CZ20004146A3 - Vazebné molekuly odvozené od imunoglobulinů, které nespouští lyži zprostředkovanou komplementem - Google Patents

Abstract

Navázání molekul, kterými jsou rekombinantní polypeptidy obsahující i) vazebnou oblast schopnou vázat cílovou molekulu a ii) efektorovou oblast, která vykazuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě homologní s celou nebo s částí konstantní oblastí těžkého řetězce lidského imunoglobulinu. Vazebná molekula je schopna vázat cílovou molekulu, aniž spustí podstatnou lyži závislou na komplementu nebo poškození cíle zprostředkované buňkou. Preferuje se, aby efektorová oblast byla schopna specificky vázat FcRn a/nebo FcyRIIb. Tyto vazebné molekuly jsou obecně založeny na chimérových oblastech, které se získaly ze dvou nebo více oblastí Ch2 těžkého řetězce lidského imunoblogulinu. V preferovaném provedení se oblasti 233 až 236 a 327 až 331 upravily tak, aby propůjčily molekule nulový alotyp. Nukleové kyseliny hostitelské buňky, způsoby produkce, materiály a použití. Farmaceutické prostředky s obsahem těchto sloučenin a jejich použití pro léčení autoimunitních, aloimunitních a zánětlivých onemocnění.

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje vazebné polypeptidy, které mají aminokyselinové sekvence získané z upravené konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu G (IgG). Vynález dále popisuje způsoby a materiály vhodné pro produkci takových polypeptidů a metod a používaných materiálů.

Dosavadní stav techniky

Imunoglobuliny

Imunoglobuliny jsou glykoproteiny, které pomáhají chránit hostitele před infekcí. V obecném případě obsahují těžký a lehký řetězec, N-terminální oblasti, kterou tvoří variabilní oblast nebo V oblast, jenž jsou schopné vázat antigen. V oblast je spojena s konstantní nebo C-terminální oblastí, která definuje třídu (a někdy podtřídu (izotyp) a alotyp (izoalotyp) imunoglobulinu.

U savčích druhů pak existují imunoglobuliny jako IgD, IgG, IgA, IgM a IgE. Třída IgG u lidí naopak existuje jako 4 podtřídy (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4). C-oblast v IgG obsahuje tři domény Cyl, Cy2 a Cy3, které jsou si v rámci těchto podtříd velmi podobné (vykazují přes 90 % homologie). Oblasti Cyl a Cy2 jsou spojeny kloubním spojením. Úloha podtříd se mění v závislosti na druzích.

Je známo, že C-oblast je odpovědná za různé funkce efektorů imunoglobulinu (popisuje se v publikaci Clark (1997) „IgG Effector Mechanisms in „Antibody Engineering Ed. Capra,

Pub. Chem. Immunol., Basel, Kurger, Vol. 65 pp 88-110).

• 9 • ·

Funkce IgG se dosáhnou prostřednictvím interakce mezi oblastí Fc imunoglobulinu a receptorů Fcy (FcyR) nebo jiné vazebné molekuly, někdy na efektorové buňce. To může způsobit, že buňka efektoru usmrtí cílové buňky, na které jsou navázány protilátky prostřednictvím jejich variabilních oblastí (V) . Také protilátky směrované proti rozpustným antigenům mohou tvořit imunitní komplexy, které jsou cíleny do FcyR, což vede k pohlcení (opsonozaci) imunitních komplexů nebo ke spuštění efektorových buněk a k uvolnění cytokinů.

U lidí se charakterizovaly tři třídy FcyR, ačkoli se situace dále komplikuje výskytem více forem receptorů. Existují tři třídy:

i) FcyRI (CD64) váže monomerní IgG s vysokou afinitou a exprimuje se na makrofágách, monocytech a někdy na neutrofilech a eosinofilech.

ii) FcyRII (CD32) se váže na komplex IgG se střední až nízkou afinitou a exprimuje se v širokém měřítku. Tyto receptory se mohou rozdělit do dvou důležitých typů, FcyRIIa a FcyRIIb.

Forma receptorů „a se nachází na mnoha buňkách a podílí se na usmrcení (například makrofágy, monocyty, neutrofily) a zdá se, že aktivují proces usmrcení a objevují se jako dvě alternativní alely.

Zdá se, že forma „b má důležitou úlohu v inhibičních procesech a nachází se na B-buňkách, makrofágech a na žírných buňkách a eosinofilech. Když se vyskytují na B-buňkách, zdá se, že působí jako supresory produkce dalšího imunoglobulinu a přepínače izotypu například třídy IgE. U makrofágů B-forma působí jako inhibitor fagocytózy, což zprostředkovává RcyRIIa. U eosinofilů a žírných buněk může forma „b pomoci potlačit aktivaci těchto buněk prostřednictvím navázání IgE na jeho oddělený receptor.

···· ·· ··· · · · iii) FcyRIII (CD16) se váže na IgG se střední až nízkou afinitou a tvoří dva typy. FcyRIIIa se nachází na buňkách NK, makrofágách, eosinofilech a některých monocytech a T buňkách a zprostředkovává ADCC. FcyRIII se silně exprimuje na neutrofilech. Oba typy tvoří různé alotypové formy.

Fc může transport také

IgG zvýšení poločasu

Stejně jako navázání na FcyR protilátky mohou aktivovat komplement a to může vést k lyži buněk, opsonizaci nebo k uvolnění cytokinů a zánětu. Oblast zprostředkovat takové vlastnosti, jako novorozenci (prostřednictvím tzv. „FcRn), rozpadu (věří se, že je také ovlivněn prostřednictvím receptoru typu FcRn (popisuje se v publikaci Ghetie and Ward (1997) Immunology Today 18, 592-598) a samoagregaci. Oblast Fc je také zodpovědná za interakci s proteinem A a proteinem G (tato interakce se jeví být analogem k navázání FcRn).

Konstrukce imunoglobulinů

Řada vlastností zprostředkovaných Fc, které se diskutují shora v textu se mohou vyžadovat u přirozeně se vyskytujících nebo uměle konstruovaných protilátek. Mohou však nastat okolnosti, kdy odumírání buněk nebo uvolňování cytokinů a výsledný zánět není žádoucí a není vhodný.

Může být také nutné zachovat jisté funkce zprostředkované Fc. Jsou to například dlouhý poločas rozpadu plazmy.

Je známo, že lidský imunoglobulin IgG4 například neaktivuje komplement a lidské IgG2 se neváže na receptor FcyRI s vysokou afinitou a na základě těchto poznatků se tyto imunoglobuliny používaly v určitých situacích (fúzní protein receptoru TFN se připravil s IgG4 Fc) .

Avšak podtřídy, které nejsou lidské nevykazují žádný z relevantních efektoru Fc, které spouští funkce nebo aktivaci komplementu za všech okolností. Pravděpodobně tyto podtřídy vykazují existenci několika forem receptorů FcyR. Tak například IgG4 může u některých lidí zpustit buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC) a IgG2 se váže na jednu alelovou formu receptorů FcyRIIa a také aktivuje komplement.

Alternativním přístupem je mutace sekvence Fc, přičemž se substituují zbytky, které jsou nutné pro zachování funkce. Jisté cílové zbytky se identifikovaly a publikovaly se v publikaci Clark (1997) „IgG Effector Mechanisms in „Antibody Engineering Ed. Capra, Pub. Chem. Immunol., Basel, Kurger, Vol. 65 pp 88-110. Tyto zbytky zahrnují sacharidy připojené svým N-koncem ke konzervativnímu místu oblasti C_H2, jisté zbytky ve spodní oblasti spojení (například sekvence ELLGGp) a prolinový zbytek v poloze 331 a sekvence E-x-K-x-K v polohách 318 až 322. Jeden příklad se popisuje v publikaci Cole et al (1997) Journal of Immunology 159, 3613-3621.

V tomto příkladu se zbytky 234, 235 a 237 mutovaly na alaniny (nebo v případě 235 někdy na Glu). Jsou to však všechno neobvyklé zbytky v těchto polohách v lidském IgG, přičemž přítomnost takových nevhodných aminokyselin může tvořit Fc více imunogenní nebo antigenní a může také vést ke ztrátě jistých požadovaných funkcí Fc.

Tato strategie se může také použít při konstrukci terapeutických glykosylovaných protilátek CD3 (popisuje se v publikaci Routledge et al., 1993 Eur J. Immunol. 23: 403411, patent UK 9206422.9) a inhibičních protilátek CD18. Jednou nevýhodou je, že nové rekombinantní konstrukce vykazují neobvyklé sekvence a mohou být rozeznány a odmítnuty imunitním systémem jako cizorodé. Glykosylované protilátky také nevykazují navázání na inhibiční receptor FcyRIIb, zatímco • · udržování schopnosti vázat se může být v některých případech výhodné.

Jiné přístupy k modifikaci imunoglobulinu se popisují v publikaci WO 92/16562 (Lynxvale LTD.). V této publikaci se popisuje úprava alotypu humanizovaných protilátek IgGl CAMPATH1H, které vykazují vazebnou afinitu pro antigen CD52. Antigen CD52 se nachází na lidských lymfocytech a monocytech a používá se jako terapeutický cíl pro léčbu lymfomů T a B buněk a leukémií, imunosuprese příjemců při transplantaci orgánu nebo kostní dřeně a také při léčbě některých autoimunitních a příbuzných poruch, jako je revmatická artritida a systémová vaskulitida.

Dokument WO 95/05468 (Lynxvale Ltd.) také popisuje modifikaci alotypických determinant v Ig (nebo deriváty), které mají požadované vazebné nebo efektorové funkce.

Na základě předcházejících informací je možné říci, že zavedení metod nebo materiálů, které umožní inženýring oblastí Fc tak, že se redukují nežádoucí účinky, zatímco se zachovávají nebo zesilují požadované vlastnosti, bude přínosem pro stav techniky.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nové kombinace sekvencí lidské podtřídy IgG za účelem vzniku chimérových polypeptidů, které obsahují nepřirozené, lidské napodobující Fc sekvence, které neaktivují komplement nebo nespouští cytotoxické aktivity prostřednictvím FcyR. Ve stejné době jisté požadované vlastnosti IgG zůstaly zachovány. Například polypeptidy neobsahují „nelidské aminokyseliny a proto pravděpodobně redukují imunogenicitu. (dále stále váží protein A, který je schopen zkřížit lidskou placentu prostřednictvím interakce s FcRn (neonatální Fc receptor).

·« · · ··

Způsob, kterým se sekvence budou vyvíjet, a jisté demonstrovatelné vlastnosti se popisují dále v textu. Vynález popisuje řadu konstrukcí založených na třech různých sekvencích IgG (1, 2 a 4). Ačkoli relevantní oblasti těchto protilátek sdílí homologii, neodpovídají délkou, čímž komplikují proces vytvoření odvozených sekvencí, které si ponechávají aktivity z přirozených sekvencí. Konstruované protilátky se porovnaly s rodičovskými kontrolními protilátkami v souladu s modelovými antigenními systémy RhD (Fogl) a CD52 (CAMPATH-1H). Překvapivě se vytvořilo řada sekvencí s požadovanou kombinací aktivit, které se nenacházejí u rodičovských molekul. V obecném případě obsahují jednu nebo více oblastí nebo bloků, které obsahovaly modifikace (obyčejně 2, 3 nebo 4 aminokyseliny), které jsou v souladu s odpovídající oblastí z různých podtříd. Dvě určité oblasti nebo bloky jsou 233 až 236 a 327, 330, 331.

Vynález popisuje molekulu vázající se na polypeptid obsahující i) vazebnou oblast schopnou vázat se na cílovou molekulu a ii) efektorovou oblast, která má aminokyselinovou sekvenci v podstatě homologní s celou nebo s částí konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu. Tato molekula je charakterizována tím, že vazebná molekula je schopna vázat cílovou molekulu, aniž spustí podstatnou lyži závislou na komplementu nebo destrukci cíle zprostředkovanou buňkou a přednostně tím, že efektorová oblast je schopna se specificky vázat na FcRn nebo na FcyRIIb, přičemž více se upřednostňuje, když se váže jak na FcRn tak na FcyRIIb.

Specifické navázání FcRn se může dokázat schopností se specificky vázat na protein A.

Vazebné molekuly podle vynálezu vykazují zlepšené klinické vlastnosti (například v souladu s „blokujícími protilátkami).

·*· « ·

Toho se dosáhne připravením efektorové domény odvozené od Fc, která má sníženou afinitu pro FcyRI, FcyRII a FcyRIII, ale která si uchovává schopnost vázat se na protein A (vzhledem k FcRn, možnému neonatálnímu transportu a vysokému poločasu rozpadu) a/nebo FcyRIIb. Tak zbytky odpovědné za navázání FcRn na IgG není třeba modifikovat s ohledem na přirozenou oblast Fc v molekulách podle vynálezu.

V obecném případě snížení afinity, kterou vykazuje oblast efektoru vzhledem k receptorů FcyRI (porovnává se s jednou oblastí Fc, ze které se odvodil), může v preferovaných provedeních vynálezu být stonásobné nebo vyšší. V případě receptorů s nižší afinitou popsaných shora v textu snížení afinity může být nižší například o 2 až 10 násobek, ačkoli ve většině preferovaných provedeních vynálezu může být vyšší než 500 krát. Obecně odpovídající snížení aktivity v testu chemoluminiscence (jak se popisuje dále v textu) může být až 30 až 300 násobné. Snížená aktivita komplementu může dosahovat 50-ti násobku. Odpovídající obrázek v případě ADCC může být daleko vyšší, například 10 000 násobek. Kombinace těchto (omezených) aktivit může být při těchto aplikacích stále výhodná s ohledem na přesnou hodnotu snížení.

Navzdory tomu, že v minulosti se připravily chiméry IgGl/IgG2 a IgGl/IgG4 (popisuje se v publikaci Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324 nebo Chappel et al., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci USA 88: 9036-9040 nebo Greenwood et al (1993) Eur. J. Immunol. 23: 1098-1104), žádná z nich nevykazuje kombinaci vlastností, které vykazuje vazebná molekula podle vynálezu.

Různé funkce vazebné molekuly se mohou odhadnout bez velkého úsilí, například za použití metod popsaných dále v textu nebo analogických metod. Například vazebné vlastnosti FcyR FcyRIIbse mohou odhadnout přímo nebo nepřímo, například • · η ····· ·**· .* “ί.....ί :

··’·· ·..* .:. ·..· .

prostřednictvím neschopnosti vyvolat chemoluminiscenci u monocytů.

Neschopnost vyvolat podstatnou lyži závislou na komplementu (která proběhne prostřednictvím snížené afinity v případě molekuly Clq) se může měřit pomocí CR-51 uvolněného z cílových buněk v přítomnosti komponentů komplementu, například ve formě séra (jak se popisuje dále v textu), přičemž vazebné molekuly způsobí méně než 5%, upřednostňuje se méně než 2 % specifickou cílenou buněčnou lyži.

Podobně, buňkou zprostředkovaná destrukce cíle se může hodnotit pomocí CR-51 uvolněným z cílových buněk v přítomnosti vhodných cytotoxických buněk, jako jsou krevní monojaderné efektorové buňky (jak se popisuje dále v textu), přičemž vazebná molekula způsobuje méně než 5%, upřednostňuje se méně než 2 % specifickou cílenou buněčnou lyži.

Jako alternativa k přímému měření se funkčnost může odvodit na základě schopnosti inhibovat tyto atributy ve funkčních imunoglobulinech. Tím, že se například poskytne ochranný účinek proti lyži buněk komplementem nebo usmrcení buněk (například pomocí ADCC) nebo inhibicí odezvy monocytů na citlivé buňky.

V jednom, preferovaném provedení podle vynálezu efektorová oblast obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě homologní se sekvencí C_H2 z lidského IgGl, G2 nbeo G4 . Uvedená sekvence obsahující jednu nebo více z následujících modifikací (substituce nebo delece aminokyselin) v uvedených polohách (popisuje se v publikaci Kabat et al., „Sequences od proteins of immunological interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH, 1991):

Poloha

233 aminokyselina

P « ·

St

234

235

236 327

330

331

V

A (není zbytek) nebo G G

S

S

V preferovaném provedení vynálezu tyto substituce připravují v „blocích 233 až 236 a/nebo 327, 330, 331. Tak mutovaná oblast v oblasti C_H2 bude vykazovat 100 % homologii s podtřídou, ze které pochází substituované zbytky, přičemž se snižuje pravděpodobnost, že oblast bude reprezentovat epitop B buňky nebo T buňky v imunitním systému.

Připravilo se několik mutantních imunoglobulinů založených na IgGl, IgG2 nebo IgG4, které vykazují dané rysy, a ukázalo se, že mají požadované vlastnosti. Ačkoli některé mutace jednotlivých zbytků ve vazebných molekulách se připravily už dříve, specifické kombinace jsou nové.

	Preferované v textu:	formy vazebné molekuly se	popisují	dále
	Efektorová oblast
i	Peptid obsahuje efektorovou oblast, aminokyselinovou sekvenci v podstatě homologní	která s celou	má nebo

částí konstantní oblasti lidského imunoglobulinů, přičemž se upřednostňuje C-oblast IgG.

Publikovala se řada sekvencí lidských C oblastí (jak se popisuje v publikaci Clark (1997) „IgG Effector Mechanisms in „Antibody Engineering Ed. Capra, Pub. Chem. Immunol., Basel, Kurger, Vol. 65 pp 88-110). Jiné sekvence těžkých řetězců lidského imunoglobulinů se mohou získat z databází SwissProt a PIR za použití software Lasergene (DNAStar Limited, London UK) ·· a přístupových čísel A93433, B90563, A90564, B91668, A91723 a A02146 v případě C oblasti lidského řetězce Igy-l, A93906, A92809, A90752, A93132, A02148 v případě C oblasti lidského řetězce Igy-2, A90933, A90249, A02150 v případě C oblasti lidského řetězce Igy-4 a A23511 v případě C oblasti lidského řetězce Igy-3.

Homologie (nebo shoda nebo podobnost) se může hodnotit libovolnou vhodnou metodou. Homologie se může prokázat na úrovni kódující nukleotidové sekvence nebo kódované aminokyselinové sekvence. Termín „v podstatě homologní,, znamená, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci sdílející alespoň 50 % nebo 60 % nebo 70 % nebo 80 % homologii, nejvíce se upřednostňuje alespoň 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99% homologie s referenčním imunoglobulinem.

Termín podobnost nebo homologie se může definovat a stanovit použitím programu TBLASTIN, který se popisuje v publikaci Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, který nachází standardní použití v oboru a preferovaný standardní program BestFit, který je součástí Wisconsin Package, Version 8, September 1994 (Genetics Computer Group, 575 Scinece Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711). Program BestFit umožňuje optimální uspořádání nej lepšího segmentu podobnosti mezi dvěmi sekvencemi. Optimální uspořádání se provede začleněním děr, přičemž se maximalizuje počet párů za použití algoritmu lokální homologie podle Smithe a Watermana.

Toto hodnocení je možné udělat bez nadměrného úsilí odborníka ve spojení s hodnocením požadované kombinace aktivit za účelem rozpoznat molekulu podle vynálezu.

Vedle toho, že molekuly vykazují sníženou afinitu vůči

Fcy-RI, Fcy-RIIa, Fcy-RIIIa a Fcy-RIIIb, aby si uchovaly • · ··» ♦

schopnost vázat inhibiční receptor Fcy-RIIb nebo vykazovaly určitý stupeň pomocí efektorové molekuly. Upřednostňuje se, aby schopnost vázat se byla vyšší než afinita v případě receptorů Fcy-RIIa a více se upřednostňuje, aby odpovídala rodičovské oblasti Ig, ze které se odvodila. Získané výsledky ukazují, že vyvinuté vazebné molekuly vykazují uvedené vlastnosti. V dosavadním stavu techniky nebylo výhodné, aby se navázání oblastí Fc manipulovalo nezávisle.

na receptor Fcy-RIIa a Fcy-RIIb

Tato schopnost může doplnit další požadované funkce (což indikuje schopnost vázat se na protein A), čímž se zvýší terapeutický potencionál vazebné molekuly.

Počet publikací zdůrazňuje důležitou úlohu, kterou může mít receptor Fcy-RIIb při inhibici buněčného postupu (popisuje se v publikaci Daeron et al., 1995, Immunity 3(5): 635-46, Van den Herik et al., 1995 Blood 85(8): 2201-11, Sarmay et al., 1996 Immunol. Lett 54(2-3): 93-100, Fong et al., 1996 Immunol. Lett. 54(2-3): 83-91, Sarmay et al., 1996 J. Biol. Chem. 271 (48): 30499-504, Unkeless and Jin, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9(3): 338-43, Isakov, 1997 Immunol. Res. 16(1): 85-100, Hunter et al. , 1998 Blood 91(5) : 1762-8, Malbec et al., 1998 J. Immunol. 160(4): 1647-58, Clynes et al., 1999 J. Exp. Med. 189 (1): 179-85). V těchto publikacích se ukázalo, že receptor FcyRIIb, když se zkříženě váže na jiné receptory, může inhibovat jejich signál, přičemž inhibuje takové procesy, jako je aktivace B buňky, degranulaci žírné buňky a fagocytózu makrofágy.

Vazebné molekuly podle vynálezu, které si udržují tuto aktivitu, se mohou použít ne pouze pro soutěžení a kompetetivní inhibici nežádoucích interakcí protilátka-antigen (tak jako autoantigeny nebo aloantigeny) , ale také při nekompetetivní inhibici těchto procesů, například prevencí produkce dalších autoprotilátek nebo aloprotilátek pomocí ·· »« • * « • · · * ··· • * • · · 0 » inhibice aktivace B buněk. Jiné příkladné aplikace tohoto inhibičniho účinku se popisují dále v textu ve vztahu k terapii alergie a astmatu (inhibice degranulace žírných buněk) a molekul anti-RhD (inhibice fagocytózy).

Upřednostňuje se, aby se samotná efektorová oblast odvodila z konstantní oblasti lidského imunoglobulinu, přičemž se více upřednostňuje, aby se tato oblast získala z C-oblasti IgG.

Upřednostňuje se, aby obsažená aminokyselinová sekvence byla v podstatě homologní se sekvencí C_H2 (to představuje přibližně zbytky 231 až 340) z lidského IgGl, G2 nebo G4, které vykazují upravené aminokyseliny, jak se popisuje shora v textu.

Nejvíce preferované sekvence C_H2 jsou zobrazeny na obrázku č. 17, zvláště ty označené GlÁab, G2Áa nebo GlAac.

Libovolná z těchto sekvencí se může v molekulách podle vynálezu kombinovat s přirozenou nebo upravenou oblasti C_H3 a s přirozenou nebo upravenou oblastí spojení plus se sekvencemi oblasti C_H1.

Odborník preferuje, že není nutné, aby jiné části efektorové oblasti (nebo jiné oblasti molekuly) obsahovaly přirozené sekvence, zvláště může být nutné kombinovat zde popsané modifikace sekvencí, které se například vybraly z literatury, přičemž je nutné, aby si pouze zachovaly požadované aktivity. Pro odborníka bude výhodné, když vazebné molekuly obsahující modifikované (například způsobem adice aminokyseliny, inzercí, delecí nebo substitucí) efektorové oblasti spadají do rozsahu vynálezu.

Zvláště preferované mohou být sekvence „nulového alotypu, což jsou sekvence získané z těžkého řetězce IgG (popisuje se v publikaci WO 92/16562), kde alotypické zbytky podléhají « · « ·

mutaci, aby se párovaly s těmi, které se nacházejí v jiných molekulách lidské podtřídy IgG. To může minimalizovat skutečnost, že sekvence se jeví libovolnému jedinci jako cizorodé.

Vazebná oblast a cílová molekula

Molekula peptidu obsahuje vazebnou oblast schopnou vázat se na cílovou molekulu.

Vazebná oblast bude mít schopnost interagovat s cílovou molekulou, kterou přednostně může být jiný polypeptid, ale může být libovolným cílem (například sacharid, lipid (takový jako fosfolipid) nebo nukleová kyselina). Upřednostňuje se, když interakce bude specifická. Vazebná oblast se může získat ze stejného zdroje nebo z odlišného zdroje než je efektorová oblast.

Zatímco efektorová oblast se obecném případě získá z protilátky, vazebná oblast se může odvodit z libovolné molekuly se specifitou pro jinou molekulu, například enzym, hormon, receptor (vázaný na buňce nebo cirkulující) pro cytokin nebo pro antigen (který specificky váže protilátky).

Přednostně obsahuje celou nebo část protilátky nebo její derivát, zvláště přirozenou nebo upravenou variabilní oblast protilátky. Tak vazebná molekula podle vynálezu může poskytovat vazebnou oblast protilátek a těžký řetězec lidského imunoglobulinu pocházející z hlodavců nebo Camelidae (popisuje se v dokumentu WO 94/25591), jak se popisuje shora v textu.

Preferují se také molekuly, které vykazují více než jeden typ vazebné oblasti, jako jsou bispecifické protilátky (popisuje se v dokumentu PCT/US92/09965). V těchto případech jedno „rameno se váže na cílovou buňku a druhé rameno se váže ·· na druhou buňku, aby spustily usmrcení cíle. V takových případech může být nutné minimalizovat působení efektorové části, která může jinak aktivovat další buňky, které interferují s požadovaným výstupem. Samotná „ramena (to je vazebná oblast) se může zakládat na oblastech Ig (například Fab) nebo může pocházet z jiných proteinů, jako je fúzní protein, jak se popisuje dále v textu.

Vazebná molekula může obsahovat více než jeden polypeptidový řetězec, které jsou spojeny například kovalentní vazbou nebo jiným způsobem (například hydrofobní interakcí, iontovou interakcí nebo prostřednictvím sulfidových můstků). Může například obsahovat lehký řetězec v kombinaci s těžkým řetězcem, který obsahuje efektorovou oblast. Může se například použít libovolný vhodný lehký řetězec, nejběžnějším alotypem lehkého řetězce kappa v běžné populaci je Km(3). Proto může být nutné využít tento běžný alotyp lehkého řetězce kappa, protože relativně málo členů populace ho bude považovat za cizorodý.

V typickém případě cílem bude antigen přítomný na buňce nebo receptor s rozpustným lígandem, o který protilátky soutěží.

Tyto látky se mohou vybrat jako terapeutický cíl, přičemž je nutné, aby se navázaly na molekulu, která vykazuje vlastnosti popisované shora v textu, může například soutěžit nebo nahrazovat požadovanou protilátku. V jiném případě může být nutné, aby se molekuly vázaly na cílovou molekulu, aniž dojde k poškození zprostředkované buňkou, zánětu způsobenému protilátkami nebo lyži komplementem. Stejně efektorová oblast může fungovat primárně při zprostředkování transportu a/nebo zlepšení poločasu rozpadu séra. V takových případech vazebná oblast a cílová molekula může být libovolný systém, pro něhož tyto rysy budou výhodné.

Dále v textu se uvádí výběr aplikací, kde vazebné molekuly podle vynálezu se mohou použít jako terapeutické protilátky, které nesou inzert oblastí Fc:

1) kompetice mateřských aloprotilátek IgG vůči antigennímu epitopu na krevních buňkách zárodku/novorozence.

Aloimunitní poruchy krevních krvinek zárodku mají běžnou patogenezi. Dochází k syntéze aloprotilátek matkou proti dědičnému antigenu na červených buňkách zárodku, granulocytech nebo krevních destičkách. Pak následuje transport aloprotilátek placentou. U zárodku nebo novorozence dochází k poškození červených krvinek zárodku potažených protilátkami, které mohou vést ke klinicky podstatnému poškození oběhového systému relevantních buněk. Terapeutické protilátky vůči relevantnímu epitopu, ale s Fc, které nespouštějí destrukci, mohou soutěžit s mateřskými protilátkami o možnost navázání na buňky zárodku, čímž inhibují jejich poškození.

Protilátky proti aloantigenům červených buněk způsobují hemolytícké onemocnění plodu nebo novorozence.

Nejdůležitější aloantigeny červených krvinek jsou v krevních skupinových systémech Rhesus a Kell. Výskyt hemolytického onemocnění způsobený antigenem RhD se dramaticky snižuje vzhledem k zavedení post-natální profylaxe, ale stále se vyskytují případy, které jsou způsobeny mateřskou citlivostí během prvního těhotenství. Další antigeny Rhesus (C, c, E, e) mohou také způsobit hemolytícké onemocnění, stejně jako protilátky vůči antigenu Kell (Kl), které navíc omezují erythopoiézu v kostní dřeni zárodku.

Současná terapie silně poškozených plodů spočívá v regulované vnitroděložní transfúzi červených krvinek, které nenesou antigen. Ukázalo se, že infúze nespecifického imunoglobulinu není v těchto podmínkách účinná. Anémie a • ·

hyperbilirubinémie u novorozence může vyžadovat transfúzi a/nebo fototerapii.

Experimenty, ve kterých se používají konstrukce Fc se specifítou vůči RhD (označené Fog-1) ukázaly jejich defekt ve spouštění efektorových mechanizmů (aktivace monocytů, jak se detekuje chemoluminiscencí a ADCC) a také se ukázalo, že inhibují chemoluminiscencí a ADCC spouštěné lidským sérem, které obsahuje polyklonální anti-D. Už dříve se ukázalo, že ADCC a chemoluminiscence znamená poškození červených krvinek in vivo. Dříve publikovaná práce také demonstruje schopnost Fog-1 soutěžit s většinou lidských anti-D sér o epitopy na proteinu RhD.

Protilátky proti aloantigenům krevních destiček způsobují aloimunitní trombocytopenii zárodku a novorozence.

Nejvíce relevantní antigen je lidský destičkový antigen (HPA)-la. Protilátky vůči antigenu HPA-la komplikují 1 z 350 normálních těhotenství a vedou k silné trombocytopenii v jednom z 1 200 případů zárodků. Velmi silně postižené případy vedou k intrakraniálnímu krvácení nebo způsobují smrt. Současná terapie zahrnuje pravidelnou každotýdenní transfúzi krevních destiček, které ne nesou HPA-la (při této léčbě hrozí nebezpečí úmrtí 0,5 % ), a vysoké dávky intravenózního imunoglobulinu, které se aplikují matce. Tato léčba vykazuje různou a nepředvídatelnou účinnost. HPA-la se definuje jediným epitopem na destičkovém glykoproteinu lila (GPIIIa) a jednořetězcový Fv rozeznávající tento epitop je dostupný u instituce University of Cambridge Divisíon of Transfusion Medicine (Griffin HM, Ouwehand WH. Lidské monoklonální protilátky specifické pro leucin-33 (PA^a1, HPA-la) tvoří destičkový glykoprotein lila z knihovny genu fága V, popisuje se v publikací Blood 1995, 86: 4430-4436). Ukázalo se, že navázání protilátek založených na této konstrukci vůči lidským • ·

destičkám se inhibuje lidským sérem proti HPA-la. Inhibice byla nejvíce konzistentní v případě séra, které vykazuje nejvyšší titr specifických protilátek, které jsou spojeny s nejtěžším onemocněním. To indikuje, že rekombinantní protilátky a sérové protilátky se váží na stejný epitop na destičkách.

Vedle kompetetivního vazebného účinku terapeutické protilátky podle vynálezu mohou také vyvolat výhodný inhibiční účinek prostřednictvím FcyRIIb.

2) Kompetice s autoprotilátkami proti epitopu na autoantigenu

Autoprotilátky zprostředkovaly poškození krevních buněk

Hemolytická anemie způsobená autoprotilátkami typu IgG a trombocytopenie způsobená autoprotilátkami vykazují běžné mechanizmy poškození krevních buněk. V obou případech autoprotilátky jsou cíleny na vybraný repertoár autoantigenů (Rh a K na červených buňkách a GPIIb/IIIa, GPIb/Ix/V na krevních destičkách). Navázání protilátek se zkrácenou délkou života krevních buněk způsobuje anemii nebo trombocytopenii. Není pravděpodopné, že autoprotilátky proti červeným krvinkám a krevním destičkám jsou cíleny na určitý počet epitopů Bbuněk na jejich autoantigenech. Rekombinantní variabilní oblast protilátek proti těmto epitopům se může vytvořit technologií vyjadřující gen fága V. Terapeutické protilátky vůči relevantním epitopům, ale s inertním Fc by mohly soutěžit s autoprotilátkami krevních buněk pacienta při navázání na autoantigen, tak se inhibuje poškození krevních buněk.

„Goodpasture's syndrom (onemocnění anti-glomerulární bazální membrány (GBM)).

To je hlavní případ rychle postupující glomerulonefritidy, která vede k plicnímu krvácení a během týdnů a měsíců od »

► ··· počátku onemocnění dojde ke konečnému selhání ledvin. Běžná terapie závisí na dialýze v kombinaci s intenzivní výměnou plazmy a imunosupresivní terapií, která se může komplikovat virovou nebo plísňovou infekcí, která ohrožuje život. Existuje důkaz, že toto onemocnění je zprostředkováno autoprotilátkami a autoantigenem lokalizovaným na kolagenu typu IV, což je hlavní komponent GBM. Ukázalo se, že autoprotilátky, které způsobují onemocnění GBM se váží na nekolagenní oblast (NC1) řetězce a3(IV). Gen kódující tuto sekvenci (COL4A3) se klonoval sekvenoval. Vytvořila se hypotéza, že účinek nebezpečných anti-GBM autoprotilátek se může neutralizovat která cílí

IgG, monoklonální kompetitorovou molekulou imunodominantní epitop na cc3(IV)NCl a je vybavena biologicky neaktivní oblastí Fc. Vyvinuly se rekombinantní chimerové protilátky IgG, které se váží na imunodominantní epitop a3(IV)NCl, ale kterému chybí klasické funkce efektoru. Toho je možné dosáhnout, když se vyvinou a charakterizují geny, které kódují variabilní oblasti myších anti-a3(IV)NC1 (popisuje se v publikaci Pusey CD et al., Lab Invest 1987, 56, 23-31 a Ross CN et al., Lab Invest 1996, 74, 1051-1059).

Vedle kompetetivního vazebného účinku terapeutické protilátky podle vynálezu mohou také vyvolat žádoucí inhibiční účinek pomocí FcyRIIb.

3) Alergie a astma

Alergie a astma vznikají z nežádoucí imunitní odezvy na běžné antigeny, které se nachází v prostředí. Jsou to například proteiny pylů trav, roztoči a řada dalších zdrojů antigenů. Jde například o protein Der Ρ 1 roztoče Dermatophagoides pteronyssinus. Postižení jednotlivci produkují vysoké množství imunoglobulinů, zvláště třídy IgE. Tyto protilátky IgE jsou schopny se vázat s vysokou afinitou

• · • ·· ···· «· na receptor Fc-epsilon Rl na žírných buňkách a na eosinofily. Zkřížené navázání IgE a alergenu na receptor vede k aktivaci buněk a k degranulaci. Při tom se uvolňuje řada zánětlivých mediátorů, které mohou způsobit vážné symptomy nebo dokonce smrt, což může být výsledek anafylaktické reakce. Předpokládají se dva mechanizmy působení místních protilátek. Nejdříve by protilátky IgG s inertní oblastí Fc mohly soutěžit o navázání alergenu na IgE. To bude bránit zkříženému navázání IgE a proto zabrání aktivaci buněk. V případě uvedeného mechanizmu protilátky IgG s inertním Fc budou přímo soutěžit o navázání na alergen s IgE.

Zadruhé mechanizmus bude zahrnovat úlohu negativního signálu prostřednictvím receptoru FcyRIIb. Ukázalo se, že zkřížené navázání Fc gamma RUB a Fc epsilon Rl vede k inhibici aktivace signálů, které je možné vidět pouze v případě, že jsou zkříženy pouze receptory Fc epsilon Rl. Tak zavedení protilátek IgG s vazebnou kapacitou Fc pro receptor Fc gamma Rllb a antigenní specifitu pro alergen může vést k inhibici aktivace žírných buněk potažených IgE a eozinofilů. V tomto případě protilátky IgG také zprostředkovávají silný negativní účinek, jestliže se váží na alergen pomocí různých míst na IgE tak, že ve stejném okamžiku se mohou také vázat na alergen.

4) Zánětlivé poruchy například Crohnova nemoc

Existuje řada poruch imunitního systému, které způsobují patologické jevy, jako výsledek chronického stavu aktivace imunitních buněk (leukocytů), které zahrnují T-lymfocyty, neutrofily a buňky NK. Tuto chronickou aktivaci je možné v normálním případě vidět jako stádium zánětu kontinuální migrace aktivovaných buněk do postižených tkání. Za účelem migrace do tkáně buňky se musi vystavit působení zánětlivým mediátorům a musí na ně reagovat a pak se regulují adhezivní

9999 ·· » · » *

999 molekuly, přičemž se jim umožní, aby adherovaly na buňky, které tvoří stěnu krevních, cév a pak migrují mezi buňkami stěn cév a do tkáně. Mělo by být možné zastavit tento cyklus zánětu buď zablokováním adhezních molekul na povrchu leukocytů nebo odpovídajících ligandů na aktivovaných epiteliálních buňkách, které tvoří stěny cév. Takovým aktivačním antigenem je VAP-l a protilátka s inertním Fc, která se váže na tuto molekulu, by měla bránit adherenci leukocytů a migraci na místa zánětu, přičemž se poruší cyklus chronické aktivace.

5) Inhibice interakce ligand/receptor

Srpkovitá anémie

Homozygoty variant lidského hemoglobinu charakterizovaný substitucí valinu za glutamovou kyselinu (HbSS) vede k chronické hemolýze a má tendence tvořit taktoidní formaci v deoxygenovaném stádiu. To vede k tomu, že červené krvinky upraví srpkovitý tvar v mikrocirkulaci, což způsobuje krizi srpkovitých buněk v daných oblastech. Ty mohou být trombotické (v kostech, plicích, mozku nebo břichu), plastické, hemolytické nebo spojené s masivní sekvestrací červených buněk v slezině a játrech. Je dáno, že během těchto krizí se červené krvinky adherují na endoteliální buňky. Tento proces adheze je založen na interakci receptorů s jejich ligandy. Dvě z dominantních drah adheze jsou interakce mezi Lutheranem a lamininem a mezi trombospondinem a ještě nedefinovaným membránovým lipidem červených krvinek. V experimentech se zvířaty se získaly důkaz, že rekombinantní lidská variabilní oblast protilátek proti trombospodinu snižuje adhezi srpkovitých buněk červených krvinek na endoteliální buňky. Ukázalo se, že mohou projevením genu fága V vyvinout podobné variabilní oblasti rekombinantních protilátek proti oblasti lutheranu vázající se na laminin (membránová proximální oblast), která blokuje interakci s lamininem. Tyto fragmenty variabilní oblasti protilátek se mohou vybavit inertními

• Φ φφ φ > ♦ · φ φ φ φ φφφ φ φ •φφφ φφ doménami Fc za vzniku terapeutických protilátek, které jsou schopny interferovat s adherencí srpkujících červených krvinek na endoteliální buňky, aniž dojde k destrukci červených buněk.

Blokování destičkových kolagenových receptorů zprostředkované protilátkami

Existuje podstatný důkaz, že dva receptory jsou velmi podstatné pro aktivaci krevních destiček pomocí subendoteliálních kolagenů, dokonce inicijují trombózu. Integrin α₂βι (destičkový glykoprotein Ia/IIa), jehož primární funkce je adheze, a neintegrinový glykoprotein VI (GpVI), který je také podstatný pro aktivaci, předcházející vylučování a agregaci. Rekombinantní lidské protilátky se mohou tvořit projevením genu fága V, který rozeznává různé domény v každém receptorů a ty se mohou použít při produkci vedoucích protilátek s inertní doménou Fc vůči anti-trombotické terapii založené na kolagenu. Tato metoda se může použít při zmírnění koronární trombózy restenózy po angioplastice a trombotických komplikacích spojených se zavedením bypasu.

6) Monoklonální protilátky se mohou někdy použít při zablokování buněčných funkcí. OKT3 se například používá k imunosupresi T-buněk blokováním receptorů T-buněk a protilátky CD18 se používají jako prevenci adheze buňka-buňka prostřednictvím molekul integrinu. Navázání Fc na receptory Fc mohou vyvolat vážné vedlejší účinky pomocí stimulovaného uvolnění cytokinů a zánětu.

7) Oblasti Fc protilátek se někdy připojují na jiné rekombinantní proteiny, přičemž vznikají fúzní molekuly s prodlouženým biologickým poločasem života. Tak receptor TNF se může připojit k lidskému Fc IgG4 za vzniku molekuly, která inhibuje účinky rozpustného TNF a CTLA4 se připravil jako fúzní protein s IgG Fc a používá se k blokování signalizace ··

φφ • · · · • φ φ • φφφφ φ φ φφφφ φφ pomocí koreceptorové molekuly Β7 (ligand pro CTLA4) na povrchu buňky. Avšak cytokin spuštěný Fc fúzního proteinu je nežádoucí.

V oboru jsou dobře známy domény V nebo jiné vazebné oblasti v souladu s typy aplikace, popisovanými shora v textu. Například vazebná oblast CD3 (například YTH12.5) se popisuje v publikaci Routledge et al (1991) Eur J. Immunol. 21, 27172725 a Bolt et al., (1993) Eur J. Immunol. 23,

Vazebná oblast CD52 (například CAMPATH-1) se v publikaci Riechmann et al., (1988) Nátuře 332,

Vazebná doména VAP-1 se popisuje v publikaci Salmi et al., (1993) J. Exp. Med. 178: 2250-60 a Smith et al., (1989) J.

403-411.

popisuje

323-327.

Exp. Med. popisuje

188

17-27. Oblast Der v publikaci McElveen et

Ρ I (například 2C7) se al., (1998) Clin. Exp.

Allergy 28, 1427-1434).

Tak vazebná molekula, která se neváže na receptory Fc a způsobuje odumírání a neaktivuje komplement, ale která se neváže na cílovou molekulu, by se mohla použít ve všech shora uvedených příkladech při minimalizaci libovolných vedlejších účinků. Specificky takové blokační protilátky by se mohly zavést do situací popsaných v odstavci 1 až 5 shora v textu a bránit tak nežádoucímu poškození přirozeně se vyskytujících protilátek. Stejné blokující oblasti typu Fc budou oblasti Fc vybrané tak, aby se použily při přípravě rekombinantních protilátek, jako jsou protilátky CD3 nebo CD18 popsané v odstavci 6 shora v textu nebo jako Fc pro fúzi popsanou v odstavci 7 shora v textu.

Vazebné a efektorové domény se mohou kombinovat libovolnou vhodnou metodou. Například domény se mohou spojit kovalentně prostřednictvím bočních řetězců. V jiném případě sulfydrylové skupiny vytvořené chemickou redukcí cysteinových zbytků se použily ke zkřížení protilátkových oblastí (popisuje se »· · · • · ···< ·· v publikaci Rhind S. K. (1990) EP 0385601 Cross-linked antibodies and processes for their preparation). Nakonec chemická modifikace skupin sacharidů se použije při vytvoření reaktivních skupin pro účely zkřížení. Tyto metody jsou standardní techniky dostupné v oboru. Mohou být zvláště aplikovatelné v provedení vynálezu, kde vazebný polypeptid obsahuje neproteinové oblasti nebo skupiny.

V obecném případě je pří expresí vazebné molekuly ve formě fúzního proteinu vhodnější použít rekombinační metody. Vynález popisuje metody a materiály, jak se uvádí dále v textu.

Nukleové kyseliny

Vynález dále popisuje nukleovou kyselinu kódující vazebnou molekulu, jak se popisuje shora v textu.

Nukleová kyselina podle vynálezu může zahrnovat cDNA, RNA, genomovou DNA (zahrnující introny) a upravené nukleové kyseliny nebo analogy nukleových kyselin (například nukleovou kyselinu peptidu) .

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou čistit a/nebo izolovat z jejich přirozeného prostředí a mohou se získat v podstatě čisté nebo v homogenní formě nebo bez dalších nebo v podstatě bez dalších nukleových kyselin. Termín ^r „izolovaná zdůrazňuje všechny tyto možnosti.

* Molekuly nukleových kyselin mohou být zcela nebo částečně syntetické. Mohou být zvláště v rekombinací se sekvencemi nukleové kyseliny, které se společně nenacházejí v přírodě.

Mohou se ligovat nebo jinak uměle kombinovat. V jiném případě se mohou přímo syntetizovat, například za použití automatického syntetizéru.

• · • 0 ·· • · · 0 • · 0

000

0

0000 00 •

0

0

0

Vynález dále popisuje konstrukci nukleové kyseliny, například replikovatelný vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny.

Vektor zahrnující nukleovou kyselinu podle vynálezu nemusí zahrnovat promotor nebo jiné regulační sekvence, zvláště, jestliže vektor se bude používat k zavedení nukleové kyseliny do buněk v případě rekombinace do genomu.

Upřednostňuje se, aby nukleová kyselina ve vektoru byla řízena a operativně spojena s vhodným promotorem nebo s jinými regulačními elementy v případě transkripce v hostitelské buňce, jako je mikrobiální (například bakteriální, kvasinková, buňka vláknitých hub) nebo eukaryontní (například hmyzí, rostlinná, savčí) buňka.

Vektor může zvláště obsahovat gen (například gpt), aby umožňoval selekci v hostiteli nebo v hostitelské buňce a jeden nebo více zesilovačů, které jsou pro hostitele vhodné.

Vektor může být expresívní vektor se dvěmi funkcemi, který funguje ve více hostitelích. V případě genomové DNA může obsahovat svůj vlastní promotor nebo jiné regulační elementy a v případě cDNA může být řízen vhodným promotorem nebo jinými regulačními elementy vhodnými pro expresi v hostitelské buňce.

Termín „promotor znamená sekvenci nukleotidů, ze které se může transkripce iniciovat DNA operativně spojenou po směru exprese genu (to je ve směru 3' konce na kódujícím řetězci dvouřetězcové DNA). Promotorem může být indukovatelný promotor.

Termín „operativně spojený znamená spojený jako část stejné molekuly nukleové kyseliny, vhodně umístěný a orientovaný za účelem transkripce, která se inicializuje • · · · · · · · · • tftftf ···· · · · • ····· tf · ·· · • · · · · · · • tftf tftf tftf tftftf ·· z promotoru. Když je DNA operativně spojená s promotorem, znamená to, že iniciace transkripce se reguluje promotorem.

Vynález popisuje genovou konstrukci, upřednostňuje se replikovatelný vektor, který obsahuje promotor operativně spojený s nukleotidovou sekvencí podle vynálezu.

V obecném případě jsou odborníci schopni zkonstruovat vektory a navrhovat protokoly pro expresi rekombinantních genů. Mohou se vybrat a zkonstruovat vhodné vektory, které obsahují vhodné regulační sekvence zahrnující promotorové sekvence, terminační fragmenty, polyadenylační sekvence, sekvence zesilovače, geny markérů a jiné sekvence, které jsou vhodné (popisuje se například v publikaci Molecular cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Řada známých metod a protokolů vhodných pro manipulaci nukleové kyseliny, například při přípravě konstrukcí nukleové kyseliny, mutageneze, sekvenování, zavedení DNA do buněk a exprese genu a analýza proteinů se popisuje v publikaci Current Protocols in Molecular Biology, second Edition, Ausubel et al., eds., Jaohn Wiley and Sons, 1992, Molecular cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Hostitelské buňky a metody

Vynález dále popisuje buňky transformované expresívními vektory, které se definují shora v textu. Také se popisují buněčné kultury (přednostně hlodavci) a produkty buněčných kultur, které obsahují vazebné molekuly.

Dále se popisují metody přípravy vazebných molekul podle vynálezu, které obsahují:

• · • · • ·

i) kombinaci nukleové kyseliny kódující vazebnou doménu s nukleovou kyselinou kódující efektorovou doménu za vzniku konstrukce nukleové kyseliny, ii) umožnění exprese konstrukce ve vhodné hostitelské buňce.

Kombinace za účelem produkce konstrukce se může provést libovolnou vhodnou metodou, která je dobře známa v oboru. Je to například ligace fragmentů (například restrikční fragmenty) nebo použití různých templátu v jednom nebo více amplifikačních krocích, například použití PCR.

Způsoby produkce protilátek (a tudíž vazebné oblasti) zahrnují imunizaci savce (například člověka, myši, krysy, králíka, koně, kozy, ovce, velblouda nebo opice) s vhodným cílovým proteinem nebo jeho fragmentem. Protilátky se mohou získat z imunizovaných zvířat za použití libovolného způsobu známého v oboru a mohou se testovat přednostně za použití navázání protilátek na uvedený antigen.

Může se například použít metoda westernová přenosu nebo imunoprecípitace (Armitage et al., 1992, Nátuře 357: 80-82).

Klonování a exprese chimérových protilátek se popisuje v dokumentech EP-A-0120694 a EP-A-0125023.

Nukleová kyselina kódující efektorovou oblast se může vytvořit v souladu s vynálezem místné řízenou mutagenezí, například zde popsanými způsoby nebo způsoby například uvedenými v dokumentech WO 92/16562 nebo WO 95/05468 (Lynxvale Ltd.) .

Další aspekty

Vynález dále popisuje použití vazebné molekuly podle vynálezu, která předchází, inhibuje nebo jinak interferuje s navázáním druhé vazebné molekuly na cílovou molekulu. To • · může zahrnovat soutěž nebo nahrazení protilátek z terapeuticky relevantního cílového antigenu nebo buňky.

Vynález dále popisuje činidlo, které obsahuje vazebnou molekulu, jak se popisuje shora v textu, ať už vzniká rekombínací nebo jiným způsobem.

Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek, který obsahuje vazebnou molekulu, jak se popisuje shora v textu, plus farmaceuticky přijatelný nosič.

Vynález také popisuje způsob léčby pacienta, který zahrnuje aplikaci farmaceutického prostředku, jak se popisuje shora v textu, pacientovi nebo do vzorku, který se pacientovi odebral a zase se mu vrací. Zvláště způsob léčby následujících onemocnění: štěp versus hostitel, odmítnutí transplantovaného orgánu, odmítnutí transplantované kostní dřeně, autoimunita, aloimunita, alergie, chronické nebo akutní zánětlivé onemocnění.

Vynález dále popisuje způsob léčby pacienta, který zahrnuje způsobení a umožnění exprese nukleové kyseliny kódující vazebnou molekulu, jak se popisuje shora v textu, přičemž vazebná molekula u pacienta projevuje své účinky in vivo. V obecném případě dojde u pacienta k expresi nebo za zvláštních okolností, pokud pacient je kojenec, se exprese projeví u matky pacienta.

Vynález také popisuje použití vazebné molekuly, jak se popisuje shora v textu, při přípravě farmaceutického prostředku, za účelem modifikace imunitní odezvy, zvláště farmaceutického prostředku vhodného pro léčbu onemocnění uvedeného shora v textu.

Přehled obrázků na výkrese .msšseiaaasBwssssB»^^

Na obrázku č. 1 je znázorněné rozdělení buněk, které nesou FcyRI pomocí RBC potažených protilátkami Fog-1. R2R2 RBC se potáhly protilátkami Fog-1 v rozmezí koncentrací protilátek s buňkami B2KA, které rostou na destičce s 96 prohlubněmi a stanovilo se procento buněk B2KA s růžicemi RBC. Značky znázorňující chybu označují hodnoty standardní odchylky v případě tří prohlubní. V případě mutantů Fog-1 GlÁb, GlÁc, GlÁab, GlÁac, G2Áa, G4Áb a G4Ác, jako v případě G2 (zobrazeno) nedošlo rozdělení mezi buňkami B2KA a RBC při žádné koncentraci potažení.

Na obrázku č. 2 je znázorněné fluorescenční barvení buněk nesoucích FcyRI. Buněčné linie transfekované FcyRI, což jsou B2KA (a a b) a 3T3 + FcyRI + γ-řetězec (c a d) se inkubovaly postupně s protilátkami CAMPATJ-1 (a a c) nebo Fog-1 (b a d) , s biotinylovanými anti-lidskými protilátkami κ a ExtrAvidinFITC. Intenzita fluorescence se měřila v případě 10 000 případů a vynesl se do grafu geometrický průměr hodnot fluorescence.

Na obrázku č. 3 je histogram reprezentující fluorescenčně zbarvené buňky nesoucí FcyRI. Buňky B2KA se barvily jako v případě obrázku č. 2 za použití 100 μρ/ιηΐ protilátek ze série CAMPATH-1. Histogram ukazující počet buněk, které spadají do každého fluorescenčního kanálu se překryl reprezentativními protilátkami.

Na obrázku č. 4 jsou znázorněna CL odezva lidských monocytů na RBC senzibilizovaných sérií protilátek Fog-1. R1R1

RBC se potáhly protilátkami mimo rozmezí koncentrací. Pro každý vzorek se stanovil počet molekul protilátek vázaných na buňku a CL odezva monocytů na RBC.

Na obrázku č. 5 je znázorněna inhibice CL způsobená protilátkami Fog-1 Gl pomocí jiných protilátek Fog-1. RBC se senzibilizovaly pomocí Fog-1 Gl v koncentraci 2 μg/ml a označily se různé koncentrace protilátek Fog-1. Tyto protilátky na obrázku č. 4 vykazují nízkou odezvu CL. Měřila se CL odezva monocytů. Odezva . způsobená samotným Gl v koncentraci 2 gg/ml se bere jako 100 %.

Na obrázku č. 6 je znázorněna inhibice CL odezvy na klinické sérum pomocí Fog-1 G2Áa. RBC se senzibilizovaly konstantním množstvím Fog-1 Gl (20 μg/ml) nebo klinicky relevantním sérem a různým množstvím Fog-1 G2Áa. 100 % odezvy se dosáhlo se standardním množstvím BRAD 5. Při nepřítomnosti Fog-1 G2Áa % odezvy byly Gl: 150 %, sérum A: 142%, sérum B: 265%, sérum C: 200 %, sérum D: 163 %, sérum E: 94 %, anti-C+D sérum: 259 % a anti-K sérum: 119%.

Na obrázku č. 7 je zobrazena úplná lyže zprostředkovaná sérií protilátek CAMPATH-1. Lidské PBMC se značily ⁵¹Cr a inkubovaly se s protilátkami v přítomnosti séra, jako zdroje komplementu. Hodnoty vyjádřené v % uvolnění specifického Cr je vyneseno, jako míra vyskytující se lyže.

Na obrázku č. 8 je znázorněna inhibice pomocí CAMPATH-1 G2Áa úplná lyže zprostředkovaná CAMATH-1 Gl. Úplná lyže se provedla stejným způsobem jako na obrázku č. 7, ale vzorky obsahovaly konstantní množství (konečná koncentrace 6,25 μg/ml) CAMPATH-1 Gl a zvyšující se množství CAMPAŤH-1 G2Aa.

Na obrázku č. 9 je znázorněna ADCC zprostředkované sérií protilátek CAMPATH-1. Lidské PBMC se značily ⁵¹Cr a inkubovaly se s protilátkami. Po promytí se buňky inkubovaly s dalšími

PBMC, které působí jako efektorové buňky, v poměru efektor:cíl jako 20:1. Hodnoty vyjádřené v % uvolnění specifického Cr je

vyneseno, jako míra vyskytující se	lyže.
Na obrázku č. 10a je	znázorněna	ADCC	RhD+	RBC
zprostředkované sériemi protilátek	Fog-1.
Na obrázku č. 10 b je	znázorněna	ADCC	RhD+	RBC
zprostředkované sériemi protilátek	Fog-1.
Na obrázku č. 11a je znázorněna inhibice	protilátkami	Fog-
1 ADCC RhD+ RBC zprostředkované	sériemi protilátek	Fog-	1 G1

v koncentraci 2 ng/mg.

Na obrázku č. 11b je znázorněna inhibice protilátkami Fog1 ADCC RhD⁺ RBC zprostředkované sériemi protilátek Fog-1 G1. RBC se senzibilizovalo ve směsi protilátek, které obsahují konstantní množství Fog-1 G1 (2 ng/ml) a odlišné koncentrace inhibičních protilátek.

Na obrázku č. 12 je znázorněna inhibice protilátkami Fog-1 ADCC RhD⁺ RBC zprostředkované polyklonálními protilátkami antiRhD v koncentraci 3 ng/mg.

Fluorescenční barvení buněk nesoucích FcyRIIa 131H/H. Buňky transfekované linie 3T6 + FcyRIIa 131H/H se inkubovaly s protilátkami Fog-1, které tvoří komplex s kozími F(ab')2 anti-lidskými κ a pak oslími anti-kozím IgG konjugovanými s FITC. Intenzita fluorescence se měřila v případě 10 000 případů a vynesl se do grafu hodnoty geometrických průměrů fluorescence.

Na obrázku č. 13b je znázorněno fluorescenční barvení buněk nesoucích FcyRIIa 131R/R. Buňky transfekované linie 3T6 + FcyRIIa 131R/R se inkubovaly s protilátkami Fog-1, které tvoří komplex s kozími F(ab')2 anti-lidskými κ. Intenzita • · ·* ·« ♦ · · · • ·· · · · · ♦ » · · · ·»···· · · · ·♦·«·· · · « · · · • ···· · · · ···· ·» ·· ··· ·· ··· fluorescence se měřila v případě 10 000 případů a vynesl se do grafu hodnoty geometrických průměrů fluorescence.

Na	obrázku	č. 14a je	znázorněno	fluorescenční	barvení
buněk nesoucích	FcyRIIbl*.	Experiment	se provedl	stejným
způsobem	jako na	obrázku č.	13b za použití transfekované linie
3T6 + FcyRIIbl*	a vytvoření	komplexů s	protilátkami	Fog-1 za
použití	směsi kozích F(ab'	') 2 anti-lidských κ konjugovaných
s FITC .	a s kozími F(abz)	2 anti-lidskými κ, které nejsou
značeny.
Na	obrázku	č. 14b je	znázorněno	fluorescenční	barvení
buněk nesoucích	FcyRIIbl*.	Experiment	se provedl	stejným
způsobem	jako na	obrázku č.	13 za použití transfekované linie
CHO + FcyRIIIb NA1.
Na	obrázku	č. 14c je	znázorněno	fluorescenční	barvení

buněk nesoucích FcyRIII NA2. Experiment se provedl stejným způsobem jako na obrázku č. 13 za použití transfekované linie CHO + FcyRIIIb NA2.

Na obrázku č. 15 je znázorněna tabulka č. 1, která porovnává mutace připravené v sekvencích divokého typu Gl, G2 a G4.

Na obrázku č. 16 je znázorněna tabulka č. 2, která je shrnutím aktivit protilátek.

Na obrázku č. 17 jsou sekvence upravené a divokého typu

C_h2, které zahrnují ty sekvence označené GlÁab, G2Áab, GlÁac.

Příklady provedení vynálezu

Obecné materiály a metody

Γ iř&S

4 4··

4 »44 44

Konstrukce expresívních vektorů

Počáteční bod konstantní oblasti IgGl byl gen konstantní oblasti lidského IgGl alotypu Glm(l,17) ve verzi vektoru M13tgl31, který obsahuje upravený polylinker (popisuje se v dokumentu Clark, M. R. : WO 92/16562). Inzert IgGl o velikosti 2,3 kb tak má restrikční místo BamHI na 5'konci a obsahuje restrikční místo HindlII vedle restrikčního místa BamHI. Na 3'konci po směru exprese genu od polyadenylačního signálu se objevily následující restrikční místa v pořadí 5'až 3': Sphl, Notl, BglII, BamHI. Gen konstantní oblasti lidského IgG2 se získal jako HindlII-Sphl fragment v Ml3tgl31 a restrikční místo Hind III se poškodilo štěpením restrikčním enzymem HindlII, přesahující konce se vyplnily a opět se spojily ligací. Fragment Sall-Sphl tohoto vektoru se klonoval tak, aby nahradil ekvivalentní fragment ve vektoru IgGl popsaném shora v textu. Gen konstantní oblasti lidského IgG4 se získal jako fragment HindlII-Smal v M13tgl31 a zničilo se restrikční místo HindlII. Mezi 3'koncem exonu CH3 a polyadenylačním místem se objevilo restrikční místo Smál tak, že polyadenylační místo se porušilo přidáním Smál fragmentu získaného z vektoru IgGl, který obsahuje DNA, která se nachází mezi ekvivalentem restrikčního místa Smál v genu IgGl a restrikčního místa po směru exprese genu v polylinkeru.

Prvním postupem bylo zavedení restrikčního místa Xbal mezi CHl a exony spojení ramen, restrikčního místa Xhol mezi spojení a exony CH2 a restrikčního místa KpnI mezi exony CH2 a CH3 v pořadí, aby umožnilo výměnu mutovaných sekvencí exonu. To bylo podobné jako manipulace genů IgGl a IgG4, která se provedla dříve (popisuje se v publikaci Greenwood, J., Clark, M. a Waldmann, H. (1993) Structural motifs involved in human IgG antibody effector functíons. Eur. J. Immunol. 23, 10981104).

~^ciKiSBisaiíBmnan

Aby se získala templátové DNA, mikroorganizmus E. coli RZ1032 se infikoval fágem M13, jak se popisuje shora v textu a připravila se ssDNA. Charakteristika kmene je duťung' tak, že produkovaná ssDNA by měla obsahovat nějaký uridin na místě thymidinu.

Oligonukleotidy používané pro zavedení mutací byly: mezí spojením a exonem CH2

MO10 5'GGA TGC AGG CTA CTC GAG GGC ACC TG 3' mezi exony CH2 a CH3

MOU 5'TGT CCA TGT GGC CCT GGT ACC CCA CGG GT 3' mezi CH1 a exony spojení

MO12 5'GAG CCT GCT TCC TCT AGA CAC CCT CCC T 3'

Restrikční místa jsou podtržena.

Oligonukleotidy se fosforylovaly v reakcích o objemu 50 μΐ, které obsahují 25 pmol oligonukleotidu a 5 jednotek T4 polynukleotidové kinázy (nbl) v 70 mM Tris HCI pH7,6, 10 mM

MgCl₂, 100 mM Kel, 5 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA, 1 mM ATP. Reakce se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny a nechaly se zahřát na teplotu 70 °C po dobu 5 minut.

Aby došlo k teplotní hybridizaci mutagenních oligonukleotidu na templátovou DNA, 500 ng DNA obsahující uridin a 1 pmol každého fosforylovaného oligonukleotidu se inkubovalo v 20 μΐ 40 mM Tris HCI pH7,5, 20 mM MgCl₂, 50 mM

NaCI při teplotě 80 °C po dobu 5 minut a směs se nechala vychladnout pomalu při teplotě 37 °C. Přidal se stejný pufr, přičemž se objem zvýšil na 30 μΐ a přidalo se DTT tak, aby konečná koncentrace byla 7 mM, ATP s konečnou koncentrací 1 mM a dATP, dCTP, dGTP a dTTP, aby konečná koncentrace každého byla 250 μΜ. Přidalo se 5 jednotek T7 DNA polymerázy (neupravená, United States Biochemical) a 0,5 jednotek T4 DNA ligázy (Gíbco BRL) a reakce se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 16 hodin, přičemž se syntetizoval mutantní řetězec. DNA se srážela v etanolu, rozpustila se v 50 μΐ 20 mM Tris HCI pH8,0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA a přidala se 1 jednotka uracilové DNA glykosylázy (New England Biolabs). Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin se přidalo 50 μΐ 400 mM NaOH a reakce se nechala stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut, přičemž se vytvořil fragment templátového řetězce DNA. DNA se srážela v etanolu, rozpustila se ve vodě a transformovala se do mikroorganizmu E. coli TG1. Replikativní forma (RF) DNA se připravila pro selekci výsledných klonů M13. Tyto klony se štěpily, aby se našly klony, které obsahovaly požadovaná restrikční místa Xbal, Xhol a KpnI. Vhodné klony se získaly v případě IgGl a 4 vektory, ale MO12 pravděpodobně teplotně nehybridizoval ve vektoru IgG2. Mutageneze se opakovala v případě IgG2, aniž tento oligonukleotid, jako místo mezi CH1 a exony spojení, nebyl nezbytný pro tento experiment. V případě každého vektoru sekvence DNA exonů se potvrdily sekvenováním.

Změny v CH2 v polohách aminokyselin 327, 330 a 331 (mutace

Aa) se zavedly použitím oligonukleotidů:

MO22BACK (kódující kmen):

5'TCT CCA ACA AAG GCC TCC CGT CCT CCA TCG AGA AAA 3'

MO22 (komplementární řetězec):

5'TTT TCT CGA TGG AGG ACG GGA GGC CTT TGT TGG AGA 3'

Změny v CH2 v polohách 233 až 236 (mutace Ab a Ac) se zavedly za použití oligonukleotidů:

M07BACK (kódující řetězec a kódující mutace Ac):

5'TCC TCA GCA CCT CCA GTC GCG GGG GGA CCG TCA GTC 3'

M021 (komplementární řetězec a kódující mutace Ab):

5'GAC TGA CGG TCC CGC GAC TGG AGG TGC TGA GGA 3'

Mutace se zavedly extenzí přesahu pomocí PCR, která také vyžaduje oligonukleotidy MO11 a MO10BACK:

5'CAG GTG CCC TCG AGT AGC CTG CAT CC 3'

Restrikční místo Xhol je podtrženo.

♦ ♦ ·· ·· • · · « · · • ··· 9 9 9 • 9 · · •9·9 99 99 • ··

9 9 9 9

9 9 9

9 9

999 99 9

V případě mutace Aa první sada PCR použila jako templáty IgGl a IgG2 amplifikované s MO22 a MOIOBACK a s MO22BACK a MOll. V případě mutací Ab a Ac první sada PCR použila jako templáty IgGl a IgG2 amplif ikované s MO21 a MOIOBACK a s MO7BACK a MOll. V konečném produktu DNA pocházející z řetězce, kde se jako primer použil M021, vykazuje mutaci Ab a ty pocházející z MO22BACK ponesou mutaci Ac. Každá reakce PCR obsahovala přibližně 30 ng M13tgl31 plus konstantní oblast ssDNA, 25 pmol každého oligonukleotidu a 1 jednotku Pwo DNA polymerázy (Boehringer Mannheim) v 50 μΐ 10 mM Tris HCI, pH8,85, 25 mM Kel, 5 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄ a dATG, dCTP, dGTP a dTTP, kdy každý je v koncentraci 250 μΜ. V reakcích se provedla amplifikace ve 14 cyklech při teplotě 94 °C po dobu 30 vteřin, 50 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 60 vteřin, pak následuje 72 °C po dobu 5 minut až do konce. Pruhy reprezentující produkt DNA očekávaných velikostí se vyřízl z agarózy tající při nízké teplotě a nechaly se roztát ve 100 μΐ vody. V případě každé mutace se spojily dva počáteční produkty PCR pomocí PCR extenzí překryvu. Přibližně 4 μΐ celých roztavených kousků gelů se smíchalo s 25 pmol každého MOIOBACK a MOll a jinými komponenty popsanými shora v textu tak, aby počáteční produkty PCR byly v ekvimolárním množství. Provedlo se 18 cyklů PCR, jak se popisuje shora v textu s tou výjimkou, že teplota teplotní hybridizace se snížila z 50 °C na 48 °C. Získané produkty, které obsahovaly celý exon CH2, se čistily a štěpily restrikčními enzymy Xhol a KpnI. DNA RF mutovaných vektorů M13tgl31 + konstantní oblast obsahující další restrikční místa, jak se popisuje dříve v textu, se štěpily restrikčními enzymy Xhol a Kpn, aby se odstranil existující DNA CH2 a ligovaly se do ní mutantní oblasti CH2. Vzorky DNA se transformovaly do mikroorganizmu E. coli TGl. DNA reprezentativních klonů se sekvenovala, aby se identifikovaly správně mutované konstantní oblasti.

• tf tftf tftf • · · · tftf tftftf tftf • tftftf·· · • · · 9 9 9 9 ···· tftf tftf tftftf ··

Za účelem získat vektory IgGl s oběma mutanty Aa a Ab nebo Ac, se DNA reprezentující mutant Aa použily jako templát pro druhé kolo PCR, aby se zavedly mutace Ab a Ac, jak se popisuje shora v textu.

IgGl, 2 a 4 divokého typu a mutované geny konstantní oblasti se každý vyřízl z RF DNA v podobě fragmentu BamHI Notl a klonovaly se do upraveného vektoru CAMPATH Hu4VH HulgGI pDVgpt (Clark, M. R. : Lynxvale Binding Molecule), aby se nahradila existující konstantní oblast. Výsledné vektory se označily jako pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgG!Aa atd. Vektor také obsahuje gen gpt, aby se umožnila selekce v savčích buňkách, zesilovač těžkého řetězce myšího imunoglobulinu a DNA variabilní oblasti CAMPATH-1 Hu4VH tak, že nese kompletní gen těžkého řetězce, který se může exprimovat v savčích buňkách. Gen humanizovaného lidského řetězce CAMPATH-l existuje v expresívním vektoru CAMPATH HuVL pSVneo (Reichmann, L., Clark, M. R., Waldmann, H. and Winter, G. (1988) Nátuře 332, 323-327).

DNA variabilní oblasti Fogl (popisuje se v publikaci Bye, J. M., Carter, C., Cui, Y., Gorick, B. D., Songsivilai, S., Winter, G., Hughes -Jones, N.C. and Marks, J. D. (1992) Germline Variable Region gene segment derivation of human monoclonal anti-Rh(D) antibodies. J. Clin. Invest. 90, 2481-

2490) se z	ískaly ve vektoru pHENl. Amplifikovaly se pomocí PCR
za použití	oligonukleotidu:
FOG1VHBACK	5'TCC ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTG CAT CTA CAG
	CAG 3'
FOGlVHFOR	5'GAG GTT GTA AGG ACT CAC CTG AGG AGA CGG TGA
	CCG T 3'
FOG1VKBACK	5'TCC ACA GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC

CAG 3 • ·

5'GAG GTT GTA AGG ACT CAC GTT TGA TCT CCA GCT

TGG T 3' • 8 9

9 <

9 8 1 ··

F0G1VKF0R

Část 5'konce inzertu ve vektoru M13VHPCR1 (Orlandi , R., Gussow, D. H., Jones, Ρ. T. and Winter, G. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 3833) obsahující promotor a DNA kódující signální peptid se amplifikoval za použití univerzálního reverzního primerů M13 a V03:

5'GGA GTG GAC ACC TGT GGA GA 3'

DNA 3'V_H v M13VHPCR1 a reprezentující 5'konec V_H-C_H intronu se získal pomocí PCR za použití univerzálního primerů M13 -40 a VO4:

5'GTG AGT CCT TAC AAC CTC TC 3'

Tyto dva fragmenty DNA se spojily postupně s oběma amplifikovanými DNA Fog-1 V_H a Fog-1 V_K PCR extenzí přesahu, jak se popisuje shora v textu. Restrikční místo BamHl uvnitř Fog-1 V_H se deletovalo stejným způsobem za použití oligonukleotidů, které odstranily rozeznávané místo, aniž se mění kódovaná aminokyselina. Úplné produkty PCR se klonovaly do M13mpl9 jako fragmenty HindlII-BamHI a potvrdila se jejich sekvence DNA.

Fragment HindlII-BamHI obsahující Fog-1 V_H se použil při nahrazení fragmentu, který obsahuje CAMPATH-1 V_H ve vektorech pSVgpt popsaných shora v textu, přičemž vznikají expresívní vektory označené pSVgptFoglVHHuIgG2 atd. V případě vektorů IgGl další restrikční místo HindlII na 5'konci konstantní oblasti DNA znamená, že není možné jednoduše změnit fragment HindlII-BamHI variabilní oblasti. Místo toho se relevantní vektory pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgGl štěpily restrikčním enzymem HindlII. Linkery, které se navrhly, aby se deletovalo restrikční místo HindlII a přidalo se restrikční místo BamHl, se ligovaly ke štěpenému konci. DNA se pak štěpily restrikčními enzymy BamHl a Notl tak, že se mohly izolovat konstantní oblasti. Fragment HindlII-BamHI obsahující Fog-1 V_K

	38	0« 00 0 0 « 0 • 0 0 0 · 00 « 0 0000 00	«0 0 0 • 0 0 0 0	0 «0 • «« 0·« « « 0 0 0 0 * 0 0 0 « 0 0 «0« 00 0
se přenesl do	vektoru	pSVhyg-HuCK	(Orlandi et	al.	, 1989),
který vždy	obsahuj e	zesilovač	těžkého řetězce	myšího
imunoglobulinu	a konstantní oblast	lidského genu	K.	Výsledný

expresívní vektor se nazývá pSVhygFoglVKHuCK.

Produkce protilátek gg každého expresívního vektoru těžkého řetězce a 20 μρ relevantního expresívního vektoru lehkého řetězce se linearizovalo štěpením pomocí restrikčního enzymu Pvul a vše se kombinovalo v 50 μΐ vody. Buňky nesekretující buněčné linie krysího myelomu YB2/0 se nechaly růst do dosažení fáze semikonfluence v modifikovaném Dulbeccově médiu podle Iscove (IMDM) s 5 % fetální bovinní sérum (FBS). Centrifugací se shromáždilo 10⁷ buněk, které se resuspendovaly v 0,5 ml kultivačního média a přenesly se do kyvety GenePulser (BioRad) . Přidala se DNA a směs se inkubovala na ledu po dobu 5 minut. Buňky se podrobily jednomu pulzu o intenzitě 960 μΓ/170 V a nechaly se na ledu po dobu 15 minut. Pak se umístily do lahve, která obsahuje 20 ml IMDM + 10 % FBS. Lahve se inkubovaly při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO2 a ve vlhku. Po 24 hodinách se objem zdvojnásobil a kultivační médium se učinilo selektivním přidáním mykofenolové kyseliny v koncentraci 0,8 μς/ιηΐ a xanthinu v koncentraci 250 gg/ml Buňky se rozdělily do alikvotů na dvě plotny s 96 prohlubněmi. Buňky se aplikovaly přibližně 18 dní po selekci, kolonie se zviditelnily a v supernatantech se testovala přítomnost IgG pomocí testu ELISA. Prohlubně mikrotitrační destičky se potáhly kozími anti-lidskými IgG, Fc specifickými protilátkami (Sigma) a pak se inkubovaly s 5 násobným ředěním supernatantu. Vázané protilátky se detekovaly inkubací s kozími antilidskými protilátkami κ konjugovanými s HRPO (Seralab) a test se vyvinul o-fenylendiaminovým substrátem. Buňky z prohlubní φφ φφ <

φ · φ 'φ · « · φ φ φ Φφφ φ φ φ φ φ φφφ φ φφ « obsahující nevetší množství protilátek se nechaly kultivovat a zamrazila se zásobní kultura.

Buněčná linie vylučující nejvyšší množství protilátek se nechala kultivovat v 500 ml IMDM + 2 % FBS, přičemž vzniká saturovaný supernatant za účelem čištění protilátek. Supernatant se čistil centrifugací a připravil se roztok 0,1 M Tris HCl pH8,0. Přidala se protein A-agaróza (Sigma) a pak se směs míchala při teplotě 4 °C po dobu 16 hodin. Shromáždily se agarózové částice a nanesly se na kolonu a promyly se 0,1 M Tris HCl pH8,0 a pak 10 mM roztokem Tris HCl pH8,0. Protilátky se eluovaly 1 ml alikvoty 0,1 M glycinu pH3,0 do 100 μΐ vzorků 1 M Tris HCl pH8,0 a na základě odečítání A280nm se identifikovaly frakce obsahující podstatné množství proteinu. Tyto frakce se dialyzovaly proti PBS, sterilizovaly se filtrací a znovu se měřila absorbance při vlnové délce 280 nm, čímž se určí přibližná koncentrace protilátek (koncentrace = A₂80 nm X 0,174 mg/ml) .

Φ

Čistota a integrita protilátek se stanovila redukční SDSPAGE za použití 12,5 % akrylamidu. Koncentrace se kontrolovaly testem ELISA, při kterém se použily kozí anti-lidské κ protilátky (Seralab) , jako krycí činidlo a biotinylované kozí anti-lidské κ protilátky (Sigma). Pak následuje detekce za použití ExtrAvidin-HRPO (Sigma). To znamená, že podstata těžkého řetězce pravděpodobně neovlivňuje získané navázání.

Tvorba rozet transfektantů FcyRI.

Promyté R2R2 RBC se inkubovaly se vzorky protilátek ve 100 ml PBS na plotnách s 96 prohlubněmi při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. RBS se třikrát promyly, resuspendovaly se v PBS a inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu 40 minut s transfektanty, které exprimují cDNA FcyRI, B2KA (popisuje se v publikací S. Gorman and G. Hale, nepublikovaná data), které se kultivovaly na plotnách s 96 prohlubněmi. Supernatant se vylil a prohlubně se promyly jednou, aby se odstranil přebytek RBC. V případě každé prohlubně se testovalo 200 buněk B2KA a zaznamenal se počet rozet s RBC. Do grafu se vynesly průměrné hodnoty v procentech a standardní odchylka pro tři prohlubně. V jiném případě senzibilizované buňky RBC a B2KA se smíchaly v mikrocentrifugačních zkumavkách, vytvořil se pelet a buňky se jemně resuspendovaly a pak se přenesly na mikroskopické sklíčko.

Fluorescenční barvení transfektantů FcyR

Transfektanti exprimující cDNA FcyRI B2KA a 3T3 + FcyRIa + γ-řetězcem (van Urgt, M. J., Heijnen, I. A. F. M., Capel, P. J. A., Park, S. Y., Ra, C., Saito, T., Verbeek , J. S. and van de Winkel, J. G. J. (1996) FcyR γ-chain is essential for both surface expression and function of human FcyRI (CD64) in vivo. Blood 87, 3593-3599) se získaly jako suspenze jediné buňky ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem, který obsahuje 0,1 % (hmotn./objem) NaN3, 0,1 % (hmotn./objem) BSA (promývací pufr), pak následuje ošetření buněčným disociačním pufrem (Gibco BRL). Vytvořil se pelet buněk, přičemž koncentrace buněk je 10⁵ buněk/prohlubeň na destičkách s 96 prohlubněmi. Buňky se resuspendovaly ve 100 μί ředění protilátek CAMPATH-1 nebo Fog-1 a inkubovaly se na ledu po dobu 30 minut. Buňky se promyly třikrát promývacím pufrem, přičemž se použilo 150 μΐ pufru na jednu prohlubeň a podobně se inkubovaly s kozími anti-lidskými protilátkami κ-řetězce konjugovanými s biotinem (Sigma) v koncentraci 20 pg/ml a pak s 20 pg/ml ExtrAvidin FITC (Sigma). Po konečném promytí se buňky zafixovaly ve 100 pl promývacího pufru, který obsahuje 1% (objem/objem) formaldehydu. Povrchová exprese FcyRI se potvrdila barvením monoklonálními protilátkami CD64 (Serotec) a kozími a myšími t · · · · • · · · · · · · · · · ·· ·

IgG protilátkami konjugovanými s FITC (Sigma). Intenzita fluorescence se měřila na zařízení FACScan (Becton Dickinson).

V případě transfektantů, které nesou FcyRII, 3T6 + FcyRIIa 131H/H, 3T6 + FcyRIIa 131R/R (Warmerdam, P. A. M., van de Winkel, J. G. J., Gosselin, E. J., and Capel, P. J. A. (1990) Molecular basis for a polymorphism of human Fcy receptor II (CD32) . J. Exp. Med. 172, 19-25, Warmerdam, P. A. M., van de

Winkel, J. G. J., Vlug, A., Westerdaal, N. A. C. and Capel, P. J. A. (1991) A single aminoacid in the second Ig-like domain of human Fcy receptor II is critical for human IgG2 binding. J. Immunol. 147, 1338-1343) a 3T6 + FcyRIIbl* (Warmerdam, P. A.

M., van den Herik-Oudijk, I. E., Parren, P. W. Η. I., Westerdaal, N. A. C., van de Winkel, J. G. J. and Capel, P. J. A. (1993) Int. Immunol. 5, 239-247) před tím, než se protilátky inkubovaly s buňkami a tvořily komplexy. Například protilátky FcyRIIa 131H/H se míchaly s ekvimolárním množstvím kozích F(ab')₂ anti-lidských κ (Seralab) a inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Komplexy se pak smíchaly s buňkami a test pak pokračoval způsobem, jak se popisuje shora v textu s výjimkou, že detekční protilátky byly oslí anti-kozí IgG konjugované s FITC (Serotec) . V případe FcyRIIa 131R/R se komplexy připravily za použití ekvimolárního množství kozích F(ab')₂ anti-lidských κ (Seralab) konjugovaných s FITC a v případě FcyRIIbl* se komplexy připravily za použití ekvimolárního množství 1:1 směsi kozích F(ab')₂ anti-lidských κ konjugovaných s FITC nebo neznačených. V případě těchto receptorů byl potřeba pouze jeden krok inkubace.

V případě transfektantů, které nesou FcyRIIIb, CHO +

FcyRIIbl NA1 nebo NA2 (popisuje se v publikaci Bux, J., Kissel,

K., Hofmann, C. and Santoso, S. (1999) The use of allelespecific recombinant Fc gamma receptor Illb antigens for the detection of granulocyte antibodies. Blood 93, 357-362), se barvení provedlo způsobem, který se popisuje v případě buněk 3T6 + FcyRIIa 131 H/H, jak se popisuje shora v textu.

Senzibilizace červených krvinek

Skupina 0 RiRi RBC se promyla v PBS a resuspendovala se v RPMI + 10 % FBS, přičemž konečná koncentrace je 5% (objem/objem). 10 μΐ buněk se přidalo do 50 μΐ monoklonálních protilátek nebo RPMI/FBS, které jsou umístěny na destičkách s prohlubněmi, které mají dno ve tvaru písmene V, a inkubovaly se po dobu 60 minut při teplotě 37 °C. V některých experimentech se monoklonální protilátky sériově naředily v RPMI/FBS, přičemž se dosáhlo rozmezí červených krvinek vázaných na IgG. V kompetičních experimentech se červené krvinky senzibilizovaly ve směsi 25 μΐ kompetičních monoklonálních protilátek a 25 μΐ monoklonálních protilátek divokého typu nebo 25 μΐ séra, které obsahuje aloprotilátky. Po senzibilizaci se buňky promyly 4 krát 200 μΐ PBS a resuspendovaly se v 50 μΐ RPMI/FBS (konečná koncentrace je 1 % (objem/objem)). Ve všech experimentech se alikvot buněk (EIgG) testoval pomocí průtokové cytometrie, přičemž se stanovila úroveň IgG vázaných na červené krvinky.

Chemoluminiscenční test

PBMC se izolovaly centrifugací s hustotním gradientem z EDTA-antikoagulované krve, která se získala z 6 normálních dárců. PBMC se promyly 4 krát PBS, které obsahují 1 % BSA bez globulinu a pak se resuspendovaly v Hankově rovnovážném roztoku solí (HBSS) obsahujícím 25 % RPMI a 2,5 % FBS v koncentraci 2 χ 10⁶ buněk/ml. Alikvoty (100 μΐ) se rozdělily do 96 bílých matných destiček s plochým dnem a inkubovaly se po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C ve vlhku v atmosféře 5 % CO2 • · · • · • · • · »♦ • · · » * · · * ♦ · ♦ · • · · · · · · « · « · ···· ·· ·· · ve vzduchu. Destičky se pak umístily do luminometru (Anthos Lucy 1, Labtech International , Uckfield, UK) a 100 μΐ HBSS obsahující 4 χ 10'⁴ M luminol (Sigma) a do každé prohlubně se přidalo 20 μΐ Ε-IgG. Odezva CL se pak monitorovala při teplotě 37 °C po dobu 60 minut.

Stanovení IgG vázaných na červených krvinkách

Alikvoty 25 μΐ Ε-IgG se přenesly na destičku s prohlubněmi se dnem do tvaru V, promyly se jednou PBS, centrifugovaly se za vzniku peletu a resuspendovaly se v 50 μΐ F(ab)2 FITC-antiIgG (ředěných 1/30 v PBS/1% BSA) . Po 30 minutách při teplotě místnosti se buňky promyly jednou 200 μΐ PBS/BSA a držely se na ledu až do další analýzy průtokovou cytometrií (EPICS XL-MCL, Coulter Electronics, Luton, UK) . Zaznamenal se průměrný profil fluorescence.

Průměrný profil fluorescence se převedl na molekuly IgG/buňku za použití standardní křivky, která se připravila přidáním 100 μΐ 5% (objem/objem) buněk RiR_x do 900 μΐ sériového dvojnásobného ředění lidských monoklonálních IgGl anti-D (BRAD-5). Senzibilizované červené krvinky se promyly 3 krát s PBS/BSA a resuspendovaly se v roztoku PBS/BSA na koncentraci 1 % (objem/objem). Odebraly se alikvoty o objemu 25 μΐ a analyzovaly se průtokovou cytometrií, jak se popisuje shora v textu. Spočítaly se zbývající červené krvinky, centrifugaci se připravil pelet, lyžovaly se v pufru, který obsahuje Triton X-100 a v lyzátu se testem ELISA stanovilo IgG, jak se popisuje v publikací Kumpel, Β. M. (1990). A simple nonisotopic method for the quantítation of red cell-bound immunoglobulin. Vox Sanquinis, 59, 34-39). Počet molekul IgG vázaných na jednu červenou krvinku se dedukoval z koncentrace IgG a počtu červených krvinek, ze kterého se připravil každý lyzát. Do grafu se vynesla standardní křivka porovnávající

9 > 444 · 4 4 4 44 • · 9 9 · · ···· «4 99 999 intenzitu fluorescence s počtem molekul IgG vázaných na jednu červenou krvinku.

Komplementární lyže zprostředkovaná sérií protilátek CAMPATH-1

100 ml venózní krve získané ze zdravých dobrovolníků se defibrinovalo a separovaly se komponenty centrifugací s hustotním gradientem za použití Ficoll-Paque Plus (Pharmacia). Do zkumavek se odebralo sérum a mononukleární buněčné vrstvy. Buňky se ředily v Dulbeccově kultivačním médiu upraveném podle Iscove (IMDM) a shromáždily se centrifugací. Buňky se dvakrát promyly v IMDM, zatímco se kombinovaly do jednoho peletu, který se resuspendoval v 200 μΐ IMDM. Přidalo se 900 μθί chromanu sodného [⁵¹Cr] a buňky se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 40 minut. Přidalo se 10 ml kultivačního média IMDM a vytvořil se pelet buněk. Buňky se promyly dvakrát a resuspendovaly se v kultivačním médiu IMDM při přibližné koncentraci 6 x 10⁶ buněk/ml. Alikvoty značených buněk o objemu 50 μΐ se přidaly ke vzorkům protilátek na destičky s 96 prohlubněmi, které obsahují 50 μί kultivačního média IMDM. Do každé prohlubně se přidalo 100 μΐ zbývajícího séra ředěného 1:1 s IMDM a plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Destičky se centrifugovaly a supernatanty se rozdělily do vzorků a měřilo se relativní množství uvolněného ⁵¹Cr gammapočítačem. Odečetla se míra spontálního uvolnění dosažená ze vzorků, kam se nepřidaly protilátky, a míra celkového množství dostupného ⁵¹Cr získaná ze stejných vzorků odebraných po resuspendování buněk. % specifického uvolněného ⁵¹Cr se vypočítala podle vzorce:

(impulzy vzorku - spontální impulzy) x 100 (celkové impulzy - spontální impulzy)

Do grafu se vynesly průměrné hodnoty a standardní odchylky tří vzorků.

V případě inhibice komplementární lyže vzorky protilátek obsahovaly konstantní množství (konečná koncentrace 6,25 μg/ml) CAMPATH-1 Gl a zvyšující se množství CAMPATH-1 G2Aa.

ADCC zprostředkovaná sérií protilátek CAMPATH-1

Mononukleární buňky periferní krve se připravily způsobem, který se popisuje shora v textu. Po promytí se buňky resuspendovaly v kultivačním médiu doplněném 5 % FBS a přenesly se do lahví, které se potáhly protilátkami CD3. Buňky se nechaly kultivovat při teplotě 37 °C v 5% atmosféře CO2 po dobu tří dní. 5 % buněk se značilo ⁵¹Cr a použily se jako cílové buňky, promyly se a resuspendovaly se v kultivačním médiu ImDM + 5 % FBS. Do prohlubní na destičkách se přidaly alikvoty o objemu 50 μΐ obsahující 50 μΐ vzorků protilátek v IMDM + 5 % FBS. Cílové buňky a protilátky se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Jako nosič se přidaly RBC a vytvořil se centrifugací pelet buněk. Buňky se promyly dvakrát v kultivačním médiu IMDM. Zbývající mononukleární buňky se sebraly centrifugací a resuspednovaly se v kultivačním médiu IMDM + 5 % FBS, aby jejich koncentrace byla 4 x 10⁶ buněk/ml, a přidalo se do každé prohlubně 150 μΐ suspenze buněk. Poměr efektor:cíl je 20:1. Buňky se jemně centrifugovaly a umístily se do inkubátoru tkáňových kultur po dobu 6 hodin. Supernatanty se rozdělily do vzorků a stanovilo se specifické uvolnění ⁵¹Cr, jak se popisuje shora v textu. Do grafu se vynesly průměrné hodnoty specifického uvolnění pro dva vzorky proti konečným koncentracím protilátek.

Příklad 1: Vytvoření a základní charakterizace protilátek ·♦ ·* ·· · ·· • · · · ···· · • ··· · · · · 9 9 · • 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 9

Mutace vybrané za účelem eliminovat efektorové funkce, jsou zobrazeny v tabulce č. 1 (obrázek č. 15) . Mutace Aa provedená v genech IgGl a IgG2 zavedla zbytky IgG4 do poloh 327, 330 a 331. Podobně zbytky IgG2 v polohách 233-236 se zavedly do IgGl a IgG4, ale protože IgG2 vykazují delece v poloze 236, kde jiné podtřídy mají glycinový zbytek, mutace se provedla vynecháním (Ab) nebo zahrnutím (Ac) G236.

Vektory umožňující expresi DNA CAMPATH-1 nebo Fog-1 V_H v kombinaci s konstantními oblastmi mutantních genů DNA se kotransfekovaly s vhodnými expresívními vektory lehkého řetězce do buněk krysího myelomu.

Izolovaly se stabilní transfektanty, nechaly se pomnožit a protilátky se čistily ze supernatantu na agaróze s proteinem

A.

Vybraly se protilátky CAMPATH-lH, protože poskytují dobrý cílový systém při studii lyže sprostředkované komplementem a buňkou in vitro.

V případě protilátek Fog-1 se po čištění vyvtořila sraženina, ale v okamžiku, kdy se odstranila filtrací, tak se už nezaznamenala další sraženina. Koncentrace protilátek se stanovily na základě absorbance při vlnové délce 280 nm a upravila se, jestliže je to nutné, testem ELISA, který udává relativní množství přítomného řetězce κ. Protilátky se vystavily redukční SDS-PAGE. Každý vzorek vykazuje dva pruhy s vhodnou molekulovou hmotností 25 000 a 55 000, který reprezentuje očekávané velikosti lehkého a těžkého řetězce. Neexistuje poznatelný rozdíl mezi velikostí těžkých řetězců každé série protilátek, ale oba řetězce protilátek Fog-1 se jeví být o trochu menší než jejich doplňky CAMPATH-1. Skutečnost, že těžký řetězec se v každé sérii jeví tak, že má stejnou zjevnou molekulovou hmotnost indikuje, že mutace

nezpůsobují žádné velké rozdíl v glykosylaci proteinů. V případě protilátek se specifitou CAMPATH-1 výtěžek po čištění kolísá od 0,6 do 9 gg/ml supernatantu, zatímco výtěžek rozpustných protilátek Fog.l se pohybuje mezi hodnotou 3 a 20 gg/ml. Neexistuje žádná korelace při hodnocení výtěžku čištění pro dvě série protilátek, které naznačují, že žádné mutace neovlivňují produkci protilátek nebo jejich schopnost vázat protein A.

Pak se testovala specifita dvou sérií protilátek. Protilátky CAMPATH-1 ukazuje, že soutěží s klinickým stupněm čistoty protilátek CAMPATH-1H při navázání anti-CAMPATH-1 idiotypu monoklonálních protilátek YID13.9. Protilátky Fog-1 byly schopny aglutinovat RhD⁺ RBC v přítomnosti anti-lidských IgG protilátek jako zkříženě reagující činidla. Podobně podtřídy IgG protilátek Fogl se testovaly potažením RhD⁺ RBC s různými protilátkami a při prohlížení aglutinačního paternu se jako zkříženě reagující protilátky použily protilátky antiGlm(a), anti-IgG2 nebo anti-IgG4. Výsledek indikuje, že protilátky byly protilátky upravené podtřídy. Aglutinace RhD⁺ RBC ppomocí Fog-1 IgGl a anti-Glm(a) , Fog-1 IgG2 a anti-IgG2 a Fog-1 IgG4 a anti-IgG4 se provedla v přítomnosti nadbytku protilátek ze série CAMPATH-1. Protilátky CAMPATH-1 jsou schopny inhibovat aglutinaci tím, že soutěží se zkříženě reagujícím činidlem. Pouze v případě, že pocházejí ze stejné podtřídy jako protilátky Fog-1, tak ověřují svou podtřídu.

Příklad 2: Navázání FcyRI

RBC, které obsahují přibližně 30 000 RhD míst na jedné buňce (R2R2) r se potáhly každou z 11 protilátek Fog-1 v celém rozhraní koncentrací a přidaly se k lidským transfektantům

B2KA, které exprimují lidský FcyRI a rostou v prohlubních. Po inkubaci se odstranil nadbytek RBC a zaznamenaly se procenta buněk B2KA , které tvoří rozety pomocí RBC (obrázek č. 1). V případě Gl a GlÁa, kde zbytky IgG4 jsou zahrnuty v polohách 327, 330 a 331 se dosáhlo podobného množství rozet, přičemž polovičního množství rozet se dosáhlo, když RBC se potáhlo protilátkami v přibližné koncentraci 0,1 μς/ιηΐ, což je koncentrace, při které se očekává, že protilátky Fog-1 obsadily přibližně jednu třetinu míst RhD. Slabě vyšší koncentrace G4 jsou nutné pro získání stejného množství rozet. Když se použily RBC potažené protilátkami Gl a G4, které obsahují mutace Áa a Ác, nebo protilátkami G2. V experimentu zobrazeném na obrázku č. 1 nejvyšší testovaná koncentrace potažení byla 10 mg/ml. Očekává se, že tato koncentrace odpovídá přibližně 90 % obsazení míst RhD. Experiment se opakoval za použití potahovacích koncentrací až 80 mg/ml, což v podstatě saturuje místa RhD a v případě protilátek G2 a protilátek, které obsahují mutace Db nebo Dc a těch, které začleňují zbytky IgG2 v nižších oblastech spojení, se neobjevily žádné rozety. To indikuje, že dokonce když se RBC potáhly těmito protilátkami při maximální hustotě uvedeného antigenů, nedošlo k dostatečné interakci IgG/FcyRI pro vytvoření rozet.

Společnou centrifugací senzibilizovaných buněk RBC a B2KA dříve než se pozorovaly rozety na mikroskopickém sklíčku se zjistilo, že vyšší poměr rozet vzniká, když se buňky inkubují v prohlubních. Tato metoda se použila při zkoumání inhibice tvoření rozet. Dříve než se R2R2 BBC smíchaly s buňkami B2KA potáhly se směsí 1 mg/ml protilátek Fog-1 a různého množství Fog-1 G2Da nebo Fog-1 G4Db. Když se použily samotné protilátky Fog-1 Gl v koncentraci 1 μς/ιηΐ, potažené RBC vytvořily rozety na 95 % buněk B2KA, zatímco při senzibilizaci v přítomnosti 64mg/ml G2Áa nebo G2Áb nedochází k žádné tvorbě rozet (data nejsou uvedena).

·· ·< ·· · ·· • · · · · · · ♦ · · « • · · · · · · · · • ··· · · · 9 9 9 9 · ♦ 9 · · · ···· ·· ·· ··· ·· *

Navázání protilátek z obou sérií na dvě různé buněčné linie, které na svém povrchu exprimují cDNA FcyRI, se měřila fluorescenčním barvením. Na obrázku č. 2 jsou zobrazeny reprezentativní experimenty. Množství FcyRI exprimovaném na povrchu, jak se detekuje za použití protilátek CD64 je vyšší v případě transfektantů 3T3 než v případě linie B2KA a to se odráží v silnějším signálu získaném, když se měří navázání prostřednictvím Fc. V případě obou sérií se protilátky Gl a GlAa vázané na receptor se stejnou zjevnou afinitou indikující, že mutace v polohách 327, 330 a 331 podstatně neovlivňují interakci. Navázání protilátek G4 je přibližně tři násobně nižší než navázání protilátek Gl a GlAa. Slabé navázání je možné spatřit v případě protilátek G2 nebo libovolných jiných mutovaných protilátek, což naznačuje, že mutace Ab a Ac u IgGl a IgG4 jsou dostatečné pro redukci navázání na FcyRI alespoň 10⁴-násobně. Protilátky obsahující mutaci Ac zvláště pak GlAc vykazují nízký stupeň navázání na FcyRII při testovaných vyšších koncentracích, jestliže síla fluorescence se porovnává s pozadím nebo s ekvivalentními protilátkami s mutací Ab. Jestliže histogramy intenzity fluorescence jsou přelity, jak je možné spatřit na obrázku č.

v případě nejvyšších koncentrací protilátek CAMPATH-1 a buněk B2KA, grafy v případě protilátek Gl a GlAa se shodují. Existuje zde jasný rozdíl mezi histogramy v případě protilátek GlAb a GlAc.

Příklad 3: Spuštění FcyRI měřené fluorescencí

Za účelem měření funkční aktivity prostřednictvím FcyRI/II se stanovila chemoluminiscenční odezva (CL) monocytů na RBC senzibilizované protilátkami ze série Fog-1. Hodnoty se vynesly do grafu a vztáhly se k počtu molekul protilátek vázaných na RBC (obrázek č. 4). Rozdíl mezi protilátkami Gl a ·· 8 88 8 8 8 8 8 8 88 8 8 8

GlAa je možné vidět u vyššího množství protilátek, ale v případě obou protilátek se projevily vyšší odezvy než v případě protilátek G4 v celém rozmezí použitých koncentrací. Podstatné spuštění se dosáhlo u protilátek GlAc a v menším rozsahu u protilátek GlAa a G4Ac. U dalších protilátek se neprokázala žádná odezva.

Protilátky, o kterých se ví, že jsou deficitní při spouštění FcyRI se smíchaly ve zvýšených koncentracích s konstantním množstvím Fog-1 Gl a použily se k senzibilizaci RBC. Odezva CL na RBC je zobrazena na obrázku č. 5. Porovnáním odezvy CL s odezvou získanou titrací samotných Gl ukazuje, že šest protilátek ze sedmi inhibuje reakci v předpovídaném rozsahu, jestliže se předpokládá, že mutanti vykazují aktivní protilátku Gl z RBC úměrnou k jejich relativní koncentraci. V případě G2 se inhibiční účinek oddálil a proto je třeba třikrát více protilátek G2, aby došlo ke stejné inhibici. Protilátky GlAc inhibují přibližně ve stejném rozsahu jako jiné mutované protilátky s výjimkou, že odezva není snížena na 0.

Existují dvě publikace, kde se popisuje použitelnost chemoluminiscence při předpovídání vážnosti patologie in vivo. Jsou to publikace Hadley (1995) Transfusion Medicine Reviews 9: 302-313 a Hadley et al (1988) Br. J. Obstet Gynaecol 105: 231-234.

V těchto testech výsledných přibližně 30 % chemoluminiscence produkované monoklonální protilátkovou kontrolou BRAD-5 bude předpovídat in vivo patologii u HDN. Tak tyto protilátky, které budou držet zmíněné množství pod 30 %, by měly být vhodné pro terapii.

Jedny z mutovaných protilátek Fog-1 G2Aa se testovaly za účelem zjištění jejich schopnosti inhibovat odezvu CL na

·· ·· • · · ·	·* • ·	• ··
• ·	•	• ·
• ···	• · ·	•	• ·	•
• ·	• ·	•	•	•
··«· ··	··	·»·	• ·	•

sérum, které obsahuje klinicky podstatné množství protilátek. Sera obsahovaly proti-látky anti-RhD nebo antiC+D a v nepřítomnosti inhibitoru došlo k CL odezvě vyšší než 30 %, což ukazuje na těžké hemolytické onemocnění novorozence a nutnost aplikace nitroděložní transfúze. Séra se smíchala s různými koncentracemi protilátek G2Áa, přičemž směsy se použily k senzibilizaci RBC a stanovily se odezvy monocytů (obrázek č. 6). Přidáním protilátek G2Áa se redukují signály CL, což způsobuje, že všech pět anti-RhD sér vykazuje hodnotu pod 30 %. Aby se dosáhlo této hodnoty je nutné přidat 16 až 260 gg/ml protilátek, přičemž rozmezí odráží různé množství a afinity protilátek anti-RhD v séru. Existují dvě kontrolní séra. Anti-K sérum se nemůže blokovat vůbec protilátkami G2Áa, protože jeho reaktivita se směřuje k jinému antigenu na RBC. Pouze část aktivity anti-C+D séra se může inhibovat protilátkami G2Áa.

Příklad 4: Aktivita při lyži komplementem

Na obrázku č. 7 je zobrazeno, že všechny mutace připravené za použití protilátek Gl a G2 CAMPATH-1 dramaticky snižují jejich schopnost zprostředkovat komplementární lyži. Když se provedl test za použití konstantního množství protilátek Gl a různého množství protilátek G2Áa (zobrazeno na obrázku č. 8), protilátky G2Áa jsou schopny blokovat odumírání PBMC zprostředkované CAMPATH-1 Gl.

Příklad 5: Aktivita při ADCC

Schopnost zprostředkovat ADCC se měřila v případě protilátek CAMPATH-1 za použití lidských PBMC jako cílových buněk (zobrazeno na obrázku č. 9) a v případě protilátek Fog-1 za použití RhD⁺ RBC jako cílových buněk (obrázky č. 10 a 10b) . Obrázek č. 9 ukazuje smíšené schopnosti protilátek CAMPATH-1 «* «· • 0 0 0 0 * 0 0 0 0 0

000 00 0

0 0 0

0000 00 «0 «0 00 0 0 0

0 0

0 0 0 > 0 0

000 »0 0 při ADCC za použití stejných mutantů, které mají velmi nízkou aktivitu. Obrázky 10 a 10b ukazují, že mutanti GlÁab, GlÁac, G2Áa, G4Áb a G4Ác protilátek Fog-1 jsou schopny podpořit libovolné odumírání RBC. Na obrázku č. 10 je možné spatřit lyži RBC senzibilizovaných protilátkami G2 nebo G4, ale uvedené protilátky nevykazují zjevnou aktivitu v testu zobrazeném na obrázku č. 10b. Tuto skutečnost demonstruje pozorování, že stupeň lyže může záležet na donorů efektorových buněk a může dokonce kolísat, když se použijí efektorové buňky, které se získají od stejného dárce v různém čase. V případě mutantů uvedených shora v textu se nezjistila žádná aktivita na úrovni pozadí, ačkoli se testovalo velké rozpětí efektorových dárců.

Některé protilátky se použily při pokusu inhibovat ADCC RhD⁺ RBC pomocí Fog-1 Gl (zobrazeno na obrázkách č. 11 a 11b) a klinickým vzorkem anti-RhD séra (zobrazeno na obrázku č. 12) . Uvedené obrázky ukázaly, že všechny testované protilátky jsou schopny inhibovat ADCC, když se smíchaly s aktivními protilátkami dříve než se provede senzibilizace RBC. Zvláště účinné při blokování ADCC jsou mutanti GlÁab, GlÁac, G2Aa, G4Ab a G4Ac protilátek Fog-1.

Příklad 6: Navázání FcyRI

Obrázky 13, 13b zobrazují navázání komplexů protilátek ze série Fog-1 na buňky nesoucí FcyRIIa 131H/H, FcyRIIa 131R/R a FcyRIIbl*. Je nezbytné tvořit komplexy protilátek v případě, že se měří navázání na tyto receptory, což způsobuje jejich slabou afinitu pro jednotlivé molekuly protilátek. FcyRIIa 131H/H je alotyp FcyRIIa, u kterého se očekává, že se na něj protilátky vážou silně a Gl a G2 vykazují silnou vazebnou aktivitu (obrázek č. 13) . Zavedení mutací těchto dvou protilátek dochází k postupné redukci • tf • tf tf • · • · tftf • tftf tftf « • tftf tftf tftf « ·· • · ♦

• ••tf v úrovni navázání a protilátky GlAac vykazují pouze úroveň navázání odpovídající pozadí, jaké vykazují protilátky G4. Obrázek č. 13b ukazuje, že protilátky mají odlišné relativní aktivity, když se váží na 131R alotyp FcyRIIa, ale mutace vytvořené s protilátkami Gl divokého typu opět snižují navázání na receptor. Všechny protilátky vykazují podstatně vyšší navázání na inhibiční receptor FcyRIIb* ve srovnání s negativními kontrolními vzorky zkříženého navázání samotného F(ab')₂ nebo glykosylovaných protilátek IgGl v komplexu s F(ab')₂ (zobrazeno na obrázku č. 14). Ačkoli navázání většiny mutantů se snižuje relativně s odpovídajícími protilátkami divokého typu, některé mutanty vykazují dvojnásobek navázání ve srovnání s protilátkami Gl divokého typu.

Příklad 6b: Navázání FcgRIII

Na obrázku 14b a 14c je znázorněno navázání komplexů protilátek ze sérií Fog-1 na buňky nesoucí FcyRIIb alotypů NAl a NA2. V případě obou alotypů je možné pozorovat navázání v případě protilátek Gl a v menším rozsahu v případě protilátek GlAa a GlÁc. V případě jiných mutovaných protilátek se nepozorovalo žádné navázání, protože vykazují podobnou sílu fluorescence jako negativní kontrolní vzorky zkříženě reagujícího samotného F(ab')₂ nebo glykosylovaných protilátek /gGl tvořících komplex s F(ab')₂.

Příklad 7: Produkce anti-GlÁa-HPA-la protilátek

Amplifikovaly se oblasti V_H a ν_λ protilátek anti-HPA-la scFv (Griffin, Η. M. and Ouwehand, W. H. (1995) A human monoclonal antibody specific for the leucine-33 form of the platelet glycoprotein lila from a V gene phage display library. Blood 86, 4430-4436) a každá se připojila na vedoucí sekvenci, která pochází z vektoru M13VHPCR1 (popisuje se v publikaci Orlandi, R., Gussow, D. Η., Jones, Ρ. T. and Winter, G. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 3833) PCR prodlužující přesah, jak se popisuje dříve v textu. DNA 3konec V_H v M13VHPCR1 a reprezentující 5'konec intronu V_h-Ch se podobně spojil s vedoucí sekvencí/V_HDNA. Produkt se klonoval jako HindlII-BamHI fragment do expresívního vektoru IgGl a IgG2, aby se nahradila existující variabilní oblast fragmentu a vznikly vektory pSVgptB2VHHu!gGl a pSVgptB2VHHu!gG2.

do rámce s DNA alotypu Kern”Oz Forster,. H. and 1:11) získané

Vedoucí sekvence/νλ DNA se spojila konstantní oblasti lidského řetězce λ (popisuje se v publikaci Rabbitts, Τ. H.

Matthews, J. G. 1983. Mol. Biol. Med.

z existujícího expresívního vektoru (popisuje se v publikaci Routledge, E. G., Lloyd, I, Gorman, S.D., Clark, M. and Waldmann, H. 1991, Eur. J. Immunol. 21: 2717). Celý gen λ se klonoval do M13 jako HindlII-BamHI fragment a zesilovač myšího těžkého řetězce z pSVhyg-HuCK (popisuje se v publikaci Orlandi, R., Gussow, D. H., Jones, Ρ. T. and Winter, G. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 3833) na 5'konec genu za použití adapterů tak, že celý inzert by se mohl přenést do pSV2neo (popisuje se v publikaci Southern, P. J. and Berg P. 1982 J. Mol. Appl. Genet. 1:327) jako fragment BamHi. Vektor se označil jako pSVneoB2VXHuCX.

Expresívní vektory se transfekovaly do buněžné linie krysího myelomu YB2/0, přičemž se vybraly transfektanty a čistily se protilátky, jak se popisuje shora v textu. Tyto protilátky B2IgGl a B2IgG2 se mohou použít jako kontrolní protilátky.

Když se vybrala preferovaná nulová konstantní oblast fragment B2 VH HindlII-BamHI, může se zavést do expresívních vektorů, které nesou vhodné konstantní oblasti genů, které nahrazují existující fragment variabilní oblasti. Expresívní • · * · · · ·· ··· ·· · vektory těžkého řetězce se pak společně transfekovaly s pSVneoB2VXHuCX do buněk myelomu a protilátky se čistily za účelem použití.

Příklad 8: Terapeutické použití vazebné molekuly

Terapeutická molekula podle vynálezu se může použít při léčbě těhotenství komplikovaných aloimunizací HPA-la, například intravenózní aplikací matce, přičemž tato léčba závisí na přenosu placentou (například prostřednictvím FcRn), aby se dostala terapeutická dávka k zárodku.

Alternativní způsob je přímá aplikace zárodku do perkutánní umbilikální žíly. Tento postup se v současné době provádí v případě FAIT, aby se transfuzí zavedly kompatibilní krevní destičky. Během jednoho těhotenství se postup může mnohokrát opakovat. Existuje zde nebezpečí ztráty plodu vyjádřeno v procentech 0,5 % při jednom provedení.

Fetální aplikace terapeutických protilátek má však tu váhodu, že velmi snižuje potřebnou dávku a proto je možné zvažovat jako první krok terapie použití molekul podle vynálezu ve spojení s transfúzí krevních destiček. Tento přístup může před zavedením omezit nebo eliminovat nutnost dalších transfúzí krevních destiček.

Shrnutí

Aktivity protilátek jsou shrnuty v tabulce č. 2 (obrázek č. 16). Jak je možné vidět mohou se produkovat vazebné molekuly, které mají sníženou schopnost vázat se na FcyRI, FcyRIIa 131H/H, FcyRIIa 131R/R, FcyRIIb NA1 a FcyRIIb NA2. Tyto látky nejsou schopné vyvolat u monocytů chemoluminiscenci, nemohou zprostředkovat komplementární lyži a nejsou proto aktivní při ADCC. Vazebné molekuly se však uchovávají ····* · · ·· · • · · · · · • · · · · · · ·· schopnost vázat se na inhibiční receptor FcyRIIb. Jiné mutace, které se dříve používaly při odstranění efektorových funkcí, jako je odstranění glykosylačních míst v oblasti CH2, aby vznikly glykosylované protilátky mohou také eliminovat navázání na tento receptor, který nemusí být nutný.

Ukázalo se, že vybraní mutanti jsou schopni zcela inhibovat tvoření rozet u buněk nesoucích FcyRI pomocí protilátek Fog-1, odezvu monocytů na RBC senzibilizované protilátkami Fog-1 Gl, odezvu monocytů na RBC senzibilizované antí-RhD, usmrcení PBMC komplementární lyží s CAMPATH-1 Gl, usmrcení RBC pomocí ADCC s protilátkami Fog-1 Gl, usmrcení RBC pomocí ADCC s polyklonálním anti-RhD sérem.

Zde uvedené výsledky ukazují, že úprava pouze jediného zbytku v oblasti IgG CH2, aby odpovídala s odlišnou podtřídou může vést k odlišné aktivitě. Tak je tomu v případě tří párů mutantů Db a Dc: GlAb a GlAc, GlAab a GlAac, G4Ab a G4Ac. V každém páru se protilátky liší pouze absencí (Ab) nebo přítomností (Ac) G236. V případě většiny zde měřených funkcí protilátky Ab a Ac mají různé aktivity. Mutanti Db jsou více aktivní při navázání FcyRIIa 131H/H, zatímco mutanti Dc jsou více aktivní při navázání FcyRI, FcyRIIIb NA1 a NA2, při aktivaci monocytů a ADCC. Oblast, kde se připravily mutace Ab a Ac je známa jako spodní část spojení a je pravděpodobné, že vykazuje rozsáhlou strukturu spojující spojení řetězců se zbývající doménou CH2. Adice nebo delece zbytku z této oblasti podle předpokladu mění uspořádání zbytků nižšího spojení vztaženo k receptorovým interakčním místům ve zbytku oblasti CH2.

Je nutné poznamenat, že účinek mutací se nemůže vždy předpovědět na základě aktivit protilátek divokého typu, ale bude záviset na novém obsahu (založeno na „smíšených • · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··· podtřídách IgG), ve kterých jsou přítomny mutace. Jedním příkladem je test komplementární lyže, kde aktivity IgG2 jsou přibližně třikrát nižší než aktivity IgGl, ale zavedení zbytků IgG2 do IgGl (GlAb a GlAc) eliminuje lyži. Podobně IgGl a IgG2 vykazuje stejné navázání jako FcyRIIa 131H, ale aktivity protilátek GlAb a GlAc jsou 50-ti a 10-ti násobně nižší.

V případě testů ADCC, jak se uvádí na obrázku č. 9 a 10, vykazují IgG2 a IgG4 podobnou, nižší, ale měřitelnou míru • lyže. Substitucí zbytků mezi IgG2 a IgG4 stejně jako do IgGl se redukuje jejich aktivita. Data naznačují, že protilátky divokého typu různých podtříd lidského IgG a podle předpokladu mutované protilátky mohou použít různé zbytky při navázání na jiné molekuly, přičemž spustí jejich aktivitu.

Claims (30)

1. Vazebná molekula, která je rekombinantním polypeptidem obsahuj ícím:

i) vazebnou doménu schopnou vázet cílovou molekulu a ii) efektorovou doménu, která má aminokyselinovou sekvenci v podstatě homologní s celou nebo s částí konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, kde vazebná molekula je schopna vázat cílovou molekulu, aniž spustí podstatnou lyži závislou na komplementu nebo poškození cíle zprostředkované buňkou, přičemž je charakterizována tím, že efektorová oblast je schopná specificky vázat FcRn a/nebo FcyRIIb a že chimerová efektorová oblast, která se získala ze dvou nebo více oblastí C_h2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, které zahrnují jako první oblast C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, kde 2, 3 nebo 4 aminokyseliny alespoň v jedné oblasti C_H2 se upravily tak, že odpovídají aminokyselinám z druhé, odlišné oblasti C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, přičemž oblast se vybrala ze dvou diskrétních oblastí zbytků s čísly 233 až 236 a 327 až 331 v souladu s číslovacím systémem EU a v každém případě se lidský imunoglobulin vybral z IgGl, IgG2 a IgG4.

2. Vazebná molekula podle nároku 1, kde první lidský imunoglobulin se vybral z IgGl, IgG2 a IgG4 a druhý lidský imunoglobulin se vybral z IgG2 a IgG4.

3. Vazebná molekula podle nároku 1 nebo 2, kde 2 aminokyseliny v jedné oblasti domény C_H2 se upravily na odpovídající aminokyseliny z druhé oblasti C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.

4. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 3, kde alespoň 2 aminokyseliny v každé ze dvou diskrétních oblastí • · · 9 · · • · · · · « · » · 9 9

9 99 9 99 99

5.

domény C_H2 se upravily na odpovídající aminokyseliny v odpovídající oblasti v druhé nebo třetí oblasti C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinů.

Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 4, kde efektorová oblast sdílí alespoň 90 % shody sekvence s první oblastí C_h2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinů.

Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 5, která obsahuje oblast C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinů vykazující jednu nebo více následujících aminokyselin nebo delecí v uvedených polohách v souladu s číslovacím systémem EU:

poloha aminokyselina

233

234

235

236

327

330

331

P

V

A (žádný zbytek) nebo G G

S

S

7. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 6, která obsahuje oblast C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinů zahrnující jednu nebo více následujících bloků aminokyselin nebo delecí v uvedených polohách v souladu s číslovacím systémem EU: 233P, 234V, 235A a žádný zbytek v poloze 236 nebo 233P, 234V, 235A a 236G a/nebo 327G, 330S a 331S.

8. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 5 až Ί, kde efektorová doména se vybrala z GlÁab, G2Áa nebo GlAac.

9. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 8, která dále zahrnuje úpravy, které umožňují molekule být v podstatě nulovým alotypem

10. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 9, přičemž efektorová oblast má omezenou afinitu pro FcyRI, FcyRIIa nebo FcyRIII a omezenou schopnost zprostředkovat lyži ·* *· «· · ·· ···♦ ···· «»· • · · ·· · · · « 888 8 8 8 8 88 8 • 8 8 8 8 8 8 ···* ·· ··» 898 88 8 komplementem porovnáním s první nebo druhou oblastí Ch2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.

11. Vazebná molekula podle nároku 10, kde efektorová oblast si zachovala afinitu pro FcyRIIb.

12. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 11, kde se vazebná oblast odvodila z odlišného zdroje než je zdroj pro efektorovou oblast.

13. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 12, kde se vazebná molekula vybrala ze skupiny zahrnující vazebné místo protilátek, enzym, hormon, receptor, cytokin nebo antigen, ligand nebo adhezní molekulu.

14. Vazebná molekula podle libovolného z nároků 1 až 13, kde vazebná oblast je schopna vázat libovolného zástupce ze skupiny zahrnující: antigen RhD červených krvinek, aloantigen HPA krevních destiček, neutrofilový antigen, receptor T-buněk, integrin, GBM kolagen, Der Pl, HPA-la, VAP-1, laminin, lutheran, glykoprotein VI krevních destiček, glykoprotein Ia/IIa krevních destiček.

15. Vazebná molekula podle nároku 14, kde vazebná oblast se vybrala ze skupiny zahrnující vazebnou oblast z CAMPATH-1 a FOGl, OKT3, B2 (anti-HPA-la), VAP-1, myší anti-a3 (IV) NC1, YTH12.5 (CD3), 2C7 (anti-Der ρ I), anti-lamininu, anti-lutheranu.

16. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující efektorovou oblast vazebné molekuly podle libovolného z předcházejících nároků.

17. Nukleová kyselina podle nároku 16, kde nukleotidová sekvence kóduje vazebnou molekulu podle libovolného z předcházejících nároků.

18. Nukleová kyselina podle nároku 16 nebo 17, kterou je replikovatelný vektor.

19. Nukleová kyselina podle nároku 18, kde nukleotidová sekvence je operativně spojená s promotorem.

20.

21.

22.

23.

24 .

25.

₍

26.

27.

Hostitelská buňka, která obsahuje nebo se transformovala vektorem podle nároku 19 nebo 20.

Způsob produkce vazebné molekuly podle libovolného z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že zahruje úpravu nukleotidové sekvence kódující první oblast C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu tak, že 2, 3 nebo 4 aminokyseliny alespoň v jedné oblasti domény C_H2 odpovídají aminokyselině z druhé oblasti C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, kde oblast se vybrala ze dvou diskrétních oblastí číslovaných zbytků 233 až 236 a 327 až 331 v souladu s číslovacím systémem EU a kde v každém případě se lidský imunoglobulin vybral z IgGl, IgG2 a IgG4.

Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e 2 aminokyseliny v jedné oblasti domény C_H2 se upravily tak, aby odpovídaly aminokyselinám z druhé oblasti C_H2 těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.

Použití vazebné molekuly nebo nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 19 při navázání cílové molekuly na uvedenou vazebnou molekulu.

Použití podle nároku 23, kde vazebná molekula je FcyRIIb, jejíž navázání způsobuje inhibici jednoho nebo více procesů: aktivace B buněk, degranulaci žírných buněk, fagocytózu.

Použití podle nároku 24 při prevenci, inhibici nebo jiné interferenci s navázáním druhé vazebné molekuly na cílovou molekulu.

Použití podle nároku 25, kde druhá vazebná molekula je protilátka.

Použití podle nároku 25 nebo 26, kde cílová molekula se vybrala ze skupiny zahrnující RhD antigen červených krvinek, aloantigen HPA krevních destiček, neutrofilový antigen, receptor T-buněk, integrin, GBM kolagen, Der Pl, HPA-la, VAP-1, laminin, lutheran, glykoprotein VI krevních destiček, glykoprotein la/IIa krevních destiček.

• *

28. Použití podle libovolného z nároků 24 až 27 při léčbě pacienta trpícího poruchou vybranou ze skupiny zahrnující nepříznivé ovlivnění štěpu hostitelem, nepříznivé ovlivnění hostitele štěpem, odmítnutí transplantovaného orgánu, odmítnutí transplantované kostní dřeně, autoimunitu, jako je vaskulitida, autoimunní hemolytícká anemie, autoimunní trombocytopenie a artritida, aloimunitu, jako je fetální nebo neonatální aloimunní trombocytopenie, astma a alergie, chronické nebo akutní zánětlívé onemocnění, jako je Crohnova nemoc, HDN, syndrom „Goodpastures, srpkovitá anemie, okluze koronární arterie.

29. Použití podle libovolného z nároků 23 až 28, kde vazebná molekula se aplikuje pacientovi nebo v případě, že pacient je nenarozené dítě, matce pacienta.

30. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje vazebnou molekulu podle libovolného z nároků 1 až 15 nebo nukleovou kyselinu podle libovolného z nároků 17 až 19 plus farmaceuticky přijatelný nosič.

31. Oligonukleotid vybraný ze skupiny zahrnující:

MO22BACK: 5 'TCT CCA ACA AAG GCC TCC CGT CCT CCA TCG AGA AAA 3 MO22: 5'TTT TCT CGA TGG AGG ACG GGA GGC CTT TGT TGG AGA 3' MO7BACK: 5' TCC TCA GCA CCT CCA GTC GCG GGG GGA CCG TCA GTC 3

MO21: 5' GAC TGA CGG TCC CGC GAC TGG AGG TGC TGA GGA 3'.