ES2584907T3 - Métodos para tratamiento del dolor inflamatorio - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo antagonista anti CGRP (péptido relacionado con el gen de la calcitonina) para el uso como un medicamento para la prevención o el tratamiento de dolor artrítico, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP no se administra por vía intratecal.

Description

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Metodos para tratamiento del dolor inflamatorio Campo de la invencion
La invencion se refiere a un anticuerpo anti CGRP para su uso en la prevencion y/o tratamiento del dolor y/o slntomas de dolor inflamatorio, y a un metodo para tratar y/o prevenir el dolor y/o slntomas de dolor inflamatorio usando un anticuerpo anti CGRP.
Antecedentes de la invencion.
El proceso inflamatorio es una serie compleja de eventos bioqulmicos y celulares, activados en respuesta a la lesion de tejidos o la presencia de sustancias extranas, que da como resultado hinchazon y dolor (Levine y Taiwo, 1994, Textbook of Pain, 45 56). Dolor artrltico es el dolor inflamatorio mas comun. La enfermedad reumatoide es una de las afecciones inflamatorias cronicas mas comunes en los palses desarrollados y la artritis reumatoide es una causa comun de discapacidad. La etiologla exacta de la artritis reumatoide es desconocida, pero las hipotesis actuales sugieren que factores tanto geneticos como microbiologicos pueden ser importantes (Grennan y Jayson, 1994, Textbook of Pain, 397 407). Ha sido estimado que casi 16 millones de estadounidenses tienen osteoartritis sintomatica (OA) o enfermedad degenerativa de las articulaciones, la mayorla de los cuales tienen mas de 60 anos de edad, y se espera que aumente a 40 millones de anos a medida que la edad de la poblacion aumente, haciendo que este sea un problema de salud publica de enorme magnitud (Houge y Mersfelder, 2002, Ann Pharmacother, 36, 679 686;. McCarthy et al, 1994, Textbook of Pain, 387 395.). Mas pacientes con osteoartritis buscan atencion medica debido al dolor asociado. La artritis tiene un impacto significativo sobre la funcion psicosocial y flsica y se sabe que es la causa principal de discapacidad en la vida posterior. La espondilitis anquilosante tambien es una enfermedad reumatica que provoca artritis en las articulaciones sacroillacas y columna vertebral. Varla de episodios intermitentes de dolor de espalda que se producen a lo largo de la vida a una enfermedad cronica grave que ataca la columna vertebral, articulaciones perifericas y otros organos del cuerpo.
Otro tipo de dolor inflamatorio es el dolor visceral que incluye el dolor asociado con enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). El dolor visceral es el dolor asociado con las vlsceras, que abarcan los organos de la cavidad abdominal. Estos organos incluyen organos de sexo, bazo y parte del sistema digestivo. El dolor asociado con las vlsceras puede dividirse en dolor visceral digestivo y dolor visceral no digestivo. (G1) trastornos gastrointestinales comunmente encontrados que provocan dolor incluyen trastorno funcional del intestino (FBD) y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Estos trastornos G1 incluyen una amplia gama de estados de enfermedad que actualmente solo estan moderadamente controlados, incluyendo, con respecto a FBD, reflujo gastro esofagico, dispepsia, slndrome del intestino irritable (IBS) y slndrome de dolor abdominal funcional (FAPS), y, con respecto a IBD, enfermedad de Crohn, ileitis y colitis ulcerosa, todos los cuales producen regularmente dolor visceral. Otros tipos de dolor visceral incluyen el dolor asociado con la dismenorrea, cistitis y pancreatitis y dolor pelvico.
Hay una necesidad medica crltica para identificar compuestos nuevos farmaceuticamente activos que interfieren con los pasos principales del proceso de dolor inflamatorio y en particular para el tratamiento y/o prevencion del dolor y/o los slntomas de dolor de artritis.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la administracion de un anticuerpo anti CGRP es eficaz en la prevencion y/o el tratamiento de dolor inflamatorio, dolor de la artritis y en particular dolor de la osteoartritis.
CGRP (peptido relacionado con el gen de la calcitonina) es un neuropeptido de 37 aminoacidos que actua como un neurotransmisor en el sistema nervioso central. Se une con alta afinidad al receptor de CGRp, receptores de calcitonina como receptor (CRLR), la activacion de ciclasa de adenilato y produccion de quinasa de protelna A.
Antagonistas de CGRP de molecula pequena selectiva de penetracion central y administracion por via espinal se han demostrado ser utiles en el tratamiento de condiciones de dolor neuropatico y nociceptivo (Adwanikar et al, Dolor 2007) lo que sugiere que la eliminacion de CGRP endogeno en la medula espinal tiene un efecto antinociceptivo. Ademas la administracion intratecal de antisuero contra CGRP se ha demostrado que reduce el comportamiento nociceptivo en modelos de roedores de artritis (Kuraishi, Y., et al., Neurosci. Lett (1998) 92, 325 - 329).
Sorprendentemente, se ha encontrado que la administracion de un anticuerpo anti CGRP es eficaz, con un sitio periferico de accion, en la prevencion y/o tratamiento del dolor inflamatorio y, en dolor osteoarthntis particular cuando se administra perifericamente. Esta via de administracion periferica proporciona una clara ventaja sobre el requisito de administrar anticuerpos intratecal o medularmente, un procedimiento de mas alto riesgo e inconveniente.
Breve descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso como un medicamento para la prevencion o el tratamiento del dolor artrltico, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP no se administra por via intratecal.
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En una realizacion, el anticuerpo antagonista anti CGRP actua perifericamente en administracion.
Descripcion de las figuras
Figura 1: El modelo de dolor de osteoartritis. Anticuerpo G2 se administro a 1 y 10 mg/kg, por via intravenosa (1 ml/kg, IV) y, un anticuerpo nulo (no se une CGRP) se administro a 10 mg/kg, IV como un control negativo. Ambos anticuerpos se disolvieron en una solucion de vehlculo que contiene PBS + 0,01% de Tween 20. Celecoxib se utilizo como control positivo en el estudio. Se suspendio en 0,5% de metilcelulosa y 0,025% de Tween 20 y se administro por sonda oral (1 ml/kg) a 30 mg/kg, dos veces al dla durante todo el perlodo de estudio. Se evaluaron las respuestas al dolor en dlas 2, 3, 7 y 10 despues de la iniciacion del estudio de farmacologla (dla 0) y se evaluaron de una manera totalmente ciega. Los datos re los medios±SEM de 6 ratas por grupo. *p<0,05 y p<0.01 vs valor de referencia (prueba de Dunnett en GraphPad Prism). En la figura, de izquierda a derecha, la barra 1=llnea de base, barras 2-5=anticuerpos nulo, bares 6-9=1 mg/ml G2, barras 10-13=10 mg/ml G2, barras 14-17=Celecoxib 30 mg/ml .
Figura 2: Los datos de union de ensayo demuestran que el anticuerpo IG inhibe la union de a-CGRP al receptor CGRPI.
Figura 3a: Los niveles sericos de la concentration contra el CGRP (ug/ml) frente al tiempo despues de la administracion IV de 10 mg/kg, medida por el anti-IgG ELISA.
Figura 3b: El nivel en suero de la concentracion de CGRP contra (ug/ml) frente al tiempo despues de la administracion IV de 10, 30, 100 mg/kg, medida por el anti-IgG ELISA.
Figura 4: Exploration de alanina usando un fragmento de CGRP C-terminal (CGRP 25-37). El cambio en la afinidad se expresa en la perdida de veces de afinidad y que muestra que el anticuerpo anti CGRP G1 se une a la region terminal C de a-CGRP humano.
Figura 5: Competencia de solucion por Biacore: CGRP, fragmentos de CGRP o peptidos relacionados en secuencia para CGRP se utiliza para determinar la especificidad de G1.
Figura 6: Secuencias de CGRP de humano, mono cynomolgus, rata, raton, perro y conejo. Residuos no conservados entre las especies estan subrayados, el epltopo de G1 esta en negrita.
Figura 7: Los datos que muestra G1 inhibe la llamarada neurogenica en la piel a partir de 90 min post tratamiento. G1 se administro por administracion intravenosa (1 ml/kg). Los datos son de 6-8 o 13 ratas por grupo. *p=0,05, p=0,01 ** vs vehlculo (salino de tampon de fosfato) grupo tratado en cada punto temporal (AVOVA).
Tabla 1: Kd y IC50 de anticuerpos anti CGRP midieron a 25°C frente a un a-CGRP humano [muMab7E9 = precursor de murino de G1. Su KD para rata p-CGRP=1 nM. RN4901=herramienta de murino, reconociendo el mismo epltopo como G1 pero mostro las mismas afinidades y selectividad en ratas (p-CGRP KD=17 nM); G1=anticuerpo humanizado de muMab7E9 (KD para ratpCGRP=0,1 nM).]
Tabla 2: Afinidades de union G1 segun lo determinado por Biacore
Descripcion de la invencion
Tecnicas generates
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologla molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiologla, biologla celular, bioqulmica e inmunologla, que estan dentro de la experiencia de la tecnica. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliografla, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edition (Sambrook et al, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths y D. G. Newell, eds., 1993 1998). J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Cal, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al, eds., 1987.); PcR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al, eds., 1994.); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al, eds., 1991.); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988 1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer:. Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993).
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Definiciones
Un "anticuerpo" es una molecula de inmunoglobulina capaz de union especlfica a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleotido, llpido, polipeptido, etc., a traves de al menos un sitio de reconocimiento del antlgeno, localizado en la region variable de la molecula de inmunoglobulina. Tal como se utiliza aqul, el termino abarca anticuerpos no solo policlonales intactos o monoclonales, sino tambien fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb), anticuerpos de cadena sencilla (ScFv), los mutantes de los mismos, anticuerpos quimericos, diacuerpos, protelnas de fusion que comprenden una porcion de anticuerpo, y cualquier otra configuracion modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antlgeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tales como IgG, IgA o IgM (o sub clase de los mismos), y el anticuerpo no necesita ser de cualquier clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoacido de anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas pueden dividirse ademas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y tres configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
"Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un reconocimiento de antlgeno completo y el sitio de union. En una especie Fv de dos cadenas, esta region consiste en un dlmero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en asociacion estrecha, no covalente. En una especie de cadena unica Fv, un dominio variable de cadena pesada y una de cadena ligera puede unirse covalentemente por un enlazador peptldico flexible tal que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura dimerica analoga a la de una cadena de dos especies Fv. Es en esta configuracion que las tres CDRs de cada dominio variable interactuan para definir una especificidad de union de antlgeno en la superficie del dlmero VH-VL. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente 3 CDR especlficas para un antlgeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antlgeno, aunque generalmente a una afinidad menor que el sitio de union.
El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio de cadena pesada CH1, incluyendo una o mas cistelnas de las regiones bisagra del anticuerpo. Un fragmento F(ab)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la region bisagra.
Un anticuerpo puede tener uno o mas sitios de union (para la combinacion con el antlgeno). Si hay mas de un sitio de union, los sitios de union pueden ser identicos entre si o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de union identicos, un anticuerpo de cadena o fragmento Fab tiene un sitio de union, mientras que un anticuerpo "biespeclfico" o "bifuncional" (diacuerpo) tiene dos sitios de union diferentes, en terminos de secuencia y/o reconocimiento del antlgeno/epltopo.
Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no esta asociado con componentes asociados naturalmente, incluyendo otros anticuerpos asociados naturalmente, que lo acompanan en su estado nativo, (2) esta libre de otras protelnas de la misma especie, (3) se expresa por una celula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza.
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una poblacion de anticuerpos homogenea en la que el anticuerpo monoclonal esta compuesto de aminoacidos (de origen natural y no de origen natural) que estan involucrados en la union selectiva de un antlgeno. Una poblacion de anticuerpos monoclonales es altamente especlfica, estando dirigida contra un unico sitio antigenico. El termino "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino tambien fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), de cadena sencilla (ScFv), mutantes de los mismos, protelnas de fusion que comprenden una porcion de anticuerpo, y cualquier otra configuracion modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antlgeno de la especificidad requerida y la capacidad de union a un antlgeno. No se pretende limitarse en lo que respecta a la fuente del anticuerpo o la manera en la que se hace (por ejemplo, por hybndoma, seleccion de fagos, expresion recombinante, animales transgenicos, etc.).
En la presente memoria, los anticuerpos "humanizados" se refieren a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) que son inmunoglobulinas quimericas especlficas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de union a antlgeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia minima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una region determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el raton, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad deseada, y la actividad biologica. En algunos casos, residuos de region marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los
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correspondientes residuos no humanos. Ademas, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en CDR importada o secuencias marco, pero se incluyen para perfeccionar y optimizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno, y tlpicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de immunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado optimamente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina o dominio (Fc), tlpicamente la de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden tener regiones Fc modificadas como se describe en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o mas CDRs (uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que estan alterados con respecto al anticuerpo original, que tambien se denomina una o mas CDR "derivadas de" una o mas CDR de anticuerpo original.
En la presente memoria, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha realizado utilizando cualquiera de las tecnicas para hacer anticuerpos humanos conocidos en la tecnica o descritos en este documento.
Esta definicion de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipeptido humano de cadena pesada o por lo menos un polipeptido de cadena ligera humana. Un ejemplo es un anticuerpo que comprende la cadena ligera de murina y los polipeptidos de cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando varias tecnicas conocidas en la tecnica. En una realizacion, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al, 1996, Nature Biotechnology, 14: 309 314; Sheets et al, 1998, PNAS, (EE.UU.) 95..: 6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol Biol, 227:381; Marks et al, 1991, J. Biol MoP, 222:581). Los anticuerpos humanos tambien se pueden hacer mediante la introduccion de inmunoglobulina humana loci en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogena han sido parcial o completamente inactivados. Este enfoque se describe en la patente de U.S. n° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016. Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antlgeno diana (por ejemplo, linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Vease, por ejemplo, Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al, 1991, J. Immunol., 147 (1): 86-95; y la patente U.S. N°. 5.750.373.
Un anticuerpo de cadena sencilla (scFc) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molecula monovalente mediante un enlazador sintetico que les permite ser hecho como una cadena de protelna unica (Bird et al Science, 242: 423-426 (1988) y Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85:5879-5883 (1988)).
Los diacuerpos son bivalentes, anticuerpos biespeclficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptldica, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de union a antlgeno.
"Anticuerpos quimericos" se refiere a aquellos anticuerpos en los que una porcion de cada una de las secuencias de aminoacidos de cadenas pesada y ligera es homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase particular correspondiente, mientras que el segmento restante de las cadenas es homologo a las correspondientes secuencias en otro. Tlpicamente, en estos anticuerpos quimericos, la region variable de cadenas ligeras y pesadas imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamlferos, mientras que las porciones constantes son homologas a las secuencias en anticuerpos derivados de otra. Una ventaja clara de dichas formas quimericas es que, por ejemplo, las regiones variables pueden convenientemente ser derivadas de fuentes actualmente conocidas, utilizando hibridomas facilmente disponibles o celulas B de organismos hospedadores no humanos en combinacion con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones celulares humanas. Mientras que la region variable tiene la ventaja de la facilidad de preparacion, y la especificidad no se ve afectada por su fuente, siendo la region constante humana, es menos probable que provoquen una respuesta inmunitaria de un sujeto humano, cuando los anticuerpos son inyectados lo que lo harla la region constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definicion no se limita a este ejemplo particular.
Una "region Fc funcional" posee al menos una funcion efectora de una region de secuencia nativa Fc. Los ejemplos de "funciones efectoras" incluyen union C1q: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); union al receptor Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulacion a la baja de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de celulas B; BCR), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la region Fc se combine con un dominio de union (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos conocidos en la tecnica para la evaluacion de tales funciones efectoras de anticuerpos.
Una "region Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de aminoacidos de una region Fc encontrada en la naturaleza. Una "region Fc variante" comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de la de una secuencia de la region Fc nativa en virtud de la modificacion de al menos un
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acido amino, sin embargo, conserva al menos una funcion efectora de region Fc de secuencia nativa. Preferiblemente, la region Fc variante tiene al menos una sustitucion de aminoacidos en comparacion con una region Fc de secuencia nativa o para la region Fc de un polipeptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoacidos, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoacidos en una region Fc de secuencia nativa o en la region Fc del polipeptido parental. La region Fc variante en este documento se poseen preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una region Fe de secuencia nativa y/o con una region Fc de un polipeptido parental, y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente 90% con la misma identidad de secuencia, mas preferiblemente al menos aproximadamente 95% con la misma identidad de secuencia.
Tal como se usa en el presente documento "anticuerpo dependiente de citotoxicidad mediadas por celulas" y "ADCC" se refieren a una celula de reaccion mediada en la que celulas citotoxicas no especlficas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, celulas asesinas naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente causan la lisis de la celula diana. Actividad ADCC de una molecula de interes se puede evaluar usando un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de U.S. N° 5.500.362 o 5.521.337. Celulas efectoras utiles para tales ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y celulas NK. Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al, 1998, PNAS (EE.UU.), 95:652-656.
Tal como se usa en este documento, "receptores Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Por otra parte, una FcR preferida es uno que se une un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de la FcyRl, FcyRll, y subclases FcyRlll, incluyendo variantes alelicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Receptores FcyRll incluyen FcyRllA (un "receptor activador") y FcyRllB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmicos de los mismos. FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol, 9: 457-92;. Capel et al., 1994, Immunomethods 4:25-34; y de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41. "FcR" tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de lgGs mateARNs al feto (Guyer et al, 1976, J. Immunol, 117:587; y Kim et al, 1994, J. Immunol, 24:249.).
"Citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de una diana en presencia del complemento. La ruta de activacion del complemento se inicia por la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) acomplejado con un antlgeno cognado. Para evaluar la activacion del complemento, un ensayo CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), puede que se realice.
Como se usa en el presente documento, los terminos "G1" y "anticuerpo G1" se utilizan indistintamente para referirse a un anticuerpo producido por los vectores de expresion con un numero de deposito ATCC-PTA-6867 y ATCC-PTA-6866. La secuencia de aminoacidos de las regiones variable de cadena pesada y de la cadena ligera se muestran en SEQ ID N°s. 1 y 2. Las porciones de CDR de anticuerpo G1 (incluyendo CDRs de Chothia y Kabat) se representan esquematicamente en la figura 5 de WO2007/054809. Los polinucleotidos que codifican regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera se muestran en SEQ ID N°s. 9 y 10. La caracterizacion de anticuerpo G1 se describe en los Ejemplos de WO2007/054809. G1 es un anticuerpo de bloqueo monoclonal humanizado (IgG2), que bloquea la union y la actividad del CGRP neuropeptido (A y B) y su efecto de vasodilatacion neurogenica causada por la liberacion de CGRP. G1 es un anticuerpo antagonista anti CGRP monoclonal IgG2Aa derivado del precursor de anticuerpo antagonista anti CGRP murino, denotado muMAb7E9 como se identifica en una pantalla usando celulas de bazo preparadas a partir de un raton inmunizado con CGRP humanas y ratas que fueron fusionadas con celulas de plasmacitoma de murino. G1 fue creado mediante el injerto de las CDR de muMAb 7E9 derivadas de cadena ligera y pesada en la secuencia de llnea germinal humana mas cercana seguida por la introduccion de al menos 1 mutacion en cada CDR y 2 mutaciones de marco de Vh. Dos mutaciones se introdujeron en el dominio Fc de G1 para suprimir la activacion del receptor humana FC15. G1 y muMab7E9 han demostrado reconocer el mismo epltopo.
En la presente memoria, los terminos "G2" y " anticuerpo G2" se utilizan indistintamente para referirse a un anticuerpo de monoclonal de raton CGRP anti rata como se describe en Wong et HC et al. Hibridoma 12:93-106 (1993). La secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera se muestran en SEQ ID N°s. 19 y 20. Los polinucleotidos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera se muestran en SEQ ID N°s. 27 y 28. Las porciones de CDR de anticuerpo G2 se proporcionan en la SEQ ID N°s. 21 a 26. G2 se ha demostrado que reconocen el mismo epltopo que G1.
Como se usa en este documento, union "inmunoespeclfica" de los anticuerpos se refiere a la interaccion de union especlfica del antlgeno que se produce entre el sitio de combinacion de antlgeno de un anticuerpo y el antlgeno especlfico reconocido por ese anticuerpo (es decir, el anticuerpo reacciona con la protelna en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reacciona de forma detectable con protelnas no relacionadas).
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Un epltopo que "se une especificamente" o "se une preferentemente" (usado de forma intercambiable en este documento) a un anticuerpo o un polipeptido es un termino bien entendido en la tecnica, y metodos para determinar tal union especlfica o preferencial tambien se conocen bien en la tecnica. Una molecula se dice que exhiben "union especlfica" o "union preferencial" si reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, con mayor duracion y/o con mayor afinidad con una celula particular o sustancia que lo hace con celulas o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une especificamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, mas facilmente, y/o con mayor duracion que se une a otras sustancias. Tambien se entiende por la lectura de esta definicion que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epltopo) que especificamente o preferentemente se une a una primera diana puede o puede no especificamente o preferentemente unirse a un segundo objetivo. Como tal, "union especlfica" o "union preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) union exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a union significa union preferencial.
Los terminos "polipeptido", "oligopeptido", "peptido" y "protelna" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a pollmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El pollmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados, y puede ser interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien abarcan un pollmero de aminoacidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervention; por ejemplo, formation de enlaces de disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulation o modification, tal como conjugation con un componente de etiquetado. Tambien se incluyen dentro de la definicion estan, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), as! como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Se entiende que, debido a que los polipeptidos de esta invention se basan en un anticuerpo, los polipeptidos pueden ocurrir como cadenas sencillas o cadenas asociadas.
"Polinucleotido", o "acido nucleico", como se usa indistintamente en este documento, se refiere a pollmeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos o bases modificadas, y/o sus analogos, o cualquier sustrato que se puede incorporar en un polimero mediante polimerasa de ADN o ARN. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y sus analogos. Si esta presente, la modificacion a la estructura de nucleotidos se puede impartir antes o despues del montaje del polimero. La secuencia de nucleotidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotidos. Un polinucleotido puede modificarse adicionalmente despues de la polimerizacion, como por conjugacion con un componente de etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "topes", sustitucion de uno o mas nucleotidos de origen natural con un analogo, modificaciones de internucleotidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosfoamidatos, cabamates, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteinas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos de senal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, acidos alfa anomericos nucleicos, etc.), asi como formas no modificadas del polinucleotido. Ademas, cualquiera de los grupos de hidroxilo normalmente presentes en los azucares puede ser reemplazado, por ejemplo, por grupos de fosfonato, grupos de fosfato, protegidos por grupos protectores estandar o activados para preparar enlaces adicionales para nucleotidos adicionales, o se pueden conjugar a soportes solidos. El terminal de OH 5' y 3' puede ser fosforilado o sustituido con aminas o fragmentos de grupos de tapado organico de entre 1 a 20 atomos de carbono. Otros hidroxilos tambien se pueden derivatizar a grupos protectores estandar. Los polinucleotidos tambien pueden contener formas analogas de azucares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, 2'--O- metilo, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos de azucar carbociclicos, a-azucares anomericos, azucares epimericos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azucares de piranosa, azucares de furanosa, sedoheptulosas, analogos aciclicos y analogos de nucleosidos abasicos tales como metil ribosido. Uno o mas vinculos de fosfodiester pueden ser sustituidos por grupos de union alteARNtivos. Estos grupos de union alteARNtivos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ('ditioato ")," (O)NR2 ("amidato") , P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en la que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un eter (-O-) vinculacion, arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleotido necesitan ser identicos. La description anterior se aplica a todos los polinucleotidos mencionados en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.
Una "region variable" de un anticuerpo se refiere a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo o la region variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea solo o en combinacion. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera se componen cada uno de las cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) tambien conocidas como regiones hypervanables. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FRs y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de anticuerpos de union de antigeno. Existen al menos dos tecnicas para determinar CDRs: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed, 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD.)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalograficos de complejos antigeno-anticuerpo (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec Biol. 273:927 948)). Como se usa en este documento, una CDR puede referirse a CDRs definidas por cualquiera de los enfoques o por una combination de ambos enfoques.
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Una "region constante" de un anticuerpo se refiere a la region constante de la cadena ligera del anticuerpo o la region constante de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea solo o en combinacion.
Como se usa en este documento, un "anticuerpo antagonista de anti CGRP" (intercambiable denominado "anticuerpo anti CGRP") se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a CGRP e inhibir la actividad biologica CGRP y/o vla(s) aguas abajo. Un anticuerpo del antagonista anti CGRP abarca anticuerpos que bloquean, antagonizan, inhiben o reducen (incluyendo significativamente) la actividad biologica CGRP. Para proposito de la presente invencion, sera expllcitamente entendido que el termino "anticuerpo antagonista anti CGRP" abarca todos los terminos previamente identificados, tltulos, y estados funcionales y las caracterlsticas por los sustancialmente se anulan, se disminuyen o se netralizan la misma CGRP, una actividad biologica CGRP, o las consecuencias de la actividad biologica, en algun grado significativo. Ejemplos de anticuerpos antagonistas anti CGRP se proporcionan en este documento.
En la presente memoria, "sustancialmente puro" se refiere a material que es de una pureza de al menos 50% (es decir, libre de contaminantes), de una pureza mas preferiblemente de al menos 90%, de una pureza mas preferiblemente de al menos 95%, de una pureza mas preferiblemente de al menos 98%, de una pureza mas preferiblemente de al menos 99%.
Una "celula huesped" incluye una celula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para el vector para la incorporacion de insertos de polinucleotidos. Las celulas huesped incluyen la progenie de una unica celula huesped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente identica (en morfologla o en complemento de ADN genomico) a la celula parental original debido a la mutacion natural, accidental o deliberada. Una celula huesped incluye celulas transfectadas in vivo con un polinucleotido de esta invencion.
Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados cllnicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invencion, los resultados cllnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a uno o mas de los siguientes: mejora o alivio de cualquier aspecto de dolor inflamatorio y/o slntoma de dolor inflamatorio. Para los fines de esta invencion, los resultados cllnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: incluyendo la disminucion de la gravedad, alivio de dolor y/o un slntoma asociado con el dolor inflamatorio.
Una "cantidad eficaz" de farmaco, compuesto, o composicion farmaceutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados cllnicos tales como el alivio o la reduccion de la sensacion de dolor. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o mas administraciones. Para los fines de esta invencion, una cantidad eficaz de drogas, un compuesto, una composicion farmaceutica, o es una cantidad suficiente para tratar, mejorar, reducir la intensidad de y/o prevenir el dolor inflamatorio o slntoma asociado con dolor inflamatorio. Como se entiende en el contexto cllnico, una cantidad eficaz de un farmaco, compuesto, o composicion farmaceutica puede o puede no conseguirse en conjunto con otro farmaco, compuesto, o composicion farmaceutica. Por lo tanto, una "cantidad eficaz" se puede considerar en el contexto de la administracion de uno o mas agentes terapeuticos, y un unico agente puede ser considerado para darse en una cantidad efectiva si, en conjunto con uno o mas otros agentes, un resultado deseable puede lograrse o se logra.
En una realizacion, "preparado para" en el presente documento significa que el medicamento esta en la forma de una unidad de dosificacion o similar empaquetado y/o marcado para uso en la administracion periferica.
"Reducir la incidencia" de dolor inflamatorio y/o un slntoma asociado con dolor inflamatorio significa cualquier reduccion de la gravedad (que puede incluir la reduccion de necesidad y/o cantidad de (por ejemplo, la exposicion a) otros farmacos y/o terapias utilizados generalmente para estas condiciones), la duracion, y/o frecuencia.
La "mejora" del dolor inflamatorio y/o un slntoma asociado con el dolor inflamatorio significa una disminucion o mejora de uno o mas slntomas de dolor inflamatoro y/o slntomas asociados con dolor inflamatorio en comparacion con la no administracion de un anticuerpo antagonista anti CGRP. La "amortiguacion" tambien incluye el acortamiento o la reduccion en la duracion de un slntoma.
El dolor inflamatorio de "paliacion" y/o un slntoma asociado con el dolor inflamatorio significa la disminucion de la extension de una o mas manifestaciones cllnicas no deseables de dolor inflamatorio en un individuo o poblacion de individuos tratados con un anticuerpo antagonista anti CGRP de acuerdo con la invencion.
Tal como se utiliza aqul, el "retraso" en el desarrollo de dolor inflamatorio significa aplazar, obstaculizar, enlentecer, retardar, estabilizar y/o posponer la progresion del dolor inflamatorio y/o un slntoma asociado con el dolor inflamatorio. Este retraso puede ser de diferentes longitudes de tiempo, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o individuos que se esta tratando. Como es evidente para un experto en la tecnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar prevencion, en que el individuo no desarrolla dolor inflamatorio. Un metodo que "retrasa" el desarrollo del slntoma es un metodo que reduce la probabilidad de desarrollar el slntoma en un marco de tiempo dado y/o reduce la extension de slntomas en un marco de tiempo dado, en comparacion con el no
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uso del metodo. Tales comparaciones se basan tlpicamente en estudios cllnicos, usando un numero de sujetos estadlsticamente significativo.
Una "muestra biologica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un individuo y se puede utilizar en un ensayo de diagnostico o de control. La definicion abarca sangre y otras muestras llquidas de origen biologico, muestras de tejido solido tal como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o celulas derivadas de los mismos, y la progenie de la misma. La definicion tambien incluye muestras que han sido manipulados de cualquier forma despues de su obtencion, como por tratamiento con reactivos, solubilizacion, o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como protelnas o polinucleotidos, o incrustacion en una matriz solida o semi solida para seccionar propositos. El termino "muestra biologica" abarca una muestra cllnica, y tambien incluye celulas en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biologico, y muestras de tejidos.
Un "individuo" o "sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamlfero, mas preferiblemente un humano. Los mamlferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja (como vacas), animales de deporte, animales domesticos (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.
En la presente memoria, "vector" se refiere a una construccion, que es capaz de entregar, y expresa preferiblemente, uno o mas gen(es) o secuencia(s) de interes en una celula huesped.
Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresion de ADN desnudo o ARN, plasmido, vectores de cosmido o fago, ADN o vectores de expresion de ARN asociados con los agentes cationicos de condensacion, ADN o vectores de expresion de ARN encapsulados en liposomas y determinadas celulas eucariotas, tales como celulas productoras.
Como se usa en este documento, "secuencia de expresion de control" significa una secuencia de acido nucleico que dirige la transcripcion de un acido nucleico. Una secuencia de control de expresion puede ser un promotor, tal como un constitutivo o un promotor inducible, o un promotor. La secuencia de control de expresion esta unida operativamente a la secuencia de acido nucleico que se transcribe.
Como se usa en este documento, "vehlculo farmaceuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combine con un ingrediente activo, permite que el ingrediente conserve actividad biologica y no es reactivo con el sistema inmune del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los vehlculos farmaceuticos estandar tales como solucion salina tamponada de fosfato, agua, emulsiones tales como emulsion de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para aerosol o administracion parenteral son solucion salina tamponada con fosfato o (0,9%) solucion salina normal. Las composiciones que comprenden tales vehlculos se formulan por metodos convencionales bien conocidos (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, A. Gennaro, ed Remington, Mack Publishing Co. 20, Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing, 2000).
El termino "administrado perifericamente" como se usa aqul se refiere a la ruta por la que una sustancia, medicamento y/o anticuerpo antagonista anti CGRP se administra, en particular, significa que no se administra centralmente, no medularmente, no por via intratecal, no se administra directamente en el sistema nervioso central. El termino se refiere a vlas de administracion distintas de las inmediatamente anteriores, e incluye rutas que sean orales, sublinguales, bucales, topicas, rectales, por inhalacion, transdermales, subcutaneas, intravenosas, intraarteriales, intramusculares, intracardlacas, intraoseas, intradermicas, intraperitoneales, transmucosales, vaginales, intravltreas, intraarticulares, periarticulares, locales o epicutaneas.
El termino "actua perifericamente", tal como se usa aqul, se refiere al sitio de accion de una sustancia, compuesto, medicamento y/o anticuerpo antagonista anti CGRP, estando dicho sitio dentro del sistema nervioso periferico en comparacion con el sistema nervioso central, dicho compuesto, medicamento y/o anticuerpo antagonista anti CGRP, estando limitados por incapacidad de atravesar la barrera al SNC y al cerebro cuando se administra perifericamente.
El termino "penetracion central" se refiere a la capacidad de una sustancia para cruzar la barrera para el cerebro o sistema nervioso central.
El termino "Koff", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociacion de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antlgeno.
El termino "Kd", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociacion de una interaction anticuerpo-antlgeno.
La presente invention esta dirigida a un medicamento para la prevention y/o tratamiento del dolor y/o slntomas de dolor inflamatorio y metodos para la prevencion y/o tratamiento del dolor inflamatori y/o slntomas de dolor inflamatorio en un individuo.
En un primer aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo antagonista anti CGRP para uso como un
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medicamento para la prevencion o el tratamiento de dolor artrltico, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP no se administra por via intratecal.
Se describe el uso de un anticuerpo antagonista anti CGRP para la fabricacion de un medicamento para mejorar, controlar, reducir la incidencia de, o retrasar el desarrollo o la progresion del dolor inflamatorio y/o los slntomas de dolor inflamatorio, en el que el medicamento se prepara para la administracion periferica o en el que el medicamento se administra perifericamente. Nosotros tambien describimos un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso en mejorar, controlar, reducir la incidencia de, o retrasar el desarrollo o la progresion del dolor inflamatorio y/o los slntomas de dolor inflamatorio, en el que el anticuerpo se prepara para la administracion periferica o en el que el anticuerpo se administra perifericamente.
De acuerdo con una forma de realizacion preferida de la presente invention, el individuo es preferiblemente un mamlfero, por ejemplo un animal de companla tal como un caballo, un gato o perro o un animal de granja tales como ovejas, vaca o cerdo. Mas preferiblemente el mamlfero es un humano.
De acuerdo con una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el medicamento y/o anticuerpo antagonista anti CGRP se prepara para administracion oral, sublingual, bucal, topica, rectal, inhalation, transdermica, subcutanea, intravenosa, intra arterial, intramuscular, intracardlaca, intraosea, intradermica, intraperitoneal, transrnucosal, vaginal, intravltrea, intraarticular, peri articular, la administracion local o epicutanea.
Segun una realizacion preferida adicional, el medicamento se esta preparado para la administracion periferica antes y/o durante y/o despues del desarrollo del dolor inflamatorio.
En una realizacion, el anticuerpo antagonista anti CGRP actua perifericamente en la administracion. En una realizacion, el anticuerpo antagonista anti CGRP no se administra central, medular o intratecalmente.
Segun la presente invencion, el dolor inflamatorio es el dolor de artritis, que puede ser dolor de la artritis reumatoide o el dolor de la osteoartritis. Preferiblemente, el dolor inflamatorio es dolor de la osteoartritis.
Los usos y metodos de la invencion pueden ser para la mejora de la funcion flsica en un individuo que tiene osteoartritis y/o la mejora de la rigidez en un individuo que tiene osteoartritis.
El diagnostico o la evaluation de dolor de la artritis reumatoide esta bien establecida en la tecnica. La evaluation puede ser realizada sobre la base de medidas conocidas en la tecnica, tales como la caracterizacion del dolor del paciente usando diversas escalas de dolor. Vease, por ejemplo, Katz et al, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2): 23152; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):23955. Tambien hay escalas que se utilizan comunmente para medir el estado de la enfermedad, como el Colegio Americano de Reumatologla (ACR) (Felson, et al, Arthritis and Rheumatism (1993) 36(6):729-740), el Cuestionario de Evaluacion de la Salud (HAQ) (Fries, et al, (1982) J. Rheumatol 9: 789-793), la Escala de Paulus (Paulus, et al, Artritis and Rheumatism (1990) 33: 477-484), y la Escala de la Medida del Impacto de Artritis (AIMS) (Meenam, et al, Arthritis and Rheumatism (1982) 25: 1048-1053).
En una realizacion, mejorar, controlar, reducir la incidencia de, o retrasar el desarrollo o la progresion del dolor y/o los slntomas de dolor de artritis reumatoide La artritis reumatoide es medida por uno o mas de ACR, HAQ y AIMS.
El diagnostico o evaluacion de dolor de la osteoartritis tambien esta bien establecido en la tecnica. La evaluacion puede realizarse basandose en las medidas conocidas en la tecnica, tales como la caracterizacion de pacientes del dolor utilizando diversas escalas de dolor. Vease, por ejemplo, Katz et al, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3): 23955. Por ejemplo, WOMAC Ambulation Pain Scale (incluyendo dolor, rigidez y funcion flsica) y 100 mm de Visual Analogue Scale (VAS) se puede emplear para evaluar el dolor y evaluar la respuesta al tratamiento.
En una realizacion, mejorar, controlar, reducir la incidencia de, o retrasar el desarrollo o la progresion del dolor de osteoartritis y/o los slntomas de dolor de osteoartritis se mide por una o mas de Escala de Dolor de Ambulation WOMAC y VAS.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion del anticuerpo antagonista anti CGRP se une a CGRP, se une mas preferiblemente a CGRP e inhibe la capacidad de CGRP para unirse al receptor de CGRP. Preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP se une tanto a CGRP humanos y roedores, preferiblemente CGRP humano y de rata. Mas preferiblemente, el anticuerpo se une a CGRP humano, mas preferiblemente el anticuerpo antagonista anti CGRP se une a a-CGRP humano o a-CGRP humano y/o p-CGRP. Mas preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP es un anticuerpo que exhibe una cualquiera o mas de las siguientes caracterlsticas funcionales: (a) se une a CGRP; (b) bloques de CGRP de la union a su receptor; (c) bloquea o disminuye la activacion del receptor de CGRP, incluyendo la activacion de cAMP; (d) inhibe, bloquea, suprime o reduce la actividad biologica CGRP, incluyendo las vlas aguas abajo mediadas por la serialization de CGRP, tales como la union al receptor y/o provocation de una respuesta celular a CGRP; (e) impide, aminora o trata a cualquier aspecto del dolor inflamatorio; (f) aumenta el aclaramiento del CGRP; e (g) inhibe (reduce), la slntesis, production o
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liberacion de CGRP. Es conocido que los anticuerpos de la invencion, incluyendo G1 y G2, se unen a CGRP y eliminan su disponibilidad biologica, por ejemplo, en el suero evitando de este modo el acceso de CGRP a sus receptores y las respuestas celulares aguas abajo y los efectos biologicos de CGRP, tales como los reflejos y la vasodilatacion.
En una realizacion preferida adicional de la invencion el anticuerpo antagonista anti CGRP se une a un fragmento de CGRP, mas preferiblemente a un fragmento de CGRP, as! como a la CGRP de longitud completa. Preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP se une a la region C-terminal o fragmento de CRGP. El terminal de la region C o un fragmento de CRGP comprende preferiblemente los aminoacidos 19-37 o 25-37 o 29-37 o como alternativa 3037, mas alternativamente 31-37 de CGRP. En una realizacion adicional, la region terminal C o fragmento de CRGP comprende preferiblemente los aminoacidos 32-37 mas preferiblemente 33 a 37 de CGRP. Preferiblemente, el CGRP es o bien a-CGRP o a-CGRP, aun mas preferiblemente humanos o roedores, mas preferiblemente un ser humano o de rata, mas preferiblemente humano, ademas preferiblemente a-CGRP o a-CGRP humanos, lo mas preferiblemente a-CGRP humano.
En una realizacion preferida adicional de la invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP se une especlficamente a la secuencia de aminoacidos GSKAF. Preferiblemente, la secuencia GSKAF de CGRP es el epltopo al que se une el anticuerpo antagonista de anti CGRP, preferiblemente a la posicion 33 a 37, lo mas preferiblemente la secuencia es GXXXF donde X puede ser cualquier aminoacido, preferiblemente en las posiciones 33 a 37 de CGRP, los extremos definidos por los aminoacidos G33 y F37 de CGRP.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un anticuerpo antagonista anti CGRP que se une especlficamente a un epltopo definido por los aminoacidos G33 a F37 de CGRP. El anticuerpo antagonista anti CGRP puede unirse especlficamente al epltopo definido por la secuencia de aminoacidos GSKAF. En una realizacion, la presente invencion proporciona el uso de un anticuerpo tal en los usos y los metodos definidos en los diversos aspectos de la presente invencion.
En una realizacion, el anticuerpo antagonista anti CGRP inhibe o impide la activacion del receptor de CGRP. Preferiblemente, el anticuerpo anti CGRP tiene un lC5O de entre 0,0001 (0,1 nM) y 500 pM. En algunas realizaciones preferidas, el IC50 esta entre 0,0001 pM, y es, o es aproximadamente, cualquiera de 250 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM, 1 pM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, o 0,5 nM como se mide en un ensayo de union in vitro. En algunas formas de realizacion preferidas adicionales, IC50 es inferior a cualquiera de 500 pM, o 100 pM, o 50 pM, tal como se mide en un ensayo de union in vitro. En una realizacion adicional mas preferida IC50 es 1,2 nM o 31 nM.
En una realizacion preferida adicional, el anticuerpo antagonista anti CGRP que se utiliza es capaz de competir con un anticuerpo que se ha descrito anteriormente para la union de CGRP o a un fragmento de CGRP, o a un fragmento de CGRP as! como el CGRP de longitud completa, preferiblemente a la region C-terminal o fragmento de CRGP, preferiblemente la region C-terminal o fragmento de CRGP comprende los aminoacidos 19-37 o 25-37 o 2937 o como alternativa 30-37, mas alternativamente 31-37 de CGRP. En una realizacion adicional, la region C- terminal o fragmento de CRGP comprende preferiblemente los aminoacidos 32-37, mas preferiblemente de 33 a 37 de CGRP.
En una realizacion preferida adicional, la porcion de anticuerpo antagonista anti CGRP o antlgeno de union del mismo, como se usa en la invencion es capaz de competir con un anticuerpo antagonista anti CGRP aqul anteriormente descrito, en particular, G1 o G2 como aqul se describen, por:
(a) la union de CGRP o un fragmento de CGRP, o un fragmento de CGRP as! como el CGRP de longitud completa, preferiblemente la region C-terminal o fragmento de CRGP, preferiblemente la region terminal C o fragmento de CRGP que comprende los aminoacidos 19-37 o 25-37 o 29-37 o, alternativamente, 30-37, mas alternativamente 31-37, preferiblemente aminoacidos 32-37, mas preferiblemente 33 a 37 de CGRP, preferiblemente el CGRP es alfa o beta, preferiblemente beta, mas preferiblemente roedor o humano, mas preferiblemente un ser humano,
(b) la union de la secuencia de epltopo GSKAF, preferiblemente en la posicion de aminoacidos 33 a 37 de CGRP como se define en (a), mas preferiblemente a la secuencia GXXXF, donde X es cualquier aminoacido, preferiblemente GXXXF en la posicion de aminoacidos 33 a 37 de CGRP como se define en (a),
(c) la union como se describe en (a) o (b) con sustancialmente la misma Kd y/o sustancialmente la misma Koff y/o
(d) la union a CGRP e inhibir/antagonizar la actividad biologica CGRP y/o vla(s) aguas abajo, preferiblemente el CGRP es alfa o beta, preferentemente beta, mas preferentemente de roedores o humanos, mas preferiblemente de humanos.
El anticuerpo antagonista anti CGRP se une preferentemente a CGRP, region de CGRP o un fragmento de CGRP con una afinidad de union (Kd) de entre 0,000001 pM (0,001 nM) o 0,00001 pM (0,01 nM) a 500 pM. En algunas realizaciones preferidas, la afinidad de union (Kd) es de entre 0,000001 pM o 0,00001 pM y, o es de aproximadamente, cualquiera de 250 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM, 1 pM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 15
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nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 0,05 nM, o 0,01 nM, 0,005 RIM, 0,001 nM, segun se mide en un ensayo de union in vitro. En algunas formas de realizacion preferidas adicionales, la afinidad de union (Kd) es inferior a cualquiera de 500 pM, o 100 pM, 50 pM, o 10 pM, 5 pM, 1 pM, tal como se mide en un ensayo de union in vitro. En una realizacion, la union de afinidad mas preferida (Kd) es de 0,04 nM o 16 nM.
El anticuerpo antagonista anti CGRP tal como se utiliza en la presente invention puede ser seleccionado del grupo de: anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv, etc.), anticuerpos quimericos, anticuerpos biespeclficos, anticuerpos heteroconjugados, de cadena sencilla (scFv), anticuerpos mutantes de la misma, protelnas de fusion que comprende una portion de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuration modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antlgeno de la especificidad requerida, incluyendo variantes de anticuerpos de glicosilacion, variantes de secuencia aminoacldica de anticuerpos, y anticuerpos modificados covalentemente. El anticuerpo antagonista anti CGRP puede ser murino, de rata, humano, o de cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quimericos o humanizados). En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti CGRP puede ser humanizado, pero es mas preferiblemente un ser humano. Preferiblemente se alsla el anticuerpo antagonista anti CGRP, aun mas preferiblemente es sustancialmente pura. Cuando el anticuerpo antagonista anti CGRP es un fragmento de anticuerpo el fragmento retiene preferiblemente las caracterlsticas funcionales del anticuerpo original es decir, la actividad antagonista y/o de union de CGRP como se describe en las caracterlsticas funcionales descritas anteriormente.
Los ejemplos de anticuerpos antagonistas anti CGRP son conocidos en la tecnica. Por lo tanto, segun una
realizacion preferida de la presente invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP como se utiliza en la presente
invencion es preferiblemente un anticuerpo anti CGRP, como se describe en general o especlficamente en cualquiera de (i) W02007/054809, (ii) W02007/076336, (iii) Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565-73, 1995, (iv) Sigma (Missouri, EE.Uu.), numero de producto C7113 (clon#4901), (v) Plourde et al, peptidos 14:1225-1229, 1993 o que comprende o consiste en:
(a) un fragmento de dicho anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv, etc.),
(b) una cadena ligera de dicho anticuerpo,
(c) una cadena pesada de dicho anticuerpo,
(d) uno o mas de la region variable a partir de una cadena ligera y/o una cadena pesada de dicho anticuerpo,
(e) una o mas CDR (s) (uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR) de dicho anticuerpo,
(f) CDR H3 de la cadena pesada de dicho anticuerpo,
(g) CDR L3 de la cadena ligera de dicho anticuerpo,
(h) tres CDR de la cadena ligera de dicho anticuerpo,
(i) tres CDR de la cadena pesada de dicho anticuerpo,
j) tres CDR de la cadena ligera y tres CDR de la cadena pesada, de dicho anticuerpo,
k) uno cualquiera o mas de (a) a traves de (j).
De acuerdo con una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP es anticuerpo G2 o anticuerpo G1. De acuerdo con una forma de realizacion mas preferida de la presente el anticuerpo antagonista anti CGRP que se utiliza es el anticuerpo anti CGRP G1 como se da a conocer especlficamente en la solicitud de patente WO2007/054809, o que comprende sus variantes de muestra en la Tabla 6 de WO2007/054809, que tambien incluye anticuerpos funcionalmente equivalentes a G1, es decir, que comprende sustituciones conservadoras de residuos de aminoacidos o una o mas deleciones o adiciones de aminoacidos que no afectan de manera significativa sus caracterlsticas funcionales, por ejemplo, union de CRGP o actividad antagonista y variantes y los cuales han mejorado o disminuido la actividad y/o vinculante. En la presente memoria, los terminos "G1" y "anticuerpo G1" se utilizan indistintamente para referirse a un anticuerpo producido por los vectores de expresion con un numero de deposito de ATCC PTA-6867 y ATCC PTA-6866 como se describe en la solicitud WO2007/054809.
Tabla 6 del WO2007/054809 se expone a continuation, y se refirio a este documento como Tabla 3.
La Tabla 3 muestra las indicaciones geograficas y las variantes de anticuerpo G1 con sus afinidades tanto en a- CGRP de rata y a-CGRP humano. Todas las sustituciones de aminoacidos de las variantes mostradas en la Tabla 3 se describen con respecto a la secuencia de G1. Las afinidades de union de fragmentos Fab se determinaron mediante Biacore haciendelos fluir a traves de CGRPs en un chip de SA.
Tabla 3. Secuencias de aminoacidos y de afinidad de enlace de datos para variantes de anticuerpo G1 determinadas a 37°C por Biacore.
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Clon
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L2
H2
HC-FW3
a-rat
koff
a-rat
G1
M1
M2
M3""
m4"
M5“
M6~
M7
M8""
M9“
mTT
M12
mt3
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mT5
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M20
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L99A
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L99A
A100V
L99A
A100Y
L99N
L99N
A100C
L99N
A100G
L99N
A100Y
L99S
A100S
L99S
A100T
L99S
A100V
L99T
A100G
L99T
A100K
L99T
A100P
L99T
A100S
L99T
A100V
L99V
A100G
L99V
A100G
L99R
A100L
L99S
L99T
L99T
A100V
L99T
A100V
3.99x10'4 1,10x10-3 2.6x10-3
2.0x10-3
1.52x10-3
7.35x10-4
7.84x10'4
9.18x10-4
7.45x10-4
n"d
1.51x10-3 4.83x10-3 1.94x10-3 1.84x10-3 n"d
1.15x10-3
9.96x10-4
2.06x10-3
1.22x10-3
n"d
1.44x10-3
6.95x10'4
1.10x10-3
7.99x10-4
1.04x10-3
(nM)
2.57
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84.4
40.8
43.6
51.0
41.4 n.d.
83.9
268.3
107.8 102.2 n.d.
63.9
55.3
114.4
67.8 n.d.
80.0
15.2
61.1
44.4
57.8
M25
R28N
L99T
A100V
1.4x10
-3
76
M26
R28N
A57G
L99T
A100V
9.24x10
-4
51.3
M27
R28N
T30A
L99T
A100V
3.41x10
-3
189.4
M28
M29
M30
R28N
T30D
R28N
T30G
R28N
T30G
E54R
A57N
E54K
A57E
L99T
A100V
L99T
A100V
L99T
A100V
1.25x10
3.59x10
6.38x10
-3
69.4
-3
199.4
-3
354.4
M31
R28N
T30G
E54K L99T A57G A100V
3.61x10
-3
200.6
Koff
a-humano
K (1/S) 5
3.63 x10-5 1.73x1Q-4 3.1x10-4
2.1x10"4
6.95x10"5
3.22x10"5
1.33x10'4
2.43x10-4
9.20x10"5
1.00x10"5
1.73x10"4
2.83x10-4
1.01x10"4
1.86x10-4
1.00x10"3
1.58x10"5
1.65x10"4
1.85x10"4
7.03x10"5
1.00x10"5
1.36x10-4
1.42x10'4
1.16x10~4
1.30x10"4
1.48x10-4
1.4x10-4
1.48x10-4
3.57x10-4
9.96X10"5
3.80x10-4
5.90x10-4
3.47x10-
4
5
10
15
20
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30
35
40
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Clon
L1
L2
H2
HC-FW3
a-rat koff (1s)
13"
a-rat Koff (nM)
a-humano Kp (1/S)
M32
R28N
T30G
E54K
A57H
L99T
A100V
2.96x10
164.4
13“
2.71x10- 4
TT
M33
R28N
T30G
E54K
A57N
S58G
L99T
A100V
9.22x10
512.2
7.50x10
M34
R28N
T30G
E54K
A57N
S58T
L99T
A100V
2.17x10-
3
120.6
6.46x10-
4
M35
R28N
T30G
E54K
A57S
L99T
A100V
3.99x10-
3
221.7
3.39x10-
4
M36
R28N
T30R
L99T
A100V
4.79x10-
3
266.1
2.39x10-
4
M37
R28N
T30S
A57G
L99T
A100V
1.45x10-
3
80.6
2.26x10-
4
M38
R28N
T30W
L99T
A100V
5.llxlO-3
283.9
2.18x10-
4
M39
R28N
G50A
L56T
A57N
S58Y
L99T
A100V
9.95x10-
3
552.8
4.25x10-
4
M40
R28N
G50A
L56T
E54K
A57L
L99T
A100V
0.36
20000.
0
1.28x10-
3
M41
R28N
G50A
L56T
E54K
A57N
E64D
L99T
A100V
4.53x10-
3
2517
210x10-
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M42
R28N
G50A
L56T
E54K
A57N
H61F
L99T
A100V
7.52x10-
3
417.8
4.17x10-
4
M43
R28N
G50A
L56T
E54K
A57N
S58C
L99T
A100V
4.53x10-
3
251.7
2.63x10-
4
M44
R28N
G50A
L56T
E54K
A57N
S58E
L99T
A100V
6.13x10-
3
443
2.10xlO-
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73“
14“
M45
R28N
G50A
L56T
E54K
A57N
S58E
E64D
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A100V
5.58x10
1 259
2.11x10
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14“
M46
R28N
G50A
L56T
E54K
A57N
S58E
H61F
L99T
A100V
2.94x10
163.3
5.39x10
13“
14“
M47
R28N
G50A
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E54K
A57N
S58G
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A100V
8.23x10
457.2
3.32x10
14“
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R28N
G50A
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E54K
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S58L
L99T
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0.0343
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R28N
G50A
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A57N
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H61F
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822.2
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13“
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G50A
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E54K
A57R
L99T
A100V
5.30x10
294.4
4.06x10
13“
14-
M51
R28N
L561
E54K
A57G
L99T
A100V
1.18x10
65.6
1.31x10
13-
14“
M52
R28N
L561
E54K
A57N
S58A
L99T
A100V
2.29x10
127.2
2.81x10
13“
1-4“
M53
R28N
L56l
E54K
A57N
S58G
L99T
A100V
1.91x10
106.1
3.74x10
10
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40
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Clon
L1 L2 H2 HC-FW3 a-rat koff (1fs) a-rat Koff (nM) a-humano Kp(1/S) a-humano Kd (nM)
M54
R28N T30A G5OA E54K A57N S58P L99T A100V 2.16x10'J 120.0 1.79x10-4 11.19
M55
R28N T30A L56S E54K A57N S58E E64D L99T A100V 5.85x10-3 325.0 4.78x10-4 2.99
M56
R28N T30D L56S E54K A57N H61F L99T A100V 9.3500-3 519.4 4.79x10-4 2.99
M57
R28N T30D L56S E54K A57N S58E L99T A100V 0.0104 1,200 3.22x10-4 3.08
M58
R28N T30D L56S E54K A57N S58I H61F L99T A100V No vinculante n.d. 1.95x10-3 12.19
M59
R28N T30D L56S E54K A57N S58N H61F L99T A100V 0.0123 683.3 5.24x10-4 3.28
M60
R28N T30D L56S E54K A57N S58R H61F L99T A100V 0.0272 1511.1 9.llxlO- 4 5.69
M61
R28N T30G A51H E540 A57N H61F L99T A100V 5.21x10-3 289.4 4.59x10-4 2.87
M62
R28N T30G A51H L56T E54K A57N S58E L99T A100V 5.75x10"3 242 5.57x10-4 5.86
M63
R28N T303 G50A E54K A57N S58T L99T A100V 2.65x10"3 147.2 1.50x10-3 9.38
M64
R28N T303 G50A E54K A57N S58V L99T A100V 0.0234 1300.0 1.32x10-3 8.25
M65
R28N T30G G50A L561 E54K A57C L99T A100V 4.07x10-3 226.1 8.03x10-4 5.02
M66
R28N T30G L561 E54K A57E L99T A100V 5.11x10-3 283.9 5.20x10-4 3.25
M67
R28N T30G L561 E54K A57F L99T A100V 1.71x10"3 95.0 8.20x10-4 5.13
M68
R28N T30G L561 E54K A57N S58D E64D L99T A100V 6.76x10"3 375.6 4.28x10-4 2.68
M69
R28N T30G L561 E54K A57N S58E L99T A100V 1.81x10-3 100.6 7.33x10-4 4.58
M70
R28N T30G L561 E54K A57S L99T A100V 6.07x10"3 337.2 5.59x10-4 3.49
M71
R28N T30G L561 E54K A57Y L99T A100V 2.12x10-3 117.8 1.28x10-3 8.00
M72
R28N T30G L56S E54K L99T A100V 3.95x10-3 219.4 4.OOx10- 4 2.50
M73
R28N T30G L56S E54K A57N S58Y E64D L99T A100V 3.00x10-3 166.7 2.55x10-4 1.59
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Clon
L1 L2 H2 HC-FW3 a-rat koff rnsi a-rat Koff (nM) a-humano Kp (1/S) a-humano Kd (nM)
M74
R28N T30G L56S E54K A57S L99T A100V 6.03x10-3 335.0 5.97x10-4 3.73
M75
R28N T30G L56S E54K A57V L99T A100V 1.87x10-2 1038.9 1.16x10-3 7.25
M76
R28N T30S G50A L56T A57G L99T A100V 1.16x10-3 64.4 3.6400-4 2.28
M77
R28N T30S G50A L56T E54K A57D L99T A100V 0.0143 794.4 4.77x10-4 2.98
M78
R28N T30S G50A L56T E54K A57N S58T L99T A100V 0.167 9277.8 1.31x10- 3 8.19
M79
R28N T30S G50A L56T E54K A57P L99T A100V 0.19 10555. 6 1.29x10- 3 8.06
M8O
R28N T30S L561 E54K A57N S58V L99T A100V 0.0993 5516.7 2.09x10-3 13.06
M81
R28N T30S L56S E54K A57N S58E L99T A100V 4.29x10-3 238.3 4.90x10-4 3.06
M82
R28N T30V A51H L56T A57N L99T A100V 6.99x10-3 388.3 8.77x10-4 5.48
M83
R28N T30V A51H L56T E54K A57N S58M H61F L99T A100V No vinculante n.d. 9.33x10-4 5.83
M84
R28N T30V A51H L56T E54N A57N 1991 A100V 1.7600-2 977.8 1.0800 3 6.75
De acuerdo con una realizacion adicional de la presente invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende o consiste en un polipeptido seleccionado de: (a) anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de W02007/054809; (b) un fragmento o una region de anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809; (c) una cadena ligera del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 del WO2007/054809; (d) una cadena pesada de anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809 (e) una o mas region(es) variable(s) a partir de una cadena ligera y/o una cadena pesada de anticuerpo G1 o sus variantes se muestra en la Tabla 6 de WO2007/054809; (f) una o mas CDR(s) (uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDRs) del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809; (g) CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809: (h) CDR L3 de la cadena ligera del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809; (i) tres CDR de la cadena ligera del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809; (j) tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809; (k) tres GDRs de la cadena ligera y/o tres CDRs de la cadena pesada, de anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809; y (i) un anticuerpo que comprende uno cualquiera de (b) a (k). La invencion tambien proporciona polipeptidos que comprenden uno cualquiera o mas de los anteriores. En algunas realizaciones, la al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis CDR(s) son al menos aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identica a por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDRs de G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809.
La determinacion de regiones de CDR esta dentro de la capacidad de la persona experta. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combination de la Kabat y Chothia CDR. En algunas realizaciones, las CDR son las CDR de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las Chothia de CDR.
El anticuerpo antagonista anti CGRP preferiblemente comprende o consiste en un fragmento o una region de anticuerpo G1 (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv, etc.) o sus variantes mostradas en la Tabla 6 de WO2007/054809. Preferiblemente dicho fragmento o region tiene las caracterlsticas funcionales de un anticuerpo antagonista anti CGRP por ejemplo actividad de union CGRP y/o actividad antagonista y comprende o consiste en una o mas de una cadena ligera, la cadena pesada, fragmento que contiene una o mas regiones variables de una cadena ligera y/o una cadena pesada, o una o mas CDR de una cadena ligera y/o pesada de una cadena del anticuerpo G1.
Segun una realizacion preferida adicional de la invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende una
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region variable de cadena ligera, LCVR, que comprende un peptido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 28-32 y/o una region variable de cadena pesada, HCVR, que comprende un peptido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 34-38 de la solicitud de patente WO2007/076336.
Mas preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende un polipeptido LCVR de una SEQ ID NO como se muestra en la Tabla 1 de la solicitud de patente WO2007/076336 y comprende ademas un polipeptido HCVR de un SED ID NO como se muestra en la Tabla 1 de una solicitud de patente WO2007/076336.
De acuerdo con una realizacion adicional de la invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP utilizado comprende una cadena ligera CDR (CDRL) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 8-13 y/o una cadena pesada CDR (CDRH) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 14-22 de la solicitud de patente WO2007/076336.
Los metodos para preparar y aislar los anticuerpos antagonistas anti CGRP de la solicitud WO2007/076336 y datos que demuestran la union del CGRP y la caracterizacion antagonista de la misma se describen en la aplicacion WO2007/076336.
Preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso en la presente invencion comprende un dominio VH que es al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 25 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% identicas en secuencia de aminoacidos a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 19 que se muestra en este documento.
Preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende un dominio VL que es al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% identicas en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20 que se presenta en este documento.
El anticuerpo antagonista anti CGRP comprende preferiblemente un dominio VH y un dominio VL que son de al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% identicas en secuencia de aminoacidos a la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, o SEQ ID NO: 19 y 20 que se muestra en este documento, respectivamente.
Preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende un dominio VH que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: I y un dominio VL que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 2 que se presenta en este documento.
Alternativamente, el anticuerpo antagonista anti CGRP preferiblemente comprende un dominio VH que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 19 y un dominio VL que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 20 presentada en este documento.
El anticuerpo antagonista anti CGRP comprende preferiblemente al menos un CDR seleccionado entre el grupo que consiste en: (a). CDR H1 como se expone en SeQ ID NO: 3 o 21; (b). CDR H2 como se expone en SEQ ID NO: 4 o 22: (c). CDR H3 como se expone en SEQ ID NO: 5 o 23; (d). CdR L1 como se expone en SEQ ID NO: 6 o 24; (e) CDR L2 como se expone en SEQ ID NO: 7 o 25; (f). CdR L3 como se expone en SEQ ID NO: 8 o 26; y (g). Variantes de CDR L1, CDR L2 y CDR H2, como se muestra en la Tabla 6 del WO2007/054809.
De acuerdo con una forma de realizacion preferida de la presente invencion, la cadena pesada de la region constante de anticuerpo antagonista anti CGRP puede ser de cualquier tipo de region constante, tales como IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE; y cualesquiera isotipos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4.
Mas preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende una cadena pesada producida por el vector de expresion con el n° de Acceso ATCC PTA-6867. Ademas, preferiblemente el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende una cadena ligera producida por el vector de expresion con el n° de Acceso ATCC PTA-6866. Ademas, preferiblemente el anticuerpo antagonista anti CGRP es producido por los vectores de expresion con acceso ATCC N{s. PTA-6867 y PTA-6866.
Preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso en la presente invencion es un anticuerpo G1 o anticuerpo G2 que se define aqul.
Segun una realizacion adicional de la invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende una region constante modificada como se describe por ejemplo en WO2007/054809. Preferiblemente, la region constante modificada es inmunologicamente inerte, incluyendo parcialmente inmunologicamente inerte, de manera que no se activa la lisis mediada por complemento, no estimula la citotoxicidad mediada por celulas dependientes de
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anticuerpos (ADCC), no se activa la microglia. Preferiblemente, la region constante modificada se reduce en una o mas de estas actividades. Lo mas preferiblemente, la region constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; La solicitud PCT n° PCT/GB99/01441; y/o solicitud de patente del Reino Unido n° 9809951.8. De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP comprende una region constante de cadena pesada humana IgG2 que comprende las siguientes mutaciones: A330, P331 a S330, S331 (numeracion de aminoacidos con referencia a la secuencia de tipo salvaje IgG2). Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624.
Los metodos de preparacion y aislamiento de los anticuerpos antagonistas anti CGRP de aplicacion WO2007/054809 y datos que demuestran la union del CGRP y caracterizacion antagonista de la misma se describen en la solicitud WO2007/054.809. Las secuencias de SEQ ID N°. 1 a 14 de dicha solicitud se proporcionan en el presente documento como SEQ ID N°. 1 a 14, respectivamente.
Segun una realizacion adicional de la presente invencion, el medicamento se prepara para administracion periferica entre una vez a 7 veces por semana, mas preferiblemente entre una a cuatro veces al mes, aun mas preferentemente entre una vez a seis veces por perlodo de 6 meses, aun mas preferiblemente una vez a doce veces al ano. Preferiblemente, el medicamento se prepara para ser administrado perifericamente en un perlodo seleccionado de: una vez al dla, una vez cada dos, tres, cuatro, cinco o seis dlas, semanalmente, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses, una vez cada siete meses, una vez cada ocho meses, una vez cada nueve meses, una vez cada diez meses, una vez cada once meses o anualmente. Segun las realizaciones preferidas se prepara el medicamento para administrarse perifericamente a traves de una ruta seleccionada de una o mas de; por via oral, sublingual, bucal, topica, rectal, por inhalacion, transdermica, subcutanea, intravenosa, intraarterial o intramuscular, a traves de la administracion intracardlaca, intraosea, intradermica, intraperitoneal, transmucosa, por via vaginal, por via intravltrea epicutanea, intraarticular, periarticular o local.
Segun una realizacion adicional de la presente invencion, el medicamento se prepara para administracion periferica con una concentracion de anticuerpo de entre 0,1 a 200 mg/ml; preferiblemente a aproximadamente, o entre 0,1 y alrededor de, cualquiera de 0,5, 1, 5, 10,15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mg/ml +/- error de 10%, lo mas preferiblemente al 50 mg/ml.
Segun una realizacion adicional de la presente invencion, el medicamento se prepara para administracion periferica con una concentracion de anticuerpo de entre 0,1 a 200 10 mg/kg de peso corporal; preferiblemente a aproximadamente, o entre 0,1 y alrededor de, cualquiera de 0,5, 1, 5, 10,15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mg/kg de peso corporal 1 error del 10%, lo mas preferiblemente a 10 mg/kg.
Segun una realizacion preferida de la presente invencion, el anticuerpo antagonista anti CGRP tiene una vida media in vivo de uno mas que cualquiera de los 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 o 210 dlas +/- 1 dla, aun mas preferiblemente mas de cualquiera de 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses.
Preferiblemente, el anticuerpo antagonista anti CGRP tiene una vida media in vivo de mas de 6 dlas.
De acuerdo con una realizacion preferida adicional de la presente invencion, el medicamento y/o el anticuerpo antagonista anti CGRP no produce efectos de sistema nervioso central y/o deterioro cognitivo. Preferiblemente, el medicamento y/o el anticuerpo antagonista anti CGRP no induce ningun uno o mas de los siguientes: amnesia, confusion, despersonalizacion, hipoestesia, pensamiento anormal, trismo, el vertigo, la acatisia, la apatla, ataxia, parestesia peribucal, estimulacion del SNC, labilidad emocional, euforia, alucinaciones, hostilidad, hiperestesia, hiperquinesia, hipotonla, falta de coordinacion, aumento de la libido, la reaccion manlaca, mioclono, neuralgia, neuropatla, psicosis, convulsiones, habla anormal, estupor, ideacion suicida; mareos, somnolencia, insomnia, ansiedad, temblores, depresion o parestesia. Mas preferentemente, el medicamento y/o el anticuerpo antagonista anti CGRP no induce el deterioro de coordinacion motor o de atencion.
Segun una realizacion adicional de la presente invencion, el medicamento y/o el anticuerpo antagonista anti CGRP no produce insuficiencia respiratoria, renal o gastrointestinal.
Segun una realizacion adicional de la presente invencion, el medicamento y/o el anticuerpo antagonista anti CGRP no produce efectos de la dependencia flsica y/o psicologica. Preferiblemente, el medicamento y/o el anticuerpo antagonista anti CGRP no demuestra afinidad por los opiaceos, las benzodiazepinas, la fenciclidina (PCP), o receptores de acido aspartico N-metil-D (NMDA), o estimulante del SNC, o producir cualquier sedante o efecto euforico.
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En una realizacion, el anticuerpo antagonista anti CGRP, en la administration, aminora, controles, reduce la incidencia de, o retrasa el desarrollo o la progresion de la sensation del dolor central.
En otra realizacion, el efecto del anticuerpo antagonista anti CGRP es igual y/o superior a los efectos de los AINE y/o opiaceos en los mismos modelos de dolor inflamatorio. En una realizacion, el anticuerpo antagonista contra el CGRP es eficaz en el tratamiento de poblaciones de dolor refractario.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invention, se proporciona el uso o metodo de acuerdo con cualquier otro aspecto de la invencion en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP se administra por separado, secuencial o simultaneamente en combination con uno o mas compuestos farmacologicamente o agentes activos, compuestos o agentes utiles para el tratamiento de dolor inflamatorio de preferencia. Preferiblemente, el agente adicional es seleccionado de uno o mas de:
(i) un analgesico opiacea, por ejemplo morfina, herolna, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanilo, cocalna, codelna, dihidrocodelna, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalniefene, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina o pentazocina; (ii) un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), por ejemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolac, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal,, ibuprofeno, indometacina, quetoprofeno, quetorolaco, acido meclofenamico, acido mefenamico, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina o zomepirac, inhibidores de ciclooxigenasa-2 (COX-2), celecoxib; rofecoxib; meloxicam; JTE-522; L-745,337; NS398;, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo; (iii) un sedante de barbiturato, por ejemplo, arnobarbital, aprobarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, phenobartital, secobarbital, talbutal, teamilal o tiopental o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo; (iv) una berizodiazepina que tiene una action sedante, por ejemplo, clordiazepoxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam o triazolam o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo; (v) un antagonista de H1 que tiene una accion sedante, por ejemplo, difenhidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina o clorciclizina o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma; (vi) un sedante tal como glutetimida, meprobamato, metacualona o dicloralfenazona o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo; (vii) un relajante de musculo esqueletico, por ejemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol o orfrenadina o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma;
(viii) un antagonista del receptor NMDA, por ejemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano) o su metabolito dextrorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano), quetamina, memantina, quinona de pirroloquinolina o cis-4-(fosfonometil)-2-acido de piperidinacarboxllico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
(ix) un alfa-adrenergico, por ejemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina o 4-amino-6,7-dimetoxi-2-(5- metanosulfonamido-1,2,3,4-tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil) quinazolina;
(x) un antidepresivo triclclico, por ejemplo desipramina, imipramina, amitriptilina o nortri ptilina;
(xi) un anticonvulsivo, por ejemplo, carbamazepina o valproato;
(xii) un antagonista de taquiquinina (NK), en particular un antagonista NK-3, NK-2 o NK-1, por ejemplo, (aR, 9R)-7-[3,5-bis(trifluorometil)bencilo]-8,9,10,11-tetrahidro-9-metil-5-(4-metilfenil)-7H-[1,4]diazocino[2,1-
g][1,7]naftridina-6-13-diona (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-bis(trifluorometilo)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)- 4-morfolinilometilo]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), lanepitant, dapitant o 3-[[2-metoxi-5- (trifluorometoxi)-fenil]metiloamino]-2-fenil-piperidina (2S, 3S);
(xiii) un antagonista muscarlnico, por ejemplo oxibutinina, tolterodina, propiverina, cloruro de tropsio o darifenacina; (xiv) un inhibidor de la COX-2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib o valdecoxib;
(xv) un inhibidor de COX no selectivo (preferiblemente con protection GI), por ejemplo, nitrofiurbiprofen (HCT 1026);
(xvi) un analgesico de alquitran de hulla, en particular paracetamol;
(xvii) un neuroleptico tal como droperidol;
(xviii) un agonista del receptor vainilloide (por ejemplo resiniferatoxina) o antagonista (por ejemplo capsazepina);
(xix) un adrenergico beta como propranolol;
(xx) un anestesico local, tal como mexiletina;
(xxi) un corticosteroide, tal como dexametasona;
(xxii) un agonista de receptor de serotonina o antagonista;
(xxiii) una colinergico (nicotlnico) analgesico;
(xxiv) El tramadol (marca registrada);
(xxv) un inhibidor de PDEV, tales como sildenafil, vardenafil o taladafil;
(xxvi) un ligando alfa-2-delta tal como gabapentina o pregabalina;
(xxvii) un cannabinoide; y
(xxviii) , un antidepresivo, como amitriptilina (Elavil), trazodona (Desyrel), y imiprarnina (Tofranil) o anticonvulsivos como fenitolna (Dilantin) o carbamazepina (Tegretol).
Segun un aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona una composition farmaceutica para la prevention y/o el tratamiento de dolor inflamatorio y/o slntomas de dolor inflamatorio o para mejorar, controlar,
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reducir la incidencia de, o retrasar el desarrollo o la progresion del dolor inflamatorio y/o los slntomas de dolor inflamatorio en un individuo, que comprende un anticuerpo antagonista anti CGRP y un vehlculo farmaceuticamente aceptable y/o un excipiente, en donde la composicion es preparada para ser administrada perifericamente .
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona un kit que comprende:
(a) una composicion farmaceutica como se ha definido anteriormente; y
(b) instrucciones para la administracion periferica de una cantidad eficaz de dicha composicion farmaceutica a un individuo para la prevencion y/o tratamiento de dolor y/o slntomas de dolor inflamatorio o para mejorar, controlar, reducir la incidencia de, o retrasar el desarrollo o la progresion del dolor inflamatorio y/o los slntomas de dolor inflamatorio.
El kit puede incluir uno o mas recipientes que contienen un anticuerpo de antagonista anti CGRP o polipeptido descrito en este documento e instrucciones para su uso de acuerdo con cualquiera de los metodos y usos de la invencion. El kit puede comprender ademas una descripcion de seleccion de un individuo adecuado para el tratamiento basado en la identificacion de si ese individuo tiene dolor inflamatorio o esta en riesgo de tener dolor inflamatorio. Las instrucciones para la administracion periferica de la composicion farmaceutica puede incluir informacion en cuanto a la dosis, la pauta de dosificacion y vlas de administracion para el tratamiento deseado.
Las caracterlsticas preferidas de cada aspecto de la invencion se aplican por igual el uno al otro aspecto mutatis mutandis.
Ejemplos
La presente invencion se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos que pretenden ilustrar pero no se limitan a la invencion.
Los siguientes ejemplos y figuras se realizan con referencia a un anticuerpo G1, un anticuerpo monoclonal humano antihumano CGRP; y al anticuerpo G2, un anticuerpo monoclonal de raton CGRP anti rata (Wong HG et al. hibridoma 12:93-106 (1993)).
Ejemplo 1: La osteoartritis (OA) modelos de dolor mecanicistas (transeccion del menisco medial (MMT))
Transeccion del menisco medial (MMT) en una rodilla posterior de los resultados de rata en el desarrollo de las lesiones del cartllago y otros cambios en la articulacion similares a los que se producen en OA. El dolor en las articulaciones resultante conduce al desarrollo de cambios sostenidos en la carga de peso (evaluado usando un metro de incapacitacion) en las extremidades traseras de rata y la alodinia mecanica (tactil) (evaluadas usando filamentos de von Frey), en la pata trasera, con una duracion de varias semanas. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo a un protocolo ciego, en el que el investigador no estaba al tanto de la identidad del compuesto/control o el tratamiento del animal.
El anticuerpo G2 (un anticuerpo monoclonal anti CGRP) invirtio el deficit de carga de peso de la extremidad posterior OA a la dosis mas alta probada, 10 mg/kg, IV. Su efecto fue comparable a celecoxib. Ambos compuestos invirtieron el cambio en la carga de peso sobre la extremidad OA al valor normal. No se observo efecto con la dosis mas baja. Este efecto duro 10 dlas despues de la administracion cuando la exposicion plasmatica de anticuerpo G2 alcanza un valor medio de 65,1 ± 3 ug/ml (6,3 ± 0,3 ug/ml, para la dosis mas baja a los 10 dlas post IV).
El control negativo, anticuerpo nulo, es decir, no se une CGRP, (vease figura 1), demostro un efecto sobre la carga de peso en los puntos de tiempo tempranos. Este efecto fue inesperado y no se puede explicar, pero no se mantuvo y no se observo en los puntos finales de la alodinia (Figura 1). experimentos repetidos en las mismas condiciones utilizando un tampon como control negativo no mostraron ningun efecto sobre la carga de peso para el control negativo y revirtieron el cambio en carga de peso sobre la extremidad OA del valor normal para G1.
Ejemplo 2: Ensayo de union
Un ensayo de union se realizo para medir el IC50 del anticuerpo anti CGRP G2 y G1 en el bloqueo de una CGRP humana a partir de la union al receptor CGRP1 en las celulas SK-N-MC. Las curvas de respuesta de dosis se representaron graficamente y valores de K se determinaron utilizando la ecuacion:
Ki=IC5o/(1+([ligand]/KD);. Figura 2, donde el equilibrio constante de disociacion KD=0,37 nM para a-CGRP al CGRP1 - receptor como presente en las celulas SK-N-MC. El valor lC50 informado (en terminos de moleculas de IgG) fue convertido a los sitios de union para que se podrla comparar con las afinidades (Kd) determinados por Biacore utilizando N-biotinilado humano y de rata a-CGRPs fueron capturados en las celulas de flujo individuales a niveles bajos (tlpicamente 100 unidades de respuesta) para proporcionar las superficies de reaccion, mientras que una celda de flujo no modificada sirvio como canal de referencia. G1 se valoro sobre la superficie del chip. Las afinidades de union se dedujeron a partir del cociente de las constantes cineticas (KD=koff/Kon) vease Tabla 1.
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G2 Raton Mab 7E9 G1
KD (nM), a-Hu
17 1,0 0,04
1C50 (nM) a-Hu
37 2,6 1,2
KD (nM) a-Rata
1,0 58 1,2
Tabla 1
N-biotln-CGRP en chip
°C kon (1/Ms) koff (1/s) T1/2 (h) Kd (nM)
a-humano
25 186x10 7,80 x 10'6 24,68 0,042
a-humano
37 587x10 3,63 x 10'5 5,30 0,063
p-humano
37 4,51 x 105 6,98 x 10'5 2,76 0,155
a-rata
25 508x10 6,18 x 10'5 3,12 1,22
a-rata
37 155x10 3,99 x 10'4 0,48 2,57
p-rata
37 516x10 716x16s 2,45 0,152
Tabla 2
Afinidad de union G1 para CGRP humano a y p era equivalente (Kd=0,155 y 0,152 nM, respectivamente). Afinidad de union de G2 para CGRP rata a y p era equivalente (16 y 17 nM, respectivamente). Ademas, afinidad de union G1 es 40 veces mas potente en humanos que en ratas para a-CGRP (Kd = 0,042 y 1,22 nM, respectivamente) y equi- potente en humanos y ratas para el p-CGRP (Kd=0,155 y 0,152 nM, respectivamente). Tambien, el anticuerpo G1 demostrado una buena selectividad de especies transversal y se une rata a-CGRP con la misma afinidad que anticuerpo G2 (alrededor de 1,2 nM) Tabla 2.
G1 une a- y p-CGRP humana y mono cynomolgus con alta afinidad (KD=63 y 155 pM, respectivamente). G1 muestra la selectividad de especies para CGRP humano/cino y se une a- y p-CGRP de otras especies por ejemplo, rata con menor afinidad (Ko=2.57nM y 152 pM, respectivamente).
Ejemplo 3: La vida media de anti-CGRP in vivo
Mediciones de suero de anticuerpos anti CGRP, en la rata, la Figura 3, indica que la vida media es del orden de 7 dlas. El anticuerpo es perifericamente restringido que tiene un peso molecular de alrededor de 150.000, las Figuras 3a, 3b, es decir, que no cruza en el sistema nervioso central o cruza la barrera de sangre del cerebro.
Ejemplo 4: La selectividad del anticuerpo anti CGRP
Se determino la especificidad del anticuerpo G1 a CGRP humano o de rata mediante el uso del chip Biacore para "sondear" la concentracion libre de un complejo peptido premezclado de mAb + peptido. Como era de esperar, cuando preincubamos el anticuerpo G1 con CGRP humano o de rata la respuesta era totalmente bloqueado. En contraste G1 preincubado, con un exceso de amilina, calcitonina o adrenomedulina era comparable a la respuesta de control (G1 mas tampon) lo que demuestra que G1 no forma un complejo con estos peptidos (Figura 5).
Ejemplo 5: Identificacion de anticuerpo G1 epftopo de union
El analisis de interaccion se lleva a cabo a 25°C en un sistema Biacore 3000TM equipado con chips de sensor recubiertos de estreptavidina (SA) (Biacore AB, Uppsala, Suecia) usando un tampon de funcionamiento estandar Biacore (HBS-P). En primer lugar se confirmo que un fragmento N-biotinilado 25-37 humano a-CGRP unido con la misma afinidad al anticuerpo G1, como la longitud total N-biotinilada humana a-CGRP. Cada aminoacido entre la posicion 27-37 despues se muto individualmente a alanina y expreso la perdida de veces en la afinidad en comparacion con el fragmento de tipo salvaje. Fragmentos N-biotinilados fueron capturados en las celulas de flujo individuales a niveles bajos (tlpicamente 100 unidades de respuesta) para proporcionar las superficies de reaccion, mientras que una celda de flujo sin modificar sirvio como un canal de referencia. Los fragmentos Fab purificados de anticuerpo G1 se generaron. Los fragmentos Fab se titularon sobre el chip usando 1pM como la concentracion superior de series de dilucion de dos veces. Fases de asociacion y disociacion fueron monitorizadas a 100 pl/min para 1 minuto y 5 minutos, respectivamente. Las superficies se regenero con una mezcla de 35% de etanol + 25 mM NaOH + 0,5 M de NaCl.
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Los resultados del analisis de alanina muestran que el anticuerpo G1 se une a la region terminal C de a-CGRP humana, en particular los residuos 25 a 37, y muestra la union especlfica a una region (es decir, la perdida de afinidad se aumento notablemente cuando se muta la region de union especlfica) que se puede definir como el epltopo y que se encuentra dentro de los ultimos 5 C- aminoacidos terminales, es decir, de G33A a F37A. Cambios mas profundos en la afinidad son causados por la mutacion G33A y F37A (Figura 4). C-terminal Phe es importante para la selectividad de anticuerpo G1 para CGRP vs peptidos relacionados y miembros de la familia de genes (Figura 6).
Por lo tanto, en una realizacion, la presente invencion proporciona un anticuerpo antagonista anti CGRP que se une especlficamente a un epltopo definido por los aminoacidos G33 a F37 de CGRP. El anticuerpo antagonista anti CGRP puede unirse especlficamente al epltopo definido por la secuencia de aminoacidos GSKAF, mas especlficamente al epltopo de CGRP se define como GXXXF donde X puede ser cualquier aminoacido, el G33 y F37 siendo los residuos mas importantes del epltopo para la definicion de la union del anticuerpo antagonista anti CGRP de alta afinidad.
Ejemplo 6: Analisis de los indicadores de dependencia ffsica o psicologica
Ni anticuerpo G1 ni anticuerpo G2 demuestran penetracion en el SNC. Ademas, la observacion a largo plazo de los animales (ratas) dosificaron con el anticuerpo a los niveles utilizados en los ejemplos anteriores no revelaron eventos adversos del SNC tales como la sedacion o la estimulacion/comportamiento euforico en comparacion con los animales control. Estas observaciones indican la ausencia de riesgo de dependencia para los anticuerpos y por lo tanto una mejora significativa de la seguridad de los anticuerpos sobre los opiaceos actuales utilizados en terapias para el dolor actuales.
Ejemplo 7: Analisis de los indicadores de los efectos adversos gastrointestinales
10 A I meses estudio en ratas in vivo con G2 anticuerpo y estudio comparativo I semana con Anticuerpo G1 en demostro que no se observaron efectos gastrointestinales adversos en el comportamiento, ingesta de alimentos, la produccion de heces o la histopatologla en comparacion con los animales control. Estas observaciones indican la ausencia de riesgo gastrointestinal para los anticuerpos y por lo tanto una mejora significativamente la seguridad de los anticuerpos sobre corriente
15 AINE utilizados en terapias para el dolor actuales.
Ejemplo 8; G1 y G2 como anticuerpos antagonistas contra CGRP
Una consecuencia de la actividad biologica conocida CGRP es la llamarada neurogenica de generacion cuando se entrega in vivo. G1 y G2 demuestran ser anticuerpos antagonista anti CGRP en que impiden el desarrollo de llamarada neurogenica in vivo.
Al usar de un modelo de rata de llamarada de piel neurogenica, la eficacia de G1 fue probada por su capacidad para bloquear el efecto de CGRP in vivo. El nervio safeno en la rata se estimula electricamente, causando la liberacion de CGRP de las terminaciones nerviosas y que conduce a la vasodilatacion, los cambios resultantes en el flujo de sangre se pueden medir usando metodos de laser Dopier.
Los cambios en los parametros de flujo de sangre se expresaron como el area bajo la curva (AUC, el cambio en unidades de flujo Doppler arbitrarias multiplicadas por el tiempo). CGRP antagonista de receptor CGRPs-37 (400 nmol/kg, i.v.) se utilizo como control positivo para validar la especificidad del modelo (datos no mostrados). Para determinar el efecto de G1 antes de la dosificacion para cada animal, la respuesta del flujo de sangre de referencia a la estimulacion se establecio con dos estimulaciones del nervio safeno cada 30 minutos de diferencia. Las ratas fueron tratadas con G1 despues de la respuesta del flujo sangulneo de la segunda estimulacion habla regresado a los niveles basales (aproximadamente 10 minutos despues de la estimulacion) se realizaron y las otros cuatro estimulaciones adicionales en intervalos de 30 minutos.
Resultados (Figura 7) demostraron que en animales tratados con vehlculo no se registro ningun cambio significativo en la respuesta del flujo sangulneo, pero las ratas tratadas con G1 mostraron una disminucion significativa en la respuesta de flujo sangulnea a partir de los 90 y 120 minutos despues de la dosis de 10 mg/kg y 1 mg/kg, respectivamente. Actividad similar se logro utilizando D2. Ademas, en llamaradas adicionales neurogenicas y pruebas de modelo de vasodilatacion G1 mostraron efecto marcado a los 7 dlas despues de la dosificacion intravenosa (ED50 predicho = 6 ug/ml en el modelo de la estimulacion del nervio safeno). Las conclusiones forman las pruebas realizadas es que G1 y G2 demuestran actividad antagonista anti CGRP.
Capacidad similar de funcion bloqueada CGRP para los anticuerpos tambien se muestra en la publicacion Zeller J, et. al. Br J Pharmacol. 2008 Dec;155(7):1093-103. Epub 2008 Sep 8.
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A continuacion se dan las secuencias de anticuerpos utiles para la practica de la presente invencion.
Secuencias de anticuerpos
Secuencia de aminoacidos de region variable de cadena pesada de Anticuerpo G1 (SEQ ID NO:1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYG LAIQNYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoacidos de region variable de cadena ligera de Anticuerpo G1 (SEQ ID NO:2)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLE
PEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK
Anticuerpo G1 CDR H1 (CDR extendido) (SEQ ID NO: 3)
GFTFSNWIS
Anticuerpo G1 CDR H2 (CDR extendido (SEQ ID NO: 4)
ElRSESDASATHYAEAVKG Anticuerpo G1 CDR H3 (SEQ ID NO: 5)
YFDYGLAIQNY
Anticuerpo G1 CDR L1 (SEQ ID NO: 6)
KASKRVTTYVS
Anticuerpo G1 CDR L2 (SEQ ID NO: 7)
GASNRYL
Anticuerpo G1 CDR L3 (SEQ ID NO: 8)
SQSYNYPYT
Secuencia de nucleotidos de region variable de cadena pesada de anticuerpo G1 (SEQ ID NO: 9)
GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTC
CGGmCAcCUCTCCPCTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAAT
CCGUCCGAAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCG1TCACCATCTCCCGTGACAA
CGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTA
CTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC
Secuencia de nucleotidos de region variable de cadena ligera de anticuerpo G1 (SEQ ID NO: 10)
GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGC
TTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACG
GTGCUCCAACCGACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATC
TCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTG1TrACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAG
GGTACCAAACTGGAAATCAAA
Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de anticuerpo completo de anticuerpo G1 (incluido IgG2 modificado como se describe en el presente documento) (SEQ ID NO: 11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNVWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDN
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNWVGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVL
TVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de anticuerpo completo de anticuerpo G1 (SEQ ID NO: 12) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRUJYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLE
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PEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de nucleotidos de cadena pesada de anticuerpo completo de anticuerpo G1 (incluido lgG2 modificado como se describe en el presente documento) (SEQ ID NO: 13)
GAAGUCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGC1TC
CGGmCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAA
ATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCG1TTCACCATCTCCCGTGA
CAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGG
CTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTrACCGTTTCCTCCGCCTCCA
CCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGG
CGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTG
GTGACCGTGCCATCCAGCAACUCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCPCACCAAG
GTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCAT
CCCTGTTCCTGUCCCTCCAAAGCC/AAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGG
TGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAA
GACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGAC
TGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTC
CAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAAC
CAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGMGGGAUCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAG
CCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCCCTGTATTCCAAGCTGACCG
TGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTG1TCTCTTGUCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATA
CCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTA
Secuencia de nucleotidos de cadena ligera de anticuerpo completo de anticuerpo G1 (SEC ID NO:14)
GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGC
TTCCAAACGGGTrACCACCTACG1TrCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGG
TGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCAT
CTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCA
GGGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTT
GAAATCCGGAACTGCCTCTGTrGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGCGAAAGTACAGTGGAAGG
TGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG
CCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC
AGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA
Comparacion de secuencias de aminoacido de CGRP humano y de rata (a-CGRP humano (SEQ ID NO: 15); p- CGRP humano (SEQ ID NO:16); rata a-CGRP (SEQ ID NO: 17); y la rata p-CGRP (SEQ ID NO : 18)): NH2-ACDTATGVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 (SEQ ID NO:15) NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2 (SEQ ID NO:16) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2 (SEQ ID NO:17) NH2-SCHTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF CONH2 (SEQ ID NO:18)
Secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de anticuerpo G2 (SEQ ID NO: 19)
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSS
STAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTVSS
Secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera de anticuerpo G2 (SEQ ID NO: 20)
EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTME
AEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIK
Anticuerpo G2 CDR H1 (CDR extendido (SEQ ID NO: 21) SSVMH
Anticuerpo G2 CDR H2 (CDR extendido (SEQ ID NO: 22) YINPYNDGTKYNEKFKG
Anticuerpo G2 CDR H3 (SEQ ID NO: 23)
GGNDGY
Anticuerpo G2 CDR L1 (SEQ ID NO: 24)
SASSSISSIYLH
Anticuerpo G2 CDR L2 (SEQ ID NO: 25)
RASNLAS
5
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15
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65
Anticuerpo G2 CDR L3 (SEQ ID NO: 26) QQGSTIPFT
Secuencia de nucleotidos de variable region de cadena pesada del anticuerpo G2 (SEQ ID NO: 27)
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGC1TCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTT
CTGGATACACA1TCACTAGCTCTGUATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGA1TGGAT
ATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATC
CTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGGG
GTAACGATGGCTACTGGGGGCAAGGCACTACTCTCACAGTCTCCTCA
Secuencia de nucleotidos de variable region de cadena ligera del anticuerpo G2 (SEQ ID NO: 28)
GAAATT GT GCTCACGCAGT CTCCAACCACCATGGCT GCAT CTCCCGGGGAGAAGAT CACT AT CACCT GT AGTGC CAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTGATTTAT AGGGCATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCAC AATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACUACTACTGCCAGCAGGGTAGTACTATACCATCACGTTCGGC TCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
Secuencia de aminoacidos de cadena pesada del anticuerpo completo de anticuerpo G2 (no incluyendo dominio Fc) (SEQ ID NO: 29)
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSS
STAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPV
TVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRD
Secuencia de aminoacidos de cadena ligera del anticuerpo completo de anticuerpo G2 (SEQ ID NO: 30) EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPARFPSSEQSGSGSGTSYSLT IGTMEAEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPRDINVKWKIDGSE RQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
Secuencia de aminoacidos de cadena pesada del anticuerpo completo de anticuerpo G2 (dominio Fc no incluido) (SEQ ID NO: 31)
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTT
CTGGATACACAUCACTAGCTCTGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGAT
ATATTAATCC1TACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAMGGCAAGGCCACACTGACUCAGACAAATCC
TCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGGGG
TAACGATGGCTACTGGGGCCAAGGCACTACTCTCAGAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATC
CACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCT
GAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGT
CTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAA
CGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGA AAATTGTGCCCAGGGAT
Secuencia de aminoacidos de cadena ligera del anticuerpo completo de anticuerpo G2 (SEQ ID NO: 32)
GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGTAGTGC
CAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTGATTTAT
AGGGCATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCAC
AATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTACTATACCATTCACGTCGG
CTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC
AGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAGAGACATCAATGTCAAGTGGA
AGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGTGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTAC
AGCATGAGCAGCACCCTCACATTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCA
CAAGACATCAACUCACCCATCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTAA

Claims (28)

  1. 5
    10
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo antagonista anti CGRP (peptido relacionado con el gen de la calcitonina) para el uso como un medicamento para la prevencion o el tratamiento de dolor artrltico, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP no se administra por via intratecal.
  2. 2. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el medicamento esta preparado para administrarse perifericamente.
  3. 3. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el medicamento se administra perifericamente.
  4. 4. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medicamento esta preparado para ser administrado por via oral, sublingual, a traves de inhalacion, transdermica, subcutanea, intravenosa, intraarterial, intraarticular, periarticular, a nivel local y/o intramuscular.
  5. 5. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el medicamento esta preparado para ser administrado por via subcutanea o intravenosa.
  6. 6. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP actua perifericamente en administracion.
  7. 7. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el dolor artrltico es dolor de osteoartritis.
  8. 8. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP:
    (a) se une a CGRP;
    (b) bloques de CGRP de la union a su receptor;
    (c) bloquea o disminuye la activacion del receptor de CGRP;
    (d) inhibe bloques, suprime o reduce actividad biologica CGRP;
    (e) aumenta el aclaramiento del CGRP; y/o
    (f) inhibe la slntesis de CGRP, produccion o liberacion.
  9. 9. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP:
    (i) es un anticuerpo humano;
    (ii) es un anticuerpo humanizado;
    (iii) es un anticuerpo monoclonal;
    (iv) se une CGRP con una Kd de 50 nM o menos (medido por resonancia de plasmon de superficie a 37°C); y/o
    (v) tiene una vida media in vivo de al menos 7 dlas.
  10. 10. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP se une especlficamente a la region C-terminal de CGRP.
  11. 11. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP reconoce especlficamente el epltopo definido por la secuencia GSKAF.
  12. 12. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo anti CGRP comprende un dominio VH que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 1.
  13. 13. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo anti CGRP comprende un dominio VL que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 2.
  14. 14. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso segun la reivindicacion 13, en el que el anticuerpo anti CGRP comprende ademas un dominio VH que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
  15. 15. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo anti CGRP comprende al menos una CDR seleccionada entre el grupo que consiste en:
    (a) CDR HI como se expone en SEQ ID NO: 3;
    (b) CDR H2 como se expone en SEQ ID NO: 4;
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    (c) CDR H3 como se expone en SEQ ID NO: 5;
    (d) CDR L1 como se expone en SEQ ID NO: 6;
    (e) CDR L2 como se expone en SEQ ID NO: 7;
    (f) CDR L3 como se expone en SEQ ID NO: 8;
    (g) una variante de CDR L1 como se muestra en la Tabla 3;
    (h) una variante de CDR L2 como se muestra en la Tabla 3; y
    (i) una variante de CDR H2, como se muestra en la Tabla 3.
  16. 16. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo anti CGRP comprende un dominio VH que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 1 y un dominio VL que es al menos 90% identica en secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 2.
  17. 17. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo anti CGRP comprende una cadena pesada producida por el vector de expresion con el n° de Acceso ATCC PTA 6867.
  18. 18. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo anti CGRP comprende una cadena ligera producida por el vector de expresion con el n° de Acceso ATCC PTA-6866.
  19. 19. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo anti CGRP es producido por los vectores de expresion con n°s de Acceso ATCC PTA-6867 y PTA-6866.
  20. 20. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento se prepara para la administracion periferica por inyeccion subcutanea o intravenosa entre una, dos, tres o cuatro veces al mes.
  21. 21. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en el que el medicamento se prepara para la administracion periferica con una concentracion de anticuerpo de entre 5 a 100 mg/ml.
  22. 22. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento se prepara para la administracion periferica con una concentracion de anticuerpo de entre 1 a 100 mg/kg de peso corporal.
  23. 23. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento no produce deterioro CNS de coordination motor o atencion.
  24. 24. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en el que el anticuerpo antagonista anti CGRP es una molecula no penetrante en el centro, medular o intratecal.
  25. 25. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en el que el anticuerpo anti CGRP se administra por separado, secuencialmente o simultaneamente en combinacion con uno o mas compuestos farmacologicamente activos.
  26. 26. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso segun la revindication 25, en el que el uno o mas compuestos farmacologicamente activo(s) es/son seleccionado(s) de;
    (i) un analgesico opioide;
    (ii) un farmaco no esteroideo antiinflamatorio (AINE), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
    (iii) un sedante de barbiturato, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
    (iv) una benzodiacepina que tiene una action sedante, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
    (v) un antagonista de H1 que tiene una accion sedante, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
    (vi) un relajante de musculo esqueletico, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
    (vii) un antagonista del receptor de NMDA, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;
    (viii) un adrenergico alfa;
    (ix) un antidepresivo triclclico;
    (x) un anticonvulsivo;
    (xi) una taquicinina (NK) antagonista;
    (xii) un antagonista muscarlnico;
    (xiii) un inhibidor de la COX-2;
    (xiv) un inhibidor de COX no selectivo;
    (xv) un analgesico de alquitran de hulla;
    5
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    (xvi) un neuroleptico;
    (xvii) un agonista del receptor vaniloide;
    (xviii) una adrenergico beta;
    (xix) un anestesico local;
    (xx) un corticosteroide;
    (xxi) un agonista del receptor de la serotonina o antagonista;
    (xxii) un analgesico colinergico;
    (xxiii) de tramadol;
    (xxiv) un inhibidor de PDEV;
    (xxv) un ligando alfa-2-delta; y
    (xxvi) un cannabinoide.
  27. 27. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el medicamento comprende ademas un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
  28. 28. Un anticuerpo antagonista anti CGRP para su uso segun la reivindicacion 25, en el que el uno o mas compuestos farmacologicamente activo es un sedante.
    imagen1
    Bn
    10 ma/ml G2
    Nuo
    La carga de peso
    Celecoxib
    30 mg/kg; p.o., bid
    mg/ml G2
    **
    **
    **
    k*
    kk
    kk
    kk
    Alodima tactil
    Naive
    **
    **
    nnnn
    □
    Base
    Tiempo (dias siguientes iv administracion (anticuerpos) or primera dosis (celecoxib)
    Figura 1
    Inhibition (%)
    13ft Ki= 0,37 nM IgG moleculas (o 0,74 nM sitios de union) IC5o= 1,8 nM en sitios de union
    imagen2
    Figura 2
    imagen3
    Figura 3a
    imagen4
    Figura 3b
    imagen5
    Figura 4
    imagen6
    Figura 5
    NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 a-CGRP humana (identica a a-CGRP cynomolgus)
    NH2-ACNTATC VTHRLAGLLSRSGGM VKSNF VPTNVGSKAF-CONH2 p-CGRP humana (identica a p-CGRP cynomolgus)
    NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2 a-CGRP de rata (identica a a-CGRP de raton y perro)
    NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2 p-CGRP de rata
    NH2-SCNTATC VTHRLADLLSRSGGVVKDNF VPTD VGSEAF-CONH2 p-CGRP de raton
    NH2-GCNTATC VTHRLAGLLSRSGGM VKSNF VPTN VGSEAF-CONH2 CGRP de conejo
    Figura 6
    Flujo sangumeo normalizado (%)
    imagen7
    Figura 7
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