MX2013004997A

MX2013004997A - Diseño de anticuerpos heterodiméricos estables con mutaciones en el dominio fc.

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Publication number: MX2013004997A
Application number: MX2013004997A
Authority: MX
Inventors: Escobar Cabrera Eric; Spreter Von Kreudenstein Thomas; Bhimarao Dixit Surjit; Kai Yuen Poon David; Irene Lario Paula; Edmondo Paolo D Angelo Igor
Original assignee: Zymeworks Inc
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2014-10-24
Also published as: EP2635607A4; US10875931B2; RS59589B1; AU2011325833C1; AU2011325833B2; AU2011325833A1; CA2815266A1; EP2635607B1; CN103429620B; WO2012058768A8; CY1122409T1; KR20190015583A; RU2013124423A; CN103429620A; CN108341868A; US20180194860A1; JP2014504265A; CN108341868B; DK2635607T3; MX352929B

Abstract

Los armazones proporcionados tienen cadenas pesadas que son asimétricas en los diversos dominios (por ejemplo CH2 y CH3) para conseguir selectividad entre los diversos receptores de Fc implicados en la modulación de la función efectora, más allá de la que puede conseguirse con una molécula Fc homodimérica (simétrica) y estabilidad y pureza aumentadas de los heterodímeros de Fc variantes resultantes. Estas nuevas moléculas comprenden complejos de componentes heterogéneos diseñados para alterar el modo natural en que se comportan los anticuerpos y que encuentran su uso en productos terapéuticos.

Description

DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fe CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción proporciona en general heterodimeros polipeptidicos, composiciones de los mismos, y métodos para realizar y usar dichos heterodimeros polipeptidicos. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos termoestables multiespecíficos , incluyendo biespecífieos , que comprenden un dominio Fe heterodimérico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos biespecífieos son moléculas basadas en anticuerpos que pueden unirse simultáneamente a dos antígenos separados y distintos (o diferentes epítopos del mismo antígeno) . Un uso de anticuerpos biespecíficos ha sido redirigir células efectoras inmunes citotóxicas para la destrucción potenciada de células tumorales, tal como por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . En este contexto, una rama del anticuerpo biespecífico se une a un antígeno en la célula tumoral y el otro se une a un determinante expresado en células efectoras. Entrecruzando células tumorales y efectoras, el anticuerpo biespecífico no solamente pone las células efectoras en proximidad de las células tumorales sino que también desencadena su activación, lo que conduce a destrucción eficaz de células tumorales. También se han usado anticuerpos biespecificos para enriquecer aqentes quimio o radioterapéuticos en tejidos tumorales para minimizar los efectos perjudiciales para tejido normal. En esta situación una rama del anticuerpo biespecifico se une a un antigeno expresado en la célula marcada para destrucción, y la otra rama suministra un fármaco quimioterapéutico, radioisótopo o toxina.

Un obstáculo importante en el desarrollo general de anticuerpos biespecificos ha sido la dificultad de producir materiales de calidad y cantidad suficientes para estudios tanto preclinicos como¦ clínicos .

La producción tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud completa se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en que las dos cadenas tengan diferentes especificidades (Millstein et al., 1983, Nature, 305: 537-539). La tendencia intrínseca de la parte Fe de la molécula de anticuerpo para dimerizar conduce a la formación de mezclas complejas de hasta 10 moléculas de IgG diferentes que consisten en diversas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras, de las que solamente una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación .de la molécula correcta, que habitualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., 1991, EMBO J., .10: 3655-3659. Por lo tanto, la producción de una molécula de anticuerpo biespecífica con las dos ramas Fab seleccionadas para unirse a dos dianas diferentes usando técnicas de hibridoma tradicionales es' difícil [Segal D et al. (2001) J Immunol Methods. 248, 1-6.]. El anticuerpo trifuncional, Catumaxomab, es un mAb biespecífico derivado de cuadroma de rata/ratón y la purificación de esta molécula se consigue basándose en una elución dependiente de pH en separación cromatográfica basada en columna de proteína A [Lindhofer H. et al. (1995) J Immunol 155, 219-225].

Otro método tradicional para la producción de anticuerpos biespecífieos es la conjugación química de dos anticuerpos o sus fragmentos que tienen diferentes especificidades. Sin embargo, este método también es complicado, y el proceso de modificación química puede inactivar el anticuerpo o promover la agregación. Debido a que la purificación de productos no deseados sigue siendo difícil, el bajo rendimiento resultante y la escasa calidad del anticuerpo biespecífico hacen a este proceso inadecuado para la producción a gran escala requerida para el desarrollo clínico. Además, estas moléculas pueden no mantener la conformación de anticuerpo tradicional.

Recientemente, se han usado diversas técnicas de heterodimerización para mejorar la producción de anticuerpos biespecífieos . Sin embargo, la fusión de dominios de heterodimerización sencillos como el superenrollamiento Jun/Fos con dominios scFv conducen a una mezcla de homo y heterodímeros y es necesario que se ensamblen por replegamiento (de Kruif y Logtenberg, J. Biol. Chem. 271: 7630-4, 1996). También se usó fusión de fragmentos scFv con anticuerpos completos como un dispositivo de dimerización (Coloma y Morrison, Nat . Biotechnol. 15: 159-63, 1997). Sin embargo, dicha fusión da como resultado una molécula grande con escasas capacidades de penetración de tejido sólido. La fusión de dos fragmentos scFv entre sí también se ha usado para generar proteínas biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos BITE® por Micromet Inc., Bethesda, MD, Patente de Estados Unidos N° 7.635.472). Sin embargo, dichas proteínas no contienen regiones Fe y por lo tanto no permiten la manipulación de sus actividades mediante regiones Fe. Además, estas proteínas son pequeñas (~55 kDa) y por lo tanto tienen una semivida en suero relativamente corta.

En otras técnicas de dimerización, los anticuerpos biespecífieos se componen de una cadena pesada de inraunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina .híbrido (que proporciona una segunda especificidad de unión) en la otra rama. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecífieos véase, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121: 210.

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO96/27011, un par de moléculas de anticuerpo pueden modificarse por ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes . En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeño de la interfaz de CH3 de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo tirosina o triptófano) . Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes con otros más pequeños (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodimero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros [documento US005731168A, US007183076B2, Ridgway JB, Presta LG, Cárter P. Protein Eng Jul 1996; 9(7): 617-21; Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Cárter P. J Mol Biol 4 Jul 1997; 270(1): 26-35.]. Gunasekaran y colaboradores [Gunasekaran K. et al. (2010) J Biol Chem. 285, 19637-46] han empleado recientemente una estrategia de diseño electroestática complementaria para conseguir el objetivo de heterodimerización selectiva. Davis y colaboradores [Davis, JH: et al. (2010) Prot Eng Des Sel; 23(4): 195-202] han diseñado dominios CH3 usando un dominio modificado por ingeniería genética de intercambio de cadena (SEED), que comprende segmentos alternantes de secuencias CH3 de IgA e IgG humana, y estas se asocian preferentemente en forma de heterodimeros . Sin embargo, todas estas tecnologías dan como resultado anticuerpos que comprenden regiones Fe heterodiméricas que son significativamente menos estables que la molécula precursora o natural.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de heterodimeros Fe variantes multiespecífieos alternativos, específicamente dominios CH3 variantes, que se han modificado para seleccionar heterodimeros con una estabilidad y pureza aumentadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporciona de acuerdo con un aspecto de la invención un heteromultimero aislado que comprende .una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros, en que la región Fe heterodimérica comprende además un dominio CH2 variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas para promover la unión selectiva de un receptor Fcgamma. En una realización el dominio CH2 variante se une selectivamente a receptor Fcgamma Illa en comparación con dominio CH2 natural. En una realización, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (.Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor.

Se proporciona en otro aspecto un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor. En una realización, la región Fe heterodimérica no comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 en relación con una región Fe natural, más específicamente la región Fe heterodimérica no comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 en relación con una región Fe natural. En una realización alternativa, la región Fe heterodimérica comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 variante en relación con una región Fe natural, a condición de que la temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor sea en ausencia del enlace disulfuro adicional. En otra realización más, la región Fe heterodimérica comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 variante en relación con una región Fe natural, y en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 77,5 °C o mayor.

Proporcionado en una realización, un heteromultímero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con una estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor y la región Fe heterodimérica tiene una pureza mayor de aproximadamente el 90%, o la región Fe heterodimérica tiene una pureza de aproximadamente el 95% o mayor o la región Fe heterodimérica tiene una pureza de aproximadamente el 98% o mayor.

También se proporciona en ' una realización un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimero con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor o la Tm es aproximadamente 71 °C o mayor o la Tm es aproximadamente 74 °C o mayor. En Otra realización, la región Fe heterodimérica tiene una pureza de aproximadamente el 98% o mayor y la Tm es de aproximadamente 73 °C o en que la región Fe heterodimérica tiene una pureza de aproximadamente el 90% o mayor y la Tm es de aproximadamente 75 °C.

Se proporciona en ciertas realizaciones un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto, el primer polipéptido de dominio CH3 o el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos adicional en la posición T411, D399, S400, F405, N390, o K392. La modificación de aminoácidos en la posición T411 se selecciona de T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. La modificación de aminoácidos en la posición D399 se selecciona de D399R, D399W, D399Y o D399K. La modificación de aminoácidos en la posición S400 se selecciona de S400E, S400D, S400R, o S400K. La modificación de aminoácidos en la posición F405 se selecciona de F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W. La modificación de aminoácidos en la posición N390 se selecciona de N390R, N390K o N390D. La modificación de aminoácidos en la posición K392 se selecciona de K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E.

En ciertas realizaciones se proporciona un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos T366V y K409F.

En otra realización se proporciona un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende la modificación de aminoácidos Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto el primer polipéptido de dominio CH3 o el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos adicionales K392E, T411E, D399R y S400R. En otro aspecto, el primer polipéptido de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos D399R, S400R y Y407A y el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366A, K409F, K392E y T411E. En una realización adicional el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o mayor y el heterodimero tiene una pureza de aproximadamente 95% o mayor.

En otra realización se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos en las posiciones L351 y modificación de aminoácidos Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende unas modificación de aminoácidos en la posición T366 y la modificación de aminoácidos K409F. ' En - un aspecto la modificación de aminoácidos en la posición L351 se selecciona de L351Y, L351I, L351D, L351R o L351F. En otro aspecto, la modificación de aminoácidos en la posición Y407 se selecciona de Y407A, Y407V o Y407S. En otro aspecto más la modificación de aminoácidos en la posición T366 se selecciona de T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En una realización el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 75 °C o mayor y el heterodimero tiene una pureza de aproximadamente el 90% o mayor .

Se proporciona en otra realización un heteromultímero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, én que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos en la posición F405 y modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T394 . En un aspecto el primer polipéptido de dominio CH3 o el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos en las posiciones K392, T411, T366, L368 o S400. La modificación de aminoácidos en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405 . La modificación de aminoácidos en la posición K392 es K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. La modificación de aminoácidos en la posición T411 es T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. La modificación de aminoácidos en la posición S400 es S400E, S400D, S400R o S400K. La modificación de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366L, T366 , T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. La modificación de aminoácidos en la posición L368 es L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S y L368A.

En otra realización se proporciona un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto, el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T366L o T366I.

En . otra realización más se ~ proporciona un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, 392M y T394W.

En ciertas realizaciones se proporciona un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido < de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W.

En otra realización se proporciona un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366L y T394W.

En otra realización se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos T366I y T394 .

En ciertas realizaciones del heteromultímero se proporciona anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico .

En otra realización se proporciona una composición que comprende un heteromultímero de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización se proporciona una célula hospedadora que comprende ácido nucleico que codifica el heteromultímero de la invención.

En ciertas realizaciones se proporciona heteromultímero, en que el heteromultímero comprende al menos un anticuerpo terapéutico. En un aspecto el anticuerpo terapéutico se selecciona del grupo que consiste en abagovomab, adalimumab, aleratuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizuraab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizumab/atlizumab, tositumomab, trastuzumab, ProxiniumTM, RencarexTM, ustekinumab y zalutumumab.

En otra realización del heteromultímero de la invención se proporciona un método para tratar cáncer en un paciente que tenga un cáncer caracterizado por un antígeno canceroso, comprendiendo dicho método administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un heteromultímero.

En otra realización del heteromultímero de la invención se proporciona un método para tratar trastornos inmunes en un paciente que tenga un trastorno inmune caracterizado por un antígeno inmune, comprendiendo dicho método administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un heteromultímero .

En otra realización más se proporciona un heteromultímero aislado que comprende un reg ón Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante qúe comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada y en que los dominios CH3 variantes se seleccionan de las variantes enumeradas en la Tabla 1, Tabla 6 o Tabla 7.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una estructura tridimensional gráfica de un anticuerpo natural que muestra las regiones CH3 (parte superior), CH2 (parte media) y receptora. El rectángulo de linea discontinua en el lado izquierdo se expande al lado derecho mostrando dos regiones, la Región 1 y la Región 2 del área diana de CH3; La Figura 2 es una representación tridimensional gráfica que muestra el resto natural en la posición 368; La Figura 3 es una representación tridimensional gráfica de la Región 1 que muestra la posición mutada 368; La Figura 4 es una representación tridimensional gráfica de mutaciones adicionales en la Región 2; .

La Figura 5 es una tabla de cálculos por ordenador con respecto a puntuación de choque, diferencia de área de interfaz, diferencia de empaquetamiento, diferencia de energía electroestática y "puntuación de afinidad" global para las primeras tres variantes AZI, AZ2 y AZ3; La Figura 6 muestra una imagen tridimensional gráfica que muestra las variantes AZ2 y AZ3, que están "incorporadas en" la variante AZI; La Figura 7 muestra representaciones tridimensionales gráficas de las variantes AZ2 y AZ3; La Figura 8 muestra una tabla como en la Figura 5 pero para heterodímeros de AZI, AZ2 y AZ3 y homodimeros. La puntuación de afinidad no es relevante para los homodimeros de modo que no se muestra puntuación para ese aspecto para los homodimeros; La Figura 9 es una representación gráfica de una representación tridimensional de AZ4 natural (izquierda) y mutada (derecha) ; La Figura 10 es una tabla como en la Figura 5 que muestra cálculos informáticos para homodimeros y heterodimero de AZ ; La Figura 11 es una representación gráfica de las variantes de CH3 AZ5 (izquierda) y AZ6 (derecha) ; La Figura 12 es una tabla como se describe para la Figura 5 que muestra datos informáticos para AZ4, AZ5 y AZ6; La Figura 13 es una representación tridimensional gráfica de un anticuerpo a la izquierda, con un dibujo de las posibilidades de características de unión en la región receptora usando un enfoque heterodimérico; La Figura 14 es una representación esquemática de la molécula de IgG; La Figura 15 muestra múltiples alineamientos de secuencia de receptor Fcy. ID de Secuencia Genebank/Uniprot : FcyRIIA (sp P12318), FcyRIIB (sp P31994), FcyRIIC (gi 126116592), FcyRIIIA (sp P08637), FcyRIIIB (sp 075015); La Figura 16 es un esquema de la estructura cristalina del Complejo Fc-FcyRIIIb [PDB ID: 1T83, Radaev y Sun]. Se observa un complejo 1:1 del Fe y receptor Fcy con un contacto asimétrico entre las dos cadenas de Fe y el FcyR; La Figura 17 muestra un esquema de moléculas multifuncionales alternativas basándose en el armazón de Fe asimétrico: Armazón de Fe Asimétrico y Rama de IgG onomérico de Fe Asimétrico; La Figura .18 muestra un esquema de moléculas multifuncionales alternativas basándose en el armazón de Fe asimétrico: Ramas de IgG Monoespecificas de Fe Asimétrico y Ramas de IgG Biespecificas de Fe Asimétrico (Cadena Ligera Común) ; La Figura 19 muestra una ilustración de moléculas multifuncionales alternativas basándose en el armazón de Fe asimétrico. Ramas de IgG Biespecificas de Fe Asimétrico y una molécula funcional tal como toxina; La Figure 20 ilustra moléculas multifuncionales alternativas basándose en el armazón de Fe asimétrico: Rama de scFv única de Fe Asimétrico y Ramas de scFv biespecificas de Fe asimétrico; La Figura 21 ilustra moléculas multifuncionales alternativas basándose en el armazón de Fe asimétrico: Ramas de scFv Triespecifico de Fe Asimétrico y Ramas de scFv tetraespecifico de Fe asimétrico; La Figura 22 presenta que un diseño asimétrico de mutaciones en una cara del Fe para mejor selectividad del FcyR introduce un lado productivo para interacciones de FcyR y una cara no productiva con interacciones de tipo natural . Las mutaciones de la cara no productiva del Fe pueden introducirse en interacciones en bloque con FcR y polaridad preferente del Fe para interacciona solamente en la cara productiva .

La Figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos para IgGl humana natural .

La Figura 24 muestra el proceso por etapas del diseño del heterodimero de Fe, combinando estrategias de diseño positivas y negativas como se describe en . detalle posteriormente .

La Figura 25 muestra el ensayo in vitro usado para determinar la pureza del heterodimero. El ensayo se basa en un armazón de anticuerpo monoespecífico de longitud completa con dos cadenas pesadas de Fe de diferente peso molecular, la cadena pesada A tiene un marcador His C terminal (His) y la cadena pesada B un marcador mRFP escindible C terminal (RFP) . Las dos cadenas pesadas A (His) y B (RFP) se expresan en relaciones relativas diferentes junto con una cantidad fija de cadena ligera, dando lugar a 3 posibles especies de dímeros con diferente peso molecular: a) Cadena de Homodimero A (His) /Cadena A (His) (-150 kDa); b) Cadena de Heterodimero A (His) /Cadena B (RFP) (-175 kDa); c) Cadena de Homodimero B (RFP)/ Cadena B (RFP) (-200 kDa). Después de la expresión, como se describe en el Ejemplo 2, la relación de heterodimero frente a los dos homodímeros se determinó por SDS-PAGE no reductor, que permite la separación de las 3 especies de dímero por peso molecular. Los genes de SDS-PAGE se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie.

Figura 25A. Las variantes ensayadas fueron WT Cadena A (His) solamente; WT cadena B (RFP) solamente; WT cadena A (His) más cadena B (RFP) ; Control 1 cadena A (His) más cadena B (RFP), que tiene una pureza de heterodimero indicada >95%. La composición de las bandas de dímeros se verificó por Transferencia de Western con anticuerpos dirigidos contra el IgG-Fc (anti-Fc) , el Marcador mRFP (anti-mRFP) y el Marcador His (anti-His), como se ha ilustrado anteriormente. El SDS- PAGE muestra una banda única para el homodimero His/His, una banda doble para el heterodimero His/RFP y múltiples bandas para el homodimero RFP. Las múltiples bandas son un artefacto del marcador mRFP y se ha confirmado que no influyen en las propiedades físicas del heterodimero de Fe.

Figura 25B. El ensayo de SDS-PAGE se validó con las variantes de heterodimero de Fe publicadas Controles 1-4 como controles, Véase, Tabla A. Las variantes se expresaron con diferentes relaciones relativas de cadena A (His) frente a cadena B (RFP): específicamente, la Relación 1:3 es equivalente a ,una relación de LC, HC_His, HC_mRFP de 25%, 10%, 65%; Relación 1:1 de 25%, 20%, 55% y Relación 3:1 de 25%, 40%, 35% respectivamente (la expresión 1:1 aparente de cadena A (His) y cadena B (RFP) se ha determinado que es cercana al 20%/55% (His/RFP) para Fe WT) .

La Figura 25C. Muestra un ensayo de SDS-PAGE no reductor para determinar la pureza del heterodimero de variantes de Armazón 1. Las variantes de Fe se expresaron con diferentes relaciones relativas de cadena A (His) frente a cadena B (RFP) y se analizaron por SDS-PAGE no reductor como se describe en la Figura 2. Específicamente, la Relación 1:3 es equivalente a una relación de LC, HC_His, HC_mRFP de 25%, 10%, 65%; Relación 1:1 de 25%, 20%, 55% y Relación 3:1 de 25%, 40%, 35% respectivamente (se ha determinado que la expresión 1:1 aparente de cadena A (His) y cadena B (RFP) es cercana al 20%/55% (His/RFP) para Fe WT) .

' La Figura 26 muestra variantes del Heterodimero de Fe expresadas con una relación especifica de cadena A (His) frente a cadena B (RFP) (Véase Tabla 2), purificada por cromatografía de afinidad de proteina A y analizada por SDS-PAGE no reductor como se describe en la Figura 25.

La Figura 26A ilustra como diferentes variantes se han agrupado en categorías de pureza basándose en la inspección visual de los resultados de SDS-PAGE. Para comparación la cantidad equivalente de producto purificado de Proteína A se cargó en el gel. Esta definición de pureza basada en SDS-PAGE no reductor se ha confirmado por LC/MS en variantes seleccionadas (véase Figura, 28).

' Figura 26B. Ejemplos de resultados de SDS-PAGE de variantes de heterodimero purificado por Proteína A de Armazón 1 y 2 (AZ94, AZ86, AZ70, AZ33 y AZ34) .

Figura 27 ilustra el análisis de DSC para determinar la temperatura de fusión del dominio CH3-CH3 en que se usaron dos métodos independientes.

Figura 27A. Los termogramas se ajustaron a 4 transiciones de estado distinto a 2 independientes y se optimizaron para producir valores para las transiciones de CH2 y Fab cercanas a los valores indicados en la bibliografía para Herceptina de -72 °C (CH2) y -82 °C (Fab) .

Figura 27B. Los termogramas normalizados y corregidos para linea basal para las variantes de heterodimeros se restaron del WT para producir un pico de diferencia positivo y negativo solamente para la transición de CH3.

La Figura 28 ilustra el análisis de LC/MS de la variante de ejemplo AZ70 como se describe en el ejemplo 2. Se indican las masas esperadas (media calculada) para los heterodimeros y homodimeros glicosilados . La región coherente con la masa heterodimérica contiene picos importantes que corresponden a la pérdida de una glicina (-57 Da) y la adicción de 1 o 2 hexosas (+162 Da y +324 Da, respectivamente) . La pureza del Heterodimero se clasifica como >90% si no hay picos significativos correspondientes a ninguno de los homodimeros.

La Figura 29 muestra la ínterfaz de CH3 de Figura 29A Fe WT; Figura 29B AZ6; Figura 29C AZ33; Figura 29D AZ19. El análisis informático exhaustivo, como se describe en la sección de descripción detallada, y la comparación de las variantes con el WT indicaron que una de las razones para la estabilidad menor que WT del heterodimero AZ33 inicial es la pérdida de la interacción principal/empaquetamiento de Y407 y T366. El AZ33 inicial muestra empaquetamiento no óptimo en este núcleo hidrófobo como ilustra la Figura 29B, lo que sugiere que la optimización de esta región, particularmente en la posición T366 mejorarla la estabilidad de AZ33. Esto se ilustra en la Figura 29C y Figura 29D con T366I y T366L. Los datos experimentales se correlacionan con este análisis estructural y muestran que T366L proporciona la mayor mejora en Tm. Véase, Ejemplo 5.

La Figura 30 ilustra la utilidad e importancia del análisis de dinámica conformacional , ejemplificado en la variante de Armazón 1 inicial AZ8. La estructura después de mutagénesis informática (conformación de cadena principal cercana a WT) se superpone con una estructura representativa de un análisis de simulación de Dinámica molecular de 50 ns . La figura destaca la gran diferencia conformacional en la región de bucle D399-S400 de variante AZ8 frente a WT, que a su vez expone el núcleo hidrófobo a disolvente y provoca reducción de la estabilidad del heterodimero AZ8.

La Figura 31 ilustra cómo la información del análisis informático exhaustivo y la simulación MD se usó en la estrategia de diseño positivo descrita. Como se ilustra en la Figura 30, una de las razones para la estabilidad menor que WT de AZ8 es la interacción debilitada del bucle 399-400 a 409, que se debe principalmente á la pérdida de las interacciones de empaquetamiento de F405 (véase comparación de la Figura 31A (WT) frente a Figura 31B (AZ8 ) ) . Una de las estrategias de diseño positivas fue la optimización del empaquetamiento de área hidrófobo, para estabilizar la conformación del bucle 399-400. Esto se consiguió mediante la mutación K392 que se ilustra en la Figura 31C. La Figura 31C representa el heterodimero AZ33, que tiene una Tm de 74 0 frente a 68 ° de la variante de diseño negativo inicial AZ8.

La Figura 32 ilustra la dinámica de la molécula Fe observada usando análisis de componentes principales de una trayectoria de dinámica molecular. La Figura 32A muestra un rastro de cadena principal de la estructura de Fe como referencia. La Figura 32B y C representa una superposición de dinámica observada a lo largo de los dos modos principales de movimiento superiores en la estructura de Fe. Los dominios CH2 de la cadena A y B muestran movimiento de apertura/cierre significativo entre si mientras que los dominios CH3 son relativamente rígidos. Las mutaciones en la interfaz de CH3 afectan a la flexibilidad relativa y dinámica de este movimiento de apertura/cierre en los dominios CH2.

La Figura 33 ilustra el empaquetamiento de .núcleo hidrófobo de dos variantes de Armazón 2 frente a WT . Figura 33A Fe WT; Figura 33B AZ63; y Figura 33C AZ70. El análisis informático exhaustivo de la variante de Armazón 2 inicial sugirió que la pérdida de las interacciones WT principales de Y407-T366 es una de las razones para la estabilidad menor que WT de las variantes de Armazón 2 iniciales. La pérdida de Y407-T366 se compensa parcialmente por las mutaciones K409F, pero como se ilustra en la Figura 33B, particularmente la mutación T366A deja una cavidad en el núcleo hidrófobo, que desestabiliza la variante frente a WT. La dirección de mutaciones , adicionales T366V_L351Y a este núcleo hidrófobo, como se muestra por la variante de Fe AZ70 en la Figura 33C, resulto exitosa; AZ70 tiene una Tm determinada de forma experimental de 75,5 °C. Véase, Tabla 4 y Ejemplo 6.

La Figura 34 ilustra las interacciones del bucle 399-400 de dos variantes de Armazón 2 frente al WT: Figura 34A Fe WT; Figura 34B AZ63; y Figura 34C AZ94. El análisis informático exhaustivo de la variante de Armazón 2 inicial sugirió que 'la pérdida del puente salino de WT K409-D399 (Figura 34A) debido a la mutación K409F y de este modo la D399 no satisfecha (Figura 34B) provoca una conformación más "abierta" del bucle 399-400. Esto conduce además a una mayor exposición al disolvente del núcleo hidrófobo y una mayor desestabilización de la variante frente a WT. Una de las estrategias empleadas para estabilizar el bucle 399-400 y compensar la pérdida de la interacción K409-D399 fue el diseño de puentes salinos adicionales D399R-T411E y S400R-K392E como se ilustra en la Figura 34C para la variante AZ94. Los datos experimentales mostraron una pureza de >95% y Tm de 74 °C. Véase, Tabla 4 y Ejemplo 6. Además, aunque AZ94 tiene una pureza y estabilidad considerablemente mayor en comparación con la variante de Armazón 2 inicial (pureza <90%, Tm 71 °C) , las mutaciones del núcleo hidrófobo de AZ94 se prefieren menos que las "mejores" mutaciones de núcleo hidrófobo identificadas en la variante AZ70 (Figura 33) . Puesto que las mutaciones en el núcleo hidrófobo de AZ70 (T366V_L351Y) están distantes de las mutaciones del puente salino de AZ94 en el bucle 399-400, se espera que la combinación de mutaciones de aminoácidos de AZ70 y las mutaciones de AZ94 adicionales tenga una mayor temperatura de fusión que AZ70 o AZ94. Esta combinación puede ensayarse como se describe en los Ejemplos 1-4.

La Figura 35 ilustra la constante de asociación (Ka(M-1)) de Fe IgGl homodimérico, uniéndose las variantes heterodiméricas hetl (Control 1) : A: Y349C_T366S_L368A_Y407V/B: S354C_T366 y het2 (Control 4): A:K409D_K392D/B: D399K_D356K con los seis receptores Fcgamma . Las variantes de Fe heterodiméricas tienden a mostrar unión ligeramente alterada con los receptores Fcgamma en comparación con el Fe IgGl natural. Véase, Ejemplo 7 La Figura 36A muestra la fuerza de unión relativa de un Fe IgGl natural y sus diversas formas mutantes homodiméricas y asimétricas con los receptores IlbF, IIBY y IlaR, basándose en la fuerza de unión natural como referencia. (Fe Homo + S267D) se refiere a la fuerza de unión de un Fe homodimérico con la mutación S267D en ambas cadenas. (Het Fe + S267D asym) se refiere a la fuerza de unión de un Fe heterodimérico con la mutación S267D introducida en una de las dos cadenas en Fe. Se presenta la media de la fuerza de unión obtenida introduciendo la mutación en una de las dos cadenas de Fe. La introducción de esta mutación en una cadena redujo la fuerza de unión aproximadamente a la mitad de la fuerza observada para la misma mutación de una manera homodimérica . El (Fe Het + S267D asim + E269K asim) se refiere a la fuerza de unión de un Fe heterodimérico con las mutaciones tanto S267D como E269K introducidas de una manera asimétrica en una de las dos cadenas de Fe. La mutación E269K bloquea la interacción del FcgR con una de las caras del Fe y es capaz de disminuir la fuerza de unión aproximadamente a la mitad de lo que se observó para la variante de S267D asimétrica (Fe Het +S267D) por sí sola. El Fe Het aquí está comprendido por mutaciones de CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la Figura 35.

La Figura 36B muestra la constante de asociación (Ka(M-1) ) de diversos Fe y sus variantes con varios alotipos de FcgRIIa, FcgRIIb y FcgRIIIa. La Ka de Fe IgGl natural para diversos receptores Fcg está representada como columnas con sombreado horizontal. Las barras con sombreados verticales (base homodimérica 2) representa la Ka de Fe homodimérico con las mutaciones S239D/D265S/I332E/S298A. Las columnas con el sombrado inclinado representan la Ka de Fe heterodimérico con mutaciones asimétricas A: S239D/D265S/I332E/E269K y B:S239D/D265S/S298A en el dominio CH2. La introducción de mutaciones asimétricas es capaz de conseguir selectividad aumentada entre los receptores Illa y Ila/IIb: El Fe Heterodimérico aquí está comprendido por mutaciones de CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la Figura 35.

La Figura 36C muestra la constante de asociación (Ka (M-1) ) para IgGl natural y otras tres variantes que implican mutaciones homodiméricas o asimétricas en el dominio CH2 de la región Fe. La Ka de Fe natural está representada en la columna sombreada en cuadriculas. La Ka de variante de Fe con la mutación de base S239D/K326E/A330L/I332E/S298A introducida de una manera homodimérica (base homodimérica 1) en ambas cadenas de Fe se muestra con la columna en patrón inclinado. La introducción de mutaciones relacionadas de una manera asimétrica en las cadenas A y B de un Fe heterodimérico (base hetero 1) se muestra con las lineas horizontales. La columna con lineas sombreadas verticales representa la variante asimétrica que incluye la mutación E269K (base hetero 1+PD) . El Fe Heterodimérico aquí está comprendido por mutaciones de CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la Figura 35.

Figura 37 - Tabla 6 Es una lista de dominios CH3 variantes basados en la tercera fase de diseño como se describe en el Ejemplo 5 para el armazón 1.

La Figura 38 - Tabla 7 es una lista de dominios CH3 variantes basados en la tercera fase de diseño como se describe en el Ejemplo 6 para el armazón 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona dominios CH3 modificados que comprenden modificaciones de aminoácidos específicos para promover la formación de heterodímeros . En una realización, los dominios CH3 modificados comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heterodímeros (Véase, por ejemplo Tabla 1). En otra realización los dominios CH3 modificados comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada (Véase, por ejemplo, Tabla 4, Tabla 6 y Tabla 7) . La estabilidad se mide como la temperatura de fusión (Tm) del dominio CH3 y una estabilidad aumentada se refiere a una Tm de aproximadamente 70 °C o mayor. Los dominios CH3 forman parte de la región de Fe de un anticuerpo heteromultimérico o biespecífico . Por lo tanto, se proporcionan en el presente documento en una realización heteromultímeros que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado o variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros en que los dominios CH3 variantes se seleccionan de las variantes enumeradas en la Tabla 1. En una segunda realización, se proporcionan heteromultimeros que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor.

Las modificaciones de aminoácidos que pueden utilizarse para generar un dominio CH3 modificado incluyen, pero sin limitación, inserciones de aminoácidos, deleciones, sustituciones y reordenamientos. Las modificaciones del dominio CH3 y los dominios CH3 modificados se denominan en el presente documento de forma colectiva "modificaciones de CH3", "dominios CH3 modificados", "dominios CH3 variantes" o "variantes de CH3". Estos dominios CH3 modificados pueden incorporarse en una molécula de elección. En consecuencia, en una realización se proporcionan moléculas, en particular polipéptidos , más específicamente inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos) y otras proteínas de unión, que comprenden una región Fe (como se usa en el presente documento "región Fe" y términos similares abarcan cualquier dominio de región constante de cadena pesada que comprende al menos una parte del dominio CH3) que incorpora un dominio CH3 modificado. Las moléculas que comprenden regiones Fe que comprenden un dominio CH3 modificado (por ejemplo, un dominio CH3 que comprende una o más inserciones, deleciones, sustituciones o reordenamientos de aminoácidos) se denominan en el presente documento "variantes de Fe", "heterodímeros" o "heteromultimeros" . Las presentes variantes de Fe comprenden un dominio CH3 que se ha modificado de forma asimétrica para generar variantes o regiones de Fe heterodiméricas . La región Fe está comprendida por dos polipéptidos de dominio constante de cadena pesada - Cadena A y Cadena B, que pueden usarse de forma intercambiable siempre que cada región Fe comprenda un polipéptido de Cadena A y uno de Cadena B. Las modificaciones de aminoácidos se introducen en el CH3 de una manera asimétrica dando como resultado un heterodimero cuando dos. dominios CH3 modificados formen una variante de Fe (véase, por ejemplo, Tabla 1) . Como se usa en el presente documento, las- modificaciones de aminoácidos asimétricas son cualquier modificación en que un aminoácido en una posición especifica en un polipéptido (por ejemplo, "Cadena A") es diferente del aminoácido en el segundo polipéptido (por ejemplo, "Cadena B") en la misma posición del heter'odímero o variante de Fe. Esto puede ser un resultado de la modificación de solamente uno de los dos aminoácidos o una modificación de ambos aminoácidos a diferentes aminoácidos de Cadena A y Cadena B de la variante de Fe. Se entiende que los dominios CH3 variantes comprenden una o más modificaciones de aminoácidos asimétricas .

En la presente descripción, se entiende que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo indicado y, cuando sea apropiado, fracciones de los mismos (tal como un décimo y un centésimo de un número entero) , a no ser que se indique de otro modo. Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" significa + 10% del intervalo, valor, secuencia o estructura indicados, a no ser que se indique de otro modo. Debería entenderse que el término "un" como se usa en el presente documento se refiere a "uno o más" de los componentes enumerados a no ser que se indique o se dicte de otro modo por su contexto. Debería entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, "o") significa uno, ambos o cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Como se usa en el presente documento, los términos "incluir" y "comprender" se usan de forma sinónima. Además, debería entenderse que los polipéptidos o heterodímeros de cadena sencilla individuales derivados de diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes (por ejemplo, dominios CH3 variante) descritos en el presente documento se describen por la presente solicitud en el mismo grado que si cada polipéptido o heterodimero de cadena sencilla se expusiera individualmente. Por lo tanto, la selección de componentes particulares para formar polipéptidos o heterodímeros de cadena sencilla individuales está dentro del alcance de la presente descripción.

El "primer polipéptido" es cualquier polipéptido que vaya a asociarse con un segundo polipéptido, también denominado en el presente documento "Cadena A". El primer y segundo polipéptidos se encuentran en una "interfaz". El "segundo polipéptido" es cualquier polipéptido que vaya a asociarse con el primer polipéptido mediante una "interfaz", también denominado en el presente documento "Cadena B". La "interfaz" comprende los restos de aminoácidos "de contacto" en el primer polipéptido que interaccionan con uno o más restos de aminoácidos "de contacto" en la interfaz del segundo polipéptido. Como se usa en el presente documento, la interfaz comprende el dominio CH3 de una región Fe que preferentemente deriva de un anticuerpo IgG y más preferentemente un anticuerpo IgGl humano.

Como se usa en el presente documento, heteromultímero "aislado" significa un heteromultímero que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente de cultivo celular natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el heteromultímero, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.

Los heterodímeros de Fe variantes se purifican en general hasta homogeneidad sustancial. Las frases "sustancialmente homogéneo", "forma sustancialmente homogénea" y "homogeneidad sustancial" se usan para indicar que el producto está sustancialmente desprovisto de productos secundarios originados de combinaciones polipeptídicas no deseadas (por ejemplo homodímeros ) .. Expresada con respecto a pureza, la homogeneidad sustancial significa que la cantidad de productos secundarios no excede el 1.0%, y preferentemente está por debajo del 5%, más preferentemente por debajo del 1%, más preferentemente por debajo del 0,5% en que los porcentajes están en peso.

Se da a los términos entendidos por los expertos en la tecnología de anticuerpos el significado adquirido en la técnica, a no ser que se defina expresamente de forma diferente en el presente documento. Se sabe que los anticuerpos tienen regiones variables, una región bisagra y dominios constantes. Se revisa la estructura y función de inmunoglobulina, por ejemplo, en Harlow et al, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capitulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988) .

El diseño de heterodimeros de Fe variantes de homodimeros naturales se ilustra por el concepto de diseño positivo y negativo en el contexto de ingeniería proteica equilibrando la estabilidad frente a la especificidad, en que las mutaciones se introducen con el objetivo de dirigir la formación de heterodimeros sobre la formación de homodimeros cuando los polipéptidos se expresan en condiciones de cultivo celular. Las estrategias de diseño negativo maximizan las interacciones desfavorables para la formación de homodimeros, introduciendo cadenas laterales voluminosas en una cadena y cadenas laterales pequeñas en la opuesta, por ejemplo la estrategia de botón en ojal desarrollado por Genentech (Ridgway JB, Presta LG, Cárter P. 'Knobs-into-holes ' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. Jul 1996; 9(7): 617-21; Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Cárter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol. 270(1): 26-35 (1997))), o por ingeniería electroestática que conduce a la repulsión de la formación de homodimeros, por ejemplo la estrategia de dirección electroestática desarrollada por Amgen (Gunaskekaran K, et al. Enhancing antibody Fe heterodimer formation through electrostatic steering effeets: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. JBC 285 (25): 19637-19646 (2010)). En estos dos ejemplos, se introdujeron mutaciones puntuales asimétricas de diseño negativo en el dominio CH3 natural para dirigir la formación de heterodímeros . Hasta la fecha, solamente se han usado estrategias de diseño negativas para desarrollar heterodímeros de Fe. Los resultados publicados muestran que los heterodímeros diseñados usando solamente un enfoque de diseño negativo conducen a alta especificidad con >95% de heterodímeros, pero desestabilizan el complejo considerablemente (Véase anteriormente) . Estos heterodímeros de diseño negativo poseen una temperatura de fusión del dominio CH3 modificado, de 69 °C o menos, sin enlaces disulfuro adicionales en comparación con el natural. Véase, Tabla A a continuación.

Tabla A: Anticuerpos Heterodiméricos Fe Publicados.

* Los inventores observaron una pureza de >90% para Control 1 en su sistema de ensayo/ pero no 100% como se ha indicado previamente en la bibliografía.

Los inventores observaron una Tm mayor de 77 °C para el control 4 en su sistema de ensayo; la Tm para esta variante no se ha publicado en la bibliografía.

NP - La Tm para el Control 3 no se ha publicado y no se ensayó en los sistemas de ensayo de los inventores.

La temperatura de fusión para IgGl natural se muestra como un intervalo de 81-83 ya que los valores en la bibliografía varían dependiendo del sistema de ensayo usado, los inventores presentan un valor de 81,5 °C en su sistema de ensayo .

A diferencia del diseño negativo, un concepto general usado para modificar proteínas por ingeniería es el diseño positivo. En este caso se introducen modificaciones de aminoácidos en polipéptidos para maximizar las interacciones favorables dentro de o entre proteínas. Esta estrategia asume que cuando se introducen múltiples mutaciones que estabilizan específicamente el heterodímero deseado desatendiendo a la vez al efecto en los homodímeros, el efecto neto será mejor especificidad para las interacciones heterodiméricas deseadas sobre los homodímeros y por lo tanto una mayor especificidad heterodimérica . Se entiende en el contexto de la ingeniería proteica que las estrategias de diseño positivo optimizan la estabilidad de las interacciones proteicas deseadas, pero en pocas ocasiones alcanzan >90% de especificidad (Havranek JJ y Harbury ?B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nat Struct Biol. 10(1): 45-52 (2003); Bolón DN, Grant RA, Baker TA, Sauer RT . Specificity versus stability in computational protein design. Proc Nati Acad Sci U S A. 6; 102(36): 12724-9 (2005); Huang PS, Love JJ, Mayo SL. A de novo designed protein protein interface Protein Sci. 16(12): 2770-4 (2007)). Y por lo tanto, hasta la fecha, no se han usado estrategias de diseño positivas para diseñar heterodíme-ros de Fe ya que la especificidad era más importante que la estabilidad para la fabricación y el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Además, puede ser difícil predecir mutaciones de diseño positivas beneficiosas. Otras metodologías para mejorar la estabilidad, tales como enlaces disulfuro adicionales, se han intentado para mejorar la estabilidad en heterodímeros de Fe con éxito limitado en mejoras de la molécula (Véase, Tabla A) . Esto puede deberse a que todos los enlaces disulfuro del dominio CH3 de Fe modificados por ingeniería genética están expuestos al disolvente, lo que da como resultado un tiempo de vida corto del enlace disulfuro y por lo tanto un impacto significativo en la estabilidad á largo plazo del heterodímero, especialmente cuando el dominio CH3 modificado por ingeniería genética tiene una Tm de menos de 70 °C sin el enlace disulfuro adicional (como en el Control 4 que tiene una Tm de 69 °C sin el disulfuro (véase Control 2) . Se contempla que pueden usarse también otras metodologías para mejorar la estabilidad, tales como enlaces disulfuro, con las variantes de Fe presentes, siempre que la estabilidad intrínseca (medida como temperatura de fusión) del dominio CH3 sea 70 °C o mayor sin el enlace disulfuro, en particular cuando la estabilidad intrínseca (medida como temperatura de fusión) del dominio CH3 sea 72 °C o mayor sin el enlace disulfuro.

Por lo tanto, los inventores describen en el presente documento un nuevo método para diseñar heterodímeros de Fe que da- como resultado formación de heterodímeros tanto estables como altamente específicos. Este método de diseño combina estrategias de diseño tanto negativas como positivas junto con técnicas de ingeniería proteica guiadas por modelación estructural y computacional . Este potente método ha permitido a los inventores diseñar nuevas combinaciones de mutaciones en el dominio CH3 de IgGl en que usando solamente condiciones de cultivo celular convencionales se formaron heterodímeros con más del 90% de pureza en comparación con homodímeros y los heterodímeros resultantes tuvieron una temperatura de fusión de 70 °C o mayor. En realizaciones ejemplares, los heterodímeros variantes de Fe tienen una temperatura de fusión de 73 °C o mayor y una pureza de más del 98%. En otras realizaciones ejemplares, los heterodímeros variantes de Fe tienen una temperatura' de fusión de 75 °C o mayor y una pureza de más del 90%.

En ciertas realizaciones, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fe heterodimérica en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de 70 °C o mayor. Como se usa en el presente documento "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable", se refiere a un dominio CH3 variante, en la formación de heterodimero, con una temperatura de fusión de aproximadamente 70 °C o mayor. Además, se entiende que la expresión "promover la formación de heterodimero" se refiere en el presente documento a las mutaciones de aminoácidos en el dominio CH3 que dan como resultado más del 90% de formación de heterodimeros en comparación con la formación de homodimeros.

En una realización adicional, esta estabilidad aumentada es en ausencia de un enlace disulfuro adicional. Específicamente, la estabilidad aumentada es en ausencia de un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3. En una realización, el dominio CH3 variante no comprende un enlace disulfuro adicional en comparación con dominio CH3 natural. En una realización alternativa, el CH3 variante comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 natural, siempre que el CH3 variante tenga una temperatura de fusión de 70 °C o más en ausencia del enlace disulfuro. En una realización, el dominio CH3 variante comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con dominio CH3 natural y el dominio CH3 variante tiene una. temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 77,5 °C o mayor. En una realización, el dominio CH3 variante comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con dominio CH3 natural y el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 78 °C o mayor. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con dominio CH3 natural y el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de más de aproximadamente 78 °C, o mayor de aproximadamente 78,5 °C, o mayor de aproximadamente 79 °C, o mayor de aproximadamente 79,5 °C, o mayor de aproximadamente 80 °C, o mayor de aproximadamente 80,5 °c, o mayor de aproximadamente 81 °c.

En una realización, , el dominio CH3 variante tiene ¦una temperatura de :fusión de más de aproximadamente 70 °c, más de aproximadamente 70,5 °c, más de aproximadamente 71 °c, más de aproximadamente 71,5 °c, más de aproximadamente 72 °c, más de aproximadamente 72,5 °c, más de aproximadamente 73 °c, más de aproximadamente 73,5 °c, más de aproximadamente 74 °c, más de aproximadamente 74,5 °c, más de aproximadamente 75 °c, más de aproximadamente 75,5 °c, más de aproximadamente 76 °c, más de aproximadamente 76, 5 °c, más de aproximadamente 77 °c, más de aproximadamente 77,5 °c, más de aproximadamente 78 °c, más de aproximadamente 78,5 °c, más de aproximadamente 79 °c, más de aproximadamente 79, 5 °c, más de aproximadamente 80 °c, más de-aproximadamente 80,5 °c, o más de aproximadamente 81 °C. En otra realización el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 70 °c, aproximadamente 70,5 °C aproximadamente 71 °c, aproximadamente 71, 5 °c, aproximadamente 72 °c, aproximadamente 72, 5 °c, aproximadamente 73 °c, aproximadamente 73, 5 °c, aproximadamente 74 °c, aproximadamente 74, 5 °c, aproximadamente 75 °c, aproximadamente 75, 5 °c, aproximadamente 76 °c, aproximadamente 76,5 °c, aproximadamente 77 °c, aproximadamente 77, 5 °c, aproximadamente 78 °c, aproximadamente 78, 5 °c, aproximadamente 79 °c, aproximadamente 79, 5 °c, aproximadamente 80 °c, aproximadamente £ 10,5 °C o aproximadamente 81 °C. En otra realización más, el dominic > CH3 variante tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 70 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 70,5 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 71 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 71,5 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 72 °c a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 72, 5 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 73 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 73, 5 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 74 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 74,5 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 75 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 75, 5 °C a aproximadamente 81 °c, de aproximadamente 76 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 76,5 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 77 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 77,5 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 78 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 78,5 °C a aproximadamente 81 °C o de aproximadamente 79 °C a aproximadamente 81 °C. En otra realización más, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 71 °C a aproximadamente 76 °C, de aproximadamente 72 °C a aproximadamente 76 °C, de aproximadamente 73 °C a aproximadamente 76 °C o de aproximadamente 74 °C a aproximadamente 76 °C.

Además de la estabilidad mejorada, la región de Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante " que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros . Se entiende que estas mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros son en comparación con la formación de homodimeros. Esta formación de heterodimeros en comparación con la formación de homodimeros se denomina conjuntamente en el presente documento "pureza", "especificidad", "pureza de heterodimeros" o "especificidad de heterodimeros". Se entiende que la pureza de heterodimeros se refiere al porcentaje de heterodimero deseado formado en comparación con especies de homodimeros formadas en solución en condiciones de cultivo celular convencionales antes de la purificación selectiva de la especie de heterodimero. Por ejemplo, üna pureza de heterodimero del 90% indica que el 90% de las especies diméricas en solución son el heterodimero deseado. En una realización, los heterodimeros variantes de Fe tienen una pureza de más de aproximadamente el 90%, más de aproximadamente el 91%, más de aproximadamente el 92%, más de aproximadamente el 93%, más de aproximadamente el 94%, más de aproximadamente el 95%, más de aproximadamente el 96%, más de aproximadamente el 97%, más de aproximadamente el 98% o más de aproximadamente el 99%. En otra realización los heterodimeros variantes de Fe tienen una pureza de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o aproximadamente 100%.

En una realización especifica, el heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de 70 °C o mayor y el heterodimero resultante tiene una pureza mayor del 90%. En un aspecto, el heterodimero variante de Fe resultante tiene una pureza mayor del 90% y el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de más de aproximadamente 70 °c, más de aproximadamente 71 °c, más de aproximadamente 72 °c, más de aproximadamente 73 °c, más de aproximadamente 74 °c, más de aproximadamente 75 °c, más de aproximadamente 76 °c, más de aproximadamente 77 °c, más de aproximadamente 78 °c, más de aproximadamente 79 °c, más de aproximadamente 80 °c o más de aproximadamente 81 °C . En un aspecto adicional, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de 70 °C o mayor y el heterodimero variante de Fe resultante tiene una pureza mayor de aproximadamente el 90%,· mayor de aproximadamente el 91%, mayor de aproximadamente el 92%, mayor de aproximadamente el 93%, mayor de aproximadamente el 94%, mayor de aproximadamente el 95%, mayor de aproximadamente el 96%, mayor de aproximadamente el 97%, mayor de aproximadamente el 98% o mayor de aproximadamente el 99%.

Para diseñar estas variantes de Fe con estabilidad y pureza mejoradas los inventores emplearon un procedimiento por iteraciones de diseño computacional y exploración experimental para seleccionar las combinaciones más exitosas de estrategias de diseño positivas y negativas (Véase, Figura 24) .

Específicamente, en la fase de diseño inicial se realizaron heterodímeros variantes de Fe de diseño negativo diferentes y se ensayaron con respecto a expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1-3. La fase de diseño inicial incluyó heterodímeros variantes de Fe AZ1-AZ16 (Véase, Tabla 1) . A partir de este conjunto inicial de heterodímeros variantes de Fe de diseño negativo, que se esperaba que tuvieran baja estabilidad (por ejemplo, una Tm de menos de 71 °C) , se seleccionaron los heterodímeros variantes de Fe con pureza mayor del 90% y una temperatura de fusión de aproximadamente 68 °C o mayor para desarrollo posterior. Esto incluyó heterodímeros variantes de Fe AZ6, AZ8 y AZ15. En la segunda fase de diseño, los heterodímeros variantes de Fe seleccionados se modificaron adicionalmente para dirigir tanto la estabilidad como la pureza usando estrategias de diseño positivas siguiendo un análisis estructural y computacional detallado. Los heterodímeros variantes de Fe seleccionados (AZ6, AZ8 y AZ15) se analizaron cada uno con métodos computacionales y análisis de función estructural exhaustivo para identificar las razones estructurales por las que estas variantes de Fe tuvieron una estabilidad menor que el homodímero de Fe natural, que es¦ de 81 °C para IgGl. Véase, Tabla 4 para la lista de heterodimeros variantes de Fe y los valores de Tm.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 ' variante se selecciona de AZI, AZ2, AZ3, AZ4, AZ5, AZ6, AZ7, AZ8, AZ9, AZ10, AZ11, AZ12, AZ13, AZ14, AZ15, o AZ16. En realizaciones seleccionadas, el dominio CH3 variante es AZ6, AZ8 o AZ15.

Las herramientas computacionales y análisis de función estructural .incluyeron, pero sin limitación, análisis dinámico molecular (MD) , reempaquetamiento de cadena lateral/cadena principal, Potencial de Base de Conocimientos (KBP) , análisis de cavidad y empaquetamiento (hidrófobo) (LJ, CCSD, SASA, dSASA (carbono/todos los átomos)), cálculos electroestáticos-GB, y análisis de acoplamiento (Véase Figura 24 para una revisión de la estrategia computacional ) .

Un aspecto del enfoque de ingeniería proteica de los inventores se basó en combinar la información estructural de la proteína de IgG Fe derivada de cristalografí de rayos X con modelación computacional y simulación de las ' formas naturales y variantes del dominio CH3. Esto permite a los inventores obtener información estructural y físico química nueva acerca del amplio potencial de los aminoácidos individuales y su acción cooperativa. Estas informaciones estructurales y físico químicas, obtenidas de múltiples dominios CH3 variantes, junto con los datos empíricos resultantes relacionados con su estabilidad y pureza ayudaron a los inventores a desarrollar un entendimiento de la relación entre la pureza y estabilidad del heterodimero de Fe en comparación con los homodímeros de Fe y los modelos estructurales simulados. Para ejecutar las simulaciones los inventores comenzaron construyendo modelos completos y realistas y refinando la calidad de la estructura de Fe natural de un anticuerpo IgGl. Las estructuras proteicas derivadas de cristalografía de rayos X carecen de detalles con respecto a ciertos elementos de la proteina en medio acuoso en condiciones fisiológicas y los procedimientos de refinamiento de los inventores abordaron estas limitaciones. Estas incluyen la construcción de regiones ausentes de la estructura proteica, con frecuencia partes flexibles de la proteína tales como bucles y algunas cadenas laterales de restos, evaluar y definir los estados de protonación de los restos neutros y cargados y situación de posibles moléculas de agua funcionalmente relevantes asociadas con la proteína.

Los algoritmos de dinámica molecular (MD) son una herramienta que usaron los inventores, simulando la estructura proteica, para evaluar la naturaleza dinámica intrínseca del homodímero de Fe y los dominios CH3 variantes en un ambiente acuoso. Las simulaciones de dinámica molecular rastrean la trayectoria dinámica de una molécula que resulta de movimientos que surgen de interacciones y fuerzas que actúan entre todas las entidades atómicas en la proteina y su ambiente local, en este caso los átomos que constituyen el Fe y sus moléculas de agua circundantes. Después de las simulaciones de dinámica molecular, se analizaron diversos aspectos de las trayectorias para obtener información acerca de las características estructurales y dinámicas de un homodímero de Fe y heterodímero de Fe variante, que los inventores usaron para identificar mutaciones de aminoácidos específicas para mejorar tanto la pureza como la estabilidad de la molécula.

Por lo tanto, las trayectorias de MD generadas se estudiaron usando métodos tales como el análisis de componentes principales para revelar los modos de frecuencia baja intrínsecos de movimiento en la estructura de Fe. Esto proporciona información sobre los subestados conformacionales potenciales de la proteína (Véase, Figura 32). Aunque las interacciones proteína-proteína críticas entre la cadena A y B en la región Fe se producen en la interfaz de los dominios CH3, las simulaciones de los inventores indicaron que esta interfaz actúa como una bisagra en un movimiento que implica la "apertura" y "cierre" de los extremos N terminales de los dominios CH2 entre sí. El dominio CH2 interacciona con FcgR en este extremo como se ve en la Figura 16. Por lo tanto, sin desear quedar ligado a la teoría, parece que la introducción de mutaciones de aminoácidos en la interfaz de CH3 tiene un impacto en la magnitud y naturaleza del movimiento de apertura/cierre en el extremo N terminal del Fe y por lo tanto cómo interacciona el Fe con los FcgR. Véase, ejemplo 4 y Tabla 5.

Las trayectorias de MD generadas también se estudiaron para determinar la mutabilidad de posiciones de restos de aminoácidos específicos en la estructura de Fe basándose en el perfil de su flexibilidad y análisis de su ambiente. Este algoritmo permitió a los inventores identificar restos que podrían afectar a la estructura y función proteica, proporcionando información única sobre las características de los restos y mutabilidad para fases de diseño posteriores de los dominios CH3 variantes. Este análisis también permite a los inventores comparar múltiples simulaciones y evaluar la mutabilidad basándose en valores extremos después de la realización de perfil.

Las trayectorias de MD generadas también se estudiaron para determinar los movimientos de restos correlacionados en la proteína y la formación de redes de restos como resultado del acoplamiento entre ellos. El hallazgo de correlaciones dinámicas y redes de restos dentro de la estructura de Fe es una etapa crítica en el entendimiento de la proteína como una entidad dinámica y para desarrollar información sobre los efectos de las mutaciones en sitios distales. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 6.

Por lo tanto, los inventores estudiaron en detalle el impacto de f mutaciones en el ámbito local del sitio de mutación. La formación de un núcleo bien empaquetado en la interfaz de CH3 entre la cadena A y B es crítica para el emparejamiento espontáneo de "las dos cadenas en una estructura de Fe estable. El buen empaquetamiento es el resultado de complementariedad estructural fuerte entre compañeros moleculares que interaccionan acoplados con' interacciones favorables entre los . grupos de contacto. Las interacciones favorables resultan de contactos hidrófobos internados bien separados de la exposición al disolvente y/o de la formación de contactos electroestáticos complementarios entre grupos polares hidrófilos. Estos contactos hidrófobos e hidrófilos tienen contribuciones entrópicas y entálpicas a la energía libre de formación de dímeros en la interfaz de CH3. Los inventores emplean una diversidad de algoritmos para modelar con precisión el empaquetamiento en la interfaz de CH3 entre la cadena A y cadena B y posteriormente evaluar las propiedades termodinámicas de la interfaz puntuando varias propiedades físico químicas relevantes.

Los inventores emplearon varios métodos de empaquetamiento de proteínas incluyendo cadenas principales flexibles para optimizar y preparar estructuras de modelo para el gran número de variantes que exploraron computacionalmente los inventores. Después del empaquetamiento los inventores evaluaron varios términos incluyendo densidad de contacto, puntuación de choque, enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad y electroestática . El-uso del modelo de disolución permitió a los inventores abordar de forma más precisa el efecto del ambiente del disolvente y contrastar las diferencias de energía libre después de mutación de posiciones específicas en la proteína para alternar tipos de restos. La densidad de contacto y puntuación de choque proporcionan una medida de complementariedad, un aspecto crítico del empaquetamiento de proteínas eficaz. Estos procedimientos de exploración se basan en la aplicación de potenciales basados en el conocimiento o esquemas de análisis de acoplamiento basándose en la energía de interacción de restos por pares y computaciones de entropía.

Este análisis informático exhaustivo proporcionó un entendimiento detallado de las diferencias de cada variante de Fe en comparación con el natural con respecto a puntos calientes de la interfaz, sitios de asimetría, cavidades y regiones mal' empaquetadas, dinámica estructural de sitios individuales y sitios de desplegamiento local. Estos resultados combinados del análisis computacional descrito identificaron restos específicos, motivos de secuencia/estructurales y cavidades que no estaban optimizadas y en combinación responsables de la menor estabilidad (por ejemplo Tm de 68 °C) y/o menor especificidad de <90% de pureza. En la segunda fase de diseño los inventores usaron diseño positivo dirigido para abordar específicamente estas hipótesis mediante mutaciones puntuales adicionales y ensayaron estas mediante ingeniería informática usando la metodología anteriormente descrita y análisis (Véase, Figura 24). Los heterodímeros variantes de Fe diseñados para mejorar la estabilidad y pureza para cada diseño diana en la fase dos (heterodímeros variantes de Fe AZ17-AZ101) se validaron experimentalmente para expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1-4.

En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante es AZ17, AZ18, AZ19, AZ20, AZ21, AZ22, AZ23, AZ24, AZ25, AZ26, AZ27, AZ28, AZ29, AZ30, AZ21, AZ32, AZ33, AZ34, AZ35, AZ36, AZ37, AZ38, AZ39, AZ40, AZ41, AZ42, AZ43, AZ44, AZ45, AZ46, AZ47, AZ48, AZ49, AZ50, AZ51, AZ52, AZ53, AZ54, AZ55, AZ56 AZ57, AZ58, AZ59, AZ60, AZ61, AZ62, AZ63, AZ64, AZ65, AZ66, AZ67, AZ68, AZ69, AZ70, AZ71, AZ72, AZ73, AZ74, AZ75, AZ76, AZ77, AZ78, AZ79, AZ80, AZ81, AZ82, AZ83, AZ84, AZ85, AZ86, AZ87, AZ88, AZ89, AZ90, AZ91, AZ92, AZ93, AZ94, AZ95, AZ96, AZ97, AZ98, AZ99, AZ100 o AZ101. En una realización ejemplar, el dominio CH3 variante es AZ17, AZ18, AZ19, AZ20, AZ21, AZ22, AZ23, AZ24, AZ25, AZ26, AZ27, AZ28, AZ29,' AZ30, AZ21, AZ32, AZ33, AZ34, AZ38, AZ42, AZ43, AZ 44, AZ45, AZ46, AZ47, AZ48, AZ49, AZ50, AZ52, AZ53, AZ54, AZ58, AZ59, AZ60, AZ61, AZ62, AZ63, AZ64, AZ65, ??ßß, AZ67, AZ68, AZ69, AZ70, AZ71, AZ72, AZ73, AZ74, AZ75, AZ76, AZ77, AZ78, AZ79, AZ81, AZ82, AZ83, AZ84, AZ85, AZ86, AZ87, AZ88, AZ89, AZ91, AZ92, AZ93, AZ94, AZ95, AZ98, AZ99, AZ100 o AZ101. En una realización especifica, el dominio CH3 variante es AZ33 o AZ34. En otra realización, el dominio CH3 variante es AZ70 o AZ90.

En una realización. ej emplar, el dominio CH3 comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en este documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y en que el segundo polipéptido comprende las modificaciones de , aminoácidos T366I, K392M y T394W. En otra realización, un primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, S400E, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, N390R, K392M y T394W.

Este procedimiento por iteraciones del análisis de la función estructural computacional , ingeniería dirigida y validación experimental se usó para diseñar las .variantes de Fe restantes enumeradas en la Tabla 1 en fases de diseño posteriores y dio como resultado heterodímeros variantes de Fe con una pureza mayor del 90% y una estabilidad aumentada con una temperatura de fusión del dominio CH3 mayor de 70 °C. En ciertas realizaciones, las variantes de Fe comprenden mutaciones de aminoácidos seleccionadas de AZI a AZ 136. En realizaciones adicionales, las variantes de Fe comprenden mutaciones de aminoácidos seleccionadas de las variantes de Fe enumeradas en la Tabla 4.

A partir de la primera y segunda fases de diseño se identificaron dos armazones centrales, el Armazón 1 y Armazón 2, en que se introdujeron modificaciones de aminoácidos adicionales en estos armazones para ajusfar la pureza y estabilidad de los heterodímeros variantes de Fe. Véase el Ejemplo 5 para una descripción detallada del desarrollo del Armazón 1 que incluye AZ8, AZ17-62 y las variantes enumeradas en la Tabla 6. Véase el Ejemplo 6 para una descripción detallada del desarrollo del Armazón 2 que incluye AZ15 y AZ63-101 y las variantes enumeradas en la Tabla 7.

Las mutaciones principales del Armazón 1 comprenden L351Y_F405A_Y407V / T394W. El Armazón la comprende las mutaciones de aminoácidos T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V y el Armazón Ib comprende las mutaciones de aminoácidos T366L_K392 _T394 /F405A_Y407V. Véase, Ejemplo 5.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto el dominio CH3 variante comprende además mutaciones puntuales en las posiciones F405 y/o K392. Estas mutaciones en la posición K392 incluyen, pero sin limitación, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. Estas mutaciones en la posición F405 incluyen, pero sin limitación, F405I, F405M, F405S, F405S, F405V o F405W. En otro aspecto, el dominio CH3 variante comprende además mutaciones puntuales en las posiciones T411 y/o S400. Estas mutaciones en la posición T411 incluyen, pero sin limitación, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. Estas mutaciones en la posición S400 incluyen, pero sin limitación, S400E, S400D, S400R o S400K. En otra realización más, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T394W, en que el primer y/o segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos adicionales en las posiciones T366 y/o L368. Estas mutaciones en la posición T366 incluyen, pero sin limitación, T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En una realización ejemplar la mutación de aminoácidos en la posición T366 es T366I. En otra realización ejemplar, la mutación de aminoácidos en la posición T366 es T366L. Las mutaciones en la posición L368 incluyen, pero sin limitación, L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S y L368A.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L y T394W. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de' aminoácidos T366I y T394W.

En ciertas otras realizaciones, el- dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en este documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392 y T394W. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

En otra realización más, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392 y T394W. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en este documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L y T394W. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I y T394W.

En una realización ejemplar, se proporcionan en el presente documento heteromultimeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o mayor. En otra realización, se proporcionan en el presente documento heteromultimeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende las mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o mayor y el heterodimero tiene una pureza de aproximadamente 98% o mayor.

En ciertas realizaciones, el heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3. variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimero con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C y los dominios CH3 variantes se seleccionan de la Tabla 6.

Las mutaciones principales del Armazón 2 comprenden L351Y_Y407A / T366A_K409F. El Armazón 2a comprende las mutaciones de aminoácidos L351Y_Y407A / T366V_K409F y el Armazón 2b comprende las mutaciones de aminoácidos Y407A / T366A_K409F. Véase, Ejemplo 6.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T365A y K409F. En un aspecto el dominio CH3 variante comprende además mutaciones puntuales en las posiciones T366, L351 y Y407. Estas mutaciones en la posición T366 incluyen, pero sin limitación, T366I, T366L, T366 , T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En una realización especifica, la mutación en la posición T366 es T366V. Las mutaciones en la posición L351 incluyen, pero sin limitación, L351I, L351D, L351R o L351F. Las mutaciones en la posición Y407 incluyen, pero sin limitación, Y407V o Y407S. Véase, variantes de CH3 AZ63-AZ70 en la Tabla 1 y Tabla 4 y el Ejemplo 6.

En una realización ejemplar, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T366V y K409F.

En una realización ejemplar, se proporcionan en el presente documento heteromultimeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 75,5 °C o mayor. En otra realización, se proporcionan en el presente documento heteromultimeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 75 °C o mayor y el heterodimero tiene una pureza de aproximadamente el 90% o mayor.

En otras ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F, en que el dominio CH3 variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en las posiciones T411, D399, S400, F405, N390, y/o K392. Estas mutaciones en la posición D399 incluyen, pero sin limitación, D399R, D399W, D399Y o D399K. Las mutaciones en la posición T411 incluyen, pero sin limitación, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. Las mutaciones en la posición S400 incluyen, pero sin limitación, S400E, S400D, S400R o S400K. Las mutaciones en la posición F405 incluyen, pero sin limitación, F405I, F405M, F405S, F405S, F405V o F405W. Las mutaciones en la posición N390 incluyen, pero sin limitación, N390R, N390K o N390D. Las mutaciones en la posición K392 incluyen, pero sin limitación, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. Véase, variantes de CH3 AZ71-101 en la Tabla 1 y Tabla 4 y el Ejemplo 6.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en que el primer polipéptido comprende la modificación de aminoácidos Y407A y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto, este dominio CH3 variante comprende además las modificaciones de aminoácidos K392E, T411E, D399R y S400R.. En una realización adicional, el dominio CH3 variante comprende un primer y segundo polipéptido en que el primer polipéptido comprende la modificación de aminoácidos D399R, S400R y Y407A y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T366A, 409F, K392E y T411E.

En una realización ejemplar, se proporcionan en el presente documento heteromultimeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o mayor. En otra realización, se proporcionan en el presente documento heteromultimeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o mayor y el heterodimero tiene una pureza de aproximadamente el 95% o mayor.

En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento heteromultimeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C y los dominios CH3 variantes se seleccionan de la Tabla 7.

Además, este nuevo método para diseñar heterodimeros variantes de Fe con estabilidad y pureza mejoradas puede aplicarse a otras clases e isotipos de regiones Fe. En ciertas realizaciones, la región Fe es una región Fe IgG humana. En realizaciones adicionales, la región Fe IgG humana es una región Fe IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En algunas realizaciones, las regiones Fe son de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. En algunas realizaciones, la IgG es de un subtipo seleccionado del grupo que consiste en IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4.

Tabla 1: Modificaciones de aminoácidos de dominio para la generación de heterodimeros variantes de Fe.

La región Fe como se define en el presente documento comprende un dominio CH3 o fragmento del mismo, y puede comprender adicionalmente uno o más dominios de región constante de adición, o fragmentos de los mismos, incluyendo bisagra, CHl o CH2. Se entenderá que la numeración de los restos de aminoácidos de Fe es la del índice EU como en Kabat et al., 1991, Publicación NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va. El "índice EU como se expone en Kabat" se refiere a la numeración del índice EU del anticuerpo Kabat IgGl humano. Por conveniencia, la Tabla B proporciona los aminoácidos numerados de acuerdo con el índice EU como se expone en Kabat del dominio CH2 y CH3 de IgGl humana.

Tabla B En ciertas realizaciones, la variante Fe comprende dominio CH2. En algunas realizaciones, el dominio CH2 es dominio CH2 variante. En algunas realizaciones, los domin CH2 variantes comprenden sustituciones de aminoáci asimétricas en la primera y/o segunda cadena polipeptidi En algunas realizaciones, el heteromultimero compre sustituciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 modo que una cadena de dicho heteromultímero se una selectivamente a un receptor de Fe.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a un receptor de Fe. En algunas realizaciones, el receptor de Fe es un miembro de la familia de receptores Fcy. En algunas realizaciones el receptor se selecciona de FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y FcyRI I Ib. En una realización, el dominio CH2 comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas que promueven la unión selectiva a receptores Fcgamma .

En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIIa. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S267D, K392D y K409D. En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIa. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, K326E, A330L y I332E. En. algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIb. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S, E269K y I332E. En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIIa y FcyRIIa. En algunas realizaciones, el heteromultimero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S y S298A. En algunas realizaciones, el heteromultimero se une selectivamente a FcyRIIIa y FcyRIIb. En algunas realizaciones, el heteromultimero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, S298A, K326E, A330L y I332E. En algunas realizaciones, el heteromultimero se une selectivamente a FcyRIIa ay FcyRIIb. En algunas realizaciones, el heteromultimero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S, S298A y I332E.

En .ciertas realizaciones hay un método para diseñar compuestos terapéuticos multifuncionales que comprenden el heteromultimero descrito en el presente documento. En algunas realizaciones hay un método para diseñar compuestos terapéuticos bifuncionales que comprenden un heterodimero Fe variante. En algunas realizaciones hay un método para el diseño de mutaciones asimétricas en el dominio CH2 de un heterodimero Fe variante derivado con mutaciones en el dominio CH3. En algunas realizaciones hay un método para diseñar selectividad para los diferentes receptores Fe gamma basándose en las mutaciones en el Fe asimétrico. En ciertas realizaciones hay un método para diseñar mutaciones que polarizan la unión de los receptores Fe gamma a una cara de 7 la molécula Fe. En ciertas realizaciones hay un método para diseñar conductores de polaridad que polarizan los receptores Fe gamma para interaccionar solamente con una cara del armazón de Fe asimétrico del heteromultímero descrito en el presente documento.

En algunas realizaciones, se proporciona un polipéptido que comprende mutaciones en el dominio CH2 del Fe asimétrico que conducen a perfiles de selectividad de receptor Fe gamma preferentes. En algunas realizaciones mutaciones en el dominio CH3 conducen a formación preferente de Fe heterodimérico . En ciertas realizaciones se proporciona un método para diseñar entidades terapéuticas biespecíficas basándose en el Fe asimétrico descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones se proporciona un método para diseñar entidades terapéuticas multiespecíficas basándose en el Fe asimétrico descrito en el presente documento.

Los anticuerpos monoclonales tales como IgG son moléculas simétricas compuestas de dos cadenas polipeptidicas pesadas equivalentes y dos ligeras (Figura 14), que comprenden cada una múltiples dominios estructurales de inmunoglobulina (Ig). La clase IgG de mAb existe en una de cuatro isoformas, IgGl, IgG2, IgG3 o IgG . La cadena pesada está compuesta de cuatro (VH, CH1, CH2 y CH3) y la cadena ligera de dos (VL y CL) dominios Ig, respectivamente. Los dominios VH y CHl de cada una de las cadenas pesadas combinan con los dominios VL y CL de cadena ligera para formar las dos ramas Fab ("fragmento de unión a antigeno") del mAb. Los dominios CH3 y CH2 de las dos cadenas pesadas interaccionan mediante contactos proteina-proteina a través de los dominios CH3 y glicosilacion en los dominios CH2 para formar la región Fe ("fragmento cristalizable") homodimérica . La región enlazadora entre dominios CHl y CH2 del anticuerpo constituye la región bisagra de la molécula de anticuerpo. Aparte de conectar las regiones Fab y Fe del mAb, la bisagra también mantiene enlaces disulfuro a través de las dos cadenas pesadas y las mantiene juntas. El número de aminoácidos y enlaces disulfuro en la región bisagra es notablemente diferente entre los cuatro isotipos de IgG. El patrón de glucosilación en moléculas IgG puede ser significativamente diverso, se han observado aproximadamente 30 restos de carbohidratos diferentes en moléculas de IgG [Arnold J. N. ; Wormald M. R. ; Sim R. B.; Rudd P. M. y Dwek R. A. (2007) Annual Reviews of Immunology 25, 21-50] .

La naturaleza simétrica de la estructura de los anticuerpos monoclonales da como resultado que ambas ramas de Fab tengan su capacidad de unión a antigeno madurada por afinidad para reconocer el mismo epitopo. En el otro extremo, la parte Fe de la molécula de anticuerpo está implicada en interacciones con diversas moléculas receptoras en las células inmunes o "efectoras" y algunas de estas interacciones son responsables de mediar en las funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) , fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) y activación de complemento. Generalmente, la función efectora implica respuestas inmunes que conducen a neutralización y eliminación de patógenos o toxinas, activación del complemento y respuesta fagocitica del sistema inmune humoral. Las moléculas del receptor Fcy (FcyR) en las células efectoras entran en contacto con el Fe del anticuerpo IgG activado implicado en el complejo inmune anticuerpo-antigeno integral para mediar y regular en la respuesta efectora. La optimización de la interacción de agentes terapéuticos proteicos basados en anticuerpos monoclonales para estos receptores Fcy puede conducir a mejora en la eficacia de estos candidatos farmacológicos.

En seres humanos hay tres clases conocidas de FcyR con más tipos polimórficos dentro de cada clase. Se sabe que el Fe en la molécula IgGl se 'une a FcyRI (CD64) con constantes de disociación en el intervalo nanomolar mientras que se produce unión de FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) en el intervalo microraolar [Bruhns P.; Iannascoli B.; England P.; Mancardi D.A.; Fernandez N.; Jorieux S. y Daeron M. (2009) Blood 113: 3716-25]. Los receptores FcyRI de alta afinidad pueden unirse a IgG en formas monoméricas mientras que los receptores FcyRII y FcyRIII de baja afinidad solamente pueden unirse ' a complejos inmunes antigeno-anticuerpo o agregados de IgG como resultado de los efectos de la avidez. Las diferentes formas de IgG tienen diversas afinidades por los diferentes FcyR; en particular, la IgGl e IgG3 muestran actividad más fuerte. Los receptores Fcy son los dominios extracelulares de proteínas transmembrana y poseen dominios citoplasmáticos que están implicados en la regulación de rutas de señalización dentro de la célula. Cuando se agrupan en la superficie de células inmunes en asociación con los complejos inmunes mediados por anticuerpo, dependiendo de la naturaleza de las unidades de señalización ligadas a los FcyR en el extremo citoplásmico de estos receptores de superficie celular, estas moléculas regulan la respuesta efectora [Nimmerjahn F. y Ravetch J. V. (2008) Nature Immu Rev 8(1): 34-47].

Al nivel cromosómico humano, tres genes codifican el FcyRI (FcyRIA, FcyRIB, FcyRIC) . y FcyRII ( FcyRI IA, FcyRI IB, FcyRIIC) y dos genes codifican el FcyRIII (FcyRIIIA, FcyRIIIB) . Entre los receptores Fcy humanos de unión a IgG, se ha mostrado que los tipos FcyRIA, FcyRIC y FcyRIIIA están asociados a membrana con una proteina adaptadora de señal de cadena y común que contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora citoplásmica (ITAM) que conduce a la activación de la función efectora. El FcyRIIA y FcyRIIC también comprenden un ITAM citoplásmico, pero sin la proteina adaptadora de señal de cadena y común. Al mismo tiempo, el FcyRIIB está unido a un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM). La activación de FcyRIIB que da como resultado la fosforilación de ITIM da como resultado la inhibición de la cascada de señalización activadora. El FcyRIIIB, aunque carece de las colas citoplasmáticas inmunomoduladoras basadas en tirosina, tiene un anclaje de GPI (glicosil-fosfatidil-inositol ) y se ha mostrado que contribuye a la activación de algunos granulocitos en presencia de FcyRIIA.

Tabla C: características del receptor Fcy ITAM: Motivo de Activación basado en Tirosina inmunorreceptora; ITIM: Motivo de Inhibición basado en Tirosina Inmunorreceptora; GPI: Glicofosfoinositol .

Aunque el papel funcional de los motivos ITAM e ITIM y las moléculas receptoras asociadas se conocen, la naturaleza y los mecanismos de la modulación de señalización en combinación no se entienden completamente, especialmente cuando se combinan con la actividad de un hospedador de otros receptores de superficie de células inmunes y moléculas adaptadoras (por ejemplo BCR, CD22, CD45 etc.) implicadas en la transducción de señales. En este contexto, el diseño de moléculas de tipo Fe que puedan interaccionar con estos receptores Fcy con perfiles de selectividad exquisitos es un armazón valioso en cualquier intento para desenrollar y modular el efecto de dichas moléculas receptoras con actividades reguladoras sutiles. ' ' En el contexto de diseño de moléculas de anticuerpo que pueden diferenciar los FcyR, el intento se complica por el hecho de que las secciones de unión a Fe extracelular de los tipos de receptores FcyRII y FcyRIII muestran alta similitud de secuencia (Figura 15), que puede atribuirse al menos en parte a duplicación segmentada ancestral. Los dos tipos principales de receptores FcyRII, A y B, tienen 69% de identidad de secuencia mientras que el FcyRIIA y FcyRIIIA muestran aproximadamente 44% de identidad de secuencia. El FcyRIIB y FcyRIIG difieren en solamente' 2 restos en la región extracelular, aunque son significativamente diferentes en la región intracelular, siendo notable la presencia de motivos ITIM e ???? respectivamente. Como resultado puede anticiparse que las moléculas de anticuerpo terapéuticas requeridas para unir un receptor también se unirían potencialmente a otras clases de receptores, posiblemente dando como resultado efectos terapéuticos no pretendidos.

Complicando más las cosas, cada una de las clases de receptor presenta múltiples polimorfismos de un único nucleótido (SNP) y variaciones en el número de copias (CNV) . La diversidad de receptor resultante influye diferencialmente en su afinidad con IgG y su mecanismo de acción. Estas variaciones genéticas podrían afectar a la afinidad de subclases de IgG particulares por los receptores Fcy, alterar los acontecimientos efectores corriente abajo o afectar a mecanismos que alteran los niveles de expresión del receptor dando como resultado fenotipos funcionalmente relevantes, variantes de receptor no funcionales o funcionalmente desconocidas (Bournazos S.; Woof J. M. ; Hart S. P. y Dransfield I. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157(2): 244-54). Potencialmente conducen a efectos complejos, alterando el equilibrio entre la señalización de receptor activadora e inhibidora, dando como resultado la creación de fenotipos susceptibles a enfermedad.

Algunas de estas variaciones alélicas se enumeran en la Tabla C. Notablemente, la variante R131 en FcyRIIa tiene alta respuesta con IgGl mientras que las variantes H131 alternativas muestran interacciones más eficaces con IgG2 e IgG3. En el caso de FcyRIIIa, los donantes homocigotos para V en la posición 158 muestran actividad de linfocitos NK aumentada en comparación con individuos F/F158 homocigotos debido a mayor afinidad del alotipo anterior por IgGl, IgG3 e IgG4 humano.' Las variantes alélicas NA1 y NA2 de FcyRIIIb es el resultado de una sustitución de cuatro aminoácidos que a su vez conduce a diferencias en la glicosílación del receptor. El alelo NA1 presenta unión potenciada y fagocitosis del complejo inmune por neutrófilos. El FcyRIIB tiene dos variantes alélicas conocidas, 2321 y 232T. Se sabe que la variante 232T está fuertemente alterada en su actividad reguladora negativa. Se han indicado las frecuencias de polimorfismos de FcyR y sus asociaciones con sensibilidad diferencial a infecciones o predisposición a enfermedades tales como lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis reumatoide (RA) , vasculitis, púrpura trombocítica mediada por inmunidad (ITP), miastenia grave, esclerosis múltiple (EM) , e inmunoneuropatías (síndrome de Guillian-Barre (GBS) ) .

Se ha demostrado la variación del número de copias en el locus de genes de FcyR, en particular para FcyRIIIB, FcyRIIc y FcyRIIIA, y se ha observado correlación adicional de estas diferencias con la expresión en superficie celular de estos receptores. Por el contrario FcyRIIa y FcyRIIb no muestran variaciones del número de copias. El bajo número de copias de FcyRIIIb se ha asociado de hecho con la glomerulonefritis en la enfermedad autoinmune lupus eritematoso sistémico (SLE) [Aitman TJ et al. (2006) Naturel6; 439(7078): 851-5]. Esto es particularmente interesante dado el hecho de que un módulo de GPI no señalizador se ancla en el receptor FcyRIIIb. Puede presentarse la hipótesis de que la presencia de estos receptores FcyRIIIb podrían actuar potencialmente como inhibidores competitivos de las interacciones de Fe con otros FcyR señalizadores. El efecto de la variación del número de copias en FcyRIIc también es especialmente interesante. Un SNP C/T en la posición 202 en FcyRIIc convierte un resto de glutamina en un codón de parada evitando la generación de una proteína funcional. La fase abierta de lectura funcional de FcyRIIc se expresa en el 9% de individuos sanos (población blanca) y hay una sobrerrepresentación significativa (19%) del alelo en la población de ITP que implica una predisposición de estos fenotipos a ITP [Breunis WB et al. (2008) Bloodlll(3): 1029-38]. Se ha demostrado que en individuos que expresan FcyRIIc funcional en células NK, el ADCC conseguido está mediado por estos receptores en un mayor grado que el FcyRIIIa. Dichas complejidades asociadas con estos polimorfismos y variaciones genéticas destacan la necesidad de estrategias de tratamiento personalizadas que requieren compuestos terapéuticos altamente adaptados.

Las, diversas células efectoras difieren en la presentación de estos receptores Fcy así como en su distribución humoral y tisular, contribuyendo de este modo a variaciones en su mecanismo de activación y acción [Tabla D] . Ajustar la selectividad de anticuerpos terapéuticos para el reconocimiento de ' tipos de FcyR específicos y modular el impacto de ciertas clases de células efectoras, conduce a optimización del mecanismo efector para enfermedades particulares. Se pretende que esto active o inhiba selectivamente modalidades efectoras específicas, dependiendo de la enfermedad que se trate.

Tabla D: Distribución celular de FcyR.

Además, los FcyR también se sobreexpresan por células dendríticas foliculares, células endoteliales , células microgliales, osteoclastos y células mesangiales. En la actualidad, la significación funcional de la expresión de FcyR en estas otras células no se conoce.

El FcyRI de alta afinidad está compuesto de tres dominios de superfamilia de inmunoglobulina de tipo C (IgSF) mientras que los FcyRII y FcyRIII de baja afinidad están constituidos de dos dominios IgSF de tipo C cada uno. La estructura de las proteínas receptoras de FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y FcyRIIIb se ha resuelto por cristalografía. Los dos dominios IgSF en estas estructuras se sitúan a 50-55 grados entre sí y se conectan por una bisagra.

La estructura disponible públicamente de un complejo conjunto Fc-FcyR es la del sistema Fc-FcyRIIIb y la geometría de FcyR en el complejo se mantiene muy cerca de la observada en el estado apo de la proteína [Sondermann P.; Huber R. ; Oosthuizen V. y Jacob U. (2000) Nature 406, 267-273. ; Radaev S . ; otyaka S.; Fridman W. ; Sautes-Fridman C. and Sun P.D. (2001) J Biol Chem 276, 16469-16477; Sondermann P. et al. Biochem Soc Trans. Ago 2002; 30(4):481-6; Sondermann P, Oosthuizen V. Immunol Lett . 3 Jun 2002; 82(1-2): 51-6; Radaev S, Sun P. Mol Immunol. May 2002; 38(14): 1073-83.] [Figura 16] . La fuerte similitud de secuencia y estructural entre los receptores forma la base de modelos comparativos del Fe unido a los otros receptores. Por otro lado, la similitud de secuencia y estructural entre estas moléculas receptoras también hace al diseño de Fe con la detallada selectividad entre los receptores y sus diversos isotipos difícil.

Antes de la evaluación estructural del complejo Fc-FcyR basada en cristalografía, hubo dudas sobre si el eje de simetría doble en la molécula Fe significa dos sitios de unión potenciales y una estequiometría 2:1 eficaz para la asociación Fc-FcyR. Los estudios estructurales basados en resonancia magnética nuclear (NMR) de interacciones Fe - FcyR indican que la unión de un Fe con un FcyR en una cara de la molécula induce un cambio conformacional que evita la unión de una segunda molécula FcyR con el Fe de la misma molécula de anticuerpo [Kato K. et al (2000) J Mol Biol. 295(2): 213-24]. La geometría del complejo cocristalino disponible del Fc-FcyRIIIb confirma la asociación del FcyR con Fe en una orientación asimétrica con una estequiometría 1:1. Como se muestra en la Figura 16, el FcyR se une a una hendidura en un extremo de la molécula de Fe en forma de herradura, y está en contacto con los dominios CH2 de ambas cadenas.

La mutagénesis de exploración de alanina [Shields RL et al. (2001) JBC 276(9): 6591-604] proporciona información sobre los restos del Fe que forma interfaz con los diversos tipos de receptores y por lo tanto está implicado en la interacción y reconocimiento de Fc-FcyR. Tradicionalmente, la optimización de los anticuerpos terapéuticos se ha centrado en mutaciones que muestran unión aumentada a los receptores activadores FcyRIII [Patente de Estados Unidos N° 6.737.056] o afinidad reducida con FcyRIIb [documento US2009/0010920A1] . En todas estas variantes alternativas, se introducen mutaciones conjuntamente en ambas cadenas.

Los anticuerpos monoclonales con frecuencia muestran su actividad terapéutica induciendo localización espacial de las células inmunes efectoras y diana. Un anticuerpo natural media en esto interaccionando con la diana usando sus dominios Fab y la célula efectora usando el dominio Fe. Son capaces de situar en yuxtaposición el complejo inmune frente a la célula efectora de modo que puede inducirse la respuesta mediada por células. Los efectos de avidez requeridos para señalización de FcyR, que se originan en la formación de complejos inmunes que implican la dirección a una diana única de múltiples moléculas de anticuerpo, es otro ejemplo de la significación de la organización espacio temporal en la acción inmune.

También hay un aspecto espacio temporal en la señalización celular que está inducida como parte de la actividad efectora de moléculas de mAb. La señalización celular tal como la basada en activación de molécula de FcyR implica la localización de las moléculas receptoras relevantes dentro de una región de dominio de membrana denominada balsa lipidica. Las balsas lipidicas están enriquecidas con glicoesfingolipidos y colesterol y varias clases de transductores de señal corriente arriba incluyendo las quinasas de la familia Src. Tras la estimulación celular se reclutan diversas moléculas de señalización, proteínas adaptadoras y las quinasas de señalización así como fosfatases. El ensamblaje molecular en balsas lipídicas es importante para la transduccion de señal.

Una estrategia de diseño no natural, que combina diferentes especificidades de antígeno y avidez aumentada para proporcionar mejores propiedades de unión es la base del diseño terapéutico biespecífico . Los anticuerpos biespecífieos u otras formas de compuestos terapéuticos proteicos multifuncionales o biespecíficos se diseñan para media en las interacciones entre la diana y una diversidad de células efectoras [Müller y Kontermann (2010) BioDrugs 24(2): 89-98]. Se modifican por ingeniería genética moléculas terapéuticas multiespecíficas para redirigir los linfocitos T auxiliares u otras células efectoras inmunes contra células diana específicas.

En otra realización, la invención se refiere a un método para identificar polipéptidos variantes de Fe por ordenador basándose en las afinidades de unión calculadas para FcyRIIa, FcyRIIb y/o FcyRIIIa. En otra realización, el método comprende además calcular por ordenador la electroestática, disolución, empaquetamiento, densidad de empaquetamiento, enlace de hidrógeno y efectos entrópicos de dichos polipéptidos variantes de Fe. En otra realización más, el método de la presente invención incluye además construir los polipéptidos variantes de Fe y expresar dichos polipéptidos en el contexto de un anticuerpo terapéutico y expresar además dicho anticuerpo en células de mamífero. En otra realización' más, el método de la presente invención comprende construir los polipéptidos variantes de Fe identificados por ordenador por mutagénesis dirigida, mutagénesis basada en PCR, mutagénesis en cásete o síntesis de novo.

Los factores que se tienen en cuenta en el diseño del armazón de Fe sintético incluyen cálculos informáticos para repulsión estérica, cambio' en el área de interfaz internada, densidad de contacto relativa, disolución relativa y efecto electroestático . Todas estas matrices se usaron para llegar a una puntuación de afinidad.

En un aspecto, la presente solicitud describe un diseño molecular para conseguir perfiles de selectividad de FcyR detallados mediante el diseño de un armazón asimétrico construido en un Fe heterodimérico . Este armazón permite mutaciones asimétricas en el dominio CH2 para conseguir una diversidad de perfiles de selectividad nuevos. Además, el armazón tiene elementos inherentes para la modificación por ingeniería genética de moléculas terapéuticas multifuncionales (bi, tri, tetra o penta funcionales) .

El armazón asimétrico puede optimizarse para propiedades de unión dependientes de pH para el receptor de Fe neonatal (FcRn) para permitir mejor reciclaje de la molécula y potenciar su semivida y propiedades farmacocinéticas relacionadas.

El armazón asimétrico puede optimizarse para unión con los alotipos del receptor FcyRI funcionalmente relevantes. FcyRI es un marcador prominente en macrófagos que está implicado en trastornos inflamatorios crónicos tales como Artritis Reumatoide, Dermatitis Atópica, Psoriasis y varias enfermedades pulmonares.

El armazón asimétrico puede optimizarse para la unión con proteina A. La unión con proteína A se emplea con frecuencia para separación y purificación de moléculas de anticuerpo. Las mutaciones pueden introducirse en el armazón asimétrico para evitar la agregación del compuesto terapéutico durante su almacenamiento.

Por lo tanto, se contempla específicamente que las variantes de Fe de la invención pueden contener entre otros una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones de restos de aminoácidos adicionales que dan como resultado un anticuerpo con características preferidas incluyendo pero sin limitación: semivida en suero aumentada, afinidad de unión aumentada, inmunogenicidad reducida, producción aumentada, actividad ADCC o CDC potenciada o reducida, glicosilación alterada y/o enlaces disulfuro y especificidad . de unión modificada .

Se contempla que las variantes de Fe de la invención pueden tener otras características alteradas incluyendo semividas in vivo aumentadas (por ejemplo, semividas en suero) en un mamífero, en particular un ser humano, estabilidad aumentada in vivo (por ejemplo, semividas en suero) y/o in vitro (por ejemplo, periodo de caducidad) y/o temperatura de fusión aumentada (Tm) , en relación con una molécula comparable. En una realización, una variante de Fe de la invención tiene una semivida in vivo de más de 15 días, más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses, o más de 5 meses. En otra realización, una variante de Fe de la invención tiene una semivida in vitro (por ejemplo, formulación líquida o en polvo) de más de 15 días, más de 30 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 6 meses, más de 12 meses, más de 24 meses, más de 36 meses, o más de 60 meses.

También se apreciará por un experto en la materia que las variantes de Fe de la invención pueden tener inmunogenicidad alterada cuando se administran a un sujeto.

En consecuencia, se contempla que el dominio CH3 variante, que minimiza la inmunogenicidad de la variante de Fe es generalmente más deseable para aplicaciones terapéuticas.

Las variantes de Fe de la presente invención pueden combinarse con otras modificaciones de Fe, incluyendo pero sin limitación .modificaciones que alteran la función efectora. La invención abarca combinar una variante de Fe de la invención con otras modificaciones de Fe para proporcionar propiedades aditivas, sinérgicas o nuevas en anticuerpos o proteínas de fusión de Fe. Tales modificaciones pueden estar en los dominios bisagra, CH1 o CH2 (o CH3 siempre que no altere de forma negativa las propiedades de estabilidad y pureza de los presentes dominios CH3 variantes) o una combinación de los mismos. Se contempla que las variantes de Fe de la invención potencian la propiedad de la modificación con la que se combinan. Por ejemplo, si una variante de Fe de la invención se combina con un mutante que se sabe que se une a FCYRIIIA con una mayor afinidad que una molécula comparable que comprende una región Fe natural; la combinación con una mutante de la invención da como resultado un factor de potenciación mayor en la afinidad de FCYRIIIA.

En una realización, las variantes de Fe de la presente invención pueden combinarse con otras variantes de Fe conocidas tales como las desveladas en Duncan et al, 1988, Nature 332: 563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147: 2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29: 53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57: 1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Nati. Acad Sci USA 92: 11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett . 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9: 115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54: 101-104; Lund et al, 1996, Immunol 157: 4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29: 2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164: 4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164: 1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166: 2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82: 57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30: 487-490); Patentes de Estados Unidos N° 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 60/601.634 y 60/608.852; Publicación de PCT N° WO 00/42072 y WO 99/58572.

Un experto en la materia entenderá que las variantes de Fe de la invención pueden tener propiedades de unión de ligando de Fe (por ejemplo, FcyR, Clq) alteradas (los ejemplos de propiedades de unión incluyen pero sin limitación, especificidad de unión, constante de disociación en equilibrio (KD) , tasas de disociación y asociación (Koff y Kon respectivamente), afinidad de unión y/o avidez) y que ciertas alteraciones son más o menos deseables. Se conoce bien en la técnica que la constante de disociación en equilibrio (KD) se define como koff/kon. Se entiende en general que una molécula de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con una KD baja es preferible a una molécula de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con una KD alta. Sin embargo, en algunos casos el valor de la kon o koff puede ser más relevante que el valor de la KD. Un experto en la materia puede determinar qué parámetro cinético es el más importante para una aplicación de anticuerpo dada. Por ejemplo, un CH3 y/o CH2 modificado que potencia la unión de Fe con. uno o más reguladores positivos (por ejemplo, FcyRIIIA) dejando a la vez sin cambios o incluso reduciendo la unión de Fe con el regulador negativo FcyRIIB seria más ventajoso para potenciar la actividad ADCC. Como alternativa, un CH3 y/o CH2 modificado que redujera la unión con uno o más reguladores positivos y/o potenciar la unión con FcyRIIB seria ventajoso para reducir la actividad ADCC. En consecuencia, la relación de afinidades de unión (por ejemplo, constantes de disociación en equilibrio (KD) ) puede indicar si la actividad ADCC de Una variante de Fe se potencia o se reduce. Por ejemplo una reducción de la relación de las constantes de disociación en equilibrio (KD) de FcyRIIIA/FcyRIIB, se correlacionará con la actividad ADCC mejorada, mientras que un aumento de la relación se correlacionará con una reducción de la actividad ADCC.

Como parte de la caracterización de las variantes de Fe, estas se ensayaron con respecto a su afinidad de unión con FCYRIIIA (CDl6a) y FcyRIIB (CD32b) presentada como una relación en comparación con IgGl natural (Véase, Ejemplo 4 y Tabla 5) . En este caso fue posible evaluar el impacto de las mutaciones del dominio CH3 en la unión con estos receptores de Fe activadores e inhibidores. En una realización, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros que comprenden una región Fe heterodiméricá, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante qu comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C, en que la unión del heterodimero con CD16a es aproximadamente la misma en comparación con el homodimero natural. En ciertas realizaciones la unión del heterodimero con CD16a aumenta en comparación con el homodimero natural. En una realización alternativa, la unión del heterodimero con CD16a se reduce en comparación con el homodimero natural.

En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tienen una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C, en que la unión de heterodimero con CD32b es aproximadamente la misma en comparación con homodimero natural. En ciertas realizaciones la unión de heterodimero con CD32b aumenta en comparación con el homodimero natural. En una realización alternativa, la unión del heterodimero con CD32b se reduce en comparación con homodimero natural.

Un experto en . la materia entenderá que en luqar de presentar la KD de la unión de CD16a y CD32b como una relación de variante de Fe y homodimero natural, la KD podría presentarse como una relación de unión de variante de Fe con CD16a y unión de variante de Fe con CD32b (datos no mostrados) . Esta relación proporcionaría un indicio de la mutación del dominio CH3 variante en ADCC, no cambiado, aumentado o reducido en comparación con el natural, descrito posteriormente en más detalle.

Las afinidades y propiedades de unión de las variantes de Fe de la invención para un FcyR se determinan inicialmente usando ensayos in vitro (ensayos basados en bioquímica o inmunología) conocidos en la técnica para determinar las interacciones Fc-FcyR, es decir, unión específica de una región Fe con un FcyR incluyendo pero sin limitación ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmón superficial, ensayos de inmunoprecipitación (véase la sección titulada "Caracterización y Ensayos Funcionales" posteriormente) y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía resonante fluorescente (FRET), electroforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, filtración en gel) . Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador en uno o más de los componentes que se examinan y/o emplear una diversidad de métodos de detección incluyendo pero sin limitación marcadores cromogénicos , fluorescentes, luminiscentes o isotópicos. Puede encontrarse una descripción detallada de afinidades de unión y cinética en Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Filadelfia (1999), que se centra en las interacciones anticuerpo-inmunógeno .

Se contempla que las propiedades de unión de las moléculas de la invención también se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones celulares efectoras mediadoras de FcyR (Véase sección titulada "Caracterización y Ensayos Funcionales" posteriormente) . En ciertas realizaciones, las moléculas de la invención tienen propiedades de unión similares en modelos in vitro (tales como los descritos y desvelados en el presente documento) como los ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la invención que no muestran el fenotipo deseado en ensayos basados in vitro pero si muestran el fenotipo deseado in vivo.

La invención abarca variantes de Fe que se unen a FCYRIIIA (CD16a) con afinidad aumentada, en relación con una molécula comparable. En una realización especifica, las variantes de Fe de la invención se unen a FCYRIIIA con afinidad aumentada y se unen a FcyRIIB (CD32b) con una afinidad de unión que no está cambiada o está reducida, en relación con una molécula .comparable.. En otra realización más, las variantes de Fe de la invención tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio de FCYRIIIA/FCYRIIB (KD) que está reducida en relación con una molécula comparable.

También se abarcan por la presente invención variantes de ' Fe que se unen a FCYRIIIA (CD16a) con afinidad reducida, en relación con una molécula comparable. En una realización especifica, las variantes de Fe de la invención se unen a FcyRIIIA con afinidad reducida, en relación con una molécula comparable y se unen a FcyRIIB con una afinidad de unión que no está cambiada o está aumentada, en relación con una molécula comparable.

En una realización, las variantes de Fe se unen con afinidad aumentada a FCYRIIIA. En una realización especifica, dichas variantes de Fe tienen afinidad por FCYRIIIA que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces o al menos 200 veces mayor que la de una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fe tienen una afinidad por FCYRIIIA que aumenta en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200% en relación con una molécula comparable.

En otra realización, la variante de Fe tiene una constante de disociación en equilibrio (KD) para un ligando de Fe (por ejemplo, FcyR, Clq) que está reducida entre aproximadamente 2 veces y 10 veces, entre aproximadamente 5 veces y 50 veces, entre aproximadamente 25 veces y 250 veces, entre aproximadamente 100 veces y 500 veces, o entre aproximadamente 250 veces y 1000 veces en relación con una molécula comparable.

En otra realización, dichas variantes de Fe tienen una constantes de disociación en equilibrio (KD) para- FcyRIIIA que está reducida al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces,, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 400 veces o al menos 600 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fe tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) para FcyRIIIA que está reducida en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable.

En una realización, la variante de Fe se une a FCYRIIB con una afinidad que no está cambiada o está reducida. En una realización especifica, dichas variantes de Fe tienen afinidad por FCYRIIB que no está cambiada o está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fe tienen una afinidad por FCYRIIB que no está cambiada o está reducida en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fe tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) para FCYRIIB que no está cambiada o está aumentada en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces o al menos 200 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización especifica, las variantes de Fe tienen una constante de disociación en equilibro (KD) para FCYRIIB que no está cambiada o está aumentada en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200% en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fe se unen a FCYRIIIA con afinidad aumentada, en relación con una molécula comparable y se unen a FCYRIIB con una afinidad que no está cambiada o está reducida en relación con una molécula comparable. En una realización especifica, las variantes de Fe tienen afinidad por FCYRIIIA que está aumentada en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización especifica, las variantes de Fe tienen afinidad por FCYRIIB que no está cambiada o está reducida en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fe tienen una afinidad por FCYRIIIA que está aumentada en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable y las variantes de Fe tienen una afinidad por FcyRIIB que no está cambiada o está aumentada en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200% en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fe tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio de FCYRIIIA/FCYRIIB (KD) que está reducida en relación con una molécula comparable. En una realización especifica, las variantes de Fe tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio (KD) de FCYRIIIA/FCYRIIB que está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización especifica, las variantes de Fe tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio (KD) de FCYRIIIA/FCYRIIB que está reducida en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fe se unen a FCYRIIIA con una afinidad reducida, en relación con una molécula comparable. En una realización especifica, dichas variantes de Fe tienen afinidad por FCYRIIIA que se reducen al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fe tienen una afinidad por FCYRIIIA que está reducida en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200% en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fe se unen a FCYRIIIA con afinidad reducida y se unen a FCYRIIB con una afinidad que no está cambiada o está aumentada, en relación con una molécula comparable. En una realización especifica, las variantes de Fe tienen afinidad por FCYRIIIA que está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización especifica, las variantes de Fe tienen afinidad por FCYRIIB que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, mayor que la de una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fe tienen una afinidad por FCYRIIIA que está reducida en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%r al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable y las variantes de Fe tienen una afinidad por FCYRIIB que está aumentada en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fe tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) para FcyRIIIA que está aumentada en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con la de una molécula comparable. En una realización especifica, dichas variantes de Fe tienen constante de disociación en equilibrio (KD) para FCYRIIB que está aumentada al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable.

Variaciones de CH2 para selectividad fcyR La interacción proteína-proteina Fc-FcyR en este complejo indica que las dos cadenas en la molécula Fe interaccionan con dos sitios distintos en la molécula FcyR. Aunque hay simetría en las dos cadenas pesadas en las moléculas de Fe naturales, el ambiente de FcyR local en torno a restos en una cadena es diferente de los restos de FcyR que rodean a la misma posición de resto en la cadena de Fe opuesta. Las dos posiciones relacionadas con simetría interaccionan con diferente selección de restos de FcyR.

Dada la asimetría en la asociación de Fe con FcyR, las mutaciones simultáneas en la cadena A y B de la molécula de Fe no influyen en las interacciones con FcyR de una manera simétrica. Cuando se introducen mutaciones para optimizar las interacciones en una cadena del Fe con su ambiente de FcyR local, en una estructura de Fe homodimérica, la mutación correspondiente en la segunda cadena puede ser favorable, desfavorable o no contribuir al perfil de selectividad y unión de FcyR requerido.

Usando un enfoque guiado por computación y estructura, las mutaciones asimétricas se modifican por ingeniería genética en las dos cadenas del Fe para superar estas limitaciones de las estrategias de ingeniería de Fe tradicionales, que introducen las mismas mutaciones en ambas cadenas de Fe. Se puede conseguir mejor selectividad de unión entre los receptores si las dos cadenas de Fe se optimizan de forma independiente para unión potenciada con su cara correspondiente de la molécula receptora.

Por ejemplo, pueden diseñarse mutaciones en una posición particular en una cadena del Fe para potenciar la selectividad para un resto particular, un intento de diseño positivo, mientras que la misma posición de resto puede mutarse para interaccionar desfavorablemente con su ambiente local en un tipo de receptor Fcy alternativo, un intento de diseño negativo, consiguiendo de este modo mejor selectividad entre los dos receptores. En ciertas realizaciones, se proporciona un método para diseñar modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 que se une selectivamente a un receptor Fe gamma en comparación con un receptor Fe gamma diferente (por ejemplo, se une selectivamente a FcyRIIIa en lugar de FcyRIIb) . En otras ciertas realizaciones, se proporciona un método para el diseño de modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 de un heterodimero de Fe variante que comprende modificaciones de aminoácidos en el dominio CH3 para promover la formación de heterodimeros . En otra realización, se proporciona un método para diseñar selectividad para los diferentes receptores Fe gamma basándose en un heterodimero de Fe variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2. En otra realización más, se proporciona un método para diseñar modificaciones de aminoácidos asimétricas que polarizan la unión de los receptores Fe gamma a una cara de la molécula de Fe. En otras ciertas realizaciones, se proporciona un método para diseñar conductores de polaridad que polarizan los receptores Fe gamma para interaccionar con solamente una cara del heterodimero de Fe variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2.

El diseño asimétrico de las mutaciones en el dominio CH2 puede adaptarse para reconocer el FcyR en una cara de la molécula de Fe. Esta constituye la cara productora del armazón de Fe asimétrico mientras que la cara opuesta presenta propensión a interacción de tipo natural sin el perfil de selectividad diseñado y puede considerarse una cara no productiva. Puede emplearse una estrategia de diseño negativa para introducir mutaciones en la cara no productiva para bloquear las interacciones de FcyR con este lado del armazón de Fe asimétrico, forzando de este modo las tendencias de interacción deseadas para los receptores Fcy.

Tabla E: Perfiles de selectividad potencialmente interesantes de Fe para diferentes receptores Fcy (†/-) indica una variante que muestra una unión aumentada o de tipo natural con el tipo de receptor particular o uno de sus alotipos. (x) indica ausencia de unión notable con el receptor o un alotipo de subconjunto.

La presente invención también se refiere a polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión fusionado con una región Fe, en que la región Fe comprende un dominio CH3 variante, que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodimeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C. Se contempla específicamente que las moléculas que comprenden un heterodímero que comprende un dominio CH3 variante pueden generarse por métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Brevemente, tales métodos incluyen pero sin limitación, combinar una región variable o dominio de unión con la especificidad deseada (por ejemplo, una región variable aislada de una biblioteca de presentación de fagos o de expresión o derivada de un anticuerpo humano o no humano o un dominio d'e unión de un receptor) con un heterodímero de Fe variante. Como alternativa, un experto en la materia puede generar un heterodímero de Fe variante modificando el dominio CH3 en la región Fe de una molécula que comprende una región Fe (por ejemplo, un anticuerpo) .

En una realización, las variantes de Fe son anticuerpos o proteínas de fusión de Fe. En una realización específica, la invención proporciona anticuerpos que comprenden una región Fe que comprende un dominio CH3 variante, que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C. Dichos anticuerpos incluyen moléculas IgG que comprenden de forma natural una región Fe que contiene un dominio CH3 que puede modificarse para generar una variante de Fc> o derivados de anticuerpos que se han modificado por ingeniería genética para contener una región Fe que comprende un dominio CH3 variante. Las variantes de Fe de la invención incluyen cualquier molécula de anticuerpo que se una, preferentemente, de forma específica (es decir, compita con unión no específica como se determina por inmunoensayos bien conocidos en la técnica para ensayar unión de antígeno-anticuerpo específica) un antígeno que comprende una región Fe que incorpore un dominio CH3 variante. Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales , monoclonales , monoespecífieos , biespecífieos , multiespecíficos, humanos, humanizados, quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fv ligados por disulfuro, y fragmentos que contienen un dominio VL o VH o incluso una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a un antígeno, en ciertos casos, modificado por ingeniería genética para contener o fusionado con un heterodímero de Fe variante .

La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que el anticuerpo secretado unido a receptores de Fe (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos Citolíticos Naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana de curación de antígenos y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos IgG de alta afinidad específicos dirigidos a la superficie de células diana "arman" a las células citotóxicas y se requieren de forma absoluta para dicha destrucción. La lisis de la célula diana es extracelular , requiere contacto entre células directo, y no implica al complemento.

La capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar en la lisis de la célula diana por ADCC puede ensayarse. Para evaluar la actividad ADCC se añade un anticuerpo de interés a células diana en combinación con células efectoras inmunes, que pueden activarse por los complejos de anticuerpo-antígeno dando como resultado citolisis de la célula diana. La citolisis se detecta en general por la liberación de marcador (por ejemplo sustratos radiactivos, colorantes fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre . periférica (PBMC) y linfocitos Citolíticos Naturales (NK) . Se describen ejemplos específicos de ensayos ADCC in vitro en Wisecarver et al., 1985, 13:211; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184: 29 y en el presente documento (véase sección titulada "Caracterización y Ensayos Funcionales" posteriormente) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC del anticuerpo de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al., 1998, PNAS USA 95: 652.

Se contempla que las variantes de Fe de la invención se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones celulares efectoras mediadoras de FcyR. En realizaciones específicas, las moléculas de la invención tienen propiedades de unión similares y funciones celulares efectoras en modelos in vivo (tales como los descritos y desvelados en el presente documento) como los ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la invención que no muestren el fenotipo deseado en ensayos basados in vitro pero si muestran el fenotipo deseado in vivo.

La presente invención proporciona además variantes de Fe ¦ con función CDC potenciada. En una realización, las variantes de Fe tienen actividad CDC aumentada. En una realización, las variantes Fe tienen actividad CDC que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos .5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor que la de una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fe se unen a Clq con una afinidad que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor que la de una molécula comparable. En otra realización más, las variantes de Fe tienen actividad CDC que está aumentada en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable. En una realización especifica, las variantes de Fe de la invención se unen a Clq con afinidad aumentada; tienen actividad CDC potenciada y se unen específicamente al menos a un antígeno.

La presente invención también proporciona variantes de Fe con función CDC reducida. En una realización, las variantes de Fe tienen actividad CDC reducida. En una realización, las variantes de Fe tienen actividad CDC que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces menor que la de una molécula comparable. En otra realización, una variante de Fe se une a Clq con una afinidad que está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fe tienen actividad CDC que está reducida en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fe se unen a Clq con afinidad reducida, tienen actividad CDC reducida y se unen específicamente al menos a un antígeno.

En algunas realizaciones, las variantes de Fe comprenden una o más glicoformas modificadas por ingeniería genética, es decir, una composición de carbohidratos que está unida covalentemente con una molécula .que comprende una región Fe. Las glicoformas modificadas por ingeniería genética pueden ser útiles para una diversidad de fines, incluyendo pero sin limitación potenciar o reducir la función efectora. Pueden generarse glicoformas modificadas por ingeniería genética por cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo usando cepas de expresión modificadas por ingeniería. genética o variantes, mediante coexpresión con una o más ¦ enzimas, por ejemplo ß (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) , , expresando una molécula que comprenda una región Fe en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o modificando carbohidratos después de que se haya expresado la molécula que comprenda región Fe. Se conocen en la técnica métodos para generar glicoformas modificadas por ingeniería genética e incluyen pero sin limitación las descritas en Umana et al, 1999, Nat . Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277 : 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466- 3473) Patente de Estados Unidos N° 6.602.684; N° de Serie de Estados Unidos 10/277.370; ^ N° de Serie de Estados Unidos 10/113,929; documentos PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N. J.); tecnología de ingeniería de glucosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza) . Véase, por ejemplo documentos WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

Se contempla que las variantes de Fe incluyen anticuerpos que comprenden una región variable y una región Fe heterodimérica, en que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C. Las variantes de Fe que son anticuerpos pueden producirse "de novo" combinando un dominio variable o fragmento del mismo, que se une específicamente al menos a un antígeno con una región Fe heterodimérica que comprende un dominio CH3 variante. Como alternativa, las variantes de Fe heterodiméricas pueden producirse modificando el dominio CH3 de una región Fe que contiene anticuerpo que se une a un antigeno.

Los anticuerpos de la invención pueden incluir, pero sin limitación, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante , intracuerpos , anticuerpos monoespecífieos , anticuerpos multiespecífieos , anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados,- anticuerpos quiméricos, anticuerpos sintéticos, FvFc de cadena sencilla (scFvFc), Fv de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) . En particular, los anticuerpos usados en los métodos de la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de ' moléculas de inmunoglobulina. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo IgG, IgE, Ig , . IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos (por ejemplo, ser humano, murino, burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo) . En una realización específica, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, en particular anticuerpos monoclonales biespecífieos . Como se usa en el presente documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humanas o de ratones que expresan anticuerpos de genes humanos.

Los -anticuerpos como todos los polipéptidos tienen un Punto Isoeléctrico (pl), que se define en general como el pH al que un polipéptido no porta carga neta. Se sabe en la técnica que la solubilidad proteica es típicamente más baja cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pl) de la proteína. Es posible optimizar la solubilidad alterando el número y localización de restos ionizables en el anticuerpo para ajustar el pl. Por ejemplo el pl de un polipéptido puede manipularse haciendo las sustituciones de aminoácidos apropiadas (por ejemplo, sustituyendo con un aminoácido cargado tal como una lisina, un resto no cargado tal como alanina) . Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, las sustituciones de aminoácidos de un anticuerpo que da como resultado cambios del pl de dicho anticuerpo pueden mejorar la solubilidad y/o la estabilidad del anticuerpo. Un experto en la materia entendería qué sustituciones de aminoácidos serían más apropiadas para que un anticuerpo particular consiga un pl deseado. El pl de una proteína puede determinarse por una diversidad de métodos incluyendo pero sin limitación, isoelectroenfoque y diversos algoritmos informáticos (véase, por ejemplo, Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14: 1023). En una realización, el pl de las variantes de Fe de la invención está entre pH 6,2 y pH 8.0. En otra realización, el pl de los anticuerpos de la invención está entre pH 6,8 y pH 7,4. En una realización, las sustituciones que dan como resultado alteraciones del pl de la variante Fe de la invención no reducirán significativamente su afinidad de unión por un antígeno. Se contempla que el dominio CH3 variante con una estabilidad aumentada también puede dar como resultado un cambio del pl .

En una realización, se seleccionan específicamente heterodímeros de Fe variantes para efectuar tanto la estabilidad como la pureza aumentadas y cualquier cambio deseado en el pl.

Los anticuerpos de la invención pueden ser monoespecificos, biespecíficos, triespecífieos o tener mayor multiespecificidad . Los anticuerpos multiespecífieos pueden unirse específicamente a diferentes epítopos de molécula diana deseada o pueden unirse específicamente tanto a la molécula diana como a un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véase, por ejemplo, Publicaciones Internacionales N° O 94/04690; WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; y WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; Patentes de Estados Unidos N° 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920 y 5.601.819 y Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148: 1547).

Pueden diseñarse diversas realizaciones de moléculas de dirección multifuncionales basándose en este armazón asimétrico como se muestra en la Figura 20.

Los anticuerpos multiespecificos tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Aunque tales moléculas normalmente se unirán solamente a dos antígenos (es decir anticuerpos biespecíficos, BsÁb) , los anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecífieos están abarcados por la presente invención. Los ejemplos de BsAb incluyen sin limitación los de una rama dirigida contra un antígeno de célula tumoral y la otra rama dirigida contra una molécula citotóxica, o ambas ramas se dirigen contra dos antígenos de células tumorales diferentes, o ambas ramas se dirigen contra dos ligandos solubles diferentes, o una rama se dirige contra un ligando soluble y la otra rama se dirige contra un receptor de superficie celular, o ambas ramas se dirigen contra dos receptores de superficie celular diferentes. Se conocen en la técnica métodos para realizar anticuerpos biespecífieos .

De acuerdo con un enfoque diferente, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina . La fusión puede ser con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprenda al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se contempla que la primera región constante de cadena pesada (CHl) que contiene el sitio necesario para unión de cadena ligera está presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo' huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptidicos en realizaciones cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptidicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Véase, Ejemplo 1 y Tabla 2. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas polipeptidicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptidicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son de importancia particular .

Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Se ha propuesto que dichos anticuerpos, por ejemplo, dirigen células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de Estados Unidos N° 4.676.980) y para el tratamiento de infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Pueden realizarse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Se conocen bien en la técnica agentes de entrecruzamiento adecuados, y se desvelan en la Patente de Estados Unidos N° 4.676.980, junto con varias técnicas de entrecruzamiento.

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias que incorporan dominios CH3 variantes y heterodimeros de Fe resultantes de la invención. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecificos . Véase, por ejemplo, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos de la presente invención también abarcan los que tienen semividas (por ejemplo, semividas en suero) en un mamífero (por ejemplo, un ser humano) , de más de 15 días, más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de '4 meses o más de 5 meses. Las semividas aumentadas de los anticuerpos de la presente invención en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), dan como resultado un título en suero mayor de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el mamífero y, por lo tanto, reducen la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o reduce la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo para administrar. Pueden generarse anticuerpos que tengan semividas in vitro aumentadas por técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos con semividas in vivo aumentadas modificando (por ejemplo, sustituyendo, suprimiendo o añadiendo) restos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, Publicaciones Internacionales N° WO 97/34631; O 04/029207; Patente de Estados Unidos N° 6.737.056 y Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2003/0190311) .

En una realización especifica el heterodimero de Fe variante que comprende el dominio CH3 variante es un anticuerpo multiespecifico (denominado en el presente documento un anticuerpo de la invención) , el anticuerpo de la invención se une específicamente a un antígeno de interés. En particular el anticuerpo de la invención es un anticuerpo biespecífico . En una realización, un anticuerpo de la invención se une específicamente a un antígeno polipeptidico. En otra realización, un anticuerpo de la invención se une específicamente a un antígeno no polipeptidico. En otra realización más, la administración de un anticuerpo de la invención a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero .

Prácticamente cualquier molécula puede dirigirse por y/o incorporarse a una proteína heterodimérica de Fe variante (por ejemplo, anticuerpos, proteínas de fusión de Fe) incluyendo, pero sin limitación, la siguiente lista de proteínas, así como subunidades, dominios, motivos y epítopos que pertenecen a la siguiente lista de proteínas: renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor de liberación de hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteinas, antitripsina alfa 1; cadena de insulina A; cadena de insulina B; proinsulina; hormona folículo estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VII, factor VIIIC, factor IX,' factor tisular (TF) y factor de von Willebrands; factores anticoagulación tales como Proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminogeno, tal como uroquinasa o activador de plasminogeno de tipo tisular o de orina humana (t-PA) ; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encef linasa ; RANTES (regulado en la activación, normalmente expresado y secretado en linfocitos T) ; proteína inflamatoria de macrófagos humanos (???-1-alfa ) ; una albúmina de suero tal como albúmina de suero humana; sustancia inhibidora muleriana; cadena de relaxina A; cadena de relaxina B; prorrelaxina; péptido asociado con gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores del crecimiento tales como, por ejemplo, EGFR, VEGFR; interferones tales como interferón alfa (ot-IFN) , interferón beta (ß-IFN) e interferón gamma (?-IFN) ; proteina A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF) , neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como AFGF y PFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 o TGF-5 ; factor de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des (l-3)-IGF-I (cerebral IGF-I) , proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulina; proteínas CD tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CDlla, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 y CD147; eritropoyetina; factores osteoinductores ; inmunotoxinas ; una proteína morfogenética del hueso (BMP); un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) , tales como M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-13; TNFa, superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana superficial; factor acelerante de la desintegración; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura de SIDA, por ejemplo, gpl20; proteínas de transporte; receptores buscadores; adresinas; proteínas reguladoras; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac 1, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 y VCAM, integrina a4/p7 e integrina Xv/p3 incluyendo una, o subunidades de la misma, subunidad de integrina alfa tal como CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, alfa7, alfa8, alfa9, alfaD, CDlla, CDllb, CD51, CDllc, CD41, alfallb, alfalELb; subunidades de integrina beta tales como CD29, CD18, CD61, CD104, beta5, beta6, beta7 y beta8; combinaciones de subunidades de Integrina incluyendo pero sin limitación, a?ß3, a?ß5 y a4ß7; un miembro de una ruta de apoptosis; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) ; receptor mpl; CTLA-4; proteína C; un receptor Eph tal como EphA2 , EphA4 , EphB2 , etc.; un Antígeno de Leucocitos Humanos (HLA) tal como HLA-DR; proteínas del complemento tales como receptor del complemento CR1, CIRq y otros factores de complemento tales como C3 y C5; un receptor de glicoproteína tal como Gplba, GPIIb/IIIa y CD200; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

También se contemplan anticuerpo de la invención que se unen específicamente a antígenos de cáncer incluyendo, pero sin limitación, receptor ALK (receptor de pleiotropina) , pleiotropina, antígeno de pancarcinoma KS 1/4; antígeno de carcinoma ovárico (CA125) ; fosfato ácido prostético; antigeno especifico de próstata (PSA) ; antigeno asociado a melanoma p97; antigeno de melanoma gp75; antigeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) ; antigeno de membrana especifico de próstata; antigeno carcinoembrionario (CEA) ; antigeno de mucina epitelial polimórfica; antigeno globular de grasa de leche humana; antigenos asociados a tumor colorrectal tales como: CEA, TAG-72, C017-1A, GICA 19-9, CTA-1 y LEA; antigeno de linfoma de Burkitt 38.13; CD19; antigeno de linfoma B humano-CD20; CD33; antigenos específicos de melanoma tales como gangliósido GD2, gangliósido GD3, gangliósido G 2 y gangliósido GM3; antígeno de superficie celular de tipo trasplante específico de tumor (TSTA) ; antígenos tumorales inducidos por virus incluyendo a tígeno T, virus de ADN tumorales y antígenos de envoltura de virus de ARN tumorales; alfa fetoproteína antigénica oncofetal tal como CEA de colon, glicoproteína de trofoblasto oncofetal 5T4 y antígeno oncofetal de tumor de vejiga; antígeno de diferenciación tal como antígenos de carcinoma de pulmón humano L6 y L20; antígenos de fibrosarcoma; antígeno de iinfocitos T de leucemia humana Gp37; neoglicoproteína; es ingolípidos ; antígenos de cáncer de mama tales como EGFR (receptor de factor de crecimiento Epidérmico) ; antígeno de NY-BR-16; NY-BR-16 y HER2 (pl85HER2); mucina epitelial polimórfica (PEM); antigeno de linfocitos humanos malignos APO-1; antigeno de diferenciación tal como antigeno I hallado en eritrocitos fetales; antigeno de endodermo primario I hallado en eritrocitos adultos; embriones preimplantación; I(Ma) hallado en adenocarcinomas gástricos; 18, M39 hallados en epitelio de mama; SSEA-1 hallado en células mieloides; VEP8; VEP9; Myl; Va4-D5; D156-22 hallado en cáncer colorrectal; TRA-1-85 í (grupo sanguíneo /H) ; SCP-1 hallado en cáncer de testículo y ovario; C14 hallado en adenocarcinoma colónico; F3 hallado en adenocarcinoma de pulmón; AH6 hallado en cáncer gástrico; hapteno Y; Ley hallado en células de carcinoma embrionario; TL5 (grupo sanguíneo A) ; el receptor EGF hallado en células A431; serie El (grupo sanguíneo B) hallado en cáncer pancreático; FC10.2 hallado en células de carcinoma embrionario; antígeno de adenocarcinoma gástrico; CO-514 (grupo sanguíneo Lea) hallado en Adenocarcinoma; NS-10 hallado en adenocarcinomas; CO-43 (grupo sanguíneo Leb) ; G49 hallado en receptor EGF de células A431; H2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) hallado en adenocarcinoma de colon; 19.9 hallado en cáncer de colon; mucinas de cáncer gástrico; T5A7 hallado en células mieloides; R24 hallado en melanoma; 4.2, GD3 , Dl.l, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 y MI: 22: 25: 8 hallado en células de carcinoma embrionario y SSEA-3 y SSEA-4 hallados en embriones de estadio de 4 a 8 células; antígeno de Linfoma de Linfocitos T Cutáneo; antigeno de MART-1; antigeno de Sialy Tn (STn) ; antigeno de cáncer de colon NY-CO-45; antigeno de cáncer de pulmón NY-LU-12 valiant A; antigeno de Adenocarcinoma ART1; antigeno de cáncer de testículo-cerebro asociado a Paraneoplasia (antigeno onconeural MA2 ; antigeno neural paraneoplásico) ; antigeno ventral Neurooncológico 2 (N0VA2); gen de antigeno de carcinoma hepatocelular 520; ANTIGENO ASOCIADO A TUMOR CO-029; antígenos asociados a Tumor MAGE-C1 (antigeno de cáncer/testículo CT7), MAGE-B1 (antigeno MAGE-XP) , MAGE-B2 (DAM6) , MAGE-2, MAGE-4-a, MAGE-4-b y MAGE-X2 ; Antigeno de Cáncer-Testículo (NY-EOS-1) y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero descrito en el presente documento, comprende al menos un anticuerpo terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo terapéutico se une a un antigeno diana de cáncer. En una realización, el anticuerpo terapéutico puede ser uno que se selecciona del grupo que consiste en abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, . motavizumab, muromonab, . mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizuraab/atlizumab, tositumomab, trastuzumab, ProxiniumTM, RencarexTM, ustekinumab, zalutumumab, y cualquier otro anticuerpo.

Los anticuerpos de la invención incluyen derivados que están modificados (es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula con el anticuerpo tal como la unión covalente) . Por ejemplo, pero sin limitación, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos de bloqueo/protección conocidos, escisión, proteolitica, enlace con un ligando celular u otra proteina, etc. Puede llevarse a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Pueden generarse anticuerpos o fragmentos de los mismos con ^emividas in vivo aumentadas uniendo moléculas poliméricas tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo.

Puede unirse PEG a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con o sin un enlazador multifuncional mediante conjugación especifica de sitio del PEG con el extremo N o C terminal de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o mediante grupos épsilon-amino presentes en restos de lisina. Se usará derivatización de polímeros lineales o ramificados que dé como resultado pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se supervisará estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación apropiada de moléculas de PEG con los anticuerpos. Los PEG que no han reaccionado pueden separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, cromatografía de expresión de tamaño o intercambio iónico.

Además, los anticuerpos pueden conjugarse con albúmina para hacer al anticuerpo o fragmento de anticuerpo más estable in vivo o que tenga una mayor semivida in vivo. Las técnicas se conocen bien en este campo, véase por ejemplo, Publicaciones Internacionales N° WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y Patente Europea N° EP 413.622.· La presente invención abarca el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados o fusionados con uno o más restos, incluyendo pero sin limitación, péptidos, polipéptidos , proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas.

La presente invención abarca el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos fusionados de forma recombinante o conjugados de forma química (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, por ejemplo, con un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. No se requiere que la fusión sea necesariamente directa, sino que puede producirse a través de secuencias enlazadoras. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos celulares particulares, in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los anticuerpos con anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. Los anticuerpos fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos también pueden usarse en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación usando métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Publicación Internacional N° WO 93/21232; Patente Europea N° EP 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99; Patente de Estados Unidos N° 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452.

La presente invención incluye además composiciones que comprenden proteínas heterólogas, péptidos o polipéptidos fusionados o conjugados con fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los polipéptidos heterólogos pueden fusionarse o conjugarse con un fragmento Fab, fragmento. Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, un dominio VH, un dominio VL, una CDR VH, una CDR VL, o fragmento de los mismos. Se conocen bien en la técnica métodos para fusionar o conjugar polipéptidos con partes de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851 y 5.112.946; Patentes Europeas N° EP 307.434 y EP 367.166; publicaciones Internacionales N° WO 96/04388 y O 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154: 5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 11337-11341.

Pueden generarse proteínas de fusión adicionales, por ejemplo de anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno (por ejemplo, mencionado anteriormente) , mediante las técnicas de combinación de genes, combinación de motivos, combinación de exones y/o combinación de codones (denominados colectivamente "combinación de ADN") . La combinación de ADN puede emplearse para alterar las actividades de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con afinidades mayores y tasas de disociación menores) . Véase, en general, Patentes de Estados Unidos N° 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252 y 5.837.458, y Patten et al., 1997, Curr. Opinión Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308-313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos o fragmentos de los mismos codificados, pueden alterarse sometiéndoles a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos aleatoria u otros métodos antes de la recombinación. Una o más partes de un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, cuyas partes se unen específicamente a un antígeno puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterologas.

La presente invención abarca además usos de heterodímeros de Fe variantes o fragmentos de los mismos conjugados con un agente terapéutico.

Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para células. Los ejemplos incluyen ribonucleasa, monometillauristatina E y F, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, epirubicina y ciclofosfamida y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbacina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatino) , antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Puede encontrarse una lista más exhaustiva de restos terapéuticos en las publicaciones de PCT WO 03/075957.

Además, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un agente terapéutico o resto farmacológico que modifique una respuesta biológica dada. Los agentes terapéuticos o restos farmacológicos no deben interpretarse como limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, Onconasa (u otra RNasa citotóxica) , exotoxina de Pseudomonas, toxina del cólera o toxina diftérica; una proteína tal como un factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón ß, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-a, TNF-ß, AIM I (véase Publicación Internacional N° WO 97/33899), AIM II (véase, Publicación Internacional N° WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567), y VEGI (véase Publicación Internacional N° WO 99/23105) , un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o un modificador de respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina 1 ("IL-1") , interleucina 2 ("IL-2") , interleucina 6 ("IL-6") , factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM- CSF") y factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") ) , o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona' del crecimiento ("GH") ) .

Además, un anticuerpo puede conjugarse con restos terapéuticos tales como materiales radiactivos o quelantes macrociclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (véase anteriormente para ejemplos de materiales radiactivos) . En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan-N, N' , N", N"-tetraacético (DOTA) que puede unirse al anticuerpo mediante una molécula enlazadora. Dichas moléculas enlazadoras se conocen habitualmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res. 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553; y Zimmerman et al., 1999, Nucí. ed. Biol. 26: 943.

Se conocen en la técnica métodos para fusionar o conjugar anticuerpos con restos polipeptidicos . Véase, por ejemplo, · Patentes de Estados Unidos N° .5.336.603 ; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851 y 5.112.946; documentos EP 307.434; EP 367.166; Publicaciones de PCT WO 96/04388 y O 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154: 5590; y Vil et al., 1992, PNAS USA 89: 11337. No es necesario que la fusión de un anticuerpo con un resto sea necesariamente directa, pero puede producirse a través de secuencias enlazadoras. Dichas moléculas enlazadoras se conocen habitualmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10: 553; Zimmerman et al., 1999, Nucí Med Biol 26: 943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171.

La expresión recombinante de una variante de Fe, derivado, análogo o fragmento del mismo (por ejemplo, un anticuerpo o proteina de fusión de la invención) , requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique la variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo, o proteína de fusión) . Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo, o proteína de fusión), el vector para la producción de la variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo, o proteína de fusión) puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en este campo. Por lo tanto, se describen en el presente documento métodos para preparar una proteína expresando un polinucleótido que contenga una variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo, o proteína de fusión) . Pueden usarse métodos que se conocen bien por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificantes de variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo, o proteína de fusión) y señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención proporciona por lo tanto vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de Fe de la invención, unida operativamente con un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, Publicación Internacional N° O 86/05807; Publicación Internacional N° WO 89/01036; y Patente de Estados Unidos N° 5.122.464 y el dominio variable del anticuerpo, o un polipéptido para generar una variante de Fe puede clonares en dicho vector para expresión de la cadena de anticuerpo de longitud completa (por ejemplo cadena pesada o ligera) o variante de Fe completa que comprende una fusión de un polipéptido no derivado de anticuerpo y una región de Fe que incorpora al menos el dominio CH3 variante.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped por técnicas convencionales y las células transferidas se cultivan después por técnicas convencionales para producir una variante de Fe de la invención. Por lo tanto, la invención incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica una variante de Fe de la invención, unido operativamente con un promotor heterólogo. En realizaciones especificas para la expresión de variantes de Fe que comprenden anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican las cadenas tanto pesada como ligera pueden coexpresarse en la célula huésped para expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla posteriormente.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de vector de expresión del huésped para expresar las variantes de Fe de la invención (por ejemplo, anticuerpo o moléculas de proteina de fusión) (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.807.715). Dichos sistemas de expresión de huésped representan vehículos por los que las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar una variante de Fe de la invención in situ. Estas incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de variantes de Fe; levadura (por ejemplo, Saccharomyces , Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de variante de Fe; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de variante de Fe; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmidicos recombínantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de variante de Fe; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO y 3T3) que albergan construcciones de expresión recombínantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus vaccinia de 7,5 K) . En ciertas · realizaciones, se usan células bacterianas tales como Escherichia coli, o células eucariotas, para la expresión de una variante de Fe, que es un anticuerpo recombinante o moléculas de proteína de fusión. Por ejemplo, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) , junto con un vector tal como el elemento promotor de gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2). En una realización especifica, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican una variante de Fe de la invención (por ejemplo, anticuerpo o proteina de fusión) se regula por un promotor constitutivo, promotor inducible o promotor especifico de tej ido .

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse provechosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o proteina de fusión) que se exprese. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de dicha proteina, para la generación de composiciones farmacéuticas de una variante de Fe, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteina de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, E BO 12: 1791), en que la secuencia que codifica la variante de Fe puede ligarse individualmente en el vector en fase con la región codificante de lac Z de modo que se produzca una proteina de fusión con lac Z; vectores pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutatión ' 5-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas por adsorción y unión a .perlas de agarosa con glutatión de matriz seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de proteasa factor Xa o trombina de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto de GST.

En una sistema de insecto se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes ajenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de la variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y situarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina) .

En células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se use un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia codificante de la variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) de interés puede ligarse con un complejo de control de la transcripción/traducción de un adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse después en el genoma del adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la variante de Fe (por ejemplo, proteina de anticuerpo o fusión) en hospedadores infectados (por ejemplo,, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 355-359). También pueden requerirse señales de inicio especificas para traducción eficaz de secuencias codificantes de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con la fase' de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de la traducción exógenas y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión ' puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544) .

La expresión de una variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) puede controlarse por cualquier elemento promotor o potenciador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen que codifica una variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o . proteina de fusión) incluyen, pero sin limitación, la región promotor temprana de SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42), el promotor de tetraciclina (Tet) (Gossen et al., 1995, Prcc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551); vectores de expresión procariotas tal como el promotor de ß lactamasa (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 75: 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80: 21-25; véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94); vectores de expresión vegetales que comprenden la región promotor de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., 1981, Nucí. Acids Res. 9: 2871) y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115-120); elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa) , promotor de PGK ( fosfoglicerol quinasa) , promotor de fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control, de la transcripción animales, que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos : región de control del gen de la elastasa I que está activa en células de acinos pancreáticos (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); región de control del gen de la insulina que está activa en células pancreáticas beta (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), región de control del gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), región de control de virus de tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares , mamarias, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), región de control del gen de la albúmina que está activa en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel. 1: 268-276), región de control del gen de la alfa fetoproteína que está activa en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); región de control del gen de alfa 1- antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes y Devel. 1: 161-171), región de control del gen de beta globina que está activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); región de control del gen de la proteina básica mielina que está activa en células oligodendrociticas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); región de control del gen de la cadena ligera de miosina 2 que está activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283-286); enolasa especifica de neuronas (NSE) que está activa en células neuronales ( orelli et al., 1999, Gen. Virol. -80: 571-83) ; región de control del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) que está activa en célula neuronales (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253: 818-823) ; promotor de la proteina ácida fibrilar glial que está activo en astrocitos (GFAP) (Gomes et al., 1999, Braz J ed Biol Res 32(5): 619-631; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80: 571-83) y región de control de gen de la hormona liberadora de gonadotropina que está activa en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

Los vectores de expresión que contienen insertos de un gen que codifica una variante de Fe de la invención (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) pueden identificarse por tres enfoques generales: (a) hibridación de ácidos nucleicos, (b) presencia o ausencia de funciones de genes "marcadores", y (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia de un gen que codifica un péptido, polipéptido, proteína o una proteína de fusión en un vector de expresión puede detectarse por hibridación de ácido nucleico usando sondas que comprenden secuencias que son homologas de un gen insertado que codifica el péptido, polipéptido, proteína o la proteína de fusión, respectivamente. En el segundo enfoque, el sistema de huésped/vector recombinante puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) provocadas por la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o proteína de fusión en el vector. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos ' que codifica la variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) se inserta dentro de la secuencia de gen marcador del vector, pueden identificarse recombinantes que contienen el gen que codifica el anticuerpo o inserto de proteína de fusión por la ausencia de la función génica marcadora. En el tercer enfoque, pueden identificarse vectores de expresión recombinantes ensayando el producto génico (por ejemplo, anticuerpo o proteina de fusión) expresado por el recombinante . Dichos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de la proteína de fusión en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, unión con anticuerpo anti molécula bioactiva.

Además, puede seleccionarse una cepa de células hospedadoras . que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. La expresión de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores; por lo tanto, la expresión de la proteína de fusión modificada por ingeniería genética puede controlarse. Además, diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación de proteínas) . Pueden seleccionarse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar , la modificación y procesamiento deseados de la proteína ajena expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano producirá un producto no glicosilado y la expresión en levadura producirá un producto glicosilado. Pueden usarse células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para procesamiento apropiado del transcrito primario (por ejemplo, glicosilación y fosforilación) del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, I38, NSO, y, en particular, líneas celulares neuronales tales como, por ejemplo, neuroblastomas humanos SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ (Sugimoto et al., 1984, J. Nati. Cáncer Inst. 73: 51-57), neuroblastoma humano SK-N-SH (Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460), meduloblastoma cerebelar humano Daoy (He et al., 1992, Cáncer Res. 52: 1144-1148) células de glioblastoma DBTRG-05MG (Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614), neuroblastoma humano IMR-32 (Cáncer Res., 1970, 30: 2110-2118), astrocitoma humano 1321N1 (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 4816), astrocitoma humano MOG-G-CCM (Br. J. Cáncer, 1984, 49: 269), glioblastoma-astrocitoma humano U87MG (Acta Pathol. icrobiol. Scand. , 1968, 74: 465-486), glioblastoma humano A172 (Olopade et al., 1992, Cáncer Res. 52: 2523-2529), células de glioma de rata C6 (Benda et al., 1968, Science 161: 370-371), neuroblastoma de ratón Neuro-2a (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1970, 65: 129-136), neuroblastoma de ratón NB41A3 (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1962, 48: 1184-1190), plexo coroide de oveja SCP (Bolin et al., 1994, J. Virol. Methods 48: 211-221), G355-5, astrocito normal de Gato PG-4 (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53: 827-833), cerebro de hurón Mpf (Trowbridge et al., 1982, In Vitro 18: 952-960) y líneas celulares normales tales como, por ejemplo, cerebro de córtex normal de rata CTX TNA2 (Radany et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6467-6471) tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst. Además, diferentes sistemas de expresión de hospedador/vector pueden efectuar reacciones de procesamiento en diferentes grados.

Para producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes , con frecuencia se prefiere expresión estable. Por ejemplo, pueden obtenerse por ingeniería genética líneas celulares que expresen de forma estable una variante de Fe de la invención (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) . En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, pueden transformarse células hospedadoras con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN ajeno, puede permitirse que las células obtenidas por ingeniería genética crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez puedan clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse provechosamente para obtener por ingeniería genética líneas celulares que expresan una variante de Fe que se une específicamente a un antígeno. Dichas líneas celulares obtenidas por ingeniería genética pueden ser particularmente útiles en la exploración y evaluación de compuestos que afecten a la actividad de una variante de Fe (por ejemplo, un polipéptido o una proteína de fusión) que se una específicamente a un antígeno.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo pero sin limitación genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48: 2026) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) que pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia antimetabolitos como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, que confiere resistente a ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2072); genes neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).

Una vez que se ha producido una variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o una proteina de fusión) de la invención por expresión recombinante, esta puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para purificación de una proteina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de proteína A, y en columna por tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.

La variante de Fe se recupera en general del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse del lisado de células hospedadoras cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si la variante de Fe está unida a membrana, puede liberarse de la membrana usando una solución de detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) .

Cuando la variante de Fe se produce en una célula recombinante distinta de una de origen humano, esta está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar la variante de Fe de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas con respecto a la variante de Fe. Como una primera etapa, el medio de cultivo o lisado normalmente se centrifuga para retirar residuos celulares en partículas.

Pueden purificarse convenientemente heterodímeros de Fe que tengan dominios constantes de anticuerpos por cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis' en gel, diálisis o cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. También están disponibles otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía informática, cromatografía en heparina Sepharose, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio dependiendo del polipéptido para recuperar. La idoneidad de la Proteína A como un ligando de afinidad, depende de la especie e isotipo del dominio Fe de inmunoglobulina que se use. La proteína A puede usarse para purificar regiones Fe de inmunoglobulina que están basadas en las cadenas pesadas ??, ?2 o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La. matriz a la que se une el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio poroso controlado o poli (estirendivinil ) benceno posibilitan caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos de los que pueden conseguirse con agarosa. Las condiciones para unir una inmunoadhesina a la columna de afinidad de proteina A o G están dictadas completamente por las características del dominio Fe; es decir, su especie e isotipo. En general, cuando se selecciona el ligando apropiado, se produce unión eficaz directamente a partir de líquido de cultivo no condicionado. Pueden eluirse eficazmente heterodímeros de Fe variantes unidos a pH ácido (a o por encima de 3,0), o en un tampón de pH neutro que contenga una sal suavemente caotrópica. Esta etapa de cromatografía de afinidad puede dar como resultado una preparación de heterodímero de Fe variante que sea >95% pura.

Los niveles de expresión de una variante de Fe (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) pueden aumentar por amplificación con vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol . 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Por ejemplo, cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo o proteina de fusión es amplificable , el aumento del nivel de inhibidor presente en cultivo de células hospedadoras aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen de anticuerpo, la producción del anticuerpo o proteina de fusión también aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257) .

La célula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la invención, por ejemplo, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos, que permiten la expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, puede usarse un único vector que codifica, y es capaz de expresar, una proteina de fusión o polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Las secuencias codificantes para la proteina de fusión o cadenas pesadas y ligeras pueden comprenden ADNc o ADN genómico.

Caracterización y ensayos funcionales Las variantes de Fe (por ejemplo, anticuerpos o proteínas de fusión) de la presente invención pueden caracterizarse de diversas maneras. En una realización, se evalúa la pureza de los heterodímeros de Fe variantes usando técnicas bien conocidas en este campo, incluyendo, pero sin limitación, geles de SDS-PAGE, transferencias de western, densitometria o espectrometría de masas. La estabilidad proteica puede caracterizarse usando una serie de técnicas, no limitadas a cromatografía de exclusión por tamaño, espectroscopia de UV visible y CD, espectroscopia de masas, dispersión de la luz diferencial, ensayo de estabilidad de sobremesa, congelación-descongelación acoplada con otras técnicas de caracterización, calorimetría de exploración diferencial, fluorometría de exploración diferencial, cromatografía de interacción hidrófoba, isoelectroenfoque, ensayos de unión a receptor o niveles de expresión de proteína relativos. En una realización ejemplar, la estabilidad de los heterodímeros de Fe variantes se evalúa por la temperatura de fusión del dominio CH3 variante, en comparación con el dominio CH3 natural, usando técnicas bien conocidas en este campo tales como Calorimetría de Exploración Diferencial o fluorometría de exploración diferencial .

Las variantes de Fe de la presente invención también pueden ensayarse con respecto a la capacidad para unirse específicamente a una ligando, (por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB, Clq) . Dicho ensayo puede realizarse en solución (por ejemplo, Houghten, · Bio/Techniques , 13: 412-421, 1992), en perlas (Lam, Nature, 354: 82-84, 1991, en microplacas (Fodor, Nature, 364: 555-556, 1993), en bacterias (Patente de Estados Unidos N° 5.223.409), en plásmidos (Culi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869, 1992) o en fagos (Scott y Smith, Science, 249: 386-390, 1990; Devlin, Science, 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382, 1990; y Felici, J. Mol. Biol., 222: 301-310, 1991) . Después las moléculas que se ha identificado que se unen específicamente a un ligando (por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB, Clq o a un antígeno) pueden ensayarse con respecto a su afinidad por el ligando.

Las variantes de ' Fe de la invención pueden ensayarse con respecto a unión específica con una molécula tal como un antígeno (por ejemplo, antígeno de cáncer y reactividad cruzada con otros antígenos) o un ligando (por ejemplo, FcyR) por cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar la unión específica y reactividad cruzada incluyen, pero sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como transferencia de western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteina A, por nombrar algunos. Dichos ensayos son rutinarios y se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York).

La afinidad de unión de las variantes de Fe de la presente invención con una molécula tal como un antigeno o un ligando (por ejemplo, FcyR) y la tasa de disociación de la interacción pueden determinarse por ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del ligando marcado, tal como FcyR (por ejemplo, 3H o 1251 con una molécula de interés (por ejemplo, variantes de Fe de la presente invención) en presencia de cantidades crecientes de ligando no marcado, tal como FcyR, y la detección de la molécula unida al ligando marcado. La afinidad de la molécula de la presente invención por el ligando y las tasas de disociación de unión pueden determinarse a partir de los datos de saturación por análisis de scatchard.

Los parámetros cinéticos de una variante de Fe también pueden determinarse usando cualquier ensayo basado' en resonancia de plasmón superficial (SPR) conocido en la técnica (por ejemplo, análisis cinético BIAcore) . Para una revisión de tecnología basada en SPR véase Mullet et al., 2000, ethods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinión in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinión in Biotechnology 11: 54-61. Adicionalmente, se contemplan en los métodos de la invención cualquiera de los instrumentos de SPR y métodos basados en SPR para medir interacciones entre proteínas descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 6.373.577; 6.289.286; 5.322.798; 5.341.215; 6.268.125.

Puede usarse separación de células activada por fluorescencia (FACS) usando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia, para caracterizar la unión de variantes de Fe con una molécula expresada en la superficie celular (por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB) . Los clasificadores de flujo son capaces de examinar rápidamente una gran cantidad de células individuales que contienen insertos de biblioteca (por ejemplo, 10-100 millones de células por hora) (Shapiro et al., Practical Flow, Cytometry, 1995) . Se conocen bien en la técnica citómetros de flujo para clasificar y examinar células biológicas. Se describen citómetros de flujo conocidos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 4.347.935; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.643.796; y 6.211.477. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson and Company, y el sistema COPAS™ fabricado por Union Biometrica.

Las variantes de Fe de la invención pueden caracterizarse por su capacidad para mediar en la función de células efectoras mediada por FcyR. Los ejemplos de funciones de células efectoras que pueden ensayarse incluyen, pero sin limitación, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) , fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis , unión de Clq, y citotoxicidad mediada por células dependientes del complemento (CDC) . Puede usarse cualquier ensayo basado en células o sin células conocido por los expertos en la materia para determinar la actividad de función de células efectoras (para ensayos de células efectoras, véase Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown E J. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med. , 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8 : 403-411) .

En particular, las variantes de Fe de la invención pueden ensayarse con respecto a actividad ADCC mediada por FcyR en células efectoras (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales) usando cualquiera de los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Véase por ejemplo, Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92). Un ensayo ejemplar para determinar la actividad ADCC de las moléculas de la invención se basa en un ensayo de liberación de 51Cr que comprende: marca las células diana con [ 51Cr] Na2Cr04 (esta molécula permeable a membrana celular se usa habitualmente para mareaje puesto que se une a proteínas citoplásmicas y aunque se libera espontáneamente de las células con cinética lenta, se libera masivamente después de necrosis de células diana) ; opsonizar las células diana con las variantes de Fe de la invención; combinar las células diana radiomarcadas opsonizadas con células efectoras en una placa de microtitulación a una relación apropiada de células diana y células efectoras; incubar la mezcla de células durante 16-18 horas a 37 °C; recoger sobrenadantes; y analizar la radiactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la invención puede determinarse después, por ejemplo usando la siguiente fórmula: % de lisis=(cpm experimental-cpm de filtración diana) / (cpm de lisis de detergente-cmp de filtración diana) xl00%. Como alternativa, % de lisis=(ADCC-AICC) /( liberación máxima-liberación espontánea). La lisis específica puede calcularse usando la fórmula: lisis específica=% de lisis con las moléculas de la invención-% de lisis en ausencia de las moléculas de la invención. Puede generarse una gráfica variando la relación' de células diana: efectoras o la concentración de anticuerpos .

Se conocen bien en la técnica métodos para caracterizar la capacidad de las variantes de Fe para unirse a Clq y mediar en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Por ejemplo, para determinar la unión de Clq, puede realizarse un ELISA de unión de Clq. Un ensayo ejemplar puede comprender lo siguiente: las placas de ensayo pueden revestirse durante una noche a 4 °C con variante polipeptidica o polipéptido de partida (control) en tampón de recubrimiento. Las placas pueden después lavarse y bloquearse. Después del lavado, puede añadirse una alícuota de Clq humana a cada pocilio e incubarse durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, pueden añadirse 100 µ? de un anticuerpo conjugado con peroxidasa de Clq anticomplemento de oveja a cada pocilio e incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa puede lavarse de nuevo con tampón de lavado y pueden añadirse 100 µ? de tampón sustrato que contenga OPD (O-fenilendiamina diclorhidrato (Sigma) ) a cada pocilio. Puede permitirse que la reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, continúe durante 30 minutos y detenerse mediante la adición de 100 µ? de NH2 S04 4,5. La absorbancia puede después leerse a (492-405) nm.

Para evaluar la activación del complemento, pude realizarse un ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , (por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods 202: 163). Brevemente, diversas concentraciones de variante de Fe y complemento humano pueden diluirse con tampón. Las células que expresan el antigeno con el que se une la variante de Fe pueden diluirse a una densidad de aproximadamente 1x106 células/ml. Pueden añadirse mezclas de la variante de Fe, complemento humano diluido y células que expresen el antígeno a unan placa de 96 pocilios de cultivo tisular de fondo plano y permitir que incuben durante 2 horas a 37 °C y C02 5% para facilitar la lisis celular mediada por complemento. Después pueden añadirse 50 µ? de . azul de alamar (Accumed International) a cada pocilio e incubarse durante una noche a 37 °C. La absorbancia se mide usando un fluorómetro de 96 pocilios con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativas (UFR) . Las concentraciones de la muestra pueden computarse a partir de una curva patrón y el porcentaje de actividad, en relación con una molécula comparable (es decir, una molécula que comprende una región Fe con un dominio CH3 no modificado o natural) se presenta para la variante de Fe de interés.

Pueden realizarse ensayos de complemento con cobaya, conejo o suero humano. Puede detectarse lisis del complemento de células diana supervisando la liberación de enzimas intracelulares tales como lactato deshidrogenasa (LDH) , como se describe en Korzeniewski et al., 1983, Immunol. Methods 64(3): 313-20; y Decker et al., 1988, J. Immunol Methods 115(1): 61-9; o la liberación de un marcador intracelular tal como europio, cromo 51 o indio 111 en el que se marcan células diana.

Métodos La presente invención abarca administrar una o más variantes de Fe de la invención (por ejemplo, anticuerpos) a un animal, en particular un mamífero, específicamente un ser humano, para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección. Las variantes de Fe de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en que se desea una eficacia alterada de la función de células efectoras (por ejemplo, ADCC, CDC) . Las variantes de Fe y composiciones de las mismas son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de enfermedad neoplásica metastásica o primaria (es decir, cáncer) y enfermedades infecciosas. Pueden proporcionarse moléculas de la invención en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conocen en la técnica o como se describe en el presente documento. Como se detalla posteriormente, las moléculas de la invención pueden usarse en métodos para tratar o prevenir cáncer (particularmente en inmunoterapia pasiva) , enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios o enfermedades infecciosas.

Las variantes de Fe de la invención también pueden utilizarse provechosamente en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento o prevención de un cáncer, enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios o enfermedades infecciosas. En una realización especifica, pueden usarse variantes de Fe de la invención en combinación con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7) , que, por ejemplo, actúan para aumentar el número o actividad de células efectoras que interaccionan con las moléculas y aumentan la respuesta inmune. Las variantes de Fe de la invención también pueden utilizarse provechosamente en combinación con uno o más fármacos usados para tratar una enfermedad, trastorno o infección tales como, por ejemplo, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios o agentes antivirales.

En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con cáncer y afecciones relacionadas administrando una o más variantes de Fe de la invención. Aunque sin desear quedar ligado a ningún mecanismo de acción, una variante de Fe de la invención que .se une a FcyRIIIA y/o FcyRIIA con una mayor afinidad que una molécula comparable, y que se une además a FcyRIIB con una menor afinidad que una molécula comparable y/o dicha variante de Fe tiene una función efectora potenciada, por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc. dará como resultado la dirección selectiva y destrucción eficaz de células cancerosas.

La invención abarca además administrar una o más variantes de Fe de la invención en combinación con otras terapias conocidas por los expertos en la materia para el tratamiento o prevención de cáncer, incluyendo, pero sin limitación, quimioterapias convencionales y experimentales actuales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias, radioterapias o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antineoplásicos , anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención de cáncer. Se conocen bien en la técnica y se han descrito en detalle en otros lugares (véase por ejemplo, publicaciones de PCT WO 02/070007 y WO 03/075957) ejemplos de regímenes de dosificación y terapias que pueden usarse en combinación con las variantes de Fe de la invención.

Los cánceres y trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse por métodos y composiciones de la presente invención incluyen, pero sin limitación, los siguientes: Leucemias, linfomas, mielomas múltiples, sarcomas de tejido conectivo y hueso, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer adrenal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cánceres de la hipófisis, cánceres oculares, cánceres vaginales, cánceres vulvares, cánceres cervicales, cánceres uterinos, cánceres ováricos, cánceres esofágicos, cánceres de estómago, cánceres de colon, cánceres rectales, cánceres de hígado, cánceres de la vesícula biliar, colangiocarcinomas , cánceres de pulmón, cánceres testiculares, cánceres de próstata, cánceres del pene; cánceres orales, cánceres de las glándulas salivares, cánceres de la faringe, cánceres cutáneos, cánceres de riñon, cánceres de vejiga (para una revisión de tales trastornos, véase Fishman et al., 1985, Medicine, 2a Ed., J. B. Lippincott Co . , Filadelfia y Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S. A., Inc., Estados Unidos de América).

La invención contempla además la modificación por ingeniería genética de cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o prevención de cáncer y trastornos relacionados, de modo que los anticuerpos comprendan una región Fe que incorpora un dominio CH3 variante de la invención.

En una realización específica, una molécula de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un heterodímero de Fe variante inhibe o reduce el crecimiento de tumor primario o metástasis de células cancerosas en al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, a-1 menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% en relación con el crecimiento de tumor primario o metástasis en ausencia de dicha molécula de la invención.

La' presente invención abarca el uso de una o más variantes de Fe de la invención para prevenir, tratar o controlar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto. Aunque sin pretender quedar ligado a ningún mecanismo de acción, las variantes de Fe con afinidad potenciada por FcyRIIB conducirán a una amortiguación de los receptores de activación y de este modo a una amortiguación de la respuesta inmune y tendrán eficacia terapéutica para tratar y/o prevenir un trastorno autoinmune. Además,¦ los anticuerpos que se unen' a más de una diana, tales como anticuerpos biespecificos que comprenden un heterodimero de Fe variante, asociados con un trastorno inflamatorio pueden proporcionar efectos sinérgicos frente a la terapia monovalente .

La invención abarca además administrar las variantes de Fe de la invención en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antiinflamatorios. La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o controlar uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmune que comprenden además administrar a dicho sujeto una variante de Fe de la invención en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes inmunomoduladores . Los ejemplos de trastornos autoinmunes que pueden tratarse administrando las variantes de Fe de la invención incluyen, pero sin limitación, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome de antifosfolípidos , enfermedad de Addison autoinmune, enfermedades autoinmunes de la glándula adrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, oforitis y orquitis autoinmune, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardimiopatía, dermatitis de esprúe celíaco, síndrome de disfunción inmune de fatiga crónica (CFIDS) , polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de aglutinina fría, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis , glomerulonefritis , enfermedad de Graves, Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), neuropatía de IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, enfermedad de tejido conectivo mixto, esclerosis múltiple, diabetes mellitus mediada por inmunidad o de tipo 1, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares , polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis tales como dermatitis herpetiforme, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero sin limitación, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones virales o bacterianas crónicas. Algunos trastornos autoinmunes están asociados con una afección inflamatoria, por lo tanto, hay solapamiento entre lo que se considera un trastorno autoinmune y un trastorno inflamatorio. Por lo tanto, algunos trastornos autoinmunes también pueden caracterizarse como trastornos inflamatorios. Los ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o controlarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones virales o bacterianas crónicas.

También pueden usarse variantes de Fe de la invención para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos con trastornos inflamatorios. En una realización especifica, un Fe de la invención reduce la inflamación en un animal en al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 6.0%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, ' al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% en relación con la inflamación en un animal al que no se administra dicha molécula.

La invención contempla además la modificación por ingeniería genética de cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o prevención de enfermedad autoinmune o enfermedad inflamatoria, de modo que los anticuerpos comprenden un heterodímero de Fe variante de la invención.

La invención también abarca métodos para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más variantes de Fe de la invención. Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse por las variantes de Fe de la invención están causadas por agentes infecciosos incluyendo pero sin limitación virus, bacterias, hongos, protozoos y virus.

Las enfermedades virales que pueden tratarse o prevenirse usando las variantes de Fe de la invención junto con los métodos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, las provocadas por hepatitis de tipo A, hepatitis de tipo B, hepatitis de tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simple de tipo I (VHS-I), herpes simple de tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma, papova virus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de paperas, virus de sarampión, virus de rubéola, virus de la polio, viruela, virus de Epstein Barr, virus de la inmunodeficiencia humana de tipo I (VIH-I), virus de la inmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-II) y agentes de enfermedades virales tales como meningitis viral, encefalitis, dengue o viruela.

Las enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse usando las variantes de Fe de la invención junto con los métodos de la presente invención, que están provocadas por bacterias incluyen, pero sin limitación, micobacterias , rickettsia, micoplasma, neisseria, S. pneumonía, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme) , Bacillus antracis (ántrax) , tétanos, estreptococos, estafilococos, micobacteria, tétanos, pertussis, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus y Legionella. Las enfermedades protozoarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención, que están provocadas por protozoos incluyen, pero sin limitación, leishmania, kokzidioa, tripanosoma o malaria. Las enfermedades parasitarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención, que están provocadas por parásitos incluyen, pero sin limitación, clamidia y rickettsia.

En algunas realizaciones, las variantes de Fe de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes terapéuticos conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa. La infección contempla el uso de las moléculas de la invención en combinación con otras moléculas conocidas por los expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa incluyendo, pero sin limitación, antibióticos, agentes antifúngicos y agentes antivirales.

La invención proporciona métodos y composiciones farmacéuticas que comprenden variantes de Fe de la invención (por ejemplo, anticuerpos, polipéptidos ) . La invención también proporciona métodos de tratamiento, profilaxis y alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección administrando a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una variante de Fe de la invención, o una composición farmacéutica que comprenda al menos una variante de Fe de la invención. En un aspecto, la variante de Fe está sustancialmente purificada (es decir, sustancialmente sin sustancias que limiten su efecto o produzcan efectos secundarios indeseados, esto incluye homodimeros y otro material celular) . En una realización especifica, el sujeto es un animal, tal como un mamífero incluyendo no primates (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y primates . (por ejemplo, monos tales como un mono cynomolgus y un ser humano) . En una realización específica, el sujeto es un ser humano. En otra realización específica más, el anticuerpo de la invención es de la misma especie que el sujeto.

La vía de administración de la composición depende de la afección para tratar. Por ejemplo, puede preferirse inyección intravenosa para el tratamiento de un trastorno sistémico tal como un cáncer linfático o un tumor que se ha metastatizado . La dosificación de las composiciones para administrar puede determinarse por el experto en la materia sin experimentación indebida junto con estudios de respuesta a dosis convencionales. Las circunstancias relevantes a considerar en la preparación de esas determinaciones incluyen la afección o las afecciones para tratar, la selección de composición para administrar,- la edad, peso y respuesta del paciente individual y la gravedad de los síntomas del paciente.

Dependiendo de la afección, la composición puede administrarse por vía oral, vía parenteral, vía intranasal, vía vaginal, vía rectal, vía lingual, vía sublingual, vía bucal, vía intrabucal y/o vía transdérmica al paciente.

En consecuencia, pueden realizarse composiciones diseñadas para administración oral, lingual, sublingual, bucal e intrabucal sin experimentación indebida por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible. La composición puede incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el fin de administración terapéutica oral, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, gomas de mascar, y similares.

Los comprimidos, cápsulas, trociscos y similares pueden contener también aglutinantes, recipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes y/o agentes saporíferos. Algunos ejemplos de aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma tragacanto y gelatina. Los ejemplos de excipientes incluyen almidón y lactosa. Algunos ejemplos de agentes disgregantes incluyen ácido algínico, almidón de maíz y similares. Los ejemplos de lubricantes incluyen estearato de magnesio y estearato de potasio. Un ejemplo de un emoliente es dióxido de silicio coloidal. Algunos ejemplos de agentes edulcorantes incluyen sacarosa, sacarina y similares. Los ejemplos de agentes saporíferos incluyen menta, metil salicilato, saporífero de naranja y similares. Los materiales usados en la preparación de estas diversas composiciones deberían ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral, tal como, por ejemplo, inyección intravenosa, intramuscular, intratecal y/o subcutánea. Puede conseguirse administración parenteral incorporando las composiciones de la presente invención en una solución o suspensión. Tales soluciones o suspensiones también pueden incluir diluyentes estériles, tales como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol y/u otros disolventes sintéticos. Las formulaciones parenterales también pueden incluir agentes antibacterianos, tales como, por ejemplo alcohol bencílico y/o metilparabenos , antioxidantes, tales como, por ejemplo, ácido ascórbico y/o bisulfito sódico, y agentes quelantes, tales como EDTA. También pueden añadirse tampones tales como acetatos, citratos y fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico y dextrosa. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables y/o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico. La administración rectal incluye administrar la composición en el recto y/o intestino grueso. Esto puede conseguirse usando supositorios y/o enemas. Las formulaciones de supositorio pueden realizarse por métodos conocidos en la técnica. La administración transdérmica incluye absorción percutánea de la composición a través de la piel. Las formulaciones transdérmicas incluyen parches, ungüentos, cremas, geles, pomadas y similares. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por via nasal a un paciente. Como se usa en el presente documento, administrar por via nasal o la administración nasal incluyen administrar las composiciones a las membranas mucosas del conducto nasal y/o cavidad nasal deL paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse de acuerdo con los métodos de la invención para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastornos o infección. Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención son estériles y están en forma adecuada para administración a un sujeto.

En una realización las composiciones de la invención son formulaciones sin pirógenos que están sustancialmente sin endotoxinas y/o sustancias pirógenas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas dentro de un microorganismo y se liberan cuando los microorganismos se rompen o mueren. Las sustancias pirógenas también incluyen sustancias termoestables inductoras de fiebre (glicoproteinas ) de la membrana externa de bacterias y otros microorganismos. Ambas de estas sustancias pueden provocar fiebre, hipotensión y choque si se administran a seres humanos. Debido a los efectos perjudiciales potenciales, es ventajoso retirar incluso cantidades pequeñas de endotoxinas de soluciones farmacológicas farmacéuticas administradas por vía intravenosa. La administración de fármacos y alimentos ("FDA") ha establecido un limite superior de 5 unidades de endotoxina (UE) por dosis por kilogramo de peso corporal en un periodo único de una hora para aplicaciones farmacológicas intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1): 223 (2000)). Cuando se administran proteínas terapéuticas en cantidades de varios cientos o miles de miligramos por kilogramo de peso corporal, como puede ser el caso con anticuerpos monoclonales , es provechoso retirar incluso cantidades traza de endotoxina. En una realización específica, los niveles de endotoxina y pirógeno en la composición son menos de 10 UE/mg, menos de 5 UE/mg, menos de 1 UE/mg, menos de 0,1 UE/mg, menos de 0,01 UE/mg o menos de 0,001 UE/mg.

La invención proporciona métodos para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección, comprendiendo dicho método: (a) administrar a un sujeto que lo necesite una dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una composición que comprenda una o más variantes de Fe y (b) administrar una o más dosis posteriores de dichas variantes de Fe, para mantener una concentración en plasma de la variante de Fe a un nivel deseable (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 µq/ml) , que se une continuamente a un antígeno. En una realización específica, la concentración en plasma de la variante de Fe se mantiene a 10 µ?/???, 15 µ?/p??, 20 µ?/???, 25 µ?/???, 30 µ?/???, 35 µ?/p??, 40 g/ml, 45 µg/ml o 50 µ?/p??. En una realización específica, dicha cantidad eficaz de variante de Fe para administrar está entre al menos 1 mg/kg y 8 mg/kg por dosis. En otra realización específica, dicha cantidad eficaz de variante de Fe para administrar está entre al menos 4 mg/kg y 5 mg/kg por dosis. En otra realización específica más, dicha cantidad eficaz de variante de Fe para administrar está entre 50 mg y 250 mg por dosis. En otra realización específica más, dicha cantidad eficaz de variante de Fe para administrar está entre 100 mg y 200 mg por dosis.

La presente invención también abarca protocolos para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección en los que se usa una variante de Fe en combinación con una terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) distinta de una variante de Fe y/o proteína de fusión variante. La invención se basa, en parte, en el reconocimiento de que las variantes de Fe de la invención potencian y tienen efecto sinérgico con, potencian la eficacia de, mejoran la tolerancia de y/o reducen los efectos secundarios provocados por otras terapias de cáncer, incluyendo quimioterapias experimentales y convencionales en la actualidad. Las terapias de combinación de la invención tienen potencia aditiva, un efecto terapéutico aditivo o un efecto sinérgico. Las terapias de combinación de la invención permiten la utilización de dosificaciones menores de ,1a terapia (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) junto con variantes de Fe para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección y/o administración menos frecuente de dichos agentes terapéuticos o profilácticos a un sujeto con una enfermedad, trastorno o infección para mejorar la calidad de vida de dicho sujeto y/o para conseguir un efecto profiláctico o terapéutico. Además, las terapias de combinación de la invención reducen o evitan efectos secundarios no deseados o adversos asociados con la administración de terapias de agentes únicos actuales y/o terapias de combinación existentes, lo que a su vez mejora la conformidad del paciente con ' el protocolo de tratamiento. Se conocen bien en la técnica numerosas moléculas que pueden utilizarse en combinación con las variantes de Fe de la invención. Véase por ejemplo, publicaciones de PGT WO 02/070007/ WO 03/075957 y Publicación de Patente de Estados Unidos 2005/064514.

La presente invención proporciona kits que comprenden una o más variantes de Fe con afinidad de unión alterada por FcyR y/o Clq y actividad ADCC y/o CDC alterada que. se unen específicamente a un antígeno conjugado o fusionado con un agente detectable, agente terapéutico o fármaco, en uno o más recipientes, para su uso en la supervisión, diagnóstico, prevención, tratamiento o alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección. 5. Ejemplos Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la práctica de la presente invención. No se pretende que limiten o definan el alcance completo de la presente invención.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoespecificos bivalentes con dominios Fe heterodiméricos .

Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo se construyeron mediante síntesis génica usando codones optimizados para expresión en mamíferos/seres humanos. Las secuencias de Fab se generaron a partir de un Ab de unión a Her2/neu conocido (Cárter P. et al. (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cáncer therapy. Proc Nati Acad Sci 89, 4285) y el Fe fue un isotipo de IgGl (SEC ID N° : 1). Los productos génicos finales se subclonaron en el vector de expresión de mamíferos pTT5 (NRC-BRI, Canadá) (Durocher, Y., Perret, S. y Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human HEK293-EBNA1 cells. Nucleic acids research 30, E9 (2002)). Las mutaciones en el dominio CH3 se introdujeron mediante mutagénesis dirigida de los vectores de molde pTT5. Véase Tabla 1, Tabla 6 y Tabla 7 para una lista de las mutaciones de dominio CH3 variante realizadas.

Para estimar la formación de heterodimeros y determinar la relación de homodimeros frente a heterodimeros, las dos cadenas pesadas de heterodimeros se diseñaron con extensiones C terminales de diferente tamaño (específicamente, la cadena A con marcador His C terminal y la cadena B con mRFP más StrepTaglI C terminal) . Esta diferencia en el peso molecular permite la diferenciación de homodimeros frente a heterodimeros en SDS-PAGE no reductor como se ilustra, en la FIGURA 25A.

Las células HEK293 se transfectaron en fase de crecimiento exponencial (de 1,5 a 2 millones de células/ml) con polietilenimina de 25 kDa 1 mg/ml acuosa (PEI, Polysciences) a una relación PEI : ADN de 2,5:1 (Raymond C. et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications . ethods. 55(1): 44-51 (2011)). Para determinar el intervalo de concentración óptimo para formar heterodímeros, el ADN se transfectó en tres relaciones separadas de las dos cadenas pesadas. Por ejemplo, esto se realizó en un volumen de cultivo de 2 mi y el ADN de transfección, comprendido por GFP 5%, ADN de esperma de salmón 45%, cadena ligera 25% y cadenas pesadas totales 25%, en que se tomaron muestras del plásmido de cadena pesada A (con marcador His C terminal) y el plásmido de cadena pesada B (con StrepTaglI C terminal más RFP) a 65%/55%/35% o 10%/20%/40%) a 3 relaciones relativas diferentes (cadena (His ) /cadena B(mRFP)) de 10%/65%; 20%/55%;' 40%/35% (se determinó que la relación de expresión 1:1 aparente de un heterodimero WT_His/WT_mRFP era cercana a la relación de ADN 20%/55%) . A las 4 a 48 horas después de la transfección en medio sin suero F17 (Gibco) , se añade peptona TN1 a una concentración final de 0,5%. Se analizó el anticuerpo expresado por SDS-PAGE para determinar la mejor relación de cadena pesada y ligera para formación de heterodímeros óptima (Véase figura 25B y C) .

Se usó una relación de ADN seleccionada, por ejemplo 50% de plásmido de cadena ligera, 25% de plásmido de cadena pesada A, 25% de cadena pesada B de AZ33 y AZ34, con GFP 5% y ADN de esperma de salmón 45% para transfectar 150 mi de cultivo celular como se ha descrito anteriormente. Las células transfectadas se recogieron después de 5-6 días con el medio de cultivo recogido después de la centrifugación a 4000 rpm y se clarificó usando un filtro de 0,45 µp?. Véase Tabla 2 posterior, para una lista del porcentaje de plásmidos de cadena ligera y pesada A y B usados en los ensayos de transfección de aumento de escala para cada uno de los anticuerpos con mutaciones de CH3 generados para análisis adicional, incluyendo determinación de pureza y temperatura de fusión.

Tabla 2: Ejemplo 2 : Purificación de anticuerpos monoespecificos bivalentes con dominios Fe heterodiméricos .

El medio de cultivo clarificado se cargó en una columna de proteina A MabSelect SuRe (GE Healthcare) y se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de PBS a pH 7,2. El anticuerpo se eluyó con 10 volúmenes de columna de tampón de citrato a pH 3,6 con las fracciones agrupadas que contenían el anticuerpo neutralizado con TRIS a pH 11. La proteína finalmente se desaló usando una columna Econo-Pac 10DG (Bio-Rad) . El marcador de mRFP C terminal en la cadena pesada B se retiró incubando el anticuerpo con enteroquinasa (NEB) a una relación de 1:10.000 durante una noche en PBS a 25°C. El anticuerpo se purificó de la mezcla por filtración en gel. Para la filtración en gel, se concentraron 3,5 mg de la mezcla de anticuerpo a 1,5 mi y se cargaron en una columna Sephadex 200 HiLoad 16/600 de 200 pg (GE Healthcare) mediante un FPLC AKTA Express a un caudal de 1 ml/min. Se usó tampón de PBS a pH 7,4 a un caudal de 1 ml/minuto. Se recogieron las fracciones correspondientes al anticuerpo purificado, se concentraron a ~lmg/ml y se almacenaron a -80 °C.

La formación de heterodimeros , en comparación con homodimeros, se ensayó usando SDS-PAGE no reductor y espectrometría de masas. Se procesó anticuerpo purificado por proteína A en un gradiente de SDS-PAGE 4-12%, gel no reductor para determinar el porcentaje de heterodimeros formados antes del tratamiento con enteroquinasa (EK) (Véase, Figura 26) . Para espectrometría de masas, todos los experimentos de Trap LC/MS (ESI-TOF) se realizaron en un sistema de HPLC Agilent 1100 en interfaz con un espectrómetro de masas Waters Q-TOF2. Se inyectaron cinco µg de anticuerpo purificado por filtración en gel en un MicroTrap proteico (1,0 por 8,0 mm) , se lavó con acetonitrilo 1% durante 8 minutos, un gradiente de 1 a 20% de acetonitrilo/ácido fórmico 0,1% durante 2 minutos, después se eluyó con un gradiente de 20 a 60% de acetonitrilo/ácido fórmico 0,1% durante 20 minutos. El eluato (30-50 µ?/minuto) se dirigió al espectrómetro con espectro adquirido cada segundo (m/z 800 a 4.000). (Véase, Figura 28).

Las variantes que tenían más del 90% de heterodímeros se seleccionaron para análisis posterior, con la excepción de AZ12 y AZ14 que tenían cada uno más del 85% de formación de heterodímero .

Ejemplo 3: Determinación de estabilidad de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fe heterodiméricos usando calorimetría de exploración diferencial (DSC) .

Todos los experimentos de DSC se llevaron a cabo usando un instrumento GE VP-Capillary . Se intercambió el tampón de las proteínas a PBS (pH 7,4) y se diluyó a 0,4 a 0,5 mg/ml con 0,137 mi cargados en la célula de muestra y se midió con una tasa de exploración de 1 °C/minuto de 20 a 100 °C. Los datos se analizaron usando el software Origin (GE Healthcare) con el fondo de tampón PBS restado (Véase, Figura 27). Véase Tabla 3 para una lista de variantes ensayadas y una temperatura de fusión determinada. Véase Tabla 4 para una lista de las variantes con una temperatura de fusión de 70 °C y superior y la Tm específica para cada variante.

Tabla 3 : Mediciones de temperatura de fusión de dominios CH3 variantes en anticuerpo IgGl que tiene 90% o más formación de heterodimeros en comparación c formación de homodimeros 5 10 15 10 15 5 15 Tabla 4 : Mediciones de temperatura de fusión de dominios CH3 variantes seleccionado en un anticuerpo IgGl 5 10 Ejemplo : Evaluación de la unión de FcgammaR usando resonancia de plasmón superficial Todos los experimentos de unión se llevaron a cabo usando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 a 25 °C con HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM y Tween 20 0,05% a pH 7,4. HER-2/neu recombinante (pl85, ErbB-2 (eBiosciences, Inc.)) se capturó en la microplaca sensora GLM activada inyectando 4,0 µ?/??? en NaOAc 10 mM (pH 4,5) a 25 µ?/minuto hasta que se hubieron inmovilizado aproximadamente 3000 unidades de resonancia (UR) con el resto de los grupos activos inactivados. Se capturaron indirectamente 40 µ?/?t?? de anticuerpos anti-HER-2 /neu purificados que comprendían los dominios CH3 variantes en la microplaca sensora uniendo la proteina Her-2/neu cuando se inyectó a 25 µ?/minuto durante 240 s (dando como resultado aproximadamente 500 UR) después de una inyección de tampón para establecer una linea basal estable. Se inyectaron concentraciones (6000, 2000, 667, 222 y 74,0 nM) de FcgammaR (CD16a (alotipo f) y CD32b) a 60 µ?/minuto durante 120 s con una fase de disociación de 180 s para obtener un conjunto de sensogramas de unión. Se determinaron los valores de KD resultantes de unión de isotermas usando el' modelo de Ajuste de Equilibrio con valores presentados como la media de tres ciclos independientes. Se realizaron comparaciones con el dominio Fe de IgGl natural y la unión se expresa como una relación de la kD WT y la kD variante (Véase, Tabla 5) .

Tabla 5 : Relación de kD de IgGl natural y anticuerpo de dominio CH3 variante que se unen de forma independiente a CD16a y CD32b Ejemplo 5 : Diseño racional de variantes de Fe usando ingeniería de Fc_CH3 - armazón 1 (la y Ib) y el desarrollo de AZ17-62 y AZ133-AZ2438 Para mejorar la variante de Fe de diseño negativo inicial AZ8 con respecto a estabilidad y pureza, se emplearon las estrategias estructurales y computacionales descritas anteriormente (Véase Figura 24) . Por ejemplo, el análisis de la función estructural en profundidad de AZ8 proporcionó un entendimiento detallado de cada una de las mutaciones introducidas de AZ8, L351Y_V397S_F405A_Y407V / K392V_T394W en comparación con IgGl humana natural e indicó que las mutaciones heterodiméricas del núcleo importantes eran L351Y_F405A_Y407V / T394W, mientras que V397S, K392V no eran relevantes para la formación de heterodimeros . Las mutaciones del núcleo (L351Y_F405A_Y407V / T394W) se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 1". El análisis reveló además que los puntos calientes de interfaz importantes que se pierden con respecto a formación de homodimeros naturales (WT) son las interacciones de WT-F405- K409, Y407-T366 y el empaquetamiento de Y407-Y407 y -F405 (Véase, Figura 29) . Esto se reflejó en el análisis de empaquetamiento, cavidades y MD, que mostró una gran diferencia conformacional en la región de bucle D399-S400-D401 (Véase, Figura 30) y las láminas ß asociadas a K370. Esto dio como resultado la pérdida de interacciones intercatenarias K409-D399 (Véase, Figura 30) y debilitamiento del enlace de hidrógeno K370 fuerte con E357 (K370 ya no está en contacto directo con S364 y E357, sino que se expone a disolvente completamente) . En el dominio CH3 de IgGl WT estas regiones se fijan a la interfaz en el borde que protege las interacciones principales de la competición del volumen del disolvente y aumenta la aparición dinámica de interacciones de van der Waals hidrófobas favorables. La consecuencia fue un área superficial internada inferior de AZ8 en comparación con WT y una mayor accesibilidad al disolvente del núcleo hidrófobo. Esto indicó que los factores más importantes para la menor estabilidad de ??8 en comparación con la estabilidad de WT eran a) la pérdida de la interacción WT-F405-K409 y el empaquetamiento de F405, y b) la pérdida de la interacción de empaquetamiento fuerte de Y407-Y407 e Y407-T366. Véase, Figura 29 En consecuencia, los inventores identificaron los motivos de secuencia/restos clave responsables de la baja estabilidad de AZ8 en comparación con WT . Para mejorar la estabilidad y especificidad de heterodimeros de AZ8 los intentos de ingeniería de diseño positivo posteriores se centraron específicamente por lo tanto en estabilizar la conformación de bucle de las posiciones 399-401 en una conformación de tipo WT más "cerrada" (Véase, Figura 30) y compensar el empaquetamiento global ligeramente reducido (más suelto) del núcleo hidrófobo en las posiciones T366 y L368 (Véase, Figura 29) .

Para conseguir esta estabilización de la conformación en bucle de las posiciones 399-401 se usó el enfoque computacional descrito para evaluar las diferentes ideas de diseño diana de los inventores. Específicamente, se analizaron tres opciones diferentes independientes para la variante de Fe AZ8 para optimizar las regiones clave identificadas para mejorar la estabilidad.- En primer lugar, se evaluó la cavidad cercana a la posición K409 y F405A para mejor empaquetamiento hidrófobo tanto para proteger el núcleo hidrófobo como para estabilizar la conformación de un bucle de 399-400 (Véase, Figura 30) . Estos incluyeron, pero sin limitación, mutaciones puntuales adicionales en -las posiciones F405 y K392. En segundo lugar, se evaluaron opciones para mejorar las interacciones electroestáticas de las posiciones 399-409, para estabilizar la conformación en bucle de 399-400 y proteger el núcleo hidrófobo. Esto incluyó, pero sin limitación, mutaciones puntuales adicionales en las posiciones T411 y S400. En tercer lugar, se evaluó la cavidad en las posiciones de empaquetamiento del núcleo T366, T394W y L368 para mejorar el empaquetamiento hidrófobo del núcleo (Véase, Figura 29) . Estos incluyeron, pero sin limitación, mutaciones puntuales adicionales en las posiciones T366 y L368. Las diferentes ideas de diseño positivo independientes se ensayaron por ordenador y las variantes mejor clasificadas usando las herramientas computacionales (AZ17-AZ62) se validaron experimentalmente para expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1- . Véase Tabla 4 para una lista de variantes de Fe de esta fase de diseño con una temperatura de fusión de 70 °C o mayor .

La variante de Fe AZ33 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fe en que el Armazón 1 se modificaba dando como resultado mutaciones de Armazón la para mejorar la estabilidad y pureza. Esta variante de Fe se diseñó basándose en AZ8 con el objetivo de mejorar el empaquetamiento hidrófobo en las posiciones 392-394-409 y 366 tanto para proteger el núcleo hidrófobo como para estabilizar la conformación en bucle de 399-400. Este heterodimero variante de Fe AZ33 tiene dos mutaciones puntuales adicionales diferentes de las mutaciones centrales de AZ8, K392M y T366I. Las mutaciones T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón la". La mutación K392M se diseñó para mejorar el empaquetamiento en la cavidad cercana a la posición K409 y F405A para proteger el núcleo hidrófobo y estabilizar la conformación en bucle de 399-400 (Véase, Figura 31) . T366I se diseñó para mejorar el empaquetamiento de núcleo hidrófobo y eliminar la formación de homodimeros de la cadena de T394 (Véase, Figura 29) . Los datos experimentales para AZ33 mostraron estabilidad mejorada significativamente sobre la variante de Fe de diseño negativo inicial AZ8 (Tm 68 °C) en que la AZ33 tiene una Tm de 74 °C y un contenido de heterodímeros de >98%. (Véase, Figura 25C) Desarrollo de variantes de Fe usando mutaciones de Armazón 1 en diseño de fase tres de heterodímeros variantes de Fe Aunque AZ33 proporciona una mejora de estabilidad y especificidad (o pureza) significativa sobre la variante de partida inicial AZ8, el análisis de los inventores indica que pueden realizarse mejoras adicionales a la estabilidad del heterodimero variante de Fe con modificaciones de aminoácidos adicionales usando los datos experimentales de AZ33 y los métodos de diseño descritos anteriormente. Las diferentes ideas de diseño se han ensayado de forma independiente con respecto a expresión y estabilidad, pero las ideas de diseño independientes son transíeribles y el heterodimero más exitoso contendrá una combinación de los diferentes diseños. Específicamente, para la optimización de mutaciones de empaquetamiento de AZ8 en la cavidad cercana a K409-F405A-K392 se han evaluado independientemente de mutaciones que optimizan el empaquetamiento central en los restos L366T-L368. Estas dos regiones 366-368 y 409-405-392 están distantes entre sí y se consideran independientes. La variante de Fe AZ33 por ejemplo se ha optimizado para empaquetamiento en 409-405-392, pero no en 366-368, porque estas mutaciones de optimización se evaluaron por separado. La comparación de las mutaciones 366-368 sugiere que T366L tiene una estabilidad mejorada sobre T366 y también T366I, la mutación puntual usada en el desarrollo de la variante de Fe AZ33. En consecuencia, los datos experimentales presentados sugieren inmediatamente la optimización adicional de AZ33 introduciendo T366L en lugar de T366I, por ejemplo. Por lo tanto, las mutaciones de aminoácidos en el dominio CH3 T366L_K392 _T394W/F405A_Y407V se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón Ib".

De manera similar se han analizado los datos experimentales completos para identificar mutaciones puntuales que puedan usarse para mejorar adicionalmente el heterodimero variante de Fe actual AZ33. Estas mutaciones identificadas se analizaron por el enfoque computacional anteriormente descrito y se clasificaron para producir la lista de heterodimeros variantes de Fe adicionales basándose en AZ33 como se muestra en la Tabla 6.

Ejemplo 6: Diseño racional de variantes de Fe usando ingeniería de Fc_CH3 - Armazón 2 (a y b) y el desarrollo de AZ63-101 y AZ2199-AZ2524 Para mejorar la variante de Fe de fase de diseño negativo inicial AZ15 con respecto a estabilidad y pureza, se emplearon las estrategias estructurales y computacionales descritas anteriormente (Véase, Figura 24) . Por ejemplo, el análisis de función estructural en profundidad de la variante de Fe AZ15 proporcionó un entendimiento detallado para cada una de las mutaciones introducidas de AZ15, L351Y_Y407A / E357L_T366A_K409F_T411N en comparación con IgGl humana natural (WT) e indicó que las mutaciones heterodiméricas de núcleo importantes fueron L351Y_Y407A / T366A_K409F, mientras que E357L, T411N no eran directamente relevantes para la formación y estabilidad de heterodimeros. Las mutaciones del núcleo (L351Y_Y407A / T366A_K409F) se denominan en este documento mutaciones de "Armazón 2". El análisis reveló además que los puntos calientes de interfaz importantes que se pierden con respecto a la formación de homodimeros naturales (WT) son el puente salino D399-K409, el enlace de hidrógeno Y407-T366 y el empaquetamiento de Y407-Y407. El análisis detallado de los inventores, proporcionado posteriormente, describe como los inventores mejoraron la estabilidad de su variante de Fe original AZ15 y las posiciones y modificaciones de aminoácidos hechas para conseguir estas variantes de Fe con estabilidad mejorada.

Desarrollo de variantes de Fe usando mutaciones de Armazón 2 y el desarrollo adicional de mutaciones de Armazón 2a.

El análisis informático de los inventores indicó un empaquetamiento no óptimo de las mutaciones de la variante de Fe AZ15 K409F_T366A_Y407A y un empaquetamiento reducido global del núcleo hidrófobo, debido a la pérdida de las interacciones WT-Y407-Y40 . Los intentos de diseño positivo en la fase de ingeniería posterior se centraron en mutaciones puntuales para compensar estos déficits de empaquetamiento en la variante de Fe inicial AZ15. Los restos diana incluyeron las posiciones T366, L351 y Y407. Se ensayaron diferentes combinaciones de estos por ordenador y las variantes de Fe mejor clasificadas usando las herramientas computacionales (AZ63-AZ70) se variaron experimentalmente con respecto a expresión y estabilidad como se ha descrito en los Ejemplos 1-4.

La variante de Fe AZ70 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fe en que el armazón 2 se modificó dando como resultado mutaciones de Armazón 2a para mejorar la estabilidad y pureza. Esta variante de Fe se diseñó basándose en AZ15 con el objetivo de conseguir mejor empaquetamiento en el núcleo hidrófobo como se ha descrito anteriormente. La variante de Fe AZ70 tiene las mismas mutaciones de núcleo de Armazón 2 (L351Y_Y407A / T366A_K409F) como se ha descrito anteriormente excepto que T366 se mutó a T366V en lugar de T366A (FIGURA 33) . La mutación L351Y mejora la temperatura de fusión de la variante 366A_409F/407A de 71,5 °C a 74 °C, y el cambio adicional de 366A a 366V mejora la Tm a 75,5 °C (Véase, AZ63, AZ64 y AZ70 en la Tabla 4, con una Tm de 71,5 °C, 74 °C y 75,5 °C, respectivamente). Las mutaciones del núcleo (L351Y_Y407A / T366V_K409F) se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 2a". Los datos experimentales para la variante de Fe AZ70 mostraron estabilidad significativamente mejorada sobre la variante de Fe de diseño negativo inicial AZ15 (Tm 71 °C) en que AZ70 tiene una Tm de 75,5 °C y un contenido de heterodimero de >90% (FIGURA 33 y 27) .

Desarrollo de variantes de Fe usando mutaciones de Armazón 2 y el desarrollo adicional de mutaciones de Armazón 2b.

La simulación de Dinámica Molecular (MD) y análisis de empaquetamiento mostraron una conformación más "abierta" preferida del bucle 399-400, que se debió probablemente a la pérdida del puente salino WT K409-D399. Esto también da como resultado la D399 insatisfecha, que a su vez prefirió una interacción compensatoria con K392 e indujo una conformación más "abierta" del bucle. Esta conformación de bucle más "abierta" da como resultado un empaquetamiento reducido global y accesibilidad a disolvente mayor de los restos de interfaz del dominio CH3 del núcleo, que a su vez desestabilizaron significativamente el complejo heterodimérico. Por lo tanto, uno de los intentos de diseño positivo diana fue la fijación de este bucle en una conformación de tipo WT más "cerrada" mediante mutaciones puntuales adicionales que compensan la pérdida del puente salino D399-K409 y las interacciones de empaquetamiento de K409. Los restos diana incluyeron las posiciones T411, D399, S400, F405, N390, K392 y combinaciones de las mismas. Se ensayaron diferentes estrategias de empaquetamiento, ingeniería positiva hidrófoba y electroestática por ordenador con respecto a las posiciones anteriores y las variantes de Fe mejor clasificadas determinadas usando las herramientas computacionales (AZ71-AZ101) se validaron experimentalmente con respecto a expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1-4.

La variante de Fe AZ94 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fe en que el Armazón 2 se modifica dando como resultado mutaciones de Armazón 2b junto con mutaciones puntuales adicionales para mejorar la estabilidad y pureza. Esta variante de Fe se diseñó basándose en AZ15 con el objetivo de fijar el bucle 399-400 en una conformación de tipo WT más "cerrada" y compensar la pérdida del puente salino D399-K409 como se ha descrito anteriormente. La variante de Fe AZ94 tiene cuatro mutaciones puntuales adicionales del Armazón 2 (L351Y_Y407A / T366A_K409F) y devuelve L351Y a L351 natural saliente (Y407A / T366A_K409F) como las mutaciones del núcleo para esta variante de Fe. Las mutaciones del núcleo Y407A / ; T366A K409F se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 2b". Las cuatro mutaciones puntuales adicionales de AZ94 son K392E_T411E / D399R_S400R. Las mutaciones T411E / D399R se obtuvieron por ingeniería genética para formar un puente salino adicional y compensar la pérdida de la interacción 409 / D399 (FIGURA 34). Adicionalmente, este puente salino se diseñó para evitar la formación de homodímeros desfavoreciendo las interacciones entre cargas en ambos homodímeros potenciales. Se pretendía que las mutaciones adicionales K392E / S400R formaran otro puente salino y de este modo fijar adicionalmente el bucle 399_400 en una conformación de tipo WT más "cerrada" (FIGURA 34) . Los datos experimentales para AZ94 mostraron estabilidad y pureza mejoradas sobre la variante de Fe de diseño negativo inicial AZ15 (Tm 71 °C, >90% de pureza) en que la variante de Fe AZ94 tiene una Tm de 74 °C y un contenido de heterodimeros o pureza de >95%.

Desarrollo de variantes de Fe usando mutaciones de Armazón 2 en diseño de fase tres de heterodimeros variantes de Fe Ambas variantes de Fe AZ70 y AZ94 proporcionan una mejora significativa en estabilidad y pureza sobre la variante de Fe de diseño negativo inicial AZ15, pero el análisis de los inventores y la comparación de AZ70 y AZ94 indican directamente que pueden realizarse mejoras adicionales a la estabilidad del heterodímero variante de Fe con modificaciones de aminoácidos adicionales. Por ejemplo, las variantes de Fe AZ70 y AZ94 se diseñaron para dirigirse a dos regiones no optimizadas distintas en la variante inicial AZ15, lo que se consiguió mejorando el empaquetamiento en el núcleo hidrófilo y realizando mutaciones fuera de los restos de interfaz del núcleo dando como resultado puentes salinos adicionales y enlaces de hidrógeno para . estabilizar la configuración del bucle en las posiciones 399-401. Las mutaciones puntuales adicionales de las variantes de Fe AZ70 y AZ94 están distantes entre si y son por lo tanto independientes y transíeribles a otras variantes de Fe diseñadas en torno a las mismas mutaciones del núcleo de Armazón 2, incluyendo mutaciones 2a y 2b. Específicamente, AZ70 solamente porta las mutaciones de núcleo optimizadas L351Y_Y407A / T366A_K409F, pero ningún puente salino adicional, mientras que AZ94 comprende cuatro mutaciones electroestáticas adicionales (K392E_T411E / D399R_S400R) , pero tiene una mutación menos en la interfaz de núcleo hidrófobo (?407?· / T366A_K409F) . Estas mutaciones de armazón 2b son menos estables que AZ70 (Véase, por ejemplo AZ63, que tiene mutaciones de núcleo equivalentes como AZ94 y Tm de 72 °C) , pero se compensan por la adición de mutaciones K392E_T411E / D399R_S400R. Los datos de estabilidad y pureza experimentales presentados indican que la combinación de las mutaciones de AZ70, que optimiza el núcleo hidrófobo, y las mutaciones electroestáticas de · AZ94 debería mejorar adicionalmente la estabilidad y pureza de los heterodímeros variantes de Fe. De manera similar los datos experimentales completos para variantes de Fe de Armazón 2 (AZ63-101) se han analizado para identificar mutaciones puntuales que puedan usare para mejorar adicionalmente los heterodímeros variantes de Fe AZ70 y AZ94. Estas mutaciones identificadas se analizaron adicionalmente mediante el enfoque computacional anteriormente descrito y se clasificaron para producir la lista de heterodimeros variantes de Fc adicionales basándose en AZ70 y AZ94 como se muestra en la Tabla 7.

Ejemplo 7: Efecto de CH3 heterodimérico en la unión de FcgR Como un ejemplo prototipico de la actividad de Fc heterodimérico con FcgR, los inventores han ensayado dos anticuerpos variantes con región Fc heterodimérica A:K409D_K392D/B: D399K_D356K (Control 1 (het 1 en la Figura 35)) y A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W (Control 4 (het 2 en la Figura 35) ) con ramas de Fab de unión a Her2 en un ensayo SPR descrito en el Ejemplo 4 con respecto a unión de FcgR. Como se muestra en la Figura 35, los inventores observan que ambas regiones Fc heterodiméricas se unen a los diferentes receptores Fcgamma con la misma fuerza relativa que la región Fc IgGl natural, pero, en general, la región Fc heterodimérica se unió a cada uno de los FcgR ligeramente mejor que el anticuerpo natural. Esto indica que las mutaciones en la interfaz de CH3 de Fc pueden influir en la fuerza de unión de la región Fc para receptores Fcgamma en todos los dominios CH2 como se observa en las simulaciones y análisis de dinámica molecular de los inventores.

Ejemplo 8: Efecto de las mutaciones asimétricas en CH2 de un Fc heterodimérico en la unión con FcgR Se sabe que la mutación de Serina en la posición 267 en el dominio CH2 de la región Fe a un ácido aspártico (S267D) potencia la unión con los receptores Fcgamma IlbF, IlbY y IlaR cuando se introducen de una manera homodimérica en las dos cadenas de dominio CH2. Esta mutación puede introducirse solamente en uno de los dominios CH2 en una molécula de Fe heterodimérica para obtener aproximadamente la mitad de la mejora en fuerza de unión en relación con cuando esta mutación se introduce en un Fe de CH2 homodimérico como indican los datos presentados en la Figura 36A. Por otro lado, la mutación E269K en un dominio CH2 homodimérico de Fe evita la unión de la región Fe con FcgR. Los inventores presentan un esquema para potenciar la manipulación de la fuerza de unión de la región Fe para los receptores Fcg mediante la . introducción asimétrica de estas mutaciones favorables y desfavorables en una de las dos cadenas en el dominio CH2 del Fe. La introducción de mutación de E269K de una manera asimétrica en una cadena CH2 en un Fe heterodimérico actúa como un conductor de polaridad bloqueando la unión del FcgR en la cara en la que está presente, dejando la otra cara del Fe interaccionar con el FcgR de una manera normal. Los resultados de esta experimentación se presentan en la Figura 36?. La oportunidad de alterar selectivamente la fuerza de unión mediante ambas cadenas de Fe de una manera independiente proporciona una mayor oportunidad para manipular la fuerza de unión y selectividad entre Fe y receptores Fcg. Por lo tanto, dicho diseño asimétrico de mutaciones en el dominio CH2 permite a los inventores introducir estrategias de diseño positivas y negativas para favorecer o desfavorecer ciertos modelos de unión, proporcionando mayor oportunidad para introducir selectividad.

En un experimento posterior, los inventores han alterado el perfil de selectividad del mutante Fe de base S239D_D265S_I332E_S298A que muestra fuerza de unión aumentada con los receptores Fcgamma IIIaF y IlIaV mostrando todavía unión más débil con los receptores Fcgamma IlaR, IlbF y IlbY. Esto se muestra en el perfil de unión mostrado en la Figura 36B. Introduciendo mutaciones asimétricas E269K en la cadena A y evitando la mutación I332E en la cadena B, los inventores son capaces de generar un nuevo perfil de unión de FcgR que debilita adicionalmente la unión con el receptor lia y Ilb y hace al Fe más específico para la unión con el receptor Illa.

En otro ejemplo mostrado en la Figura 36C, las mutaciones asimétricas se destacan en relación con el Fe homodimérico que implica la mutación S239D/K326E/A330L/I332E/S298A en el dominio CH2. En relación con el Fe de IgGl natural, esta variante muestra unión aumentada con el receptor lia pero también se une a los receptores lia y Ilb de forma ligeramente más fuerte que el Fe natural. La introducción de estas mutaciones de una manera asimétrica A: S239D/.K326E/A330L/I332E y B:S298A reduciendo a la vez la unión de Illa, también aumenta la unión con el receptor Ila/IIb, perdiendo selectividad en el proceso. Introduciendo una mutación E269K asimétrica en esta variante heterodimérica, es decir A: S239D/K326E/A330L/I332E/E269K y B:S298A, los inventores pueden reducir la unión de Ila/IIb de nuevo a niveles naturales. Esto destaca el hecho de que el uso de las mutaciones asimétricas en el dominio CH2 de Fe puede proporcionar una proteina significativa para selectividad de FcgammaR mejorada por diseño.

Los reactivos empleados en los ejemplos están disponibles en el mercado o pueden prepararse usando instrumentación disponible en el mercado, métodos o reactivos conocidos en la técnica. Los ejemplos anteriores ilustran diversos aspectos de la invención y práctica de los métodos de la invención. No se pretende que los- ejemplos proporcionen una descripción exhaustiva de las muchas realizaciones diferentes de la invención. Por lo tanto, aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle como ilustración y ejemplos para fines de claridad de entendimiento, los expertos habituales en la materia entenderán fácilmente que pueden realizarse muchos cambios y modificaciones a la misma sin alejarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adj untas .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la presente memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en la memoria descriptiva en el mismo grado que si se indicara específica e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorpora en el presente documento por referencia.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

1. - Un heteromultimero aislado que comprende una región Fe heterodimérica, caracterizado por que la región Fe heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos caracterizado por que dichas mutaciones de aminoácidos promueven la formación de región Fe heterodimérica con estabilidad aumentada en comparación con un dominio CH3 que no comprende mutaciones de aminoácidos, y caracterizado por que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor.

2. - Un heteromultimero aislado de la reivindicación 1, caracterizado por que la región Fe heterodimérica comprende además un dominio CH2 variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas para promover la unión selectiva de un receptor Fcgamma.

3. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 2, caracterizado por que el dominio CH2 variante se une selectivamente a receptor FcgammalIIa en comparación con el dominio CH2 natural.

4. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 1, caracterizado por que la región Fe heterodimérica no comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 en relación con una región Fe natural.

5. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 1, caracterizado por que la región Fe heterodimérica comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 variante en relación con una región Fe natural, a condición de que la temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o mayor sea en ausencia del enlace disulfuro adicional.

6. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 1, caracterizado por que la región Fe heterodimérica tiene una pureza mayor de aproximadamente el 90%.

7. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 1, caracterizado por que la región Fe heterodimérica tiene una pureza de aproximadamente el 98% o mayor.

8. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 1, caracterizado por que la Tm es de aproximadamente 74 °C o mayor .

9. - El heteromultimero según la reivindicación 1, caracterizado por que la región Fe heterodimérica tiene una pureza de aproximadamente el 98% o mayor y la Tm es de aproximadamente 73 °C.

10. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 1, caracterizado por que la región Fe heterodimérica tiene una pureza de aproximadamente el 90% o mayor y la Tm es de aproximadamente 75 °C.

11. - El heteromultimero aislado según la reivindicación I, caracterizado por que un primer polipéptido de dominio CH3 comprende modificación de aminoácidos en las posiciones F405 y Y407 y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende modificación de aminoácidos en la posición T394.

12. - El heteromultimero aislado según la reivindicación II, caracterizado por que uno de dicho primer y segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos de la posición Q347 y el otro polipéptido de dominio CH3 comprende modificación de aminoácidos en la posición K360.

13. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 11, caracterizado por que al menos un polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos en al menos una de N390 y S400.

14. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 11, caracterizado por que uno de dicho primer y segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos de T350V.

15. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 11, caracterizado por que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o mayor y el . heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 95% o mayor .

16. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 11, caracterizado por que el primer polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos en la posición L351.

17. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 11, caracterizado por que el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de al menos una de las posiciones T366 y K392.

18. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 11, caracterizado por que uno de dicho primer y segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos de D399R o D399K y el otro polipéptido de dominio CH3 comprende uno o más de T411E, T411D, K409E, 'K409D, K392E y K392D.

19. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 18, caracterizado por que uno de dicho primer y segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos de T350V.

20. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 11, caracterizado por que el primer polipéptido de dominio CH3 comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, F405A y Y407V, y el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de T366L, T366I, K392L, K392M y T394W.

21.- El heteromultimero aislado según la reivindicación 20, caracterizado por que uno de dicho primer y segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos de T350V.

22. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 18, caracterizado por que el primer polipéptido de dominio CH3 comprende una · o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, F405A y Y407V, y el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de T366L, T366I, K392L, K392M y T394W.

23. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 1, caracterizado por que un primer polipéptido de dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones D399 y Y407 y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones K409 y T411.

24. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 23, caracterizado por que uno de dicho primer y segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos de T350V.

25. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 23, caracterizado por que el primer polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos en la posición L351 y el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificaciones de aminoácidos en la posición T366 y -K392.

26. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 23, caracterizado por que el primer polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos en la posición S400 y el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos en la posición N390.

27. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 23, caracterizado por que el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o mayor y el heterodimero tiene una pureza de aproximadamente el 95% o mayor .

28. - El heteromultimero aislado según la reivindicación 23, caracterizado por que dicho primer polipéptido de dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I y Y407V, y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos seleccionadas de T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D y T411E.

29. - El heteromultímero aislado según la reivindicación 25, caracterizado por que dicho primer polipéptido de dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, D399R, D399K, Y407A, Y407I y Y407V, y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos seleccionadas de T366V, T366I, T366L, T366M, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D y T411E.

30. - El heteromultímero aislado según la reivindicación 25, caracterizado por que uno de dicho primer y segundo polipéptido de dominio CH3 comprende además modificación de aminoácidos de T350V.