KR20200139720A - 에레누맙 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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케네스 로슨
노엘 리에더
수민다 하푸아락치
호세 그레고리오 라미레즈
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암젠 인크
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Abstract

본 발명은 에레누맙 및 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체 및 HMW 종을 포함하는 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제 및 이 조성물을 사용하고 규명하는 방법이 또한 기재된다.

Description

에레누맙 조성물 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 4월 2일에 출원된 미국 가출원 제62/651,651호의 이익을 주장하며, 이는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
전자로 제출된 텍스트 파일의 설명
본 출원은 전체가 본원에 참고로 포함된 ASCII 포맷으로 전자로 제출된 서열 목록을 포함한다. 2019년 3월 1일에 생성된 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형식의 사본은 A-2190-WO-PCT_SeqList_ST25로 명명되며 15 킬로바이트 크기이다.
기술분야
본 발명은 바이오의약품의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 에레누맙(erenumab)의 기능성 활성에 영향을 미치는 에레누맙의 변이체의 확인 및 규명에 관한 것이다. 본 발명은 또한 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물, 이 조성물을 포함하는 약제학적 제제 및 이 조성물을 사용하고 규명하는 방법에 관한 것이다.
에레누맙은 인간 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP: calcitonin gene-related peptide) 수용체에 특이적으로 결합하고 CGRP 리간드가 그 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 것을 막는 완전 인간 단일클론 항체이다. CGRP는 편두통 발병기전에 연루된다(Durham, New England Journal of Medicine, Vol. 350: 1073-1075, 2004; Edvinsson et al., Neurotherapeutics, Vol. 7: 164-175, 2010). 2상 및 3상 임상 실험에서, 에레누맙으로 치료된 만성 편두통 또는 삽화성 편두통을 갖는 환자는 위약을 받은 환자와 비교하여 매달의 편두통일의 수의 감소를 경험하였다(Tepper et al., Lancet Neurol., Vol. 16: 425-434, 2017; Goadsby et al., New England Journal of Medicine, Vol. 377: 2123-2132, 2017).
복잡한 치료학적 생물의약품, 예컨대 단일클론 항체는 생물의약품의 안전성 및/또는 효능에 영향을 미칠 수 있는 많은 생성물 품질 속성을 가질 수 있다. 그 분자의 포괄적인 구조 평가 및 기능 평가는 일반적으로 이러한 속성을 확인하고 그 분자의 특성에 대한 이의 영향을 이해하는 데 필요하다. 분자의 속성의 이해는 일관된 생성물의 제조를 보장하는 데 중요하다.
생물의약품의 변이체는 제조 공정 동안 또는 저장 조건하에 생길 수 있다. 이러한 생성물 변이체는 생성물 유연 물질 또는 생성물 유연 불순물로 분류될 수 있다. 생성물 유연 물질은 원하는 생성물의 특성에 필적하는 특성을 갖는 생성물의 제조 또는 저장 동안 형성된 원하는 생성물의 분자 변이체이고, 불순물로 생각되지는 않는다. 정반대로, 생성물 유연 불순물은 생성물 효능 및 환자 안전성과 관련하여 원하는 생성물의 특성에 필적하는 특성을 갖지 않는 원하는 생성물의 분자 변이체이다. 따라서, 생성물 유연 불순물의 확인 및 규명은 특히 생물학적 약물 생성물의 제조 및 품질 관리에 유용하다.
본 발명은 부분적으로 에레누맙의 생성물 유연 불순물, 특히 기능적 활성이 감소한 에레누맙의 변이체의 확인 및 규명에 관한 것이다. 치료학적 에레누맙 조성물에서의 이들 변이체의 양의 제어 및 모니터링은 에레누맙 조성물이 원하는 임상 효과를 생성하기 위한 필요한 효력을 갖도록 보장한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 에레누맙 조성물을 제공하고, 여기서 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체(isomerization variant), 탈아미드화 변이체(deamidation variant), 산성 변이체, 디설파이드 아이소폼 변이체, 고분자량(HMW) 종, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 조성물에서의 에레누맙 변이체의 양은 특정 범위 내에 있도록 제어된다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 하나 이상의 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이성질체화 변이체는 에레누맙의 중쇄(서열 번호 1 또는 서열 번호 3) 중 어느 하나 또는 둘 다에서 105번 아미노산 위치에서 이소아스파르트산 잔기 또는 숙신이미드를 갖는다. 이들 구현예 및 다른 구현예에서, 탈아미드화 변이체는 아스파르트산 잔기, 숙신이미드 또는 이소아스파르트산 잔기로 전환된 에레누맙의 중쇄(서열 번호 1 또는 서열 번호 3) 중 어느 하나 또는 둘 다에서 102번 아미노산 위치에서 아스파라긴 잔기를 갖는다. 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC: hydrophobic interaction chromatography high performance liquid chromatography)에 의해 결정될 때 약 30% 미만, 약 15% 미만, 약 8% 미만 또는 약 4% 미만일 수 있다.
본 발명은 또한 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙의 산성 변이체의 조성물을 제공한다. 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 40% 미만, 예를 들어 약 25% 내지 약 38% 또는 약 26% 내지 약 34%일 수 있다. 일부 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양은 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC: cation exchange high performance liquid chromatography)에 의해 결정된다. 에레누맙의 산성 변이체는 디설파이드 아이소폼 변이체, 탈아미드화 변이체, 단편화 변이체, 비공통 글리코실화 변이체, HMW 종, 및 이들의 조합을 포함한다. 소정의 구현예에서, 산성 변이체는 디설파이드 아이소폼 변이체, 단편화 변이체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 에레누맙 및 에레누맙의 디설파이드 아이소폼 변이체의 조성물을 포함한다. 에레누맙의 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-B 아이소폼 및/또는 IgG2-A/B 아이소폼을 포함할 수 있다. 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 20% 미만, 예를 들어 약 10% 미만, 또는 약 8% 미만, 예컨대 약 4% 내지 약 6%일 수 있다. 상기 조성물에서의 IgG2-A/B 아이소폼의 양은 약 20% 내지 약 40%, 약 26% 내지 약 38%, 또는 약 34% 내지 약 37%일 수 있다. 소정의 구현예에서, 디설파이드 아이소폼의 양은 비환원 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC: reversed phase high performance liquid chromatography)에 의해 결정된다.
본 발명은 또한 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙의 크기 변이체, 예컨대 저분자량(LMW: low molecular weight) 종, 중분자량(MMW: middle molecular weight) 종, 및 고분자량(HMW: high molecular weight) 종을 포함하는 조성물을 포함한다. 소정의 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 3.0% 미만, 예를 들어 약 2.5% 이하, 약 2.1% 이하, 약 1.8% 이하, 약 1.4% 이하, 또는 약 1.2% 이하이다. 하나의 특정 구현예에서, 에레누맙의 HMW 종은 주로 에레누맙의 공유 결합된 이합체로 이루어진다. 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양은 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UHPLC: size exclusion ultra-high performance liquid chromatography)에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 에레누맙 조성물의 품질을 평가하거나 분석하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계; 상기 조성물에서의 하나 이상의 에레누맙 변이체의 양을 측정하는 단계; 하나 이상의 에레누맙 변이체의 측정된 양을 소정의 참조 기준과 비교하는 단계; 및 그 비교가 소정의 참조 기준이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 (1) (예를 들어, HIC-HPLC에서의 프리피크(pre-peak)의 피크 면적 백분율에 의해) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양을 측정하는 단계, (2) (예를 들어, CEX-HPLC에서의 산성 피크의 피크 면적 백분율에 의해) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양을 측정하는 단계, 및/또는 (3) (예를 들어, SE-UHPLC에서의 프리피크의 피크 면적 백분율에 의해) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양을 측정하는 단계 중 1개, 2개 또는 3개를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 3가지의 측정은 모두 에레누맙 조성물에서 수행된다.
본원에 기재된 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제가 또한 본 발명에 포함된다. 일부 구현예에서, 약제학적 제제는 본원에 기재된 에레누맙 조성물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 완충액, 당 및 계면활성제를 포함한다. 약제학적 제제는 주사 장치, 예컨대 프리필드 주사기 또는 오토인젝터로 혼입될 수 있다. 이러한 구현예에서, 프리필드 주사기 또는 오토인젝터에 대한 주사 부피는 약 2 mL 미만, 예를 들어 약 1 mL이다.
본 발명은 또한 본 발명의 에레누맙 조성물 및 약제학적 제제를 사용하여 두통의 치료, 예방 또는 이의 발생의 감소를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 두통은 편두통 두통, 군발성 두통, 또는 다른 유형의 두통 장애, 예컨대 긴장성 두통, 반신마비 편두통, 월경 편두통 및 망막 편두통일 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 용도에 따라 치료되는 환자는 편두통, 예컨대 삽화성 편두통 또는 만성 편두통을 앓거나 이것으로 진단된다.
본원에 개시된 임의의 방법에서의 또는 본원에 개시된 임의의 방법에 따른 투여를 위한 약제의 제조를 위한 에레누맙 조성물의 용도가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명은 두통의 치료, 예방 또는 이의 발생의 감소를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 본원에 기재된 에레누맙 조성물 또는 약제학적 제제를 포함한다. 본 발명은 또한 두통의 치료, 예방 또는 이의 발생의 감소를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 에레누맙 조성물 또는 약제학적 제제의 용도를 포괄한다.
도 1a 및 도 1b는 에레누맙에 대한 중쇄(도 1a; 서열 번호 1) 및 경쇄(도 1b; 서열 번호 2)의 아미노산 서열을 보여준다. 각각의 사슬에서의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)은 볼드체이고 밑줄표시된다. 중쇄는 306번 위치에서 아스파라긴 잔기에서 N 연결된 글리코실화 부위를 함유한다.
도 1c 및 도 1d는 에레누맙에 대한 N 말단 및 C 말단에서 공통 번역 후 변형을 갖는 중쇄(도 1c; 서열 번호 3) 및 경쇄(도 1d; 서열 번호 4)의 아미노산 서열을 보여준다. 각각의 사슬에서의 CDR은 볼드체이고 밑줄표시된다. pE는 피로글루타메이트를 나타낸다.
도 1e 및 도 1f는 에레누맙에 대한 중쇄 가변 영역(도 1e; 서열 번호 5) 및 경쇄 가변 영역(도 1f; 서열 번호 6)의 아미노산 서열을 보여준다. 각각의 가변 영역에서의 CDR은 볼드체이고 밑줄표시된다.
도 2a 및 도 2b는 실물 크기(도 2a) 및 확대 크기(도 2b)의 에레누맙 약물 물질의 대표적인 HIC-HPLC 프로필을 도시한다. 에레누맙 약물 물질은 황산암모늄의 선형 감소 구배에 의한 용리로 아세트산나트륨 pH 5.5 이동상을 사용한 HIC-HPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다.
도 3은 HIC-HPLC 수집된 분획 및 HIC-HPLC에 의해 분석된 에레누맙 약물 물질의 오버레이를 보여준다. 에레누맙 약물 물질 및 반분취용 HIC-HPLC로부터 수집된 분획(F1-F7)은 황산암모늄의 선형 감소 구배에 의한 용리로 아세트산나트륨 pH 5.5 이동상을 사용한 HIC-HPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 각각의 패널은 분 단위의 용리 시간에 대한 280 nm에서의 흡광도의 선도이다. 7개 모두의 HIC-HPLC 분획과 에레누맙 약물 물질의 오버레이는 패널 8에 도시되어 있다.
도 4는 풍부한 HIC-HPLC 분획(F2-F6) 및 비분획화된 에레누맙 약물 물질(DS)에 대한 에레누맙 중쇄 CDR3 내의 펩타이드에 대한 용리 영역의 환원된 트립신 펩타이드 맵 오버레이이다. TH12H13 펩타이드는 서열 번호 1의 99번 내지 113번 아미노산 잔기에 대응하고, TH13은 서열 번호 1의 101번 내지 113번 아미노산 잔기에 대응한다.
도 5는 열 스트레스에 노출된 에레누맙 약물 물질의 HIC-HPLC 프로필이다. 50℃에서 14일 동안 항온처리된 에레누맙 약물 물질은 황산암모늄의 선형 구배에 의한 용리로 아세트산나트륨 pH 5.5 이동상을 사용한 HIC-HPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 상부 트레이스는 14일 시점에 대응한다.
도 6은 50℃에서 14일 동안 스트레스인 에레누맙 약물 물질에 대한 확대 크기의 환원된 트립신 펩타이드 맵 프로필을 도시한다. TH12H13 펩타이드는 서열 번호 1의 99번 내지 113번 아미노산 잔기에 대응하고, TH13은 서열 번호 1의 101번 내지 113번 아미노산 잔기에 대응한다. TH26 펩타이드는 서열 번호 1의 311번 내지 326번 아미노산 잔기에 대응하고, 검출된 단편은 L315와 T316 사이의 비특이적 절단으로 인한 것이다.
도 7은 pH 7.4 및 37℃에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 HIC-HPLC 프로필이다. PBS(pH 7.4)에 의해 10 mg/mL로 희석되고, 37℃에서 14일 동안 항온처리된 에레누맙 약물 물질은 황산암모늄의 선형 구배에 의한 용리로 아세트산나트륨 pH 5.5 이동상을 사용한 HIC-HPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 대조군 샘플을 제제 완충액(pH 5.2)에 희석하고, 생리학적 pH 스트레스 조건 샘플과 함께 37℃에서 14일 동안 항온처리하였다.
도 8은 pH 8.0 및 25℃에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 HIC-HPLC 프로필이다. Tris 염기(pH 8.0)에 의해 10 mg/mL로 희석되고, 25℃에서 14일 동안 항온처리된 에레누맙 약물 물질은 황산암모늄의 선형 구배에 의한 용리로 아세트산나트륨 pH 5.5 이동상을 사용한 HIC-HPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 대조군 샘플을 제제 완충액(pH 5.2)에 희석하고, 높은 pH 스트레스 조건 샘플과 함께 25℃에서 14일 동안 항온처리하였다.
도 9는 4가지의 상이한 저장 조건에 대한 동일한 로트의 HIC-HPLC 분석에서 프리피크의 백분율 피크 면적의 함수로서 에레누맙 로트의 백분율 상대 효력의 선도이다. 데이터의 선형 회귀 분석으로부터 적합화된 회귀 선은 각각의 온도에 대해 도시되어 있다. 40℃ 조건에 대해, 회귀 선의 기울기는 0과 통계학적으로 상이하고, 백분율 상대 효력이 HIC-HPLC 프리피크 백분율 면적의 증가에 따라 어떻게 감소하는지를 보여준다.
도 10은 도 9에서의 40℃ 저장 조건으로부터의 데이터에 대한 선도 및 적합화된 회귀 선을 보여주고, 적합화된 선은 70% 상대 효력 한계치를 가로지르도록 연장된다. 70% 상대 효력 한계치 선은 28.85% 주위에 HIC-HPLC 프리피크 면적의 회귀 선을 가로지른다.
도 11은 에레누맙 약물 물질의 대표적인 CEX-HPLC 프로필을 도시한다. 에레누맙 약물 물질은 염화나트륨의 선형 구배에 의한 용리로 인산나트륨 pH 6.6 이동상을 사용한 CEX-HPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다.
도 12는 CEX-HPLC 수집된 분획 및 CEX-HPLC에 의해 분석된 에레누맙 약물 물질의 오버레이를 보여준다. 에레누맙 약물 물질 및 반분취용 CEX-HPLC로부터 수집된 분획(F1-F9)은 염화나트륨의 선형 구배에 의한 용리로 인산나트륨 pH 6.6 이동상을 사용한 CEX-HPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 각각의 패널은 분 단위의 용리 시간에 대한 280 nm에서의 흡광도의 선도이다.
도 13a 및 도 13b는 CEX-HPLC 산성 피크 및 주 피크 분획(도 13a) 및 CEX-HPLC 염기성 피크 분획(도 13b)의 RP-HPLC 프로필을 보여준다. 에레누맙 약물 물질(DS) 및 CEX-HPLC 분획(F1-F9)을 Waters BEH300 C4 칼럼(1.7 ㎛ 입자 크기, 2.1 mm x 50 mm)을 사용하여 RP-HPLC에 의해 분석하고, 215 nm에서의 검출로 75℃에서 0.1% TFA 함유 이동상 및 1-프로판올의 구배를 사용하여 용리하였다. IgG2-A, IgG2-A/B 및 IgG2-B는 에레누맙의 상이한 디설파이드 아이소폼에 대응한다. 상이한 디설파이드 아이소폼의 구조는 도 15a 내지 도 15c에 도식적으로 도시되어 있다.
도 14는 비환원된 에레누맙(상부 트레이스) 및 환원된 에레누맙(하부 트레이스)의 Lys-C 펩타이드 맵을 예시한다. 에레누맙 약물 물질을 변성시키고, 엔도프로테아제 Lys-C로 분해하였다. 환원된 맵에서의 표지된 피크는 환원된 Lys-C 펩타이드 맵에 존재하지만 비환원된 Lys-C 펩타이드 맵에 부재한 펩타이드를 알아보게 한다. 각각의 표지된 펩타이드에 대한 설명은 표 18 및 표 19에 기재되어 있다.
도 15a는 비환원된 Lys-C 펩타이드 및 환원된 Lys-C 펩타이드 맵에 의해 확인된 에레누맙 디설파이드 아이소폼 IgG2-A 구조의 도식이다.
도 15b는 비환원된 Lys-C 펩타이드 및 환원된 Lys-C 펩타이드 맵에 의해 확인된 에레누맙 디설파이드 아이소폼 IgG2-A/B 구조의 도식이다.
도 15c는 비환원된 Lys-C 펩타이드 및 환원된 Lys-C 펩타이드 맵에 의해 확인된 에레누맙 디설파이드 아이소폼 IgG2-B 구조의 도식이다.
도 16a는 확대 크기의 에레누맙 약물 물질의 비환원 RP-HPLC 프로필이다. 에레누맙 약물 물질을 Waters BEH300 C4 칼럼(1.7 ㎛ 입자 크기, 2.1 mm x 50 mm)을 사용하여 RP-HPLC에 의해 분석하고, 215 nm에서의 검출로 75℃에서 0.1% TFA 함유 이동상 및 1-프로판올의 구배를 사용하여 용리하였다. IgG2-A, IgG2-A/B 및 IgG2-B는 에레누맙의 상이한 디설파이드 아이소폼에 대응한다. 상이한 디설파이드 아이소폼의 구조는 도 15a 내지 도 15c에 도식적으로 도시되어 있다.
도 16b는 에레누맙 약물 물질에 대한 디설파이드 아이소폼 변이체가 풍부한 CEX-HPLC 분획의 RP-HPLC 프로필의 오버레이이다. 에레누맙 약물 물질 및 CEX-HPLC 분획을 Waters BEH300 C4 칼럼(1.7 ㎛ 입자 크기, 2.1 mm x 50 mm)을 사용하여 RP-HPLC에 의해 분석하고, 215 nm에서의 검출로 75℃에서 0.1% TFA 함유 이동상 및 1-프로판올의 구배를 사용하여 용리하였다.
도 17a 및 도 17b는 실물 크기(도 17a) 및 확대 크기(도 2b)의 에레누맙 약물 물질의 대표적인 SE-UHPLC 프로필을 도시한다. 에레누맙 약물 물질은 100 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨(pH 6.8) 이동상을 사용한 SE-UHPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 완충액 피크는 별표(*)로 표시된다.
도 18은 SE-UHPLC 수집된 분획 및 SE-UHPLC에 의해 분석된 에레누맙 약물 물질의 오버레이를 보여준다. 에레누맙 약물 물질 및 반분취용 SE-HPLC로부터 수집된 분획은 100 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨(pH 6.8) 이동상을 사용한 SE-UHPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 각각의 패널은 에레누맙 약물 물질에 대해 SE-UHPLC 프로필에서 오버레이된 각각의 분획에 대한 분 단위의 용리 시간에 대한 280 nm에서의 흡광도의 선도이다. 3개 모두의 SE-UHPLC 분획과 에레누맙 약물 물질의 오버레이는 패널 4에 도시되어 있다.
도 19는 확대 크기의 SE-UHPLC 수집된 분획 및 에레누맙 약물 물질의 rCE-SDS 프로필이다. 에레누맙 약물 물질(DS) 및 SE-UHPLC 분획(주요, HMW1, HMW2)을 25℃에서 SDS 겔 완충액으로 충전된 기본 용융 실리카 모세관(bare-fused silica capillary)으로 동전기적으로 주입하기 전에 변성시키고 환원시켰다. 220 nm에서 흡광도를 모니터링하였다. 시스템 피크는 별표(*)로 표시된다. LMW = 저분자량 종; MMW = 중분자량 종; HMW = 고분자량 종; LC = 경쇄; HC = 중쇄; NGHC = 비글리코실화 중쇄; 포스트-HC = 중쇄후.
도 20은 열 스트레스에 노출된 에레누맙 약물 물질의 SE-UHPLC 프로필이다. 50℃에서 14일 이하 동안 항온처리된 에레누맙 약물 물질은 100 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨(pH 6.8) 이동상을 사용한 SE-UHPLC 및 280 nm 흡광도에서의 검출에 의해 분석되었다. 상부 트레이스는 14일 시점에 대응한다.
본 발명은 기능적 활성의 감소를 나타내는 에레누맙의 변이체의 확인 및 규명에 관한 것이다. 구체적으로는, 소정의 구조 변형을 갖는 에레누맙의 변이체는 CGRP 리간드에 의한 CGRP 수용체 활성화를 차단하는 데 있어서 에레누맙보다 훨씬 덜 강력하다. 본원에 각각 더 자세히 기재된 이러한 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 디설파이드 아이소폼 변이체, 산성 변이체 및 HMW 종을 포함한다. 에레누맙 약물 물질 및 에레누맙 약물 생성물에서의 이들 변이체의 양을 제한함으로써, 에레누맙 조성물의 전체 효력은 유지되거나 임상 실험 동안 사용된 에레누맙 조성물과 일치될 수 있고, 임상 효능을 갖는 것으로 관찰될 수 있다. 따라서, 본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물에서의 에레누맙 변이체의 양은 본원에 기재된 바와 같은 특정 범위 또는 한계 내로 제어된다.
용어 에레누맙은 서열 번호 5의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 6의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 IgG2 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 에레누맙은 서열 번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 2의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 이러한 구현예에서, 에레누맙은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체이고, 여기서 각각의 중쇄는 서열 번호 1의 서열을 포함하고, 각각의 경쇄는 서열 번호 2의 서열을 포함한다. 에레누맙은 재조합으로 제조될 때 중쇄 및 경쇄의 말단에서의 흔한 번역 후 변형, 예컨대 중쇄로부터의 456번 위치에서의 C 말단 리신 잔기의 제거 및 피로글루타메이트로의 경쇄 및 중쇄에서의 N 말단 글루타민 잔기의 고리화를 겪을 수 있다. 따라서, 용어 에레누맙은 또한 중쇄의 하나 또는 둘 다에서 C 말단 리신 잔기가 결여되고/되거나, 경쇄의 하나 또는 둘 다 및/또는 중쇄의 하나 또는 둘 다에서 글루타민 잔기 대신에 N 말단 잔기로서 피로글루타메이트 잔기를 포함하는 IgG2 항체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 에레누맙은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체이고, 여기서 각각의 중쇄는 서열 번호 3의 서열을 포함하고, 각각의 경쇄는 서열 번호 4의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 에레누맙은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체이고, 여기서 각각의 중쇄는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 서열을 포함하고, 각각의 경쇄는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물에 존재하는 에레누맙 변이체는 전하 변이체이다. 전하 변이체는 항체의 순전하를 직접 변경하거나, 입체형태 변화를 유도하거나, 국소 전하 분포에 영향을 미치는 특히 번역 후 변형으로부터 생긴 상이한 전하 프로필을 갖는 에레누맙의 변이체를 지칭한다. 이러한 번역 후 변형은 탈아미드화, 이성질체화, 글리코실화, 산화 및 시알릴화된 글리코실화를 포함할 수 있다. 전하 변이체는 에레누맙으로부터 분리되고, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 검출될 수 있다. 에레누맙의 전하 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 디설파이드 아이소폼 변이체, 산성 변이체 및 글리코실화 변이체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 에레누맙의 전하 변이체는 이성질체화 변이체이다. 에레누맙의 이성질체화 변이체는 중쇄 폴리펩타이드 또는 경쇄 폴리펩타이드에서의 하나 이상의 아스파르트산 잔기가 이소아스파르트산 또는 숙신이미드로 전환된 에레누맙의 변이체를 지칭한다. 일 구현예에서, 에레누맙의 이성질체화 변이체는 에레누맙의 중쇄(서열 번호 1 또는 서열 번호 3)의 어느 하나 또는 둘 다에서 105번 아미노산 위치에서 이소아스파르트산 잔기 또는 숙신이미드를 갖는다. 실시예 1에 기재된 바대로, 이소아스파르테이트로의 중쇄 가변 영역의 CDR3에서의 105번 위치에서의 아스파르트산 잔기의 전환은 에레누맙의 억제 효력을 유의미하게 감소시킨다.
다른 구현예에서, 에레누맙의 전하 변이체는 탈아미드화 변이체이다. 에레누맙의 탈아미드화 변이체는 중쇄 폴리펩타이드 또는 경쇄 폴리펩타이드에서의 하나 이상의 아스파라긴 잔기가 아스파르트산으로 전환되고, 결국 숙신이미드 또는 이소아스파르트산으로 전환될 수 있는 에레누맙의 변이체를 지칭한다. 일 구현예에서, 탈아미드화 변이체는 아스파르트산, 숙신이미드 또는 이소아스파르트산으로 전환된 에레누맙의 중쇄(서열 번호 1 또는 서열 번호 3)의 어느 하나 또는 둘 다에서 102번 아미노산 위치에서 아스파라긴 잔기를 갖는다. 실시예 1에 기재된 바대로, 중쇄 가변 영역의 CDR3에서의 102번 위치에서의 아스파라긴 잔기의 탈아미드화는 에레누맙의 억제 효력을 유의미하게 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 탈아미드화 변이체는 아스파르트산, 숙신이미드 또는 이소아스파르트산으로 전환된 에레누맙의 중쇄의 어느 하나 또는 둘 다에서 393번 및/또는 398번 아미노산 위치에서 아스파라긴 잔기를 갖는다.
에레누맙의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체를 검출하고 정량화하는 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피, 예컨대 실시예 1에 기재된 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC) 방법, 펩타이드 맵핑, 예컨대 실시예 1에 기재된 ESI-MS/MS 펩타이드 맵핑 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 실시예 3에 기재된 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC) 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 당업자에게 알려진 다른 방법, 예컨대 문헌[Kameoka et al., Journal of Biochemistry, Vol. 134: 129-135, 2003; Zhang et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 30: 1479-1490, 2003; Yang et al., Electrophoresis, Vol. 31: 1764-1772, 2010; Faseri et al., Journal of Chromatography A, Vol. 1498: 215-223, 2017; 및 Leblanc et al., Journal of Chromatography B, Vol. 1048: 130-139, 2017]에 기재된 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 에레누맙 조성물의 전체 효력이 임상 효능을 갖는 것으로 관찰된 수준에서 유지되도록 에레누맙의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 제어된 양을 포함한다. 실시예 1 및 실시예 2를 참조. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 하나 이상의 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체를 포함하고, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 30% 미만이다. 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 17% 미만, 약 15% 미만, 약 12% 미만, 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 6% 미만 또는 약 4% 미만일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 15% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 8% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 4% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 0.5% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 17%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 12%, 약 1% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 0.5% 내지 약 6%, 약 1% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 3.5%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 또는 약 1.7% 내지 약 2.1%일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 1% 내지 약 10%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 1% 내지 약 4%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 0.5% 내지 약 3.5%이다.
본 발명의 조성물에서의 에레누맙 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 이들 변이체를 검출하고 정량화하기 위한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 소정의 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에 의해 결정된다. 이성질체화 변이체(예를 들어, 중쇄에서의 Asp105의 이성질체화) 및 탈아미드화 변이체(예를 들어, 중쇄에서의 Asn102의 탈아미드화)는 HIC-HPLC의 프리피크 분획에서의 주요 종이다. 실시예 1 및 실시예 2를 참조. 따라서, 에레누맙 조성물에서의 이들 변이체의 양은 HIC-HPLC 크로마토그램에서의 프리피크의 피크 면적 백분율로부터 결정될 수 있다. HIC-HPLC 크로마토그램에서의 프리피크는, 일반적으로 최대 피크 높이를 갖는 크로마토그램에서의 피크인, 주 피크에 대한 보유 시간보다 짧은 보유 시간을 갖는 검출 한계보다 높은 피크 높이를 갖는 피크를 지칭한다. 도 2a, 도 2b, 도 5, 도 7 및 도 8을 참조. 주 피크는 상기 조성물에서의 항체 분자의 주요 형태인 에레누맙(예를 들어, 서열 번호 1 또는 3의 서열을 갖는 2개의 중쇄 및 서열 번호 2 또는 4의 서열을 갖는 2개의 경쇄를 포함하는 항체)에 대응한다. 프리피크의 피크 면적 백분율은 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
Figure pct00001
, 상기 식에서, 총 적분 피크 면적은 검출 한계 초과의 피크 높이를 갖는 크로마토그램에서의 모든 피크에 대해 합해진 면적이다. 유사하게, 주 피크의 피크 면적 백분율은 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
Figure pct00002
, 상기 식에서, 총 적분 피크 면적은 검출 한계 초과의 피크 높이를 갖는 크로마토그램에서의 모든 피크에 대해 합해진 면적이다. 일부 구현예에서, HIC-HPLC 방법은 실시예 1에 기재된 바대로 수행된다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물에서의 이성질체화 변이체(예를 들어, 중쇄에서의 Asp105의 이성질체화) 및 탈아미드화 변이체(예를 들어, 중쇄에서의 Asn102의 탈아미드화)의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 15% 이하이다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 10% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 8% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 6% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 4% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 3.2% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 2.7% 이하이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 1% 내지 약 10%이다. 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 1% 내지 약 4%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 0.5% 내지 약 3.5%이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하고, 여기서 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체를 포함하고,
(i) 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 HIC-HPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 93.9% 이상, 약 94.4% 이상, 약 96.2% 이상, 약 96.8% 이상, 또는 약 97.3% 이상이고;
(ii) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 6.1% 이하, 약 5.6% 이하, 약 3.8% 이하, 약 3.2% 이하, 또는 약 2.7% 이하이다.
일 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 HIC-HPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 92% 이상이고, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 8% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 HIC-HPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 96.8% 이상이고, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 3.2% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 HIC-HPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 97.3% 이상이고, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 2.7% 이하이다. 이들 구현예 및 다른 구현예에서, HIC-HPLC는 실시예 1에 기재된 바대로 수행되고, 그 양은 주 피크 및 프리피크에 대한 피크 면적 백분율로부터 결정된다.
실시예 2에 기재된 바대로, 중쇄 CDR3에서의 Asp105의 이성질체화는 강제된 열 스트레스 조건에 고도로 민감하고, 중쇄 CDR3(Asn102) 및 Fc 영역(Asn393 및 Asn398) 둘 다에서의 탈아미드화는 증가된 pH(예를 들어, pH 7.4 이상)에 노출될 때 증가한다. 따라서, 에레누맙의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 생성은 에레누맙 조성물의 노출 시간을 실온 초과의 온도에 그리고 염기성 용액, 예를 들어 pH가 7.0 초과인 용액에 한정함으로써 제조 공정 및 저장 동안 제어될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 공정내 풀이 유지되거나, 에레누맙 조성물의 저장은 14일 이하 동안 실온에서 유지된다. 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물의 장기간 저장은 15℃ 미만, 예를 들어 2℃ 내지 8℃의 온도에서 수행된다. 에레누맙의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체는 또한 정제 공정, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 통해 에레누맙 조성물로부터 제거될 수 있다. 에레누맙의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체 둘 다는 HIC에서 에레누맙보다 더 빨리 용리하고, 이에 따라 이 변이체는 이 더 빨리 용리하는 분획을 수집하고 버림으로써 에레누맙 조성물로부터 제거될 수 있다. 에레누맙의 탈아미드화 변이체는 일반적으로 에레누맙보다 더 음전하이고, 따라서 양이온 교환 크로마토그래피에서 에레누맙보다 더 빨리 용리하거나, 음이온 교환 크로마토그래피에서 에레누맙보다 더 늦게 용리할 것이다. 따라서, 더 산성인 탈아미드화 변이체는 양이온 교환 또는 음이온 교환 수지로부터 용리하는 분획의 수집을 적절하게 시기선택하여 에레누맙 조성물로부터 제거될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물에서의 에레누맙의 전하 변이체는 산성 변이체이다. 산성 변이체는 음전하를 얻거나 양전하를 잃거나, 입체형태 변화로 인해 변경된 표면 전하 프로필을 갖고, 이에 따라 에레누맙에 비해 더 산성인 특성을 갖는 에레누맙의 변이체를 지칭한다. 에레누맙의 산성 변이체는 에레누맙과 비교하여 감소한 억제 효력을 나타낸다. 실시예 3 및 표 14를 참조. 산성 변이체는 전하 특징에 기초하여 단백질을 분리하는 임의의 방법, 예컨대 등전 초점화 겔 전기영동, 모세관 등전 초점화 겔 전기영동, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 사용하여 에레누맙으로부터 분리되고 검출되고 정량화될 수 있다. 산성 변이체는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석될 때 에레누맙에 대응하는 주 피크에 대비하여 이의 보유 시간에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 산성 변이체는 CEX로부터 주 피크보다 더 빨리 용리하고, 즉 산성 변이체는 CEX에서 주 피크에 대한 보유 시간보다 더 짧은 보유 시간을 갖는다. 산성 변이체는 AEX를 사용할 때 주 피크보다 더 늦게 용리하고, 이에 따라 AEX에서 주 피크에 대한 보유 시간보다 긴 보유 시간을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 에레누맙 조성물의 전체 효력이 임상 효능을 갖는 것으로 관찰된 수준에서 유지되도록 에레누맙의 산성 변이체의 제어된 양을 포함하는 조성물을 제공한다. 실시예 3을 참조. 따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 산성 변이체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 40% 미만이다. 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 38% 미만, 약 37% 미만, 약 36% 미만, 약 35% 미만, 약 34% 미만, 약 33% 미만, 약 32% 미만, 약 31% 미만, 약 30% 미만, 약 29% 미만, 약 28% 미만, 약 27% 미만, 또는 약 26% 미만일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 38% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 35% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 32% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 30% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 38%, 약 24% 내지 약 35%, 약 28.5% 내지 약 37.5%, 약 26% 내지 약 34%, 약 28% 내지 약 32%, 약 32.5% 내지 약 37.5%, 약 28.7% 내지 약 31.3%, 또는 약 26.5% 내지 약 33.6%일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 25% 내지 약 38%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 26% 내지 약 34%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 28% 내지 약 32%이다.
본 발명의 조성물에서의 에레누맙의 산성 변이체의 양은 이들 변이체를 검출하고 정량화하기 위한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 소정의 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정된다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC, 예컨대 실시예 3에 기재된 방법에 의해 결정된다. 에레누맙의 산성 변이체는 CEX에 의해 분리될 때 에레누맙(주 피크)보다 더 빨리 용리하고, 에레누맙의 염기성 변이체는 에레누맙(주 피크)보다 더 늦게 용리한다. 도 11을 참조. 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC 크로마토그램에서의 산성 피크의 피크 면적 백분율로부터 결정될 수 있다. 산성 피크는 주 피크에 대한 보유 시간보다 짧은 보유 시간을 갖는 검출 한계보다 높은 피크 높이를 갖는 피크이다. 염기성 피크는 주 피크에 대한 보유 시간보다 긴 보유 시간을 갖는 검출 한계보다 높은 피크 높이를 갖는 피크이다. 원하는 성분에 대한 피크 면적(예를 들어, 산성 피크, 주 피크 또는 염기성 피크)을 총 적분 피크 면적으로 나누고 그 결과에 100을 곱해 원하는 성분에 대한 피크 면적 백분율(예를 들어, 산성 피크, 주 피크 또는 염기성 피크)을 계산할 수 있다. 소정의 구현예에서, CEX-HPLC 방법은 실시예 3에 기재된 바대로 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하고, 여기서 에레누맙 변이체는 산성 변이체를 포함하고, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에서 산성 피크에 의해 측정될 때 약 40% 이하, 약 38% 이하, 약 36% 이하, 약 35% 이하, 약 34% 이하 또는 약 32% 이하이다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에서 산성 피크에 의해 측정될 때 약 25% 내지 약 38%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에서 산성 피크에 의해 측정될 때 약 26% 내지 약 34%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에서 산성 피크에 의해 측정될 때 약 26.5% 내지 약 33.6%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에서 산성 피크에 의해 측정될 때 약 28.7% 내지 약 31.3%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에서 산성 피크에 의해 측정될 때 약 32.5% 내지 약 37.5%이다. 이들 구현예 및 다른 구현예에서, CEX-HPLC는 실시예 3에 기재된 바대로 수행되고, 산성 변이체의 양은 산성 피크에 대한 피크 면적 백분율로부터 결정된다.
산성 변이체는 디설파이드 아이소폼 변이체, 탈아미드화 변이체, 단편화 변이체, 비공통 글리코실화 변이체, 고분자량(HMW) 종, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 산성 변이체는 디설파이드 아이소폼 변이체(본원에 더 자세히 기재됨), 단편화 변이체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 실시예 3에 기재된 것처럼, 단편화 변이체 또는 디설파이드 아이소폼 변이체, 특히 IgG2-B 디설파이드 아이소폼이 풍부한 산성 분획은 에레누맙과 비교하여 감소한 효력을 나타낸다.
일부 구현예에서, 산성 변이체는 단편화 변이체를 포함한다. 단편화 변이체는 펩타이드 결합의 가수분해에 의해 형성될 수 있어서, 경쇄 폴리펩타이드 및/또는 중쇄 폴리펩타이드를 절단시킨다. 따라서, 에레누맙의 단편화 변이체는 전장 사슬보다 더 적은 아미노산으로 이루어진 에레누맙 경쇄의 단편(서열 번호 2 또는 4) 또는 에레누맙 중쇄의 단편(서열 번호 1 또는 3)을 지칭한다. 단편화 변이체는 황산 도데실 나트륨을 사용한 환원된 모세관 전기영동(rCE-SDS), 예컨대 저분자량(LMW) 종 및 중분자량(MMW) 종으로서 이 단편화 변이체를 분해하는 실시예 3에 기재된 rCE-SDS 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 에레누맙의 LMW 종은 분자량이 약 22,790 Da인 온전한 에레누맙 경쇄의 분자량보다 낮은 분자량을 갖는 단편이다. 에레누맙의 MMW 종은 온전한 에레누맙 경쇄의 분자량보다 높지만 분자량이 약 50,165 Da인(탈글리코실화됨) 온전한 에레누맙 중쇄의 분자량보다 낮은 분자량을 갖는 단편이다. rCE-SDS에 의한 분리 시, 에레누맙의 LMW 종은 에레누맙 경쇄 피크 전에 이동하고, 에레누맙의 MMW 종은 에레누맙 경쇄 피크와 에레누맙 중쇄 피크 사이에 이동한다. 예를 들어, 도 19를 참조.
에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양은 전하 특징에 기초하여 단백질을 분리시키는 크로마토그래피 방법, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피를 사용하여 감소할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,946,395호; 제9,067,990호; 제9,249,218호; 및 제9,346,879호에 기재된 방법을 참조. 상기 기재된 바대로, 에레누맙의 산성 변이체는 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리 시 에레누맙(주 피크)보다 더 일찍 용리한다. 따라서, 산성 변이체는 에레누맙 주 피크의 용리 전에 수집되고 버려질 수 있거나, 에레누맙 분획의 수집은 산성 변이체의 용리 후에 시작할 수 있다. 에레누맙의 산성 변이체는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리될 때 에레누맙(주 피크)보다 더 늦게 용리하고, 이에 따라 산성 변이체는 산성 변이체의 용리 전에 에레누맙 분획의 수집을 중단함으로써 에레누맙 조성물로부터 감소하거나 제거될 수 있다.
소정의 구현예에서, 산성 변이체는 디설파이드 아이소폼 변이체를 포함한다. IgG2 항체는 힌지 영역에서 디설파이드 결합의 배열에 기초하여 상이한 구조 아이소폼을 나타낼 수 있다. IgG2-A로 공지된 전통적인 디설파이드 아이소폼에서, Fab 아암은 디설파이드 결합을 통해 힌지 영역에 연결되지 않고, 하나의 중쇄의 힌지 영역에서의 4개의 시스테인 잔기(예를 들어, 서열 번호 1 또는 3의 C232, C233, C236 및 C239)는 각각 다른 중쇄의 힌지 영역에서 대응하는 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성한다. 도 15a를 참조. 디설파이드 아이소폼 변이체는 전통적인 IgG2-A 아이소폼에서 발견되는 것과 상이한 디설파이드 결합 연결성을 갖는 IgG2 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-B 아이소폼이다. IgG2-B 아이소폼 구조에서, Fab 아암 둘 다는 힌지 영역에서 하나 이상의 시스테인 잔기에 의해 힌지 영역에 연결되어 중쇄 불변 CH1 영역 및/또는 경쇄 불변 CL 영역에서 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성한다. 도 15c를 참조. 예를 들어, 일 구현예에서, IgG2-B 아이소폼은 제1 중쇄(HC1), 제1 경쇄(LC1), 제2 중쇄(HC2)와 제2 경쇄(LC2) 사이의 하기의 디설파이드 결합 연결성을 포함하고, 아미노산 위치는 중쇄에 대해 서열 번호 1 또는 3에 대한 것이고, 경쇄에 대해 서열 번호 2 또는 4에 대한 것이다:
Figure pct00003
HC2의 C157에 대한 HC1의 C232
Figure pct00004
LC1의 C215에 대한 HC1의 C233
Figure pct00005
HC1의 C157에 대한 HC2의 C232
Figure pct00006
LC2의 C215에 대한 HC2의 C233
Figure pct00007
HC2의 C236에 대한 HC1의 C236
Figure pct00008
HC2의 C239에 대한 HC1의 C239
다른 구현예에서, 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-A/B 아이소폼이다. IgG2-A/B 아이소폼 구조에서, 오직 하나의 Fab 아암은 힌지 영역에서 하나 이상의 시스테인 잔기에 의해 힌지 영역에 연결되어 중쇄 불변 CH1 영역 및/또는 경쇄 불변 CL 영역에서 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성한다. 도 15b를 참조. 일 구현예에서, IgG2-A/B 아이소폼은 HC1, LC1, HC2와 LC2 사이의 하기의 디설파이드 결합 연결성을 포함하고, 아미노산 위치는 중쇄에 대해 서열 번호 1 또는 3에 대한 것이고, 경쇄에 대해 서열 번호 2 또는 4에 대한 것이다:
Figure pct00009
HC2의 C157에 대한 HC1의 C232
Figure pct00010
LC2의 C215에 대한 HC2의 C232
Figure pct00011
HC2의 C233에 대한 HC1의 C233
Figure pct00012
HC2의 C236에 대한 HC1의 C236
Figure pct00013
HC2의 C239에 대한 HC1의 C239
본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 이의 디설파이드 아이소폼 변이체를 포함하는 조성물을 포함한다. 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-B 아이소폼, IgG2-A/B 아이소폼, 또는 둘의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 에레누맙 및 하나 이상의 이의 디설파이드 아이소폼 변이체를 포함하고, 여기서 하나 이상의 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-B 아이소폼을 포함하고, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 20% 미만이다. 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 18% 미만, 약 16% 미만, 약 14% 미만, 약 12% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 6% 미만일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 10% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 8% 미만이다. 소정의 구현예에서, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 16%, 약 3% 내지 약 12%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 6%, 약 4% 내지 약 6%, 약 4.4% 내지 약 5.9%, 또는 약 4.6% 내지 약 5.2%일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 0.5% 내지 약 8%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 4% 내지 약 6%이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에레누맙 및 하나 이상의 이의 디설파이드 아이소폼 변이체를 포함하고, 여기서 하나 이상의 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-A/B 아이소폼을 포함한다. 상기 조성물에서의 IgG2-A/B 아이소폼의 양은 약 10% 내지 약 56%, 약 20% 내지 약 40%, 약 26% 내지 약 38%, 약 27% 내지 약 32%, 약 32% 내지 약 38%, 약 34% 내지 약 37%, 또는 약 34.2% 내지 약 35.5%일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 IgG2-A/B 아이소폼의 양은 약 32% 내지 약 38%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 IgG2-A/B 아이소폼의 양은 약 34% 내지 약 37%이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에레누맙 IgG2-A 아이소폼, 에레누맙 IgG2-A/B 아이소폼 및 에레누맙 IgG2-B 아이소폼을 포함하고, 여기서
(i) 상기 조성물에서의 IgG2-A 아이소폼의 양은 약 50% 내지 약 70%, 약 52% 내지 약 66%, 약 56% 내지 약 60%, 또는 약 57.4% 내지 약 59.3%이고;
(ii) 상기 조성물에서의 IgG2-A/B 아이소폼의 양은 약 26% 내지 약 38%, 약 32% 내지 약 38%, 약 34% 내지 약 37%, 또는 약 34.2% 내지 35.5%이고;
(iii) 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 3% 내지 약 12%, 약 1% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 8%, 또는 약 4.6% 내지 약 5.2%이다.
디설파이드 아이소폼을 검출하고 정량화하는 방법은 비환원 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 예컨대 실시예 3 및 실시예 4 및 문헌[Wypych et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 283(23):16194-16205, 2008]에 기재된 RP-HPLC 방법; 펩타이드 맵핑, 예컨대 실시예 4에 기재된 Lys-C 펩타이드 맵핑 방법; 및 질량 분광법 기반 방법, 예컨대 문헌[Zhang et al., Anal Chem., Vol. 82(3):1090-1099, 2010 및 Zhang et al., Biochemistry, Vol. 54: 1956-1962, 2015]에 기재된 것을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물에서의 디설파이드 아이소폼(예를 들어, IgG2-A, IgG2-A/B 및 IgG2-B)의 양은 비환원 RP-HPLC에 의해, 선택적으로 RP-HPLC 프로필에서의 각각의 아이소폼에 대해 피크 면적 백분율을 사용하여 결정된다(예를 들어, 도 16a 참조).
디설파이드 아이소폼의 비율은 상이한 아이소폼을 포함하는 조성물을 문헌[Dillon et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 283(23):16206-16215, 2008], PCT 공보 WO 2006/047340호 또는 PCT 공보 WO 2006/060083호(이들 모두는 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 방법을 사용하여 단독으로 또는 무질서 유발제(chaotropic agent)와 조합하여 환원-산화(레독스) 물질에 노출시켜 변경될 수 있다. 예를 들어, IgG2-A 아이소폼의 비율은 상이한 아이소폼을 포함하는 조성물을 레독스 물질(예를 들어, 시스테인/시스틴 또는 글루타티온/산화된 글루타티온) 및 무질서 유발제(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드)에 노출시켜 증가할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, IgG2-A/B 및 IgG2-A 아이소폼보다 유의미하게 덜 강력한 에레누맙의 IgG2-B 아이소폼의 양은 선택적으로 Dillon 등의 2008 문헌; WO 2006/047340호; 또는 WO 2006/060083호에 기재된 방법에 따라 상기 조성물을 무질서 유발제와 조합하여 레독스 물질에 노출시켜 조성물로부터 감소하거나 제거될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물에 존재하는 에레누맙 변이체는 크기 변이체이다. 에레누맙의 크기 변이체는 에레누맙 단량체보다 더 낮은 분자량 또는 에레누맙 단량체보다 더 높은 분자량을 갖는 변이체를 지칭한다. 본원에 사용된 바대로, 용어 에레누맙 단량체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 항체를 지칭하고, 이 단량체는 N 말단 또는 C 말단 변형이 없는 탈글리코실화된 중쇄 및 경쇄를 측정할 때 약 146,194 Da의 분자량을 갖는다. 크기 변이체는 단편화 변이체, 예컨대 상기 기재된 LMW 종 및 MMW 종, 및 고분자량(HMW) 종을 포함한다. 에레누맙의 HMW 종은 에레누맙 단량체보다 큰 분자량을 갖는 종을 지칭한다. HMW 종은 공유 및 비공유 자기 회합을 통해 형성되는 에레누맙의 이합체, 다합체, 및 다른 응집체 형태를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 에레누맙의 HMW 종은 에레누맙의 공유 결합된 이합체(즉, 2개의 공유 결합된 에레누맙 단량체)를 포함한다. 소정의 구현예에서, 공유 결합된 에레누맙 이합체는 환원성 이합체이고, 이합체는 환원 및 변성 조건하에 개별 중쇄 및 경쇄로 환원된다.
에레누맙의 크기 변이체를 검출하고 정량화하는 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 예컨대 실시예 5에 기재된 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UHPLC) 방법, 환원 또는 비환원 조건하에 수행되는 황산 도데실 나트륨을 사용한 모세관 전기영동(CE-SDS), 예컨대 실시예 3에 기재된 rCE-SDS 및 nrCE-SDS 방법, 침강 속도 초원심분리 및 몰 질량을 결정하기 위한 정적 광 산란 검출을 이용한 SE-HPLC를 포함한다.
HMW 종이 풍부한 분획은 에레누맙과 비교하여 CGRP 수용체의 리간드 유도된 활성화를 억제하는 데 상당히 덜 강력하다. 실시예 5 및 표 26을 참조. 따라서, 본 발명은 에레누맙 조성물의 전체 효력이 임상 효능을 갖는 것으로 관찰된 수준에서 유지되도록 제어된 양의 HMW 종을 함유하는 에레누맙 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에레누맙 및 에레누맙의 HMW 종을 포함하고, 여기서 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 3.0% 미만이다. 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 2.5% 이하, 약 2.4% 이하, 약 2.3% 이하, 약 2.2% 이하, 약 2.1% 이하, 약 2.0% 이하, 약 1.8% 이하, 약 1.6% 이하, 약 1.4% 이하, 약 1.2% 이하, 약 1.0% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.6% 이하, 또는 약 0.4% 이하일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 1.8% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 1.4% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 1.2% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 0.6% 이하이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 0.3% 내지 약 2.4%, 약 0.4% 내지 약 1.2%, 약 0.6% 내지 약 2.1%, 약 0.3% 내지 약 1.8%, 약 1.0% 내지 약 1.6%, 또는 약 0.6% 내지 약 1.4%일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 0.4% 내지 약 1.2%이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 0.6% 내지 약 2.1%이다.
본 발명의 조성물에서의 크기 변이체의 양은 이들 변이체를 검출하고 정량화하기 위한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 소정의 구현예에서, 크기 변이체(예를 들어, HMW 종)의 양은 SE-UHPLC에 의해 결정된다. 에레누맙의 HMW 종은 SE-UHPLC에서 에레누맙 단량체(주 피크)보다 더 일찍 용리하고, 이에 따라 SE-UHPLC 크로마토그램에서의 프리피크에 대응하는 한편, LMW 및 MMW 종은 에레누맙 단량체보다 더 늦게 용리하고, 이에 따라 SE-UHPLC 크로마토그램에서의 포스트피크(post-peak)에 대응한다. 실시예 5 및 도 17a 및 도 17b를 참조. 따라서, 에레누맙 조성물에서의 이 크기 변이체의 양은 SE-UHPLC 크로마토그램에서의 프리피크(HMW 종) 또는 포스트피크(LMW 및 MMW 종)의 피크 면적 백분율로부터 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, SE-UHPLC 방법은 실시예 5에 기재된 바대로 수행된다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 크기 변이체를 포함하고, 여기서 에레누맙 크기 변이체는 에레누맙의 HMW 종을 포함하고,
(i) 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 SE-UHPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 97.5% 이상, 약 97.9% 이상, 약 98.2% 이상, 약 98.4% 이상, 약 98.6% 이상, 약 98.8% 이상, 약 99.2% 이상, 또는 약 99.4% 이상이고;
(ii) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 2.5% 이하, 약 2.1% 이하, 약 1.8% 이하, 약 1.6% 이하, 약 1.4% 이하, 약 1.2% 이하, 약 0.8% 이하, 또는 약 0.6% 이하이다.
일 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 SE-UHPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 97.9% 이상이고, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 2.1% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 SE-UHPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 98.2% 이상이고, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 1.8% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 SE-UHPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 98.8% 이상이고, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 1.2% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙의 양은 SE-UHPLC에서 주 피크에 의해 측정될 때 약 98.6% 이상이고, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 1.4% 이하이다. 이들 구현예 및 다른 구현예에서, SE-UHPLC는 실시예 5에 기재된 바대로 수행되고, 그 양은 주 피크 및 프리피크에 대한 피크 면적 백분율로부터 결정된다.
에레누맙 조성물에서의 크기 변이체(예를 들어, HMW 종)의 양은 크기 또는 수력학적 부피에 기초하여 단백질을 분리하는 방법, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 및 여과 단계를 사용하여 감소할 수 있다. 또한, 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피), 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피는 또한 HMW 종을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Shukla et al., Journal of Chromatography B, Vol. 848: 28-39, 2007; Chen et al., Journal of Chromatography A, Vol. 1217: 216-224, 2010]; 미국 특허 제6,620,918호; 제9,505,803호; 및 제9,783,570호에 기재된 방법을 참조. 상기 기재된 바대로, 에레누맙의 HMW 종은 크기 배제 크로마토그래피에 의한 분리 시 에레누맙(주 피크)보다 더 일찍 용리한다. 따라서, HMW 종은 에레누맙 주 피크의 용리 전에 수집되고 버려질 수 있거나, 에레누맙 분획의 수집은 HMW 종의 용리 후에 시작할 수 있다.
본 발명의 에레누맙 조성물은 하나 이상의 본원에 기재된 에레누맙 변이체에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 조성물은 제어된 양의 각각의 이들 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하고, 여기서 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상 또는 모두를 갖는다: (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 25% 내지 약 38%인 특징; (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 2.1% 이하인 특징; 및 (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 8.0% 이하인 특징. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상 또는 모두를 갖는다: (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 38% 미만인 특징; (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 2.5% 이하인 특징; 및 (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 10% 이하인 특징. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상 또는 모두를 갖는다: (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 32.5% 내지 약 37.5%인 특징; (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 1.8% 이하인 특징; 및 (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 6.1% 이하인 특징. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상 또는 모두를 갖는다: (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 26.5% 내지 약 33.6%인 특징; (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 1.2% 이하인 특징; 및 (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 3.2% 이하인 특징. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상 또는 모두를 갖는다: (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 26.5% 내지 약 33.6%인 특징; (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 1.2% 이하인 특징; 및 (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 2.7% 이하인 특징. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상 또는 모두를 갖는다: (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 26.5% 내지 약 33.6%인 특징; (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 1.4% 이하인 특징; 및 (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 3.2% 이하인 특징. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상 또는 모두를 갖는다: (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 28.7% 내지 약 31.3%인 특징; (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 0.6% 이하인 특징; 및 (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 2.1% 이하인 특징.
본 발명의 에레누맙 조성물은 숙주 세포에서 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 재조합으로 발현시키고, 숙주 세포 배양물 또는 숙주 세포 용해물로부터 에레누맙을 부분적으로 정제하거나 정제하고, 하기 더 자세히 기재된 방법에 따라 본원에 기재된 에레누맙 변이체 중 하나 이상에 대해 생성된 조성물을 분석하여 제조될 수 있다.
에레누맙의 재조합 제조를 위해, 중쇄(예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드) 및 경쇄(예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드)를 암호화하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 발현 벡터로 삽입된다. 중쇄를 암호화하는 핵산 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 단일 발현 벡터로 삽입될 수 있거나, 별개의 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"은 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 원하는 암호화 서열 및 적절한 핵산 제어 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 발현 벡터는 전사, 번역에 영향을 미치거나 제어하고, 인트론이 존재하면, 그에 작동 가능하게 연결된 암호화 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있다. 원핵생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 선택적으로 조작자 서열, 리보솜 결합 부위 및 가능하게는 다른 서열을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 분비 신호 펩타이드 서열은 또한 선택적으로, 발현된 폴리펩타이드가 원한다면 세포로부터의 관심 폴리펩타이드의 더 손쉬운 단리를 위해 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있도록, 관심 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 벡터는 또한 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진하기 위해 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 에레누맙의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 예시적인 핵산, 및 적합한 신호 펩타이드 서열 및 에레누맙을 재조합으로 발현하기 위한 발현 벡터를 위한 다른 성분은 본원에 전체가 참고로 포함된 PCT 공보 WO 2010/075238호에 기재되어 있다.
발현 벡터가 작제되고 에레누맙의 중쇄 및 경쇄 성분을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자가 벡터 또는 벡터들의 적절한 부위(들)에 삽입된 후에, 완성된 벡터(들)는 증폭 및/또는 폴리펩타이드 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 선택된 숙주 세포 내로 에레누맙에 대한 발현 벡터의 형질전환은 형질주입, 감염, 인산칼슘 동시침전, 전기천공, 미량주사, 리포펙션, DEAE-덱스트란 매개 형질주입, 또는 다른 알려진 기법을 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포 유형에 따를 것이다. 이 방법 및 다른 적합한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)]에 기재되어 있다.
숙주 세포는 적절한 조건하에 배양될 때 에레누맙을 합성하고, 이는 후속적으로 (숙주 세포가 그것을 배지 내로 분비한다면) 배양 배지로부터 수집되거나, (그것이 분비되지 않는다면) 그것을 생산하는 숙주 세포로부터 직접적으로 수집될 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자, 예컨대 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩타이드 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화) 및 생물학적으로 활성인 분자로의 접힘의 용이함에 따라 달라질 것이다.
예시적인 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 원핵생물 숙주 세포는 유박테리아, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스체리치아(Escherichia), 예컨대 E. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스(Bacillus), 예컨대 B. 서브틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 재조합 폴리펩타이드에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반 제빵 효모는 하등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나 여러 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 피치아(Pichia), 예컨대 P. 파스토리스(P. pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia); 칸디다(Candida); 트리코더마 리이시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 나이거(A. niger)가 일반적으로 이용 가능하며 본원에서 유용하다.
글리코실화된 항체의 발현을 위한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있다. 무척추 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 이집트 숲모기(Aedes aegypti)(모기), 흰줄숲모기(Aedes albopictus)(모기), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 누에나방(Bombyx mori)과 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 상기 세포의 형질주입을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 누에나방(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용 가능하다.
척추동물 숙주 세포가 또한 적합한 숙주이고, 이러한 세포로부터 항체의 재조합 생산이 일상적인 절차가 되었다. 발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 포유류 세포주는 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적인 예로서 CHOK1 세포(ATCC CCL61)를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, DXB-11, DG-44 및 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR를 포함하는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 이용 가능한 불멸화 세포주(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포(Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 포유류 골수종 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. CHO 세포는 일부 구현예에서 에레누맙을 발현하기 위한 바람직한 숙주 세포이다.
숙주 세포는 에레누맙의 생성을 위해 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환 또는 형질주입되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 에레누맙을 생성하는 데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 배지, 예컨대 Ham F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58: 44, 1979; Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255, 1980]; 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430호; 또는 WO 87/00195호에 기재된 임의의 배지는 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 인산염), 완충액(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 겐타마이신™ 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도로 보통 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며, 당업자에게 명백할 것이다.
숙주 세포를 배양할 때, 항체는 세포내, 주변세포질 공간에서 생성되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 제1 단계로서 세포내로 제조되면, 숙주 세포는 (예를 들어, 기계적 전단, 삼투성 쇼크 또는 효소 방법에 의해) 용해되고, 미립자 부스러기(예를 들어, 숙주 세포 및 용해된 단편)는 예를 들어 원심분리, 미세여과 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배양 배지로 분비되면, 항체는 원심분리 또는 미세여과를 통해 숙주 세포로부터 분리되고, 선택적으로 후속하여 한외여과를 통해 농축될 수 있다. 에레누맙은 예를 들어 하나 이상의 크로마토그래피 단계, 예컨대 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화도 크로마토그래피), 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다.
에레누맙 조성물이 제조되거나 얻어지면, 상기 조성물은 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체 및 크기 변이체(예를 들어, HMW 종)를 포함하는 하나 이상의 본원에 기재된 에레누맙 변이체의 존재 및 양에 대해 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계; 상기 조성물에서의 하나 이상의 에레누맙 변이체의 양을 측정하는 단계; 하나 이상의 에레누맙 변이체의 측정된 양을 소정의 참조 기준과 비교하는 단계; 및 그 비교가 소정의 참조 기준이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함하는, 에레누맙 조성물의 품질을 평가하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (1) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양을 측정하는 것, (2) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양을 측정하는 것, 및/또는 (3) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양을 측정하는 것 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다. 소정의 구현예에서, 3가지의 측정은 모두 에레누맙 조성물에서 수행된다.
각각의 에레누맙 변이체에 대한 소정의 참조 기준은 CGRP 수용체의 리간드 유도된 활성화를 억제하기 위한 에레누맙 조성물의 효력에 유의미하게 영향을 미치지 않는 변이체의 한계치 양 또는 양의 범위일 수 있다. 예를 들어, 변이체의 이들 한계/범위를 갖는 에레누맙 조성물이 임상 실험에서 평가된 에레누맙 조성물과 필적하는 효력을 갖고 임상 효능을 갖는 것으로 나타나면서 각각의 에레누맙 변이체에 대한 소정의 참조 기준은 각각의 변이체에 대해 본원에 개시된 임의의 한계 또는 범위일 수 있다.
상기 방법의 소정의 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙 변이체의 측정된 양이 소정의 참조 기준을 충족하면, 에레누맙 조성물은 허용 가능하다고 분류되고, 예를 들어 상기 조성물의 약제학적 제제를 제조함으로써(예를 들어, 하나 이상의 부형제 또는 희석제와 배합함으로써); 상기 조성물의 약제학적 제품을 제조함으로써(예를 들어, 바이알, 주사기, 오토인젝터 또는 다른 용기 또는 전달 장치로 충전함으로써); 상기 조성물을 사용 설명서, 희석제 및/또는 전달 장치와 패키징함으로써; 또는 상업적 판매를 위해 상기 조성물을 출시하거나 유통업자에 선적함으로써 제조 또는 배급 과정에서 다음 단계로 진행될 수 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙 변이체의 측정된 양이 소정의 참조 기준을 충족하면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제가 제조된다. 상기 방법의 다른 구현예에서, 상기 조성물에서의 에레누맙 변이체의 측정된 양이 소정의 참조 기준을 충족하면 에레누맙 조성물의 약제학적 제품이 제조된다. 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 및 약제학적 제품을 제조하는 방법은 하기에 더 자세히 기재되어 있다. 상기 조성물에서의 에레누맙 변이체의 측정된 양이 소정의 참조 기준을 충족하지 않으면, 상기 방법의 일부 구현예에서, 에레누맙 조성물은 허용 불가능하다고 분류되고, 소정의 참조 기준이 충족되도록 상기 조성물에서의 에레누맙 변이체의 양을 제거하거나 감소시키도록 버려지거나 파괴되거나 추가의 정제와 같은 추가의 제조 단계로 처리된다.
일 구현예에서, 에레누맙 조성물의 품질을 평가하는 방법은 에레누맙 및 에레누맙 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계; 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양을 측정하는 단계; 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 측정된 양을 소정의 참조 기준과 비교하는 단계; 및 그 비교가 소정의 참조 기준이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 30% 미만, 예를 들어 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 17% 이하, 약 15% 이하, 약 12% 이하, 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 6% 이하, 또는 약 4% 이하일 수 있다. 일 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 15% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 10% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 8% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 6% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 4% 이하이다. 소정의 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 3.2% 이하이다. 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 2.7% 이하이다. 일부 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 예를 들어 에레누맙 조성물의 약 1% 내지 약 10%, 에레누맙 조성물의 약 1% 내지 약 4%, 또는 에레누맙 조성물의 약 0.5% 내지 약 3.5%와 같은 양의 범위일 수 있다. 소정의 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에 의해, 예를 들어 HIC-HPLC에서 프리피크의 피크 면적 백분율에 의해 측정된다. 이러한 구현예에서, HIC-HPLC 방법은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물의 품질을 평가하는 방법은 에레누맙 및 에레누맙 산성 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계; 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양을 측정하는 단계; 산성 변이체의 측정된 양을 소정의 참조 기준과 비교하는 단계; 및 그 비교가 소정의 참조 기준이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 40% 미만, 예를 들어 약 38% 이하, 약 37% 이하, 약 36% 이하, 약 35% 이하, 약 34% 이하, 약 33% 이하, 약 32% 이하, 약 31% 이하, 약 30% 이하, 약 29% 이하, 약 28% 이하, 약 27% 이하, 또는 약 26% 이하일 수 있다. 일 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 38% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 35% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 32% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 30% 이하이다. 일부 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 에레누맙 조성물의 약 25% 내지 약 38%, 에레누맙 조성물의 약 32.5% 내지 약 37.5%, 에레누맙 조성물의 약 26% 내지 약 34%, 또는 에레누맙 조성물의 약 26.5% 내지 약 33.6%와 같은 양의 범위이다. 하나의 특정 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 25% 내지 약 38%이다. 또 다른 특정 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 26.5% 내지 약 33.6%이다. 소정의 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해, 예를 들어 CEX-HPLC에서 산성 피크의 피크 면적 백분율에 의해 측정된다. 이러한 구현예에서, CEX-HPLC 방법은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물의 품질을 평가하는 방법은 에레누맙 및 에레누맙의 HMW 종을 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계; 상기 조성물에서의 HMW 종의 양을 측정하는 단계; HMW 종의 측정된 양을 소정의 참조 기준과 비교하는 단계; 및 그 비교가 소정의 참조 기준이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 3.0% 미만, 예를 들어 약 2.5% 이하, 약 2.4% 이하, 약 2.3% 이하, 약 2.2% 이하, 약 2.1% 이하, 약 2.0% 이하, 약 1.8% 이하, 약 1.6% 이하, 약 1.4% 이하, 약 1.2% 이하, 약 1.0% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.6% 이하, 또는 약 0.4% 이하일 수 있다. 일 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 2.5% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 1.8% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 1.4% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 1.2% 이하이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양에 대한 소정의 참조 기준은 약 0.6% 이하이다. 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양에 대한 소정의 참조 기준은 일부 구현예에서 예를 들어 에레누맙 조성물의 약 0.3% 내지 약 2.4%, 에레누맙 조성물의 약 0.6% 내지 약 2.1%, 에레누맙 조성물의 약 0.4% 내지 약 1.2%, 또는 에레누맙 조성물의 약 0.6% 내지 약 1.4%와 같은 양의 범위일 수 있다. 소정의 구현예에서, 에레누맙 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해, 예를 들어 SE-UHPLC에서 프리피크의 피크 면적 백분율에 의해 측정된다. 이러한 구현예에서, SE-UHPLC 방법은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 소정의 구현예에서, 상기 방법은
(a) 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계이되, 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하는 단계;
(b) (i) HIC-HPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 10% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것;
(ii) CEX-HPLC에서의 산성 피크에 의해 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 25% 내지 약 38%의 소정의 참조 기준과 비교하는 것; 및/또는
(iii) SE-UHPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 HMW 종의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 2.5% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것
중 1가지, 2가지 또는 3가지 모두를 수행하여 에레누맙 조성물을 평가하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서의 그 비교 또는 비교들이 소정의 참조 기준/기준들이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 3가지의 단계 (b) (i), (b) (ii) 및 (b) (iii)을 모두 수행한다. 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (ii)를 수행한다. 또 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (ii) 및 (b) (iii)을 수행한다. 소정의 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (iii)을 수행한다.
본 발명의 방법의 소정의 다른 구현예에서, 상기 방법은
(a) 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계이되, 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하는 단계;
(b) (i) HIC-HPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 3.2% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것;
(ii) CEX-HPLC에서의 산성 피크에 의해 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 26.5% 내지 약 33.6%의 소정의 참조 기준과 비교하는 것; 및/또는
(iii) SE-UHPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 HMW 종의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 1.2% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것
중 1가지, 2가지 또는 3가지 모두를 수행하여 에레누맙 조성물을 평가하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서의 그 비교 또는 비교들이 소정의 참조 기준/기준들이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 3가지의 단계 (b) (i), (b) (ii) 및 (b) (iii)을 모두 수행한다. 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (ii)를 수행한다. 또 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (ii) 및 (b) (iii)을 수행한다. 소정의 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (iii)을 수행한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은
(a) 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계이되, 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하는 단계;
(b) (i) HIC-HPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 2.7% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것;
(ii) CEX-HPLC에서의 산성 피크에 의해 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 26.5% 내지 약 33.6%의 소정의 참조 기준과 비교하는 것; 및/또는
(iii) SE-UHPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 HMW 종의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 1.2% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것
중 1가지, 2가지 또는 3가지 모두를 수행하여 에레누맙 조성물을 평가하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서의 그 비교 또는 비교들이 소정의 참조 기준/기준들이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 3가지의 단계 (b) (i), (b) (ii) 및 (b) (iii)을 모두 수행한다. 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (ii)를 수행한다. 또 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (ii) 및 (b) (iii)을 수행한다. 소정의 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (iii)을 수행한다.
본 발명의 방법의 다른 구현예에서, 상기 방법은
(a) 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계이되, 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하는 단계;
(b) (i) HIC-HPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 3.2% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것;
(ii) CEX-HPLC에서의 산성 피크에 의해 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 26.5% 내지 약 33.6%의 소정의 참조 기준과 비교하는 것; 및/또는
(iii) SE-UHPLC에서의 프리피크에 의해 상기 조성물에서의 HMW 종의 양을 측정하고, 측정된 양을 약 1.4% 이하의 소정의 참조 기준과 비교하는 것
중 1가지, 2가지 또는 3가지 모두를 수행하여 에레누맙 조성물을 평가하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서의 그 비교 또는 비교들이 소정의 참조 기준/기준들이 충족된다는 것을 나타내면 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 3가지의 단계 (b) (i), (b) (ii) 및 (b) (iii)을 모두 수행한다. 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (ii)를 수행한다. 또 다른 구현예에서, 오직 단계 (b) (ii) 및 (b) (iii)을 수행한다. 소정의 구현예에서, 오직 단계 (b) (i) 및 (b) (iii)을 수행한다.
상기 기재된 에레누맙 조성물을 품질 분석하거나 평가하기 위한 본 발명의 방법은 다양한 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 에레누맙에 대한 제조 공정의 상이한 단계에서의 품질 관리 방법으로서(예를 들어, 공정내 제어 방법으로서) 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대부분의 또는 모든 제조 공정의 완료에서, 예를 들어 에레누맙 약물 물질(예를 들어, 활성 약제학적 성분 또는 API) 또는 에레누맙 약물 생성물(예를 들어, 인간 사용을 위해 하나 이상의 부형제와 제제화된 API)에 대한 로트 방출 방법으로서 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 약물 유통 기한의 결정을 촉진하기 위해 다양한 기간 동안 저장된 에레누맙 조성물을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 소정의 참조 기준이 초기에 충족되지 않고 재공정처리되는(예를 들어, 추가의 정제 조작으로 처리됨) 에레누맙 조성물을 재평가하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 상기 방법에 사용된 에레누맙 조성물은 에레누맙 및 가능하게는 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 임의의 조성물일 수 있다. 일부 구현예에서, 에레누맙 조성물은 서열 번호 1의 중쇄를 암호화하는 핵산 및 서열 번호 2의 경쇄를 암호화하는 핵산을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주로부터 얻는다. 이러한 구현예에서, 에레누맙 조성물은 세포 배양 수확물(예를 들어, 청징된 세포 배양 상청액 또는 청징된 세포 용해물)이다. 다른 이러한 구현예에서, 에레누맙 조성물은 하나 이상의 정제 조작으로 처리된 에레누맙의 부분적으로 정제된 제제(예를 들어, 하나 이상의 크로마토그래피 또는 여과 단계로부터의 풀 또는 분획)이다. 일 구현예에서, 에레누맙 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터의 용리 풀이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물은 에레누맙 약물 물질(예를 들어, 활성 약제학적 성분 또는 API)이다. 또 다른 구현예에서, 에레누맙 조성물은 에레누맙 약물 생성물(예를 들어, 인간 사용을 위한 하나 이상의 부형제와 제제화된 에레누맙 약물 물질 또는 API)이다.
에레누맙 조성물의 생물학적 활성은 상기 기재된 품질 평가 방법의 일부로서 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 CGRP 수용체의 CGRP 리간드 유도된 활성화를 억제하는 에레누맙 조성물의 능력을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. CGRP 수용체의 활성화를 평가하기 위한 다양한 검정이 당업계에 알려져 있으며, CGRP 리간드 유도성 칼슘 동원 및 cAMP 생산을 측정하는 세포 기반 검정을 포함한다. 예시적인 세포 기반 cAMP 검정은 실시예 1에서 기술되어 있다. 다른 적합한 CGRP 수용체 활성화 검정은 문헌[Aiyar et al., Molecular and Cellular Biochemistry, Vol. 197:179-185, 1999; Pin et al., European Journal of Pharmacology, Vol. 577: 7-16, 2007]; 미국 특허 제8,168,592호 및 WO 2010/075238호(이들 모두 본원에 전체가 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
본 발명은 본원에 기재된 에레누맙 조성물 중 어느 하나 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 제제를 포함한다. "약제학적으로 허용 가능한"은 사용된 투여량 및 농도에서 인간 수혜자에게 비독성이고/이거나 인간에게 투여될 때 알레르기 반응 또는 부작용을 일으키지 않는 분자, 화합물 및 조성물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 약제학적 제제는 예를 들어 에레누맙 조성물의 pH, 오스몰 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 살균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변경하거나 유지시키거나 보존하기 위한 물질을 함유할 수 있다. 이러한 구현예에서, 적합한 물질은 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제(예컨대, 아세트산염, 중탄산염, Tris-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산); 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예컨대, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물(예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제; 유화제; 친수성 중합체(예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염 형성 반대이온(예컨대 나트륨); 보존제(예컨대 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대, 만니톨 또는 소르비톨); 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉스(pluronics), PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제(예컨대, 수크로스 또는 소르비톨); 등장성 향상제(예컨대, 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨, 소르비톨); 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 보조제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료 용도를 위해 분자를 제제화하기 위한 방법 및 적합한 물질은 약제학적 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 제제는 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 4.5 내지 약 6.5의 범위 내에 용액의 pH를 유지시키는 완충액, 안정화제 및 선택적으로 계면활성제를 포함한다. 적합한 완충액은 글루타메이트, 아세테이트, Tris, 시트레이트, 히스티딘, 숙시네이트 및 포스페이트 완충액을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 약제학적 제제는 아세테이트 완충액을 포함한다. 아세테이트 완충액은 아세트산 또는 아세테이트 염, 예를 들어, 아세트산나트륨으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 아세테이트의 칼륨염, 암모늄염, 칼슘염 또는 마그네슘염과 같은 다른 염을 사용할 수 있다. 아세테이트 완충액을 포함하는 약제학적 제제는 일반적으로 약 4.5 내지 약 5.5의 pH 또는 약 4.8 내지 약 5.2의 pH, 예를 들어 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4 및 약 5.5의 pH를 갖는다.
안정화제는 항체의 고유한 입체구성을 안정화시키고/시키거나, 항체의 물리적 분해 또는 화학적 분해를 방지하거나 감소시키는 부형제를 지칭한다. 적합한 안정화제는 폴리올(예를 들어, 소르비톨, 글리세롤, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 에리쓰리톨 및 트레이톨), 당(예를 들어, 프럭토스, 글루코스, 글리세르알데하이드, 락토스, 아라비노스, 만노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스, 말토스, 수크로스, 트레할로스, 소르보스, 수크랄로스, 멜레지토스 및 라피노스) 및 아미노산(예를 들어, 글리신, 메티오닌, 프롤린, 리신, 아르기닌, 히스티딘 또는 글루탐산)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 약제학적 제제는 안정화제로서 당을 포함한다. 이들 구현예 및 다른 구현예에서, 당은 수크로스이다.
소정의 구현예에서, 약제학적 제제는 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 이것이 용해되는 액체의 표면 장력을 감소시키도록 작용하는 물질이다. 계면활성제는 예를 들어 액체 제제에서 응집, 입자 형성 및/또는 표면 흡착을 방지하거나 제어하기 위한 것 또는 동결건조된 제제에서 동결건조 및/또는 재구성 공정 동안 이 현상을 방지하거나 제어하기 위한 것을 포함하는 다양한 목적을 위해 약제학적 제제에 포함될 수 있다. 계면활성제는 예를 들어 유기 용매 및 수성 용액 둘 다에서 부분 용해도를 나타내는 양극성 유기 화합물을 포함한다. 계면활성제의 일반 특징은 물의 표면 장력을 감소시키고, 오일과 물 사이의 계면 장력을 감소시키고 또한 미셀(micelle)을 형성하는 이의 능력을 포함한다. 본 발명의 약제학적 제제로 혼입될 수 있는 계면활성제는 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제 둘 다를 포함한다. 적합한 비이온성 계면활성제는 알킬 폴리 (에틸렌 옥사이드), 알킬 폴리글루코사이드, 예컨대 옥틸 글루코사이드 및 데실 말토사이드, 지방 알콜, 예컨대 세틸 알콜 및 올레일 알콜, 코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA 및 코카마이드 TEA를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비이온성 계면활성제의 특정 예는 예를 들어 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 28, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81, 폴리소르베이트 85 등을 포함하는 폴리소르베이트; 예를 들어, 폴록살콜(poloxalkol) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)로도 공지된 폴록사머 188, 폴록사머 407 또는 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 등을 포함하는 폴록사머, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 적합한 이온성 계면활성제는 예를 들어 음이온성, 양이온성 및 양쪽이온성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제는 설포네이트계 또는 카복실레이트계 계면활성제, 예컨대 비누, 지방산 염, 황산 도데실 나트륨(SDS), 황산 라우릴 암모늄 및 다른 알킬 설페이트 염을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄계 계면활성제, 예컨대 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 다른 알킬트리메틸암모늄 염, 세틸 피리디늄 클로라이드, 폴리에톡실화 탤로우 아민(POEA) 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 양쪽이온성 또는 양쪽성 계면활성제는 예를 들어 도데실 베타인, 도데실 디메틸아민 옥사이드, 코카마이도프로필 베타인 및 코코 암포 글리시네이트를 포함한다. 소정의 구현예에서, 약제학적 제제는 비이온성 계면활성제를 포함한다. 일 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 또 다른 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
소정의 구현예에서, 약제학적 제제는 어느 하나의 본원에 기재된 에레누맙 조성물(예를 들어, 약 70 mg/mL 내지 약 140 mg/mL의 에레누맙 조성물), 약 20 mM 내지 약 40 mM 아세테이트, 약 6% 내지 약 9%(w/v) 수크로스 및 약 0.008% 내지 약 0.012%(w/v) 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20을 포함한다. 이들 제제의 pH는 약 4.9 내지 약 5.5의 범위(예를 들어, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3 또는 약 5.4의 pH)이다. 하나의 특정 구현예에서, 약제학적 제제는 70 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 25 mM 아세테이트, 약 7.3%(w/v) 수크로스 및 약 0.010%(w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하고, 여기서 약제학적 제제는 약 5.2 ± 0.2의 pH를 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 약제학적 제제는 140 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 34 mM 아세테이트, 약 6.5%(w/v) 수크로스 및 약 0.010%(w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하고, 여기서 약제학적 제제는 약 5.2 ± 0.2의 pH를 갖는다.
약제학적 제제는 바람직하게는 비경구 주사(예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사)에 적합하다. 비경구 주사에 적합한 예시적인 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 그리고 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 바람직하게는, 약제학적 제제는 멸균이고, 주사기 또는 다른 주사 장치를 통한 전달을 허용하기에 충분히 유체이다(즉, 이 제제는 주사기 또는 다른 주사 장치를 통한 통과를 막을 정도로 과도하게 점성이 아님). 멸균은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조될 때, 이 여과 방법을 사용하는 멸균은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적 제제는 동결건조 형태로 또는 용액으로 저장될 수 있다. 비경구 제제는 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백(bag) 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개가 있는 바이알에 배치될 수 있다. 비경구 제제는 또한 주사기, 오토인젝터 장치, 또는 펜 주사 장치 또는 이러한 주사 장치와 사용하도록 구성된 카트리지에 저장될 수 있다.
상기 기재된 약제학적 제제는 약제학적 제품을 제조하기 위해 바이알, 주사기, 오토인젝터, 또는 다른 용기 또는 전달 장치로 충전되고, 선택적으로 사용 설명서(예를 들어, 두통, 예를 들어 편두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키기 위해 약제학적 제제를 사용하기 위한 처방 정보를 함유하는 설명서)와 패키징될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 제제는 자가 투여 주사 장치로 혼입된다. 이러한 장치는 상업적으로 이용 가능하고, 오토인젝터, 투약 펜, 미세주입 펌프 및 프리필드 주사기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 약제학적 제제가 혼입될 수 있는 예시적인 장치는 오토인젝터(예를 들어, SureClick®, EverGentle®, Avanti®, DosePro®, Molly® 및 Leva®), 펜 주사 장치(예를 들어, Madie® 펜 주사기, DCP™ 펜 주사기, BD Vystra™ 1회용 펜, BD™ 재사용 펜) 및 프리필드 주사기(BD Sterifill™, BD Hypak™, Baxter로부터의 프리필드 주사기)를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 제제는 프리필드 주사기를 제조하기 위해 주사기로 혼입되고 여기에서 저장된다. 다른 구현예에서, 약제학적 제제는 오토인젝터로 혼입된다. 프리필드 주사기 또는 오토인젝터의 주사 부피는 약 2 mL 이하, 약 1.5 mL 이하 또는 약 1 mL 이하일 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 제제는 약 1 mL의 주사 부피를 갖는 주사기 또는 오토인젝터로 혼입된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 약 70 mg/mL 내지 약 140 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 20 mM 내지 약 40 mM 아세테이트, 약 6% 내지 약 9%(w/v) 수크로스 및 0.008% 내지 약 0.012%(w/v) 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20(약 4.5 내지 약 5.5의 pH)을 포함하는 프리필드 주사기를 제공한다. 일 구현예에서, 프리필드 주사기는 70 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 25 mM 아세테이트, 약 7.3%(w/v) 수크로스 및 약 0.010%(w/v) 폴리소르베이트 80(약 5.2 ± 0.2의 pH)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 프리필드 주사기는 140 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 34 mM 아세테이트, 약 6.5%(w/v) 수크로스 및 약 0.010%(w/v) 폴리소르베이트 80(약 5.2 ± 0.2의 pH)을 포함한다. 임의의 이들 구현예에서, 프리필드 주사기의 주사 부피는 약 1 mL일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 약 70 mg/mL 내지 약 140 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 20 mM 내지 약 40 mM 아세테이트, 약 6% 내지 약 9%(w/v) 수크로스 및 약 0.008% 내지 약 0.012%(w/v) 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20(약 4.5 내지 약 5.5의 pH)을 포함하는 오토인젝터를 제공한다. 일 구현예에서, 오토인젝터는 70 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 25 mM 아세테이트, 약 7.3%(w/v) 수크로스 및 약 0.010%(w/v) 폴리소르베이트 80(약 5.2 ± 0.2의 pH)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 오토인젝터는 140 mg/mL의 본원에 기재된 에레누맙 조성물, 약 34 mM 아세테이트, 약 6.5%(w/v) 수크로스 및 약 0.010%(w/v) 폴리소르베이트 80(약 5.2 ± 0.2의 pH)을 포함한다. 임의의 이들 구현예에서, 오토인젝터의 주사 부피는 약 1 mL일 수 있다.
본원에 기재된 에레누맙 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 약제학적 제제는 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 에레누맙 조성물 또는 본원에 기재된 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키는 방법을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키는 데 사용하기 위한 에레누맙 조성물 또는 본원에 기재된 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 에레누맙 조성물 또는 본원에 기재된 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제의 용도를 제공한다. "두통을 예방하거나 이의 발생을 감소시키는 것"은 상기 조성물/제제의 투여 전의 두통의 빈도, 기간 또는 중증도와 비교되거나 상기 조성물/제제가 투여되지 않은 환자(즉, 대조군 대상체)에서의 두통의 빈도, 기간 또는 중증도와 비교된 두통의 빈도, 기간 또는 중증도의 감소를 지칭한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 용도는 임의의 에레누맙 조성물 또는 본원에 기재된 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제를 환자에게 투여하여 이를 필요로 하는 환자에서 편두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시킨다. "편두통"은 구역 또는 구토 또는 빛 또는 소리에 대한 민감성과 관련이 있는 두통 및/또는 다음의 통증 특징 중 적어도 2개를 특징으로 하는 두통이다: 편측성 통증, 지끈거리는 통증, 중등도 내지 중증의 통증 강도, 또는 신체 활동에 의해 악화되는 통증. 일부 구현예에 따르면, 70 mg 또는 140 mg의 본원에 기재된 에레누맙 조성물을 포함하는 약제학적 제제는 환자에서 편두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키기 위해 1개월에 1회 환자에게 투여된다. 이러한 구현예에서, 약제학적 제제는 예를 들어 상기 기재된 주사 장치(예를 들어, 프리필드 주사기 또는 오토인젝터) 중 하나를 사용하여 피하 주사에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료되는 환자는 삽화성 편두통을 앓거나, 이로 고통을 받거나, 삽화성 편두통으로 진단을 받는다. 삽화성 편두통은 편두통의 병력(예를 들어, 적어도 5회의 평생 편두통 발작)이 있는 환자가 1개월당 14일 이하의 편두통일을 가질 때 진단된다. "편두통일(migraine headache day)"은 환자가 30분을 초과하여 전조가 지속되거나 지속되지 않는 "편두통"의 발병, 지속 또는 재발을 경험하는 임의의 달력일을 포함한다. 일부 구현예에서, 삽화성 편두통을 앓거나, 이로 고통을 받거나, 삽화성 편두통으로 진단을 받은 환자는 평균적으로 1개월당 적어도 4일, 그러나 15일 미만의 편두통일을 갖는다. 관련 구현예에서, 삽화성 편두통을 앓거나, 이로 고통을 받거나, 삽화성 편두통으로 진단을 받은 환자는 평균적으로 1개월당 15일 미만의 편두통일을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, "두통일"은 환자가 편두통 또는 30분을 초과하여 지속되거나 급성 두통 치료를 요하는 임의의 두통을 경험하는 임의의 달력일이다. 소정의 구현예에서, 환자는 고빈도 삽화성 편두통을 앓거나 이로 고통을 받는 것으로 분류될 수 있다. 고빈도 삽화성 편두통 환자는 1개월당 8일 내지 14일의 편두통일을 갖는 환자이다. 다른 구현예에서, 환자는 저빈도 삽화성 편두통을 앓거나 이로 고통을 받는 것으로 분류될 수 있다. 저빈도 삽화성 편두통 환자는 1개월당 8일 미만의 편두통일을 갖는 환자이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료되는 환자는 만성 편두통을 앓거나, 만성 편두통으로 고통을 받거나, 만성 편두통으로 진단을 받는다. 만성 편두통은 편두통 환자(즉, 적어도 5회의 평생 편두통 발작이 있는 환자)가 1개월당 15일 이상의 두통일을 갖고, 적어도 8일의 두통일이 편두통일일 때 진단된다. 일부 구현예에서, 만성 편두통을 앓거나, 만성 편두통으로 고통을 받거나, 만성 편두통으로 진단을 받은 환자는 평균적으로 1개월당 15일 이상의 편두통일을 갖는다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료되는 편두통 환자는 임의의 예방학적 편두통 치료를 과거에 받지 않았다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료되는 편두통 환자는 하나 이상의 예방학적 편두통 치료에 실패하거나 불관용성이다. 하나의 이러한 구현예에서, 환자는 적어도 하나의 편두통 예방제에 의한 과거의 치료에 반응하지 않았다. "반응 실패" 또는 "치료 실패"는 예방제의 표준 치료 요법 후에 환자에서의 편두통의 빈도, 기간 및/또는 중증도를 감소시키는 데 있어서의 예방제의 효능의 결여를 지칭한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 편두통 예방제에 의한 과거의 치료에 실패한 환자는 예방제에 의한 치료 전의 1개월당 편두통일의 수와 비교하여 편두통 예방제의 투여 후에 동일하거나 더 많은 1개월당 편두통일을 경험하는 환자이다. 편두통 예방제에 의한 과거의 치료의 반응 실패는 또한 편두통 예방제를 견딜 수 없음을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 편두통 예방제에 의한 과거의 치료에 실패한 환자는 예방제와 연관된 부작용을 견딜 수 없는 환자이다. 이러한 구현예에서, 예방제와 연관된 부작용은 악화할 수 있거나 환자가 갖는 또 다른 의학 병태와 공존 불가능할 수 있다. 소정의 구현예에서, 환자는 베타-차단제(예를 들어, 프로프라놀롤, 티몰롤, 아테놀롤, 메토프롤롤 및 나돌롤), 항간질제(예를 들어, 디발프로엑스, 나트륨 발프로에이트, 발프로산, 토피라메이트 및 가바펜틴), 삼환식 항우울제(예를 들어, 아미트립틸린, 노르트립틸린, 독세핀 및 플루옥세틴) 및 오나보툴리늄 독소A로부터 선택된 하나 이상의 물질에 의한 치료에 실패하거나 불관용성이다.
본원에 기재된 에레누맙 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 약제학적 제제는 또한 다른 유형의 두통 장애, 예컨대 긴장성 두통, 군발성 두통, 반신마비 편두통, 월경 편두통 및 망막 편두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키도록 사용될 수 있다. CGRP/CGRP 수용체 신호전달과 연관된 다른 질환 또는 병태는 또한 에레누맙 조성물 및 본원에 기재된 이러한 조성물을 포함하는 약제학적 제제에 의해 치료되거나 완화될 수 있다. CGRP/CGRP 수용체 신호전달과 연관된 질환 또는 병태는 만성 통증(예를 들어, 통각수용성 통증, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 섬유근육통, 관절염성 통증), 이질통, 염증(예를 들어, 신경성 염증, 건선, 골관절염), II형 당뇨병, 과민성 방광 및 천식을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 약제학적 제제는 바람직하게는 비경구로 환자에게 투여된다. 비경구 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 동맥내, 피내, 피하, 대뇌내, 뇌혈관내 및 초내 투여를 포함한다. 소정의 구현예에서, 약제학적 제제는 정맥내로 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 약제학적 제제는 피하로, 예를 들어 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 주사는 본원에 기재된 하나 이상의 장치(예를 들어, 프리필드 주사기 및 오토인젝터)를 사용하여 환자에게 전달될 수 있다.
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 다음의 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며 첨부되는 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1. HIC-HPLC에 의한 에레누맙 전하 변이체의 확인 및 규명
에레누맙은 IgG2 하위종류의 완전 인간 단일클론 항체이다. 항체는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 재조합으로 제조되고, 람다 하위종류의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진다. 각각의 중쇄는 4개의 사슬내 디설파이드를 갖는 456개의 아미노산을 함유한다. 각각의 경쇄는 2개의 사슬내 디설파이드를 갖는 216개의 아미노산을 함유한다. 에레누맙은 총 18개의 사슬내 디설파이드 결합 및 사슬간 디설파이드 결합에 대해 6개의 사슬간 디설파이드를 함유한다. 에레누맙의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있다. 각각의 중쇄는 서열 번호 1의 306번 위치에서의 아스파라긴 잔기에서의 공통 글리코실화 부위에서의 N 연결된 글리칸을 함유한다. 포유류 세포에 의해 생산된 항체에 대해 자주 관찰된 것처럼, 중쇄에서의 456번 위치에서의 C 말단 리신 잔기는 세포 배양에서 제조 동안 존재하는 카복시펩티다제에 의해 대부분 제거된다. 또한, 중쇄 및 경쇄 둘 다에서의 N 말단 글루타민 잔기는 제조 동안 피로글루타메이트로 자주 전환된다. 이들 N 말단 및 C 말단 변형을 갖는 에레누맙의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 도 1c 및 도 1d에 도시되어 있다. 중쇄 둘 다로부터 C 말단 리신이 제거되고 완전 중쇄 및 경쇄 N 말단 피로글루타메이트가 형성된 탈글리코실화된 에레누맙의 계산된 질량은 145,872 달톤이다.
에레누맙은 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고, CGRP가 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 것을 막는다. CGRP는 통각수용성 신호전달을 조절하는 신경펩타이드이고, 편두통 병리생리학과 연관된 혈관확장제이다. 에레누맙은 CGRP 수용체에 대한 CGRP의 결합과 강력하게 특이적으로 경쟁하고, 세포내 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 신호전달 캐스케이드의 CGRP 유도된 활성화를 억제한다. 에레누맙은 아드레노메둘린, 칼시토닌 또는 아밀린 수용체에서 임의의 유의미한 약물학적 활성을 나타내지 않고, CGRP 수용체에서 작용제 활성이 결여된다.
상업 규모 제조 공정에 의해 제조된 에레누맙 약물 물질의 생화학적 규명, 생물물리적 규명 및 생물학적 규명은 약물 물질의 구조적 특성 및 기능적 특성을 설명하도록 수행되었다. 이 실시예는 감소한 CGRP 수용체 억제 기능을 나타내는 에레누맙의 전하 변이체의 확인 및 규명을 기재한다. 이 실시예에서의 에레누맙의 전하 이질성은 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의해 평가되었다.
HIC-HPLC는 단백질을 주로 분자의 표면 소수화도에 기초하여 분리하고, 또한 구조적 이질성 및 칼럼 매트릭스와의 분자 상호작용에 영향을 미치는 다른 변형에 의해 영향을 받을 수 있다. HIC-HPLC에서의 피크 용리는 순 표면 소수화도의 함수이고, 표면 소수화도가 더 높은 분자는 표면 소수화도가 더 낮은 분자보다 더 늦게 용리한다.
에레누맙 약물 물질의 샘플은 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼(ProPac HIC-10, 5 ㎛ 입자 크기, 4.6 mm x 250 mm, ThermoFisher Scientific)에 로딩되었다. 이동상 A는 10 mM 아세트산나트륨, 1 M 황산암모늄(pH 5.5)을 함유하고, 이동상 B는 10 mM 아세트산나트륨(pH 5.5)으로 이루어졌다. 단백질은 0분 내지 52분에 25% 내지 100% 이동상 B 및 다시 55.5분 내지 75분에 25% 이동상 B로 생성된 감소하는 염 구배에서 분리되었다. 용리제는 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 모니터링되었다. 칼럼은 35℃에서 조작되고, 이동상은 0.5 mL/분의 유속에서 칼럼에 적용되었다.
HIC-HPLC 프로필은 프리피크, 주 피크 및 포스트피크를 포함하는 3개의 구별되는 영역을 함유하였다(도 2a 및 도 2b). 프리피크, 주 피크 및 포스트피크 영역에 걸쳐 7개의 분획이 단리되었다. 수집된 분획은 HIC-HPLC에 의해 재분석되었고, 이들 분획이 규명에 충분한 순도를 갖는다는 것을 나타냈다. 단리된 분획의 HIC-HPLC 프로필 및 순도는 각각 도 3 및 표 1에 기재되어 있다.
Figure pct00014
도 3 및 표 1에서의 프리피크, 주 피크 및 포스트피크 분획은 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UHPLC), LC-MS/MS를 이용한 환원된 트립신 펩타이드 맵핑 및 세포 기반 생물검정을 포함하는 다양한 분석 기법에 의해 규명되었다.
비분획화된 약물 물질 및 7개의 HIC-HPLC 분획은 BEH200 분석용 UHPLC 칼럼(1.7 ㎛ 입자 크기, 4.6 mm x 150 mm, Waters Corporation) 및 100 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨(pH 6.8)을 포함하는 이동상을 사용하여 SE-UHPLC에 의해 분석되었다. SE-UHPLC 분석은 모든 프리피크 및 포스트피크 분획에서 고분자량(HMW) 종이 풍부하지만, 가장 이른 프리피크 분획(F1) 및 가장 늦은 포스트피크 분획(F7)에서만이 비분획화된 약물 물질에 비해 저분자량(LMW) 종이 풍부하다는 것을 밝혀냈다(표 2).
Figure pct00015
풍부한 프리피크, 주 피크, 및 포스트피크 분획에 존재하는 에레누맙, 및 비분획화된 약물 물질의 생화학적 변형은 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광법(ESI-MS/MS)에 의한 검출과 함께 환원된 트립신 펩타이드 맵핑에 의해 평가되었다. 약물 물질 및 7개의 HIC-HPLC 분획은 7.5 M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액에서 변성되고, 0.5 M의 환원제 디티오트레이톨(DTT)로 처리되고, 모든 시스테인 잔기는 0.5 M 나트륨 요오도아세테이트(IAA)의 첨가에 의해 알킬화되었다. 환원되고 알킬화된 샘플은 겔 여과에 의해 탈염되고, 35분 동안 37℃에서 트립신에 의해 분해되었다. 분해된 샘플은 C18 칼럼(1.8 ㎛ 입자 크기, 2.1 mm x 150 mm) 및 0.3 mL/분의 유속에서의 아세토니트릴 구배에 의한 0.1% TFA 이동상을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 분리되었다. 펩타이드는 온라인 ESI-MS/MS에 의해 피크가 확인되면서 215 nm에서의 자외선(UV) 광 흡광도에 검출되었다. 각각의 펩타이드 이온의 단편화 패턴은 이후 이의 예상된 MS/MS 스펙트럼에 대해 조사되었다.
약물 물질 및 풍부한 분획의 오버레이가 도 4에 제시되고, 이는 TH12H13(서열 번호 1의 99번 내지 113번 아미노산 잔기) 및 TH13(서열 번호 1의 101번 내지 113번 아미노산 잔기)인 중쇄 CDR3 내의 2개의 펩타이드에 대한 용리 영역을 나타낸다. 프리피크 분획 F2, F3 및 F4 및 포스트피크 분획 F6은 모두 약물 물질에 대한 CDR3 펩타이드(TH13)의 변화를 나타냈다. 분획 F1 및 F7에 대해 TH13 펩타이드의 차이가 관찰되지 않았다. 프리피크 분획 F2, F3 및 F4 및 포스트피크 분획 F6은 중쇄 CDR3 펩타이드 TH13 내의 탈아미드화 변이체 및 이성질체화 변이체(이소아스파르테이트(IsoAsp) 및 숙신이미드 중간체) 둘 다 풍부하였다. 102번 위치에서의 아스파라긴 잔기의 탈아미드화 및 105번 위치에서의 아스파르트산 잔기의 이성질체화(위치 둘 다는 서열 번호 1에 대한 것임)가 관찰되었다. 상이한 보유 시간에서 용리하는 IsoAsp105로서 확인된 2개의 별개의 펩타이드가 관찰되었다. 이들 펩타이드는 아마도 아스파르트산 이성질체화 동안 생성된 구조적 거울상이성질체이다. 자연적 펩타이드 후에 용리하는 105번 위치에서의 숙신이미드 중간체에 대응하는 추가의 TH13 펩타이드 변이체가 또한 관찰되었다. 변형된 펩타이드의 추출된 이온 크로마토그램(EIC) 피크 면적을 비변형된 펩타이드로부터 생성된 피크 면적과 비교하여 변형 수준이 근사치 계산되었다. 질량 분석은 프리피크 영역 및 포스트피크 영역 내의 상승된 탈아미드화 변이체 및 IsoAsp 변이체의 존재를 확인시켜주었다(표 3).
Figure pct00016
rCE-SDS에 의한 프리피크 분획 F1의 분석이 이전에 유의미한 수준의 LMW 및 중분자량(MMW) 종을 나타내면서, 이 분획은 감소하고 ESI-TOF 질량 분광법에 의해 분석되었다. 총 6개의 절단 단편은 프리피크 분획 F1에서 확인되었고, 이들 중 4개의 절단 부위(Leu315/Thr316; Ser197/Val198; Leu195/Ser196; 및 Leu192/Tyr193)는 중쇄 CH1 및 CH2 도메인 내에 있었다. 2개의 절단 부위(Gly108/Tyr109 및 Asp105/Ser106)가 중쇄의 CDR3에서 또한 확인되었다. 모든 종에 대해, C 말단 단편만이 검출되었다. 상승된 수준의 Leu195/Ser196 절단 단편은 약물 물질에 비해 프리피크 분획 F1 내에 관찰되었다(표 3).
에레누맙 약물 물질과 비교하여 풍부한 HIC-HPLC 분획의 생물학적 활성은 세포 기반 생물검정에 의해 평가되었다. 세포 기반 생물검정은 인간 CGRP 수용체의 리간드 유도된 활성화를 억제하는 에레누맙의 능력을 측정함으로써 에레누맙의 효력을 평가한다. CGRP 수용체는 G-단백질 결합 수용체이고, 이 계열의 수용체는 이의 신호 전달 기전의 일부로서 세포내로 cAMP를 생성시키는 것으로 나타났다. 인간 CGRP 수용체를 발현하는 안정한 중국 햄스터 난소 K1(CHO-K1) 세포주(CHO-K1 huCGRP)는 CGRP 리간드 및 변화하는 농도의 에레누맙 참조 표준품 및 시험 샘플과 항온처리되었다. 에레누맙 참조 표준품 및 시험 샘플의 존재 또는 부재하에 CGRP와의 항온처리 후에 세포에 의해 생성된 cAMP의 양은 경쟁적 균일 시분해 형광 에너지 이동(TR-FRET) 검정을 사용하여 측정되었고, 여기서 검출 가능한 신호는 표지된 검정 성분(Alexa Fluor® 647 염료로 표지된 cAMP 및 항-cAMP 단일클론 항체-크립테이트)이 서로에 결합할 때 생성된다. cAMP가 CGRP에 의해 CGRP 수용체의 활성화에 의해 세포내로 생성될 때, 그 세포에 의해 생성된 자연적 cAMP는 크립테이트 표지된 항-cAMP 단일클론 항체에 대한 결합에 대해 Alexa Fluor® 647 염료 표지된 cAMP와 경쟁하고, 검출 가능한 신호가 감소한다. 따라서, TR-FRET cAMP 검정의 경쟁 성질로 인해, 생성된 신호는 세포에서 cAMP의 농도에 역비례한다. TR-FRET 신호는 플레이트 판독기에 의해 측정되었다. 시험 샘플의 활성은 시험 샘플로 생성된 신호를 에레누맙 참조 표준품으로 생성된 신호와 비교하여 결정되고, 상대 효력으로 보고된다.
하기 표 4에 기재된 것처럼, 모든 프리피크 분획은 유의미한 효력 감소를 나타냈다. 이 감소는 상기 기재된 바와 같이 프리피크 분획에서의 주요 변이체인 (F1 분획에 대한) 높은 수준의 단편화 또는 (분획 F2-F4에 대한) 중쇄 CDR3 영역에서의 탈아미드화 및 이성질체화로 인한 것이다. 포스트피크 분획은 또한 아마도 상기 기재된 바와 같이 포스트피크 분획에서의 주요 변이체인 상승된 HMW 종 및 낮은 수준의 중쇄 CDR3 아스파르트산(Asp105) 이성질체화의 결과로서 효력 감소를 나타냈다.
Figure pct00017
이 실시예에 기재된 분석의 결과는 에레누맙 약물 물질의 HIC-HPLC 프로필이 프리피크, 주 피크 및 포스트피크를 포함하는 3개의 구별되는 영역을 함유한다는 것을 나타냈다. HIC-HPLC에 의해 검출된 주요 에레누맙 변이체는 프리피크 및 포스트피크 영역 둘 다에서 중쇄 CDR3 아스파르트산 이성질체화(예를 들어, 서열 번호 1의 Asp105의 이성질체화) 변이체 및 탈아미드화(예를 들어, 서열 번호 1의 Asn102의 탈아미드화) 변이체를 포함한다. 단편화된 종은 프리피크 그룹에서 관찰되고, 상승된 수준의 HMW 종은 포스트피크 그룹에서 관찰되었다. 모든 에레누맙 HIC-HPLC 프리피크 및 포스트피크 분획의 효력은 세포 기반 생물검정에 의해 평가된 바대로 약물 물질보다 낮았다. 프리피크는 중쇄 CDR3 영역에서의 아스파르트산 이성질체화 및 탈아미드화, 및 높은 수준의 단편화 변이체의 결과로서 유의미한 효력 감소를 나타냈다. 포스트피크는 또한 상승된 수준의 HMW 종 및 중쇄 CDR3 이성질체화 변이체의 결과로서 효력 감소를 나타냈다.
에레누맙의 중쇄 CDR3 아스파르트산 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화 변이체의 존재가 조성물의 억제 효력에 영향을 미치므로, 상업적 규모로 제조된 에레누맙 약물 물질(140 mg/mL)의 여러 로트는 HIC-HPLC 크로마토그램에서의 프리피크의 피크 면적 백분율에 의해 측정된 바대로 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 존재 및 분량을 평가하도록 HIC-HPLC에 의해 분석되었다. 약물 물질 로트의 효력은 또한 상기 기재된 세포 기반 효력 검정에 의해 평가되고, II상/III상 임상 실험에 사용된 에레누맙 약물 물질을 대표하는 로트 78137호의 효력과 비교되었다. 데이터의 요약은 하기 표 5에 제공된다.
Figure pct00018
표 5에서의 데이터에 의해 표시된 것처럼, 상업적 규모로 제조된 에레누맙 약물 물질은 HIC-HPLC 프리피크에 의해 측정된 바대로 1.7% 내지 2.1%의 범위의 한결같은 수준의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체를 함유하였다. 이 범위에서 탈아미드화/이성질체화 변이체의 수준을 함유하는 약물 물질은 임상 실험에서 사용된 에레누맙 약물 물질의 효력에 필적하는 효력을 나타냈다.
실시예 2. 다양한 저장 조건하에 에레누맙 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 평가
Asn102의 탈아미드화 및 이소아스파르테이트로의 Asp105의 전환은 약물 물질의 제조 동안 에레누맙 중쇄의 CDR3에서 관찰되었다(실시예 1). 이들 변형을 갖는 에레누맙 변이체는 에레누맙의 비변형된 형태와 비교하여 효력 감소를 나타냈다(실시예 1). 에레누맙 약물 물질의 효력에 대한 Asn102 탈아미드화 변이체 및 Asp105 이성질체화 변이체의 영향을 추가로 평가하기 위해, 에레누맙 약물 물질은 탈아미드화 변이체 및 이성질체화 변이체의 형성을 증가시키도록 스트레스 조건으로 처리되고, 스트레스인 약물 물질의 효력이 평가되었다. 구체적으로는, 에레누맙 약물 물질은 탈아미드화 변이체 및 이성질체화 변이체의 생성을 촉진하도록 3가지의 스트레스 조건으로 처리되었다:
Figure pct00019
열 노출(14일 동안 50℃)
Figure pct00020
생리학적 pH 및 온도(14일 동안 37℃에서 pH 7.4)
Figure pct00021
높은 pH 노출(14일 동안 25℃에서 pH 8.0)
시간 경과에 따라 각각의 스트레스 조건에 의해 유도된 탈아미드화 변이체 및 이성질체화 변이체의 형성은 실시예 1에 기재된 HIC-HPLC 및 환원된 트립신 펩타이드 맵핑 방법에 의해 모니터링되었다. 각각의 스트레스 조건에 대해, 샘플을 연구의 과정에 걸쳐 다양한 시점에 제거하고 동결시켰다. 최종 시점 후에, 모든 샘플을 분석 변동성을 최소화하기 위해 나란히 분석하였다.
열 노출
50℃에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 HIC-HPLC 분석의 결과는 유의미한 프리피크 증가를 나타냈다(도 5 및 표 6). 이 프리피크 증가는 하기 자세히 설명된 환원된 트립신 펩타이드 맵핑 분석에 의해 밝혀진 것처럼 열 스트레스에 대한 노출 14일 후에 주로 아스파르트산 이성질체화의 증가로 인한 것이다. 포스트피크의 증가는 또한 아마도 실시예 1에서 표 2에 기재된 것처럼 더 늦게 용리하는 포스트피크의 일부로서 이 용리물로서의 증가한 수준의 HMW 종으로 인해 관찰되었다.
Figure pct00022
펩타이드 맵 크로마토그램은 노출의 시간에 걸친 새로운 피크의 존재 또는 이미 있는 피크의 피크 면적의 유의미한 변화에 대해 평가되었다. 차이가 관찰되는 영역을 강조하는 0일 및 14일 샘플의 확대 크기의 오버레이가 도 6에 도시되어 있다. 중쇄 CDR3에서의 Asp105에서의 아스파르트산 이성질체화(펩타이드 TH12H13 및 TH13)는 펩타이드 맵 오버레이에서 관찰된 주요 분해물질이다. Fc 영역에서의 Leu315 내지 Thr316 사이의 (서열 번호 1의 311번 내지 326번 아미노산 잔기에 대응하는) 펩타이드 TH26의 가수분해 단편은 14일 샘플 크로마토그램에서 또한 관찰되었다.
열 스트레스 조건에 노출된 에레누맙 약물 물질의 생물학적 활성은 실시예 1에 기재된 세포 기반 생물검정에 의해 평가되었다. 표 7에 기재된 것처럼, 열 스트레스는 14일 동안 50℃에 노출된 후에 에레누맙 약물 물질의 상대 효력에 부정적인 영향을 가졌다. 열 스트레스 후에 효력 감소는 Asp105 이성질체화 변이체 및 고분자량 종의 증가로 인한 것이고, 이들 둘 다는 효력에 영향을 미치는 것으로 나타났다(실시예 1 및 실시예 5 참조).
Figure pct00023
생리학적 pH 및 온도
에레누맙 약물 물질을 pH 7.4에서의 인산염 완충 식염수(PBS) 용액으로 대략 10 mg/mL로 희석에 의해 생리학적 pH에 노출시키고, 14일 동안 37℃(생리학적 온도)에서 항온처리하였다. 제제 완충액(15 mM 아세트산나트륨, 8.2% (w/v) 수크로스, 0.010% (w/v) 폴리소르베이트 80)(pH 5.2)에 희석된 약물 물질인 pH 대조군을 14일에 걸쳐 37℃에서 항온처리하였다. 따라서, "생리학적 pH 스트레스인 샘플"을 pH 및 열 스트레스 둘 다에 노출시키는 한편, "pH 대조군 샘플"을 열 스트레스에만 노출시켰다.
14일 생리학적 pH 스트레스인 샘플과 0일 샘플과의 HIC-HPLC 프로필 비교는 프리피크 및 포스트피크 둘 다의 증가를 나타냈다(도 7 및 표 8). 생리학적 pH 스트레스인 샘플 및 pH 대조군 샘플로부터의 14일 트레이스는 Asp105 이성질체화 변이체에 대응하는 대략 30분에 용리하는 유사한 수준의 프리피크를 나타내고, 이는 이 이소아스파르테이트 변이체가 pH 스트레스보다는 열 스트레스에 의해 주로 유도된다는 것을 제안한다. Asn102 탈아미드화 변이체에 대응하는 대략 34분에 용리하는 프리피크는 pH 대조군이 아니라 14일 생리학적 pH 스트레스인 샘플에서 증가하여, Asn102의 탈아미드화가 열 스트레스보다는 pH 스트레스에 의해 주로 유도된다는 것을 나타낸다. 포스트피크의 증가가 0일 샘플 및 14일 pH 대조군 샘플 둘 다에 비해 14일 생리학적 pH 스트레스인 샘플에서 또한 관찰되어, 그 변화가 주로 pH 스트레스에 의해 유도된다는 것을 나타낸다.
Figure pct00024
생리학적 pH 및 온도에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 생화학적 변형은 트립신에 의한 분해 후에 질량 분광법(MS)을 이용한 환원된 펩타이드 맵핑에 의해 모니터링되었다. MS 데이터의 분석은 중쇄 CDR3(Asn102) 및 Fc 영역(Asn393 및 Asn398) 둘 다에서의 탈아미드화의 증가, 및 증가한 양의 중쇄 CDR3 Asp105 이성질체화(데이터 비기재)를 나타냈다. 중쇄 CDR3 Asp105 이성질체화 및 Asn102 탈아미드화의 증가한 수준은 도 7 및 표 8에 기재된 HIC-HPLC에 의해 관찰된 프리피크 및 포스트피크 증가와 일치한다.
생리학적 pH 및 온도에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 생물학적 활성은 세포 기반 생물검정에 의해 평가되었다. 표 9에 기재된 것처럼, 생리학적 pH 및 온도 스트레스는 노출 14일 후에 에레누맙 약물 물질의 효력 감소를 생성하였다. Asn102 탈아미드화 변이체 및 Asp105 이성질체화 변이체의 수준의 증가가 이 스트레스 조건하에 관찰되었지만, 오직 적절한 효력 감소가 관찰되었다. 이 결과는 아마도 세포 기반 생물검정에 의해 측정된 바대로 효력에 유의미하게 영향을 미치기에 너무 낮은, 약물 물질의 약 6%를 차지하는, 이 탈아미드화 변이체 및 이성질체화 변이체의 전체 수준으로 인한 것이다.
Figure pct00025
높은 pH 노출
에레누맙 약물 물질을 Tris 염기 용액(pH 8.0)으로 대략 10 mg/mL로 희석하여 높은 pH에 노출시키고, 14일 동안 25℃에서 항온처리하였다. 제제 완충액(15 mM 아세트산나트륨, 8.2% (w/v) 수크로스, 0.010% (w/v) 폴리소르베이트 80)(pH 5.2)에 희석된 약물 물질인 pH 대조군을 14일에 걸쳐 25℃에서 항온처리하였다.
HIC-HPLC 분석의 결과는 Asn102 탈아미드화로 인한 프리피크의 증가, 및 0일 샘플 및 pH 대조군 샘플에 비해 14일 높은 pH 스트레스인 샘플에서의 포스트피크의 증가를 나타냈다(도 8 및 표 10).
Figure pct00026
높은 pH에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 생화학적 변형은 트립신에 의한 분해 후에 MS를 이용한 환원된 펩타이드 맵핑에 의해 모니터링되었다. 생리학적 pH 스트레스 조건에서처럼, Asn102에서의 중쇄 CDR3에서의 탈아미드화, 및 Asn393 및 Asn398에서의 Fc 영역 내의 탈아미드화의 증가는 0일 및 pH 대조군 샘플에 비해 14일 스트레스 샘플에 관찰되었다. 높은 pH에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 생물학적 활성은 세포 기반 생물검정에 의해 평가되었다. 표 11에 기재된 것처럼, 높은 pH 스트레스는 노출 14일 후에 에레누맙 약물 물질의 효력에 적절한 영향을 미쳤다. 생리학적 pH 및 온도 스트레스 조건에 의해 얻은 결과와 유사하게, 스트레스 약물 물질에 존재하는 Asn102 탈아미드화 변이체의 전체 수준은 세포 기반 생물검정에 의해 측정된 바대로 효력에 유의미한 영향을 미치기에 너무 낮았다.
Figure pct00027
에레누맙 약물 물질의 효력을 유의미하게 감소시키는 데 필요한 Asn102 탈아미드화 변이체 및 Asp105 이성질체화 변이체의 수준을 더 잘 확인하기 위해, 효력과 HIC-HPLC 프리피크 면적 백분율 사이의 관계를 모델링하는 통계 분석을 상이한 온도에서 저장된 상이한 에레누맙 로트로부터 이용 가능한 데이터로 수행하였다. 에레누맙 로트를 5℃(13개 로트), 25℃(4개 로트), 30℃(4개 로트) 또는 40℃(5개 로트)에서 저장하였다. 5℃ 저장 조건으로부터의 데이터에 대해, 오직 1 시점에 6개의 로트가 있고, 오직 2 시점에 9개 로트가 있었다. 모든 다른 저장 조건은 적어도 3가지의 상이한 시점으로부터의 데이터를 가졌다.
세포 기반 생물검정에 의해 측정된 바와 같은 % 상대 효력은 4가지의 상이한 저장 조건에 대해 HIC-HPLC 크로마토그램에서의 프리피크에 대한 % 피크 면적의 함수로 작도되었고, 회귀 분석이 수행되었다(도 9). 적합화된 회귀 선의 기울기 추정은 기울기가 0과 다른지를 결정하기 위해 시험에 대해 조정된 p-값과 함께 각각의 온도에 대해 결정되었다(표 12). 40℃ 저장 조건으로부터의 데이터에 대한 회귀 선의 기울기는 0.05 유의도 수준에서 0으로부터 통계적으로 유의미하였다. 40℃ 저장 조건으로부터의 데이터의 회귀 분석에 기초하여, HIC-HPLC 프리피크 면적의 1% 증가는 상대 효력을 1.14% 감소시켰다.
Figure pct00028
임상 실험에 사용된 에레누맙 약물 물질의 상대 효력은 세포 기반 생물검정에 의해 측정된 바대로 70% 초과였다. 임상 실험에 허용 가능한 수준(70%)보다 낮게 에레누맙 약물 물질의 효력을 감소시키는 (HIC-HPLC 프리피크로 표시된) Asn102 탈아미드화 변이체 및 Asp105 이성질체화 변이체의 수준을 추정하기 위해, 도 9에 도시된 40℃ 저장 조건에 대한 적합화된 회귀 선은 70% 상대 효력에 대한 HIC-HPLC 프리피크의 % 면적을 나타내도록 외삽되었다. 도 10에 도시된 것처럼, 적합화된 회귀 선에 기초한 70% 상대 효력에 대한 % HIC-HPLC 프리피크 면적의 예측된 값은 약 28.85%이다.
이 실시예에 기재된 실험의 결과는 에레누맙 약물 물질에서의 Asn102 탈아미드화 변이체의 수준 및/또는 Asp105 이성질체화 변이체의 수준의 증가가 CGRP 수용체의 CGRP 유도된 활성화를 억제하는 에레누맙의 효력을 소실시킨다는 것을 나타낸다. 탈아미드화 변이체 및 이성질체화 변이체의 수준은 모니터링되고, 임상 실험에 사용된 에레누맙 약물 물질과 유사한 수준으로 약물 물질의 효력을 유지시키기 위해 약물 물질에서 약 30% 미만으로 제어되어야 한다. 일부 구현예에서, 약물 물질에서의 약 17%의 Asn102 탈아미드화 변이체 및/또는 Asp105 이성질체화 변이체가 에레누맙 약물 물질의 효력을 유의미하게 감소시키므로(표 6 및 표 7 참조), 약물 물질에서의 더 낮은 수준(예를 들어, 약 15% 미만)의 이들 변이체가 바람직하다.
실시예 3. CEX-HPLC에 의한 에레누맙 전하 변이체의 확인 및 규명
이 실시예는 감소한 CGRP 수용체 억제 기능을 나타내는 에레누맙의 추가의 전하 변이체의 확인 및 규명을 기재한다. 이 실시예에서의 에레누맙의 전하 이질성은 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC)에 의해 평가되었다.
CEX-HPLC는 단백질을 주로 표면 전하의 이질성에 기초하여 분리하지만, 또한 구조적 이질성 및 이온 교환 수지와의 분자 상호작용에 영향을 미치는 다른 변형에 의해 영향을 받을 수 있다. 이 방법에서의 피크 용리는 더 일찍 용리하는 음으로 하전된 종 및 더 늦게 용리하는 양으로 하전된 종을 갖는 순 표면 전하의 함수이다.
에레누맙 약물 물질의 샘플을 분석용 CEX-HPLC 칼럼(BioPro SP-F, 5 ㎛ 입자 크기, 4.6 mm x 100 mm, YMC America, Inc.)에 로딩하였다. 이동상 A는 pH 6.6에서의 20 mM 인산나트륨을 함유하고, 이동상 B는 pH 6.6에서의 20 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨으로 이루어졌다. 단백질을 0분 내지 4분에서의 5% 내지 12% 이동상 B, 18분에서의 23% 이동상 B, 18.5분 내지 20.5분에서의 100% 이동상 B 및 다시 21분 내지 25분에서의 5% 이동상 B로 생성된 선형 염 구배를 사용하여 분리하였다. 용리제는 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 모니터링되었다. 칼럼은 28℃에서 조작되고, 이동상은 0.6 mL/분의 유속에서 칼럼에 적용되었다.
CEX-HPLC 프로필은 산성 피크, 주 피크 및 염기성 피크를 포함하는 3개의 구별되는 영역을 함유하였다(도 11). 산성 피크, 주 피크 및 염기성 피크 영역에 걸쳐 9개의 분획이 단리되었다. 수집된 분획은 CEX-HPLC에 의해 재분석되어서 그 분획이 규명에 충분한 순도를 갖는다는 것을 나타낸다. 단리된 분획의 CEX-HPLC 프로필 및 순도는 각각 도 12 및 표 13에 기재되어 있다.
Figure pct00029
에레누맙 약물 물질과 비교하여 각각의 풍부한 CEX-HPLC 분획의 생물학적 활성은 실시예 1에 기재된 세포 기반 생물검정에 의해 평가되었다. 표 14에 기재된 것처럼, 산성 피크 분획 F1 및 F2 둘 다는 약물 물질에 비해 감소한 효력을 나타내는 한편, 나머지의 산성 피크, 주 피크 및 염기성 피크 분획은 유의미하지 않은 차이를 나타냈다.
Figure pct00030
산성 분획에서의 어떤 변이체가 효력에 영향을 주는지를 더 완전히 이해하기 위해, 비환원된 황산 도데실 나트륨 모세관 전기영동(nrCE-SDS), 환원된 황산 도데실 나트륨 모세관 전기영동(rCE-SDS) 및 비환원된 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 포함하는 다양한 분석 기법에 의해 풍부한 CEX-HPLC 분획을 규명하였다.
nrCE-SDS에 의해 비분획화된 약물 물질 및 9개의 CEX-HPLC 분획을 분석하였다. 25℃에서 SDS 겔 완충액으로 충전된 기본 용융 실리카 모세관으로 동전기적으로 주사하기 전에 황산 도데실 나트륨(SDS) 및 N-에틸말레이미드(pH 6.5)의 존재하에 가열하여 샘플을 변성시켰다. 220 nm에서 흡광도를 모니터링하였다. 하기 표 15에 기재된 것처럼, 산성 분획 F1은 약물 물질에 비해 프리피크 및 포스트피크 종 둘 다 풍부하였다. 프리피크 종은 펩타이드 가수분해 또는 부분 분자 어셈블리로부터 생긴 온전한 에레누맙(주 피크)보다 분자량이 더 낮은 종을 포함하는 반면에, 포스트피크 종은 주 피크에 비해 크기가 더 크다. 전체적으로, 프리피크 그룹 내에 분포에서 작은 차이가 관찰되긴 하지만, 프리피크 종의 상대 양은 나머지의 산성 피크, 주 피크 및 염기성 피크 분획(즉, F2 내지 F9) 및 약물 물질 중에서 한결같았다.
Figure pct00031
rCE-SDS에 의해 에레누맙 약물 물질 및 9개의 CEX-HPLC 분획을 또한 분석하였다. rCE-SDS에 대한 방법은 샘플이 모세관으로 주입 전에 SDS 및 β-머캅토에탄올의 존재하에 가열에 의해 환원되고 변성된다는 것을 제외하고는 nrCE-SDS에 대한 방법과 유사하였다. rCE-SDS 분석의 결과는 산성 피크 분획 F1을 제외하고 모든 분획이 비분획화된 약물 물질 대조군과 유사하다는 것을 나타냈다. 산성 피크 분획 F1은 필시 펩타이드 가수분해 단편에 대응하는 LMW 및 MMW 종이 유의미하게 풍부하였다(데이터 비기재). 산성 피크 분획 F1 및 더 적은 양의 분획 F2는 비공통 글리코실화 변이체에 대응하는 포스트-중쇄가 풍부하였다.
다음에, 약물 물질 및 CEX-HPLC 분획을 Waters BEH300 C4 칼럼(1.7 ㎛ 입자 크기, 2.1 mm x 50 mm)을 사용하여 RP-HPLC에 의해 분석하고, 75℃에서 0.1% TFA 함유 이동상 및 1-프로판올의 구배를 사용하여 용리하였다. 215 nm에서의 흡광도를 모니터링하였다. CEX-HPLC 프로필에 걸쳐, IgG2-B가 풍부한 디설파이드 아이소폼 및 산성 분획에 풍부한 IgG2-A/B 아이소폼의 경향이 관찰되는 반면, IgG2-A 디설파이드 아이소폼은 주 피크 및 염기성 피크 분획에서 풍부하다(도 13 및 표 16). 실시예 4에 더 자세히 기재된 것처럼, IgG2-B 디설파이드 아이소폼은 에레누맙 약물 물질 또는 IgG2-A 및 IgG2-A/B 디설파이드 아이소폼보다 유의미하게 덜 강력하였다. 산성 피크 분획 F1의 RP-HPLC 프로필은 약물 물질 크로마토그램과 일치하지 않았고, 이는 필시 상기 기재된 바대로 각각 rCE-SDS 및 nrCE-SDS에 의해 관찰된 환원성 및 공유 단편화의 유의미한 수준의 결과이다.
Figure pct00032
이 실시예에 기재된 분석의 결과는 CEX-HPLC 크로마토그램에서 산성 피크에 대응하는 단편화 변이체 및 디설파이드 아이소폼 변이체와 같은 에레누맙의 소정의 산성 변이체가 에레누맙 약물 물질보다 덜 강력하다는 것을 나타낸다. 구체적으로는, 산성 분획 F1은 rCE-SDS 및 nrCE-SDS에 의해 검출된 높은 수준의 단편화의 결과로서 유의미한 효력 감소를 나타냈다. 산성 분획 F2는 또한 비분획화된 약물 물질에 비해 이 분획에서 풍부한 상승된 수준의 IgG2-B 디설파이드 아이소폼으로 인해 효력 감소를 나타냈다. 전체적으로, CEX-HPLC에 의해 검출된 주요 에레누맙 변이체는 디설파이드 아이소폼 변이체를 포함하고, IgG2-B 및 IgG2-A/B 아이소폼은 산성 피크에서 풍부하다. 탈아미드화, 단편화(LMW 및 MMW), HMW 종 및 비공통 글리코실화 변이체는 산성 피크 분획에서 또한 검출되었다.
상업적 규모로 제조된 에레누맙 약물 물질(140 mg/mL)의 여러 로트를 CEX-HPLC 크로마토그램에서의 산성 피크의 피크 면적 백분율에 의해 측정된 것처럼 산성 변이체(예를 들어, IgG2-B 디설파이드 아이소폼)의 존재 및 분량을 평가하도록 CEX-HPLC에 의해 분석하였다. 약물 물질 로트의 효력은 또한 세포 기반 효력 검정에 의해 평가되고, II상/III상 임상 실험에 사용된 에레누맙 약물 물질을 대표하는 로트 78137호의 효력과 비교되었다. 데이터의 요약은 하기 표 17에 제공된다.
Figure pct00033
표 17에서의 데이터에 의해 표시된 것처럼, 상업적 규모로 제조된 에레누맙 약물 물질은 CEX-HPLC 산성 피크에 의해 측정된 바대로 28.7% 내지 31.3%의 범위의 한결같은 수준의 산성 변이체를 함유하였다. 이 범위에서 산성 변이체의 수준을 함유하는 약물 물질은 임상 실험에서 사용된 에레누맙 약물 물질의 효력에 필적하는 효력을 나타냈다.
실시예 4. 에레누맙의 디설파이드 아이소폼 변이체
에레누맙은 IgG2 하위종류의 항체이고, 따라서 IgG2 분자에 대해 기재된 디설파이드 아이소폼 변이체를 나타낼 수 있다(Dillon et al., J Chromatogr A., Vol. 1120(1-2):112-120, 2006; Wypych et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 283(23):16194-16205, 2008; Dillon et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 283(23):16206-16215, 2008). 에레누맙에서 검출된 디설파이드 결합의 연결성은 확인을 위해 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광법(ESI-MS/MS)과 커플링된 비환원된 및 환원된 Lys-C 펩타이드 맵을 사용하여 설명되었다. 이 접근법을 통해, 전통적인 IgG2-A 구조의 예상된 디설파이드 결합, 및 IgG2-A/B 및 IgG2-B 구조에 대응하는 디설파이드 결합이 설명되었다.
디설파이드 연결된 펩타이드는 도 14에 도시된 바와 같은 비환원 조건 및 환원 조건하에 엔도프로테아제 Lys-C를 사용하여 펩타이드 맵핑에 의해 약물 물질에서 확인되었다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 분리의 출구는 흡광도 검출 이외에 직교 질량 분석을 위해 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광기(ESI-MS/MS)에 커플링되었다. 비환원된 분해물의 일부를 환원제 트리스(2-카복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)로 처리하고, 동일한 RP-HPLC 조건을 사용하여 분석하였다.
비환원된 Lys-C 맵(도 14, 상부 트레이스)을 피크 "A" 내지 "G" 및 "a" 내지 "i"로 표지하고, 이들은 환원 조건하에 사라졌다. 환원 후에 이들 펩타이드의 사라짐은 이들이 자연적 단백질에서의 디설파이드 연결에 관여된다는 것을 나타낸다. 비환원된 Lys-C 분해물에서 디설파이드 결합을 함유하는 펩타이드 및 환원된 Lys-C 분해물에서의 대응하는 환원된 펩타이드는 흡광도 크로마토그램에서 이의 존재 또는 부재에 의해 결정되고, 온전한 펩타이드 질량 정확성 및 진단학적 MS/MS 생성물 이온의 존재에 의해 확인되었다. 디설파이드 연결된 펩타이드를 검증하기 위해 사용된 모든 펩타이드 이온에 대한 이론적 질량 및 관찰된 질량은 각각 비환원된 펩타이드 맵 및 환원된 펩타이드 맵에 대해 표 18 및 표 19에 기재되어 있다. 확인된 비환원된 펩타이드 및 환원된 펩타이드는 도 15a에 도식적으로 도시된 예상된 IgG2-A 디설파이드 아이소폼 구조를 설명한다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Lys-C 펩타이드 맵핑은 힌지 펩타이드와 분자의 다른 영역 사이의 디설파이드 페어링의 이종성에 대응하는 소수의 디설파이드 연결된 펩타이드 피크를 밝혀냈다. 도 14에 표지된 주요 디설파이드 연결된 펩타이드 피크 이외에, 환원된 맵에서는 부재하는 소수의 늦게 용리하는 피크("a" 내지 "i")가 비환원된 맵에 있어서, 이들이 자연적 단백질에서 디설파이드 연결에 관여된다는 것을 나타낸다. 이 늦게 용리하는 펩타이드는 질량 분광법에 의해 IgG2의 알려진 구조 아이소폼에 대한 사슬간 디설파이드 결합된 펩타이드로서 확인되었다(Wypych et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 283(23):16194-16205, 2008; Dillon et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 283(23):16206-16215, 2008; 및 Zhang et al., Anal Chem., Vol. 82(3):1090-1099, 2010). 펩타이드 "a", "b", "d" 및 "e"는 구조적 아이소폼 IgG2-B에 대응하는 반면에, 펩타이드 "c", "f" 및 "i"는 구조적 아이소폼 IgG2-A/B에 대응한다. IgG2-A/B 및 IgG2-B 디설파이드 아이소폼 구조의 도식적 표시는 각각 도 15b 및 도 15c에 도시되어 있다. IgG2-A/B 및 IgG2-B 디설파이드 연결된 펩타이드를 검증하기 위해 사용된 모든 펩타이드 이온에 대한 이론적 질량 및 관찰된 질량은 표 18에 기재되어 있다. 분석은 에레누맙의 디설파이드 연결이 IgG2 항체에 대해 이전에 관찰된 것과 일치한다고 제안한다(Wypych et al., 2008; Dillon et al., 2008; 및 Zhang et al., 2010).
상기 기술된 바대로, 펩타이드 맵핑은 주요 IgG2-A 구조에 대한 디설파이드 연결된 펩타이드, 및 추가의 IgG2-A/B 및 IgG2-B 디설파이드 구조적 아이소폼과 연관된 연결성을 보유하는 펩타이드의 존재를 밝혀냈다. 도 15에 도시된 것처럼, IgG2-B 아이소폼에서, Fab 아암 둘 다는 힌지 영역에 연결되는 반면에, IgG2-A 아이소폼에서, Fab 아암의 어느 것도 힌지에 연결되지 않는다. IgG2-A/B 아이소폼은 이 2개의 형태 사이에 하이브리드이고, 오직 하나의 Fab 아암이 힌지에 디설파이드 연결된다. 비환원 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의한 IgG2 디설파이드 아이소폼의 분리는 이전에 보고되었다(Wypych et al., 2008 및 Dillon et al., 2008). 이 연구에서, 디설파이드 아이소폼 A, A/B 및 B에 대응하는 펩타이드는 RP-HPLC 피크 분획에서 확인되었다(Wypych et al., 2008 및 Dillon et al., 2008). 비환원 RP-HPLC에 의해 분석된 에레누맙 약물 물질에 대한 대표적인 프로필은 도 16a에 도시되어 있는데, 표지된 디설파이드 아이소폼 피크는 Wypych 등의 2008년 문헌에 의해 보고된 용리 순서와 일치한다. 늦게 용리하는 피크는 IgG2-A 아이소폼으로 확인되고, 상대 백분율의 보고에서 IgG2-A 피크로 그룹화된다. 에레누맙 약물 물질에서의 디설파이드 아이소폼의 상대 수준은 대략 59.5%의 IgG2-A, 34.7%의 IgG2-A/B 및 4.4%의 IgG2-B이고, 대략 1.5%는 일찍 용리하는 프리피크 종이다.
비환원 RP-HPLC가 디설파이드 아이소폼 변이체의 상대 양의 결정에 효과적인 방법이지만, 이동상 및 분리 조건은 에레누맙의 억제 효력을 결정하기 위해 사용된 세포 기반 생물검정과 부적합하다. 따라서, 디설파이드 아이소폼 풍부한 분획은 실시예 3에 기재된 바와 같은 반분취용 CEX-HPLC로부터 수집되고, 실시예 1에 기재된 세포 기반 생물검정을 이용하여 효력에 대해 시험되었다. 약물 물질에 비해 디설파이드 아이소폼 IgG2-A, IgG2-A/B 및 IgG2-B가 풍부한 3개의 CEX-HPLC 분획(표 16 및 도 13a)은 하기 더 자세히 기재된 것처럼 효력에 대해 분석되었다. 풍부한 IgG2-A, IgG2-B 및 IgG2-A/B 디설파이드 아이소폼 CEX-HPLC 분획은 효력 평가 전에 적절한 순도를 확인하도록 비환원 RP-HPLC에 의해 분석되었다. 비분획화된 약물 물질에 비해 3개의 CEX-HPLC 수집된 분획의 RP-HPLC 오버레이는 도 16b에 도시되어 있고, RP-HPLC 디설파이드 아이소폼 분포 데이터는 표 20에 제공된다.
Figure pct00037
표 21에 기재된 것처럼, IgG2-A 및 IgG2-A/B 풍부한 아이소폼 분획의 상대 효력은 에레누맙 약물 물질의 상대 효력과 유사하다. 그러나, IgG2-B 디설파이드 아이소폼이 풍후한 분획은 약물 물질 및 풍부한 IgG2-A/B 및 IgG2-A 아이소폼 분획에 비해 유의미하게 감소한 효력을 나타냈다.
Figure pct00038
이 데이터는 에레누맙의 힌지 영역에서의 디설파이드 결합의 구조적 입체형태가 항체의 생물학적 활성에 중요하다는 것을 제안한다. 특히, 약물 물질에서의 상승된 수준의 IgG2-B 디설파이드 아이소폼은 억제 효력에 유의미하게 영향을 미친다. 상업적 규모로 제조된 에레누맙 약물 물질의 여러 로트의 분석은 비환원 RP-HPLC에 의해 측정된 것처럼 4.6% 내지 5.2%의 범위의 약물 물질에서의 IgG2-B 디설파이드 아이소폼의 한결같은 수준을 밝혀냈다. 이 에레누맙 약물 물질 로트에서의 IgG2-A/B 및 IgG2-A 디설파이드 아이소폼의 수준은 또한 34.2% 내지 35.5%의 범위의 IgG2-A/B 수준 및 57.4% 내지 59.3%의 범위의 IgG2-A 수준으로 한결같았다.
실시예 5. 에레누맙 크기 변이체의 확인 및 규명
이 실시예는 감소한 CGRP 수용체 억제 기능을 나타내는 에레누맙의 크기 변이체의 확인 및 규명을 기재한다. 에레누맙의 크기 변이체는 고분자량(HMW) 종 및 저분자량(LMW) 종을 포함할 수 있다. 단량체보다 더 큰 종인 HMW 종(예를 들어, 이합체 및 더 고차의 올리고머 종)은 비공유 회합, 환원성 공유 회합, 및/또는 비환원성 공유 회합을 통해 형성될 수 있다. LMW 종은 폴리펩타이드 골격의 단편화 및/또는 아단위 성분, 예컨대 경쇄 및 중쇄의 불완전한 어셈블리를 통해 생길 수 있다.
이 실시예에서, 에레누맙의 크기 이종성은 SE-UHPLC에 의해 평가되었다. SE-UHPLC는 주로 수력학적 부피의 차이에 기초하여 단백질을 분리한다. SE-UHPLC 방법은 자연적 조건하에 에레누맙의 크기 분포를 평가하도록 비환원, 비변성 조건하에 수행되었다. 에레누맙 약물 물질의 샘플을 분석용 SE-UHPLC 칼럼(BEH200 칼럼, 1.7 ㎛ 입자 크기, 4.6 mm x 150 mm, Waters Corporation)에 로딩하고, 단백질을 100 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨(pH 6.8)을 포함하는 이동상을 사용하여 등용매로 분리하였다. 용리제는 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 모니터링되었다. 칼럼은 실온에서 조작되고, 이동상은 0.4 mL/분의 유속에서 칼럼에 적용되었다.
도 17a 및 도 17b에 도시된 바와 같이 주요 단량체 피크(주 피크) 및 낮은 수준의 HMW(프리피크) 및 LMW(포스트피크)를 포함하는 3개의 별개의 영역은 에레누맙 약물 물질의 SE-UHPLC 프로필에서 명확하였다. 프리피크, 주 피크 및 포스트피크 영역으로부터의 분획을 수집하고, 그 분획에서 분리된 변이체를 규명하였다. SE-UHPLC에 의한 HMW 피크(도 17b)는 2개의 불완전하게 분할된 종으로 이루어지고, 그러므로 각각 HMW 피크의 리딩 에지 및 테일링 에지를 나타내는 2개의 별개의 분획으로 수집되었다. 2개의 HMW 피크 및 주 피크는 반분취용 SE-HPLC를 사용하여 단리된 후에, 분석용 SE-HPLC에 의해 더 풍부해졌다. 수집된 HMW 및 주 피크 분획을 분자량 컷오프 필터를 사용하여 농축시키고, 규명 분석 전에 15 mM 아세트산나트륨(pH 5.2)으로 완충액을 교환하였다. SE-UHPLC에 의한 LMW 피크 그룹(도 17b)은 2개의 작은 피크로 이루어지고, 이들의 합은 약물 물질에서의 0.3%의 검정 정량 한계보다 낮다. LMW 피크 그룹은 분석용 SE-UHPLC를 사용하여 단리되고 풍부해지고, 하기 더 자세히 기재된 것처럼 제한된 규명 시험으로 처리되었다.
SE-UHPLC HMW 분획의 규명
각각 도 18 및 표 22에 기재된 SE-UHPLC 프로필 및 단리된 HMW 및 주 피크 분획의 순도는 그 분획이 규명에 충분한 순도를 갖는다는 것을 나타낸다.
Figure pct00039
도 18 및 표 22에 기재된 풍부한 HMW 및 주 피크 분획은 정적 광 산란 검출을 이용한 SE-UHPLC, 환원된 황산 도데실 나트륨 모세관 전기영동(rCE-SDS), 비환원된 황산 도데실 나트륨 모세관 전기영동(nrCE-SDS) 및 세포 기반 생물검정을 포함하는 다양한 분석 기법에 의해 규명되었다.
비분획화된 약물 물질과 함께 HMW 및 주 피크 분획은 각각의 크로마토그램에서 우세한 피크의 몰 질량을 결정하기 위해 정적 광 산란 검출을 이용한 SE-HPLC(SE-HPLC-SLS)에 의해 분석되었다. SE-HPLC-SLS 분석은 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 칼럼은 TSK-겔 G3000SWxl, 5 ㎛ 입자 크기, 7.8 mm 내경 x 300 mm 길이 칼럼(Tosoh Biosep)이다. 사용된 검출기는 파장이 280 nm로 설정된 Wyatt Heleos II 광 산란 검출기, Wyatt Optilab rEX RI 검출기 및 Agilent UV 검출기이다. SE-HPLC 실행은 실온에서 수행되고, 100 mM 인산칼륨, 250 mM 염화칼륨(pH 6.8) 완충액이 이동상으로 사용되고, 유속은 0.5 mL/분이었다. 주입 부피는 300 ㎍의 단백질을 주입하도록 4.3 ㎕이었다. 분자량(MW) 계산을 위해, LS(광 산란) 및 RI(굴절률) 신호 및 0.185의 샘플 굴절 증분(dn/dc) 값을 사용하였다.
주 피크 분획으로부터의 단량체(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 항체)의 측정된 질량은 149 kDa이고, 약물 물질 대조군으로부터의 것은 143 kDa이고, 이들 둘 다는 에레누맙 단량체의 이론적 분자 질량(148.8 kDa)과 일치한다(표 23). HMW 풍부한 분획(HMW 1 및 HMW 2) 둘 다에 대한 HMW 피크의 측정된 질량은 각각 292 kDa 및 279 kDa이고, 이들 둘 다는 에레누맙 이합체에 대한 분자 질량(297.6 kDa)과 일치한다(표 23). 이 데이터는 HMW 1 및 HMW 2 풍부한 분획 둘 다가 주로 에레누맙 이합체로 이루어진다는 것을 나타낸다.
Figure pct00040
실시예 3에 기재된 방법에 따른 nrCE-SDS에 의한 풍부한 분획 및 비분획화된 약물 물질의 분석은 HMW 분획 둘 다가 단량체(주 피크)보다 큰 공유 고분자량 종에 대응하는 포스트피크에 풍부하고, 대조군에 필적하는 프리피크 면적을 갖는다는 것을 밝혀냈다(표 24).
Figure pct00041
비공유 이합체 및 공유 이합체의 비율은 자연적 조건하의 풍부한 분획의 순도를 변성 조건하의 것과 비교하여 근사치 계산될 수 있다. 자연적 조건하의 이합체의 수준(SE-UHPLC: 표 22에서의 % HMW)을 변성 조건하의 공유 이합체의 수준(nrCE-SDS: 표 24에서의 % 포스트피크)과 비교 시, 공유 이합체의 수준은 자연적 약물 물질에서 추산될 수 있다. 이 비교에 기초하여, 에레누맙 약물 물질에서의 대부분의 자연적 이합체 종은 변성 시험 조건하에 남은 대략 68%의 HMW 1 이합체 종 및 거의 모든 HMW 2 이합체와 공유이다.
에레누맙 약물 물질 및 풍부한 HMW 종 및 주 피크 분획은 또한 실시예 3에 기재된 방법에 따라 rCE-SDS에 의해 분석되었다. 도 19에 도시된 것처럼, rCE-SDS 분석의 결과는 HMW 1 및 HMW 2 분획 둘 다 약물 물질에 비해 중분자량(MMW) 및 고분자량(HMW) 종이 풍부하다는 것을 나타낸다. 공유 이합체 및 비공유 이합체 종의 수준의 평가와 유사하게, rCE-SDS는 약물 물질에서의 환원성 이합체 및 비환원성 이합체 종의 수준을 근사치 계산하도록 사용될 수 있다. 자연적 조건하의 이합체의 수준(SE-UHPLC: % HMW)을 환원 및 변성 조건하의 비환원성 이합체의 수준(rCE-SDS: % HMW)과 비교 시, 비환원성 이합체의 수준은 자연적 약물 물질에서 추산될 수 있다. 표 25에 기재된 비교에 기초하여, 에레누맙 약물 물질에서의 대부분의 자연적 이합체 종은 환원 및 변성 조건하에 대략 87%의 HMW 1 이합체 종 및 대략 93%의 HMW 2 이합체 종에 의해 환원 가능하여 환원되어 개별 성분이 된다.
Figure pct00042
에레누맙 약물 물질과 비교하여 풍부한 SE-UHPLC 분획의 생물학적 활성은 실시예 1에 기재된 세포 기반 생물검정에 의해 평가되었다. 표 26에 기재된 것처럼, HMW 1 및 HMW 2 풍부한 분획 둘 다는 약물 물질 및 풍부한 주 피크에 비해 감소한 효력을 나타냈다. 이들 분획에서의 상당 부분의 HMW 종은 공유 결합되고, 상기 기재된 바대로 비해리성이다. 자기 회합은 입체형태 변화를 발생시킬 수 있는 입체 구속을 부여하고, 이는 결국 CGRP 수용체 표적에 대한 분자의 결합에 영향을 미쳐 관찰된 감소한 효력을 설명할 수 있다.
Figure pct00043
SE-UHPLC LMW 분획의 규명
LMW 피크(도 17b)는 단일 분획에서 SE-UHPLC에 의해 수집되고, 규명 분석 전에 분자량 컷오프 필터를 사용하여 농축되었다. SE-UHPLC에서의 LMW 분획의 재주입은 대략 34.4%로의 LMW 종의 풍부함을 보여주었다(데이터 비기재). 수집된 풍부한 LMW 분획은 LMW 종의 성질을 규명하기 위해 비환원 조건하에 전체 질량 분석에 의해 분석되었다.
풍부한 LMW 분획의 질량은 전기분무 이온화 비행 시간 질량 분광법에 커플링된 RP-HPLC를 사용하여 자연적, 비환원 조건하에 질량 분광학적 분석에 의해 결정되었다. 분석으로부터의 결과는 수집된 LMW 분획이 비분획화된 약물 물질에 비해 공유 결합된 경쇄 이합체(LC-LC)가 풍부하다는 것을 나타낸다.
이 실시예에 기재된 분석의 결과는 에레누맙이 비변성 조건하에 SE-UHPLC에 의해 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 항체(약물 물질의 대략 99.2%)로서 주로 이의 예상된 단량체 형태로 존재하는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 남은 부분은 주로 이합체로 구성된 HMW 종(약물 물질의 0.5%) 및 미량 수준의 LMW 종으로 이루어진다. 더 고차의 올리고머가 관찰되지 않았다. HMW 종이 풍부한 에레누맙 약물 물질의 SE-UHPLC 분획은 에레누맙의 단량체 형태에 비해 감소한 억제 효력을 나타냈다.
에레누맙 이합체는 주로 공유 결합된 단량체 아단위로 이루어지고, 변성 조건하에 해리하지 않는다. 대부분의 이합체는 환원성이어서 환원 및 변성 조건하에 중쇄 및 경쇄 성분으로 전환되고, 따라서 디설파이드 결합을 통해 회합된다. 비환원성 종은 공유 이합체의 소수의 성분으로 존재하여서 rCE-SDS에 의해 중쇄 피크 후에 이동한다. SE-UHPLC LMW 피크의 규명은 경쇄 이합체가 풍부한 피크를 나타냈다.
상업적 규모로 제조된 에레누맙 약물 물질(140 mg/mL)의 여러 로트를 SE-UHPLC 크로마토그램에서의 HMW 및 LMW 피크의 피크 면적 백분율에 의해 측정된 것처럼 크기 변이체(예를 들어, HMW 및 LMW 종)의 존재 및 분량을 평가하도록 SE-UHPLC에 의해 분석하였다. 약물 물질 로트의 효력은 또한 세포 기반 효력 검정에 의해 평가되고, II상/III상 임상 실험에 사용된 에레누맙 약물 물질을 대표하는 로트 78137호의 효력과 비교되었다. 데이터의 요약은 하기 표 27에 제공된다.
Figure pct00044
표 27에서의 데이터에 의해 표시된 것처럼, 상업적 규모로 제조된 에레누맙 약물 물질은 SE-UHPLC에 의해 측정된 바대로 약 0.6% HMW 종의 한결같은 수준을 함유하였다. 이 수준의 HMW 종을 함유하는 약물 물질은 임상 실험에서 사용된 에레누맙 약물 물질의 효력에 필적하는 효력을 나타냈다.
표 27로부터의 3개의 약물 물질 배치(batch)(63131, 63132 및 63133)는 25℃에서 30개월 동안 저장되고, 샘플은 시간 경과에 따른 크기 변이체의 수준의 변화로 인한 약물 물질 효력에 대한 임의의 영향을 평가하기 위해 SE-UHPLC 분석 및 효력 시험을 거쳤다. 이 안정성 연구의 결과는 표 28에 기재되어 있다.
Figure pct00045
1.6%만큼 높은 수준의 HMW 종을 함유하는 약물 물질은 임상 실험에 사용된 에레누맙 약물 물질과 필적하는 효력을 가졌다.
열 스트레스 조건하에 크기 변이체를 형성하는 에레누맙의 감수성을 평가하기 위해, 에레누맙 약물 물질을 50℃에서 14일 동안 항온처리하였다. 샘플을 연구 기간에 걸쳐 다양한 시점에 제거하고 동결시켰다. 최종 시점 후에, 모든 샘플을 분석 변동성을 최소화하기 위해 나란히 분석하였다. 샘플은 상기 기재된 방법 및 실시예 1에 기재된 세포 기반 생물검정에 따라 SE-UHPLC에 의해 평가되었다.
50℃에서 스트레스인 에레누맙 약물 물질의 0일 및 14일 샘플의 자연적 SE-UHPLC 프로필은 도 20에 도시되어 있다. 도 20에 도시된 피크에 대한 상대 피크 면적 %는 세포 기반 생물검정에 의해 평가된 바대로 샘플의 % 상대 효력과 함께 표 29에 제시된다. HMW 종은 14일에 걸쳐 증가를 나타내는 주요 분해물이고, 대응하는 주 피크는 감소한다. 생성된 HMW 종은 주로 더 고차의 응집물(이합체 초과의 HMW 종)로 이루어졌다. LMW 종의 증가가 또한 14일에 관찰되었다. 에레누맙 약물 물질의 열 스트레스인 샘플은 유의미하게 감소한 효력을 나타냈다. 감소한 효력은 주로 HMW 종의 증가, 및 Asp105 이성질체화 변이체의 증가로 인한 것이고, 이는 또한 에레누맙 약물 물질의 열 스트레스인 샘플에서 상승하였다(실시예 2 참조).
Figure pct00046
추가의 열 스트레스 연구는 상업적 규모로 제조된 추가의 에레누맙 약물 물질 배치에서 수행되었다. 표 27로부터의 3개의 약물 물질 배치(63131, 63132 및 63133)는 40℃에서 30일 동안 저장되고, 샘플은 시간 경과에 따른 크기 변이체의 수준의 변화로 인한 약물 물질 효력에 대한 임의의 영향을 더 평가하기 위해 SE-UHPLC 분석 및 세포 기반 효력 시험을 거쳤다. 이 열 스트레스 연구의 결과는 표 30에 기재되어 있다.
Figure pct00047
이 연구의 결과는 HMW 및 LMW 종의 증가와 함께 효력의 감소의 일반적인 경향을 보여준다. 특히, 약물 물질에서의 약 2.5% 초과의 HMW 종의 수준은 약물 물질의 효력의 감소와 연관되었다. 63132 로트의 30일 샘플이 효력 감소를 나타내지 않지만, 이는 아마도 세포 기반 생물검정의 변동성으로 인한 것이라는 점에 주목한다.
본원에 논의되고 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 개시된 발명은 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 물질이 변할 수 있으므로 이들에 제한되지 않음이 이해된다. 또한, 본원에 사용된 용어가 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며 첨부된 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해된다.
당업자는 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나, 통상적 실험만으로도 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. LAWSON, Kenneth RIEDER, Noel HAPUARACHCHI, Suminda RAMIREZ, Jose Gregorio <120> ERENUMAB COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> IPA201274-US <150> US 62/651,651 <151> 2018-04-02 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Ser Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Tyr 100 105 110 Lys Tyr Tyr Gly Met Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 130 135 140 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Thr Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu 85 90 95 Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 3 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> pyroglutamate residue <400> 3 Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Ser Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Tyr 100 105 110 Lys Tyr Tyr Gly Met Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 130 135 140 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Thr Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu 85 90 95 Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110

Claims (48)

  1. 에레누맙(erenumab) 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물로서, 하나 이상의 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체(isomerization variant) 및 탈아미드화 변이체(deamidation variant)를 포함하고, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 30% 미만인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 15% 미만인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 8% 미만인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 4% 미만인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 1% 내지 약 10%인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 약 1% 내지 약 4%인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이성질체화 변이체는 에레누맙의 중쇄(서열 번호 1 또는 서열 번호 3) 중 어느 하나 또는 둘 다에서 105번 아미노산 위치에서 이소아스파르트산 잔기 또는 숙신이미드를 갖는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈아미드화 변이체는 아스파르트산 잔기, 숙신이미드 또는 이소아스파르트산 잔기로 전환된 에레누맙의 중쇄(서열 번호 1 또는 서열 번호 3) 중 어느 하나 또는 둘 다에서 102번 아미노산 위치에서 아스파라긴 잔기를 갖는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC: hydrophobic interaction chromatography high performance liquid chromatography)에 의해 결정되는, 조성물.
  10. 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 산성 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 40% 미만인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 35% 미만인, 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 25% 내지 약 38%인, 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 약 26% 내지 약 34%인, 조성물.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 산성 변이체는 디설파이드 아이소폼 변이체, 단편화 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC: cation exchange high performance liquid chromatography)에 의해 결정되는, 조성물.
  16. 에레누맙 및 하나 이상의 이의 디설파이드 아이소폼 변이체를 포함하는 조성물로서, 하나 이상의 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-B 아이소폼을 포함하고, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 20% 미만인, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 10% 미만인, 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 조성물에서의 IgG2-B 아이소폼의 양은 약 4% 내지 약 6%인, 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 디설파이드 아이소폼 변이체는 IgG2-A/B 아이소폼을 추가로 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물에서의 IgG2-A/B 아이소폼의 양은 약 34% 내지 약 37%인, 조성물.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서의 디설파이드 아이소폼 변이체의 양은 비환원 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC: reversed phase high performance liquid chromatography)에 의해 결정되는, 조성물.
  22. 에레누맙 및 에레누맙의 고분자량(HMW) 종을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 2.5% 미만인, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 1.8% 이하인, 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 약 1.2% 이하인, 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HMW 종은 에레누맙의 공유 결합된 이합체를 포함하는, 조성물.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UHPLC: size exclusion ultra-high performance liquid chromatography)에 의해 결정되는, 조성물.
  27. 에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 포함하는 조성물로서, 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 조성물은
    (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 25% 내지 약 38%인 특징;
    (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 2.1% 이하인 특징; 및
    (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크(pre-peak)에 의해 측정될 때 약 8% 이하인 특징 중 하나 이상을 갖는, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 상기 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정될 때 약 26.5% 내지 약 33.6%인 특징;
    (b) 상기 조성물에서의 HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정될 때 약 1.2% 이하인 특징; 및
    (c) 상기 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에서 프리피크에 의해 측정될 때 약 3.2% 이하인 특징 중 하나 이상을 갖는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 에레누맙은 서열 번호 1의 중쇄 및 서열 번호 2의 경쇄를 포함하는, 조성물.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 에레누맙은 서열 번호 3의 중쇄 및 서열 번호 4의 경쇄를 포함하는, 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 제제.
  32. 두통의 치료, 예방 또는 이의 발생의 감소를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키는 방법으로서, 제31항의 약제학적 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 두통은 편두통인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 편두통은 삽화성 편두통 또는 만성 편두통인, 방법.
  35. 두통의 치료, 예방 또는 이의 발생의 감소를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 에레누맙 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 두통은 편두통인, 에레누맙 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 편두통은 삽화성 편두통 또는 만성 편두통인, 에레누맙 조성물.
  38. 두통의 치료, 예방 또는 이의 발생의 감소를 필요로 하는 환자에서 두통을 치료하거나 예방하거나 이의 발생을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 에레누맙 조성물의 용도.
  39. 제38항에 있어서, 두통은 편두통인, 용도.
  40. 제39항에 있어서, 편두통은 삽화성 편두통 또는 만성 편두통인, 용도.
  41. 에레누맙 조성물의 품질을 평가하는 방법으로서,
    에레누맙 및 하나 이상의 에레누맙 변이체를 함유하는 에레누맙 조성물을 수득하는 단계;
    상기 조성물에서의 하나 이상의 에레누맙 변이체의 양을 측정하는 단계이되, 에레누맙 변이체는 이성질체화 변이체, 탈아미드화 변이체, 산성 변이체, HMW 종, 또는 이들의 조합을 포함하는 단계;
    하나 이상의 에레누맙 변이체의 측정된 양을 소정의 참조 기준과 비교하는 단계; 및
    상기 비교가 상기 소정의 참조 기준이 충족된다고 나타내면 상기 에레누맙 조성물의 약제학적 제제 또는 약제학적 제품을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양이 측정되고, 상기 소정의 참조 기준은 약 10% 이하인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 에레누맙 조성물에서의 이성질체화 변이체 및 탈아미드화 변이체의 양은 HIC-HPLC에 의해 측정되는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 산성 변이체의 양이 측정되고, 상기 소정의 참조 기준은 약 38% 이하인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 에레누맙 조성물에서의 산성 변이체의 양은 CEX-HPLC에 의해 측정되는, 방법.
  46. 제41항에 있어서, HMW 종의 양이 측정되고, 상기 소정의 참조 기준은 약 2.5% 이하인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, HMW 종의 양은 SE-UHPLC에 의해 측정되는, 방법.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에레누맙 조성물은 서열 번호 1의 중쇄를 암호화하는 핵산 및 서열 번호 2의 경쇄를 암호화하는 핵산을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포주로부터 얻어지는, 방법.
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