PT2320940E - Anticorpos humanos que se ligam ao gene de ativação linfocitária-3 (lag-3) e utilizações dos mesmos - Google Patents

Anticorpos humanos que se ligam ao gene de ativação linfocitária-3 (lag-3) e utilizações dos mesmos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS HUMANOS QUE SE LIGAM AO GENE DE ATIVAÇÃO LINFOCITÁRIA—3 (LAG—3) E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS
Antecedentes da Invenção 0 Gene de ativação linfocitária-3, ou LAG-3 (também conhecido como CD223), é membro da superfamilia génica de imunoglobulinas e está estruturalmente e geneticamente relacionado a CD4. LAG-3 não é expresso em linfócitos de sangue periférico em repouso, mas é expresso em células T e células NK ativadas. LAG-3 é uma proteína de membrana codificada por um gene localizado na parte distai do braço curto do cromossoma 12, perto do gene CD4, sugerindo que o gene LAG-3 possa ter sido desenvolvido através de duplicação génica (Triebel et al. (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405) .
De forma semelhante a CD4, LAG-3 foi demonstrado interagir com moléculas MHC Classe II, mas, diferentemente de CD4, LAG-3 não interage com a proteína do vírus de imunodeficiência humana gpl20 (Baixeras et al. (1992) J.
Exp. Med. 176:327-337) . Estudos usando uma proteína de fusão de imunoglobulina de LAG-3 solúvel (sLAG-3lg) demonstraram ligação direta e específica de LAG-3 à MHC classe II na superfície celular (Huard et al. (1996) Eur. J. Immunol. 2 6:1180-1186) .
Em estudos in vitro de respostas de células T específicas de antigénio, a adição de anticorpos anti-LAG-3 levou a proliferação aumentada de células T, expressão superior de antigénios de ativação, tais como CD25, e concentrações superiores de citocinas, tais como interferão-gama e interleucina-4, suportando um papel para a interação de LAG-/MHC classe II na regulação negativa da estimulação dependente de antigénio de linfócitos T CD4+ (Huard et al. (1994) Eur. J. Immunol. 2j4: 3216-3221) . A região intracitoplasmática de LAG-3 foi demonstrada interagir com uma proteína denominada LAP, que é pensado que seja uma molécula de transdução de sinal envolvida na regulação negativa da via de ativação CD3/TCR (Iouzalen et al. (2001) Eur. J. Immunol. 3_^: 2885-2891) . Além disso, foi mostrado que células T reguladoras CD4+CD25+ (Treg) expressam LAG-3 sob ativação e anticorpos para supressão da inibição de LAG-3 por células Treg induzidas, tanto in vitro como in vivo, sugerindo que LAG-3 contribui para a atividade supressora de células Treg (Huang, C. et al. (2004) Immunity 21:503-513). Além disso, LAG-3 tem sido mostrada regular negativamente a homeostasia de células T por células T reguladoras tanto em mecanismos dependentes como independentes de células T (Workman, C.J. and Vignali, D.A. (2005) J. Immunol. 174:688-695).
Em certas circunstâncias, foi mostrado que LAG-3 também tem efeitos imunoestimulatórios. Por exemplo, células tumorais transfectadas com LAG-3 transplantadas em ratinhos singénicos mostraram redução de crescimento acentuada ou regressão completa quando comparadas com células tumorais não transfectadas, sugerindo que a expressão de LAG-3 nas células tumorais estimulou uma resposta antitumoral pelo acionamento de células apresentadoras de antigénio através de moléculas MHC classe II (Prigent et al. (1999) Eur. J. Immunol. 2_9:38 67-387 6) . Adicionalmente, a proteína de fusão de LAG-3lg solúvel tem sido mostrada estimular tanto respostas imunitárias humorais como celulares quando administrada a ratinhos em conjunto com um antigénio, indicando que LAG -3lg solúvel pode funcionar como um adjuvante de vacina (EI Mir and Triebel (2000) J. Immunol. 164:5583-5589). Além disso, foi mostrado que LAG-3lg humano solúvel amplifica a geração in vitro de imunidade específica de tumor tipo I (Casati et al. (2006) Cancer Res. 66:4450-4460) . A atividade funcional de LAG-3 é ainda revista em Triebel (2003) Trends Immunol. 7Λ_: 619-622. Tendo em vista o supracitado, agentes adicionais para modulação da atividade de LAG-3 são de interesse.
Sumário A presente divulgação fornece anticorpos monoclonais isolados (em particular, anticorpos monoclonais humanos), e porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente a LAG-3 humano e que compreendem: (a) uma sequência de região variável de cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 37 e uma sequência de região variável de cadeia leve que tem pelo menos 95% de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 43.
Os anticorpos, e porções de ligação a antigénio dos mesmos, da invenção têm propriedades funcionais desejáveis. Estas propriedades incluem ligação de alta afinidade a LAG-3 humano, ligação a LAG-3 humano e de macaco (por exemplo, LAG-3 de cinomolgus e/ou macaco rhesus) mas não ao LAG-3 de ratinho, a capacidade de inibir a ligação de LAG-3 a moléculas de histocompatibilidade principal Classe II (MHC) e/ou a capacidade de estimular respostas de células T especificas de antigénio. Os anticorpos da invenção podem ser usados, por exemplo, para detetar proteína LAG-3 ou para estimular respostas de células T específicas de antigénio, tais como num indivíduo carregando um tumor ou num indivíduo portador de vírus.
Num aspeto, o anticorpo da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, é um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, em que o anticorpo se liga a LAG-3 humano e exibe pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) liga-se a LAG-3 de macaco; (b) não se liga a LAG-3 de ratinho; (c) inibe a ligação de LAG-3 a moléculas de histocompatibilidade principal classe II (MHC); e (d) estimula uma resposta imunitária.
Preferivelmente, o anticorpo exibe pelo menos duas das propriedades (a), (b), (c) e (d) . Mais preferivelmente, o anticorpo exibe pelo menos três das propriedades (a) , (b) , (c) e (d) . Ainda mais preferivelmente, o anticorpo exibe todas as quatro de propriedades (a), (b), (c) e (d).
Numa forma de realização preferencial, o anticorpo estimula uma resposta de células T especifica de antigénio, tal como produção de interleucina-2 (IL-2) numa resposta de células T especifica de antigénio. Em outras formas de realização, o anticorpo estimula uma resposta imunitária, tal como uma resposta antitumoral (por exemplo, inibe o crescimento tumoral num modelo de enxerto tumoral in vivo) ou uma resposta autoimune (por exemplo, promove o desenvolvimento de diabetes em ratinhos NOD) . Em outra forma de realização preferencial, o anticorpo liga-se a um epitopo de LAG-3 humano compreendendo a sequência de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76). Ainda em outra forma de realização preferencial, o anticorpo liga-se a um epitopo de LAG-3 humano compreendendo a sequência de aminoácidos HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) ou PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). Ainda em outras formas de realização, o anticorpo liga-se a LAG-3 humano com uma KD de 1 x 1CT7 M ou menos, ou liga-se a LAG-3 humano com uma KD de 1 x 1CT8 M ou menos, ou liga-se a LAG-3 humano com uma KD de 5 x 1CT9 M ou menos, ou liga-se a LAG-3 humano com uma KD de 1 x 1CT9 M ou menos. Numa forma de realização, o anticorpo marca o tecido pituitário por inmunohistoquimica, ao passo que em outra forma de realização, o anticorpo não marca o tecido pituitário por inmunohistoquimica.
Em outro aspeto, o anticorpo da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, é um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, em que o anticorpo compete de forma cruzada pela ligação a LAG-3 humano com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em outro aspeto, o anticorpo da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, é um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada que é o produto ou derivado de um gene 3-2 0 de VH humana, um gene 4-34 de VH humana, um gene 3-33 de VH humana ou um gene 1-24 de VH humana, em que o anticorpo especificamente se liga a LAG-3 humano. Em outro aspeto, o anticorpo, ou porções de ligação a antigénio do mesmo da invenção é um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia leve que é o produto ou derivado de um gene L18 de VK humana, um gene L6 de VK humana ou um gene A27 de VK humana, em que o anticorpo especificamente se liga a LAG-3 humano. Numa forma de realização preferencial, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo: uma região variável da cadeia pesada que é o produto ou derivado de um gene 4-34 de VH humano e uma região variável da cadeia leve que é o produto ou derivado de um gene L6 de VK humano; em que o anticorpo se liga especificamente a LAG-3 humano.
Em outro aspeto, o anticorpo da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, é um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo: (a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.
Os anticorpos da invenção podem ser, por exemplo, anticorpos de comprimento completo, por exemplo, um isotipo de IgGl, IgG2 ou IgG4. Numa forma de realização preferencial, o anticorpo é um isotipo de IgG4. Em outra forma de realização preferencial, o anticorpo é um isotipo de IgG4 tendo uma mutação serina para prolina na região constante da região de dobradiça da cadeia pesada (numa posição correspondente à posição 241 como descrito em Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108), tal que a heterogeneidade da ponte dissulfeto intercadeia pesada é reduzida ou eliminada. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab, Fab' ou Fab'2 ou anticorpos de cadeia única.
Esta divulgação também fornece um imunoconjugado compreendendo um anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, ligado a um agente terapêutico, por exemplo, uma citotoxina ou um isótopo radioativo. Esta divulgação também fornece uma molécula biespecifica compreendendo um anticorpo, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção, ligado a uma segunda porção funcional tendo uma especificidade de ligação diferente que o dito anticorpo, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo.
Composições compreendendo um anticorpo, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, ou imunoconjugado ou molécula biespecifica da invenção e veiculo farmaceuticamente aceitável também são fornecidos.
Moléculas de ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, da invenção também são englobadas por esta divulgação, bem como vetores de expressão compreendendo tais ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo tais vetores de expressão. Métodos para preparação de anticorpos anti-LAG-3 usando as células hospedeiras compreendendo tais vetores de expressão também são fornecidos e podem incluir as etapas de (i) expressão do anticorpo na célula hospedeira e (ii) isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.
Em outro aspeto, a invenção pertence a anticorpos anti-LAG-3 da invenção, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, para utilização em métodos de estimulação de respostas imunitárias. Por exemplo, é descrito no presente documento um método de estimulação de uma resposta de células T especifica de antigénio que compreende o contato da dita célula T com um anticorpo da invenção tal que uma resposta de células T especifica de antigénio seja estimulada. Preferivelmente, a produção de interleucina-2 pela célula T especifica de antigénio é estimulada. Adicionalmente, é descrito no presente documento um método de estimulação de uma resposta imunitária (por exemplo, uma resposta de células T especifica de antigénio) num indivíduo que compreende administração de um anticorpo da invenção ao indivíduo tal que uma resposta imunitária (por exemplo, uma resposta de células T específica de antigénio) no indivíduo seja estimulada. Num método preferido, o indivíduo é um indivíduo carregando um tumor e uma resposta imunitária contra o tumor é estimulada. Noutro método preferido, o indivíduo é um indivíduo portador de vírus e uma resposta imunitária contra o vírus é estimulada.
Ainda em outro aspeto, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, para utilização num método para inibição do crescimento de células tumorais num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo do anticorpo da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, tal que o crescimento do tumor seja inibido no indivíduo. Ainda em outro aspeto, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, para utilização num método para tratamento de infeção virai num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo do anticorpo da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, tal que a infeção virai seja tratada no indivíduo.
Ainda em outro aspeto, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, para utilização num método para estimulação de uma resposta imunitária num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo do anticorpo anti-LAG-3, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, e pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional, tal como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-Ll e/ou um anticorpo anti-CTLA-4, tal que uma resposta imunitária seja estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir o crescimento tumoral ou para estimular uma resposta antiviral. Numa forma de realização, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-1. Em outra forma de realização, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-Ll. Ainda em outra forma de realização, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-CTLA-4. Numa forma de realização, o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo humano, tal como um anticorpo da divulgação. Alternativamente, o anticorpo anti-LAG-3 pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado. Em outra forma de realização, pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional (por exemplo, anticorpo anti-PD-1, anti-PD-Ll e/ou anti-CTLA-4) é um anticorpo humano. Alternativamente, pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado.
Breve Descrição dos Desenhos A figura IA mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 49) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 37) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 25F7. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 13) são delineadas e as derivações de linha germinativa V, D e J são indicadas. A figura 1B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 55) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 43) da região variável da cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal humano 25F7. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 19) , CDR2 (SEQ ID NO: 25) e CDR3 (SEQ ID NO: 31) são delineadas e as derivações de linha germinativa V e J são indicadas.
A figura 2A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 50) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 38) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 26H10. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 2) , CDR2 (SEQ ID NO: 8) e CDR3 (SEQ ID NO: 14) são delineadas e as derivações de linha germinativa V, D e J são indicadas.
A figura 2B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 56) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 44) da região variável da cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal humano 26H10. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 20) , CDR2 (SEQ ID NO: 26) e CDR3 (SEQ ID NO: 32) são delineadas e as derivações de linha germinativa V e J são indicadas.
A figura 3A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 51) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 39) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 25E3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 3) , CDR2 (SEQ ID NO: 9) e CDR3 são delineadas e as derivações de linha germinativa V, D e J são indicadas.
A figura 3B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 57) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 45) da região variável da cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal humano 25E3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 21) , CDR2 (SEQ ID NO: 27) e CDR3 (SEQ ID NO: 33) são
delineadas e as derivações de linha germinativa V e J são indicadas. A figura 4A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 52) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 8B7. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 10) e CDR3 (SEQ ID NO: 16) são delineadas e as derivações de linha germinativa V, D e J são indicadas. A figura 4B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 58) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 46) da região variável da cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal humano 8B7. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 22) , CDR2 (SEQ ID NO: 28) e CDR3 (SEQ ID NO: 34) são delineadas e as derivações de linha germinativa V e J são indicadas. A figura 5A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 53) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 41) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 11F2. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 5) , CDR2 (SEQ ID NO: 11) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) são delineadas e as derivações de linha germinativa V, D e J são indicadas. A figura 5B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 59) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 47) da região variável da cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal humano 11F2. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 23) , CDR2 (SEQ ID NO: 29) e CDR3 (SEQ ID NO: 35) são delineadas e as derivações de linha germinativa V e J são indicadas. A figura 6A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 54) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 42) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 17E5. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 6) , CDR2 (SEQ ID NO: 12) e CDR3 (SEQ ID NO: 18) são delineadas e as derivações de linha germinativa V, D e J são indicadas. A figura 6B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 60) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 48) da região variável da cadeia leve kappa do anticorpo monoclonal humano 17E5. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 30) e CDR3 (SEQ ID NO: 36) são delineadas e as derivações de linha germinativa V e J são indicadas. A figura 7 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada 25F7 (SEQ ID NO: 37) com as sequências de linha germinativa humana 4-34 VH e de aminoácidos JH5b (SEQ ID NOS: 61 e 62, respetivamente). A figura 8 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve 25F7 (SEQ ID NO: 43) com as sequências de aminoácidos Vk L6 e JK2 de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 63 e 64, respetivamente). A figura 9 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada 26H10 (SEQ ID NO: 38) com as sequências de aminoácidos VH 3-33 e JH6B de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 65 e 66, respetivamente). A figura 10 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve 26H10 (SEQ ID NO: 44) com as sequências de aminoácidos Vk A2j e JK3 de linha germinativa humana (SEQ ID NO: 67 e 68, respetivamente). A figura 11 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada 25E3 (SEQ ID NO: 39) com as sequências de aminoácidos VH 3-20 e JH4b de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 69 e 70, respetivamente). A figura 12 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve 25E3 (SEQ ID NO: 45) com as sequências de aminoácidos Vk L18 e JK2 de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 71 e 64, respetivamente). A figura 13 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada 8B7 (SEQ ID NO: 40) com as sequências de aminoácidos VH 4-34 e JH5b de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 61 e 62, respetivamente). A figura 14 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve 8B7 (SEQ ID NO: 46) com as sequências de aminoácidos Vk L6 e JK4 de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 63 e 72, respetivamente). A figura 15 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada 11F2 (SEQ ID NO: 41) com as sequências de aminoácidos VH 1-24 e JH4b de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 73 e 70, respetivamente). A figura 16 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve 11F2 (SEQ ID NO: 47) com as sequências de aminoácidos Vk L6 e JK1 de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 63 e 74, respetivamente). A figura 17 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada 17E5 (SEQ ID NO: 42) com as sequências de aminoácidos VH 3-33 e 2-2 de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 65 e 70, respetivamente). A figura 18 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve 17E5 (SEQ ID NO: 48) com a sequência de aminoácidos Vk L6 de linha germinativa humana (SEQ ID NOS: 63 e 75, respetivamente). A figura 19 mostra o alinhamento da sequência proteica codificada pelo clone de cADN de LAG-3 de macaco pa23- 5 (SEQ ID NO: 93) com a sequência de proteína LAG-3 de macaco rhesus depositada no Genbank (SEQ ID NO: 94) (No. de Acesso no Genbank XM_001108923). A região peptídica de alça extra e domínio transmembranário estão sublinhados. Uma diferença de aminoácido entre as duas sequências (posição de aminoácido 419) é destacada em negrito.
Descrição Detalhada da Invenção A presente divulgação refere-se a anticorpos monoclonais isolados conforme definido na reivindicação 1, particularmente anticorpos monoclonais humanos, que se ligam a LAG-3 humano e que têm propriedades funcionais desejáveis. Esta divulgação fornece anticorpos isolados, métodos de produção de tais anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo tais anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecificas da invenção. Adicionalmente, métodos de uso dos anticorpos, tais como, para detetar a proteína LAG-3, bem como métodos de uso dos anticorpos anti-LAG-3 da invenção para estimular respostas imunitárias, sozinhos ou em combinação com outros anticorpos imunoestimulatórios, são descritos no presente documento. Consequentemente, esta divulgação também fornece métodos de uso dos anticorpos anti-LAG-3 da invenção para utilização, por exemplo, na inibição do crescimento tumoral ou tratamento de uma infeção virai.
Para que a presente divulgação possa ser mais prontamente entendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são como definidas ao longo da descrição detalhada. 0 termo "LAG-3" refere-se ao Gene de ativação linfocitária-3. 0 termo "LAG-3" inclui variantes, isoformas, homólogos, ortólogos e parálogos. Por exemplo, anticorpos específicos para uma proteína LAG-3 humana, em certos casos, podem reagir cruzadamente com uma proteína LAG-3 de uma espécie além da humana. Em outras formas de realização, anticorpos específicos para uma proteína LAG-3 humana podem ser completamente específicos para a proteína LAG-3 humana e podem não exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada, ou podem reagir de forma cruzada com LAG-3 de outras espécies, mas não todas as espécies (por exemplo, reagir de forma cruzada com LAG-3 de macaco, mas não LAG-3 de ratinho) . 0 termo "LAG-3 humano" refere-se a LAG-3 de sequência humana, tal como a sequência de aminoácidos de comprimento completo de LAG-3 humano tendo No. de Acesso no Genbank NP_002277. 0 termo "LAG-3 de ratinho" refere-se à sequência de LAG-3 de ratinho, tal como a sequência de aminoácidos de comprimento completo de LAG-3 de ratinho tendo No. de Acesso no Genbank NP_032505. LAG-3 também é conhecido na técnica como, por exemplo, CD223. A sequência de LAG-3 humano pode diferenciar-se de LAG-3 humano do N° de Acesso no Genbank NP_002277 tendo, por exemplo, mutações conservadas ou mutações em regiões não conservadas e o LAG-3 tem substancialmente a mesma função biológica que o LAG-3 humano do No. de Acesso no Genbank NP_002277. Por exemplo, uma função biológica de LAG-3 humano é ter um epítopo no domínio extracelular de LAG-3 que é especif icamente ligado por um anticorpo da divulgação imediata ou uma função biológica de LAG-3 humano é a ligação a moléculas de MHC classe II. 0 termo "LAG-3 de macaco" é destinado a englobar proteínas LAG-3 expressas por macacos do Velho Mundo e do Novo Mundo, incluindo mas não limitados ao LAG-3 de macaco cinomolgus e LAG-3 de macaco rhesus. Uma sequência de aminoácidos representativa de LAG-3 de macaco é a sequência de aminoácidos de LAG-3 de macaco rhesus mostrada na figura 19 e SEQ ID NO: 85, que também é depositada com o N° de Acesso no Genbank XM_001108923. Outra sequência de aminoácidos representativa da LAG-3 de macaco é a sequência de macaco rhesus alternativa do clone pa23-5 mostrado na figura 19 e SEQ ID NO: 84, isolada como descrito no exemplo 3A, subseção 3. Esta sequência de rhesus alternativa exibe uma diferença de aminoácido única, na posição 419, quando comparada à sequência depositada no Genbank.
Uma sequência particular de LAG-3 humano será geralmente pelo menos 90% idêntica em sequência de aminoácidos a LAG-3 humano do N° de Acesso no Genbank NP_002277 e contém resíduos de aminoácidos que identificam a sequência de aminoácidos como sendo humana quando comparada a sequências de aminoácidos de LAG-3 de outras espécies (por exemplo, murina). Em certos casos, um LAG-3 humano pode ser pelo menos 95%, ou até pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácidos a LAG-3 do N° de Acesso no Genbank NP_002277. Em certas formas de realização, uma sequência de LAG-3 humano exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácidos da sequência de LAG-3 do N° de Acesso no Genbank NP_002277. Em certas formas de realização, o LAG-3 humano pode exibir não mais do que 5, ou até não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácidos da sequência de LAG-3 do No. de Acesso no Genbank NP_002277. A identidade percentual pode ser determinada como descrito neste pedido. O termo "resposta imunitária" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentadoras de antigénio, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em dano seletivo, destruição ou eliminação do corpo humano por agentes patogénicos invasores, células ou tecidos infetados com agentes patogénicos, células cancerígenas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.
Uma "resposta de células T específica de antigénio" refere-se a respostas por uma célula T que resultam da estimulação da célula T com o antigénio para o qual a célula T é específica. Exemplos não limitantes de respostas por uma célula T sob estimulação específica de antigénio incluem proliferação e produção de citocina (por exemplo, produção de IL-2). 0 termo "anticorpo" como referido neste pedido inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação a antigénio (isto é, "porção de ligação a antigénio") ou cadeias únicas dos mesmos. Anticorpos inteiros são glicoproteinas que compreendem pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável da cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões de VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões conservadas (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas do amino-terminal ao carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunitário (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), como usado no presente documento, refere-se a um ou mais
fragmentos de um anticorpo que conservam a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio (por exemplo, uma proteína LAG-3). Foi mostrado que a função de ligação a antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo em domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça (iii) um fragmento Fab' , que é essencialmente um Fab com parte da região de dobradiça (veja-se, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) um fragmento Fd composto dos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (vi) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), que consiste num domínio VH; (vii) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR); e (viii) um nanocorpo, uma região variável da cadeia pesada contendo um domínio variável único e dois domínios constantes. Além disso, embora dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite a eles serem produzidos como uma cadeia proteica única em que regiões VL e VH emparelham-se para formar moléculas monovalentes (conhecido como Fv de cadeia única (scFv); veja-se por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883) . Tais anticorpos de cadeia única também são destinados a serem englobados dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelos peritos na especialidade, e os fragmentos são rastreados para utilidade da mesma maneira que são anticorpos intactos.
Um "anticorpo isolado", como usado no presente documento, é destinado a referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigénicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína LAG-3 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios além das proteínas LAG-3). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína LAG-3 humana pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antigénios, tais como proteínas LAG-3 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como usados no presente documento, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade de ligação única e afinidade por um epitopo particular. 0 termo "anticorpo humano", como usado no presente documento, é destinado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais tanto a região conservada como as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, o termo "anticorpo humano", como usado no presente documento, não é destinado a incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies mamíferas, tais como um ratinho, foram enxertadas em sequências de região conservada humana. 0 termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única, que têm regiões variáveis nas quais tanto a região conservada como as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgénico, por exemplo, um ratinho transgénico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fusionado a uma célula imortalizada. 0 termo "anticorpo humano recombinante", como usado no presente documento, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgénico ou transcromossómico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir dos mesmos (ainda descrito abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humana recombinante, combinatória, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências génicas de imunoglobulina humana a outras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais a região conservada e regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certas formas de realização, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagénese in vitro (ou, quando um animal transgénico de sequências de Ig humana é usado, mutagénese somática in vivo) e dessa forma as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas e relacionadas a sequências de VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinativa de anticorpo humano in vi vo. 0 termo "isotipo" refere-se à classe do anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificado pelos genes da região constante da cadeia pesada.
As frases "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo especifico para um antigénio" são usadas indistintamente no presente documento com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio". 0 termo "derivados de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada de anticorpo humano, por exemplo, um conjugado de anticorpo e outro agente ou anticorpo. 0 termo "anticorpo humanizado" é destinado a referir-se a anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies mamíferas, tais como um ratinho, foram enxertadas em sequências de região conservada humana. Modificações adicionais de região conservada podem ser feitas dentro das sequências de região conservada humanas. 0 termo "anticorpo quimérico" é destinado a referir-se a anticorpos nos quais as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo no qual as sequências de região variável são derivadas de um anticorpo de ratinho e as sequências de região constante são derivadas de um anticorpo humano.
Como usado no presente documento, um anticorpo que "especificamente se liga a LAG-3 humano" é destinado a referir-se a um anticorpo que se liga à proteína LAG-3 humana (e possivelmente uma proteína LAG-3 de uma ou mais espécies não humanas), mas não se liga substancialmente a proteínas não LAG-3. Preferivelmente, o anticorpo liga-se a uma proteína LAG-3 humana com "alta afinidade", ou seja, com uma KD de 1 x 1CT7 M ou menos, mais preferivelmente 5 x 1CT8 M ou menos, mais preferivelmente 3 x 1CT8 M ou menos, mais preferivelmente 1 x 1CT8 M ou menos, mais preferivelmente 5 x 1CT9 M ou menos ou ainda mais preferivelmente 1 x 1CT9 M ou menos. 0 termo "não se liga substancialmente" a uma proteína ou células, como usado no presente documento, significa não se liga ou não se liga com uma alta afinidade à proteína ou células, isto é, liga-se à proteína ou células com uma KD de 1 x 1CT6 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 1CT5 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 1CT4 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 1CT3 M ou mais, ainda mais preferivelmente 1 x 1CT2 M ou mais. 0 termo "Kassoc" ou "Ka", como usado no presente documento, é destinado a referir-se à taxa de associação de uma interação particular anticorpo-antigénio, ao passo que o termo "KdiS" ou "Kd", como usado no presente documento, é destinado a referir-se à taxa de dissociação de uma interação particular anticorpo-antigénio. 0 termo "KD", como usado no presente documento, é destinado a referir-se à constante de dissociação, que é obtida da razão de Kd por Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M) . Os valores de KD de anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método preferencial para determinação de KD de um anticorpo é pelo uso de ressonância de plasmón de superfície, Preferivelmente usando um sistema biossensor, tal como um sistema Biacore®. 0 termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo tendo uma KD de 1 x 1CT7 M ou menos, mais preferivelmente 5 x 1CT8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 1 x 1CT8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 5 x 1CT9 M ou menos e ainda mais preferivelmente 1 x 1CT9 M ou menos por um antigénio alvo. Entretanto, ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "alta afinidade" para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo tendo uma KD de 1CT5 M ou menos, mais preferivelmente 1CT7 M ou menos, ainda mais preferivelmente 1CT8 M ou menos. 0 termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. 0 termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, frangos, animais anfíbios e répteis, embora mamíferos sejam preferenciais, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas e cavalos. Vários aspetos da invenção são descritos em detalhes adicionais nas subseções seguintes.
Anticorpos Anti-LAG-3 Tendo Propriedades Funcionais Particulares
Os anticorpos da invenção são caracterizados por caracteristicas funcionais ou propriedades particulares dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos se ligam especificamente a LAG-3 humano e podem se ligar a LAG-3 de outras espécies, por exemplo, LAG-3 de macaco (por exemplo, macaco cinomolgus, macaco rhesus), mas não se ligam substancialmente a LAG-3 de outras espécies, por exemplo, LAG-3 de ratinho. Preferivelmente, um anticorpo da invenção liga-se a LAG-3 humano com alta afinidade. A capacidade do anticorpo de estimular uma resposta imunitária, tal como uma resposta de células T específica de antigénio, pode ser indicada, por exemplo, pela capacidade do anticorpo de estimular a produção de interleucina-2 (IL-2) numa resposta de células T específica de antigénio. Em certas formas de realização, um anticorpo da invenção liga-se a LAG-3 humano e exibe uma capacidade de estimular uma resposta de células T específica de antigénios. Em outras formas de realização, um anticorpo da invenção liga-se a LAG-3 humano, mas não exibe uma capacidade de estimular uma resposta de células T específica de antigénio. Outros meios pelos quais avaliar a capacidade do anticorpo de estimular uma resposta imunitária incluem a capacidade do anticorpo de inibir o crescimento tumoral, tal como num modelo de enxerto tumoral in vivo (veja-se, por exemplo, exemplo 6) ou a capacidade do anticorpo de estimular uma resposta autoimune, tal como a capacidade de promover o desenvolvimento de uma doença autoimune num modelo autoimune, tal como a capacidade de promover o desenvolvimento de diabetes no modelo de ratinho NOD (veja-se, por exemplo, exemplo 7). A ligação de um anticorpo da invenção a LAG-3 pode ser avaliada usando uma ou mais técnicas bem estabelecidas na técnica. Por exemplo, numa forma de realização preferencial, um anticorpo pode ser testado por um ensaio de citometría de fluxo no qual o anticorpo é reagido com uma linha celular que expressa LAG-3 humano, tal como células CHO que foram transfectadas para expressar LAG-3 (por exemplo, LAG-3 humano ou LAG-3 de macaco (por exemplo, macaco rhesus ou cinomolgus) ou LAG-3 de ratinho) em sua superfície celular (veja-se, por exemplo, exemplo 3A para um ensaio adequado). Outras células adequadas para uso em ensaios de citometría de fluxo incluem células T CD4+ ativadas anti-CD3-estimuladas, que expressam LAG-3 nativo. Adicionalmente ou alternativamente, a ligação do anticorpo, incluindo a cinética de ligação (por exemplo, valor de KD) pode ser testada em ensaios de ligação BIAcore (veja-se, por exemplo, exemplo 3B para ensaios adequados). Ainda outros ensaios de ligação adequados incluem ensaios ELISA, por exemplo, usando uma proteína LAG-3 recombinante (veja-se, por exemplo, o exemplo 1 para um ensaio adequado).
Preferivelmente, um anticorpo da invenção liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 5 x 1CT8 M ou menos, liga-
se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 2 x 1CT8 M ou menos, liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 5 1CT9 M x ou menos, liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 4 x 1CT9 M ou menos, liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 3 x 1CT 9 M ou menos, liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 2 10 9 M x ou menos, liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 1 x 1CT9 M ou menos, liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 5 x 1CT10 M ou menos, ou liga-se a uma proteína LAG-3 com uma KD de 1 x 1CT10 M ou menos.
Tipicamente, um anticorpo da invenção liga-se a LAG-3 em tecidos linfoides, tais como amídala, baço ou timo, que pode ser detetado por imunohistoquímica. Adicionalmente, como ainda descrito no exemplo 8, certos anticorpos anti-LAG-3 da invenção marcam tecido pituitário (por exemplo, são retidos na hipófise) como medido por imunohistoquímica, ao passo que outros anticorpos anti-LAG-3 da invenção não marcam o tecido pituitário (por exemplo, não são mantidos na hipófise) como medido por imunohistoquímica. Dessa forma, numa forma de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 humano que marca o tecido pituitário por imunohistoquímica, ao passo que em outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 humano que não marca o tecido pituitário por imunohistoquímica.
Anticorpos preferenciais da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Adicionalmente ou alternativamente, os anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos monoclonais quiméricos ou humanizados.
Anticorpos Monoclonais 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5
Um anticorpo preferido da invenção é o anticorpo monoclonal humano 25F7. 25F7 e anticorpos anti-LAG-3 adicionais 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 foram isolados e estruturalmente caracterizados como descrito nos exemplos 1 e 2. As sequências de aminoácidos de VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 37 a 42, respetivamente. As sequências de aminoácidos de VK de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 43 a 48, respetivamente.
Considerando que cada um destes anticorpos pode se ligar a LAG-3 humano, as sequências de VH e VL podem ser "misturadas e combinadas" para gerar outras moléculas de ligação anti-LAG-3 da invenção. Preferivelmente, quando as cadeias VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência de VH de um emparelhamento particular de VH/VL é substituída por uma sequência de VH estruturalmente semelhante. Do mesmo modo, preferivelmente uma sequência de VL de um emparelhamento particular de VH/VL é substituída por uma sequência de VL estruturalmente semelhante.
Num aspeto, esta divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.
Em outro aspeto, esta divulgação fornece anticorpos que compreendem as CDRls, CDR2s e CDR3s da cadeia pesada e cadeia leve de 25F7. As sequências de aminoácidos das CDRls de VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 37 a 42, respetivamente. As sequências de aminoácidos das CDR2s de VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 43 a 48, respetivamente. As sequências de aminoácidos das CDR3s de VH de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 13 a 14, GGY e 16 a 18, respetivamente. As sequências de aminoácidos das CDRls de Vk de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 19 a 24 respetivamente. As sequências de aminoácidos das CDR2s de Vk de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 25 a 30. As sequências de aminoácidos das CDR3s de Vk de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 31 a 36, respetivamente. As regiões de CDR são descritas usando o sistema Rabat (Rabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N. 91-3242).
Considerando que cada um destes anticorpos pode se ligar a LAG-3 humano e que a especificidade de ligação a antigénio é fornecida principalmente pelas regiões CDR1, CDR2 e CDR3, sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VL podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo deva conter CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e CDR1, CDR2 e CDR3 de VL) para gerar outras moléculas de ligação anti-LAG-3 da invenção. Ligação a LAG-3 de tais anticorpos "variados e combinados" pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos exemplos (por exemplo, ELISAs, análise Biacore®) . Preferivelmente, quando as sequências de CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência particular de VH é substituída por uma sequência(s) de CDR estruturalmente semelhante. Do mesmo modo, quando sequências de CDR de VL são misturadas e combinadas, sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência particular de VL preferivelmente é substituída por uma sequência(s) de CDR estruturalmente semelhante. Será prontamente evidente para o técnico no assunto que novas sequências de VH e VL podem ser geradas pela substituição de uma ou mais sequências de região CDR de VH e/ou VL por sequências estruturalmente semelhantes das sequências de CDR reveladas no presente documento para anticorpos monoclonais 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5. Numa forma de realização preferida, o anticorpo da invenção, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreende: (a) uma CDR1 da região variável da cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 1; (b) uma CDR2 da região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7; (c) uma CDR3 da região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 13; (d) uma CDR1 da região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 19; (e) uma CDR2 da região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 25; e (f) uma CDR3 da região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 31. É bem conhecido na técnica que o domínio CDR3, independentemente do(s) domínio(s) CDR2 e/ou CDR1, sozinho pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo a um antigénio cognato e que múltiplos anticorpos podem ser gerados previsivelmente tendo a mesma especificidade de ligação com base numa sequência de CDR3 comum. Veja-se, por exemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83 (2):252-260 (2000) ; Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000);
Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) ; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92:2529-2533 (1995); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) ; Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995) ; Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:4374-8 (1993);
Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) e
Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000) . Veja-se também,
Patentes Americanas Nos. 6.951.646; 6.914.128; 6.090.382; 6.818.216; 6.156.313; 6.827.925; 5.833.943; 5.762.905 e 5.760.185.
Anticorpos Tendo Sequências Particulares de Linha germinativa
Em certas formas de realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável da cadeia pesada de um gene particular de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa e/ou uma região variável da cadeia leve de um gene particular de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa.
Por exemplo, numa forma de realização preferencial, esta divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada que é o produto ou derivado de um gene 3-20 de VH humana, um gene 4-34 de VH humana, um gene 3-33 de VH humana ou um gene 1-24 de VH humana, em que o anticorpo especificamente se liga a LAG-3 humano. Em outra forma de realização preferencial, esta divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia leve que é o produto ou derivado de um gene L18 de VK humana, um gene L6 de VK humana ou um gene A27 de VK humana, em que o anticorpo especificamente se liga a LAG-3 humano. Numa forma de realização preferida, esta divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que é o produto ou derivado de um gene 4-34 de VH humana e compreende uma região variável da cadeia leve que é o produto ou derivado de um gene L6 de VK humana, em que o anticorpo especificamente se liga a LAG-3 humano. Tais anticorpos também podem possuir uma ou mais das caracteristicas funcionais descritas em detalhes acima, tal como ligação de alta afinidade a LAG-3 humano, ligação a LAG-3 de macaco, falta de ligação a LAG-3 de ratinho, capacidade de inibir a ligação de LAG-3 a moléculas MHC classe II e/ou capacidade de estimular respostas de células T especifica de antigénio.
Um exemplo de um anticorpo tendo VH e VL de VH 3-20 e L18 de VK, respetivamente, é o anticorpo 25E3. Exemplos de anticorpos que têm VH e VL de VH 4-34 e L6 de VK, respetivamente, são os anticorpos 25F7 e 8B7. Um exemplo de um anticorpo tendo VH e VL de VH 3-33 e A27 de VK, respetivamente, é o anticorpo 26H10. Um exemplo de um anticorpo tendo VH e VL de VH 1-24 e L6 de VK, respetivamente, é o anticorpo 11F2. Um exemplo de um anticorpo tendo VH e VL de VH 3-33 e L6 de VK, respetivamente, é o anticorpo 17E5.
Como usado no presente documento, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência particular de linha germinativa se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linha germinativa humana. Tais sistemas incluem imunização de um ratinho transgénico carregando genes de imunoglobulina humana com o antigénio de interesse ou rastreamento de uma biblioteca génica de imunoglobulina humana exibida no fago com o antigénio de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana pode ser identificado como tal por comparação da sequência de aminoácidos do anticorpo humano às sequências de aminoácidos de imunoglobulinas de linha germinativa humana e seleção da sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana que é muito próxima em sequência (isto é, maior identidade %) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é o "produto de" ou "derivado de" uma sequência particular de imunoglobulina de linha germinativa humana pode conter diferenças de aminoácidos em comparação à sequência de linha germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação sitio-dirigida. Entretanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinativa humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano em comparação às sequências de aminoácidos de imunoglobulina de linha germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linha germinativa murina). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou até pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência particular de linha germinativa humana exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5, ou até não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa.
Anticorpos Homólogos
Anticorpos da invenção compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências de aminoácidos do anticorpo monoclonal 25F7 descrito no presente documento, e em que os anticorpos conservam as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-LAG-3 da invenção. Especificamente, esta divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que: (a) a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% homóloga à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% homóloga à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; e (c) o anticorpo liga-se especificamente a LAG-3 humano . 0 anticorpo pode possuir uma ou mais das seguintes propriedades funcionais discutidas acima, tais como ligação de alta afinidade a LAG-3 humano, ligação a LAG-3 de macaco, falta da ligação a LAG-3 de ratinho, capacidade de inibir a ligação de LAG-3 a moléculas MHC classe II e/ou capacidade de estimular respostas de células T especifica de antigénios.
Em várias formas de realização, o anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
Em outras formas de realização, as sequências de aminoácidos de VH e/ou VL podem ser 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às sequências apresentadas acima. Um anticorpo tendo regiões de VH e VL que têm alta homologia (isto é, 95% ou maior) a regiões de VH e VL das sequências apresentadas acima, pode ser obtido por mutagénese (por exemplo, mutagénese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácidos nucleicos que codificam as SEQ ID NO: 49 ou 55, seguido pelo teste do anticorpo alterado codificado para função retida (isto é, as funções apresentadas acima) usando os ensaios funcionais descritos no presente documento.
Como usado no presente documento, a homologia percentual entre duas sequências de aminoácidos é equivalente à identidade percentual entre as duas sequências. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, homologia % = # de posições idênticas/# de posições totais x 100), considerando o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisam ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de identidade percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo. A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4_:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch {J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de programa GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
Adicionalmente ou alternativamente, as sequências proteicas da presente divulgação podem ser ainda usadas como "uma sequência de questionamento" para realizar uma pesquisa em bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Buscas de proteína no BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para obtenção de alinhamentos lacunados para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1991) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. Utilizando os programas BLAST e BLAST Gapped, os parâmetros pré-configurados dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) são úteis. Veja-se www.ncbi.nlm.nih.gov.
Anticorpos com Modificações Conservativas
Em certas formas de realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 tendo sequências de aminoácidos especificadas com base em 25F7, ou modificações conservativas dos mesmos, e em que os anticorpos conservam as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-LAG-3 da invenção. É entendido na técnica que certa modificação conservativa de sequência que pode ser feita não remove a ligação ao antigénio. Veja-se, por exemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Blol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605- 12; Kelley e O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341 a 6 e Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43. Consequentemente, esta divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que: (a) a sequência de CDR3 de região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13, e modificações conservativas das mesmas; (b) a sequência de CDR3 de região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e modificações conservativas das mesmas; e (c) o anticorpo liga-se especificamente a LAG-3 humano.
Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode possuir uma ou mais das seguintes propriedades funcionais descritas acima, tal como ligação de alta afinidade a LAG-3 humano, ligação a LAG-3 de macaco, falta da ligação ao LAG-3 de ratinho, capacidade de inibir a ligação de LAG-3 a moléculas MHC classe II e/ou capacidade de estimular respostas de células T específica de antigénios.
Numa forma de realização preferencial, a sequência de CDR2 de região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e modificações conservativas das mesmas; e a sequência de CDR2 de região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e modificações conservativas das mesmas. Em outra forma de realização preferencial, a sequência de CDR1 de região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e modificações conservativas das mesmas; e a sequência de CDR1 de região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e modificações conservativas das mesmas.
Em várias formas de realização, o anticorpo pode ser, por exemplo, anticorpo humano, anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico.
Como usado no presente documento, o termo "modificações conservativas de sequência" é destinado a referir-se a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácido. Modificações podem ser introduzidas num anticorpo da invenção por técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagénese sítio-dirigida e mutagénese mediada por PCR. Substituições de aminoácido conservativas são aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acidicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Dessa forma, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado para a função conservada (isto é, as funções apresentadas acima) usando os ensaios funcionais descritos no presente documento. Anticorpos que se Ligam ao Mesmo Epítopo que Anticorpos Anti-LAG-3
Os anticorpos da invenção ligam-se ao mesmo epítopo em LAG-3 do que o anticorpo monoclonal anti-LAG-3 25F7 (isto é, têm a capacidade de competir de forma cruzada por ligação a LAG-3 humano com o anticorpo monoclonal 25F7). Em formas de realização preferenciais, o anticorpo de referência para estudos de competição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal 25F7.
Tais anticorpos competidores de forma cruzada podem ser identificados com base em sua capacidade de competir cruzadamente com 25F7 em ensaios de ligação a LAG-3 padrão. Por exemplo, ensaios de ELISA padrão podem ser usados em que uma proteína LAG-3 humana recombinante é imobilizada na placa, um dos anticorpos é marcado com fluorescência e a capacidade de anticorpos não marcados de competir pela ligação do anticorpo marcado é avaliada. Adicionalmente ou alternativamente, a análise por BIAcore pode ser usada para avaliar a capacidade dos anticorpos de competir de forma cruzada. A capacidade de um anticorpo teste de inibir a ligação de, por exemplo, 25F7 a LAG-3 humano demonstra que o anticorpo teste pode competir com 25F7 a LAG-3 humano e dessa forma liga-se ao mesmo epítopo em LAG-3 humano que 25F7. Numa forma de realização preferencial, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em LAG-3 humano que 25F7 é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados como descrito nos exemplos.
Como discutido ainda no exemplo 3C, a ligação de 25E3, 25F7 e 8B7 a LAG-3 humano foi mapeada numa região de "ansa extra" dentro do primeiro domínio extracelular de LAG-3 humano. A sequência da região de ansa extra é apresentada na SEQ ID NO: 79. Usando uma experiência de varrimento de péptido, a ligação de 25E3 foi mapeada para região de ansa extra seguinte à sequência de aminoácidos: PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76), ao passo que a ligação de 25F7 foi mapeada para a região de ansa extra seguinte à sequência de aminoácidos: HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) e a ligação de 8B7 à região de ansa extra foi mapeada seguinte à sequência de aminoácidos: PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). Consequentemente, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 que se liga a um epítopo de LAG-3 humano compreendendo a sequência de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76). Especificamente, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 que se liga a um epítopo de LAG-3 humano compreendendo a sequência de aminoácidos HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77).
Anticorpos Manipulados e Modificados
Um anticorpo que tem uma ou mais das sequências de VH e/ou VL reveladas no presente documento pode ser utilizado como material inicial para manipular um anticorpo modificado, anticorpo modificado o qual pode ter propriedades alteradas a partir do anticorpo inicial. Um anticorpo pode ser modificado pela modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL) , por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões conservadas. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser modificado pela modificação de resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função (ões) efetora(s) do anticorpo.
Por exemplo, o enxerto de CDR pode ser usado para manipular regiões variáveis de anticorpos. Anticorpos interagem com antigénios alvo predominantemente por resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões de determinação complementaridade (CDRs) da cadeia pesada e leve. Por essa razão, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversificadas entre anticorpos individuais do que em sequências fora das CDRs. Como as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência natural pela construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado para sequências de região conservada de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja-se, por exemplo, Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Veja-se. U.S.A. 86:10029-10033; Patentes Americanas Nos. 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 . )
Consequentemente, outra forma de realização da invenção pertence a um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 13, respetivamente, e uma região variável da cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 31, respetivamente. Dessa forma, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de VH e VL do anticorpo monoclonal 25F7e podem conter sequências de região conservada diferentes deste anticorpo.
Tais sequências de região conservada podem ser obtidas de bancos de dados de ADN públicos ou referências publicadas que incluem sequências génicas de anticorpo de linha germinativa. Por exemplo, sequências de ADN de linha germinativa para genes de região variável da cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linha germinativa humana "VBase" (disponíveis na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Rabat et al. (1991), citados supra; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germline VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 2A_: 827-836. Como outro exemplo, sequências de ADN de linha germinativa para genes de região variável da cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas no banco de dados Genbank. Por exemplo, as seguintes sequências de linha germinativa de cadeia pesada encontradas no HuMAb HCo7 de ratinho estão disponíveis nos Números de Acesso no Genbank acompanhantes: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333), 3-33 (NG_001010 9 & NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 & NT_024637) . Como outro exemplo, as seguintes sequências de linha germinativa de cadeia pesada encontradas no HuMAb HCol2 de ratinho estão disponíveis no Números de Acesso no Genbank acompanhantes: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333), 5-51 (NG_001010 9 & NT_024637), 4-34 (NG_0010109 & NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) & 3-23 (AJ406678).
Sequências proteicas de anticorpo são comparadas a um banco de dados de sequências proteicas compilado usando um dos métodos de pesquisa de semelhança de sequência chamado BLAST Gapped (Altschul et al. (1997), supra), que é bem conhecido pelos peritos na especialidade.
Sequências de região conservada preferenciais para uso nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente semelhantes às sequências de região conservada usadas por anticorpos selecionados da invenção, isto é, semelhantes a sequências de região conservada de VH 4-34 (SEQ ID NO: 61) e/ou sequências de região conservada de L6 de VK (SEQ ID NO: 63) ou usadas pelo anticorpo monoclonal preferencial da invenção. Sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VK, podem ser enxertadas em regiões conservadas que têm sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinativa do qual a sequência de região conservada deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões conservadas que contêm uma ou mais mutações quando comparadas às sequências de linha germinativa. Por exemplo, foi encontrado que em certos exemplos é benéfico mutar resíduos dentro das regiões conservadas para manter ou aumentar a capacidade de ligação a antigénio do anticorpo (veja-se por exemplo, Patentes Americanas Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370) .
Outro tipo de modificação de região variável deve mutar resíduos de aminoácido dentro de regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para melhorar por meio disso uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. Mutagénese sítio-dirigida ou mutagénese mediada por PCR podem ser realizadas para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, podem ser avaliadas in vitro ou ensaios in vivo como descrito no presente documento e fornecidas nos exemplos. Preferivelmente modificações conservativas (como discutido acima) são introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácido, mas são preferivelmente substituições. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.
Consequentemente, os anticorpos monoclonais anti-LAG-3 isolados, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, descritos no presente documento podem compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo: (a) uma região CDR1 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada com a SEQ ID NO: 1; (b) uma região CDR2 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada com a SEQ ID NOs: 7; (c) uma região CDR3 de VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada com a SEQ ID NO: 13; (d) uma região CDR1 de VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando comparada com a SEQ ID NO: 19; (e) uma região CDR2 de VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando comparada com a SEQ ID NO: 25; e (f) uma região CDR3 de VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando comparada com a SEQ ID 31.
Anticorpos manipulados da invenção incluem aqueles nos quais as modificações foram feitas a resíduos de região conservada dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de região conservada são feitas para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "retromutar" um ou mais resíduos de região conservada da sequência de linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que passou por mutação somática pode conter resíduos de região conservada que se diferenciam da sequência de linha germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados pela comparação das sequências de região conservada de anticorpo às sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é derivado.
Por exemplo, a tabela A mostra regiões onde uma posição de aminoácido de região conservada (usando o sistema de numeração Rabat) se diferencia da linha germinativa e como esta posição pode ser retromutada à linha germinativa pelas substituições indicadas:
Outro tipo de modificação de região conservada envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região conservada, ou até dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de células T para reduzir por meio disso a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem também é referida como "desimunização" e é descrita em detalhe adicional na Publicação de Patente U.S. N° 20030153043.
Além disso, ou em alternativa às modificações feitas dentro da região conservada ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação de recetor de Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente de antigénio. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, alterar novamente uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas formas de realização é descrita em detalhes adicionais abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é aquele do índice EU de Rabat.
Numa forma de realização preferencial, o anticorpo é um anticorpo de isotipo IgG4 compreendendo uma mutação Serina por Prolina numa posição correspondente à posição 228 (S228P; índice da UE) na região de dobradiça da região constante da cadeia pesada. Foi relatado que esta mutação elimina a heterogeneidade de pontes de dissulfeto intercadeia pesada na região de dobradiça (Angal. supra; a posição 241 é baseada na numeração do sistema Rabat) . Por exemplo, em várias formas de realização, um anticorpo anti-LAG-3 da invenção pode compreender a região variável da cadeia pesada de 25F7 (SEQ ID NO: 37) ligada a uma região constante de IgG4 humana em que a Serina numa posição correspondente à posição 241 como descrito em Angal et al., supra, foi mutada para Prolina. Dessa forma, para a região variável da cadeia pesada de 25F7 ligada a uma região constante de IgG4 humana, esta mutação corresponde a uma mutação S228P pelo índice da UE.
Numa forma de realização, a região de dobradiça de CHI é modificada tal que o número de resíduos cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita ainda na Patente U.S No. 5.677.425. 0 número de resíduos cisteína na região de dobradiça de CHI é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem de cadeias leves e pesadas ou aumentar ou reduzir a estabilidade do anticorpo.
Em outra forma de realização, a região de dobradiça Fc de um anticorpo é mutada para reduzir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento Fc-dobradiça tal que o anticorpo tenha prejudicado a ligação de proteína Estaf ilocócica A (SpA) em relação à ligação de SpA de domínio de Fc-dobradiça nativo. Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais na Patente U.S No. 6.165.745.
Em outra forma de realização, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S No. 6.277.375. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região de CHI ou CL para conter um epítopo de ligação de recetor de salvamento tomado de duas ansas de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes U.S Nos. 5.869.046 e 6.121.022.
Ainda em outras formas de realização, a região Fc é alterada pela substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente tal gue o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor mas conserve a capacidade de ligação a antigénio do anticorpo parental. O ligante efetor ao gual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um recetor Fc ou o componente Cl do complemento. Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais nas Patentes U.S Nos. 5.624.821 e 5.648.260.
Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente tal gue o anticorpo tenha ligação de Clg alterada e/ou tenha reduzido ou tenha eliminado a citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais na Patente U.S No.6.194.551.
Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro de posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados para alterar por meio disso a capacidade do anticorpo de fixar o complemento. Esta abordagem é descrita ainda na Publicação PCT WO 94/29351.
Ainda noutro exemplo, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo de mediar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo de um recetor Fey pela modificação de um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é descrita ainda na Publicação PCT WO 00/42072. Além disso, os sítios de ligação em IgGl humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (veja-se Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591 a 6604). Foi mostrado que mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 melhoravam ligação a FcyRIII. Adicionalmente, foi mostrado que os seguintes mutantes de combinação melhoravam a ligação de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.
Ainda em outra forma de realização, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser produzido (isto é, o anticorpo sem glicosilação). Glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo pelo antigénio. Tais modificações de hidrato de carbono podem ser realizadas, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios da glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas o que resulta na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de região conservada de região variável para eliminar por meio disso a glicosilação naquele sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antigénio. Veja-se, por exemplo, Patentes U.S Nos. 5.714.350 e 6.350.861.
Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosilo ou um anticorpo tendo estruturas aumentadas de GlcNac de bissegmentação. Tais modelos de glicosilação alterados têm sido demonstrados para aumentar a capacidade ADCC de anticorpos. Tais modificações de hidrato de carbono podem ser realizadas, por exemplo, pela expressão do anticorpo numa célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. Células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes da invenção para produzir por meio disso um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 sem o gene fucosiltransferase, FUT8 (a (1,6)-fucosiltransferase), tal que os anticorpos expressos nas linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 sem fucose em seus hidratos de carbono. As linhas celulares FUT8_/_ Ms704, Ms705 e Ms709 foram criadas pela rutura direcionada do gene FUT8 em células CHO/DG44 usando dois vetores de substituição (veja-se Publicação de Patente U.S No. 20040110704 e Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 8_7:614-22) . Como outro exemplo, EP 1.176.195 descreve uma linha celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de tal forma que os anticorpos expressos em tal linha celular exibiram hipofucosilação por redução ou eliminação da enzima relacionada à ligação a-1,6. EP 1.176.195 também descreve linhas celulares que têm uma baixa atividade enzimática para adicionar fucose à N-acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou não tem atividade enzimática, por exemplo, a linha celular de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). Publicação PCT WO 03/035835 descreve uma variante linha de células CHO, células Lecl3, com a capacidade reduzida de ligar fucose a hidratos de carbono ligados por Asn(297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (veja-se também Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740) . Anticorpos com um perfil de glicosilação modificado também podem ser produzidos em ovos de galinha, como descrito na Publicação PCT WO 06/089231.
Alternativamente, anticorpos com um perfil de glicosilação modificado podem ser produzidos em células vegetais, tais como Lemna. Métodos para produção de anticorpos num sistema vegetal são descritos no Pedido de Patente U.S No. correspondente ao registro legal de Alston & Bird LLP No. 040989/314911, depositado em 11 de agosto de 2006. Publicação PCT WO 99/54342 descreve linhas celulares manipuladas para expressar glicosil transferases que modificam glicoproteína (por exemplo, β (1,4)-N-acetil glicosaminiltransferase III (GnTIII)) tais que os anticorpos expressos em linhas celulares manipuladas exibiram estruturas aumentadas de GlcNac de bissegmentação que resultam em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (veja-se também Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:17 6-180) . Alternativamente, os resíduos fucose do anticorpo podem ser clivados usando uma enzima fucosidase; por exemplo, fucosidase α-L-fucosidase remove resíduos fucosilo de anticorpos (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516-23) .
Outra modificação dos anticorpos no presente documento que é contemplada por esta divulgação é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, sérica) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, anticorpo ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagido com polietilenoglicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peguilação é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como usado no presente documento, o termo "polietilenoglicol" é destinado a englobar qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivar outras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcoxi- ou ariloxi-polietilenoglicol ou maleimida de polietilenoglicol. Em certas formas de realização, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Veja-se, por exemplo, EP 0 154 316 e EP 0 401 384. Propriedades Físicas do Anticorpo
Anticorpos desta divulgação podem ser caracterizados pelas suas várias propriedades físicas, para detetar e/ou diferenciar classes diferentes dos mesmos.
Anticorpos da presente divulgação podem conter um ou mais sítios de glicosilação na região variável da cadeia leve ou pesada. Tais sítios de glicosilação podem resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma alteração do pK do anticorpo devido à ligação a antigénio alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706) . É conhecido que a glicosilação ocorre em motivos contendo uma sequência N-X-S/T. Em alguns exemplos, é preferencial ter um anticorpo anti-LAG-3 que não contém glicosilação de região variável. Isto pode ser alcançado pela seleção de anticorpos que não contêm o motivo de glicosilação na região variável ou por mutação de resíduos dentro da região de glicosilação.
Numa forma de realização preferencial, os anticorpos da presente divulgação não contêm sítios de isomerismo de asparagina. A desamidação da asparagina pode ocorrer em sequências N-G ou D-G e resultar na criação de um resíduo ácido isoaspártico que introduz uma torção na cadeia polipeptidica e reduz a sua estabilidade (efeito do ácido isoaspártico).
Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico único (pi), que geralmente se situa no intervalo de pH entre 6 e 9,5. O pi de um anticorpo IgGl tipicamente está incluído no intervalo de pH de 7 a 9,5 e o pi de um anticorpo IgG4 tipicamente está incluído no intervalo de pH de 6 a 8. Há especulação que os anticorpos com um pi fora da faixa normal podem ter um pouco de desdobramento e instabilidade sob condições in vivo. Dessa forma, é preferencial ter um anticorpo anti-LAG-3 que contém um valor de pi que se situa no intervalo normal. Isto pode ser alcançado pela seleção de anticorpos com um pi no intervalo normal ou mutação de resíduos superficiais carregados.
Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão característica, com uma temperatura de fusão mais alta indicando maior estabilidade total in vivo (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3_: 361-71) . Geralmente, é preferencial que a TMi (a temperatura de desdobramento inicial) seja maior que 60 °C, preferivelmente maior que 65 °C, ainda mais preferivelmente maior que 70 °C. O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido usando varrimento diferencial de calorimetria (Chen e ai (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et ai (1999) Immunol Lett 68:47-52) ou dicroísmo circular (Murray et ai. (2002) J. Chromatogr Sei 40:343-9).
Numa forma de realização preferencial, anticorpos são selecionados daqueles que não se degradam rapidamente. A degradação de um anticorpo pode ser medida usando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 6_7:3626-32) .
Em outra forma de realização preferencial, anticorpos são selecionados daqueles que têm efeitos de agregação mínimos, que podem levar ao disparo de uma resposta imunitária não desejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. Geralmente, anticorpos são aceitáveis com agregação de 25% ou menos, preferivelmente 20% ou menos, ainda mais preferivelmente 15% ou menos, ainda mais Preferivelmente 10% ou menos e ainda mais preferivelmente 5% ou menos. A agregação pode ser medida por várias técnicas, incluindo coluna por exclusão do tamanho (SEC), cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC), e dispersão de luz. Métodos para Manipular Anticorpos
Como discutido acima, os anticorpos anti-LAG-3 tendo sequências de VH e VL descritas no presente documento podem ser usados para criar novos anticorpos anti-LAG-3 pela modificação de sequências de VH e/ou VL, ou a(s) região(ões) constante(s) ligada(s) a estas. Dessa forma, as caracteristicas estruturais de um anticorpo anti-LAG-3 da invenção, por exemplo, 25F7, são usadas para criar anticorpos anti-LAG-3 estruturalmente relacionados que conservam pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tais como ligação a LAG-3 humano. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de 25F7, ou mutações das mesmas, podem ser combinadas de forma recombinante com regiões conservadas conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-LAG-3, manipulados de forma recombinante adicionais da invenção, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. 0 material inicial do método de manipulação é uma ou mais das sequências de VH e/ou VL fornecidas no presente documento, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Para criar o anticorpo manipulado, não é necessário preparar realmente (isto é, expresso como uma proteína) um anticorpo tendo um ou mais das sequências de VH e/ou VL fornecidas no presente documento, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Preferivelmente, a informação contida na(s) sequência(s) é usada como o material inicial para criar uma sequência(s) de "segunda geração" derivada da(s) sequência (s) original (ais) e em seguida a(s) sequência (s) de "segunda geração" é(são) preparada(s) e expressa (s) como uma proteína.
Consequentemente, um método para preparar um anticorpo anti-LAG-3 é descrito no presente documento compreendendo: (a) fornecer: (i) uma sequência de anticorpo de região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de CDR1 de SEQ ID NO: 1, a sequência de CDR2 de SEQ ID NOs: 7, e/ou a sequência de CDR3 de SEQ ID NOs: 13; e/ou (ii) uma sequência de anticorpo de região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de CDR1 de SEQ ID NO: 19, a sequência de CDR2 de SEQ ID NO: 25, e/ou a sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 31; (b) alteração de pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de região variável da cadeia pesada e/ou a sequência de anticorpo de região variável da cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e (c) expressão da sequência de anticorpo alterada como uma proteína. Técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada.
Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é aquele que conserva uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-LAG-3 descritos no presente documento, propriedades funcionais as quais incluem, mas não são limitadas a: (i) ligação de alta afinidade a LAG-3 humano; (ii) ligação a LAG-3 de macaco; (iii) sem ligação a LAG-3 de ratinho (iv) uma capacidade de inibir ligação de LAG-3 a moléculas de MHC classe II; e/ou (v) uma capacidade de estimular uma resposta imunitária (por exemplo, uma resposta de células T específica de antigénio).
As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando ensaios padrão disponíveis na técnica e/ou descritos no presente documento, tais como aqueles apresentados nos exemplos.
Em certas formas de realização dos métodos de manipulação de anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas de forma aleatória ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo anti-LAG-3 e os anticorpos anti-LAG-3 modificados resultantes podem ser rastreados para atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais como descrito no presente documento. Métodos mutacionais foram descritos na técnica (veja-se, por exemplo, Publicações PCT WO 02/092780 e WO 03/074679) .
Moléculas de Ácidos Nucleicos que Codificam Anticorpos da Invenção
Outro aspeto da invenção pertence a moléculas de ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisado celular, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "produzido substancialmente puro" quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, junção de CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Veja-se, Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, ADN ou ARN e pode ou não conter sequências intrónicas. Numa forma de realização preferencial, o ácido nucleico é uma molécula de cADN. Ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados de ratinhos transgénicos carregando genes de imunoglobulina humana como descrito ainda abaixo), cADNs codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos pela amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cADN. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca génica de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), um ácido nucleico que codifica tais anticorpos pode ser recuperado a partir da biblioteca génica.
Moléculas de ácidos nucleicos preferenciais da invenção são aquelas que codificam as sequências de VH e VL do anticorpo monoclonal 25F7. Sequências de ADN que codificam as sequências de VH de 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 49 a 54, respetivamente. Sequências de ADN que codificam as sequências de VL de 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 e 17E5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 55 a 60, respetivamente.
Uma vez que os fragmentos de ADN que codificam segmentos de VH e VL são obtidos, estes fragmentos de ADN podem ser ainda manipulados por técnicas de ADN recombinantes padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes de cadeia de anticorpo completo, em genes de fragmento Fab ou num gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de ADN de codificação de VH ou VL é operacionalmente ligado a outro fragmento de ADN que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operacionalmente ligado", como usado neste contexto, é destinado a significar que dois fragmentos de ADN são unidos tal que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de ADN permaneçam na estrutura. O ADN isolado que codifica a região VH pode ser convertido num gene de cadeia pesada completa ligando operacionalmente ADN de codificação de VH a outra molécula de ADN que codifica regiões constantes da cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As sequências dos genes de região constante da cadeia pesada humana são conhecidos na técnica (veja-se por exemplo, Rabat et al. (1991), supra) e os fragmentos de ADN que englobam estas regiões podem ser obtidos pela amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas ainda mais Preferivelmente é uma região constante de IgGl ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, ADN de codificação de VH pode ser operacionalmente ligado a outra molécula de ADN que codifica somente a região constante da cadeia pesada CHI. ADN isolado que codifica a região VL pode ser convertido num gene de cadeia leve completo (bem como um gene de cadeia leve de Fab) ligando operacionalmente ADN de codificação de CL a outra molécula de ADN que codifica a região constante da cadeia leve, CL. As sequências de genes de região constante da cadeia leve humana são conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo, Rabat et al., supra) e os fragmentos de ADN que englobam estas regiões podem ser obtidos pela amplificação por PCR padrão. Em formas de realização preferenciais, a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.
Para criar um gene scFv, os fragmentos de ADN de codificação de VL e VH são operacionalmente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, tal que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões de VL e VH unidas pelo ligante flexível (veja-se por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Produção de Anticorpos Monoclonais da Invenção
Anticorpos monoclonais (mAbs) da presente divulgação podem ser produzidos usando a técnica bem conhecida de hibridização de célula somática (hibridoma) de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Outras formas de realização para produção de anticorpos monoclonais incluem transformação virai ou oncogénica de linfócitos B e técnicas de exibição de fago. Anticorpos quiméricos ou humanizados também são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Patentes U.S Nos. 4.816.567; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370.
Numa forma de realização preferencial, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos direcionados contra LAG-3 humano podem ser gerados usando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos que transportam partes do sistema imunitário humano em vez do sistema de ratinho. Estes ratinhos transgénicos e transcromossómicos incluem ratinhos referidos no presente documento como Ratinho HuMAb® e Ratinho KM®, respetivamente, e são coletivamente referidos no presente documento como "ratinhos de Ig humana." O Ratinho HuMAb® (Medarex®, Inc) contém miniloci génicos de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ humana não rearranjada em conjunto com mutações visadas que inativam os loci endógenos da cadeia μ e κ (Veja-se por exemplo, Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474) : 856-859) .
Consequentemente, os ratinhos exibiram expressão reduzida de IgM ou κ de ratinho, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofre troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGx de alta afinidade humanos (Lonberg et al. (1994), supra; revisto em Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding and Lonberg (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Preparação e uso de Ratinho HuMAb®, e as modificações genómicas transportadas por tais ratinhos, são ainda descritas em Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117 a 123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Veja-se ainda, Patentes U.S Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.770.429; e 5.545.807; Publicação Nos. PCT. WO 92/03918; WO 93/12227; WO 94/25585; WO 97/13852; WO 98/24884; o WO 99/45962 e WO 01/14424.
Anticorpos humanos da invenção podem ser originados usando um ratinho carregando sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, tais como um ratinho carregando um transgene de cadeia pesada humana e um transcromossoma de cadeia leve humana. Este ratinho é referido no presente documento como um "ratinho KM®" e é descrito detalhadamente na Publicação PCT WO 02/43478. Uma forma modificada deste ratinho, que compreende ainda uma rutura homozigótica do gene do recetor FcyRIIB endógeno, também é descrita na Publicação PCT WO 02/43478 e referida no presente documento como um "ratinho KM/FCGR2D®" . Além disso, ratinhos com transgenes de cadeia pesada HCo7 ou com HCol2 ou ambos podem ser usados.
Formas de realização de animais transgénicos adicionais incluem o Xenomouse (Abgenix, Inc, Patentes U.S Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963). Formas de realização adicionais incluem "ratinhos TC" (Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA j/7 :722-727) e vacas carregando transcromossomas de cadeia pesada e leve humana (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894; Publicação PCT WO 02/092812).
Alternativamente, anticorpos monoclonais humanos anti-LAG-3 podem ser preparados usando métodos de exibição de fago para rastreamento de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Veja-se, por exemplo, Patentes U.S Nos. 5.223.409; 5.403.484; 5.571.698; 5.427.908; 5.580.717; 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; e 6.593.081.
Anticorpos monoclonais humanos anti-LAG-3 também podem ser preparados usando ratinhos SCID nos quais as células imunes humanas foram reconstituídas tal que uma resposta de anticorpo humana possa ser gerada na imunização. Veja-se, por exemplo, Patentes U.S Nos. 5.476.996 e 5.698.767.
Adicionalmente, anticorpos anti-LAG-3 humanos podem ser preparados usando exibição de fago onde os fagos compreendem ácidos nucleicos que codificam anticorpos gerados em animais transgénicos anteriormente imunizados com LAG-3. Preferivelmente, o animal transgénico é um ratinho HuMab, KM ou Kirin. Veja-se, por exemplo, Patente U.S No. 6.794.132 .
Imunização de Ratinhos de Ig Humana
Ratinhos de Ig humana podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida com um antigénio de LAG-3, proteína LAG-3 recombinante, ou células que expressam uma proteína LAG-3. Veja-se, por exemplo, Lonberg et al. (1994), supra; Fishwild et al. (1996), supra-, Publicações PCT WO 98/24884 ou WO 01/14424. Preferivelmente, ratinhos de 6 a 16 semanas de idade são imunizados com 5 a 50 yg de proteína LAG-3. Alternativamente, uma porção de LAG-3 fusionada a um polipéptido não LAG-3 é usada.
Os ratinhos transgénicos podem ser imunizados intraperitonialmente (IP) ou intravenosamente (IV) com antigénio de LAG-3 em adjuvante de Freund completo, seguido por imunização IP ou IV subsequente com antigénio em adjuvante de Freund incompleto. Alternativamente, adjuvantes além de adjuvante de Freund ou células inteiras na ausência do adjuvante são usadas. 0 plasma pode ser rastreado por ELISA e células dos ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-LAG-3 podem ser usadas para fusões.
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos da Invenção
Para gerar hibridomas que produzem anticorpos anti-LAG-3 monoclonais humanos, esplenocitos e/ou células de linfonodo de ratinhos imunizados podem ser isolados e fusionados a uma linha celular imortalizada apropriada, tal como uma linha celular de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem ser rastreados para a produção de anticorpos específicos ao antigénio. Geração de hibridomas é bem conhecida na técnica. Veja-se, por exemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York.
Geração de Transfectomas que Produzem Anticorpos
Monoclonais da Invenção
Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos num transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção génica como é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Numa forma de realização, ADN que codifica cadeias leves e pesadas parciais ou completas obtidas por técnicas de biologia molecular padrão é inserido num ou mais vetores de expressão tal que os genes sejam operacionalmente ligados a sequências reguladoras de transcrição e tradução. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligado" é destinado a significar que um gene de anticorpo é ligado num vetor tal que as sequências controlo da transcrição e da tradução dentro do vetor sirvam à sua função desejada de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O termo "sequência regulatória" é destinado a incluir promotores, potencializadores e outros elementos de controlo de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)) . Sequências reguladoras preferenciais para expressão de célula hospedeira mamífera incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão proteica em células mamíferas, tais como promotores e/ou potencializadores derivados do citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovirus, (por exemplo, promotor principal tardio de adenovirus (AdMLP) e polioma. Alternativamente, as sequências reguladoras não virais podem ser usadas, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina. Ainda mais, os elementos reguladores compostos de sequências de fontes diferentes, tais como o sistema promotor SRa, que contém sequências do promotor precoce de SV40 e terminal de longa repetição de vírus de leucemia tipo 1 de células T humanas (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8_: 466-472) . O vetor de expressão e sequências de controlo de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos nos mesmos vetores de expressão ou separados. Em formas de realização preferenciais, as regiões variáveis são usadas para criar genes de anticorpo completo de qualquer isotipo de anticorpo pela inserção deles em vetores de expressão que já codificam regiões constantes da cadeia pesada e cadeia leve constantes do isotipo desejado tal que o segmento de VH seja operacionalmente ligado ao segmento (s) de CH dentro do vetor e o segmento de VL seja operacionalmente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um péptido sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o péptido sinal seja ligado na estrutura ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (isto é, um péptido sinal de uma proteína não imunoglobulina).
Além dos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinante da invenção podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. 0 gene marcador selecionável facilita seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (veja-se, por exemplo, Patentes U.S Nos. 4.399.216; 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene de marcador selecionável confere a resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferenciais incluem gene de dihidrofolato redutase (DHFR) (para o uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação por metotrexato) e o gene neo (para seleção por G418).
Para expressão das cadeias leves e pesadas, o vetor (es) de expressão que codifica as cadeias pesadas e leves é transfectado numa célula hospedeira por técnicas padrão. Várias formas do termo "transfecção" são destinadas a englobar uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação por fosfato do cálcio, transfecção por DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou em eucarióticas, expressão de anticorpos em células eucarióticas, e ainda mais preferivelmente células hospedeiras mamíferas, são as mais preferenciais porque tais células eucarióticas, e em particular células mamíferas, são mais propensas do que células procarióticas para montar e secretar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo. Células hospedeiras mamíferas preferenciais para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovário de Hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr~, descritas em Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, usado com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601 a 621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferencial é o sistema de expressão génica GS descrito em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras mamíferas, os anticorpos são produzidos pela cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo em meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação proteica padrão. Caracterização da Ligação de Anticorpo a Antigénio
Anticorpos da invenção podem ser testados para ligação a LAG-3 humano por, por exemplo, ELISA padrão. IgGs anti-LAG-3 humano podem ser ainda testadas para reatividade com um antigénio de LAG-3 por Western blotting. A especificidade de ligação de um anticorpo da invenção também pode ser determinada pelo monitoramento da ligação do anticorpo a células expressando uma proteína LAG-3, por exemplo, citometría de fluxo. Estes métodos são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Harlow and Lane (1988), citados supra.
Imunoconjugados
Anticorpos desta invenção podem ser conjugados a um agente terapêutico para formar um imunoconjugado, tal como um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Agentes terapêuticos adequados incluem antimetabolitos, agentes alquilantes, ligantes de sulcos menores de ADN, intercalantes de ADN, interligantes de ADN, inibidores de histona deacetilase, inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteassoma, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores proteicos de choque térmico, inibidores de tirosina quinase, antibióticos e agentes antimitóticos. No ADC, o anticorpo e agente terapêutico preferivelmente são conjugados através de um ligante clivável, tal como um ligante peptidil, dissulfeto ou hidrazona. Mais preferivelmente, o ligante é um ligante peptidil, tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO:15), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser ou Glu. Os ADCs podem ser preparados como descrito nas Patentes U.S Nos. 7.087.600; 6.989.452; e 7.129.261; Publicações PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; e WO 08/103693; Publicações de Patentes U.S 20060024317; 20060004081; e 20060247295.
Moléculas Biespecíficas
Em outro aspeto, a presente divulgação caracteriza moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-LAG-3 ligado a pelo menos uma outra molécula funcional, por exemplo, outro péptido ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante de um recetor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas alvo diferentes. Dessa forma, como usado no presente documento, "molécula biespecífica" inclui moléculas tendo três ou mais especificidades. Numa forma de realização preferencial, a molécula biespecífica compreende uma primeira especificidade de ligação de LAG-3 e uma segunda especificidade de ligação de uma molécula de provocação que recruta células efetoras citotóxicas que podem eliminar uma célula-alvo expressando LAG-3. Exemplos de moléculas desencadeadoras adequadas são CD64, CD89, CD16 e CD3. Veja-se, por exemplo, Kufer et al., TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004).
Numa forma de realização, uma molécula biespecífica tem, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-LAG-3, uma terceira especificidade. A terceira especificidade pode ser por um fator antipotencialização (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína superficial envolvida na atividade citotóxica e por meio disso aumenta a resposta imunitária contra a célula-alvo. Por exemplo, o fator antipotencialização pode ligar-se a uma célula T citotóxica (por exemplo, através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40 ou ICAM-1) ou outra célula imune, resultando numa resposta imunitária aumentada contra a célula-alvo.
Moléculas biespecíficas podem vir em muitos formatos e tamanhos diferentes. Numa extremidade do espectro de tamanho, uma molécula biespecífica conserva o formato de anticorpo tradicional, exceto que, em vez de ter dois braços de ligação de especificidade idêntica, tem dois braços de ligação cada um tendo uma especificidade diferente. Em outro extremo são moléculas biespecificas consistindo de dois fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv's) ligados por uma cadeia peptídica, uma chamada construção Bs(scFv)2. Moléculas biespecificas de tamanho intermediário incluem dois fragmentos F (ab) diferentes ligados por um ligante peptidil. Moléculas biespecíficas destes e outros formatos podem ser preparadas por manipulação genética, hibridização somática, ou métodos químicos. Veja-se, por exemplo, Kufer et al, citado supra; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); e van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000), e as referências citadas nestes.
Composições Farmacêuticas
Em outro aspeto, a presente divulgação fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da presente divulgação formulada em conjunto com veículo farmaceuticamente aceitável. Pode conter opcionalmente um ou mais ingredientes adicionais farmaceuticamente ativos, tais como outro anticorpo ou um fármaco. As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas numa terapêutica de combinação com, por exemplo, outro agente imunoestimulatório, agente anticancro, um agente antiviral, ou uma vacina, tal que o anticorpo anti-LAG-3 aumenta a resposta imunitária contra a vacina. A composição farmacêutica pode compreender qualquer número de excipientes. Excipientes que podem ser usados incluem veículos, agentes de superfície ativa, agentes espessantes ou emulsificantes, ligantes sólidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, solubilizantes, corantes, aromatizantes, revestimentos, agentes desintegrantes, lubrificantes, adoçantes, conservantes, agentes isotónicos e combinações dos mesmos. A seleção e uso de excipientes adequados são ensinados em Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003) .
Preferivelmente, uma composição farmacêutica é adequada para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão) . Dependendo da via de administração, o composto ativo pode ser recoberto com um material para protegê-lo da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativá-lo. A frase "administração parenteral" como usada no presente documento significa modos de administração além de administração entérica e tópica, normalmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via não parenteral, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.
Os compostos farmacêuticos da invenção podem estar na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que conserva a atividade biológica desejada do composto parental e não transmite nenhum efeito toxicológico indesejado. Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tal como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil substituídos, ácidos hidroxi-alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos alifáticos sulfónicos e aromáticos e semelhantes. Sais de adição básica incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,Ν'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
Composições farmacêuticas podem estar na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis. Também podem ser formulados numa microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada à alta concentração de fármaco. A quantidade do ingrediente ativo que pode ser combinado com um material veículo para produzir uma forma de dosagem unitária variará dependendo do indivíduo que é tratado e o modo particular de administração e será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem porcento, esta quantidade variará de aproximadamente 0,01% a aproximadamente noventa e nove porcento do ingrediente ativo, preferivelmente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 70%, ainda mais preferivelmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 30% do ingrediente ativo em combinação com veículo farmaceuticamente aceitável.
Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica) . Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como usada no presente documento refere-se a unidades fisicamente discretas ajustadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com veículo farmacêutico necessário. Alternativamente, anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, em que caso a administração menos frequente é necessária.
Para a administração do anticorpo, a dosagem varia de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, e mais normalmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser peso corporal de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem preferenciais de um anticorpo anti-LAG-3 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal através de administração intravenosa, com o anticorpo sendo dado usando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, então a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmática de anticorpo de aproximadamente 1 a 1000 pg/ml e em alguns métodos aproximadamente 25 a 300 yg/ml.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-LAG-3 da invenção Preferivelmente resulta numa redução na gravidade de sintomas de doença, um aumento em frequência e duração de períodos sem sintoma da doença, ou prevenção de prejuízo ou inabilidade devido à afecção de doença. Por exemplo, para o tratamento de indivíduos carregando tumor, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" preferivelmente inibe o crescimento tumoral em pelo menos aproximadamente 20%, mais preferivelmente em pelo menos aproximadamente 40%, ainda mais preferivelmente em pelo menos aproximadamente 60%, e ainda mais preferivelmente em pelo menos aproximadamente 80% em relação a indivíduos não tratados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode reduzir o tamanho tumoral, ou de outra maneira melhorar sintomas num indivíduo, que é tipicamente humano ou pode ser outro mamífero. A composição farmacêutica pode ser uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de viniletileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido polilático. Veja-se, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc, New York, 1978.
Composições terapêuticas podem ser administradas através de dispositivos médicos tais como (1) dispositivos de injeção hipodérmica sem agulha (por exemplo, US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; e 4.596.556); (2) bombas de microinfusão (US 4.487.603); (3) dispositivos transdérmicos (US 4.486.194); (4) aparatos de infusão (US 4.447.233 e 4.447.224); e (5) dispositivos osmóticos (US 4.439.196 e 4.475.196).
Em certas formas de realização, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessam a barreira hematoencefálica, podem ser formulados em lipossomas, que podem compreender adicionalmente porções de direcionamento para aumentar o transporte seletivo a células ou órgãos específicos. Veja-se, por exemplo, US 4.522.811; 5.374.548; 5.416.016; e 5.399.331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 3 9:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; e Killion and Fidler (1994) Lmmunomethods £:273.
Usos e Métodos da Invenção
Os anticorpos, composições de anticorpo e métodos da presente invenção têm numerosas utilidades in vitro e in vivo envolvendo, por exemplo, deteção de LAG-3 ou aumento da resposta imunitária pelo bloqueio de LAG-3. Numa forma de realização preferencial, os anticorpos da presente invenção são anticorpos humanos. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para aumentar a imunidade numa variedade de situações. Consequentemente, num aspeto, a invenção fornece um anticorpo, ou porção de liqação a antiqénio do mesmo, da invenção para utilização num método de modificação de uma resposta imunitária num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo do anticorpo, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção tal que a resposta imunitária no indivíduo seja modificada. Preferivelmente, a resposta é aumentada, estimulada ou regulada.
Indivíduos preferenciais incluem pacientes humanos em necessidade de aumento de uma resposta imunitária. Os métodos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanos tendo um distúrbio que pode ser tratado pelo aumento de uma resposta imunitária (por exemplo, a resposta imunitária mediada por célula T) . Numa forma de realização particular, os métodos são particularmente adequados para o tratamento do cancro in vivo. Para alcançar o aumento antigénio-específico de imunidade, os anticorpos anti-LAG-3 podem ser administrados em conjunto com um antigénio de interesse ou o antigénio já pode estar presente no indivíduo a ser tratado (por exemplo, um indivíduo carregando tumor ou carregando vírus). Quando os anticorpos a LAG-3 são administrados em conjunto com outro agente, os dois podem ser administrados em ordem ou simultaneamente. A invenção fornece ainda métodos para deteção da presença do antigénio de LAG-3 humano numa amostra, ou medida da quantidade do antigénio de LAG-3 humano, compreendendo contato da amostra, e uma amostra controlo, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, que especificamente se liga a LAG-3 humano, sob condições permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e LAG-3 humano. A formação de um complexo então é detetada, em que uma diferença de formação de complexo entre a amostra comparada à amostra controlo é indicativa da presença do antigénio de LAG-3 humano na amostra. Além disso, os anticorpos anti-LAG-3 da invenção podem ser usados para purificar LAG-3 humano através de purificação por imunoafinidade.
Considerando a capacidade de anticorpos anti-LAG-3 da invenção para inibir a ligação de LAG-3 a moléculas de MHC classe II e estimular respostas de células T especifica de antigénios, a invenção também fornece métodos in vitro e in vivo de uso dos anticorpos da invenção para estimular, aumentar ou regular para cima respostas de células T especifica de antigénios. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser utilizado num método de estimulação de uma resposta de células T especifica de antigénios compreendendo contato da dita célula T com o anticorpo da invenção tal que uma resposta de células T especifica de antigénios seja estimulada. Qualquer indicador adequado de uma resposta de células T especifica de antigénios pode ser usado para medir a resposta de células T especifica de antigénios. Exemplos não limitantes de tais indicadores adequados incluem proliferação de células T aumentada na presença do anticorpo e/ou produção de citocina aumentada na presença do anticorpo. Numa forma de realização
preferencial, produção de interleucina-2 por célula T especifica de antigénio é estimulada. A invenção também fornece um anticorpo da invenção para utilização num método de estimulação de uma resposta imunitária (por exemplo, uma resposta de células T especifica de antigénios) num indivíduo compreendendo administração do anticorpo da invenção ao indivíduo tal que uma resposta imunitária (por exemplo, uma resposta de células T específica de antigénios) no indivíduo seja estimulada. Numa forma de realização preferencial, o indivíduo é um indivíduo carregando tumor e uma resposta imunitária contra o tumor é estimulada. Em outra forma de realização preferencial, o indivíduo é um indivíduo carregando vírus e uma resposta imunitária contra o vírus é estimulada.
Em outro aspeto, a invenção fornece um anticorpo da invenção para utilização num método para inibição de crescimento de células tumorais num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo do anticorpo da invenção tal que o crescimento do tumor seja inibido no indivíduo. Ainda em outro aspeto, a invenção fornece um anticorpo da invenção para utilização num método de tratamento de infeção virai num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo do anticorpo da invenção tal que a infeção virai seja tratada no indivíduo.
Estas e outras utilizações da invenção são discutidos em detalhes adicionais abaixo.
Cancro
Bloqueio de LAG-3 por anticorpos pode aumentar a resposta imunitária a células cancerígenas no paciente. Num aspeto, a presente invenção relaciona-se ao tratamento de um indivíduo in vivo usando um anticorpo anti-LAG-3 tal que o crescimento de tumores cancerígenos seja inibido. Um anticorpo anti-LAG-3 pode ser usado sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerígenos. Alternativamente, um anticorpo anti-LAG-3 pode ser usado em conjunto com outros agentes imunogénicos, tratamentos de cancro padrão, ou outros anticorpos, como descrito abaixo.
Consequentemente, numa forma de realização, a invenção fornece um anticorpo da invenção, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, para utilização num método de inibição de crescimento de células tumorais num indivíduo, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-LAG-3, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo anti-LAG-3 humano (tal como qualquer um dos anticorpos de LAG-3 anti-humanos descritos no presente documento). Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-LAG-3 quimérico ou humanizado.
Cancros preferenciais cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos da invenção incluem cancros tipicamente responsivos à imunoterapia. Exemplos não limitantes de cancros preferenciais para tratamento incluem melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), cancro renal (por exemplo, carcinoma de células claras), cancro de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormonas), cancro de mama, cancro de cólon e cancro de pulmão (por exemplo, cancro de pulmão de não pequenas células). Adicionalmente, a invenção inclui malignidades refratárias ou recorrentes cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos da invenção.
Exemplos de outros cancros que podem ser tratados usando os métodos da invenção incluem cancro ósseo, cancro pancreático, cancro de pele, cancro de cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, cancro uterino, cancro ovariano, cancro retal, cancro da região anal, cancro de estômago, cancro testicular, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma de endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma vaginal, carcinoma de vulva, Doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, cancro de esófago, cancro de intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tireoide, cancro da glândula paratireoide, cancro da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, cancro de uretra, cancro de pênis, leucemias crónicas ou agudas incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de infância, linfoma linfocítico, cancro de bexiga, cancro de rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma de SNC primário, angiogénese tumoral, tumor de eixo espinhal, glioma de tronco cerebral, adenoma de pituitária, sarcoma de Kaposi, cancro epidermoide, cancro de célula escamosa, linfoma de célula T, cancros induzidos ambientalmente incluindo aqueles induzidos por asbesto, e combinações dos ditos cancros. A presente invenção é também útil para o tratamento de cancros metastáticos, cancros especialmente metastáticos que expressam PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144).
Opcionalmente, anticorpos para LAG-3 podem ser combinados com um agente imunogénico, tal como células cancerígenas, antigénios tumorais purificados (incluindo proteínas recombinantes, péptidos e moléculas de hidrato de carbono), células, e células transfectadas com genes que codificam citocinas imunoestimulantes (He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Exemplos não limitantes das vacinas tumorais que podem ser usados incluem péptidos de antigénios de melanoma, tais como péptidos gplOO, antigénios MAGE, Trp-2, MARTI e/ou tirosinase, ou células tumorais transfectadas para expressar a citocina GM-CSF (discutido ainda abaixo).
Em humanos, foi mostrado que alguns tumores são imunogénicos, tais como melanomas. Pelo aumento do limiar de ativação de células T pelo bloqueio de LAG-3, as respostas tumorais no hospedeiro podem ser ativadas. O bloqueio de LAG-3 será provavelmente mais eficaz quando combinado com um protocolo de vacinação. Muitas estratégias experimentais de vacinação contra tumores foram inventadas (veja-se Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; veja-se também Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 em DeVita et al. feds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition). Numa destas estratégias, uma vacina é preparada usando células tumorais autólogas ou alogénicas. Foi mostrado que estas vacinas celulares são mais eficazes quando células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF. Foi mostrado que GM-CSF é um ativador potente de apresentação de antigénio para vacinação tumoral (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 9_0: 3539-43) . O estudo de expressão génica e modelos de expressão génica em larga escala em vários tumores levaram à definição dos chamados antigénios específicos tumorais (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7). Em muitos casos, estes antigénios específicos para tumores são antigénios de diferenciação expressos nos tumores e na célula da qual o tumor surgiu, por exemplo, antigénios para melanócitos gplOO, antigénios MAGE e Trp-2. O que é mais importante, pode ser mostrado que muitos destes antigénios são os alvos de células T específicas para tumor encontradas no hospedeiro. Bloqueio de LAG-3 pode ser usado em conjunto com uma coleção de proteínas e/ou péptidos recombinantes expressos num tumor a fim de gerar uma resposta imunitária a estas proteínas. Estas proteínas são normalmente examinadas pelo sistema imune como os mesmos antigénios e são, por isso, tolerantes a eles. O antigénio tumoral pode incluir a proteína telomerase, que é necessária para a síntese de telómeros de cromossomas e que é expressa em mais de 85% de cancros humanos e em somente um número limitado de tecidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013) . (Estes tecidos somáticos podem ser protegidos do ataque imune por vários meios). Antigénio tumoral também pode ser "neo-antigénios" expressos em células de cancro em razão de mutações somáticas que alteram a sequência proteica ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas (isto é, bcr-abl no cromossoma Philadelphia), ou idiotipo de tumores de células B.
Outras vacinas tumorais podem incluir as proteínas de vírus envolvidos em cancros humanos tais como Vírus de Papiloma Humano (HPV), Vírus de Hepatite (HBV e HCV) e Vírus de Sarcoma de Herpes de Kaposi (KHSV). Outra forma do antigénio específico para tumor que pode ser usado em conjunto com bloqueio de LAG-3 são proteínas de choque de calor purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas de células tumorais e estas HSPs são altamente eficientes na entrega a células apresentadoras de antigénio para provocação de imunidade tumoral (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117 a 120). Células dendríticas (DC) são células apresentadoras de antigénio potentes que podem ser usadas para preparar respostas específicas de antigénio. DC pode ser produzida ex vivo e carregada com vários antigénios proteicos e peptídicos bem como extratos de células tumorais (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332) . DC também pode ser transduzida por meios genéticos para expressar também estes antigénios tumorais. DC também foi fusionada diretamente a células tumorais para fins de imunização (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336) . Como um método de vacinação, imunização de DC pode ser efetivamente combinada com bloqueio de LAG-3 para ativar respostas antitumorais mais potentes.
Bloqueio de LAG-3 também pode ser combinado com tratamentos de cancro padrão. Bloqueio de LAG-3 pode ser efetivamente combinado com regimes quimioterápicos. Nestes exemplos, pode ser possível reduzir a dose do reagente quimioterápico administrado (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Um exemplo de tal combinação é um anticorpo anti-LAG-3 em combinação com decarbazina para o tratamento de melanoma. Outro exemplo de tal combinação é um anticorpo anti-LAG-3 em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento de melanoma. O argumento científico por trás do uso combinado de bloqueio de LAG-3 e quimioterapia é que a morte celular, que é uma consequência da ação citotóxica da maioria dos compostos quimioterápicos, deve resultar em níveis aumentados do antigénio tumoral na via de apresentação de antigénio. Outras terapêuticas de combinação que podem resultar em sinergia com o bloqueio de LAG-3 pela morte celular são radiação, cirurgia e privação hormonal. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antigénio tumoral no hospedeiro. Inibidores de angiogénese também podem ser combinados com bloqueio de LAG-3. Inibição de angiogénese leva à morte de células tumorais as quais podem alimentar o antigénio tumoral em vias de apresentação de antigénio de hospedeiro.
Anticorpos de bloqueio de LAG-3 também podem ser usados em combinação com anticorpos biespecíficos que direcionam células efetoras expressando recetor Fca ou Fey a células tumorais (veja-se, por exemplo, Patentes Americanas Nos. 5.922.845 e 5.837.243). Anticorpos biespecíficos podem ser usados para visar dois antigénios separados. Por exemplo, anticorpos biespecificos de recetor anti-Fc/antigénio antitumoral (por exemplo, Her-2/neu) foram usados para direcionar macrófagos a sítios de tumor. Este direcionamento pode ativar mais efetivamente respostas específicas tumorais. O braço de células T destas respostas seria aumentado com o uso do bloqueio de LAG-3. Alternativamente, o antigénio pode ser entregue diretamente a DC pelo uso de anticorpos biespecificos que se ligam ao antigénio tumoral e a um marcador de superfície celular específico para célula dendrítica.
Tumores escapam da imunovigilância do hospedeiro por uma larga variedade de mecanismos. Muitos destes mecanismos podem ser superados pela inativação de proteínas que são expressas pelos tumores e que são imunossupressoras. Estas incluem entre outras, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), e ligante Fas (Hahne et al. (1996) Science 27 4: 1363-1365) . Anticorpos para cada uma destas entidades podem ser usados em combinação com anti-LAG-3 para contrariar os efeitos do agente imunossupressor e favorecer respostas imunitárias tumorais pelo hospedeiro.
Outros anticorpos que ativam a responsividade imunitária do hospedeiro podem ser usados em combinação com anti-LAG-3. Estes incluem moléculas na superfície de células dendriticas que ativam a função de DC e apresentação de antigénio. Anticorpos anti-CD40 são capazes de substituir efetivamente por atividade auxiliar de células T (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) e podem ser usados em conjunto com anticorpos para LAG-3 (Ito et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). Ativação de anticorpos para moléculas coestimulatórias de célula T, tais como CTLA-4 (por exemplo, Patente U.S No. 5.811.097), BOI 40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) , e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266) também pode fornecer níveis aumentados de ativação de células T. O transplante de medula óssea está a ser atualmente usado para tratar uma variedade dos tumores de origem hematopoiética. Enquanto a doença de enxerto contra o hospedeiro é uma consequência deste tratamento, beneficio terapêutico pode ser obtido do enxerto vs. respostas tumorais. 0 bloqueio de LAG-3 pode ser usado para aumentar a eficácia das células T especificas para tumor enxertadas do dador. Há também vários protocolos de tratamento experimentais que envolvem ativação e expansão ex vivo de células T especifica de antigénios e transferência adotiva destas células em recipientes a fim de estimular células T especifica de antigénios contra tumor (Greenberg & Riddell (1999) Science 2 8 5: 546-51) . Estes métodos também podem ser usados para ativar respostas de células T para agentes infeciosos, tais como CMV. Ativação ex vivo na presença de anticorpos anti-LAG-3 pode aumentar a frequência e atividade das células T adotivamente transferidas.
Doenças Infeciosas A invenção também é útil para tratar pacientes que foram expostos a toxinas ou agentes patogénicos particulares. Consequentemente, é descrito no presente documento um método de tratamento de uma doença infeciosa num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo anti-LAG-3, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, tal que o indivíduo seja tratado para a doença infeciosa. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo humano anti-LAG-3 humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-LAG-3 humanos descritos no presente documento). Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado.
Semelhante à sua aplicação a tumores como discutido acima, bloqueio de LAG-3 mediado por anticorpo pode ser usado sozinho, ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para estimular a resposta imunitária a agentes patogénicos, toxinas e auto-antigénios. Exemplos de agentes patogénicos para os quais esta abordagem terapêutica pode ser particularmente útil incluem agentes patogénicos para os quais não há atualmente nenhuma vacina eficaz, ou agentes patogénicos para os quais as vacinas convencionais são menos do que completamente eficazes. Estes incluem, mas não são limitados ao VIH, Hepatite (A, B & C) , Influenza, Herpes, Giardia, Malária, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. 0 bloqueio de LAG-3 é particularmente útil contra infeções estabelecidas por agentes, tais como VIH que apresenta antigénios alterados ao longo do curso das infeções. Estes novos epítopos são reconhecidos como estranhos no momento da administração de LAG-3 anti-humano, dessa forma provocando uma forte resposta de células T que não é amortecida por sinais negativos através de LAG-3.
Alguns exemplos de virus patogénicos que causam infeções tratáveis por métodos da invenção incluem HIV, hepatite (A, B, ou C), virus de herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, e CMV, vírus Epstein-Barr), adenovirus, vírus influenza, flavivírus, ecovírus, rinovírus, vírus coxsackie, coronavírus, vírus sincicial respiratório, virus de parotidite, rotavirus, vírus de sarampo, vírus de rubéola, parvovirus, vírus de vacínia, vírus HTLV, vírus da dengue, papilomavírus, vírus molluscum, poliovirus, vírus de hidrofobia, vírus JC e vírus de encefalite arboviral.
Alguns exemplos de bactérias patogénicas que causam infeções tratáveis por métodos da invenção incluem clamídia, bactérias rickettsial, micobactéria, estafilococos, estreptococos, pneumonococos, meningococos e gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétano, botulismo, antraz, peste, leptospirose e bactérias da doença de Lyme.
Alguns exemplos de fungos patogénicos que causam infeções tratáveis por métodos da invenção incluem Género Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.),
Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
Alguns exemplos de parasitas patogénicos que causam infeções tratáveis por métodos da invenção incluem Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.
Em todos os métodos acima, bloqueio de LAG-3 pode ser combinado com outras formas de imunoterapia, tais como tratamento de citocina (por exemplo, interferões, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ou a terapêutica de anticorpo biespecifica, que fornece a apresentação aumentada de antigénios tumorais (veja-se, por exemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2_:1121-1123).
Reações autoimunes
Anticorpos anti-LAG-3 podem provocar e amplificar respostas autoimunes. De fato, a indução de respostas antitumorais usando vacinas de célula tumoral e péptido descreve que muitas respostas antitumorais envolvem anti-autorreat ividades (van Elsas et ai. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et ai. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1) : 81-4). Por isso, é possível considerar uso de bloqueio anti-LAG-3 em conjunto com várias autoproteínas a fim de inventar protocolos de vacinação para gerar eficientemente respostas imunitárias contra estas autoproteínas para tratamento de doença. Por exemplo, doença de Alzheimer envolve acúmulo inapropriado de péptido Αβ em depósitos de amiloide no cérebro; respostas de anticorpo contra o amiloide são capazes de compensar estes depósitos de amiloide (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177).
Outras autoproteinas também podem ser usadas como alvos, tais como IgE do tratamento de alergia e asma, e TNFa para a artrite reumatoide. Finalmente, as respostas de anticorpo a várias hormonas podem ser induzidas pelo uso do anticorpo anti-LAG-3. Neutralização de respostas de anticorpo a hormonas reprodutivas pode ser usada para contraceção. Neutralização de resposta de anticorpo a hormonas e outros fatores solúveis que são necessários para o crescimento de tumores particulares também podem ser considerados como alvos de vacinação possíveis. Métodos análogos como descrito acima para o uso do anticorpo anti-LAG-3 podem ser usados para a indução de respostas autoimunes terapêuticas para tratar pacientes tendo uma acumulação inapropriada de outros auto- antigénios, tais como depósitos de amiloide, incluindo Αβ na doença de Alzheimer, citocinas, tais como TNFa, e IgE. Vacinas
Anticorpos anti-LAG-3 podem ser usados para estimular respostas imunitárias específicas de antigénio por coadministração de um anticorpo anti-LAG-3 com um antigénio de interesse (por exemplo, uma vacina). Consequentemente, em outro aspeto a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, para utilização num método de aumento de uma resposta imunitária a um antigénio num indivíduo, compreendendo administração ao indivíduo: (i) o antigénio; e (ii) um anticorpo anti-LAG-3, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, tal que uma resposta imunitária ao antigénio no indivíduo é aumentada. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo humano anti-LAG-3 humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-LAG-3 humanos descritos no presente documento). Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado. 0 antigénio pode ser, por exemplo, um antigénio tumoral, um antigénio virai, um antigénio bacteriano ou um antigénio de um agente patogénico. Exemplos não limitantes de tais antigénios incluem aqueles discutidos nas seções acima, tais como os antigénios tumorais (ou vacinas tumorais) discutidos acima, ou antigénios dos vírus, bactérias ou outros agentes patogénicos descritos acima.
Vias adequadas de administração das composições de anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunocon jugados) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados pelos peritos na especialidade. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). Dosagens adequadas das moléculas usadas dependerão da idade e peso do indivíduo e a concentração e/ou formulação da composição de anticorpo.
Como anteriormente descrito, anticorpos anti-LAG-3 humanos da invenção podem ser coadministrados com um ou outros mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. 0 anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. No último caso, (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou concorrentemente com o agente ou pode ser coadministrado com outras terapêuticas conhecidas, por exemplo, uma terapêutica anticancro, por exemplo, radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como doxorrubicina (adriamicina), cisplatina, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo, dacarbazina, ciclofosfamida e hidroxiureia que, por si mesmos, são somente eficazes em níveis que são tóxicos ou subtóxicos a um paciente. Cisplatina é intravenosamente administrada como uma dose 100 mg/ml uma vez a cada quatro semanas e adriamicina é intravenosamente administrada como uma dose 60 a 75 mg/ml uma vez a cada 21 dias. Coadministração dos anticorpos anti-LAG-3 humanos, ou fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos, da presente invenção com agentes quimioterápicos fornece dois agentes anticancro que funcionam através de mecanismos diferentes que produzem um efeito citotóxico a células tumorais humanas. Tal coadministração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma modificação na antigenicidade das células tumorais que as tornariam não reativas ao anticorpo.
Também dentro do âmbito da presente invenção estão kits compreendendo as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecificas ou multiespecificas, ou imunoconjugados) e instruções do uso. O kit pode conter ainda pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano tendo uma atividade complementar que se liga a um epitopo no antigénio de LAG-3 distinto do primeiro anticorpo humano). Os kits tipicamente incluem uma etiqueta que indica o uso desejado dos conteúdos do conjunto. O termo etiqueta inclui qualquer escrita, ou material registrado fornecido no ou com o kit, ou que de outra maneira acompanha o kit. Terapêutica de combinação
Em outro aspeto, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização em métodos de terapêutica de combinação na qual um anticorpo anti-LAG-3 é coadministrado com um ou mais anticorpos adicionais que são eficazes na estimulação de respostas imunitárias por meio disso ainda aumentam, estimulam ou regulam para cima respostas imunitárias num indivíduo. Por exemplo, a invenção fornece um método para estimulação de uma resposta imunitária num indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo anti-LAG-3 e um ou mais anticorpos imunoestimulatórios adicionais, tais como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-Ll e/ou um anticorpo anti-CTLA-4, tal que uma resposta imunitária é estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir crescimento tumoral ou estimular uma resposta antiviral. Numa forma de realização, o indivíduo é administrado com um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-1. Em outra forma de realização, o indivíduo é administrado com um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-Ll. Ainda em outra forma de realização, o indivíduo é administrado com um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-CTLA-4. Numa forma de realização, o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo humano, tal como um anticorpo da divulgação. Alternativamente, o anticorpo anti-LAG-3 pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado de um mAb de ratinho anti-LAG-3). Em outra forma de realização, pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional (por exemplo, anticorpo anti-PD-1, anti-PD-Ll e/ou anti-CTLA-4) é um anticorpo humano. Alternativamente, pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado de um anticorpo anti-PD-1, anti-PD-Ll e/ou anti-CTLA-4 de ratinho).
Numa forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização num método para tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro), compreendendo administração do anticorpo de LAG-3 e um anticorpo CTLA-4 a um indivíduo. Em formas de realização adicionais, o anticorpo anti-LAG-3 é administrado numa dose subterapêutica, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado numa dose subterapêutica, ou ambos são administrados numa dose subterapêutica. Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização num método para alteração de um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo administração do anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica do anticorpo anti-CTLA-4 a um indivíduo. Em certas formas de realização, 0 indivíduo é humano. Em certas formas de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 é a anticorpo monoclonal de sequência humana 10D1 (descrito na Publicação PCT WO 01/14424) e o anticorpo anti-LAG-3 é o anticorpo monoclonal de sequência humana, tal como 25F7 descrito no presente documento. Outros anticorpos anti-CTLA-4 englobados pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles revelados em: WO 98/42752; WO 00/37504; Patente U.S No. 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95 (17) :10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22 (145): Abstract No. 2505 (anticorpo CP-675206); e Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304. Em certas formas de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 liga-se a CTLA-4 humano com uma KD de 5 x 1CT8 M ou menos, liga-se a CTLA-4 humano com uma KD de 1 x 1CT8 M ou menos, liga-se a CTLA-4 humano com uma KD de 5 x 1CT9 M ou menos, ou liga-se a CTLA-4 humano com uma KD entre 1 x 1CT8 M e 1 x 1CT10 M ou menos.
Numa forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização num método para tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro), compreendendo administração de um anticorpo de LAG-3 e um anticorpo PD-1 a um indivíduo. Em formas de realização adicionais, o anticorpo anti-LAG-3 é administrado numa dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD- 1 é administrado numa dose subterapêutica, ou ambos são administrados numa dose subterapêutica. Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização num método para alteração de um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo administração do anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica do anticorpo anti-PD-1 a um indivíduo. Em certas formas de realização, o indivíduo é humano. Em certas formas de realização, o anticorpo anti-PD-Ll é um anticorpo monoclonal de sequência humana e o anticorpo anti-LAG-3 é o anticorpo monoclonal de sequência humana, tal como 25F7 descrito no presente documento. Exemplos de anticorpos de sequência humana anti-PD-1 incluem 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 e 4A11, que são descritos na Publicação PCT WO 06/121168. Em certas formas de realização, o anticorpo anti-PD-1 liga-se a PD-1 humano com uma KD de 5 x 1CT8 M ou menos, liga-se a PD-1 humano com uma KD de 1 x 1CT8 M ou menos, liga-se a PD-1 humano com uma KD de 5 x 1CT9 M x ou menos, ou liga-se a PD-1 humano com uma KD entre 1 x 1CT8 M e 1 x 1CT10 M ou menos.
Numa forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização num método para tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro), compreendendo administração do anticorpo LAG-3 e um anticorpo PD-L1 a um indivíduo. Em formas de realização adicionais, o anticorpo anti-LAG-3 é administrado numa dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD-Ll é administrado numa dose subterapêutica, ou ambos são administrados numa dose subterapêutica. Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um método para alteração de um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo administração de um anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica do anticorpo anti-PD-Ll a um indivíduo. Em certas formas de realização, o indivíduo é humano. Em certas formas de realização, o anticorpo anti-PD-Ll é um anticorpo monoclonal de sequência humana e o anticorpo anti-LAG-3 é o anticorpo monoclonal de sequência humana, tal como 25F7descrito no presente documento. Exemplos de anticorpos de sequência humana anti- PD-L1 incluem 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4, que são descritos na Publicação PCT WO 07/005874. Em certas formas de realização, o anticorpo anti-PD-Ll liga-se a PD-L1 humano com uma KD de 5 x 1CT8 M ou menos, liga-se a PD -LI humano com uma KD de 1 x 1CT8 M ou menos, liga-se a PD-L1 humano com uma KD de 5 x 10 9 M ou menos, ou liga-se a PD-L1 humano com uma KD entre 1 x 1CT8 M e 1 x 1CT10 M ou menos. O bloqueio de LAG-3 e um ou mais antigénios alvo secundários, tais como CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 por anticorpos pode aumentar a resposta imunitária a células cancerígenas no paciente. Cancros cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos da divulgação imediata incluem cancros tipicamente responsivos à imunoterapia. Exemplos representativos de cancros para tratamento com a terapêutica de combinação da divulgação imediata incluem aqueles cancros especificamente listados acima na discussão de monoterapia com anticorpos anti-LAG-3.
Em certas formas de realização, a combinação de anticorpos terapêuticos discutidos no presente documento pode ser administrada concorrentemente como uma composição única em veículo farmaceuticamente aceitável, ou concorrentemente como composições separadas com cada anticorpo em veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, a combinação de anticorpos terapêuticos pode ser administrada sequencialmente. Por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4 e um anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tais como anticorpo anti-CTLA-4 sendo administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 após, ou anticorpo anti-LAG-3 sendo administrado primeiro e anticorpo anti-CTLA-4 depois. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo anti-PD-1 e um anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tais como anticorpo anti-PD-1 sendo administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 após, ou anticorpo anti-LAG-3 sendo administrado primeiro e anticorpo anti-PD-1 depois. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo anti-PD-Ll e um anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tais como anticorpo anti-PD-Ll sendo administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 após, ou anticorpo anti-LAG-3 sendo administrado primeiro e anticorpo anti-PD-Ll depois.
Além disso, se mais de uma dose da terapêutica de combinação é administrada sequencialmente, a ordem da administração sequencial pode ser invertida ou mantida na mesma ordem a cada ponto de tempo de administração, administrações sequenciais podem ser combinadas com administrações simultâneas, ou qualquer combinação das mesmas. Por exemplo, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-CTLA-4 e anticorpo anti-LAG-3 pode ser simultânea, a segunda administração pode ser sequencial com anti-CTLA-4 primeiro e anti-LAG-3 após, e a terceira administração pode ser sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-CTLA-4 após, etc. Adicionalmente ou alternativamente, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-PD-1 e anticorpo anti-LAG-3 pode ser simultânea, a segunda administração pode ser sequencial com anti-PD-1 primeiro e anti-LAG-3 após, e a terceira administração pode ser sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-PD-1 após, etc. Adicionalmente ou alternativamente, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-PD-Ll e anticorpo anti-LAG-3 pode ser simultânea, a segunda administração pode ser sequencial com anti-PD-Ll primeiro e anti-LAG-3 após, e a terceira administração pode ser sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-PD-Ll após, etc. Outro esquema de dosagem representativo pode envolver uma primeira administração que é sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-CTLA-4 (e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll) após, e administrações subsequentes podem ser simultâneas.
Opcionalmente, a combinação de anti-LAG-3 e um ou mais anticorpos adicionais (por exemplo, anticorpos anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll) pode ser ainda combinada com um agente imunogénico, tal como células cancerígenas, antigénios tumorais purificados (incluindo proteínas recombinantes, péptidos, e moléculas de hidrato de carbono), células, e células transfectadas com genes que codificam citocinas estimulantes imunes (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28) . Exemplos não limitantes de vacinas tumorais que podem ser usadas incluem péptidos de antigénios de melanoma, tais como péptidos de gplOO, antigénios MAGE, Trp-2, MARTI e/ou tirosinase, ou células tumorais transfectadas para expressar a citocina GM-CSF (discutido ainda abaixo). Um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinados pode ser ainda combinado com um protocolo de vacinação, tal como qualquer um dos protocolos de vacinação discutidos detalhadamente acima com respeito à monoterapia com anticorpos anti-LAG-3.
Um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinados também podem ser ainda combinados com tratamentos de cancro padrão. Por exemplo, um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinados pode ser efetivamente combinado com regimes quimioterápicos. Nestes exemplos, é possível reduzir a dose de outro reagente quimioterápico administrado com a combinação da divulgação imediata (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 5_8: 5301-5304) . Um exemplo de tal combinação é uma combinação de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-Ll ainda em combinação com decarbazina para o tratamento do melanoma. Outro exemplo é uma combinação de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-Ll ainda em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento do melanoma. O argumento lógico científico por trás do uso combinado de bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD- LI com quimioterapia é que a morte celular, que é uma consequência da ação citotóxica da maioria de compostos quimioterápicos, deve resultar em níveis aumentados do antigénio tumoral na via de apresentação de antigénio. Outras terapêuticas de combinação que podem resultar em sinergia com um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD—LI combinados pela morte celular incluem radiação, cirurgia ou privação hormonal. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antigénio tumoral no hospedeiro. Inibidores de angiogénese também podem ser combinados com um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinados. Inibição da angiogénese leva à morte de células tumorais, que podem ser uma fonte de antigénio tumoral alimentadas em vias de apresentação de antigénio do hospedeiro.
Uma combinação de anticorpos de bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 também pode ser usada em combinação com anticorpos biespecíficos que visam células efetoras Fca ou Fcy expressam o recetor a células tumorais (veja-se, por exemplo, Patentes U.S N° . 5.922.845 e 5.837.243). Anticorpos biespecíficos podem ser usados para visar dois antigénios separados. 0 braço de células T destas respostas seria aumentado com o uso de um bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinados.
Em outro exemplo, uma combinação de anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-Ll pode ser usada em conjunto com anticorpos antineoplásicos, tais como Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar (tositumomab) , Zevalm (íbritumomab) , Campath (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab), Avastin® (bevacizumab) e Tarceva® (erlotinib), e semelhantes. Por meio de exemplo e não desejando estar ligado por teoria, tratamento com um anticorpo anticancro ou um anticorpo anticancro conjugado a uma toxina pode levar à morte de célula de cancro (por exemplo, células tumorais) que potencializaria uma resposta imunitária mediada por CTLA-4, PD-1, PD—LI ou LAG-3. Numa forma de realização exemplar, um tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, um tumor cancerígeno) pode incluir um anticorpo anticancro em combinação com anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll, concorrentemente ou sequencialmente ou qualquer combinação dos mesmos, que pode potencializar respostas imunitárias antitumorais pelo hospedeiro.
Os tumores escapam da imunovigilância do hospedeiro por uma grande variedade de mecanismos. Muitos destes mecanismos podem ser superados pela inativação de proteínas, que são expressas pelos tumores e que são imunossupressoras. Estas incluem, entre outras, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), e ligante Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Em outro exemplo, os anticorpos para cada uma destas entidades podem ser ainda combinados com uma combinação de anticorpo anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll para neutralizar os efeitos de agentes imunossupressores e favorecer respostas imunitárias antitumorais pelo hospedeiro.
Outros anticorpos que podem ser usados para ativar a sensibilidade imunitária do hospedeiro podem ser ainda usados em combinação com uma combinação de anticorpo anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll. Estes incluem moléculas na superfície de células dendriticas que ativam função de DC e apresentação de antigénio. Anticorpos anti-CD40 (Ridge et al., supra) podem ser usados em conjunto com uma combinação de anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll (Ito et al. , supra) . Outros anticorpos de ativação para moléculas coestimuladoras de célula T (Weinberg et al., supra, Melero. supra, Hutloff et al. , supra) também podem fornecer níveis aumentados da ativação de células T.
Como discutido acima, o transplante de medula óssea está a ser atualmente usado para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiética. Um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinados pode ser usado para aumentar a eficácia das células T especificas para tumores enxertados do dador. Vários protocolos de tratamento experimentais envolvem ativação ex vivo e expansão de células T especificas para antigénio e transferência adotiva destas células em recipientes para células T antigénioespecifica de antigénios contra tumor (Greenberg & Riddell, supra). Estes métodos também podem ser usados para ativar respostas de células T para agentes infeciosos, tais como CMV. Ativação ex vivo na presença de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll pode ser esperado aumentar a frequência e atividade das células T adotivamente transferidas.
Em certas formas de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-LAG-3 da invenção para utilização num método para alterar um evento adverso associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, cancro) com um agente imunoestimulatório, compreendendo administração do anticorpo anti-LAG-3 e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll a um indivíduo. Por exemplo, a incidência de colite induzida pelo anticorpo de terapêutica imunoestimulatória ou diarreia pode ser reduzida pela administração de um esteroide não absorvível ao paciente. Como qualquer paciente que receberá um anticorpo terapêutico imunoestimulatório está em risco de desenvolver colite ou diarreia induzida por tal anticorpo, esta população de pacientes inteira é adequada para a terapêutica de acordo com os métodos da presente invenção. Embora os esteroides tenham sido administrados para tratar a doença intestinal inflamatória (IBD) e prevenir exacerbações de IBD, não foram usados para impedir (reduzir a incidência de) IBD em pacientes que não foram diagnosticados com IBD. Os efeitos colaterais significantes associados com esteroides, mesmo esteroides não absorvíveis, desencorajaram uso profilático.
Em formas de realização adicionais, um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 de combinação (isto é, anticorpos terapêuticos imunoestimulatórios anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-L1) podem ser ainda combinados com o uso de qualquer esteroide não absorvível. Como usado no presente documento, um "esteroide não absorvível" é um glucocorticoide que exibe o primeiro metabolismo de primeira passagem tal que, após metabolismo no fígado, a biodisponibilidade do esteroide seja baixa, isto é, menos de aproximadamente 20%. Numa forma de realização da invenção, o esteroide não absorvível é budenosida. Budenosida é um glucocorticoesteroide que atua localmente, que é extensivamente metabolizado, principalmente pelo fígado, após administração oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) é uma formulação oral dependente de pH e de tempo da budenosida desenvolvida para otimizar a entrega de fármaco ao íleo e em todas as partes do cólon. ENTOCORT EC® é aprovado nos Estados Unidos para o tratamento de doença de Crohn leve a moderada que envolve o íleo e/ou cólon ascendente. A dosagem oral habitual de ENTOCORT EC® para o tratamento da doença de Crohn é 6 a 9 mg/dia. ENTOCORT EC® é libertado nos intestinos antes de ser absorvido e conservado na mucosa intestinal. Uma vez que passa pelo tecido alvo da mucosa intestinal, ENTOCORT EC® é extensivamente metabolizada pelo sistema de citocromo P450 no fígado a metabolitos com atividade de glucocorticoide insignificante. Por isso, a biodisponibilidade é baixa (aproximadamente 10%) . A baixa biodisponibilidade da budenosida resulta numa proporção terapêutica melhorada comparada com outros glucocorticoides com o metabolismo de primeira passagem menos extenso. Budenosida resulta em menos efeitos adversos, incluindo menos supressão hipotalâmico-pituitária, do que corticosteroides atuando sistemicamente. Entretanto, administração crónica de ENTOCORT EC® pode resultar em efeitos de glucocorticoide sistémicos, tais como hipercorticismo e supressão adrenal. Veja-se PDR 58th ed. 2004; 608-610.
Ainda em formas de realização adicionais, um bloqueio de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 de combinação (isto é, anticorpos terapêuticos imunoestimulatórios anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll) em conjunto com um esteroide não absorvível podem ser ainda combinados com um salicilato. Salicilatos incluem agentes 5-ASA tais como, por exemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc); e mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc; ROWASA®, Solvay).
Conforme as utilizações médicas da presente invenção, um salicilato administrado em combinação com anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll e um esteroide não absorvível pode incluir qualquer sobreposição ou administração sequencial do salicilato e o esteroide não absorvível para fins de redução da incidência da colite induzida pelos anticorpos imunoestimulatórios. Dessa forma, por exemplo, métodos para redução da incidência da colite induzida pelos anticorpos imunoestimulatórios de acordo com a presente invenção englobam a administração de um salicilato e um não absorvível concorrentemente ou sequencialmente (por exemplo, um salicilato é administrado 6 horas após um esteroide não absorvível), ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, de acordo com a presente invenção, um salicilato e um esteroide não absorvível podem ser administrados pela mesma via (por exemplo, ambos são administrados oralmente) ou por vias diferentes (por exemplo, um salicilato é administrado oralmente e um esteroide não absorvível é administrado retalmente), que pode diferenciar-se da(s) via(s) usada(s) para administrar os anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-Ll. A presente divulgação é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitação adicional.
Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra LAG-3
Anticorpos monoclonais humanos anti-LAG-3 foram gerados usando ratinhos transgénicos que expressam genes de anticorpo humano, como se segue.
Antigénios
Proteínas de fusão de LAG-3 humano recombinante foram usadas como o imunogénio para originar anticorpos LAG-3 anti-humano. Em certas imunizações, uma proteína de fusão compreendendo a região extracelular completa (domínios 1 a 4) de LAG-3 humano fusionado a um domínio de Fc de imunoglobulina humana (R&D Systems, Catálogo #2319-L3) (Dl-D4 hFc) ou um domínio Fc de imunoglobulina de ratinho (Dl-D4 mFc) foi usada como o imunogénio. Para outras imunizações, uma proteína de fusão compreendendo somente os dois primeiros domínios extracelulares de LAG-3 humano fusionados a um domínio Fc de imunoglobulina de ratinho (D1-D2 mFc) foi usada como o imunogénio. As proteínas de fusão de LAG-3 foram preparadas usando técnicas de ADN recombinante padrão.
Ratinho KM™ Transcromossómico Transgénico e Estirpes de Ratinho KM/FCGR2D™
Anticorpos monoclonais totalmente humanos para LAG-3 humano foram preparados usando os ratinhos de estirpes de Ratinho KM™ e de Ratinho KM/FCGR2D™ transcromossómicos transgénicos, que expressam genes de anticorpo humanos.
Na linha de Ratinho KM™, o gene de cadeia leve de ratinho endógeno kappa foi homozigotamente alterado como descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 e o gene de cadeia pesada de ratinho endógeno foi homozigotamente interrompido como descrito no exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Além disso, esta estirpe de ratinho transporta um transgene de cadeia leve kappa humana, KCo5, como descrito em Fishwild et al., supra. A estirpe também contém o transcromossoma SC20, que transporta o locus de cadeia pesada de Ig humana, como descrito na Publicação PCT WO 02/43478. A estirpe de Ratinho KM/FCGR2D™ é a mesma como a estirpe Ratinho KM™ exceto que o seu genoma também compreende uma alteração homozigótica do gene FcyRIIB endógeno. As estirpes de Ratinho KM™ e de Ratinho KM/FCGR2D™ também são descritas em detalhes na Publicação de Patente U.S No. 20020199213.
Imunizações de Ratinho KM™ e Ratinho KM/FCGR2D™:
Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para LAG-3, ratinhos de estirpes de Ratinho KM™ e Ratinho KM/FCGR2D™ foram imunizados com uma das três proteínas de fusão de LAG-3 recombinantes diferentes descritas acima (D1-D4 hFc, D1-D4 mFc, D1-D2, mFc) . Esquemas de imunização gerais são descritos em Lonberg et al. (1994) supra; Fishwild et al., supra e Publicação PCT WO 98/24884. Ratinhos tinham de 6 a 16 semanas de idade na primeira infusão de antigénio. Os ratinhos foram imunizados intraperitonialmente (IP) e/ou subcutaneamente (SC) . Os ratinhos foram imunizados a cada duas semanas quatro vezes com 10 pg da proteína de fusão de LAG-3 recombinante, seguida pela imunização duas vezes com 20 pg do mesmo imunogénio em Ribi como um adjuvante. A resposta imunitária foi monitorizada por sangramento retro-orbital. O plasma foi rastreado por ELISA (como descrito abaixo), e os ratinhos com títulos suficientes da imunoglobulina humana anti-LAG-3 foram usados para fusões. Antes de sacrifício e remoção dos baços, os ratinhos foram reforçados intravenosamente e intraperitonialmente com 20 pg do antigénio seguido por um reforço intravenoso subsequente com 20 pg do antigénio.
Seleção de Ratinhos KM e KM/FCGR2D que Produzem Anticorpos Anti-LAG-3
Para selecionar ratinhos que produzem anticorpos que se ligaram a proteína LAG-3, soros de ratinhos imunizados com o D1-D4 hFc proteína de fusão foram testados por um ELISA modificado como originalmente descrito por Fishwild et al. (1996) . Resumidamente, as placas de microtitulação foram revestidas com proteína de fusão de LAG-3 recombinante purificada em 1 pg/ml em PBS, 50 pl/poços incubados a 4°C por uma noite, em seguida bloqueadas com 200 pl/poço de BSA 5% em PBS. Diluições de plasma de ratinhos imunizados com LAG-3 foram adicionados a cada um dos poços e incubados por 1 a 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e em seguida incubadas com um anticorpo policlonal conjugado de cadeia leve kappa de cabra anti-humano com Peroxidase de Rábano Silvestre (HRP) por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram reveladas com substrato ABTS e analisadas pelo espectrofotómetro em OD 405.
Para ratinhos imunizados com proteínas de fusão D1-D4 mFc ou D1-D2 mFc, soros destes ratinhos foram testados por ELISA indireto usando IgG de cabra anti-ratinho para revestir as placas por uma hora antes do revestimento com o antigénio para eliminar a ligação não especifica à parte Fc de ratinho. Então as mesmas etapas de ELISA como descrito acima foram realizadas.
Os ratinhos que desenvolveram os títulos mais altos de anticorpos anti-LAG-3 foram usados para fusões. Fusões foram realizadas como descrito abaixo e sobrenadantes de hibridoma foram testados para atividade anti-LAG-3 por ELISA.
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos para Proteínas LAG-3
Os esplenocitos de ratinho, isolados de ratinhos KM ou KM/FCGR2D, foram fusionados por eletrofusão baseada em campo elétrico usando um eletroporador de fusão de célula de câmara ampla Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc, Glen Burnie, MD) a uma linha celular de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes então foram rastreados para a produção de anticorpos antigénio-específicos. Suspensões celulares únicas de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados foram fusionadas a um quarto de células de mieloma de ratinho P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580) não secretoras. As células foram colocadas em placas em aproximadamente 1 x 105/poço na placa de microtítulo de fundo plano, seguida por incubação de aproximadamente duas semanas em meio seletivo contendo soro fetal de bezerro 10%, suplementado com origen (IGEN) em RPMI, L-glutamina, piruvato de sódio, HEPES, penicilina, estreptamicina, gentamicina, HAT lx e β-mercaptoetanol. Após 1 a 2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído por HT. Poços individuais foram então rastreados por ELISA (descrito acima) para anticorpos IgG monoclonais anti-LAG-3 humano. Uma vez que ocorreu o extenso crescimento de hibridomas, o meio foi monitorizado normalmente após 10 a 14 dias. Os hibridomas secretando anticorpos foram colocados em placas novamente, rastreados novamente e, se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-LAG-3 foram subclonados pelo menos duas vezes por limitação de diluição. Os subclones estáveis foram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades do anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização adicional.
Clones de hibridoma 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 foram selecionados para análise e sequenciação adicionais .
Exemplo 2: Caracterização Estrutural de Anticorpos
Monoclonais Anti-LAG-3 Humanos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5
As sequências de cADN que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos mAbs expressos pelos clones 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5, como descrito no exemplo 1, foram sequenciadas usando o seguinte protocolo. ARN total foi preparado de 5 x 106 células de hibridoma usando o Conjunto Mini RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). cADN foi preparado pelo protocolo 5'-RACE com Conjunto de Amplificação SMART RACE cADN (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) e Transcriptase Reversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Regiões V de cada anticorpo foram amplificadas usando um iniciador 3' de região constante humano-específica, pareado com mistura de iniciador universal 5' RACE. Produtos de PCR contendo a
região V foram clonados no vetor pCR4-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados em cepa de E. coli TOPIO (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Amostras de ADN miniprep ou Templiphi (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, EUA) foram preparadas, e submetidas à sequenciação de ADN (Sequetech, Mountain View, CA). As sequências de ADN resultantes foram analisadas para rearranjos na estrutura e outras características de anticorpo. As proteínas expressas foram caracterizadas pela análise de química proteica padrão. Os clones 125E3, 25F7 e 26H10 foram encontrados como expressando um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de IgGl e uma cadeia leve kappa, ao passo que os clones 8B7 e 17E5 foram encontrados como expressando um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de IgG4 e uma cadeia leve kappa e o clone 11F2 foi encontrado como expressando um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de
IgG2 e uma cadeia leve kappa.
As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 25F7 são mostradas na figura IA e na SEQ ID NO: 49 e 37, respetivamente. As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve kappa de 25F7 são mostradas na figura IB e na SEQ ID NO: 55 e 43, respetivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 25F7 a sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 7) mostrou que a cadeia pesada de 25F7 utiliza um segmento de VH da linha germinativa humana VH 4-34 (SEQ ID NO:61), e um segmento de JH da linha germinativa humana JH5b (SEQ ID NO:62). Análise adicional da sequência de VH de 25F7 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 como mostrado na figura IA e nas SEQ ID NOs: 1, 7 e 13, respetivamente. Comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 25F7 às sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 8) mostrou que a cadeia leve kappa 25F7 utiliza um segmento VK da linha germinativa humana VK L6 (SEQ ID NO: 63) e um segmento JK da linha germinativa humana JK 2 (SEQ ID NO: 64) . Análise adicional da sequência VK de 25F7 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 como mostrado na figura 1B e nas SEQ ID NOs: 19, 25 e 31, respetivamente.
As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 26H10 são mostradas na figura 2A e nas SEQ ID NO: 50 e 38, respetivamente. As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 26H10 são mostradas na figura 2B e em SEQ ID NO: 56 e 44, respetivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 26H10 a sequências da cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 9) mostrou que a cadeia pesada de 26H10 utiliza um segmento de VH da linha germinativa humana VH 3-33 (SEQ ID NO:65), e um segmento de JH da linha germinativa humana JH 6B (SEQ ID NO:66). Análise adicional da sequência de VH de 26H10 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada como mostrado na figura 2A e nas SEQ ID NOs: 2, 8 e 14, respetivamente. Comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 26H10 às sequências da cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humanas conhecida (figura 10) mostrou que a cadeia leve kappa de 26H10 utiliza um segmento de Vk da linha germinativa humana VK A27 (SEQ ID NO: 67) e um segmento de JK da linha germinativa humana JK 3 (SEQ ID NO:68). Análise adicional da sequência de Vk de 26H10 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve como mostrado na figura 2B e nas SEQ ID NOs: 20, 26 e 32, respetivamente.
As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 25E3 são mostradas na figura 3A e nas SEQ ID NO: 51 e 39, respetivamente. As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 25E3 são mostradas na figura 3B e nas SEQ ID NO: 57 e 45, respetivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 25E3 a sequências da cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 11) mostrou que a cadeia pesada de 25E3 utiliza um segmento de VH da linha germinativa humana VH 3-20 (SEQ ID NO:69), e um segmento de JH da linha germinativa humana JH 4b (SEQ ID NO:70). Análise adicional da sequência de VH de 25e3 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada como mostrado na figura 3A e nas SEQ ID NOs: 3, 9 e GGY, respetivamente. Comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia levede 25E3 a sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 12) mostrou que a cadeia leve kappa 25E3 utiliza um segmento de Vk da linha germinativa humana VK L18 (SEQ ID NO:71) e um segmento Jk da linha germinativa humana JK 2 (SEQ ID NO: 64) . Análise adicional da sequência de Vk de 25E3 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve como mostrado na figura 3B e nas SEQ ID NOs: 21, 27 e 33, respetivamente.
As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 8B7 são mostradas na figura 4A e nas SEQ ID NO: 52 e 40, respetivamente. As sequências nucleotidicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 8B7 são mostradas na figura 4B e nas SEQ ID NO: 58 e 46, respetivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de 8B7 a sequências da cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 13) mostrou que a cadeia pesada de 8B7 utiliza um segmento de VH da linha germinativa humana VH 4-34 (SEQ ID NO:61), e um segmento de JH da linha germinativa humana JH 5B (SEQ ID NO:62). Análise adicional da sequência de VH de 8B7 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada como mostrado na figura 4A e nas SEQ ID NOs: 4, 10 e 16, respetivamente. Comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de 8B7 (figura 14) a sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humanas conhecidas mostrou que cadeia leve kappa de 8B7 utiliza um segmento de Vk da linha germinativa humana VK L6 (SEQ ID NO: 63) e um segmento de JK da linha germinativa humana JR 4 (SEQ ID NO:72) . Análise adicional da sequência de Vk de 26H10 usando o sistema Rabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve como mostrado na figura 4B e nas SEQ ID NOs: 22, 28 & 34, respetivamente.
As sequências nucleotídicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 11F2 são mostradas na figura 5A e nas SEQ ID NO: 53 e 41, respetivamente. As sequências nucleotídicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 11F2 são mostradas na figura 5B e nas SEQ ID NO: 59 e 47, respetivamente. Comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada de 11F2 a sequências da cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 15) mostrou que a cadeia pesada de 11F2 utiliza um segmento de VH da linha germinativa humana VH 1-24 (SEQ ID NO:73), um segmento de D da linha germinativa humana 2-15, e um segmento de JH da linha germinativa humana JH 4B (SEQ ID NO:70). Análise adicional da sequência de VH de 11F2 usando o sistema Rabat da determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada como mostrado na figura 13A e nas SEQ ID NOs: 5, 11 e 17, respetivamente. Comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve de 11F2 a sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 16) mostrou que a cadeia leve kappa de 11F2 utiliza um segmento de Vk da linha germinativa humana VK L6 (SEQ ID NO: 63) e um segmento de JK da linha germinativa humana JK 1 (SEQ ID NO:74). Análise adicional da sequência de Vk de 11F2 usando o sistema Rabat da determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve como mostrado na figura 5B e nas SEQ ID NOs: 23, 29 e 35, respetivamente.
As sequências nucleotídicas e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 17E5 são mostradas na figura 6A e nas SEQ ID NO: 54 e 42, respetivamente. As sequências nucleotídicas e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 17E5 são mostradas na figura 6B e nas SEQ ID NO: 60 e 48, respetivamente. Comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada de 17E5 a sequências da cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (figura 17) mostrou que a cadeia pesada de 17E5 utiliza um segmento de VH da linha germinativa humana VH 3-33 (SEQ ID NO: 65), um segmento de D da linha germinativa humana 2-2, e um segmento de JH da linha germinativa humana JH 4B (SEQ ID NO:70) . Análise adicional da sequência de VH de 17E5 usando o sistema Rabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada como mostrado na figura 6A e nas SEQ ID NOs: 6, 12 e 18, respetivamente. Comparação do 17E5 a sequência de imunoglobulina de cadeia leve a sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinativa humana conhecida (Figura 18) mostrou que a cadeia leve de 17E5 kappa utiliza um segmento de Vk da linha germinativa humana VK L6 (SEQ ID NO: 63) e um segmento de JK da linha germinativa humana JK 5 (SEQ ID NO:75). Análise adicional da sequência de Vk de 17E5 usando o sistema Rabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve como mostrado na figura 6B e nas SEQ ID NOs: 24, 30 e 36, respetivamente.
As regiões variáveis de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 podem ser convertidas em anticorpos de comprimento completo de qualquer isotipo desejado usando técnicas padrão de ADN recombinante. Por exemplo, ADN que codifica regiões VH e VL pode ser clonado num vetor de expressão que transporta regiões constantes de cadeia pesada e leve tal que as regiões variáveis sejam operacionalmente ligadas às regiões constantes. Alternativamente, vetores separados podem ser usados para a expressão da cadeia pesada completa e da cadeia leve completa. Exemplos não limitantes de vetores de expressão adequados para uso na criação de anticorpos de comprimento completo incluem os vetores pIE descritos na Publicação de Patente Americana No. 20050153394.
Exemplo 3: Caracterização de Propriedades de Ligação de Anticorpos Monoclonais LAG-3
Neste exemplo, a ligação de anticorpos anti-LAG-3 humanos a LAG-3 de superfície celular (LAG-3 humano, de macaco e de ratinho) foi examinada por citometría de fluxo. Além disso, cinética de ligação a LAG-3 foi analisada por análise de BIACORE. 0 mapeamento de epítopos foi conduzido usando uma experiência de varrimento de péptidos. A. Estudos de Citometría de fluxo 1. Ligação Celular de CHO a LAG-3 humano
Para testar a capacidade dos anticorpos de ligar-se à proteína LAG-3 de superfície celular, os anticorpos foram incubados com uma linha de célula CHO que tinha sido transfectada para expressar LAG-3 humano na superfície celular. Os anticorpos monoclonais 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 foram diluídos em série com tampão gelado PFAE lx (PBS lx + FBS 2%, azida de sódio 0,02%, Na EDTA 2 mM) . Para a reação de ligação, 50 μΐ da solução de anticorpo diluída foram adicionados a 50 μΐ de uma suspensão celular contendo 2 x 105 células e a mistura foi incubada em gelo durante 30 minutos. As células então foram lavadas duas vezes com tampão PFAE lx. Uma diluição 1:100 de anticorpo de cabra anti cadeia leve kappa humana marcado com FITC (Bethyl Laboratories, Inc, Cat. número A80-115F) foi adicionada e a mistura foi incubada por 30 minutos a 4°C, seguida de lavagem duas vezes com tampão PFAE gelado lx. Após lavagem final, 150 μΐ de PFAE lx gelado contendo iodeto de propídio 10 pg/mL (Roche Applied Science, Cat número 1_348_639) foram adicionados a cada solução e a análise da ligação de anticorpo foi realizada por citometría de fluxo usando um citómetro de fluxo FACScalibur (BD Bioscience).
Os resultados da análise de citometría de fluxo são resumidos abaixo na tabela 1, que mostra CE50 para ligação a LAG-3 CHO-humano, demonstrando que 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 e 17E5 ligam-se efetivamente a LAG-3 humano na superfície celular, com 25F7 tendo uma CE50 aproximadamente 20 vezes menor que 25E3, mas CE50 aproximadamente equivalente àquela de 8B7 e 26H10. Os resultados de CE50 para 11F2 e 17E5 estavam na mesma faixa em relação a 25E3.
Tabela 1: Ligação de Anticorpos Anti-LAG-3 a Células CHO _que Expressam
LAG-3 Humano_ 2. Ligação de Célula T CD4+ humana ativada
Para testar a capacidade dos anticorpos de ligar-se a LAG-3 humano nativo na superfície de células T humanas ativadas, células T CD4+ em repouso foram isoladas de células mononucleares do sangue periférico purificado e submetidas a três dias de estimulação com uma combinação de anticorpos anticD3 e anticD28 fixos a esferas de poliestireno. Os anticorpos monoclonais 25F7, 8B7 e 26H10 foram diluídos em série com tampão PFAE lx gelado (PBS lx + FBS 2%, azida de sódio 0,02%, Na EDTA 2 mM). Para a reação de ligação, 50 μΐ da solução de anticorpo diluída foram misturados com 50 μΐ de CD4 anti-humano marcado com PE (BD Bioscience, Cat número 555347) . Células T ativadas foram processadas pelo mesmo protocolo descrito acima. A análise da ligação de anticorpo foi conduzida como descrito acima.
Os resultados da análise de citometría de fluxo são resumidos abaixo na tabela 2, que mostra CE50 para ligação a células T CD4+ humanas ativadas, demonstrando que os três anticorpos se ligam de forma semelhante a LAG-3 humano de superfície celular.
Tabela 2; Ligação de Anticorpos Anti-LAG-3 a Células T CD4+ humanas Ativadas
3. Ligação ao Antigénio de LAG-3 de Macaco
Para determinar se os anticorpos anti-LAG-3 reagem de forma cruzada com LAG-3 de macaco, uma sequência de cADN foi clonada por RT-PCR de uma preparação de cADN agrupado preparado por transcrição reversa de ARNs de uma recolha de amostras teciduais de macaco cinomolgus e rhesus. A sequência foi primeiro amplificada dos iniciadores usando agrupamento de cADN (iniciador de sentido direto 5': 5Mcynl408; 5'- atgtgggaggctcagttcctg-3' (SEQ ID NO: 91) e iniciador de sentido reverso 3': 3Mcynl408a; 5'-gtcagagctgctccggctc-3'
(SEQ ID NO: 92)) usando um sistema de amplificação por PCR rico em GC (Roche) e foi clonada num vetor de clonagem TOPO do recipiente (Invitrogen) para análise de sequência. Clones que combinam com a sequência de LAG-3 de macaco rhesus de referência no Genbank (No. de Acesso no Genbank XM_001108923) foram posteriormente reamplifiçados do ADN de vetor de clonagem TOPO e utiliza um segundo conjunto de iniciadores que incorporaram sítios de enzima de restrição da clonagem direcional num vetor de expressão celular mamífero.
Clone de LAG-3 pa23-5 macaco foi isolado e sequenciado. A sequência de macaco isolada exibiu identidade de 99,6% à sequência de LAG-3 de macaco rhesus de referência no Genbank. Uma comparação da sequência de aminoácidos de clone de cADN pa23-3 (SEQ ID NO: 93) com LAG-3 de macaco rhesus (SEQ ID NO: 94) no Genbank (Acesso
No. XM_001108923) é mostrado na Figura 19. As duas sequências são idênticas exceto uma diferença de aminoácido na posição 419 (arginina no clone pa23-5 versus treonina na sequência de rhesus no Genbank) e nesta base conclui-se que clone de cADN pa23-5 representa a sequência génica de LAG-3 de rhesus. 0 cADN do clone pa23-5 foi inserido numa construção de expressão, que foi transfectada em células de suspensão CHO-S por nucleofecção (Amaxa). Expressão de LAG-3 de rhesus de por classificado, a seleção clones resistentes ao fármaco foi verificada pela análise FACS. Esta linha celular de CHO clonal que sobre-expressa rhesus LAG-3 foi usado em FACS semelhante analisa aos descritos acima para medir a reatividade de cruzamento de anticorpo à proteína de macaco. Resumidamente, anticorpos monoclonais 25F7, 8B7 e 26H10 foram diluídos em série com tampão PFAE lx gelado (PBS lx + FBS 2%, azida de sódio 0,02%, Na EDTA 2 mM). Para a reação de ligação, 50 μΐ da solução de anticorpo diluída foram adicionados a 50 μΐ de uma suspensão celular contendo 2 x 105 células e a mistura foi incubada em gelo por 30 minutos. As células foram processadas pelo mesmo protocolo descrito acima. A análise da ligação de anticorpo foi conduzida como descrito acima.
Numa experiência separada, os anticorpos foram testados para ligação a LAG-3 de macaco cinomolgus usando células T de macaco cinomolgus ativada. Ativação in vitro destas de células T de macaco foi alcançada por tratamento das células T anti-CD3/anti-CD28 por essencialmente o mesmo protocolo descrito acima para a ativação in vitro de células T humanas, seguido pela análise de citometría de fluxo realizada como descrito acima para marcação de células T CD4+ humano in vitro ativadas.
Os resultados das análises de citometría de fluxo usando células LAG-3 CHO-rhesus e as células T de cinomolgus ativadas são resumidos abaixo na Tabela 3, que mostra CE50 para ligação a dois tipos diferentes de células expressando LAG-3 de macaco. Estes resultados mostraram que todos os anticorpos ligam-se efetivamente tanto a LAG-3 nas células T de cinomolgus ativadas como a LAG-3 de rhesus (SEQ ID NO: 93) transfectadas em células CHO. Há uma hierarquia, no entanto, de afinidades de ligação, com clone 26H10 mostrando afinidade mais alta, que é aproximadamente 2,5 e 6 vezes melhor do que aquela dos clones 8B7 e 25F7, respetivamente. A diferença na hierarquia de ligação entre dois tipos celulares pode refletir diferenças da sequência de aminoácidos entre proteínas LAG-3 de rhesus e cinomolgus.
Tabela 3: Ligação de Anticorpos Anti-LAG-3 a LAG-3 de
Macaco
4. Ligação ao Antigénio de LAG-3 de Ratinho
Para determinar se os anticorpos reagem de forma cruzada com LAG-3 de ratinho, estudos de citometría de fluxo semelhantes àqueles descritos acima foram realizados usando como célula-alvo uma linha celular de hibridoma de célula T de ratinho (3A9) que foi transfectada para expressar LAG-3 de ratinho em sua superfície celular, seguida pela análise por FACS para detetar ligação de anticorpo. Os resultados indicaram que, em contraste com um anticorpo controlo anti-LAG3 de ratinho controlo que não mostrou marcação forte, nenhum dos anticorpos humanos 25E3, 25F7, 8B7 ou 26H10 exibiram ligação acima de níveis de referência a LAG-3 de superfície celular de ratinho, demonstrando que nenhum destes anticorpos reage de forma cruzada com LAG-3 de ratinho.
B. Análise BIACORE A ligação dos anticorpos 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 e 17E5 à proteína LAG-3 recombinante foi examinada por BIAcore® usando um método de captura. Os anticorpos 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 e 17E5 cada um foram capturados usando anti-CHl, um anticorpo de reagente que é específico em direção à região 1 constante da cadeia pesada do anticorpo humano (Zymed, Clone HP6045, Cone. mãel,0 mg/mL). Anti-CHl foi revestido num chip CM5 (BR-1000-14, Research Grade) de alta densidade (9700-1150ORUs). O revestimento foi realizado com base no procedimento de imobilização padrão recomendado pelo fabricante. O anticorpo 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 ou 17E5 purificado, com concentrações nos limites de 0,5 a 3 pg/mL, então foi capturado na superfície revestida com anti-CHl no fluxo de 10 pL/min por 1 minuto. Uma concentração única da proteína de fusão de LAG-3 humano recombinante (20 nM) foi injetada sobre o anticorpo capturado por 3 minutos a uma taxa de fluxo de 25 pg/mL. Permitiu-se que o antigénio se dissociasse durante 7,5 minutos. A superfície de chip foi regenerada após cada ciclo com 25 pL de NaOH 25 mM seguidos por 30 pL de lavagem HBS-EP. Controlos de isotipo foram corridos no chip, e os dados usados para subtrair ligação não específica. Todas as experiências foram realizadas num instrumento de ressonância de plasmón de superfície Biacore 3000, usando o programa BIAcore Control v 3.2. A análise de dados foi realizada usando o programa BiaEvaluation v 3.2. Os resultados são mostrados na tabela 4 abaixo. Os resultados de BIAcore para 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 e 17E5 confirmam os resultados de citometría de fluxo que os cinco anticorpos são capazes de ligação com alta afinidade a LAG-3 humano.
Tabela 4: Cinética de Ligação do Anticorpo Anti-LAG-3 a LAG-3 Humano Recombinante
C. Mapeamento de Epitopos
Na proteína LAG-3, o primeiro domínio semelhante à imunoglobulina da região extracelular contém uma "ansa exposta" extra tendo a sequência de aminoácidos: GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 79) . Para examinar a ligação de 25E3, 25F7, 8B7 e 26H10 a esta região de LAG-3, e mapear o epítopo ligado por cada anticorpo, uma experiência de varrimento de péptido foi realizada através desta região. Uma série de 10 péptidos de sobreposição que se varreram através do comprimento completo da sequência de ansa extra foi preparada e conjugada à biotina. Para análise de ELISA, placas de microtitulação pré-revestidas com estreptavidina (Sigma-Aldrich, Cat número M5432) foram usadas para capturar os conjugados do péptido de ansa biotinilados aplicados num volume de 100 μΐ numa concentração de 2 pg/mL e incubadas por 18 horas a 4°C, após as quais as placas foram lavadas 3 vezes e bloqueadas à temperatura ambiente por 1 hora com bloqueio de tampão (PBS lx + FBS 10%). A seguir, anticorpos anti-LAG-3 humanos diluídos em série 3 vezes em tampão de bloqueio a partir de 10 pg/mL foram aplicados e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas e em seguida lavadas três vezes. Para detetar o anticorpo humano ligado, um de anticorpo de cabra anti-cadeia leve kappa humana conjugado a HRP (Bethyl Laboratories, Cat #A80-115P) foi diluído a 1 pg/mL no tampão de bloqueio e aplicado a poços de ensaio por 1 hora seguida por três lavagens e aplicação de substrato TMB (eBioscience, Cat número 00-4201-56) . Leituras de densidade ótica em comprimento de onda de 650 nm foram feitas num espectrofotómetro Spectramax 340PC (Molecular Dynamics, Inc.). Os resultados da experiência de varrimento de péptido estão resumidos abaixo na tabela 5.
Tabela 5: Ligação de Anticorpo Anti-LAG ao Varrimento de _Péptido da Ansa Extra de LAG-3_
Com base nestes resultados, foi determinado que o anticorpo 25E3 reconheceu uma região dentro da ansa extracelular compreendendo a sequência de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76), ao passo que o anticorpo 25F7 reconheceu uma região dentro da ansa extra compreendendo a sequência de aminoácidos HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) e 8B7 pareceu reconhecer uma região dentro da ansa extracelular compreendendo a sequência de aminoácidos PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). Ao contrário, nenhuma ligação de péptido completo de ansa extra ou qualquer um dos péptidos de varredura mais curtos pode ser detetada pelo anticorpo 26H10.
As regiões identificadas neste estudo estão sublinhadas na sequência de ansa extra completa:
Dessa forma, os resultados do varrimento de péptido indicam que os anticorpos 25E3, 25F7 e 8B7 se ligam a epítopos diferentes embora estritamente localizados dentro de LAG-3 humano .
Para examinar ainda a ligação destes anticorpos à região de péptido de ansa extra, ensaios de ELISA adicionais foram realizados. Num ensaio de ELISA usando o péptido de ansa completo humano extra (SEQ ID NO: 79), valores de CE50 para ligação foram determinados para 25E3, 25F7 e 8B7. Adicionalmente, um péptido semelhante ELISA foi conduzido usando a sequência de péptido de ansa completo extra de LAG-3 de macaco rhesus, tendo a sequência GPPAPAPGHPPAPGHRPAAP YSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 90), e valores de CE50 da ligação foram determinados para 25F7 e 8B7. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 6. Os resultados confirmam que anticorpos 25E3, 25F7 e 8B7 são capazes de reconhecimento da região de péptido de LAG-3 humano de ansa extra. Além disso, os anticorpos 25F7 e 8B7 também se ligam à região de péptido de LAG-3 de rhesus de ansa extra, embora bem menos em comparação à sequência humana, que pode ser devido à divergência de sequência de espécies neste polipéptido. Os resultados também confirmam que o anticorpo 26H10 não é capaz de reconhecer o péptido de ansa extra de LAG-3.
Tabela 6: Ligação de Anticorpos Anti-LAG-3 a Péptido de Ansa Extra LAG-3 Humano e de Rhesus
Exemplo 4: Inibição da Ligação de LAG-3 a MHC classe II por mAbs Anti-LAG-3
Para testar a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 de inibir a ligação de LAG-3 a moléculas de MHC classe II, um ensaio de ligação in vitro foi realizado no qual uma proteína de fusão de LAG-3, compreendendo domínio extracelular de LAG-3 humano fusionado a Fc de ratinho (hLAG-3-mIg), foi reagida com células Daudi, que expressam moléculas de MHC classe II humanas.
Para testar a inibição de anticorpo da ligação de LAG-3 à MHC classe II, 25E3, 25F7, 8B7 e 26H10 foram diluídos em série de 20 pg/mL no tampão PFAE e a estas diluições seriais foi adicionado 1 pg/ml da proteína de fusão hLAG-3-mlg. Esta mistura foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente antes da adição de 2xl05 células Daudi lavadas lx com PFAE. A mistura foi aplicada a células Daudi e incubada a 4°C por 30 minutos. As células foram precipitadas (três minutos, 400 x g) , lavadas uma vez com tampão PFAE lx e precipitadas novamente, e a ligação de hLAG-3-mIg às células Daudi foi detetada usando um reagente secundário anti-mlgG Fcy recombinante marcado com PE. Análise de ligação de LAG-3-mIg foi realizada com o citómetro de fluxo FACScalibur (BD Bioscience). Os resultados estão resumidos na tabela 7 abaixo, que mostra valores de CI50 em nM.
Tabela 7: Inibição da Ligação de LAG-3 a MHC de Classe II _pelos Anticorpos Anti-LAG-3_
Os resultados demonstram que todos os quatro anticorpos são eficazes na inibição de ligação de LAG-3 a anticorpos de MHC classe II, com 25F7, 8B7 e 26H10 exibindo valores de CI50 aproximadamente de 7 a 13 vezes menor do que aquele de 25E3.
Exemplo 5: Estimulação de Resposta de Células T Especifica de antigénio por mAbs Anti-LAG-3
Para testar a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 de estimular uma resposta de células T especifica de antigénio, um Ensaio de Estimulação Peptídica de Célula T 3A9 (veja-se, por exemplo, Workman et al. (2003) J. Immunol. 169:5392-5395; Workman et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:2255-2263) foi usado.
Neste ensaio, um hibridoma de célula T de ratinho, 3A9, especifico para o péptido HEL48-62 ,· foi usado como a célula T respondedora. A célula T 3A9 respondente foi retroviralmente transduzida para expressar LAG-3 humano ou LAG-3 de ratinho em sua superfície celular. A célula de apresentação de antigénio (APC) usada para apresentar o antigénio peptídico HEL48-62 às células 3A9 foi a linha celular positiva MHC Classe II de ratinho LK35.2. Estudos separados determinaram que uma proteína de fusão de LAG-3 humano foi capaz de ligação a moléculas de MHC Classe II de ratinho, por meio disso validando o uso de APCs LK35.2 de ratinho neste ensaio. A estimulação específica de antigénio de células 3A9 foi indicada pela produção de interleucina-2 (IL-2), a secreção da qual foi medida por ELISA (kit IL-2 OptEIA de ratinho, BD Bioscience, Cat número 555148 de acordo com as recomendações do fabricante).
Expressão ectópica de LAG-3 humano ou de ratinho nas células T 3A9, na ausência de qualquer anticorpo, levou a um efeito inibitório sobre respostas específica de antigénios quando as células T transfectadas foram incubadas com APCs LK35.2 apresentando o antigénio peptídico HEL48_62, como indicado por um aumento na quantidade do antigénio peptídico necessário para estimular produção de IL-2 por células 3A9 em comparação ao perfil de resposta de dose de péptido de células T 3A9 controlo.
Para testar estimulação de anticorpo da resposta de células T específica de antigénios, a APC (2,5xl04 células) foi primeiro pré-incubada com o péptido antigénico (200 nM) por 30 minutos a 37 °C e células T 3A9 (5,0xl04 células expressando mLAG-3, hLAG-3 ou células controlo) foram pré-incubados com um anticorpo anti-hLAG-3 (25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2, 17E5), diluído em série em diluição de três vezes de 25 pg/mL) durante 15 minutos a 37 °C. As células T 3A9 então foram adicionadas a APCs pulsadas por antigénio e a cultura incubada por 24 horas a 37 °C. Os sobrenadantes foram então recolhidos e medidos guanto à produção de IL-2 de ratinho. Os resultados para células T 3A9 expressando LAG-3 humano estão na tabela 8, gue mostra valores de CI50 em nM.
Tabela 8: Estimulação de Respostas de Células T Específica de antigénio por Anticorpos Anti-LAG-3
Os resultados mostram que anticorpos 25F7, 8B7 e 26H10, e até uma menor extensão, 25E3, foram capazes de estimular produção de IL-2 num ensaio de resposta de células T específica de antigénios, ao passo que o anticorpo 11F2 exibiu capacidade mínima de inibir e o anticorpo 17E5 não foi funcional neste ensaio. Nenhum dos anticorpos alterou a produção de IL-2 medida pelas células T 3A9 controlo ou células T 3A9 transfectadas com proteína LAG-3 de ratinho, demonstrando a especificidade do efeito estimulatório. Exemplo 6: Inibição de Crescimento Tumoral por mAb Anti- LAG-3, Isoladamente ou em Combinação
Para testar a capacidade do anticorpo anti-LAG-3, isoladamente ou em combinação com outro anticorpo imunoestimulatório, para inibir o crescimento de células tumorais in vivo, dois modelos diferentes de enxerto tumoral de ratinho singénico foram usados. 0 primeiro modelo usou células de fibrossarcoma de SalN murino. 0 segundo modelo usou linha celular de cancro de cólon MC38 murina.
Num primeiro experimento, foram implantados em cada um dos ratinhos (estirpe A/J) com 2 x 106 células de f ibrossarcoma SalN no dia 0 e as células tumorais foram permitidas crescer durante sete dias. No dia 7, dia 10 e dia 12 pós-implante, os ratinhos foram tratados com 10 mg/kg de qualquer um de mAb anti-LAG-3 sozinho (o mAb de rato anti-LAG-3 de ratinho C9B7W; eBioscience, Cat. No. 14-2231), um anticorpo anti-PD-Ll sozinho (um mAb anti-PD-Ll de ratinho 14D8), os anticorpos anti-LAG-3 e anti-PD-Ll em combinação, ou um anticorpo controlo de isotipo IgGl. O mAb 14D8 é um anticorpo de rato anti-PD-Ll de ratinho que foi quimerizado para conter regiões constantes de IgGl de ratinho e kappa de ratinho.
Volumes tumorais nos ratinhos foram medidos pós-implante por mais de 50 dias e volumes tumorais médios e medianos foram determinados. Inibição de crescimento tumoral médio foi calculada (baseado no tratamento com o anticorpo de isotipo IgGl controlo sendo inibição de 0%) . Os resultados do dia 24 pós-implante estão resumidos abaixo na tabela 9:
Tabela 9: Inibição Média do Crescimento Tumoral no Modelo
Tumoral SalN
Desta forma, o anticorpo anti-LAG3 sozinho, ou tratamento de anticorpo anti-PD-Ll sozinho, resultou na inibição de crescimento tumoral, enquanto a combinação de ambos os anticorpos levou à inibição de crescimento tumoral ainda maior. Com respeito aos grupos de tratamento, até ao final da experiência os resultados consistiram em que 4 de 10 ratinhos tratados com anti-LAG3 sozinho tornaram-se livres de tumor, ao passo que somente 1 de 10 ratinhos tratados com o anticorpo IgGl controlo se tornou livre de tumor. De forma semelhante 4 de 11 ratinhos tratados com anti-PD-Ll sozinho tornaram-se livres de tumor. O tratamento de ratinhos com a combinação de anti-LAG3 e anti-PD-Ll resultou em que 9 de 10 ratinhos se tornaram livres de tumor; o ratinho restante que não era livre de tumor tinha um tumor indolente que permaneceu pequeno ao longo do estudo.
Dois estudos adicionais usaram ratinhos implantados com células da linha celular de cancro de cólon MC38 murina. Na primeira experiência, ratinhos C57B1/6 foram cada um implantados com 2 x 106 células MC38 no dia 0, e foram tratados no dia 7, dia 10 e dia 12 pós-implante com 200 pg/dose de anti-LAG-3 sozinho (mAb C9B7W), anti-PD-1 sozinho (mAb 4H2) ou anti-LAG-3 e anti-PD-1 em combinação. Um isotipo IgGl combinado com anticorpo, em 400 pg/dose, foi usado como um controlo. O mAb 4H2 é um anticorpo de rato anti-PD-1 de ratinho que foi quimerizado para conter regiões constantes de IgGl de ratinho e kappa de ratinho. O volume tumoral médio, volume tumoral mediano e % de sobrevivência foram determinados em pós-implante de 80 dias. Os resultados mostraram que a monoterapia de LAG-3 neste modelo tumoral (MC38) mostrou pouca ou nenhuma atividade na inibição de crescimento tumoral e nenhum dos ratinhos tratados sobreviveu à duração da experiência. Ao contrário, a monoterapia de anti-PD-1 mostrou atividade significante, com 4 de 10 ratinhos livres de tumor no fim da experiência. Além disso, semelhante aos resultados com o modelo SalN, a terapêutica de combinação de anti-LAG-3 mais anti-PD-1 foi mais eficaz do que qualquer tratamento sozinho, com 7 de 8 ratinhos estando livres de tumor no fim da experiência.
Numa segunda experiência com o modelo MC38, ratinhos C57B1/6 foram cada um implantados com 2 x 106 células MC38 no dia 0, e foram tratados no dia 5, dia 8 e dia 11 pós- implante com 200 pg/dose do anticorpo teste e/ou 400 pg/dose do anticorpo IgG controlo, como se segue: (i) um anticorpo controlo anti-IgGl; (ii) um mAb anti-LAG-3 (mAb C9B7W) em conjunto com a IgGl controlo; (iii) um anticorpo anti-PD-1 (4H2) em conjunto com a IgGl controlo; (iv) um anticorpo anti-CTLA-4 (mAb de ratinho 9D9 anti-CTLA-4 de ratinho) em conjunto com a IgGlcontrolo; (v) o mAb anti- LAG-3 em conjunto com o mAb anti-PD-1; ou (vi) o mAb anti- LAG-3 em conjunto com o mAb anti-CTLA-4. O mAb 9D9 é um anticorpo de ratinho anti-CTLA-4 de ratinho que foi originado num ratinho no qual o CTLA-4 endógeno de ratinho havia sido silenciado. O volume tumoral médio, volume tumoral mediano e % de sobrevivência foram determinados para pós-implante por mais de 100 dias. Os resultados foram semelhantes ao primeiro experimento em que a monoterapia de LAG-3 mostrou pouca ou nenhuma atividade na inibição de crescimento de tumor de MC38 e nenhum dos ratinhos tratados sobreviveu à duração da experiência. A monoterapia de CTLA-4 também mostrou pouca ou nenhuma de atividade na inibição de crescimento de tumor MC38 e nenhum dos ratinhos tratados sobreviveu à duração da experiência. Ao contrário, monoterapia anti-PD-1 novamente mostrou atividade significante, com 4 de 10 ratinhos livres de tumor no fim da experiência. Além disso, novamente a terapêutica de combinação foi mais eficaz do que a monoterapia. Para ratinhos tratados com a combinação anti-LAG-3 e anti-CTLA-4, 3 de 10 ratinhos estavam livres de tumor no fim da experiência e para os ratinhos tratados com a combinação anti-LAG-3 e anti-PD-1, 8 de 10 ratinhos estavam livres de tumor no fim da experiência.
Dessa forma, estudos de enxerto de tumor in vivo acima descritos demonstraram que, para pelo menos alguns modelos tumorais, o tratamento de anticorpo sozinho anti-LAG resultou na inibição significante do crescimento tumoral in vivo. Além disso, para múltiplos modelos tumorais, a terapêutica de combinação do anticorpo anti-LAG-3 em conjunto com anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-Ll ou com anticorpo anti-CTLA-4 resultou na atividade antitumoral ainda maior do que monoterapia sozinha.
Exemplo 7: Promoção de Autoimunidade em Ratinhos NOD por Inibição por mAb Anti-LAG-3
Para testar a capacidade do anticorpo anti-LAG-3 de estimular uma resposta imunitária, como indicado pelo desenvolvimento de autoimunidade, o modelo de ratinho NOD de diabetes foi utilizado. É conhecido que ratinhos NOD são propensos ao desenvolvimento de diabetes autoimune. Progressão de diabetes pode ser seguida em ratinhos NOD fêmeas pela medida de glicose sérica. Desta forma, o efeito do tratamento com anti-LAG-3, sozinho ou em combinação com qualquer anticorpo imunoestimulatório, no desenvolvimento de diabetes em ratinhos NOD fêmeas foi examinado.
Ratinhos NOD fêmeas foram tratados no dia 0, dia 2 e dia 5 com 250 pg/dose de cada: (i) um anticorpo controlo de isotipo IgGl; (ii) mAb anti-LAG-3 sozinho (mAb C9B7W); (iii) mAb anti-PD-1 sozinho (4H2 mAb); (iv) mAb anti-CTLA-4 sozinho (mAb 9D9) ; (v) mAb anti-LAG-3 em conjunto com mAb anti-PD-1; ou (vi) mAb anti-LAG-3 em conjunto com anti-CTLA-4. Os resultados demonstraram que tratamento com anti-LAG-3 sozinho ou tratamento com anti-PD-1 sozinho (mas não tratamento com anti-CTLA-4 sozinho) aumentaram o número de ratinhos convertendo-se no fenótipo diabético. Além disso, o tratamento de combinação de anti-LAG-3 mais anti-PD-1, ou anti-LAG-3 mais anti-CTLA-4, foi mesmo mais eficaz na conversão de ratinhos ao fenótipo diabético.
Desta forma, estes resultados demonstram que o bloqueio da interação de LAG-3 com o seu recetor interferiu num sinal imunorregulatório negativo que permitiu maior atividade imunológica nos ratinhos NOD, e esta maior atividade imunológica em ratinhos tratados com LAG-3 pode ser aumentada pelo tratamento de combinação com anticorpo anti-PD-1 ou com anti-CTLA-4.
Exemplo 8: Imunohistoquímica Usando mAbs Anti-LAG-3
Nesta experiência, anticorpos humanos anti-LAG-3 marcados com fluorescência foram usados em experiências de imunohistoquímica. Os seguintes anticorpos anti-LAG-3 humanos marcados com FITC foram usados: 25F7-FITC (F:P = 2,9; versão de IgGl); 25F7-G4-FITC (F:P = 2,7; versão de IgG4) ; 8B7-FITC (F:P = 2,6) e 26H10-FITC (F:P = 3,4). Um painel de tecidos linfoides, especificamente amígdala (duas amostras), baço (duas amostras) e timo (duas amostras), foi examinado, junto com tecido pituitário (quatro amostras). Células CHO transfectadas com LAG-3 também foram usadas como um controlo. Seções criostáticas fixadas em acetona foram usadas. As seções foram coradas com anticorpo anti-LAG-3 marcado com FITC (0,2 a 5 pg/ml), seguida por marcação com um anticorpo de coelho anti-FITC como um anticorpo ponte e em seguida visualização usando Conjunto de Sistema EnVision™+ de coelho (Dako USA, Carpinteria, CA). Os resultados são resumidos abaixo na tabela 10.
Como esperado, a expressão de LAG-3 foi detetada no painel de tecido linfoide. Adicionalmente, dois de três anticorpos anti-LAG-3 examinados, 25F7 (versões IgGl e
IgG4) e 26H10, exibiram retenção no tecido pituitário, ao passo que um anticorpo examinado, 8B7, não mostrou esta retenção no tecido pituitário. Desta forma, a experiência de imunohistoquímica identificou dois subconjuntos de anticorpos anti-LAG-3, em que um subconjunto é conservado no tecido pituitário e outro subconjunto não é conservado no tecido pituitário.
SUMÁRIO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Medarex, Inc. <120> Anticorpos humanos que se ligam ao gene de ativação linfocitária-4 (LAG-3) e utilizações dos mesmos <130> MXI-392PC <140> <141> 11-08-2009 <150> US 61/188548 <151> 11-08-2008 <16 0 > 94 <170> Patentln versão 3.4
<210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1
Asp Tyr Tyr Trp Asn 1 5
<210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Ser Tyr Gly Met His 1 5
<210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Asp Tyr Gly Met Ser 1 5
<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5
<210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Glu Val Ser Met His 1. 5
<210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Ser Tyr Gly Met His 1 5
<210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Glu lie Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Gly lie Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 . 5 10 15
Gly
<210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10
Glu lie Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Cys Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 1 5 10 15
Gly
<210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13
Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro 15 10
<210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14
Glu Trp Ala Val Ala Ser. Trp Asp Tyr Gly Met Asp Val 1-5 10
<210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 15
Pro Val Gly Val Val 1 5
<210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16
Gly Tyr Asp He Leu Thr Gly Tyr Tyr Glu Asp Ser 1 5 10
<210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 17
Ala Phe Val Val Val Val Ala Ala Ser Asp Tyr 1 5 10
<210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18
Asp Pro His Cys Ser Ser Thr Asn Cys Tyr Leu Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19
Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10
<210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 21
<211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Ser Ala Leu Ala 1 5 10
<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5
<210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Asn Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5
<210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Thr 1 5
<210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33
Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro.Tyr Thr -1 5
<210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5
<210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr 1 5
<210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro lie Thr 1 5.
<210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37
Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser ASp Tyr 20 25 30
Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 -45
Gly Glu He Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90. 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 38 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15.
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vãl 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr:
65 70 75 SO
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Trp Ala Val Ala Ser Trp Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 39 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Arg Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Thr Gly Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vàl Ser Ser 100 105 110
<210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40
Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Fhe Ser Gly Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Cys Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr lie Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gin Phe Ala Leu 65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Tyr Asp lie Leu Thr Gly Tyr Tyr Glu Asp Ser Trp Gly Pro 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 41 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41
Thr His Asp Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 20 25 30
Thr Glu Val Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr He Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Phe Val Val Val Val Ala Ala Ser Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vàl Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 42 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42
Gin Val His Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Pro His Cys Ser Ser Thr Asn Cys Tyr Leu Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 8Ò
Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Tfp Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 44 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44
Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Sér Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 10 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp lie Lys 100 105
<210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45
Ala lie Gin Leu Thr Giln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
<210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 IS
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr -20 25 30
Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg. Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105
<210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48
Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 20 75 8.0
Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro lie 85 SO 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 49 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gattactact ggaactggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata atggaaacac caactcçaac .180 ccgtccctca agagtcgagt caccctatca ctagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgtt tggatatagt 300 gactacgagt acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 50 <211> 366 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 50 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat ISO gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaatgg 300 gcagtggcct cctgggacta cggtatggac gtetggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366
<210> 51 <211> 336 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 51 gaggtgcagt tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtct.ctggt attaattgga atggtggtág cacatattat 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccggagaca acgccaagaa ctc.cctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtac cactgggggc 300 tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctca 336
<210> 52 <211> 360 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 52 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc catcggaaac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caactgcaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca ggagatacgt ccaagaaaca gttcg'ccctg 240 aagctgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtctatt actgtgcgag aggatacgat 300 attttgactg gttattatga ggactcctgg ggeeegggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 53 <211> 369 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 53 acccacgacc aggtccagct ggtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggcctca 60 gtgaaggtct cctgcaaggt ttccggatac accctcactg aagtatccat gcactgggtg 120 cgacaggctc ctggaaaagg gcttgagtgg atgggaggtt ttgatcctga agatggtgaa 150 acaatctacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccgaggacac atctacagac 240 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgca 300 acagcctttg tagtggtggt agctgcttct gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca ' ’ 369
<210> 54 <211> 369 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 54 caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccc 300 cattgtagta gtaccaactg ctaccttttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369
<210> 55 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 55 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccáaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac ttttggccag 300 gggaccaacc tggagatcaa a 321
<210> 56 <211> 324 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 56 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcaçc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccatt cactttcggc 300 cctgggacca aagtggatat caaa 324
<210> 57 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 57 gccatccagt tgaçccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagg agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 58 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 58 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctataat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 59 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 59 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcetgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtaeca acagaaaeét 120 ggccaggctc coaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcecagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaastcaa a 321
<210> 60 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 0 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtaeca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg'gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 61 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> 0 resíduo 98 é apresentado apenas num subgrupo de figuras. <400> 61
Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1.5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys . 50 55 60
Ser Arg. Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly
<210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (3) <223> Os resíduos 1-3 são apresentado apenas num subgrupo de figuras. <400> 62 <210> 63 <211> 95 Ásn Trp Phé Asp Pro Trp .Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe.Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95
<210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1) . . (1) <223> 0 resíduo 1 é apresentado apenas num subgrupo de figuras. <400> 64
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 15 10
<210> 65 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65
Gin val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 . 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala.Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr .. 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 6 <210> 67 <211> 96
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 , 80 .
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Çys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95.
<210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Lys 15 10
<210> 69 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 6 9
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Gly He Asn Trp Asn Gly Gly Ser. Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ash Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1) . . (2) <223> Os resíduos 1-2 são apresentados apenas num subgrupo de figuras. <400> 70 <210> 71
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10
<211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71
Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro 85 90 95
<210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10
<210> 73 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 73
Thr His Ala Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Gys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 20 25 30
Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr He Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp 65 . 70 75 80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser GlU Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Thr 100
<210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 1 5 10
<210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 75 lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 1 5 10
<210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76
Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly 1 5
<210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77
His Pro Á-la Ala Pro Ser Ser Trp 1 ' 5
<210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly 1 5 <210> 79 <211> 30
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79
Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His 15 10 15
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr 20 25 30
<210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80
Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala 15 10
<210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81
Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly 15 10
<210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 82
Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His 1 5 10
<210> 83 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83
Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala 15 10
<210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84
His Pró Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro 1 .. 5 10
<210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85
Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser 15 10 <210> 86
<211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 6
Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly 15 10
<210> 87 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87
Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg i 5 10
<210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg 15 10
<210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89
Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr 15 10 <210> 90 <211> 30 <212> PRT <213> Macaca sp. <400> 90
Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro Ala Pro Gly His Arg 1 5 10 '15
Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr 20 25 30 <210> 91 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador 5Mcynl408 <400> 91 atgtgggagg ctcagttcct g 21 <210> 92 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador 3Mcynl408a <400> 92 gtcagagctg ctccggctc 19
<210> 93 <211> 532 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 93
Met Trp Glu Ala, Gin Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gin Pro Leu Trp 1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gin Pro Gly Ala Glu lie Sér Val Val 20 25 30
Trp Ala Gin Glu Gly Ala Pro Ala Gin Leu Pro Cys Ser Pro Thr lie 35 40 45
Pro Leu Gin Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gin 50 55 60
His Gin Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro 65 70 75 80
Ala Pro Gly His Axg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gin Pro Arg Val Glh Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gin 115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gin Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175
Gly Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val He Leu Ash Cys Ser Phe Ser 180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gin 195 200 205
Gly Arg val Pro val Gin Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly 225 230 235 240
Cys lie.Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser lie Met Tyr Asn 245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Val Tyr Ala Gly 260 265 270
Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val Gly 275 280 285
Thr Gin Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly Pro 290 295 3.00
Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu 305 310 315 320
Asp Val Ser Gin Ala Gin Ala Gly Thr Tyr lie Cys His lie Arg Leu 325 330 ' 335
Gin Gly Gin Gin Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala lie He Thr Val 340 345 350
Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys 355 360 365
Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gin Glu His Phe Val Trp Ser Pro Leu 370 375 380
Asn Thr Pro Ser Gin Arg Ser Phe Sér Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gin 385 390 395 400
Glu Ala Gin Leu Leu Ser Gin Pro Trp Gin Cys Gin Leu His Gin Gly 405 410 415
Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro 420 425 43Q
Gly Ala Gin Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly His 435 440 445
Leu Pro Leu Phe Leu lie Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu Val 450 455 460
Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gin Trp Arg Pro Arg 4 65· 470 475 480
Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gin Gly lie His Pro Pro Gin Ala Gin Ser 485 490 495
Lys He Glu Glu Leu Glu Gin Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Glu 500 505 510
Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro Glu 515 520 525
Pro Glu Gin Leu 530
<210> 94 <211> 533 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 94
Met Trp Glu Ala Gin Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gin Pro Leu Trp 1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gin Pro Gly Ala Glu lie Ser Val Val 20 25 30
Trp Ala Gin Glu Gly Ala Pro Ala Gin Leu Pro Cys Ser Pro Thr lie 35 40 45
Pro Leu Gin Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gin 50 55 60
His Gin Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro 65 70 75 80
Ala Pro Gly His Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gin Pro Arg Val Gin Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gin 115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 ' 160
Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gin Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175
Gly Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val He Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gin 195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Gin Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Sér 210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly 225 230 235 240
Cys lie Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser lie Met Tyr Asn 245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val 275 280 285
Gly Thr Gin Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gin Ala Gin Ala Gly Thr Tyr lie Cys His He Arg 325 330 335
Leu Gin Gly Gin Gin Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala He He Thr 340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gin Glu His Phe Val Trp Ser Pro 370 375 380 Léu Asn Thr Pro Ser Gin Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 <900
Gin Glu Ala Gin Leu Leu Ser Gin Pro Trp Gin Cys Gin Leu His Gin 405 410 415
Gly Glu Thr Leu Leu Gly Ala Ala Vai Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430
Pro Gly Ala Gin Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly 435 440 445
His Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Vai Leu Phe Leu Leu Leu Leu 450 455 460
Vai Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gin Trp Arg Pro 465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gin Gly lie His Pro Pro Gin Ala Gin 485 490 495
Ser Lys lie Glu Glu Leu Glu Gin Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro 500 505 510
Glu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro 515 52Ò 525
Glu Pro Glu Gin Leu 530
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
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Lisboa, 19 de Maio de 2015

Claims (26)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga ao gene de ativação linfocitária-3 (LAG-3), em que o anticorpo compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 37 e uma sequência de região variável de cadeia leve que tem pelo menos 95% de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 43.
  2. 2. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 1, que compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que tem pelo menos 98% de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 37 e uma sequência de região variável de cadeia leve que tem pelo menos 98% de identidade da sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 43.
  3. 3. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 1, que compreende sequências de região variável de cadeia pesada e leve conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 43, respetivamente.
  4. 4. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações anteriores, que inibe a ligação de LAG-3 a moléculas de histocompatibilidade principal (MHC) da classe II.
  5. 5. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações anteriores, que estimula uma resposta de células T especifica de antigénio.
  6. 6. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 5, em que o anticorpo estimula a produção de interleucina-2 pela célula T especifica de antigénio.
  7. 7. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações anteriores, que se liga a LAG-3 humano com uma KD de 1 x 1CT9 M ou menos.
  8. 8. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações anteriores, que se liga a LAG-3 humano com uma KD de 5 x 1CT9 M ou menos.
  9. 9. Uma composição que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações anteriores, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  10. 10. A composição da reivindicação 9, que compreende adicionalmente pelo menos um anticorpo adicional imunoestimulatório.
  11. 11. A composição da reivindicação 10, em que o anticorpo imunoestimulatório é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-Ll e / ou um anticorpo anti-CTLA-4.
  12. 12. A composição da reivindicação 10, em que o anticorpo imunoestimulatório é um anticorpo anti-PD-1.
  13. 13. Um imunoconjugado que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ligado a um agente terapêutico.
  14. 14. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio da mesma, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
  15. 15. Um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 14.
  16. 16. Uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão da reivindicação 15.
  17. 17. Um método para a preparação de um anticorpo anti-LAG- 3, que compreende expressar o anticorpo na célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16 e isolar o anticorpo a partir da célula hospedeira.
  18. 18. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 9 a 12, para utilização em terapêutica.
  19. 19. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional para utilização em terapêutica.
  20. 20. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, e o pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional, da reivindicação 19 para a utilização da reivindicação 19, em que o anticorpo imunoestimulatório é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-Ll e/ou um anticorpo anti-CTLA-4.
  21. 21. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, e o pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional, da reivindicação 19 para a utilização da reivindicação 19, em que o anticorpo imunoestimulatório é um anticorpo anti-PD-1
  22. 22. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, e pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional, de qualquer uma das reivindicações 19-21 para a utilização de qualquer uma das reivindicações 19-21, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, e o pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional são administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
  23. 23. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 9 a 12, para utilização na estimulação de uma resposta de células T específica de antigénio.
  24. 24. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 9 a 12, para utilização na estimulação de uma resposta imunitária num indivíduo.
  25. 25. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 9 a 12, para utilização na inibição do crescimento de células tumorais num indivíduo.
  26. 26. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 9 a 12, para utilização no tratamento de uma infeção virai num indivíduo. Lisboa, 19 de Maio de 2015
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