DE112008003232T5 - Antigen-Bindungskonstrukte - Google Patents

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Jonathan Henry Stevenage Ellis
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Abstract

Ein Antigen-bindendes Konstrukt bestehend aus einem Proteingerüst, das mit einem oder mehreren Epitop-bindenden Domänen verknüpft ist, wobei das Antigen-bindende Konstrukt mindestens zwei Antigen-bindende Stellen hat, von denen mindestens eine von einer Epitop-bindenden Domäne und mindestens eine von einer gepaarten VH/VL-Domäne stammt.

Description

  • Hintergrund
  • Antikörper sind wohlbekannt für den Einsatz bei therapeutischen Applikationen.
  • Antikörper sind heteromultimere Glykoproteine, die mindestens zwei schwere und zwei leichte Ketten aufweisen. Neben IgM sind Antikörper gewöhnlich heterotetramere Glykoproteine mit etwa 150 Kda, bestehend aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten. Typischerweise ist jede leichte Kette mit einer kovalenten Disulfid-Bindung an eine schwere Kette gebunden, während die Zahl der Disulfid-Bindungen zwischen den schweren Ketten verschiedener Immunglobulin-Isotypen unterschiedlich ist. Jede schwere und leichte Kette verfügt auch über Intraketten-Disulfidbrücken. Jede schwere Kette besitzt an einem Ende eine variable Domäne (VH), gefolgt von einigen konstanten Regionen. Jede leichte Kette besitzt eine variable Domäne (VL) und eine konstante Region am anderen Ende; die konstante Region der leichten Kette ist auf die erste konstante Region der schweren Kette ausgerichtet und die variable Domäne der leichten Kette ist auf die variable Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Die leichten Ketten der Antikörper der meisten Wirbeltierarten können einer der zwei Arten Kappa und Lambda zugeteilt werden, je nach der Aminosäuresequenz der konstanten Region. Abhängig von der Aminosäuresequenz der konstanten Region ihrer schweren Ketten, können menschliche Antikörper fünf verschiedenen Klassen zugeteilt werden, nämlich IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. IgG und IgA können weiter unterteilt werden in die Unterklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4; sowie IgA1 und IgA2. Artspezifische Varianten existieren, wobei die Maus und Ratte mindestens über IgG2a, IgG2b verfügen. Die variable Domäne des Antikörpers verleiht dem Antikörper Bindungsspezifität, wobei bestimmte Regionen eine spezifische Variabilität, die sogenannten Komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR), aufweisen. Die besser konservierten Anteile der variablen Region werden als Rahmenregionen (FR) bezeichnet. Die variablen Domänen von intakten schweren und leichten Ketten weisen jeweils vier FR verbunden mit drei CDR auf. Die CDR in jeder Kette werden durch die FR-Regionen eng zusammengehalten und tragen mit den CDR der anderen Kette zur Entstehung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei. Die konstanten Regionen sind nicht direkt an der Bindung des Antikörpers an das Antigen beteiligt, weisen jedoch verschiedene Effektorfunktionen auf, wie zum Beispiel Teilnahme an der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC), Phagozytose durch Bindung an den Fcγ-Rezeptor, Halbwertszeit-/Clearance-Rate via neonatalen Fc-Rezeptor (FcRn) und Komplementabhängige Zytotoxizität via die C1q-Komponente der Komplement-Kaskade.
  • Ein IgG-Antikörper ist so strukturiert, dass er zwei Antigen-Bindungsstellen enthält, welche beide spezifisch für dasselbe Epitop sind. Sie sind deshalb monospezifisch.
  • Ein bispezifischer Antikörper ist ein Antikörper mit Bindungsspezifitäten für mindestens zwei verschiedene Epitope. Methoden zur Herstellung solcher Antikörper sind im Stand der Technik bekannt. Ursprünglich basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Koexpression zweier H-L-Ketten-Paare des Immunglobulins, wobei die beiden H-Ketten verschiedene Bindungsspezifitäten aufweisen, siehe Millstein und Mitarb., Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 und Traunecker und Mitarb., EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Die zufällige Auswahl der H- und L-Ketten produziert eine potentielle Mischung aus zehn verschiedenen Antikörperstrukturen, von denen nur eine die gewünschte Bindungsspezifität hat. Ein alternativer Ansatz beinhaltet die Verschmelzung der variablen Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten an die konstante Region der schweren Kette, die mindestens einen Teil der Scharnierregion aufweist, nämlich Regionen CH2 und CH3. Bevorzugterweise enthält die CH1-Region die zur Bindung an die leichte Kette notwendige Stelle in mindestens einer der Verschmelzungen. DNA-Kodierung dieser Verschmelzungen und falls gewünscht, Einfügen der L-Kette in separate Expressionsvektoren und nachfolgend Kotransfektion in einen geeigneten Wirtsorganismus. Es ist jedoch möglich, die Kodierungssequenzen für zwei oder alle drei Ketten in einen Expressionsvektor einzufügen. Bei einem Ansatz besteht ein bispezifischer Antikörper aus einer H-Kette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem H-L-Ketten-Paar, das eine zweite Bindungsspezifität im anderen Arm aufweist, siehe WO94/04690 . Siehe auch Suresh und Mitarb., Methods in Enzymology 121, 210, 1986. Weitere Ansätze umfassen Antikörpermoleküle, welche Einzeldomänen-Bindungsstellen aufweisen, wie in WO2007/095338 beschrieben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorgelegte Erfindung betrifft ein Antigen-Bindungskonstrukt, das ein Proteingerüst aufweist, welches an eine oder mehr Epitop-Bindungsdomänen gebunden ist, wobei das Antigen-Bindungskonstrukt mindestens zwei Antigen-Bindungsstellen hat, von denen mindestens eine aus einer Epitop-Bindungsdomäne stammt und von denen mindestens eine aus einer gepaarten VH-/VL-Domäne stammt.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Antigen-Bindungskonstrukt, welches mindestens ein Homodimer enthält, welches wiederum zwei oder mehr Strukturen der Formel I enthält:
    Figure 00030001
    wobei
    X eine konstante Antikörperregion darstellt, die eine konstante Domäne der schweren Kette 2 und konstante Domäne der schweren Kette 3 aufweist;
    R1, R4, R7 und R8 eine Domäne darstellen, die unabhängig von einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    R2 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus der konstanten Domäne der schweren Kette 1 und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    R3 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer gepaarten VH- und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    R5 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten leichten Kette und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    R6 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer gepaarten VL- und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    n eine ganze Zahl darstellt, die unabhängig ausgewählt wird aus: 0, 1, 2, 3 und 4;
    m eine ganze Zahl darstellt, die unabhängig ausgewählt wird aus: 0 und 1,
    wobei die Domänen der konstanten Domäne der schweren Kette 1 und der konstanten Domäne der leichten Kette verknüpft sind;
    wobei mindestens eine Epitop-Bindungsdomäne vorhanden ist; und wenn R3 eine gepaarte VH-Domäne darstellt, dann stellt R6 eine gepaarte VL-Domäne dar, so dass die beiden Domänen zusammen Antigen binden können.
  • Die Erfindung betrifft IgG-basierte Strukturen, welche monoklonale Antikörper aufweisen oder Fragmente, die mit einem oder mehr Domänen-Antikörpern verbunden sind und Methoden um solche Konstrukte herzustellen sowie deren Anwendungen, hauptsächlich Anwendungen für Therapiezwecke.
  • Die Erfindung stellt auch eine Polynukleotid-Sequenz bereit, die eine schwere Kette eines der hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukte kodiert und ein Polynukleotid, das eine leichte Kette eines beliebigen hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukts kodiert. Solche Polynukleotide stellen die Kodierungssequenz dar, die den gleichwertigen Polypeptidsequenzen entsprechen; es versteht sich jedoch, dass solche Polynukleotidsequenzen in einen Expressionsvektor geklont werden könnten, zusammen mit einem Startcodon, einer geeigneten Signalsequenz und einem Stopcodon.
  • Die Erfindung stellt weiter eine rekombinant transformierte oder transfizierte Wirtszelle bereit, welche ein oder mehrere Polynukleotide aufweist, die eine schwere Kette und eine leichte Kette eines beliebigen hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukts kodieren.
  • Die Erfindung stellt zudem eine Methode für die Produktion eines beliebigen hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukts zur Verfügung, wobei die Methode aus einem Schritt zur Kultivierung einer Wirtszelle besteht, welche einen ersten und zweiten Vektor umfasst, wobei dieser erste Vektor ein Polynukleotid enthält, welches eine schwere Kette eines beliebigen hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukts kodiert und der besagte zweite Vektor ein Polynukleotid enthält, welches eine leichte Kette eines beliebigen hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukts kodiert, in einem Serum-freien Kulturmedium.
  • Die Erfindung stellt weiter eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, welche ein wie hier beschriebenes Antigen-Bindungskonstrukt als pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
  • Die Erfindung stellt weiter einen Domänenantikörper bereit, welcher die in SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 3 dargestellte Polypeptidsequenz enthält oder daraus zusammengesetzt ist. In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Protein bereit, welches aus der in SEQ ID NR: 60 oder SEQ ID NR: 61 dargestellten Polynukleotidsequenz exprimiert wird.
  • Definitionen
  • Der hier verwendete Begriff ”Proteingerüst” umfasst insbesondere ein Immunglobulin(Ig)-Gerüst, beispielsweise ein IgG-Gerüst, das ein vierkettiger oder zweikettiger Antikörper sein kann, oder das nur die Fc-Region eines Antikörpers umfassen kann, oder das eine oder mehr konstante Regionen eines Antikörpers umfassen kann, wobei diese konstanten Regionen von Menschen oder Primaten abstammen können, oder die eine künstliche Chimäre der konstanten Regionen von Menschen oder Primaten sein können. Solche Proteingerüste können zusätzlich zu einer oder mehreren konstanten Regionen Antigen-Bindungsstellen umfassen, wobei das Proteingerüst beispielsweise einen vollständigen IgG umfasst. Solche Proteingerüste können an andere Proteindomänen geknüpft werden, zum Beispiel an Proteindomänen mit Antigen-Bindungsstellen wie zum Beispiel Epitop-Bindungsdomänen oder ScFv-Domänen.
  • Eine ”Domäne” ist eine gefaltete Proteinstruktur mit einer tertiären Struktur, die vom Rest des Proteins unabhängig ist. Domänen sind generell für diskrete funktionelle Eigenschaften der Proteine verantwortlich und können in vielen Fällen anderen Proteinen beigefügt, entnommen oder an sie übertragen werden, ohne dass die Funktion des restlichen Proteins und/oder der Domäne dabei verloren geht. Eine ”variable Einzelantikörper-Domäne” ist eine gefaltete Polypeptid-Domäne, welche für die variablen Antikörper-Domänen charakteristische Sequenzen aufweist. Deshalb umfasst sie vollständige variable Antikörper-Domänen und modifizierte variable Domänen, bei denen beispielsweise eine oder mehrere Schleifen durch Sequenzen ersetzt worden sind, die für variable Antikörper-Domänen nicht charakteristisch sind, oder variable Antikörper-Domänen, die verkürzt worden sind oder die Verlängerungen des N- oder C-Terminus umfassen, sowie gefaltete Fragmente von variablen Domänen, die mindestens die Bindungsaktivität und Spezifität der gesamten Domäne beibehalten.
  • Der Ausdruck ”variable Immunglobulin-Einzeldomäne” bezieht sich auf eine variable Antikörperdomäne (VH, VHH, VL), die namentlich an ein Antigen oder Epitop bindet, und zwar unabhängig von einer anderen V-Region oder -Domäne. Eine variable Immunglobulin-Einzeldomäne kann in einem Format (zum Beispiel Homo- oder Heteromultimer) vorhanden sein mit anderen, verschiedenartigen variable Regionen oder variable Domänen, wobei die anderen Regionen oder Domänen von der variablen Immunglobulin-Einzeldomäne nicht für die Antigenbindung benötigt werden (z. B. wenn die variable Immunglobulin-Einzeldomäne Antigen unabhängig von zusätzlichen variablen Domänen bindet). Ein ”Domänenantikörper” oder ”dAb” ist dasselbe wie eine ”variable Immunglobulin-Einzeldomäne”, welche laut hier verwendetem Begriff die Fähigkeit hat an ein Antigen zu binden. Eine variable Immunglobulin-Einzeldomäne kann eine menschliche variable Antikörperdomäne sein, schließt jedoch auch variable Einzelantikörperdomänen anderer Arten wie Nagetiere (wie beispielsweise in WO 00/29004 beschrieben), Ammenhaie und Kamelide VHH-dAb ein. Kameliden VHH sind variable Immunglobulin-Einzeldomänen-Polypeptide, die von Arten wie dem Kamel, Lama, Alpaka, Dromedar und Guanako abstammen, welche Schwere-Ketten-Antikörper von Natur aus ohne leichte Ketten produzieren. Solche VHH-Domänen können gemäß dem Stand der Technik humanisiert werden, und diese Domänen gelten gemäß der Erfindung immer noch als ”Domänenantikörper”. Wie hier verwendet, beinhaltet VH Kamelide VHH-Domänen. NARV sind eine andere Art variabler Einzeldomänen, die bei Knorpelfischen, einschließlich dem Ammenhai identifiziert worden sind. Diese Domänen sind auch als variable Region neuer Antigenrezeptoren bekannt (üblicherweise abgekürzt als V(NAR) oder NARV). Für weitere Einzelheiten, siehe Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) und US20050043519A .
  • Der Begriff ”Epitop-Bindungsdomäne” bezieht sich auf eine Domäne, die namentlich ein Antigen oder Epitop bindet, unabhängig von einer anderen V-Region oder – Domäne; dies kann ein Domänenantikörper (dAb) sein, beispielsweise eine variable Immunglobulin-Einzeldomäne eines Menschen, Kameliden oder Hais, oder es kann eine Domäne sein, die aus einem Gerüst abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CTLA-4 (Evibody); Lipocalin; Protein A abgeleiteten Molekülen wie der Z-Domäne von Protein A (Affibody, SpA), der A-Domäne (Avimer/Maxibody); Hitzeschockproteinen wie GroEI und GroES; Transferrin (Trans-Body); Ankyrin Wiederholungsprotein (DARPin); Peptidaptamer; C-Typ Lektindomäne (Tetranektin); menschlichem γ-Kristallin und menschlichem Ubiquitin (Affiline); PDZ-Domänen; Skorpion Toxin Kunitz-Domänen von menschlichen Proteasehemmern; und Fibronektin (Adnektin); welches proteintechnisch manipuliert worden ist, um die Bindung an ein anderes als ein natürliches Ligand zu erreichen.
  • CTLA-4 (zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Antigen 4) ist ein Rezeptor der CD28-Familie, der vorwiegend auf CD4+ T-Zellen exprimiert wird. Seine extrazelluläre Domäne besitzt eine der variablen Domäne ähnliche Ig-Falte. Den CDR von Antikörpern entsprechende Schleifen können zur Vermittlung anderer Bindungseigenschaften durch eine heterologe Sequenz ersetzt werden. CTLA-4-Moleküle, die so manipuliert worden sind, dass sie andere Bindungseigenschaften aufweisen, werden auch Evibodies genannt. Für weitere Einzelheiten, siehe Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)
  • Lipokaline gehören zur Familie extrazellulärer Proteine, welche kleine wasserabweisende Moleküle wie Steroide, Biline, Retinoide und Lipide transportieren. Sie besitzen eine starre sekundäre β-Schicht Struktur mit mehreren Schleifen am offenen Ende der konischen Struktur welche so manipuliert werden können, dass sie an verschiedene Zielantigene binden. Die Größe von Antikalinen liegt zwischen 160-180 Aminosäuren, und sie sind von Lipokalinen abgeleitet. Für weitere Einzelheiten, siehe Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 und US20070224633
  • Ein Affibody ist ein Gerüst, abgeleitet aus Protein A von Staphylococcus aureus, das so manipuliert werden kann, dass es an Antigen bindet. Die Domäne besteht aus einem dreifach schraubenförmigen Bündel von ungefähr 58 Aminosäuren. Bestände sind durch Randomisierung von Oberflächenrückständen gebildet worden. Für weitere Einzelheiten, siehe Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) und EP1641818A1 .
  • Avimere sind Mehrfachdomänen-Proteine, abgeleitet aus der Familie der A-Domänen-Gerüste. Die natürlich vorkommenden Domänen von ungefähr 35 Aminosäuren nehmen eine festgelegte Disulfid-gebundene Struktur an. Vielfalt entsteht durch Vermischen der von der Familie der A-Domänen an den Tag gelegten natürlichen Veränderung. Für weitere Einzelheiten, siehe Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) und Fachgutachten zu Prüfmedikationen 16(6), 909-917 (Juni 2007).
  • Ein Transferrin ist ein monomeres Serum-Transport-Glykoprotein. Transferrine können durch Einfügen von Peptidsequenzen in eine zulässige Oberflächenschleife so manipuliert werden, dass sie verschiedene Zielantigene binden. Der Transbody ist ein Beispiel manipulierter Transferrin-Gerüste. Für weitere Einzelheiten, siehe J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).
  • Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) sind von Ankyrin abgeleitet, einer Proteinfamilie, die die Anlagerung von integralen Membranproteinen an das Zytoskeleton vermittelt. Ein Ankyrin-Wiederholungsprotein ist ein Motiv aus 33 Rückständen, bestehend aus zwei α-Spiralen und einer β-Kurve. Sie können durch Randomisierung der Rückstände in der ersten α-Spirale und einer β-Kurve jeder Wiederholung so manipuliert werden, dass sie verschiedene Zielantigene binden. Die Bindungsoberfläche kann durch Erhöhung der Anzahl Moleküle erhöht werden (eine Methode der Affinitätsreifung). Für weitere Einzelheiten, siehe J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) und J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) und US20040132028A1 .
  • Fibronektin ist ein Gerüst, das zur Bindung an Antigen manipuliert werden kann. Adnektin besteht aus einem Backbone der natürlichen Aminosäure-Sequenz der 10. Domäne der 15 wiedeholenden Einheiten des menschlichen Firbonectins Typ III (FN3). Drei Schleifen an einem Ende des β-Sandwiches können so manipuliert werden, dass ein Adnektin fähig ist, speziell ein interessantes therapeutisches Ziel zu erkennen. Für weitere Einzelheiten, siehe Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791 , WO2005056764 und US6818418B1 .
  • Peptidaptamere sind kombinatorische Erkennungsmoleküle, bestehend aus einem konstanten Gerüstprotein, normalerweise Thioredoxin (TrxA), welches an der aktiven Stelle eine abhängige variable Peptidschleife enthält. Für weitere Einzelheiten, siehe Fachgutachten, Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).
  • Microbodies werden aus natürlich vorkommenden Mikroproteinen mit einer Länge von 25-50 Aminosäuren abgeleitet, welche 3-4 Cysteinbrücken enthalten – Beispiele von Mikroproteinen sind KalataB1 und Conotoxin und Knottine. Die Mikroproteine haben eine Schleife, die so manipuliert werden kann, dass sie bis zu 25 Aminosäuren enthält, ohne dadurch die allgemeine Faltung des Mikroproteins zu beeinträchtigen. Für weitere Einzelheiten zu manipulieren Knottin-Domänen, siehe WO2008098796 .
  • Andere Epitop-Bindungsdomänen umfassen Proteine, die als Gerüst benutzt werden, um verschiedene Zielantigen-Bindungseigenschaften herzustellen, einschließlich menschliches γ-Kristallin, menschliches Ubiquitin (Affiline), Kunitz-artige Domänen von menschlichen Proteasehemmern, PDZ-Domänen des Ras-Bindungsproteins AF-6, Skorpion Toxine (Charybdotoxin), C-Typ Lektindomäne (Tetranektine); sie werden in Kapitel 7 – Nicht-Antikörper-Gerüste des Handbuches über therapeutische Antikörper (2007, herausgegeben von Stefan Dubel) und Protein Science 15: 14-27 (2006) untersucht. Epitop-Bindungsdomänen der vorgestellten Erfindung können von irgendeiner dieser alternativen Proteindomänen abgeleitet sein.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe ”gepaarte VH-Domäne”, ”gepaarte VL-Domäne” und ”gepaarte VH-NL-Domänen” auf variable Antikörperdomänen, die Antigen namentlich nur binden, wenn sie mit ihrer variablen Partnerdomäne gepaart sind. Jede Paarbildung umfasst jeweils eine VH und eine VL, und die Bezeichnung ”gepaarte VH-Domäne” bezieht sich auf den VH-Partner, die Bezeichnung ”gepaarte VL-Domäne” bezieht sich auf den VL-Partner und die Bezeichnung ”gepaarte VH-/VL-Domänen” bezieht sich auf die beiden Domänen zusammen.
  • In einer Ausführung der Erfindung bindet die Antigenbindungsstelle an ein Antigen mit einer KD von mindestens 1 mM, zum Beispiel laut BiacoreTM-Messung an jedes Antigen mit einer Kd von 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, wie der in Methode 4 oder 5 beschriebenen BiacoreTM-Verfahrensweise.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff ”Antigen-Bindungsstelle” auf eine Stelle an einem Konstrukt, die die Fähigkeit hat, spezifisch an ein Antigen zu binden, das kann eine Einzeldomäne sein, zum Beispiel eine Epitop-Bindungsdomäne, oder es können gepaarte VH-/VL-Domänen sein wie sie an einem gewöhnlichen Antikörper zu finden sind. In einigen Aspekten der Erfindung können Einzelketten Fv (ScFv)-Domänen Antigen-Bindungsstellen bereitstellen.
  • Die Bezeichnungen ”mAb/dAb” und ”dAb/mAb” werden hier dazu verwendet um auf Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung hinzuweisen. Die beiden Bezeichnungen sind auswechselbar und sollen dieselbe Bedeutung haben wie hier beschrieben.
  • Der Begriff ”konstante Domäne der schweren Kette 1” wird hier dazu verwendet um auf die CH1-Domäne einer schweren Immunglobulin-Kette hinzuweisen.
  • Der Begriff ”konstante Domäne der leichten Kette” wird hier dazu verwendet um auf die konstante Domäne einer leichten Immunglobulin-Kette hinzuweisen.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Antigen-Bindungskonstrukt, das ein Proteingerüst umfasst, welches mit einer oder mehreren Epitop-Bindungsdomänen verbunden ist, wobei das Antigen-Bindungskonstrukt mindestens zwei Antigen-Bindungsstellen besitzt, von denen eine aus einer Epitop-Bindungsdomäne stammt und von denen mindestens eine aus einer gepaarten VH-/VL-Domäne stammt.
  • Solche Antigen-Bindungskonstrukte weisen ein Proteingerüst auf, beispielsweise ein Ig-Gerüst wie IgG, zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper, welcher mit einer oder mehreren Epitop-Bindungsdomänen verbunden ist, zum Beispiel einem Domänenantikörper, wobei das Bindungskonstrukt mindestens zwei Antigen-Bindungsstellen besitzt, von denen mindestens eine aus einer Epitop-Bindungsdomäne stammt und Methoden zur Produktion und Verwendung davon, insbesondere der Verwendung für Therapiezwecke.
  • Einige Beispiele von Antigen-Bindungskonstrukten gemäß der Erfindung sind in der 1 dargestellt.
  • Die Antigen-Bindungskonstukte der vorliegenden Erfindung werden auch als mAbdAbs bezeichnet.
  • In einer Ausführung ist das Proteingerüst des Antigen-Bindungskonstrukts der vorliegenden Erfindung ein Ig-Gerüst, beispielsweise ein IgG-Gerüst oder IgA-Gerüst. Das IgG-Gerüst kann sämtliche Domänen eines Antikörpers aufweisen (d. h. CH1, CH2, CH3, VH, VL). Das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung kann ein IgG-Gerüst umfassen, ausgewählt aus IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 oder IgG4PE.
  • Das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung besitzt mindestens zwei Antigen-Bindungsstellen, beispielsweise zwei Bindungsstellen von denen die erste Bindungsstelle Spezifität für ein Epitop an einem Antigen und die zweite Bindungsstelle Spezifität für ein zweites Epitop am selben Antigen besitzt. In einer weiteren Ausführung gibt es 4 Antigen-Bindungsstellen, oder 6 Antigen-Bindungsstellen oder 8 Antigen-Bindungsstellen oder 10 oder mehr Antigen-Bindungsstellen. In einer Ausführung hat das Antigen-Bindungskonstrukt Spezifität für mehr als ein Antigen, zum Beispiel zwei Antigene oder für drei Antigene oder für vier Antigene.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Antigen-Bindungskonstrukt das mindestens ein Homodimer aufweist, welches wiederum zwei oder mehr Strukturen der Formel I aufweist:
    Figure 00110001
    wobei
    X eine konstante Antikörperregion darstellt, die eine konstante Domäne der schweren Kette 2 und konstante Domäne der schweren Kette 3 aufweist;
    R1, R4, R7 und R8 eine Domäne darstellen, die unabhängig von einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    R2 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus der konstanten Domäne der schweren Kette 1 und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird; R3 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer gepaarten VH- und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    R5 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten leichten Kette und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    R6 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer gepaarten VL- und einer Epitop-Bindungsdomäne ausgewählt wird;
    n eine ganze Zahl darstellt, die unabhängig ausgewählt wird aus: 0, 1, 2, 3 und 4;
    m eine ganze Zahl darstellt, die unabhängig ausgewählt wird aus: 0 und 1,
    wobei die Domänen der konstanten Domäne der schweren Kette 1 und der konstanten Domäne der leichten Kette verknüpft sind;
    wobei mindestens eine Epitop-Bindungsdomäne vorhanden ist;
    und wenn R3 eine gepaarte VH-Domäne darstellt, dann stellt R6 eine gepaarte VL-Domäne dar, so dass die beiden Domänen zusammen Antigen binden können.
  • In einer Ausführung stellt R6 eine gepaarte VL und R3 eine gepaarte VH dar.
  • In einer weiteren Ausführung stellen R7 und R8 entweder jeweils allein oder zusammen eine Epitop-Bindungsdomäne dar.
  • In noch einer weiteren Ausführung stellen R1 und R4 entweder jeweils allein oder zusammen eine Epitop-Bindungsdomäne dar.
  • In einer Ausführung ist R4 vorhanden.
  • In einer Ausführung stellen R1 R7 und R8 eine Epitop-Bindungsdomäne dar.
  • In einer Ausführung stellen R1 R7 und R8, und R4 eine Epitope-Bindungsdomäne dar.
  • In einer Ausführung sind (R1)n, (R2)m, (R4)m und (R5)m = 0, d. h. nicht vorhanden, R3 ist eine gepaarte VH-Domäne, R6 ist eine gepaarte VL-Domäne, R8 ist eine VH-dAb und R7 ist eine VL-dAb.
  • In einer weiteren Ausführung sind (R1)n, (R2)m, (R4)m und (R5)m gleich 0, d. h. nicht vorhanden, R3 ist eine gepaarte VH-Domäne, R6 ist eine gepaarte VL-Domäne, R8 ist eine VH-dAb und (R7)m ist = 0, d. h. nicht vorhanden.
  • In einer anderen Ausführung sind (R2)m und (R5)m gleich 0, d. h. nicht vorhanden, R1 ist eine dAb, R4 ist eine dAb, R3 ist eine gepaarte VH-Domäne, R6 ist eine gepaarte VL-Domäne, (R8)m und (R7)m sind = 0, d. h. nicht vorhanden.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung ist die Epitop-Bindungsdomäne eine dAb.
  • Es versteht sich, dass sämtliche hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukte die Fähigkeit haben, ein oder mehrere Antigene zu neutralisieren.
  • Der Begriff ”neutralisieren” und grammatische Abwandlungen davon wie sie in der vorliegenden Beschreibung in Bezug auf Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung verwendet werden, bedeutet, dass eine biologische Aktivität des Ziels in der Gegenwart der Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur Aktivität des Ziels bei Abwesenheit solcher Antigen-Bindungskonstrukte entweder vollständig oder teilweise reduziert wird. Die Neutralisation kann insbesondere verursacht werden durch eines oder mehr des Folgenden: Blockierung von Ligandbindungen, Verhinderung der Rezeptoraktivierung durch das Ligand, Down Regulierung des Rezeptors oder Beeinträchtigung der Effektorfunktionalität.
  • Neutralisationsstufen können auf verschiedene Art gemessen werden, zum Beispiel mittels irgend einer der in den nachfolgenden Beispielen und Methoden beschriebenen Prüfungen, beispielsweise mit einer Prüfung bei der die Hemmung der Ligandbindung an den Rezeptor gemessen wird, welche zum Beispiel ausgeführt werden kann wie in einer der Methoden 12, 19 oder 21 oder dem Beispiel 32 beschrieben. Bei diesen Prüfungen wird die Neutralisation von VEGF, IL-4, IL-13 oder HGF durch die Beurteilung der verminderten Bindung zwischen dem Ligand und dessen Rezeptor in der Gegenwart eines neutralisierenden Antigen-Bindungskonstrukts gemessen.
  • Neutralisationsstufen können zum Beispiel auch gemessen werden mit einer TF1-Untersuchung, die beispielsweise ausgeführt werden kann wie in Methode 8, 9, 10, 20 oder 21 beschrieben. Bei dieser Untersuchung wird die Neutralisation von IL-13, IL-4 oder von beiden dieser Zytokine durch Beurteilung der Hemmung der TF1-Zellproliferation in der Gegenwart des neutralisierenden Antigen-Bindungskonstrukts gemessen. Alternativ könnte die Neutralisation mit einer Phosphorylisierungsprobe für epidermale Wachstumsfaktoren gemessen werden, die beispielsweise ausgeführt werden kann wie in Methode 13 beschrieben. Bei dieser Probe wird die Neutralisation von epidermalen Wachstumsfaktoren durch Beurteilung der Tyrosinkinase-Phosphorylisierungs-Hemmung des Rezeptors in der Gegenwart den neutralisierenden Antigen-Bindungskonstrukts gemessen. Andernfalls könnte die Neutralisation mit einer IL-8-Sekretionsprobe in MRC-5-Zellen gemessen werden, welche beispielsweise ausgeführt werden kann wie in Methode 14 oder 15 beschrieben. Bei dieser Probe wird die Neutralisation von TNFα oder IL-1 R1 durch Beurteilung der Hemmung der IL-8-Sekretion in der Gegenwart des neutralisierenden Antigen-Bindungskonstrukts gemessen.
  • Andere Methoden zur Beurteilung der Neutralisation sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel die Beurteilung der verringerten Bindung zwischen dem Ligand und dessen Rezeptor in der Gegenwart des neutralisierenden Antigen-Bindungskonstrukts, und diese umfassen zum Beispiel BiacoreTM-Proben.
  • In einem alternative Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antigen-Bindungskonstrukte bereitgestellt, die mindestens eine im Wesentlichen gleichwertige Neutralisationsaktivität besitzen wie die hier beispielhaft genannten Antikörper, zum Beispiel Antigen-Bindungskonstrukte, welche die Neutralisationsaktivität von 586H-TVAAPS-210, oder PascoH-G4S-474, oder PascoH-474, PascoH-474 mit GS entfernt, PascoL-G4S-474 oder PascoHL-G4S-474 in der Proliferationsprobe für TF1-Zellen bewahren, oder Hemmung der Signalgebungsprobe für pSTAT6 wie in den Beispielen 4 bzw. 20 beschrieben, oder zum Beispiel Antigen-Bindungskonstrukte, welche die Neutralisationsaktivität von BPC1603, BPC1604, BPC1605, BPC1606 in der Bindungsprobe für VEGFR bewahren, oder Hemmung der IGF-1R-Rezeptor-Phosphorylierung wie in den Beispielen 14.6 und 14.7 beschrieben.
  • Die Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung umfassen solche mit Spezifität für IL-13, zum Beispiel solche, die eine Epitop-Bindungsdomäne aufweisen, die fähig ist, an IL-13 zu binden, oder solche, die eine gepaarte VH/VL aufweisen, welche an IL-13 bindet. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen Antikörper aufweisen, der fähig ist, an IL-13 zu binden. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen dAb aufweisen, welcher fähig ist, an IL-13 zu binden.
  • In einer Ausführung besitzt das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung Spezifität für mehr als ein Antigen, wobei es zum Beispiel fähig ist, zwei oder mehr Antigene zu binden, ausgewählt aus IL-13, IL-5 und IL-4, wobei es zum Beispiel fähig ist, IL-13 und IL-4 zu binden oder wobei es fähig ist, IL-13 und IL-5 zu binden oder wobei es fähig ist, IL-5 und IL-4 zu binden.
  • In einer Ausführung besitzt das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung Spezifität für mehr als ein Antigen, wobei es zum Beispiel fähig ist, zwei oder mehr Antigene ausgewählt IL-13, IL-5 und IL-4 zu binden, wobei es zum Beispiel fähig ist, IL-13 und IL-4 gleichzeitig zu binden oder wobei es fähig ist, IL-13 und IL-5 gleichzeitig zu binden oder wobei es fähig ist, IL-5 und IL-4 gleichzeitig zu binden.
  • Es versteht sich, dass irgend eines der hier beschriebenen Antigen-Bindungskonstrukte fähig sein kann, zwei oder mehr Antigene gleichzeitig zu binden, zum Beispiel wie nachgewiesen durch stöchiometrische Analysen an Hand eines geeigneten Tests wie im Abschnitt der Beispiele, Methode 7 beschrieben.
  • Beispiele von Antigen-Bindungskonstrukten der Erfindung umfassen IL-13-Antikörper, welche eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-4 besitzen, zum Beispiel einen am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder am N-Terminus der leichten Kette befestigten Anti-IL-4 dAb, zum Beispiel der mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 16 bis 39, SEQ ID NR: 41 bis 43, SEQ ID NR: 87 bis 90, SEQ ID NR: 151, SEQ ID NR: 152 oder SEQ ID NR: 155 beschrieben ist. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4-Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können zudem eine oder mehr zusätzliche Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstruke umfassen IL-4-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-13 besitzen, zum Beispiel einen am D-Terminus oder N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigten Anti-IL-13-dAb, zum Beispiel der mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 48 bis 53, SEQ ID NR: 91, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 149, SEQ ID NR: 150 oder SEQ ID NR: 157 bis 160 und/oder die Leichte-Kette Sequenz in SEQ ID NR: 54 bis 59 beschrieben ist. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Katte befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können ebenfalls eine oder mehr Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität besitzen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder am N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstruke umfassen IL-13-Antikörper, welche eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-5 besitzen, zum Beispiel einen am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder am N-Terminus der leichten Kette befestigten Anti-IL-5-dAb. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigen IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-13-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität besitzen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IL-5-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-13 besitzen, zum Beispiel einen Anti-IL-13-dAb, befestigt am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette, zum Beispiel der mAbdAb, dessen Leichte-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 72 beschrieben ist. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13-Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IL-4-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-5 besitzen, zum Beispiel einen am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder am N-Terminus der leichten Kette befestigten Anti-IL-5-dAb. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-4-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-5-Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte könne eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IL-5-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-4 besitzen, zum Beispiel ein am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigten Anti-IL-4-dAb, zum Beispiel der mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 71 beschrieben ist. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen aufweisen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Die Erfindung stellt ebenso ein trispezifisches Bindungskonstrukt bereit, welches fähig ist, an IL-4, IL-13 und IL-5 zu binden.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IL-5-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-4 besitzen, zum Beispiel einen Anti-IL-4-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist und eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-13, zum Beispiel einen Anti-IL-13-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-5-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Die Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung umfassen solche, die Spezifität für IL-18 besitzen, solche die zum Beispiel eine Epitop-Bindungsdomäne aufweisen, die fähig ist, an IL-18 zu binden oder solche, die eine gepaarte VH/VL aufweisen, welche an IL-18 bindet. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen Antikörper aufweisen, der fähig ist, an IL-18 zu binden. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen dAb aufweisen, der fähig ist, an IL-18 zu binden.
  • Die Erfindung stellt auch ein trispezifischen Bindungskonstrukt bereit, das fähig ist, an IL-4, IL-13 und IL-18 zu binden.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IL-18-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-4 besitzen, zum Beispiel einen Anti-IL-4-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist und eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für IL-13, zum Beispiel einen Anti-IL-13-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL-18-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL-4 Epitop-Bindungsdomäne und einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL-13 Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität besitzen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Die Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung schließen solche mit Spezifität für TNFα ein, zum Beispiel solche, die eine Epitop-Bindungsdomäne aufweisen mit der Fähigkeit, an TNFα zu binden, oder welche eine gepaarte VH/VL aufweisen, die an TNFα bindet. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen Antikörper aufweisen, welcher die Fähigkeit hat, an TNFα zu binden. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen dAb aufweisen, der die Fähigkeit hat, an TNFα zu binden. In einer Ausführung besitzt das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung Spezifität für mehr als ein Antigen, wobei es zum Beispiel die Fähigkeit hat, zwei oder mehr Antigene ausgewählt aus TNFα, EGFR und VEGF zu binden, wobei es beispielsweise fähig ist, TNFα und EGFR zu binden, oder wobei es fähig ist, TNFα und VEGF zu binden oder wobei es fähig ist, EGFR und VEGF zu binden. Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen TNFα-Antikörper, welche eine Epitop-Bindungsdomäne mit Spezifität für EGFR besitzen, zum Beispiel einen Anti-EGFR-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, wie zum Beispiel ein mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 74 beschrieben und/oder dessen Leichte-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 79 beschrieben ist.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten EGFR Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten EGFR Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten EGFR Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten EGFR Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen EGFR-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten TNFα Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen EGFR-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten TNFα Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen EGFR-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten TNFα Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen EGFR-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten TNFα Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen TNFα-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für VEGF besitzen, zum Beispiel einen Anti-VEGF dAb, dem am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, wie zum Beispiel ein mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 75, 78 oder 185 beschrieben ist.
  • Das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung kann Spezifität für mehr als ein Antigen aufweisen, wobei es beispielsweise fähig ist, TNFα zu binden, und ein oder beide Antigene werden ausgewählt aus IL-4 und IL-13, wobei es zum Beispiel die Fähigkeit hat, TNFα und IL-4 zu binden oder wobei es fähig ist, TNFα und IL-13 zu binden oder wobei es fähig ist, TNFα und IL-13 und IL-4 zu binden. Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstruke umfassen IL-13-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für TNFα besitzen, zum Beispiel ein Anti-TNFα-Adnectin, das am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, zum Beispiel ein mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 134 oder 135 beschrieben ist. Weitere Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IL-4-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für TNFα besitzen, zum Beispiel ein Anti-TNFα-Adnectin, das am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, wie zum Beispiel ein mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 146 oder 147 beschrieben ist.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten VEGF Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten VEGF Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten VEGF Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen TNFα-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten VEGF Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten TNFα-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten TNFα-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten TNFα-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten TNFα-Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Die Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung umfassen solche, die Spezifität für CD-20 besitzen, zum Beispiel solche, die eine Epitop-Bindungsdomäne besitzen, die fähig ist, an CD-20 zu binden, oder solche mit einer gepaarten VH/VL, die an CD-20 bindet.
  • Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen Antikörper aufweisen mit der Fähigkeit, an CD-20 zu binden, es kann zum Beispiel einen Antikörper aufweisen, dessen Schwere- und Leichte-Ketten-Sequenzen in SEQ ID NR: 120 und 117 beschrieben sind. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen dAb aufweisen, der fähig ist, an CD-20 zu binden. Beispiele von mAbdAb mit Spezifität für CD-20 sind solche, deren Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 116, 118 beschrieben ist oder solche, deren Leichte-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 119 oder 121 beschrieben ist. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder unterschiedlichen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder dem N-Terminus der schweren Kette und/oder dem C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Die Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung umfassen solche mit Spezifität für IL1R1, zum Beispiel solche mit einer Epitop-Bindungsdomäne mit der Fähigkeit, an IL1R1 zu binden, oder solche mit einer gepaarten VH/VL, die an IL1R1 bindet. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen Antikörper aufweisen mit der Fähigkeit, an IL1R1 zu binden. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen dAb aufweisen mit der Fähigkeit, an IL1R1 zu binden.
  • In einer Ausführung besitzt das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung Spezifität für eines oder mehr Antigene, zum Beispiel für eines, das fähig ist, an IL1R1 zu binden und ein zweites Antigen, das beispielsweise fähig ist, an IL1R1 und VEGF zu binden. Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IL1R1-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für VEGF besitzen, zum Beispiel einen Anti-VEGF-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, zum Beispiel einen mAbdAb, dessen Leichte-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 77 beschrieben ist.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL1R1-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten VEGF-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL1R1-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten VEGF-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL1R1-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten VEGF-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen IL1R1-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten VEGF-Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungsdomänen mit derselben oder verschiedenen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am N-Terminus der schweren Kette befestigten IL1R1-Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am N-Terminus der leichten Kette befestigten IL1R1 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am C-Terminus der schweren Kette befestigten IL1R1 Epitop-Bindungsdomäne. Antigen-Bindungskonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen VEGF-Antikörper mit einer am C-Terminus der leichten Kette befestigten IL1R1 Epitop-Bindungsdomäne. Solche Antigen-Bindungskonstrukte können auch eine oder mehr weitere Epitop-Bindungskonstrukte mit derselben oder verschiedenen Antigen-Spezifität aufweisen und sind am C-Terminus und/oder am N-Terminus der schweren Kette und/oder am C-Terminus und/oder N-Terminus der leichten Kette befestigt.
  • Die Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung umfassen solche mit Spezifität für EGFR, zum Beispiel solche, die eine Epitop-Bindungsdomäne aufweisen, die fähig ist, an EGFR zu binden oder solche, die eine gepaarte VH/VL aufweisen, die an EGFR bindet.
  • Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen Antikörper aufweisen mit der Fähigkeit, an EGFR zu binden. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen dAb aufweisen mit der Fähigkeit, an EGFR zu binden. Einige Beispiele eines solchen Antigen-Bindungskonstrukts haben die Fähigkeit, an ein Epitop auf einem EGFR mit der SEQ ID NR: 103 zu binden, zum Beispiel ein Antigen-Bindungskonstrukt, das eine oder mehr in SEQ ID NR: 97 bis SEQ ID NR: 102 und SEQ ID NR: 104 bis SEQ ID NR: 107 beschriebene CDR aufweist.
  • In einer Ausführung besitzt das Antigen-Bindungskonstrukt der vorliegenden Erfindung Spezifität für mehr als ein Antigen, wobei es zum Beispiel fähig ist, zwei oder mehr Antigene ausgewählt aus EGFR, IGF-1R, VEGFR2 und VEGF zu binden, wobei es zum Beispiel fähig ist, EGFR und IGF-1R zu binden oder wobei es fähig ist, EGFR und VEGF zu binden oder wobei es fähig ist, VEGF und IGF-1R zu binden oder wobei es fähig ist, EGFR und VEGFR2 zu binden oder wobei es fähig ist, IGF-1R und VEGFR2 zu binden oder wobei es fähig ist, VEGF und VEGFR2 zu binden oder wobei es fähig ist, EGFR, IGF-1R und VEGFR2 zu binden oder wobei es fähig ist, VEGF, IGF-1R und VEGFR2 zu binden oder wobei es fähig ist, EGFR, VEGF und VEGFR2 zu binden oder wobei es fähig ist, EGFR, VEGF und IGF1R zu binden. Beispiele von solchen Antigen-Bindungskonstrukten umfassen EGFR-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit Spezifität für VEGFR2 besitzen, zum Beispiel ein Anti-VEGFR2-Adnectin, das am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, beispielsweise der mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 136, 140 oder 144 beschrieben und/oder dessen Leichte-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 138, 142 oder 145 beschrieben ist.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen EGFR-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für VEGF besitzen, zum Beispiel ein Anti-VEGF-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, zum Beispiel der mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 165, 174, 176, 178, 184 oder 186 beschrieben und/oder dessen Leichte-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 188 oder 190 beschrieben ist.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen VEGF-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit Spezifität für EGFR besitzen, zum Beispiel Anti-EGFR-dAb, der am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, zum Beispiel der mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 180 beschrieben ist. Solche mAbdAb können ebenfalls die in SEQ ID NR: 182 beschriebene Leichte-Kette-Sequenz aufweisen.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IGF-1R-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für VEGF besitzen, zum Beispiel ein Anti-VEGF-Lipocalin, das am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, zum Beispiel der mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 123 oder 125 beschrieben ist. Solche mAbdAb können auch die in SEQ ID NR: 113 beschriebene Leichte-Kette-Sequenz aufweisen.
  • Beispiele solcher Antigen-Bindungskonstrukte umfassen IGF-1R-Antikörper, die eine Epitop-Bindungsdomäne mit einer Spezifität für VEGFR2 besitzen, zum Beispiel ein Anti-VEGFR2-Adnectin, das am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren Kette oder am C-Terminus oder N-Terminus der leichten Kette befestigt ist, zum Beispiel den mAbdAb, dessen Schwere-Kette-Sequenz in SEQ ID NR: 124 oder 133 beschrieben ist. Solche mAbdAb können auch die in SEQ ID NR: 113 beschriebene Leichte-Kette-Sequenz aufweisen.
  • Die Antigen-Bindungskonstrukte der Erfindung umfassen solche, die Spezifität für IL-23 besitzen, zum Beispiel solche, die eine Epitop-Bindungsdomäne aufweisen mit der Fähigkeit an IL-23 zu binden oder welche eine gepaarte VH/VL aufweisen, die an IL-23 bindet.
  • Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen Antikörper aufweisen, der fähig ist, an IL-23 zu binden. Das Antigen-Bindungskonstrukt kann einen dAb aufweisen, der fähig ist, an IL-23 zu binden.
  • Bei einer Ausführungsform verfügt das antigen-bindende Konstrukt der vorliegenden Erfindung über eine Spezifität für mehr als ein Antigen, z. B. wenn es in der Lage ist, zwei oder mehr Antigene zu binden, die etwa aus einer Menge von H17-artigen Zytokinen wie etwa IL-17, IL-22 und IL-21 ausgewählt worden sind; oder wenn es in der Lage, IL-23 und IL-17 zu binden; oder wenn es in der Lage ist, IL-23 und IL-21 bzw. IL-23 und IL-22 zu binden. Ein Beispiel für solche antigen-bindenden Konstrukte sind u. a. die IL-23-Antikörper, die über eine epitop-bindende Domäne mit einer Spezifität für IL-17 verfügen, z. B. ein anti-IL-17 dAb, das mit dem C-Terminus bzw. dem N-Terminus der schweren Kette oder mit dem N-Terminus der leichten Kette verbunden ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für PDGFRα, z. B. indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an PDGFRα in der Lage ist, oder indem sie etwa über eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an PDGFRα verfügen. Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an PDGFRα in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann einen dAb enthalten, der zu einer Bindung an PDGFRα in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für FGFR1, z. B. indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an FGFR1 in der Lage ist, oder indem sie etwa über eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an FGFR1 verfügen. Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an FGFR1 in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann einen dAb enthalten, der zu einer Bindung an FGFR1 in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für FGFR3, .B. indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an FGFR3 in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an FGFR3 enthalten. Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an FGFR3 in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zu einer Bindung an FGFR3 in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für VEGFR2, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an VEGFR2 in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an VEGFR2.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an VEGFR2 in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zu einer Bindung an VEGFR2 in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für VEGFR3, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an VEGFR3 in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an VEGFR3 enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an VEGFR3 in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zu einer Bindung an VEGFR3 in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für VE Cadherin, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an VE Cadherin in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an VE Cadherin enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an VE Cdherin in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zu einer Bindung an VE Cdherin in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für Nuropilin, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an Neuropilin in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an Neuropilin enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an Neuropilin in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb, die zur Bindung an Neuropilin in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für Flt-3, indem sie etwa etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an Flt-3 in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an Flt-3 enthalten. Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an Flt-3 in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zur Bindung an Flt-3 in der Lage ist. Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für Ron, indem sie etwa etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an Ron in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an Ron enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an Ron in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zur Bindung an Ron in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für Trp-1, indem sie etwa etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an Trp-1 in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an Trp-1 enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an Trp-1 in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zur Bindung an Trp-1 in der Lage ist.
  • Bei einer Ausführungsform verfügt das antigen-bindende Konstrukt der vorliegenden Erfindung über eine Spezifität für mehr als ein Antigen, so etwa, wenn es in der Lage ist, zwei oder mehr krebserregende Antigene zu binden, wie etwa zwei oder mehr der folgenden Antigene: PDGFRα, FGFR1, FGFR3, VEGFR2, VEGFR3, IGF1R, EGFR und VEGF, VE Cadherin, Neuropilin, Flt-3, Ron, Trp-1, CD-20, oder wenn es zur Bindung von PDGFRα und FGFR1 in der Lage ist, oder zur Bindung von PDGFRα und VEGF in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von PDGFRα und FGFR3 bzw. PDGFRα und VEGFR2 in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von PDGFRα und VEGFR3 oder PDGFRα und IGF1R in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von PDGFRα und EGFR oder PDGFRα und VEGF in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von PDGFRα und VE Cadherin in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von PDGFRα und Neuropilin, PDGFRα und Flt-3, PDGFRα und Ron, oder PDGFRα und Trp1 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von PDGFRα und CD-20, FGFR1 und FGFR3,
    oder FGFR1 und VEGFR2 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von FGFR1 und VEGR3, FGFR1 und IGF1R, oder FGFR1 und EGFR in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von FGFR1 und VEGF, FGFR1 und VE Cadherin, oder FGFR1 und Neuropilin in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von FGFR1 und Flt-3, FGFR1 und Ron, oder FGFR1 und Trp-1 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von FGFR1 und CD-20, FGFR3 und VEGFR2, oder FGFR3 und VEGFR3 in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von FGFR3 und IGF1R, FGFR3 und EGFR, oder FGFR3 und VEGF in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von FGFR3 und VE Cadherin, GFR3 und Neuropilin, oder FGFR3 und Flt-3 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von FGFR3 und Ron, FGFR3 und Trp-1, oder FGFR3 und CD-20 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGFR2 und VEGFR3, VEGFR2 und IGF1R, oder VEGFR2 und EGFR in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGFR2 und VEGF oder VEGFR2 und VE Cadherin in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGFR2 und Neuropilin, VEGFR2 und Flt-3, oder VEGFR2 und Ron in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGFR2 und Trp-1, VEGFR2 und CD-20, oder VEGFR3 und IGF-1R in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGFR3 und EGFR, VEGFR3 und VEGF, oder VEGFR3 und VE Cadherin in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGFR3 und Neuropilin, VEGFR3 und Flt-3, oder VEGFR3 und Trp-1 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGFR3 und CD-20, IGF1R und EGFR, oder IGF1R und VEGF in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von IGF1R und VE Cadherin, IGF1R und Neuropilin, oder IGF1R und Flt-3 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von IGF1R und Ron, IGF1R und Trp-1, oder IGF1R und CD-20 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von EGFR und VEGF, EGFR und VE Cadherin, oder EGFR und Neuropilin in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von EGFR und Flt-3
    oder EGFR and Ron in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von EGFR und Trp-1, EGFR und CD-20, oder VEGF und VE Cadherin in der Lage ist, oder wenn es zhur Bindung von VEGF und Neuropilin, VEGF und Flt-3, oder VEGF und Ron in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VEGF und Trp-1, VEGF und CD-20, oder VE Cadherin und Neuropilin in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VE Cadherin und Flt-3, VE Cadherin und Ron, oder VE Cadherin und Trp-1 in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von VE cadherin und CD-20, Neuropilin und Flt-3, oder Neuropilin und Ron in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von Neuropilin und Trp-1, Neuropilin und CD-20, oder Flt-3 und Ron in der Lage ist,
    oder wenn es zur Bindung von Flt-3 und Trp-1, Flt-3 und CD-20, oder Ron und Trp-1 in der Lage ist, oder wenn es zur Bindung von Ron und CD-20 oder Trp-1 und CD-20 in der Lage ist.
  • Solch antigen-bindende Konstrukte können zusätzlich auch über eine oder mehrere epitop-bindende Domänen mit derselben oder einer anderen Spezifität verfügen, die mit dem C-Terminus und/oder dem N-Terminus der schweren Kette und/oder mit dem C-Terminus bzw. N-Terminus der leichten Kette verbunden ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für Beta-Amyloid, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an Beta-Amyloid in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an Beta-Amyloid enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an Beta-Amyloid in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zu einer Bindung an Beta-Amyloid in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für CD-3, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an CD-3 in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an CD-3 enthalten. Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an CD-3 in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zur Bindung an CD-3 in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für GpIIIb/IIa, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an GpIIIb/IIa in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an GpIIIb/IIa enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an GpIIIb/Lia in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zur Bindung an GpIIIb/IIa in der Lage ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der Erfindung sind u. a. solche mit einer Spezifität für TGFbeta, indem sie etwa eine epitop-bindende Domäne enthalten, die zu einer Bindung an TGFbeta in der Lage ist, oder indem sie etwa eine paarweise auftretende VH/VL mit Bindung an TGFbeta enthalten.
  • Das antigen-bindende Konstrukt kann einen Antikörper enthalten, der zu einer Bindung an TGFbeta in der Lage ist. Das antigen-bindende Konstrukt kann eine dAb enthalten, die zur Bindung an TGFbeta in der Lage ist.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein antigen-bindendes Konstrukt gemäß der hierin beschriebenen Erfindung geliefert, das über eine konstante Region verfügt, sodass der Antikörper das ADCC und/oder die Komplementaktivierung oder die Effektorfunktionalität verringert hat. Bei einer solchen Ausführungsform kann die konstante Region der schweren Kette eine auf natürliche Weise außer Kraft gesetzte Region von IgG2 oder IgG4-Isotypen oder eine mutierte konstante IgG1-Region umfassen. Beispiele für passende Modifikationen warden in EP0307434 beschrieben. Ein Beispiel umfasst die Substitutionen von Alaninresten in den Positionen 235 und 237 (EU-Indexnummerierung).
  • Bei einer Ausführungsform bewahren die antigen-bindenden Konstrukte der vorliegenden Erfindung die Fc-Funktionalität; so können sie z. B. entweder zu ADCC- oder CDC-Aktivität oder zu beidem zugleich in der Lage sein. Solche antigenbindenden Konstrukte können eine epitop-bindende, auf der leichten Kette befindliche Domäne umfassen, z. B. auf dem C-Terminus der leichten Kette.
  • Die Erfindung bietet zudem eine Methode zur Aufrechterhaltung von ADCC- und CDC-Funktionen antigen-bindender Konstrukte durch Positionierung der epitop-bindenden Domäne auf der leichten Kette des Antikörpers, und insbesondere durch Positionierung der epitop-bindenden Domäne auf dem C-Terminus der leichten Kette. Solche ADCC- und CDC-Funktionen können mit Hilfe einer beliebigen passenden Probe gemessen werden, wie etwa der in Beispiel 15.3 dargelegten ADCC-Probe oder der in Beispiel 15.4 dargelegten CDC-Probe.
  • Die Erfindung bietet zudem eine Methode der Reduzierung der CDC-Funktion antigen-bindendender Konstrukte durch Positionierung der epitop-bindenden Domäne auf der schweren Kette des Antikörpers, und insbesondere durch Positionierung der epitop-bindenden Domäne auf dem C-Terminus der schweren Kette. Solche CDC-Funktionen können mit Hilfe einer beliebigen passenden Probe gemessen werden, wie etwa der in Beispiel 15.4 dargelegten CDC-Probe.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform ist das antigen-bindende Konstrukt der vorliegenden Erfindung in der Lage, zwei oder mehr aus VEGF, IGF-1R und EGFR ausgewählte Antigene zu binden; so ist es z. B in der Lage, EGFR und VEGF bzw. EGFR und IGF1R bzw. IGF1R und VEGF zu binden, oder es ist in der Lage, diese etwa an TNF und IL1-R zu binden. Bei Ausführungsformen der Erfindung, die eine Bindungsstelle zu IGF-1R umfassen, kann die Bindungsstelle zu IGF-1R des antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung eine paarweise vorhandene VH/VL Domäne im Proteingerüst umfassen, wobei diese paarweise vorhandene VH/VL-Domäne eine oder mehrere der CDRs umfassen kann, die in SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 und SEQ ID NO: 86 dargelegt sind.
  • So kann sie z. B. zumindest CDRH3 umfassen, das in SEQ ID NO: 80 dargelegt ist, oder sie kann sämtliche CDRs umfassen, die in SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, und SEQ ID NO: 86 dargelegt sind.
  • Bei Ausführungsformen der Erfindung, die eine EGFR-Bindungsstelle beinhalten, kann das antigen-bindende Konstrukt der vorliegenden Erfindung über eine Bindung an ein Epitop
    verfügen, das Spuren 273-501 einer reifen, Normal- oder Wildtypsequenz im EGFR aufweist; so kann es z. B. über eine Bindung an ein Epitop verfügen, die Spuren 287-302 der reifen bzw. Normal- oder Wildtypsequenz im EGFR (SEQ ID NO: 103) umfasst.
  • Bei einer Ausführungsform kann die EGFR-Bindungsstelle des antigen-bindenden Konstrukts der Erfindung eine paarweise vorhandene VH/VL-Domäne im Proteingerüst umfassen, wobei diese paarweise vorhandene VH/VL-Domäne ihrerseits eine oder mehrere der in SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 und SEQ ID NO: 102 dargelegten CDRs umfasst. So kann sie z. B. CDRH3 enthalten, wie in SEQ ID NO: 106 dargelegt, oder sie kann sämtliche sechs CDRs enthalten, die in SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 und SEQ ID NO: 102 dargelegt sind. Eine solche paarweise vorhandene VH/VL-Domäne kann zusätzlich weitere Spuren umfassen, vor allem in den CDRs der schweren Kette, und bei einer Ausführungsform kann CDRH1 SEQ ID NO: 104 sowie bis zu fünf zusätzliche Spuren umfassen, wie etwa eine oder mehrere in SEQ ID NO: 97 dargelegte Spuren, und CDRH2 kann SEQ ID NO: 105 sowie bis zu zwei zusätzliche Spuren umfassen, wie etwa eine oder beide in SEQ ID NO: 98 und SEQ ID NO: 107 dargelegte Spuren, und CDRH3 kann SEQ ID NO: 106 sowie bis zu zwei zusätzliche Spuren umfassen, wie etwa eine oder beide in SEQ ID NO: 99 dargelegte Spuren. Bei einer solchen Ausführungsform umfasst die paarweise vorhandene VH/VL eine oder mehrere der in SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 bzw. SEQ ID NO: 102 dargelegten CDRs; so kann sie z. B. mindestens CDRH3 umfassen, wie in SEQ ID NO: 99 dargelegt, oder sie kann alle sechs in SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 bzw. SEQ ID NO: 102 dargelegten CDRs umfassen (für weitere Einzelheiten zu passenden Antikörpern siehe WO02/092771 und WO2005/081854 ).
  • Bei einer Ausführungsform enthalten die antigen-bindenden Konstrukte eine epitop-bindende Domäne, die ein Domänenantikörper (dAb) ist; so kann etwa die epitop-bindende Domäne eine menschliche VH-Domäne oder menschliche VL-Domäne, oder auch ein Camelidae-VHH oder eine Hai-dAb (NARV) sein. Bei einer Ausführungsform enthalten die antigen-bindenden Konstrukte eine epitop-bindende Domäne, die ein Derivativ eines aus der folgenden Gruppe ausgewählten Gerüstes darstellt: CTLA-4 (Evibody); Lipocalin; von Protein A abgeleitete Moleküle wie etwa die Z-Domäne von Protein A (Affibody, SpA), A-Domäne (Avimer/Maxibody); Hitzeschockproteine wie etwa GroEI und GroES; Transferrin (Trans-body); Ankyrin-Repeat-Protein (DARPin); Peptid-Aptamer; Lectindomäne vom Typ C (Tetranectin); menschliches γ-Krystallin und menschliches Ubiquitin (Affilins); PDZ-Domänen; menschliche Hemmsubstanzdomänen vom Typ Skorpiontoxin Kunitz; sowie Fibronectin (Adnectin), das durch Protein Engineering behandelt wurde, um eine Bindung an einen Liganden zu erhalten, der vom natürlichen Liganden verschieden ist.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der vorliegenden Erfindung können ein Proteingerüst an einer epitop-bindenden Domäne umfassen, welches ein Adnectin darstellt, wie z. B. ein IgG-Gerüst mit einem am C-Terminus der schweren Kette befindlichen Adnectin, oder sie können ein mit einem Adnectin verbundenes Proteingerüst umfassen, wie etwa ein IgG-Gerüst mit einem am N-Terminus der schweren Kette befindlichen Adnectin, oder sie können ein mit einem Adnectin verbundenes Proteingerüst umfassen, wie etwa ein IgG-Gerüst mit einem am C-Terminus der leichten Kette befestigten Adnectin, oder sie können ein mit einem Adnectin verbundenes Proteingerüst umfassen, wie etwa ein IgG-Gerüst mit einem am N-Terminus der leichten Kette befindlichen Adnectin.
  • Bei anderen Ausführungen können sie ein mit einer eine CTLA-4 darstellende epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, wie z. B. ein IgG-Gerüst mit einer mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen CTLA-4, oder sie können z. B. ein IgG-Gerüst mit einer am C-Terminus der schweren Kette verbundenen CTLA-4 umfassen, oder sie können z. B. ein IgG-Gerüst mit einer am N-Terminus der leichten Kette verbundenen CTLA-4 umfassen, oder sie können z. B. ein IgG-Gerüst mit einer am C-Terminus der leichten Kette verbundenen CTLA-4 umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann das antigen-bindende Konstrukt ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, wobei diese Domäne ein Lipocalin darstellt, wie z. B. ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen Lipocilin, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen Lipocilin umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen Lipocilin umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der Leichten Kette verbundenen Lipocilin umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein SpA darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen SpA, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen SpA umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen SpA umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen SpA umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein Affibody darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen Affibody, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen Affibody umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen Affibody umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen Affibody umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein Affimer darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen Affimer, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen Affimer umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen Affimer umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen Affimer umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein GroEI darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen GroEI, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen GroEI, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen GroEI umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen GroEI umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein Transferrin darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen Transferrin, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen Transferrin, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen Transferrin umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen Transferrin umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein GroES darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen GroES, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen GroES, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen GroES umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen GroES umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein DARPin darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen DARPin, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen DARPin, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen DARPin umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen DARPin umfassen.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann es ein mit einer epitop-bindenden Domäne verbundenes Proteingerüst umfassen, das ein Peptid-Aptamer darstellt, wie etwa ein ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der schweren Kette verbundenen Peptid-Aptamer, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der schweren Kette verbundenen Peptid-Aptamer, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem N-Terminus der leichten Kette verbundenen Peptid-Aptamer umfassen, oder es kann ein IgG-Gerüst mit einem mit dem C-Terminus der leichten Kette verbundenen Peptid-Aptamer umfassen.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gibt es vier epitop-bindende Domänen, z. B. vier Domänenantikörper, wobei zwei der epitop-bindenden Domänen oder auch sämtliche vorhandenen epitop-bindenden Domänen eine Spezifität für dasselbe Antigen haben können.
  • Proteingerüste der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe von Verknüpfern mit epitop-bindenden Domänen verbunden werden. Beispiele für passende Verknüpfer sind u. a. Aminosäuresequenzen mit einer Länge von 1 bis 150 Aminosäuren, oder von 1 bis 140 Aminosäuren, von 1 bis 130 Aminosäuren oder von 1 bis 120 Aminosäuren, oder von 1 bis 80 Aminosäuren, oder von 1 bis 50 Aminosäuren, oder von 1 bis 20 Aminosäuren, oder von 1 bis 10 Aminosäuren, oder von 5 bis 18 Aminosäuren. Solche Sequenzen können über ihre eigene Tertiärstruktur verfügen; so kann etwa ein Verknüpfer der vorliegenden Erfindung eine einzelne variable Domäne umfassen. Passende Verknüpfer können eine Größe von zwischen 1 bis 20 Angströms, oder weniger als 15 Angströms, oder weniger als 10 Angströms, oder schließlich weniger als 5 Angströms.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist mindestens eine der epitop-bindenden Domänen direct über einen 1 bis 50, oder 1 bis 20 bzw. 1 bis 10 Aminosäuren umfassenden Verknüpfer mit dem Ig-Gerüst verbunden. Solche Verknüpfer können aus einer beliebigen der in SEQ ID NO: 6 to 11 dargelegten Mengen ausgewählt werden; dabei kann es sich um „TG” (Serin, Threonin, Glycin), „GSTG” oder „RS” handeln, so kann der Verknüpfer z. B. „TVAAPS” oder „GGGGS” sein. In den antigen-bindenden Konstrukten der vorliegenden Erfindung verwendete Verknüpfer können einzeln oder in Verbindung mit anderen Verknüpfern eine oder mehr Mengen von GS-Spuren umfassen, wie etwa „GSTVAAPS” oder „TVAAPSGS” oder „GSTVAAPSGS”. Bei einer anderen Ausführungsform gibt es keinen Verknüpfer zwischen der there epitop-bindenden Domäne, z. B. ein dAb, und dem Ig-Gerüst. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die epitop-bindende Domäne, z. B. ein dAb, mit dem Ig-Gerüst durch den Verknüpfer „TVAAPS” verbunden. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die epitop-bindende Domäne, z. B. ein dAb, mit dem Ig-Gerüst durch den Verknüpfer „TVAAPSGS” verbunden. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die epitop-bindende Domäne, z. B. ein dAb, mit dem Ig-Gerüst durch den Verknüpfer „GS” verbunden.
  • Bei einer Ausführungsform umfasst das antigen-bindende Konstrukt der vorliegenden Erfindung mindestens eine epitop-bindende Domäne, die zur Bindung von menschlichem Serum Albumin in der Lage ist.
  • Bei einer Ausführungsform gibt es mindestens 3 Antigen-Bindungsstellen, oder auch 4, 5, 6, 8 oder 10 Antigen-Bindungsstellen, und das antigen-bindende Konstrukt ist in der Lage, mindestens 3, 4, 5, 6, 8 oder 10 Antigene zu binden, oder ist es in der Lage, 3, 4, 5, 6, 8 oder 10 Antigene gleichzeitig zu binden.
  • Die Erfindung liefert die in der Medizin – z. B. bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krebs oder Entzündungskrankheiten wie etwa Asthma, Gelenkrheumatismus und Arthrose verwendeten antigen-bindenden Konstrukte.
  • Die Erfindung bietet eine Behandlungsmethode für Patienten, die an Krebs oder Entzündungskrankheiten wie etwa Asthma, Gelenkrheumatismus oder Arthrose leiden; sie umfasst die Verabreichung einer Behandlungsmenge eines antigenbindenden Konstruktes der Erfindung.
  • Das antigen-bindende Konstrukt der Erfindung kann zur Behandlung von Krebs oder Entzündungskrankheiten wie etwa Asthma, Gelenkrheumatismus oder Arthrose eingesetzt werden.
  • Das antigen-bindende Konstrukt der Erfindung kann eine Effektorfunktion haben, wenn z. B. das Proteingerüst eine von einem Antikörper abgeleitete Fc-Region enthält, oder wenn das Proteingerüst CH2 und CH3 von IgG1 umfasst. Die Ebenen der Effektorfunktion lassen sich gemäß den bekannten Techniken variieren, z. B. durch Mutationen in der CH2-Domäne, wobei die IgG1-CH2-Domäne eine oder mehrere Mutationen an ausgewählten Positionen von 239 und 332 und 330 aufweist, oder wobei die Mutationen aus S239D und I332E und A330L derart ausgewählt werden, dass der Antikörper eine erweiterte Effektorfunktion ausüben kann, und/oder wobei das Glycosylationsprofil des antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung derart geändert wird, dass dadurch eine Reduktion der Fucosylierung in der Fc-Region herbeigeführt wird.
  • Bei der vorliegenden Erfindung verwendete Proteingerüste sind u. a. vollständige monoklonische Antikörpergerüste, die sämtliche Domänen eines Antikörpers umfassen, oder Proteingerüste der vorliegenden Erfindung können auch eine nicht-konventionelle Antikörperstruktur aufweisen, wie etwa einen monovalenten Antikörper. Solch monovalente Antikörper können eine paarweise vorhandene schwere und leichte Kette aufweisen, wobei die Gelenkregion der schweren Kette derart modifiziert ist, dass die schwere Kette nicht homodimerisiert, wie etwa der in WO2007059782 beschriebene monovalente Antikörper. Andere monovalente Antikörper können eine paarweise vorhandene schwere und leichte Kette aufweisen, die mit einer zweiten schweren Kette dimerisiert, wobei diese zweite schwere Kette über keine funktional variable Region und CH1-Region verfügt und die erste und zweite schwere Kette derart modifiziert werden, dass sie gemeinsam Heterodimere anstatt Homodimere bilden, sodass das Resultat ein monovalenter Antikörper mit zwei schweren Ketten und einer leichten Kette wie z. B. der in WO2006015371 beschriebene monovalente Antikörper ist. Solch monovalente Antikörper können das Proteingerüst der vorliegenden Erfindung liefern, mit dem epitop-bindende Domänen verbunden werden können, wie etwa die in Beispiel 32 beschriebenen antigenbindenden Konstrukte.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten epitope-bindenden Domänen dienen speziell dazu, ein Antigen oder ein Epitop unabhängig von einer anderen V-Region oder Domäne zu binden; dabei kann es sich um einen Domänen-Antikörper oder um eine Domäne handeln, die von einem aus der folgenden Gruppe ausgewählten Gerüst abgeleitet ist: CTLA-4 (Evibody); Lipocalin; von Protein A abgeleitete Moleküne wie etwa die Z-Domäne von oProtein A (Affibody, SpA), A-Domäne (Avimer/Maxibody); Hitzeschockproteine wie etwa GroEI und GroES; Transferrin (Transbody); Ankyrin-Repeat-Pprotein (DARPin); Peptid-Aptamer; Lectindomäne vom Typ C (Tetranectin); menschliches γ-Krystallin und menschliches Ubiquitin (Affilins); PDZ-Domänen; menschliche Hemmsubstanz domänen vom Typ Skorpiontoxin Kunitz; sowie Fibronectin (Adnectin), das durch Protein Engineering behandelt wurde, um eine Bindung an einen Liganden zu erhalten, der vom natürlichen Liganden verschieden ist. Bei einer Ausführungsform kann es sich hierbei um einen Domänenantikörper oder sonstige passende Domänen handeln, wie etwa Domänen aus der Gruppe : CTLA-4, Lipocallin, SpA, ein Affibody, ein Avimer, GroEI, Transferrin, GroES und Fibronectin. Bei einer Ausführungsform kann dieser aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: eine dAb, ein Affibody, ein Ankyrin-Repeat-Protein (DARPin) und ein Adnectin. Bei einer anderen Ausführungsform kann er aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: ein Affibody, ein Ankyrin-Repeat-Protein (DARPin) und ein Adnectin. Bei einer anderen Ausführungsform kann es sich dabei um einen Domänenantikörper handeln, wie etwa einem menschlichen, Camelidae- oder Hai-(NARV)-Domänenantikörper.
  • Epitope-bindende Domänen können mit dem Proteingerüst an einer oder mehreren Stellen verbunden sein. Diese Stellen umfassen u. a. den C-Terminus und den N-Terminus des Proteingerüsts, wie etwa den C-Terminus der schweren Kette und/oder den C-Terminus der leichten Kette eines IgG, oder z. B. den N-Terminus der schweren Kette und/oder den N-Terminus der leichten Kette eines IgG.
  • Bei einer Ausführungsform ist eine erste epitop-bindende Domäne mit dem Proteingerüst verbunden und eine zweite epitop-bindende Domäne ist mit der ersten epitop-bindenden Domäne verbunden; wobei das Proteingerüst ein IgG-Gerüst ist; eine erste epitop-bindende Domäne kann mit dem C-Terminus der schweren Kette des IgG-Gerüsts verbunden sein, und dieselbe epitop-bindende Domäne kann außerdem an ihrem C-Terminus mit einer zweiten epitop-bindenden Domäne verbunden sein, oder eine erste epitop-bindende Domäne kann mit dem C-Terminus der leichten Kette des IgG-Gerüsts verbunden sein, und dieselbe epitop-bindende Domäne kann außerdem an ihrem C-Terminus mit einer zweiten epitop-bindenden Domäne verbunden sein, oder eine erste epitop-bindende Domäne kann mit dem N-Terminus der leichten Kette des IgG-Gerüsts verbunden sein, und dieselbe epitop-bindende Domäne kann außerdem an ihrem N-Terminus mit einer zweiten epitop-bindenden Domäne verbunden sein, oder eine erste epitop-bindende Domäne kann mit dem N-Terminus der schweren Kette des IgG-Gerüsts verbunden sein, und dieselbe epitop-bindende Domäne kann außerdem an ihrem N-Terminus mit einer zweiten epitop-bindenden Domäne verbunden sein. Beispiele solcher antigenbindenden Konstrukte sind in Beispiel 31 beschrieben.
  • Wenn die epitop-bindende Domäne ein Domänenantikörper ist, so können einige Domänenantikörper an bestimmten Positionen innerhalb des Gerüstes angebracht werden.
  • In der vorliegenden Erfindung verwendete Domänenantikörper können mit dem C-Ausgang der schweren Kette terminal und/oder der leichten Kette konventioneller IgGs verbunden werden. Außerdem können einige dAbs an die C-Ausgänge sowohl der schweren als auch der leichten Kette konventioneller Antikörper angeschlossen werden.
  • Bei Konstrukten, in denen der N-Terminus der dAbs mit einer antikörper-konstanten Domäne verschmolzen ist, (entweder CH3 oder CL), kann ein Peptidenverknüpfer dem dAb bei der Bindung an das Antigen behilflich sein. Tatsächlich liegt der N-Ausgang des dAb in der Nähe der die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRS), die in den antigen-bindenden Aktivitäten involviert sind. Daher wird ein kurzer Peptid-Verknüpfer als Distanzhalter zwischen der epitop-bindenden und der konstanten Domäne des Proteingerüsts verwendet, wodurch die dAb-CDRs das Antigen leichter erreichen können, welches sich dadurch wiederum mit größerer Übereinstimmung binden kann.
  • Die Umgebung, in der dAbs mit dem IgG gebunden werden, unterscheidet sich je nachdem, mit welcher Antikörperkette sie verschmolzen werden: Wenn die dAbs mit dem C-Ausgang der leichten Antikörperkette eines IgG-Gerüstes verschmolzen werden, dann liegt jedes dAb voraussichtlich in der Nähe des Antikörpergelenks und des Fc-Abschnitts. Es ist wahrscheinlich, dass solche dAbs weit voneinander entfernt liegen. Bei konventionellen Antikörpern kann der Winkel zwischen Fab-Fragmenten erheblich von dem Winkel zwischen jedem Fab-Fragment und dem Fc-Abschnitt abweichen. Es ist wahrscheinlich, dass – wie bei mAbdAbs – die Winkel zwischen den Fab-Fragmenten nicht erheblich verschieden ist, während hingegen einige Winkelbeschränkungen beim Winkel zwischen jedem Fab-Fragment und dem Fc-Abschnitt zu beobachten sind.
  • Wenn die dAbs mit dem C-Ausgang der schweren Antikörperkette eines IgG-Gerüstes verschmolzen werden, dann liegt jedes dAb voraussichtlich in der Nähe der CH3-Domänen des Fc-Abschnitts. Eine Beeinträchtigung der Fc-Bindungseigenschaften der Fc-Rezeptoren (z. B. FcγRI, II, III ein FcRn) ist dadurch nicht zu erwarten, da diese Rezeptoren mit den CH2-Domänen (bei der FcγRI-, II- und III-Klasse von Rezeptoren) bzw. mit den Gelenken zwischen den CH2- und CH3-Domänen (z. B. FcRn-Rezeptor) interagieren. Eine weiteres Merkmal solcher antigen-bindenden Konstrukte ist, dass beide dAbs räumlich nahe beieinander liegen und dass – vorausgesetzt, dass durch passende Verknüfer für Flexibilität gesorgt wird – diese dAbs sogar homodimerische Arten bilden können, woher die reißverschlussartige quartäre Struktur des Fc-Abschnitts herrührt, der die Stabilität des Konstruktes verbessert.
  • Solch strukturelle Erwägungen können bei der Wahl der passendsten Stelle als Bindungsstelle einer epitop-bindenden Domäne behilflich sein, wie etwa ein dAb an ein Proteingerüst wie etwa einen Antikörper.
  • Die Größe des Antigens, seine Lokalisierung (im Blut oder auf einer Zelloberfläche), seine quartäre Struktur (monomerisch oder multimerisch) können variieren. Konventionellel Antikörper sind aufgrund des Vorhandenseins der Gelenkregion natürlich so beschaffen, dass sie als Adaptorkonstrukte fungieren können, während die Orientierung der beiden Antigen-Bindestellen an der Spitze des Fab-Fragments sehr unterschiedlich ausfallen kann und daher an die molekulare Beschaffenheit des Antigens und seiner Umgebung angepasst ist. Im Unterschied dazu können mit einem Antikörper oder einem sonstigen Proteingerüst – z. B. einem Proteingerüst, dass einen Antikörper ohne Gelenkregion umfasst – verbundene dAbs entweder direkt oder indirekt weniger strukturelle Flexibilität aufweisen.
  • Ein Verständnis des Lösungsstatus' und des Bindungsmodus am dAb ist ebenfalls hilfreich. Es gibt eine wachsende Zahl von Belegen dafür, dass in vitro dAbs vor allem in monomerischen, homo-dimerischen oder multimerischen Formen in Lösung existieren kann (Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698; Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553, Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903; Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165; Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365). Dies ist ziemlich analog zu in vivo beobachteten Multimerisierungsereignissen mit Ig-Domänen wie etwa Bence-Jones-Proteinen (die Dimere von leichten Immunoglobulinketten darstellen (Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952; Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857; Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301) sowie Amyloid-Fasern (James et al. (2007) J Mol Biol. 367: 603-8).
  • So kann es z. B. geboten sein, Domänenantikörper, die zur Dimerisierung in einer Lösung tendieren, mit dem C-Ausgang des Fc-Abschnitts anstatt mit dem C-Ausgang der leichten Kette zu verbinden, weil die Bindung an den C-Ausgang des Fc es diesen dAbs erlaubt, im Kontext des antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung zu dimerisieren.
  • Das antigen-bindende Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann Antigen-Bindungsstellen umfassen, die speziell für ein Antigen bestimmt sind, oder es kann Antigen-Bindungsstellen umfassen, die speziell für zwei oder mehrere Antigene bestimmt sind, oder für zwei oder mehrere Epitope auf einem einzelnen Antigen, oder es können Antigen-Bindungsstellen existieren, deren jede speziell für jeweils ein anderes Epitop auf demselben oder auf verschiedenen Antigenen bestimmt sind.
  • Die Antigen-Bindungsstellen können jeweils eine Bindungsspezifität für ein bestimmtes Antigen aufweisen, wie etwa menschliche oder tierische Proteine einschließlich Zytokine, Wachstumsfaktoren, Zytokinrezeptoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Enzyme (z. B. Proteasen), Co-Faktoren für Enzyme, DNA-bindende Proteine, Lipide und Kohlenhydrate. Passende Ziele einschließlich Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Zytokinrezeptoren, Wachstumsfaktorrezeptoren und sonstige Proteine umfassen u. a. – sind jedoch nicht beschränkt auf: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrophin-1, CEA, CD40, CD40 Ligand, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF Rezeptor, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Exodus-2, FAPα, FGF-Säure, FGF-Lauge, Fibroblast-Wachstumsfaktor-10, FLT3-Ligand, Fractalkin (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, menschliches Serum Albumin, Insulin, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-1-Rezeptor, IL-1-Rezeptor Typ 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a. a.), IL-8 (77 a. a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibin α, Inhibin β, IP-10, Keratinocyte Growth Factor-2 (KGF-2), KGF, Leptin, LIF, Lymphotactin, Müllersche Hemmsubstanz, Hemmfaktor für Monozytenkolonien, Monozytenanziehungsprotein, M-CSF, c-fms, v-fmsMDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, Hemmfaktor-1 gegen die Verbreitung von Myeloiden (MPIF-1), NAP-2, Neurturin, Nervenwachstumsfaktor, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatin M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, Stammzellenfaktor (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, Tumornekrosisfaktor (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF-Receptor I, TNF-Receptor II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF receptor 1, VEGF receptor 2, VEGF receptor 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, Serum Albumin, vWF, Amyloid-Proteine (z. B. Amyloid Alpha), MMP12, PDK1, IgE, und sonstige hier offenbarte Ziele. Wir bitten um Verständnis, dass diese Liste auf keinen Fall vollständig ist.
  • In einigen Ausführungen bindet das protease-resistente Peptid oder Polypeptid ein Ziel im Lungengewebe, z. B. ein zu der folgenden Gruppe gehörendes Ziel: TNFR1, IL-1, IL-1 R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), Chymase, FGF, Furin, Endothelin-1, Eotaxins (z. B. Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, Integrins, L-Selectin, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, Neutrophil Elastase, Osteopontin, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Thrombin, Tim-1, TNF, TRANCE, Tryptase, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, Alphavbeta6, Alphavbeta8, cMET, CD8, vWF, Amyloid-Proteine (z. B. Amyloid Alpha), MMP12, PDK1, und IgE.
  • Vor allem können sich die antigen-bindenden Konstrukte der vorliegenden Erfindung als sehr nützlich bei der Behandlung von mit IL-13, IL-5 und IL-4 zusammenhängenden Krankheiten erweisen, wie etwa atopische Dermatitis, allergische Rhinitis, Crohns Krankheit, COPD, fibrotische Krankheiten oder Krankheiten wie etwa idiopathische Lungenfibrose, progressive systemische Sklerose, hepatische Fibrose, hepatische Granulome, Schistosomiase, Leishmaniase, Krankheiten der Zellkreislauregulierung wie etwa Hodgkins Krankheit, chronische lymphozytische B-Zellen-Leukämie, und die Konstrukte wären auch nützlich bei der Behandlung von Asthma.
  • Antigen-bindende Konstrukts der vorliegenden Erfindung können bei der behandlung von Krankheiten im Zusammenhang mit Wachstumsfaktoren sein, wie etwa IGF-1R, VEGF, und EGFR, z. B bei Krebs oder Gelenkrheumatismus; Beispiele für Krebsarten, bei denen solche Behandlungen hilfreich wären sind Brustkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs und examples of types of cancer in which such therapies may be useful are breast cancer, prostrate cancer, lung cancer and Myelom.
  • Antigen-bindende Konstrukte der vorliegenden Erfindung können hilfreich bei der Behandlung von Krankheiten sein, die mit TNF zusammenhängen, wie etwa Gelenkentzündung, z. B. Gelenkrheumatismus oder Arthrose.
  • Antigen-bindende Konstrukte der vorliegenden Erfindung können in der Behandlung von mit IL1-R zusammenhängenden Krankheiten wie etwa Gelenkentzündung hilfreich sein, z. B. Gelenkrheumatismus oder Arthrose.
  • Antigen-bindende Konstrukte der vorliegenden Erfindung können hilfreich bei der Behandlung von Krankheiten sein, die mit CD-20 zusammenhängen, z. B. Autoimmunkrankheiten wie etwa Psoriase, Darmentzündung, Colitis Ulcerosa, Crohns Krankheit, Gelenkrheumatismus, jugendlicher Gelenkrheumatismus, systemischer Lupus Erythematosus, neurodegenerative Krankheiten wie Multiple Sklerose, neutrophil angeregte Krankheiten wie etwa COPD , Wegeners Vasculitis, cystische Fibrose, Sjogrens-Syndrom, chronische Transplantatabweisung, Diabetes vom Typ 1, Graft-versus-Host-Reaktion, Asthma, allergische Krankheiten, atoptische Dermatitis, ekzematöse Dermatitis, allergische Rhinitis, Autoimmunkrankheiten und sonstige Krankheiten einschließlich Thyroiditis, Spondyloarthropathie, Ankylosing Spondylitis, Uveitis, Polychonritis oder Skleroderm, oder Krebs; z. B. B-Zellen-Lymphom oder fortgeschrittenes B-Zellen-Neoplasma wie CLL oder SLL.
  • Antigen-bindende Konstrukte der vorliegenden Erfindung können hilfreich bei der Behandlung von Krankheiten sein, die mit IL-17 und IL-23 zusammenhängen, wie z. B. Psoriase, Darmentzündung, Colitis Ulcerosa, Crohns Krankheit, Gelenkrheumatismus, jugendlicher Gelenkrheumatismus, systemischer Lupus Erythematosus, neurodegenerative Krankheiten wie Multiple Sklerose, neutrophil angeregte Krankheiten wie etwa COPD , Wegeners Vasculitis, cystische Fibrose, Sjogrens-Syndrom, chronische Transplantatabweisung, Diabetes vom Typ 1, Graft-versus-Host-Reaktion, Asthma, allergische Krankheiten, atoptische Dermatitis, ekzematöse Dermatitis, allergische Rhinitis, Autoimmunkrankheiten und sonstige Krankheiten einschließlich Thyroiditis, Spondyloarthropathie, Ankylosing Spondylitis, Uveitis, Polychonritis oder Skleroderm.
  • Die antigen-bindenden Konstrukte der vorliegenden Erfindung können durch Transfektion einer Gastzelle mit einem Expressionsvektor hergestellt werden, der die Kodierungssequenz für das antigen-bindende Konstrukt der vorliegenden Erfindung umfasst. Ein Expressionsvektor oder rekombinanter Plasmid wird durch Platzierung dieser Kodierungssequenzen für das antigen-bindende Konstrukt in operativer Verbindung mit konventionellen regulierenden Kontrollsequenzen, die zur Kontrolle der Replikation und Expression in, und/oder der Ablösung von, einer Gastzelle in der Lage sind. Regulierende Sequenzen sind u. a. Promotor equenzen, z. B. CMV-Promotoren, sowie Signalsequenzen, die von anderen bekannten Antikörpern abgeleitet warden können. Gleichermaßen kann ein zweiter Expressionsvektor mit Hilfe einer DNS-Sequenz hergestellt werden, die die leichte oder schwere Kette eines komplementären antigen-bindenden Konstruktes enkodiert. Bei bestimmten Ausführungsformen ist dieser zweite Expressionsvektor identisch mit dem ersten außer im Hinblick auf die Kodierungssequenzen und auswählbaren Markierungen, deren Zweck es ist, so weit wie möglich sicher zu stellen, dass jede Polypeptidkette funktional ausgedrückt ist. Als Alternative könnten die Kodierungssequenzen mit schwerer und leichter Kette für das antigen-bindende Konstrukt sich auf einem einzelnen Vektor befinden, z. B. in zwei Expressionskassetten desselben Vektors. Eine ausgewählte Gastzelle wird durch konventionelle Verfahren mit sowohl dem ersten als auch dem zweiten Vektor kotransfiziert (oder einfach mit einem einzelnen Vektor transfiziert), um die transfizierte Gastzelle der Erfindung herzustellen, die sowohl die rekombinante bzw. synthetische leichte und schwere Kette umfasst. Die transfizierte Zelle wird sodann durch konventionelle Verfahren kultiviert, um das künstliche antigen-bindende Konstrrukt der Erfindung herzustellen. Die Kultivierung des antigen-bindenden Konstruktes, das die zusammenhängenden rekombinanten schweren bzw. leichten Ketten beinhaltet, wird mit Hilfe einer angemessenen Probe wie etwa ELISA oder RIA verfolgt. Ähnliche konventionelle Verfahren können zur Herstellung anderer antigen-bindender Konstrukte eingesetzt werden.
  • Passende Vektoren für die Klonierungsschritte zum Einsatz bei den Verfahren und der Konstruktion der Kompositionen dieser Erfindung können gemäß ihrer Bevorzugung durch die Experten auf diesem Gebiet ausgewählt werden. So kann man z. B. die konventionelle pUC-Serie von Klonierungsvektoren verwenden. Ein Vektor, nämlich, pUC19, ist kommerzielle von Anbietern wie Amersham (Buckinghamshire, England) oder Pharmacia (Uppsala, Schweden) erhältlich. Außerdem kann jeder beliebige Vektor für die Klonierung verwendet warden, der zur schnellen Replikation in der Lage ist, über eine Vielfalt von Klonierungsstellen und auswählbaren Genen verfügt (z. B. antibiotische Resistenz) und leicht manipulierbar ist. Insofern stellt die Wahl von Klonierungsvektoren keine Einschränkung dieser Erfindung dar.
  • Die Expressionvektoren können evenfalls durch Gene charakterisiert warden, die für die Erweiterung der Expression der heterologen DNS-Sequenzen geeignet sind, z. B. durch das Dihydrofolatreduktase-Gen (DHFR) der Warmblüter. Andere bevorzugte Vektorsequenzen sind u. a. eine Poly-A-Signalequenz wie z. B. vom Rinderwachstumshormon (BGH) und die Betaglobin-Promotorsequenz (betaglopro). Die in diesem Zusammenhang hilfreichen Expressionvektors können durch Verfahren synthetisiert warden, die unter den Experten auf diesem Gebiet gut bekannt sind.
  • Die Komponenten solcher Vektoren wie z. B. Replikone, Selektionsgene, Wirkverstärker, Promotoren, Signalsequenzen usw. kann man aus kommerzeillen oder natürlichen Quellen erhalten, oder man kann sie durch wohlbekannte Verfahren synthetisch zur Verwendung bei der Kontrolle des Ausdrucks oder der Sekretion des Produktes der rekombinanten DNS in einer ausgewählten Gastzelle herstellen. Andere angemessene Expressionsvektoren, von denen etliche den Experten auf diesem Gebiet zur Expression bei Warmblütern, Bakterien, Insekten, Hefen und Pilzen bekannt sind, können ebenfalls zu diesem Zweck ausgewählt werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine mit einem rekombinanten Plasmiden transfizierte Zelllinie, wobei dieser Plasmid die Kodierungssequenzen des antigen-bindenden Konstrukts der vorliegenden Erfindung enthält. Für die Klonierung und andere Manipulierungen dieser Klonierungsvektoren nützliche Gastzellen sind ebenfalls konventionell. Allerdings können Zellen von verschiedenen E.Coli-Strängen zur Replikation der Klonierungsvektoren sowie in anderen Verfahrensschritten bei nder Konstruktion der antigen-bindenden Konstrukte dieser Erfindung verwendet werden.
  • Passende Gastzellen für die Expression der antigen-bindenden Konstrukte dieser Erfindung sind u. a. Warmblutzellen wie etwa S0, Sp2/0, CHO (e. g. DG44), COS, HEK, eine Fibroblast-Zelle (z. B. 3T3), sowie Myelomzellen; so können diese Konstrukte z. B. in einer CHO oder einer Myelomzelle ausgedrückt werden. Menschliche Zellen können verwendet werden, wodurch das Molekül durch menschliche Glycosylationsmuster modifiziert werden kann. Alas Alternative können auch andere eukaryotische Zelllinien verwendet warden. Die Selektion geeigneter Warmblut-Gastzellen und Methoden zur Transformation, Kultivierung, Erweiterung, Überprüfung und Produktherstellung und -Reinigung sind den fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Siehe z. B. Sambrook et al. wie oben zitiert.
  • Bakterienzellen können sich als geeignete Gastzellen für die Expression von rekombinanten Fabs oder anderer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nützlich erweisen (siehe z. B. Plückthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)). Wegen der Tendenz der in Bakterienzellen ausgedrückten Proteine, in einer ungefalteten oder nicht-glycosylierten Form vorzuliegen, müsste allerdings jede in einer Bakterienzelle hergestellte rekombinante Fab daraufhin überprüft werden, ob sie ihre Fähigkeit bewahrt, Antigene zu binden. Wenn das in der Bakterienzelle ausgedrückte Molekül in einer angemessen gefalteten Form hergestellt wurde, so ist die entsprechende Bakterienzelle eine bevorzugte Gastzelle; oder bei anderen Ausführungsformen kann das Molekül in der bakteriellen Gastzelle ausgedrückt und im Anschluss daran neun gefaltet werden. So sind z. B. auf dem Gebiet der Biotechnologie verschiedene zur Expression verwendete E.-Coli-Stränge bestens als Gastzellen bekannt. Verschiedene Stränge von B. Subtilis, Streptomyzen und anderen Bazillen usw. Können auch bei diesem Verfahren eingesetzt werden.
  • Nach Bedarf können Stränge von Hefezellen, die den fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, ebenfalls als Hastzellen verwendet werden, ebenso wie Insektenzellen, z. B. Drosophila und Lepidoptera sowie virale Expressionssysteme. Siehe dazu z. B. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986) und die dort angeführten Verweise. Die allgemeinen Methoden zur Herstellung der Vektoren, die Transfizierungsverfahren zur Herstellung der Gastzellen der Erfindung, und die zur Herstellung des antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung aus solchen Gastzellen notwendigen Kultivierungsverfahren können sämtlich konventionelle Techniken darstellen. Üblicherweise ist das Kultivierungsverfahren der vorliegenden Erfindung ein serum-freies Kultivierungsverfahren, gewöhnlich durch serum-freie Kultivierung von Zellen in hängender Position. Gleichermaßen können die antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung nach ihrer Herstellung gemäß einem einschlägig bekannten Standardverfahren von den Zellkulturinhalten gereinigt werden, einschließlich Ammoniaksulfatablagerung, Affinitätssäulen, Säulenchromatografie, Gel-Elektrophorese usw. Solche Verfahren sind einschlägig auf diesem Gebiet und stellen keine Einschränkung dieser Erfindung dar. So wird z. B. die Vorbereitung geänderter Antikörper in WO 99/58679 und WO 96/16990 beschrieben.
  • Noch eine weitere Methode der Expression der antigen-bindenden Konstrukte verwendet Ausdruck in einem transgenischen Tier, wie es im U. S. Patent Nr. 4.873.316 beschrieben ist. Dies bezieht sich auf ein Expressionssystem, das auf den Caseinpromotor des Tieres zurückgreift, der bei transgenischer Aufnahme in das Tier dem Weibchen gestattet, das bevorzugte rekombinante Protein in seiner Milch zu produzieren.
  • Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Methode zur Herstellung eines Antikörpers der Erfindung vorgegeben, wobei diese Methode den Schritt der Kultivierung einer durch einen Vektor transformierten oder mit einem Vektor transfizierten Gastzelle beinhaltet, der die leichte und/oder schwere Kette des Antikörpers enkodiert, wodurch der Antikörper produziert wird. In Einklang mit der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Herstellung eines antigenbindenden Konstruktes angeboten, die die foolgenden Verfahrensschritte umfasst:
    • (a) Vorgabe eines ersten Vektors, der eine schwere Kette des antigen-bindenden Konstruktes enkodiert;
    • (b) Vorgabe eines zweiten Vektors, der eine leichte Kette des antigen-bindenden Konstrukes enkodiert;
    • (c) Transformierung einer Warmblut-Gastzelle (z. B. CHO) mit Hilfe des angegebenen ersten und zweiten Vektors;
    • (d) Kultivierung der Gastzelle von Schritt (c) unter Bedingungen, die für die Sekretierung des antigen-bindenden Konstruktes von der genannten Gastzelle in das genannte Kulturmedium förderlich sind;
    • (e) Gewinnung des abgelösten antigen-bindenden Konstruktes von Schritt (d).
  • Sobald das antigen-bindende Konstrukt mit Hilfe der bevorzugten Methode ausgedrückt worden ist, wird es durch Verwendung einer angemessenen Probe auf in-vitro-Aktivität überprüft. Gegenwärtige konventionelle ELISA-Probeformate warden zur Beurteilung der qualitativen und quantitativen Bindung des antigen-bindenden Konstruktes an sein Ziel eingesetzt. Zusätzlich werden auch andere in-vitro-Proben zur Verifikation neutralisierender Wirksamkeit noch vor den nachfolgenden klinischen Studien an Menschen durchgeführt, um die Beständigkeit des antigen-bindenden Konstruktes im Körper trotz standardmäßiger Reinigungsmechanismen zu überprüfen.
  • Dosierung und Dauer der Behandlung hängen von der relativen Dauer der Molecüle der vorliegenden Erfindung im menschlichen Kreislauf ab und können durch einen Fachmann auf diesem Gebiet in Abhängigkeit von der behandelten Krankheit und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten modifiziert werden. Es ist zu erwarten, dass eine wiederholte Dosierungsfestlegung (z. B. einmal in der Woche oder einmal alle zwei Wochen) über eine ausgedehnte Zeitdauer (z. B. vier bis sechs Monate) möglicherweise zur. Erzielung maximaler therapeutischer Wirksamkeit nötig sein wird.
  • Der Verabreichungsmodus des therapeutischen Substrats der Erfindung kann in einem eine geeigneten Weg bestehen, auf dem das therapeutische Substrat an seine Gastzelle geliefert wird. Die antigen-bindenden Konstrukte und pharmazeutischen Kompositionen der Erfindung sind vor allem hilfreich bei parenteraler Verabreichung, d. h. subkutan (s. c.), intrathekal, intraperitonal, intramuskular (i. m.), intravenös (i. v.) oder intranasal.
  • Therapeutische Substrate der Erfindung können als pharmazeutische Kompositionen hergestellt werden, die eine wirksame Menge des antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung als aktiven Bestandteil in einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz enthalten. Beim prophylaktischen Substrat der Erfindung ist eine wasserhaltige Suspension oder Lösung bevorzugt, die das antigen-bindende Konstrrukt enthält und die vorzugsweise mit einem physiologischen pH gepuffert und in einer zur Injektion geeigneten Form ist. Die Kompositionen für parenterale Verabreichung umfassen üblicherweise eine Lösung des antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung oder einen Cocktail desselben, der in in einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz – vorzugsweise einem wasserhaltigen Träger – aufgelöst ist. Eine Vielzahl wasserhaltiger Träger kann hierfür verwendet warden, z. B. 0,9% Salin, 0,3% Glyzin etc. Diese Lösungen steril und generell frei von Partikeln hergestellt warden. Diese Lösungen können durch konventionelle, gut bekannte Sterilisationsverfahren (z. B. Filtrierung) sterilisiert werden. Die Kompositionen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen verwenden, wenn dies zur Approximierung physiologischer Bedingungen wie etwa pH-Anpassung und Puffersubstrate etc. notwendig ist. Die Konzentration des antigenbindenden Konstrukts der Erfindung in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann erheblich variieren, etwa von weniger als c. 0,5% bis gewöhnlich um die oder mindestens 1% bis zu 15 oder 20% im Hinblick auf Gewicht, und wird primär auf Grundlage von Flüssigkeitsvolumen, Viskositäten, etc. nach der bevorzugten Verabreichungsmethode ausgewählt.
  • So könnte daher eine pharmazeutische Komposition der Erfindung für intramuskulare Injizierung so prepariert werden, dass sie 1 mL steriles gepuffertes Wasser enthält sowie und zwischen ca. 1 ng bis zu ca. 100 mg, z. B. vorzugsweise ca. 50 ng bis zu ca. 30 mg oder mehr, ca. 5 mg bis zu ca. 25 mg eines antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung enthält. In ähnlicher Weise kann eine pharmazeutische Komposition der Erfindung zur intravenösen Infusion so prepariert sein, dass sie 250 ml sterile Ringers Lösung und ca. 1 bis zu ca. 30 und vorzugsweise 5 mg bis zu ca. 25 mg eines antigen-bindenden Konstruktes der Erfindung pro ml Ringers Lösung enthält. Die tatsächlichen Verfahren zur Preparierung parenteral verabreichbarer Kompositionen sind gut bekannt oder werden den Fachleuten auf dem Gebiet wohlvertraut sein; sie sind auch ausführlicher etwa in Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausgabe., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania beschrieben. Zur Herstellung intravenös zu verabreichender antigen-bindender Konstruktformulierungen der Erfindung siehe Lasmar U und Parkins D „The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, Seite 129-137, Bd.3 (3. April 2000),Wang, W „Instability, stabilisation and formulation of liquid Protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T. J., Manning M. C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers, M. J. Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al „Effects of types of sugar an stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274, Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its Protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, „Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for Protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922.
  • Ha, E Wang W, Wang Y. j. „Peroxide formation in polysorbate 80 and Protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264, (2002), wobei der gesamte Inhalt dieser Schriften hier durch Verweis mit aufgenommen ist und auf die der Leser hiermit ausdrücklich verwiesen wird. Vorzugsweise sollte das therapeutische Substrat der Erfindung bei der pharmazeutischen Präparierung in einheitlichen Dosierungsformen vorliegen. Die angemessene therapeutisch wirksame Dosierung wird leicht durch die Fachleute auf diesem Gebiet bestimmt werden können. Geeignete Dosierungen können für Patienten auf der Grundlage ihres Gewichts festgelegt werden; so kann eine geeignete Dosierung etwa im Bereich von 0,01 bis 20 mg/kg, oder vom 0,1 bis 20 mg/kg, oder von 1 bis 20 mg/kg, oder von 10 bis 20 mg/kg oder von 1 bis 15 mg/kg, oder von 10 bis 15 mg/kg liegen. Um Krankheitserscheinungen beim Menschen effektiv mit Hilfe der Erfindung zu behandeln, kann die geeignete Dosierung im Bereich von 0,01 bis 1000 mg, oder von 0,1 bis 1000 mg, oder von 0,1 bis 500 mg, oder von 500 mg, oder von 0,1 bis 100 mg, oder von 0,1 bis 80 mg, oder von 0,1 bis 60 mg, oder von 0,1 bis 40 mg, oder von 1 bis 100 mg, oder von 1 bis 50 mg, eines antigen-bindenden Konstruktes dieser Erfindung liegen, die Parenteral – z. B subkutan, intravenös oder intramuskular zu verabreichen ist. Eine solche Dosierung kann bei Bedarf in angemessenen Abständen wiederholt werden, die vom Arzt als angemessen zu bestimmen sind.
  • Die hier beschriebenen antigen-bindenden Konstrukte zur Lagerung lyophilisiert und vor Gebrauch in einer geeigneten Trägersubstanz wieder hergestellt werden. Diese Methode hat sich bei konventionellen Immunoglobulinen als wirksam erwiesen, und die den Fachleuten bekannten Lyophilisierungs- und Rekonstruierungsverfahren können eingesetzt werden.
  • Es gibt verschiedene der Fachwelt bekannte Methoden, die zur Auffindung epitop-bindender Domänen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
  • Der Begriff „Sammlung” bezieht sich auf eine Mischung von heterogenen Polypeptiden oder Nucleinsäuren. Die Sammlung besteht aud Mitgliedern, von denen jedes über eine einzelne Polypeptid oder Nucleinsäuresequenz verfügt. In diesem Sinne ist „Sammlung” synonym mit „Repertoire”. Sequenzdifferenzen zwischen Sammlungsmitgliedern sind für die in der Sammlung vorhandene Diversität verantwortlich. Die Sammlung kann die Form einer einfachen Mischung aus Polypeptiden oder Nucleinsäuren haben, oder sie kann in Form von Organismen oder Zellen auftreten, wie z. B. Bakterien, Viruse, Tier- oder Pflanzenzellen usw., die durch eine Sammlung von Nucleinsäuren transformiert sind. Bei einem Beispiel enthält jeder individuelle Organismus oder jede Zelle nur eine beschränkte Anzahl von Sammlungsmitgliedern. Es ist von Vorteil, dass die Nucleinsäuren in Expressionsvektoren aufgenommen sind, um eine Expression der in den Nucleinsäuren enkodierten Polypeptiden zu ermöglichen. In einer Hinsicht kann eine Sammlung daher die Form einer Population von Gastgeberorganismendarstellen, wobei jeder Organismus eine oder mehr Kopien eines Expressionsvektors enthält, der wiederum ein einzelnes Mitglied der Sammlung in Form von Nucleinsäure umfasst , die zur Herstellung seines entsprechenden Polypeptidmitglieds ausgedrückt werden kann. So hat die Population von Gastgeberorganismen das Potential, ein großes Repertoire verschiedener Polypeptiden zu enkodieren.
  • Ein „universelles Rahmenwerk” ist ein einzelnes Antikörper-Rahmenwerk, das den in Sequenz konservierten Regionen eines Antikörpers, wie sie von Kabat („Sequences of Proteins of Immunological interest", US Department of Health and Human Services) definiert werden, entspricht; oder auch, das dem menschlichen Keimbahn-Immunoglobulinrepertoire bzw -struktur entspricht, wie sie von Chothia und Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917 definiert wurden. Es kann ein einzelnes Rahmenwerk oder auch eine Menge solcher Rahmenwerke vorhanden sein, was die Ableitung virtuell beliebiger Bindespezifitäten durch Variationen in den hypervariablen Regionen allein gestattet.
  • Aminosäuren und nucleotide Sequenzanpassungen und Homologie, Ähnlichkeit und Identität, wie sie hier definiert werden, werden in einer Ausführungsform durch Verwendung des Algorithmus BLAST 2 Sequences und Standardparameter hergestellt und bestimmt (Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)).
  • Die epitop-bindenden Domänen und Antigen-Bindestellen können jeweils über eine Bindespezifität für einen generischen Liganden oder für einen jeglichen bevorzugten Zielliganden, wie etwa menschliche oder tierische Proteine – einschließlich Zytokine, Wachstumsfaktoren, Zytokinrezeptoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Enzyme (z. B. Proteasen), Kofaktoren für Enzyme, DNS-bindende Proteine, Lipide und Kohlehydrate – verfügen. Passende Ziele einschließlich Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Zytokinrezeptoren, Wachstumsfaktorrezeptoren und sonstige Proteine umfassen u. a. – sind jedoch nicht beschränkt auf: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrophin-1, CEA, CD40, CD40 Ligand, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF Rezeptor, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Exodus-2, FAPα, FGF-Säure, FGF-Lauge, Fibroblast-Wachstumsfaktor-10, FLT3-Ligand, Fractalkin (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, menschliches Serum Albumin, Insulin, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-1-Rezeptor, IL-1-Rezeptor Typ 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a. a.), IL-8 (77 a. a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibin α, Inhibin β, IP-10, Keratinocyte Growth Factor-2 (KGF-2), KGF, Leptin, LIF, Lymphotactin, Müllersche Hemmsubstanz, Hemmfaktor für Monozytenkolonien, Monozytenanziehungsprotein, M-CSF, c-fms, v-fmsMDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, Hemmfaktor-1 gegen die Verbreitung von Myeloiden (MPIF-1), NAP-2, Neurturin, Nervenwachstumsfaktor, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatin M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, Stammzellenfaktor (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, Tumornekrosisfaktor (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF-Receptor I, TNF-Receptor II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF receptor 1, VEGF receptor 2, VEGF receptor 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, Serum Albumin, vWF, Amyloid-Proteine (z. B. Amyloid Alpha), MMP12, PDK1, IgE, und sonstige hier offenbarte Ziele. Wir bitten um Verständnis, dass diese Liste auf keinen Fall vollständig ist.
  • In einigen Ausführungen bindet das protease-resistente Peptid oder Polypeptid ein Ziel im Lungengewebe, z. B. ein zu derfolgenden Gruppe gehörendes Ziel: TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), Chymase, FGF, Furin, Endothelin-1, Eotaxins (z. B. Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, Integrins, L-Selectin, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, Neutrophil Elastase, Osteopontin, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Thrombin, Tim-1, TNF, TRANCE, Tryptase, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, Alphavbeta6, Alphavbeta8, cMET, CD8, vWF, Amyloid-Proteine (z. B. Amyloid Alpha), MMP12, PDK1, und IgE.
  • Wenn ein Anzeigesystem (z. B. ein Anzeigesystem, dass Kodierungsfunktionen einer Nucleinsäure und funktionale Merkmale des durch die Nucleinsäure enkodierten Peptids oder Polypeptids) in den hier beschriebenen Verfahren verwendet wird, z. B. bei der Selektion eines dAb oder einer anderen epitop-bindenden Domäne, so ist es häufig von Vorteil, die Kopiezahl der Nucleinsäuren, die die ausgewählten Peptide oder Polypeptide enkodieren. Dadurch wird eine wirksame Weise geschaffen, in der hinreichende Mengen von Nucleinsäuren und/oder Peptiden oder Polypeptiden mit den hier beschriebenen oder anderen geeigneten Verfahren für zusätzliche Selektionsrunden gewonnen werden können, oder es können zusätzliche Repertoirs geschaffen werden (z. B. Affinitätsreifungsrepertoires). Bei einigen Ausführungsformen erfordern somit die Methoden zur Selektion epitop-bindender Domänen den Gebrauch eines Anzeigesystems (z. B. eines Anzeigesystems, das die Kodierungsfunktion einer Nucleinsäure und die funktionalen Merkmale des von der Nucleinsäure enkodierten Peptids oder Polypeptids miteinander verbindet , wie etwa Phagenazeige), und sie können darüber hinaus die Amplifikation oder Erhöhung der Zahl von Kopien einer Nucleinsäure erfordern, die das selektierte Peptid oder Polypeptid enkodiert. Nucleinsäuren können durch Einsatz jeder geeigneten Methode, wie etwa Phage-Amplifikation, Zellwachstum oder polymerische Kettenreaktion amplifiziert werden.
  • In einem Beispiel wird bei den Verfahren ein Display-System eingesetzt, das die Kodierungsfunktion einer Nukleinsäure und die physikalischen, chemischen und/oder funktionellen Eigenschaften des Polypeptids, das von der Nukleinsäure kodiert wird, verknüpft. Ein solches Display-System kann mehrere replizierbare genetische Pakete aufweisen, wie z. B. Bakteriophagen oder Zellen (Bakterien). Das Display-System kann eine Bibliothek, wie z. B. eine Bakteriophagen-Display-Bibliothek, umfassen. Ein Bakteriophagen-Display ist ein Beispiel für ein Display-System.
  • Eine Anzahl von geeigneten Bakteriophagen-Display-Systemen (z. B. monovalente und multivalente Display-Systeme) sind beschrieben worden. (siehe z. B. Griffiths et al., US-Patenschrift Nr. 6,555,313 B1 (durch Bezugnahme hierin eingebunden); Johnson et al., US-Patenschrift Nr. 5,733,743 (durch Bezugnahme hierin eingebunden); McCafferty et al., US-Patenschrift Nr. 5,969,108 (durch Bezugnahme hierin eingebunden); Mulligan-Kehoe, US-Patenschrift Nr. 5,702,892 (durch Bezugnahme hierin eingebunden); Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2): 121-133 (2001).) Die Peptide oder Polypeptide, die in einem Bakteriophagen-Display-System präsentiert werden, können auf jedem geeigneten Bakteriophagen, wie z. B. einem filamentösen Phagen (z. B. fd, M13, F1), einem lytischen Phagen (z. B. T4, T7, Lambda) oder einem RNA-Phagen (z. B. MS2), präsentiert werden.
  • Im Allgemeinen wird eine Bibliothek von Phagen, die ein Repertoire von Peptiden oder Phagepolypeptiden als Fusionsproteine mit einem geeigneten Phagenhüllprotein (z. B. fd-pIII-Protein) präsentiert, erzeugt oder bereitgestellt. Das Fusionsprotein kann die Peptide oder Polypeptide an der Spitze des Phagenhüllproteins oder, falls gewünscht, an einer inneren Position präsentieren. Beispielsweise kann das präsentierte Peptid oder Polypeptid an einer Position vorhanden sein, die aminoterminal zur Domäne 1 von pIII ist (die Domäne 1 von pIII wird auch als N1 bezeichnet.) Das präsentierte Polypeptid kann direkt mit pIII fusioniert werden (z. B. dem N-Terminus von Domäne 1 von pIII) oder unter Benutzung eines Linkers mit pIII fusioniert werden. Falls gewünscht, kann die Fusion ferner ein Tag umfassen (z. B. myc-Epitop, His-Tag). Bibliotheken, die ein Repertoire von Peptiden oder Polypeptiden umfassen, die als Fusionsproteine mit einem Phagenhüllprotein präsentiert werden, können unter Benutzung jedes geeigneten Verfahrens, wie z. B. durch Einführen einer Bibliothek von Phagenvektoren oder Phagemidvektoren, die die präsentierten Peptide oder Polypeptide in geeignete Wirtsbakterien kodieren, und Kultivieren der resultierenden Bakterien, um Phagen zu erzeugen (z. B. unter Benutzung eines geeigneten Helferphagen oder komplementierenden Plasmids, falls gewünscht), erzeugt werden. Die Bibliothek von Phagen kann unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens, wie z. B. Fällen und Zentrifugieren, aus der Kultur zurückgewonnen werden.
  • Das Display-System kann ein Repertoire von Peptiden oder Polypeptiden umfassen, das jedes gewünschte Maß an Vielfalt enthält. Beispielsweise kann das Repertoire Peptide oder Polypeptide enthalten, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die natürlich vorkommenden Polypeptiden entsprechen, die von einem Organismus, einer Gruppe von Organismen, einem gewünschten Gewebe oder gewünschten Zelltyp exprimiert werden, oder kann Peptide oder Polypeptide enthalten, die zufällige oder randomisierte Aminosäuresequenzen aufweisen. Falls gewünscht, können die Polypeptide einen gemeinsamen Kern oder Gerüst aufweisen. Beispielsweise können alle Polypeptide in dem Repertoire oder der Bibliothek auf einem Gerüst basiert werden, das aus Protein A, Protein L, Protein G, einer Fibronektin-Domäne, einem Anticalin, CTLA4, einem gewünschten Enzym (z. B. einer Polymerase, einer Cellulase) oder einem Polypeptid aus der Immunglobulin-Superfamilie, wie z. B. einem Antikörper oder Antikörperfragment (z. B. einer variablen Antikörperdomäne) selektiert wird. Die Polypeptide in solch einem Repertoire oder einer Bibliothek können definierte Regionen mit zufälliger oder randomisierter Aminosäuresequenz und Regionen mit gemeinsamer Aminosäuresequenz umfassen. In bestimmten Ausführungsformen sind alle oder im Wesentlichen alle Polypeptide in einem Repertoire von einem gewünschten Typ, wie z. B. ein gewünschtes Enzym (z. B. eine Polymerase) oder ein gewünschtes Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpers (z. B. humanes VH oder humanes VL). In einigen Ausführungsformen umfasst das Polypeptid-Display-System ein Repertoire von Polypeptiden, wobei jedes Polypeptid eine variable Antikörperdomäne umfasst. Beispielsweise kann jedes Polypeptid in dem Repertoire ein VH, ein VL oder ein Fv (z. B. ein einkettiges Fv) enthalten.
  • Vielfalt der Aminosäuresequenz kann unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens in jede gewünschte Region eines Peptids oder Polypeptids oder Gerüstes eingeführt werden. Beispielsweise kann Vielfalt der Aminosäuresequenz in eine Zielregion, wie z. B. eine komplementaritätsbestimmende Region einer variablen Antikörperdomäne oder eine hydrophobe Domäne, durch Anfertigen einer Bibliothek von Nukleinsäuren, welche die diversifizierten Polypeptide kodieren, unter Anwendung jedes geeigneten Mutageneseverfahrens (z. B. Low-Fidelity-PCR, Oligonukleotid-vermittelte oder ortsgerichtete Mutagenese, Diversifikation unter Benutzung von NNK-Codons) oder jedes anderen geeigneten Verfahrens eingeführt werden. Falls gewünscht, kann eine Region eines zu diversifizierenden Polypeptids randomisiert werden. Die Größe der Polypeptide, die das Repertoire bilden, ist in hohem Maße eine Frage der Auswahl, und eine einheitliche Polypeptidgröße ist nicht erforderlich. Die Polypeptide in dem Repertoire können mindestens tertiäre Struktur aufweisen (mindestens eine Domäne bilden).
  • Selektion/Isolierung/Rückgewinnung
  • Eine Epitop-bindende Domäne oder Population von Domänen kann unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens aus einem Repertoire oder einer Bibliothek (z. B. in einem Display-System) selektiert, isoliert und/oder rückgewonnen werden. Beispielsweise wird eine Domäne auf Grundlage einer selektierbaren Eigenschaft (z. B. physikalische Eigenschaft, chemische Eigenschaft, funktionelle Eigenschaft) selektiert oder isoliert. Zu geeigneten selektierbaren funktionellen Eigenschaften gehören biologische Aktivitäten der Peptide oder Polypeptide in dem Repertoire, beispielsweise, das Binden an einen generischen Liganden (z. B. ein Superantigen), das Binden an einen Zielliganden (z. B. ein Antigen, ein Epitop, ein Substrat), das Binden an einen Antikörper (z. B. durch ein Epitop, das auf einem Peptid oder Polypeptid exprimiert ist) und die katalytische Aktivität (siehe z. B. Tomlinson et al., WO 99/20749 ; WO 01 /57065 ; WO 99/58655 ).
  • In einigen Ausführungsformen wird das Protease-resistente Peptid oder Polypeptid aus einer Bibliothek oder einem Repertoire von Peptiden oder Polypeptiden selektiert und/oder isoliert, in der/dem im Wesentlichen alle Domänen ein gemeinsames selektierbares Merkmal aufweisen. Beispielsweise kann die Domäne aus einer Bibliothek oder einem Repertoire selektiert werden, in der/dem im Wesentlichen alle Domänen einen gemeinsamen generischen Liganden binden, einen gemeinsamen Zielliganden binden, einen gemeinsamen Antikörper binden (oder von diesem gebunden werden) oder eine gemeinsame katalytische Aktivität aufweisen. Dieser Typ von Selektion ist besonders nützlich zum Anfertigen eines Repertoires von Domänen, die auf einem parentalen Peptid oder Polypeptid basieren, das eine gewünschte biologische Aktivität aufweist, beispielsweise wenn Affinitätsreifung einer einzelnen variablen Immunglobulin-Domäne durchgeführt wird.
  • Die auf das Binden an einen gemeinsamen generischen Liganden basierende Selektion kann eine Sammlung oder Population von Domänen ergeben, die alle oder im Wesentlichen alle Domänen enthalten, die Komponenten der ursprünglichen Bibliothek oder des ursprünglichen Repertoires waren. Beispielsweise können Domänen, die einen Zielliganden oder einen generischen Liganden binden, wie z. B. Protein A, Protein L oder ein Antikörper, durch Panning oder unter Benutzung einer geeigneten Affinitätsmatrix selektiert, isoliert und/oder rückgewonnen werden. Das Panning kann durchgeführt werden, indem eine Lösung eines Liganden (z. B. eines generischen Liganden, Zielliganden) in ein geeignetes Gefäß (z. B. Röhrchen, Petrischale) gegeben und der Ligand sich absetzen oder die Wände des Gefäßes überziehen lassen wird. Überschüssiger Ligand kann weggewaschen werden, und Domänen können dem Gefäß zugegeben werden und das Gefäß unter Bedingungen gehalten werden, die für Peptide oder Polypeptide geeignet sind, um den immobilisierten Liganden zu binden. Nicht gebundene Domänen können weggewaschen werden, und gebundene Domänen können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens, wie z. B. Abschaben oder Senken des pH-Wertes, rückgewonnen werden.
  • Geeignete Ligandenaffinitätsmatrizen enthalten im Allgemeinen einen festen Träger oder Kügelchen (z. B. Agarose), an den/das ein Ligand kovalent oder nicht-kovalent befestigt wird. Die Affinitätsmatrix kann unter Anwendung eines diskontinuierlichen Verfahrens, eines Säulenverfahrens oder jedes anderen geeigneten Verfahrens unter Bedingungen, die zum Binden von Domänen an den Liganden auf der Matrix geeignet sind, mit Peptiden oder Polypeptiden (z. B. einem Repertoire, das mit Protease inkubiert wurde) kombiniert werden. Domänen, welche die Affinitätsmatrix nicht binden, können weggewaschen werden, und gebundene Domänen können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens, wie z. B. Elution mit einem Puffer von niedrigerem pH-Wert, mit einem milden Denaturierungsmittel (z. B. Harnstoff) oder mit einem Peptid oder einer Domäne, die um das Binden an den Liganden konkurriert, eluiert und rückgewonnen werden. In einem Beispiel wird ein biotinylierter Zielligand unter Bedingungen, die für Domänen in dem Repertoire geeignet sind, den Zielliganden zu binden, mit einem Repertoire kombiniert. Gebundene Domänen werden unter Benutzung von immobilisiertem Avidin oder Streptavidin (z. B. auf einem Kügelchen) rückgewonnen.
  • In einigen Ausführungsformen ist der generische oder der Zielligand ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon. Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente, die strukturelle Merkmale von Peptiden oder Polypeptiden binden, die in den Peptiden oder Polypeptiden einer Bibliothek oder eines Repertoires im Wesentlichen konserviert bleiben, sind als generische Liganden besonders nützlich. Antikörper und Antigen-bindende Fragmente, die zur Benutzung als Liganden zum Isolieren, Selektieren und/oder Rückgewinnen von Protease-resistenten Peptiden oder Polypeptiden geeignet sind, können monoklonal oder polyklonal sein und unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden.
  • BIBLIOTHEKEN/REPERTOIRES
  • Bibliotheken, die für Protease-Epitop-bindende Domänen kodieren und/oder diese enthalten, können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt oder erhalten werden. Eine Bibliothek kann gestaltet werden, um auf Grundlage einer interessierenden Domäne oder eines interessierenden Gerüstes (z. B. einer Domäne, die aus einer Bibliothek selektiert wird) Domänen zu kodieren, oder unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren aus einer anderen Bibliothek selektiert werden. Beispielsweise kann eine Bibliothek, die an Domänen angereichert ist, unter Benutzung eines geeigneten Polypeptid-Display-Systems hergestellt werden.
  • Bibliotheken, die für ein Repertoire von einem gewünschten Typ von Domäne kodieren, können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens leicht erzeugt werden. Beispielsweise kann eine Nukleinsäuresequenz, die für einen gewünschten Typ von Polypeptid kodiert (z. B. eine variable Immunglobulin-Domäne) erhalten werden, und für eine Sammlung von Nukleinsäuren, die jeweils eine oder mehrere Mutationen enthalten, kann beispielsweise durch Amplifizieren der Nukleinsäure unter Benutzung eines Error-Prone-Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Systems, durch chemische Mutagenese (Deng et al., J. Biol. Chem., 269: 9533 (1994)) oder unter Benutzung von bakteriellen Mutationsstämmen (Low et al., J. Mol. Biol., 260: 359 (1996)) hergestellt werden.
  • In anderen Ausführungsformen kann die Diversifikation auf bestimmte Regionen der Nukleinsäure gerichtet werden. Verfahren zum Mutieren selektierter Positionen sind im Fachgebiet ebenfalls gut bekannt; dazu gehören beispielsweise die Benutzung fehlangepasster Oligonukleotide oder degenerierter Oligonukleotide, mit oder ohne Anwendung der PCR. Beispielsweise wurden Bibliotheken synthetischer Antikörper durch zielgerichtete Mutationen an den Antigen-bindenden Schleifen erzeugt. Zufällige oder halbzufällige Antikörper-H3- und -L3-Regionen wurden an Keimbahn-Immunglobulin-V-Gensegmente angehängt, um große Bibliotheken mit nicht mutierten Rahmenregionen zu erzeugen (Hoogenboom and Winter (1992) oben; Nissim et al. (1994) oben; Griffiths et al. (1994) oben; DeKruif et al. (1995) oben). Eine solche Diversifikation wurde ausgeweitet, um einige oder alle anderen Antigenbindenden Schleifen einzubeziehen (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO 97/08320 , oben). In anderen Ausführungsformen kann die Diversifikation der Nukleinsäure beispielsweise durch eine Zweischritt-PCR-Strategie auf bestimmte Regionen gerichtet werden, wobei das Produkt der ersten PCR als ein ”Mega-Primer” eingesetzt wird (siehe z. B. Landt, O. et al., Gene 96: 125-128 (1990)). Zielgerichtete Diversifikation kann beispielsweise auch durch SOE-PCR erreicht werden (siehe z. B. Horton, R. M. et al., Gene 77: 61-68 (1989)).
  • Sequenzvielfalt an selektierten Positionen kann durch Ändern der Kodierungssequenz erzielt werden, die die Sequenz des Polypeptids spezifiziert, so dass eine Anzahl von möglichen Aminosäuren (z. B. alle 20 oder eine Teilmenge davon) an dieser Position eingebunden werden kann. Das vielseitigste Codon ist – gemäß der Nomenklatur nach IUPAC – NNK, das für alle Aminosäuren sowie auch für das TAG-Stopp-Codon kodiert. Das NNK-Codon kann benutzt werden, um die die geforderte Vielfalt einzuführen. Andere Codons, die zu dem selben Ziel führen, sind ebenfalls nützlich, einschließlich des NNN-Codons, das zu der Produktion der zusätzlichen Stopp-Codons TGA und TAA führt. Solch ein zielgerichteter Ansatz kann ermöglichen, den vollständigen Sequenzraum in einem Zielgebiet auszunutzen. Einige Bibliotheken umfassen Domänen, die Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie sind (z. B. Antikörper oder Teile davon). Beispielsweise können die Bibliotheken Domänen umfassen, die eine bekannte Hauptkettenkonformation aufweisen (siehe z. B. Tomlinson et al., WO 99/20749 ). Bibliotheken können in einem geeigneten Plasmid oder Vektor hergestellt werden. Wie hierin benutzt, bezieht sich Vektor auf ein eigenständiges Element, das benutzt wird, um heterologe DNA zu deren Expression und/oder Replikation in Zellen einzuführen. Jeder geeignete Vektor kann benutzt werden, einschließlich Plasmide (z. B. bakterielle Plasmide), virale oder Bakteriophagenvektoren, künstliche Chromosomen und episomale Vektoren. Solche Vektoren können zur einfachen Klonierung und Mutagenese benutzt werden, oder ein Expressionsvektor kann benutzt werden, um die Expression der Bibliothek anzutreiben. Vektoren und Plasmide enthalten gewöhnlich eine oder mehrere Klonierungsstellen (z. B. einen Polylinker), einen Replikationsursprung und mindestens ein selektierbares Markergen. Expressionsvektoren können ferner Elemente zum Antreiben der Transkription und Translation eines Polypeptids enthalten, wie z. B. ein Enhancer-Element, einen Promotor, ein Transkriptionsterminationssignal, Signalsequenzen und dergleichen. Diese Elemente können so angeordnet werden, dass sie operabel mit einem klonierten Insert verknüpft sind, das für ein Polypeptid kodiert, derart, dass das Polypeptid exprimiert und erzeugt wird, wenn solch ein Expressionsvektor unter Bedingungen gehalten wird, die für die Expression geeignet sind (z. B. in einer geeigneten Wirtszelle).
  • Klonierungs- und Expressionsvektoren enthalten im Allgemeinen Nukleinsäuresequenzen, die es dem Vektor ermöglichen, sich in einer oder mehreren selektierten Wirtszellen zu replizieren. In Klonierungsvektoren ist diese Sequenz typischerweise eine Sequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und beinhaltet Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind von einer Vielfalt an Bakterien, Hefe und Viren gut bekannt. Der Replikationsursprung von dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet; der 2-Mikrometer-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (z. B. SV40, Adenovirus) sind für Klonierungsvektoren in Säugerzellen nützlich. Im Allgemeinen wird der Replikationsursprung für Säuger-Expressionsvektoren nicht benötigt, sofern diese nicht in Säugerzellen benutzt werden, die große Mengen von DNA replizieren können, wie z. B. COS-Zellen. Klonierungs- oder Expressionsvektoren können ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Solche Markergene kodieren für ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum transformierter Wirtszellen notwendig ist, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert werden, der das Selektionsgen enthält, werden deshalb in dem Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die Resistenz gegen Antibiotika und andere Toxine verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, den Bedarf auxotropher Organismen ergänzen oder lebenswichtige Nährstoffe liefern, die in dem Wachstumsmedium nicht verfügbar sind.
  • Geeignete Expressionsvektoren können eine Anzahl von Komponenten enthalten, beispielsweise einen Replikationsursprung, ein selektierbares Markergen, ein oder mehrere Expressionssteuerungselemente, wie z. B. ein Transkriptionssteuerungselement (z. B. Promotor, Enhancer, Terminator) und/oder ein oder mehrere Translationssignale, eine Signalsequenz oder Leitsequenz und dergleichen. Expressionssteuerungselemente und eine Signal- oder Leitsequenz, falls vorhanden, können von dem Vektor oder einer anderen Quelle bereitgestellt werden. Beispielsweise können die Transkriptions- und/oder Translationssteuerungssequenzen einer klonierten Nukleinsäure, die für eine Antikörperkette kodiert, benutzt werden, um die Expression zu lenken. Ein Promotor kann zur Expression in einer gewünschten Wirtszelle bereitgestellt werden. Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein. Beispielsweise kann ein Promotor operabel mit einer Nukleinsäure verknüpft werden, die für einen Antikörper, eine Antikörperkette oder einen Teil davon kodiert, so dass er die Transkription der Nukleinsäure lenkt. Eine Vielfalt an geeigneten Promotoren für prokaryotische (z. B. die β-Lactamase- und Lactose-Promotersysteme, alkalische Phosphatase, das Tryptophan-(trp)-Promotersystem, lac-, tac-, T3-, T7-Promotoren für E. coli) und eukaryotische (z. B. früher oder später Promotor von Simian-Virus 40, Promotor der langen terminalen Wiederholungen des Rous-Sarkom-Virus, Cytomegalovirus-Promotor, später Promotor des Adenovirus, EG-1a-Promotor) Wirte sind verfügbar.
  • Außerdem umfassen Expressionsvektoren typischerweise einen selektierbaren Marker zur Selektion von Wirtszellen, die den Vektor tragen, und im Falle eines replizierbaren Expressionsvektors einen Replikationsursprung. Gene, die für Produkte kodieren, die Resistenz gegen Antibiotika oder Arzneimittel verleihen, sind gebräuchliche selektierbare Marker und können in prokaryotischen (z. B. β-Lactamase-Gen (Ampicillinresistenz), Tet-Gen für Tetracyclinresistenz) und eukaryotischen Zellen (z. B. Neomycin (G418 oder Geneticin), GPT (Mycophenolsäure), Ampicillin oder Gene für Hygromycinresistenz) benutzt werden. Dihydrofolatreduktase-Markergene ermöglichen die Selektion mit Methotrexat in einer Vielfalt an Wirten. Gene, die für das Genprodukt von auxothrophen Markern des Wirts kodieren (z. B. LEU2, URA3, HIS3) werden häufig als selektierbare Marker in Hefe benutzt. Die Benutzung von viralen (z. B. Baculovirus) oder Phagenvektoren und Vektoren, die fähig sind, in das Genom der Wirtszelle integriert zu werden, wie z. B. retrovirale Vektoren, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Zu geeigneten Expressionsvektoren zur Expression in prokaryotischen (z. B. Bakterienzellen wie E. coli) oder Säugerzellen gehören beispielsweise ein pET-Vektor (z. B. pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, Novagen und andere), ein Phagenvektor (z. B. pCANTAB 5 E, Pharmacia), pRIT2T (Protein-A-Fusionsvektor, Pharmacia), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L. A., et al., Biotechniques, 21: 1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18: 5322 (1990)) und dergleichen. Expressionsvektoren, die zur Benutzung in verschiedenen Expressionswirten, wie z. B. prokaryotischen Zellen (E. coli), Insektenzellen (Drosophila-Schnieder-S2-Zellen, Sf9), Hefe (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) und Säugerzellen (z. B. COS-Zellen), geeignet sind, sind verfügbar.
  • Einige Beispiele für Vektoren sind Expressionsvektoren, die die Expression einer Nukleotidsequenz ermöglichen, die einem Mitglied einer Polypeptid-Bibliothek entsprechen. So kann die Selektion mit generischen und/oder Zielliganden durch separate Propagation und Expression eines einzelnen Klons, der das Mitglied der Polypeptid-Bibliothek exprimiert, durchgeführt werden. Wie oben beschrieben, ist ein bestimmtes Selektions-Display-System das Bakteriophagen-Display. Daher können Phagen- oder Phagemidvektoren benutzt werden. Beispielsweise können Vektoren Phagemidvektoren sein, die einen E.-coli-Replikationsursprung (für doppelsträngige Replikation) und auch einen Phagen-Replikationsursprung (zur Herstellung einsträngiger DNA) aufweisen. Die Manipulation und Expression solcher Vektoren sind im Fachgebiet gut bekannt (Hoogenboom und Winter (1992), oben; Nissim et al. (1994), oben). Kurz ausgedrückt: Der Vektor kann ein β-Lactamase-Gen enthalten, um dem Phagemid Selektivität zu verleihen, und einen lac-Promotor, der einer Expressionskassette vorgeschaltet wird, die eine geeignete Leitsequenz enthalten kann, eine mehrfache Klonierungsstelle, ein oder mehrere Peptid-Tags, ein oder mehrere TAG-Stopp-Codons und das Phagenprotein pIII enthalten. Daher ist der Vektor, unter Benutzung verschiedener Suppressor- und Nicht-Suppressor-Stämme von E. coli und mit Zugabe von Glucose, iso-Propyl-thio-β-D-galactosid (IPTG) oder einem Helferphagen, wie z. B. VCS M13, in der Lage, sich als ein Plasmid ohne Expression zu replizieren, große Mengen nur des Mitglieds der Polypeptid-Bibliothek oder Produktphagen zu produzieren, von denen einige mindestens eine Kopie der Polypeptid-pIII-Fusion an ihrer Oberfläche enthalten.
  • Variable Antikörperdomänen können eine Zielliganden-Bindungsstelle und/oder eine Bindungsstelle für einen generischen Liganden umfassen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Bindungsstelle für den generischen Liganden eine Bindungsstelle für ein Superantigen, wie z. B. Protein A, Protein L oder Protein G. Die variablen Domänen können auf jeder gewünschten variablen Domäne basieren, beispielsweise auf einem humanen VH (z. B. VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), einem humanen Vλ (z. B. VλI, VλII, VλIII, VλIV, VλV, VλVI oder Vκ1) oder einem humanen Vκ (z. B. Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vκ5, Vκ6, Vκ7, Vκ8, Vκ9 oder Vκ10).
  • In eine noch weitere Kategorie von Techniken ist die Selektion von Repertoires in künstlichen Kompartimenten einbezogen, die die Verknüpfung eines Gens mit seinem Genprodukt ermöglichen. Beispielsweise ist ein Selektionssystem, in dem Nukleinsäuren für die gewünschten Genprodukte kodieren, in Mikrokapseln selektiert werden können, die durch Wasser-in-Öl-Emulsionen gebildet werden, in WO99/02671 , WO00/40712 und Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6, beschrieben. Genetische Elemente, die für ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität kodieren, werden in Mikrokapseln kompartimentalisiert und dann transkribiert und/oder translatiert, um ihre jeweiligen Genprodukte (RNA oder Protein) innerhalb der Mikrokapseln zu produzieren. Genetische Elemente, die Genprodukte mit gewünschter Aktivität produzieren, werden anschließend sortiert. In diesem Ansatz werden durch Detektieren der gewünschten Aktivität mittels einer Vielfalt von Mitteln Genprodukte von Interesse selektiert.
  • Charakterisierung der Epitop-bindenden Domänen
  • Das Binden einer Domäne an ihr spezifisches Antigen oder Epitop kann mittels Verfahren geprüft werden, die dem Fachmann vertraut sind und ELISA umfassen. In einem Beispiel wird das Binden unter Benutzung monoklonaler Phagen-ELISA geprüft.
  • Phagen-ELISA kann gemäß jeder geeigneten Arbeitsweise durchgeführt werden. Unten ist eine beispielhafte Vorschrift bekannt gegeben.
  • Populationen von Phagen, die in jeder Selektionsrunde produziert werden, können mittels ELISA hinsichtlich des Bindens an das selektierte Antigen oder Epitop durchmustert werden, um „polyklonale” Phagen-Antikörper zu identifizieren. Phagen von einzelnen infizierten Bakterienkolonien dieser Populationen können dann mittels ELISA durchmustert werden, um „monoklonale” Phagen-Antikörper zu identifizieren. Es ist ebenfalls wünschenswert, lösliche Antikörperfragmente hinsichtlich des Bindens an Antigen oder Epitop zu durchmustern; dies kann ebenfalls mittels ELISA unter Benutzung von Reagenzien, beispielsweise gegen einen C- oder N-terminalen Tag, durchgeführt werden (siehe beispielsweise Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 und darin zitierte Literaturquellen.
  • Die Vielfalt der selektierten monoklonalen Phagen-Antikörper kann auch mittels Gelelektrophorese von PCR-Produkten (Marks et al. 1991, oben; Nissim et al. 1994, oben), Sondieren (Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) oder mittels Sequenzieren der Vektor-DNA bestimmt werden.
  • E. Struktur von dAbs
  • Falls die dAbs aus V-Gen-Repertoires selektiert werden, die zum Beispiel unter Anwendung der Phagen-Display-Technik selektiert werden, wie hierin beschrieben, dann umfassen diese variablen Domänen eine universelle Rahmenregion, so dass sie durch einen spezifischen generischen Liganden, wie hierin definiert, erkannt werden können. Die Benutzung von universellen Rahmenregionen, generischen Liganden und dergleichen ist in WO99/20749 beschrieben.
  • Wenn V-Gen-Repertoires benutzt werden, kann Variation der Polypeptidsequenz innerhalb struktureller Schleifen der variablen Domänen lokalisiert werden. Die Polypeptidsequenzen jeder variablen Domäne können durch DNA-Shuffling oder durch Mutation verändert werden, um die Wechselwirkung jeder variablen Domäne mit ihrem komplementären Paar zu verstärken. DNA-Shuffling ist im Fachgebiet bekannt und wird beispielsweise von Stemmer in 1994, Nature 370: 389-391 und der US-Patenschrift Nr. 6,297,053 gelehrt, die beide durch Bezugnahme hierin eingebunden werden. Andere Mutageneseverfahren sind Fachleuten gut bekannt.
  • Gerüst zur Benutzung bei der Konstruktion von dAbs
  • i. Selektion der Hauptkettenkonformation
  • Die Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie weisen alle eine ähnliche Faltung ihrer Polypeptidkette auf. Obwohl beispielsweise Antikörper hinsichtlich ihrer Primärsequenz in hohem Maße vielfältig sind, hat der Vergleich von Sequenzen und kristallographischen Strukturen enthüllt, dass entgegen der Erwartung fünf der sechs Antigen-bindenden Schleifen von Antikörpern (H1, H2, L1, L2, L3) eine begrenzte Anzahl von Hauptkettenkonformationen oder kanonischen Strukturen annehmen (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). Die Analyse von Schleifenlängen und Schlüsselresten hat daher die Vorhersage der Hauptkettenkonformationen von H1, H2, L1, 12 und L3, die sich in der Mehrheit humaner Antikörper finden, ermöglicht (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Obwohl die H3-Region hinsichtlich Sequenz, Länge und Struktur wesentlich vielfältiger ist (bedingt durch die Benutzung von D-Segmenten), bildet sie dennoch eine begrenzte Anzahl von Hauptkettenkonformationen für kleine Schleifenlängen, die von der Länge und der Anwesenheit bestimmter Reste oder Typen von Resten abhängig sind, an Schlüsselpositionen in der Schleife und der Rahmenregion aus (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
  • Die dAbs werden vorteilhaft aus Bibliotheken von Domänen, wie z. B. Bibliotheken von VH-Domänen und/oder Bibliotheken von VL-Domänen zusammengefügt. Unter einem Gesichtspunkt werden Bibliotheken von Domänen gestaltet, in denen bestimmte Schleifenlängen und Schlüsselreste ausgewählt werden, um sicherzustellen, dass die Hauptkettenkonformation der Mitglieder bekannt ist. Diese sind vorteilhaft wirkliche Konformationen von Molekülen der Immunglobulin-Superfamilie, die sich in der Natur finden, um die Möglichkeiten zu minimieren, dass sie nicht-funktionell sind, wie oben erörtert. Keimbahn-V-Gensegmente dienen als ein geeigneter grundlegender Rahmen zum Konstruieren von Antikörper- oder T-Zellen-Rezeptor-Bibliotheken; andere Sequenzen sind ebenfalls nützlich. Bei niedriger Frequenz können Variationen vorkommen, derart, dass eine kleine Anzahl funktioneller Mitglieder eine geänderte Hauptkettenkonformation aufweisen kann, die ihre Funktion nicht beeinflusst.
  • Die kanonische Strukturtheorie ist ebenfalls nützlich, um die Anzahl unterschiedlicher Hauptkettenkonformationen, die von Liganden kodiert werden, zu bestimmen, um die Hauptkettenkonformation auf der Grundlage von Ligandensequenzen vorherzusagen und die Reste zur Diversifikation auszuwählen, welche die kanonische Struktur nicht beeinflussen. Es ist bekannt, dass in der humanen Vκ-Domäne die L1-Schleife eine von vier kanonischen Strukturen annehmen kann, dass die L2-Schleife eine einzelne kanonische Struktur aufweist und dass 90% der humanen Vκ-Domänen eine von vier oder fünf kanonischen Strukturen für die L3-Schleife annehmen (Tomlinson et al. (1995) oben); daher können sich allein in der Vκ-Domäne unterschiedliche kanonische Strukturen kombinieren, um einen Bereich von unterschiedlichen Hauptkettenkonformationen zu erzeugen. Da die Vλ-Domäne für einen unterschiedlichen Bereich von kanonischen Strukturen für die L1-, L2- und L3-Schleifen kodiert, und da die Vκ- und Vλ-Domänen sich mit jeder beliebigen VH-Domäne, die für mehrere kanonische Strukturen für die H1- und H2-Schleifen kodieren kann, paaren kann, ist die Anzahl von kanonischen Strukturkombinationen, die bei diesen fünf Schleifen beobachtet wurde, sehr groß. Dies bringt mit sich, dass die Erzeugung von Vielfalt in der Hauptkettenkonformation wesentlich für die Erzeugung eines breiten Bereichs von Bindespezifitäten sein kann. Durch Konstruieren einer Antikörper-Bibliothek auf Grundlage einer einzelnen bekannten Hauptkettenkonformation ist jedoch festgestellt worden, dass entgegen der Erwartung die Vielfalt in der Hauptkettenkonformation nicht erforderlich ist, um ausreichende Vielfalt zum Abzielen auf im Wesentlichen alle Antigene zu erzeugen. Noch überraschender ist, dass die einzelne Hauptkettenkonformation keine Konsensusstruktur zu sein braucht; eine einzelne natürlich vorkommende Konformation kann als die Grundlage für eine gesamte Bibliothek benutzt werden. Daher weisen unter einem besonderen Gesichtspunkt die dAbs eine einzelne bekannte Hauptkettenkonformation auf.
  • Die einzelne Hauptkettenkonformation, die gewählt wird, kann bei Molekülen der Immunglobulin-Superfamilie des besagten Typs weit verbreitet sein. Eine Konformation ist weit verbreitet, wenn beobachtet wird, dass sie von einer signifikanten Anzahl natürlich vorkommender Moleküle eingenommen wird. Dementsprechend wird unter einem Gesichtspunkt das natürliche Vorkommen der unterschiedlichen Hauptkettenkonformation für jede bindende Schleife einer Immunglobulin-Domäne separat betrachtet und dann eine natürlich vorkommende variable Domäne gewählt, welche die gewünschte Kombination von Hauptkettenkonformationen für die verschiedenen Schleifen aufweist. Wenn keine verfügbar ist, kann das am nächsten kommende Äquivalent gewählt werden. Die gewünschte Kombination von Hauptkettenkonformationen für die verschiedenen Schleifen kann durch Selektieren von Keimbahn-Gensegmenten erzeugt werden, welche für die gewünschten Hauptkettenkonformationen kodieren. In einem Beispiel werden die selektierten Keimbahn-Gensegmente in der Natur häufig exprimiert, und insbesondere können sie die am häufigsten exprimierten von allen natürlichen Keimbahn-Gensegmenten sein.
  • Beim Entwerfen von Bibliotheken kann das Auftreten der verschiedenen Hauptkettenkonformationen für jedes der sechs Antigen-bindenden Schleifen separat betrachtet werden. Für H1, H2, L1, 12 und 13 wird eine gegebene Konformation gewählt, die von zwischen 20% und 100% der Antigen-bindenden Schleifen natürlich vorkommender Moleküle eingenommen wird. Typischerweise beträgt ihr Auftreten mehr als 35% (d. h. zwischen 35% und 100%) und idealerweise mehr als 50% oder sogar mehr als 65%. Da die überwiegende Mehrheit von H3-Schleifen keine kanonische Struktur aufweist, ist es vorzuziehen, eine Hauptkettenkonformation zu selektieren, die unter diesen Schleifen, welche die kanonischen Strukturen präsentieren, weit verbreitet ist. Für jede der Schleifen wird daher die Konformation selektiert, die am häufigsten in dem natürlichen Repertoire beobachtet wird. In humanen Antikörpern sind die gängigsten kanonischen Strukturen (CS) für jede Schleife wie folgt: H1 – CS 1 (79% des exprimierten Repertoires), H2 – CS 3 (46%), L1 – CS 2 von Vκ(39%), L2 – CS 1 (100%), L3 – CS 1 von Vκ (36%) (Berechnung geht von einem κ:λ-Verhältnis von 70:30 aus, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Für H3-Schleifen, die kanonische Strukturen aufweisen, ist eine CDR3-Länge (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services) von sieben Resten mit einer Salzbrücke von Rest 94 zu Rest 101 anscheinend die häufigste. Es gibt mindestens 16 humane Antikörpersequenzen in der EMBL-Datenbibliothek mit der erforderlichen H3-Länge und den erforderlichen Schlüsselresten, um diese Konformation zu bilden, und mindestens zwei kristallographische Strukturen in der Protein-Datenbank, die als eine Basis für das Antikörper-Modellieren benutzt werden können (2cgr and ltet). Die am häufigsten exprimierten Keimbahn-Gensegmente, die diese Kombination von kanonischen Strukturen, sind das VH-Segment 3-23 (DP-47), das JH-Segment JH4b, das Vκ-Segment O2/O12 (DPK9) und das Jκ-Segment Jκ 1. Die VH-Segmente DP45 und DP38 sind ebenfalls geeignet. Diese Segmente können daher in Kombination als eine Basis zum Konstruieren einer Bibliothek mit der gewünschten einzelnen Hauptkettenkonformation benutzt werden.
  • Anstatt die einzelne Hauptkettenkonformation auf der Basis des natürlichen Vorkommens der verschiedenen Hauptkettenkonformationen für jede der isolierten bindenden Schleifen zu wählen, wird alternativ das natürliche Vorkommen von Kombinationen von Hauptkettenkonformationen als die Basis für die Wahl der einzelnen Hauptkettenkonformation benutzt. Im Falle von Antikörpern beispielsweise kann das natürliche Vorkommen kanonischer Strukturkombinationen für jeweils zwei, drei, vier, fünf oder für alle sechs Antigen-bindende Schleifen bestimmt werden. Hier kann die gewählte Konformation in natürlich vorkommenden Antikörpern weit verbreitet sein und in dem natürlichen Repertoire am häufigsten beobachtet werden. Wenn daher beispielsweise bei humanen Antikörpern natürliche Kombinationen der fünf Antigen-bindenden Schleifen H1, H2, L1, 12 und 13 betrachtet werden, wird die häufigste Kombination kanonischer Strukturen bestimmt und dann als eine Basis für die Wahl der Hauptkettenkonformation mit der gängigsten Konformation für die H3-Schleife kombiniert.
  • Diversifikation der kanonischen Sequenz
  • Nach der Selektion mehrerer bekannter Hauptkettenkonformationen oder einer einzelnen bekannten Hauptkettenkonformation kann dAbs durch Variieren der Bindungsstelle des Moleküls konstruiert werden, um ein Repertoire mit struktureller und/oder funktioneller Vielfalt zu erzeugen. Dies bedeutet, dass Varianten erzeugt werden, derart, dass sie ausreichende Vielfalt in ihrer Struktur und/oder ihrer Funktion aufweisen, so dass sie in der Lage sind, einen Bereich von Aktivitäten bereitzustellen.
  • Die gewünschte Vielfalt wird typischerweise durch Variieren des selektierten Moleküls an einer oder mehreren Positionen erzeugt. Die zu ändernden Positionen können per Zufall ausgewählt oder selektiert werden. Die Variation kann dann entweder durch Randomisierung, bei der die residente Aminosäure durch eine beliebige Aminosäure oder ein Analoges davon, natürlich oder synthetisch, ersetzt wird, wobei eine sehr große Anzahl von Varianten erzeugt wird, oder durch Ersetzen der residenten Aminosäure durch eine oder mehrere von einer definierten Teilmenge von Aminosäuren erzielt werden, wobei eine begrenztere Anzahl von Varianten erzeugt wird.
  • Verschiedene Verfahren zum Einführen solcher Vielfalt sind angegeben: Error-Prone-PCR (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889), chemische Mutagenese (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) oder bakterielle Mutationsstämme (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359) können angewendet werden, um Zufallsmutationen in die Gene einzuführen, die für das Molekül kodieren. Verfahren zum Mutieren selektierter Positionen sind im Fachgebiet ebenfalls gut bekannt; dazu gehören beispielsweise die Benutzung fehlangepasster Oligonukleotide oder degenerierter Oligonukleotide, mit oder ohne Anwendung der PCR. Beispielsweise wurden mehrere Bibliotheken synthetischer Antikörper durch zielgerichtete Mutationen an den Antigen-bindenden Schleifen erzeugt. Die H3-Region vom humanen Tetanustoxoid-bindenden Fab wurde randomisiert, um einen Bereich neuer Bindungsspezifitäten zu erzeugen (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Zufällige oder halbzufällige H3- und L3-Regionen wurden an Keimbahn-V-Gensegmente angehängt, um große Bibliotheken mit unmutierten Rahmenregionen zu erzeugen (Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Eine solche Diversifikation wurde ausgeweitet, um einige oder alle anderen Antigenbindenden Schleifen einzubeziehen (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320 , oben).
  • Da die Randomisierung das Potenzial aufweist, allein für H3 mehr als etwa 1015 Strukturen und eine ähnlich große Anzahl von Varianten für die anderen fünf Schleifen zu erzeugen, ist es unter Anwendung der gegenwärtigen Transformationstechnik oder selbst durch Benutzung zellfreier Systeme nicht machbar, eine Bibliothek zu erzeugen, die alle möglichen Kombinationen darstellt. Beispielsweise wurden in einer der größten bisher konstruierten Bibliotheken 6 × 1010 verschiedene Antikörper erzeugt, was nur ein Bruchteil der potenziellen Vielfalt für eine Bibliothek mit diesem Design ist (Griffiths et al. (1994), oben).
  • In einer Ausführungsform sind nur die direkt an der Erzeugung oder Modifizierung der gewünschten Molekülfunktion beteiligten Rückstände diversifiziert. Für viele Moleküle wird die Funktion darin bestehen, ein Ziel zu binden, deshalb sollte Diversifizierung in der Zielbindestelle konzentriert sein und die Änderung von Rückständen vermieden werden, die für die gesamte Molekülpackung oder zur Aufrechterhaltung der gewählten Hauptkettenkonformation ausschlaggebend sind.
  • In einem Aspekt werden dAbs-Bibliotheken verwendet, in denen nur die Rückstände in der Antigenbindungsstelle variiert sind. Diese Rückstände sind im humanen Antikörper-Repertoire extrem diversifiziert und machen bekanntermaßen Kontakte in Antikörper-/Antigen-Komplexen mit hoher Auflösung. Es ist beispielsweise bekannt, dass in 12 die Positionen 50 und 53 in natürlich vorkommenden Antikörpern diversifiziert sind und beim Kontakt mit dem Antigen beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu hätte der konventionelle Ansatz darin bestanden, alle Rückstände in der entsprechenden Complementarity Determining Region (komplementaritätsbestimmende Region, CDR1) zu diversifizieren, wie von Kabat et al definiert. (1991, supra), ungefähr sieben Rückstände im Vergleich zu den zwei diversifizierten in der Bibliothek.. Dies stellt eine signifikante Verbesserung hinsichtlich der funktionalen Diversifizierung dar, die zur Herstellung eines Bereichs von antigenbindenden Spezifitäten erforderlich ist.
  • In der Natur ist die Antikörperdiversifizierung das Ergebnis von zwei Prozessen: somatische Rekombination der Keimlinie V, D- und J-Gensegmente zur Erzeugung eines naiven primären Repertoires (so genannte Keimlinie und junktionale Diversifizierung) und somatische Hypermutation der resultierenden umgelagerten V-Gene. Die Analyse der humanen Antikörpersequenzen hat gezeigt, dass Diversifizierung im primären Repertoire auf den Mittelpunkt der Antigenbindungsstelle konzentriert ist, wohingegen die somatische Hypermutation die Diversifizierung auf Regionen an der Peripherie der Antigenbindungsstelle verteilt, die im primären Repertoire hochkonserviert sind (siehe Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813). Dies Komplementarität hat sich wahrscheinlich als eine effiziente Strategie zur Suche nach Sequenzraum entwickelt und obwohl sie scheinbar einmalig ist für Antikörper, kann sie leicht auf andere Polypeptid-Repertoires angewendet werden. Die vielgestaltigen Rückstände sind ein Subset derjenigen, die die Bindungsstelle für das Ziel bilden. Verschiedene (einschließlich überlappende) Subsets von Rückständen in der Zielbindungsstelle werden in verschiedenen Stadien während der Auswahl diversifiziert, falls erwünscht.
  • Im Fall eines Antikörper-Repertoires wird ein anfängliches ,naives' Repertoire erzeugt, in dem einige, jedoch nicht alle Rückstände in der Antigenbindungsstelle diversifiziert sind. Wie hierin in diesem Zusammenhang verwendet bezieht sich der Begriff „naiv” oder „Dummy” auf Antikörpermoleküle, die kein vorbestimmtes Ziel haben. Diese Moleküle ähneln denjenigen, die in den Immunglobulingenen einer Person verschlüsselt sind, die keiner Immundiversifizierung unterzogen wurde, wie dies bei Föten oder Neugeborenen der Fall ist, deren Immunsystem noch nicht durch eine große Vielzahl von antigenen Stimuli herausgefordert wurde. Dieses Repertoire wird dann gegen eine Reihe von Antigenen und Epitopen gewählt. Falls erforderlich kann dann außerhalb der im ursprünglichen Repertoire diversifizierten Region eine weitere Diversifizierung eingeführt werden. Dieses reife Repertoire kann für modifizierte Funktion, Spezifität oder Affinität gewählt werden.
  • Es ist selbstverständlich, dass die hierin beschriebenen Sequenzen solche umfassen, die im Wesentlichen identisch sind, beispielsweise Sequenzen, die mindestens 90% identisch sind, beispielsweise mindestens 91%, oder mindestens 92%, oder mindestens 93%, oder mindestens 94% oder mindestens 95%, oder mindestens 96%, oder mindestens 97% oder mindestens 98%, oder mindestens 99% mit den hierin beschriebenen Sequenzen identisch sind.
  • Für Nukleinsäuren gibt der Begriff „wesentliche Identität” an, dass zwei Nukleinsäuren oder deren designierte Sequenzen bei optimaler Ausrichtung und einem Vergleich identisch sind, mit angemessenen Nukleotidinsertionen oder -deletionen bei mindestens ungefähr 80% der Nukleotide, gewöhnlich mindestens ungefähr 90% bis 95% und vorzugsweise mindestens 98% bis 99,5% der Nukleotide. Alternativ besteht eine wesentliche Identität, wenn die Segmente unter selektiven Hybridisierungsbedingungen zum Komplement des Strangs hybridisiert werden.
  • Für Nukleotid- und Aminosäuresequenzen gibt der Begriff „identisch” den Grad der Identität zwischen zwei Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen an, wenn sie optimal ausgerichtet sind und verglichen werden, mit angemessenen Insertionen oder Deletionen. Alternativ besteht eine wesentliche Identität, wenn die DNS-Segmente unter selektiven Hybridisierungsbedingungen zum Komplement des Strangs hybridisiert werden.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen Positionen zwischen den Sequenzen (d. h.% Identität = Anz. der identischen Positionen/Gesamtanz. der Positionen mal 100) unter Berücksichtigung der Anzahl von Gaps und der Länge jedes Gaps, die für eine optimale Ausrichtung der zwei Sequenzen eingeführt werden müssen. Der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen kann mit einem mathematischen Algorithmus erreicht werden, wie in den nicht-limitierenden Beispielen unten beschrieben.
  • Die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen kann mithilfe von des GAP-Programms im GCG-Softwarepaket unter Verwendung einer NWSgapdna.CMP-Matrix und eines Gap-Gewichts von 40, 50, 60, 70, oder 80 und eines Längen-Gewichts von 1, 2, 3, 4, 5, or 6. Die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen kann auch mithilfe des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: IL-17 (1988)) bestimmt werden, der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) inkorporiert wurde, unter Verwendung einer PAM120-Gewichtsrückstandstabelle, einer Gap-Längenstrafe von 12 und einer Gap-Strafe von 4. Außerdem kann die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen mithilfe des Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) bestimmt werden, der in das GAP-Programm im GCG-Softwarepaket inkorporiert wurden unter Verwendung entweder einer Blossum 62-Matrix oder einer PAM250-Matrix und einem Gap-Gewicht von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einem Längen-Gewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6.
  • Als Beispiel kann eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung mit der Referenzsequenz von SEQ ID NR.: 122 identisch sein, die 100% identisch ist, oder sie kann bis zu eine bestimmte Ganzzahl von Nukleotidwechseln im Vergleich zur Referenzsequenz umfassen. Solche Wechsel werden aus der Gruppe gewählt, die aus mindestens einer Nukleotiddeletion, Substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder Insertion besteht und wobei besagte Wechsel an den 5'- oder 3'-Terminalpositionen der Referenz-Nukleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen Terminalpositionen eintreten können, entweder einzeln unter die Nukleotide in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren benachbarten Gruppen innerhalb der Referenzsequenz eingestreut. Die Anzahl der Nukleotidwechseln wird durch Multiplikation der Gesamtanzahl von Nukleotiden in der SEQ ID NR.: 122 mit den numerischen Prozent der jeweiligen prozentualen Identität (geteilt durch 100) und Subtraktion dieses Produkts von besagter Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NR.: 122 bestimmt oder: nn ≤ xn – (xn·y), wobei nn die Anzahl der Nukleotidwechsel, xn die Gesamtanzahl der Nukleotide in SEQ ID NR.: 122 und y 0,50 für 50%, 0,60 für 60%, 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85%, 0,90 für 90%, 0,95 für 95%, 0,97 für 97% oder 1,00 für 100% ist und wobei jedes nicht-ganzzahlige Produkt von xn und y auf die nächste Ganzzahl abgerundet wird, bevor es von xn subtrahiert wird. Wechsel der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NR.: 122 könnten Nonsense-, Missense- oder Frameshift-Mutationen in dieser Kodierungssequenz erzeugen und dadurch das nach solchen Wechseln vom Polynukleotid verschlüsselte Polypeptid verändern.
  • Ähnlich kann in einem anderen Beispiel eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung mit der durch SEQ ID NR.: 26 verschlüsselten Referenzsequenz identisch sein, die 100% identisch ist, oder sie kann bis zu eine bestimmte Ganzzahl von Aminosäurewechseln im Vergleich zur Referenzsequenz umfassen, so dass die Identität weniger als 100% beträgt. Solche Wechsel werden aus der Gruppe gewählt, die aus mindestens einer Aminosäurendeletion, Substitution, einschließlich konservativer und nicht-konservativer Substitution, oder Insertion besteht und worin besagte Wechsel an den Amino- oder Carboxy-Terminalpositionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder irgendwo zwischen diesen Terminalpositionen eintreten können, entweder einzeln unter die Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren benachbarten Gruppen innerhalb der Referenzsequenz eingestreut. Die Anzahl der Aminosäurewechsel für eine bestimmte% Identität wird durch Multiplikation der Gesamtanzahl von Aminosäuren in der durch SEQ ID NR.: 262 verschlüsselten Polypeptidsequenz mit den numerischen Prozent der jeweiligen prozentualen Identität (geteilt durch 100) und Subtraktion dieses Produkts von besagter Gesamtanzahl von Aminosäuren in der durch SEQ ID NR.: 26 verschlüsselten Polypeptidsequenz bestimmt oder: na ≤ xa – (xa·y), wobei na die Anzahl der Aminosäurewechsel, xa die Gesamtanzahl von Aminosäuren in der durch SEQ ID NR.: 26 verschlüsselten Polypeptidsequenz und y beispielsweise 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85% usw. ist und wobei jedes nicht-ganzzahlige Produkt von xa und y auf die nächste Ganzzahl abgerundet wird, bevor es von xa subtrahiert wird.
  • Beispiele
  • Die folgenden Methoden wurden in den hierin beschriebenen Beispielen verwendet.
  • Methode 1
  • Bindung an E. Coli-exprimiertes rekombinantes humanes IL-13 durch ELISA
  • mAbdAb-Moleküle wurden für die Bindung an rekombinantes E. coli-exprimiertes humanes IL-13 in einem Direktbindungs-ELISA beurteilt. Mit wenigen Worten, 5 μ g/ml rekombinantes E. coli-exprimiertes humanes IL-13 (bei GSK hergestellt und gereinigt) wurde auf eine 96-Well-ELISA-Platte aufgebracht. Die Wells wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, mAbdAb-Konstrukte wurden dann auf die Platte titriert (in der Regel um 100 nM in Dreifachlösungen bis ca. 0,01 nM). Die Bindung wurde mithilfe einer geeigneten Lösung von anti-humanem, peroxidasekonjugiertem Kappa-Leichtketten-Antikörper (Katalognummer A7164, Sigma-Aldrich) oder einer geeigneten Lösung von anti-humanem, peroxidase-konjugiertem, kettenspezifischem IgG-Detektionsantikörper γKatalognummer A6029, Sigma-Aldrich) erkannt.
  • Methode 2
  • Bindung an E. Coli-exprimiertes rekombinantes humanes IL-4 durch ELISA
  • mAbdAb-Moleküle wurden für die Bindung an rekombinantes E. coli-exprimiertes humanes IL-4 in einem Direktbindungs-ELISA beurteilt. Mit wenigen Worten, 5 μ g/ml rekombinantes E. coli-exprimiertes humanes IL-4 (bei GSK hergestellt und gereinigt) wurde auf eine 96-Well-ELISA-Platte aufgebracht. Die Wells wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, mAbdAb-Konstrukte wurden dann auf die Platte titriert (in der Regel um 100 nM in Dreifachlösungen bis ca. 0,01 nM). Die Bindung wurde mithilfe einer geeigneten Lösung von anti-humanem, peroxidase-konjugiertem Kappa-Leichtketten-Antikörper (Katalognummer A7164, Sigma-Aldrich) oder einer geeigneten Lösung von anti-humanem, peroxidase-konjugiertem, kettenspezifischem IgG-Detektionsantikörper γKatalognummer A6029, Sigma-Aldrich) erkannt.
  • Methode 3
  • Bindung an E. Coli-exprimiertes rekombinantes humanes IL-18 durch ELISA
  • mAbdAb-Konstrukte wurden für die Bindung an rekombinantes E. coli-exprimiertes humanes IL-18 in einem Direktbindungs-ELISA beurteilt. Mit wenigen Worten, 5 μ g/ml rekombinantes E. coli-exprimiertes humanes IL-18 (bei GSK hergestellt und gereinigt) wurde auf eine 96-Well-ELISA-Platte aufgebracht. Die Wells wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, mAbdAb-Konstrukte wurden dann auf die Platte titriert (in der Regel um 100 nM in Dreifachlösungen bis ca. 0,01 nM). Die Bindung wurde mithilfe einer Lösung von 1:2000 von anti-humanem, peroxidasekonjugiertem Kappa-Leichtketten-Antikörper (Katalognummer A7164, Sigma-Aldrich) oder einer Lösung von 1:2000 von anti-humanem, peroxidase-konjugiertem, kettenspezifischem IgG-Detektionsantikörper γKatalognummer A6029, Sigma-Aldrich) erkannt.
  • Methode 4
  • BiacoreTM Bindungsaffinitätsbeurteilung für die Bindung an E. Coli-exprimiertes rekombinantes humanes IL-13
  • Die Bindungsaffinität von mAbdAb-Konstrukten für rekombinantes E. Coli-exprimiertes humanes IL-13 wurde mit BiacoreTM-Analyse beurteilt. Die Analysen wurden unter Verwendung von Protein A- oder anti-humaner IgG-Capture durchgeführt. Mit wenigen Worten, Protein A oder anti-humanes IgG wurde den Empfehlungen des Herstellers entsprechend durch primäre Aminkopplung auf einen CM5-Chip gekoppelt. mAbdAb-Konstrukte wurden dann auf diese Fläche gebunden und humanes IL-13 (bei GSK hergestellt und gereinigt) zu bestimmten Konzentrationen darüber passiert. Die Oberfläche wurde mit milden Säureeluierungsbedingungen (wie 100 mM Phosphorsäure) zur Protein A-Fläche regeneriert; dies hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit, Antikörper für ein nachfolgendes IL-13-Bindungsereignis einzufangen. Die anti-humane IgG-Fläche wurde entweder unter ähnlichen Bedingungen zur Protein A-Fläche regeneriert oder durch Verwendung von 3M MgCl2 . Die Arbeit wurde auf dem BiacoreTM 3000 und/oder der T100-Maschine durchgeführt, die Daten wurden mit der Evaluierungssoftware in den Maschinen analysiert und an das 1:1-Bindungsmodell angepasst. BiacoreTM-Durchläufe wurden bei 25°C oder 37°C durchgeführt.
  • Methode 5
  • BiacoreTM Bindungsaffinitätsbeurteilung für die Bindung an E. Coli-exprimiertes rekombinantes humanes IL-4
  • Die Bindungsaffinität von mAbdAb-Konstrukten für rekombinantes E. Coli-exprimiertes humanes IL-4 wurde mit BiacoreTM-Analyse beurteilt. Die Analysen wurden unter Verwendung von Protein A- oder anti-humaner IgG-Capture durchgeführt. Mit wenigen Worten, Protein A oder anti-humanes IgG wurde den Empfehlungen des Herstellers entsprechend durch primäre Aminkopplung auf einen CM5-Chip gekoppelt. mAbdAb-Konstrukte wurden dann auf diese Fläche gebunden und humanes IL-4 (bei GSK hergestellt und gereinigt) zu bestimmten Konzentrationen darüber passiert. Die Oberfläche wurde mit milden Säureeluierungsbedingungen (wie 100 mM Phosphorsäure) zur Protein A-Fläche regeneriert; dies hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit, Antikörper für ein nachfolgendes IL-4-Bindungsereignis einzufangen. Die anti-humane IgG-Fläche wurde entweder unter ähnlichen Bedingungen zur Protein A-Fläche regeneriert oder durch Verwendung von 3M MgCl2 . Die Arbeit wurde auf dem BiacoreTM 3000 und/oder der T100- und/oder der A100-Maschine durchgeführt, die Daten wurden mit der Evaluierungssoftware in den Maschinen analysiert und an das 1:1-Bindungsmodell angepasst. BiacoreTM-Durchlaufe wurden bei 25°C oder 37°C durchgeführt.
  • Methode 6
  • BiacoreTM Bindungsaffinitätsbeurteilung für die Bindung an E. Coli-exprimiertes rekombinantes humanes IL-18
  • Die Bindungsaffinität von mAbdAb-Konstrukten für rekombinantes E. Coli-exprimiertes humanes IL-18 wurde mit BiacoreTM-Analyse beurteilt. Die Analysen wurden unter Verwendung von Protein A- oder anti-humaner IgG-Capture durchgeführt. Mit wenigen Worten, Protein A oder anti-humanes IgG wurde den Empfehlungen des Herstellers entsprechend durch primäre Aminkopplung auf einen CM5-Chip gekoppelt. mAbdAb-Konstrukte wurden dann auf diese Fläche gebunden und humanes IL-18 (bei GSK hergestellt und gereinigt) zu bestimmten Konzentrationen darüber passiert. Die Oberfläche wurde mit milden Säureeluierungsbedingungen (wie 100 mM Phosphorsäure) zur Protein A-Fläche regeneriert; dies hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit, Antikörper für ein nachfolgendes IL-18-Bindungsereignis einzufangen. Die anti-humane IgG-Fläche wurde entweder unter ähnlichen Bedingungen zur Protein A-Fläche regeneriert oder durch Verwendung von 3M MgCl2 . Die Arbeit wurde auf dem BiacoreTM 3000 und/oder der T100- und/oder der A100-Maschine durchgeführt, die Daten wurden mit der Evaluierungssoftware in den Maschinen analysiert und an das 1:1-Bindungsmodell angepasst. Der BiacoreTM-Durchlauf wurde bei 25°C durchgeführt.
  • Methode 7
  • Stoichiometrie-Beurteilung von mAbdAb-bispezifischen Antikörpern oder trispezifischem Antikörper für IL-13, IL-4 oder IL-18 (mit BiacoreTM)
  • Anti-humanes IgG wurde mit primärer Aminkopplung auf einen CM5 Biosensor-Chip immobilisiert. mAbdAb-Konstrukte wurden auf diese Fläche gebunden, wonach eine einzelne Konzentration von IL-13, IL-4 oder IL-18 Zytokin darüber passiert wurde. Diese Konzentration war ausreichend zur Sättigung der Bindungsfläche und das beobachtete Bindungssignal erreichte volle R-max. Dann wurden Stoichiometrien mithilfe der folgenden Formel berechnet: Stoich = Rmax·Mw (Ligand)/Mw (Analyt)·R (Ligand immobilisiert oder gefangen)
  • In Fällen, in denen die Stoichiometrien für mehr als eine Analytbindung auf einmal berechnet wurden, wurden die verschiedenen Zytokine der Reihe nach mit der Sättigungszytokinkonzentration passiert und die Stoichiometrien wie oben berechnet.
  • Die Arbeit wurde auf dem Biacore 3000 bei 25°C mit HBS-EP-Laufpuffer durchgeführt.
  • Methode 8
  • Neutralisierung von E. Coli-exprimiertem rekombinantem humanem IL-13 in einem TF-1-Zellproliferations-Bioassay
  • TF-1-Zellen proliferieren in Reaktion auf eine Anzahl von verschiedenen Zytokinen, einschließlich humanes IL-13. Die Proliferationsreaktion dieser Zellen für IL-13 kann deshalb zur Messung der Bioaktivität von IL-13 verwendet werden und aus diesem Grund wurde ein Test entwickelt, um die Neutralisierungspotenz für IL-13 (Inhibition der Bioaktivität von IL-13) des mAbdAb-Konstrukts zu bestimmen.
  • Der Test wurde in sterilen 96-Well-Gewebekulturplatten unter sterilen Bedingungen durchgeführt und alle Test-Wells wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Ungefähr 14 ng/ml rekombinantes E.Coli-exprimiertes humanes IL-13 wurde mit verschiedenen Verdünnungen des mAbdAb-Konstrukts vorinkubiert (gewöhnlich von 200 nM in Dreifachverdünnungen titriert bis 0,02 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für 1 Stunde bei 37°C. Diese Proben wurden dann 50 μl der TF-1-Zellen (mit einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml) in einer sterilen 96-Well-Gewebekulturplatte hinzugefügt. Somit enthielt das endgültige 100 μl-Testvolumen verschiedene Verdünnungen des mAbdAb-Konstrukts (mit einer endgültigen Konzentration von 100 nM in Dreifachverdünnungen titriert bis 0,01 nM), rekombinantes, E.Coli-exprimiertes, humanes IL-13 (mit einer endgültigen Konzentration von 7 ng/ml) und TF-1-Zellen (mit einer endgültigen Konzentration von 1 × 105 Zellen pro ml). Die Testplatte wurde bei 37°C für ungefähr 3 Tage in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Die Bestimmung der Menge der Zellproliferation erfolgte dann mithilfe des ,CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay' von Promega (Katalognummer G4100) wie in den Anleitungen des Herstellers beschrieben. Die Absorption der Proben in der 96-Well-Platte wurde in einem Plattenleser bei 570 nm gelesen.
  • Die Kapazität des mAbdAb-Konstrukts zur Neutralisierung der Bioaktivität von rekombinantem, E. Coli-exprimiertem, humanem IL-13 wurde ausgedrückt als die zur Neutralisierung der Bioaktivität der definierten Menge von humanem IL-13 (7 ng/ml) um 50% benötigte Konzentration des mAbdAb-Konstrukts (= ND50). Je niedriger die benötigte Konzentration des mAbdAb-Konstrukts, um so stärker die Neutralisierungskapazität. Die hierin angegebenen ND50-Daten wurden manuell errechnet oder unter Verwendung des in Microsoft Excel eingebauten Robosage-Softwarepakets.
  • Methode 9
  • Neutralisierung von E. Coli-exprimiertem rekombinantem humanem IL-4 in einem TF-1-Zellproliferations-Bioassay
  • TF-1-Zellen proliferieren in Reaktion auf eine Anzahl von verschiedenen Zytokinen, einschließlich humanes IL-4. Die Proliferationsreaktion dieser Zellen für IL-4 kann deshalb zur Messung der Bioaktivität von IL-4 verwendet werden und aus diesem Grund wurde ein Test entwickelt, um die Neutralisierungspotenz für IL-4 (Inhibition der Bioaktivität von IL-4) des mAbdAb-Konstrukts zu bestimmen.
  • Der Test wurde in sterilen 96-Well-Gewebekulturplatten unter sterilen Bedingungen durchgeführt und alle Test-Wells wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Ungefähr 2,2 ng/ml rekombinantes E.Coli-exprimiertes humanes IL-4 wurde mit verschiedenen Verdünnungen des mAbdAb-Konstrukts vorinkubiert (gewöhnlich von 200 nM in Dreifachlösungen titriert bis 0,02 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für 1 Stunde bei 37°C. Diese Proben wurden dann 50 μl der TF-1-Zellen (mit einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml) in einer sterilen 96-Well-Gewebekulturplatte hinzugefügt. Somit enthielt das endgültige 100 μl-Testvolumen verschiedene Verdünnungen des mAbdAb-Konstrukts (mit einer endgültigen Konzentration von 100 nM in Dreifachverdünnungen titriert bis 0,01 nM), rekombinantes, E. Coli-exprimiertes, humanes IL-4 (mit einer endgültigen Konzentration von 1,1 ng/ml) und TF-1-Zellen (mit einer endgültigen Konzentration von 1 × 105 Zellen pro ml). Die Testplatte wurde bei 37°C für ungefähr 3 Tage in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Die Bestimmung der Menge der Zellproliferation erfolgte dann mithilfe des ,CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay' von Promega (Katalognummer G4100) wie in den Anleitungen des Herstellers beschrieben. Die Absorption der Proben in der 96-Well-Platte wurde in einem Plattenleser bei 570 nm gelesen.
  • Die Kapazität des mAbdAb-Konstrukts zur Neutralisierung der Bioaktivität von rekombinantem, E. Coli-exprimiertem, humanem IL-4 wurde ausgedrückt als die zur Neutralisierung der Bioaktivität der definierten Menge von humanem IL-4 (1,1 ng/ml) um 50% benötigte Konzentration des mAbdAb-Konstrukts (= ND50). Je niedriger die benötigte Konzentration des mAbdAb-Konstrukts, um so stärker die Neutralisierungskapazität. Die hierin angegebenen ND50-Daten wurden manuell errechnet oder unter Verwendung des in Microsoft Excel eingebauten Robosage-Softwarepakets.
  • Methode 10
  • Neutralisierung von E. Coli-exprimiertem rekombinantem humanem IL-13 und E. Coli-exprimiertem rekombinantem IL-4 in einem TF-1-Zellproliferations-Bioassay
  • TF-1-Zellen proliferieren in Reaktion auf eine Anzahl von verschiedenen Zytokinen, einschließlich humanes IL-13 und humanes IL-4. Die Proliferationsreaktion dieser Zellen für IL-13 und IL-4 kann deshalb zur gleichzeitigen Messung der Bioaktivität von IL-13 und IL-4 verwendet werden und aus diesem Grund wurde ein Test entwickelt, um die doppelte Neutralisierungspotenz für IL-13 und IL-4 (doppelte Inhibition der Bioaktivität von IL-13 und IL-4) des mAbdAb-Konstrukts zu bestimmen.
  • Der Test wurde in sterilen 96-Well-Gewebekulturplatten unter sterilen Bedingungen durchgeführt und alle Test-Wells wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Ungefähr 14 ng/ml rekombinantes E.Coli-exprimiertes humanes IL-13 und ungefähr 2,2 ng/ml rekombinantes, e. Coli-exprimiertes, humanes IL-4 wurden mit verschiedenen Verdünnungen des mAbdAb-Konstrukts vorinkubiert (gewöhnlich von 200 nM in Dreifachlösungen titriert bis 0,02 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für 1 Stunde bei 37°C. Diese Proben wurden dann 50 μl der TF-1-Zellen (mit einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml) in einer sterilen 96-Well-Gewebekulturplatte hinzugefügt. Somit enthielt das endgültige 100-μl-Testvolumen verschiedene Verdünnungen des mAbdAb-Konstrukts (mit einer Endkonzentration von 100 nM in Dreifachverdünnungen titriert bis 0,01 nM), rekombinantes, E.Coli-exprimiertes, humanes IL-13 (mit einer Endkonzentration von 7 ng/ml), rekombinantes, E. Coli-exprimiertes, humanes IL-4 (mit einer Endkonzentration von 1,1 ng/ml) und TF-1-Zellen (mit einer Endkonzentration von 1 × 105 Zellen pro ml). Die Testplatte wurde bei 37°C für ungefähr 3 Tage in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Die Bestimmung der Menge der Zellproliferation erfolgte dann mithilfe des ,CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay' von Promega (Katalognummer G4100) wie in den Anleitungen des Herstellers beschrieben. Die Absorption der Proben in der 96-Well-Platte wurde in einem Plattenleser bei 570 nm gelesen.
  • Methode 11
  • BiacoreTM Bindungsaffinitätsbeurteilung für die Bindung an Sf21-exprimiertes rekombinantes humanes IL-5
  • Die Bindungsaffinität von mAbdAb-Molekülen für rekombinantes Sf21-exprimiertes humanes IL-5 wurde mit BiacoreTM-Analyse beurteilt. Die Analysen wurden unter Verwendung von Protein A- oder anti-humaner IgG-Capture durchgeführt. Mit wenigen Worten, Protein A oder anti-humanes IgG wurde den Empfehlungen des Herstellers entsprechend durch primäre Aminkopplung auf einen CM5-Chip gekoppelt. mAbdAb-Moleküle wurden dann auf diese Fläche gebunden und humanes IL-5 (bei GSK hergestellt und gereinigt) zu bestimmten Konzentrationen darüber passiert. Die Oberfläche wurde mit milden Säureeluierungsbedingungen (wie 100 mM Phosphorsäure) zur Protein A-Fläche regeneriert; dies hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit, Antikörper für ein nachfolgendes IL-5-Bindungsereignis einzufangen. Die anti-humane IgG-Fläche wurde entweder unter ähnlichen Bedingungen zur Protein A-Fläche regeneriert oder durch Verwendung von 3M MgCl2. Die Arbeit wurde auf den BiacoreTM 3000-, T100- und A100-Maschinen durchgeführt, die Daten wurden mit der Evaluierungssoftware in den Maschinen analysiert und an das 1:1-Bindungsmodell angepasst. Der BiacoreTM-Durchlauf wurde bei 25°C durchgeführt.
  • Methode 12
  • VEGF-Rezeptorbindungstest.
  • Mit diesem Test wird die Bindung von VEGF165 an VEGF R2 (VEGF-Rezeptor) und die Fähigkeit der Testmoleküle zur Blockierung dieser Interaktion gemessen. ELISA-Platten wurden über Nacht mit VEGF-Rezeptor (R&D Systems, Kat.-Nr.: 357-KD-050) (0,5 μg/ml Endkonzentration in 0,2 M Natriumcarbonat-Bicarbonat pH 9,4) beschichtet, gewaschen und mit 2% BSA in PBS geblockt. VEGF (R&D Systems, Kat.-Nr.: 293-VE-050) und die Testmoleküle (verdünnt in 0,1% BSA in 0,05% Tween 20TM PBS) wurden für eine Stunde vor der Zugabe zur Platte vorinkubiert (3 ng/ml VEGF-Endkonzentration). Die Bindung von VEGF an den VEGF-Rezeptor wurde mithilfe von biotinyliertem Anti-VEGF-Antikörper (0,5 μg/ml Endkonzentration) (R&D Systems, Kat.-Nr.: BAF293) und eines peroxidase-konjugierten sekundären Anti-Biotin-Antikörpers (Verdünnung von 1:5000) (Stratech, Kat.-Nr.: 200-032-096) erkannt und bei OD450 mithilfe eines kolorimetrischen Substrats (Sure Blue TMB Peroxidasesubstrat, KPL) visualisiert, nachdem die Reaktion mit einem gleichen Volumen 1M HCl gestoppt wurde.
  • Methode 13
  • EGFR-Kinasetest
  • Die Aktivierung von auf der Oberfläche von A431-Zellen exprimiertes EGFR durch seine Interaktion mit EGF führt zu Tyrosinkinase-Phosphorylierung des Rezeptors. Die Reduzierung der EGFR-Tyrosinkinase-Phosphorylierung wurde gemessen, um die Stärke der Testmoleküle zu bestimmen. A431-Zellen durften über Nacht an 96-Well-Gewebekulturplatten anhaften, dann wurde das Testmolekül hinzugefügt und für 1 Stunde belassen und dann für 10 Minuten mit EGF inkubiert (mit 300 ng/ml) (R&D Systems Katalognummer 236-EG). Die Zellen wurden lysiert und das lysierte Präparat wurde auf mit Anti-EGFR-Antikörper beschichtete ELISA-Platten überfragen (mit 1 μg/ml) (R&D Systems, Kat.-Nr. AF231). Das phosphorylierte und nicht-phosphorylierte EGFR in der lysierten Zelllösung wurde gefangen. Nach dem Abwaschen von nicht-gebundenem Material wurde phosphoryliertes EGFR spezifisch erkannt unter Verwendung eines HRP-konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (Verdünnung von 1:2000) (Upstate Biotechnology, Kat.-Nr. 16-105). Die Bindung wurde mit kolometrischem Substrat visualisiert.
  • Methode 14
  • MRC-5/TNF-Test
  • Die Fähigkeit der Testmoleküle, die Bindung von humanem TNF-a an humanes TNFR1 zu verhindern und die IL-8-Sekretion zu neutralisieren, wurde unter Verwendung von humanen Lungenfibroplast-MRC-5-Zellen bestimmt. Eine Verdünnungsserie von Testproben wurde für 1 Stunde mit TNF-a inkubiert (500 pg/ml) (Peprotech). Diese wurde dann Im Verhältnis von 1:2 mit einer Suspension von MRC-5-Zellen verdünnt (ATCC, Kat.-Nr. CCL-171) (5 × 103 Zellen/Well). Nach der Inkubation über Nacht wurden die Proben im Verhältnis von 1:10 verdünnt und die Freisetzung von IL-8 wurde unter Verwendung eines IL-8-ABI-8200-Zellerkennungstests (FMAT) bestimmt, wobei die IL-8-Konzentration mithilfe von Anti-IL-8-(R&D Systems, Kat.-Nr. 208-IL)beschichteten Polystyrolbeads, biotinyliertem Anti-IL-8 (R&D Systems, Kat.-Nr. BAF208) und Streptavidin-Alexafluor 647 (Molecular Probes, Kat.-Nr. S32357) bestimmt wurde. Das Test-Readout war lokalisierte Fluoreszenz-Emission bei 647 nm und unbekannte IL-8-Konzentrationen wurden mithilfe einer im Test eingeschlossenen IL-8-Standardkurve interpoliert.
  • Methode 15
  • MRC-5/IL-1-Test
  • Die Fähigkeit der Testmoleküle, die Bindung von humanem IL-1a an humanes IL1-R zu verhindern und die IL-8-Sekretion zu neutralisieren, wurde unter Verwendung von humanen Lungenfibroplast-MRC-5-Zellen bestimmt. MRC-5-Zellen (ATCC, Kat.-Nr. CCL-171) wurden trypsinisiert und dann für eine Stunde als eine Suspension mit den Testproben inkubiert. Dann wurde IL-1a (200 pg/ml Endkonzentration) (R&D Systems Kat.-Nr.: 200-LA) hinzugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht wurde die IL-8-Freisetzung mithilfe eines ELISA-Kits zur IL-8-Quantifizierung (R&D Systems) mit Anti-IL-8-beschichteten ELISA-Platten, biotinyliertem Anti-IL-8 und Streptavidin-HRP bestimmt. Das Test-Readout war kolometrische Absorption bei 450 nm und unbekannte IL-8-Konzentrationen wurden mithilfe einer im Test eingeschlossenen IL-8-Standardkurve interpoliert.
  • Methode 16
  • Neutralisierungspotenz von E. Coli-exprimiertem, rekombinantem, humanem IL-13 oder IL-4 in einen Vollblut-Phospho-STAT6-Bioassay
  • Vollblutzellen können ex-vivo mit rekombinantem, E. Coli-exprimiertem, humanem IL-4 (rhIL-14) oder IL-13 (rhIL-13) stimuliert werden, um Phospho-STAT6 (pSTAT6) zu exprimieren. Dieser Test wurde für die quantitative Messung von pSTAT6 und folglich die Bestimmung der Neutralisierungspotenz (Inhibition der Bioaktivität von IL-4 oder IL-13) des mAbdAb-Konstrukts entwickelt.
  • Der Test wurde in sterilen 96-Well-Gewebekulturplatten unter sterilen Bedingungen durchgeführt und alle Test-Wells wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. 12 ng/ml von rhIL-13 oder rhIL-4 wurde in serumfreien Zellkulturmedium vorbereitet und 31,2 μl den Wells einer 96-Well-Platte zugegeben. Eine 9-Punkt-Verdünnungskurve des mAbdAb-Konstrukts oder eine Isotyp-Kontrolle wurde mit dem 6-fachen der endgültige Testkonzentration vorbereitet und 31,2 μl jeder Verdünnung wurde entweder rhIL-4 oder rhIL-13 enthaltenden Wells hinzugegeben. Allen Wells wurde 125 μl von heparinisiertem humanem Vollblut hinzugegeben und für 30 Sekunden auf einem Schüttler vermischt. Das endgültige Testvolumen enthielt verschiedene Verdünnungen des mAbdAb-Konstrukts zusammen mit rhIL-13 oder rhIL-4 mit einer Endkonzentration von 2 ng/ml. Die Testplatte wurde bei 37°C, 5% CO2 für 60 Minuten inkubiert.
  • Die Zellen wurden dann durch Zugabe von 62,5 μl von 4× Lysepuffer lysiert. Der Lysepuffer enthielt endgültige Testkonzentrationen von 50 mM Tris-Hydrochlorid, 300 mM Natriumchlorid, 1% NP40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 50 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM EDTA und Proteaseinhibitor-Cocktail. Die Platten wurden dann für 30 Minuten auf Eis gelegt und dann bis zur Testung für pSTAT6 bei –80°C eingefroren.
  • Die Messung von pSTAT6 in den Vollblutproben erfolgte mit einem elektrochemilumineszierenden Immunoassay (Meso-Scale-Discovery, MSD). Mit wenigen Worten, Avidin-beschichtete 96-Well-MSD-Platten wurden mit 150 μl pro Well eines 5% MSD-Blockers A für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler mit 750 U/min geblockt. Die Platte wurde 3 Mal mit 150 μl pro Well des MSD Tris-Waschpuffers gewaschen. 25 μl pro Well des Capture-Antikörpers (biotinylierter Maus-anti-humaner STAT6 monoklonaler Antikörper) wurde hinzugegeben und die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Capture-Antikörper war auf 4 μg/ml in Testpuffer aus 50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 0,2% BSA, 0,5% Tween 20, 1 mM EDTA verdünnt worden. Die Platte wurden 3 Mal mit MSD Tris-Waschpuffer gewaschen und dann mit 150 μl des 5% MSD-Blockers A für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler geblockt. Die Platten wurden wie zuvor angegeben 3 Mal gewaschen, dann wurde 25 μl des Vollblutlysats oder pSTAT6-Kalibrator pro Well hinzugegeben. Die Platten wurden für 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die Platten wurden 3 Mal gewaschen und dann wurden 25 μl von Rabbit-anti-humanem pSTAT6-Antikörper (im Verhältnis von 1:800 in Testpuffer verdünnt) hinzugegeben und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer weiteren Wäsche wurden 25 μl pro Well des MSD TAG Goat-anti-Rabbit-IgG-Antikörpers hinzugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die Platten wurden wiederum gewaschen und dann wurden 150 μl pro Well von 2× MSD-Lesepuffer T hinzugegeben. Die Platten wurden sofort auf einem MSD SECTOR-Imager gelesen.
  • Die Fähigkeit des mAbdAb-Konstrukts zur Neutralisierung der Bioaktivität von rhIL-13 oder rhIL-4 wurde ausgedrückt als die zur Neutralisierung von 2 ng/ml des humanen IL-4 oder humanen IL-13 um 50% (IC50) erforderliche Konzentration des mAbdAb-Konstrukts. Je niedriger die benötigte Konzentration des mAbdAb-Konstrukts, um so stärker die Neutralisierungskapazität.
  • Methode 17
  • Bindung an E. Coli-exprimiertes rekombinantes cynomolgus IL-13 durch ELISA mAbdAb-Moleküle wurden für die Bindung an rekombinantes E. coli-exprimiertes cynomolgus IL-13 in einem Direktbindungs-ELISA beurteilt. Mit wenigen Worten, 5 μ g/ml rekombinantes E. coli-exprimiertes cynomolgus IL-13 (bei GSK hergestellt und gereinigt) wurde auf eine 96-Well-ELISA-Platte aufgebracht. Die Wells wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, mAbdAb-Moleküle wurden dann auf die Platte titriert (in der Regel um 100 nM in Dreifachlösungen bis ca. 0,01 nM). Die Bindung wurde mithilfe einer geeigneten Lösung von anti-humanem, peroxidasekonjugiertem Kappa-Leichtketten-Antikörper (Katalognummer A7164, Sigma-Aldrich) oder einer geeigneten Lösung von anti-humanem, peroxidase-konjugiertem, kettenspezifischem IgG-Detektionsantikörper γKatalognummer A6029, Sigma-Aldrich) erkannt.
  • Methode 18
  • Nicht verwendet
  • Methode 19
  • Inhibition der humanen IL-4-Bindung an humanen IL4-Rezeptor alpha (IL4Rα) durch ELISA
  • Wenn nicht anders angegeben wurden alle Reagenzien unmittelbar vor dem Gebrauch auf die erforderliche Konzentration in Blocklösung verdünnt (4% Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,05% Tween20). Eine ELISA-Platte wurde über Nacht bei 4°C mit 5 μg/ml rekombinantem humanem IL4Rα-Fc chimaera (R&D Systems, Kat.- Nr. 604-4R) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung beschichtet. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platte wurde für 2 Stunden in Blocklösung geblockt und dann wurden 50 μl verschiedener Konzentrationen von mAbdAb (oder der positiven Kontrolle mAbs oder dAbs) hinzugegeben, die mit 0,02 μg/ml von rekombinantem humanem IL-4 vorvermischt waren (bei GSK hergestellt). Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert und dann 4 Mal in Waschpuffer gewaschen (Tris-gepufferte Kochsalzlösung und 0,05% Tween20). Jeder Well wurden 50 μl einer 0,5-μg/ml-Lösung von biotinyliertem anti-humanem IL-4 (R&D Systems, Kat.-Nr. BAF 204) hinzugegeben und dann für 1 Stunde inkubiert. Die Platte wurde 4 Mal in Waschpuffer gewaschen und dann wurden 50 μl/Well einer 1/2000-Verdünnung von Extravadin (Sigma, Kat.- Nr. E2886) hinzugegeben. Nach 1 Stunde wurde die Platte 4 Mal gewaschen und ein kolormetrisches Signal wurde durch Inkubation mit OPD Peroxidasesubstrat (von Sigma) erkannt, die Reaktion wurde mit der Stopp-Lösung (3M H2SO4-Säure) gestoppt und die Absorptionsdaten wurden durch Lesen auf einem Plattenleser bei 490 nm erhalten. Mittlere Absorption und Standardfehler wurden in GraphPad Prism geplottet und IC50-Werte wurden mit dem Cambridge Soft BioAssay errechnet.
  • Methode 20
  • Neutralisierung von E. Coli-exprimiertem rekombinantem cynomolgus IL-13 in einem TF-1-Zellproliferations-Bioassay
  • TF-1 Zellen proliferieren als Antwort auf eine Reihe von verschiedenen Zytokinen, darunter Cynomolgus IL-13. Die proliferative Antwort dieser Zellen auf IL-13 kann daher als Maß für die Bioaktivität von IL-13 dienen, und in der Folge wurde ein Assay zur Bestimmung der IL-13-Neutralisationskraft (Hemmung der Bioaktivität von IL-13) von mAbdAb-Konstrukten entwickelt.
  • Der Assay wurde in sterilen Gewebekulturschalen mit 96 Mulden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wobei alle Testmulden dreifach getestet wurden. Ungefähr 14ng/ml rekombinantes in E. coli-exprimiertes Cynomolgus IL-13 wurden mit mAbdAb-Konstrukten in unterschiedlicher Verdünnung (normalerweise von 1000 nM oder 200 nM in 3-facher Verdünnung titriert auf 1 nM oder 0,02 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl 1 Stunde lang bei 37°C vorinkubiert. Diese Proben wurden dann 50 μl TF-1 Zellen (in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml) in einer sterilen 96-Mulden-Gewebekulturschale zugegeben. Somit enthielt das endgültige Assayvolumen von 100 μl verschiedene Verdünnungen von mAbdAb-Konstrukten (in einer Endkonzentration von 500 nM oder 100 nM in 3-facher Verdünnung titriert auf 0,5 nM oder 0,01 nM), rekombinantes, in E. coli-exprimiertes Cynomolgus IL-13 (in einer Endkonzentration von 7 ng/ml) und TF-1 Zellen (in einer Endkonzentration von 1 × 105 Zellen pro ml). Die Assay-Schale wurde bei 37°C ungefähr 3 Tage lang in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Die Zellproliferation wurde dann mit dem 'CellTitre 96® Nichtradioaktiven Zellproliferations-Assay' von Promega (Katalognummer G4100) nach der Anleitung des Herstellers ermittelt. Die Extinktion der Proben in der 96-Mulden-Schale wurde in einem Plattenleser bei einem Wert von 570 nm gelesen.
  • Die Fähigkeit der mAbdAb-Konstrukte zur Neutralisation der Bioaktivität von rekombinantem in E. coli-exprimierten Cynomolgus IL-13 wurde als die Konzentration des mAbdAb-Konstrukts ausgedrückt, die zur Neutralisation der Bioaktivität einer definierten Menge von Cynomolgus IL-13 (7 ng/ml) um 50% (= ND50) erforderlich ist. Je geringer die erforderliche Konzentration des mAbdAb-Konstrukts, desto stärker ist dessen Neutralisationsfähigkeit. Die hier angegebenen ND50-Daten wurden entweder manuell oder mit dem in Microsoft Excel enthaltenen Softwarepaket Robosage berechnet.
  • Verfahren 21
  • Neutralisation von in E. coli-exprimiertem rekombinantem Cynomolgus IL-4 in einem TF-1 Zellproliferations-Bioassay
  • TF-1 Zellen proliferieren als Antwort auf eine Reihe von verschiedenen Zytokinen, darunter Cynomolgus IL-4. Die proliferative Antwort dieser Zellen auf IL-4 kann daher als Maß für die Bioaktivität von IL-4 dienen, und in der Folge wurde ein Assay zur Bestimmung der IL-4-Neutralisationskraft (Hemmung der Bioaktivität von IL-4) von mAbdAb-Konstrukten entwickelt.
  • Der Assay wurde in sterilen Gewebekulturschalen mit 96 Mulden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wobei alle Testmulden dreifach getestet wurden. Ungefähr 2,2 ng/ml rekombinantes in E. coli-exprimiertes Cynomolgus IL-4 wurden mit mAbdAb-Konstrukten in unterschiedlicher Verdünnung (normalerweise von 200 nM in 3-facher Verdünnung titriert auf 0,02 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl 1 Stunde lang bei 37°C vorinkubiert. Diese Proben wurden dann 50 μl TF-1 Zellen (in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml) in einer sterilen 96-Mulden-Gewebekulturschale zugegeben. Somit enthielt das endgültige Assayvolumen von 100 μl verschiedene Verdünnungen von mAbdAb-Konstrukten (in einer Endkonzentration von 100 nM in 3-facher Verdünnung titriert auf 0,01 nM), rekombinantes, in E. coli-exprimiertes Cynomolgus IL-13 (in einer Endkonzentration von 1,1 ng/ml) und TF-1 Zellen (in einer Endkonzentration von 1 × 105 Zellen pro ml). Die Assay-Schale wurde bei 37°C ungefähr 3 Tage lang in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Der Umfang der Zellproliferation wurde dann mit dem 'CellTitre 96® Nichtradioaktiven Zellproliferations-Assay' von Promega (Katalognummer G4100) nach der Anleitung des Herstellers ermittelt. Die Extinktion der Proben in der 96-Mulden-Schale wurde in einem Plattenleser bei einem Wert von 570 nm gelesen.
  • Die Fähigkeit der mAbdAb-Konstrukte zur Neutralisation der Bioaktivität von rekombinantem in E. coli-exprimierten Cynomolgus IL-4 wurde als die Konzentration des mAbdAb-Konstrukts ausgedrückt, die zur Neutralisation der. Bioaktivität der definierten Menge von Cynomolgus IL-4 (1,1 ng/ml) um 50% (= ND50) erforderlich ist. Je geringer die erforderliche Konzentration des mAbdAb-Konstrukts, desto stärker ist dessen Neutralisationsfähigkeit. Die hier angegebenen ND50-Daten wurden entweder manuell oder mit dem in Microsoft Excel enthaltenen Softwarepaket Robosage berechnet.
  • Verfahren 22
  • Hemmung der Bindung von humanem IL-13 an den Human IL13-Rezeptor
  • Alpha 2 (IL13Rα2) durch ELISA
  • Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Reagenzien in Blocklösung (1% Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,05% Tween20) unmittelbar vor dem Gebrauch auf die erforderliche Konzentration verdünnt. Eine ELISA-Schale wurde über Nacht bei 4°C mit 5 μg/ml rekombinanter humaner III 3Rα2/Fc-ChimaTe exprimiert in Sf21 Zellen (R&D Systems, Kat. Nr. 614-IR) in einer Beschichtungspufferlösung (0,05 M Bicarbonat pH 9,6, Sigma C-3041) beschichtet. Die Schale wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Blocklösung (1% BSA in TEST) blockiert, bevor verschiedene Konzentrationen von mit 30 ng/ml rekombinantem humanem IL-13 (Hersteller: GSK) vorinkubiertem mAbdAb (oder die positiven Kontrollen mAbs oder dAbs) 30 Minuten lang bei 37°C zugegeben wurden. Die Schalen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie dreimal in Waschpuffer (Tris-gepufferte Kochsalzlösung und 0,05% Tween20) gewaschen wurden. 50 μl einer 0,5 μg/ml Lösung von biotinyliertem antihumanem IL-13 (R&D Systems, Kat. Nr. BAF 213) wurden in jede der Mulden gegeben und danach für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schale wurde dreimal mit Waschpuffer gewaschen, bevor Extravadin (Sigma, Kat. Nr. E2886) in geeigneter Verdünnung zugegeben wurde. Nach einer Stunde wurde die Schale gewaschen, und durch Inkubieren mit OPD Peroxidasesubstrat (von Sigma) ein kolometrisches Signal erkannt, die Reaktion mit einer Stopplösung (3M Säure) gestoppt und die Extinktion durch Ablesen vom Plattenleser bei 490 nm erhalten. Die mittlere Extinktion und der Standardfehler wurden in ein Excel-Arbeitsblatt übertragen und die IC50-Werte mit der Robosage-Software von Microsoft Excel berechnet.
  • Verfahren 23
  • BiacoreTM-Bindungsaffinitätsbewertung für die Bindung an in E. coli-exprimiertes rekombinantes Cynomolgus IL-13
  • Die Bindungsaffinität von mAbdAb-(oder mAb)-Molekülen für rekombinantes in E. coli-exprimiertes Cynomolgus IL-13 wurde durch eine BiacoreTM-Analyse bewertet. Die Analysen wurden mit Einfang von Protein A oder antihumanem IgG durchgeführt. Kurz beschrieben wurde Protein A oder antihumaner IgG durch primäre Aminkopplung nach Herstelleranleitung auf einen CM5-Chip gekoppelt. mAbdAb- (oder mAb-)Moleküle wurden dann auf dieser Oberfläche eingefangen und Cynomolgus IL-13 (hergestellt und gereinigt von GSK) in bestimmten Konzentrationen darüber passiert. Die Oberfläche wurde durch milde Säureelution zur Protein A-Oberfläche regeneriert, was deren Fähigkeit zum Einfangen von Antikörpern für ein nachfolgendes IL-13-Bindungsereignis nicht wesentlich veränderte. Die Arbeit wurde auf einem BIAcoreTM 3000 und/oder dem T100 durchgeführt, die Daten wurden mit Auswertungssoftware in den Geräten analysiert und an das 1:1-Bindungsmodell angepasst. BIAcoreTM-Läufe wurden bei 25°C oder 37°C durchgeführt.
  • Verfahren 24
  • BiacoreTM-Bindungsaffinitätsbewertung für die Bindung an in E. coli-exprimiertes rekombinantes Cynomolgus IL-4
  • Die Bindungsaffinität von mAbdAb- (oder mAb)-Molekülen für rekombinantes in E. coli-exprimiertes Cynomolgus IL-4 wurde durch eine BiacoreTM-Analyse bewertet. Die Analysen wurden mit Einfang von Protein A oder Anti-human IgG durchgeführt. Kurz beschrieben wurde Protein A oder antihumaner IgG durch primäre Aminkopplung nach Herstelleranleitung auf einen CM5-Chip gekoppelt. mAbdAb- (oder mAb-)Moleküle wurden dann auf dieser Oberfläche eingefangen und Cynomolgus IL-4 (hergestellt und gereinigt von GSK) in bestimmten Konzentrationen darüber passiert. Die Oberfläche wurde durch milde Säureelution (wie 100 mM Phosphorsäure) zur Protein A-Oberfläche regeneriert, was deren Fähigkeit zum Einfangen von Antikörpern für ein nachfolgendes IL-4-Bindungsereignis nicht wesentlich veränderte. Die Antihuman-IgG-Oberfläche wurde entweder unter den gleichen Bedingungen wie die Protein A-Oberfläche oder mit 3M MgCl2 regeneriert. Die Arbeit wurde auf einem BIAcoreTM 3000 und/oder dem T100 und/oder dem A100 durchgeführt, die Daten wurden mit Auswertungssoftware in den Geräten analysiert und an das 1:1-Bindungsmodell angepasst. BIAcoreTM-Läufe wurden bei 25°C oder 37°C durchgeführt.
  • Verfahren 25
  • IL-13-zellbasierter Neutralisationsassay
  • Die Stärke von mAbdAbs mit Spezifität für IL13 wurde in einem IL-13 Zellassay mit der gentechnisch erzeugten Reporterzelllinie HEK Blue-STAT6 ermittelt. Der Transkriptionsfaktor STAT6 wird in erster Linie durch zwei Zytokine mit überlappender biologischer Funktion, IL-4 und IL-13, die an einen Rezeptorkomplex aus IL-4Ralpha und IL-13Ralpha1 binden, aktiviert. Bei Ligandenbindung aktiviert der Rezeptorkomplex die rezeptorassoziierten Januskinasen (JAK1 und Tyk2), was zur Rekrutierung von STAT6 und dessen Phosphorylierung führt. Aktiviertes STAT6 bildet ein Homodimer, das in den Nukleus transloziert und die Transkription von Genen unter der Kontrolle des reagierenden Promotors induziert. Die Linie HEK Blue-STAT6 wird gentechnisch zur Expression von SEAP (Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase) unter der Kontrolle eines solchen Promotors erzeugt. Die Zellen wurden in 96-Mulden-Platten gegeben und 20-24 Stunden lang mit voräquilibriertem humanem IL-13 und Testmolekülen inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum wurde die von den Zellen als Ergebnis der IL-13-Stimulierung produzierte SEAP-Menge mit dem Quanti-Blue-System (Invivogen) gemessen.
  • Beispiel 1
  • 1. Erzeugung von dual targetierenden mAbdAbs
  • Die in den Tabellen 1-4 dargestellten dual targetierenden mAbdAbs wurden auf die folgende Weise konstruiert. Expressionsprodukte werden durch Transplantieren einer einen Domänenantikörper kodierenden Sequenz auf eine eine Schwerkette oder Leichtkette (oder beide) kodierende Sequenz erzeugt, so dass sich der dAb bei Expression am C-Terminal der Schwer- oder Leichtkette befindet. Bei manchen Konstrukten werden die Domänenantikörper mit Linker-Sequenzen an schwerkettiges CH3 oder leichtkettiges CK angefügt. Bei anderen Konstrukten wird der Domänenantikörper ohne Linker-Sequenz direkt an die Schwer- oder Leichtkette angefügt. Eine allgemeine schematische Darstellung dieser mAbdAb-Konstrukte zeigt 8 (die mAb-Schwerkette ist grau dargestellt; die mAb-Leichtkette weiß, der dAb ist schwarz dargestellt).
  • Ein Beispiel für den mAbdAb-Typ 1 nach 8 wäre PascoH-G4S-474. Ein Beispiel für den mAbdAb-Typ 2 nach 8 wäre PascoL-G4S-474. Ein Beispiel für den mAbdAb-Typ 3 nach 8 wäre PascoHL-G4S-474. Die mAbdAb-Typen 1 und 2 sind tetravalente Konstrukte, der mAbdAb-Typ 3 ist ein hexavalentes Konstrukt.
  • Eine schematische Darstellung des Aufbaus einer mAbdAb-Schwerkette (Darstellung oben) bzw. einer mAbdAb-Leichtkette (Darstellung unten) ist im Folgenden abgebildet. Wenn nicht anders angegeben, wurden für die Konstruktion der in den Tabellen 1-4 beschriebenen mAbdAbs diese Restriktionsstellen verwendet.
  • Figure 00800001
  • Für die Schwerkette ist die Bezeichnung 'VH' der variable Schwerkettenbereich des monoklonalen Antikörpers; 'CH1, CH2 und CH3' sind Sequenzen des konstanten Schwerkettenbereichs des humanen IgG1; 'linker' ist die Sequenz des verwendeten speziellen Linker-Bereichs; 'dAb' ist die Sequenz des Domänenantikörpers. Für die Leichtkette ist die Bezeichnung 'VL' der variable Leichtkettenbereich des monoklonalen Antikörpers; 'CK' ist die Sequenz des konstanten Leichtkettenbereichs des humanen IgG1; 'linker' ist die Sequenz des verwendeten speziellen Linker-Bereichs; 'dAb' ist die Sequenz des Domänenantikörpers.
  • Manche DNA-Expressionskonstrukte wurden de novo durch Oligoaufbau erzeugt. Andere DNA-Expressionskonstrukte wurden aus vorhandenen (nach der Beschreibung weiter oben hergestellten) Konstrukten durch Cloning mit Restriktionsenzymen oder ortsgerichtete Mutagenese abgeleitet.
  • Diese Konstrukte (mAbdAb-Schwer- oder Leichtketten) wurden mit molekularbiologischen Standardtechniken zu Säugerexpressionsvektoren (Vektorserie RIn, RId oder pTT) kloniert. Hierzu wurde eine Säugeraminosäuresignalsequenz (wie in SEQ-ID-NR.: 64) verwendet.
  • Zur Expression von mAbdAbs, bei denen der dAb an das C-terminale Ende der Schwerkette des monoklonalen Antikörpers angefügt wird, wurde der entsprechende Schwerketten-mAbdAb-Expressionsvektor mit dem entsprechenden Leichtketten-Expressionvektor für diesen monoklonalen Antikörper gepaart. Zur Expression von mAbdAbs, bei denen der dAb an das C-terminale Ende der Leichtkette des monoklonalen Antikörpers angefügt wird, wurde der entsprechende Leichtketten-mAbdAb-Expressionsvektor mit dem entsprechenden Schwerketten-Expressionvektor für diesen monoklonalen Antikörper gepaart.
  • Zur Expression von mAbdAbs, bei denen der dAb an das C-terminale Ende der Schwerkette des monoklonalen Antikörpers und der dAb an das C-terminale Ende der Leichtkette des monoklonalen Antikörpers angefügt wird, wurde der entsprechende Schwerketten-mAbdAb-Expressionsvektor mit dem entsprechenden Leichtketten-mAbdAb-Expressionsvektor gepaart.
  • 1.1 Nomenklatur und verwendete Abkürzungen
    • Monoklonaler Antikörper (mAb)
    • Monoklonale Antikörper (mAbs)
    • Domänenantikörper (dAb)
    • Domänenantikörper (dAbs)
    • Schwerkette (H-Kette)
    • Leichtkette (L-Kette)
    • Variabler Bereich der Schwerkette (VH)
    • Variabler Bereich der Leichtkette (VL)
    • Humaner IgG1: konstanter Schwerkettenbereich 1 (CH1)
    • Humaner IgG1: konstanter Schwerkettenbereich 2 (CH2)
    • Humaner IgG1: konstanter Schwerkettenbereich 3 (CH3)
    • Humaner Kappa: konstanter Leichtkettenbereich (CK)
  • 1.2 Anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs
  • Bispezifische Anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs wurden nach der genannten Beschreibung konstruiert. Es wurde eine Reihe von verschiedenen Linkern verwendet, um die Anti-IL4-Domänenantikörper an den monoklonalen Antikörper anzufügen. Manche Konstrukte hatten keinen Linker.
  • Mit einem BamHI-Klonierungsort (der für die Aminosäurereste G und S kodiert) wurden die Linker und dAbs entweder an CH3 der mAb-Schwerkette oder an CK der mAb-Leichtkette kloniert. Somit sind zusätzlich zur gegebenen Linker-Sequenz sowohl bei Schwerketten- als auch bei Leichtkettenexpressionkonstrukten zusätzliche G- und S-Aminosäurereste zwischen der Linkersequenz und dem Domänenantikörper bzw. zwischen CH3 und der Linker-Sequenz in manchen, aber nicht allen Schwerkettenexpressionskonstrukten vorhanden. Wenn jedoch der G4S-Linker im Format mAbdAb zwischen dem mAb und dem dAb angeordnet wurde, war der BamHI-Klonierungsort (wegen der der G4S-Linkersequenz inhärenten G- und S-Aminosäurereste) bereits vorhanden und waren in den Konstrukten, die diesen Linker verwendeten, somit keine G- und S-Aminosäurereste zwischen CH3 oder CK und dem Domänenantikörper präsent. Wenn im Format mAbdAb zwischen dem mAb und dem dAb keine Linker-Sequenz verwendet wurde, war der BamHI-Klonierungsort (und damit die G- und S-Aminosäurereste) noch immer zwischen CH3 oder CK und dem Domänenantikörper präsent. Vollständige Details zu den Aminosäuresequenzen der Schwer- und Leichtketten von mAbdAb sind in Tabelle 1 angegeben.
  • In mehreren der folgenden Beispiele wird ein IL-4 mAb als Kontrollantikörper verwendet. Der in diesen Beispielen verwendete IL-4-Kontrollantikörper ist entweder der Antikörper mit der Schwerkettensequenz der SEQ-D-NR.: 14 und der Leichtkettensequenz der SEQ-ID-NR.: 15 oder der Antikörper mit der Schwerkettensequenz der SEQ-ID-NR.: 166 und der Leichtkettensequenz der SEQ-ID-NR: 15. Beide dieser IL-4 mAbs haben die gleichen CDR-Bindungsstellen und sollten daher auf die gleiche Weise binden, weshalb beide dieser Antikörper in den folgenden Beispielen als 'Pascolizumab' oder '1L-4 mAb' bezeichnet werden.
  • In mehreren der folgenden Beispiele wird ein IL-5 mAb als Kontrollantikörper verwendet. Der in diesen Beispielen verwendete IL-5-Kontrollantikörper ist entweder der Antikörper mit der Schwerkettensequenz der SEQ-ID-NR.: 65 und der Leichtkettensequenz der SEQ ID NR: 66 oder der Antikörper mit der Schwerkettensequenz der SEQ-ID-NR: 191 und der Leichtkettensequenz der SEQ-ID-NR: 66. Beide dieser IL-5 mAbs haben die gleichen CDR-Bindungsstellen und sollten daher auf die gleiche Weise binden, weshalb beide dieser Antikörper in den folgenden Beispielen als 'Mepolizumab' oder 'IL-5 mAb' bezeichnet werden.
  • Die in Tabelle 1 dargestellten mAbdAbs wurden transient in CHOK1-Zellüberständen exprimiert. Nach der mAbdAb-Quantifizierung wurden diese mAbdAb-haltigen Überstände in IL-13 und IL-4 bindenden ELISAs auf Aktivität analysiert. Tabelle 1
    Figure 00830001
    Figure 00840001
    Figure 00850001
    Figure 00860001
  • Die in Tabelle 2 dargestellten mAbdAbs wurden in einem oder in beiden Zellüberständen CHOK1 oder CHOE1a exprimiert, gereinigt und in einer Reihe von IL-13 und IL-4 Aktivitäts-Assays analysiert.
  • Tabelle 2
    Figure 00860002
  • 1.3 Anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs
  • Bispezifische Anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs wurden, nach der genannten Beschreibung konstruiert. Es wurde eine Reihe von verschiedenen Linkern verwendet, um die Anti-IL13-Domänenantikörper an den monoklonalen Antikörper anzufügen. Manche Konstrukte hatten keinen Linker.
  • Mit einem BamHI-Klonierungsort (der für die Aminosäurereste G und S kodiert) wurden die Linker und dAbs entweder an CH3 der mAb-Schwerkette oder an CK der mAb-Leichtkette kloniert. Somit sind zusätzlich zur gegebenen Linker-Sequenz sowohl bei Schwerketten- als auch bei Leichtkettenexpressionkonstrukten zusätzliche G- und S-Aminosäurereste zwischen der Linkersequenz und dem Domänenantikörper bzw. zwischen CH3 und der Linker-Sequenz in manchen, aber nicht allen Schwerkettenexpressionskonstrukten vorhanden. Wenn jedoch der G4S-Linker im Format mAbdAb zwischen dem mAb und dem dAb angeordnet wurde, war der BamHI-Klonierungsort (wegen der der G4S-Linkersequenz inhärenten G- und S-Aminosäurereste) bereits vorhanden und waren in den Konstrukten, die diesen Linker verwendeten, somit keine G- und S-Aminosäurereste zwischen CH3 oder CK und dem Domänenantikörper präsent. Wenn im Format mAbdAb zwischen dem mAb und dem dAb keine Linker-Sequenz verwendet wurde, war der BamHI-Klonierungsort (und damit die G- und S-Aminosäurereste) noch immer zwischen CH3 oder CK und dem Domänenantikörper präsent. Vollständige Details zu den Aminosäuresequenzen der Schwer- und Leichtketten von mAbdAb sind in Tabelle 3 angegeben.
  • Die in Tabelle 3 dargestellten mAbdAbs wurden transient in CHOK1-Zellüberständen exprimiert. Nach der mAbdAb-Quantifizierung wurden diese mAbdAb-haltigen Überstände in IL-13 und IL-4 bindenden ELISAs auf Aktivität analysiert.
  • Tabelle 3
    Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Die in Tabelle 4 dargestellten mAbdAbs wurden in einer oder mehreren CHOK1, CHOE1a oder HEK293-6E-Zellen exprimiert.
  • Tabelle 4
    Figure 00880002
  • Figure 00890001
  • 1.4 Sequenz-ID-Nummern für monoklonale Antikörper, Domänenantikörper und Linker
  • Die Sequenz-ID-Nummern für die zur Generierung von mAbdAbs verwendeten monoklonalen Antikörper (mAb), Domänenantikörper (dAb) und Linker sind in Tabelle 5 aufgeführt.
  • Tabelle 5
    Figure 00890002
  • Reife Aminosäuresequenz von humanem IL-13 (ohne Signalsequenz) ist angegeben in SEQ ID-NR.: 63.
  • Reife Aminosäuresequenz von humanem IL-4 (ohne Signalsequenz) ist angegeben in SEQ ID-NR.: 62.
  • 1.5 Expression und Reinigung von mAbdAbs
  • Die in Beispiel 1 beschriebenen mAbdAb-Expressionskonstrukte wurden in eine oder mehrere CHOK1-, CHOE1a- oder HEK293-6E-Zellen transfiziert, in kleinem (ca. 3 ml), mittleren (ca. 50 ml bis 100 ml) oder großen (ca. 1 Liter) Umfang exprimiert, wonach einige der Konstrukte mit immobilisierten Protein A-Säulen gereinigt und durch Ablesen der Extinktion bei 280 nm quantifiziert wurden.
  • 1.6 Ausschlusschromatographische Analysen von gereinigten mAbdAbs
  • Eine Anzahl von mAbdAbs wurden durch Ausschlusschromatographie (SEC) und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS PAGE) analysiert. Repräsentative Daten für einige dieser Moleküle (PascoH-G4S-474, PascoL-G4S-474, PascoH-474 und PascoHL-G4S-474.) sind in den 9, 10, 11 bzw. 12 dargestellt. Repräsentative Daten aus der SEC- und SDS Page-Analyse für diese Moleküle mit dem entfernten 'GS'-Motiv sind in den 90-98 dargestellt.
  • In manchen Fällen wurde SEC zur weiteren Reinigung dieser Moleküle zur Entfernung von Aggregaten eingesetzt.
  • Beispiel 2
  • Binden von mAbdAbs an humanes IL-13 und humanes IL-4 durch ELISA
  • 2.1 Binden von Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs an IL-13 und IL-4
  • mAbdAb-Überstände wurden auf ihr Binden an humanes IL-13 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 1 beschrieben) getestet. Die Daten sind in 13 dargestellt.
  • 13 zeigt, dass alle diese Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs IL-13 gebunden haben. Die Bindungsaktivität dieser mAbdAbs war auch ungefähr gleichwertig (innerhalb 2-fach bis 3-fach) mit gereinigtem antihumanem IL13 mAb allein, der als positive Kontrolle für die IL-13-Bindung und zum direkten Vergleich mit dem mAbdAbs in diesen Assay eingeschlossen wurde. Gereinigter antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) wurde als negative Kontrolle für die IL-13 Bindung einbezogen.
  • Diese Moleküle wurden auf ihr Binden an humanes IL-4 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 2 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 14 dargestellt.
  • 14 zeigt, dass all diese Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs an IL-4 banden, doch wurde eine gewisse Schwankung in der IL-4-Bindungsaktivität beobachtet. Es wurde keine Bindung an IL-4 beobachtet, wenn kein Anti-IL4 dAb im mAbdAb-Konstrukt präsent war. Gereinigter antihumaner IL13 mAb wurde ebenfalls als negative Kontrolle für die Bindung an IL-4 einbezogen. Hingegen wurden die Anti-IL-4 dAbs allein in diesem Assay nicht getestet, weil die dAbs vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt werden; stattdessen wurde gereinigter antihumaner IL4 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Gereinigte Proben von mAbdAbs wurden auch auf ihr Binden an humanes IL-13 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 1 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 15 dargestellt.
  • Diese gereinigten Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs banden IL-13. Die Bindungsaktivität dieser mAbdAbs für IL-13 war gleichwertig mit der von gereinigtem antihumanem IL-13 allein. Ein isotyp-angepasster mAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurde auch als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 in diesen Assay einbezogen.
  • Diese gereinigten mAbdAbs wurden auch auf ihr Binden an humanes IL-4 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 2 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 16 dargestellt.
  • Diese gereinigten Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs banden IL-4. Hingegen wurden die Anti-IL-4 dAbs allein in diesem Assay nicht getestet, weil die dAbs vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt werden; stattdessen wurde gereinigter antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet. Ein isotyp-angepasster mAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurde auch als negative Kontrolle für die Bindung an IL-4 in diesen Assay einbezogen.
  • 2.2 Binden von Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs an IL-13 und IL-4
  • mAbdAb-Überstände wurden auf ihr Binden an humanes IL-4 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 2 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 17 dargestellt (manche Proben wurden doppelt zubereitet und getestet, was als Probe 1 und Probe 2 verzeichnet wurde).
  • 17 zeigt, dass alle diese mAbdAbs IL-4 gebunden haben. Gereinigter antihumaner IL4 mAb allein (Pascolizumab) wurde in diesen Assay einbezogen, erzeugte aber keine Bindungskurve, weil beim Verdünnen dieses mAb für den Einsatz im Assay ein Fehler gemacht wurde (Pascolizumab wurde erfolgreich in allen anderen nachfolgenden IL-4 Bindungs-ELISAs angewendet). Gereinigter antihumaner IL13 mAb wurde als negative Kontrolle für die IL-4-Bindung einbezogen.
  • Die gleichen mAbdAbs-Überstände wurden auch auf ihr Binden an humanes IL-13 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 1 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 18 dargestellt (manche Proben wurden doppelt zubereitet und getestet, was als Probe 1 und Probe 2 verzeichnet wurde).
  • 18 zeigt, dass alle diese Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs IL-13 gebunden haben. Gereinigter antihumaner IL13 mAb allein wurde in diesen Assay einbezogen, erzeugte aber keine Bindungskurve, weil beim Verdünnen dieses mAb für den Einsatz im Assay ein Fehler gemacht wurde (gereinigter antihumaner IL-13 mAb wurde erfolgreich in allen anderen nachfolgenden IL-13 Bindungs-ELISAs angewendet). Gereinigter Anti-IL4 mAb (Pascolizumab) wurde ebenfalls als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 einbezogen. Der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) wurde in diesem Assay nicht getestet, weil dieser dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird.
  • Diese gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs 'PascoH-G4S-474', 'PascoH-474', 'PascoL-G4S-474' und 'PascoHL-G4S-474' wurden auch auf ihr Binden an humanes IL-4 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 2 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 19 dargestellt.
  • Diese gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs banden IL-4. Die Bindungsaktivität dieser mAbdAbs war etwa gleichwertig (innerhalb des 2-fachen) mit der von gereinigtem Anti-IL4 mAb allein. Ein isotyp-angepasster mAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurde auch als negative Kontrolle für die Bindung an IL-4 in diesen Assay einbezogen.
  • Diese gleichen gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 wurden auch auf ihr Binden an humanes IL-13 in einem Direktbindungs-ELISA (wie in Verfahren 1 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 20A dargestellt.
  • Diese gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs banden IL-13. Ein isotyp-angepasster mAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurde auch als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 in diesen Assay einbezogen. Der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) wurde in diesem Assay nicht getestet, weil dieser dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde der antihumane IL13 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Gereinigte PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 und PascoH-ELQLE-474 wurden in einem Direktbindungs-ELISA wie in Verfahren 17 beschrieben auch auf Bindung an Cynomolgus IL-13 getestet (PascoH-474 mit entfernten GS und PascoH-TVAAPS-474 mit entferntem GS wurden auch in diesen Assay einbezogen, der Aufbau dieser Moleküle ist in Beispiel 18 beschrieben). Eine Grafik mit repräsentativen Daten ist in 206 dargestellt.
  • Gereinigte PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 und PascoH-ELQLE-474 banden alle Cynomolgus IL-13. Gereinigter antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) allein wurde ebenfalls als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 einbezogen. Gereinigter antihumaner IL13 mAb wurde als negative Kontrolle für die Cynomolgus IL-13-Bindung einbezogen. Der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) wurde in diesem Assay nicht getestet, weil dieser dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde der antihumane 1113 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Beispiel 3
  • Binden von mAbdAbs an humanes IL-13 und humanes IL-4 durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz (BIAcoreTM)
  • 3.1 Binden von Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs an IL-13 und IL-4 durch BIAcoreTM
  • mAbdAbs (in CHO-Zellüberständen, zubereitet nach der Beschreibung in Abschnitt 1.5) wurden auf Bindung an humanes IL-13 mit BIAcoreTM bei 25°C (wie in Verfahren 4 beschrieben) getestet. Für diesen Datensatz wurden zwei IL-13-Konzentrationskurven (100 nM und 1 nM) beurteilt und für die einzelnen mAbdAb-Konstrukte Einfangniveaus zwischen 1000 und (ungefähr) 1300 (mit relativem Korrekturfaktor) erreicht. Wegen der begrenzten Anzahl an verwendeten IL-13-Konzentrationen eignen sich die generierten Daten eher für eine Rangordnung von Konstrukten als als genaue kinetische Messungen. Diese Daten sind in Tabelle 6 dargestellt.
  • Tabelle 6
    Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Alle diese Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs banden IL-13 mit gleichen Bindungsaffinitäten, die etwa mit der Bindungsaffinität von gereinigtem antihumanem IL13 mAb allein vergleichbar waren. Diese Daten legten nahe, dass sich die Zugabe von Linkern und/oder Anti-IL4 dAbs zur Schwerkette des Anti-IL13 mAb nicht auf die IL-13-Bindungsaffinität der mAb-Komponente innerhalb dieser mAbdAb-Konstrukte ausgewirkt hat.
  • Diese mAbdAbs wurden auf ihr Binden an humanes IL-4 in einem Direktbindungs-ELISA bei 25°C (wie in Verfahren 5 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 7 dargestellt. Für diesen Datensatz wurden vier IL-4-Konzentrationskurven (512, 128, 32 and 8 nM) beurteilt; die ungefähren Einfangniveaus für die einzelnen getesteten mAbdAbs (mit relativem Korrekturfaktor) sind in der Tabelle angegeben. Die Anti-IL-4 dAbs allein wurden allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil die dAbs auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen werden; stattdessen wurde antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Tabelle 7
    Figure 00940002
  • Figure 00950001
  • Bei den angegebenen Datensätzen wurden Vorbehalte beobachtet. Bei manchen Datensätzen (*) wurden schlechte Kurvenanpassungen beobachtet, daher sollten die für diese Daten bestimmten tatsächlichen Bindungsaffinitätswerte mit Vorsicht behandelt werden. Bei manchen Kurven (**) wurde positiver Dissoziation beobachtet, daher sollten die für diese Daten bestimmten tatsächlichen Bindungsaffinitätswerte mit Vorsicht behandelt werden. Außerdem war BIAcoreTM nicht in der Lage (d. h. nicht empfindlich genug), die On- und Off-Raten für alle den DOM9-112-210 dAb enthaltenden mAbdAb-Konstrukte zu bestimmen, weil diese mAbdAbs besonders eng an den IL-4 binden. Die Bestimmung der Bindungskinetik für diese mAbdAbs für IL-4 wurde weiter durch beobachtete positive Dissoziationswirkungen beeinträchtigt. Diese Daten sind in 21 dargestellt.
  • Ähnliche Daten wurden in einem zusätzlichen Experiment erhalten. Diese Daten sind in 22 dargestellt.
  • Die beiden unabhängigen Datensätze geben an, dass alle Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs IL-4 banden, die Bindungsaffinitäten jedoch abhängig vom verwendeten Linker für das Anfügen des Anti-IL4 dAb an die Schwerkette des Anti-IL13 mAb schwankten. In diesem Experiment wirkte sich die Präsenz eines Linkers fördernd auf die Bindungsaffinität für IL-4 an die Anti-IL4-dAb-Komponente im mAbdAb-Format aus (bei Platzierung auf der Schwerkette). Zum Beispiel scheinen die Moleküle mit den Linkern TVAAPS oder ELQLEESCAEAQDGELDG stärkere Binder zu sein. Es wurde keine Bindung an IL-4 beobachtet, wenn kein Anti-IL4 dAb im mAbdAb-Konstrukt präsent war. Es war nicht möglich, die Bindungsaffinität des 586-Linker-210 mAbdAbs für IL-4 zu messen, weil die Komponente DOM9-112-210 dieser mAbdAbs sehr eng bindet und daher die Off-Rate für eine Bestimmung mit BIAcoreTM zu klein ist.
  • Gereinigte Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs wurden auch auf ihre Bindung an humanes IL-13 und humanes IL-4 mit BIAcoreTM bei 25°C (wie in Verfahren 4 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 8 dargestellt.
  • Tabelle 8
    Figure 00960001
  • 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 und 586H-TVAAPS-210 banden alle IL-13 mit gleichen Bindungsaffinitäten, die etwa mit der Bindungsaffinität von gereinigtem antihumanem 1113 mAb allein vergleichbar waren. 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 und 586H-TVAAPS-210 banden alle IL-4. Es war nicht möglich, die Bindungsaffinität von 586-TVAAPS-210 für IL-4 zu messen, weil die Komponente DOM9-112-210 dieses mAbdAbs sehr eng bindet und daher die Off-Rate für eine Bestimmung mit BIAcoreTM zu klein ist. Die Anti-IL-4 dAbs allein (DOM9-155-25, DOM9-155-154 und DOM9-112-210) wurden allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil die dAbs auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen werden; stattdessen wurde antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • 3.2 Binden von Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs an IL-13 und IL-4 durch BIAcoreTM
  • mAbdAbs (in CHO-Zellüberständen, zubereitet nach der Beschreibung in Abschnitt 1.5) wurden auf Bindung an humanes IL-13 mit BIAcoreTM bei 25°C (wie in Verfahren 5 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 9 dargestellt (manche Proben wurden doppelt zubereitet und getestet, was als Probe 1 und Probe 2 verzeichnet wurde). Für diesen Datensatz wurden vier IL-4-Konzentrationskurven (100 nM, 10 nM, 1 nM und 0,1 nM) beurteilt; die ungefähren Einfangniveaus (mit relativem Korrekturfaktor) für die einzelnen getesteten mAbdAbs sind in der Tabelle angegeben. Ein isotyp-angepasster mAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurde auch als negative Kontrolle für die Bindung an IL-4 in diesen Assay einbezogen.
  • Tabelle 9
    Figure 00970001
  • Alle getesteten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs banden IL-4 mit gleichen Bindungsaffinitäten, die etwa mit der Bindungsaffinität von antihumanem IL4 mAb allein (Pascolizumab) vergleichbar waren. PascoL-EPKSC-474 band IL-4 etwa 2-mal weniger stark als Pascolizumab. Diese Daten legen nahe, dass die Zugabe von 5 Linkern und Anti-IL13 entweder zur Schwerkette oder zur Leichtkette von Pascolizumab keinen offenen Einfluss auf die IL-4-Bindungsaffinität der mAb-Komponente innerhalb des mAbdAb-Konstrukts hat.
  • Diese mAbdAbs wurden auf ihr Binden an humanes IL-13 mit BIAcoreTM bei 25°C 10 (wie in Verfahren 4 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 10 dargestellt (manche Proben wurden doppelt zubereitet und getestet, was als Probe 1 und Probe 2 verzeichnet wurde). Für diesen Datensatz wurden vier IL-13-Konzentrationskurven (128 nM, 32 nM, 8 nM und 2 nM) beurteilt; die ungefähren Einfangniveaus für die einzelnen getesteten mAbdAbs (mit relativem Korrekturfaktor) sind in der Tabelle 15 angegeben. Tabelle 10
    Antikörper Einfang niveau On-Rate (ka, Ms–1) Off-Rate (kd, s–1) Bindungsaffinität KD (nM)
    Experiment 1
    PascoH-474 ~500 3,6e5 3,1e–4 0,84
    PascoH-G4S-474 ~500 3,9e5 2,6e–4 0,67
    PascoH-TVAAPS-474 ~500 4,5e5 4,2e–4 0,94
    PascoH-ASTKG-474 ~500 3,1e5 4,6e–4 1,5
    PascoH-ELQLE-474 ~500 3,4e5 6,2e–4 1,8
    PascoH-EPKSC-474 ~500 3,5e5 4,0e–4 1,1
    Antihumaner IL-13 mAb (gereinigt) ~650 8,6e5 4,9e–4 0,57
    Experiment 2
    PascoL-474 (Probe 1) 3254 2,86e5 3,82e–4 1,34
    PascoL-474 (Probe 2) 2756 3,12e5 3,86e–4 1,24
    PascoL-G4S-474 (Probe 1) 1871 5,63e5 4,25e–4 0,756
    PascoL-G4S-474 (Probe 2) 1921 5,59e5 3,47e–4 0,621
    PascoL-TVAAPS-474 (Probe 1) 2796 7,42e5 2,58e–4 0,348
    PascoL-TVAAPS-474 (Probe 2) 3250 6,22e5 1,71e–4 0,275
    PascoL-ASTKG-474 (Probe 1) 3037 5,26e5 2,38e–4 0,451
    PascoL-ASTKG-474 (Probe 2) 3784 5,38e5 3,20e–4 0,595
    PascoL-EPKSC-474 (Probe 1) 3238 4,17e5 3,34e–4 0,801
    PascoL-EPKSC-474 (Probe 2) 3276 3,51e5 2,86e–4 0,815
    Antihumaner IL-13 mAb (gereinigt) 1373 9,12e4 6,11e–4 0,67
    Pascolizumab (gereinigt) 1152 keine keine -
    Bindung Bindung
    mAb für negative Kontrolle 2976 keine Bindung keine Bindung -
  • Bindungsaffinitätsdaten für in Experiment 2 getestete Konstrukte sind auch in 23 abgebildet.
  • Alle Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs banden IL-13. In den meisten Fällen wirkte sich die Präsenz eines Linkers offenbar nicht fördernd auf die Bindungsaffinität für IL-13 an die Anti-IL13-dAb-Komponente im mAbdAb-Format bei Platzierung auf der Schwerkette aus. Jedoch schien die Präsenz eines Linkers die Bindungsaffinität für IL-13 an die Anti-IL13-dAb-Komponente im mAbdAb-Format zu fördern, wenn diese auf der Leichtkette platziert war. PascoL-TVAAPS-474 schien in diesem Experiment die stärkste IL-13-Bindungsaffinität zu haben.
  • Der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) wurde allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil der dAb auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen wird; stattdessen wurde gereinigter antihumaner 1113 mAb als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet. Ein isotyp-angepasster mAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurde auch als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 in diesen Assay einbezogen.
  • Gereinigte Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs wurden auch auf ihre Bindung an humanes IL-13 und humanes IL-4 mit BIAcoreTM bei 25°C (wie in den Verfahren 4 und 5 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11
    Konstrukt Bindungsaffinität, KD (nM)
    Humanes IL-4 Humanes IL-13
    PascoH-G4S-474 0,036 0,58
    PascoH-474 0,037 0,71
    PascoL-G4S-474 0,028 1,2
    PascoHL-G4S-474 0,035 0,87
    Antihumaner IL-13 mAb (gereinigt) - 0,41
    Pascolizumab (gereinigt) 0,037 -
  • In diesem Experiment banden PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 den IL-4 mit gleichen Bindungsaffinitäten, die etwa mit der Bindungsaffinität von antihumanem 114 mAb allein (Pascolizumab) vergleichbar waren. Sie banden auch alle IL-13. Der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) wurde allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil der dAb auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen wird; stattdessen wurde antihumaner IL13 mAb als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • 3.3 Stöchiometrie der Bindung von IL-13 und IL-4 an Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs mit BIAcoreTM
  • Gereinigte Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs wurden auch auf die Stöchiometrie der Bindung an humanes IL-13 und humanes IL-4 mit BIAcoreTM bei 25C (wie in Verfahren 7 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12
    Konstrukt Stöchiometrie
    Humanes IL-4 Humanes IL-13
    PascoL-G4S-474 1,8 1,8
    PascoH-G4S-474 1,8 1,9
    Pasco-474 1,8 1,9
    PascoHL-G4S-474 1,7 3,5
    Antihumaner IL-13 mAb (gereinigt) - 1,8
    Pascolizumab (gereinigt) 1,8 -
  • PascoH-G4S-474, PascoH-474 und PascoL-G4S-474 waren in der Lage, an fast zwei Moleküle von IL-13 und zwei Moleküle von IL-4 zu binden. PascoHL-G4S-474 war in der Lage, fast zwei Moleküle von IL-4 und fast vier Moleküle von IL-13 zu binden. Diese Daten zeigten an, dass die getesteten Konstrukte von der erwarteten Anzahl an IL-13 oder IL-4-Molekülen vollständig besetzt werden konnten.
  • Beispiel 4
  • Neutralisationskraft von mAbdAbs in IL-13 und IL-4-Bioassays
  • 4.1 Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs
  • Gereinigte Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs wurden auf Neutralisation von humanem IL-13 in einem TF-1-Zellbioassay (wie in Verfahren 8 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 24 dargestellt.
  • Die gereinigten Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 und 586H-TVAAPS-210 haben die Bioaktivität von IL-13 in einem TF-1-Zellbioassay vollständig neutralisiert. Die Neutralisationskraft dieser mAbdAbs lag innerhalb des Zweifachen der von gereinigtem antihumanem IL-13 mAb allein. Gereinigter antihumaner IL-4 mAb (Pascolizumab) und gereinigte Anti-IL4 dAbs (DOM9-155-25, DOM9-155-154 oder DOM9-112-210) wurden als negative Kontrollen für die Neutralisation von IL-13 in diesen Assay einbezogen.
  • Die gereinigten Anti-IL13mAb-Anti-IL4dAbs 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 und 586H-TVAAPS-210 wurden ebenfalls auf Neutralisation von humanem IL-4 in einem TF-1-Zellbioassay (wie in Verfahren 9 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 25 dargestellt.
  • 586H-TVAAPS-210 hat die Bioaktivität von IL-4 in einem TF-1-Zellbioassay vollständig neutralisiert. Die Neutralisationskraft dieses mAbdAb lag innerhalb des Zweifachen der von gereinigtem antihumanem IL-4 dAb (DOM9-112-210) allein. 586H-TVAAPS-25 und 586H-TVAAPS-154 haben die Bioaktivität von IL-4 nicht neutralisiert, was in Kontrast zu gereinigten antihumanen IL-4 dAbs allein (DOM9-155-25 und DOM9-155-154) stand. Wie von BIAcoreTM nachgewiesen, hatten die gereinigten 586H-TVAAPS-25 und 586H-TVAAPS-154 Bindungsaffinitäten für IL-4 von 1,1 nM bzw. 0,49 nM. IL-4 bindet den IL-4-Rezeptor sehr eng (Bindungsaffinitäten von ungefähr 50 pM wurden in Literaturveröffentlichungen berichtet), und somit kann die Beobachtung, dass weder 586H-TVAAPS-25 noch 586H-TVAAPS-154 in der Lage waren, die Bioaktivität von IL-4 im TF-1-Zellbioassay wirksam zu neutralisieren, eventuell auch das Resultat der relativ geringeren Bindungsaffinität dieser mAbdAbs für IL-4 im Vergleich zur Stärke von IL-4 für den IL-4-Rezeptor sein.
  • Gereinigter antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) wurde als positive Kontrolle für die Neutralisation von IL-4 in diesen Bioassay einbezogen. Gereinigter antihumaner 1113 mAb wurde als negative Kontrolle für die Neutralisation von IL-4 in diesen Bioassay einbezogen.
  • 4.2 Anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs
  • Die gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 wurden auch auf Neutralisation von humanem IL-4 in einem TF-1-Zellbioassay (wie in Verfahren 9 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 26 dargestellt.
  • Die gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 haben die Bioaktivität von IL-4 in einem TF-1-Zellbioassay vollständig neutralisiert. Die Neutralisationskraft dieser mAbdAbs war ungefähr gleichwertig mit der von gereinigtem antihumanem IL4-mAb allein (Pascolizumab). Gereinigter antihumaner IL-13-mAb, gereinigter DOM10-53-474 dAb und ein dAb mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen (dAb zur negativen Kontrolle) wurden auch als negative Kontrollen für die Neutralisation von IL-4 in diesen Bioassay einbezogen.
  • Die gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 wurden auch auf Neutralisation von humanem IL-13 in einem TF-1-Zellbioassay (wie in Verfahren 8 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 27 dargestellt.
  • Die gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 haben die Bioaktivität von IL-13 in einem TF-1-Zellbioassay vollständig neutralisiert. Die Neutralisationskraft dieser mAbdAbs lag innerhalb des 3-fachen der von gereinigtem Anti-IL-13 dAb (DOM10-53-474) allein. Gereinigter antihumaner IL-13 mAb wurde auch als positive Kontrolle für die Neutralisation von IL-13 in diesen Bioassay einbezogen. Ein dAb mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen (dAb zur negativen Kontrolle) und gereinigter antihumaner 114 mAb allein (Pascolizumab) wurden ebenfalls als negative Kontrollen für die Neutralisation von IL-4 in diesen Bioassay einbezogen.
  • Die gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 wurden auch auf gleichzeitige Neutralisation von humanem IL-4 und humanem IL-13 in einem Doppelneutralisations-TF-1-Zellbioassay (wie in Verfahren 10 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in 28 dargestellt.
  • Die gereinigten Anti-IL4mAb-Anti-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 haben die Bioaktivität von IL-4 und IL-13 in einem Doppelneutralisations-TF-1-Zellbioassay vollständig neutralisiert. Die Neutralisationskraft dieser mAbdAbs war ungefähr gleichwertig mit der einer Kombination aus gereinigtem antihumanem 114 mAb (Pascolizumab) und gereinigtem Anti-IL13 dAb (DOM10-53-474). Gereinigter antihumaner IL-13 mAb allein, gereinigter antihumaner IL-4 mAb allein (Pascolizumab) und der antihumane IL-13 dAb (DOM10-53-474) allein (die als negative Kontrollen einbezogen waren) haben die Bioaktivität sowohl von IL-4 als auch von IL-13 in diesem Doppelneutralisationsbioassay für IL-4 und IL-13 nicht vollständig neutralisiert.
  • Beispiel 5
  • SEC-MALLS-Analyse von dAbs
  • Antigenspezifische dAbs wurden nach deren Lösungszustand durch SEC-MALLS (Size-Exclusion Chromatography – Multi-Angle Laser Light Scattering [Ausschlusschromatographie – Mehrwinkel-Laserlichtsstreuung]) charakterisiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt: der Domänenantikörper DOM10-53-474 existiert als Monomer in Lösung, während alle DOM9-dAbs (DOM9-112-210, DOM9-155-25, DOM9-155-147 und DOM9-155-154) stabile Dimere (und in manchen Fällen Tetramere) bilden können.
  • 5.1. Präparation der Proteine
  • Die Proben wurden gereinigt und in geeignete Puffer, z. B. PBS dialysiert. Nach der Dialyse wurden die Proben gefiltert und die Konzentration bestimmt (0,43 mg/ml DOM-155-25), (1,35 mg/ml DOM9-155-147) und 1,4 mg/ml DOM9-155-159). DOM10-53-474 und DOM9-112-210 wurden auf 1 mg/ml eingestellt. BSA wurde von Sigma erworben und ohne weitere Aufreinigung verwendet.
  • 5.2. Ausschlusschromatographie und Detektoreinrichtung
  • Ein Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC-System mit Autosampler (SIL-20A) und SPD-20A Prominence UV/Vis-Detektor wurde an ein Wyatt Mini Dawn Treos (MALLS, Detektor für Mehrwinkellaserlichtstreuung) und einen Wyatt Optilab rEX-DRI-Detektor (DRI: differential refractive index) angeschlossen. Die Detektoren wurden in der folgenden Reihenfolge verbunden: LS-UV-RI. Sowohl das RI- als auch das LS-Gerät arbeiteten bei einer Wellenlänge von 488 nm. Es wurde eine TSK2000-Säule der Tosoh Corporation (HPLC-Säule auf Kieselgelbasis) mit mobiler Phase von 50 mM Phosphatpuffer (ohne Salz), oder 1 × PBS, beide mit pH 7,4 verwendet. Die verwendete Flussrate betrug 0,5 oder 1 ml/min, die Laufzeit wurde an die verschiedenen Flussraten angepasst (45 oder 23 min), wobei mit keiner signifikanten Auswirkung auf die Trennung der Moleküle gerechnet wurde. Proteine wurden in Puffer auf eine Konzentration von 1 mg/ml präpariert, das Injektionsvolumen betrug 100 μl.
  • 5.3. Detektorkalibrierung
  • Der Lichtstreuungsdetektor wurde nach Herstelleranleitung mit Toluol kalibriert.
  • 5.4. Detektorkalibrierung mit BSA
  • Die Ausgänge des UV-Detektors und des RI-Detektors wurden an das Lichtstreuungsgerät angeschlossen, so dass Signale von allen drei Detektoren gleichzeitig mit der Wyatt ASTRA-Software erfasst werden konnten. Mehrere Injektionen von BSA in eine mobile Phase PBS (1 ml/min) wurden über eine Tosoh TSK2000-Säule geleitet, wobei UV-, LS- und RI-Signale von der Wyatt-Software erfasst wurden. Die Spuren werden dann mit der ASTRA-Software analysiert, und die Signale werden nach Herstelleranleitung normalisiert ausgerichtet und auf Bandenverbreiterung korrigiert. Dann wird der Durchschnitt aus den Kalibrierungskonstanten gebildet und in eine Vorlage für künftige Probenläufe eingegeben.
  • 5.5. Berechnungen der absoluten molaren Masse
  • 100 μl von jeder Probe wurden in eine entsprechend voräquilibirierte Säule injiziert. Nach der SEC-Säule durchläuft die Probe 3 Online-Detektoren: UV, MALLS (Mehrwinkel-Laserlichtstreuung) und DRI (differentialer Refraktionsindex), was die Bestimmung der absoluten molaren Masse gestattet. Die auf der Säule stattfindende Verdünnung ist etwa 10-fach und die Konzentration die, bei der der Zustand „in Lösung” für geeignet befunden wurde.
  • Die Berechnungsgrundlage von ASTRA wie auch der Zimm-Plot-Technik, die oft in einem Batch-Probenmodus durchgeführt wird, ist die Formel von Zimm [J. Chem. Phys. 16, 1093-1099 (1948)]:
    Figure 01040001
    wobei
    • • c die Massenkonzentration der im Lösungsmittel gelösten Moleküle ist (g/mL)
    • • M die massegemittelte Molekülmasse ist (g/mol)
    • • A2 der zweite Virialkoeffizient ist (mol mL/g2)
    • • K* = 4p2 n02 (dn/dc)2 l0 –4 NA –1 eine optische Konstante repräsentiert, bei der n0 der Refraktionsindex des Lösungsmittels bei der (Vakuum-)Wellenlänge der einfallenden Strahlung, l0 die (Vakuum-)Wellenlänge der einfallenden Strahlung, ausgedrückt in Nanometern, NA die Avogadro-Zahl (6,022 × 1023 mol–1) und dn/dc das differentiale Refraktionsindexinkrement der Lösung aus Lösungsmittel und gelöster Komponente in Bezug auf eine Änderung der Lösungskonzentration, augedrückt in mL/g ist (dieser Faktor muss gesondert mit dem DRI-Detektor gemessen werden).
    • • P(q) der theoretisch hergeleitete Formfaktor ist, der etwa gleich 1 – 2μ2 = 〈r2〉3!+... wobei μ = (4π/λ)sin(θ/2), und <r2> das Mittel über das Quadrat des Radius ist. P(q) ist eine Funktion der z-Durchschnittsgröße, Form und Struktur der Moleküle.
    • • Rq das übermäßige Rayleigh-Verhältnis ist (cm–1)
  • Diese Gleichung geht von vertikal polarisiertem einfallendem Licht aus und ist gültig zur Ordnung c2.
  • Um Berechnungen mit dem Zimm-Justierverfahren durchführen zu können, das eine Anpassung an Rq/K*c vs. sin2(q/2) darstellt, müssen wir das Reziproke der Gleichung 1 erster Ordnung in c erweitern:
    Um Berechnungen mit dem Zimm-Justierverfahren durchführen zu können, das eine Anpassung an Rq/K*c vs. sin2(q/2) darstellt, müssen wir das Reziproke der Gleichung 1 zur ersten Ordnung in c erweitern:
    Figure 01040002
  • Die entsprechenden Ergebnisse in diesem Fall lauten
    Figure 01050001
  • Die Berechnungen werden von der ASTRA-Software automatisch ausgeführt und ergeben einen Plot, bei dem die molare Masse für die einzelnen Schnitte ermittelt wird [ASTRA-Handbuch].
  • Die aus dem Plot für die einzelnen auf dem Chromatogramm beobachteten Spitzen erhaltene molare Masse wurde mit der erwarteten molaren Masse einer einzelnen Einheit des Proteins verglichen. Dies ergab eine Grundlage für das Ziehen von Schlussfolgerungen über den Lösungszustand des Proteins. Repräsentative Daten sind in Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 13: Übersicht
    dAb SEC-MALLS MW Säule und mobile Phase
    DOM10-53-474 Monomer 14 kDa TSK2000, PBS, pH 7,4, 0,5 ml/min
    DOM9-112-210 Dimer 30 kDa TSK2000, PBS, pH 7,4, 0,5 ml/min
    DOM9-155-25 Dimer 28 kDa TSK2000, 50 mM, Phosphatpuffer pH 7,4, 1 ml/min
    DOM9-155-147 Dimer-Tetramer-Äquilibrium 26-51 kDa TSK2000, 50 mM, Phosphatpuffer pH 7,4, 1 ml/min
    DOM9-155-159 Dimer 28 kDa TSK2000, 50 mM, Phosphatpuffer pH 7,4, 1 ml/min
  • DOM10-53-474
  • Einzelspitze mit durchschnittlicher molarer Masse definiert als ~14 kDa, zeigt einen monomeren Zustand in Lösung an, dargestellt in 29.
  • DOM9-112-210
  • Einzelspitze mit durchschnittlicher molarer Masse definiert als 30 kDa, zeigt einen dimeren Zustand in Lösung an, dargestellt in 30.
  • DOM9-155-25
  • Schöne symmetrische Spitze, aber an der Pufferfront. Der Mittelteil der Spitze wurde zur Bestimmung der molaren Masse verwendet (siehe die folgende Figur, in der alle drei Signale übereinander dargestellt sind). Die molare Masse beträgt 28 kDa, was einen dimeren Domänenantikörper repräsentiert, der in 31 dargestellt ist.
  • Überlagerung aller drei Signale (32).
  • DOM9-155-147
  • Der Hauptspitze ist eine molare Masse von 26 kDa über dem rechten Teil der Spitze zugewiesen, die sich über dem linken Teil der Spitze steil bis auf 53 kDa erhöht. Die Spitze repräsentiert höchstwahrscheinlich ein Dimer und eine kleinere Fraktion von Tetramer in raschem Gleichgewicht. Eine viel kleinere, bei 7,6 min eluierte Spitze repräsentiert ein tetrameres Protein mit einer molaren Masse von 51 kDa (33).
  • DOM9-155-159
  • Das Protein läuft als einzelne symmetrische Spitze mit einer bei ~28 kDa zugewiesenen molaren Masse, was einen dimeren Zustand in Lösung angibt (34).
  • Kontrolle für die Zuweisung der molaren Masse durch SEC-MALLS: BSA Jeder BSA-Lauf für die einzelnen oben dargestellten Experimente hat zur erwarteten molaren Masse geführt, z. B. zwei Spitzen mit molaren Massen von 67 und 145 kDa (Monomer und Dimer) (35).
  • Beispiel 6
  • Erzeugung von trispezifischen mAbdAbs
  • Trispezifische mAb-dAbs wurden entweder durch Generierung von VH- und VL-Sequenzen durch Assemblierungs-PCR, die dann in vorhandene mAbdAb-Expressionsvektoren kloniert wurden, oder durch Subklonierung vorhandener VH- und VL-Bereiche von mAb-Expressionsvektoren in vorhandene mAbdAb-Expressionsvektoren konstruiert, so dass der trispezifische mAbdAb bei Expression sowohl am C-Terminal der Schwer- als auch dem der Leichtkette dAbs angefügt hat.
  • Mit einer Linker-Sequenz wurde der Domänenantikörper an die Schwerkette CH3 oder die Leichtkette CK angefügt. Eine allgemeine schematische Darstellung dieser mAbdAb-Moleküle zeigt 36 (die mAb-Schwerkette ist grau dargestellt; die mAb-Leichtkette weiß, der dAb ist schwarz dargestellt).
  • Unten ist eine schematische Darstellung angeführt, die die Konstruktion einer trispezifischen mAbdAb-Schwerkette (Darstellung oben) und einer trispezifischen mAbdAb-Leichtkette (untere Darstellung) zeigt.
  • Figure 01070001
  • Für die Schwerkette ist die Bezeichnung 'VH' der variable Schwerkettenbereich des monoklonalen Antikörpers; 'CH', CH2 und CH3' sind Sequenzen des konstanten Schwerkettenbereichs des humanen IgG1; 'linker' ist die Sequenz des verwendeten speziellen Linker-Bereichs; 'dAb' ist die Sequenz des Domänenantikörpers. Für die Leichtkette: Die Bezeichnung 'VL' der variable Leichtkettenbereich des monoklonalen Antikörpers; 'CK' ist die Sequenz des konstanten Leichtkettenbereichs des humanen IgG1; 'linker' ist die Sequenz des verwendeten speziellen Linker-Bereichs; 'dAb' ist die Sequenz des Domänenantikörpers.
  • Eine Säugeraminosäuresignalsequenz (wie in SEQ ID NR: 64) wurde zu Erzeugung dieser Konstrukte verwendet.
  • 6.1 Trispezifische Anti-IL18mAb-Anti-IL4dAb-Anti-IL13dAb
  • Ein trispezifischer Anti-IL18mAb-Anti-IL4dAb-Anti-IL13dAb (auch bekannt als IL18mAb-210-474) wurde durch Transplantieren einer Sequenz, die einen antihumanen IL-4-Domänenantikörper (DOM9-112-210) kodiert, auf eine Sequenz, die eine Schwerkette kodiert, und einer Sequenz, die einen Anti-IL13-Domänenantikörper (DOM10-53-474) kodiert, auf eine Sequenz, die eine Leichtkette eines humanisierten monoklonalen antihumanen IL-18-Antikörpers kodiert, konstruiert. Mit einem G4S-Linker wurde der Anti-IL4-Domänenantikörper an die Schwerkette des monoklonalen Antikörpers angefügt. Mit einem G4S-Linker wurde der Anti-IL13-Domänenantikörper an die Leichtkette des monoklonalen Antikörpers angefügt.
  • IL18mAb-210-474 wurde transient in CHOK1-Zellüberständen exprimiert, und nach Quantifizierung des IL18mAb-210-474 im Zellüberstand in einer Anzahl von IL-18, IL-4 und IL-13 bindenden Assays analysiert.
    Name Beschreibung Sequenz-ID-Nr.
    IL18mAb-210-474 H-Kette = Antihumaner IL-18 mAb Schwerkette-G4S Linker-DOM9-112-210 dAb 69 (= H-Kette) 70 (= L-Kette)
    L-Kette = Antihumaner IL-18 mAb Leichtkette-G4S Linker-DOM9-112-210 dAb
  • 6.2 Trispezifische Anti-IL5mAb-Anti-IL4dAb-Anti-IL13dAb
  • Ein trispezifischer Anti-IL5mAb-Anti-IL4dAb-Anti-IL13dAb (auch bekannt als Mepo-210-474) wurde durch Transplantieren einer Sequenz, die einen antihumanen IL-4-Domänenantikörper DOM9-112-210 (SEQ ID-NR: 4) kodiert, auf eine Sequenz, die die Schwerkette eines humanisierten monoklonalen antihumanen IL-5-Antikörpers (SEQ ID-NR: 65) kodiert, und Transplantieren einer Sequenz, die einen Anti-IL13-Domänenantikörper DOM10-53-474 (SEQ ID-NR: 5) kodiert, auf eine Sequenz, die die Leichtkette eines humanisierten monoklonalen antihumanen IL-5-Antikörpers (SEQ ID-NR: 66) kodiert, konstruiert. Mit einem G4S-Linker wurde der Anti-IL4-Domänenantikörper an die Schwerkette des monoklonalen Antikörpers angefügt. Mit einem G4S-Linker wurde der Anti-IL13-Domänenantikörper an die Leichtkette des monoklonalen Antikörpers angefügt.
  • IL18mAb-210-474 wurde transient in CHOK1- und HEK293-6E-Zellüberständen exprimiert, und nach Quantifizierung im Zellüberstand in einer Anzahl von IL-4, IL-5 und IL-13 bindenden Assays analysiert.
    Name Beschreibung Sequenz-ID-Nr.
    Mepo-210-474 H-Kette = Antihumaner IL-5 mAb Schwerkette-G4S Linker-DOM9-112-210 dAb L-Kette = Antihumaner IL-5 mAb Leichtkette-G4S Linker-DOM9-112-210 dAb 71 (= H-Kette) 72 (= L-Kette)
  • 6.3 Sequenz von monoklonalen Antikörpern, Domänenantikörpern und Linkern
  • Die Sequenzen für die monoklonalen Antikörper, Domänenantikörper und Linker, mit denen die trispezifischen mAbdAbs erzeugt (oder die als Kontrollreagenzien in den folgenden Veranschaulichungen verwendet) wurden, sind unten in Tabelle 14 aufgeführt. Tabelle 14
    Name Spezifität Sequenz-ID-Nr.
    Domänenantikörper DOM9-112-210 Humanes IL-4 4
    Domänenantikörper DOM10-53-474 Humanes IL-13 5
    Linkersequenz GGGGS 6
    Pascolizumab (monoklonaler Antikörper Antihuman IL-4) Humanes IL-4 14 (= H-Kette) 15 (= L-Kette)
    Mepolizumab (monoklonaler Antikörper Antihuman IL-5) Humanes IL-5 65 (= H-Kette) 66 (= L-Kette)
    (Humanisierter) monoklonaler Antikörper Antihuman IL-13 Humanes IL-13 12 (= H-Kette) 13 (= L-Kette)
    (Humanisierter) monoklonaler Antikörper Antihuman IL-18 Humanes IL-13 67 (= H-Kette) 68 (= L-Kette)
  • Reife Aminosäuresequenz von humanem IL-4 (ohne Signalsequenz) ist angegeben in SEQ ID-NR.: 62.
  • Reife Aminosäuresequenz von humanem IL-13 (ohne Signalsequenz) ist angegeben in SEQ ID-NR.: 63.
  • 6.4 Expression und Reinigung von trispezifischen mAbdAbs
  • Trispezifische mAbdAb-Moleküle kodierende DNA-Sequenzen wurden mit molekularbiologischen Standardtechniken zu Säugerexpressionvektoren (RIn, RId oder pTT) kloniert. Die trispezifischen mAbdAb-Expressionskonstrukte wurden transient in eine oder beide CHOK1 oder HEK293-6E-Zelle(n) transfiziert, und in geringem Umfang (3 ml bis 150 ml) exprimiert. Die zur Erzeugung der trispezifischen mAbdAbs verwendeten Expressionsverfahren waren die gleichen wie die routinemäßig zum Exprimieren monoklonaler Antikörper eingesetzten Verfahren.
  • Manche der Konstrukte wurden an Säulen von immobilisiertem Protein A aufgereinigt und durch Ablesen der Extinktion bei 280 nm quantifiziert.
  • Beispiel 7
  • Binden von trispezifischen mAbdAbs an humanes IL-4, humanes IL-13 und humanes IL-18 durch ELISA
  • 7.1 Binden von IL-18mAb-210-474 an IL-4, IL-13 und IL-18 durch ELISA
  • Trispezifische mAbdAb IL18mAb-210-474 (Überstände), die nach der Beschreibung in Beispiel 6 (SEQ ID-NR: 69 und 70) zubereitet wurden, wurden in direkt bindenden ELISAs (nach der Beschreibung in den Verfahren 1, 2 und 3) auf Bindung an humanes IL-18, humanes IL-13 und humanes IL-4 getestet, wobei diese Daten in den 37, 38 bzw. 39 dargestellt sind (IL18mAb-210-474 wurde ein paar Male zubereitet und getestet, was in den Figuren als Probe 1, Probe 2, Probe 3 usw. verzeichnet ist).
  • Diese Figuren zeigen, dass IL-18mAb-210-474 durch ELISA IL-4, IL-13 und IL-18 band. Gereinigter antihumaner 1118 mAb wurde als positive Kontrolle für die IL-18-Bindung in den IL-18 bindenden ELISA einbezogen. Der Anti-IL-4 dAb (DOM9-112-210) wurde im IL-4 bindenden ELISA nicht getestet, weil dieser dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde gereinigter antihumaner IL4 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-4-Bindung in diesem ELISA verwendet. Der Anti-IL-13 dAb (DOM10-53-474) wurde im IL-13 bindenden ELISA nicht getestet, weil dieser dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde gereinigter antihumaner IL-13 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-13-Bindung in diesem ELISA verwendet. Wie in den Figuren dargestellt, wurden mAbs gegen ein irrelevantes Antigen zur negativen Kontrolle in jeden Bindungs-ELISA einbezogen.
  • In jedem ELISA weicht die Bindungskurve für IL18mAb-210-474 Probe 5 von den Bindungskurven der anderen IL18mAb-210-474 Proben ab. Der Grund hierfür ist nicht bekannt, doch liegt dies eventuell an einem Quantifizierungsproblem beim Quantifizierungs-ELISA für humanen IgG für diese bestimmte Probe 5 von IL18mAb-210-474.
  • 7.2 Binden von Mepo-210-474 an IL-4 und IL-13 durch ELISA
  • Trispezifische mAbdAbs Mepo-210-474 (Überstände), die nach der Beschreibung in Abschnitt 1 (Sequenz-ID-Nummern 71 und 72) zubereitet wurden, wurden in direkt bindenden ELISAS (nach der Beschreibung in den Verfahren 1 bzw. 2) auf Bindung an humanes IL-13 und humanes IL-4 getestet, wobei diese Daten in den 40 bzw. 41 dargestellt sind (Mepo-210-474 viermal zubereitet und getestet, was als Probe 1, Probe 2, Probe 3 und Probe 4 verzeichnet wurde).
  • Diese Figuren zeigen, dass Mepo-210-474 durch ELISA IL-4 und IL-13 band. Der Anti-IL-4 dAb (DOM9-112-210) wurde im IL-4 bindenden ELISA nicht getestet, weil dieser dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde gereinigter antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-4-Bindung in diesem ELISA verwendet. Der Anti-IL-13 dAb (DOM10-53-474) wurde im IL-13 bindenden ELISA nicht getestet, weil dieser dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde gereinigter antihumaner IL-13 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-13-Bindung in diesem ELISA verwendet. Wie in den 40 und 41 dargestellt, wurden mAbs gegen ein irrelevantes Antigen zur negativen Kontrolle in jeden Bindungs-ELISA einbezogen.
  • Mepo-210-474 Probe 1 und Probe 2 wurden in einem Experiment zur Transienttransfizierung und Mepo-210-474 Probe 3 und Probe 4 in einem anderen Experiment zur Transienttransfizierung zubereitet. Alle vier Proben banden IL-13 und IL-4 in IL-13 und IL-4 bindenden ELISAs. Der Grund für die verschiedenen Bindungsprofile der Proben 1 und 2 im Vergleich zu den Proben 3 und 4 ist unbekannt, kann jedoch auf einen Qualitätsunterschied des in den einzelnen Transfizierungsexperimenten erzeugten mAbdAb (im Überstand) hindeuten.
  • Beispiel 8
  • Binden von trispezifischen mAbdAbs an humanes IL-4, humanes IL-5, humanes I1-13 und humanes I1-18 durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz (BIAcoreTM)
  • 8.1 Binden von IL-18mAb-210-474 an IL-4, IL-13 und IL-18 durch BIAcoreTM
  • Trispezifische mAbdAb IL18mAb-210-474 (Überstände), die nach der Beschreibung in Beispiel 6,1 (SEQ ID-NR: 69 und 70) zubereitet wurden, wurden auch auf ihre Bindung an humanes IL-4, humanes IL-13 und humanes IL-18 mit BIAcoreTM bei 25°C (wie in Verfahren 4, 5 und 6 beschrieben) getestet. Die Einfangniveaus lagen im Bereich von ungefähr 400 bis 850 Reaktionseinheiten. Es wurden drei Konzentrationen der einzelnen Analyten getestet (236, 32 und 4 nM). Diese Daten sind in Tabelle 15 dargestellt (manche Proben wurden dreifach zubereitet und getestet, was als Probe 1, Probe 2 und Probe 3 verzeichnet wurde). Tabelle 15
    Konstrukt On-Rate (ka) Off-Rate (kd) Bindungsaffinität, KD (nM)
    Bindung an IL-18
    IL18mAb-210-474 (Probe 1) 2,1e6 2,3e–5 0,011
    IL18mAb-210-474 (Probe 2) 2,1e6 2,8e–5 0,014
    IL18mAb-210-474 (Probe 3) 2,1e6 2,9e–5 0,014
    Antihumaner IL-13 mAb (gereinigt) 1,9e6 6,8e–5 0,035
    Bindung an IL-13
    IL18mAb-210-474 (Probe 1) 5,8e5 5,7e–4 0,99
    IL18mAb-210-474 (Probe 2) 6,2e5 6,1e–4 0,99
    IL18mAb-210-474 (Probe 3) 7,4e5 7,4e–4 1,0
    Antihumaner IL-13 mAb (gereinigt) 1,2e6 5,0e–4 0,41
    Bindung an IL-4
    IL18mAb-210-474 (Probe 1) - - sehr eng bindend *
    IL18mAb-210-474 (Probe 2) - - sehr eng bindend *
    IL18mAb-210-474 (Probe 3) - - sehr eng bindend *
    Pascolizumab (gereinigt) 4,6e6 1,7e–4 0,037
    • *KD kann wegen positiver Dissoziationswirkungen und der Empfindlichkeit der BIAcoreTM-Technik nicht bestimmt werden
  • Der trispezifische mAbdab band IL-4, IL-13 und IL-18 mit BIAcoreTM. Die Bindungsaffinität von mAbdAb für IL-18 war ungefähr mit der des gereinigten antihumanen 1118 mAb allein äquivalent, der in diesen Assay als positive Kontrolle für die IL-18-Bindung und zum direkten Vergleich der Bindungsaffinitäten der mAbdab einbezogen wurde. Es war nicht möglich, die absolute Bindungsaffinität des mAbdAb für IL-4 zu bestimmen, weil die Komponente DOM9-112-210 dieses trispezifischen mAbdAb sehr eng an IL-4 bindet und daher die Off-Rate für eine Bestimmung mit BIAcoreTM zu klein ist. Der Anti-IL-4 dAbs allein (DOM9-112-210) wurde allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil dieser dAb auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen wird; stattdessen wurde antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet. Der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) wurde allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil der dAb auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen wird; stattdessen wurde antihumaner IL13 mAb als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • 8.2 Binden von Mepo-210-474 an IL-4, IL-5 und IL-13 durch BIAcoreTM
  • Trispezifische mAbdAb Mepo-210-474 (Überstände), die nach der Beschreibung in Beispiel 6.2 (SEQ ID-NR: 71 und 72) zubereitet wurden, wurden auch auf ihre Bindung an humanes IL-4, humanes IL-5 und humanes IL-13 mit BIAcoreTM bei 25°C (wie in Verfahren 5, 11 und 4 beschrieben) getestet. Die Einfangniveaus lagen im Bereich von ungefähr 550 bis 900 Reaktionseinheiten. Für die IL-4- und IL-13-Bindung wurden fünf Konzentrationen der einzelnen Analyten getestet (256, 64, 16, 4 und 1 nM). Für die IL-5-Bindung wurden vier Konzentrationen der einzelnen Analyten getestet (256, 64, 16, 4 und 1 nM). Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 dargestellt. Tabelle 16
    Konstrukt On-Rate (ka) Off-Rate (kd) Bindungsaffinität, KD (nM)
    Bindung an IL-5
    Mepo-210-474 3,34e5 1,50e–4 0,45
    Mepolizumab (gereinigt) 3,78e4 1,30e–4 0,34
    Bindung an IL-13
    Mepo-210-474 6,38e5 1,03e–3 1,62
    Antihumaner IL-13 mAb (gereinigt) 1,51e6 5,68e–4 0,38
    Bindung an IL-4
    Mepo-210-474 - - sehr eng bindend (KD kann wegen positiver Dissoziationswirkungen und der Empfindlichkeit der BIAcoreTM-Technik nicht bestimmt werden)
    Pascolizumab (gereinigt) 6,26e6 1,43e–4 0,02
  • Mepo-210-474 band IL-4, IL-13 und IL-18 mit BIAcoreTM. Die Bindungsaffinität von Mepo-210-474 für IL-5 war ungefähr gleichwertig mit der von gereinigtem antihumanem IL5-mAb (Mepolizumab) allein, das in diesen Assay als positive Kontrolle für die IL-5-Bindung und zum direkten Vergleich mit der Bindungsaffinität von Mepo-210-474 einbezogen war. Es war nicht möglich, die absolute Bindungsaffinität von Mepo-210-474 für IL-4 zu bestimmen, weil die Komponente DOM9-112-210 dieses trispezifischen mAbdAb sehr eng an IL-4 bindet und daher die Off-Rate für eine Bestimmung mit BIAcoreTM zu klein ist. Der Anti-IL-4 dAbs allein (DOM9-112-210) wurde allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil dieser dAb auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen wird; stattdessen wurde antihumaner 114 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) wurde allerdings in diesem Assay nicht getestet, weil der dAb auf dem mit Protein A oder antihumanem IgG beschichteten CM5-Chip nicht eingefangen wird; stattdessen wurde antihumaner 1113 mAb als positive Kontrolle für den Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Beispiel 9
  • Stöchiometrie
  • 9.1 Stöchiometrie der Bindung von IL-4, IL-13 und IL-18 an IL-18mAb-210-474 mit BIAcoreTM
  • IL18mAb-210-474 (in CHO-Zellüberständen, die nach der Beschreibung in Beispiel 1 zubereitet wurden) (SEQ ID-NR: 69 und 70) wurden auch auf die Stöchiometrie der Bindung an humanes IL-4, IL-13 und IL-18 mit BIAcoreTM (wie in Verfahren 7 beschrieben) beurteilt. Diese Daten sind in Tabelle 17 dargestellt (R-max ist die gesättigte Bindungsantwort und nach der gegebenen Formel in Verfahren 7 zur Berechnung der Stöchiometrie erforderlich). Die Konzentration der einzelnen Zytokine betrug 500 nM. Die Injektionsposition bezieht sich auf die Reihenfolge, in der die Zytokine zugegeben wurden. Tabelle 17
    Zytokine Injektionsposition R-max Stöchiometrie
    IL-4 1. 59 0,9
    IL-4 2. 56 0,9
    IL-4 3. 51 0,8
    IL-13 1. 74 1,6
    IL-13 2. 77 1,7
    IL-13 3. 80 1,8
    IL-18 1. 112 1,8
    IL-18 2. 113 1,8
    IL-18 3. 110 1,7
  • Nach den stöchiometrischen Daten band IL18mAb-210-474 an ungefähr zwei Moleküle IL-18, zwei Moleküle IL-13 und nur ein Molekül IL-4. Der Anti-IL4 dAb allein (DOM9-112-210) ist bekanntermaßen in Lösung ein Dimer und kann nur an ein IL-4-Molekül binden. Es ist von daher nicht unerwartet, dass der IL8mAb-210-474 nur ein IL-4-Molekül binden kann. Diese Daten zeigten an, dass die getesteten Moleküle von der erwarteten Anzahl an IL-18, IL-13 oder IL-4-Molekülen vollständig besetzt werden konnten. Die stöchiometrischen Daten zeigten außerdem an, dass die Einfangreihenfoige der Zytokine unabhängig von der Reihenfolge ihre Zugabe zu sein scheint.
  • Beispiel 10
  • 10.1 Erzeugung eines dual targetierenden Anti-TNF/Anti-EGFR-mAbdAb
  • Dieser dual targetierende mAbdAb wurde durch Fusion eines dAb an das C-Terminal der mAb-Schwerkette konstruiert. Die Expressionskassetten der Schwer- und Leichtkette des anti-TNF-mAb waren bereits zuvor konstruiert worden. Die zum Klonieren verwendeten Restriktionsstellen sind unten angegeben (42). Um Restriktionsstellen für die Einfügung des dAb in die Schwerkette einzuführen, wurde eine ortsgerichtete Mutagenese zur Schaffung von SalI- und HindIII-Klonierungsstellen mit dem mAb-Schwerkettenexpressionsvektor als Vorlage verwendet. Einen anti-EGFR dAb (DOM16-39-542) kodierende DNA wurde dann durch eine PCR (mit Primern, die Enden von SalI und HindIII kodieren) verstärkt und in den modifizierten Kodierungsbereich 3' eingefügt, was zu einem Linker aus 'STG' (Serin, Threonin, Glycin) zwischen dem mAb und dem dAb führte.
  • Sequenzverifizierte Klone (SEQ-ID-NR.: 170 und 169) für Leicht- bzw. Schwerkette) wurden ausgewählt und mit dem Qiagen Mega Prep Kit nach Herstellerprotokollen in großem Umfang hergestellt. mAbdAbs wurden in Säugerzellen HEK293-6E mit Techniken der transienten Transfixierung durch Ko-Transfizierung der Leicht- und Schwerkette (SEQ-ID-NR.: 73 und 74) exprimiert.
  • 10.2 Reinigung und SEC-Analyse eines dual targetierenden Anti-TNF/Anti-EGFR-mAbdAb
  • Das Anti-TNF/Anti-EGFR mAbdAb-Konstrukt wurde aus dem geklärten Expressionsüberstand mittels Protein-A-Affinitätschromatographie nach feststehenden Protokollen gereinigt. Konzentrationen von gereinigten Proben wurden durch Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtextinktion bei 280 nm ermittelt. Eine SDS-PAGE-Analyse (43) der gereinigten Probe zeigt die nichtreduzierte Probe bei ~170 kDa, während die reduzierte Probe zwei Banden bei ~25 und ~60 kDa aufweist, die der Leichtkette bzw. der Schwerkette mit dem daran angebrachten dAb entsprechen.
  • Für die ausschlusschromatographische Analyse (SEC) wurde das Anti-TNF/Anti-EGFR mAbdAb-Konstrukt auf eine Superdex-200 10/30 HR Säule (die mit einem Akta Express FPLC-System verbunden war) aufgebracht, voräquilibriert und bei 0,5 ml/min in PBS analysiert. Das SEC-Profil zeigt eine einzelne als symmetrische Spitze laufende Spezies (44).
  • 10.3 Bindungsaffinitäten des dual targetierenden Anti-TNF/Anti-EGFR-mAbdAb
  • Die Bindungsaffinitäten an EGFR und TNF wurden nach der Beschreibung in den Verfahren 13 bzw. 14 ermittelt Die Assay-Daten wurden mit der GraphPad Prism Software analysiert. Die Stärkewerte wurden mit einer S-förmigen Dosisantwortkurve bestimmt und mit einem Kurvenermittlungsmodell auf die beste Übereinstimmung gebracht. Die Anti-EGFR-Potenz (45) dieses mAbdAb wurde mit 39.1 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-EGFR mAb, einen EC50-Wert von 3,4 nM ergab. Im Anti-TNF-Bioassay (46) lag die Stärke des mAbdAb bei 3 pM (0,0028 nM), während ein monoklonaler Anti-TNF-Kontrollantikörper einen EC50 von 104 pM erzeugte. Als Schlussfolgerung zeigen die Assay-Daten, dass das Konstrukt des Beispiels 10, ein dual targetierender Anti-TNF/Anti-EGFR-mAbdAb, gegen beide Antigene potent ist.
  • 10.4 Ratten-PK des dual targetierenden Anti-TNF/Anti-EGFR-mAbdAb
  • Dieses Molekül wurde in vivo an Ratten auf pharmakokinetische Eigenschaften getestet. Der Anti-TNF/Anti-EGFR mAbdAb wurde drei Ratten i. v. verabreicht, wobei über einen Zeitraum von 7 Tagen (168 Stunden) Serumproben gesammelt wurden.
  • Die verbleibende Konzentration des Medikaments zu verschiedenen Zeiten nach der Dosisgabe wurde durch ELISA im Vergleich zu TNF und EGFR bewertet. Die Ergebnisse sind in 125 dargestellt.
  • Die PK-Parameter haben bestätigt, dass dieses Molekül im gleichen Bereich wie zuvor für das unmodifizierte Adalimumab (125 Stunden) beobachtet eine lange Halbwertszeit hat. Weitere Einzelheiten sind in Tabelle 17.1 dargestellt. Tabelle 17.1
    Assay-Antigen Halbwertszeit (h) Cmax (μg/mL) AUC (0-inf) (h*μg/mL) Clearance (mL/h/kg) % AUC extrapoliert
    TNF 157,2 149,8 10301,3 0,5 40,6
    EGFR 140,8 123,6 7986,7 0,7 35
  • Beispiel 11
  • 11.1 Erzeugung eines dual targetierenden Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb
  • Ein Anti-TNF/Anti-VEGF mAbdAb wurde nach einer ähnlichen Vorgehensweise wie für Beispiel 10 produziert. Zur Konstruktion der Schwerkettenexpressionskassette wurde die die Schwerkette von Beispiel 10 kodierende Vektor-DNA als Ausgangspunkt verwendet. Der Anti-EGFR-dAb wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und HindIII aus dem Vektor herausgeschnitten. DOM15-26-593, ein Anti-VEGF-dAb wurde durch eine PCR (mit Primern, die Enden von SalI und HindIII kodieren) verstärkt und unter Verwendung der gleichen Restriktionsstellen in die Hauptkette des Vektors, aus dem zuvor der Anti-EFGR-Ab herausgeschnitten wurde, ligiert, was zu einem Linker aus 'STG' (Serin, Threonin, Glycin) zwischen dem mAb und dem dAb führte.
  • Sequenzverifizierte Klone (SEQ-ID-NR: 169 und 168 für die Leicht- bzw. die Schwerkette) wurden selektiert und DNA-Präparate in großem Umfang hergestellt, wobei der Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb mit Techniken der transienten Transfixierung durch Ko-Transfizierung der Leicht- und Schwerkette (SEQ ID NO: 73 und 75) in Säugerzellen HEK293-6E exprimiert wurde.
  • 11.2 Reinigung und SEC-Analyse eines dual targetierenden Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb
  • Das Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb-Konstrukt wurde aus dem geklärten Expressionsüberstand mittels Protein-A-Affinitätschromatographie nach feststehenden Protokollen gereinigt. Konzentrationen von gereinigten Proben wurden durch Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtextinktion bei 280 nm ermittelt. Eine SDS-PAGE-Analyse (47) der gereinigten Probe zeigt die nichtreduzierte Probe bei ~170 kDa, während die reduzierte Probe zwei Banden bei ~25 und ~60 kDa aufweist, die der Leichtkette bzw. der Schwerkette mit dem daran angebrachten dAb entsprechen.
  • Für die ausschlusschromatographische Analyse (SEC) wurde das Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb-Konstrukt auf eine Superdez-200 10/30 HR Säule (die mit einem Akta Express FPLC-System verbunden war) aufgebracht, voräquilibriert und bei 0,5 ml/min in PBS analysiert. Das SEC-Profil zeigt eine einzelne als symmetrische Spitze laufende Spezies (48).
  • 11.3 Bindungsaffinitäten des dual targetierenden Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb
  • Die Bindungsaffinitäten an VEGF und TNF wurden nach der Beschreibung in den Verfahren 12 bzw. 14 ermittelt Die Assay-Daten wurden mit der GraphPad Prism Software analysiert. Die Stärkewerte wurden mit einer S-förmigen Dosisantwortkurve bestimmt und mit einem Kurvenermittlungsmodell auf die beste Übereinstimmung gebracht. Die Anti-VEGF-Potenz (49) dieses mAbdAb wurde mit 57 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-VEGF-mAb, einen EC50-Wert von 366 pM ergab. Im Anti-TNF-Bioassay (50) lag die Stärke bei 10 pM, während ein monoklonaler Anti-TNF-Kontrollantikörper einen EC50 von 22 pM erzeugte. Als Schlussfolgerung zeigen die Assay-Daten, dass das Konstrukt des Beispiels 11, ein dual targetierender Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb, gegen beide Antigene potent ist.
  • 11.4 Ratten-PK des dual targetierenden Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb
  • Dieses Molekül wurde in vivo an Ratten auf pharmakokinetische Eigenschaften getestet. Der Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb wurde drei Ratten i. v. verabreicht, wobei über einen Zeitraum von 10 Tagen (240 Stunden) Serumproben gesammelt wurden.
  • Die verbleibende Konzentration des Medikaments zu verschiedenen Zeiten nach der Dosisgabe wurde durch ELISA im Vergleich zu TNF und VEGF bewertet. Die Ergebnisse sind in 126 dargestellt.
  • Die PK-Parameter haben bestätigt, dass dieses Molekül in vivo mit dem unmodifizierten Adalimumab vergleichbare pharmakokinetische Eigenschaften hat.
  • Die kürzere beobachtete t1/2β für die VEGF-Komponente wird nicht als signifikant angesehen und kann ein Assay-Artefakt sein. Weitere Einzelheiten sind in Tabelle 17.2 dargestellt. Tabelle 17.2
    Antigen Halbwertszeit (h) Cmax (μg/mL) AUC (0-inf) (h*μg/mL) Clearance (mL/h/kg) %AUC extrapoliert
    TNF 180,1 89,9 7286,3 0,7 35,8
    VEGF 94,2 102,8 4747,1 1,1 14,3
  • 11.5 Erzeugung eines alternativen Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb
  • Ein alternativer Anti-TNF/Anti-VEGF-mAbdAb wurde auf die gleiche Weise wie für Beispiel 11.1 beschrieben unter Verwendung des gleichen Anti-TNF-mAb, der mit einem über einen STG-Linker an das C-Terminal der Schwerkette angefügten VEGF-dAb verbunden ist, konstruiert. Bei dem in diesem Fall verwendeten Anti-VEGF-dAb handelt es sich um DOM15-10-11. Diese Moleküle wurden mit Techniken der transienten Transfixierung durch Ko-Transfizierung der Leicht- und Schwerkette (SEQ ID NO: 73 und 185) in Säugerzellen HEK293-6E exprimiert. Dieses Molekül ergab exprimiert einen mAbdAb vergleichbarer Expressionsstufe wie der in Beispiel 11.2 beschriebene, der aber beim Test der Potenz im gleichen VEGF-Assay wie in Beispiel 11.3 die VEGF-Bindung an den VEGF-Rezeptor in diesem Assay in einem Niveau unterhalb der Detektionsgrenze hemmt.
  • Beispiel 12
  • 12.1 Erzeugung eines dual targetierenden, mit einem Anti-VEGF/Anti-IL1R1-dAb erweiterten IgG
  • Zwei dual targetierende, mit dAb erweiterte IgG-Moleküle wurden mit molekularbiologischen Standardtechniken nach der Vorgehensweise zum Einfügen von Dummy-V-Domänen kodierenden Bereichen zwischen dAb und konstanten Bereichen der beiden Ketten konstruiert.
  • Für die Leichtkette wurde der Anti-IL1R1-dAbDOM4-130-54 zuvor in eine Expressionskassette mit SalI und BsiWI-Stellen (51) kloniert, um eine dAb-Ck-Kette zu produzieren. Zur Produktion der dAb-erweiterten IgG-Leichtkette wurde der Dummy-Vk-Bereich durch eine PCR an beiden Enden mit BsiWI kodierenden Primern verstärkt. Das die dAb-Ck-Expressionskassette enthaltende Plasmid wurde mit BsiWI aufgeschlossen. Die mit BsiWI aufgeschlossene Dummy-Vk-Domäne wurde hineinligiert, um die um den dAb erweiterte IgG-Leichtkette mit einem 'TVAAPS'-Linker zwischen den beiden variablen Domänen zu produzieren.
  • Auf identische Weise wurde die dAb-erweiterte IgG-Schwerkette produziert, wobei die durch PCR verstärkte Dummy-Vh-Domäne mit NheI-Enden in eine mit NheI aufgeschlossene dAb-Schwerkette zwischen dem dAb DOM15-26 und CH1 (51) mit einem 'ASTKGPS'-Linker zwischen den beiden variablen Domänen ligiert wird.
  • Diese wird als DMS2090 bezeichnet und hat die in SEQ-ID-NR.: 163, (DNA-SEQ-ID-NR.: 162) angegebene Sequenz. Diese wird mit der in SEQ-ID-NR.: 77, (DNA-SEQ-ID-NR.: 171) angegebenen Leichtkette gepaart.
  • Eine zweite Schwerkette wurde auf die gleiche Weise konstruiert, jedoch unter Verwendung des dAb DOM15-26-593. Diese wird als DMS2091 bezeichnet und hat die in SEQ-ID-NR.: 76, (DNA-SEQ-ID-NR.: 172) angegebene Sequenz. Diese wird mit der in SEQ-ID-NR.: 77, (DNA-SEQ-ID-NR.: 171) angegebenen Leichtkette gepaart.
  • Es wurden sequenzverifizierte Klone selektiert und mit Zubereitungs-Kits Qiagen Maxi oder Mega nach Herstelleranleitung in großem Umfang DNA-Präparate hergestellt. Das resultierende Konstrukt wurde mit Techniken der transienten Transfixierung durch Ko-Transfizierung der Leicht- und Schwerkette in Säugerzellen exprimiert.
  • 12.2 Reinigung und SEC-Analyse des dual targetierenden Anti-VEGF/Anti-IL1R1-mAbdAb
  • Beide mit Anti-IL1R1/Anti-VEGF-dAb erweiterten IgG-Moleküle wurden aus dem geklärten Expressionsüberstand mit Protein-A-Affinitätschromatographie nach feststehenden Protokollen gereinigt. Konzentrationen von gereinigten Proben wurden durch Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtextinktion bei 280 nm ermittelt. Die SDS-PAGE-Analyse für DMS2090 ist in 52 und für DMS2091 in 53 dargestellt. Beide gereinigten Proben zeigen nichtreduzierte Proben bei 190 kDa, während die reduzierten Proben zwei Banden bei 35 und 60 kDa aufweisen, die der mit dem dAb erweiterten Leicht- bzw. Schwerkette entsprechen.
  • Für die ausschlusschromatographische Analyse (SEC) wurde der mit dAb-erweiterte Anti-VEGF/Anti-IL1R1-IgG auf eine Superdez-200 10/30 HR Säule (die mit einem Akta Express FPLC-System verbunden war) aufgebracht, voräquilibriert und bei 0,5 ml/min in PBS analysiert. Die SEC-Profile für DMS2090 (54) und DMS2091 (55) zeigen beide eine einzelne als symmetrische Spitze auftretende Spezies.
  • 12.3 Bindungsaffinitäten des dual targetierenden Anti-VEGF/Anti-IL1R1-mAbdAb
  • Die Bindungsaffinitäten an VEGF und IL1R1 wurden nach der Beschreibung in den Verfahren 12 bzw. 15 ermittelt Die Assay-Daten wurden mit der GraphPad Prism Software analysiert. Die Stärkewerte wurden mit einer S-förmigen Dosisantwortkurve bestimmt und mit einem Kurvenermittlungsmodell auf die beste Übereinstimmung gebracht. Die Anti-VEGF-Potenz (57) von DMS2090 wurde mit 158,4 pM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-VEGF-mAb, einen EC50-Wert von 689,2 pM ergab. Die Anti-VEGF-Potenz (56) von DMS2091 wurde mit 55 pM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-VEGF-mAb, einen EC50-Wert von 766 pM ergab.
  • Im Anti-IL1R1-Bioassay lag die Stärke von DMS2090 (58) bei 32 pM, während ein monoklonaler Anti-IL1R1-Kontrollantikörper einen EC50 von 35 pM erzeugte. Die Stärke von DMS2091 (59) betrug 17,47 pM, während ein monoklonaler Anti-IL1R1-Kontrollantikörper einen EC50 of 35,02 pM erzeugte.
  • Als Schlussfolgerung zeigen die Assay-Daten, dass das Konstrukt des Beispiels 12, ein dual targetierender dAb-erweiterter Anti-IL1R1/Anti-VEGF-IgG, gegen beide Antigene potent ist.
  • 12.4 Ratten-PK des dual targetierenden Anti-VEGF/Anti-IL1R1-mAbdAb
  • Dieses Molekül wurde in vivo an Ratten auf pharmakokinetische Eigenschaften getestet. Der dAb erweiterte Anti-IL1R1/Anti-VEGF-IgG wurde drei Ratten i. v. verabreicht, wobei über einen Zeitraum von 7 Tagen (168 Stunden) Serumproben gesammelt wurden. Die verbleibende Konzentration des Medikaments zu verschiedenen Zeiten nach der Dosisgabe wurde durch ELISA im Vergleich zu IL1R1 und VEGF bewertet. Die Ergebnisse sind in 127 dargestellt.
  • Die PK-Parameter sind in Tabelle 17.3 dargestellt. Tabelle 17.3
    Molekül Assay-Antigen Halbwertszeit Cmax AUC (0-inf) Clearance % AUC extrapoliert
    (h) (μg/mL) (h*μg/mL) (mL/h/kg)
    DMS2090 VEGF 72,1 100,4 4811,6 1,1 19
    DMS20901 IL-1R 86,3 87,7 3467,4 1,6 23,7
  • Beispiel 13
  • 13.1 Erzeugung eines dreifach targetierenden Anti-TNF/Anti-VEGF/Anti-EGFR-mAbdAb
  • Ein dreifach targetierender mAb wurde mit molekularbiologischen Standardtechniken nach der Vorgehensweise zum Einfügen von mAb-V-Domänen kodierenden Bereichen zwischen dAb und konstanten Bereichen der beiden Ketten konstruiert. Für die Leichtkette wurde der Anti-EGFR-dAb DOM16-39-542 zuvor in eine Expressionskassette mit SalI und BsiWI-Stellen (15) kloniert, um eine dAb-Ck-Kette zu produzieren. Zur Produktion der mAbdAb-Leichtkette wurde der mAb-VL-Bereich durch eine PCR an beiden Enden mit BsiWI kodierenden Primern verstärkt. Das die dAb-Ck-Expressionskassette enthaltende Plasmid wurde mit BsiWI aufgeschlossen. Die mit BsiWI aufgeschlossene mAb-VL-Domäne wurde hineinligiert, um die mAbdAb-Leichtkette mit einem 'TVAAPS'-Linker zwischen den beiden variablen Domänen zu produzieren.
  • Auf identische Weise wurde die mAbdAb-Schwerkette produziert, wobei der durch PCR verstärkte mAb-VH-Bereich mit NheI-Enden in einen mit NheI aufgeschlossenen dAb-Schwerkettenvektor zwischen dem dAb (DOM15-26) und CH1 (60) mit einem 'ASTKGPS'-Linker zwischen den beiden variablen Domänen ligiert wird.
  • Sequenzverifizierte Klone (Aminosäure-SEQ-ID-NR.: 78 und 79 für die Schwerkette bzw. Leichtkette) wurden selektiert und mit Qiagen Mega Prep Kits nach Herstellerprotokollen in großem Umfang hergestellt. mAbdAbs wurden in Säugerzellen mit Techniken der transienten Transfixierung durch Ko-Transfizierung der Leicht- und Schwerkette exprimiert.
  • 13.2 Reinigung eines dreifach targetierenden Anti-TNF/Anti-VEGF/Anti-EGFR-mAbdAb
  • Das Anti-TNF/Anti-VEGF/Anti-EGFR-mAbdAb-Konstrukt wurde aus dem geklärten Expressionsüberstand mittels Protein-A-Affinitätschromatographie nach feststehenden Protokollen gereinigt. Konzentrationen von gereinigten Proben wurden durch Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtextinktion bei 280 nm ermittelt. Eine SDS-PAGE-Analyse (61) der gereinigten Probe zeigt die nichtreduzierte Probe bei ~190 kDa, während die reduzierte Probe zwei Banden bei 35 und 60 kDa aufweist, die der mit dem dAb erweiterten Leichtkette bzw. der mit dem dAb erweiterten Schwerkette entsprechen.
  • 13.3 Bindungsaffinitäten des dreifach targetierenden Anti-TNF/Anti-VEGF/Anti-EGFR-mAbdAb
  • Die Bindungsaffinitäten an VEGF, EGFR und TNF wurden nach der Beschreibung in den Verfahren 12 bzw. 14 ermittelt Die Assay-Daten wurden mit der GraphPad Prism Software analysiert. Die Stärkewerte wurden mit einer S-förmigen Dosisantwortkurve bestimmt und mit einem Kurvenermittlungsmodell auf die beste Übereinstimmung gebracht. Die Anti-VEGF-Potenz (62) dieses mAbdAb wurde mit 1,885 mM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-VEGF-mAb, einen EC50-Wert von 0,145 nM ergab.
  • Im Anti-TNF-Bioassay (63) lag die Stärke bei 87 pM, während ein monoklonaler Anti-TNF-Kontrollantikörper einen EC50 von 104 pM erzeugte. Im Anti-EGFR-Assay (64) erzeugte der dreifach targetierende mAbdAb ~20% Hemmung bei ~300 nM. Während die EC50-Werte für die VEGF und TNF-Bindung berechnet wurden, wurde für die EGFR-Bindung keine Vollkurve zur Berechnung des EC50-Wertes erzeugt.
  • Beispiel 14 IGF-1R/VEGF-mAbdAb
  • 14.1 Konstruktion des IGF-1R/VEGF-mAbdAb
  • Variable Schwer- und Leichtgensequenzen von Anti IGF-1R wurden ursprünglich de novo aus einer PCR von überlappenden Oligonukleotiden aufgebaut. Diese Bereiche wurden mit molekularbiologischen Standardtechniken in einem Säugerexpressionsvektor an konstante Bereiche eines humanen IgG1 oder Kappa angebracht. Die Gensequenz für einen VEGF-Domänenantikörper wurde gleichermaßen durch eine PCR mit überlappenden Oligonukleotiden konstruiert und an das 3'-Ende entweder der Schwerketten- oder der Leichtkettengene der oben beschriebenen Anti-IGF-1R-Komponenten angebracht. Die Fusion umfasste entweder zwei Aminosäure-(GS)-Linker oder 8 Aminosäure-(TVAAPSGS)-Linker zwischen den Komponenten Antikörper und Domänenantikörper. Schwer- und Leichtkette des Antikörpers wurden auch ohne die Domänenantikörper- und Linkersequenzen erzeugt. Es wurden sequenzverifizierte Klone selektiert und mit dem Zubereitungs-Kit Endofree Qiagen Maxi nach Herstelleranleitung in großem Umfang DNA-Präparate hergestellt.
  • In den Sequenzen mit den SEQ-ID-Nummern: 108, 109, 111 und 112 ist die Position der Linkersequenz zwischen Antikörper und Domänenantikörper unterstrichen dargestellt. Alternative Varianten können durch Entfernen des Linkers als Ganzes oder durch Verwendung anderer Linker konstruiert werden. Beispiele für andere geeignete Linker werden in SEQ-ID-NR.: 6 und 8 bis 11 angegeben. Tabelle 18 führt eine Liste der konstruierten und exprimierten Antikörper an. Table 18 – Konstruierte und getestete Antikörper
    Kennung Alternativbezeichnungen Antikörper Domänenantikörper Linker SEQ-D-NR. für die Schwerkette SEQ-D-NR. für die Leichtkette Fusionsstelle
    BPC1603 381H TVAAPSGS 593, DMS4019 Anti-IGF-1R Antikörper H0L0 Dom15-26-593 Anti-VEGF TVAAPS GS 108 113 C-Terminal der Schwerkette
    BPC1604 381H GS 593, DMS4020 Anti-IGF-1R Anti-körper H0L0 Dom15-26-593 Anti-VEGF GS 109 113 C-Terminal der Schwerkette
    BPC1605 381L TVAAPSGS 593, DMS4021 Anti-IGF-1R Anti-körper H0L0 Dom15-26-593 Anti-VEGF TVAAPS GS 110 111 C-Terminal der Leichtkette
    BPC1606 381L GS 593, DMS4022 Anti-IGF-1R Anti-körper H0L0 Dom15-26-593 Anti-VEGF GS 110 112 C-Terminal der Leichtkette
  • Beispiel 14.2: Expression, Reinigung und SEC-Profil des IGF-1R/VEGF-mAbdAb
  • Kombinationen von in transienten Transfizierungen von HEK293-6E exprimierten Schwer- und Leichtkettenvektoren. Es werden kurz gesagt 50 ml HEK293-6E-Zellen in einer Konzentration von 1,5 × 106 mit 25 μg Schwerketten- und 25 μg Leichtkettenplasmid transfiziert, die zuvor mit 293fectin-Reagenz (Invitrogen Nr. 51-0031) inkubiert wurden. Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2 und 95% relativer Luftfeuchtigkeit in einen Schüttelinkubator gegeben. Nach 24 Stunden wurde Trypton-Nährmedium zugegeben und die Zellen weitere 72 Stunden lang gezüchtet. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren und nachfolgender Filterung durch einen 0,22 μm-Filter gewonnen. Das exprimierte Protein wurde mit einer Protein A-Sepharosesäule gereinigt und in einer PCS dialysiert. Das gereinigte Protein wurde mit Ausschlusschromatographie (SEC) analysiert und ist in 65 dargestellt.
  • Ein IGF-1R-Antikörper (HOLD) wurde in den folgenden Assays als Komparator verwendet Dieses Molekül hat die in SEQ-ID-NR: 110 angegebene Schwerkettensequenz und die in SEQ-ID-NR.: 113 angegebene Leichtkettensequenz.
  • Ein weiterer mAbdAb mit irrelevanter Spezifität wurde in den folgenden Assays als Komparator verwendet Dieses Molekül hat die in SEQ-ID-NR: 87 angegebene Schwerkettensequenz und die in SEQ-ID-NR.: 13 angegebene Leichtkettensequenz und wird als BPC1601 bezeichnet.
  • Beispiel 14.3: IGF-1R-Bindungs-ELISA
  • Es wurde ein Bindungs-ELISA zum Testen der Bindung der gereinigten Anti-IGF-1R/VEGF-mAbdAbs an IGF-1R durchgeführt. Kurz gesagt wurden mit 1 μg/ml Antipolyhistidin (AbCam AB9108) beschichtete ELISA-Schalen mit Blocklösung (4% BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung) mit 400 ng/ml an rekombinantem humanem IGF-1R-his Tag (R&D Systems 305-GR) in PBS beladen. Die Schale wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie in TBS + 0,05% Tween 20 (TEST) gewaschen wurde. Es wurden verschiedene Konzentrationen von gereinigten mAbdAbs sowie ein monoklonaler Anti-IGF-1R-Antikörper (HOLD) und ein irrelevanter mAbdAb (BPC1601) in Blocklösung zugegeben. Die Schale wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie in TEST gewaschen wurde. Die Bindung wurde durch Zugabe eines mit Peroxidase markierten antihumanen Kappa-Leichtkettenantikörpers (Sigma A7164) in einer Verdünnung von 1/1000 in Blocklösung ermittelt. Die Schale wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie in TEST gewaschen wurde. Die Schale wurde durch Zugabe von OPD-Substrat (Sigma P9187) entwickelt, wobei die Farbentwicklung durch Zugabe von 3M H2SO gestoppt wurde. Mit einem Plattenleser wurde die Extinktion bei 490 nm abgelesen und danach die mittlere Extinktion berechnet.
  • Die Ergebnisse des Bindungs-ELISAs sind in 66 dargestellt und bestätigen, dass alle getesteten Varianten von IGF1R-VEGF mAbdAb (BPC1603-1606) Bindung an IGF-1R in mit dem Anti-IGF-1R-Antikörper vergleichbaren Umfang aufweisen. Die EC50-Werte wurden mit Cambridgesoft Bioassay-Software berechnet und lauten: HOLD (0,1797 μg/ml)), BPC1603 (0,1602 μg/ml), BPC1604 (0,1160 μg/ml), BPC1605 (0,1975 μg/ml), BPC1606 (0,1403 μg/ml). Der irrelevante bispezifische Kontrollantikörper BPC1601 zeigte nun nachweisbare Bindung an IGF-1R.
  • Beispiel 14.4: VEGF-Bindungs-ELISA
  • Es wurde ein Bindungs-ELISA zum Testen der Bindung der gereinigten bispezifischen Anti-IGF-1R/VEGF-mAbdAbs an VEGF durchgeführt. ELISA-Schalen wurden mit 400 ng/ml rekombinantem humanem VEGF (GSK) in PBS beschichtet und dann mit Blocklösung (4% BSA in TBS) blockiert. Verschiedene Konzentrationen von gereinigten, in Blocklösung verdünnten mAbdAbs wurden zugegeben und das mAbdAb-Konstrukt BPC1601 als negative Kontrolle einbezogen. Die Schale wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie in TEST gewaschen wurde. Die Bindung wurde durch Zugabe eines mit Peroxidase markierten antihumanen Kappa-Leichtkettenantikörpers (Sigma A7164) in einer Verdünnung von 1/1000 in Blocklösung ermittelt. Die Schale wurde 40 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie in TEST gewaschen wurde. Die Schale wurde durch Zugabe von OPD-Substrat (Sigma P9187) entwickelt, wobei die Farbentwicklung durch Zugabe von 3M H2SO gestoppt wurde. Mit einem Plattenleser wurde die Extinktion bei 490 nm abgelesen und danach die mittlere Extinktion berechnet.
  • Die Ergebnisse des Bindungs-ELISAs sind in 67 dargestellt und bestätigen, dass alle vier Anti-IGF1R-VEGF mAbdAbs (BPC1603-1606) an immobilisiertes VEGF binden können. Die offenbar geringere Bindungsaktivität von BPC1605 und BPC1606 kann auf Interferenz zwischen dem (am C-Terminal der Leichtkette angeordneten) Domänenantikörper und dem Detektionsantikörper zurückzuführen sein. Die EC50-Werte wurden mit Cambridgesoft Bioassay-Software berechnet und lauten: BPC1603 (0,044 μg/ml), BPC1604 (0,059 μg/ml), BPC1605 (0,571 μg/ml). Es ist wegen der geringeren Antwortwerte nicht möglich, einen genauen EC50-Wert für BPC1606 anzugeben. Der Anti-IGF-R-Antikörper HOLD und der irrelevante Kontroll-mAbdAb BPC1601 zeigten nunmehr nachweisbare Bindung an VEGF.
  • Beispiel 14.5: Kinetik der Bindung an VEGF
  • Ein monoklonaler Mausantikörper gegen den humanen IgG (Biacore BR-1008-39) wurde durch primäre Aminkopplung an einen CM5-Biosensor-Chip immobilisiert. Die Antikörperkonstrukte wurden mit dieser Oberfläche eingefangen. Nach dem Einfang wurde VEGF über die Oberfläche geleitet, die dann mit 3M MgCl2 regeneriert wurde.
  • Die zum Erzeugen der Kinetik verwendeten VEGF-Konzentrationen betrugen 256, 64, 16, 4, 1 und 0,25 nM, mit einer Nur-Puffer-Injektion über der eingefangenen Oberfläche zum doppelten Referenzieren. Die Experimente wurden auf einem Biacore T100 mit 1 × HBS-EP Puffer (BR-1006-69) bei 25°C durchgeführt. Die Daten wurden in ein der Analysesoftware des Geräts inhärentes 1:1-Modell eingepasst. Die in Tabelle 19 angegebenen Daten stammen aus zwei unabhängigen Experimenten. Tabelle 19: Kinetik der Bindung an humanes VEGF
    Experiment 1 Experiment 2
    Konstrukt ka kd KD (nM) ka kd KD (nM)
    BPC1603 2,398E+6 2,762E–4 0,115 1,334E+6 3,497E–4 0,262
    BPC1604 9,933E+5 3,092E–4 0,311 5,806E+5 3,266E–4 0,563
    BPC1605 1,599E+6 2,161E–4 0,135 1,089E+6 2,727E–4 0,251
    BPC1606 4,343E+5 1,573E–4 0,362 2,717E+5 1,607E–4 0,591
  • Beispiel 14.6: Hemmung der VEGF-Bindung an den Rezeptor
  • Die Aktivität der mAbdAbs wurde mit einem VEGF-Rezeptorbindungs-Assay wie in Verfahren 12 beschrieben gemessen. Die in diesem Assay erhaltenen IC50-Werte für die Bindung von VEGF an VEGFR2 lauten:
    BPC1603 (0,037 nM)
    BPC1604 (0,010 nM)
    BPC1605 (0,167 nM)
    BPC1606 (0,431 nM)
  • Diese Ergebnisse bestätigen, dass alle vier Antigen bindenden Konstrukte die Ligandenbindung an den Rezeptor hemmen.
  • Beispiel 14.7: Hemmung der IGF-1R-Rezeptorphosphyrilierung
  • 3T3/LISN c4 Zellen wurden in einer Dichte von 10.000 Zellen/Mulde in 96-Mulden-Schalen über Nacht in komplettem DMEM (DMEM-Hepes-Modifikation + 10%FCS) inkubiert. Gereinigte mAbdAbs wurden zu den Zellen gegeben und 1 Stunde lang inkubiert. rhlGF-1 wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml zu den behandelten Zellen gegeben, und dann weitere 30 Minuten lang inkubiert, um die Rezeptorphosphorylierung zu simulieren . Die Medien wurden aspiriert und die Zellen dann durch Zugabe von RIPA-Lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM TrisHCl, 6 mM Na Deoxycholat, 1% Tween 20) plus Proteasehemmer-Cocktail (Roche 11 697 498 001) lysiert. Die Platten wurden über Nacht gefroren. Nach dem Auftauen wurde das Lysat aus den Mulden in eine 96-Mulden-ELISA-Schale transferiert, die mit Anti-IGF-1R-Einfangantikörper 2B9 (GSK) in einer Konzentration von 2 μg/ml beschichtet und mit 4% BSA/TBS blockiert war. Die Schale wurde mit TEST (TBS + 0,1%Tween 20) gewaschen, und ein mit Europium markierter Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66), verdünnt im Verhältnis 1/2500 in 4%BSA/TBS, wurde ebenfalls zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubationszeit wurde die Schale gewaschen und DELFIA Enhancement-Lösung (PerkinElmer 1244-105) zugegeben. Nach 10 Minuten Inkubationszeit wurde die Rezeptorphosphorylierung mit einem Plattenleser ermittelt, der für die Messung der zeitlich aufgelösten Fluoreszenz (TRF) des Europiums eingerichtet war.
  • Die Ergebnisse des Experiments sind in den 68 und 69 dargestellt. Die Ergebnisse bestätigen, dass die mAbdAbs BPC1603-1606 die IGF-I vermittelte Rezeptorphosphorylierung auf vergleichbarer Stufe wie der monoklonale Anti-IGF-1R-Antikörper HOLD hemmen können. Ein irrelevanter Antikörper (markiert als IgG1, Sigma 15154) zeigte in diesem Assay keine Aktivität.
  • Beispiel 15 Anti-CD20/IL-13 Antigen-bindendes Protein
  • Beispiel 15.1: Molekularbiologie
  • Die Säugetier-Expressionsvektoren, die die schweren und leichten Kettensequenzen eines anti-CD20 mAk, dargestellt in SEQ ID-NR. 117 und 120 kodieren, wurden de novo mittels eines PCR-basierten Ansatzes und Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert. Bi-spezifische anti-CD20mAb-anti-IL13dAb schwere und leichte Ketten wurden durch Klonen der Sequenzen gebaut, die anti-CD20 mAk schwere und leichte variable Regionen in Säugetier-Expressionsvektoren kodieren, welche humane Antikörper-konstante Regionen fusioniert an einen anti-humanen IL-13-Domäne-Antikörper (DOM10-53-474) enthalten.
  • Die mAbdAb-Expressionskonstrukte wurden in CHOE1a-Zellen transfiziert. Der Überstand wurde geerntet und dann der Antikörper mit immobilisiertem Protein A gereinigt und durch Messung der Absorption bei 280 nm quantifiziert. Die konstruierten und getesteten mAbdAbs (und der anti-CD20 Kontroll-mAk) sind in Tabelle 20 aufgeführt. Tabelle 20
    Identifizierer Alternative Namen Antikörper Ziel Domäne Antikörper Linker Seq ID: für schwere Kette Seq ID: für leichte Kette Stelle der Fusion
    BPC1401 RituxanH-TVAAPSGS-DOM474 CD20 DOM10-53-474 TVAAPSGS 116 117 Schwere Kette C-Term.
    BPC1402 RituxanH-GS-DOM474 CD20 DOM10-53-474 GS 118 117 Schwere Kette C-Term.
    BPC1403 RituxanL-TVAAPSGS-DOM474 CD20 DOM10-53-474 TVAAPSGS 120 119 Leichte Kette C-Term.
    BPC1404 RituxanL-GS-DOM474 CD20 DOM10-53-474 GS 120 121 Leichte Ketten C-Term.
    anti-CD20 mAb Rituxan CD20 - 120 117
  • Beispiel 15.2: Kinetik der Bindung an humanes IL-13
  • Die Bindungsaffinität von mAbdAb Konstrukten für humanes IL-13 wurde durch BIAcoreTM Analyse bewertet. Die Analysen wurden mittels anti-human-IgG Capture durchgeführt. Kurz gesagt, anti-human IgG (Biacore-BR 1008-1039) wurde durch primäre Aminkupplung auf einen CM5 Chip gekoppelt. MAbdAb Konstrukte wurden anschließend auf dieser Fläche erfasst und humanes IL-13 (bei GSK hergestellt und aufgereinigt) bei definierten Konzentrationen übergeführt. Die Oberfläche wurde mit 3M MgCl2 zurück auf die anti-humane IgG-Oberfläche regeneriert. Diese Behandlung hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit, Antikörper für ein späteres IL-13 Bindungsereignis zu erfassen. Die Läufe wurden bei 25°C mit HBS-EP-Puffer auf der BIAcoreTM T100 Maschine durchgeführt. Die Daten wurden mittels der Auswertesoftware des Gerät analysiert und auf das 1:1-Bindungsmodell angepasst. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 48 dargestellt, die bestätigt, dass für alle mAbdAb Konstrukte, die Kinetik der Bindung an IL-13 vergleichbar ist. Tabelle 48 – Oberflächenplasmonresonanz(BiacoreTM)-Daten
    Name des Antikörpers Ka (M–1.s–1) kd (s–1) KD (nM)
    BPC1401 5,81 E+5 1,82 E–4 0,313
    BPC1402 8,52 E+5 3,05 E–4 0,358
    BPC1403 1,07 E+6 2,95 E–4 0,277
    BPC1404 4,99 E+5 5,08 E–4 1,02
    PascoH-474 GS entfernt 6,29 E+5 2,66 E–4 0,423
    anti-CD20 mAb Keine Bindung festgestellt
  • Die Bindung des mAb-tdAbs an CD20 wurde durch Flusszytometrie anhand einer CD20 positiven Zelllinie (Wein 133) beurteilt. Alle mAb-dAbs (BPC1401-BPC1404) und der anti-CD20 Kontrollantikörper zeigten eine dosisabhängige Erhöhung der mittleren Fluoreszenzintesität (MFI) (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 15.3: ADCC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper
  • Der ADCC-Assay basiert auf der veröffentlichten Methode von Boyd et al. (1995) J. Imm. Meth. 184: 29-38. Kurz gesagt, Raji-Zellen (Targets) wurden mit Europium wie folgt gelabelt. Die Zellen wurden geerntet, gezählt und auf eine endgültige Dichte von 1 × 107 in einem 15 ml Falcon-Röhrchen vorbereitet, einmal mit Hepes-Puffer gewaschen (50 mM HEPES, 83 mm NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2·H2O, pH 7,4). Die Zellen wurden pelletiert und 1 ml eiskalter Europium Labelling-Puffer (HEPES-Puffer plus 600 μM EuCl3, 3 mM DTPA und 25 mg/ml Dextransulfat) wurde zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Die Zellsuspension wurde kräftig zu Beginn des Labelling geschnippt und anschließend alle 10 Minuten während der 30 minütigen Inkubationszeit auf Eis. 10 ml eiskalter Reparatur-Puffer (Hepes-Puffer mit 294 mg/l CaCl2·2 H2O, 1,8 g/l D-Glukose, pH 7,4) wurde zugegeben und die Zellen weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, der Überstand dekantiert und zweimal mit Reparaturpuffer und dann noch einmal mit komplettem Medium gewaschen. Die gelabelten Zellen wurden dann gezählt und in serumfreiem Medium bei 2 × 105 Zellen/ml resuspendiert und auf Eis gelagert.
  • Humane gereinigte mononukleare Blutzellen (PBMCs oder Effektor-Zellen) wurden wie folgt hergestellt. 150 ml Vollblut wurde 10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert, um das Serum zu entfernen. Die Zellen wurden dann auf das Doppelte ihres ursprünglichen Volumens mit PBS (Invitrogen/Gibco, Nr. 14190) verdünnt. Accuspin Dichtegradientenröhren (Sigma, Nr. A2055-10EA) wurden durch Zugabe von 15 ml Lymphoprep (Axis Shield, Nr. NYC1114547) präpariert und für 1 Minute bei 1500 U/min zentrifugiert. 25 ml Blutsuspension wurde zu den Dichtegradientenröhrchen hinzugefügt und für 20 Minuten bei 2500 U/min mit ausgeschalteter Zentrifugenbremse zentrifugiert. Die obersten 10 ml des Überstands wurden verworfen. Der Rest (einschließlich der ”Buffy”-Schicht) wurde in ein sauberes, mit PBS aufgefülltes Röhrchen gegossen und bei 1500 U/mm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellpellets wurden gepoolt, einmal in RPMI-Medium gewaschen, zentrifugiert und gezählt. Effektorzellen wurden bei 5 × 106/ml in serumfreiem RPMI vorbereitet.
  • Die Testplatten wurden in Rundboden-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc 96 maxisorb Platte, Nr. 735-0199) wie folgt eingerichtet. Antikörper-Verdünnungen wurden in serumfreiem RPMI-Medium bei einer Ausgangskonzentration von ca. 12 μg/ml und elf weitere 3-fache Verdünnungen hergestellt. Mit dem Plattenlayout unten wurde 50 μl Antikörperprobe zu den entsprechenden Vertiefungen (nur Reihen BG) hinzugefügt, was 6 Wiederholungen pro Verdünnung ermöglichte. 50 μl RPMI-Medium wurde allen Vertiefungen in Reihe A und H hinzugefügt. 50 μl RPMI-Medium wurde zu allen Vertiefungen in den Medium-gelabelten Platten hinzugefügt. 50 μl rekombinantes humanes IL-13 g, verdünnt in RPMI-Medium auf 4 μg/ml (1 μg/ml Endkonzentration, GSK internes Material), wurde zu allen Vertiefungen in den + IL13-gelabelten Platten hinzugefügt. Alle Platten wurden bei 4°C für mindestens 30 Minuten inkubiert. 50 μl Europium-gelabelte Zielzellen wurden alle Platten hinzugefügt. 20 μl einer 10X Triton wurde zu allen Vertiefungen in Reihe H bei Platten hinzugefügt. Die Platten wurden für mindestens 30 Minuten bei 4°C inkubiert. 50 μl RPMI-Medium wurde zu allen Vertiefungen in den Spalten hinzugefügt, die nur als Ziele gelabelt waren. 50 μl PBMCs wurde zu allen Vertiefungen in Spalten mit dem Labelling Effektorziele hinzugefügt, um ein 25:1-Verhältnis zu schaffen. Die Platten wurden bei 1500 U/min für 3 Minuten und bei 37°C für 3-4 Stunden zentrifugiert. 200 μl Enhancement-Lösung (Wallac/Perkin Elmer, Katalog Nr. 1244-105) wurde zu jeder Vertiefung einer Nunc immunsorbierenden ELISA-Platte (eine ELISA-Platte für jede Testplatte) hinzugefügt. 20 μl Überstand wurde von der Assay-Platte auf die ELISA-Platte übertragen. Die ELISA-Platten wurden bei Raumtemperatur auf Schüttler für mindestens 30 Minuten inkubiert oder über Nacht bei 4°C gelagert. Die Europium-Freisetzung wird mit zeitverzögerter Fluorimetrie (Wallac Victor-Reader) gemessen. Spontane Lyse = Messung von aus den Zellen und dem Medium allein freigesetztem Europium·Maximale Lyse = unspezifische Lyse von Zielzellen durch Zugabe von Triton-X100 (nichtionisches Detergens).
  • Figure 01280001
  • Der ADCC-Assay wurde zu zwei separaten Zeitpunkten unter Verwendung zweier unterschiedlicher Spender PBMCs durchgeführt. Die Ergebnisse aus einem repräsentativen Test sind in den und dargestellt. Darüber hinaus wurde ein ähnlicher ADCC-Assay mit einem kürzeren Dosisbereich zu einem anderen Zeitpunkt unter Verwendung anderer Spender PBMCs durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in und dargestellt.
  • Beispiel 15.4: CDC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper
  • WEIN-Zellen (Targets) wurden wie folgt mit Europium gelabelt. Kurz gesagt, die Zellen wurden geerntet, gezählt und auf eine endgültige Dichte von 1 × 107 in einem 15 ml Falcon-Röhrchen vorbereitet, einmal mit Hepes-Puffer gewaschen (50 mM HEPES, 83 mm NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2·H2O, pH 7,4). Die Zellen wurden pelletiert und 1 ml eiskalter Europium Labelling-Puffer (HEPES-Puffer plus 600 μM EuCl3, 3 mM DTPA und 25 mg/ml Dextransulfat) wurde zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Die Zellsuspension wurde kräftig zu Beginn des Labelling geschnippt und anschließend alle 10 Minuten während der 30 minütigen Inkubationszeit auf Eis. 10 ml eiskalter Reparatur-Puffer (Hepes-Puffer mit 294 mg/l CaCl2·2 H2O, 1,8 g/l D-Glukose, pH 7,4) wurde zugegeben und die Zellen weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, der Überstand dekantiert und zweimal mit Reparaturpuffer und dann noch einmal mit komplettem Medium gewaschen. Die gelabelten Zellen wurden dann gezählt und in serumfreiem Medium bei 2 × 105 Zellen/ml resuspendiert und auf Eis gelagert.
  • Serum wurde aus Vollblut abzentrifugiert, das von internen Spendern gesammelt wurde. Die Hälfte der Probe wurde durch Hitzebehandlung bei 56°C für 30 Minuten inaktiviert. Antikörperproben wurden in serumfreiem RPMI-Medium verdünnt, beginnend bei 12 μg/ml mit fünf weiteren 3-fachen Verdünnungen. 50 μl Antikörperprobe wurde zu den entsprechenden Vertiefungen nur in den Reihen BG hinzugefügt (gemäß dem Plattenlayout unten). 50 μl RPMI-Medium wurde zu allen Vertiefungen in den Spalten 1 bis 6 hinzugefügt. Wo angezeigt, wurde 50 μl rekombinantes humanes IL-13 (bei 4 μg/ml in RPMI-Medium) zu allen Vertiefungen in den Spalten 7-12 hinzugefügt. Die Platten wurden bei 4°C für mindestens 30 Minuten inkubiert. 50 μl Europium gelabelte Zielzellen wurde zu allen Platten hinzugefügt und die Platten wurden bei 4°C für mindestens 30 Minuten inkubiert. 50 μl Serum (aktiv oder Hitze-inaktiviert) wurde zu den entsprechenden Vertiefungen hinzugefügt (siehe Plattenlayout unten). Die Platten wurden bei 37°C im Inkubator für 2-3 Stunden inkubiert und dann bei 1500 U/min für 3 Minuten zentrifugiert. 200 μl Enhancement-Lösung (Wallac/Perkin Elmer, Katalog Nr. 1244-105) wurde zu jeder Vertiefung einer Nunc immunsorbierenden ELISA-Platte (eine ELISA-Platte für jede Testplatte) hinzugefügt. 20 μl Überstand wurde von der Assay-Platte auf die ELISA-Platte übertragen. Die ELISA-Platten wurden bei Raumtemperatur auf Schüttler für mindestens 30 Minuten inkubiert oder über Nacht bei 4°C gelagert. Die Europium Freisetzung wird mit zeitverzögerter Fluorimetrie (Wallac Victor-Reader) gemessen. Spontane Lyse = Messung von aus den Zellen und dem Medium allein freigesetztem Europium. Maximale Lyse = unspezifische Lyse von Zielzellen durch Zugabe von Triton-X100 (nichtionisches Detergens).
  • Figure 01300001
  • Das CDC-Assay wurde zu drei separate Zeitpunkten mit drei verschiedenen Spendersera durchgeführt. Die Ergebnisse aus einem repräsentativen Test sind in den und dargestellt und zeigen, dass die CDC-Aktivität der Antikörpersproben ohne IL-13 vergleichbar ist. Bei einem Überschuss an IL-13 ist die CDC-Aktivität der Antikörperproben BPC1401 und BPC1402 (Domäne-Antikörper mit der schweren Kette fusioniert) reduziert, während die CDC-Aktivität von BPC1403 und BPC1404 (Domäne-Antikörper mit der leichten Kette fusioniert) von der Anwesenheit von IL-13 weitgehend unberührt ist.
  • Beispiel 16
  • 16.1 Design und Bau von Antigen-bindenden Proteine mit Epitop-bindenden Domänen, die aus alternativen Gerüsten zusammengesetzt sind Fünf alternative Gerüste, die unten aufgeführt sind, wurden mit monoklonalen Antikörpern kombiniert, um mAb-alternative Gerüst-bispezifische Moleküle zu bilden:
    • • Anti VEGF Tear Lipocalin (TLPC)
    • • Anti HER2 Affibody (Affi)
    • • Anti HER2 DARPin (DRPN)
    • • Anti Hühnereiweiß-Lysozym (Narv)
    • • Anti-RNase A Kamelid VHH
  • Die Proteinsequenzen von TLPC (für weitere Informationen siehe US2007/0224633 ), Affi (für weitere Informationen siehe WO2005003156A1 ), DRPN (für weitere Informationen siehe Zahnd, C. et al. (2007), J. Mol. Biol., 369, 1015-1028) und Narv (für weitere Informationen siehe US20050043519A ) wurden zu DNA rückübersetzt und Codon-optimiert. Eine BamHI-Stelle am N-Terminus und EcoR1-Stelle am C-Terminus wurden bei jedem dieser vier alternativen Gerüste aufgenommen, um die Klonierung zu erleichtern.
  • DNA-Fragmente, die die vier letzten alternativen Gerüst-DNA-Sequenzen kodieren, wurden de novo mit einer PCR-basierten Strategie und überlappenden Oligonukleotiden konstruiert. Die TLPC, Affi und DRPN PCR-Produkte wurden in Säugetier-Expressionsvektoren mit der schweren Kette von HOLD, einem Anti-hIGF-1R Antikörper geklont. Die resultierenden DNA-Sequenzen kodieren die alternativen Gerüste, fusioniert auf den C-Terminus der schweren Kette über einen TVAAPSGS-Linker oder GS-Linker. Das NAR V PCR-Produkt wurde in Säugetier-Expressionsvektoren geklont, die DNA enthalten, die die schwere Kette von Pascolizumab (einem Anti-IL-4 Antikörper) kodiert. Die resultierende DNA-Sequenz kodiert das NAR V fusioniert auf den C-Terminus der schweren Kette über einen GS-Linker.
  • Eine Anti-RNAse A Kamelid VHH DNA-Sequenz wurde durch PCR geändert, sodass eine BamHI-Stelle am 5'-Ende und eine EcoR1-Stelle am 3'-Ende aufgenommen wurde, um die Klonierung zu erleichtern. Das PCR-Produkt wurde in Säugetier-Expressionsvektoren mit der schweren Kette von Pascolizumab, einem Anti-IL4-Antikörper, kloniert. Die resultierende DNA-Sequenz kodiert einen Kamelid VHH Linker, fusioniert auf den C-Terminus der schweren Kette über einen GS-Linker.
  • Tabelle 21 unten ist eine Zusammenfassung der Antigen-bindenden Proteine, die konstruiert wurden. Tabelle 21
    Antikörper-ID Beschreibung SEQ ID Nr.: Aminosäuresequenz
    BPC1803 antiIGF1R schwere Kette-GS-TLPC 123
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1804 antiIGF1R schwere Kette-TVAAPSGS-TLPC 125
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1805 antiIGF1R schwere Kette-GS-AFFI 126
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1806 antiIGF1R schwere Kette-TVAAPSGS-AFFI 127
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1807 antiIGF1R schwere Kette-GS-DRPN 128
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1808 antiIGF1R schwere Kette-TVAAPSGS-DRPN 129
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1809 Anti IL-4 schwere Kette-GS-anti RNAse A camelid VHH 130
    Anti IL-4 leichte Kette 15
    BPC1816 Anti IL-4 schwere Kette-GS-NARV 131
    Anti IL-4 leichte Kette 15
  • Die Expressionsplasmide, die die schweren und leichten Ketten der Antigenbindenden Proteine in Tabelle 21 kodieren, wurden vorübergehend in HEK 293-6E Zellen mittels 293fectin (Invitrogen, 12347019) transfiziert. Ein Trypton-Futtermittel wurde jeder der Zeltkulturen am selben Tag oder am folgenden Tag hinzugefügt und der Überstand wurden nach ca. 2-6 Tagen nach der anfänglichen Transfektion geerntet. Das Antigen-bindende Protein wurde aus dem Überstand mit einer Protein A-Säule gereinigt wurde, bevor es in Bindungsstudien getestet wurde.
  • 16.2: rhIGF-1R-bindendes ELISA
  • Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 1 μg/ml anti-His-Tag-Antikörper (Abcam, ab9108) in PBS beschichtet und über Nacht bei 4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. 0,4 μg/ml der rhIGF-1R (R & D Systems) wurde zu jeder Vertiefung mit 50 μl pro Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend gewaschen. Die gereinigten Antigen-bindenden Proteine/Antikörper wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen. Ziegen-anti-human Kappaleichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • Die , und zeigen die ELISA-Ergebnisse und bestätigen, dass Antigen-bindende Proteine BPC1803-BPC1808 sich an rekombinantes humanes IGF-1R binden. Die Anti-IGF-1R monoklonalen Antikörper HOLD zeigten auch eine Bindung an rekombinantes humanes IGF-1R, während die negative Kontroll-Antikörper (Sigma 15154) keine Bindung an IGF-1R zeigten.
  • 16.3: VEGF-bindendes ELISA
  • Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 0,4 μg/ml hVEGF165 (R & D Systems) beschichtet und über Nacht bei +4°C inkubiert. Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Die gereinigten Antigenbindenden Proteine/Antikörper wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen. Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • Die zeigt die Ergebnisse des VEGF-bindenden ELISA und bestätigt, dass bispezifische Antikörper BPC1803-BPC1804 sich an humanes VEGF binden. Ein anti-VEGF bispezifischer Antikörper (BPC1603) wurde bei diesem Test als positive Kontrolle verwendet und zeigte eine Bindung an VEGF. Im Gegensatz dazu zeigte der Anti-IGF-1R monoklonale Antikörper HOLD keine Bindung an humanes VEGF.
  • 16.4: HER2-bindendes ELISA
  • Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 1 μg/ml HER2 (R&D Systems) beschichtet und über Nacht bei +4°C inkubiert. Die Platten wurden zweimal mit Trisgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Die gereinigten Antigen-bindenden Proteine/Antikörper wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen. Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • Die und zeigen die Ergebnisse des HER2-bindenden ELISA und bestätigen, dass die Antigen-bindenden Proteine BPC1805, BPC1806, BPC1807 und BPC1808 sich an rekombinantes humanes HER2 binden. Herceptin wurde als positive Kontrolle in diesem Assay verwendet und zeigte eine Bindung an HER2. Im Gegensatz zeigte der Anti-IGF-1R monoklonale Antikörper HOLD keine Bindung an humanes HER2.
  • 16.5: IL-4-bindendes ELISA
  • Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 5 μg/ml humanem IL-4 in PBS beschichtet und über Nacht bei +4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Trisgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Die gereinigten Antigen-bindenden Proteine/Antikörper wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen. Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper (Sigma, A7164) wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • zeigt die ELISA-Ergebnisse und bestätigt, dass das Antigen-bindende Protein BPC1809 sich in einer Höhe, die mit dem anti-IL-4 monoklonalen Antikörper, Pascolizumabist, vergleichbar ist, an humanes IL-4 bindet. Der negative Kontrollantikörper (Sigma 15154) zeigte keine Bindung an IL-4.
  • zeigt die ELISA-Ergebnisse und bestätigt, dass das Antigen-bindende Protein BPC1816 sich in einer Höhe, die mit dem anti-IL-4 monoklonalen Antikörper, Pascolizumabist, vergleichbar ist, an humanes IL-4 bindet. Der negative Kontrollantikörper (Sigma 15154) zeigte keine Bindung an IL-4.
  • 16.6: RNAse A-bindendes ELISA
  • 50 μl von 1 μg/ml RNAse A (Qiagen, 19.101), die in verdünntem PBS worden war, wurde in jede Vertiefung einer Costar-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Platte wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, dann mit PEST gewaschen und anschließend 200 μl von 4% BSA/PBS-Block in jede Vertiefung hinzugegeben. Die Platte wurde für 1 Stunde inkubiert und vor der Zugabe der Proben gewaschen. Gereinigte Antikörper und Antigen-bindendes Protein BPC1809 wurden bei einer Konzentration von 2 μg/ml in Vertiefungen der Spalte 1, dann seriell verdünnt 1 in 2 über die Platte im Block zugegeben. Die Platte wurde für 1 Stunde inkubiert und anschließend gewaschen. Es wurde 50 μl pro Vertiefung eines Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischen Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Sigma, A7164) in einer Verdünnung von 1 zu 1000 hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde inkubiert und anschließend gewaschen. 50 μl der OPD wurde in jede Vertiefung gegeben und die Reaktion wurde nach 15-30 Minuten mit 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorbanz wurde bei 490 nm mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls gelesen.
  • zeigt die Ergebnisse des RNase A-bindenden ELISA und bestätigt, dass gereinigter humaner monoklonaler Antikörper-Kamelid VHH bispezifischer Antikörper BPC1809 eine Bindung an RNAse A zeigt. Im Gegensatz dazu zeigten sowohl die IL-4 monoklonalen Antikörper Pascolizumab als auch die negative Kontrolle (Sigma 15154) keine Bindung an RNase A
  • 16.7: HEL-bindendes ELISA
  • Eine Hochbindungsplatte mit 96 Vertiefungen wurde mit 5 μg/ml HEL (Hühnerei-Lysozym, Sigma 16876) in PBS beschichtet und über Nacht bei +4°C gelagert. Die Platte wurde zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Die gereinigten Antikörper wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurde die Platte gewaschen. Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper (Sigma, A7164) wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • zeigt die Ergebnisse der HEL-Bindung ELISA und bestätigt, dass gereinigter humaner monoklonaler Antikörper-NAR V bispezifischer Antikörper BPC1816 sich an HEL bindet. Im Gegensatz dazu zeigte der IL-4 monoklonale Antikörper Pascolizumab keine Bindung an HEL.
  • Beispiel 17
  • 17.1 Design und Bau von Antigen-bindenden Proteinen mit Epitop-bindenden Domänen, die aus Adnectin bestehen
  • CT01 Adnectin ist spezifisch für VEGFR2 (für weitere Informationen siehe WO2005/056764 ). Die CT01-Adnectin-Proteinsequenz wurde zu DNA rückübersetzt und Codon-optimiert. Eine BamHI-Stelle am N-Terminus und EcoR1-Stelle am C-Terminus wurden aufgenommen, um die Klonierung zu erleichtern.
  • DNA-Fragmente, die die endgültige CT01-DNA-Sequenz kodieren, wurden de novo mit einer PCR-basierten Strategie und überlappenden Oligonukleotiden konstruiert. Das PCR-Produkt wurde in Säugetier-Expressionsvektoren mit der schweren Kette von HOLD (einem Anti-hIGF-1R Antikörper) geklont, was es ermöglichte, dass das Adnectin entweder über einen GS-Linker oder einen TVAAPSGS-Linker auf den C-Terminus der schweren Kette fusioniert. Protein-Sequenzen der schweren und leichten Ketten der IGF-1R-VEGFR2 bispezifisch sind in den SEQ ID-Nummern 124, 113 und 133 angegeben.
  • Eine weitere Adnectin-Proteinsequenz für ein Anti-TNF-α-Adnectin (für weitere Informationen siehe US20080139791 ) wurde zu DNA rückübersetzt, Codon-optimiert und modifiziert, um die terminalen BamHI- und EcoR1-Stellen aufzunehmen, bevor sie mit der zuvor beschriebenen überlappenden Oligonukleotid-PCR-Methode konstruiert wurde. Das PCR-Produkt wurde in Säugetier-Expressionsvektoren mit DANN geklont, die die schwere Kette von Pascolizumab (einem Anti-IL-4-Antikörper) enthielt, was es ermöglichte, dass die das Anti-TNF-α-Adnectin kodierende DNA entweder über einen GS-Linker oder einen TVAAPSGS-Linker auf den C-Terminus der schweren Kette fusionierte. Protein-Sequenzen der schweren und leichten Ketten des IL-4-TNF-α bispezifisch sind in SEQ ID-Nummern 146, 147 und 15 angegeben.
  • Antigen-bindende Proteine mit dem TNF-α-spezifischen Adnectin, das am C-Terminus der schweren Kette eines monoklonalen IL-13-Antikörpers fusionierte, wurden ebenfalls entwickelt. Beispiel-Proteinsequenzen sind in SEQ ID-Nummern 134, 13 und 135 angegeben. Darüber hinaus wurden bispezifische Moleküle basierend auf der Fusion von CT01 entweder am C-Terminus oder am N-Terminus der schweren oder leichten Kette von anti-EGFR-Antikörpern Erbitux und IMC-11F8 entworfen. Beispiele für Proteinsequenzen, die entworfen wurden, sind in den SEQ ID-Nummern 136-145 angegeben.
  • Von diesen Beispielsequenzen wurde einige konstruiert. DNA-Sequenzen, die SEQ ID-Nr. 136 (CT01-Kette fusioniert auf den C-Terminus der schweren Kette Erbitux), SEQ ID-Nr. 144 (CT01-Kette fusioniert auf den N-Terminus der schweren Kette Erbitux) und SEQ ID-Nr. 138 (CT01C fusioniert auf den C-Terminus der leichten Kette Erbitux) kodieren, wurden gebaut. Alle drei Sequenzen wurden mit Hilfe der PCR-basierten Klonierungsmethoden gebaut und in Säugetier-Expressionsvektoren geklont. Tabelle 22 unten ist eine Zusammenfassung der Antigen-bindenden Proteine, die entworfen und/oder konstruiert wurden. Tabelle 22
    Antikörper-ID Beschreibung SEQ ID-Nr.: Aminosäuresequenz
    BPC1801 (gebaut) antiIGF1R schwere Kette-GS-CT01 Adnectin 124
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1802 (gebaut) antiIGF1R schwere Kette-TVAAPSGS-CT01 Adnectin 133
    antiIGF1R leichte Kette 113
    BPC1810 (entworfen) antiIL13-schwere Kette-GS-antiTNFα Adnectin 134
    antiIL13-leichte Kette 13
    BPC1811 (entworfen) antiIL13-schwere Kette-TVAAPSGS-antiTNFα Adnectin 135
    antiIL13-leichte Kette 13
    BPC1812 (gebaut) Erbitux schwere Kette-RS-CT01 Adnectin 136
    Erbitux leichte Kette 137
    BPC1813 Erbitux leichte Kette-RS-CT01 Adnectin 138
    (gebaut) Erbitux schwere Kette 139
    BPC1814 (entworfen) 11F8 schwere Kette-GS-CT01 Adnectin 11F8 leichte Kette 140 141
    BPC1815 (entworfen) 11F8 leichte Kette-GS-CT01 Adnectin 11F8 schwere Kette 142 143
    BPC1818 (gebaut) GS-CT01 Adnectin-GSTG-Erbitux schwere Kette 144
    Erbitux leichte Kette 137
    BPC1819 (entworfen) CT01 Adnectin-STG-Erbitux leichte Kette 145
    Erbitux schwere Kette 139
    BPC1823 (gebaut) Anti IL-4 schwere Kette-GS-anti TNF-α Adnectin 146
    Anti IL-4 leichte Kette 15
    BPC1822 (gebaut) Anti IL-4 schwere Kette-TVAAPSGS-anti TNF-α Adnectin 147
    Anti IL-4 leichte Kette 15
  • Expressionsplasmide, die die schweren und leichten Ketten von BPC1801, BPC1802, BPC1822, BPC1823, BPC1812, BPC1813 und BPC1818 kodieren, wurden vorübergehend mittels 293fectin (Invitrogen, 12347019) in HEK 293-6E-Zellen transfiziert. Ein Trypton A-Futtermittel wurde am selben Tag oder am folgenden Tag zu der Zellkultur hinzugefügt, und das überstehende Material wurde ca. 2-6 Tagen nach der ursprünglichen Transfektion geerntet. In einigen Fällen wurde das überstehende Material als Testartikel für Bindungstests verwendet. In anderen Fällen wurde das Antigen-bindende Protein mit einer Protein A-Säule vor dem Testen in Bindungstest gereinigt.
  • 17.2: rhIGF-1R-bindendes ELISA
  • Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 1 μg/ml Anti-His-Tag-Antikörper (Abcam, ab9108) in PBS beschichtet und über Nacht bei +4°C gelagert.
  • Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. 0,4 μg/ml rhIGF-1R (R&D Systems) wurde zu jeder Vertiefung mit 50 μl pro Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann gewaschen. Die gereinigten Antigen-bindenden Proteine/Antikörper wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen. Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • zeigt die Ergebnisse des IGF-1R-bindenden ELISA und bestätigt, dass gereinigte humane monoklonale Antikörper-Adnectin bispezifische Antikörper (BPC1801 und BPC 1802) sich an rekombinantes humanes IGF-1R in einer Höhe binden, die mit dem Anti-IGF-1R monoklonalen Antikörper HOLD vergleichbar ist. Der negative Kontrollantikörper (Sigma 15154) zeigte keine Bindung an IGF-1R.
  • 17.3: VEGFR2-bindendes ELISA
  • Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 0,4 μg/ml VEGFR2 (R&D Systems) beschichtet und über Nacht bei +4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Die Überstände oder gereinigten Antikörper wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen. Ziegen-antihuman Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • zeigt die Ergebnisse des VEGFR2 bindenden ELISA und bestätigt, dass gereinigte humane monoklonale Antikörper-Adnectin bispezifische Antikörper (BPC1801 und BPC1802) sich an rekombinantes humanes VEGFR2 binden. Im Gegensatz dazu zeigte der Anti-IGF-1R monoklonale Antikörper H0L0 keine Bindung an humanes VEGFR2.
  • zeigt die Ergebnisse des VEGFR2 bindenden ELISA und bestätigt, dass Antigen-bindende Proteine BPC1818 und BPC1813 sich an rekombinantes humanes VEGFR2 binden. Im Gegensatz dazu zeigte Erbitux keine Bindung an humanes VEGFR2. Für die Antigen-bindenden Proteine BPC1813 und BPC1818 wurde die Menge der Antikörper im Überstand nicht quantifiziert; daher werden die in dargestellten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterial dargestellt. Für Erbitux wurde gereinigtes Material im Test mit einer Startkonzentration von 2 μg/ml verwendet, was einem Verdünnungsfaktor von 1 in entspricht.
  • zeigt die Ergebnisse des VEGFR2 bindenden ELISA und bestätigt, dass Antigen-bindendes Protein BPC1812 sich an rekombinantes humanes VEGFR2 bindet. Im Gegensatz dazu zeigten Erbitux und der negative Kontroll-Sigma I5154 IgG-Antikörper keine Bindung an humanes VEGFR2. Für das Antigen-bindende Protein BPC1812 wurde die Menge der Antikörper im Überstand nicht quantifiziert; daher werden die in dargestellten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterial dargestellt. Für Erbitux und Sigma IgG I5154 wurde gereinigtes Material im Test mit einer Startkonzentration von 2 μg/ml verwendet, was einem Verdünnungsfaktor von 1 in entspricht.
  • 17.4: IL-4-bindendes ELISA
  • Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 5 μg/ml humanes IL-4 in PBS beschichtet und über Nacht bei +4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Trisgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Die Überstände oder gereinigten Antikörper/Antigen-bindenden Proteine wurden nacheinander über die Platten in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen. Ziegen-antihuman Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper (Sigma, A7164) wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • zeigt die Ergebnisse des IL-4 bindenden ELISA und bestätigt, dass humane monoklonale Antikörper-Adnectin bispezifische Antikörper (BPC1823 und BPC 1822) sich an rekombinantes humanes IL-4 binden. Der positive monoklonale Kontroll-Anti-IL-4-Antikörper Pascolizumab zeigte eine Bindung an IL-4 und der negative Kontroll-Antikörper (Sigma 15154) zeigte keine Bindung an IL-4.
  • Die HEK-Transfektion für diesen Versuch wurde wiederholt, um überstehendes Material mit einer höheren Antikörperkonzentration zu erhalten. zeigt die Bindung dieses höherkonzentrierten überstehenden humanen monoklonalen Antikörper-Adnectin bispezifischen Antikörpers (BPC1823) an humanes IL-4, wie durch ELISA bestimmt.
  • Für die Antigen-bindenden Proteine BPC1823 und BPC1822 wurde die Menge der Antikörper im Überstand nicht quantifiziert; daher werden die in und dargestellten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterial dargestellt. Für Pascolizumab und den negative Kontroll-Antikörper (Sigma 15154) wurde gereinigtes Material im Test mit einer Startkonzentration von 1 μg/ml verwendet, was einem Verdünnungsfaktor von 1 in und entspricht.
  • 17.5: TNF-α-bindendes ELISA
  • Eine Hochbindungsplatte mit 96 Vertiefungen wurde mit 0,4 μg/ml rekombinantem humanen TNFα (RnD Systems 210-TA-050/CF) in PBS beschichtet und über Nacht bei +4°C gelagert. Die Platte wurde zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Der Überstand oder die gereinigten Antikörper wurden nacheinander über die Platte in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurde die Platte gewaschen. Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidasekonjugierter Antikörper (Sigma, A7164) wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • zeigt die Ergebnisse des TNF-α-bindenden ELISA und bestätigt, dass humane monoklonale Antikörper-Adnectin bispezifische Antikörper (BPC1823 und BPC1822) sich an rekombinantes humanes TNF-α binden. Im Gegensatz dazu zeigte der monoklonale Anti-IL-4-Antikörper Pascolizumab keine Bindung an rekombinantes humanes TNF-α.
  • Die HEK-Transfektion für diesen Versuch wurde wiederholt, um überstehendes Material mit einer höheren Antikörperkonzentration zu erhalten. zeigt die Bindung dieses höherkonzentrierten überstehenden humanen monoklonalen Antikörper-Adnectin bispezifischen Antikörpers (BPC1823) an rekombinantes humanes TNF-α, wie durch ELISA bestimmt. Die IgG-Kontrolle zeigte keine Bindung an rekombinantes humanes TNF-α.
  • Für die Antigen-bindenden Proteine BPC1822 und BPC1823 wurde die Menge der Antikörper im Überstand nicht quantifiziert; daher werden die in und dargestellten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterial dargestellt. Für Pascolizumab wurde gereinigtes Material im Test mit einer Startkonzentration von 1 μg/ml verwendet, was einem Verdünnungsfaktor von 1 in und entspricht.
  • 17.6: EGFR-bindendes ELISA
  • Eine Hochbindungsplatte mit 96 Vertiefungen wurde mit 0,67 μg/ml rekombinantem humanem EGFR-Protein in PBS beschichtet und über Nacht bei +4°C gelagert. Die Platte wurde zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. 200 μl Blockierlösung (5% BSA in DPBS-Puffer) wurde in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Die Antigen-bindenden Proteine/Antikörper wurden nacheinander über die Platte in Blockierlösung verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurde die Platte gewaschen. Ziegen-anti-human Kappa-leichte Kette spezifischer Peroxidasekonjugierter Antikörper (Sigma, A7164) wurde auf 1 μg/ml in Blockierlösung verdünnt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde in jede Vertiefung 50 μl OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung zugegeben, und die Reaktion wurde 25 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde mit dem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines grundlegenden Endpunkt-Protokolls bei 490 nm gelesen.
  • zeigt die Ergebnisse des EGFR-bindenden ELISA und bestätigt, dass bispezifische Antikörper BPC1818 und BPC1813 sich an rekombinantes humanes EGFR binden. Der positive Kontroll-Antikörper Erbitux zeigte auch eine Bindung an rekombinantes humanes EGFR. Im Gegensatz dazu zeigte das Sigma IgG 15154 keine Bindung an rekombinantes humanes EGFR. Für die bispezifischen Antikörper BPC1813 und BPC1818 wurde die Menge der Antikörper im Überstand nicht quantifiziert; daher werden die in dargestellten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterial dargestellt. Für Erbitux und den negativen Kontrollantikörper (Sigma I5154) wurde gereinigtes Material im Test mit einer Startkonzentration von 2 μg/ml bzw. 1 μg/ml verwendet, was einem Verdünnungsfaktor von 1 in entspricht.
  • zeigt die Ergebnisse des EGFR-bindenden ELISA und bestätigt, dass bispezifische Antikörper BPC1812 sich an rekombinantes humanes EGFR binden.
  • Der positive Kontroll-Antikörper Erbitux zeigte auch eine Bindung an rekombinantes humanes EGFR. Im Gegensatz dazu zeigte das Sigma IgG 15154 keine Bindung an rekombinantes humanes EGFR. Für die bispezifischen Antikörper BPC1812 wurde die Menge der Antikörper im Überstand nicht quantifiziert; daher werden die in
  • dargestellten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterial dargestellt. Für Erbitux und den negativen Kontrollantikörper (Sigma I5154) wurde gereinigtes Material im Test mit einer Startkonzentration von 2 μg/ml bzw. 1 μg/ml verwendet, was einem Verdünnungsfaktor von 1 in entspricht.
  • Beispiel 18
  • Daten zur Bindungsaktivität von IL-13/IL-4 mAbdAbs, bei denen die 'G- und S'-Aminosäurereste entfernt wurden.
  • 18.1 Der Bau der mAbdAbs
  • mAbdAbs wurden gebaut, bei denen die G- und S-Aminosäurenreste (neben der Linker-Sequenz) entfernt wurden. Expressionsplasmide wurden mit Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert. Diese mAbdAbs sind in Tabelle 23 beschrieben. Sie wurden kloniert, dann in einer oder mehreren HEK293-6E-Zellen, CHOK1-Zellen oder CHOE1a-Zellen exprimiert. Anschließend wurden sie gereinigt (wie in den Beispielen 1, 1.3 bzw. 1.5 beschrieben) und in einer Reihe von IL-13- und IL-4-Aktivitäts-Assays analysiert. Tabelle 23
    Name Beschreibung Sequenz-ID-Nr.
    PascoH-474 GS entfernt H Kette = Pascolizumab schwere Kette-DOM10-53-474 dAb L Kette = Pascolizumab leichte Kette 91 (= H Kette) 15 (= L Kette)
    PascoH-TVAAPS-474 GS entfernt H Kette = Pascolizumab schwere Kette-TVAAPS-DOM10-53-474 dAb L Kette = Pascolizumab leichte Kette 92 (= H Kette) 15 (= L Kette)
    PascoH-GS-ASTKGPT-474 2nd GS entfernt H Kette = Pascolizumab schwere Kette-GS-ASTKGPT-DOM10-53-474 dAb L Kette = Pascolizumab leichte Kette 96 (= H Kette) 15 (= L Kette)
    586H-210 GS entfernt H Kette = Anti-human IL-13 mAb schwere Kette-DOM9-112-210 dAb L Kette = Anti-human IL-13 mAb leichte Kette 87 (= H Kette) 13 (= L Kette)
    586H-TVAAPS-210 GS entfernt H Kette = Anti-human IL-13 mAb schwere Kette-TVAAPS-DOM9-112-210 dAb L Kette = Anti-human IL-13 mAb leichte Kette 88 (= H Kette) 13 (= L Kette)
  • 18.2 Expression und Reinigung
  • Diese mAbdAbs wurden gereinigt und durch SEC und SDS-PAGE analysiert. Eine Reihe von gereinigten Präparationen wurden angefertigt, und die SEC- und SDS-PAGE-Daten in den bis zeigen diese Präparationen.
  • 18.3 Bindung an humanes IL-4 in einem direkt bindenden ELISA Gereinigtes PascoH-474 GS-entfernt und PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt wurden auf Bindung an humanes IL-4 in einem direkt bindenden ELISA, wie in Methode 2 beschrieben, getestet (PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 und PascoH-ELQLE-474 wurden in diesem Assay ebenfalls auf Bindung getestet). Eine Reihe von ELISA-Tests wurden für diese Moleküle abgeschlossen; die Daten in sind repräsentativ für diese Assays.
  • PascoH-474 GS-entfernt und PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt banden beide humanes IL-4. Gereinigtes anti-humanes 114 mAb allein (Pascolizumab) wurde in diesen Assay als positive Kontrolle für die Bindung an IL-4 aufgenommen. Gereinigte anti-humane IL13 mAb wurden als negative Kontrolle für IL-4-Bindung aufgenommen. Die Bindungsaktivität des PascoH-474 GS-entfernt und PascoH TVAAPS-474 GS-entfernt war ähnlich wie gereinigte anti-IL4 mAb allein (Pascolizumab), PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 und PascoH-ELQLE-474.
  • 18.4 Bindung an humanes IL-13 in einem direkt bindenden ELISA
  • Gereinigtes PascoH-474 GS-entfernt und PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt wurden ebenfalls auf Bindung an humanes IL-13 in einem direkt bindenden ELISA, wie in Methode 1 beschrieben, getestet (PascoH-616, PascoH-TVAAPS-616 wurden in diesem Assay ebenfalls auf Bindung getestet; die Generierung dieser Moleküle wird in Beispiel 19 beschrieben). Eine Reihe von ELISA-Tests wurden für diese Moleküle abgeschlossen; die Daten in sind repräsentativ für diese Assays.
  • PascoH-474 GS-entfernt und PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt, PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 banden alle humanes IL-13. Gereinigtes anti-humanes 114 mAb allein (Pascolizumab) wurde in diesen Assay als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 aufgenommen. Gereinigtes anti-humanes 1113 mAb wurde als positive Kontrolle für IL-13-Bindung aufgenommen. Beachten Sie, dass das Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) in diesem Test nicht getestet wurde, da das dAb von dem sekundären Erkennungsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde das anti-humane IL13 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis einer IL-13-Bindung bei diesem Assay verwendet.
  • 18.5 Bindung an Cynomolgus IL-13 in einem direkt bindenden ELISA
  • Gereinigtes PascoH-474 GS-entfernt und PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt, PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 mAbdAbs wurden ebenfalls auf Bindung an Cynomolgus-IL-13 in einem direkt bindenden ELISA (wie in Methode 17 beschrieben). Eine Reihe von ELISA-Tests wurden für diese Moleküle abgeschlossen; die Daten in sind repräsentativ für diese Assays.
  • PascoH-474 GS-entfernt und PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt, PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 banden alle Cynomolgus-IL-13. Gereinigtes anti-humanes 114 mAb allein (Pascolizumab) wurde in diesen Assay als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 aufgenommen. Gereinigtes anti-humanes IL13 mAb wurde als positive Kontrolle für Cynomolgus-IL-13-Bindung aufgenommen. Beachten Sie, dass die Anti-IL-13 dAbs allein (DOM10-53-474 und DOM10-53-616) in diesem Test nicht getestet wurden, da das dAb von dem sekundären Erkennungsantikörper nicht erkannt wird; stattdessen wurde das anti-humane 1113 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis einer IL-13-Bindung bei diesem Assay verwendet.
  • 18.6 Biacore-Analyse für die Bindung an humanes IL-4 und humanes IL-13
  • Gereinigte mAbdAbs wurden auf Bindung an humanes IL-4 und humanes IL-13 mit dem BIAcoreTM T100 bei 25°C (wie in Methode 4 und 5 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 24 dargestellt.
  • In Versuch 1 wurde eine mAbdAb-Capture-Höhe von ca. 600 relativen Ansprecheinheiten erzielt und sechs IL-13- und IL-4 Konzentrationskurven (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM und 0,25 nM) wurden bewertet. Nur eine IL-13-(256 nM) und eine IL-4-(256 nM)-Konzentrationskurve wurde in Versuch 1 für die mAbs bewertet.
  • In Versuch 2 wurde eine mAbdAb Capture-Höhe von ca. 400 relativen Ansprecheinheiten erzielt und sechs IL-4- (64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM, 0,25 nM und 0,0625 nM) und sechs IL-13-Konzentrationskurven (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM und 0,25 nM) wurden bewertet. In Versuch 2 wurde nur eine IL-13-Konzentrationskurve (256 nM) für Anti-IL13 mAb und fünf IL-4-Konzentrationskurven (64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM und 0,25 nM) wurden für Pascolizumab bewertet.
  • In Versuch 3 wurde eine mAbdAb oder mAb-Capture-Höhe von ca. 700 relativen Ansprecheinheiten erzielt und sechs IL-4-Konzentrationskurven (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM und 0,25 nM) und sechs IL-13-Konzentrationskurven (256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM und 0,25 nM) wurden bewertet. Tabelle 24
    Molekül (gereinigtes Material) Bindungsaffinität, KD (nM)
    Humanes IL-4 Humanes IL-13
    Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
    PascoH-474 GS-entfernt nicht gemacht 0,005 nicht gemacht 0,3307 0,351 nicht gemacht
    PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt nicht gemacht 0,011 nicht gemacht 0,2677 0,305 nicht gemacht
    586H-210 GS-entfernt nicht gemacht nicht gemacht sehr enger Binder * nicht gemacht nicht gemacht 0,438
    586H-TVAAPS-210 GS-entfernt nicht gemacht nicht gemacht sehr enger Binder * nicht gemacht nicht gemacht 0,501
    Anti-humanes IL-13 mAb bindet nicht bindet nicht bindet nicht 0,2799 0,31 0,547
    Pascolizumab 0,0137 0,011 0,013 bindet nicht bindet nicht bindet nicht
  • In Versuch 1 und 2, PascoH-474 GS-entfernt und PascoH TVAAPS-474 GS-entfernt, banden beide IL-4 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten, und dies war in etwa äquivalent zur Bindungsaffinität des anti-humanen 114 mAb allein (Pascolizumab). PascoH-474 GS-entfernt und PascoH TVAAPS-474 GS-entfernt banden IL-13 ebenfalls mit ähnlichen Bindungsaffinitäten. Beachten Sie, dass das Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-474) in diesem Assay nicht getestet wurde, da das dAb nicht auf dem Protein A- oder Anti-Human-IgG-beschichteten CM5-Chip erfasst werden kann; stattdessen wurde das anti-humane 1113 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • In Versuch 3, 586H-210 GS-entfernt und 586H-TVAAPS-210 GS-entfernt, banden beide IL-13 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten, und dies war in etwa äquivalent zur Bindungsaffinität des anti-humanen 1113 mAb. 586H-210 GS-entfernt und 586H-TVAAPS-210 GS-entfernt banden IL-4 ebenfalls sehr eng, jedoch konnte mit dieser Methode, aufgrund von positiven Dissoziationseffekten und der Empfindlichkeitsstufe der BIAcoreTM-Technik (*), die Bindungsaffinität nicht bestimmt werden. Beachten Sie, dass das Anti-IL-4 dAb allein (DOM9-112-210) in diesem Assay nicht getestet wurde, da das dAb nicht auf dem Protein A- oder Anti-Human-IgG-beschichteten CM5-Chip erfasst werden kann; stattdessen wurde das anti-humane 114 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • 18.7 Biacore-Analyse für die Bindung an Cynomolgus-IL-4 und Cynomolgus-IL-13
  • Gereinigte mAbdAbs wurden auf Bindung an Cynomolgus-IL-4 und Cynomolgus-IL-13 mit dem BIAcoreTM T100 bei 25°C (wie in Methode 24 und 23 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 25 dargestellt. Es wurde eine mAbdAb-Capture-Höhe von ca. 600 relativen Ansprecheinheiten erzielt und sechs IL-13-Konzentrationskurven (256, 64, 16, 4, 1, 0,25 nM) und fünf IL-4-Konzentrationskurven (64, 16, 4, 1, 0,25 nM) wurden bewertet. Tabelle 25
    Molekül (gereinigtes Material) Bindungaffinität, KD
    Cynomolgus-IL-13 Cynomolgus-IL-4
    on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (nM) on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (pM)
    PascoH-474 GS-entfernt 6,62 E+5 1,10 E–2 16,6 1,87 E+6 6,38 E–5 34,2
    PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt 4,83 E+5 1,29 E–2 26,7 1,83 E+6 5,30 E–5 29,0
    PascoH-ASTKGPT-474 2. GS-entfernt 4,79 E+5 1,14 E–2 23,8 1,83 E+6 5,30 E–5 29,0
    PascoH-474 5,86 E+5 1,09 E–2 18,6 1,85 E+6 8,14 E–5 43,9
    PascoH-TVAAPS-474 4,33 E+5 1,17 E–2 27,1 1,80 E+6 8,85 E–5 49,1
    PascoH-ASTKG-474 3,64 E+5 1,07 E–2 29,5 1,78 E+6 7,90 E–5 44,5
  • PascoH-474 GS-entfernt, PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt, PascoH-ASTKGPT-474 2. GS-entfernt, PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474 und PascoH-ASTKG-474 banden alle Cynomolgus-IL-4 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten. PascoH-474 GS-entfernt, PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt, PascoH-ASTKGPT-474 2. GS-entfernt, PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474 und PascoH-ASTKG-474 banden ebenfalls alle IL-13 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten.
  • Gereinigte mAbdAbs wurden auf Bindung an Cynomolgus-IL-4 und Cynomolgus-IL-13 mit dem BIAcoreTM T100 bei 25°C (wie in Methode 24 und 23 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 26 dargestellt. Es wurde eine mAbdAb-Capture-Höhe von ca. 600 relativen Ansprecheinheiten erzielt und sechs IL-13- und sechs IL-4-Konzentrationskurven (256, 64, 16, 4, 1 und 0,25 nM) wurden bewertet. Tabelle 26
    Molekül (gereinigtes Material) Bindungsaffinität, KD
    Cynomolgus-IL-13 Cynomolgus-IL-4
    on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (pM) on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (pM)
    586H-TVAAPS-210 GS-entfernt 4,92 E+5 2,86 E–5 58 sehr enger Binder * sehr enger Binder * sehr enger Binder *
    586H-210 GS-entfernt 5,07 E+5 2,24 E–5 44 sehr enger Binder * sehr enger Binder * sehr enger Binder *
    Anti-IL13 mAb 4,74 E+5 1,05 E–4 222 bindet nicht bindet nicht bindet nicht
    Pascolizumab bindet nicht bindet nicht bindet nicht 2,34 E+6 1,08 E–4 46
  • 586H-210 GS-entfernt und 586H-TVAAPS-210 GS-entfernt banden beide Cynomolgus-IL-13 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten; diese mAbdAbs schienen IL-13 stärker zu binden als das anti-humane 1113 mAb, jedoch wurde im Fall von mAb nur eine Konzentrationskurve abgeschlossen, was weniger genau ist als eine volle Konzentrationsbereichsbewertung. 586H-210 GS-entfernt und 586H-TVAAPS-210 GS-entfernt banden IL-4 ebenfalls sehr eng, jedoch konnte mit dieser Methode, aufgrund von positiven Dissoziationseffekten und der Empfindlichkeitsstufe der BIAcoreTM-Technik (*), die Bindungsaffinität nicht bestimmt werden. Beachten Sie, dass das Anti-IL-4 dAb allein (DOM9-112-210) in diesem Assay nicht getestet wurde, da das dAb nicht auf dem Protein A- oder Anti-Human-IgG-beschichteten CM5-Chip erfasst werden kann; stattdessen wurde das anti-humane IL4 mAb (Pascolizumab) als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-4-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • 18.8 Biacore-Analyse der Wirkung der IL-4-Bindung an mAbdAbs auf nachfolgende IL-13-Bindungskinetik und umgekehrt, und die Wirkung der IL-13-Bindung an mAbdAbs auf nachfolgende IL-4-Bindungskinetik und umgekehrt.
  • Die IL-13- und IL-4-BIAcoreTM Bindungsassays wurden außerdem zur Untersuchung der Wirkung der IL-4-Bindung an PascoH-474 GS-entfernt auf die nachfolgende IL-13-Bindungskinetik und umgekehrt sowie der Wirkung der IL-13-Bindung auf 586H-TVAAPS-210 auf die nachfolgende IL-4-Bindungskinetik und umgekehrt verwendet.
  • Es wurden Analysen mit der anti-humanen IgG-Erfassung von mAbdAb (oder der positiven Kontroll-mAb) am BIAcoreTM T100 bei 25°C durchgeführt. Kurz dargestellt, anti-humanes IgG wurde durch primäre Aminkupplung gemäß den Empfehlungen des Herstellers auf einen CM5-Chip gekoppelt. mAbdAb-Konstrukte (oder positive Kontroll-mAb) wurden dann auf dieser Fläche erfasst (bei ca. 250 bis 750 RUs) und die erste analysierte Substanz (entweder humanes IL-13 oder humanes IL-4) wurde bei 256 nM für 4 Minuten übergeführt. Die zweite analysierte Substanz (humanes IL-4 bzw. humanes IL-13) wurde dann bei Konzentrationen von 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 1 nM und 0,25 nM übergeführt, und zur doppelten Referenzierung wurde eine Pufferinjektion über die Capture-Antikörper oder mAbdAb-Fläche übergeführt. Die Daten wurden unter Zuhilfenahme der Bewertungssoftware in der Maschine analysiert (angepasst auf das 1:1-Bindungsmodell). Die Oberfläche wurde anschließend mit 3M Magnesiumchlorid regeneriert. Die Daten aus diesen Versuchen sind in Tabelle 27 und 28 dargestellt. Tabelle 27
    Molekül IL-13-Bindungskinetik
    mit humanem IL-4 gebunden an Molekül ohne humanes IL-4 gebunden an Molekül
    on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (pM) on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (pM)
    PascoH-474 GS-entfernt 5,66 E+5 2,31 E–4 407,7 6,09 E+5 2,59 E–4 425,2
    586H-TVAAPS-210 9,68 E+5 3,15 E–4 325,2 9,09 E+5 3,47 E–4 381,3
    Anti-IL13 mAb nicht getestet 1,01 E+6 3,68 E–4 366,1
  • Die Bindungsaffinität von PascoH-474 GS-entfernt für humanes IL-13 war ähnlich, unabhängig davon, ob humanes IL-4 an dieses Molekül gebunden war oder nicht.
  • Darüber hinaus war die Bindungsaffinität von 586H-TVAAPS-210 für humanes IL-13 ähnlich, unabhängig davon, ob humanes IL-4 an dieses Molekül gebunden war oder nicht, und es war auch ähnlich wie die Bindungsaffinität des Anti-IL13 mAb für humanes IL-13.
  • Die Off-Raten (kd) für IL-4-Bindung, die für PascoH-474 GS-entfernt und 586H-TVAAPS-210 erzielt wurden, sind sehr langsam und außerhalb des Empfindlichkeitsbereichs des BIAcoreTM T100; sie konnten daher nicht zur genauen Bestimmung der Bindungsaffinität verwendet werden (Daten nicht gezeigt). Die Daten weisen jedoch darauf hin, dass alle getesteten Konstrukte sich sehr eng an humanes IL-4 binden. Demnach war die Bindungsaffinität von PascoH-474 GS-entfernt für humanes IL-4 war eng, unabhängig davon, ob humanes IL-13 an dieses Molekül gebunden war oder nicht. Darüber hinaus war die Bindungsaffinität von 586H-TVAAPS-210 für humanes IL-4 sehr eng, unabhängig davon, ob humanes IL-13 an dieses Molekül gebunden war oder nicht.
  • 18.9 Die Potenz von mAbdAbs
  • mAbdAbs wurden durch ELISA auf Hemmung der humanen IL-4-Bindung an humanes IL-4Rα getestet, wie in Methode 19 beschrieben. Alle in Tabelle 28 dargestellten Moleküle wurden in einem Versuch getestet, die Daten wurden jedoch auf zwei Graphen gezeichnet, um zwischen den Kurveneintragungen zu unterscheiden (586H-TVAAPS-210 wurde zweimal durchgeführt; dies wird in Tabelle 25 als Probe und Probe 2 aufgeführt). Diese Daten sind in und dargestellt.
  • PascoH-474 GS-entfernt hemmte die Bindung von humanem IL-4 an humanem IL4Rα ähnlich wie Pascolizumab. 586H-210 GS-entfernt, 586H-TVAAPS-210 GS-entfernt, 586H-TVAAPS-210, 586H-210, 586H-G4S-210 und 586H-ASTKG-210 hemmten alle die Bindung von humanem IL-4 an humanem IL4Rα ähnlich wie DOM9-112-210. Pascolizumab und DOM9-112-210 wurden als positive Kontrollen für die Hemmung der IL-4-Bindung an IL4Rα aufgenommen. DOM10-53-474 und ein Isotyp-angepasstes mAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurden als negative Kontrollen für die Hemmung der IL-4-Bindung an IL4Rα aufgenommen.
  • Diese Daten wurden auch verwendet, um die IC50-Werte für jedes Molekül zu bestimmen. Der IC50-Wert ist die Konzentration von mAbdAb oder mAb oder dAb, welches in der Lage ist, die Bindung von humanem IL-4 an humanes IL4Rα um 50% zu hemmen. Die IC50-Werte sind in Table 28 dargestellt. Tabelle 28
    Molekül IC50 (nM)
    PascoH-474 GS-entfernt 5,14
    Pascolizumab 3,45
    DOM9-112-210 36,77
    586H-210 26,79
    586H-210 GS-entfernt 36,18
    586H-TVAAPS-210 (Probe 1) 23,77
    586H-TVAAPS-210 (Probe 2) 21,03
    586H-TVAAPS-210 GS-entfernt 19,21
    586H-ASTKG-210 27,32
    586H-G4S-210 29,85
    DOM10-53-474 Keine Hemmung im getesteten Konzentrationsbereich
    Negatives Kontroll-mAb Keine Hemmung im getesteten Konzentrationsbereich
  • Diese Daten bestätigen, dass sich GS-entferntes PascoH-474 vergleichbar zu Pascolizumab verhält und dass sich alle 586H-210 mAbdAb ”Familienangehörige” ähnlich wie das DOM9-112-210 dAb verhalten.
  • 18.10 Neutralisation von humanem und Cynomolgus IL-13 in TF-1 Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • Eine Reihe von gereinigtem mAbdAbs wurden hinsichtlich der Neutralisation von menschlichen und Cynomolgus IL-13 in TF-1 Zell-Bioassays getestet (wie in den Methoden 8 bzw. 20 beschrieben). Jedes Molekül wurde 1-9 mal in diesen Assays getestet; es werden nicht alle Grafiken dargestellt; die und stellen jedoch repräsentative Graphen der Neutralisations-Daten für das humane IL-13 bzw. das IL-13 von Cynomolgus dar. DOM10-53-474 wurde als positive Kontrolle für die Neutralisierung von humanem oder Cynomolgus IL-13 in die Bioassays aufgenommen. Zusätzlich wurde ein für ein irrelevantes Antigen spezifischer dAb (dAb Negativkontrolle) als Negativ-Kontrolle zur Neutralisierung von humanem oder Cynomolgus IL-13 in die Bioassays mitaufgenommen.
  • GS-entferntes PascoH-474, GS-entferntes PascoH-TVAAPS-474 und 2. GS-entferntes PascoH-ASTKG-474, sowie PascoH-616, PascoH-TVAAPS-616 und DOM10-53-616 (diese sind in Beispiel 19 beschrieben), neutralisierten vollständig die Bioaktivität von humanem und Cynomolgus IL-13 in TF-1 Zell-Bioassays.
  • 18.11 Neutralisation von humanem und Cynomolgus IL-4 in TF-1 Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • Zusätzlich wurden eine Reihe von gereinigten mAbdAbs hinsichtlich einer Neutralisation von humanem und Cynomolgus IL-4 in TF-1 Zell-Bioassays getestet (wie in den Methoden 9 bzw. 21 beschriebenen). Jedes Molekül wurde zweimal in diesen Assays getestet; es werden nicht alle Graphen gezeigt; die und sind jedoch repräsentative Graphen (aus dem Datensatz) und zeigen die Neutralisationsdaten für humane IL-4 und IL-4 von Cynomolgus an. Der Anti-IL13 mAb wurde als negative Kontrolle und Pascolizumab als positive Kontrolle für die Neutralisierung von humanen oder Cynomolgus IL-4 in die Bioassays aufgenommen. Darüber hinaus wurden ebenso PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 und PascoH-G4S-474 auf eine Neutralisation der humanen und Cynomolgus IL-4 in diesen Biotests überprüft.
  • GS-entferntes Pasch-474 und GS-entferne PascoH-TVAAPS-474 neutralisierten die Bioaktivität von humanen und Cynomolgus IL-4 in TF-1 Zell-Bioassays vollständig. Darüber hinaus neutralisierten PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 und PascoH-G4S-474 die Bioaktivität von IL-4 im TF-1 Zell-Bioassay ebenso vollständig.
  • ND50-Werte wurden auf der Grundlage von Daten einer Reihe verschiedener Experimente abgeleitet. Der ND50-Wert ist diejenige Konzentration von mAbdAb oder mAb oder dAb, das in der Lage ist, die Bioaktivität von IL-13 oder IL-4 um 50% zu neutralisieren. Tabelle 29 zeigt den Mittelwert des ND50-Werts, die Standardabweichung (SD) und die Anzahl der Tests (n). Tabelle 29
    Molekül Mittelwert des ND50-Werts und Standardabweichung (nM)
    humanes IL-13 cyno IL-13 humanes IL-4 cyno IL-4
    Mittelwert (SD) n Mittelwert (SD) n Mittelwert (SD) n Mittelwert (SD) n
    PascoH-474 GS-entfernt 2,269 (0,763) 9 39,834 (14,675) 8 2,855 (1,464) 2 1,89 (0,325) 2
    PascoH-TVAAPS-474, GS-entfernt 2,114 (0,766) 9 47,882 (13,181) 9 3,015 (2,015) 2 1,36 (0,41) 2
    PascoH-ASTKGPT-474 2. GS entfernt 1,37 1 21,49 1 nicht ausgeführt nicht ausgeführt
    DOM10-53-474 1,035 (0,741) 4 10,495 (6,958) 4 keine Neutralisieru ng keine Neutralisieru ng
    Negative Kontrolle dAb keine Neutralisieru ng keine Neutralisieru ng nicht ausgeführt nicht ausgeführt
    Pascolizumab keine Neutralisieru ng keine Neutralisieru ng 1,36 (0,198) 2 2,615 (2,242) 2
  • PascoH-474 GS-entfernt, PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt und PascoH-ASTKGPT-474 2. GS-entfernt, neutralisierten alle komplett die Bioaktivität von humanem und Cynomolgus IL-13 in TF-1 Zell-Bioassays. Darüber hinaus sind die Neutralisations-Potenzen (ND50-Werte) von PascoH-474 GS-entfernt, PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt und PascoH-ASTKGPT-474 2. GS-entfernt für das humane IL-13 ähnlich und liegen innerhalb des -fachen des ND50-Werts für gereinigte anti-IL13 dAb allein (DOM10-53-474).
  • PascoH-474 GS-entfernt und PascoH TVAAPS-474 GS-entfernt neutralisierten beide vollständig die Bioaktivität von humanem und Cynomolgus IL-4 in TF-1 Zell-Bioassays. Darüber hinaus sind die Neutralisations-Potenzen (ND50-Werte) von PascoH-474 GS-entfernt und PascoH TVAAPS-474 GS-entfernt für den humanen IL-13 und cyno IL-13 ähnlich und lagen innerhalb des-fachen des ND50-Werts für Pascolizumab.
  • 18.12 Fähigkeit von mAbdAbs die Bindung von humanem IL-13 an humanes IL-13Rα2 zu hemmen
  • Die Moleküle, die in Tabelle 30 aufgeführt sind, wurden auf die Hemmung der Bindung von humanem IL-13 an humanes IL-13Rα2 mittels ELISA getestet, wie dies in Methode 22 beschriebenen wurde. Alle Moleküle wurden in einem Experiment getestet. Die Daten sind in dargestellt.
  • Alle getesteten mAbdAbs hemmten die Bindung von humanem IL-13 an humanes IL3Rα2. Der Grad der Hemmung war ähnlich wie bei DOM10-53-474, DOM10-53-616 und dem Anti-IL13 mAb. Pascolizumab und ein Negativ-Kontroll dAb (mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen) wurden als Negativ-Kontrollen für die Hemmung von IL-13 Bindung an IL13Rα2 aufgenommen.
  • Diese Daten wurden auch dazu verwendet, um IC50-Werte für jedes Molekül zu bestimmen. Der IC50-Wert ist die Konzentration von mAbdAb oder mAb oder dAb, die in der Lage ist, die Bindung von humanem IL-13 an humanes IL13Rα2 um 50% zu hemmen. Die IC50-Werte sind in Tabelle 30 dargestellt. Tabelle 30
    Molekül IC50 (nM)
    PascoH-474 GS-entfernt 9,58
    PascoH-TVAAPS-474, GS-entfernt 7,41
    DOM10-53-474 7,61
    PascoH-616 6,41
    PascoH-TVAAPS-616 6,17
    DOM10-53-616 5,76
    Anti-IL13 mAb 6,43
    Pascolizumab Keine Hemmung im getesteten Konzentrationsbereich
    Negative Kontrolle dAb Keine Hemmung im getesteten Konzentrationsbereich
  • Diese Daten bestätigen, dass sich PascoH-474 GS-entfernt, PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt, PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 ähnlich wie DOM10-53-474, DOM10-53 bis 616 und der Anti-IL13 mAb verhalten.
  • Beispiel 19
  • mAbdAbs mit dem anti-IL13 DOM1053-616 dAb
  • 19.1 Der Bau des mAbdAbs mit den anti-IL13-DOM10-53-616 dAb
  • Zwei Anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs, wie in Tabelle 31 dargelegt, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, aus vorhandenen Vektoren durch ortsspezifische Mutagenese geklont. Tabelle 31
    Name Beschreibung Sequenz-ID-Nr.
    PascoH-616 H-Kette = Pascolizumab schwere Kette-DOM10-53-616 dAb L-Kette = Pascolizumab leichte Kette 149 (= H-Kette) 15 (= L-Kette)
    PascoH-TVAAPS-616 H-Kette = Pascolizumab schwere Kette-TVAAPS-DOM10-53-616 dAb L-Kette = Pascolizumab leichte Kette 150 (= H-Kette) 15 (= L-Kette)
  • 19.2 Expression und Aufreinigung von mAbdAbs mit den anti-IL13-DOM10-53-616 dAb
  • Diese mAbdAbs wurden wie in Beispiel 1.3 beschrieben, in HEK293-6E-Zellen und CHOE1a-Zellen exprimiert.
  • Die mAbdAbs wurden mittels SEC und SDS-PAGE gereinigt und analysiert. Eine Reihe gereinigter Präparationen der PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 mAbdAbs wurden erzeugt, die SEC und SDS-PAGE-Daten werden in den (SEC Profil für PascoH-616), 110 (SEC Profil für PascoH-TVAAPS_616), 111 (SDS-PAGE für PascoH-616) und 112 (SDS-PAGE für PascoH TVAAPS-616) dargestellt und sind repräsentativ für diese Präparationen.
  • 19.3 Bindung von mAbdAbs an humanes IL-13 in einem direkt bindenden ELISA
  • PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 gereinigte mAb dAbs wurden (wie in Methode 1 beschrieben) für die Bindung an humanes IL-13 in einem direkten Bindungs-ELISA getestet. Die Daten sind in dargestellt.
  • Sowohl gereinigtes PascoH-616 als auch PascoH-TVAAPS-616 banden an humanes IL-13. Der gereinigte anti-human IL4 mAb allein (Pascolizumab) war in diesem Test als negative Kontrolle für die Bindung an IL-13 enthalten. Gereinigter anti-human IL13 mAb war als positive Kontrolle für die IL-13 Bindung enthalten. Beachten Sie, dass der Anti-IL-13 dAb allein (DOM10-53-616) in diesem Assay nicht getestet wurde, da der dAb vom sekundären Detektionsantikörper nicht erkannt wird; als Ersatz wurde der anti-humane 1113 mAb als positive Kontrolle verwendet, um die IL-13-Bindung in diesem Test anzuzeigen.
  • 19.4 Biacore-Analyse für die Bindung an humanes IL-4 und IL-13
  • Gereinigte mAbdAbs wurden (wie in den Methoden 4 und 5 beschrieben) hinsichtlich der Bindung an humanes IL-4 und IL-13 mit dem BIAcoreTM T100 bei 25°C getestet.
  • Die Daten sind in Tabelle 32 dargestellt.
  • In Experiment 1, wurde ein mAbdAb Capture-Bereich von ca. 600 relativen Ansprecheinheiten erzielt und sechs IL-13 und IL-4 Konzentrationskurven (256 nM, 64 nM, 16 nm, 4 Nm, 1 nm und 0,25 nM) wurden bewertet. Nur je eine IL-13 (256 nM) und IL-4 (256 nM) Konzentrationskurve wurde für die mAbs in Experiment 1 bewertet.
  • In Experiment 2 wurde ein mAbdAb Capture-Niveau von etwa 400 relativen Ansprecheinheiten erzielt und sechs IL-4 (64 nM, 16 nm, 4 Nm, 1 nm, 0,25 nM und 0,0625 nM) und sechs IL-13 Konzentrationskurven (256 nM, 64 nM, 16 nm wurden 4 Nm, 1 nm und 0,25 nM) wurden bewertet. In Experiment 2 wurde nur eine IL-13 Konzentrationskurve (256 nM) für den Anti-IL13 mAb und fünf IL-4 Konzentrationskurven (64 nM, 16 nm, 4 Nm, 1 nm und 0,25 nM) wurden für Pascolizumab bewertet. Tabelle 32
    Molekül (Gereinigtes Material) Bindungsaffinität, KD (nM)
    Humanes IL-4 Humanes IL-13
    Experiment 1 Experiment 2 Experiment 1 Experiment 2
    PascoH-616 0,00172 Sehr enger Binder 0,1137 0,15
    PascoH-TVAAPS-616 0,003 0,005 0,0497 0,056
    Anti-humaner IL-13 mAb bindet nicht bindet nicht 0,2799 0,31
    Pascolizumab 0,0137 0,011 bindet nicht bindet nicht
  • Sowohl PascoH-616 als auch PascoH-TVAAPS-616 banden IL-4 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten und diese waren ähnlich der Bindungsaffinität des einzelnen Anti-Human-IL4 mAb (Pascolizumab). Sowohl PascoH-616 als auch PascoH-TVAAPS-616 banden an IL-13. Beachten Sie, dass der Anti-IL-13 dAb alleine (DOM10-53-616) in diesem Assay nicht getestet wurde, da der dAb nicht auf dem Protein A- oder Anti-Human-IgG beschichteten CM5-Chip erfasst werden kann; der anti-humane IL13 mAb wurde daher als positive Kontrolle verwendet, um in diesem Assay die IL-13 Bindung zu demonstrieren.
  • 19.5 Biacore-Analyse für die Bindung an Cynomolgus IL-13
  • Gereinigte mAbdAbs wurden mit dem BIAcoreTM T100 auch für die Bindung an Cynomolgus IL-13 bei 25°C getestet (wie dies in der Methode 30 beschrieben wurde). Diese Daten sind in Tabelle 33 dargestellt. Ein mAbdAb Capture-Niveau von ca. 400 Einheiten relativen Ansprechens wurde erreicht und sechs IL-13 Konzentrationskurven (256, 64, 16, 4, 1 und 0,25 nM) wurden bewertet. Es gab nur eine IL-13 Konzentrationskurve (256 nM) für den Anti-IL13 mAb. Tabelle 33
    Molekül (Gereinigtes Material) Bindungsaffinität für Cynomolgus IL-13 (KD)
    Assoziationsrate (ka, Ms–1) Dissoziationsrate (kd, s–1) KD (nM)
    PascoH-616 3,411E+5 1,842E–3 5,4
    PascoH-TVAAPS-616 4,597E+5 4,514E–3 9,8
    Anti-IL13 mAb 5,498E+5 6,549E–5 0,119
    Pascolizumab bindet nicht bindet nicht bindet nicht
  • Sowohl PascoH-616 als auch PascoH-TVAAPS-616 banden Cynomolgus IL-13 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten. Beachten Sie, dass der Anti-IL-13 dAb alleine (DOM10-53-616) in diesem Assay nicht getestet wurde, da der dAb nicht auf dem Protein A- oder Anti-Human-IgG beschichteten CM5-Chip erfasst werden kann; der anti-humane IL13 mAb wurde daher als positive Kontrolle verwendet, um in diesem Assay die IL-13 Bindung zu demonstrieren.
  • 19.6 Neutralisierung von humanen und Cynomolgus IL-13 in TF-1 Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • Gereinigte mAbdAbs wurden (wie in den Methoden 8 bzw. 20 beschrieben) zur Neutralisation von humanem IL-13 und Cynomolgus IL-13 in TF-1 Zell-Bioassays getestet. Diese Moleküle wurden in jedem Test 3-mal getestet; ist ein repräsentativer Graph, der die Neutralisations-Daten für humanes IL-13 darstellt.
  • ist ein repräsentativer Graph, der die Neutralisations-Daten für cyno IL-13 darstellt. Dieser Bioassay beinhaltete DOM10-53-616 als positive Kontrolle für die Neutralisation von IL-13. Außerdem wurde ein dAb mit einer Spezifität für ein irrelevantes Antigen (negativer Kontroll-dAb) als Negativ-Kontrolle für die Neutralisation von IL-13 in diesem Bioassay eingesetzt.
  • Der mittlere ND50-Wert, die Standardabweichung (SD) und die Anzahl der Tests sind in Tabelle 34 dargestellt. Tabelle 34
    Molekül Mittlerer ND50-Wert und Standardabweichung (nM)
    humanes IL13 cyno IL-13
    Mittelwert (SD) n Mittelwert (SD) n
    PascoH-616 0,7956 (0,129) 3 9,23 (1,422) 3
    PascoH-TVAAPS-616 0,722 (0,245) 3 14,477 (2,847) 3
    DOM10-53-616 0,416 (0,144) 3 4,81 (3,266) 3
    Negative Kontrolle dAb keine Neutralisierung keine Neutralisierung
  • Sowohl PascoH-616 als auch PascoH-TVAAPS-616, sowie außerdem mAbdAbs PascoH-TVAAPS-474 GS-entfernt und PascoH-474 GS-entfernt neutralisierten die Bioaktivität von humanem und Cynomolgus IL-13 in TF-1 Zell-Bioassays vollständig. Darüber hinaus waren die Neutralisationspotenzen (ND50-Werte) von PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 für das humane IL-13 ähnlich, und innerhalb des 2-fachen des ND50-Werts für den gereinigten anti-IL13 dAb alleine (DOM10-53-616).
  • Außerdem wurden PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 nach der in 22 beschriebenen Methode, auf die Hemmung der Bindung des humanen IL-13 an humanes IL-13Rα2 mittels ELISA getestet. Diese Daten sind im Beispiel 18.12 dargestellt.
  • Beispiel 20
  • Die Fähigkeit von mAbdAbs, das humane I1-13 oder IL-4 in einem humanen Vollblut-Phospho-STAT6-Bioassay zu neutralisieren.
  • Die Fähigkeit von mAbdAbs, das humane IL-13 oder IL-4 in einem humanen Vollblut-Phospho-STAT6-Bioassay zu neutralisieren, wurde entsprechend der in Methode 16 beschriebenen Methode durchgeführt.
  • Die IL-4 oder IL-13 Neutralisations-Potenzen (z. B. Hemmung der IL-4- oder IL-13-Bioaktivität) von 2 mAbdAb Konstrukten (der gereinigte anti-IL13mAb-anti-IL4dAb, 586H-TVAAPS-210; und der gereinigte anti-IL4mAb-anti-IL13dAb, PascoH-474 GS-entfernt) wurden bestimmt. Gereinigter anti-human IL-4 mAb (Pascolizumab) und gereinigter anti-IL4 dAb (DOM9-112 bis 210) waren als positive Kontrollen für die Neutralisierung von rhIL-4 in diesem Test enthalten. Gereinigte Anti-human IL-13 mAb und Anti-IL13 dAb (DOM10-53-474) waren in diesem Assay als positive Kontrollen für die Neutralisierung von rhIL-13 enthalten. Ein Isotyp war auf mAb gemischt mit einem dAb (beide mit Spezifitäten für irrelevante Antigene) abgestimmt, und war als eine negative Kontrolle der Neutralisierung von rhIL-4 oder rhIL-13 enthalten. Jedes Molekül wurde mindestens zweimal unter Verwendung von Blut verschiedener Spender getestet. Die bis sind Diagramme, die repräsentative Daten darstellen.
  • Der gereinigte mAbdAbs neutralisierte die Bioaktivität von rhIL-13 und rhIL-4 vollständig.
  • Wie in der Methode 16 beschrieben, wurde die Fähigkeit der Testmoleküle, die Bioaktivität von rhIL-13 oder rhIL-4 zu neutralisieren, als die Konzentration der Moleküle (z. B. mAbdAbs) angegeben, die benötigt wurden, um 2 ng/ml des humanem IL-4 oder IL-13 zu 50% zu neutralisieren (IC50). Die Daten sind in Tabelle 35 dargestellt. Gezeigt wird der kombinierte mittlere IC50 zusammen mit der Standardabweichung von allen Spendern für jedes Molekül. Tabelle 35
    Molekül Target im Assay Mittlerer IC50 (Standardabweichung) nM Anzahl der Spender
    586-TVAAPS-210 IL-4 1,23 (0,6) 3
    IL-13 2,68 (1,2) 3
    PascoH-474 GS-entfernt IL-4 7,95 (7,8) 3
    IL-13 2,78 (0,7) 3
    Anti-IL13 mAb IL-13 1,47 (0,4) 3
    Pascolizumab IL-4 2,44 (1,2) 3
    DOM10-53-474 IL-13 6,83 (2,2) 2
    DOM9-112-210 IL-4 3,51 (0,8) 2
    Negative Kontrolle mAb - Keine Hemmung gezeigt 4
    Negative Kontrolle dAb - Keine Hemmung gezeigt 4
  • Ein Vergleich der IC50-Werte ergab, dass 586-TVAAPS-210 IL-13 inhibierte und IL-4 pSTAT-6 vergleichbar zum Anti-IL13 mAb und DOM9-112-210 induzierte (in den IL-13 bzw. IL-4 Vollblut-Assays). Außerdem zeigte der Vergleich der IC50-Daten, dass GS-entferntes PascoH-474, IL-13 hemmte, und IL-4 pSTAT-6 ähnlich wie DOM10-53-474 und Pascolizumab induzierte (in den IL-13 bzw. IL-4 Vollblut-Assays). Der Kontroll-mAb zeigte bei allen Spendern bis zur maximalen getesteten Konzentration von 661 nM keine Hemmung, und der Kontroll-dAb zeigte bei allen Spendern keine Neutralisierung bis zur maximalen getesteten Konzentration von 2291 nM.
  • Beispiel 21
  • PK-Studien zum Dual-Targeting anti-IL4/anti-IL13 mAbdAb bei Ratten
  • PascoH-G4S-474, PascoL-G4S-474, 586H-TVAAPS-210 und 586H-TVAAPS-154 wurden in PK-Studien an Ratten beurteilt (zusammengefasst in Tabelle 35.1). In Kurzfassung: männliche Sprague-Dawley Ratten (ca. 200 bis 220 Gramm Gewicht) erhielten eine einmalige intravenöse (i/v) Verabreichung von mAbdAb in einer Zieldosis-Niveau von 2 mg/kg. Zu bestimmten Zeitpunkten (0 Stunden bis 312 Stunden) wurden 100 μl Blutproben entnommen und für Plasma aufbereitet. Die Plasmaproben der Ratten wurden auf das Vorhandensein des Testmoleküls in einem humanen IgG-Nachweis-Assay und/oder einem IL-13 Ligandenbindungs-Assay und/oder einem IL-4 Ligandenbindungs-Assay ausgewertet. Darüber hinaus wurde das Plasma-PK-Profil für Pascolizumab (bei Ratten) untersucht: in diesem Fall wurden die Ratten-Plasmaproben auf das Vorhandensein von Pascolizumab in einem humanen IgG-Nachweis-Assay und einem IL-4 Ligandenbindungs-Assay ausgewertet.
  • In einer ersten Studie wurde Pascolizumab 4 Ratten verabreicht. In einer zweiten Studie gab es vier Behandlungsgruppen (2 mg/kg PascoH-G4S-474, 2 mg/kg PascoL-G4S-474, 2 mg/kg 586H-TVAAPS-210 und 2 mg/kg 586H-TVAAPS-154) mit je 4 Ratten in jeder Gruppe.
  • Die PK-Parameter (in Tabelle 35.1 dargestellt) wurden aus den Plasmakonzentrations-Zeitprofil-Daten (nicht gezeigt) abgeleitet. Beachten Sie, dass einige Plasmaproben mehr als einmal in diesen Assays analysiert wurden und die PK-Parameter in Tabelle 35.1 nur von einem dieser Datensätze abgeleitet wurden. Beachten Sie auch, dass die PK-Parameter nicht für die Dosen einzelne Tiere normalisiert, sondern nominale Dosen von 2 mg/kg angenommen wurden. Beachten Sie, dass einige technische Schwierigkeiten beim IgG-PK-Assay für PascoH-G4S-474 auftraten und die Konzentrationen möglicherweise zu hoch angesetzt wurden. Darüber hinaus wurden in einigen Fällen die IgG-Plasmakonzentrations-Zeitprofile zweimal durchgeführt (zur Analyse 1 und 2, wie dies in Tabelle 35.1 annotiert wird). Die Analyse der aus den PK-Assays der IL-13 und IL-4 Ligandenbindung generierten Plasmakonzentrations-Zeitprofildaten wurde nur bei Analyse 2 durchgeführt. Die Plasmakonzentrations-Zeitprofildaten aus den IL-13 und IL-4 Ligandenbindung-Assays für PascoL-G4S-474 und 586H-TVAAPS-154 wurden nicht verwendet, um PK-Parameter für diese Moleküle abzuleiten. Tabelle 35.1
    Molekül Assay Analyse T1/2 (h) Cmax (Ng/ml) AUC (zuletzt) (Ng.h/ml) AUC (Extrap) (%) Clearance (ml/h/ kg) Mittlere Verweilzeit (h)
    PascoH-G4S-474 IgG 1 129 60950 3430345 18,7 0,49 83
    IL-4 2 117 21975 1231243 17,2 1,42 83
    IL-13 2 87 22050 1328651 13,2 1,36 85
    586H-TVAAPS-210 IgG 1 134 42400 1932615 21,9 0,81 88
    IgG 2 92 42400 2215579 16,1 0,76 82
    IL-4 2 60 41350 1674740 20,9 1,08 77
    I1-13 2 101 31125 1515155 16,0 1,13 83
    Pascolizumab IgG 1 188 45150 3528174 31,9 0,39 110
    IgG 2 193 45150 3496503 34,9 0,38 109
    IL-4 2 136 42825 2590114 30,6 0,54 110
    PascoL-G4S-474 IgG 1 69 42550 2539978 6,8 0,75 87
    586H-TVAAPS-154 IgG 1 166 43900 3315164 41,7 0,36 93
  • Plasmakonzentrations-Zeitprofilaten, die in den IL-13 und IL-4-Assays für PascoH-G4S-474 generiert wurden (und die später abgeleiteten PK-Parameter), waren vergleichbar; dies war auch der Fall für die in den IL-13, IL-4 und IgG-PK-Assays für 586H-TVAAPS-210 (und spätere davon abgeleitete PK-Parameter) generierten Plasmakonzentrations-Zeitprofildaten. Dies deutet darauf hin, dass diese mAbdAbs im Plasma der Ratten über den Verlauf der Studie ”intakt” waren. Die abgeleiteten Parameter für PK-586H-TVAAPS-154 schienen eher den abgeleiteten pharmakokinetischen Parametern für Pascolizumab als einem der anderen mAbdAbs ähnlich zu sein.
  • Beispiel 22
  • Cyno PK-Studien
  • Diese PK-Studien wurden an Cynomolgus-Affen durchgeführt. Die Tiere erhielten eine einmalige intravenöse (i/v) Verabreichung in einem Zieldosis-Niveau von 1 mg/kg. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden 500 μl Blutproben entnommen und für Plasma aufbereitet. Die Cynomolgus-Plasmaproben wurden auf das Vorhandensein des Testmoleküls in einem IL-13 Ligandenbindungs-Assay, einem IL-4 Ligandenbindungs-Assay und einem IL13/IL-4 Brückenassay ausgewertet. Vorläufige Daten aus diesen Studien mit den mAbdAbs ”PascoH-474, GS-entfernt” und ”586H-TVAAPS-210” stehen im Einklang mit den oben gezeigten PK-Daten der Ratte und weisen darauf hin, dass diese Moleküle schneller als ein mAb, aber langsamer als ein dAb aus dem Blutkreislauf entfernt werden.
  • Beispiel 23
  • 23.1 Generation eines Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb
  • Dieser Dual-Targeting mAbdAb wurde durch die Fusion eines dAb zum C-Terminus der schweren Kette des mAb konstruiert. Die Expressionskassetten der schweren und leichten Ketten des anti-EGFR mAb wurden zuvor konstruiert. Die Restriktionsschnittstellen, die zur Klonierung verwendet wurden, sind die gleichen wie in Beispiel 10 gezeigt (SAII und HindIII).
  • Die DNA-Kodierung eines Anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) wurde dann mittels PCR amplifiziert (unter Verwendung von Primern, die HindIII und SalI-Enden kodieren) und dann in die modifizierte 3' kodierende Region eingeführt, was zu einem Linker von ”STG” (Serin, Threonin, Glycin) zwischen dem mAb und dem dAb führt.
  • Sequenz-überprüfte Klone (SEQ ID NR: 164 und 243) für leichte bzw. schwere Ketten wurden ausgewählt und DNA-Präparationen in großem Maßstab mit Hilfe des Qiagen Mega Prep Kits nach Herstellerangaben hergestellt. mAbdAbs wurden in HEK293-6E-Zellen von Säugetieren mittels transienter Transfektionstechniken durch Co-Transfektion von leichten und schweren Ketten exprimiert (SEQ ID NR: 165 und 137).
  • 23.2 Aufreinigung und SEC-Analyse des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb
  • Dieser Dual-Targeting mAbdAb wurde aus geklärtem Expressions-Überstand unter Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie nach etablierten Verfahren aufgereinigt. Die Konzentrationen der gereinigten Proben wurden mittels Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt. Die SDS-PAGE-Analyse ( ) der gereinigten Probe (als DMS4010 bezeichnet) zeigt einen nicht-reduzierten Probelauf bei ~170 kDa wogegen die reduzierte Probe zwei Bänder bei ~25 und ~60 kDa aufweist, die der leichten Kette bzw. der dAb-fusionierten schweren Kette entsprechen.
  • Für die Größenausschlusschromatographie(SEC)-Analyse wurde der anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb auf eine S-200 10/300 GL-Säule (eines HPLC-Systems) aufgebracht, prä-äquilibriert und in PBS bei ml/min ausgeführt. Das SEC-Profil zeigt eine einzige Art als symmetrischen Peak ausgeführt (siehe ).
  • 23.3 Potenz des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb
  • Die Fähigkeit des Moleküls VEGF und EGFR zu neutralisieren wurde gemäß der in den Methoden 12 bzw. 13 beschriebenen Verfahren bestimmt. Assay-Daten wurden mit Hilfe von GraphPad Prism analysiert. Potenz-Werte wurden aus einer sigmoiden Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt und die Daten dem besten Passform-Modell angepasst. Die Anti-EGFR-Potenz ( ) dieses mAbdAb (als DMS4010 bezeichnet) wurde als 4,784 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-EGFR mAb einen EC50-Wert von 4,214 nM ergab. Im Anti-VEGF-Rezeptorbindungs-Assay ( ) war der EC50 des mAbdAb (als DMS4010 bezeichnet) 58 pM (0,058 nM), während ein Anti-VEGF-Kontroll mAb einen EC50 von 214,1 pM (0,2141 nM) ergab. Im Ergebnis zeigen die Assay-Daten, dass das Konstrukt von Beispiel 23, ein Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb gegen beide Antigene potent ist.
  • 23.4 PK des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb
  • Das pharmakokinetische Profil des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb (als DMS4010 bezeichnet) wurde nach Verabreichung an Cynomolgus-Affen bestimmt. Die Verbindung wurde in einer Dosis von 5 mg/kg i. v. verabreicht und die Serumspiegel des Wirkstoffs wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Einnahme sowohl durch die Bindung an EGFR als auch VEGF in separaten ELISA-Assays bestimmt. zeigt die Ergebnisse für diesen Assay, in dem die Daten mit historischen Daten, die für die mAbs Cetuximab (anti-EGFR) und Bevacizumab (anti-VEGF) erzeugt wurden, verglichen wurden. Weitere Details werden in Tabelle 36 dargestellt.
  • Tabelle 36
    Antigen Halbwertszeit Cmax AUC (0-inf) Clearance Hochgerechnete % AUC
    (h) (ug/ml) (h*ug/ml) (ml/h/kg)
    Cetuximab EGFR 43,6 151,4 5684,3 0,9 18,4
    Bevacizumab VEGF 238,7 167,4 24201,9 0,2 13,4
    DMS4010 EGFR 7,5 89,7 623,2 8,1 5,2
    DMS4010 VEGF 6,7 125,5 733,8 7 7,2
  • 23.5 Generation eines alternativen anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb
  • Eine alternativer anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb wurde in ähnlicher Weise, wie oben in Beispiel 11.1 beschrieben, unter Verwendung des gleichen anti-EGFR mAb in Verbindung mit einem VEGF dAb am C-Terminus der schweren Kette mit einem STG-Linker gebaut. Der in diesem Fall verwendete Anti-VEGF dAb war DOM15-10-11. Dieses Molekül wurde in HEK293-6E-Zellen von Säugetieren mittels transienter Transfektionstechniken durch Co-Transfektion von leichten und schweren Ketten exprimiert (SEQ ID NR: 165 und 186). Es wurden jedoch signifikant reduzierte Expressionswerte im Vergleich zur Expression des in Beispiel 23.2 beschriebenen Moleküls erreicht. Testet man es im gleichen VEGF-Assay, der in Beispiel 23.3 beschrieben wurde, auf Potenz, fanden sich in diesem Assay nicht-nachweisbare Niveaus der Hemmung der VEGF-Bindung an den VEGF-Rezeptor.
  • Beispiel 24
  • 24.1 Generation eines Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb ohne Linker
  • Es wurde ein Derivat des oben in Beispiel 23 beschriebenen mAbdAb erzeugt, dessen ”STG”-Linker zwischen dem dAb und der CH3-Domäne des mAb entfernt wurde. SDM wurde verwendet, um die Rückstände, die den STG-Linker kodieren, aus dem Plasmid zu entfernen, das die schwere Kette kodiert. Sequenz-überprüfte Klone (SEQ ID NR: 164 und 243) für leichte bzw. schwere Ketten wurden ausgewählt und DNA-Präparationen in großem Maßstab mit Hilfe des Qiagen Mega Prep Kits nach Herstellerangaben hergestellt. mAbdAbs wurden in HEK293-6E-Zellen von Säugetieren mittels transienter Transfektionstechniken durch Co-Transfektion von leichten und schweren Ketten exprimiert (SEQ ID NR: 175 und 137).
  • 24.2 Aufreinigung und SEC-Analyse des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb ohne Linker
  • Dieser Dual-Targeting mAbdAb wurde aus geklärtem Expressions-Überstand unter Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie nach etablierten Verfahren aufgereinigt. Die Konzentrationen der gereinigten Proben wurden mittels Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt. Die SDS-PAGE-Analyse ( ) der gereinigten Probe (als DMS4011 bezeichnet) zeigt einen nicht-reduzierten Probelauf bei ~170 kDa wogegen die reduzierte Probe zwei Bänder bei ~25 und ~60 kDa aufweist, die der leichten Kette bzw. der dAb-fusionierten schweren Kette entsprechen.
  • Für die Größenausschlusschromatographie(SEC)-Analyse wurde der anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb auf eine S-200 10/300 GL-Säule (eines HPLC-Systems) aufgebracht, prä-äquilibriert und in PBS bei 1 ml/min ausgeführt. Das SEC-Profil zeigt eine einzige Art als symmetrischen Peak ausgeführt (siehe ).
  • 24.3 Potenz des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb ohne Linker
  • Die Fähigkeit des Moleküls VEGF und EGFR zu neutralisieren wurde gemäß der in den Methoden 12 bzw. 13 beschriebenen Verfahren bestimmt. Assay-Daten wurden mit Hilfe von GraphPad Prism analysiert. Potenz-Werte wurden aus einer sigmoiden Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt und die Daten dem besten Passform-Modell angepasst. Die Anti-EGFR-Potenz ( ) dieses mAbdAb (als DMS4011 bezeichnet) wurde als 3,529 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-EGFR mAb einen EC50-Wert von 3,647 nM ergab. Im Anti-VEGF-Rezeptorbindungs-Assay ( ) war der EC50 des mAbdAb (als DMS4011 bezeichnet) 342,9 pM (0,3429 nM), während ein Anti-VEGF-Kontroll mAb einen EC50 von 214,1 pM (0,2141 nM) ergab. Im Ergebnis zeigen die Assay-Daten, dass das Konstrukt von Beispiel 24, ein Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb ohne Linker gegen beide Antigene potent ist.
  • Beispiel 25
  • 25.1 Generation eines Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb mit längeren Linkern
  • Es wurden Derivate des oben in Beispiel 23 beschriebenen mAbdAb erzeugt, deren Linker zwischen dem dAb und der CH3-Domäne des mAb durch das Einfügen von einem oder zwei Wiederholungen eines flexiblen ”GGGGS”-Motivs in das Plasmid, das die schwere Kette kodiert, verlängert wurde.
  • Das erste Molekül mit einer schweren Ketten-Sequenz wie in der SEQ ID NR: 175 festgelegt, hat eine Wiederholung dieses Motivs und daher den Linker:
    ”STGGGGGS”.
  • Das zweite Molekül mit einer schweren Ketten-Sequenz wie in der SEQ ID NR: 177 festgelegt, hat zwei Wiederholungen dieses Motivs und daher den Linker:
    ”STGGGGGSGGGGS”.
  • Diese wurden beide unabhängig mit der gleichen leichten Kette gekoppelt wie in Beispiel 23 verwendet (SEQ ID NO: 243)
  • Sequenz-überprüfte Klone für leichte bzw. schwere Ketten wurden ausgewählt und DNA-Präparationen in großem Maßstab mit Hilfe des Qiagen Mega Prep Kits nach Herstellerangaben hergestellt. mAbdAbs wurden in HEK293-6E-Zellen von Säugetieren mittels transienter Transfektionstechniken durch Co-Transfektion von leichten und schweren Ketten exprimiert (SEQ ID NR: 176 und 137, die als DMS4023 bezeichnet wird; und SEQ ID NR: 178 und 137, die als DMS4024 bezeichnet wird).
  • 25.2 Aufreinigung und SEC-Analyse des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb mit längeren Linkern
  • Diese Dual-Targeting mAbdAbs wurden aus geklärtem Expressions-Überstand unter Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie nach etablierten Verfahren aufgereinigt. Die Konzentrationen der gereinigten Proben wurden mittels Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt. Die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proben DMS4023 und DMS4024 ( ) zeigen nicht-reduzierte Probeläufe bei ~170 kDa wogegen die reduzierten Proben zwei Bänder bei ~25 und ~60 kDa aufweisen, die der leichten Kette bzw. der dAb-fusionierten schweren Kette entsprechen.
  • Für die Größenausschlusschromatographie(SEC)-Analyse wurde der anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb auf eine S-200 10/300 GL-Säule (eines HPLC-Systems) aufgebracht, prä-äquilibriert und in PBS bei 1 ml/min ausgeführt. Die SEC-Profile für beide DMS4023 ( ) und DMS4024 ( ) zeigen eine einzige Art mit einem leicht abschließenden Höhepunkt.
  • 25.3 Potenz des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb mit längeren Linkern
  • Die Fähigkeit des Moleküls VEGF und EGFR zu neutralisieren wurde gemäß der in den Methoden 12 bzw. 13 beschriebenen Verfahren bestimmt. Assay-Daten wurden mit Hilfe von GraphPad Prism analysiert. Potenz-Werte wurden aus einer sigmoiden Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt und die Daten dem besten Passform-Modell angepasst. Die Anti-EGFR-Potenz ( ) des mAbdAb DMS4023 wurde als 7,066 nM berechnet und die Potenz von mAbdAb DMS4024 wurde als 6,420 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-EGFR mAb einen EC50-Wert von 7,291 nM ergab. Im Anti-VEGF-Rezeptorbindungs-Assay ( ) war der EC50 des mAbdAb DMS4023 91,79 pM (0,091 nM) und der EC50 des mAbdAb DMS4024 war 90 pM (0,0906 nM) während ein Anti-VEGF-Kontroll mAb einen EC50 von 463,2 pM (0,4632 nM) ergab. Im Ergebnis zeigen die Assay-Daten, dass die Konstrukte von Beispiel 25, ein Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb mit längeren Linkern gegen beide Antigene potent ist.
  • Beispiel 26
  • 26.1 Generation eines Dual-Targeting anti-VEGF/anti-EGFR mAbdAb
  • Dieser Dual-Targeting mAbdAb wurde durch die Fusion eines dAb zum C-Terminus der schweren Kette des mAb konstruiert. Die Expressionskassetten der schweren und leichten Ketten des anti-VEGF mAb wurden zuvor konstruiert. Die Restriktionsschnittstellen, die zur Klonierung verwendet wurden, sind die gleichen wie in Beispiel 10 gezeigt (SAII und HindIII).
  • Die DNA-Kodierung eines Anti-EGFR dAb (DOM16-39-542) wurde dann mittels PCR amplifiziert (unter Verwendung von Primern, die HindIII und SalI-Enden kodieren) und dann in die modifizierte 3' kodierende Region eingeführt, was zu einem Linker von ”STG” (Serin, Threonin, Glycin) zwischen dem mAb und dem dAb führt.
  • Sequenz-überprüfte Klone (SEQ ID NR: 179 und 181) für leichte bzw. schwere Ketten wurden ausgewählt und DNA-Präparationen in großem Maßstab mit Hilfe des Qiagen Mega Prep Kits nach Herstellerangaben hergestellt. mAbdAbs wurden in HEK293-6E-Zellen von Säugetieren mittels transienter Transfektionstechniken durch Co-Transfektion von leichten und schweren Ketten exprimiert (SEQ ID NR: 180 und 182).
  • 26.2 Aufreinigung und SEC-Analyse des Dual-Targeting anti-VEGF/anti-EGFR mAbdAb
  • Diese Dual-Targeting mAbdAbs wurden aus geklärtem Expressions-Überstand unter Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie nach etablierten Verfahren aufgereinigt. Die Konzentrationen der gereinigten Proben wurden mittels Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt. Die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Probe (als DMS4009 bezeichnet) ( ) zeigen nicht-reduzierte Probeläufe bei ~170 kDa wogegen die reduzierten Proben zwei Bänder bei ~25 und ~60 kDa aufweisen, die der leichten Kette bzw. der dAb-fusionierten schweren Kette entsprechen.
  • Für die Größenausschlusschromatographie(SEC)-Analyse wurde der anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb auf eine S-200 10/300 GL-Säule (eines HPLC-Systems) aufgebracht, prä-äquilibriert und in PBS bei 1 ml/min ausgeführt. Das SEC-Profil für dieses Molekül ( ) zeigt eine einzige Art mit einem symmetrischen Peak.
  • 26.3 Potenz des Dual-Targeting anti-VEGF/anti-EGFR mAbdAb
  • Die Fähigkeit des Moleküls VEGF und EGFR zu neutralisieren wurde gemäß der in den Methoden 12 bzw. 13 beschriebenen Verfahren bestimmt. Assay-Daten wurden mit Hilfe von GraphPad Prism analysiert. Potenz-Werte wurden aus einer sigmoiden Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt und die Daten dem besten Passform-Modell angepasst. Die Anti-EGFR-Potenz ( ) des mAbdAb DMS4009 wurde als 132,4 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-EGFR mAb einen EC50-Wert von 6,585 nM ergab. Im Anti-VEGF-Rezeptorbindungs-Assay ( ) war der EC50 des mAbdAb war 539,7 pM (0,5397 nM), während ein Anti-VEGF-Kontroll mAb einen EC50 von 380,5 pM (0,3805 nM) ergab. Im Ergebnis zeigen die Assay-Daten, dass das Konstrukt von Beispiel 26, ein Dual-Targeting anti-VEGF/anti-EGFR mAbdAb gegen beide Antigene potent ist.
  • Beispiel 27
  • 27.1 Generation eines Dual-Targeting anti-EGFR/anti-IL-13 mAbdAb Dieser Dual-Targeting mAbdAb wurde durch die Fusion eines dAb zum C-Terminus der schweren Kette des mAb konstruiert. Die Expressionskassetten der schweren und leichten Ketten des anti-EGFR mAb wurden zuvor konstruiert. Die Restriktionsschnittstellen, die zur Klonierung verwendet wurden, sind die gleichen wie in Beispiel 10 gezeigt (SAII und HindIII).
  • Die DNA-Kodierung eines Anti-IL-13 dAb (DOM10-53-474) wurde dann mittels PCR amplifiziert (unter Verwendung von Primern, die HindIII und SalI-Enden kodieren) und dann in die modifizierte 3' kodierende Region eingeführt, was zu einem Linker von ”STG” (Serin, Threonin, Glycin) zwischen dem mAb und dem dAb führt. Sequenz-überprüfte Klone (SEQ ID NR: 243 und 183) für leichte bzw. schwere Ketten wurden ausgewählt und DNA-Präparationen in großem Maßstab mit Hilfe des Qiagen Mega Prep Kits nach Herstellerangaben hergestellt. mAbdAbs wurden in HEK293-6E-Zellen von Säugetieren mittels transienter Transfektionstechniken durch Co-Transfektion von leichten und schweren Ketten exprimiert (SEQ ID NR: 137 und 184).
  • 27.2 Aufreinigung und SEC-Analyse des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-IL-13 mAbdAb
  • Diese Dual-Targeting mAbdAbs wurden aus geklärtem Expressions-Überstand unter Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie nach etablierten Verfahren aufgereinigt. Die Konzentrationen der gereinigten Proben wurden mittels Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt. Die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Probe (als DMS4029 bezeichnet) ( ) zeigen nicht-reduzierte Probeläufe bei ~170 kDa wogegen die reduzierten Proben zwei Bänder bei ~25 und ~60 kDa aufweisen, die der leichten Kette bzw. der dAb-fusionierten schweren Kette entsprechen.
  • Für die Größenausschlusschromatographie(SEC)-Analyse wurde der anti-EGFR/anti-IL-13 mAbdAb auf eine S-200 10/300 GL-Säule (eines HPLC-Systems) aufgebracht, prä-äquilibriert und in PBS bei 0,5 ml/min ausgeführt. Das SEC-Profil für dieses Molekül ( ) zeigt eine einzige Art mit einem symmetrischen Peak.
  • 27.3 Potenz des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-IL-13 mAbdAb
  • Die Fähigkeit des Moleküls EGFR und IL-13 zu neutralisieren wurde gemäß der in den Methoden 13 bzw. 25 beschriebenen Verfahren bestimmt. Assay-Daten wurden mit Hilfe von GraphPad Prism analysiert. Potenz-Werte wurden aus einer sigmoiden Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt und die Daten dem besten Passform-Modell angepasst. Die Anti-EGFR-Potenz ( ) des mAbdAb DMS4029 wurde als 9,033 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-EGFR mAb einen EC50-Wert von 8,874 nM ergab. Im IL-13 zellbasierten Neutralisierungs-Assay ( ) war der EC50 des mAbdAb war 1,654 nM, während ein Anti-IL-13-Kontroll dAb einen EC50 von 0,996 nM ergab. Im Ergebnis zeigen die Assay-Daten, dass das Konstrukt von Beispiel 27, ein Dual-Targeting anti-EGFR/anti-IL-13 mAbdAb gegen beide Antigene potent ist.
  • Beispiel 28
  • 28.1 Generation eines Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb, wobei sich der dAb in der leichten Kette befindet
  • Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAbs wurden durch Fusion eines dAb an den C-Terminus der mAb leichten Kette konstruiert. Die Expressionskassetten der schweren und leichten Ketten des anti-EGFR mAb wurden zuvor konstruiert.
  • Zur Einführung von Restriktionsstellen für die dAb-Insertion in die leichte Kette wurde eine ortsspezifische Mutagenese verwendet, um BamHI und HindIII Klonierungsstellen mit dem mAb Leichtketten-Expressionsvektor als Vorlage zu erstellen. Die DNA-Kodierung eines Anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) wurde dann mittels PCR amplifiziert (unter Verwendung von Primern, die HindIII und SalI-Enden kodieren) und dann in die modifizierte 3' kodierende Region eingeführt, was zu einem Linker von entweder ”GSTG” oder ”GSTVAAPS” zwischen dem mAb und dem dAb führt.
  • Das erste Molekül mit einer leichten Ketten-Sequenz wie in SEQ ID NR: 187 festgelegt, verfügt über einen Linker von ”GSTG”.
  • Das erste Molekül mit einer leichten Ketten-Sequenz wie in SEQ ID NR: 189 festgelegt, verfügt über einen Linker von ”GSTVAAPS”.
  • Diese wurden beide unabhängig mit der schweren Kette der SEQ ID NR: 245 gekoppelt.
  • Sequenz-überprüfte Klone für leichte bzw. schwere Ketten wurden ausgewählt und DNA-Präparationen in großem Maßstab mit Hilfe des Qiagen Mega Prep Kits nach Herstellerangaben hergestellt. mAbdAbs wurden in HEK293-6E-Zellen von Säugetieren mittels transienter Transfektionstechniken durch Co-Transfektion von leichten und schweren Ketten exprimiert (SEQ ID NR: 188 und 139, die als DMS4013 bezeichnet wird; und SEQ ID NR: 190 und 139, die als DMS4027 bezeichnet wird).
  • 28.2 Aufreinigung und SEC-Analyse des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb, wobei sich der dAb in der leichten Kette befindet
  • Diese Dual-Targeting mAbdAbs wurden aus geklärtem Expressions-Überstand unter Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie nach etablierten Verfahren aufgereinigt. Die Konzentrationen der gereinigten Proben wurden mittels Spektrophotometrie aus Messungen der Lichtabsorption bei 280 nm bestimmt. Die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proben DMS4013 und DMS4027 ( ) zeigen nicht-reduzierte Probeläufe bei ~170 kDa wogegen die reduzierten Proben zwei Bänder bei ~38 und ~50 kDa aufweisen, die der dAb-fusionierten leichten Kette bzw. der schweren Kette entsprechen.
  • Für die Größenausschlusschromatographie(SEC)-Analyse wurde der anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb auf eine S-200 10/300 GL-Säule (eines HPLC-Systems) aufgebracht, prä-äquilibriert und in PBS bei 1 ml/min ausgeführt. Die SEC-Profile für beide DMS4013 ( ) und DMS4027 ( ) zeigen eine einzige Art mit einem symmetrischen Höhepunkt.
  • 28.3 Potenz des Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb, wobei sich der dAb in der leichten Kette befindet
  • Die Fähigkeit des Moleküls VEGF und EGFR zu neutralisieren wurde gemäß der in den Methoden 12 bzw. 13 beschriebenen Verfahren bestimmt. Assay-Daten wurden mit Hilfe von GraphPad Prism analysiert. Potenz-Werte wurden aus einer sigmoiden Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt und die Daten dem besten Passform-Modell angepasst. Die Anti-EGFR-Potenz ( ) des mAbdAb DMS4013 wurde als 7,384 nM berechnet und die Potenz von mAbdAb DMS4027 wurde als 7,554 nM berechnet, während die Kontrolle, ein Anti-EGFR mAb einen EC50-Wert von 7,093 nM ergab. Im Anti-VEGF-Rezeptorbindungs-Assay ( ) war der EC50 des mAbdAb DMS4013 1,179 nM und der EC50 des mAbdAb DMS4027 war 0,1731 nM, während ein Anti-VEGF-Kontroll mAb einen EC50 von 0,130 nM ergab. Im Ergebnis zeigen die Assay-Daten, dass die Konstrukte von Beispiel 28, ein Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb, wobei sich der dAb auf der leichten Kette befindet, gegen beide Antigene potent ist.
  • Beispiel 29
  • Biacore-Analyse von Dual-Targeting anti-EGFR/anti-VEGF und anti-TNF/anti-VEGF mAbdAbs
  • Die in Beispiel 11 beschriebenen mAbdAbs (anti-TNF/anti-VEGF mAbdAb) und Beispiele 23, 24, 25 und 28 (anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAbs) wurden einer BIAcore-Analyse unterzogen, um die kinetischen Assoziations- und Dissoziationskonstanten der Bindung um die Bindung an die entsprechenden Antigene zu bestimmen. Die Analyse wurde mit dem BIAcoreTM 3000 Instrument durchgeführt. Die Temperatur des Gerätes wurde auf 25°C eingestellt. Als Laufpuffer wurde ein HBS-EP-Puffer verwendet. Experimentelle Daten wurden mit der höchstmöglichen Rate für das Instrument erhoben. Eine Durchflussküvette mit einem CM5-Chip im Forschungsstadium wurde unter Verwendung von Standard-Amin Kopplungschemie nach Herstellerangaben mit Protein A beschichtet; eine zweite Durchflussküvette wurde gleich behandelt – es wurde aber ein Puffer anstelle von Protein A verwendet, um einen Referenzoberfläche zu erzeugen. Die Durchflussküvette mit Protein A wurde dann verwendet, um die mAbdAbs zu erfassen. Antigen wurde in Serie in 2× seriellen Verdünnungen gemäß Tabelle 37 injiziert. Mehrere Verdünnungen wurden in Doppelbestimmung durchgeführt. Injektionen von Puffer allein anstelle von Liganden wurden für die Hintergrund-Subtraktion verwendet. Die Proben wurden über den zur Gerätesoftware gehörenden Kinetik-Wizard in zufälliger Reihenfolge injiziert. Die Oberfläche wurde am Ende eines jeden Zyklus durch die Injektion von 10 mM Glycin, pH 1,5 regeneriert. Sowohl die Datenverarbeitung als auch die kinetische Anpassung wurden unter Verwendung der BIAevaluation Software 4.1 durchgeführt. Die Tabelle 37 zeigt die Durchschnittswerte von doppelten Ergebnissen (des gleichen Laufs). Die für DMS4010 gezeigten Mehrfachwerte repräsentieren zwei Experimente zu verschiedenen Zeiten. Der Wert von 787 nM überschätzt wahrscheinlich die Affinität aufgrund der analysierten Ligandenkonzentrationen Tabelle 37
    mAbdAb Beispiel Molekülnummer Antigen Ka [1/Ms] Kd [1/s] KD [pM] Top-Konzentration (nM) Anz. Verdünnungen
    11 4000 TNF 3,65E+05 4,16E–05 112 10 6
    23 4010 EGFR 1,47E+06 1,16E–03 787 1,25 5
    23 4010 EGFR 3,14E+05 1,16E–03 3700 10 6
    24 4011 EGFR 1,81E+05 1,11E–03 6120 5 6
    28 4013 EGFR 2,20E+05 1,17E–03 5310 20 5
    28 4013 EGFR 3,01E+05 1,40E–03 4650 10 7
    25 4023 EGFR 2,38E+05 1,10E–03 4630 5 7
    25 4024 EGFR 2,34E+05 1,10E–03 4700 10 6
    28 4027 EGFR 2,80E+05 1,14E–03 4060 20 7
    11 4000 VEGF 9,19E+05 4,78E–04 520 2,5 5
    23 4010 VEGF 9,85E+05 1,90E–04 193 10 8
    24 4011 VEGF 6,17E+05 1,26E–04 204 10 8
    28 4013 VEGF 7,62E+05 3,64E–04 478 2 5
    25 4023 VEGF 1,60E+06 2,40E–04 150 2 6
    25 4024 VEGF 1,01E+06 2,30E–04 224 2 4
    28 4027 VEGF 7,47E+05 2,23E–04 229 2 5
  • Beispiel 30
  • Trispezifische Antikörper, die auf ein Gerüst bispezifischer Antikörper fusionierte Einzeldomain-Antikörper umfassen
  • 30.1 Konstruktion
  • Gene für schwere und leichte variable Domänen eines bispezifischen Antikörpermoleküls, das spezifisch für IL-18 und IL-12-Antigene ist (für weitere Informationen siehe WO 2007/024715 ), wurden de-novo mit geeigneten Stellen für Restriktionsenzyme und hinzugefügten Signalsequenzen entwickelt. Unter Verwendung von Standard-Techniken der Molekularbiologie, wurden die variablen schweren Domains in einen Expressionsvektor mit der konstanten IgG1 Region schwerer Ketten kloniert, die an eine Anti-IL4-Antikörperregion DOM9-112-210 (SEQ ID NR: 4) über einen TVAAPS-Linker am C-Terminus der konstanten Region fusioniert ist. Die variable Domäne der leichten Kette wurde in einer ähnlichen Weise in einen Expressionsvektor mit der konstanten Region einer Ck-Sequenz kloniert. Die konstruierten und exprimierten Antikörper sind in Tabelle 38 aufgeführt. Tabelle 38
    Antikörper ID Beschreibung SED ID NR: der Armnosäuresequenz
    BPC1616 IL-12/18 DVDH TVAAPS-210 schwere Kette 193
    IL-12/18 DVD Kappa leichte Kette 194
  • 30.2 Expression und Aufreinigung
  • In Kurzfassung: 25 ml HEK293 Zellen bei 1,5 × 106 Zellen/ml wurden co-transfiziert mit Expressionsplasmiden für schwere und leichte Ketten, welche zuvor mit 293Fectin-Reagenz (Invitrogen Nr. 51-0031) inkubiert wurden. Diese wurden in einen Schüttler-Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und 95% RH verbracht. Nach 24 Stunden wurde Trypton-Nährmedium hinzugefügt und die Zellen für weitere 48 Stunden angewachsen. Der Überstand wurde durch Zentrifugation abgeerntet und die IgG-Werte über einen ELISA quantifiziert. Der daraus resultierende mAbdAb wurde als BPC1616 (SEQ ID NR: 193 und 194) bezeichnet
  • 30.3 IL-12 Bindungs-ELISA
  • Der Zell-Überstand der Transfektionen wurde auf die Bindung an rekombinantes humanes IL-12 untersucht. In Kurzfassung: mit 2 μg/ml anti-human IL-12 (R & D Systems AF219NA) beschichtete ELISA-Platten wurden mit Blocking-Lösung (4% BSA in Tris gepufferte Kochsalzlösung) blockiert. Die Platten wurden dann mit 25 ng/ml rekombinantem humanem IL-12 (PeproTech # 200-12) in Blocking-Lösung beladen. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann in TBS + 0,05% Tween 20 (TEST) gewaschen. Verschiedene Verdünnungen des Zellüberstands sowie irrelevante Kontroll-Antikörper (Pascolizumab und ein isotypentsprechendes hIgG) wurden in Blocking-Lösung verdünnt hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann in TEST gewaschen. Die Detektion einer Bindung wurde durch Zugabe eines Peroxidase-markierten humanen Anti-Kappa-Leichtketten-Antikörper (Sigma A7164) in einer Verdünnung von 1/1000 in Blocking-Lösung erreicht. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann in TEST gewaschen. Die Platte wurde durch Zugabe von OPD-Substrat (Sigma P9187) entwickelt und die Farbentwicklung durch Zugabe von 3M H2SO4 gestoppt. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Plattenleser gemessen und die mittlere Extinktion geplottet.
  • Die Ergebnisse sind in dargestellt und zeigen, dass BPC1616 an rekombinantes humanes IL-12 bindet, während die beiden Kontroll-Antikörper keine Bindung zeigten.
  • 30.4 IL-18 Bindungs-ELISA
  • Der Zell-Überstand der Transfektionen wurde auf die Bindung an rekombinantes humanes IL-18 untersucht. In Kurzfassung: ELISA-Platten wurden mit mit 1 μg/ml humanem IL-18 (hergestellt von GSK) beschichtet und mit Blocking-Lösung (4% BSA in Tris gepufferter Kochsalzlösung) blockiert. Verschiedene Verdünnungen des Zellüberstands sowie irrelevante Kontroll-Antikörper (Pascolizumab und ein Isotopentsprechendes humanes IgG) wurden in Blocking-Lösung verdünnt hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann in TBS + 0,05% Tween 20 (TEST) gewaschen. Die Detektion einer Bindung wurde durch Zugabe eines Peroxidase-markierten humanen Anti-Kappa-Leichtketten-Antikörper (Sigma A7164) in einer Verdünnung von 1/1000 in Blocking-Lösung erreicht. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann in TEST gewaschen. Die Platte wurde durch Zugabe von OPD-Substrat (Sigma P9187) entwickelt und die Farbentwicklung durch Zugabe von 3M H2SO4 gestoppt. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Plattenleser gemessen und die mittlere Extinktion geplottet. Die Ergebnisse sind in dargestellt und zeigen, dass BPC1616 an rekombinantes humanes IL-18 bindet, während die beiden Kontroll-Antikörper keine Bindung zeigen.
  • 30.5 IL-4 Bindungs-ELISA
  • Der Zell-Überstand der Transfektionen wurde auf die Bindung an rekombinantes humanes IL-4 untersucht. In Kurzfassung: ELISA-Platten wurden mit mit 1 μg/ml humanem IL-4 (hergestellt von GSK) beschichtet und mit Blocking-Lösung (4% BSA in Tris gepufferter Kochsalzlösung) blockiert. Verschiedene Verdünnungen des Zellüberstands sowie ein anti-IL-4 monoklonaler Antikörper (Pascolizumab) und ein irrelevanter Antikörper (Isotop-entsprechendes Kontroll-hIgG) wurden in Blocking-Lösung verdünnt hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann in TBS + 0,05% Tween 20 (TEST) gewaschen. Die Detektion einer Bindung wurde durch Zugabe eines Peroxidase-markierten humanen Anti-Kappa-Leichtketten-Antikörper (Sigma A7164) in einer Verdünnung von 1/1000 in Blocking-Lösung erreicht. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann in TEST gewaschen. Die Platte wurde durch Zugabe von OPD-Substrat (Sigma P9187) entwickelt und die Farbentwicklung durch Zugabe von 3M H2SO4 gestoppt. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Plattenleser gemessen und die mittlere Extinktion geplottet.
  • Die Ergebnisse sind in dargestellt und zeigen, dass BPC1616 und Pascolizumab an rekombinantes humanes IL-4 binden, während der Kontroll-Antikörper keine Bindung zeigt.
  • Beispiel 31
  • Trispezifische mAbdAbs bestehend aus zwei einzelnen hintereinander am C-Terminus eines monoklonalen Antikörpers fusionierten Domänen
  • 31.1 Konstruktion
  • Es wurden drei trispezifische Antikörper (mAbdAb-dAb) gebaut, bei denen zwei einzelne Domänen-Antikörper hintereinander am C-Terminus der schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers fusioniert sind.
  • In Kurzfassung: eine BgIII-Restriktionsschnittstelle am N-Terminus und BamHI-Restriktionsschnittstelle am C-Terminus wurden mittels PCR eingeführt, um die DNA-Sequenzen zu flankieren, die die Domain-Antikörper in die DOM10-53-474 (SEQ ID NR: 5), DOM9-155-154 (SEQ ID NR: 3) und DOM9-112-210 (SEQ ID NO: 4) kodieren.
  • Das für den DOM10-53-474 Domain-Antikörper kodierende DNA-Fragment wurde dann in eine BamHI-Stelle eines Säugetier-Expressionsvektors kloniert, der die schwere Kette eines anti IL-5 monoklonalen Antikörpers kodiert, die mit einem anti-IL-4-Domänen-Antikörper DOM9-112-210 ( SEQ ID NR: 71) fusioniert ist. Die DNA-Fragmente, die die DOM9-155-154 und DOM9-112-210 Domänen-Antikörper kodieren, wurden beide unabhängig voneinander in die BamHI-Stelle eines Säugetier-Expressionsvektors geklont, welcher die schwere Kette eines monoklonalen Anti-CD20-Antikörpers kodiert, und mit einem Anti-IL-13-Domänen-Antikörper DOM10-53-474 (SEQ ID NR: 116) fusioniert ist. Die daraus resultierenden Expressionsvektoren kodieren für eine schwere Kette mit zwei Einzeldomänen-Antikörper, die auf den C-Terminus fusioniert sind. Die Protein-Sequenzen der schweren Ketten sind in den SEQ ID NR: 195, 196 und 197 spezifiziert, wie sie in Tabelle 39 festgelegt sind.
  • Tabelle 39 ist eine Zusammenfassung der konstruierten mAbdAbs. Tabelle 39
    Antikörper ID Beschreibung SEQ ID NR: der Aminosäuresequenz
    BPC1008 Anti-IL-5-Schwerkette-G4S-dAb474-TVAAPSGS-dAb210 195
    Anti-IL-5 leichte Kette 66
    BPC1009 Anti CD-20 Schwere Kette-TVAAPSGS-dAb 154-TVAAPSGS-dAb474 196
    Anti-CD-20 leichte Kette 117
    BPC1010 Anti-CD-20 Schwere Kette-TVAAPSGS-dAb210-TVAAPSGS-dAb474 197
    Anti-CD-20 leichte Kette 117
  • 31.2 Expression und Aufreinigung
  • Expressionsplasmide, die für die schweren und leichten Ketten von BPC1008, BPC1009 und BPC1010 kodieren, wurden zu HEK2936E-Zellen mittels 293fectin (Invitrogen, 12347019) ko-transfiziert. A-Trypton-Nährmedium wurde am folgenden Tag der Zellkultur zugegeben und das überstehende Material wurde nach ca. 2-6 Tagen nach der anfänglichen Transfektion geerntet. Die Antikörper wurden mit einer Protein A-Säule gereinigt, bevor sie in Bindungsassays getestet wurden.
  • 31.3: IL-4 Bindungs-ELISA
  • Hochbindende 96-Well Platten wurden mit 5 μg/ml humam IL-4 (GSK) in Coating-Puffer (0,05 M Bicarbonat pH 9,6, Sigma C-3041) 3 beschichtet und über Nacht bei 4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 (TEST) gewaschen. 100 μl der Blocking-Lösung (1% BSA in TBST-Puffer) wurde in jede Vertiefung geben und die Platten für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die gereinigten Antikörper nacheinander über die Platten in Blocking-Lösung verdünnt. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten dreimal gewaschen. Anti-humaner Kappa-Leichtketten-spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper von der Ziege (Sigma A7164) wurde 1:2000 in einer Blocking-Lösung verdünnt und jedem Well 50 μl hinzugefügt. Die Platten wurden für eine Stunde inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen, dann wurde OPD (o-Phenylendiamin-dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung in jedes Well hinzugefügt; die Reaktion wurde 5 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion wurde bei 490 nm mit einem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines basalen Endpunkt-Protokolls abgelesen.
  • Die Ergebnisse des ELISA werden in gezeigt und bestätigen, dass die Antikörper BPC1008, 1009 und BPC1010 an rekombinantes humanes IL-4 binden. Die positive Kontrolle Pascolizumab zeigte ebenso Bindung an rekombinantes IL-4, wohingegen die negative Kontrolle anti-IL-13 mAb und Mepolizumab keine Bindung an IL-4 zeigte. Die Antikörper BPC1009 und BPC1010 wurden ebenso in einem separaten Experiment getestet, das ähnliche Ergebnisse wie die in gezeigten, aufwies.
  • 31.4: IL-5 Bindungs-ELISA
  • Hochbindende 96-Well Platten wurden mit 5,9 μg/ml humanem IL-5 (GSK) in Coating-Puffer (0,05 M Bikarbonat pH 9,6) beschichtet und über Nacht bei 4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 (TEST) gewaschen. 100 μl der Blocking-Lösung (1% BSA in TEST-Puffer) wurde in jede Vertiefung geben und die Platten für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die gereinigten Antikörper nacheinander über die Platten in Blocking-Lösung verdünnt. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten dreimal gewaschen. Anti-humaner Kappa-Leichtketten-spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper von der Ziege (Sigma A7164) wurde 1:2000 in einer Blocking-Lösung verdünnt und jedem Well 50 μl hinzugefügt. Die Platten wurden für eine Stunde inkubiert. Die Proben wurden dreimal gewaschen, dann wurde OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung in jedes Well hinzugefügt; dann wurde die Reaktion 5 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion wurde bei 490 nm mit einem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines basalen Endpunkt-Protokolls abgelesen.
  • zeigt die Ergebnisse der ELISA, die bestätigt, dass die Antikörper BPC1008 an rekombinantes humanes IL-5 binden, wohingegen BPC1009 und BPC1010 keine Bindung an IL-5 zeigten. Die positive Kontrolle Pascolizumab zeigte ebenso Bindung an rekombinantes IL-5, wohingegen die negative Kontrolle anti-IL-13 mAb und Pascolizumab keine Bindung an IL-5 zeigte.
  • IL-13 Bindungs-ELISA
  • Hochbindende 96-Well Platten wurden mit 5 μg/ml humanem IL-13 (GSK) in Coating-Puffer (0,05 M Bicarbonat pH 9,6 – Sigma C-3041) 3 beschichtet und über Nacht bei 4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 (TEST) gewaschen. 100 μl der Blocking-Lösung (1% BSA in TBST-Puffer) wurde in jede Vertiefung geben und die Platten für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die gereinigten Antikörper nacheinander über die Platten in Blocking-Lösung verdünnt. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten dreimal gewaschen. Anti-humaner Kappa-Leichtketten-spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper von der Ziege (Sigma A7164) wurde 1:2000 in einer Blocking-Lösung verdünnt und jedem Well 50 μl hinzugefügt. Die Platten wurden für eine Stunde inkubiert. Die Proben wurden dreimal gewaschen, dann wurde OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung in jedes Well hinzugefügt; dann wurde die Reaktion 5 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion wurde bei 490 nm mit einem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines basalen Endpunkt-Protokolls abgelesen.
  • Die Ergebnisse des ELISA werden in gezeigt und bestätigen, dass die Antikörper BPC1008, 1009 und BPC1010 an rekombinantes humanes IL-13 binden. Die positive Kontrolle anti-IL-13 mAb zeigte ebenso Bindung an rekombinantes IL-13, wohingegen die negative Kontrolle Pascolizumab und Mepolizumab keine Bindung an IL-13 zeigte. Die Antikörper BPC1009 und BPC1010 wurden ebenso in einem separaten Experiment getestet, das ähnliche Ergebnisse wie die in gezeigten, aufwies.
  • Beispiel 32
  • mAbdAbs mit Einzeldomänen-Antikörpern, die auf monovalente Gerüste fusioniert sind
  • 32.1 Die Konstruktion von mAbdAbs
  • bispezifischen Antikörpern, die eine Fusion zwischen einem monovalenten Antikörper (für weitere Informationen siehe WO2006015371 und WO2007059782 ) und einem Domänen-Antikörper DOM-15-26-293 enthalten, wurden wie folgt aufgebaut. DNA-Sequenzen, die für die Anti-c-Met Knob-into-Hole der schweren Kette (SEQ ID NR: 202 und 203) kodieren, wurden unter Verwendung einer PCR-basierten Strategie und nachfolgender Site-gerichteten Mutagenese konstruiert. Die DNA-Sequenz, die für die Anti-c-Met Unibody schwere Kette (SEQ ID NR: 204) kodiert, wurde unter Verwendung einer PCR-basierten Strategie gefolgt von der Entfernung der Hinge-Region durch einen PCR-basierten Ansatz konstruiert. Für Fusionskonstrukte wurden zusätzlich BamHI und EcoRI Restriktionsschnittstellen am C-Terminus der Expressionskassette der schweren Kette eingebracht, um die anschließende Klonierung der DNA-Sequenz (kodiert die Aminosäuren 455-570 von SEQ ID NR: 75) des Anti-VEGF-A Domänen-Antikörpers (DOM-15-26-593) als ein BamHI-EcoRI-Fragment eines bestehenden Vektors zu verbessern. Die daraus resultierenden Expressionsvektoren kodieren für einen Anti-VEGFA Domänen-Antikörper, der über einen GS-Linker auf den C-Terminus der schweren Kette fusioniert ist (SEQ ID NR: 198, 199 und 201). Die DNA-Sequenz, die für die Anti-c-Met Leichte Kette kodiert (SEQ ID NR: 200), wurde mit Hilfe einer PCR-basierten Strategie aufgebaut.
  • Der Bau des BPC1604 wird in Beispiel 14 beschrieben. Tabelle 40 unten ist eine Zusammenfassung der monovalenten Gerüst-mAbdAbs und Antikörpern, die generiert und exprimiert wurden. Tabelle 40
    Antikörper ID Beschreibung SED ID NR: der Aminosäureseq uenz
    BPC1017 Anti-cMet 5D5v2 Schwere Kette (Hole)-GS-dAb593 198
    Anti-cMet 5D5v2 Schwere Kette (Knob)-GS-dAb593 199
    Anti-cMET 5D5v2 Leichte Kette 200
    BPC1018 Anti-cMet 5D5v2 IgG4 Schwere Kette (UNI BODY)-GS-dAb593 201
    Anti-cMET 5D5v2 Leichte Kette 200
    BPC1019 Anti-cMET 5D5v2 Leichte Kette (Hole) 202
    Anti-cMET 5D5v2 Leichte Kette (Knob) 203
    Anti-cMET 5D5v2 Leichte Kette 200
    BPC1020 Anti-cMet 5D5v2 IgG4 Schwere Kette (UNIBODY) 204
    Anti-cMET 5D5v2 Leichte Kette 200
  • 32.2 Expression und Aufreinigung
  • Expressionsplasmide, die für die schweren und leichten Ketten von BPC1008, BPC1009 und BPC1010 kodieren, wurden zu HEK2936E-Zellen mittels 293fectin (Invitrogen, 12347019) ko-transfiziert. A-Trypton-Nährmedium wurde am folgenden Tag der Zellkultur zugegeben und das überstehende Material wurde nach ca. 2-6 Tagen nach der anfänglichen Transfektion geerntet. Die Antikörper wurden mit einer Protein A-Säule gereinigt, bevor sie in Bindungsassays getestet wurden.
  • 32.3 HGF Rezeptorbindungs-ELISA
  • Hochbindende 96-Well Platten wurden mit 5 μg/ml rekombinantem humanem HGF R (c-MET)/Fc Chimär (R&D System, Katalognummer: 358-MT/CF) in Coating-Puffer (0,05 M Bicarbonat pH 9,6 β Sigma C-3041) 3 beschichtet und über Nacht bei 4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 (TEST) gewaschen. 100 μL der Blocking-Lösung (1% BSA in TBST-Puffer) wurde in jede Vertiefung geben und die Platten für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen. Danach wurden die gereinigten Antikörper nacheinander über die Platten in Blocking-Lösung verdünnt. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten dreimal gewaschen. Anti-humaner Kappa-Leichtketten-spezifischer Peroxidasekonjugierter Antikörper von der Ziege (Sigma A7164) wurde 1:2000 in einer Blocking-Lösung verdünnt und jedem Well hinzugefügt. Die Platten wurden für eine Stunde inkubiert. Die Proben wurden dreimal gewaschen, dann wurde OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung in jedes Well hinzugefügt; dann wurde die Reaktion 5 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion wurde bei 490 nm mit einem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines basalen Endpunkt-Protokolls abgelesen.
  • Die Ergebnisse des ELISA werden in gezeigt und bestätigen, dass die mAbdAbs BPC1017, und BPC1018 an rekombinantes humanes c-MET in vergleichbarer Aktivität zu den Antikörpern BPC1019 und BPC1020 binden. Die negative Kontrolle Pascolizumab und BPC1604 (ein IGF-1R/VEGF mAbdAb) zeigten keine Bindung an c-MET.
  • 32.4 VEGF Bindungs-ELISA
  • Hochbindende 96-Well Platten wurden mit 0,4 μg/ml humanem VEGF (GSK) in PBS beschichtet und über Nacht bei 4°C gelagert. Die Platten wurden zweimal mit Trisgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 (TEST) gewaschen. 100 μL der Blocking-Lösung (4% BSA in TEST-Puffer) wurde in jede Vertiefung geben und die Platten für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt durchgeführt. Danach wurden die gereinigten Antikörper nacheinander über die Platten in Blocking-Lösung verdünnt. Die Platten wurden nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur gewaschen. Antihumaner Kappa-Leichtketten-spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper von der Ziege wurde 1:2000 in einer Blocking-Lösung verdünnt und jedem Well hinzugefügt.
  • Die Platten wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) SigmaFast Substratlösung in jedes Well hinzugefügt; die Reaktion wurde 5 Minuten später durch Zugabe von 25 μl 3M Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion wurde bei 490 nm mit einem VersaMax Tunable Mikroplatten-Reader (Molecular Devices) unter Verwendung eines basalen Endpunkt-Protokolls abgelesen.
  • zeigt die Ergebnisse des ELISA, der bestätigt, dass die mAbdAbs BPC1017 und BPC1018 an rekombinantes humanes VEGF binden. Auch die positive Kontrolle BPC1604 zeigte eine Bindung an rekombinantes humanes VEGF, wohingegen Pascolizumab, BPC1019 und BPC1020 keine Bindung an VEGF zeigten.
  • Beispiel 33
  • mAbdAbs mit den anti-IL13 dAbs DOM10-53-546 dAb und DOM10-53-567
  • 33.1 Konstruktion, Expression und Aufreinigung
  • Die in Tabelle 41 gezeigten Anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs wurden kloniert und transient in HEK2936E-Zellen exprimiert, gereinigt (wie in den Beispielen 1, 1.3 bzw. 1.5 behandelt.) Tabelle 41
    Name Beschreibung Sequenz-ID-Nr.
    PascoH-TVAAPS-546 H-Kette = Pascolizumab schwere Kette-TVAAPS-DOM10-53-546 dAb L-Kette = Pascolizumab leichte Kette 157 (= H-Kette) 15 (= L-Kette)
    PascoH-TVAAPS-567 H-Kette = Pascolizumab schwere Kette-TVAAPS-DOM10-53-567 dAb L-Kette = Pascolizumab leichte Kette 159 (= H-Kette) 15 (= L-Kette)
  • Gereinigtes PascoH-TVAAPS-546 und PascoH-TVAAPS-567 mAbdAbs wurden durch Größenausschlusschromatographie (SEC) und Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die SEC- und SDS-PAGE-Daten sind in den , , 165 und 166 dargestellt.
  • 33.2 Biacore-Analyse der Bindung an IL-13 und IL-4
  • Gereinigtes PascoH-TVAAPS-546 und PascoH-TVAAPS-567 wurden auf Bindung an humanes IL-13 und IL-4 mit dem BIAcoreTM T100 bei 25°C (wie in Methoden 4 und 5 beschrieben) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 42 gezeigt. Tabelle 42
    Molekül (gereinigtes Material) Bindungsaffinität, KD (nM)
    Humanes IL-4 Humanes IL-13
    on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (nM) on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (nM)
    PascoH-TVAAPS-546 4,92 E+6 2,37 E–5 0,00482 2,26 E+5 1,69 E–4 0,747
    PascoH-TVAAPS-567 enge Bindung beobachtet 4,46 E+5 1,70 E–5 0,038
    Anti-humanes IL-13 mAb bindet nicht 1,00 E+6 3,78 E–4 0,377
    Pascolizumab 4,25 E+6 2,43 E–5 0,00572 bindet nicht
  • Die diesem Test getesteten mAbdAbs banden beide IL-4 mit sehr hoher Affinität (Hinweis: für PascoH-TVAAPS-567 ging dies über die Empfindlichkeit der Maschine hinaus) und mit ähnlicher Bindungsaffinität zu der des anti-humanen IL4 mAb allein (Pascolizumab ). PascoH-TVAAPS-546 und PascoH-TVAAPS-567 banden beide IL-13. Beachten Sie, dass die Anti-IL-13 dAbs allein (DOM10-53-546 und DOM10-53-567) in diesem Assay nicht getestet wurden, da das dAb auf dem Protein A- oder Anti-Human-IgG-beschichteten CM5-Chip nicht erfasst werden kann; stattdessen wurde das anti-humane 1113 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Diese mAbdAbs wurden auch auf Bindung an Cynomolgus-IL-13 mit dem BIAcoreTM T100 bei 25°C (wie beschrieben in Methode 23) getestet. Diese Daten sind in Tabelle 43 dargestellt. Es wurde eine mAbdAb-Capture-Höhe zwischen 500 und 750 relativen Ansprecheinheiten erzielt; sechs IL-13-Konzentrationskurven (256, 64, 16, 4, 1 und 0,25 nM) wurden sowohl auf mAbdAbs als auch auf Anti-IL13 mAb bewertet. Tabelle 43
    Molekül (gereinigtes Material) Bindungsaffinität für Cynomolgus-IL-13 (KD)
    on-Rate (ka, Ms–1) off-Rate (kd, s–1) KD (nM)
    PascoH-TVAAPS-546 1,67 E+6 2,09 E–2 12,5
    PascoH-TVAAPS-567 5,92 E+5 5,22 E–3 8,8
    Anti-IL13 mAb 4,79 E+5 8,22 E–5 0,171
  • PascoH-TVAAPS-546 und PascoH-TVAAPS-567 banden beide Cynomolgus-IL-13 mit ähnlichen Bindungsaffinitäten. Beachten Sie, dass die Anti-IL-13 dAbs allein (DOM10-53-546 und DOM10-53-567) in diesem Assay nicht getestet wurden, da das dAb auf dem Protein A- oder Anti-Human-IgG-beschichteten CM5-Chip nicht erfasst werden kann; stattdessen wurde das anti-humane IL13 mAb als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-13-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • 33.3 Neutralisierung von humanem IL-13 und Cynomolgus-IL-13 in TF-1-Zellen-Bioassays
  • Gereinigtes PascoH-TVAAPS-546 und PascoH-TVAAPS-567 wurden auf Neutralisierung von humanem IL-13 und Cynomolgus-IL-13 in TF-1-Zellen-Bioassays (wie in Methode 8 bzw. Methode 20 beschrieben) getestet. und zeigen die Neutralisierungsdaten für humanes IL-13 bzw. Cynomolgus-IL-13 (in den TF-1-Zellen-Bioassays). DOM10-53-616 wurde als positive Kontrolle für die Neutralisierung von IL-13 in diese Bioassays aufgenommen. Ein dAb mit Spezifität für ein irrelevantes Antigen (negative Kontrolle dAb) wurde ebenfalls als negative Kontrolle für die Neutralisierung von IL-13 aufgenommen. Darüber hinaus wurden auch PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 in diesen Assays getestet.
  • Sowohl PascoH-TVAAPS-546 als auch PascoH-TVAAPS-567 neutralisierte die Bioaktivität von humanem und Cynomolgus-IL-13 in den TF-1-Zellen-Bioassays vollständig.
  • ND50-Werte wurden aus dem Datensatz berechnet. Der ND50-Wert ist die Konzentration von mAbdAb oder mAb oder dAb, die in der Lage ist, die Bioaktivität von IL-13 um 50% zu neutralisieren. Der mittlere ND50-Wert, die Standardabweichung (SD) und die Anzahl der Tests (n) sind in Tabelle 44 dargestellt. Tabelle 44
    Molekül Mittlerer ND50-Wert und Standardabweichung (nM)
    humanes IL-13 Cyno-IL-13
    Mittel (SD) n Mittel (SD) n
    PascoH-TVAAPS-546 1,522 1 33,88 1
    PascoH-TVAAPS-567 2,06 1 38,25 1
    DOM10-53-616 0,536 1 3,57 1
    Negatives Kontroll-dAb neutralisierte nicht neutralisierte nicht
  • Beispiel 34
  • mAbdAbs mit IgG2, IgG4 und IgG4PE schwere Kette-konstante Regionen
  • 34.1 Konstruktion von mAbdAbs
  • Die schwere Kette-konstante Regionen der humanen Antikörper-Isotypen IgG2, IgG4 und einer Variante IgG4(IgG4PE)-Gene wurden mittels PCR aus bestehenden Konstrukten verstärkt und mithilfe von Standardtechniken der Molekularbiologie in einen Expressionsvektor kloniert, der PascoH-GS-474 schwere Kette kodiert (SEQ ID-Nr. 48). Die entworfenen und getesteten mAbdAbs-Antikörper sind in Tabelle 45 dargestellt. Tabelle 45
    Antikörper-ID Beschreibung SED ID-Nr. der Aminosäuresequenz
    BPC1617 PascoH IgG2-GS-474 207
    Pasco Kappa 15
    BPC1618 PascoH IgG4-GS-474 208
    Pasco Kappa 15
    BPC1619 PascoH IgG4PE-GS-474 209
    Pasco Kappa 15
  • 34.2 Expression
  • Die in Tabelle 45 dargestellten mAbdAbs wurden zusammen mit PascoH-GS-474 (SEQ ID-Nr. 48 und 15), das als BPC1000 bezeichnet wird, exprimiert. Kurz dargestellt, 750 μl HEK293-Zellen mit 1,5 × 106 Zellen/ml wurden mit schwere- und leichte-Kette-Expressionsplasmiden, die zuvor mit 293-fectin-Reagenz (Invitrogen Nr. 51-0031) inkubiert wurden, co-transfiziert. Diese wurden bei 37°C, 5% CO2, und 95% RH in einen Schüttlerinkubator gesetzt. Nach 1 Stunde wurde Trypton-Fütterungsmedium hinzugefügt, und die Zellen wuchsen weitere 72 Stunden. Der Überstand wurde durch Zentrifugation geerntet.
  • 34.3 IL-4-bindendes ELISA
  • Die Überstände, die diese mAbdAbs enthielten, wurden auf Bindung an rekombinantes humanes IL-4 bewertet. Kurz dargestellt, ELISA-Platten wurden bei 1 μg/ml mit humanem IL-4 (bei GSK hergestellt) beschichtet und mit Blockierlösung blockiert (4% BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung). Verschiedene Verdünnungen des Zellüberstands, eines anti-IL-4 monoklonalen Antikörpers (Pascolizumab) und eines Antikörpers mit irrelevanter Spezifität (586 anti-IL-13) wurden hinzugefügt. Alle Proben wurden in Blockierlösung verdünnt. Die Platte wurde vor dem Waschen in TBS + 0,05% Tween 20 (TEST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Bindung wurde durch Zugabe eines Peroxidase-gelabelten anti-humanen Kappa-leichte Kette-Antikörpers (Sigma A7164) bei einer Verdünnung von 1/1000 in Blockierlösung erkannt. Die Platte wurde vor dem Waschen in TEST für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde durch Zusatz von OPD-Substrat (Sigma P9187) entwickelt und die Farbentwicklung durch Zugabe von 3M H2SO4 gestoppt.
  • Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Plattenleser gemessen und die mittlere Absorption eingezeichnet.
  • Die in dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die mAbdAbs, die die alternativen Isotypen enthalten, sich alle an humanes IL-4 binden. Für die mAbdAbs BPC1000, BPC1617, BPC1618 und BPC1619 wurde die Menge an Antikörpern im Überstand nicht quantifiziert; deshalb werden die in aufgeführten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterials dargestellt. Für die anti-IL4- und IL-13-Kontrollantikörper wurde gereinigtes Material im Assay verwendet, und es wurde eine Startkonzentration von 1 μg/ml bzw. 1 μg/ml verwendet (welche einem Verdünnungsfaktor von 1 in entspricht).
  • 34.4 IL-13-bindendes ELISA
  • Die Überstände, die diese mAbdAbs enthielten, wurden auf Bindung an rekombinantes humanes IL-13 bewertet. Kurz dargestellt, ELISA-Platten wurden bei 5 μg/ml mit humanem IL-13 (bei GSK hergestellt) beschichtet und mit Blockierlösung blockiert (4% BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung). Verschiedene Verdünnungen des Zellüberstands, eines anti-IL-13 monoklonalen Antikörpers (586) und eines Antikörpers mit irrelevanter Spezifität (Pascolizumab anti-IL-4) wurden hinzugefügt. Alle Proben wurden in Blockierlösung verdünnt. Die Platte wurde vor dem Waschen in TBS + 0,05% Tween 20 (TEST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Bindung wurde durch Zugabe eines Peroxidase-gelabelten anti-humanen Kappaleichte Kette-Antikörpers (Sigma A7164) bei einer Verdünnung von 1/1000 in Blockierlösung erkannt. Die Platte wurde vor dem Waschen in TEST für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde durch Zusatz von OPD-Substrat (Sigma P9187) entwickelt und die Farbentwicklung durch Zugabe von 3M H2SO4 gestoppt. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Plattenleser gemessen und die mittlere Absorption eingezeichnet.
  • Die in dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die bispezifischen Antikörper, die die alternativen Isotypen enthalten, sich alle an humanes IL-13 binden. Für die bispezifischen Antikörper BPC1000, BPC1617, BPC1618 und BPC1619 wurde die Menge an Antikörpern im Überstand nicht quantifiziert; deshalb werden die in aufgeführten Daten als Verdünnungsfaktor des NEAT-Überstandsmaterials dargestellt. Für die anti-IL4- und IL-13-Kontrollantikörper wurde gereinigtes Material im Assay bei einer Startkonzentration von 1 μg/ml bzw. 1 μg/ml verwendet (welche einem Verdünnungsfaktor von 1 in entspricht).
  • Beispiel 35
  • Alternative Anti-IL-13/IL-4 mAbdAbs
  • 35.1 Konstruktion von anti-IL-13/IL-4 mAbdAbs mit alternativen variablen Regionssequenzen
  • Mittels Standardtechniken der Molekularbiologie wurden DNA-Sequenzen, die die alternative schwere Kette variable Region Anti-IL-13 mAb mit der Bezeichnung 'C1' und 'D1' kodieren, aus bestehenden Konstrukten über einen TVAAPSGS-Linker am C-Terminus der konstanten Region zu einem Expressionsvektor mit DNA übertragen, welche die hIgG1-konstante Region, fusioniert an einen Anti-IL-4-Domäne-Antikörper (DOM9-112-210) kodiert. DNA-Sequenzen, die die alternative leichte Kette variable Region IL-13 mAbs mit der Bezeichnung 'M0' und 'N0' kodieren, wurden de novo zusammengebaut und in Expressionsvektoren mit der humanen Ck-konstanten Region kloniert. Diese alternative schwere- und leichte-Kette-Antikörper-variable-Regionen umfassen die gleichen CDR-Regionen wie der in SEQ ID-Nr. 12 und 13 beschriebene Anti-IL-13-Antikörper, jedoch mit einer alternativen humanisierten variablen Rahmenregion.
  • 35.2 Konstruktion von mAbdAbs mit den variablen Regionen der Anti-IL-13 mAb '656'
  • Mittels Standardtechniken der Molekularbiologie wurde eine DNA-Sequenz, die die schwere Kette-variable Region des humanisierten Anti-IL-13 mAb '656' kodiert, aus einem bestehenden Konstrukt übertragen und über einen TVAAPS-Linker am C-Terminus der konstanten Region in einen Expressionsvektor mit DNA kloniert, welche die hIgG1-konstante Region, fusioniert an einen Anti-IL-4-Domäne-Antikörper (DOM9-112-210), kodiert. Eine DNA-Sequenz, die die variable leichte Region kodiert, wurde aus einem bestehenden. Konstrukt übertragen und in einen Expressionsvektor mit der humanen Ck-konstanten Region kloniert.
  • 35.3 Expression von mAbdAbs
  • Kurz dargestellt, 25 ml HEK293-Zellen mit 1,5 × 106 Zellen/ml wurden mit schwere- und leichte-Kette-Expressionsplasmiden, die zuvor mit 293-fectin-Reagenz (Invitrogen Nr. 51-0031) inkubiert wurden, co-transfiziert. Diese wurden bei 37°C, 5% CO2, und 95% RH in einen Schüttlerinkubator gesetzt. Nach 24 Stunden wurde Trypton-Fütterungsmedium hinzugefügt, und die Zellen wuchsen weitere 72 Stunden.
  • Der Überstand wurde durch Zentrifugation geerntet und die IgG-Werte durch ELISA quantifiziert. Die konstruierten und exprimierten Antikörper sind in Tabelle 46 dargestellt. Tabelle 46
    Antikörper-ID/Name Beschreibung SED ID-Nr. der Aminosäuresequenz
    BPC1607 H-Kette = C1-TVAAPSGS-210 151
    L-Kette = M0 Kappa 154
    BPC1608 H-Kette = C1-TVAAPSGS-210 151
    L-Kette = N0 Kappa 153
    BPC1609 H-Kette = C1-TVAAPSGS-210 151
    L-Kette = 586 Kappa (Anti-humanes IL-13 mAb leichte Kette) 13
    BPC1610 H-Kette = D1-TVAAPSGS-210 152
    L-Kette = M0 Kappa 154
    BPC1611 H-Kette = D1-TVAAPSGS-210 152
    L-Kette = N0 Kappa 153
    BPC1612 H-Kette = D1-TVAAPSGS-210 152
    L-Kette = 586 Kappa (Anti-humanes IL-13 mAb leichte Kette) 13
    BPC1613 H-Kette = 586H-TVAAPS-210 (Anti-humanes IL-13 mAb schwere Kette-TVAAPS-DOM9-112-210 dAb) 88
    L-Kette = M0 Kappa 154
    BPC1614 H-Kette = 586H-TVAAPS-210 (Anti-humanes IL-13 mAb schwere Kette-TVAAPS-DOM9-112-210 dAb) 88
    L-Kette = N0 Kappa 153
    BPC1615 H-Kette = 656H-TVAAPS-210 (Anti-humanes IL-13 mAb 2 schwere Kette-TVAAPS-DOM9-112-210 dAb) 155
    L-Kette = 656 Kappa (Anti-humanes IL-13 mAb 2 leichte Kette) 156
    BPC1602 (586H-TVAAPS-210 GS-entfernt) H-Kette = 586H-TVAAPS-210 (Anti-humanes IL-13 mAb schwere Kette-TVAAPS-DOM9-112-210 dAb) 88
    L-Kette = 586 Kappa (Anti-humanes IL-13 mAb leichte Kette) 13
  • 35.4 Bindung von mAbdAbs an IL-13
  • Die Bindungsaktivität des mAbdAbs an IL-13 wurde durch ELISA bewertet. Kurz dargestellt, 5 μg/ml rekombinantes E.coli-exprimiertes humanes IL-13 (hergestellt und gereinigt bei GSK) wurde zur Beschichtung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen verwendet. Die Vertiefungen wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert; mAbdAb-Konstrukte wurden anschließend die Platte herunter titriert. Bindung wurde unter Verwendung einer 1/1000-Verdünnung des anti-humanen Kappa leichte Kette-Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Katalog-Nummer A7164, Sigma-Aldrich) erkannt.
  • zeigt, dass alle untersuchten Moleküle in der Lage waren, sich an humanes IL-13 zu binden.
  • Obwohl BPC1615 in diesem ELISA eine Bindung zeigte, war es nicht möglich, die Konzentration dieses Moleküls genau zu quantifizieren, und deshalb sind die IL-13-bindenden ELISA-Daten für dieses Molekül in nicht eingetragen. Es wurde auch in einem unabhängigen Biacore-Assay gezeigt, dass BPC1615 eine hohe Affinitätsbindung an IL-13 hat (Tabelle 47).
  • 35.5 Bindung von anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs an IL-13 mittels BIAcoreTM
  • Zellüberstände aus den HEK-Zelltransfektionen wurden ebenfalls mittels BIAcoreTM bei 25°C auf Bindung an rekombinantes E.Coli-exprimiertes humanes IL-13 getestet (wie in Methode 4 beschrieben). BPC1601 wurde als gereinigtes Protein getestet.
  • Bindungsaffinitäten, dargestellt in Tabelle 47, bestätigen, dass alle Antikörper eine hohe Affinitätsbindung an humanes IL-13 zeigen. Tabelle 47
    ka kd KD (nM)
    C1-NAAPSGS-210 & M0kappa BPC1607 5.15E+5 8.89E–4 1.73
    C1-TVAAPSGS-210 & N0kappa BPC1608 4.90E+5 8.83E–4 1.80
    C1-TVAAPSGS-210 & 586kappa BPC1609 7.55E+5 7.61E–4 1.01
    D1-TVAAPSGS-210 & M0kappa BPC1610 3.31E+5 4.66E–4 1.41
    D1-TVAAPSGS-210 & N0kappa BPC1611 2.59E+5 3.31E–4 1.28
    D1-NAAPSGS-210 & 586kappa BPC1612 4.85E+5 2.74E–4 0.565
    586H TVAAPS-210 & M0kappa BPC1613 5.54E+5 4.45E–4 0.804
    586H NAAPS-210 & N0kappa BPC1614 5.49E+5 4.42E–4 0.805
    656H TVAAPS-210 & 656kappa BPC1615 4.89E+6 4.17E–4 0.085
    586H-TVAAPS-210noGS BPC1602 8.21E+5 4.62E–4 0.562
    586H-nolinker-210noGS BPC1601 purified 8.93E+5 3.93E–4 0.440
  • Beispiel 36
  • Generierung von mAbdAb mit Spezifität für humanes IL-5 und humanes IL-13
  • 36.1 Konstruktion und Expression von mAbdAb
  • Ein mAbdAb-Molekül mit der in SEQ ID-Nr. 65 dargestellten schweren Kette und der in SEQ ID-Nr. 72 dargestellten leichten Kette, wurde in HEK2936E-Zellen exprimiert.
  • Dieses wurde bezeichnet als MepolizumabL-G4S-474 oder BPC1021.
  • 36.2 Bindung von Anti-IL5mAb-anti-IL13dAb an IL-5 und IL-13
  • Dieses mAbdAb (im Zellüberstand) wurde auf Bindung an humanes IL-13 in einem direkt bindenden ELISA (wie in Methode 1 beschrieben) getestet. Die entsprechenden Daten sind in dargestellt. Die Probe wurde transfiziert und doppelt getestet und als Probe A und Probe B bezeichnet.
  • Dieses mAbdAb band IL-13. Gereinigtes anti-humanes 1113 mAb allein wurde in diesen Test als positive Kontrolle für die IL-13-Bindung aufgenommen. Gereinigtes anti-humanes IL-4 mAb (Pascolizumab) und anti-humanes IL-5 mAb (Mepolizumab) wurden als negative Kontrollen für die IL-13-Bindung aufgenommen.
  • Dieses mAbdAb wurde auch für die Bindung an humanes IL-5 in einem direkt bindenden ELISA (wie in Beispiel 31.4 beschrieben) getestet. Die entsprechenden Daten sind in dargestellt.
  • MepolizumabL-G4S-474 band IL-5. Gereinigtes anti-humanes 114 mAb (Pascolizumab) und gereinigtes anti-humanes 13 mAb wurden als negative Kontrollen für die Bindung an IL-5 aufgenommen. Gereinigtes anti-humanes 115 mAb (Mepolizumab) wurde als positive Kontrolle zum Nachweis der IL-5-Bindung in diesem Assay verwendet.
  • Sequenzen Tabelle 49:
    Figure 01850001
  • Figure 01860001
  • Figure 01870001
  • Figure 01880001
  • Figure 01890001
  • Figure 01900001
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • bis : Beispiele Antigen-bindender Konstrukte
  • : Schematische Darstellung von mAbdAb-Konstrukten.
  • : SEC- und SDS-Page-Analyse bzgl. PascoH-G4S-474
  • : SEC- und SDS-Page-Analyse bzgl. PascoL-G4S-474
  • : SEC- und SDS-Page-Analyse bzgl. PascoH-474
  • : SEC- und SDS-Page-Analyse bzgl. PascoHL-G4S-474
  • : mAbdAb-Überstände, die sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-13 binden
  • : mAbdAb-Überstände, die sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-4 binden
  • : Gereinigte mAbdAbs, die sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-13 binden
  • : Gereinigte mAbdAbs, die sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-4 binden
  • : mAbdAb-Überstände, die sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-4 binden
  • : mAbdAb-Überstände, die sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-13 binden
  • : Gereinigtes mAbdAb, das sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-4 bindet
  • : Gereinigtes mAbdAb, das sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-13 bindet
  • : Gereinigtes mAbdAb, das sich in einem direkt bindenden ELISA an Makaken-IL-13 bindet
  • : mAbdAb-Bindungskinetik für IL-4 mittels BIAcoreTM
  • : mAbdAb-Bindungskinetik für IL-4 mittels BIAcoreTM
  • : mAbdAbs-Bindungskinetik für IL-13 mittels BIAcoreTM
  • : Fähigkeit von gereinigten anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs zur Neutralisierung von humanem IL-13 in einem TF-1-Zell-Bioassay
  • : Fähigkeit von gereinigten anti-IL13mAb-anti-IL4dAbs zur Neutralisierung von humanem IL-4 in einem TF-1-Zell-Bioassay
  • : Fähigkeit von gereinigten anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 zur Neutralisierung von humanem IL-4 in einem TF-1-Zell-Bioassay
  • : Fähigkeit von gereinigten anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 zur Neutralisierung von humanem IL-13 in einem TF-1-Zell-Bioassay
  • : Fähigkeit von gereinigten anti-IL4mAb-anti-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 und PascoHL-G4S-474 zur gleichzeitigen Neutralisierung von humanem IL-4 und humanem IL-13 in einem Doppel-Neutralisierungs-TF-1-Zell-Bioassay
  • : DOM10-53-474 SEC-MALLS
  • : DOM9-112-210 SEC-MALLS
  • : DOM9-155-25 SEC-MALLS
  • : DOM9-155-25 SEC-MALLS Überlagerung auf allen drei Signalen
  • : DOM9-155-147 SEC-MALLS
  • : DOM9-155-159 SEC-MALLS
  • : Kontrolle für MW-Zuweisung durch SEC-MALLS: BSA
  • : Schematische Darstellung eines trispezifischen mAbdAb-Moleküls
  • : Trispezifisches mAbdAb IL18mAb-210-474 (Überstände), das sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-18 bindet
  • : Trispezifisches mAbdAb IL18mAb-210-474 (Überstände), das sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-13 bindet
  • : Trispezifisches mAbdAb IL18mAb-210-474 (Überstände), das sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-4 bindet
  • : Trispezifisches mAbdAb Mepo-210-474 (Überstand), das sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-13 bindet
  • : Trispezifisches mAbdAb Mepo-210-474 (Überstand), das sich in einem direkt bindenden ELISA an humanes IL-4 bindet
  • : Klonierung von anti-TNF/anti-EGFR mAb-dAb
  • . SDS-PAGE-Analyse von anti-TNF/anti-EGFR mAb-dAb
  • . SEC-Profil von anti-TNF/anti-EGFR mAb-dAb (Beispiel 10)
  • . Anti-EGFR-Aktivität von Beispiel 10
  • . Anti-TNF-Aktivität von Beispiel 10
  • . SDS-PAGE-Analyse von anti-TNF/anti-VEGF mAb-dAb (Beispiel 11)
  • . SEC-Profil von anti-TNF/anti-VEGF mAb-dAb (Beispiel 11)
  • . Anti-VEGF-Aktivität von Beispiel 11
  • . Anti-TNF-Aktivität von Beispiel 11
  • . Klonierung von anti-VEGF/anti-IL1R1 dAb-erweitert-IgG (Beispiel 12)
  • . SDS-PAGE-Analyse von anti-TNF/anti-VEGF dAb-erweitertem IgG A (Beispiel 12)
  • . SDS-PAGE-Analyse von anti-TNF/anti-VEGF dAb-erweitertem IgG B (Beispiel 12)
  • . SEC-Profil von anti-TNF/anti-VEGF dAb-erweitertem IgG A (Beispiel 12)
  • : SEC-Profil von anti-TNF/anti-VEGF dAb-erweitertem IgG B (Beispiel 12)
  • . Anti-VEGF-Aktivität von Beispiel 12 (DMS2091)
  • Anti-VEGF-Aktivität von Beispiel 12 (DMS2090)
  • . Anti-IL1R1-Aktivität von Beispiel 12 (DMS2090)
  • : Anti-IL1R1-Aktivität von Beispiel 12 (DMS2091)
  • : Klonierung von anti-TNF/anti-VEGF/anti-EGFR mAb-dAb (Beispiel 13)
  • . SDS-PAGE-Analyse von anti-TNF/anti-VEGF/anti-EGFR mAb-dAb (Beispiel 13)
  • : Anti-VEGF-Aktivität von Beispiel 13
  • : Anti-TNF-Aktivität von Beispiel 13
  • : Anti-EGFR-Aktivität von Beispiel 13
  • : SEC-Analyse von gereinigten bispezifischen Antikörpern, BPC1603 (A), BPC1604 (B), BPC1605 (C), BPC1606 (D)
  • . Bindung von bispezifischen Antikörpern an immobilisiertes IGF-1R
  • . Bindung von bispezifischen Antikörpern an immobilisiertes VEGF
  • . Inhibition von Liganden-vermittelter Rezeptorphosphorylierung durch verschiedene bispezifische Antikörper
  • : Inhibition von Liganden-vermittelter Rezeptorphosphorylierung durch verschiedene bispezifische Antikörper
  • ADCC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper
  • : ADCC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper
  • : ADCC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper mittels kürzerem Dosisbereich
  • : ADCC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper mittels kürzerem Dosisbereich
  • : CDC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper
  • : CDC-Assay mit anti-CD20/IL-13 bispezifischem Antikörper
  • : BPC1803- und BPC1804-Bindung in rekombinantem humanem IGF-1R ELISA
  • : BPC1803- und BPC1804-Bindung in rekombinantem VEGF-bindendem ELISA
  • : BPC1805- und BPC1806-Bindung in rekombinantem humanem IGF-1R ELISA
  • : BPC1805- und BPC1806-Bindung in rekombinantem humanem HER2 ELISA
  • : BPC1807- und BPC1808-Bindung in rekombinantem humanem IGF-1R ELISA
  • : BPC1807- und BPC1808-Bindung in rekombinantem humanem HER2 ELISA
  • : BPC1809-Bindung in rekombinantem humanem 114 ELISA
  • : BPC1809-Bindung in RNAse A ELISA
  • : BPC1816-Bindung in rekombinantem humanem 114 ELISA
  • : BPC1816-Bindung in HEL ELISA
  • : BPC1801- und BPC1802-Bindung in rekombinantem humanem IGF-1R ELISA
  • : BPC1801- und BPC1802-Bindung in rekombinantem humanem VEGFR2 ELISA
  • BPC1823- und BPC 1822-Bindung in rekombinantem humanem IL-4 ELISA
  • BPC1823(Überstand mit höherer Konzentration)-Bindung in rekombinantem humanem IL-4 ELISA
  • : BPC1823- und BPC1822-Bindung in rekombinantem humanem TNF-α ELISA
  • : BPC1823(Überstand mit höherer Konzentration)-Bindung in rekombinantem humanem TNF-α ELISA
  • : SEC-Profil für PascoH-474 GS entfernt
  • : SEC-Profil für PascoH-TVAAPS-474 GS entfernt
  • : SEC-Profil für PascoH-GS-ASTKGPT-474, 2. GS entfernt
  • : SEC-Profil für 586H-210 GS entfernt
  • : SEC-Profil für 586H-TVAAPS-210 GS entfernt
  • : SDS PAGE für PascoH-474 GS entfernt (Bahn B) und PascoH-TVAAPS-474 GS entfernt (Bahn A)
  • : SDS PAGE für PascoH-GS-ASTKGPT-474, 2. GS entfernt [A = nicht reduzierende Bedingungen, B = reduzierende Bedingungen]
  • : SDS PAGE für 586H-210 GS entfernt (Bahn A)
  • : SDS PAGE für 586H-TVAAPS-210 GS entfernt (Bahn A)
  • : Gereinigtes PascoH-474, GS entfernt, und PascoH-TVAAPS-474, GS entfernt, Bindung in humanem IL-4 ELISA
  • : Gereinigtes PascoH-474, GS entfernt, und PascoH-TVAAPS-474, GS entfernt, Bindung in humanem IL-13 ELISA
  • : Gereinigtes PascoH-474, GS entfernt, und PascoH-TVAAPS-474, GS entfernt, PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 Bindung in humanem IL-13 ELISA
  • : mAbdAbs-Inhibition von humanem IL-4 gebunden an humanes IL-4Rα durch ELISA
  • : mAbdAbs-Inhibition von humanem IL-4 gebunden an humanes IL-4Rα durch ELISA
  • Neutralisierung von humanem IL-13 in TF-1-Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • : Neutralisierung von Makaken-IL-13 in TF-1-Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • : Neutralisierung von humanem IL-4 in TF-1-Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • : Neutralisierung von Makaken-IL-4 in TF-1-Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • : Fähigkeit von mAbdAbs zur Inhibition der Bindung von humanem IL-13 gebunden an humanes IL-13Rα2
  • : SEC-Profil für PascoH-616
  • : SEC-Profil für PascoH-TVAAPS_616
  • : SDS PAGE für PascoH-616 [E1 = nicht reduzierende Bedingungen, E2 = reduzierende Bedingungen]
  • : SDS PAGE für PascoH-TVAAPS-616 [A = nicht reduzierende Bedingungen, B = reduzierende Bedingungen]
  • : Gereinigtes PascoH-616 und PascoH-TVAAPS-616 Bindung in humanem IL-13 ELISA
  • : Neutralisierung von humanem IL-13 in TF-1-Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • : Neutralisierung von Makaken-IL-13 in TF-1-Zell-Bioassays durch mAbdAbs
  • : Inhibition der IL-4-Aktivität durch PascoH-474 GS entfernt
  • : Inhibition der IL-13-Aktivität durch PascoH-474 GS entfernt
  • : Inhibition der IL-4-Aktivität durch 586-TVAAPS-210
  • : Inhibition der IL-13-Aktivität durch 586-TVAAPS-210
  • : Inhibition der IL-4-Aktivität durch Pascolizumab
  • : Inhibition der IL-4-Aktivität durch DOM9-112-210
  • : Inhibition der IL-13-Aktivität durch anti-IL13 mAb
  • : Inhibition der IL-13-Aktivität durch DOM10-53-474
  • : Aktivität der Kontrolle von mAb und dAb in IL-4 Vollblut-Assay
  • : Aktivität der Kontrolle von mAb und dAb in IL-13 Vollblut-Assay
  • : Die Konzentration des verbleibenden Medikaments zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Dosisgabe, beurteilt durch ELISA gegen sowohl TNF als auch EGFR.
  • : Die Konzentration des verbleibenden Medikaments zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Dosisgabe, beurteilt durch ELISA gegen sowohl TNF als auch VEGF.
  • : Die Konzentration des verbleibenden Medikaments zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Dosisgabe, beurteilt durch ELISA gegen sowohl IL1R1 als auch VEGF.
  • : SDS-PAGE des gereinigten DMS4010
  • : SDS-Profil des gereinigten DMS4010
  • : Anti-EGFR-Wirksamkeit von DMS4010
  • : Anti-VEGF-Rezeptorbindungsassay
  • : Pharmakokinetisches Profil des doppelt abzielenden anti-EGFR/anti-VEGF mAbdAb
  • : SDS-PAGE-Analyse des gereinigten DMS4011
  • : SDS-Profil des gereinigten DMS4011
  • : Anti-EGFR-Wirksamkeit von DMS4011
  • : DMS4011 im Anti-VEGF-Rezeptorbindungsassay
  • : SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proben DMS4023 und DMS4024
  • : Das SEC-Profil für DMS4023
  • : Das SEC-Profil für DMS4024
  • : Anti-EGFR-Wirksamkeit von mAbdAb DMS4023
  • : DMS4023 und DMS4024 im Anti-VEGF-Rezeptorbindungsassay
  • : SDS-PAGE-Analyse des gereinigten DMS4009
  • : Das SEC-Profil für DMS4009
  • : Anti-EGFR-Wirksamkeit von mAbdAb DMS4009
  • : DMS4009 im Anti-VEGF-Rezeptorbindungsassay
  • : SDS-PAGE-Analyse des gereinigten DMS4029
  • : Das SEC-Profil für DMS4029
  • : Anti-EGFR-Wirksamkeit von mAbdAb DMS4029
  • : DMS4029 im IL-13 Zell-basierten Neutralisierungsassay
  • : SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proben DMS4013 und DMS4027
  • : Das SEC-Profil für DMS4013
  • : Das SEC-Profil für DMS4027
  • : Anti-EGFR-Wirksamkeit von mAbdAb DMS4013
  • : DMS4013 im Anti-VEGF-Rezeptorbindungsassay
  • : BPC1616-Bindung in rekombinantem humanem IL-12 ELISA
  • : BPC1616-Bindung in rekombinantem humanem IL-18 ELISA
  • : BPC1616-Bindung in rekombinantem humanem IL-4 ELISA
  • : BPC1008-, 1009- und BPC1010-Bindung in rekombinantem humanem IL-4ELISA
  • : BPC1008-Bindung in rekombinantem humanem IL-5 ELISA
  • : BPC1008-, 1009- und BPC1010-Bindung in rekombinantem humanem IL-13 ELISA
  • : BPC1017- und BPC1018-Bindung in rekombinantem humanem c-MET ELISA
  • : BPC1017- und BPC1018-Bindung in rekombinantem humanem VEGF ELISA
  • : SEC-Profil für PascoH-TVAAPS-546
  • : SEC-Profil für PascoH-TVAAPS-567
  • : SDS PAGE für PascoH-TVAAPS-546 [A = nicht reduzierende Bedingungen, B = reduzierende Bedingungen]
  • : SDS PAGE für PascoH-TVAAPS-567 [A = nicht reduzierende Bedingungen, B = reduzierende Bedingungen]
  • : Neutralisierungsdaten für humanes IL-13 im TF-1-Zell-Bioassay
  • : Neutralisierungsdaten für Makaken-IL-13 im TF-1-Zell-Bioassay
  • : mAbdAbs mit alternativen Isotypen Bindung in humanem IL-4 ELISA
  • : mAbdAbs mit alternativen Isotypen Bindung in humanem IL-13 ELISA
  • : BPC1818- und BPC1813-Bindung in rekombinantem humanem EGFR ELISA
  • : BPC1818- und BPC1813-Bindung in rekombinantem humanem VEGFR2 ELISA
  • : anti-IL5mAb-anti-IL13dAb-Bindung in IL-13 ELISA
  • : anti-IL5mAb-anti-IL13dAb-Bindung in IL-5 ELISA
  • : BPC1812-Bindung in rekombinantem humanem VEGFR2 ELISA
  • : BPC1812-Bindung in rekombinantem humanem EGFR ELISA
  • : mAbdAb-Bindung in humanem IL-13 ELISA
    Figure 01970001
    Figure 01980001
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    Figure 02770001
  • Die Erfindung bezieht sich auf Antigen-bindende Konstrukte mit einem Proteingerüst, die mit einer oder mehreren Epitop-bindenden Domänen verbunden sind, wobei das Antigen-bindende Konstrukt mindestens zwei Antigen-bindende Stellen hat, von denen mindestens eine von einer Epitop-bindenden Domäne und mindestens eine von einer gepaarten VH/VL-Domäne stammt, Methoden für die Herstellung solcher Konstrukte und deren Verwendungen.
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  • Zitierte Patentliteratur
    • - WO 93/08829 [0004]
    • - WO 94/04690 [0004]
    • - WO 2007/095338 [0004]
    • - WO 00/29004 [0015]
    • - US 20050043519 A [0015, 0469]
    • - US 7250297 B1 [0018]
    • - US 20070224633 [0018]
    • - EP 1641818 A1 [0019]
    • - US 20040132028 A1 [0022]
    • - US 20080139791 [0023, 0489]
    • - WO 2005056764 [0023]
    • - US 6818418 B1 [0023]
    • - WO 2008098796 [0025]
    • - EP 0307434 [0125]
    • - WO 02/092771 [0132]
    • - WO 2005/081854 [0132]
    • - WO 2007059782 [0154, 0639]
    • - WO 2006015371 [0154, 0639]
    • - WO 99/58679 [0183]
    • - WO 96/16990 [0183]
    • - US 4873316 [0184]
    • - US 6555313 B1 [0201]
    • - US 5733743 [0201]
    • - US 5969108 [0201]
    • - US 5702892 [0201]
    • - WO 99/20749 [0205, 0213, 0225]
    • - WO 01/57065 [0205]
    • - WO 99/58655 [0205]
    • - WO 97/08320 [0212, 0235]
    • - WO 99/02671 [0220]
    • - WO 00/40712 [0220]
    • - US 6297053 [0226]
    • - US 2007/0224633 [0469]
    • - WO 2005003156 A1 [0469]
    • - WO 2005/056764 [0487]
    • - WO 2007/024715 [0620]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Millstein und Mitarb., Nature 305 537-539 (1983) [0004]
    • - Traunecker und Mitarb., EMBO, 10, 1991, 3655-3659 [0004]
    • - Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) [0015]
    • - Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001) [0017]
    • - Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000) [0018]
    • - Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) [0020]
    • - Fachgutachten zu Prüfmedikationen 16(6), 909-917 (Juni 2007) [0020]
    • - J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999) [0021]
    • - J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003) [0022]
    • - PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) [0022]
    • - J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) [0022]
    • - Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005) [0023]
    • - Fachgutachten, Biol. Ther. 5, 783-797 (2005) [0024]
    • - Kapitel 7 – Nicht-Antikörper-Gerüste des Handbuches über therapeutische Antikörper (2007, herausgegeben von Stefan Dubel) [0026]
    • - Protein Science 15: 14-27 (2006) [0026]
    • - Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698 [0165]
    • - Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553 [0165]
    • - Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903 [0165]
    • - Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165 [0165]
    • - Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614 [0165]
    • - Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365 [0165]
    • - Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952 [0165]
    • - Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857 [0165]
    • - Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301 [0165]
    • - Amyloid-Fasern (James et al. (2007) J Mol Biol. 367: 603-8 [0165]
    • - Sambrook et al. [0181]
    • - Plückthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992) [0182]
    • - Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986) [0183]
    • - Lasmar U und Parkins D „The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci.Tech.today, Seite 129-137, Bd.3 (3. April 2000) [0190]
    • - Wang, W „Instability, stabilisation and formulation of liquid Protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188 [0190]
    • - Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T. J., Manning M. C., New York, NY: Plenum Press (1992) [0190]
    • - Akers, M. J. Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300 [0190]
    • - Imamura, K et al „Effects of types of sugar an stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274 [0190]
    • - Izutsu, Kkojima, S. ”Excipient crystalinity and its Protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039 [0190]
    • - Johnson, R, „Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for Protein lyophilization”, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922 [0190]
    • - Ha, E Wang W, Wang Y. j. „Peroxide formation in polysorbate 80 and Protein stability”, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264, (2002) [0191]
    • - Kabat („Sequences of Proteins of Immunological interest”, US Department of Health and Human Services) [0195]
    • - Chothia und Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917 [0195]
    • - Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999) [0196]
    • - Griffiths et al. [0201]
    • - Johnson et al. [0201]
    • - McCafferty et al. [0201]
    • - Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994) [0201]
    • - Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994) [0201]
    • - Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2): 121-133 (2001) [0201]
    • - Tomlinson et al., [0205]
    • - Deng et al., J. Biol. Chem., 269: 9533 (1994) [0211]
    • - Low et al., J. Mol. Biol., 260: 359 (1996) [0211]
    • - Hoogenboom and Winter (1992) [0212]
    • - Nissim et al. (1994) [0212]
    • - Griffiths et al. (1994) [0212]
    • - DeKruif et al. (1995) [0212]
    • - Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100 [0212]
    • - Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475 [0212]
    • - Landt, O. et al., Gene 96: 125-128 (1990) [0212]
    • - Horton, R. M. et al., Gene 77: 61-68 (1989) [0212]
    • - Tomlinson et al., [0213]
    • - Goldman, L. A., et al., Biotechniques, 21: 1013-1015 (1996) [0217]
    • - Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18: 5322 (1990) [0217]
    • - Hoogenboom und Winter (1992) [0218]
    • - Nissim et al. (1994) [0218]
    • - Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6 [0220]
    • - Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 [0223]
    • - Marks et al. 1991 [0224]
    • - Nissim et al. 1994 [0224]
    • - Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776 [0224]
    • - Stemmer in 1994, Nature 370: 389-391 [0226]
    • - Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901 [0227]
    • - Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877 [0227]
    • - Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799 [0227]
    • - Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628 [0227]
    • - Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220 [0227]
    • - Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800 [0227]
    • - Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1 [0227]
    • - Tomlinson et al. (1995) [0229]
    • - Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133 [0231]
    • - Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services [0231]
    • - Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889 [0235]
    • - Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533 [0235]
    • - Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359 [0235]
    • - Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457 [0235]
    • - Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381 [0235]
    • - Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457 [0235]
    • - Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692 [0235]
    • - Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245 [0235]
    • - De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97 [0235]
    • - Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100 [0235]
    • - Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475 [0235]
    • - Griffiths et al. (1994) [0236]
    • - Kabat et al definiert. (1991, supra) [0238]
    • - Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813 [0239]
    • - E. Meyers und W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: IL-17 (1988)) [0245]
    • - J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970) [0245]
    • - J. Chem. Phys. 16, 1093-1099 (1948) [0365]
    • - Methode von Boyd et al. (1995) J. Imm. Meth. 184: 29-38 [0461]
    • - Zahnd, C. et al. (2007), J. Mol. Biol., 369, 1015-1028 [0469]
    • - Standard-Techniken der [0620]

Claims (49)

  1. Ein Antigen-bindendes Konstrukt bestehend aus einem Proteingerüst, das mit einem oder mehreren Epitop-bindenden Domänen verknüpft ist, wobei das Antigen-bindende Konstrukt mindestens zwei Antigen-bindende Stellen hat, von denen mindestens eine von einer Epitop-bindenden Domäne und mindestens eine von einer gepaarten VH/VL-Domäne stammt.
  2. Ein Antigen-bindendes Konstrukt bestehend aus mindestens einem Homodimer bestehend aus zwei oder mehr Strukturen der Formel I:
    Figure 02790001
    wobei X eine konstante Antikörperregion bestehend aus konstanter schwerer Domäne 2 und konstanter schwerer Domäne 3 darstellt; R1, R4, R7 und R6 eine Domäne darstellen, die unabhängig au seiner Epitop-bindenden Domäne gewählt wurde; R2 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten schweren Kette 1 und einer Epitop-bindenden Domäne gewählt wurde; R3 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer gepaarten VH und einer Epitop-bindenden Domäne gewählt wurde; R5 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten leichten Kette und einer Epitop-bindenden Domäne gewählt wurde; R6 eine Domäne darstellt, die aus der Gruppe bestehend aus einer gepaarten VL und einer Epitop-bindenden Domäne gewählt wurde; n eine ganze Zahl darstellt, die unabhängig aus: 0, 1, 2, 3 und 4 gewählt wird; m eine ganze Zahl darstellt, die unabhängig aus: 0 und 1 gewählt wird, wobei die konstante schwere Kette 1- und die konstante leichte Kette-Domänen assoziiert sind; wobei mindestens eine Epitop-bindende Domäne präsent ist; und wenn R3 eine gepaarte VH-Domäne darstellt, R6 eine gepaarte VL-Domäne darstellt, sodass die beiden Domänen zusammen Antigen binden können.
  3. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 2 wobei und R6 ein gepaartes VL und R3 ein gepaartes VH darstellen.
  4. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 3, wobei entweder eine oder beide von R7 und R8 eine Epitop-bindende Domäne darstellen.
  5. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei entweder eine oder beide von R1 und R4 eine Epitop-bindende Domäne darstellen.
  6. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei R4 präsent ist.
  7. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei R1 R7 und R8 eine Epitop-bindende Domäne darstellen.
  8. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei R1 R7 und R8, und R4 eine Epitop-bindende Domäne darstellen.
  9. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens eine Epitop-bindende Domäne ein dAb ist.
  10. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 9, wobei das dAb ein humanes dAb ist.
  11. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 9, wobei das dAb ein Camelid-dAb ist.
  12. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 9, wobei das dAb ein Shark-dAb ist (NARV).
  13. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei mindestens eine Epitop-bindende Domäne von einem Gerüst abgeleitet ist, ausgewählt aus CTLA-4 (Evibody); Lipocalin; Protein A-abgeleitete Moleküle, wie z. B. Z-Domäne von Protein A (Affibody, SpA), A-Domäne (Avimer/Maxibody); Heat-Shock-Proteine, wie z. B. GroEI und GroES; Transferrin (Trans-body); Ankyrin-Repeat-Protein (DARPin); Peptid-Aptamer; C-Typ-Lectin-Domäne (Tetranectin); humanes γ-Crystallin und humanes Ubiquitin (Affilins); PDZ-Domänen; Scorpion-Toxinkunitz-artige Domänen von humanen Proteasehemmern; und Fibronectin (Adnectin).
  14. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 13, wobei die Epitop-bindende Domäne von einem Gerüst abgeleitet ist, ausgewählt aus einem Affibody, einem Ankyrin-Repeat-Protein (DARPin) und einem Adnectin.
  15. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Epitop-bindende Domäne aus einem dAb, einem Affibody, einem Ankyrin-Repeat-Protein (DARPin) und einem Adnectin ausgewählt ist.
  16. Ein Antigen-bindendes Konstrukt eines vorstehenden Anspruchs, wobei das bindende Konstrukt Spezifität für mehr als ein Antigen hat.
  17. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die erste bindende Stelle Spezifität für ein erstes Epitop an einem Antigen und die zweite bindende Stelle Spezifität für ein zweites Epitop an demselben Antigen hat.
  18. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Antigen-bindende Konstrukt in der Lage ist, IL-13 zu binden.
  19. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Antigen-bindende Konstrukt in der Lage ist, zwei oder mehr Antigene, gewählt aus IL-13, IL-5 und IL-4, zu binden.
  20. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 19, wobei das Antigen-bindende Konstrukt in der Lage ist, IL-13 und IL-4 gleichzeitig zu binden.
  21. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Antigen-bindende Konstrukt in der Lage ist, zwei oder mehr Antigene, gewählt aus VEGF, IGF-1R und EGFR, zu binden.
  22. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Antigen-bindende Konstrukt in der Lage ist, TNF zu binden.
  23. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 22, wobei das Antigen-bindende Konstrukt in der Lage ist, TNF und IL1-R zu binden.
  24. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 oder 9 bis 23, wobei das Proteingerüst ein Ig-Gerüst ist.
  25. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 24, wobei das Ig-Gerüst ein IgG-Gerüst ist.
  26. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 25, wobei das IgG-Gerüst aus IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 gewählt wird.
  27. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 oder 9 bis 26, wobei das Proteingerüst einen monovalenten Antikörper umfasst.
  28. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das IgG-Gerüst alle Domänen eines Antikörpers umfasst.
  29. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 oder 15 bis 28, das vier Domänen-Antikörper umfasst.
  30. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 29, wobei zwei der Domänen-Antikörper Spezifität für dasselbe Antigen haben.
  31. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 29, wobei alle Domänen-Antikörper Spezifität für dasselbe Antigen haben.
  32. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens eine der einfach-variablen Domänen mit einem Linker, der von 1 bis 150 Aminosäuren umfasst, direkt an das Ig-Gerüst angeschlossen ist.
  33. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 32, wobei mindestens eine der einfach-variablen Domänen mit einem Linker, der von 1 bis 20 Aminosäuren umfasst, direkt an das Ig-Gerüst angeschlossen ist.
  34. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 33, wobei mindestens eine der Epitop-bindenden Domänen mit einem Linker, ausgewählt aus einem der in SEQ ID-Nr.: 6 bis 11 angegebenen oder 'GS', oder einer Kombination davon, direkt an das Ig-Gerüst angeschlossen ist.
  35. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens eine der Epitop-bindenden Domänen humanes Serumalbumin bindet.
  36. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 21 bis 33 bestehend aus einer Epitop-bindenden Domäne, die am N-Terminus der leichten Kette an das Ig-Gerüst angeschlossen ist.
  37. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 21 bis 33 bestehend aus einer Epitop-bindenden Domäne, die am N-Terminus der schweren Kette an das Ig-Gerüst angeschlossen ist.
  38. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 21 bis 33 bestehend aus einer Epitop-bindenden Domäne, die am C-Terminus der leichten Kette an das Ig-Gerüst angeschlossen ist.
  39. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 21 bis 33 bestehend aus einer Epitop-bindenden Domäne, die am C-Terminus der schweren Kette an das Ig-Gerüst angeschlossen ist.
  40. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß Anspruch 1 oder 2, die 4 Antigen-bindende Stellen hat und in der Lage ist, 4 Antigene gleichzeitig zu binden.
  41. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung in der Medizin.
  42. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs oder entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. Asthma, rheumatoide Arthritis oder Osteoarthrose.
  43. Eine Methode zur Behandlung eines Patienten, der an Krebs oder einer entzündlichen Erkrankung, wie z. B. Asthma, rheumatoide Arthritis oder Osteoarthrose leidet, bestehend aus der Verabreichung einer therapeutischen Menge eines Antigen-bindenden Konstrukts gemäß einem der vorstehenden Ansprüche.
  44. Ein Antigen-bindendes Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche für die Behandlung von Krebs oder entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. Asthma, rheumatoide Arthritis oder Osteoarthrose.
  45. Eine Polynukleotidsequenz, die eine schwere Kette eines Antigen-bindenden Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 1 bis 40 kodiert.
  46. Ein Polynukleotid, das eine leichte Kette eines Antigen-bindenden Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 1 bis 40 kodiert.
  47. Eine rekombinante transformierte oder transfizierte Wirtszelle, bestehend aus einer oder mehreren Polynukleotidsequenzen, die eine schwere Kette und eine leichte Kette eines Antigen-bindenden Konstrukts eines vorstehenden Anspruchs kodiert.
  48. Eine Methode für die Herstellung eines Antigen-bindenden Konstrukts gemäß den Ansprüchen 1 bis 40, wobei diese Methode den Schritt der Kulturierung einer Wirtszelle von Anspruch 47 und der Isolierung des Antigen-bindenden Konstrukts umfasst.
  49. Eine pharmazeutische Zusammensetzung bestehend aus einem Antigenbindenden Konstrukt einer der Ansprüche 1 bis 38 und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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Country Link
US (3) US20110008345A1 (de)
EP (3) EP2641919A3 (de)
JP (1) JP5791898B2 (de)
KR (1) KR101710472B1 (de)
CN (2) CN104650235A (de)
AR (1) AR069495A1 (de)
AU (2) AU2008328726B2 (de)
BR (1) BRPI0819693A2 (de)
CA (1) CA2706419A1 (de)
CL (1) CL2008003561A1 (de)
CO (1) CO6280497A2 (de)
DE (1) DE112008003232T5 (de)
EA (1) EA023031B1 (de)
ES (1) ES2614284T3 (de)
GB (1) GB2468232B (de)
IL (1) IL205906A (de)
MA (1) MA31940B1 (de)
MX (1) MX2010005927A (de)
PE (1) PE20091234A1 (de)
TW (1) TW200944231A (de)
UY (1) UY31504A1 (de)
WO (1) WO2009068649A2 (de)
ZA (1) ZA201003850B (de)

Families Citing this family (219)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090286962A1 (en) * 2005-12-20 2009-11-19 Woolven Benjamin P Chimeric antibodies with part new world primate binding regions
US7846439B2 (en) 2006-02-01 2010-12-07 Cephalon Australia Pty Ltd Domain antibody construct
EP2471816A1 (de) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispezifische Antikörper
ES2667729T3 (es) 2007-09-26 2018-05-14 Ucb Biopharma Sprl Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
CN104650235A (zh) * 2007-11-30 2015-05-27 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
GEP20156390B (en) 2008-01-03 2015-11-10 Scripps Research Inst Antibody targeting through a modular recognition domain
US8574577B2 (en) 2008-01-03 2013-11-05 The Scripps Research Institute VEGF antibodies comprising modular recognition domains
US8454960B2 (en) 2008-01-03 2013-06-04 The Scripps Research Institute Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains
US8557243B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute EFGR antibodies comprising modular recognition domains
US8557242B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains
WO2010027981A1 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
LT2334705T (lt) 2008-09-26 2017-03-27 Ucb Biopharma Sprl Biologiniai produktai
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
JP2012509658A (ja) * 2008-11-26 2012-04-26 グラクソ グループ リミテッド Ｉｌ−１３に結合するリガンド
GB0904214D0 (en) 2009-03-11 2009-04-22 Ucb Pharma Sa Biological products
US9394374B2 (en) 2009-05-28 2016-07-19 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
EP2435075A2 (de) * 2009-05-28 2012-04-04 Glaxo Group Limited Antigenbindende proteine
CA2763446A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Victoria Ballard Stem cell targeting
TW201107345A (en) 2009-05-28 2011-03-01 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
US20120064064A1 (en) * 2009-05-28 2012-03-15 Thil Dinuk Batuwangala Antigen-binding proteins
EP2481754B1 (de) * 2009-09-22 2014-06-18 Shanghai Yijie Biotechnology Co., Ltd Spezifische bindeproteine und deren verwendungen
EP2308897A1 (de) * 2009-10-09 2011-04-13 Pierre Fabre Medicament Chimäre Antikörper spezifisch für CD151 und deren Verwendung zur Behandlung von Krebs
ES2728115T3 (es) 2009-10-30 2019-10-22 Janssen Biotech Inc Antagonistas de IL-17A
TW201120210A (en) * 2009-11-05 2011-06-16 Hoffmann La Roche Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates
WO2011057347A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Tgr Biosciences Pty Ltd Analyte detection
EA201290630A1 (ru) * 2010-02-09 2013-03-29 Глаксо Груп Лимитед Лечение расстройства обмена веществ
EP2536757B1 (de) 2010-02-18 2015-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Il-23-bindende proteine mit fibronectin-gerüstdomänen
AR080794A1 (es) * 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
CA2796932A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Glaxo Group Limited Binding domains
PT2569013T (pt) * 2010-05-14 2017-02-08 Univ Leland Stanford Junior Anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos para cd47
BR112012029280A2 (pt) 2010-05-20 2016-11-29 Glaxo Group Ltd variante de domínio variável único de imunoglobulina antialbumina sérica, imunoglobulina anti-sa, ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, uso de uma variante, ligando multiespecífico ou proteína de fusão
TWI488966B (zh) * 2010-07-09 2015-06-21 優普生物科技股份有限公司 Ｄｎａ疫苗
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2603522A1 (de) 2010-08-13 2013-06-19 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Verbesserte antiserumalbuminbindende varianten
SG188204A1 (en) 2010-08-20 2013-04-30 Glaxo Group Ltd Improved anti-serum albumin binding variants
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
JP2014501725A (ja) 2010-11-24 2014-01-23 グラクソ グループ リミテッド Ｈｇｆを標的とする多特異的抗原結合タンパク質
KR20230057485A (ko) * 2010-12-06 2023-04-28 씨젠 인크. Ｌｉｖ-１에 대한 인간화 항체 및 이의 암을 치료하기 위한 용도
EP2655415A4 (de) * 2010-12-22 2016-03-09 Abbvie Inc An eine trivariable domäne bindende proteine und ihre verwendung
US9260496B2 (en) 2010-12-22 2016-02-16 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23
DK2668210T3 (da) 2011-01-26 2020-08-24 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antistoffer og anvendelser deraf
JP2014505698A (ja) 2011-02-02 2014-03-06 グラクソ グループ リミテッド 新規抗原結合タンパク質
CN102251013A (zh) * 2011-02-22 2011-11-23 北京市肿瘤防治研究所 一个识别肿瘤起始细胞的抗体和抗原及其应用
PL3235508T3 (pl) * 2011-03-16 2021-07-12 Sanofi Kompozycje zawierające białko podobne do przeciwciała z podwójnym regionem v
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
EA201391488A1 (ru) * 2011-04-07 2014-01-30 ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи Композиции со сниженной вязкостью
CA2837169C (en) 2011-05-24 2021-11-09 Zyngenia, Inc. Multispecific complexes comprising angiopoietin-2-binding peptide and their uses
MX2013014789A (es) * 2011-06-16 2014-01-20 Novartis Ag Proteinas solubles para utilizarse como productos terapeuticos.
EP3626739A1 (de) * 2011-06-24 2020-03-25 Stephen D. Gillies Leichtkettige immunglobulinfusionsproteine und verfahren zur verwendung davon
EP2546268A1 (de) * 2011-07-13 2013-01-16 F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. Internalisierendes Immunglobulin
GB201112429D0 (en) * 2011-07-19 2011-08-31 Glaxo Group Ltd Antigen-binding proteins with increased FcRn binding
US9499612B2 (en) * 2011-07-27 2016-11-22 Glaxo Group Limited Antigen binding constructs
UA118833C2 (uk) 2011-08-17 2019-03-25 Ґлаксо Ґруп Лімітед Одиничний варіабельний домен імуноглобуліну, який зв'язується з tnfr1
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (de) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
HRP20211773T1 (hr) 2011-11-04 2022-03-04 Zymeworks Inc. Stabilna heterodimerni dizajn antitijela s mutacijama u fc domeni
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
KR102338833B1 (ko) 2012-02-06 2021-12-13 인히브릭스, 인크. Cd47 항체 및 그 사용 방법
GB2502127A (en) * 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
EP2833923A4 (de) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US20130280282A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
SG11201406943XA (en) * 2012-04-27 2014-12-30 Cytomx Therapeutics Inc Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
CN102676569A (zh) * 2012-05-08 2012-09-19 百泰生物药业有限公司 一种新型噬菌粒展示载体pCANTAB5M
WO2013166594A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Zymeworks Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the fc domain
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
CA2877584A1 (en) * 2012-06-28 2014-01-03 Molecular Partners Ag Designed ankyrin repeat proteins binding to platelet-derived growth factor
RS62509B1 (sr) 2012-07-13 2021-11-30 Roche Glycart Ag Bispecifična anti-vegf/anti-ang-2 antitela i njihova upotreba u lečenju očnih vaskularnih bolesti
SG11201500489YA (en) 2012-07-25 2015-02-27 Kolltan Pharmaceuticals Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
EP2888279A1 (de) 2012-08-22 2015-07-01 Glaxo Group Limited Anti-lrp6-antikörper
CN105121630B (zh) 2012-10-03 2018-09-25 酵活有限公司 定量重链和轻链多肽对的方法
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
BR112015012385A2 (pt) 2012-11-28 2019-08-27 Zymeworks Inc constructo de polipeptídeo de ligação de antígeno isolado, polinucleotídeo isolado ou conjunto de polinucleotídeos isolados, vetor ou conjunto de vetores, célula isolada, composição farmacêutica, uso do constructo, método para tratar um sujeito tendo uma doença ou distúrbio ou câncer ou doença vascular, método para inibir, reduzir ou bloquear um sinal dentro de uma célula, método para obter o constructo, método para preparar o constructo, meio de armazenamento legível por computador, método implementado por computador e método para produzir um constructo de polipeptídeo de ligação de antígeno bi-específico
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
RU2015128651A (ru) 2013-01-31 2017-03-06 Глаксо Груп Лимитед Способ продуцирования белка
BR112015018851A2 (pt) * 2013-02-06 2017-07-18 Inhibrx Llc anticorpos cd47 de não depleção de plaquetas e de não depleção de células vermelhas do sangue, e métodos de uso dos mesmos
CA2896370A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
BR112015023752B1 (pt) 2013-03-15 2023-11-14 Zyngenia, Inc. Domínio de reconhecimento modular (mrd), complexo compreendendo mrd e cetuximabe, usos do complexo para inibir a angiogênese e tratar câncer e composição farmacêutica compreendendo o dito complexo
EP3000827B1 (de) * 2013-05-22 2020-04-22 Seoul National University Hospital Anti-tnf-alpha/cxcl10-doppeltargeting-antikörper und verwendung davon
KR102236367B1 (ko) 2013-07-26 2021-04-05 삼성전자주식회사 DARPin을 포함하는 이중 특이 키메라 단백질
CN104341504B (zh) * 2013-08-06 2017-10-24 百奥泰生物科技(广州)有限公司 双特异性抗体
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (de) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynukleotide zur codierung von low-density-lipoprotein-rezeptor
US9540440B2 (en) 2013-10-30 2017-01-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
AU2014348552A1 (en) 2013-11-13 2016-06-02 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting EGFR and/or HER2 and uses thereof
CA2931356A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
WO2015089283A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
TW201609805A (zh) 2013-12-23 2016-03-16 美國禮來大藥廠 結合ｅｇｆｒ及ｍｅｔ之多功能抗體
RU2016129724A (ru) * 2013-12-23 2018-01-30 Займворкс Инк. Антитела, содержащие с-концевые удлинения полипептида легкой цепи, их конъюгаты и способы применения
AU2015205530B8 (en) * 2014-01-13 2019-09-19 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
SI3116909T1 (sl) 2014-03-14 2020-03-31 Novartis Ag Molekule protiteles na LAG-3 in njih uporaba
JP2017513818A (ja) 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
WO2015181805A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
KR20170010863A (ko) 2014-07-01 2017-02-01 화이자 인코포레이티드 이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 이의 용도
KR102272213B1 (ko) * 2014-07-08 2021-07-01 삼성전자주식회사 표적화 부위, 절단 부위, 및 세포막 투과 부위를 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
CA2955154C (en) 2014-07-21 2023-10-31 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
EP3193915A1 (de) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Kombinationen aus niedrigen, immunfördernden dosen von mtor-inhibitoren und cars
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
EP3180359A1 (de) 2014-08-14 2017-06-21 Novartis AG Behandlung von krebs mit einem chimären gfr-alpha-4-antigenrezeptor
ES2791248T3 (es) 2014-08-19 2020-11-03 Novartis Ag Receptor antigénico quimérico (CAR) anti-CD123 para su uso en el tratamiento del cáncer
AU2015317608B2 (en) 2014-09-17 2021-03-11 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
GB201416832D0 (en) 2014-09-24 2014-11-05 Glaxosmithkline Plc Methods of treatment
RU2609627C2 (ru) * 2014-09-26 2017-02-02 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Высокоаффинные и агрегационно стабильные антитела на основе вариабельных доменов vl и производного vhh
PE20171067A1 (es) 2014-10-14 2017-07-24 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
WO2016135041A1 (en) * 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
RU2752918C2 (ru) 2015-04-08 2021-08-11 Новартис Аг Cd20 терапия, cd22 терапия и комбинированная терапия клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (car) k cd19
EP3286211A1 (de) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Behandlung von krebs mit chimärem antigenrezeptor- und proteinkinase-a-blocker
JP6783797B2 (ja) 2015-05-04 2020-11-11 ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー 抗がん融合ポリペプチド
MX2018000948A (es) 2015-07-23 2018-09-27 Inhibrx Inc Proteinas de fusion que se unen a gitir multivalentes y multiespecificas.
EP3878465A1 (de) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Kombinationstherapien mit antikörpermolekülen gegen tim-3
EP3317301B1 (de) 2015-07-29 2021-04-07 Novartis AG Kombinationstherapien mit antikörpermolekülen gegen lag-3
JP6878405B2 (ja) 2015-07-29 2021-05-26 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子を含む組み合わせ治療
EA037487B1 (ru) * 2015-08-24 2021-04-02 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти (No.2) Лимитед Биофармацевтические композиции
CA2998740A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 The Scripps Research Institute Dual variable domain immunoconjugates and uses thereof
JP2018533017A (ja) * 2015-10-02 2018-11-08 ティージーアール バイオサイエンシス ピーティーワイ エルティーディー． 多基体による検体検出
JP6932693B2 (ja) 2015-10-08 2021-09-08 ザイムワークス，インコーポレイテッド カッパ及びラムダ軽鎖を含む抗原結合ポリペプチド構築物及びその使用
CA3007421A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
WO2017125897A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
WO2017143406A1 (en) * 2016-02-26 2017-08-31 Imunexus Pty Ltd Multi-specific molecules
EP3423482A1 (de) 2016-03-04 2019-01-09 Novartis AG Zellen mit expression von mehreren chimären antigenrezeptor (car)-molekülen und verwendungen dafür
MA45324A (fr) 2016-03-15 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Polythérapie utilisant un adc-liv1 et un agent chimiothérapeutique
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
MX2018012615A (es) 2016-04-15 2019-05-30 Novartis Ag Composiciones y metodos para la expresion selectiva de proteinas.
US20210177896A1 (en) 2016-06-02 2021-06-17 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
CN106084067A (zh) * 2016-06-15 2016-11-09 无锡市人民医院 具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
WO2018014260A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
SG11201900677SA (en) 2016-07-28 2019-02-27 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors
CN110267677A (zh) 2016-08-01 2019-09-20 诺华股份有限公司 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症
TW202340473A (zh) 2016-10-07 2023-10-16 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
TW201829462A (zh) * 2016-11-02 2018-08-16 英商葛蘭素史克智慧財產（第二）有限公司 結合蛋白
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
CN108456250A (zh) * 2017-02-17 2018-08-28 科济生物医药（上海）有限公司 靶向il-13ra2的抗体及其应用
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
CA3058477A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615068A1 (de) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Auf bcma abzielender wirkstoff und kombinationstherapie mit einem gamma-sekretase-inhibitor
BR112019025736A2 (pt) 2017-06-06 2020-06-30 Glaxosmithkline Llc uso de um anticorpo e composições para tratar uma doença e para diminuir uma contagem absoluta de eosinófilo no sangue
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
MA49457A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis Ag Molécules d'anticorps se liant à cd73 et leurs utilisations
WO2019006007A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag POSOLOGICAL REGIMES FOR ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
CN111278858B (zh) 2017-07-11 2024-07-23 指南针制药有限责任公司 结合人cd137的激动剂抗体及其用途
GB201711208D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Iontas Ltd Ion channel inhibitors
AU2018302283A1 (en) 2017-07-20 2020-02-06 Novartis Ag Dosage regimens of anti-LAG-3 antibodies and uses thereof
WO2019028367A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING ESOPHAGITIS WITH ACTIVE EOSINOPHILES
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
TWI801425B (zh) * 2017-09-29 2023-05-11 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Il-5 抗體、其抗原結合片段及醫藥用途
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
KR20200089286A (ko) 2017-11-16 2020-07-24 노파르티스 아게 조합 요법
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
KR20200104333A (ko) 2017-12-28 2020-09-03 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Tigit에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 변이체
WO2019134710A1 (en) * 2018-01-08 2019-07-11 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
CN111699200B (zh) 2018-01-15 2023-05-26 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-1的单域抗体和其变体
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
EP3784351A1 (de) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car-t-zelltherapien mit erhöhter wirksamkeit
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
WO2019226617A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
US20210198370A1 (en) * 2018-05-31 2021-07-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Bi-specific antibodies and use thereof
SG11202011830SA (en) 2018-06-13 2020-12-30 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
JP7472119B2 (ja) 2018-06-19 2024-04-22 アターガ，エルエルシー 補体第５成分に対する抗体分子およびその使用
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
GB2576914A (en) * 2018-09-06 2020-03-11 Kymab Ltd Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals
EP3852728B1 (de) 2018-09-20 2024-09-18 ModernaTX, Inc. Herstellung von lipidnanopartikeln und verfahren zu deren verabreichung
BR112021008795A2 (pt) 2018-11-13 2021-08-31 Compass Therapeutics Llc Construtos de ligação multiespecíficos contra moléculas de ponto de verificação e seus usos
JP2022514315A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与計画及び薬剤組み合わせ
CA3123356A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Combinations of a hdm2-p53 interaction inhibitor and a bcl2 inhibitor and their use for treating cancer
CN113645996B (zh) * 2019-02-01 2024-04-02 新石生物制药有限公司 抗claudin 18抗体及其使用方法
JP7483732B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-15 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソ－５－（ピペリジン－４－イル）イソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
JP7488826B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-22 ノバルティス アーゲー 置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
WO2020172553A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Novartis Ag Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
MA55204A (fr) 2019-03-06 2022-01-12 Regeneron Pharma Inhibiteurs de la voie il-4/il-13 pour une efficacité améliorée dans le traitement du cancer
BR112021018627A2 (pt) 2019-03-21 2021-11-23 Regeneron Pharma Combinação de inibidores da via de il-4/il-13 e ablação de células plasmáticas para o tratamento de alergia
WO2020205523A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Atarga, Llc Anti fgf23 antibody
US20230220109A1 (en) * 2019-06-06 2023-07-13 Janux Therapeutics, Inc. Compositions and methods relating to tumor activated t cell engagers
AU2020370832A1 (en) 2019-10-21 2022-05-19 Novartis Ag TIM-3 inhibitors and uses thereof
IL292347A (en) 2019-10-21 2022-06-01 Novartis Ag Combination treatments with ventoclax and tim-3 inhibitors
BR112022010206A2 (pt) 2019-11-26 2022-11-29 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos e usos dos mesmos
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
US20230058489A1 (en) 2020-01-17 2023-02-23 Novartis Ag Combination comprising a tim-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
JP2023515211A (ja) 2020-02-27 2023-04-12 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
US20230321067A1 (en) 2020-06-23 2023-10-12 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
TWI818276B (zh) * 2020-06-30 2023-10-11 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 Fab-HCAb結構的結合蛋白
AU2021308712A1 (en) 2020-07-16 2023-02-02 Novartis Ag Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
US20230338587A1 (en) 2020-08-31 2023-10-26 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
JP2023547499A (ja) 2020-11-06 2023-11-10 ノバルティス アーゲー 抗体Ｆｃ変異体
US20240033358A1 (en) 2020-11-13 2024-02-01 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
EP4284510A1 (de) 2021-01-29 2023-12-06 Novartis AG Dosierungsschemata für anti-cd73- und anti-enpd2-antikörper und verwendungen davon
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
EP4405396A2 (de) 2021-09-20 2024-07-31 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von her2-positivem krebs
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US20230220089A1 (en) 2021-12-30 2023-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for attenuating atopic march by administering an il-4/il-13 antagonist
TW202342548A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商威特拉公司 抗獨特型(anti-idiotype)抗體分子及其用途
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
WO2024168061A2 (en) 2023-02-07 2024-08-15 Ayan Therapeutics Inc. Antibody molecules binding to sars-cov-2

Citations (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307434A1 (de) 1987-03-18 1989-03-22 Medical Res Council Geänderte antikörper.
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
WO1996016990A1 (en) 1994-12-02 1996-06-06 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to cd38
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1999002671A1 (en) 1997-07-07 1999-01-21 Medical Research Council In vitro sorting method
WO1999020749A1 (en) 1997-10-20 1999-04-29 Medical Research Council Method to screen phage display libraries with different ligands
US5969108A (en) 1990-07-10 1999-10-19 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1999058679A1 (en) 1998-05-09 1999-11-18 Glaxo Group Limited Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses
WO1999058655A2 (en) 1998-05-13 1999-11-18 Diversys Limited Phage display selection system for folded proteins
WO2000029004A1 (en) 1998-11-18 2000-05-25 Peptor Ltd. Small functional units of antibody heavy chain variable regions
WO2000040712A1 (en) 1999-01-07 2000-07-13 Medical Research Council Optical sorting method
WO2001057065A2 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Domantis Limited Combinatorial protein domains
US6297053B1 (en) 1994-02-17 2001-10-02 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO2002092771A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US6555313B1 (en) 1991-12-02 2003-04-29 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US20040132028A1 (en) 2000-09-08 2004-07-08 Stumpp Michael Tobias Collection of repeat proteins comprising repeat modules
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2005003156A1 (en) 2003-07-04 2005-01-13 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for her2
US20050043519A1 (en) 2001-08-10 2005-02-24 Helen Dooley Antigen binding domains
WO2005056764A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
WO2005081854A2 (en) 2004-02-20 2005-09-09 Ludwig Institute For Cancer Research Egf receptor epitope peptides and uses thereof
WO2006015371A2 (en) 2004-08-05 2006-02-09 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
US7250297B1 (en) 1997-09-26 2007-07-31 Pieris Ag Anticalins
WO2007095338A2 (en) 2006-02-15 2007-08-23 Imclone Systems Incorporated Functional antibodies
US20070224633A1 (en) 2003-08-25 2007-09-27 Pieris Ag Muteins of Tear Lipocalin
US20080139791A1 (en) 1998-12-10 2008-06-12 Adnexus Therapeutics, Inc. Pharmaceutically acceptable Fn3 Polypeptides for human treatments
WO2008098796A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Nascacell Technologies Ag Polypeptide comprising a knottin protein moiety

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9221657D0 (en) * 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
GB9225453D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US6846486B1 (en) * 2000-02-24 2005-01-25 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Method of treating allergy by administering an anti-histamine antibody
DK2857516T3 (en) * 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
US20050142539A1 (en) * 2002-01-14 2005-06-30 William Herman Targeted ligands
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AR049390A1 (es) * 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
WO2006036877A2 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 Cornell Research Foundation, Inc. Recombinant bifunctional protein of human lutropin receptor and human chorionic gonadotropin b-subunit and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1957541A2 (de) * 2005-11-21 2008-08-20 Laboratoires Serono SA Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von antigenbindenden hybridmolekülen und anwendungen davon
TW200804425A (en) * 2005-12-06 2008-01-16 Domantis Ltd Ligands that have binding specificity for EGFR and/or VEGF and methods of use therefor
CN101370881B (zh) * 2006-01-18 2013-05-29 西巴控股有限公司 低挥发性有机化合物溶剂型涂料的多用途添加剂
AU2007209201A1 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Domantis Limited Fusion proteins that contain natural junctions
US20110059101A9 (en) * 2006-03-13 2011-03-10 Ablynx N.V. Amino Acid Sequences Directed Against Il-6 And Polypetides Comprising The Same For The Treatment Of Diseases And Disorders Associated With Il-6 Mediated Signalling
BRPI0811857A2 (pt) * 2007-05-14 2014-10-21 Biogen Idec Inc Regiões fc (scfc) de cadeia simples, polipeptídeos de aglutinação que as compreendem e métodos relacionados.
EP2050764A1 (de) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Neues polyvalentes bispezifisches Antikörperformat und Verwendung
CN104650235A (zh) * 2007-11-30 2015-05-27 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
AU2009213141A1 (en) * 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind EGFR
DK3037104T3 (da) * 2009-10-20 2020-07-20 Abbvie Inc Isolering og renselse af anti-il-13 antistoffer ved brug af protein a beslægtet kromatografi

Patent Citations (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307434A1 (de) 1987-03-18 1989-03-22 Medical Res Council Geänderte antikörper.
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5969108A (en) 1990-07-10 1999-10-19 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US6555313B1 (en) 1991-12-02 2003-04-29 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US6297053B1 (en) 1994-02-17 2001-10-02 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1996016990A1 (en) 1994-12-02 1996-06-06 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to cd38
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
WO1999002671A1 (en) 1997-07-07 1999-01-21 Medical Research Council In vitro sorting method
US7250297B1 (en) 1997-09-26 2007-07-31 Pieris Ag Anticalins
WO1999020749A1 (en) 1997-10-20 1999-04-29 Medical Research Council Method to screen phage display libraries with different ligands
WO1999058679A1 (en) 1998-05-09 1999-11-18 Glaxo Group Limited Antibodies to cd23, derivatives thereof, and their therapeutic uses
WO1999058655A2 (en) 1998-05-13 1999-11-18 Diversys Limited Phage display selection system for folded proteins
WO2000029004A1 (en) 1998-11-18 2000-05-25 Peptor Ltd. Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20080139791A1 (en) 1998-12-10 2008-06-12 Adnexus Therapeutics, Inc. Pharmaceutically acceptable Fn3 Polypeptides for human treatments
WO2000040712A1 (en) 1999-01-07 2000-07-13 Medical Research Council Optical sorting method
WO2001057065A2 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Domantis Limited Combinatorial protein domains
US20040132028A1 (en) 2000-09-08 2004-07-08 Stumpp Michael Tobias Collection of repeat proteins comprising repeat modules
WO2002092771A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US20050043519A1 (en) 2001-08-10 2005-02-24 Helen Dooley Antigen binding domains
EP1641818A1 (de) 2003-07-04 2006-04-05 Affibody AB Polypeptide mit bindungsaffinität für her2
WO2005003156A1 (en) 2003-07-04 2005-01-13 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for her2
US20070224633A1 (en) 2003-08-25 2007-09-27 Pieris Ag Muteins of Tear Lipocalin
WO2005056764A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
WO2005081854A2 (en) 2004-02-20 2005-09-09 Ludwig Institute For Cancer Research Egf receptor epitope peptides and uses thereof
WO2006015371A2 (en) 2004-08-05 2006-02-09 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007095338A2 (en) 2006-02-15 2007-08-23 Imclone Systems Incorporated Functional antibodies
WO2008098796A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Nascacell Technologies Ag Polypeptide comprising a knottin protein moiety

Non-Patent Citations (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Akers, M. J. Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300
Amyloid-Fasern (James et al. (2007) J Mol Biol. 367: 603-8
Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457
Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)
Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2): 121-133 (2001)
Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901
Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877
Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799
Chothia und Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917
Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100
De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97
DeKruif et al. (1995)
Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533
Deng et al., J. Biol. Chem., 269: 9533 (1994)
E. Meyers und W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: IL-17 (1988))
Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952
Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553
Fachgutachten zu Pr�fmedikationen 16(6), 909-917 (Juni 2007)
Fachgutachten, Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)
Goldman, L. A., et al., Biotechniques, 21: 1013-1015 (1996)
Griffiths et al.
Griffiths et al. (1994)
Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245
Ha, E Wang W, Wang Y. j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and Protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264, (2002)
Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889
Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133
Hoogenboom and Winter (1992)
Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381
Hoogenboom und Winter (1992)
Horton, R. M. et al., Gene 77: 61-68 (1989)
Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857
Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301
Imamura, K et al "Effects of types of sugar an stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274
Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its Protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039
J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)
J. Chem. Phys. 16, 1093-1099 (1948)
J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003)
J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)
J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)
Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903
Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165
Johnson et al.
Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for Protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922
Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)
Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological interest", US Department of Health and Human Services)
Kabat et al definiert. (1991, supra)
Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services
Kapitel 7 - Nicht-Antik�rper-Ger�ste des Handbuches �ber therapeutische Antik�rper (2007, herausgegeben von Stefan Dubel)
Landt, O. et al., Gene 96: 125-128 (1990)
Lasmar U und Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, Seite 129-137, Bd.3 (3. April 2000)
Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359
Low et al., J. Mol. Biol., 260: 359 (1996)
Marks et al. 1991
Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614
Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800
McCafferty et al.
Methode von Boyd et al. (1995) J. Imm. Meth. 184: 29-38
Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986)
Millstein und Mitarb., Nature 305 537-539 (1983)
Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18: 5322 (1990)
Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)
Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)
Nissim et al. (1994)
Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692
Nissim et al. 1994
Pl�ckthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)
PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)
Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)
Protein Science 15: 14-27 (2006)
Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698
Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475
Sambrook et al.
Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365
Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1
Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994)
Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T. J., Manning M. C., New York, NY: Plenum Press (1992)
Standard-Techniken der
Stemmer in 1994, Nature 370: 389-391
Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)
Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6
Tomlinson et al. (1995)
Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628
Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813
Tomlinson et al.,
Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776
Traunecker und Mitarb., EMBO, 10, 1991, 3655-3659
Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid Protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188
Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220
Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55
Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994)
Zahnd, C. et al. (2007), J. Mol. Biol., 369, 1015-1028

Also Published As

Publication number Publication date
GB201008468D0 (en) 2010-07-07
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EA201000704A1 (ru) 2010-12-30
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JP2011504742A (ja) 2011-02-17
UY31504A1 (es) 2009-07-17
JP5791898B2 (ja) 2015-10-07
KR101710472B1 (ko) 2017-02-27
EA023031B1 (ru) 2016-04-29
CO6280497A2 (es) 2011-05-20
AR069495A1 (es) 2010-01-27
EP2641919A3 (de) 2014-05-07
TW200944231A (en) 2009-11-01
US20090148905A1 (en) 2009-06-11
EP2615115A2 (de) 2013-07-17
IL205906A0 (en) 2010-11-30
AU2014224077A1 (en) 2014-10-02
BRPI0819693A2 (pt) 2020-08-18
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US20110008345A1 (en) 2011-01-13
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AU2008328726A1 (en) 2009-06-04
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CN101932608A (zh) 2010-12-29

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