CN117320752A - 具有改善的半衰期的经修饰FcRn结合片段 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及具有改善的半衰期的经修饰FcRn结合片段、特别是包含所述经修饰FcRn结合片段的融合蛋白和多肽，以及所述融合蛋白的制造方法及其在治疗方法中的用途。

Description

具有改善的半衰期的经修饰FcRn结合片段
技术领域
本披露涉及具有改善的半衰期的经修饰FcRn结合片段、特别是包含所述经修饰FcRn结合片段的融合蛋白和多肽，以及所述融合蛋白的制造方法及其在治疗方法中的用途。
背景技术
免疫球蛋白Fc区是由两组CH2和CH3结构域组成的同源二聚体，并且已被用于产生具有高表达产率、简化纯化过程和延长血清半衰期的双臂蛋白融合物。然而，尝试使用具有一组CH2和CH3结构域的单体Fc生成单臂融合蛋白，通常受到一些挑战如与FcRn结合减弱或部分单体形成的困扰。
已进入临床的单价形式的Fc融合蛋白(Alprolix-凝血因子IX融合物，Eloctate-因子VIII融合物)或单价抗体(奥那妥组单抗(Onartuzumab)-抗cMet单臂mAb)利用Fc区，该Fc区采用栓系或“杵臼结构(knobs-into-hole)”技术被工程化以形成异源二聚体。这些技术与其他异源二聚体Fc技术都依靠强大的纯化过程来去除不需要的链配对并实现均质融合蛋白。为了寻找旨在简化产品开发的替代方法，已经在工程化具有仅由一组CH2和CH3结构域组成的单体Fc模式的融合蛋白平台方面进行了大量努力，这通过减弱相互作用或通过在Fc中的CH3-CH3二聚体界面处添加聚糖产生空间位阻来实现。到目前为止，这些方法中的大多数都在几个方面遇到了挑战，包括溶解度和稳定性、FcRn结合的丧失或缺乏均质性。此外，通过动态光散射观察到许多先前工程化的单体Fc分子具有聚集的趋势，这突出了在弱化同源二聚体界面后稳定单体构象的挑战。在工程化的单体Fc模式中，仅报道了两种分子具有均质性和稳定性可证明的晶体结构。其中之一是通过添加阻断CH3-CH3相互作用的糖基化位点来稳定的单体。另一种是衍生自在先前发现的基础上合理设计的IgG4噬菌体文库的单体Fc(Shan等人(2016)PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]11(8)：e0160345)。然而，已经注意到第二平台可以在高浓度下寡聚，这可能会破坏其对需要以高浓度递送的药品的效用。
由于批准的生物治疗剂的日益增加的优先性以及它们的施用模式和使用机制的扩展，仍然需要开发单价形式的Fc融合蛋白的稳健平台。例如，基因疗法应用和可吸入产品都是生物治疗模式的丰富发展领域。然而，关于在包装编码治疗剂的DNA的能力或者在肺中有效生物分布的最佳大小方面，两者都具有大小方面限制。此外，产生与单克隆抗体具有相似药代动力学或药效学特性的较小分子通常对改善商业制造产量和降低商品成本具有吸引力。
因此，仍然需要提供单价形式的Fc融合蛋白。
发明内容
本披露涉及令人惊讶的发现，即FcRn-CH3二聚化界面的修饰改善了FcRn结合片段的单体化。因此，这些FcRn结合片段当用于需要或期望衍生自Fc区的单价FcRn结合片段的融合蛋白、多肽或FcRn结合片段-非蛋白质药剂缀合物(本文中称为“分子”)时，具有改善的可开发性特征。
因此，本披露提供了融合蛋白，其包含IgG分子的Fc区的FcRn结合片段，其中该FcRn结合片段包含：位置351处的苯丙氨酸(F)；位置354处的精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)或蛋氨酸(M)；位置366处的精氨酸(R)；位置395处的赖氨酸(K)；位置405处的精氨酸(R)；以及位置407处的谷氨酸(E)，其中氨基酸编号根据EU索引。已经发现，用这些氨基酸取代这些位置中每一个的野生型残基改善FcRn结合片段的单体稳定性。
在另一方面，本披露提供了多肽，其至少包含IgG分子的Fc区的FcRn结合片段，其中该FcRn结合片段包含：位置351处的苯丙氨酸(F)；位置354处的精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)或蛋氨酸(M)；位置366处的精氨酸(R)；位置395处的赖氨酸(K)；位置405处的精氨酸(R)；以及位置407处的谷氨酸(E)，其中氨基酸编号根据EU索引。
在另一方面，本披露提供了分子，其包含与IgG分子的Fc区的FcRn结合片段缀合的非蛋白质药剂，其中该FcRn结合片段包含：位置351处的苯丙氨酸(F)；位置354处的精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)或蛋氨酸(M)；位置366处的精氨酸(R)；位置395处的赖氨酸(K)；位置405处的精氨酸(R)；以及位置407处的谷氨酸(E)，其中氨基酸编号根据EU索引。
在另一方面，本披露提供了编码与所述分子缀合的所述融合蛋白或多肽或FcRn结合片段的核酸。
在另一方面，本披露提供了包含所述核酸的载体。
在另一方面，本披露提供了包含所述载体或核酸的宿主细胞。
在另一方面，本披露提供了通过从所述宿主细胞表达所述FcRn结合片段的融合蛋白、多肽并从中纯化来产生所述用于在所述分子中使用的FcRn结合片段的融合蛋白、多肽的方法。
在另一方面，本披露提供了用于在疗法中使用的融合蛋白、多肽或分子。
在另一方面，本披露提供了融合蛋白、多肽或分子在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
在另一方面，本披露提供了治疗方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的融合蛋白、多肽或分子。
附图说明
图1A显示了野生型IgG4、来自先前噬菌体文库活动的MFc1和MFc2、用CH3突变集替换MFc1 CH2结构域中的YTE突变的T1变体、以及MFc3和MFc4的最终序列中CH2和CH3结构域的序列比对。
图1B显示了T1的晶体结构。
图1C显示了T1的放大视图，详细说明了在Thr350/Leu440和Gln355/Glu356中形成的一小组氢键。
图2A显示了野生型IgG4、T1和T1-lib中CH2和CH3结构域的序列比对，T1-lib是一组靶向残基S354的点突变变体。
图2B显示了代表性SEC-MALS分析，其显示T1点突变体的分子量为约26-27kDa，具有良好的均质性。
图2C显示了T1精细突变体之间的DSF比较，以鉴定具有稍高热稳定性的S354E和S354D。
图3显示了无糖基化形式的新单体Fc，即MFc3(N297D)的晶体结构。MFc3(橙色)与MFc2(或C4n)的先前解析结构(浅紫色)的重叠表明，两者都保持了相似的单体Fc结构，并且S354E突变没有引起Fc区结构的任何显著变化。按照设计，谷氨酸侧链由于S354E突变凸出到T1中观察到的任何可能的二聚体相互作用中。
图4A显示了MFc3(橙色)和FcRn(蓝色)/β2-巨球蛋白(粉红色)复合物的结构探察(structural interrogation)。
图4B显示了MFc3(橙色)和FcRn(蓝色)之间的结合界面。氢键用虚线表示。
图4C显示了MFc4(绿色)和FcRn(蓝色)/β2-巨球蛋白(粉红色)复合物。
图4D显示了MFc4(绿色)和FcRn(蓝色)之间的结合界面。氢键用虚线表示。
图4E是显示参与受体结合界面的每个MFc残基的微分溶剂化能ΔiG(kcal/mol)贡献的热图。正值越高表明单体Fc结合表面的溶剂化效应越强。
图5A显示了基于单体Fc的单价双特异性抗体的卡通图。
图5B是Fab-MFc1-scFv和Fab-MFc4-scFv的SEC-MALS分析，显示了测得的分子量为约100kDa，多分散性为1.001。
图5C显示了使用生物层干涉法的并行结合分析，证明了Fab和scFv部分与重组抗原的预期结合活性。
图6A是单体Fc-双特异性抗体的体内小鼠PK分析。基于并行Fab和Fc区结合，绘制Fab-MFc1-scFv、Fab-MFc4-scFv、Fab-MFc1和IgG1对照的hFcRn转基因小鼠血清清除曲线。
图6B显示了通过利用模型201进行的非隔室分析确定的PK参数。AUCINF＝从时间0到无穷大的血浆浓度与时间图的浓度-时间曲线下面积；CL＝清除率；Cmax＝峰值浓度；t1/2＝终末半衰期。
具体实施方式
定义
如在本说明书中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该”具体地还涵盖它们所提及的术语的复数形式，除非本内容清楚地另外指明。
术语“约”或“大约”意指如由本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差，这部分取决于如何测量或确定该值。在某些情况下，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些情况下，术语“约”或“大约”意指给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。每当术语“约”或“大约”位于一系列的两个或更多个数值中的第一个数值之前时，应理解术语“约”或“大约”适用于该系列中的每个数值。在“约”与氨基酸位置结合使用的情况下，它表示在指定位置的1、2、3、4、5或10个氨基酸内。
“氨基酸缺失”或“缺失”是指去除亲本序列中存在的氨基酸残基。可以例如通过本领域已知的重组方法来缺失亲本序列中的氨基酸。因此，提及“位置X处缺失”是指在位置X处存在的氨基酸的缺失。缺失类型可以根据模式AX描述，其中A是对应于天然存在于位置X处的氨基酸的单个字母代码，并且A是缺失的氨基酸残基。因此，L234将是指位置234处的亮氨酸氨基酸(L)的缺失。在这样的情况下，残基233和235随后将按顺序编码。
“氨基酸取代”或“取代”是指用另一个氨基酸残基替换存在于亲本序列中的氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来取代。因此，提及“在位置X处取代(substitution/substitutions at position X)”是指用替代性氨基酸残基取代存在于位置X处的氨基酸。取代类型可以根据模式AXY描述，其中A是对应于天然存在于位置X处的氨基酸的单个字母代码，并且A是取代的氨基酸残基。因此，L234F将是指用苯丙氨酸(F)取代在位置234处的亮氨酸氨基酸(L)。
“抗体”在最广泛的意义上使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性即可。免疫球蛋白，例如免疫球蛋白G(IgG)是抗体的实例。抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为a、8、E、y和11。
“抗原结合结构域”是指除了完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗原结合结构域的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、F(ab')2、Fab'-SH、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)以及由抗原结合片段形成的多特异性抗体。关于某些抗原结合结构域的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.[自然医学]9：129-134(2003)。有关scFv片段的综述，参见例如Pluckthün，在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学]第113卷，Rosenburg和Moore主编(Springer-Verlag，New York[纽约施普林格出版社])，第269-315页(1994年)中；也参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.[自然医学]9：129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90：6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.[自然医学]9：129-134(2003)中进行了描述。
“EU索引”是指Kabat等人的EU编号索引(Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]，第5版，1991NIH公布号91-3242，将该文献通过引用以其全文并入本文)。本文披露的FcRn结合片段的氨基酸残基根据该编号系统进行编号。
“Fab”是指包含配对的VH-CH1和VL-CL的抗体片段。该术语涵盖包含非规范序列(non-canonical sequence)变体的Fab，这些非规范序列变体是如典型地与高序列变异性相关的序列区外的Fab内的氨基酸取代、缺失或插入。例如，Fab变体包括在VH或VL构架区或CH1或CL结构域中包含非规范氨基酸或序列改变的Fab。这样的改变可以包括非规范半胱氨酸或其它可衍生的氨基酸的存在，其可用于将所述Fab变体与异源部分缀合。其它这样的改变包括非规范多肽接头的存在，这些非规范多肽接头是在两个结构域之间共价桥接的多肽序列。例如，Fab变体可包含将CH1结构域共价附接至VL结构域或将CL结构域共价附接至VH结构域的接头多肽，使得Fab可表达为单一多肽链。
“Fc区”或“Fc结构域”是指免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区。它不具有抗原结合活性，但含有碳水化物部分和针对补体和Fc受体(包括FcRn受体)的结合位点(参见下文)。该Fc区含有整个的第二恒定结构域CH2(人IgG的残基231-340，根据EU索引)和第三恒定结构域CH3(残基341-447)。人IgG1 Fc区的参考序列可经由UniProtKB登录号P01857找到。人IgG4 Fc区的参考序列可经由UniProtKB登录号P01861找到。
“FcRn结合片段”是指Fc区中与FcRn受体结合的片段。FcRn结合片段可包括涉及结合FcRn的重链CH2-CH3区或铰链CH2-CH3区的部分(参见Roopenian等人，NatureRev.Immunol.[自然评论免疫学]7：715-725(2007))。
“FcRn受体”或“FcRn”是指这样的Fc受体(“n”指示新生儿)：已知该Fc受体涉及母体IgG通过人或灵长类动物胎盘或卵黄囊(兔类)向胎儿的转移，以及由初乳通过小肠向新生儿的转移。还已知的是，FcRn通过结合IgG分子并且使它们再循环到血清中来涉及恒定血清IgG水平的维持。FcRn与天然存在的IgG1、IgG2和IgG4分子的结合具有严格地pH依赖性，其中在pH 6下具有最佳结合。IgG3具有位置435处的已知变异(即，人IgG具有R435而不是在人IgG1、IgG2和IgG4中发现的H435)，这可导致pH 6下的结合降低。FcRn包含两个多肽的异源二聚体，这两个多肽的分子量分别为大约50kD和15kD。50kD多肽的细胞外结构域与主要组织相容性复合物(MHC)I类α链相关并且15kD多肽显示为非多态性β2-微球蛋白(β2-m)。除了胎盘和新生儿肠之外，FcRn还在各种物种的各种组织以及各种类型的内皮细胞系中表达。FcRn还在人成人血管内皮、肌肉脉管系统和肝血窦中表达，并且表明内皮细胞可能对人和小鼠中的血清IgG水平的维持是最具有作用的。
“融合蛋白”是指包含第一结构域的嵌合多肽，该第一结构域连接到在自然状态下不与其天然连接的第二结构域。融合蛋白可以包含两个以上的结构域。
如本文所用，“铰链-Fc区”、“Fc-铰链区”、“铰链-Fc结构域”或“Fc-铰链结构域”可互换地使用并且是指IgG分子的由Fc区(残基231-447，根据EU索引编号)和从Fc区的N末端延伸的铰链区(残基216-230，根据EU索引编号)组成的区。
“宿主细胞”是指用核酸分子转染或用噬菌粒或噬菌体感染的特定受试者细胞以及这样的细胞的后代或潜在后代。这样的细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同，这是由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或将核酸分子整合到宿主细胞基因组中引起的。
“连接的”、“融合的”或“融合”可互换地使用。这些术语是指通过任何手段(包括化学缀合或重组手段)将两个或更多个元件或组分连接在一起。
“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸聚合物并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和它们的类似物。
“ScFv”是指包含抗体的VH/VL结构域配对的抗体片段。scFv包含VH和VL结构域之间的多肽接头。scFv还可以包含非经典氨基酸序列变体，例如工程化半胱氨酸。scFv可以包含一对用于结构域内二硫键形成的工程化半胱氨酸。
“受试者”是指动物、人或非人，根据本发明的方法向其提供治疗。考虑了兽医和非兽医应用。该术语包括但不限于哺乳动物，例如人、其他灵长类动物、猪、啮齿动物(比如小鼠和大鼠)、兔、豚鼠、仓鼠、牛、马、猫、狗、绵羊和山羊。典型的受试者包括人、农场动物和家养宠物(比如猫和狗)。优选的受试者是人。
“治疗有效量”是指对“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或障碍有效的融合蛋白、多肽、分子或其药物组合物的量。
“治疗(treating/treatment/to treat)”是指(1)使得诊断的病理性病症或障碍被治愈、减缓、减轻症状和/或停止进展的治疗措施以及(2)防止和/或减缓所靶向的病理学病症或障碍的发展的预防性或防止性措施。因此，需要治疗的那些包括已患有障碍的那些；倾向于患有障碍的那些；以及在他们中需要预防障碍的那些。在某些方面中，根据本披露的方法，如果患者表现出例如疾病或病症(例如某种类型的癌症)的全部、部分或暂时缓解，则受试者被成功“治疗”该疾病或病症(例如癌症)。
“载体”是指构建体，其能够在宿主细胞中递送并在某些方面表达一个或多个目的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体以及某些真核细胞(例如生产细胞)中的DNA或RNA表达载体。
FcRn结合片段
Fc区是促进一系列抗体介导的功能的抗体的非抗原结合组分。一个特殊的功能是与FcRn受体结合以促进抗体循环来调节抗体半衰期。在内体pH下，Fc区和FcRn之间的更高亲和力结合促进抗体从酸性内体的运输，以拯救抗体免于溶酶体降解。
本披露涉及开发以单体形式稳定的FcRn结合片段，其可用于延长一系列治疗方式的半衰期。这种增强是通过使Fc区的FcRn循环特性以单体形式实现来实现的。FcRn结合片段可用于创建融合蛋白，以扩展受益于FcRn循环的治疗方式库。
因此，本披露提供了IgG分子的Fc区的FcRn结合片段。FcRn结合片段包括位置351处的F，位置354处的R、K、D、E、F、Y、P、G、L或M，位置366处的R，位置395处的K，位置405处的R和位置407处的E。氨基酸编号根据EU索引。
实例表明，相对于IgG分子的Fc区的野生型(wt)序列，这些氨基酸取代改善了FcRn结合片段的单体稳定性。wt抗体中的Fc区典型地以二聚化形式存在。当FcRn结合片段被用于融合蛋白中时，改善的单体稳定性是有利的，其中期望治疗性蛋白质是单体的(例如，在基因疗法应用中或用于通过吸入递送，其中包装尺寸限制或雾化特性阻碍了经由这些途径施用标准抗体)。与分离具有四级结构的治疗性蛋白质相比，用于与非蛋白质药剂缀合的融合蛋白、多肽或FcRn结合片段的表达和纯化还可以改善以大规模制造的产量。
通常，序列中每个指定位置的氨基酸是非规范的，这意味着它们典型地不会在野生型Fc区(特别是野生型人Fc区)的指定位置找到。可以使用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将氨基酸修饰(例如，取代、缺失或插入)工程化到序列中。
因此，本披露提供了IgG分子的Fc区的FcRn结合片段。FcRn结合片段包含以下氨基酸取代：位置351处的F，位置354处的R、K、D、E、F、Y、P、G、L或M，位置366处的R，位置395处的K，位置405处的R和位置407处的E。氨基酸编号根据EU索引。
除非本文另有说明，否则提及Fc区中特定位置的特定氨基酸(根据EU索引编号)意味着该氨基酸是与天然序列相比在该特定位置的取代。
在一些情况下，FcRn结合片段进一步包含位置354处的R、K、D或E，任选地D或E，其中编号根据EU索引。实例表明，S354有助于FcRn结合片段在高浓度下的二聚化。对于作为高浓度溶液通过皮下注射施用的特定治疗剂，高浓度下高阶物质的形成可能是不希望的。某些疗法可能需要施用相对高的(例如，超过300mg)量才能达到治疗效果。高量可能需要高浓度配制品来减少注射体积。对于患者来说，通常不希望较大的注射体积。高浓度下高阶物质的形成可能会增加粘度，当药物产品从加压装置(例如预填充注射器)施用时，这可能会产生问题。此外，如果在制造过程中(例如在过滤或分馏期间)损失了高阶物质，则高浓度下更高的单体纯度可能会提高产量。在一些情况下，FcRn结合片段进一步包含位置354处的E。
在一些情况下，FcRn结合片段包含IgG分子的约氨基酸残基216至约氨基酸残基447，其中编号根据EU索引。残基216-447包括铰链-Fc区(残基216-230，根据EU索引编号)和Fc区(残基231-447，根据EU索引编号)。
在一些情况下，FcRn结合片段包含IgG分子的约氨基酸残基231至约氨基酸残基447，其中编号根据EU索引。
在某些情况下，FcRn结合片段衍生自IgG的IgG4亚类，但也可以是给定动物的任何其他IgG亚类。例如，在人中，IgG类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些情况下，FcRn结合片段衍生自IgG4 Fc区。
在一些情况下，FcRn结合片段包含：位置351处的F、位置354处的E、位置366处的R、位置395处的K、位置405处的R和位置407处的E，其中氨基酸编号根据EU索引。
在一些情况下，FcRn结合片段可包含(相对于这些氨基酸位置中每一个处的这些氨基酸中每一个)保守的氨基酸取代：位置351处的F、位置354处的E、位置366处的R、位置395处的K、位置405处的R和位置407处的E，其中氨基酸编号根据EU索引。
这些氨基酸中每一个的示例性保守氨基酸取代如下：
氨基酸 保守取代
F M、Y、W、I、L、V
E Q、D、K、N、H、R
R H、L、E、Q
K R、E、Q、H
保守取代是蛋白质中的氨基酸替换，即将给定氨基酸改变为具有相似生化特性(例如，电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。因此，技术人员可以预期，与本文所述的最示例性FcRn结合片段相比，保守的氨基酸取代在单体形成和半衰期修饰方面产生类似的益处。技术人员可以产生在位置351、354、366、395、405和407(根据EU索引编号)中的一个或多个处具有保守氨基酸取代的FcRn结合片段，并通过进行实例中描述的实验测试这些变体是否具有与本文披露的优选FcRn结合片段相似的特性(例如，单体稳定性、FcRn结合效力、半衰期特性)。
在一些情况下，FcRn结合片段包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。在一些情况下，FcRn结合片段具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。在一些情况下，FcRn结合片段由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成。
在一些情况下，FcRn结合片段包含半衰期延长突变(例如，氨基酸插入、缺失或取代)。
在一些情况下，FcRn结合片段对人FcRn的平衡解离常数(KD)小于300nM。实例表明，人IgG1 Fc区在pH 6下与FcRn结合，其KD为约300nM。相比之下，工程化FcRn结合片段可以在pH 6.0下与人FcRn结合，其KD显著改善。与包含天然序列的FcRn结合片段相比，在较低pH下更紧密的结合意味着从内体的循环倾向可能会得到改善。
KD可以通过技术人员熟知的多种技术来测量，包括实例中概述的技术。例如，FcRn结合片段与纯化的重组人FcRn的结合测量可以通过生物层干涉法进行。生物层干涉法可以使用Octet384仪器(佛特比奥公司(ForteBio)，加利福尼亚州门洛帕克)进行。例如，可以在链霉亲和素生物传感器(佛特比奥公司)上捕获PBS缓冲液(pH 7.4)或100mM MES缓冲液(pH6.0)中1μg/mL的生物素化FcRn，该缓冲液含有3mg/mL牛血清白蛋白(0.05％(vol/vol))和Tween 20(1×动力学缓冲液；佛特比奥公司)。然后可以用测定缓冲液洗涤负载的生物传感器以去除任何未结合的蛋白质，然后在所希望pH下使用不同Fc变体或Fc融合构建体的连续稀释液进行缔合和解离测量。然后，可以使用Octet软件(7.2版)根据数据的1∶1结合动力学模型从非线性拟合计算动力学参数(kon和koff)和表观KD，方程如下：
在一些情况下，FcRn结合片段对人FcRn的平衡解离常数(KD)为至少300nM。
在一些情况下，FcRn结合片段在pH 6下与人FcRn结合，其KD为约1nM和约300nM之间(例如，在约1nM和约250nM之间、在约1nM和约240nM之间、在约1nM和约230nM之间、在约1nM和约200nM之间、在约1nM和约180nM之间、在约1nM和约160nM之间、在约1nM和约140nM之间、在约1nM和约120nM之间、在约1nM和约100nM之间、在约1nM和约80nM之间、在约1nM和约60nM之间、在约1nM和约40nM之间、在约1nM和约20nM之间、或在约1nM和约100nM之间)。在一些情况下，FcRn结合片段在pH 6下与人FcRn结合，其KD为约1nM和约10nM之间。在一些情况下，FcRn结合片段与人FcRn结合，其KD为约1nM、约2nM、约3nM、约4nM、约5nM、约6nM、约7nM、约8nM、约9nM或约10nM。在一些情况下，FcRn结合片段在pH 6.0下与人FcRn结合，其KD为约5nM。在一些情况下，FcRn结合片段在pH 6.0下与人FcRn结合，其KD为5nM。
在一些情况下，KD值可以通过生物层干涉法来确定，例如，如上文和实例中所述。
抗原结合结构域
在某些情况下，本披露提供了包含至少一个抗原结合结构域的融合蛋白，该抗原结合结构域与本文披露的FcRn结合片段共价连接。
在一些情况下，融合蛋白或多肽包含多个抗原结合结构域。
在一些情况下，融合蛋白或多肽包含1、2、3、4或5个抗原结合结构域。
在一些情况下，融合蛋白或多肽包含两个抗原结合结构域。
在一些情况下，第一抗原结合结构域位于FcRn结合片段的N末端。
在一些情况下，第二抗原结合结构域位于FcRn结合片段的C末端。
在一些情况下，每个抗原结合结构域位于FcRn结合片段的N末端。
在一些情况下，每个抗原结合结构域位于FcRn结合片段的C末端。
在一些情况下，每个抗原结合结构域特异性结合至不同的抗原。
在一些情况下，每个抗原结合结构域独立地选自Fv、Fab、Fab′、F(ab')2、Fab'-SH、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体或scFv。
在一些情况下，抗原结合结构域是Fab。
在一些情况下，抗原结合结构域是scFv。
在一些情况下，融合蛋白或多肽包含均作为Fab的第一和第二抗原结合结构域。
在一些情况下，融合蛋白或多肽包含均作为scFv的第一和第二抗原结合结构域。
在一些情况下，融合蛋白或多肽包含作为Fab的第一抗原结合结构域和作为scFv的第二抗原结合结构域。
实例表明，本文披露的FcRn结合片段可用于产生双特异性分子。
Fc区变钵
在某些情况下，可以将一个或多个氨基酸修饰引入Fc区，从而产生Fc区变体。然后可以将Fc区变体掺入本文披露的FcRn结合片段中。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如，取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些情况下，FcRn结合片段具有一些(但非全部)效应子功能，这些功能使其成为以下应用的理想候选物，其中FcRn结合片段在体内的半衰期很重要但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII以及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.[免疫学年鉴]9：457-492(1991)的第464页的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于以下中：美国专利号5，500，362(参见例如，Hellstrom，I.等人Proc.Nat′l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]166：1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(细胞技术公司(CellTechnology，Inc.)，加利福尼亚州山景城(Mountain View))；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊)。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内，例如在动物模型中，如Clynes等人Proc.Nat′l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95：652-656(1998)中披露的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood[血液]101：1045-1052(2003)；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood[血液]103：2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如，Petkova，S.B.等人，Int′l.Immunol.[国际免疫学]18(12)：1759-1769(2006))。
在一些情况下，可以将一个或多个氨基酸修饰引入Fc区以增加与FcRn的结合。在一些情况下，FcRn结合片段包含以下三个突变(根据EU索引编号)：M252Y、S254T和T256E(“YTE突变”)(美国专利号8,697,650；还参见Dall′Acqua等人，Journal of BiologicalChemistry[生物化学杂志]281(33)：23514-23524(2006))。
在某些情况下，与天然(即非YTE突变体)FcRn结合片段相比，YTE突变增加了FcRn结合片段的血清半衰期。在某些情况下，与天然(即非YTE突变体)FcRn结合片段相比，YTE突变使FcRn结合片段的血清半衰期增加了2倍。在某些情况下，与天然(即非YTE突变体)FcRn结合片段相比，YTE突变使FcRn结合片段的血清半衰期增加了3倍。在某些情况下，与天然(即非YTE突变体)FcRn结合片段相比，YTE突变使FcRn结合片段的血清半衰期增加了4倍。在某些情况下，与天然(即非YTE突变体)FcRn结合片段相比，YTE突变使FcRn结合片段的血清半衰期增加了至少5倍。在某些情况下，与天然(即非YTE突变体)FcRn结合片段相比，YTE突变使FcRn结合片段的血清半衰期增加了至少10倍。参见例如，美国专利号8,697,650；还参见Dall′Acqua等人，Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]281(33)：23514-23524(2006)。
在一些情况下，FcRn结合片段发生突变以降低效应子功能。在一些情况下，具有降低效应子功能的FcRn结合片段包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(根据EU索引编号)中的一个或多个处具有取代的那些片段(美国专利号6,737,056)。这样突变的FcRn结合片段包括在根据EU索引编号的氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的那些片段，包括残基265和297(根据EU索引进行编号)被丙氨酸取代的所谓的“DANA”Fc区突变体(即，根据EU编号D265A和N297A)(美国专利号7,332,581)。在某些情况下，FcRn结合片段包含以下两个氨基酸取代：D265A和N297A。在某些情况下，FcRn结合片段由以下两个氨基酸取代组成：D265A和N297A。
在某些情况下，位置329(根据EU索引编号)的脯氨酸(P329)被甘氨酸或精氨酸或大到足以破坏Fc/Fcγ受体界面内的脯氨酸夹心的氨基酸残基取代，该界面在Fc的P329和FcgRIII的色氨酸残基W87和W110之间形成(Sondermann等人：Nature[自然]406，267-273(2000年7月20日))。在进一步的情况下，FcRn结合片段中的至少一个另外的氨基酸取代是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且仍然在另一情况下，所述至少一个另外的氨基酸取代是人IgG1的Fc区的L234A和L235A或人IgG4的Fc区的S228P和L235E，所有这些均根据EU索引编号(美国专利号8,969,526)。
在一些情况下，FcRn结合片段包含US 2005/0014934 A1中描述的一个或多个取代，这些取代改善了Fc区与FcRn的结合。这样的FcRn结合片段包括在以下根据EU索引编号的Fc区残基的一个或多个处具有取代的那些片段：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代的(美国专利号7,371，826)。还参见Duncan和Winter，Nature[自然]322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351，这些文献涉及Fc区变体的其他实例。
在一些情况下，FcRn结合片段包含WO 2015/175874(将该文献通过引用以其全文并入本文)中描述的His435环突变，该突变调节与FcRn的结合。实例表明，与位置432-437(根据EU索引编号)处包含天然氨基酸残基的FcRn结合片段相比，His435环突变增强了FcRn结合片段血清半衰期。
在一些情况下，Fc区包含以下取代：位置432处的C；残基433处的H、R、P、T、K、S、A、M或N；残基434处的Y、N、R、W、H、F、S、M或T；残基435处的H；残基436处的L、Y、F、R、I、K、M、V、H、S或T；以及残基437处的C。在一些情况下，相对于天然(即，非YTE突变体)FcRn结合片段，经修饰FcRn结合片段的体内半衰期增加。增加生物活性分子的体内半衰期有许多好处，包括例如在疫苗、被动免疫疗法和其他治疗性和预防性方法中减少这些分子的给药量和/或频率。
在一些情况下，FcRn结合片段变体包含以下取代：位置432处的C；残基433处的S、H、R、P、T、K、A、M或N；残基434处的Y、R、W、H或F；残基435处的H；残基436处的L、R、I、K、M、V或H；以及残基437处的C，其中编号根据EU索引。在一些情况下，FcRn结合片段包含：位置432处的C；位置433处的S；位置434处的W或Y；位置435处的H；位置436处的L以及位置437处的C，其中编号根据EU索引。在一些情况中，FcRn结合片段变体包含位置432处的C；位置433处的S；位置434处的Y；位置435处的H；位置436处的L以及位置437处的C，其中编号根据EU索引。WO2015/175874和本披露的实例表明，这种特定的突变组合增加了Fc区与FcRn的pH依赖性结合，增加了pH依赖性FcRn介导的循环，从而改善了半衰期。
在一些情况下，FcRn结合片段变体包含位置438(根据EU索引编号)处的氨基酸缺失。实例令人惊讶地表明，从序列中缺失该氨基酸会产生具有至少相当的半衰期延长特性的FcRn结合片段，而不包括可开发性特征。在一些情况下，FcRn结合片段包含Q438的缺失，其中编号根据EU索引。
治疗方法
本文披露的融合蛋白、多肽或分子可用于治疗方法，例如治疗癌症的方法。还提供了治疗方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本文披露的融合蛋白、多肽或分子。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于正治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如剂量的确定)属于全科医生和其他医生的职责。
核酸
本披露提供包含编码本文披露的融合蛋白、多肽或分子的FcRn结合片段的核酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链的或单链的，并且如果是单链的话，可以是编码链或非编码(反义)链。在某些情况下，DNA是用于产生非天然存在的重组融合蛋白、多肽或分子的FcRn结合片段的cDNA。
在某些情况下，多核苷酸是分离的。在某些情况下，多核苷酸是基本上纯的。在某些情况下，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在相同阅读框中与有助于例如多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸(天然或异源)融合的(例如，充当用于控制多肽从细胞运输的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白质并且可以使得前导序列被宿主细胞切割以形成成熟形式的多肽。在某些情况下，多核苷酸被改变以优化用于某一宿主细胞的密码子使用。
在某些情况下，多核苷酸包含融合蛋白、多肽或分子的FcRn结合片段的编码序列，该编码序列在相同阅读框中与允许例如纯化编码的多肽的异源标志物序列融合。例如，在细菌宿主的情况下，该标志物序列可以是由pQE-9载体供给的六聚组氨酸标签以便提供对融合至该标志物的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标志物序列可以是来源于流感病毒血凝素蛋白的血球凝集素(HA)标签。
多核苷酸可以含有在编码区、非编码区、或两者中的改变。在一些实施例中，这些多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失而不改变编码的多肽的性质或活性的改变。在一些实施例中，多核苷酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。多核苷酸变体还可以因为各种原因而产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主如大肠杆菌优选的那些密码子)。
还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。一旦组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码特定的目的分离多肽的多核苷酸序列可以被插入至表达载体中并且可操作地连接至适于蛋白质在所希望的宿主中的表达的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制酶切作图以及表达适合宿主中的生物活性多肽来确认适当的组装。如本领域中所熟知的，为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，该基因必须可操作地连接至在选择表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。
在某些情况下，重组表达载体用于扩增和表达编码本文披露的融合蛋白、多肽或分子的FcRn结合片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，它们具有编码例如融合蛋白、多肽或分子的FcRn结合片段的多肽链的合成的或cDNA来源的DNA片段，操作性地连接到来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调控元件。转录单位通常包含以下组件：(1)基因表达中具有调控作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构序列或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译启动和终止序列，如下文详细描述的。这样的调控元件可以包括控制转录的操纵子序列。可以采用多种多样的表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9以及其衍生物，更广泛的宿主范围质粒，例如M13和丝状单链DNA噬菌体。
用于表达本文披露的融合蛋白、多肽或分子的FcRn结合片段的合适的宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核细胞、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下文所述的哺乳动物起源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。用于细菌、真菌、酵母菌、以及哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体由Pouwels等人(Cloning Vectors：A Laboratory Manual[克隆载体：实验室手册]，Elsevier[爱思唯尔公司]，纽约，1985)描述，将该文献的相关披露通过引用特此并入。有关蛋白质产生(包括抗体产生)方法的其他信息可以在例如美国公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501以及国际专利公开号WO 04009823中找到，将这些文献各自通过引用以其全文特此并入。
可以根据任何适合的方法对由转化宿主产生的融合蛋白、多肽或分子的FcRn结合片段进行纯化。这样的标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可以附接至蛋白质，以便允许蛋白质通过适当的亲和柱后较容易地得到纯化。还可以使用如蛋白质水解、核磁共振和x射线结晶等此类技术来在物理上表征分离的蛋白质。
在另一方面，本披露提供了制备如本文所定义的融合蛋白、多肽或FcRn结合片段的方法。该方法包括(i)通过用编码如本文所述的每个位置处的氨基酸的密码子替换氨基酸位置351、354、366、395、405和407处的密码子来诱变编码FcRn结合片段的核酸序列。氨基酸位置编号根据EU索引。该方法进一步包括表达诱变的核酸序列；并分离表达的融合蛋白、多肽或FcRn结合片段。
在一些情况下，该方法包括另外的步骤，即使FcRn结合片段与非蛋白质药剂反应以形成分子，如本文所披露。
药物组合物
本披露延伸至包含本文所述的融合蛋白、多肽或分子的组合物，特别是包含本披露的融合蛋白、多肽或分子和药物赋形剂、稀释剂或载剂的药物组合物(或诊断组合物)。
该组合物通常作为无菌药物组合物的一部分提供，该组合物通常包含药学上可接受的载剂。在疫苗配制品的情况下，本发明的药物组合物可另外地包含药学上可接受的佐剂。
本披露还延伸至制备所述组合物的方法，例如制备药物或诊断组合物，这些方法包括添加本披露的分子(例如本发明的披露内容的水解分子)并将其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一种或多种混合在一起。
本披露的融合蛋白、多肽或分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴有其他活性成分。
药物组合物适合地包含治疗有效量的根据本披露的融合蛋白、多肽或分子。治疗有效量可以最初在细胞培养测定中或在动物模型中(通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物)中估算。动物模型也可以用来确定合适的浓度范围和施用途径。然后可以使用这样的信息来确定在人中施用的有用的剂量和途径。
组合物可以单独施用给患者，或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、依次或分开)施用。
药学上可接受的载剂本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且不应有毒。
治疗性组合物中的药学上可接受的载剂可另外含有液体，例如水。辅助物质，例如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质可以存在于这样的组合物中。这样的载剂使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，供患者摄取。
适合的施用形式包括适合于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过推注(bolus injection)或连续输注。当产品用于注射或输注时，它可以采取悬浮液、溶液或乳液的形式，并且它可以含有配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，本披露的分子可以呈干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。
适合地，在根据本披露的配制品中，最终配制品的pH与融合蛋白、多肽或分子的等电点值是不相似的，例如如果配制品的pH为7，那么pI为8-9或更高可能是合适的。
本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，这些途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO 98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下喷射器也可用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗性组合物可以制备成注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。
组合物的直接递送通常通过注射、皮下、腹膜内、静脉内或肌内，或递送至组织的间隙来完成。组合物也可以施用至病变中。剂量治疗可以是单剂量方案或者多剂量方案。
药学上可接受的载剂的充分讨论可获得于Remington′s PharmaceuticalSciences[雷明顿药物科学](Mack Publishing Company[马克出版公司]，新泽西州1991)。
实例
实例1
随着疾病生物学和抗体技术的突破，药物发现领域在提供范式转换抗体和抗体衍生治疗剂方面取得了显著进展。1，2免疫肿瘤学的研究进展与新型双特异性和多特异性靶向平台的开发之间的协同作用为推动癌症治疗的最新成功提供了许多有希望的可能性。3-7在实现临床疗效的同时使毒性最小化的重要性突出了将靶向价从免疫球蛋白G(IgG)或片段可结晶(Fc)融合蛋白的默认二价形式进行微调的需要。越来越多的证据表明，具有单价靶向臂的双特异性和多特异性形式对于减少非特异性细胞杀伤、细胞因子释放和不期望的受体交联以及改善受体激动和转运是必要的。8-11T细胞衔接子或自然杀伤(NK)细胞衔接子，例如双特异性T细胞衔接子(BiTe)、双亲和力再靶向蛋白(DART)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)和三特异性杀伤细胞衔接子(TriKE)，已显示出单价双特异性和多特异性靶向的临床前景，但半衰期短。异源二聚体Fc工程化经由开发例如杵臼结构、CrossmAb和DuetmAb等技术从而可以指导双特异性和多特异性靶向的定向正确链配对使得延长这些衔接子的半衰期成为可能。11-13
具有“可调”血清半衰期的构象稳定的单体Fc抗体片段的成功生成可以为抗体和Fc融合治疗剂开辟新的可能性。在已获得美国食品和药物管理局批准的180多种治疗性蛋白质中，许多具有被嵌入活性、更持久的融合蛋白的潜力。14-18免疫细胞衔接子、抗体-药物缀合物、免疫细胞因子融合物和其他治疗性蛋白质可以经定制设计以提供单特异性和多特异性形式的单价靶向，从而增强活性并降低毒性。过去对单体Fc(定义为一组CH2和CH3结构域)进行工程化的努力已被证明具有挑战性，因为要破坏CH3-CH3二聚体界面中的广泛相互作用。在高浓度下，在许多突变体中观察到单体-二聚体平衡。19,20在工程化的单体Fc模式中，据报道只有两种分子具有可证明的均质性和稳定性的晶体结构。13,21其中之一是通过添加阻断CH3-CH3相互作用的糖基化位点来稳定的单体。21另一个由我们团队生成的衍生自IgG4噬菌体文库的单体Fc，该文库是在先前发现的基础上合理设计的。13
为了扩大单体Fc平台在下一波蛋白治疗剂中的应用，我们着手解决这项工作的三个重要并相互关联的方面：(1)可调的血清半衰期，(2)单价双特异性分子的多功能构建，以及(3)Fc新生儿受体(FcRn)与Fc变体相互作用的简单结构探察。pH依赖性Fc-FcRn相互作用是抗体及其衍生物的血清半衰期延长的关键影响因素。FcRn利用抗体分子并携带它们通过酸性内体囊泡，保护它们免受溶酶体降解，并由于在中性pH下的弱结合而将它们释放到细胞外。22,23预计并观察到单体Fc变体与FcRn的表观结合减少，二聚体亲合力丧失。13,21先前，我们通过在噬菌体文库模板设计中构建YTE(M252Y/S254T/T256E)突变来避免FcRn结合的丧失。与没有YTE的对应物相比，所得的单体Fc分子在FcRn结合亲和力方面提高了10倍以上。13,24
在这项工作中，我们报道了结构引导性方法来将单体Fc分子工程化，该单体Fc分子适用于半衰期延长修饰，超越了先前使用内置YTE突变所实现的那些。这是首个概念验证单体双特异性分子设计，证明只用一个拷贝的CH2-CH3结构域就可能实现体内血清半衰期的显著改善。这些单体Fc分子与FcRn的共晶体结构揭示了界面的细节，可以作为构建其他半衰期延长的基础。
结果
基于结构见解的CH3-CH3界面破坏。在先前的工作中，我们从合理设计的IgG4噬菌体文库生成了单体Fc变体C4(现在更名为MFc1)，该文库包含CH3结构域中的一组突变以完全稳定Fc二聚体界面的破坏(图1a)。为了扩大这些破坏二聚体的突变与YTE以外的半衰期延长突变的相容性，我们首先使用测试变体T1，其中用CH3中残基432-438附近的一组新的半衰期修饰突变替换单体Fc序列的CH2结构域中的YTE突变。之所以选择这个突变集，是因为它符合以下两个标准。首先，这一新突变集可以帮助我们探索另外的半衰期增强的方法，这基于先前噬菌体文库活动的发现，表明与YTE突变相比，它可以显著改善FcRn结合。25其次，这组突变的广泛性将是对单体Fc维持Fc二聚化界面破坏的能力的“压力测试”。
我们解析了T1的晶体结构，并将其与二聚体IgG4 Fc的结构和先前解析的单体Fc，MFc2(或C4n，无YTE突变；PDB ID：5HVW)的结构一起进行分析。13MFc2和IgG4 Fc(PDB ID：4C54)的CH3结构域与T1重叠，其中在Cα原子上的均方根偏差(RMSD)分别为约0.7和(当排除在MFc2结构中形成人工链交换的最后11个残基时)。尽管CH3结构域高度相似，但T1出人意料地显示出同源二聚体的形成(图1b)。然而，二聚体界面与野生型IgG4的二聚体界面有显著不同。在链之间形成了涉及氨基酸Thr350/Leu440和Gln355/Glu356的一小组氢键，表明单体Fc的形成可能被破坏(图1c)。在检查与MFc2重叠的新形成的T1二聚体界面时，我们观察到MFc2中的一个突变，即Arg366，已经在其侧链中发生了移位。这种移位允许来自每条链的Phe351“进入”并形成疏水性堆叠相互作用。此外，Arg366突变几乎没有建立稳定二聚体的新氢键(图1c)。通过对结构的仔细检查，我们推断Arg366移位之所以变得可能，部分原因是Ser354侧链上方存在空间。尽管分析方法显示出T1蛋白表现相对良好，但晶体结构表明，尽管二聚体界面发生广泛的破坏，但在高蛋白质浓度下，工程化的Fc仍有可能可以参与二聚体的形成。
基于结构的工程化以及结合和生物物理特性的表征。在T1晶体结构中观察到的新形成的相互作用为构建适应性更强的单体Fc分子创造了机会。根据T1二聚体界面的结构检查(图1c)，我们假设用具有更大侧链的氨基酸替换位置354处的丝氨酸可能会阻止Arg366侧链为涉及Phe351的疏水性相互作用让路。这种取代也可能破坏任何产生的氢键形成。有趣的是，Ser354被选为原始噬菌体文库模板中发生突变的界面位置之一，尽管我们的第一个单体Fc构建体MFc1在除Ser354之外的每个靶向位置都产生了突变(图1a)。13因此，我们在位置354设计了一小组精细突变，以研究引入更大的侧链或静电斥力是否会完全稳定单体的形成。构建了含有在位置354(T1-lib)处被带电荷残基(R、K、D、E)和庞大极性和非极性残基(F、Y、P、Q、L、M)取代的T1变体(图2a)，随后通过蛋白A亲和色谱法纯化。SEC-MALS分析揭示，几乎所有的T1-lib精细变体都是单体的(图2b)。
为了在T1-lib变体中选择最稳定的单体，我们使用差示扫描荧光法(DSF)(已被确立为正交筛选工具)以评估作为疏水性(Tb)残基暴露的函数的热解折叠。32,33监测T1-lib变体中的热解折叠，并观察疏水性暴露的转变温度Th的变化。值得注意的是，氨基酸取代的类型对Th排序有影响，因为酸性残基(Glu和Asp)产生的转变温度比碱性残基(Arg和Lys)高多达3℃(图2c)。
具有S354E的单体Fc变体(MFc3和MFc4)的结构和性质。基于SEC-MALS和DSF结果，选择S354E突变来探索MFc平台的普遍适用性。首先，为了确认其与我们原始单体Fc构建体的相容性，我们生成了MFc3(MFc1的S354E点突变体)，以及其无糖基化变体(N297D)，用于晶体结构确认(图1a)。无糖基化MFc3蛋白的晶体很容易生长并衍射到解析结构表明MFc3分子在高蛋白质浓度下保持单体状态(图3)。与先前发表的MFc2的单体Fc结构的重叠表明，S354E突变没有引起Fc的CH2或CH3结构域结构的任何重大变化。13除了R405侧链位置的微小变化外，MFc1中所有其他原始二聚体破坏性突变组几乎彼此完全对齐。重要的是，这种晶体结构表明，按照设计，位置354处的谷氨酸侧链取代确实凸出并破坏了我们在T1中观察到的相互作用。
为了与我们构建一组单体Fc变体以调节FcRn介导的循环半衰期的目标保持一致，我们将重点转向FcRn与我们的单体Fc分子相互作用的功能和结构表征。使用重组FcRn结合分析，我们发现MFc3与MFc1显著不同，显示出约300nM的平衡解离常数(KD)(表A)。这一发现表明，S354E取代没有改变与FcRn的相互作用。为了确认这种结合模式，在低pH下制备MFc3/FcRn复合物，随后进行纯化和结晶，并收集衍射数据至的分辨率(图4a)。可用于比较的最接近的Fc-FcRn复合物结构是我们团队解析的结构，其由下与人血清白蛋白复合的结合人FcRn的人IgG1 Fc(具有YTE突变组)(PDB ID：4N0U)组成。29两个界面的比较表明，相互作用模式几乎保持相同，具有微小的差异，这些差异很可能是由于在电子密度图中解析侧链的差异引起的。这种Fc-FcRn相互作用的结构和功能不变性是意料之中的，因为S354E突变距离FcRn界面超过
表A.以重组1∶1结合形式的单体Fc变体与人FcRn的平衡结合
为了评估S354E突变是否确实可用于使T1进入单体状态，我们将T1-S354E(MFc4)与FcRn的复合物结晶(图4b)。解析的MFc4/FcRn复合物结构表明MFc4确实是单体的。尽管MFc3/FcRn和MFc4/FcRn复合物的结晶条件搜索是独立进行的，但晶体在相同的条件下生长并表现出几乎相同的细胞参数和空间群。正如先前工作所预期的那样，从MFc3到MFc4的序列变化导致重组FcRn结合亲和力显著增加，从300nM增加到5nM(表A)。25在这些分子中观察到pH依赖性FcRn结合，显示从pH 6结合到中性pH结合降低了约50倍(数据未显示)。MFc4/FcRn和MFc3/FcRn复合物的整体结构在3,700个非氢原子上以的RMSD重叠，表明高度相似性。MFc3/FcRn和MFc4/FcRn复合物结构的比较视图揭示了Fc-FcRn相互作用的不同细节，并为我们在FcRn结合中观察到的差异提供了结构解释。MFc4中新引入的Tyr434和Leu436将界面面积从增加到近同时为相互作用增加了一些疏水性(图4c，图4d)。FcRn中的残基Leu135(曾被认为是造成Fc/FcRn界面疏水性的影响因素)29现在更多地参与MFc4中Tyr434和Leu436的存在。
使用PDBePISA分析，我们用微分溶剂化能热图捕获了MFc3/FcRn相对于MFc4/FcRn的结合口袋中单个残基的能量贡献(图4e)。作为结合界面程度的测量，微分溶剂化能计算反映了溶剂无法进入的结构表面的部分。30,31发现MFc4对结合界面的最大影响因素是Ile253、Tyr434和Leu436，而MFc3中为残基Ile253和Thr254。MFc4的总溶剂化能变化为5.09kcal/mol，疏水相互作用明显强于MFc3，MFc3的总ΔiG为3.14kcal/mol(图4e)。作为比较，我们对唯一其他可用的人YTE IgG1 Fc-FcRn复合物进行了相同的计算，并发现ΔiG相似，为2.67kcal/mol，这与结合亲和力测量一致。
MFc4/FcRn复合物结构也为我们提供了对野生型人Fc/FcRn相互作用的结构见解，这在以前由于两个原因而从未得到过。首先，野生型人Fc/FcRn相互作用相对较弱，使得复杂的纯化变得困难，即使不是不可能。其次，二聚体Fc的结晶倾向(因此称为“片段可结晶”)非常高，以至于大多数尝试产生仅包含Fc的晶体(未发表的数据)。在我们的稳定单体Fc变体可用之前，我们必须依靠大鼠Fc或FcYTE来改善Fc和FcRn之间的亲和力，以及使用白蛋白来破坏Fc晶格形成，以增加结合状态的停留时间来形成晶体。29现在，在MFc3和MFc4与FcRn的结构复合物及其两组远端突变的帮助下，我们能够更好地了解野生型结合界面及其突变组。例如，在YTE(M252Y/S254T/T256E)突变所在的残基252、254和256周围的野生型界面处，界面溶剂化能图显示Met252对FcRn界面只有中等影响，而Thr256实际上没有参与(图4e)。来自252-254-256环的最显著FcRn相互作用由Ser254提供。该分析还解释了为什么YTE突变组可以改善Fc和FcRn之间的亲和力，以及为什么最大影响来自其S254T取代。
单体双特异性分子的构建。这些单体Fc分子可以很容易地用作用于设计单价、双靶向Fc融合蛋白的构建块。先前我们使用MFc1变体来生成奥那妥组单抗Fab-MFc1融合蛋白。8，13在本研究中，我们设计了具有单体Fc构建体的单价双特异性靶向分子的第一个实例。对于单质粒构建，我们将来自奥那妥组单抗的同一Fab结构域与靶向程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抗体的C末端单链可变片段(scFv)一起连接到MFc1或MFc4的N末端(图5a)。将构建体转染用于在HEK293悬浮培养物中瞬时表达(表达滴度为约90mg/L)，随后在一步蛋白A纯化中将蛋白质纯化。SEC-MALS分析表明蛋白质是单分散的，且预期分子量为100kDa(图5b)。单体双特异性分子的双靶向活性在夹心形式的Octet平台上得到证实(图5c)。双特异性分子还在pH 6下将其相应的FcRn结合保持在单独Fc结构域结合的2至3倍内。
使用下一代单体Fc改善体内半衰期。与MFc1相比，我们在MFc4变体中实现了体外FcRn结合的显著改善。我们还想评估这种改善是否会转化为体内血清半衰期的增强。新生成的Fab-MFc4-scFv和Fab-MFc1-scFv(其分子量(100kDa)远高于典型的肾脏过滤清除大小(约60kDa))34是评估改善FcRn结合的体内半衰期意义的理想分子。我们在半合子人FcRn(TG276)转基因小鼠中进行了体内药代动力学(PK)研究。该小鼠模型是经过充分研究的模型，其反映了Fc突变和血清半衰期为约18小时的标准IgG1对人FcRn结合的可证明的PK影响。13，25，35向小鼠以2.5mg/kg给药融合蛋白，并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清蛋白质浓度。Fab-MFc4-scFv双特异性蛋白的血清水平高于Fab-MFc1-scFv(图6a)。对PK参数进行分析和测定，表明Fab-MFc4-scFv的清除率和终末半衰期显著高于Fab-MFc1-scFv，几乎高出两倍。这表明与MFc1相比，更强的MFc4介导的人FcRn结合有助于增强血清蛋白循环。正如预期的那样，增加的分子大小有助于从Fab-MFc1到双特异性分子Fab-MFc1-scFv的清除率降低。
讨论
基于单体Fc的单价抗体或融合蛋白具有向更多类别的蛋白质治疗剂赋予IgG样血清特性的潜力。在对稳定的单体Fc进行成功工程化之后，我们承担起构建和扩展MFc平台实用性的挑战，以实现几个关键特性。
首先，我们想建立更通用的单体Fc分子，以容纳用于半衰期调节的可替代Fc突变，包括进一步延长半衰期的潜力。其次，我们试图证明MFc平台确实可以维持单体状态并且对于双特异性分子靶向是稳定的(这是所希望的靶向策略)以能够实现新的治疗性应用，包括免疫肿瘤学和受体介导的转胞吞作用。4-7，9围绕单体Fc构建的单价双特异性药物形式可以提供完全消除效应子功能并降低毒性和脱靶沉默(off-target sink)的优势，这是对T细胞和其他免疫细胞衔接子最佳的设计特征。最后，我们旨在验证一种计算方法，以实现未来单体Fc设计的开发。为了实现这些目标，我们试图利用结构引导的分子设计的力量。
我们先前已经证明，MFc1中的YTE突变能够改善FcRn结合亲和力以抵消结合亲合力的降低。13基于先前Fc噬菌体文库的输出和工程化工作，我们鉴定了一组突变T1(图1)，在pH 6.0下FcRn结合有希望增强。这为我们提供了理想的测试案例，以评估单体稳定突变对CH3结构域中的半衰期突变(而不是CH2结构域中的YTE突变)的适应性。
T1蛋白的晶体结构表明，工程化的Fc可以在高蛋白质浓度下参与新堆积的二聚体形成。虽然我们没有发现新的半衰期延长突变组对这种新形式的Fc二聚化有任何直接贡献，但我们相信这些突变在允许在紧密堆积条件下诱导二聚化方面发挥作用。对这种二聚体界面的仔细检查指导了我们的合理设计，以扩大位置354处残基的侧链。从替换丝氨酸残基的突变组中，我们根据谷氨酸优越的热稳定性选择了谷氨酸(图2)。使用溶液分析方法和晶体学，我们证明了S354E能够维持单体Fc结构，并且谷氨酸侧链如设计的那样凸出(图3)。当MFc3和MFc4维持单体状态并保持与FcRn的广泛结合时，在共晶体结构的观察中证实了S354E对单体Fc结构的适应性和活性(图4a，图4c)。这是首次证明可以很容易地产生共晶体结构来探察Fc-FcRn界面，并且在那些结合相互作用中存在可量化的差异。使用结合界面的微分溶剂化能计算，我们能够量化由于MFc4中扩展的疏水相互作用而增强的FcRn结合(图4b-4e)。
具有可变FcRn结合能力的单体Fc分子的可用性使我们能够验证MFc平台用于构建单价双特异性分子靶向的用途。我们使用MFc1和MFc4两者产生Fab-MFc-scFv分子，MFc1和MFc4具有可证明的单体构象纯度和双靶向活性。由于分子大小远高于肾脏过滤截止值，因此这些分子非常适合用于评估改善FcRn结合的体内药代动力学结果。我们发现Fab-MFc4-scFv双特异性分子比Fab-MFc1-scFv维持更高的血清水平，接近标准IgG1抗体的水平。这些结果还表明，这些MFc构建体可有助于可调节的血清蛋白循环，并且可以为下一波技术的开发提供多功能的双特异性平台，以支持治疗性进展。
由于Fc二聚体的破坏而导致CH3结构域的暴露并不是新的现象。为我们的MFc平台选择了IgG4骨架，因为IgG4分子的Fab臂交换的随时接合，使Fc在二聚体-单体平衡之间交替。36此外，为了启动强烈且特异性的免疫反应，T细胞表位需要由抗原呈递细胞处理和呈递。37为了减轻新引入的突变可能形成新的T细胞表位的担忧，对MFc1和MFc4中单体形成突变进行了计算机T细胞表位预测。我们观察到这些突变的总体预测结合率低，表明免疫原性风险较低。38
治疗性治疗剂的最终成功将取决于许多合作努力，以解决效力与毒性和血清半衰期与组织渗透的平衡，同时加深对免疫和转化科学的理解。MFc平台具有提供单价双特异性靶向基序的能力和灵活性，以避开任何不希望的Fc受体介导的细胞毒性和脱靶沉默，同时模拟IgG样血清特性，为进一步扩大免疫细胞衔接子的探索提供了及时的可能性。
方法
伦理声明。需要在这些研究中使用动物的方案(MI-13-0012)由阿斯利康机构动物护理和使用委员会(AstraZeneca's Institutional Animal Care and Use Committee)审查和批准，并符合美国农业部(U.S.Department of Agriculture)实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)以及实验动物护理评估和认证协会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory AnimalCare)的动物福利标准。
抗体克隆、表达和纯化。所有抗体位置根据Kabat编号惯例(对于可变结构域)和EU编号惯例(对于CH2-CH3结构域)列出。41，42所有化学品均为分析级。寡核苷酸购自欧陆MWG操纵子公司(Eurofns MWG Operon)(肯塔基州路易斯维尔)。使用来自宝生物公司(TakaraBio)(加利福尼亚州山景城)的In-Fusion HD克隆试剂盒产生编码mAb-J的质粒，将可变重链和可变轻链序列编码到内部IgG1哺乳动物表达载体中。使用QuikChange MultiLighming诱变试剂盒(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉)通过定点诱变引入点突变。
使用293Fectin转染试剂(生命技术公司(Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，将变体瞬时转染到人胚肾细胞系HEK293FT中。使细胞在FreeStyle 293-F表达培养基(生命技术公司)中生长。通过亲和色谱法用HiTrap蛋白A柱(GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences)，马萨诸塞州马尔伯勒)从细胞上清液中纯化表达的抗体。将抗体用Pierce IgG洗脱缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientifc)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)洗脱，并用1M Tris(pH 8.0)中和。将抗体透析到磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.2)中。通过分析SEC测定所有抗体的单体含量大于95％。
SEC-MALS和分析超速离心。在室温下，使用14mL床体积的TSK-GEL G2000SWXL柱(东曹生物科学公司(Tosoh Biosciences)，日本东京)在1100HPLC仪器(安捷伦公司，加利福尼亚州圣克拉拉)上通过SEC分析浓度为1mg/mL或更高的经纯化Fc克隆和融合蛋白。将样品在PBS中以1mL/min的流速等度洗脱20分钟。用紫外吸光度于280nm波长处检测洗脱蛋白。使用ChemStation软件(A.02.10版)进行数据分析。使用一组范围为10至500kDa的分子量标准品(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules))进行柱校准。进行在线SEC-MALS。在带有Optilab Rex折射计的Dawn Heleos II MALS(怀特技术公司(WyattTechnologies)，加利福尼亚州圣巴巴拉)上进行样品测量。通过使用Astra 6.1版(怀特技术公司)计算定义的色谱峰内每种蛋白质的分子量。
对于分析超速离心分析，将样品和参考缓冲液加载到具有Epon中心的12mm双扇区池中，然后放入An-50 Ti转子中，使用设置为20℃的Optima XL-I离心机以50,000rpm进行超速离心(贝克曼-库尔特公司(Beckman-Coulter)，印第安纳州印第安纳波利斯)。使用Sedfit软件(16.1c版)分析在280nm处收集的扫描2至160的沉降数据，以生成c(s)分布。43，44部分比容设置为0.73mL/g。使用Sednterp程序(20130813版)的计算值，将PBS的溶液密度和粘度值分别设置为1.00523g/mL和1.019mPa·s。45基于Svedberg方程，预计分子量为27kDa的单体Fc的沉降系数为1.7-2.4S(Svedberg单位)，假设摩擦比为1.3-1.8(球状到扩展形状)。
结晶、数据收集和结构确定。在结晶之前，将蛋白A纯化的T1、MFc3和MFc4通过离子交换色谱法在Q HP 5mL预填充柱(该柱用pH 8的25mM Tris-HCl缓冲液平衡)(GE医疗生命科学公司)上进一步纯化，通过SEC使用Superdex 200Increase 10/300GL色谱柱(该柱用pH8的25mM Tris-HCl和100mM NaCl预平衡)(GE医疗生命科学)进一步纯化。将收获后的重组异源二聚体FcRn的培养基的pH进行调节以在IgG Sepharose柱(GE医疗生命科学公司)上进行亲和纯化。在QHP柱(GE医疗生命科学公司)上纯化FcRn后，将其透析到pH 5.2的30mM乙酸钠缓冲液中，并在FcRn摩尔缺陷(molardeficit)为1％的情况下与MFc3和MFc4复合，并将复合物通过SEC使用相同Superdex 200柱(该柱用pH 5.2的30mM乙酸钠和100mM NaCl平衡)纯化。SDS PAGE证实了复合物组成。
所有蛋白质和蛋白质复合物的初始结晶试验均在20℃下通过坐滴蒸气扩散法进行。将结晶液滴通过Phoenix机器人(艺术罗宾斯仪器公司(Art Robbins Instruments))分配到96孔结晶板(Intelli-plate102-0001-20；艺术罗宾斯仪器公司，加利福尼亚州森尼韦尔)中，并由等体积的蛋白质和储器缓冲液组成。对于T1和MFc3自身的结晶，我们使用可商购的筛选(汉普顿研究公司(Hampton Research)，加利福尼亚州亚里索维耶荷；分子维度公司(Molecular Dimensions)，英国萨福克)。对于FcRn复合蛋白的结晶，我们生成了新的筛选，该筛选由可商购筛选中包含的低pH条件的组合组成。在结晶优化步骤中，从以下结晶溶液中以悬滴形式使衍射质量晶体生长：T1：0.01M硫酸锌七水合物；0.1M吗啉乙磺酸(MES)一水合物(pH 6.5)和25％(w/v)PEG 550MME(蛋白质浓度为5.5mg/mL)。MFc4/FcRn复合物：0.2M氯化镁六水合物、1M碘化钠、0.1M MES(pH 6)和20％PEG 6000(蛋白质浓度为6.35mg/mL)。MFc3/FcRn复合物：0.2M氯化镁六水合物、30％1，5-二氨基戊烷二盐酸盐、0.1M MES(pH6)和20％PEG 6000(蛋白质浓度为6mg/mL)。MFc3的晶体从由以下组成的条件中直接从原始坐滴板收获：0.8％麻醉生物碱(2％w/v盐酸利多卡因一水合物、2％w/v盐酸普鲁卡因、2％w/v盐酸丙卡因、2％w/v盐酸丁卡因)、0.1M MOPS(酸)和HEPES钠pH 7.5、以及50％v/v沉淀剂混合物(40％v/v乙二醇，20％w/v PEG 8000)，蛋白质浓度为7mg/mL。通过浸入液氮对所有收获用于X射线分析的晶体进行快速冷却。在配备Pilatus 6M PAD检测器的斯坦福同步辐射光源(Stanford Synchrotron Radiation Lightsource)(保罗谢勒研究所(PaulScherer Institute)，瑞士菲利根)的光束线BL9-2上从单晶收集衍射数据，其中振荡范围为180°，增量为0.5°，并且每张图像曝光0.8秒。用XDS程序处理衍射数据。46所有晶体学计算均使用CCP4软件套件(7.0版)进行。47通过使用Molrep程序进行分子替换程序。48使用Refmac5进行结构细化，并使用“O”程序进行模型调整。49，50使用PyMOL(薛定谔公司纽约州纽约)生成结构图。
Octet结合分析。单体Fc及其融合蛋白与内部经纯化重组人FcRn的结合测量是通过生物层干涉法在Octet384仪器(佛特比奥公司，加利福尼亚州门洛帕克)上进行的。在链霉亲和素生物传感器(佛特比奥公司)上捕获PBS缓冲液(pH 7.4)或100mM MES缓冲液(pH6.0)中1μg/mL的生物素化FcRn，该缓冲液含有3mg/mL牛血清白蛋白(0.05％(vol/vol))和Tween 20(1×动力学缓冲液；佛特比奥公司)。用测定缓冲液洗涤负载的生物传感器以去除任何未结合的蛋白质，然后使用不同Fc变体或Fc融合构建体的连续稀释液进行缔合和解离测量。使用Octet软件(7.2版)根据数据的1∶1结合动力学模型从非线性拟合计算动力学参数(kon和koff)和表观亲和力(KD)，方程如下：
还进行了Fab-MFc-scFv分子与重组抗原蛋白的并行结合测量。在含有1×动力学缓冲液的PBS缓冲液(pH 7.2)中在链霉亲和素生物传感器(佛特比奥公司)上以5μg/mL捕获生物素化的cMet蛋白。结合步骤包括300nM Fab-MFc-scFv与缓冲液对照，然后结合抗原2与缓冲液对照。
hFcRn转基因小鼠中的体内PK。本研究中使用的人FcRn转基因小鼠是鼠FcRn缺陷型B6.129X1-Fcgrttm1Dcr/DcrJ和人FcRn cDNA转基因系B6.Cg-Fcgrttm 1Dcr Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ的F1杂交种。在第0天，对性别匹配(6-16周龄)的小鼠静脉内推注剂量2.5mg/kg的单体Fc融合蛋白。每种蛋白质使用8只小鼠，在交替的时间点对两组小鼠(A组和B组)进行放血。在整个2-3周的研究中，在不同时间点使用毛细移液管从眶后神经丛获得血液样品。在整个研究过程中，所有动物都保持健康。使用定量ELISA来监测所测试抗体的血清浓度。简而言之，用2μg/mL cMet细胞外结构域包被96孔板。将包被有5μg/mL cMet的板在4℃下孵育过夜，用PBS-Tween中3％牛血清白蛋白封闭，然后在不同时间点与稀释的血清样品一起孵育。使用以1∶104稀释的山羊抗人Fc特异性辣根过氧化物酶缀合抗体(杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，宾夕法尼亚州西格罗夫(WestGrove，PA))进行检测。根据制造商的指示，在用3,3′，5，5′-四甲基联苯胺底物(柯克加德和佩里实验室公司(KPL)，马里兰州盖瑟斯堡)显色后测量450nm处的吸光度。生成每个抗体变体的标准曲线。在Prism(6版；GraphPad软件公司(GraphPad Software)，加利福尼亚州拉荷亚)中生成标准曲线的线性部分，然后用于定量血清样品中的人抗cMet融合蛋白。使用Phoenix64WinNonlin 6.3(法赛特公司(Pharsight)，加利福尼亚州山景城)进行非隔室PK数据分析。通过使用WinNonlin检查观察到的数据来确定观察到的最大峰值血浆浓度。终末消除半衰期用方程ln(2)/λz确定，其中λz是自然-对数浓度-时间曲线末端部分的斜率，由至少最后三个时间点的线性回归确定。通过使用线性/对数梯形法则计算从给药开始到最后可测量浓度的时间的血浆浓度与时间图的曲线下面积(AUC)(即AUClast)来确定全身暴露。从时间0到无穷大的血浆浓度与时间图的AUC(即AUC∞)计算为：AUClast+Clast/λz，其中Clast是最后可量化浓度。清除率(CL)通过剂量/AUC∞来计算，并且稳态分布体积计算为：(AUMC∞×CL)/AUC∞，其中AUMC∞是从第一时刻外推到无穷大的AUC。对PK参数进行统计总结，并以平均值呈现。
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序列
序列表
<110> 梅迪缪思有限公司（MEDIMMUNE, LLC）
<120> 具有改善的半衰期的经修饰FcRn结合片段
<130> AEFC-130-WO-PCT
<150> US 63/186,445
<151> 2021-05-10
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
20 25 30
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
35 40 45
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
50 55 60
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
65 70 75 80
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
85 90 95
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
100 105 110
Tyr Thr Phe Pro Pro Glu Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
115 120 125
Leu Arg Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
130 135 140
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Lys Pro
145 150 155 160
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Glu Ser Arg Leu Thr Val
165 170 175
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
180 185 190
His Glu Ala Cys Ser Tyr His Leu Cys Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
195 200 205

Claims (41)

1.一种融合蛋白，其包含IgG分子的Fc区的FcRn结合片段，其中该FcRn结合片段包含：
a.位置351处的F
b.位置354处的R、K、D、E、F、Y、P、G、L或M
c.位置366处的R
d.位置395处的K
e.位置405处的R；以及
f.位置407处的E
其中氨基酸编号根据EU索引。
2.一种多肽，其包含IgG分子的Fc区的FcRn结合片段，其中该FcRn结合片段包含：
a.位置351处的F
b.位置354处的R、K、D、E、F、Y、P、G、L或M
c.位置366处的R
d.位置395处的K
e.位置405处的R；以及
f.位置407处的E
其中该氨基酸编号根据EU索引。
3.一种分子，其包含与IgG分子的Fc区的FcRn结合片段缀合的非蛋白质药剂，其中该FcRn结合片段包含：
a.位置351处的F
b.位置354处的R、K、D、E、F、Y、P、G、L或M
c.位置366处的R
d.位置395处的K
e.位置405处的R；以及
f.位置407处的E
其中该氨基酸编号根据EU索引。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，根据权利要求2所述的多肽或根据权利要求3所述的分子，其中该FcRn结合片段包含位置354处的R、K、D或E，任选地D或E，其中该氨基酸编号根据EU索引。
5.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含位置354处的E，其中该编号根据EU索引。
6.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含IgG分子的约氨基酸残基216至约氨基酸残基446，其中该编号根据EU索引。
7.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含IgG分子的约氨基酸残基236至约氨基酸残基446，其中该编号根据EU索引。
8.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该IgG分子是IgG4。
9.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段进一步包含半衰期延长突变。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含位置252处的Y、位置254处的T和位置256处的E，其中编号根据EU索引。
11.根据权利要求9所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该Fc区包含以下氨基酸：
a.位置432和437处的C；
b.位置433处的S、H、R、P、T、K、A、M或N；
c.位置434处的Y、N、R、W、H、F、S、M或T；
d.位置435处的H；以及
e.位置436处的L、Y、F、R、I、K、M、V、H、S或T其中编号根据EU索引。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含：
a.位置434处的Y、R、W、H或F；以及
b.位置436处的L、R、I、K、M、V或H
其中编号根据EU索引。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含以下氨基酸：
a.位置432和437处的C；
b.位置433处的S；
c.位置434处的Y；
d.位置435处的H；以及
e.位置436处的L
其中编号根据EU索引。
14.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含位置438处的氨基酸的缺失，其中编号根据EU索引。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、多肽或分子，其中缺失该FcRn结合片段的Q438(根据EU索引编号)。
16.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白、多肽或分子，其中该FcRn结合片段包含紧接在残基437之后插入的E，其中编号根据EU索引。
17.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白或多肽，其包含至少一个，例如一个或两个抗原结合结构域。
18.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白或多肽，其包含两个抗原结合结构域。
19.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白或多肽，其中第一抗原结合结构域位于该FcRn结合片段的N末端。
20.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白或多肽，其中第二抗原结合结构域位于该FcRn结合片段的C末端。
21.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白或多肽，其中每个抗原结合结构域独立地选自Fv、Fab、Fab′、F(ab')2、Fab'-SH、双体抗体、三体抗体、四体抗体、线性抗体和scFv。
22.根据任一前述权利要求所述的融合蛋白或多肽，其包含非IgG蛋白结构域。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白或多肽，其中该非IgG结构域是免疫调节剂、受体、激素、酶或药物。
24.根据权利要求1-16中任一项所述的分子，其中该非蛋白质药剂是核酸(例如，DNA或RNA)、脂质、糖脂、多糖、药物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒或报告基团，例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱检测的化合物。
25.根据权利要求24所述的分子，其中该核酸是DNA、RNA、siRNA、RNAi或微小RNA。
26.根据权利要求24所述的分子，其中该药物是细胞毒性剂、化疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂或促凋亡剂。
27.根据权利要求1所述的融合蛋白，根据权利要求2所述的多肽或根据权利要求3所述的分子，其中该FcRn结合片段包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。
28.一种核酸，其包含编码根据任一前述权利要求所述的融合蛋白或多肽的核苷酸序列。
29.一种载体，其包含根据权利要求28所述的核酸。
30.一种宿主细胞，其包含根据权利要求28所述的核酸或根据权利要求29所述的载体。
31.一种核酸，其包含编码根据权利要求1至16中任一项所述的分子的FcRn结合片段的核苷酸序列。
32.一种载体，其包含根据权利要求31所述的核酸。
33.一种宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的核酸或根据权利要求32所述的载体。
34.一种产生根据权利要求1至23或27中任一项所述的融合蛋白或多肽的方法，该方法包括从根据权利要求30所述的宿主细胞表达所述融合蛋白或多肽，并纯化所述融合蛋白或多肽。
35.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-27中任一项所述的融合蛋白、多肽或分子，药学上可接受的载剂和稀释剂。
36.根据权利要求35所述的药物组合物用于在疗法中使用。
37.根据权利要求35所述的药物组合物在疗法中的用途。
38.根据权利要求1-27中任一项所述的融合蛋白、多肽或分子用于在疗法中使用。
39.根据权利要求1-27中任一项所述的融合蛋白、多肽或分子在疗法中的用途。
40.根据权利要求1-27中任一项所述的融合蛋白、多肽或分子在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
41.一种治疗方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-27中任一项所述的融合蛋白、多肽或分子，或根据权利要求35所述的药物组合物。
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