KR102453537B1 - 결합 검정 - Google Patents

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Abstract

림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하는 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 바이오-층 간섭법(BLI)을 이용하여 MHC 클래스 II 분자로의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 이러한 화합물의 우수 제조 관행(GMP) 등급 생산에서 품질 관리 검정으로 이용될 수 있다. 방법을 수행하기 위한 프로브 및 키트가 또한 기재되어 있다.

Description

결합 검정
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 19일에 중국 특허청에 출원된 발명의 명칭이 "결합 검정(Binding Assay)"인 중국 특허 출원 제201611180971.4호에 대해 우선권을 주장하며, 이 중국 특허 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 림프구 활성화 유전자-3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3) 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 방법, 및 이 방법에 사용하기 위한 프로브 및 키트에 관한 것이다.
배경
LAG-3 단백질은 4 개의 세포외 면역글로불린 수퍼패밀리 도메인을 갖는 CD4 동족체 I형 막 단백질이다. CD4와 유사하게, LAG-3는 T 세포의 표면에서 올리고머화되고 항원 제시 세포(APC) 상에서 MHC 클래스 II 분자에 결합하되 CD4보다 훨씬 높은 친화도로 결합한다. LAG-3는 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 상에서 발현되며, 세포 표면에서 CD3/T 세포 수용체 복합체와 회합하여 신호 전달을 부정적으로 조절한다. 결과적으로, LAG-3는 T 세포 증식, 기능, 및 항상성을 부정적으로 조절한다. LAG-3는 이펙터 또는 기억 T 세포와 비교하여 탈진(exhausted) T 세포 상에서 상향 조절된다. LAG-3는 종양 침윤 림프구(TIL) 상에서 또한 상향 조절되고, 항-LAG-3 항체를 사용한 LAG-3의 차단은 항-종양 T 세포 반응을 향상시킬 수 있다.
IMP321은 높은 결합력으로 MHC 클래스 II에 결합하는 재조합 가용성 LAG-3Ig 융합 단백질이다. 이것은 MHC 클래스 II-양성 항원 제시 세포(APC)를 표적으로 하는 혁신 신약 면역강화제이다(문헌[Fougeray et al.: A soluble LAG-3 protein as an immunopotentiator for therapeutic vaccines: Preclinical evaluation of IMP321. Vaccine 2006, 24:5426-5433]; 문헌[Brignone et al.: IMP321 (sLAG-3) safety and T cell response potentiation using an influenza vaccine as a model antigen: A single-blind phase I study. Vaccine 2007, 25:4641-4650]; 문헌[Brignone et al.: IMP321 (sLAG-3), an immunopotentiator for T cell responses against a HBsAg antigen in healthy adults: a single blind randomised controlled phase I study. J Immune Based Ther Vaccines 2007, 5:5]; 문헌[Brignone et al.: A soluble form of lymphocyte activation gene-3(IMP321) induces activation of a large range of human effector cytotoxic cells. J Immunol 2007, 179:4202-4211]). IMP321은 면역 억제된 것으로 공지된 이전에 치료받은 진행성 신장 세포 암종 환자에서 시험되었고, 3 개월에 걸친 반복 주사에 의해 치료된 모든 환자에서 임의의 검출 가능한 독성없이 활성화된 순환성 CD8 T 세포 및 수명이 긴 이펙터-기억 CD8 T 세포의 백분율의 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Brignone et al.: A phase I pharmacokinetic and biological correlative study of IMP321, a novel MHC class II agonist in patients with advanced renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 2009, 15:6225-6231]). 단지 수 ng/mL 농도의 IMP321이 시험관내에서 APC에 대해 활성인 것으로 밝혀졌고, 이는 면역계의 효능제로서의 IMP321의 큰 효능을 나타낸다(상기 문헌[Brignone, et al., 2009]).
전이성 유방 암종(MBC) 환자에서의 연구에서, Brignone 등(문헌[First-line chemoimmunotherapy in metastatic breast carcinoma: combination of paclitaxel and IMP321 (LAG-3Ig) enhances immune responses and antitumor activity. Journal of Translational Medicine 2010, 8:71])은, IMP321이, IMP321이 결합하는 1차 표적 세포(MHC 클래스 II-양성 단핵구/수지상 세포)와 후속하여 활성화되는 2차 표적 세포(NK/CD8+ 이펙터 기억 T 세포) 둘 모두를 수 개월 동안 확장 및 활성화시켰음을 입증하였다. 30명의 모든 환자의 결과를 모으고 종양 퇴행을 적절한 과거 대조 그룹과 비교함으로써 Brignone 등은 객관적 반응률이 2배가 됨을 확인하였고, 이는 IMP321이 이러한 임상 상황에서 효과적인 항암 세포성 면역 반응의 강력한 효능제임을 시사한다.
WO 99/04810호는 백신 접종을 위한 애주번트로서 그리고 암 치료에서의 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편 또는 유도체의 용도를 기재한다. 암 및 전염병의 치료를 위한 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편 또는 유도체의 용도는 WO 2009/044273호에 기재되어 있다.
LAG-3, 및 그의 단편 또는 유도체의 의학적 용도에 비추어 볼 때, 우수 제조 관행(good manufacturing practice, GMP)에 부합하는 그러한 화합물의 제제를 제공할 필요가 있다. 그러한 관행은 활성 의약품의 제조 및 판매에 대한 인허가를 관리하는 기관이 권장하는 지침을 준수하기 위해 필요하다. 이러한 지침은 제품이 고품질이며 소비자 또는 대중에게 위험을 초래하지 않음을 보장하기 위해 제약 업체가 충족해야 하는 최소의 요구 사항을 제공한다. 단백질의 GMP 등급 제조에서의 품질 관리 절차의 일부로서, 그러한 화합물의 제제가 높은 수준의 생체 활성을 보유하는지 여부를 결정할 필요가 있다.
그러나, 본 발명자들은 단백질-단백질 상호 작용을 결정하기 위한 몇 가지 통상적인 방법이 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자로의 LAG-3 유도체인 IMP321의 특이적 결합을 결정하기에 적합하지 않음을 발견하였다. 특히, 형광 활성 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)는 MHC 클래스 II-발현 세포에 결합하는 능력이 상이한 IMP321 제제들을 구별하기에 적합하지 않았다. FACS를 이용하여 얻어진 결합 곡선에 대해 증가하는 농도의 IMP321에서 상부 평탄역(upper plateau)은 관찰되지 않았다. 이는 수렴된 평탄역(평행도)을 필요로 하는 상이한 제제들의 상대적 효력의 계산을 방해한다.
본 발명자들은 또한 IMP321이 메소 스케일 디스커버리(MesoScale Discovery, MSD) 전기화학발광(electrochemiluminescent, ECL) 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA)에 사용되는 플레이트에 비특이적으로 결합함을 발견하였다. ELISA 및 MSD 검정에 사용되는 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합은 카제인을 차단 시약으로 사용함으로써 극적으로 감소되었지만, 이는 MSD 검정에서 절대 신호를 낮추었다. MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포가 MSD 플레이트에 고정된 검정을 이용하여 얻어진 결합 곡선에 대해 상부 평탄역은 관찰되지 않았다. 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합의 효과를 최소화하기 위해, IMP321의 결합 후에 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포를 다른 플레이트로 옮긴 상이한 ELISA 기법이 또한 시험되었다. 그러나, 웰 대 웰 신호 변동은 용인될 수 없는 것으로 밝혀졌다. 이에 비추어 볼 때, MSD ECL 검정 또는 ELISA 검정 중 어느 것도 GMP 등급 제품을 시험하기 위한 품질 관리 검정에서 고정된 세포로의 IMP321의 특이적 결합을 결정하는데 사용될 수 없다고 결론이 내려졌다.
따라서, 그러한 화합물의 GMP 등급 생산에서 품질 관리 검정으로 사용하기에 적합한, LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 방법을 제공할 필요가 있다.
개요
본 발명에 따르면, 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하는 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 방법으로서, 바이오-층 간섭법(bio-layer interferometry, BLI)을 이용하여 MHC 클래스 II 분자로의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
"바이오-층 간섭법(BLI)"라는 용어는 본 명세서에서, 예를 들어 미국 특허 제5,804,453호(Chen)에 기재된 바와 같은 위상-이동 간섭법에 기초한 광섬유 검정을 지칭하기 위해 사용된다. 분석물 검출의 민감도 및 정확도를 향상시키는 것을 목표로 한 개발을 포함하는 BLI 기법의 개발은 ForteBio, Inc.의 WO 2005/047854호 및 WO 2006/138294호에 기재되어 있다.
미국 특허 제5,804,453호는 광섬유 단부 표면으로의 분석물 결합을 검출하기 위한 프로브, 방법, 및 시스템을 기재한다. 분석물 검출은 표면으로의 분석물 분자의 결합으로 인한 광섬유의 단부 표면에서의 두께의 변화에 기초하며, 분석물의 양이 많을 수록 간섭 신호에서 더 큰 두께 관련 변화를 일으킨다. 간섭 신호의 변화는, 특히 미국 특허 제5,804,453호의 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, 섬유의 단부로부터 반사된 광과 섬유 단부 상에 보유된 결합층으로부터 반사된 광 사이의 위상 이동에 기인한다.
미국 특허 제5,804,453호에 기재된 프로브는 근위 단부 팁과 원위 단부 팁을 갖는 광섬유 섹션 및 원위 단부 팁 상에 배치된 시약 층을 포함한다. 시약 층은 검출되는 물질(분석물)과 반응(또는 결합)한다. 광섬유 섹션은 제1 굴절률을 가지고, 시약 층은 제2 굴절률을 갖는다. 임의의 물질이 시약 층에 결합할 때, 시약 층과 물질을 포함하는 결과물 층이 형성된다. 결과물 층은 균일한 굴절률을 갖는 것으로 취급될 수 있다.
방법은 광섬유 프로브를 사용하여 샘플 용액 내의 물질의 농도가 결정될 수 있게 한다. 방법은 (i) 광섬유 프로브의 원위 단부를 샘플 용액 내로 침지시키는 단계, (ii) 광원을 광섬유 프로브의 근위 단부와 광학적으로 커플링시키는 단계, (iii) 광섬유 프로브의 원위 단부로부터 반사되는, 적어도, 광섬유 섹션의 원위 단부 표면과 시약 층 사이의 계면으로부터 반사된 제1 광빔 및 시약 층과 샘플 용액 사이의 계면으로부터 반사된 제2 광빔을 검출하는 단계, (iv) 제1 시간에서 제1 광빔과 제2 광빔에 의해 형성된 간섭 패턴을 검출하는 단계, (v) 제2 시간에서 제1 광빔과 제2 광빔에 의해 형성된 간섭 패턴을 검출하는 단계, 및 (vi) 간섭 패턴에서 이동이 발생하는지 여부에 기초하여 물질이 샘플 용액 내에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 물질의 농도는 간섭 패턴에서의 이동 및 제1 시간과 제2 시간 사이의 차이에 기초하여 결정될 수 있다.
샘플 용액 내의 물질의 농도를 검출하는 시스템은 광빔을 제공하는 광원, 광섬유 프로브, 검출기, 광섬유 커플러, 광섬유 커넥터, 및 프로세서를 갖는다. 광섬유 커플러는 입사 광빔을 수용하는 근위 단부를 갖는 제1 광섬유 섹션, 반사된 간섭 광빔을 검출기에 전달하는 근위 단부를 갖는 제2 광섬유 섹션, 및 광섬유 프로브에 연결하는 원위 단부를 갖는 제3 광섬유 섹션을 포함한다. 광섬유 프로브는 광섬유 커플러에 연결하는 근위 단부 및 시약 층이 배치된 원위 단부 팁을 포함한다. 광섬유 프로브는 입사 광빔으로부터 적어도 제1 반사 빔 및 제2 반사 빔을 생성한다. 검출기는 제1 반사 빔과 제2 반사 빔에 의해 형성된 간섭 패턴을 검출한다. 커플러는 광원을 광섬유 프로브와 광학적으로 커플링시키고, 광섬유 프로브를 검출기와 광학적으로 커플링시킨다. 프로세서는 제1 시간에서 검출기에 의해 검출된 간섭 패턴과 관련된 위상을 결정하고, 제2 시간에서 검출기에 의해 검출된 간섭 패턴과 관련된 위상을 결정하고, 제1 시간과 제2 시간에서 검출기에 의해 검출된 간섭 패턴과 관련된 위상의 이동에 기초하여 물질의 농도를 결정한다.
본 발명자들은 BLI 기법이 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는데 사용될 수 있고, 그러한 방법이 그러한 화합물의 GMP 등급 생산에서 품질 관리 검정으로서 특히 유용함을 인식하였다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 MHC 클래스 II-발현 세포 상에 존재하는 MHC 클래스 II 분자로의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정하는 단계를 포함한다. 그러한 구현예에서, LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체는 BLI 프로브의 시약 층에 고정될 수 있고, MHC 클래스 II-발현 세포는 용액 내 존재한다.
미국 특허 제5,804,453호에 기재된 프로브, 방법, 및 시스템은, 아래에 예시된 바와 같이 MHC 클래스 II-발현 Raji 세포로의 재조합 LAG-3 단백질 유도체인 IMP321의 결합에 의해, LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
아래의 도 1a를 참조하면, 바이오센서 프로브(100)는 광섬유(102), 및 광섬유(102)의 원위 팁에 차단 시약(예를 들어, BSA)과 IMP321을 포함하는 시약 층(104)을 포함한다. 차단 시약과 IMP321은, 팁을 미리 결정된 농도의 IMP321 또는 차단 시약을 갖는 용액에 미리 결정된 기간 동안 담금으로써 광섬유(102)의 팁에 결합될 수 있다.
입사 광빔(110)은 광섬유(102)를 통해 그의 원위 단부를 향해 보내진다. 제1 굴절률을 갖는 광섬유(102)와 제2 굴절률을 갖는 시약 층(104) 사이에 규정된 계면(106)에서, 입사 광빔(110)의 제1 부분(112)은 반사되는 한편, 입사 광빔(110)의 제2 부분(114)은 계속하여 시약 층(104)을 통과할 것이다. 전형적으로, 차단 시약과 IMP321은 광학 관점으로부터 입사 광빔(110)의 파장에 비해 작을 것이므로 차단 시약과 IMP321은 단일 시약 층(104)을 형성하는 것으로 취급될 수 있다. 시약 층(104)의 노출된 표면에 규정된 계면(108)에서, 입사 빔(110)의 제2 부분(114) 중에서, 제1 부분(116)은 반사되는 한편, 제2 부분(118)은 인접 매체 내로 전달될 것이다. 입사 빔(110)의 제2 부분(114)의 제1 부분(116) 중에서, 제1 부분(160)은 광섬유(102)를 통해 다시 전송되는 한편, 제2 부분(도시되지 않음)은 계면(106)에서 다시 시약 층(104) 내로 반사될 것이다.
광섬유(102)의 근위 단부에서, 반사 빔(112 및 160)이 검출되고 분석된다. 근위 단부를 포함하는 광섬유(102)를 따른 임의의 주어진 지점에서, 반사 빔(112 및 160)은 위상차를 나타낼 것이다. 이 위상차에 기초하여, 시약 층(104)의 두께(S1)가 결정될 수 있다.
아래의 도 1b를 참조하면, 프로브(100)를 Raji 세포(136)를 함유하는 용액(134)에 침지시켜, 고정된 IMP321로의 세포의 결합을 결정한다. 세포(136)는 시약 층(104) 내의 고정된 IMP321에 결합하여, 일정 시간에 걸쳐 세포 층(132)을 형성할 것이다. 층의 두께(S2)는 샘플 유체(134) 내에서의 프로브(100)의 침지 시간뿐만 아니라 샘플 유체(134) 내의 세포(136)의 농도의 함수일 것이다. 샘플 용액 내의 다른 분자(138)(도시되지 않음)는 시약 층(104)에 결합하지 않을 것이다.
이 조합 층의 전체 두께(S2)는 시약 층(104) 단독의 두께(S1)보다 두꺼울 것이다. 따라서, 도 1a의 프로브(100)와 유사하게, 입사 빔(110)이 광섬유(102)의 원위 팁을 향해 유도될 때, 광섬유(102)와 조합 층 사이의 계면(106)에서, 입사 빔(110)의 제1 부분(112)은 반사되는 한편, 입사 빔(110)의 제2 부분(120)은 계속하여 조합 층을 통과한다. 제2 부분(120)이 세포 층(132)의 세포에 도달한 경우, 그의 제1 부분(도시되지 않음)은 세포의 세포막 및 세포 골격 구조를 만났을 때 반사될 것이다.
조합 층과 샘플 용액(134) 사이의 제2 계면(128)에서, 입사 빔(110)의 제2 부분(120) 중 제2 부분(124)은 반사되는 한편, 입사 빔(110)의 제2 부분(120) 중 제3 부분(122)은 계속하여 샘플 용액(134)을 통과한다. 입사 빔(110)의 제2 부분(120)의 제2 부분(124) 중에서, 제1 부분(126)은 계속하여 다시 광섬유(102)를 통과하는 한편, 제2 부분(도시되지 않음)은 계면(106)에서 조합 층 내로 다시 반사된다. 광섬유(102)의 근위 단부에서, 반사 빔(112 및 126)이 검출되고 분석된다. 근위 단부를 포함하는 광섬유(102)를 따른 임의의 주어진 지점에서, 반사 빔(112 및 126)은 위상차를 나타낼 것이다. 이 위상차에 기초하여, 조합 층의 두께(S2)가 결정될 수 있다.
조합 층의 두께(S2)와 시약 층(104)의 두께(S1) 사이의 차이를 결정함으로써, 세포 층(132)의 두께가 결정될 수 있다. 조합 층의 두께(S2)는 이산적인 시점에서 결정(또는 "샘플링")된다. 이러한 방식으로, 조합 층의 두께(S2)와 시약 층(104)의 두께(S1) 사이의 차이의 증가율(즉, 세포 층(132)의 두께의 증가율)이 결정될 수 있다. 이 비율에 기초하여, Raji 세포 상의 MHC 클래스 II 분자로의 고정된 IMP321의 결합률이 매우 짧은 인큐베이션 기간 내에 결정될 수 있다.
Raji 세포의 직경은 광의 파장의 1,000배인 대략 5 내지 7 μM이므로, 얻어지는 결과에 영향을 미칠 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 신호 판독값은 약 1 내지 2 nM이며, 이는 광이 세포의 표면 근처에서 반사됨을 나타낸다. 본 발명자들은 신호 변화가 반복 가능하며 세포 결합과 상관 관계가 있고, 결합률 변화가 측정 범위 내에 있는 바, 이들이 광섬유의 팁에 고정된 IMP321로의 Raji 세포의 결합을 결정하는데 사용될 수 있음을 발견하였다.
제제의 MHC 클래스 II 결합 활성은 MHC 클래스 II 분자로의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합률로서 결정될 수 있다.
본 발명자들은 BLI 검정을 이용하여 얻어진 결합률이 용액 내의 MHC 클래스 II-발현 세포의 밀도에 좌우되는 반면, 비-MHC 클래스 II-발현 세포의 밀도가 증가할 때 결합률이 낮고 비교적 단조롭다는 것을 발견하였다. 더 높은 비율뿐만 아니라 결합 곡선의 더 높은 상부 평탄역은 MHC 클래스 II-발현 세포가 4E6/mL 이상, 바람직하게는 6E6/mL 이상 또는 8E6/mL 이상의 밀도로 존재하는 경우에 얻어진다.
본 발명자들은, BLI 프로브의 시약 층이, 시약 층으로의 MHC 클래스 II-발현 세포의 비특이적 결합을 최소화하도록 차단 시약으로 전처리될 때 BLI 검정의 특이성이 개선됨을 발견하였다. 임의의 적합한 차단 시약, 예를 들어 비활성 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 알부민을 포함하는 차단 시약이 사용될 수 있다.
MHC 클래스 II-발현 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 면역 세포일 수 있다. 적합한 예는 항원 제시 세포, 또는 면역 세포로부터 유래된 세포주의 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, MHC 클래스 II-발현 세포는 B 세포 또는 B 세포주의 세포, 예를 들어 Raji 세포이다.
본 발명자들은 본 발명의 방법에 사용된 MHC 클래스 II-발현 세포가 동결된 저장 용액으로부터 얻어진 해동된 즉시 사용 가능한 세포일 수 있음을 발견하였다. 그러한 세포의 사용은 본 발명의 방법이 수행되기 직전에 세포를 배양해야 할 요건을 제거하고, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 결과의 신뢰성 및 재현성을 보장하는 것을 도울 수 있고, 또한 상이한 시간에서 얻어진 결과를 비교할 수 있게 한다.
본 발명의 방법은 복수의 상이한 농도의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체에 대해 MHC 클래스 II 분자로의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합률을 결정하는 단계, 및 예를 들어 아래의 실시예 6에 기재된 바와 같이, 결합률에 대한 용량-반응 곡선을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 제제의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정하는데 사용된 조건과 동일한 조건 하에서 BLI를 이용하여 MHC 클래스 II 분자로의 참조 샘플의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정함으로써 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 참조 샘플의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 단계, 및 참조 샘플에 대해 결정된 MHC 클래스 II 결합 활성을 제제에 대해 결정된 MHC 클래스 II 결합 활성을 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
미리 결정된 농도에서의 참조 샘플의 MHC 클래스 II 결합 활성은 100%로 설정될 수 있고, 예를 들어 본 발명의 방법을 이용하여 이루어진 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하는 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성의 측정의 정량 또는 검증을 가능하게 하기 위해, 다양한 원하는 농도로 희석될 수 있다.
일부 구현예에서, 참조 샘플은 MHC 클래스 II 결합 활성을 감소시키도록 처리된 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함한다. 적합한 처리는, 예를 들어, 탈글라이코실화(예를 들어, PNGase 처리), 37℃에서 12일 이상 동안의 보관, (예를 들어, 1% 또는 0.1% 과산화수소 처리에 의한) 산화, 산 또는 알칼리 처리, 또는 5일 이상 동안의 광 노출을 포함한다.
아래의 실시예 6은 용액 내 Raji 세포에 대한 고정된 IMP321의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 BLI 검정을 상세히 설명한다.
또한, LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체가 고정된 시약 층을 포함하는, LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 BLI 프로브가 본 발명에 따라 제공된다.
추가로, LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체가 고정된 시약 층을 갖는 BLI 프로브 및 MHC 클래스 II-발현 세포를 포함하는, LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 키트가 제공된다.
일부 구현예에서, BLI 프로브의 시약 층은, 시약 층으로의 MHC 클래스 II-발현 세포의 비특이적 결합을 최소화하도록 차단 시약으로 전처리되었다. 임의의 적합한 차단 시약, 예를 들어 비활성 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 알부민을 포함하는 차단 시약이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC 클래스 II-발현 세포는 동결된 세포이다.
일부 구현예에서, MHC 클래스 II-발현 세포는 Raji 세포이다.
MHC 클래스 II-발현 세포는 1E6/mL 이상, 바람직하게는 4E6/mL 이상 또는 8E6/mL 이상의 밀도로 존재할 수 있다.
본 발명의 키트는 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하는, 예를 들어 앞서 기재된 바와 같은 참조 샘플을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 참조 샘플의 MHC 클래스 II 결합 활성은 (예를 들어, 아래에 기재된 CCL4 방출 검정에 의해 결정되는 바와 같이) 공지되어 있다.
본 발명의 프로브 및 키트는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
LAG-3 단백질은 분리된 천연 또는 재조합 LAG-3 단백질일 수 있다. LAG-3 단백질은 영장류 또는 뮤린 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질과 같은 임의의 적합한 종으로부터의 LAG-3 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 및 뮤린 LAG-3 단백질의 아미노산 서열은 Huard 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997]의 도 1에 제공되어 있다. 인간 LAG-3 단백질의 서열은 아래의 도 25(서열 번호 1)에 반복되어 있다. 인간 LAG-3의 4개의 세포외 Ig 수퍼패밀리 도메인(D1, D2, D3, 및 D4)의 아미노산 서열은 Huard 등의 문헌의 도 1에서 아미노산 잔기 1-149(D1); 150-239(D2); 240-330(D3); 및 331-412(D4)로 또한 확인된다.
LAG-3 단백질의 유도체는 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질의 가용성 단편, 변이체, 또는 돌연변이체를 포함한다. MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 몇 가지의 LAG-3 단백질 유도체가 공지되어 있다. 그러한 유도체의 많은 예가 Huard 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997]에 기재되어 있다. 이 문헌은 LAG-3 단백질 상의 MHC 클래스 II 결합 부위의 특징을 기재한다. LAG-3의 돌연변이체를 생성시키는 방법뿐만 아니라 클래스 II-양성 Daudi 세포에 결합하는 LAG-3 돌연변이체의 능력을 결정하는 정량적 세포 유착 검정이 기재되어 있다. MHC 클래스 II 분자로의 LAG-3의 몇 가지 상이한 돌연변이체의 결합이 결정되었다. 일부 돌연변이는 클래스 II 결합을 감소시킬 수 있었던 한편, 다른 돌연변이는 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 친화도를 증가시켰다. MHC 클래스 II 단백질에 결합하는데 필수적인 많은 잔기는 LAG-3 D1 도메인 내의 큰 30개 아미노산 엑스트라-루프(extra-loop) 구조의 기저부에서 클러스터를 이루고 있다. 인간 LAG-3 단백질의 D1 도메인의 엑스트라-루프 구조의 아미노산 서열은 GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(SEQ ID NO: 2)이며, 이는 도 25에서 밑줄 그어진 서열이다.
LAG-3 단백질 유도체는 인간 LAG-3 D1 도메인의 30개 아미노산 엑스트라-루프 서열, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 변이체는 인간 LAG-3 D1 도메인의 30개 아미노산 엑스트라-루프 서열과 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, 및 선택적으로 도메인 D2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, 또는 도메인 D1 및 D2와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, D2, D3, 및 선택적으로 D4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
LAG-3 단백질의 유도체는 LAG-3 단백질, 바람직하게는 인간 LAG-3 단백질의 도메인 D1, D2, 및 D3, 또는 도메인 D1, D2, D3, 및 D4와 70%, 80%, 90%, 또는 95%이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
아미노산 서열들 사이의 서열 동일성은 서열들의 정렬을 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열들에서의 동등한 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 동일성의 백분율로 정렬에 점수를 매기는 것은 비교된 서열들에 의해 공유되는 위치에서의 동일한 아미노산 개수의 함수이다. 서열들을 비교할 때, 최적의 정렬은 서열들에서의 가능한 삽입 및 결실을 고려하기 위해 서열들 중 하나 이상 내로 갭(gap)을 도입할 필요가 있을 수 있다. 서열 비교 방법은 갭 페널티(penalty)를 사용하여, 비교되는 서열들 중 동일한 수의 동일한 분자에 대해, 비교된 두 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 서열 정렬보다 더 높은 점수를 달성하게 할 수 있다. 최대 동일성 퍼센트의 계산은 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 생성을 포함한다.
서열 비교를 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 상업 및 공공 부문에서 널리 이용 가능하다. 예로는 MatGat(문헌[Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4: 29]; http://bitincka.com/ledion/matgat에서 이용 가능한 프로그램), Gap(문헌[Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 -453]), FASTA(문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410]; http://www.ebi.ac.uk/fasta에서 이용 가능한 프로그램), Clustal W 2.0 및 X 2.0(문헌[Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948]; http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2에서 이용 가능한 프로그램) 및 EMBOSS 페어와이즈 얼라인먼트 알고리듬스(Pairwise Alignment Algorithms)(상기 문헌[Needleman & Wunsch, 1970]; 문헌[Kruskal, 1983, In: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff & Kruskal (eds), pp 1-44, Addison Wesley]; http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align에서 이용 가능한 프로그램). 모든 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하여 실행될 수 있다.
예를 들어, 서열 비교는 EMBOSS 페어와이즈 얼라인먼트 알고리듬스의 "니들(needle)" 방법을 이용하여 착수될 수 있으며, 이는 전장에 걸쳐 고려될 때 두 서열의 (갭을 포함하는) 최적 정렬을 결정하고 동일성 백분율 점수를 제공한다. 아미노산 서열 비교를 위한 디폴트 파라미터("프로테인 몰레큘(Protein Molecule)" 옵션)는 갭 익스텐드(Gap Extend) 페널티: 0.5, 갭 오픈(Gap Open) 페널티: 10.0, 매트릭스(Matrix): 블로섬(Blosum) 62일 수 있다.
서열 비교는 참조 서열의 전장에 걸쳐 수행될 수 있다.
LAG-3 단백질 유도체는 면역글로불린 Fc 아미노산 서열, 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 아미노산 서열, 선택적으로 링커 아미노산 서열에 융합될 수 있다.
MHC 클래스 II 분자에 결합하는 LAG-3 단백질의 유도체의 능력은 (상기) Huard 등의 문헌에 기재된 바와 같은 정량적 세포 유착 검정을 이용하여 결정될 수 있다. MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3 단백질의 유도체의 친화도는 클래스 II 분자에 대한 인간 LAG-3 단백질의 친화도의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%일 수 있다. 바람직하게는, MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3 단백질의 유도체의 친화도는 클래스 II 분자에 대한 인간 LAG-3 단백질의 친화도의 50% 이상이다.
MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 LAG-3 단백질의 적합한 유도체의 예는 다음을 포함하는 유도체를 포함한다:
인간 LAG-3 서열의 아미노산 잔기 23 내지 448;
LAG-3의 도메인 D1 및 D2의 아미노산 서열;
다음의 위치들 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 LAG-3의 도메인 D1 및 D2의 아미노산 서열: ARG가 GLU로 치환되는 73번 위치; ARG가 ALA 또는 GLU로 치환되는 75번 위치; ARG가 GLU로 치환되는 76번 위치; ASP가 ALA로 치환되는 30번 위치; HIS가 ALA로 치환되는 56번 위치; TYR이 PHE로 치환되는 77번 위치; ARG가 ALA로 치환되는 88번 위치; ARG가 ALA로 치환되는 103번 위치; ASP가 GLU로 치환되는 109번 위치; ARG가 ALA로 치환되는 115번 위치;
아미노산 잔기 54 내지 66의 결실을 갖는 LAG-3의 도메인 D1의 아미노산 서열;
인간 IgG1 Fc에 융합된 hLAG-3의 세포외 도메인을 인코딩하는 플라스미드로 형질감염된 중국 햄스터 난소 세포에서 생성된 200-kDa 이량체인 재조합 가용성 인간 LAG-3Ig 융합 단백질(IMP321). IMP321의 서열은 미국 특허 출원 제2011/0008331호의 서열번호 17에 주어져 있다.
본 발명의 구현예가 이하에서 다음의 도면을 참조하여 예로서만 설명된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른, LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는데 사용된 프로브의 작동을 도시한다(미국 특허 제5,804,453호로부터 취한 도면).
도 2는 Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 FACS 검정의 결과를 도시한다.
도 3은 Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 메소 스케일 디스커버리(MSD) 전기화학발광(ECL) 검정을 개략적으로 도시한다.
도 4(a)는 Raji 세포의 존재 및 부재 하에서 상이한 농도의 IMP321에서 MSD 검정에 대해 얻어진 ECL 신호의 플롯을 도시하고; 도 4(b)는 Raji 세포의 존재 및 부재 하에서 상이한 농도의 리툭산(Rituxan)에서 MSD 검정에 대해 얻어진 ECL 신호의 플롯을 도시한다.
도 5(a)는 5% BSA 또는 10% FBS로 ELISA 플레이트를 차단한 후 상이한 농도의 IMP321에서 ELISA에 대해 얻어진 OD 신호의 플롯을 도시하고; 도 5(b)는 PBS 중의 30% FBS로 ELISA 플레이트를 차단한 후 상이한 농도의 IMP321 또는 리툭산에서 ELISA에 대해 얻어진 OD 신호의 플롯을 도시하고; 도 5(c)는 RPIM1640 중의 5% BSA로 ELISA 플레이트를 차단한 후 상이한 농도의 IMP321 또는 리툭산에서 ELISA에 대해 얻어진 OD 신호의 플롯을 도시한다.
도 6(a)는 상이한 차단 시약(1% 무지방 우유, 3% 무지방 우유, 카세인)으로 ELISA 플레이트를 차단한 후 상이한 농도의 IMP321 또는 리툭산에서 ELISA에 대해 얻어진 OD 신호의 플롯을 도시하고; 도 6(b)는 상이한 차단 시약(1% 젤라틴, 3% 젤라틴, 또는 PBS)으로 ELISA 플레이트를 차단한 후 상이한 농도의 IMP321 또는 리툭산에서 ELISA에 대해 얻어진 OD 신호의 플롯을 도시한다.
도 7(a)는 상이한 시딩 밀도의 Raji 세포에 대한 상이한 농도의 IMP321에서 MSD 검정에 대해 얻어진 원시(raw) ECL 신호의 플롯을 도시하고; 도 7(b)는 상이한 시딩 밀도의 Raji 세포에 대한 상이한 농도의 IMP321에서 MSD 검정에 대해 얻어진 특정 ECL 신호의 플롯을 도시한다.
도 8은 카제인으로 MSD 플레이트를 차단한 후 Raji 세포 또는 HLA-DRdim L929 세포로의 상이한 농도의 IMP321의 결합에 대한 MSD 검정에 대해 얻어진 ECL 신호의 플롯을 도시한다.
도 9는 단백질 A-접합 센서 및 센서의 광섬유의 원위 팁에 고정된 IMP321을 갖는 BLI 프로브를 좌측에 개략적으로 도시하며, 센서의 팁은 Raji 세포를 함유하는 샘플 용액에 침지되어 있다. 방법의 기본 단계는 도면의 우측에 제시되어 있다.
도 10(a)는 회합 단계에서 용액 내 Raji 세포로의 고정된 IMP321의 용량-의존성 결합에 대해 BLI 검정에서 얻어진 결합 신호의 플롯을 도시하고; 도 10(b)는 BLI 검정에서 Raji 세포로의 IMP321 용량-의존성 결합의 표준 곡선을 도시한다.
도 11(a)는 BLI 검정에서 용액 내 상이한 농도의 (MHC 클래스 II를 발현하는) Raji 세포 또는 (MHC 클래스 II를 발현하지 않는) Jurkat 세포로의 고정된 IMP321의 결합에 대한 회합 및 해리 곡선을 도시하고; 도 11(b)는 상이한 Raji 세포 농도에 대해 얻어진 결합 신호의 그래프를 도시한다.
도 12(a)는 BLI 검정에서 용액 내 Raji 세포로의 고정된 IMP321, 휴미라(Humira), 또는 아바스틴(Avastin)의 결합에 대한 회합 및 해리 곡선을 도시하고; 도 12(b)는 상이한 고정된 단백질에 대해 얻어진 결합 신호의 그래프를 도시한다.
도 13은 용액 내 Raji 세포로의 IMP321의 상이한 고정된 제제의 결합에 대해 BLI 검정에 의해 측정된 결합 효능 백분율 대 이들의 예상 효능의 플롯을 도시한다.
도 14(a)는 용액 내 이전에 배양된 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321의 결합에 대해 BLI 검정에 의해 얻어진 결합 신호의 플롯을 도시하고;
도 14(b)는 용액 내 이전에 동결된 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321의 결합에 대해 BLI 검정에 의해 얻어진 결합 신호의 플롯을 도시한다.
도 15(a)는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 탈글라이코실화된 IMP321의 결합에 대한 세포-기반 검정에 의해 얻어진 다운스트림 CCL4 방출의 플롯을 도시하고;
도 15(b)는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 탈글라이코실화된 IMP321의 결합에 대한 BLI 검정에 의해 얻어진 결합 신호의 플롯을 도시한다.
도 16은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 (37℃에서 12일 동안) 부적절하게 저장된 IMP321의 결합에 대한 신호의 플롯을 도시한다. 도 16(a)에 도시된 결과는 CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정에 의해 얻어졌고, 도 16(b)에 도시된 결과는 BLI 검정에 의해 얻어졌다.
도 17은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 (37℃에서 1 개월 동안) 부적절하게 저장된 IMP321의 결합에 대한 신호의 플롯을 도시한다. 도 17(a)에 도시된 결과는 CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정에 의해 얻어졌고, 도 17(b)에 도시된 결과는 BLI 검정에 의해 얻어졌다.
도 18는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 IMP321 또는 (1% 과산화수소로) 산화된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 18a) 또는 BLI 검정(도 18b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 19는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 IMP321 또는 (0.1% 과산화수소로) 산화된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 19a) 또는 BLI 검정(도 19b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 20는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (pH 3.0에서) 산 처리된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 20a) 또는 BLI 검정(도 20b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 21은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (pH 3.1 또는 pH 3.6에서) 산 처리된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 21a) 또는 BLI 검정(도 21b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 22는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (pH 9.2 또는 pH 9.75에서) 염기 처리된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 22a) 또는 BLI 검정(도 22b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 23은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (25℃에서 5일 동안) 광 노출된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 23a) 또는 BLI 검정(도 23b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 24는 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (25℃에서 10일 동안) 광 노출된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 24a) 또는 BLI 검정(도 24b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 25는 성숙한 인간 LAG-3 단백질의 아미노산 서열을 도시한다. 4개의 세포외 Ig 수퍼패밀리 도메인은 아미노산 잔기: 1-149(D1); 150-239(D2); 240-330(D3); 및 331-412(D4)에 존재한다. 인간 LAG-3 단백질의 D1 도메인의 엑스트라-루프 구조의 아미노산 서열은 굵게 밑줄 그어져 있다.
상세한 설명
아래의 실시예 1 내지 5는 재조합 LAG-3 단백질 유도체인 IMP321의 GMP 등급 생산을 위한 품질 관리 검정으로서 사용하기에 적합한 지의 여부를 결정하기 위한 다양한 상이한 결합 검정의 평가를 설명한다. 어떠한 검정도 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다. 실시예 6 내지 11은 세포-기반 BLI 방법들, 및 IMP321의 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하기 위한 이들의 적합성의 입증을 설명한다.
실시예 1
Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 형광 활성 세포 분류(FACS) 검정의 이용의 평가
Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위해 FACS 검정을 수행하였다. 100%, 75%, 및 50%의 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 IMP321 샘플을 시험하였다. 100%의 활성을 갖는 샘플은 미리 결정된 농도에서 공지된 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 참조 샘플이었다. 75% 및 50%의 활성을 갖는 샘플은 참조 샘플의 희석에 의해 제조하였다.
얻어진 결합 곡선은 도 2에 도시되어 있다. 그러한 결합 곡선은 상부 평탄역에 도달하지 않았음을 보여주므로, 100%의 활성을 갖는 참조 샘플의 결합 곡선과 다른 샘플들 사이에 평행도는 존재하지 않았다. 이는 상이한 샘플의 상대적 효력의 계산을 방해하였다.
실시예 2
Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 메소 스케일 디스커버리(MSD) 검정 의 이용의 평가
본 실시예는 Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 메소 스케일 디스커버리(MSD) 검정의 평가를 설명한다.
메소 스케일 디스커버리 플랫폼(MSD-ECL)은 검출 항체에 접합된 전기화학발광 표지를 사용한다. 이러한 표지는 적절한 화학적 환경에서 전기에 의해 자극될 때 광을 발생시키며, 이는 이어서 핵심 단백질과 분자를 측정하는데 사용될 수 있다.
메소 스케일 디스커버리 플랫폼(MSD-ECL)에 의해 전기를 플레이트 전극에 인가하여, 표지에 의한 광 방출을 일으킨다. 이어서 샘플 내의 분석물을 정량하기 위해 광 세기를 측정한다.
검출 프로세스가 메소 스케일 디스커버리(MSD-ECL)의 마이크로플레이트의 바닥에 위치한 전극에서 개시되고, 전극 근처의 표지만이 여기되어 검출된다. 시스템은 루테늄과의 이중 산화환원 반응을 위한 촉매로서 고농도의 트리프로필아민을 갖는 완충액을 사용하며, 620 nm에서 광을 방출한다.
이용된 MSD 검정은 도 3에 개략적으로 도시되어 있다. 간략하게 말하면, PBS 중의 Raji 세포의 웰당 약 2 x 104개 세포를 25μL/웰로 싱글-스폿(Single-SPOT) 96-웰 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) 내로 시딩하였다. 차단 완충액(25 ul/웰)으로 차단하기 전에 플레이트를 실온에서 1 내지 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, IMP321 참조 표준 또는 샘플의 연속 희석물을 50 uL/웰로 중복(duplicate) 웰 내로 로딩하였다. 실온에서의 약 1 시간 인큐베이션 후, 루테늄-접합 항-인간 Fc를 50 uL/웰로 사용하여 결합된 IMP321을 검출하였다. 계면활성제가 없는 MSD 판독 완충액을 사용하여 전기화학발광 신호를 획득하였다. ECL 총수는 검정 범위 내에서 세포 표면 상으로 결합하는 IMP321에 비례해야 한다.
마이크로플레이트의 바닥에 있는 높은 결합 탄소 전극은 Raji 세포의 용이한 부착을 허용한다. 검정은 항-IMP321 항체에 접합된 전기화학발광 표지를 사용한다. MSD 기기에 의해 플레이트 전극에 전기를 인가하여 표지에 의한 광 방출을 일으킨다. 이어서, 고정된 Raji 세포의 표면 상의 MHC 클래스 분자에 결합된 IMP321의 존재를 정량하기 위해 광 세기를 측정한다.
Raji 세포와 함께 그리고 Raji 세포없이 IMP321을 함유하는 샘플에 대해 얻어진 결과는 도 4(a)에 도시되어 있고, Raji 세포와 함께 그리고 Raji 세포없이 리툭산을 함유하는 샘플에 대해 얻어진 결과는 도 4(b)에 도시되어 있다.
결과는 MSD 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합이 Raji 세포의 부재 하에서 관찰되었음을 보여준다. 그에 비해, Raji 세포로의 리툭산의 특이적 결합이 관찰되었다.
Raji 세포는 1963년에 11세의 나이지리아 버킷 림프종 남성 환자의 B-림프구로부터 유래된 세포주의 세포이다. 리툭산(리툭시맙)은 B 세포의 표면 상에서 주로 발견되는 단백질 CD20에 대한 키메라 모노클로날 항체이다.
실시예 3
ELISA 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합의 평가
본 실시예는 상이한 차단 시약을 사용하는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 사용된 플레이트로의 IMP321과 리툭산의 비특이적 결합의 평가를 설명한다.
간략하게 말하면, 마이크로플레이트를 25℃에서 2시간 동안 차단 시약으로 차단하였다. 샘플과 리툭산 대조군을 희석 완충액으로 2 μg/ml로 희석하고, 이어서 2배 연속 희석에 의해 추가로 희석하였다. 희석된 샘플을 첨가하고 인큐베이션하기 전후에 마이크로플레이트를 세척하고 잘 배수시켰다. 2차 항체와 함께 인큐베이션한 후, SpectraMax M2(450 내지 650 nm)를 사용하는 분광법 검정에 의해 신호를 측정하였다.
Figure 112019062703495-pct00001
결과는 도 5에 도시되어 있다. 도 5(a)는 증가하는 농도의 IMP321 및 5% BSA 또는 10% FBS로 차단된 ELISA 플레이트를 사용하는 ELISA의 결과를 도시한다. 도 5(b)는 증가하는 농도의 IMP321 또는 리툭산 및 PBS 중의 30% FBS로 차단된 ELISA 플레이트를 사용하는 ELISA의 결과를 도시한다. 도 5(c)는 증가하는 농도의 IMP321 또는 리툭산 및 RPIM 1640 중의 5% BSA로 차단된 ELISA 플레이트를 사용하는 ELISA의 결과를 도시한다.
결과는 차단 시약으로 BSA 또는 FBS를 사용할 때 ELISA 플레이트로의 리툭산이 아닌 IMP321의 심각한 비특이적 결합이 존재함을 보여준다.
이어서, ELISA 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합이 제거될 수 있는지 여부를 알아 보기 위해 IMP321 또는 리툭산으로 다양한 상이한 유형의 차단제를 시험하였다.
Figure 112019062703495-pct00002
결과는 도 6에 도시되어 있다. 도 6(a)는 차단 시약으로 1% 무지방 우유, 3% 무지방 우유, 또는 블록커 카제인 블록킹 버퍼스(Blocker Casein Blocking Buffers)(Thermo)를 사용한 IMP321 또는 리툭산에 대한 결과를 도시한다. 도 6(b)는 차단 시약으로 1% 젤라틴, 3% 젤라틴, 또는 PBS를 사용한 IMP321 또는 리툭산에 대한 결과를 도시한다.
결과는 카제인이 ELISA 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합을 감소시키기 위한 최상의 차단 시약임을 보여준다.
실시예 4
Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한, 카제인 차단 완충액을 사용한 메소 스케일 디스커버리(MSD) 검정의 이용의 평가
본 실시예는 카제인 차단 완충액을 사용한 상이한 시딩 밀도에서 Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 MSD 검정의 평가를 설명한다.
실시예 2에서 관찰된 MSD 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합이 카제인 차단 완충액을 사용하여 최소화될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 그 실시예에 기재된 것과 유사한 MSD 검정을 수행하였다.
Figure 112019062703495-pct00003
결과는 도 7에 도시되어 있다. 도 7(a)는 상이한 농도의 IMP321에서 상이한 시딩 밀도(0 내지 5x104개 세포/웰)의 Raji 세포로의 IMP321의 결합의 결과를 도시한다. 결과는 최대 IMP321 결합의 세포 밀도-의존성 증가를 보여준다. 도 7(b)는 상이한 시딩 밀도(1x103개 내지 5x104개 세포/웰)의 Raji 세포로의 IMP321의 특이적 결합의 결과를 도시한다. 결과는 특이적 IMP321 결합의 세포 밀도-의존성 증가를 보여준다.
Raji 세포로의 IMP321의 결합을, 카세인 차단 완충액을 사용한 MSD 검정을 이용하여 상이한 농도의 IMP321 에서 HLA-DRdim L929 세포(이러한 세포는 MHC 클래스 II를 발현하지 않음)로의 IMP321의 결합과 비교하였다. L929는 스트레인(strain) L로부터 클로닝된 섬유모세포-유사 세포주이다. 결과는 도 8에 도시되어 있다. 결과는 MSD 플레이트로의 IMP321의 비특이적 결합이 카세인 차단제 존재 하에서 유의하게 감소되었음을 보여준다. 그러나, 특이적 결합 신호는 낮았고, IMP321 용량-결합 곡선의 상부 평탄역은 관찰되지 않았다.
카제인 차단 완충액을 사용한 MSD 검정은 플레이트-고정 Raji 세포로의 IMP321의 특이적 결합을 입증하는데 사용될 수 없다고 결론이 내려졌다.
실시예 5
Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 ELISA 검정의 이용의 평가
본 실시예는 Raji 세포로의 IMP321의 결합을 결정하기 위한 세포-기반 다이렉트(direct) ELISA 및 세포-기반 트랜스퍼(transfer) ELISA의 능력의 평가를 설명한다.
상이한 차단 시약(5% BSA, 10% FBS, 0.5% 카제인, 또는 3% 젤라틴)의 존재 하에서 상이한 양의 플레이트-고정 Raji 세포(10,000개, 5,000개, 또는 2,500개 세포) 및 상이한 농도의 IMP321 또는 펩타이드-N-글리코시다제 F(N-결합 당단백질로부터의 고 만노스(high mannose), 하이브리드, 및 복합 올리고당의 가장 안쪽의 GlcNAc와 아스파라긴 잔기 사이를 절단하는 아미다제인 PNGase F)로 처리된 IMP321을 사용하여 (실시예 3에 설명된 검정과 유사한) 다이렉트 ELISA를 수행하였다. 다이렉트 ELISA 검정에 사용된 조건은 아래의 표에 요약되어 있다:
Figure 112019062703495-pct00004
Figure 112019062703495-pct00005
결과를 아래의 표에 나타낸다.
Figure 112019062703495-pct00006
결과는 플레이트-고정 Raji 세포로의 용량-의존성 IMP321 결합을 보여준다.
IMP321이 ELISA 플레이트에 비특이적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위해, 아래의 표에 요약된 조건 하에서 Raji 세포의 부재 하에서 다이렉트 ELISA를 수행하였다:
Figure 112019062703495-pct00007
결과를 아래의 표에 나타낸다:
Figure 112019062703495-pct00008
결과는 플레이트-고정 Raji 세포의 부재 하에서 ELISA 플레이트로의 IMP321의 강한 비특이적 결합을 보여준다. 카세인, 젤라틴 차단 시약, 또는 IMP321의 PNGase 처리 중 어느 것도 비특이적 결합을 제거하지 못했다.
다이렉트 세포-기반 ELISA는 플레이트-고정 Raji 세포로의 IMP321의 특이적 결합을 입증하는데 사용될 수 없다고 결론이 내려졌다.
고정된 Raji 세포로의 상이한 농도의 IMP321 또는 PNGase로 처리된 IMP321의 결합을 결정하기 위해 트랜스퍼 세포 ELISA를 수행하였다. IMP321 또는 처리된 IMP321에 결합한 후 Raji 세포를 다른 플레이트로 옮겼다. 검정에 사용된 조건은 아래의 표에 요약되어 있다.
Figure 112019062703495-pct00009
Figure 112019062703495-pct00010
결과를 아래의 표에 나타낸다.
Figure 112019062703495-pct00011
결과는 웰 대 웰 신호 변동이 품질 관리 방법에 대해 용인될 수 없음을 보여준다. 방법은 또한 많은 노동을 필요로 한다. 세포-기반 트랜스퍼 ELISA는 플레이트-고정 Raji 세포로의 IMP321의 특이적 결합을 입증하는데 사용될 수 없다고 결론이 내려졌다.
실시예 6
바이오-층 간섭법(BLI)을 이용한 LAG-3 단백질 유도체인 IMP321의 제제의 결합 활성을 측정하기 위한 세포-기반 검정
IMP321은 MHC 클래스 II 분자에 대해 높은 친화도를 갖는 LAG-3 단백질의 가용성 재조합 유도체이다. 본 실시예는 BLI를 이용한 MHC 클래스 II-발현 Raji 세포로의 IMP321의 결합 활성을 측정하기 위한 세포-기반 검정을 설명한다. 검정은 간단하고 신속하며, 참조 표준과 샘플 사이의 비교를 가능하게 한다.
도 9는 단백질 A-접합 센서 및 센서의 광섬유의 원위 팁에 고정된 IMP321을 갖는 BLI 프로브를 좌측에 개략적으로 도시하며, 센서의 팁은 Raji 세포를 함유하는 샘플 용액에 침지되어 있다. 방법의 기본 단계는 도면의 우측에 제시되어 있다. 검정은 아래에서 더욱 상세히 설명된다.
재료:
1) Raji 세포: ATCC/CCL-86
2) RPMI 1640: Invitrogen/22400-089
3) HI-FBS: Invitrogen/10100147
4) DPBS: Hyclone/SH30028.01B
5) BSA: Sigma/A3032
6) IMP321 참조 물질
7) Raji 세포 성장 배지: RPMI 1640, 10% HI-FBS
8) 결합 검정 희석액: DPBS, 0.5% BSA
9) 프로테인 A 트레이(Protein A Tray)(ForteBio-18-5010)
10) 96-평면-바닥-웰 흑색 플레이트(Greiner-655209)
11) 단일- 및 다중-채널 피펫: Sartorius 및 Eppendorf/다양한 피펫
12) 세포 계수기: Roche/Cedex HiRes 및 Beckman/ViCell
13) 바이오-층 간섭계: 소프트웨어 버전 7.0 이상의 Fortebio/Octet Red
방법:
1. 즉시 사용 가능한 Raji 세포의 준비
1) 액체 질소 냉동고로부터 N개 바이알(들)의 Raji 세포를 꺼내고, 37℃ 수욕에서 신속히 해동한다.
2) 대략 N X 9 mL의 Raji 세포 성장 배지를 함유하는 멸균 원심분리 튜브에 바이알 내용물을 무균적으로 옮긴다. 천천히 피펫팅하여 잘 혼합한다.
3) 세포를 300x g에서 5 분간 원심분리한다. 결합 검정 희석액 중에 세포를 재현탁하고, 세포 계수기 또는 혈구계로 계수한다.
4) 세포 저장 현탁액의 부피를 충분한 부피의 결합 검정 희석액에 첨가하여 mL 당 4.0E6개 내지 8.0E6개 세포로 세포 밀도를 조정하고, 사용을 위해 얼음 상에서 유지시킨다.
2. IMP321 참조 표준, 대조군 및 샘플의 준비
주의: 1) 정확성을 보장하기 위해 역 피펫팅(reverse pipetting)을 사용한다.
2) 거품 및 기포의 생성을 방지하거나 최소화하기 위해 천천히 볼텍싱한다.
1) 참조 표준 준비:
1.1) 필요에 따라 IMP321 참조 물질의 바이알을 해동한다. 2℃ 내지 8℃에서 보관한다. 만료일은 해동일로부터 7일이다.
1.2) IMP321 참조 물질을 제형 완충액 중에서 대략 1.0 mg/mL로 희석한다. 새롭게 준비하고 새롭게 사용한다. 제형 완충액을 블랭크(blank)로 사용하여 분광광도법으로 단백질 농도를 결정한다.
1.3) 측정된 단백질 농도에 기초하여, RM을 희석하여 아래에 설명된 바와 같은 적절한 농도에 대한 표준 곡선을 작성한다. 볼텍싱하여 희석물을 혼합한다.
Figure 112019062703495-pct00012
1.4) 표준 곡선에 대해 희석물 C 내지 J를 사용한다. 곡선의 선형 부분과 상부 및 하부 평탄역을 포함하도록, 필요한 경우 추가의 농도를 사용할 수 있다.
2) 대조군의 준비
2.1) 대조군은 위의 단계 1.3에서 준비된 튜브 C로부터의 참조 물질의 독립적인 희석물이다. 위의 표에 설명된 바와 같이 추가로 희석한다. 볼텍싱하여 희석물을 혼합한다.
2.2) 대조군에 대해 희석물 C 내지 J를 사용한다.
3) 샘플의 준비
3.1) 단백질 농도에 기초하여, IMP321 샘플을 검정 희석액 중에서 대략 1.0 mg/mL로 희석한다. 새롭게 준비하고 새롭게 사용한다.
3.2) 위의 표에 설명된 바와 같이 적절한 농도에 대한 표준 곡선을 작성하기 위해 추가로 희석한다. 볼텍싱하여 희석액을 혼합한다.
3.3) 샘플에 대해 희석물 C 내지 J를 사용한다. 곡선의 선형 부분과 상부 및 하부 평탄역을 포함하도록, 필요한 경우 추가의 농도를 사용할 수 있다.
3. 옥테트(Octet) 시스템에서의 검출 단계
1) 10분 이상 동안 PBS 중에서 바이오센서를 수화시킨다
2) 검정 플레이트를 준비한다. 흑색 폴리프로필렌 마이크로플레이트에서, 웰당 200 μL의 PBS, 검정 희석액, AD 중의 IMP321의 적정물(titration), 또는 Raji 세포를 아래의 샘플 플레이트 맵에 따라 적절한 웰 내로 각각 옮긴다.
Figure 112019062703495-pct00013
Figure 112019062703495-pct00014
3) 아래에 설명된 매개변수 설정으로 역학(kinetic) 검정을 마련한다.
4) 데이터를 저장하기 위한 위치와 파일 명칭을 입력한다.
5) GO를 클릭하여 검정을 실행한다.
Figure 112019062703495-pct00015
4. 데이터 분석
1) 옥테트 데이터 분석(Octet Data Analysis) 소프트웨어에서, 분석할 데이터 폴더를 로딩한다.
2) 처리(Processing) 탭에서, 회합(Association) 단계를 선택한다. 이어서 "선택된 단계 정량(quantitate the Selected Step)"을 클릭한다.
3) 그에 따라 농도 정보를 입력한다.
4) 결과(Results) 탭에서, R 평형(Req)을 결합률 방정식으로 선택한다. 이 방정식은 실험 중에 생성된 결합 곡선에 들어맞고, 평형에서의 반응을 출력 신호로 계산할 것이다.
5) 결합율 계산(Calculate Binding Rate)을 클릭한다. 결과가 표에 자동으로 표시될 것이다.
6) 보고서 저장(Save Report) 버튼을 클릭하여 MS Excel 보고서 파일을 생성한다.
7) 4-파라미터 로지스틱 곡선-맞춤 프로그램인 SoftMax Pro를 사용하여 ug/mL로 표현된 IMP321 농도에 대한 결합률(nm)에 의해 표준 곡선 또는 샘플 곡선을 생성한다. 일 예가 도 10에 도시되어 있다.
8) 참조 표준과 샘플의 EC50 비를 사용하여 샘플의 상대적 결합 효능을 계산한다.
5. 시스템 적합성 및 검정 용인 기준.
검정은 다음 기준을 모두 충족하는 경우 유효하다.
1) 60% 이상의 즉시 사용 가능한 Raji 세포 생존력
2) 대조군의 상대 활성은 80% 내지 120% 이내이다
3) 2 이상의 대조군의 신호 대 배경 비(파라미터 D/파라미터 A).
4) 평행도(비교 가능성): 표준과의 기울기 비는 0.8 내지 1.4 이다.
5) 검정 대조군에 대한 결과가 위에 열거된 기준을 충족하지 않는 경우, 검정은 유효하지 않은 것으로 간주된다.
6.보고 가능한 값:
1) 임상 샘플의 경우, 샘플에 대한 보고 가능한 값은 아래에 자세히 설명된 바와 같이 2개 또는 3개의 유효하고 독립적인 검정 결과의 평균으로 정의된다.
차이 %는 다음과 같이 계산한다:
절대 값(검정 1의 결과 - 검정 2의 결과)/평균 값(검정 1의 결과, 검정 2의 결과) x 100%
2) 두 검정 결과의 차이 %가 20% 이하인 경우, 두 검정의 평균 결과를 보고한다.
3) 두 검정 결과의 차이 %가 20% 초과인 경우, 1회의 추가 유효 검정을 수행한다.
4) 3회의 샘플 검정 결과의 CV가 25% 이하인 경우, 3회 검정의 평균 결과를 보고한다.
5) 3회의 샘플 검정 결과의 CV가 25% 초과인 경우, 보고 가능한 값은 없다. 재시험 계획으로 불일치를 개시한다.
6) 샘플에 대한 보고 가능한 값이 COA에 열거된 명세를 충족하지 않는 경우, 재시험 계획으로 불일치를 개시한다.
7. 재시험 계획
다음과 같이 샘플의 재시험을 수행한다:
1) 3회의 유효하고 독립적인 검정으로 샘플을 재시험한다
2) 3회의 샘플 검정 결과의 CV가 25% 이하인 경우, 3회 검정의 평균 결과를 보고한다.
3) 3회의 샘플 검정 결과의 CV가 25% 초과인 경우, 보고 가능한 값은 없다.
4) 재시험 결과가 COA에 열거된 명세를 벗어난(OOS) 경우, 결론은 실패이다.
실시예 7
BLI 검정에서 용액 상태의 Raji 세포로의 고정된 IMP321의 특이적 결합의 결정
실시예 6에 설명된 바와 같은 BLI 검정을 이용하여 용액 상태의 상이한 농도(8E6/mL, 4E6/mL, 2E6/mL, 1E6/mL)의 Raji 세포로의 고정된 IMP321의 결합을 결정하였다. Jurkat 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 얻어진 회합 및 해리 곡선을 도 11(a)에 도시한다. 도 11(b)는 상이한 Raji 세포 농도에 대해 얻어진 결합 신호의 그래프를 도시한다. 결과는 결합 신호가 Raji 세포의 농도에 좌우됨을 보여주며, 즉, Raji 세포의 농도가 높을수록 얻어진 결합률과 상부 평탄역이 높아진다. 동일한 검정에서 Jurkat 세포의 특이적인 결합은 관찰되지 않았다.
실시예 6에 설명된 바와 같이, 그러나 Raji 세포로의 고정된 IMP321의 결합을 고정된 휴미라 또는 아바스틴의 결합과 비교하기 위해, 추가의 BLI 검정을 수행하였다. 얻어진 회합 및 해리 곡선을 도 12(a)에 도시한다. 도 12(b)는 상이한 고정된 단백질에 대해 얻어진 결합 신호의 그래프를 도시한다. 결과는 휴미라 또는 아바스틴이 아닌 IMP321이 Raji 세포에 결합함을 보여준다.
이러한 결과로부터 BLI 검정이 용액 상태의 Raji 세포로의 고정된 IMP321의 특이적 결합을 결정할 수 있다고 결론이 내려졌다.
실시예 8
BLI 검정에 의해 측정된 IMP321 결합 활성과 공지된 결합 효능의 상관 관계
상이한 수준의 Raji 세포 결합 효능을 갖는 참조 표준으로부터 희석된 IMP321의 샘플을 BLI 검정에서 사용하여 검정에 의해 측정된 결합 활성이 샘플의 공지된 결합 효능과 상관 관계가 있는지 여부를 결정하였다. 결과를 아래 표에 나타낸다. 도 13은 BLI 검정에 의해 측정된 결합 효능 백분율 대 이들의 예상 효능의 플롯을 도시한다.
Figure 112019062703495-pct00016
결과는 BLI 검정에 의해 측정된 결합 효능과 예상 결합 효능 사이의 양호한 상관 관계를 보여준다. 각 샘플의 평균 회수율은 90% 내지 110%이며, 결합 곡선의 양호한 평행도(즉, 용인 가능한 기울기 비 및 수렴된 평탄역)를 가졌다.
실시예 9
MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하기 위한 BLI 검정에서의 동결된 세포의 사용
배양액 또는 동결된 저장 용액으로부터 얻어진 용액 상태의 Raji 세포로의 고정된 IMP321의 결합을 비교하기 위해 실시예 6에 설명된 바와 같은 BLI 검정을 수행하였다. 용액 상태의 배양된 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321의 결합에 대해 얻어진 결합 신호의 플롯을 도 14(a)에 도시한다. 용액 상태의 미리 동결된 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321의 결합에 대해 얻어진 결합 신호의 플롯을 도 14(b)에 도시한다.
결과는 동결된 Raji 세포가 배양된 Raji 세포와 매우 유사하게 행동하므로 동결된 저장 용액이 새로운 배양 용액 대신 사용될 수 있는 바, 향상된 검정 견고성(robustness) 및 전이성(transferability)을 제공할 수 있음을 보여준다.
실시예 10
공정 중 샘플 시험
IMP321의 다양한 상이한 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하고, CCL4 방출 검정에 의해 결정된 바와 같은 제제의 생체 활성을 비교하기 위해 실시예 6에 설명된 바와 같은 BLI 검정을 수행하였다.
THP-1은 인간 단핵 백혈병 세포주이다. LAG-3 단백질 또는 스트레스가 가해진 샘플로 유도될 때, THP-1 세포는 CCL4 ELISA 키트로 정량될 수 있는 사이토카인인 CCL4를 분비한다. CCL4 방출 수준은 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 제제의 생체 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
Figure 112019062703495-pct00017
상이한 IMP321 샘플의 생체 활성은 CCL4 방출 검정에 의해 결정된 바와 같은 생체 활성과 상관 관계가 있다고 결론이 내려졌다.
실시예 11
스트레스가 가해진 IMP321 샘플의 BLI 검정 시험 및 세포-기반 CCL4 방출 검정과의 상관 관계
상이한 처리(PNGase 처리에 의한 탈글라이코실화, 37℃에서의 저장, 1% 또는 0.1% 과산화수소 처리에 의한 산화, pH 3.0, 3.6, 또는 3.1에서의 산 처리, pH 9.2, 9.75에서의 알칼리 처리, 또는 광 노출)에 노출된 IMP321 샘플의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하기 위해 실시예 6에 설명된 바와 같은 BLI 검정을 이용하였다. 결과를 도 15 내지 도 24에 도시한다.
도 15(a)는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 탈글라이코실화된 IMP321의 결합에 대한 세포-기반 검정에 의해 얻어진 다운스트림 CCL4 방출의 플롯을 도시하고;
도 15(b)는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 탈글라이코실화된 IMP321의 결합에 대한 BLI 검정에 의해 얻어진 결합 신호의 플롯을 도시한다.
도 16은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 (37℃에서 12일 동안) 부적절하게 저장된 IMP321의 결합에 대한 신호의 플롯을 도시한다. 도 16(a)에 도시된 결과는 CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정에 의해 얻어졌고, 도 16(b)에 도시된 결과는 BLI 검정에 의해 얻어졌다.
도 17은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 IMP321 또는 (37℃에서 1 개월 동안) 부적절하게 저장된 IMP321의 결합에 대한 신호의 플롯을 도시한다. 도 17(a)에 도시된 결과는 CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정에 의해 얻어졌고, 도 17(b)에 도시된 결과는 BLI 검정에 의해 얻어졌다.
도 18는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 IMP321 또는 (1% 과산화수소로) 산화된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 18a) 또는 BLI 검정(도 18b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 19는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 IMP321 또는 (0.1% 과산화수소로) 산화된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 19a) 또는 BLI 검정(도 19b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 20는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (pH 3.0에서) 산 처리된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 20a) 또는 BLI 검정(도 20b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 21은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (pH 3.1 또는 pH 3.6에서) 산 처리된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 21a) 또는 BLI 검정(도 21b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 22는 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (pH 9.2 또는 pH 9.75에서) 염기 처리된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 22a) 또는 BLI 검정(도 22b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 23은 Raji 세포로의 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (25℃에서 5일 동안) 광 노출된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 23a) 또는 BLI 검정(도 23b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
도 24는 상이한 농도의 고정된 미처리 또는 (25℃에서 10일 동안) 광 노출된 IMP321의 결합에 대한, CCL4 방출을 측정하는 세포-기반 검정(도 24a) 또는 BLI 검정(도 24b)에 의해 얻어진 신호의 플롯을 도시한다.
상이한 IMP321 샘플의 CCL4 방출에 의해 결정된 바와 같은 생체 활성을 (실시예 6에 설명된 방법에 의해 결정된) 이들의 MHC 클래스 II 결합 활성과 비교하여 아래의 표에 나타낸다:
Figure 112019062703495-pct00018
결과는 CCL4 방출에 의해 결정된 바와 같은 각각의 처리된 IMP321 샘플의 생체 활성과 본 발명에 따른 BLI 검정에 의해 결정된 바와 같은 이의 MHC 클래스 II 결합 활성 사이의 양호한 상관 관계를 보여준다. BLI 검정에 의한 MHC 클래스 II 결합 활성의 결정이 IMP321 제제의 생체 활성을 결정하는데 이용될 수 있다고 결론이 내려졌다.

Claims (24)

  1. 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하는 제제의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 방법으로서,
    바이오-층 간섭법(BLI)을 이용하여 MHC 클래스 II 분자로의 상기 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    MHC 클래스 II-발현 세포 상에 존재하는 MHC 클래스 II 분자로의 상기 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체는 BLI 프로브의 시약 층에 고정되고, 상기 MHC 클래스 II-발현 세포는 용액 내 존재하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 II-발현 세포는 1E6/mL 이상, 또는 4E6/mL 이상 또는 8E6/mL 이상의 밀도로 존재하는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 시약 층은, 상기 시약 층으로의 상기 MHC 클래스 II-발현 세포의 비특이적 결합을 최소화하도록 차단 시약으로 전처리된 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 차단 시약은 알부민, 또는 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는, 방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 II-발현 세포는 Raji 세포인, 방법.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 II-발현 세포는 동결된 저장 용액으로부터 얻어진, 해동된 즉시 사용 가능한 세포인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    복수의 상이한 농도의 상기 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체에 대해 상기 MHC 클래스 II 분자로의 상기 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합률을 결정하는 단계, 및 상기 결합률에 대해 용량-반응 곡선을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제제의 상기 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정하는데 사용된 조건과 동일한 조건 하에서, BLI를 이용하여 MHC 클래스 II 분자로의 참조 샘플의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체의 결합을 결정함으로써, 상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 참조 샘플의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 단계, 및
    상기 참조 샘플에 대해 결정된 상기 MHC 클래스 II 결합 활성을 상기 제제에 대해 결정된 상기 MHC 클래스 II 결합 활성을 비교하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 참조 샘플의 MHC 클래스 II 결합 활성은 100%로 설정되는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 참조 샘플은, MHC 클래스 II 결합 활성을 감소시키도록 처리된 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 참조 샘플의 LAG-3 단백질, 단편, 유도체, 또는 유사체는 탈글라이코실화되거나, 37℃에서 12일 이상 동안 저장되거나, 산화되거나, 산 또는 알칼리 처리에 의해 변성되거나, 5일 이상 동안 광에 노출된 것인, 방법.
  14. LAG-3 단백질의 단편, 유도체, 또는 유사체의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 BLI 프로브로서, 상기 LAG-3 단백질의 단편, 유도체, 또는 유사체가 고정된 시약 층을 포함하는, 프로브.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 시약 층은, 상기 시약 층으로의 MHC 클래스 II-발현 세포의 비특이적 결합을 최소화하도록 차단 시약으로 전처리된 것인, 프로브.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 차단 시약은 알부민, 또는 BSA를 포함하는, 프로브.
  17. LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체의 MHC 클래스 II 결합 활성을 결정하는 키트로서, 상기 LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체가 고정된 시약 층을 갖는 BLI 프로브 및 MHC 클래스 II-발현 세포를 포함하는, 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 BLI 프로브의 시약 층은, 상기 시약 층으로의 상기 MHC 클래스 II-발현 세포의 비특이적 결합을 최소화하도록 차단 시약으로 전처리된 것인, 키트.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 차단 시약은 알부민, 또는 BSA를 포함하는, 키트.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 II-발현 세포는 동결된 세포인, 키트.
  21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 Raji세포인, 키트.
  22. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 1E6/mL 이상, 4E6/mL 이상 또는 8E6/mL 이상의 밀도로 존재하는, 키트.
  23. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    LAG-3 단백질, 또는 그의 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하는 참조 샘플을 추가로 포함하는, 키트.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 참조 샘플의 MHC 클래스 II 결합 활성이 공지된, 키트.
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