TWI488966B

TWI488966B - Ｄｎａ疫苗

Info

Publication number: TWI488966B
Application number: TW099122639A
Authority: TW
Inventors: 季匡華; 王愈善; 張照君
Original assignee: 優普生物科技股份有限公司
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2015-06-21
Also published as: TW201202421A

Description

DNA疫苗

本發明關於一種免疫療法的DNA疫苗，特別是關於癌症治療的DNA疫苗。

表皮生長因子受體(EGFR)的過度表現已知為多種腫瘤細胞的特徵，特別是在非小細胞肺癌(NSCLC)。EGFR在調節細胞生長、分化、及增生上扮演重要的角色。預後不佳的腫瘤細胞通常伴隨EGFR的過度表現。因此，以EGFR為目標的癌症治療為近年癌症研究的趨勢之一。

爾必得舒(Cetuximab)是目前美國食品及藥物管理局(FDA)核准的EGFR抑制劑，為治療大腸癌的單株抗體。爾必得舒(Cetuximab)為人鼠鑲嵌抗體(chimeric antibody)，以EGFR的細胞外區域(extracellular domain)為連接目標。因此，爾必得舒(Cetuximab)可與EGFR的配體，例如EGF、TGF-α競爭，阻斷EGFR與其配體的連接及後續引發的EGFR的活化(Riemer AB.,et al.,Vaccination with Cetuximab Mimotope and Biological Properties of Induced Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibodies,Journal of the National Cancer Institute,Vol.97,No.22,November 16,2005)。

血管內皮成長因子(VEGF)的過度表現已知會增加血管新生(angiogenesis)，為腫瘤血管增生(vascularization)的要因之一。VEGF影響腫瘤血管新生的機制並不明確，但VEGF的表現可能與EGFR有關(Pore N.,et al.,EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors Decrease VEGF Expression by Both Hypoxia-inducible Factor(HIF)-1-Independent and HIF-1-Depenednet Mechanisms,Cancer Res.2006；66：(6)：3197-204)。具體來說，在多種腫瘤細胞中，抑制EGFR可使VEGF的表現降低，因而減少腫瘤的血管新生。

阿瓦斯丁(bevacizumab)為人型化(humanized)的單株抗體，可辨識及阻斷VEGF，為FDA核准的抑制血管新生劑，用於大腸直腸癌、非小細胞肺癌、轉移性乳癌等癌症的治療。

然而，使用上述人型化單株抗體特異性抑制EGFR及VEGF的癌症治療方法，必須重複投藥以達到抑制及抗腫瘤的效度。因此，以投予相關胜肽、抗體或核酸分子使體內引發免疫反應的免疫療法，成為另一有效的替代療法。

本發明人基於上述知識，研發以引起體內免疫機制、及提高抑制或治療癌細胞效率的醫藥組合物。

本發明人以引發個體免疫產生抗腫瘤細胞的特定抗體為發明目的，藉由投予編碼EGF、VEGF及EGFR抗原決定位的核苷酸序列，達到抑制或治療癌症的加成效應(synergetic effect)，進而提出本發明。

本發明提供一種DNA疫苗，包括：(1)第1重組質體(recombinant plasmid)，包括編碼表皮生長因子(EGF)的核苷酸序列；(2)第2重組質體，包括編碼血管內皮成長因子(VEGF)的核苷酸序列；及(3)第3重組質體，包括編碼表皮生長因子受體(EGFR)抗原決定位(epitope)的核苷酸序列。

第1圖顯示本發明一實施例之DNA疫苗投予小鼠後，小鼠血清中的相對EGF抗體量。

第2圖本發明一實施例之DNA疫苗投予小鼠後，小鼠血清中的相對VEGF抗體量。

第3圖本發明一實施例之DNA疫苗投予小鼠後，小鼠血清中的相對EGFR抗體量。

第4圖顯示pVAC1-mcs質體(Invivogen)的多重選殖部位(MCS)。

上述之重組質體的構成，簡單地說，將編碼EGF、VEGF及EGFR 抗原決定位的核苷酸序列分別擴增(amplification)，經限制酶切割、連接(splicing)後，插入一載體(vector)中，形成包含編碼EGF、VEGF及EGFR抗原決定位的核苷酸序列的重組質體。

上述核苷酸序列的擴增可經由適當設計的引子，在嚴謹條件(stringent conditions)下以聚合酶連鎖反應(PCR)擴增該核苷酸序列。為了有效進行核苷酸序列的選殖(cloning)，可視需要對欲選殖的DNA進行定量及定性，例如以光譜儀測量該DNA的OD值，或以特定染料與DNA結合，經螢光光譜儀(fluorometer)測定發出的光強度，以及經電泳(electrophoresis)確定DNA片段大小等方法。

上述載體沒有特別限定，可根據此技術領域中的公知技術選用。但考慮上述核苷酸序列的選殖及插入以及進入適當宿主細胞內進行複製的因素，該載體較佳選擇具有篩選基因(selection marker)、多重選殖部位(multiple cloning sites；MCS)、以及與宿主細胞相容者。

本發明一實施例中，選用pVAC1-mcs(Invivogen)作為載體。pVAC1-mcs為商業上可獲得的DNA疫苗質體，經由肌肉內注射人體後可誘發體液性免疫反應(humoral immune response)。pVAC1-mcs因具有多重選殖部位(MCS)，如第4圖所示，適合作為選殖核苷酸序列的載體。此實施例中，將編碼EGF核苷酸序列(序列識別號：1)、編碼VEGF核苷酸序列(序列識別號：2)及編碼EGFR抗原決定位的核苷酸序列(序列識別號：3)分別經過PCR擴增(amplification)後，與pVAC1-mcs質體以相同限制酶切割，經過連接(splicing)，分別形成重組質體。

上述編碼EGF、VEGF及EGFR抗原決定位的核苷酸序列可來自實驗室或商業上可獲得的核苷酸序列，或者來自編碼實驗室或商業上可獲得的胺基酸序列之核苷酸序列。本發明一實施例，編碼EGF多胜肽之核苷酸序列來自pUNO1-hEGF(Invivogen)重組質體的片段。另一實施例中，編碼VEGF多胜肽之核苷酸序列來自hBLAST49-hVEGF(Invivogen)重組質體的片段。

上述編碼EGFR抗原決定位的核苷酸序列，除了可來自實驗室或商業上可獲得的核苷酸序列或編碼實驗室或商業上可獲得的胺基酸序列之核苷酸序列以外，也可來自類似EGFR抗原決定位結構的模擬表位(mimotope)。該模擬表位為模擬EGFR與其配體(ligand)特異性連接的抗原決定位之結構，但是模擬表位的胺基酸序列與EGFR抗原決定位不必然完全相同。由於該模擬表位可與EGFR的配體特異性連接，具有與EGFR抗原決定位相同或相似的功能，例如抑制EGFR訊息傳遞(signaling)，間接抑制腫瘤細胞的增生。因此，本發明所述之EGFR抗原決定位，包括此技術領域中定義的抗原決定位，也包括可與EGFR配體特異性連接的模擬表位。本發明一實施例中，根據Riemer等人記載之類似爾必得舒(Cetuximab)的EGFR抗原決定位(epitope)之模擬表位的胺基酸序列(Riemer AB.,et al.,Vaccination with Cetuximab Mimotope and Biological Properties of Induced Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibodies,Journal of the National Cancer Institute,Vol.97,No.22,November 16,2005)，設計編碼該模擬表位的核苷酸序列，作為編碼EGFR抗原決定位的核苷酸序列。

上述DNA疫苗包括編碼EGF、VEGF及EGFR抗原決定位之多胜肽的核苷酸序列，在投予個體後，在個體內表現EGF、VEGF及EGFR抗原決定位之多胜肽，進而誘發個體的免疫反應，產生抗EGF、VEGF及EGFR抗體，直接及有效地發揮抑制或治療腫瘤的功效，而且該抗體可不斷地因免疫反應誘發而產生，不需反覆地投藥。

上述DNA疫苗可溶於生理食鹽水中(又稱為裸DNA(naked DNA))，或者添加醫藥可接受載劑，例如賦型劑、懸浮劑等。上述之編碼EGF、VEGF、EGFR抗原決定位之核苷酸序列也可由微脂體(liposome)或病毒包覆而投予個體。上述之DNA疫苗可視需要與其他免疫藥劑、化療藥劑、或類似的藥物組合投予，亦可視需要分次或重複投予。投藥方式沒有特別限定，可經由皮下、靜脈內、肌肉內，或以適當的方式投予。投予個體包括哺乳動物，例如老鼠、貓、狗、牛、羊、猴、猿及人。

本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。

[實施例1]包含編碼人EGF核苷酸序列的重組質體的構築

使用pUNO1-hEGF質體及套組(Invivogen)，將含有pUNO1- hEGF質體的管(tube)快速旋轉，使其中的DNA形成錠狀(pellet)後收集pUNO1-hEGF質體。另一方面，根據該套組所提供的hEGF基因開放閱讀框架(open reading frame)，設計與hEGF核苷酸序列連接的引子對(序列識別號4及5)。之後，將上述收集的pUNO1-hEGF質體及上述的引子對(序列識別號4及5)加入1μg的PCR premix溶液(TOYOBO)中，將此溶液進行聚合酶連鎖反應(PCR)(使用ABI 96-Well GeneAmp® PCR System 9700；使用TOYOBO Taq DNA聚合酶；經過95℃、30分鐘變性；60℃、30分鐘黏合；72℃、45分鐘延伸；為1次循環，共經30次循環)。選殖(cloning)出pUNO1-hEGF中第3480位至第3639位的DNA片段。再以膠萃取法(gel extaction)(Geneaid)分離該DNA片段之後，此序列即含有N端的BamHI限制酶切割位序列(ggatcc)及C端的EcoRI限制酶切割位序列(gaattc)切割，形成序列識別號1所示之核苷酸序列。之後以BamHI及EcoRI限制酶切割該DNA片段。

另一方面，使用pVAC1-mcs質體及套組(Invivogen)，快速旋轉含有pVAC1-mcs質體的管，收集pVAC1-mcs質體，同樣以BamHI及EcoRI限制酶切割。之後，將上述經BamHI及EcoRI限制酶切割的該DNA片段及pVAC1-mcs質體混合，以抗生素zeocin篩選出包含編碼人EGF核苷酸序列的重組質體。

[實施例2]包含編碼人VEGF核苷酸序列的重組質體的構築

除使用pBLAST49-hVEGF質體及套組(Invivogen)代替pUNO1-hEGF質體及套組(Invivogen)及使用序列識別號6及7作為引子對以外，其餘步驟同實施例1之步驟進行。選殖pBLAST49-hVEGF中第563位至第1146位的DNA片段，以膠萃取法(gel extaction)(Geneaid)分離該DNA片段之後，此序列即含有N端的BamHI限制酶切割位序列(ggatcc)及C端的EcoRI限制酶切割位序列(gaattc)。之後以BamHI及EcoRI限制酶切割該DNA片段，形成序列識別號2所示之核苷酸序列。其次，同實施例1之步驟，將此DNA片段插入pVAC1-mcs質體(Invivogen)中獲得包含編碼人VEGF核苷酸序列的重組質體。

[實施例3]包含編碼人EGFR模擬表位之核苷酸序列的重組質體的構築

根據Riemer等人的實驗(Riemer AB.,et al.,Vaccination with Cetuximab Mimotope and Biological Properties of Induced Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibodies,Journal of the National Cancer Institute,Vol.97,No.22,November 16,2005)，將Riemer等人記載的EGFR模擬表位之胺基酸序列轉換為核苷酸序列。根據該核苷酸序列設計引子對(序列識別號8及9)。之後，同實施例1之步驟，將上述編碼EGFR模擬表位之DNA片段及序列識別號8及9所示之引子對，經聚合酶連鎖反應(PCR)擴增、分離。此DNA片段上含有N端的BamHI限制酶切割位序列(ggatcc)及C端的EcoRI限制酶切割位序列(gaattc)，以BamHI及EcoRI限制酶切割該DNA片段，形成序列識別號3所示之核苷酸序列。之後，同時實施例1之步驟，將此DNA片段插入pVAC1-mcs質體(Invivogen)中，獲得包含編碼人EGFR模擬表位核苷酸序列的重組質體。

[實施例4]動物免疫試驗及偵測體內抗EGF及VEGF抗體的產生

將實施例1~3所獲得的重組質體分別以注射用生理實驗水溶解，分別取上述三種重組質體1mg均勻混和，形成3mg/ml濃度的DNA疫苗(各含有1mg的重組質體)。

7隻小鼠BALB/c皆在未投予DNA疫苗的第0天時採血。之後每隻小鼠投予100μl的上述DNA疫苗，以兩周為間隔的方式，皮下注射施打三次(第0、14、28天)。之後再分別在第21、35天採其尾靜脈血液，分離出血清，收集儲存於-80度冰箱。

將取得的血清，分別以小鼠的抗EGF單株抗體(R & D)及抗VEGF單株抗體(R & D)作為捕捉抗體(capture antibody)。以sandwish ELISA的方式，將A431細胞株(CRL-1555)細胞培養液為EGF及VEGF的來源，上述經免疫的血清為偵測的抗體，觀察在450nm的波長，結果分別如第1、2圖所示。

如第1圖所示，7隻小鼠在第二次免疫後的一週(第21天)，血清中EGF抗體有明顯上升的趨勢。如第2圖所示，7隻小鼠在第二次免疫後的一週(第21天)，血清中VEGF抗體也有明顯上升的趨勢。

[實施例5]動物免疫試驗及偵測體內抗EGFR抗體的產生

同實施例4之步驟，獲得未經免疫及經該DNA疫苗免疫的小鼠血清樣本。

另一方面，將EGFR過度表現之A431細胞株(CRL-1555)以105細胞分別與第0天與第21、35天採集的血清共同培養30分鐘後，以螢光(fluorescein isothiocyanate；FITC)連接的羊抗鼠IgG(Caltag Laboratories,Burlingame,CA)再共同培養20分鐘後偵測(BD,FACSCalibur)連接於A431的EGFR上的胜肽，結果如第3圖所示。

結果顯示，在第21天時，螢光強度有些微的上升，但到達第35天時，螢光強度大幅度上升，所以表示血清中抗EGFR抗體大量產生。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 優普生物科技股份有限公司

<120> DNA疫苗

<150> TW 099122639

<151> 2010-07-09

<160> 9

<210> 1

<211> 173

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼人EGF的核苷酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼人VEGF的核苷酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼人EGFR模擬表位(mimotope)的核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接編碼人EGF核苷酸序列的順向引子

<400> 4

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接編碼人EGF核苷酸序列的反向引子

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接編碼人VEGF核苷酸序列的順向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接編碼人VEGF核苷酸序列的反向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接編碼人EGFR模擬表位(mimotope)核苷酸序列的順向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接編碼人EGFR模擬表位(mimotope)核苷酸序列的反向引子

<400> 9

Claims

一種DNA疫苗，包括：(1)第1重組質體，包括編碼表皮生長因子(EGF)的核苷酸序列，該編碼表皮生長因子(EGF)的核苷酸序列包括序列識別號：1所示之核苷酸序列；(2)第2重組質體，包括編碼血管內皮成長因子(VEGF)的核苷酸序列，該編碼血管內皮成長因子(VEGF)的核苷酸序列包括序列識別號：2所示之核苷酸序列；(3)第3重組質體，包括編碼表皮生長因子受體(EGFR)抗原決定位(epitope)的核苷酸序列，該編碼表皮生長因子受體(EGFR)抗原決定位的核苷酸序列包括序列識別號：3所示之核苷酸序列；以及一醫藥可接受載劑。
如申請專利範圍第1項所述之DNA疫苗，其中該表皮生長因子受體(EGFR)抗原決定位包括模擬表位(mimotope)。
如申請專利範圍第1或2項所述之DNA疫苗，係投予哺乳動物。
如申請專利範圍第3項所述之DNA疫苗，其中該哺乳動物包括人。
如申請專利範圍第3項所述之DNA疫苗，其中該投與包括皮下、肌肉內或靜脈內投予。
如申請專利範圍第1或2項所述之DNA疫苗，係用於免疫療法。
如申請專利範圍第6項所述之DNA疫苗，其中該免疫療法包括癌症治療。