NO328687B1

NO328687B1 - Rekombinant antistoff, anvendelse, fremgangsmate for fremstilling, nukleinsyre, vektor, vertcelle samt farmasoytisk preparat

Info

Publication number: NO328687B1
Application number: NO20005612A
Authority: NO
Inventors: Kathryn Lesley Armour; Michael Ronald Clark; Lorna Mcleod Williamson
Original assignee: Univ Cambridge Tech
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 2000-11-07
Publication date: 2010-04-26
Also published as: EP1075496B1; TR200003292T2; US7597889B1; DE69942178D1; KR20010034847A; NO20005612D0; GB9809951D0; PL343931A1; EE200000643A; ZA200005870B; EP1075496A1; HK1039624A1; ATE461940T1; RU2226196C2; WO1999058572A1; NZ507694A; KR100634853B1; AU752185C; AU752185B2; CA2326501C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante antistoff med aminosyresekvens som er avledet fra et modifisert konstant område i tungkjeden til immunglobulin G (IgG). Oppfinnelsen gjelder videre fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av slike polypeptider. Videre vedrører også oppfinnelsen nukleinsyrer som koder for effektordomenet av det rekombinant antistoffet, vektorer inneholdende nevnte nukleinsyre samt vertceller transfromert med nevnte vektor. Farmasøytisk preparat som omfatter nevnte rekombinante antistoff er også å anse som en del av foreliggende oppfinnelse.

Immunglobuliner

Immunglobuliner er glykoproteiner som bidrar til å beskytte verten mot infeksjon. De består generelt av tunge og lette kjeder, hvis N-terminale domener danner et variabelt domene eller V-domene som kan binde antigen. V-domenet er forbundet med et konstant eller C-terminalt domene, som definerer klassen (og noen ganger underklassen [isotype], og allotype [isoallotype]) av immunglobulinet.

Hos pattedyrarter foreligger immunglobuliner således som IgD, IgG, IgA, IgM og IgE. IgG-klassen foreligger for sin del som fire subklasser hos mennesker (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4). C-domenet i IgG omfatter tre domener Cyl, Cy2, Cy3, som er svært like mellom disse subklassene (over 90% homologi). Cyl - og Cy2-domenet er sammenkoblet med et hengsel. Subklassenes rolle varierer tilsynelatende mellom artene.

Det er kjent at C-domenet er ansvarlig for flere av immunglobulinets effektorfunksjoner (se Clark (1997) "IgG Effector Mechanisms" i "Antibody Engineering", red. Capra, Pub. Chem. Immunol. Basel, Kurger, bind 65, s. 88-110, for en detaljert oversikt).

Kort beskrevet, oppnås funksjonenen til IgG ved interaksjon mellom Fc-området i lg og en Fcy-reseptor (FcyR) eller et annet bindende molekyl, noen ganger på en effektorcelle. Dette kan få effektorcellene til å drepe målceller til hvilke antistoffene er bundet via sine variable (V) områder. Antistoffer rettet mot løselige antigener kan også danne im-munkomplekser som styres til FcyR, noe som fører til opptak (opsonisering) av immun-kompleksene eller aktivering av effektorcellene og frigivelse av cytokiner.

Hos mennesker har tre klasser av FcyR blitt karakterisert, selv om situasjonen kompliseres ytterligere ved at det foreligger flere reseptorformer. De tre klassene er: (i) FcyRI (CD64) binder monomert IgG med høy affinitet og uttrykkes på makrofager, monocyter, og, noen ganger, neutrofile og eosinofile celler. (ii) FcyRII (CD32) binder kompleksbundet IgG med middels til lav affinitet og uttrykkes på mange celletyper. Disse reseptorene kan inndeles i to viktige typer: FcyRIIa og FcyRIIb. "a"-formen av reseptoren finnes på mange celler som deltar i dreping (f.eks. makrofager, monocyter og neutrofile celler) og ser ut til å være i stand til å aktivere drepings-prosessen, og foreligger som to alternative alleler. "b"-formen ser ut til å spille en rolle i inhibitoriske prosesser og finnes på B-celler, makrofager, mastceller og eosinofile celler. På B-celler ser denne formen ut til å virke ved å undertrykke ytterligere immunglobulinproduksjon og i et bytte av isotype til f.eks. IgE-klassen. På makrofager, virker b-formen ved å inhibere fagocytose formidlet gjennom FcyRIIa. På eosinofile celler og mastceller kan b-formen bidra til å undertrykke aktivering av disse celler ved binding av IgE til sin særskilte reseptor. (iii) FcyRIII (CD 16) binder IgG med middels til lav affinitet og foreligger i to typer. FcyRIIIa finnes på NK-celler, makrofager, eosinofile celler og noen monocyter og T-celler, og formidler ADCC. FcyRIIIb uttrykkes i høyt nivå på neutrofile celler. Begge typer har forskjellige allotypiske former.

I tillegg til å bindes til FcyR, kan IgG-antistoffer aktivere komplement, og dette kan også føre til cellelysis, opsonisering eller til cytokinfrigivelse og inflammasjon. Fc-området formidler også egenskaper som transport av IgG til fosteret (via den såkalte "FcRn"), forlenget halveringstid (også antatt å formidles via en reseptor av FcRn-type - se Ghetie og Ward (1997) Immunology Today 18, 592-598) og selvaggregering. Fc-området er også ansvarlig for interaksjonen med protein A og protein G (hvis interaksjon synes å være analog med bindingen til FcRn).

Modifisering av immunglobuliner

Mange av de Fc-formidlede egenskaper som er diskutert ovenfor kan være ønskelige i naturlig forekommende eller kunstig konstruerte antistoffer. Det finnes imidlertid omstendigheter hvor særlig celledreping eller cytokinfrigivelse og resulterende inflammasjon er ugunstig og uønsket.

Det kan imidlertid likeså være ønskelig å bibeholde visse Fc-formidlede funksjoner, f.eks. den lange halveringstid i plasma.

Det er kjent at f.eks. humant IgG4, ikke aktiverer komplement og at humant IgG2 ikke bindes til høyaffinitetsreseptoren FcyRI, og disse har således tidligere blitt benyttet i noen situasjoner (TNF-reseptorfusjonsprotein ble fremstilt med IgG4 Fc).

Imidlertid mangler ingen human subklasse alle de relevante Fc-effektorutløsningsfunksjonene eller komplementaktivering under alle omstendigheter, muligens grunnet eksistensen av flere former av FcyR. Således kan f.eks. IgG4 utløse antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) i noen mennesker og IgG2 bindes til en allelisk form av FcyRIIa-reseptoren og aktiverer også komplement.

En alternativ tilnærming har vært å mutere Fc-sekvensen for å substituere aminosyrerester som er avgjørende for funksjonen. Visse målaminosyrer har blitt identifisert og publisert (se oversikt av Clark 1997, supra). Disse omfatter det N-koblede karbohydrat fes-tet til det konserverte sete i CH2-domenet, visse aminosyrerester i det nedre hengselområdet (f.eks. sekvensen ELLGGP) og en prolinrest i posisjon 331 og sekvensen E-x-K-x-K i posisjonene 318-322. Et ferskt eksempel beskrives av Cole et al. (1997) Journal of Immunology 159, 3613-3621.1 den beskrivelsen ble aminosyrerestene 234,235 og 237 mutert til alaniner (eller når det gjelder 235, noen ganger til Glu). Disse er imidlertid alle uvanlige aminosyrerester i disse posisjoner i humant IgG, forekomst av slike util-passede aminosyrer kan således gjøre Fc mer immunogent eller antigent og kan også føre til tap av visse ønskelige Fc-funksjoner.

Igjen har denne strategi blitt benyttet for konstruksjon av et terapeutisk, aglykosylert CD3-antistoff (se Routledge et al. 1993, Eur. J. Immunol. 23:403-411; se også UK PA 9206411.9 og for et inhibitorisk CD18-antistoff. En ulempe her er imidlertid at de nye rekombinante konstruksjoner har uvanlige sekvenser og kan gjenkjennes og avvises av immunsystemet som fremmed. Aglykosylerte antistoffer mangler også binding til den inhiberende reseptor FcyRIIb, mens opprettholdelse av denne binding kan være fordelaktig i noen anvendelser.

WO9805787 beskriver en fremgangsmåte for å hemme antistoff avhengig cytotoksisitet og komplement formidlet celle lysis ved å modifisere deler av Ig-konstant regionen. Bibeholdelse av FcyRIIb aktivitet er ikke omtalt, ei heller et kimært effektor domene som har følgende aminosyrer ved de gitte posisjoner: 233P, 234V, 235A og 236G og 327G, 3 3 OS og 331S. I tillegg til dette inkluderer konstruktene som er omtalt i WO9805787 minst en av de følgende endringer: CH2 domenet slettet, Gly237 til Ala

(ikke naturlig IgG), Glu318, Lys320 og Lys322 til Ser (ikke naturlig IgG) og Pro331 til Ala (ikke naturlig IgG).

US5624821 beskriver fremgangsmåte for fremstilling av antistoff med endret effektor domene, der affiniteten til effektor ligander, slik som FcR og Cl komponent av komplement, er blitt forandret. Bibeholdelse av FcyRIIb aktivitet er ikke omtalt, og samtlige av modifikasjoner involverer innskudd av ikke-naturlig IgG rester.

Andre tilnærminger til modifisering av immunglobuliner beskrives i WO 92/16562 (Lynxvale Ltd.) som beskriver modifisering av allotypen til det humaniserte IgGl-antistoff CAMPATH1H, som har bindingsaffinitet overfor antigen CD52. CD52-antigenet finnes på humane lymfocyter og monocyter og har blitt benyttet som terapeutisk mål for behandling av T- og B-cellelymfomer og -leukemier, immunsuppresjon av organ- og benmargstransplantatmottakere og også behandling av noen autoimmune og beslektede sykdommer, f.eks. reumatoid artritt og systemisk vaskulitt.

WO 95/05468 (Lynxvale Ltd.) beskriver også modifisering av allotypiske determinanter i lg (eller derivater) med ønskede bindingsfunksjoner eller andre effektorfunksjoner.

Fra det ovenstående kan det ses at tilveiebringelse av fremgangsmåter eller materialer som kan forenkle modifisering av Fc-områder slik at uønskede virkninger reduseres samtidig som ønskede egenskaper bibeholdes eller forsterkes, vil utgjøre et bidrag til faget.

De foreliggende oppfinnere har benyttet nye kombinasjoner av humane IgG-subklassesekvenser for frembringelse av kimære polypeptider som omfatter ikke-naturlige, humanetterlignende Fc-sekvenser som ikke desto mindre mangler evnen til å aktivere komplement eller utløse cytotoksiske aktiviteter gjennom FcyR. Samtidig har visse ønskede IgG-egenskaper blitt bibeholdt. Polypeptidene inneholder f.eks. ikke "ikke-humane" aminosyrer, og har derfor sansynligvis redusert immunogenisitet. Videre bindes de fortsatt til protein A, noe som er i samsvar med at de kan passere den humane placenta via interaksjon med FcRn (den neonatale Fc-reseptor).

Måten som disse sekvensene ble utviklet på og visse påviste egenskaper vil diskuteres i mer detalj i det påfølgende. Kort beskrevet, utformet imidlertid oppfinnerene flere konstruksjoner basert på tre forskjellige IgG-sekvenser (1, 2 og 4). Selv om de relevante områder i disse antistoffer er homologe, er de ikke nøyaktig like lange, noe som komp-liserer prosessen å frembringe deriverte sekvenser som bibeholder aktiviteter fra de naturlige sekvenser. De konstruerte antistoffer ble sammenlignet med utgangsantistoffene i forbindelse med antigenmodellsystemer RhD (Fogl) og CD52 (CAMPATH-1H). Overraskende nok ble det utviklet en rekke sekvenser med den ønskede kombinasjon av aktiviteter som ikke forelå i utgangsmolekylene. Generelt beskrevet, omfattet disse et eller flere områder eller blokker som inneholdt en modifikasjon (generelt 2, 3 eller 4 aminosyrer) som var i samsvar med det tilsvarende området fra en forskjellig subklasse. To spesielle områder eller blokker av interesse var 233-236 og 237,330,331.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et rekombinant antistoff, kjenne-tegnet ved at nevnte molekyl er et rekombinant polypeptid som omfatter:

(i) et bindingsdomene som kan bindes til et målmolekyl, og

(ii) et effektordomene;

hvor nevnte rekombinante antistoff er i stand til å binde mål molekylet uten å utløse vesentlig komplement avhengig lysering eller celle mediert destruksjon av målet, og hvor effektor domenet er

- istand til spesifikt å binde FcyRIIb, og

- et kimært domene som er avledet fra to eller flere humane immunoglobulin tungkjede Ch2-domener, der de humane immunoglobuliner er valgt blant IgGl,

IgG2 og IgG4,

og hvori det kimære domenet er et humant immunoglobulin tung kjede Ch2-domene som har følgende aminosyrer ved de gitte posisjoner: 233P, 234V, 235A og 236G og 327G, 330S og 33IS i samsvar med EU-nummereirngssystemet (se Kabat et al. "Se-quences of proteins of immunological interest". Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH, 1991), og er minst 98% identisk med en Ch2 sekvens (restene 231-340) fra humant IgGl, IgG2 eller IgG4 som har de nevnte modifiserte aminosyrer.

Således har de rekombinante antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse forbedrede kliniske egenskaper (f.eks. i forbindelse med "blokkerende" antistoffer). Dette oppnås ved tilveiebringelse av et Fc-avledet effektordomene med redusert affinitet for FcyRI, FcyRIIa og FcyRIII, men som bibeholder evnen til å binde FcyRIIb.

Generelt kan reduksjonen i affinitet som effektorområdet har for reseptoren FcyRI (sammenlignet med et Fc-område fra hvilket det er avledet), i foretrukne utførelser være av størrelse 100 ganger eller mer. For visse av reseptorene med lavere affinitet diskutert ovenfor, kan reduksjonen i affinitet være lavere, f.eks. tilnærmet 2-10 ganger, selv om den i de mest foretrukne utførelser kan være så høy som 500 ganger. Generelt kan den tilsvarende reduksjon i aktivitet i kjemiluminiscensanalysen (som beskrevet i mer detalj nedenfor) være så høy som 30-300 ganger. Den reduserte komplementaktivitet kan være av størrelse 50 ganger. Det tilsvarende tall for ADCC kan være mye høyere, f.eks. 10 000 ganger. Fagfolk vil imidlertid forstå at kombinasjonen av disse (reduserte) aktiviteter fortsatt kan være gunstig i visse anvendelser, uavhengig av det nøyaktige reduk-sjonsnivå.

Selv om IgGl/IgG2- og IgGl/IgG4-kimærer har blitt fremstilt tidligere (se f.eks. Mor-gan et al. (1995) Immunology 86:319-324 eller Chappel et al. (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:9036-9040, eller Greenwood et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:1098-1104), har ingen av disse blitt vist å besitte den kombinasjon av egenskaper som besittes av de rekombinante antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.

De forskjellige funksjoner av det rekombinante antistoff kan måles uten problemer av fagfolk, f.eks. ved å benytte fremgangsmåter som beskrevet nedenfor eller fremgangsmåter som er analoge med disse. For eksempel, kan FcyR-bindingsegenskapene måles direkte eller indirekte, f.eks. ved manglende evne til å utløse monocytkjemiluminiscens.

Nærmere bestemt kan manglende evne til å utløse signifikant komplementavhengig lysis (som generelt vil skyldes redusert affinitet for Clq-molekylet) måles ved CR-51-frigivelse fra målceller i nærvær av komplementbestanddelene, f.eks. i form av serum (som beskrevet nedenfor), hvorved det rekombinante antistoff utløser mindre enn 5%, fortrinnsvis mindre enn 2%, spesifikk målcellelysis.

På tilsvarende måte kan celleformidlet ødeleggelse av målet anslås ved CR-51-frigivelse fra målceller i nærvær av egnede cytotoksiske celler, f.eks. mononukleære effektorceller fra blod (som beskrevet nedenfor), hvorved det rekombinante antistoff forårsaker mindre enn 5%, fortrinnsvis mindre enn 2%, målcellelysis.

Som et alternativ til direkte måling, kan funksjonaliteten utledes fra evnen til å inhibere disse egenskaper i funksjonelle immunglobuliner. Ved f.eks. å tilveiebringe en beskyt-tende virkning mot komplementlysis av celler eller dreping av celler (f.eks. ved ADCC), eller ved å inhibere monocyters respons på sensitiviserte celler.

Flere mutante immunglobuliner basert på IgGl, IgG2 eller IgG4 med de angitte egenskaper har blitt fremstilt og vist å ha de ønskede egenskaper. Selv om noen av de enkel-te aminosyrerestmutasjoner har blitt innført i bindende molekyler ifølge teknikkens stand, er de angitte kombinasjoner nye, likeså de oppnådde funksjonaliteter.

Foretrukne rekombinante antistoff vil nå beskrives i mer detalj:

Effektordomenet

Peptidet er i stand til å spesifikt binde FcyRIIb, og omfatter et kimært domene som er avledet fra to eller flere humane immunoglobulin tungkjede CH2-domener, der de humane immunoglobuliner er valgt blant IgGl, IgG2 og IgG4, og hvori det kimære domenet er et humant immunoglobulin tung kjede CH2-domene som har følgende aminosyrer ved de gitte posisjoner: 233P, 234V, 235A og 236G og 327G, 330S og 331S i samsvar med EU-nummereringssystemet, og er minst 98% identisk med en Ch2 sekvens (restene 231-340) fra humant IgGl, IgG2 eller IgG4 som har de nevnte modifiserte aminosyrer.

En rekke sekvenser for humane C-områder har blitt publisert, se f.eks.Clark (1997) supra. Andre sekvenser for tungkjeder fra humane immunglobuliner kan erholdes fra da-tabasene SwissProt og PIR ved benyttelse av programvaren Lasergene (DNAStar Limi-ted, London UK) under aksesjonsbetegnelsene A93433, B90563, A90564, B91668, A91723 og A02146 for C-området fra human Igy-kjede, A93906, A92809, A90752, A93132, A02148 for C-området fra human Igy2-kjede, A90933, A90249, A02150 for C-området fra human Igy4-kjede, og A23511 for C-området fra human Igy3-kjede.

Homologi (eller identitet eller likhet) kan anslås ved enhver egnet fremgangsmåte. Ho-mologien kan foreligge på kodende nukleotidsekvensnivå eller på kodet aminosyresek-vensnivå. Med "idet vesentlige homolog" menes at den angjeldende aminosyresekvens deler minst tilnærmet 50% eller 60%, eller 70%, eller 80% homologi, mest foretrukket minst tilnærmet 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% homologi med referanseimmun-globulinet.

Likhet eller homologi kan være som definert og bestemt ved programmet TBLASTN, til Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10, som benyttes som standard innen faget, eller, og dette kan foretrekkes, standardprogrammet BestFit, som er en del av Wisconsin-pakken, versjon 8, september 194, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 537119.

BestFit lager en optimal sammenstilling av segmentet med best likhet mellom to sekvenser. Optimale sammenstillinger finnes ved innføring av gap for maksimalisering av antall tilpassede aminosyrerester, ved benyttelse av den lokale homologialgoritme til Smith og Waterman.

Denne beregning kan utføres uten problemer av en gjennomsnittsfagmann i forbindelse med måling av den ønskede kombinasjon av aktiviteter, for å gjenkjenne et molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse.

I tillegg til å ha redusert affinitet for FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa og FcyRIIIb, kan det væ-re ønskelig at en evne til å bindes til den "inhiberende" reseptor FcyRIIb bibeholdes eller i en viss grad besittes av effektormolekylet, og at affiniteten fortrinnsvis er høyere enn affiniteten for FcyRIIa-reseptoren, og mer foretrukket tilsvarende affiniteten til et utgangs-Ig-domene som det rekombinate antistoff er avledet fra. Resultater oppnådd av de foreliggende oppfinnere tyder på at de rekombinante antistoff som de har utviklet har denne egenskap. Til nå har det ikke vært innsett innen faget at binding av Fc-områder til FcyRIIa og FcyRIIb kan manipuleres uavhengig av hverandre. Denne evne kan kom-plementere de andre påkrevede funksjoner (som vist ved evnen til å binde protein A) for å øke den terapeutiske anvendbarhet av det rekombinante antistoff.

Særlig har et antall publikasjoner rettet søkelyset mot den viktige rolle som FcyRIIb kan spille når det gjelder inhibering av cellulære prosesser (se Daeron et al., 1995 hnmunity 3(5): 635-46; Van den Herik et al, 1995 Blood 85(8):2201-11; Sarmay et al., 1996 Immunol. Lett. 54(2-3):93-100; Fong et al., 1996 Immunol. Lett. 54(2-3): 83-91; Sarmay et al., 1996 J. Biol. Chem. 271(48):30499-504; Unkeless & Jin, 1997 Curr. Opin. Immunol. 9(3):338-43; Isakov, 1997 Immunol. Res. 16(1):85-100; Hunter et al., 1998 Blood 91(5):1762-8; Malbec et al., 1998 J. Immunol. 160(4): 1647-58; Clynes et al., 1999 J. Exp. Med. 189(l):179-85). Disse forskere viste at FcyRIIb ved kryssbinding til andre reseptorer kan inhibere signalisering fra disse, og derved inhibere prosesser som B-celleaktivering, mastcelledegranulering og fagocytose ved makrofager.

rekombinante antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som bibeholder denne aktivitet,

kunne således benyttes ikke bare for å konkurrere med og kompetitivt inhibere uønskede antistoff-antigen (f.eks. autoantigener eller alloantigener)-interaksjoner, men også for ikke-kompetitiv inhibering av disse prosesser, f.eks. ved å forhindre ytterligere produk-sjon av autoantistoff eller alloantistoff ved inhibering av B-celleaktiveringen. Andre eksempler på anvendelser for denne inhiberende virkning diskuteres nedenfor i forbindelse med terapeutiske midler for allergi og astma (inhibering av mastcelledegranulering) og anti-RhD-molekyler (inhibering av fagocytose).

De mest foretrukne CfÆ-sekvenser er vist i figur 17, særlig de betegnet GlAab, G2Aa, hhv. GlAac.

Enhver av disse sekvenser kan kombineres med (f.eks. være direkte koblet til) naturlig eller modifisert Ch3 og naturlig eller modifisert hengselområde, samt, om ønskelig ChI-sekvenser, i molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fagfolk vil imidlertid forstå at det ikke er noe krav at andre deler av effektordomenet (eller andre domener i molekylet) omfatter naturlige sekvenser - særlig kan det være ønskelig å kombinere sekvensmodifikasjonene beskrevet heri med andre, f.eks. utvalgt fra litteraturen, med kun det forbehold at de påkrevede aktiviteter bibeholdes. Fagman-nen vil forstå at rekombinante antistoff som omfatter slike ytterligere modifiserte (f.eks. ved aminosyreaddisjon, -insersjon, -delesjon eller -substitusjon) effektordomener faller innenfor foreliggende oppfinnelses område.

Spesielt foretrukket kan "null-allotype"-sekvenser være, f.eks. sekvenser avledet fra tungkjeden i IgG (se WO 92/16562), hvori allotypiske aminosyrerester er mutert slik at de tilsvarer restene funnet i molekyler fra andre humane IgG-underklasser. Dette kan minimalisere sekvensene som oppfattes som fremmede i et gitt individ.

Bindingsdomenet og målmolekyl

Peptidmolekylet omfatter et bindingsdomene som kan bindes til et målmolekyl.

Bindingsdomenet vil ha en evne til å interagere med et målmolekyl som fortrinnsvis vil være et annet polypeptid, men som kan være et hvert mål (f.eks. karbohydrat, lipid (som fosfolipid) eller nukleinsyre). Interaksjonen vil fortrinnsvis være spesifik. Bindingsdomenet kan være avledet fra samme kilde som effektordomenet eller fra en annen kilde.

Mens f.eks. effektordomenet generelt vil være avledet fra et antistoff, kan bindingsdomenet være avledet fra et hvert molekyl med spesifisitet overfor et annet molekyl, f.eks. et enzym, et hormon, en reseptor (cellebundet eller sirkulerende), et cytokin eller et antigen (som bindes spesifikt til et antistoff).

Domenet omfatter fortrinnsvis hele eller en del av et antistoff eller et antistoffderivat, fortrinnsvis et naturlig eller modifisert variabelt domene fra et antistoff. Således kan et rekombinat antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte et bindingsdomene fra et antistoff med opphav i en gnager eller camelidae (se WO 94/25591) og en tungkjede fra et humant immunglobulin, som diskutert ovenfor.

Videre foretrekkes molekyler med mer enn en type bindingsdomene, f.eks. bispesifikke antistoffer (se f.eks. PCT/US92/09965). I disse tilfeller bindes en "arm" til en målcelle og den andre "arm" til en annen celle, noe som utløser dreping av målcelle. I slike tilfeller kan det være ønskelig å minimalisere virkningen av effektordelen, som ellers kunne tenkes å aktivere ytterligere celler, noe som ville interferere med det ønskede resultat. "Armene" selv (dvs. bindingsdomenet) kan være basert på Ig-domener (f.eks. Fab) eller de kan være fra andre proteiner, som i et fusjonsprotein, som diskutert i mer detalj nedenfor.

Det rekombinante antistoff kan omfatte mer enn en polypeptidkjede bundet sammen, f.eks. kovalent eller på annet vis (f.eks. hydrofob interaksjon, ionisk interaksjon eller sammenkoblet via sulfidbroer). Det kan f.eks. omfatte en lettkjede i forbindelse med en tungkjede som utgjør effektordomenet. En hver egnet lettkjede kan benyttes, for eksempel er den vanligste kappe-lettkjedeallotype Km(3) i den generelle befolkning. Det kan derfor være ønskelig å benytte denne vanlige kappa-lettkjedeallotype, siden relativt få medlemmer av befolkningen ville oppfatte denne som fremmed.

Målet vil typisk være et antigen som foreligger på en celler eller en reseptor med en løselig ligand som antistoffet konkurrerer om.

Målet kan utvelges som et terapeutisk mål, hvorved det er ønskelig å binde til det et molekyl med egenskapene diskutert ovenfor, f.eks. for å konkurrere med eller forskyve uønskede antistoffer fra det. Alternativt kan det i seg selv være ønskelig å bindes til målmolekylet uten å forårsake celleformidlet ødeleggelse, antistoffutløst inflammasjon eller komplementlysis. På tilsvarende måte kan effektordomenet fungere primært ved å formidle transport og/eller forbedret serumhalveringstid - i slike tilfelle kan bindingsdomenet og målmolekylet være et hvert system som ville dra fordeler av disse egenskaper.

Et utvalg av anvendelser hvori rekombinante antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes som terapeutiske antistoffer med inerte (i visse henseende) Fc-områder er beskrevet nedenfor: 1) Konkurranse med maternelle IgG-alloantistoffer for en antigen epitop på blodceller fra fosteret.

Alloimmune forstyrrelser omfattende fetale blodceller har en felles patogenese. Denne omfatter syntese av IgG-alloantistoffer hos moren rettet mot et paternelt nedarvet antigen på fetale røde blodceller, granulocyter eller blodplater. Dette følges av transplacen-tatransport av alloantistoffet. I fosteret foregår en destruksjon av antistoffbelagte fetale blodceller, noe som fører til en klinisk signifikant reduksjon av nivået av de relevante celler i sirkulasjonen. Terapeutiske antistoffer rettet mot den relevante epitop, men med et Fc-område som ikke utløser ødeleggelse, kunne konkurrere med maternelt antistoff for binding til fetale celler og således inhibere ødeleggelse av disse.

Antistoffer mot røde blodcellealloantigener fører til hemolyttisk sykom hos fosteret

De viktigste alloantigener på røde blodceller foreligger i blodgruppesystemene Rhesus

og Keil. Hyppigheten av hemolyttisk sykdom grunnet RhD-antigenet har blitt dramatisk redusert etter innføring av postnatal profylakse, men det opptrer fortsatt tilfeller grunnet maternell sensitivisering under den første graviditet. Andre Rhesus-antigener (C, c, E, e) kan også gi hemolyttisk sykdom, likeså antistoffer mot Keil (Kl)-antigenet, som i tillegg svekker erytropoiesen i fosterets benmarg.

Dagens behandling av alvorlig påvirkede fostere består i regelmessig intrauteirntrans-fusjon av antigennegative røde blodceller. Infusjon av ikke-spesifikt immunglobulin har ikke vist seg å være effektivt ved denne tilstand. Anemi og hyperbilirubinemi hos fosteret kan kreve utbyttingstransfusjon og/eller fototerapi.

Eksperimenter som benytter inerte Fc-konstruksjoner med RhD-spesifisitet (betegnet Fog-1) har vist manglende evne hos disse til å utløse effektormekanismer (monocytaktivering bestemt ved kjemiluminiscens og ADCC), og har viktig nok blitt vist å inhibere kjemiluminiscens og ADCC utløst av humant serum inneholdende polyklonalt anti-D. ADCC og kjemiluminiscens har tidligere blitt vist å korrelere med ødeleggelse av røde blodceller in vivo. Tidligere publiserte arbeider har også påvist evnen til Fog-1 til å konkurrere med hovedmengden av humane anti-D-sera for epitoper på RhD-proteinet.

Antistoffer mot blodplatealloantigener fører til alloimmun trombocytopeni hos fosteret Det mest relevante antigen er det humane blodplateantigen (HPA)-la. HPA-la-antistoffer fører til komplikasjoner i 1 av 350 normale svangerskap og fører til alvorlig trombocytopeni hos 1 av 1200 fostere. De hardest rammede tilfeller fører til intrakranial blødning eller død. Dagens muligheter for behandling er ukentlige transfusjoner av HPA-la-negative blodplater (noe som medfører 0,5%/behandling fare for fosterdød), og intravenøst immunglobulin i høy dose gitt til moren, noe som har variabel og uforutsig-bar effektivitet. HPA-la defineres ved en enkelt epitop på blodplateglykoprotein Illa (GPIIIa) og et enkeltkjedet Fv som gjenkjenner denne epitop er tilgjengelig fra Univer-sity of Cambridge Division of Transfusion Medicine (Griffin HM, Ouwehand WH. A human monoclonal antibody specific for the Leucine-33 (PA<A1>, HPA-la) form of platelet glycoprotein Illa from a V gene phage display library. Blood 1995; 86:4430-4436). Binding av et antistoff basert på denne konstruksjon til humane blodplater har blitt vist å inhiberes av humane anti-HPA-la-sera. Inhiberingen var mest påtagbar for sera med det høyeste titer av spesifikke antistoffer, som var forbundet med den mest alvorlige sykdom. Dette tyder på at det rekombinante antistoff og antistoffer i serum bindes til den samme epitop på blodplatene.

I anvendelsene beskrevet ovenfor og i de beskrevet nedenfor, kan de terapeutiske antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse i tillegg til å ha en kompetitiv bindingsvirkning også utløse en fordelaktig inhiberende virkning via FcyRIIb.

2) Konkurranse med autoantistoff for epitop på autoantigen.

Autoantistoff- formidlet ødeleggelse av blodceller

Hemolytisk anemi ved IgG-autoantistoffer av "varm" type og trombocytopeni grunnet autoantistoffer har en felles mekanisme for ødeleggelse av blodceller. I begge er autoantistoffer rettet mot et utvalgt repertoar av autoantigener (Rh og K på røde blodceller og GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V på blodplater). Binding av autoantistoffet reduserer blodcellens levetid, noe som fører til anemi hhv. trombocytopeni. Det er ikke usansynlig at autoantistoffer mot røde blodceller og blodplater er rettet mot et begrenset antall B-celleepitoper på de tilsvarende autoantigener. Antistoffer med rekombinante variable domener rettet mot disse epitoper kan frembringes ved V-gen-fagfremvisningsteknologi. Terapeutiske antistoffer mot de relevante epitoper, men med inert Fc, kunne konkurrere med pasientens blodcelle-autoantistoffer for binding til autoantigenet og således inhibere ødeleggelsen av blodcellen.

Goodpasture ' s syndrom ( anti- glomerulusbasal membran [ GBM]- sykdom)

Dette er en hovedårsak til hurtigutviklende glomerulonefritt som fører til lungeblødning og nyresvikt i sluttstadiet, uker eller måneder eller sykdommens inntreden. Konvensjo-nell behandling bygger på dialyse kombinert med intensiv plasmautbytting og immun-suppressiv behandling, som i seg selv kan kompliseres ved livstruende, opportunistiske sopp- og virusinfeksjoner. Det foreligger overveldende bevismateriale for at denne sykdom formidles av autoantistoffer, og autoantigenet har blitt lokalisert til type IV-kollagen, en hovedbestanddel i GBM. Det har blitt vist at autoantistoffer i GBM-sykdom bindes til ikke-kollagendomenet (NC1) i a3(IV)-kjeden. Genet som koder for denne sekvens (COL4A3) er klonet og sekvensert. Vi foreslår at virkningen av skadeli-ge anti-GBM-autoantistoffer kan nøytraliseres med et monoklonalt, konkurrerende IgG-molekyl som er rettet mot den immundominante epitop i ct3(IV)NCl og som har blitt utformet med et biologisk inaktivt Fc-domene. Vi vil utvikle et rekombinant, kimært IgG-antistoff som bindes til den immunodominante a3(IV)NCl -epitop, men som mangler de klassiske effektorfunksjoner. Vi vil kunne oppnå dette, siden genene som koder for de variable domener i anti-a3(IV)NCl fra mus har blitt isolert og karakterisert (Pu-sey CD et al., Lab Invest 1987, 56:23-31 og Ross CN, et al, Lab Invenst 1996, 74:1051-1059).

Igjen kan de terapeutiske antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse i tillegg til en kompetitiv bindingsvirkning også utløse en gunstig inhiberende virkning via FcyRIIb.

3) Allergi og astma

Allergier og astma er en følge av uheldige immunresponser mot vanlige antigener i mil-jøet, f.eks. proteiner fra gresspollen, husstøvmidd og mange andre vanlige antigenkilder, hvor et eksempel er Der P 1-proteinet fra husstøvmiddel Dermatophagoides pteronyssinus. Påvirkede individer produserer immunglobuliner i høyt nivå, særlig immunglobuliner av IgE-klassen. Disse IgE-antistoffene kan bindes til høyaffinitets-Fc-epsilon-RI-reseptoren på mastceller og på eosinofile celler. Kryssbinding av reseptorbundet IgE ved allergenet fører til aktivering av cellene og degranulering. Dette frigir en rekke in-flammasjonsformidlere som kan gi alvorlige symptomer eller til og med død som følge av en anafylaktisk reaksjon. Man kan forestille seg to virkningsmekanismer for et blokkerende antistoff. For det første, vil et IgG-antistoff med inert Fc-område kunne konkurrere med IgE om binding til allergenet. Dette ville forhindre kryssbinding av IgE og således forhindre aktivering av cellene. For denne mekanisme må IgG-antistoffet med inert Fc konkurrere direkte med IgE om binding til allergenet.

En annen og vesentlig mekanisme ville omfatte en negativ signalliseirngsrolle via FcyRIIb-reseptoren. Det har blitt vist at kryssbinding av FcyRIIb og Fc-epsilon RI fører til inhibering av aktiveringssignalene som normalt observeres når kun Fc-epsilon RI-reseptorer kryssbindes. Således vil innføring av et IgG-antistoff med en Fc-bindingsevne for Fc-gamma Rllb og antigenspesifisitet for et allergen kunne føre til en inhibering av aktiveringen av IgE-belagte mastceller og eosinofile celler. For dette må IgG-antistoffet også kunne formidle sin kraftige negative virkning dersom det er bundet til allergenet i et annet sete enn IgE, slik at begge kan bindes til allergenet samtidig.

4) Inflammatoriske forstyrrelser, f.eks. Crohn ' s sykdom

Det finnes en rekke forstyrrelser i immunsystemet som ser ut til å skape sykdom som følge av en kronisk aktiveringstilstand for immunceller (leukocyter), innbefattet T-lymfocytter, neutrofile celler og NK-celler. Denne kroniske aktivering ses normalt som en inflammasjonstilstand med kontinuerlig migrering av aktiverte celler inn i de påvirk-de vev. For å kunne migrere inn i vevet, må cellene motta og respondere på inflammatoriske formidlere og så regulere adhesjonsmolekyler som tillater dem først å adherere til cellene som bekler blodkarveggene og deretter å migrere mellom cellene i karveggene og inn i vevet. Det bør kunne være mulig å stoppe denne inflammasjonssyklus ved en-ten å blokkere adhesjonsmolekylene på leukocytoverflaten eller de tilsvarende ligander på de aktiverte epitelceller som bekler karveggene. Et slikt aktiveringsantigen er VAP-1, og et antistoff med inert Fc som bindes til dette molekyl bør kunne forhindre leuko-cytadherering og migrering til inflammasjonsseter og således bryte den kroniske aktive-ringssyklus.

5) Inhibering av ligand/reseptor-interaksjon

Sigdcellesykdom

Homozygositet for en variant av humant hemoglobin som særpreges ved en substitusjon av glutaminsyre med valin (HbSS) fører til kronisk hemolyse og en tendens for molekylet til å gjennomgå taktoiddannelse i deoksygenert tilstand. Dette fører til at de røde blodceller inntar en sigdform i mikrosirkulasjonen, noe som fører til sigd-"kriser" i nær-liggende områder. Disse kan være trombotiske (i ben, lunge, hjerne eller abdomen), aplastiske, hemolyttiske eller forbundet med massiv sekvestrering av røde blodceller i milt og lever. Det har blitt postulert at de røde blodceller under disse kriser adhererer til endotelceller. Denne adhesjonsprosess er basert på interaksjonen mellom flere reseptorer og deres respektive ligander. To av de dominante adhesjonsreaksjonsveier er interaksjonen mellom luteran og laminin og mellom trombospondin og et ennå ikke definert lipid i membranen hos røde blodceller. I dyreforsøk har vi erholdt bevis for at antistoffer med rekombinant humant variabelt domene, rettet mot trombospondin, reduserer adhe-sjonen av sigdformede røde blodceller til endotelceller. Vi postulerer at tilsvarende antistoffer med rekombinant variabelt domene, rettet mot det lamininbindende domenet i luteran (domenet nærmest membranen) som blokkerer interaksjonen med laminin kan uvikles ved V-genfagfremvisning. Disse variabelt domeneantistoffragmentene kan ut-styres med inerte Fc-domener for fremstilling av terapeutiske antistoffer som kan interferere med adhesjon av sigdformede røde blodceller til endotelceller uten å forårsake ødeleggelse av røde blodceller.

Antistofformidlet blokkering av kollagenreseptorer på blodplater

Vi har omfattende bevismateriale for at to reseptorer er avgjørende for blodplateaktive-ring via subendotelkollagener, en begivenhet som innleder trombosen; integrin CI2P1 (blodplate-glykoprotein Ia/Ila) hvis funksjon vi ser som primært adhesiv, og ikke-integringlykoprotein VI (GpVI) som anses som nødvendig for aktiveringen, og går forut for sekresjon og aggregering. Rekombinante humane antistoffer som gjenkjenner forskjellige domener i hver reseptor kan frembringes ved V-genfagfremvisning, og disse kan benyttes for fremstilling av utgangsantistoffer med inert Fc-domene for kollagenba-sert antitrombosebehandling. Disse kan benyttes for å lindre koronar trombose, resteno-se etter angioplasti og trombosekomplikasjoner forbundet med "bypass"-transplantasjon. 6) Monoklonale antistoffer benyttes noen ganger for blokkering av cellefunksjoner, f.eks. benyttes OKT3 for immunsuppressjon av T-celler ved å blokkere T-cellereseptoren, og CD18-antistoffer benyttes for å forhindre celle-celleadhesjon via integrinmolekylene. Binding av Fc til Fc-reseptorer kan imidlertid utløse alvorlige bivirkninger ved stimulering av cytokinfirgivelse og inflammasjon. 7) Fc-områder fra antistoffer kobles noen ganger til andre rekombinante proteiner for erholdelse av fusjonsmolekyler med forlenget biologisk halveringstid. Således har TNF-reseptoren blitt koblet til humant IgG4-Fc for frembringelse av et molekyl som inhiberer virkningene av løselig TNF, og CTLA4 har blitt fremstilt som et fusjonsprotein med IgG-Fc og blitt benyttet for blokkering av signalisering via B7-koreseptor (en ligand for CTLA4)-molekylet på celleoverflaten. Igjen er imidlertid cytokinutløsning via Fc-delen av fusjonsproteinet uønsket. V-domener eller andre bindingsområder, som er egnede for de anvendelsestyper som er diskutert ovenfor, vil være velkjente for fagfolk. For eksempel beskrives et CD3-bindende domene (f.eks. YTH12.5) av Routledge et al. (1991). Eur. J. Immunol. 21, 2717-2725 og Bolt et al., (1993) Eur. J. Immunol. 23,403-411. Et CD52-bindende domene (f.eks. CAMPATH-1) beskrives av Riechmann et al. (1988) Nature, 322, 323-327.

Et VAP-1-bindende domene beskrives av Salmi et al., (1993) J. Exp. Med. 178:2250-60 og Smith et al. (1998) J. Exp. Med. 188:17-27. Et Der p I-domene (f.eks. 2C7) beskrives av McElveen et al. (1998). Clin. Exp. Allergy 28,1427-1434.

Således kunne et bindende molekyl som ikke ble bundet til Fc-reseptorer og utløste dreping og som ikke aktiverte komplement, men som ble bundet til et målmolekyl, benyttes i alle eksemplene ovenfor for minimalisering av eventuelle bivirkninger. Nærmere bestemt kunne et slikt "blokkerende" antistoff innføres i situasjonene 1-5 ovenfor og forhindre den uønskede ødeleggelse via de naturlig forekommende antistoffer. De samme Fc-områder av blokkerende type ville være de foretrukne Fc-områder for anvendelse i rekombinante antistoffer som CD3- eller CD18-antistoffene i 6 ovenfor, eller som Fc for fusjonene i 7 ovenfor.

Bindings- og effektordomenene kan kombineres ved enhver egnet fremgangsmåte. For eksempel kan domener sammenkobles kovalent via sidekjeder. Alternativt har sulf-hydrylgrupper dannet ved kjemiske reduksjon av cysteinrester blitt benyttet for kryssbinding av antistoffdomener. (Rhind, S.K. (1990) EP 0385601 Kryssbundede antistoffer og fremgangsmåter for fremstilling av disse). Endelig har kjemisk modifisering av kar-bohydratgrupper blitt benytte for dannelse av reaktive grupper for kryssbinding. Disse fremgangsmåter er standardteknikker som er tilgjengelige for fagfolk. De kan særlig benyttes i utførelser hvori det rekombinante antistoff inneholder ikke-proteindeler eller - grupper.

Generelt kan det være mer egnet å benytte rekombinante teknikker for ekspresjon av det rekombinante antistoff i form av et fusjonsprotein. Fremgangsmåter og materialer som benytter denne tilnærming utgjør ytterligere utforminger av foreliggende oppfinnelse, som beskrevet nedenfor.

Nukleinsyrer

I en utforming av foreliggende oppfinnelse beskrives en nukleinsyre som koder for et rekombinant antistoff som beskrevet ovenfor.

Nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte cDNA, RNA, genomisk DNA (innbefattet introner) og modifiserte nukleinsyrer eller nukleinsyreanaloger (f.eks. pep-tidnukleinsyre). Dersom en DNA-sekvens er spesifisert, f.eks. med henvisning til en figur, omfattes RNA-ekvivalenten hvor U erstatter T, hvor denne forekommer, dersom ikke annet er angitt.

Nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan erholdes isolert og/eller renset fra sitt naturlige miljø, i idet vesentlige ren eller homogen tilstand, eller fri eller idet vesentlige fri for andre nukleinsyrer fra opphavsarten. Ved benyttelse heri omfatter be-grepet "isolert" alle disse muligheter.

Nukleinsyremolekylene kan være helt eller delvis syntetiske. Nærmere bestemt kan de være rekombinante ved at nukleinsyresekvenser som ikke finnes sammen i naturen (ikke løper kontinuerlig) er ligert sammen eller på annet kunstig vis kombinert. Alternativt kan de være direkte syntetisert ved f.eks. benyttelse av en automatisk syntesema-skin.

I en annen utførelse beskrives en nukleinsyrekonstruksjon, f.eks. en replikerbar vektor, som omfatter nukleinsyresekvensen.

En vektor som omfatter nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse må ikke nødven-digvis omfatte en promoter eller en annen regulatorisk sekvens, særlig dersom vektoren skal benyttes for innføring av nukleinsyren i celler for rekombinasjon inn i genomet.

Fortrinnsvis er nukleinsyren i vektoren under kontroll av og operativt koblet til en egnet promoter eller andre regulatoriske elementer for transkripsjon i en vertscelle, f.eks. en mikrobiell celle (f.eks. bakteriecelle, gjærcelle, filamentøs soppcelle) eller eukaryot celle (f.eks. insektscelle, plantecelle, pattedyrscelle).

Nærmere bestemt kan vektoren inneholde et gen (f.eks. gpt) som tillater seleksjon i en vert eller av en vertscelle, og en eller flere enhancere som er tilpasset verten.

Vektoren kan være en bifunksjonell ekspresjonsvektor som fungerer i flere verter. Når det gjelder genomisk DNA kan dette inneholde sin egen promoter eller andre regulatoriske elementer, og når det gjelder cDNA kan dette være under kontroll av en egnet promoter eller andre regulatoriske elementer for ekspresjon i vertscellen.

Med "promoter" menes en nukleotidsekvens fra hvilken transkripsjon kan innledes av operativt tilkoblet nedstrøms-DNA (dvs. i 3' retning på "sens"-tråden i dobbelttrådet DNA). Promoteren kan om ønskelig være en induserbar promoter.

"Operativt sammenkoblet" betyr sammenkoblet som del av samme nukleinsyremolekyl med passende posisjonering og orientering for innledning av transkripsjon fra promote-

ren. DNA som er operativt sammenkoblet med en promoter er "under transkripsjonsini-tieringsregulering" av promoteren.

Denne utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer således en genkonstruksjon, fortrinnsvis en replikerbar vektor, som omfatter en promoter som er operativt sammenkoblet med en nukleotidsekvens tilveiebragt av foreliggende oppfinnelse.

Generelt sagt, er fagfolk godt i stand til å konstruere vektorer og utforme fremgangsmåter for rekombinant genekspresjon. Egnede vektorer som inneholder passende regulatoriske sekvenser, innbefattet promotersekvenser, terminatorrfagmenter, polyadenyle-ringssekvenser, enhancersekvenser, markørgener og andre egnede sekvenser kan utvelges eller konstrueres. For ytterligere detaljer, se f.eks. Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2. utgave, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Mange kjente teknikker og fremgangsmåter for manipulering av nukleinsyrer, f.eks. ved fremstilling av nukleinsyrekonstruksjoner, mutagenese, sekvensering, innføring av DNA i celler og genekspresjon, samt analyse av proteiner, beskrives i detalj i Current Protocols in Molecular Biologi, 2. utave, Ausubel et al., red., John Wiley & Sons, 1992.

Vertsceller og fremgangsmåter

Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er celler transformert med ekspresjonsvektorene definert ovenfor. Videre tilveiebringes cellekulturer (fortrinnsvis av gnagerceller) og produkter fra cellekulturer som inneholder de rekombinante antistoff.

Videre tilveiebringes fremgangsmåter for fremstilling av rekombinante antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter: (i) å kombinere en nukleinsyre som koder for et bindende domene med en nukleinsyre som koder for et effektordomene slik at det dannes en nukleinsyrekonstruksjon;

(ii) å oppnå ekspresjon av konstruksjonen i en egnet vertscelle.

Kombinasjon for fremstilling av en konstruksjon kan skje ved enhver egnet fremgangsmåte kjent blant fagfolk, f.eks. ved ligering av fragmenter (f.eks. restriksjonsfragmen-ter) eller ved benyttelse av forskjellige templater i et eller flere amplifiseirngstrinn, f.eks. ved benyttelse av PCR.

Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer (og således bindingsdomener) omfatter immunisering av et pattedyr (f.eks. menneske, mus, rotte, kanin, hest, geit, sau, kamel eller ape) med et egnet målprotein eller et fragment av dette. Antistoffer kan erholdes fra immuniserte dyr ved benyttelse av en rekke teknikker som er kjent innen faget, og de kan analyseres, fortrinnsvis ved benyttelse av binding av antistoff til antigenet av interesse.

For eksempel kan Western-blottingteknikker eller immunutfelling benyttes (Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82).

Kloning og ekspresjon av kimære antistoffer beskrives i EP-A-0120694 og EP-A-0125023.

Nukleinsyren som koder for effektordomenet kan i lys av den foreliggende beskrivelse frembringes ved setestyrt mutagenese, f.eks. ved fremgangsmåter som beskrives heri eller i publiserte kilder (se f.eks. WO 92/16562 eller WO 95/05468, begge fra Lynxvale Ltd.).

Andre utførelser

Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører in vitro anvendelse av et rekombinant antistoff ifølge oppfinnelsen for å binde mål molekylet med nevnte bindingsdomene.

I en utførelsesform av nevnte in vitro anvendelse binder effektor domenet spesifikt FcyRIIb, der bindingen gir inhibering av en eller flere av: B-celleaktivering, mastcelledegranulering, fagocytose. Forettrukket er nevnte anvendelse for å inhibere eller interferere med binding av et andre bindende molekyl til målmolekylet. Dette kan omfatte konkurrering med eller forskyvning av et antistoff fra et terapeutisk relevant målantigen eller en målcelle.

I en ytterligere utførelsesform av nevnte in vitro anvendelse er målmolekylet utvalgt blant: RhD-antigenet på røde blodceller; et HPA-alloantigen på blodplater; et neutrofilt antigen; en T-cellereseptor; integrin; GBM-kollagen; Der Pl; HPA-la; VAP-1; laminin; luteran; blodplateglykoprotein VI; blodplateglykoprotein Ia/Ila.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et rekombinant antistoff ifølge oppfinnelsen, for fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse hos en pasient, hvor nevnte bindingsdomene av nevnte rekombinante antistoff er anvendt i nevnte behandling for å binde målmolekylet som er assosiert med nevnte lidelse, hvor nevnte lidelse og målmolekyl er valgt fra:

(i) "Graft-vs-host"-sykdom, "host-vs-graft"-sykdom, organtransplantatawis-ning, benmargstransplantatawisning, autoimmun vaskulit, artritt eller astma; hvor målmolekylet er en T-celle reseptor; (ii) autoimmun hemolytisk anemi eller autoimmun trombocytopeni; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av rød blodcelle resus antigener D, C, c, E, e; Keil (Kl) antigenet; blodplateglykoprotein GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V; (iii) fetal/neonatal alloimmun trombocytopeni; hvor målmolekylet er humant blodplateantigen (HPA)-la på blodplateglykoprotein Illa; (iv) støvmidd allergi; hvor målmolekylet er Der Pl protein fra hus støv midd Dermatophagoides pteronyssinus; (v) chrohn' s sykdom; hvor målmolekylet er VAP-1; (vi) HDN; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av rød blodcelle resus antigener D, C, c, E, e og Keil (Kl) antigenet; (vii) goodpastueres syndrom; hvor målmolekylet er ikke-kollagen (NC1) domenet av a3(IV) kollagen; (viii) sigdcelleanemi; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av trombospondin; liminin; luteran;

(ix) koronar arterieokklusjon; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av integrin (X2P1 (blodplateglykoprotein Ia/Ila); ikke-integrin blodplateglykoprotein VI.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et farmasøytisk preparat som omfatter et rekombinant antistoff som nevnt ovenfor, samt et farmasøytisk aksepterbart bærestoff.

FIGURER

Figur 1

Rosettdannelse av FcyRI-bærende celler med RBC belagt med Fog-1-antistoffer. R2R2 RBC ble belagt med Fog-1-antistoffer ved en rekke antistoffkonsentrasjoner, og inkubert med B2KA-celler dyrket i en 96-brønners plate og prosent B2KA-celler med RBC-rosetter ble bestemt. Feilstolpene angir standardawiksverdiene for triplikatbrønner. For mutantene Fog-1 Gl Ab, GlAc, GlAab, GlAac, G2Aa, G4Ab og G4Ac, som for G2 (vist), forekom ingen rosettdannelse melom B2KA-celler og RBC ved noen av konsentrasjonene benyttet i beleggingen.

Figur 2

Fluorescensfarging av FcyRI-bærende celler. De FcyRI-transfekterte cellelinjene B2KA (a og b) og 3T3+ FcyRI+y-kjede (c og d) ble inkubert, først med antistoffer fra CAMPATH-1 (a og c) eller Fog-1 (b og d)-serien, og så med biotinylerte anti-human k-antistoffer og ExtrAvidin-FITC. Fluorescensintensiteten ble målt for 10 000 partikler og den geometriske middelkanal for fluorescensen fremstilt grafisk.

Figur 3

Histogramfremstilling av fluorescensfargede, FcyRI-bærende celler. B2KA-celler ble farget som i figur 2 med 100 ug/ml antistoff fra CAMPATH-1-serien. Histogrammer for representative antistoffer som viser antall celler i hver fluorescenskanal er lagt over hverandre.

Figur 4

CL-respons av humane monocyter mot RBC sensitivisert med Fogl-serien av antistoffer. RiRi RBC ble belagt med antistoffer ved en rekke konsentrasjoner. Antall antistoffmolekyler bundet pr. celle og CL-responsen av monocytene mot RBC ble bestemt for hver prøve som beskrevet.

Figur 5

Inhibering av CL grunnet Fog-1 Gl ved andre Fog-1-antistoffer. RBC ble sensitivisert med 2 ug/ml Fog-1 Gl og forskjellige konsentrasjoner av det angitte Fog-1-antistoff. Disse antistoffer ga en lav CL-respons i figur 4. CL-responsen av monocytene ble målt. Responsen grunnet 2 ug/ml Gl alene ble satt til 100%.

Figur 6

Inhibering av CL-responsen overfor kliniske sera av Fog-1 G2Aa. RBC ble sensitivisert med en konstant mengde Fog-1 Gl (20 ug/ml) eller klinisk relevante sera og forskjellige mengder av Fog-1 G2Aa. 100% respons ble oppnådd med en standardmengde BRAD 5.1 fravær av Fog-1 G2Aa, var % respons Gl: 150%, serum A: 142%, serum B: 265%, serum C: 200%, serum D: 163%; serum E: 94%, anti-C+D-serum: 259% og anti-K-serum: 119%.

Figur 7

Komplementlysis formidlet av CAMPATH-1-serien av antistoffer. Humane PBMC bvle merket med51 Cr og inkubert med antistoffene i nærvær av serum som komplementkil-de. % spesifikk Cr-frigivelse er fremstilt som et mål på den oppnådde lysis.

Figur 8

Inhibering ved CAMPATH-1 G2Aa av komplementlysis formidlet av CAMPATH-1 Gl. Komplementlysis ble utført som i figur 7, men prøvene inneholdt en konstant mengde (6,25 ug/ml sluttkonsentrasjon) av CAMPATH-1 Gl og økende mengder CAMPATH-1 G2Aa.

Figur 9

ADCC formildet av CAMPATH-1-serien av antistoffer. Humane PBMC ble merket med51 Cr og inkubert med antistoff. Etter vask ble cellene inkubert med ytterligere PBMC, som fungerte som effektorceller, i et forhold mellom effektor og målcelle på 20:1. % Spesifikk Cr-frigivelse er fremstilt som et mål på den oppnådde lysis.

Figur 10a

ADCC av RhD<+> RBC formidlet av Fog-1-serien av antistoffer.

Figur 10b

ADCC av RhD<+> RBC formidlet av Fog-1-serien av antistoffer.

Figur lia

Inhibering ved Fog-1-antistoffer av ADCC av RhD<+> RBC formidlet av Fog-1 Gl, 2 ng/mg.

Figur 1 lb

Inhibering av Fog-1-antistoffer av ADCC av RhD<+> RBC formidlet av Fog-1 Gl. RBC ble sensitivisert i en blanding av antistoffer bestående av en konstant mengde Fog-1 Gl (2 ng/ml) og forskjellige konsentrasjoner av inhibitorantistoffene.

Figur 12

Inhibering ved Fog-1-antistoffer av ADCC av RhD<+> RBC formidlet av polyklonalt anti-RhD, 3 ng/mg.

Figur 13a

Fluorescensfarging av FcyRIIa 131R/R-bærende celler. Celler fra den transfekterte cellelinje 3T6+ FcyRIIa 131R/R ble inkubert med Fog-1-antistoffene i kompleks med F(ab')2 anti-human k fra geit, og så med FITC-konjugert anti-geite-IgG fra esel. Fluorescensintensiteten ble målt for 10 000 partikler og den geometriske middelkanal for fluorescensen fremstilt.

Figur 13b

Fluorescensfarging av FcyRIIa 131R/R-bærende celler. Celler fra den transfekterte cellelinje 3T6+ FcyRIIa 13 IR/R ble inkubert med Fog-1-antistoffene i kompleks med FITC-konjugert F(ab')2 anti-human k fra geit. Fluorescensintensiteten ble målt for

10 000 partikler og den geometriske middelkanal for fluorescensen fremstilt.

Figur 14a

Fluorescensfarging av FcyRIIb 1*-bærende celler. Eksperimentet ble utført som i figur 13b, med den transfekterte cellelinje 3T6+ FcyRIIb 1* og kompleksdannelse av Fog-1-antistoffene med en blanding av FITC-konjugert og umerket F(ab')2 anti-human k fra geit.

Figur 14b

Fluorescensfarging av FcyRIIIb NAI-bærende celler. Eksperimentet ble utført som i figur 13 med den transfekterte cellelinje CHO + FcyRIIIb NAI.

Figur 14c

Fluorescensfarging av FcyRIIIb NA2-bærende celler. Eksperimentet ble utført som i figur 13 med den transfekterte cellelinje CHO + FcyRIIIb NA2.

Figur 15

Denne figur viser tabell 1, som sammenligner mutasjonene innført i vildtype Gl-, G2-og G4-sekvenser.

Figur 16

Denne figur viser tabell 2, som er en oppsummering av antistoffenes aktiviteter.

Figur 17

Denne figur viser sekvensen av visse modifiserte og vildtype CH2-sekvenser, innbefattet dem betegnet Gl Aab, G2Aa, GlAac.

EKSEMPLER

Generelle materialer og fremgangsmåter

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer

Utgangspunktet for det konstante området fra IgGl var genet for det konstante området fra humant IgGl av allotype Glm(l,17) i en versjon av vektoren M13tgl31, som inneholder en modifisert polylinker (Clark, M.R., WO 92/16562). IgGl-innskuddet på 2,3 kb har således et BamHl- sete i 5' ende og inneholder et ///«dlll-sete ved siden av Bam-HI-setet. I 3' ende, nedstrøms for polyadenyleirngssignalet, ligger følgende seter i rek-kefølge fra 5' til 3': Sphl, Noti, Bglll, BamRl. Genet for konstant område fra humant IgG2 ble erholdt som et //indlll-S^/iI-fragment i M13tgl31 og //mdlll-setet var blitt ødelagte ved kutting med Hinålll, innfylling av de overhengende ender og sammenlige-ring av endene. Sa/I-S/>/iI-fragmentet fra denne vektor ble klonet for å erstatte det tilsvarende fragment i IgGl-vektoren beskrevet ovenfor. Genet for konstant område fra humant IgG4 ble erholdt som et ///ndlll-S/Hlfl-fragment i M13tgl31 og //mdlll-setet øde-lagt. iS/wal-setet ligger mellom den 3' ende av CH3-exonet og polyadenyleirngssetet, slik at polyadenyleringssetet ble gjeninnført ved innføring av Smal-fragmentet fra IgGl-vektoren, som omfatter DNA fra mellom det tilsvarende Smal- setet i IgGl-genet og Smal- setet nedstrøms for genet i polylinkeren.

Den første fremgangsmåte var å innføre et ^Y&orl-restriksjonssete mellom CHl-exonet og hengselexonet, et^TiøI-sete mellom hengselexonet og CH2-exonet, og et Kpnl- sete mellom CH2-exonet og CH3-exonet for å forenkle utbytting av muterte exonsekvenser. Dette tilsvarte manipuleringen av IgGl - og IgG4-genet som tidligere var utført (Greenwood, J., Clark, M. og Waldmann, H. (1993) Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions. Eur. J. Immunol. 23,1098-1104).

For erholdelse av templat-DNA ble E. coli RZ1032 infisert med M13-vektoren beskrevet ovenfor og ssDNA fremstilt. Stammen er dufung slik at det fremstilt ssDNA bør inneholde noe uridin i stedet for tymidin.

Oligonukleotidene som ble anvendt for innføring av mutasjonene var:

mellom hengselexonet og CH2-exonet

mellom CH2-exonet og CH3-exonet mellom CHl-exonet og hengselexonet

Restriksjonssetene er understreket.

Oligonukleotidene ble fosforylert i reaksjoner på 50 ul inneholdende 25 pmol oligonukleotid og 5u T4 polynukleotidkinase (nbl) i 70 mM Tris HC1 pH 7,6,10 mM MgCl2, 100 mM KC1, 5 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA, 1 mM ATP. Reaksjonsblandingene ble inkubert ved 37°C i 1 time og oppvarmet til 70°C i 5 minutter.

For hybridisering av de mutagene oligonukleotider til templat-DNA ble 500 ng uridin-holdig DNA og 1 pmol av hvert av de fosforylerte oligonukleotider inkubert i 20 ul 40 mM Tris HC1 pH 7,5,20 mM MgCl2, 50 mM NaCl ved 80°C i 5 minutter og avkjølt langsomt til 37°C. Volumet ble økt til 30 ul med den samme buffer og DTT tilsatt til 7 mM, ATP til 1 mM og dATP, dCTP, dGTP og DTTP hver til 250 uM. 5u T7 DNA-polymerase (umodifisiert, United States Biochemical) og 0,5u T4 DNA ligase (Gibco BRL) ble tilsatt og reaksjonsblandingen inkubert ved romtemperatur i 16 timer for syntese av den muterte tråd. DNA ble utfelt med etanol, løst i 50 (il 20 mM Tris HC1 pH 8,0,0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml bSA og 1 u ureacil DNA-glykosylase (New England Biolabs) tilsatt. Etter inkubering ved 37°C i 2 timer, ble 50 ul 400 mM NaOH tilsatt og reaksjonsblandingen inkubert ved romtemperatur i 5 minutter for fragmente-ring av DNA-templattråden. DNA ble utfelt med etanol, løst i H2O og transformert inn i E. coli TG1. Replikativ form (RF)-DNA ble fremstilt for et utvalg av de resulterende M13-kloner og kuttet for å finne kloner som inneholdt de nødvendige restriksjonsseter fordal, Xhol og Kpnl. Egnede kloner ble erholdt for IgGl og 4 vektorer, men MO 12 så ut til å feilhybridisere i IgG2-vektoren, slik at mutagenesen ble gjentatt for IgG2 uten dette oligonukleotid, siden setet mellom CHl-exonet og hengselexonet ikke var nød-vendig for disse eksperimenter. For alle vektorer ble DNA-sekvensen i exonene bekreftet ved sekvensering.

Endringene i CH2 i aminosyreposisjonene 327, 330 og 331 (Aa-mutasjon) skulle innfø-res med oligonukleotidene:

M022BACK (kodende tråd):

5' TCT CC A ACA AAG GCC TCC CGT CCT CCA TCG AGA AAA 3'

M022 (komplementær tråd):

5' TTT TCT CGA TGG AGG ACG GGA GGC CTT TGT TGG AGA 3'

Endringene i CH2 i posisjonene 233 til 236 (Ab- og Ac-mutasjon) skulle innføres med oligonukleotidene:

M07BACK (kodende tråd og kodende for Ac-mutasjonen):

M021 (den komplementær tråd og kodende for Ab-mutasjonen):

Mutasjonene skulle innføres ved overlappforlengelse-PCR, som også krevde oligonukleotidene MOI 1 ogMOlOBACK:

ATzoI-restriksjonssetet er understreket.

For Aa-mutasjonen, benyttet det første sett av PCR-reaksjoner IgGl - og IgG2-templater amplifisert med M022 og MO10BACK og med M022BACK og MOI 1. For Ab- og Ac-mutasjonene, benyttet det første sett med PCR-reaksjoner IgGl- og IgG4-templater med M021 og MO10BACK og med M07BACK og MOI 1.1 sluttproduktet, vil DNA med opphav i en tråd primet med M021 ha Ab-mutasjonen og DNA med opphav i M022BACK vil bære Ac-mutasjonen. Hver PCR-reaksjon inneholdt tilnærmet 30 ng M13tgl31+konstant område-ssDNA, 25 pmol av hvert oligonukleotid og 1 u Pwo DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) i 50 ul 10 mM Tris HC1, pH 8,85, 25 mM KC1, 5 mM (NH4)2S04,2 mM MgS04 og 250 uM av hver av dATG, dCTP, dGTP og dTTP. Reaksjonsblandingene ble behandlet med 14 sykluser bestående av 94°C, 30 s.; 50°C, 30 s.; 72°C, 60 s., fulgt av 72°C i 5 minutter som avslutning. Bånd som representerer produkt-DNA med forventet størrelse ble kuttet ut av agarose med lavt smelte-punkt og smeltet i 100 ul H20. For hver mutasjon ble de to opprinnelige PCR-produktet sammenkoblet ved overlappforlengelse-PCR. Tilnærmet 4 ul totalt av de smeltede gel-biter, slik at de opprinnelige PCR-produkter forelå i ekvimolare mengder, ble blandet med 25 pmol av hver av MO10BACK og MOI 1 og andre bestanddeler som ovenfor. PCR ble utført over 18 sykluser som ovenfor, bortsett fra at hybridiseringstemperaturen ble redusert fra 50°C til 48°C. De erholdte produkter, som inneholdt hele CH2-exonet, ble renset og kuttet med Xhol og Kpnl. RF-DNA fra de muterte M13tgl31+konstant områdevektorer, inneholdende de ekstra restriksjonssetene som beskrevet ovenfor, ble kuttet med Xhol og Kpnl for å fjerne foreliggende CH2-DNA, og de muterte CH2-områder ble ligert inn. DNA-prøvene ble transformert inn i E. coli TG1. DNA fra representative kloner ble sekvensert for identifisering av korrekt muterte konstante områder.

For erholdelse av IgGl-vektorer med både Aa og Ab eller Ac, ble DNA som representer-te en Aa-mutant benyttet som templat i en ny PCR-runde for innføring av Ab- og Ac-mutasjonene som beskrevet ovenfor.

Vildtype og muterte gener for konstant område fra IgGl, 2 og 4 ble kuttet ut fra RF-DNA som ÆamHI-Atort-fra<g>menter og klonet inn i den modifiserte CAMPATH Hu4VH HuIgGl pSVgpt-vektor (Clark, M.R., Lynxvale Binding Molecules som ovenfor) slik at de erstattet de eksisterende konstante områder. De resulterende vektorer ble betegnet pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgGl Aa, osv. Vektoren inneholder også gpt-genet som tillater seleksjon i pattedyrsceller, enhanceren fra immunglobulintungkjede fra mus og DNA for variabelt område fra CAMPATH-1 Hu4VH, slik at den bærer et fullstendig tungkjedegen som kan uttrykkes i pattedyrsceller. Det humaniserte CAMPATH-1-lettkjedegen foreligger i ekspresjonsvektoren CAMPATH HuVL pSVneo (Reichman, L., Clark, M.R., Waldmann, H. og Winter, G. (1988) Nature 322, 323-327).

DNA for variable områder fra Fog-1 (Bye, J.M., Carter, C, Cui, Y., Gorick, B.D., Songsivilai, S., Winter, G., Hughes-Jones, N.C. og Marks, J.D. (1992) Germline variable region gene segment derivation of human monoclonal anti-Rh(D) antibodies. J. Clin. Invest. 90, 2481-2490) ble erholdt i vektoren pHENl. De ble amplifisert ved PCR ved benyttelse av oligonukleotidene:

Den 5' del av innskuddet i vektoren M13VHPCR1 (Orlandi, R., Gussow, D.H., Jones, P.T. og Winter, G. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86, 3833), som omfatter promoteren og DNA som koder for signalpeptidet, ble amplifisert ved benyttelse av den universelle reverse M13-primer og V03:

DNA som ligger 3' for Vh i M13VHPCR1 og representerer den 5' ende av Vh-Ch-intronet ble erholdt ved PCR ved benyttelse av den universelle Ml3 -40-primer og V04:

Disse to DNA-segmenter ble koblet etter hverandre til både amplifisert Fog-1 Vh-DNA og Fog-1 VK-DNA ved overlappforlengelse-PCR som beskrevet ovenfor. BamHl-restriksjonssetet som ligger internt i Fog-1 Vh ble fjernet ved den samme fremgangsmåte, ved benyttelse av oligonukleotider som fjernet gjenkjenningssetet uten å endre de kodede aminosyrer. De ferdige PCR-produkter ble klonet inn i M13mpl9 som Hindlll-Æa/wHI-rfagmenter og deres DNA-sekvens bekreftet.

/f/ndlll-Æa/wHI-fragmentet som inneholdt Fog-1 Vh ble benyttet for å erstatte fragmentet som inneholdt CAMPATH-1 Vh i pSVgpt-vektorene beskrevet ovenfor, slik at ekspresjonsvektorer som ble betegnet pSVgptFogl VHHuIgG2, osv. ble dannet. For IgGl-vektorene betød det ekstra //wdlll-restriksjonssetet i 5' ende av konstant område-DNA at det ikke var mulig å ganske enkelt utbytte i//HdIII-2tø/wHI-fragmentet med det variable området. I stedet, ble de relevante pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgGl-vektorer kuttet med Hindlll. Linkere som var utformet for delesjon av ATzwdlll-setet og innføring av et ZtøwHI-sete ble ligert til de kuttede ender. DNA ble så kuttet med BamHl og Noti slik at de konstante områder kunne isoleres, og disse ble klonet inn i pSVgptFogl VHHuIgG2 slik at de erstattet det konstante området fra IgG2.

//wdlll-ifa/wHI-fragmentet som inneholdt Fog-1 VK ble overført til vektoren pSVhyg-HuCK (Orlandi et al., 1989) som allerede inneholder enhanceren fra immunglobulin-tungkjedegenet i mus og genet for konstant område fra human K-kjede. Den resulterende ekspresjonsvektor ble betegnet pSVhygFogl VKHuCK.

Fremstilling av antistoffer

10 ug av hver tungkjedeekspresjonsvektor og 20 ug av den relevante lettkje-deekspresjonsvektor ble linearisert ved kutting med Pvul og sammenblandet i 50 ul H2O. Celler fra den ikke-sekreterende rottemyelomcellelinje, YB2/0, ble dyrket til se-mikonfluens i Iscove's modifiserte Dulbecco's medium (IMDM) med 5% fetalt bovint

serum (FBS). IO<7> celler ble oppsamlet ved sentrifugering, resuspendert i 0,5 ml medium og overført til en GenePulser-kuvette (BioRad). DNA ble tilsatt og blandingen inkubert på is i 5 minutter. Cellene ble gitt en puls med 960 uF/170 V og igjen overført til is i 15 minutter før de ble overført til en flaske i 20 ml IMDM + 10% FBS. De ble inkubert ved 37°C, 5% CO2 i en fuktgjort atmosfære. Etter 24 timer ble volumet fordoblet og mediet gjort selektivt ved tilsetning av mykofenolsyre til 0,8 ug/ml og xantin til 250 ug/ml. Cellene ble fordelt på to 96-brønners plater. Tilnærmet 18 dager etter at seleksjonen ble begynt var kolonier synlige, og supernatantene ble analysert for nærvær av IgG ved ELISA. Kort beskrevet, ble mikrotiterplatebrønner belagt med anti-human IgG fra geit, Fc-spesifikke antistoffer (Sigma) og så inkubert med 5 gangers fortynninger av supernatantene. Bundet antistoff ble påvist ved inkubering med HRPO-konjugerte anti-human

K-antistoffer fra geit (Seralab) og analysen ble fremkalt med o-fenylendiaminsubstrat. Celler fra brønner som inneholdt de høyeste antistoffmengder ble ekspandert og lager-kulturer nedfrosset.

Cellelinjen som utskilte de høyeste Ab-mengder ble ekspandert til 500 ml i IMDM + 2% FBS for erholdelse av mettet supernatant for antistoffrensing. Supernatanten ble klarnet ved sentrifugering og justert til 0,1 M Tris HC1 pH 8,0. Protein A-agarose (Sigma) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 4°C i 16 timer. Agarosekulene ble oppsamlet i en kolonne og vasket med 0,1 M Tris HC1 pH 8,0, fulgt av 10 mM Tris HC1 pH 8,0. Antistoffet ble eluert med 1 ml porsjoner 0,1 M glycin pH 3,0 over i 100 ul porsjoner med 1 M Tris HC1 pH 8,0, og fraksjoner som inneholdt signifikante proteinmengder ble identifisert ut fra måling av A280nm- Disse fraksjoner ble dialysert mot PBS og filtersteri-lisert, og A280nm ble målt på ny for erholdelse av den tilnærmede antistoffkonsentrasjon (konsentrasjon = A280nm x 0,714 mg/ml).

Renhet og integritet av antistoffene ble etablert ved reduserende SDS-PAGE, ved benyttelse av 12,5% akrylamid. Konsentrasjonene ble kontrollert i en ELISA som benyttet anti-human K-antistoffer fra geit (Seralab) som innfangningsreagens og biotinylerte anti-human K-antistoffer fra geit (Sigma) fulgt av ExtrAvidin-HRPO (Sigma) for deteksjon. Dette vil si at tungkjedens natur sansynligvis ikke ville påvirke det oppnådde bindings-nivå.

Rosettdannelse med FcyRI- transfektanter

Vaskede R2R2 RBC ble inkubert med Ab-prøver i 100 ml PBS i 96-brønners plater ved romtemperatur i 1 time. RBC ble vasket tre ganger, resuspendert i PBS og inkubert ved 37°C i 40 minutter med transfektanter som uttrykte FcyRI cDNA, B2KA (S. Gorman og G. Hale, ikke publisert), ved dyrking i 96-brønners plater. Supernatanten ble fjernet og brønnene vasket en gang for fjerning av overskudd av RBC. For hver brønn ble 200 B2KA-celler undersøkt og antall RBC-rosetter notert. Gjennomsnitts prosenttall og standardavvik for brønner i triplikat ble fremstilt grafisk. Alternativt, ble de sensitiviserte RBC- og B2KA-celler sammenblandet i mikrosentirfugerør, nedsentrifugert og forsiktig resuspendert før overføring til et objektglass.

Fluorescens/ åring av FcyR- transfektanter

Transfektanter som uttrykte FcyRI cDNA, B2KA og 3T3+ FcyRIa+7-kjede (van Urgt, M. J., Heijnen, I.A.F.M., Capel, P.J.A., Park, S.Y., Ra, C, Saito, T., Verbeek, J.S. og van de Winkel, J.G.J. (1996) FcR y-chain is essential for both surface expression and function of human FcyRI (CD64) in vivo. Blood 87,3593-3599), ble erholdt som en-keltcellesuspensjoner i fosfatbufret saltvann tilsatt 0,1% (vekt/volum) NaN3, 0,1%

(vekt/volum) BSA (vaskebuffer) etter behandling med celledissosieringsbuffer (Gibco BRL). Cellene ble nedsentrifugert med 10<5> celler/brønn i 96-brønners plater, resuspendert i 100 ul fortynninger av CAMPATH-1 eller Fog-1-Ab og inkubert på is i 30 minutter. Cellene ble vasket tre ganger med 150 ul/brønn vaskebuffer og inkubert på tilsvarende måte med 20 ug/ml biotinkonjugert anti-human K-kjede-Ab fra geit (Sigma) og deretter med 20 ug/ml ExtrAvidin-FITC (Sigma). Etter den avsluttende vask ble cellene fiksert i 100 (il vaskebuffer tilsatt 1% (volum/volum) formaldehyd. Overflateekspresjon av FcyRI ble bekreftet ved farging med CD64-mAb (Serotec) og FITC-konjugert geite-og muse-IgG Ab (Sigma). Fluorescensintensiteten ble målt i et FACScan-instrument (Becton Dickinson).

For transfektanter som uttrykte FcyRII, 3T6+ FcyRIIa 131H/H, 3T6+ FcyRIIa 131R/R (Warmerdam, P.A.M., van de Winkel, J.G.J., Gosselin, E.J. og Capel, P.J.A. (1990) Molecular basis for a polymorphism of human Fcy receptor II (CD32). J. Exp. Med. 172, 19-25; Warmedam, P.A.M., van de Winkel, J.G.J., Vlug, A., Westerdaal, N.A.C. og Capel, P.J.A. (1991) A single amino acid in the second Ig-like domain of the human Fcy receptor II is critical for human IgG2 binding. J. Immunol. 147,1338-1343) og 3T6 + FcyRIIb<*> (Warmerdam, P.A.M., van den Herik-Oudijk, LE., Parren, P.W.H.I., Westerdaal, N.A.C, van de Winkel, J.G.J, og Capel, P.J.A. (1993) Int. Immunol. 5, 239-247) ble antistoffene overført til komplekser før inkubering med cellene. For FcyRIIa 131H/H, ble antistoffene blandet med ekvimolare mengder av geite-F(ab')2 anti-human k (Seralab) og inkubert ved 37°C i 1 time. Kompleksene ble så blandet med cellene og analysen fortsatt som ovenfor, bortsett fra at påvisningsantistoffet var FITC-konjugert anti-geite-IgG fra esel (Serotec). For FcyRIIa 131R/R, ble kompleksene fremstilt ved benyttelse av ekvimolare mengder av FITC-konjugert F(ab')2 anti-human k fra keit (Seralab) og for FcyRIIb 1* ble kompleksene fremstilt ved benyttelse av ekvimolare mengder av en 1:1 blanding av FITC-konjugert og umerket F(ab')2 anti-human k fra geit. For disse reseptorer var således kun et inkuberingstrinn nødvendig.

For transfektanter som uttrykte FcyRIIIb, CHO + FcyRIIIb NAI eller NA2 (Bux, J., Kissel, K., Hofmann, C. og Santoso, S. (1991) The use of allele-specific recombinant Fc gamma receptor Illb antigens for the detection of granulocyte antibodies. Blood 93, 357-362), ble fargingen utført som beskrevet for 3T6 + FcyRIIa 13 lH/H-celler ovenfor.

Sensitivisering av røde blodceller

Gruppe O R1R1 RBC ble vasket i PBS og resuspendert i RPMI + 10% FBS i en sluttkonsentrasjon på 5% volum/volum. 10 ul celler ble tilsatt til 50 ul mAb eller

RPMI/FBS i plater med V-bunnbrønner og inkubert i 60 minutter ved 37°C. I noen eksperimenter ble mAb seriefortynnet i RPMI/FBS for å oppnå et konsentrasjonsområde av IgG bundet til røde blodceller. I konkurranseeksperimenter ble de røde blodceller sensitivisert i en blanding av 25 ul konkurrerende mAb og 25 ul vildtype-mAb eller 25 ul serum som inneholdt alloantistoffer. Etter sensitiviseringen ble cellene vasket 4 ganger med volumer på 200 ul av PBS og resuspendert i 50 ul RPMI/FBS (sluttkonsentrasjon = 1% volum/volum). I alle eksperimenter ble et uttak av celler (E-IgG) benyttet i kjemiluminiscens (CL)-analysen og en porsjon analysert ved "flow"-cytometri for bestemmelse av nivået av IgG bundet til røde blodceller.

Kjemiluminiscensanalyse

PBMC ble isolert ved tetthetsgradientsentrifugering fra EDTA-behandlet blod som en blanding fra 6 normale donorer. PBMC ble vasket fire ganger med PBS tilsatt 1% glo-bulinfritt BSA, og så resuspendert ved 2 x 106/ml i Hank's balanserte saltløsning (HBSS) tilsatt 25% RPMI og 2,5% FBS. Uttak (100 ul) ble fordelt i 96-brønners, flat-bunnete, hvit, ugjennomsiktige plater og inkubert i 2 timer ved 37°C i fuktgjort atmosfære med 5% CO2 i luft. Platene ble så plassert i et luminometer (Anthos Lucy 1, Lab-tech International, Uckfield, UK) og 100 ul HBSS inneholdende 4 x IO"<1> M luminol (Sigma) og 20 ul E-IgG ble tilsatt til hver brønn. CL-responsen ble så målt ved 37°C i 60 minutter.

Bestemmelse av IgG bundet til røde blodceller

25 ul uttak av E-IgG ble overført til en plate med V-bunnsbrønner, vasket en gang med PBS, nedsentrifugert og resuspendert i 50 ul F(ab)2 FItC-anti-IgG (fortynnet 1/30 i PBS/1% BSA). Etter 30 minutter ved romtemperatur ble cellene vasket en gang med 200 ul PBS/BSA og inkubert på is inntil analyse ved "flow"-cytometri (EPICS XL-MCL, Coulter Electronics, Luton, UK). Gjennomsnittskanalfluorescensen ble notert.

Gjennomsnittskanalfluorescensen ble omregnet til IgG-molekyler/celle ved benyttelse av en standardkurve som ble fremstilt ved tilsetning av 100 ul 5% volum/volum R1R1-celler til 900 ul to gangers seriefortynninger av humant monoklonalt IgGl anti-D (BRAD-5). Sensitiviserte røde blodceller ble vasket tre ganger med PBS/BSA og resuspendert til 1% volum/volum i PBS/BSA. 25 ul porsjoner ble tatt ut og analysert ved "flow"-cytometri som beskrevet ovenfor. De gjenværende røde blodceller ble talt, nedsentrifugert og lysert i en buffer tilsatt Triton X-l 00, og IgG i lysatene ble bestemt ved ELISA som beskrevet av Kumpel (Kumpel, B.M. (1990). A simple non-isotopic method for the quantitation of red cell-bound immunoglobulin. Vox Sanguinis, 59, 34-39). Antall IgG-molekyler bundet pr. røde blodcelle ble utledet fra IgG-konsentrasjonen og antall røde blodceller som lysatet var fremstilt fra. En standardkurve ble så fremstilt hvor fluorescensintensiteten ble sammenlignet med antall IgG-molekyler bundet pr. røde blodcelle.

Komplementlysis formidlet av CAMPATH- 1- serien av antistoffer

100 ml veneblod fra en frisk frivillig ble defibrinert og bestanddelene separert ved tetthetsgradientsentrifugering med Ficoll-Paque Plus (Pharmacia). Serum og mononukleære cellelag ble overført til nye rør. Cellene ble fortynnet med Iscove's modifiserte Dul-becco's medium (IMDM) og oppsamlet ved sentrifugering. Cellene ble vasket to ganger med IMDM samtidig som de ble overført til et rør, hvor de etter nedsentrifugering ble

resuspendert i 200 ul IMDM. 900 uCi natirum-[51 Cr]-kromat ble tilsatt og cellene inkubert ved 37°C i 40 minutter. 10 ml IMDM ble tilsatt og cellene nedsentrifugert. Cellene ble vasket to ganger og resuspendert i IMDM ved tilnærmet 6 x IO<6> celler/ml. Uttak på 50 ul av de merkede cellene ble tilsatt til antistoffprøver i 50 ul IMDM i 96-brønners plater. 100 ul tilbakeholdt serum fortynnet 1:1 med IMDM ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert ved 37°C i 1 time. Platene ble sentrifugert og prøver av supernatantene tatt ut, og de relative mengder frigitt51 Cr ble målt i en y-teller. Nivået for spontan frigivelse ble erholdt fra prøver hvor antistoff ikke var tilsatt, og et mål på totalmengden <51>Cr som var tilgjengelig for frigivelse ble funnet fra tilsvarende prøver tatt etter re-suspendering av cellene. % spesifikk <51>Cr-frigivelse ble beregnet med formelen:

( telling i prøve - telling i prøve uten antistoff) x 100

(totaltelling - telling i prøve uten antistoff

Gjennomsnittsverdi og standardavvik for prøver i triplikat ble fremstilt grafisk.

For inhibering av komplementlysis inneholdt antistoffprøvene en konstant mengde (6,25 fig/ml sluttkonsentrasjon) av CAMPATH-1 Gl og økende mengder av CAMPATH-1 G2Aa.

ADCC formidlet av CAMPATH- 1- serien av antistoffer

Mononukleære celler fra perifert blod ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Etter vask ble cellene resuspendert i IMDM tilsatt 5% FBS og overført til en flaske som var belagt med CD3-antistoff. Cellene ble dyrket ved 37°C, 5% C02 i 3 dager. 5% av cellene ble merket med51 Cr for anvendelse som målceller, vasket og resuspendert ved 6 x IO<5> celler/ml i IMDM + 5% FBS. Uttak på 50 ul ble tilsatt til brønnene i 96-brønners plater som inneholdt 50 ul antistoffprøver i IMDM + 5% FBS. Målcellene og antistoffene ble inkubert ved 37°C i 1 time, RBC tilsatt som bærer og cellene nedsentrifugert. Cellene ble vasket to ganger med IMDM. De gjenværende mononukleære cellene ble oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert ved 4 x 10<6> celler/ml i IMDM + 5% FBS og 150 ul tilsatt til hver brønn samtidig som målcellene ble resuspendert. Dette gir et forhold mellom effektorceller og målceller på 20:1. Cellene ble forsiktig sentrifugert og plassert i en vevskultuirnkubator i 6 timer. Supernatantprøver ble tatt ut og spesifikk <51>Cr-frigivelse bestemt som beskrevet ovenfor. Gjennomsnittsverdier for spesifikk frigivelse fra prøver i duplikat ble fremstilt grafisk mot den endelige antistoffkonsentrasjon.

Eksempel 1 - Frembringelse og grunnleggende karakterisering av antistoffer

Mutasjonene som ble valgt for å fjerne effektorfunksjonene er vist i tabell 1 (fig. 15). Aa-mutasjonen som ble innført i IgGl - og IgG2-genene innfører IgG4-aminosyrerestene i posisjonene 327, 330 og 331. På tilsvarende måte ble IgG2-restene i posisjonene 233-236 innført i IgGl og IgG4, men siden IgG2 har en delesjon i posisjon 236 hvor de andre subklasser har en glycinrest, ble mutasjonen utført ved utelatelse av (Ab) eller innfø-ring av (Ac) G236.

Vektorer som tillot ekspresjon av GAMPATH-1- eller Fog-l-VH DNA i forbindelse med gener for vildtype eller mutant konstant område ble kotransfektert med passende lettkjedeekspresjonsvektorer inn i rottemyelomceller.

Stabile transfektanter ble isolert og ekspandert, og Ab renset fra supernatanten med protein A-agarose.

CAMPATH-1H ble utvalgt siden dette utgjør et godt målsystem for studier av komplement- og celleformidlet lysis in vitro.

For Fog-1 Ab, ble en utfelling dannet etter rensingen, men når denne først var fjernet ved filtersteirlisering ble ingen ytterligere utfelling observert. Ab-konsentrasjonene ble estimert fra absorbansen ved 280 nm og ble justert etter behov etter en ELISA som må-ler relative mengder av foreliggende K-kjede. Ab ble analysert ved reduserende SDS-PAGE. Hver prøve viste to bånd med tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 25 hhv. 55 kDa, som representerer de forventede størrelser av lettkjeder og tungkjeder. Det var ingen påvisbar forskjell i størrelse mellom tungkjedene fra de forskjellige Ab-seriene, men begge kjeder i Fog-1 Ab var tilsynelatende noe mindre enn motpartene i CAMPATH-1. Det fakum at tungkjeden i hver serie så ut til å ha samme tilsynelatende molekylvekt tyder på at mutasjonene ikke medførte omfattende forskjeller i proteinenes glykosylering. For Ab med CAMPATH-1-spesifisitet, varierte utbyttet etter rensing fra 0,6 til 9 ug/ml supernatant, mens utbyttet av løselig Fog-1 Ab var mellom 3 og 20 ug/ml. Det var ingen korrelasjon i rangeringen av utbyttet av renset Ab for de to anti-stoffseriene, noe som tyder på at ingen av mutasjonene påvirket produksjonen av Ab eller antistoffenes evne til å binde protein A.

Spesifisiteten av de to Ab-serier ble så analysert. CAMPATH-1 ble vist å konkurrere med CAMPATH-1H av klinisk renhet når det gjaldt binding til anti-CAMPATH-1 - idiotype-mAb YID13.9. Fog-1 Ab kunne agglutinere RhD<+> RBC i nærvær av anti-human IgG Ab som kryssbindingsreagenser. På tilsvarende måte ble IgG-subklassene av Fogl Ab undersøkt ved å belegge RhD<+> RBC med de forskjellige Ab og undersøke agglutineringsmønsteret med anti-Glm(a), anti-IgG2 eller anti-IgG4 Ab som kryssbindende Ab. Resultatet tydet på at antistoffene var av korrekte subklasser. Agglutinering av RhD<+> RBC ved Fog-1 IgGl og anti-Glm(a), ved Fog-1 IgG2 og anti-IgG2 og ved Fog-1 IgG4 og anti-IgG4 ble så utført i nærvær av overskudd av Ab fra CAMPATH-1-serien. CAMPATH-1 Ab kunne inhibere agglutineringen ved å konkurrere om kryss-bindingsreagenset bare når de var av samme subklasse som Fog-1 Ab, noe som bekref-ter deres subklasser.

Eksempel 2 - FcyRI- binding

RBC med tilnærmet 30 000 RHD-seter pr. celle (R2R2) ble belagt med hvert av de 11 Fog-1 Ab over et konsentrasjonsområde og tilsatt til transfektanter som uttrykker human FcyRI, B2KA, dyrket i brønner. Etter inkuberingen ble overskudd av RBC vasket bort og prosent B2KA-celler i rosettformasjon med RBC ble notert (figur 1). For Gl og GlAa, hvor IgG4-aminosyrerester er innført i posisjonene 327, 330 og 331, ble tilsvarende rosetteringsnivå erholdt, med halvmaksimal rosettdannelse når RBC var belagt med antistoff ved tilnærmet 0,1 ug/ml, en konsentrasjon hvor Fog-1 Ab ville forventes å besitte tilnærmet en tredjedel av RhD-setet. Noe høyere konsentrasjoner av G4 var nød-vendig for å oppnå det samme rosetteirngsnivå. Ingen rosetter ble dannet dersom RBC belagt med Gl - og G4-Ab inneholdende Ab- og Ac-mutasjonene, eller G2 Ab. I eksperimentet vist i figur 1, var den høyeste belegningskonsentrasjon som ble analysert 10 mg/ml, noe som ville forventes å tilsvare tilnærmet 90% binding til RhD-setene. Eksperimentet ble gjentatt ved benyttelse av belegningskonsentrasjoner på opp til 80 mg/ml, noe som idet vesentlige vil mettet RhD-setene, og rosetter kunne fortsatt ikke observeres for G2 og Ab som inneholdt Ab- eller Ac-mutasjonen og således hadde innført IgG2-aminosyrerester i det nedre hengselområdet. Dette tyder på at det var utilstrekkelig RBC IgG/ FcyRI-interaksjon for rosettdannelse, selv dersom RBC var belagt med disse Ab ved den maksimale tetthet for dette antigen.

Samsentirfugering av sensitiviserte RBC og B2KA-celler før observasjon av rosetter på et objektglass ble funnet å gi en høyere rosettfraksjon enn inkubering av cellene i brøn-ner, så denne fremgangsmåte ble benyttet for å undersøke inhibering av rosettdannelse. R2R2 RBC ble belagt med en blanding av 1 mg/ml Fog-1 Gl og forskjellige mengder av Fog-1 C2Da eller Fog-1 G4Db før sammenblanding med B2KA-celler. Dersom 1 ug/ml Fog-1 Gl ble benyttet alene, dannet de belagte RBC rosetter med 95% av B2KA-cellene, mens sensitivisering i nærvær av 64 mg/ml G2Aa eller G4Ab ga fullstendig inhibering av rosettdannelsen (resultater ikke vist).

Binding av Ab fra begge serier til to forskjellige cellelinjer som uttrykker FcyRI-cDNA på overflaten ble målt ved fluorescensfarging. Figur 2 viser representative eksperimenter. Nivået av overflateuttrykt FcyRI, bestemt ved benyttelse av CD64 Ab, var høyere for 3T3-transfektantene enn for B2KA-cellelinjen og dette gjenspeiles i de høyere sig-naler som ble oppnådd ved måling av binding via Fc. For begge serier ble Gl- og Gl Aa-Ab bundet til reseptoren med samme tilsynelatende affinitet, noe som tyder på at mutasjonene i posisjonene 327, 330 og 331 ikke i signifikant grad påvirker interaksjonen. Binding av G4-Ab var tilnærmet tre ganger lavere enn binding av Gl - og Gl Aa-Ab. Lite binding ble observert for G2-Ab og alle de andre muterte Ab, noe som tyder på at Ab- og Ac-mutasjonene i IgGl og IgG4 var tilstrekkelig for å redusere bindingen til FcyRI minst IO<4> ganger. Ab som inneholdt Ac-mutsjonen, nærmere bestemt Gl Ac, viste en lav bindingsgrad til FcyRI i de høyeste analyserte konsentrasjoner dersom fluore-scensnivået sammenlignes med bakgrunnsnivået eller med det ekvivalente Ab med Ab-mutasjonen. Dersom fluorescensintensitetshistogrammene legges over hverandre, som vist i figur 3 for de høyeste konsentrasjoner av CAMPATH-1-Ab og B2KA-celler, faller kurvene for Gl og Gl Aa sammen. Det er en klar forskjell mellom histogrammene for GlAb-Ab og GlAc-Ab.

Eksempel 3 - FcyRI- akti veiing målt ved kjemiluminiscens

For å måle funksjonell aktivitet via FcyRI/II, ble kjemiluminiscens (CL)-responsen av monocyter overfor RBC sensitivisert med Ab fra Fog-1-serien målt og fremstilt grafisk, relativt til antall Ab-molekyler bundet pr. RBC (figur 4). En forskjell mellom Gl - og Gl Aa-Ab observeres ved høye Ab-mengder, men begge antistoffer gir høyere respons enn G4-Ab over hele Ab konsentrasjonsområdet. Signifikant aktiviering oppnås med GlAc Ab og, i mindre grad, med GlAac og G4Ac, men de andre Ab gir ingen respons.

Ab som man ut fra foregående avsnitt visste ikke kunne aktivere FcyRI ble blandet i økende konsentrasjoner med en konstant mengde Fog-1-Gl og benyttet for sensitivisering av RBC. CL-responsen på RBC er vist i figur 5. Ved å sammenligne CL-responsen med responsen erholdt ved titrering av Gl alene fremgår det at seks av de åtte Ab inhiberer reaksjonen i forventet grad, dersom det antas at mutantene forskyver aktivt Gl fra RBC proporsjonalt med de relative konsentrasjoner. For G2 er den inhiberende virkning forsinket, siden tilnærmet tre ganger mer G2 er nødvendig for å oppnå samme inhibe-ringsgrad. GlAc inhiberer i tilnærmet samme grad som de andre mutanter, bortsett fra at responsen ikke reduseres til null.

To artikler som diskuterer anvendbarheten av kjemiluminiscens når det gjelder å forutsi omfanget av patologiske tilstander in vivo er Hadley (1995) Transfusion Medicine Re-views 9:301-313 og Hadley et al. (1998) Br. J. Obstet. Gynacol. 105:231-234.

I disse analyser ville et resultat over 30% kjemiluminiscens oppnådd med det monoklonale kontrollantistoff BRAD-5 tyde på en patologisk tilstand in vivo i HDN. De antistoffene som kan blokkere responsen til et nivå under 30% ville således være egnede for terapeutisk behandling.

Et av de mutante Ab, Fog-1 G2A ble analysert for evne til å inhibere CL-responsen overfor serum inneholdende klinisk signifikant Ab. De benyttede sera inneholdt anti-RhD-Ab eller antiC+D og ga, i fravær av inhibitor, CL-responser som var høyere enn 30% på denne skala, noe som tyder på alvorlig hemolyttisk sykdom hos det nyfødte barn og behov for intrauterintransfusjon. De benyttede sera ble blandet med forskjellige konsentrasjoner av G2Aa, blandingene ble benyttet for sensitivisering av RBC og monocyters respons målt (figur 6). Tilsetning av G2Aa-Ab reduserte CL-signalene forårsa-ket av alle de fem anti-RhD-sera til under grenseverdien på 30%. Mengden Ab som var nødvendig for å oppnå dette varierte fra 16 til 260 ug/ml, hvor konsentrasjonsområdet formodentlig reflekterer de forskjellige mengder og affiniteter av anti-RhD-antistof i serumet. Det foreligger to kontrollsera. Anti-K-serum kan ikke i det hele tatt blokkeres av G2Aa, da dette serums reaktivitet er rettet mot et annet antigen på RBC. Kun en del av aktiviteten i anti-C+D-serum kunne inhiberes av G2Aa.

Eksempel 4 - Aktivitet i komplementlysis

Figur 7 viser at alle mutasjoner innført i Gl- og G2-CAMPATH-1-antistoffene i dramatisk grad reduserte deres evne til å formidle komplementlysis. Dersom analysen ble ut-ført ved benyttelse av en konstant mengde Gl og forskjellige mengder G2Aa (figur 8), var G2Aa-antistoffet i stand til å blokkere dreping av PBMC ved CAMPATH-1 Gl.

Eksempel 5 - Aktivitet i ADCC

Evnen til å formidle ACDD ble målt for CAMPATH-1-antistoffene ved benyttelse av humane PBMC som målceller (figur 9) og for Fog-1-antistoffene ved benyttelse av RhD<+> RBC som målceller (figurene 10 og 10b). Figur 9 viser blandede evner for CAMPATH-1-antistoffene i ADCC, hvor noen av mutantene har svært lav aktivitet. Figurene 10 og 10b viser at Fog-l-antistoffmutantene GlAab, GlAac, G2Aa, G4Ab og G4Ac var ute av stand til å understøtte dreping av RBC. I figur 10, kan noe lysis av RBC sensitivisert med G2 eller G4 ses, men disse antistoffer har tilsynelatende ingen aktivitet i analysen i figur 10b. Dette viser at lysisgraden kan avhenge av donoren av effektorcellene, og kan til og med variere ved benyttelse av effektorceller tatt fra samme donor på forskjellige tidspunkt. For mutantene opplistet ovenfor har imidlertid ingen aktivitet over bakgrunnsnivå blitt observert, selv om et utvalg av effektorcelledonorer har blitt analysert.

Noen av Fog-1-antistoffene ble benyttet for å prøve å inhibere ADCC av RhD<+->RBC ved Fog-1 Gl (figurene 11 og 1 lb) og ved en klinisk prøve av anti-RhD-serum (figur 12). Figurene viser at alle de analyserte antistoffer var i stand til å inhibere ADCC ved sammenblanding med de aktive antistoffene før RBC-sensitivisering. De mutante Fog-1-antistoffene Gl Ab, GlAab, GlAac, G4Ab og G4Ac var spesielt effektive i blokkering av ADCC.

Eksempel 6 - Fcyll- binding

Figurene 13,13b og 14 viser binding av komplekser av antistoffer fra Fog-1-serien til celler som uttrykker FcyRIIa 131H/H, FcyRIIa 131R/R hhv. FcyRIIb 1*. Det er nødven-dig å danne antistoffkomplekser ved måling av binding til disse reseptorer, grunnet deres lave affinitet for enkeltvise antistoffmolekyler. FcyRIIa 131H/H er en allotype av

FcyRIIa til hvilken IgG2-antistoffer forventes å binde kraftig, og Gl og G2 viser faktisk en kraftig bindingsaktivitet (figur 13). Tilsetning av mutasjonene til disse to antistoffer gir tilsynelatende en trinnvis reduksjon i bindingsnivået, og antistoffene Gl Ac og GlAac viser kun bakgrunnsnivå av binding, som vist ved G4-antistoffene. Figur 13b viser at antistoffene har forskjellig relativ aktivitet ved binding til 131R-allotypen av FcyRIIa, men mutasjonene innført i vildtype-Gl-antistoffet reduserer igjen binding til reseptoren. Alle antistoffene viser signifikant mer binding til den inhiberende reseptor FcyRIIbl<*>, enn de negative kontrollprøver av kryssbindende F(ab')2 alene eller et agly-kosyl-IgGl-antistoff i kompleks med F(ab')2 (Figur 14). Selv om binding av de fleste mutanter er redusert relativt til de tilsvarende vildtypeantistoffer viser noen mutanter binding som er mindre enn to ganger lavere enn binding av vildtype-Gl-antistoff.

Eksempel 6b - FcgRIII- binding

Figur 14b og 14c viser binding av komplekser av antistoffer fra Fog-1-serien til celler som uttrykker FcyRIIIb av allotypene NAI hhv. NA2. For begge allotyper observeres binding for Gl-antistoffet og, i mindre grad, GlAa- og Gl Ac-antistoffene. Ingen binding observeres for de andre mutante antistoffer, siden disse viser tilsvarende fluore-scensnivå som de negative kontrollprøver av kryssbindende F(ab')2 alene eller et agly-kosyl-IgGl-antistoff i kompleks med F(ab')2.

Eksempel 7 - Fremstilling av anti- HPA- la- antistoffer

VH og Vx fra anti-HPA-la scFv (Griffin, H.M. og Ouwehand, W.H. (1995) A human monoclonal antibody specific for the leucine-33 form of the platelet glycoprotein Illa from a V gene phage display library. Blood 86,4430-4436) ble amplifisert og hvert av dem koblet til en ledersekvens fra vektoren M13VHPCR1 (Orlandi et al., 1989) ved overlappforlengelse-PCR som beskrevet tidligere. DNA, 3' for Vh i M13VHPCR1 som representerer den 5' ende av Vn-CH-intronet ble på tilsvarende måte koblet til le-der/VHDNA. Produktet ble klonet som et Mwdin-Æa/nHI-fragment i IgGl - og IgG2-ekspresjonsvektor ved at de erstattet det eksisterende variabelt områdefragment, slik at vektorene pSVgp/B2VHHuIgGl og pSVg/tfB2VHHuIgG2 ble dannet.

Leder/WDNA ble sammenkoblet med opprettholdelse av leserammen til DNA for det konstante området fra den humane X,-kjede av Kern"Oz"-allotype (Rabbitts, T.H., Fors-ter, H. og Matthews, J.G. 1983. Mol. Biol. Med. 1:11), tatt fra en eksisterende ekspresjonsvektor (Routledge, E.G., Lloyd, I., Gorman, S.D., Clark, M. og Waldmann, H. 1991, Eur. J. Immunol. 21:2717). Hele X-genet ble klonet i M13 som et Hinålll- Bamm-fragment og musetungkjedeenhanceren fra pSV/iyg-HuCK (Orlandi, et al., 1989) addert 5' for genet ved benyttelse av adaptere, slik at hele innskuddet kunne overføres til pSV2neo (Southern, P.J. og Berg. P. 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327 som et BamHl-fragment. Vektoren ble betegnet pSV/jeoB2VXHuCX,.

Ekspresjonsvektorene ble transfektert inn i rottemyelomcellelinjen YB2/0, transfektanter selektert og antistoff renset som beskrevet tidligere. Disse B2IgGl- og B2IgG2-antistoffer kan benyttes som kontrollantistoffer.

Når først de foretrukne nullkonstantområder er selektert, kan B2 VH Hindlll- BamHl-fragmentet innføres i ekspresjonsvektorer som bærer passende gener for konstant område, ved at de erstatter de eksisterende variabelt områdefragment. Tungkje-deekspresjonsvektorene kan så kotransfekteres med pSV/ieoB2VA.HuCX inn i myelom-celler og antistoffene renses for anvendelse.

Eksempel 8 - Terapeutisk anvendelse av rekombinant antistoff

Et terapeutisk molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes for behandling av graviditet komplisert ved HPA-la-alloimmunisering, f.eks. ved intravenøs tilførsel til moren, hvorved man stoler på placental overføring (f.eks. via FcRn) for å oppnå en terapeutisk dose i fosteret.

Et alternativ er direkte tilførsel til fosteret ved perkutan navleblodkaroverføring. Denne fremgangsmåte benyttes i dag i FAIT for tilførsel av transfusjoner av kompatible blodplater. Grunnet den korte overlevelsestid for transfuserte blodplater kan det være nød-vendig å gjenta fremgangsmåten mange ganger i løpet av en graviditet. Det er imidlertid risikofyllt, med 0,5%/behandling fare for tap av fosteret.

Tilførsel til fosteret av et terapeutisk antistoff vil imidlertid ha den fordel at en mye lavere dose sansynligvis er nødvendig, og derfor kan en kombinert tilnærming som benytter molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse i forbindelse med blodplatetransfusjon betraktes som et første behandlingstrinn. Denne tilnærming kan redusere eller fjerne behovet for ytterligere blodplatetransfusjoner før fødselen.

O ppsummering

Antistoffenes aktiviteter er oppsummert i tabell 2 (figur 16). Som figuren viser har det blitt fremstilt rekombinante antistoff med redusert evne til å bindes til FcyRI, FcyRIIa 131H/H, FcyRIIa 131R/R, FcyRIIIb NAI og FcyRIIIb NA2, som er ute av stand til å utløse monocytkjemiluminiscens, som ikke kan formidle komplementlysis og som ikke er aktive i ADCC. De rekombinante antistoff opprettholder imidlertid binding til den inhiberende reseptor FcyRIIb. Andre mutasjoner som tidligere har blitt benyttet for å slå ut effektorfunksjoner, f.eks. fjerning av glykosyleirngssetet i CH2-domenet for fremstilling av aglykosylantistoffer, kan også eliminere binding til denne reseptor, noe som ikke nødvendigvis er ønskelig.

Utvalgte mutanter har blitt vist å kunne inhibere fullstendig rosettdannelse av FcyRI-bærende celler ved Fog-1 Gl, monocytenes respons på Fog-1 Gl-sensitiviserte RBC, monocytenes respons på polyklonalt anti-RhD-sensitiviserte RBC, dreping av PBMC ved komplementlysis med CAMPATH-1 Gl, dreping av RBC ved ADCC med Fog-1 Gl, dreping av RBC ved ADCC med polyklonalt anti-RhD-serum.

Resultatene heri viser at endring av selv bare en enkelt aminosyrerest i et IgG CH2-domene slik at den tilsvarer en forskjellig subklasse kan føre til forskjellige aktiviteter. Dette gjelder f.eks. for de tre par av Ab- og Ac-mutanter: GlAb og GlAc, GlAab og GlAac, G4Ab og G4Ac. Innen hvert par avviker antistoffene kun ved fravær (Ab) eller nærvær (Ac) av G236. For de fleste funksjoner som er målt her har imidlertid Ab- og Ac-antistoffene forskjellig aktivitet. Ab-mutantene er mer aktive når det gjelder binding til FcyRIIa 131H/H, mens Ac-mutantene er mer aktive i FcyRI-binding, FcyRIIIb NA1-og NA2-binding, monocytaktivering og ADCC. Området hvor Ab- og Ac-mutasjonene er innført er kjent som det lavere hengselområde eller hengselkoblingsområdet og har sansynligvis en utstrukket struktur som forbinder hengselen til resten av CH2-domenet. Innføring eller delesjon av en aminosyrerest i dette området endrer sansynligvis sam-menstillingen av aminosyrerester i det lavere hengselområdet relativt til reseptorinterak-sjonsseter i resten av CH2-domenet.

Det bør imidlertid understrekes at virkningen av mutasjonene ikke alltid kan forutsies fra aktiviteten til vildtypeantistoff, men vil avhenge av den nye sammenheng (basert på "sammenblandede" underklasser av IgG) som mutasjonen foreligger i. Et eksempel gjelder analysen av komplementlysis, hvor aktiviteten av IgG2-antistoffet bare er tilnærmet tre ganger lavere enn aktiviteten av IgGl, mens innføring av IgG2-aminosyrerester i IgGl (GlAb og GlAc) fjerner lysisreaksjonen. På tilsvarende måte viser IgGl og IgG2 like stor binding til FcyRIIa 131H, mens aktiviteten til GlAb og Gl Ac er 50 hhv. 10 ganger lavere. I ADCC-analysene i figur 9 og 10, gir IgG2 og IgG4 tilsvarende lavt, men målbart nivå av lysis. Substituering av aminosyrerester mellom IgG2 og IgG4, så vel som i IgGl, reduserer aktiviteten. Disse resultater antyder at vild-typeantistoffene av de forskjellige humane IgG-underklasser, og formodentlig de mutante antistoffer, kan benytte forskjellige aminosyrerester for binding til andre molekyler for utløsing av aktiviteter.

Claims

1. Rekombinant antistoff, karakterisert ved at nevnte molekyl er et rekombinant polypeptid som omfatter: (i) et bindingsdomene som kan bindes til et målmolekyl, og (ii) et effektordomene; hvor nevnte rekombinante antistoff er i stand til å binde mål molekylet uten å utløse vesentlig komplement avhengig lysering eller celle mediert destruksjon av målet, og hvor effektor domenet er - istand til spesifikt å binde FcyRIIb, og - et kimært domene som er avledet fra to eller flere humane immunoglobulin tungkjede Ch2-domener, der de humane immunoglobuliner er valgt blant IgGl, IgG2 ogIgG4, og hvori det kimære domenet er et humant immunoglobulin tung kjede Ch2-domene som har følgende aminosyrer ved de gitte posisjoner: 233P, 234V, 235A og 236G og 327G, 3 3 OS og 331S i samsvar med EU-nummereringssystemet, og er minst 98% identisk med en Ch2 sekvens (restene 231-340) fra humant IgGl, IgG2 eller IgG4 som har de nevnte modifiserte aminosyrer.

2. Rekombinant antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at effektor domenet er GlAac med følgende aminosyresekvens:

3. Rekombinant antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at effektor domenet er G4Ac med følgende aminosyresekvens:

4. Rekombinant antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at resten i posisjon 236 er slettet slik at det kimære domenet er et humant immunoglobulin tungkjede Ch2 domene som har følgende blokker av aminosyrer ved de angitte posisjoner: 233P, 234V, 235A, ingen rest i posisjon 236, 327G, 330S og 33IS i samsvar med EU nummereringssystemet, og er minst 98% identisk med en Ch2 sekvens (rest 231-340) fra humant IgGl eller IgG2 som har nevnte modifiserte aminosyrer.

5. Rekombinant antistoff ifølge krav 4, karakterisert ved at effektor domenet er GlAab med følgende aminosyresekvens:

6. Rekombinant antistoff ifølge krav 4, karakterisert ved at effektor domenet er G2Aa med følgende aminosyresekvens:

7. Rekombinant antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at effektor domenet er avledet fra et første humant immunoglobulin tung kjede Ch2 domene, hvor minst 1 aminosyre i minst 1 region av Ch2 domenet har blitt modifisert til den korresponderende aminosyre fra et andre, forskjellig, humant immunoglobulin tung kjede Ch2 domene, og hvor effektor domenet har redusert affinitet for FcyRI, FcyRIIa eller FcyRIII og en redusert evne til å mediere komplement lysering sammenliknet med det første eller andre humane immunoglobulin tung kjede Ch2 domenet.

8. Rekombinant antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at bindingsdomenet er avledet fra en kilde som er forskjellig fra kilden til effektor domenet.

9. Rekombinant antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at bindingsdomenet er i stand til å binde til hvilket som helst av: RhD-antigenet på røde blodceller, et HPA-alloantigen på blodplater, et neutrofilt antigen, en T-cellereseptor, integrin, GBM-kollagen, Der Pl, HPA-la, VAP-1, laminin, luteran, blodplateglykoprotein VI og blodplateglykoprotein Ia/Ila.

10. Rekombinant antistoff ifølge krav 9, karakterisert ved at bindingsdomenet er valgt fra det til CAMPATH-1 og FOG1; OKT3; B2 (anti-HPA-la); VAP-1; muse-anti-a3 (IV) NC1; YTH12.5 (CD3); 2C7 (anti-Der p I); anti-laminin; anti-luteran.

11. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den omfatter en nukleotidsekvens som koder for effektordomenet av det rekombinant antistoffet iføl-ge et hvilket som helst av de foregående krav.

12. Nukleinsyre ifølge krav 11, karakterisert ved at nukleotidsekvensen koder for et rekombinant antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

13. Vektor, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyre som definert i krav 11 eller 12.

14. Vektor ifølge krav 13, karakterisert ved at nukleotidsekvensen er operativt koblet til en promoter.

15. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter eller er transformert med vektoren ifølge krav 13 eller krav 14.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant antistoff ifølge et hvert av kravene 1 til 10, karakterisert ved at den omfatter modifisering av en nukleotidsekvens som koder for Ch2 fra tungkjeden til et første humant immunglobulin, slik at 2, 3 eller 4 aminosyrer i minst 1 område i CH2-domenet tilsvarer en aminosyre i Ch2-domenet i tungkjeden til et andre humant immunglobulin, hvor området er valgt fra de 2 avgrensede områdene nummerert residuer 233-236 og 327-331 i samsvar med EU-nummereringssystemet, og hvor det humane immunoglobulin i hvert enkelt tilfelle er valgt fra IgGl, IgG2 og IgG4.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at 2 aminosyrer i 1 område i Ch2-domenet er modifisert til de korresponderende aminosyrer fra et andre humant immunoglobulin tung kjede CH2-domene.

18. Anvendelse in vitro, av et rekombinant antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1-10 for å binde mål molekylet med nevnte bindingsdomene.

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvor effektor domenet spesifikt binder FcyRIIb, og hvor bindingen gir inhibering av en eller flere av: B-celleaktivering, mastcelledegranulering, fagocytose.

20. Anvendelse ifølge krav 19, for å forhindre, inhibere eller interferere med binding av et andre bindende molekyl til målmolekylet.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor det andre bindende molekyl er et antistoff.

22. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 18-21, karakterisert ved at målmolekylet er utvalgt blant: RhD-antigenet på røde blodceller; et HPA-alloantigen på blodplater; et neutrofilt antigen; en T-cellereseptor; integrin; GBM-kollagen; Der Pl; HPA-la; VAP-1; laminin; luteran; blodplateglykoprotein VI; blodplateglykoprotein Ia/Ila.

23. Anvendelse av et rekombinant antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, for fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse hos en pasient, hvor nevnte bindingsdomene av nevnte rekombinante antistoff er anvendt i nevnte behandling for å binde målmolekylet som er assosiert med nevnte lidelse, hvor nevnte lidelse og målmolekyl er valgt fra: (x) "Graft-vs-host"-sykdom, "host-vs-graft"-sykdom, organtransplantatawis-ning, benmargstransplantatawisning, autoimmun vaskulit, artritt eller astma; hvor målmolekylet er en T-celle reseptor; (xi) autoimmun hemolytisk anemi eller autoimmun trombocytopeni; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av rød blodcelle resus antigener D, C, c, E, e; Keil (Kl) antigenet; blodplateglykoprotein GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V; (xii) fetal/neonatal alloimmun trombocytopeni; hvor målmolekylet er humant blodplateantigen (HPA)-la på blodplateglykoprotein Illa; (xiii) støvmidd allergi; hvor målmolekylet er Der Pl protein fra hus støv midd Dermatophagoides pteronyssinus; (xiv) chrohn' s sykdom; hvor målmolekylet er VAP-1; (xv) HDN; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av rød blodcelle resus antigener D, C, c, E, e og Keil (Kl) antigenet; (xvi) goodpastueres syndrom; hvor målmolekylet er ikke-kollagen (NC1) domenet av a3(IV) kollagen; (xvii) sigdcelleanemi; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av trombospondin; liminin; luteran; (xviii) koronar arterieokklusjon; hvor målmolekylet er valgt fra gruppen bestående av integrin c^Pi (blodplateglykoprotein Ia/Ila); ikke-integrin blodplateglykoprotein VI.

24. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et rekombinant antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 10 samt en farma-søytisk akseptabel bærer.

25. Antistoff CH2 område, karakterisert ved at det er GlAac med følgende aminosyresekvens:

26. Antistoff CH2 område, karakterisert ved at det er GlAab med følgende aminosyresekvens:

27. Antistoff CH2 område, karakterisert ved at det er G2Aa med følgende aminosyresekvens: