KR20100097720A - 항원-결합 작제물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한 개 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 단백질 골격을 포함하는 항원-결합 작제물, 이 작제물을 만드는 방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상기 항원-결합 작제물은 두개 이상의 항원 결합 부위를 가지는데 이중 한 개 이상은 에피토프 결합 도메인으로부터 유래된 것이고, 이 중 한 개 이상은 짝지은 VH/VL 도메인에서 유래된 것이다.

Description

항원-결합 작제물{antigen-binding constructs}
항체는 치료적 적용의 용도로 잘 알려져 있다.
항체는 두 개 이상의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 헤테로멀티머(heteromultimeric) 글리코단백질이다. IgM을 제외하고, 보통 무손상(intact) 항체는 대략 150Kda의 헤테로테트라머(heterotetrameric) 글리코단백질이고, 두 개의 동일한 경쇄(L) 및 두 개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진다. 일반적으로, 각각의 경쇄는 한 개의 이황화 공유결합에 의해 중쇄와 연결되나, 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이의 이황화 결합의 개수는 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 쇄(chain)내 이황화 브리지(bridge)를 가진다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 다수의 불변영역이 뒤따르는 가변 도메인(VH)을 가진다. 각각의 경쇄는 이의 다른 말단에 가변 도메인(VL) 및 불변 영역을 지니고; 경쇄의 불변 영역은 중쇄의 첫번째 불변 영역에 정렬하고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 정렬한다. 대부분의 척추동물 종에서 유래한 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열에 기초한 카파(Kappa) 및 람다(Lambda)로 불리는 두 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 이들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 인간 항체는 5개의 상이한 부류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 지정될 수 있다. IgG 및 IgA는 하위부류, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 적어도 IgG2a 및 IgG2b를 지니는 마우스 및 래트와 같은 종 변이체가 존재한다. 항체의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 특별한 가변성을 나타내는 특정 영역을 지니는 항체에 결합 특이성을 수여한다. 가변 영역의 더욱 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)이라 불린다. 무손상 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 3개의 CDRs에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각각의 쇄 내 CDRs은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 서로 고정되어 있고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여하는 기타 쇄로부터의 CDR을 지닌다. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), Fcγ 수용체에 대한 결합을 통한 포식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/제거율, 및 보체 연속반응의 C1q 성분을 통한 보체 의존성 세포독성을 나타낸다.
IgG 항체의 구조의 본질은 두 개의 항원-결합 부위가 존재하고, 이 두 부위 모두는 동일한 에피토프에 대해 특이적이라는 것이다. 따라서 이것은 단일특이적(monospecific)이다.
이중특이적 항체는 두 개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이러한 항체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 면역글로불린 H 쇄-L 쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 여기서 두 개의 H 쇄는 상이한 결합 특이성을 갖는다. 참조[Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 및 Traunecker ef a/ EMBO, 10, 1991 , 3655-3659]. H 및 L 쇄의 무작위 조합에 의해, 10개의 상이한 항체의 구조의 가능한 혼합체가 생산되며 이 중 단 한가지만이 원하는 결합 특이성을 갖는다. 대안적 접근은 원하는 결합 특이성을 갖는 가변 도메인을 힌지영역(hinge region), CH2 및 CH3 영역 중 최소한 일부분을 포함하는 중쇄 불변 영역에 융합시키는 것(fusing)과 관련이 있다. 한개 이상의 융합체에 존재하는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하는 CH1 영역을 갖는 것이 바람직하다. 이 융합을 엔코딩하는 DNA, 및 원한다면 L 쇄를 별개의 발현 벡터에 삽입시키고 그 후 적당한 숙주 유기체에 공동형질감염시킨다. 두 개 또는 모든 세 개 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터내로 삽입시키는 것이 가능할 것으로 생각된다. 하나의 접근법에서, 이중특이적 항체는 한 개의 팔(arm)에서 제 1 결합 특이성을 지니는 H 쇄 및 다른 쪽 팔에서 제 2 결합 특이성을 제공하는 H-L 쇄 쌍으로 구성된다(참조: WO94/04690 및 Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986). 기타 접근법은 WO2007/095338에 제시된 단일 도메인 결합 부위를 포함하는 항체 분자를 포함한다.
본원 발명은 한 개 이상의 에피토프-결합 도메인과 연결된 단백질 골격을 포함하는 항원-결합 작제물에 관한 것으로서, 상기 항원-결합 작제물은 두 개 이상의 항원 결합 부위를 가지는데, 이 중 한 개 이상은 에피토프 결합 도메인에서 유래된 것이고, 이 중 한 개 이상은 짝지은(paired) VH/VL 도메인으로부터 유래된 것이다.
본 발명은 추가적으로 두개 이상의 하기 구조식Ⅰ의 구조를 포함하는 한개 이상의 동형이합체(homodimer)를 포함하는 항원-결합 작제물과 관련이 있다:
Figure pct00001
상기 구조식에서,
X는 중쇄 불변 도메인 2 및 중쇄 불변 도메인 3을 포함하는 불변 항체 영역을 나타내고;
R1, R4, R7 및 R8은 에피토프-결합 도메인에서 독립적으로 선택된 도메인을 나타내고;
R2는 중쇄 불변 1, 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
R3은 짝지은 VH 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
R5는 경쇄 불변 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
R6은 짝지은 VL 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
n은 0,1,2,3 및 4에서 독립적으로 선택된 정수를 나타내고;
m은 0 및 1에서 독립적으로 선택된 정수를 나타내고,
상기 중쇄 불변 1과 경쇄 불변 도메인은 연결되어 있고;
한 개 이상의 에피토프 결합 도메인이 존재하며;
R3이 짝지은 VH 도메인을 나타내는 경우, R6은 짝지은 VL 도메인을 나타내어, 상기 두 도메인은 함께 항원에 결합할 수 있다.
본 발명은 모노클로날 항체 또는 하나 이상의 도메인 항체와 연결된 단편을 포함하는 IgG 기초 구조와 관련이 있고, 이 같은 작제물을 만드는 방법 및 이의 이용, 특히 치료적 이용과 관련이 있다.
본 발명은 또한 상술한 항원 결합 작제물의 임의의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 상술한 항원 결합 작제물의 임의의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 등가 폴리펩티드 서열에 상응하는 코딩서열을 나타내지만, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 개시코돈, 적절한 신호 서열 및 종결코돈과 함께 발현 벡터내로 복제될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 또한 상술한 항원 결합 작제물의 임의의 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 한개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 형질전환된 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 상술한 임의의 항원 결합 작제물의 생산 방법을 제공하는데, 상기 방법은 제 1 및 제 2 벡터 -상술한 항원 결합 작제물의 임의의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 벡터 및 상술한 항원 결합 작제물의 임의의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 벡터- 를 포함하는 숙주 세포를 무-혈청 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가적으로 상술한 항원 결합 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에서 제시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 또는 이루어진 도메인 항체를 제공한다. 제 1 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 60 또는 SEQ ID NO: 61에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 단백질을 제공한다.
용어
본원에서 사용된 용어 "단백질 골격"은 면역 글로불린(Ig) 골격, 예컨대, IgG 골격을 포함하지만 이에 제한되지는 않고, 이 골격은 4개 쇄 또는 2개 쇄 항체일 수 있고, 또는 단지 항체의 Fc 영역을 포함할 수 있거나, 항체로부터 한 개 이상의 불변 영역을 포함할 수 있고, 이 불변 영역은 인간 또는 영장류 기원일 수 있거나, 인간 및 영장류 불변 영역의 인공 키메라일 수 있다. 이 같은 단백질 골격은 항원 결합 부위 외에도 한 개 이상의 불변 영역을 포함할 수 있는데, 예컨대 상기 단백질 골격은 충분한 IgG를 포함한다. 이 같은 단백질 골격은 다른 단백질 도메인, 예컨대 항원-결합 부위를 가진 단백질 도메인, 예컨대 에피토프-결합 도메인 또는 ScFv 도메인과 연결될 수 있다.
"도메인"은 나머지 단백질과 독자적인 제 3차 구조를 가진 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 분리된 기능적 특성에 책임이 있고, 많은 경우에 잔여 단백질 및/또는 도메인의 기능 손실 없이 다른 단백질을 첨가, 제거 또는 운반할 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이것은 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 예컨대, 한 개 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특성이 아닌 서열로 대체된 가변 도메인, N- 또는 C-말단 연장부를 포함하거나 절단된(truncated) 항체 가변 도메인뿐만 아니라, 적어도 전-장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유한 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
어구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과는 독립적인 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른, 상이한 가변 영역 또는 가변 도메인과 함께, 한 포맷(예컨대, 호모- 또는 헤테로-멀티머)으로 존재할 수 있고, 상기 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합을 필요로 하지 않는다(즉, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가적 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합한다). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용된 상기 용어와 같이 항원에 결합할 수 있는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있으나, 또한 다른 종, 예컨대 설치류(예컨대, WO 00/29004에 기재됨), 너스 상어(nurse shark) 및 카멜리드 VHH dAbs에서 온 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 VHH는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이며, 이는 자연적으로 경쇄가 결핍된 중쇄 항체를 생성시킨다. 이러한 VHH 도메인은 당 업계에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 여전히 본 발명에 따른 "도메인 항체"로 고려된다. 본원에서 사용되는 "VH"는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다. NARV는 너스 상어를 포함하는 연골 어류로 확인된 면역 글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 유형이다. 이 도메인은 또한 신규한 항원 수용체 가변 영역(Novel Antigen Receptor variable region)(일반적으로, 줄여서 V(NAR) 또는 NARV)으로 공지되어 있다. 추가적 상세한 설명은 문헌[Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) 및 US20050043519A]을 참조하라.
용어 "에피토프-결합 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 지칭하며, 이는 도메인 항체(dAb), 예컨대 인간, 카멜리드 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예컨대, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디(Affibody), SpA), A-도메인(아비머/맥시바디(Avimer/Maxibody)); 열 충격 단백질, 예컨대, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 안키린 반복 단백질(ankyrin repeat protein)(DARPin); 펩티드 압타머; C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아플린(affilins)); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 저해제의 스콜피온 독성쿠니츠형 도메인(scorpion toxinkunitz type domains); 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin));으로 이루어진 군에서 선택된 골격의 유도체인 도메인일 수 있고, 천연 리간드 이외의 리간드에 대한 결합을 획득하기 위하여 단백질 조작이 이러한 에피토프-결합 도메인에 적용되었다.
CTLA-4(세포독성 T 림프구-관련 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포에서 발현된 CD-28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 Ig 접힘과 같은 가변 도메인을 가진다. 항체의 CDRs와 상응하는 루프는 이종 서열(heterologous sequence)로 치환되어 상이한 결합 특성을 수여할 수 있다. 상이한 결합 특성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로 알려져 있다. 추가 상세한 설명은 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조하라.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예컨대, 스테로이드, 빌린(bilins), 레티노이드 및 지질를 운반하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이것은 원뿔형 구조의 개방 말단(open end)에서 상당한 루프와 함께 단단한 β-시트 제 2차 구조를 갖으며, 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 안티칼린은 160 내지 180개의 아미노산 크기이며, 리포칼린에서 유래되었다. 추가 상세한 설명은 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 및 US20070224633]을 참조하라.
아피바디는 Staphylococcus aureus의 단백질 A에서 유래된 골격이고, 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이 도메인은 대략 58개의 아미노산의 3개의 나선형 다발로 이루어져 있다. 표면 잔기의 무작위성(randomisation)에 의해 라이브러리를 생성하였다. 추가 상세한 설명은 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) 및 EP1641818A1]을 참조하라.
아비머는 A-도메인 골격 패밀리에서 유래된 멀티도메인 단백질이다. 대략 35개의 아미노산의 천연 도메인은 정의된 이황화 결합된 구조를 채택하였다. A-도메인의 패밀리에 의해 나타낸 자연적 변이체의 뒤섞임에 의해 다양성이 생성된다. 추가 상세한 설명은 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 및 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조하라.
트랜스페린은 단량체 혈청 운반 글리코단백질이다. 트랜스페린은 허용적(permissive) 표면 루프 내에서 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 골격의 예는 트랜스-바디를 포함한다. 추가 상세한 설명은 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조하라.
계획된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPins)은 세포 골격에 내재성 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 한 페밀리인 안키린에서 유래된다. 단일 안키린 반복은 두 개의 α-나선 및 β-턴으로 이루어진 33개의 잔기 모티프(residue motif)이다. 이것은 각각의 반복의 제 1 α-나선 및 β-턴 중 잔기를 무작위 추출함에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 인터페이스는 모듈의 수를 증가시킴에 의해 증가될 수 있다(친화도 성숙(affinity maturation)방법). 추가 상세한 설명은 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 및 J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 및 US20040132028A1]을 참조하라.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 골격이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 Ⅲ(FN3)의 15 반복 단위의 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 백본으로 이루어져 있다. β-샌드위치의 한 말단에서 세 개의 루프는 애드넥틴이 흥미로운 치료적 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가 상세한 설명은 문헌[Protein Eng. Des. SeI. 18, 435-444(2005), US20080139791, WO2005056764 및 US6818418B1]을 참조하라.
펩티드 앱타머는 불변 골격 단백질, 활성 부위에 삽입된 제약적 가변 펩티드 루프를 포함하는 전형적인 티오레독신(TrxA)으로 이루어진 조합의 인식 분자이다. 추가 상세한 설명은 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조하라.
미소체는 3-4개의 시스테인 브릿지를 포함하는, 길이로는 25-50개의 아미노산의 자연적으로 발생한 마이크로단백질에서 유래된다 - 마이크로단백질의 예는 카라타B1(KalataB1) 및 코노독소(conotoxin) 및 노틴(knottins)을 포함한다. 상기 마이크로단백질은 상기 마이크로단백질의 전반적인 접힘에 영향을 미치지 않고, 최대 25개의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 노틴 도메인의 추가 상세한 설명은 WO2008098796을 참조하라.
다른 에피토프 결합 도메인은 상이한 표적 항원 결합 특성을 조작하기 위하여 골격으로서 사용된 단백질을 포함하고, 이 단백질에는 인간 λ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아플린), 인간 프로테아제 저해제의 쿠니츠형 도메인, 라스(Ras)-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 스콜피온 독소(카리브도독소(charybdotoxin)), C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴)이 포함된다 - [Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007, Stefan Dubel 출판)의 제 7장 및 Protein Science 15:14-27 (2006)에 개관되어 있음]. 본 발명의 에피토프 결합 도메인은 상기 임의의 대체 단백질 도메인에서 유래될 수 있다.
본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "짝지은 VH 도메인". "짝지은 VL 도메인" 및 "짝지은 VH/VL 도메인"은 이의 파트너 가변 도메인과 짝지은 경우에만 특이적으로 항원에 결합하는 항체 가변 도메인을 지칭한다. 임의의 쌍 중에는 보통 한 개의 VH와 한 개의 VL이 존재하고, 상기 용어 "짝지은 VH 도메인"은 VH 파트너를 지칭하고, 상기 용어 "짝지은 VL 도메인"은 VL 파트너를 지칭하며, 상기 용어 "짝지은 VH/VL 도메인"은 두 개의 도메인을 함께 지칭한다.
본 발명의 제 1 구체예에서, 상기 항원 결합 부위는 각 항원에 대해 Biacore™, 예컨대, 방법 4 또는 5에서 상술한 바와 같은 Biacore™ 에 의해 측정된 경우, 1mM 이상의 Kd, 예컨대, 1OnM, 1nM, 50OpM, 20OpM, 10OpM의 Kd를 지니는 항원에 결합한다.
본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "항원 결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 작제물 상의 부위를 지칭하고, 이는 단일 도메인, 예컨대 에피토프-결합 도메인일 수 있거나, 표준 항체에서 발견될 수 있기 때문에 짝지은 VH/VL 도메인일 수 있다. 본 발명의 몇 가지 양태에서, 단일-쇄 Fv(ScFv) 도메인은 항원-결합 부위를 제공할 수 있다.
용어 "mAb/dAb" 및 "dAb/mAb"는 본 발명의 항원-결합 작제물을 지칭하기 위해 본원에서 사용되었다. 상기 두 용어는 호환성있게 사용될 수 있으며 본원에서 사용된 것과 같이 동일한 의미를 가지도록 의도되었다.
용어 "불변 중쇄 1"은 면역글로불린 중쇄의 CH1 도메인을 지칭하기 위해 본원에서 사용되었다.
용어 "불변 경쇄"는 면역글로불린 경쇄의 불변 도메인을 지칭하기 위해 본원에서 사용되었다.
본 발명은 한 개 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 단백질 골격을 포함하는 항원-결합 작제물에 관한 것으로, 상기 항원-결합 작제물은 두 개 이상의 항원 결합 부위를 가지고, 상기 항원 결합 부위 중 한 개 이상은 에피토프 결합 도메인에서 유래된 것이고 상기 항원 결합 부위 중 한 개 이상은 짝지은 VH/VL 도메인으로부터 유래된 것이다.
이러한 항원-결합 작제물은 단백질 골격, 예컨대 IgG와 같은 Ig, 예컨대 모노클로날 항체를 포함하고, 이는 한 개 이상의 에피토프-결합 도메인, 예컨대 도메인 항체와 연결되고, 상기 결합 작제물은 두 개 이상의 항원 결합 부위를 가지고, 이 중 한개 이상은 에피토프 결합 도메인에서 유래된 것이고, 생산 방법 및 이의 사용, 특히 치료적 이용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항원-결합 작제물의 몇가지 예가 도 1에 제시되어 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 또한 mAbdAbs로 지칭된다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물의 단백질 골격은 Ig 골격, 예컨대 IgG 골격 또는 IgA 골격이다. IgG 골격은 항체의 모든 도메인(즉, CH1, CH2, CH3, VH, VL)을 포함할 수 있다. 본 발명의 항원-결합 작제물은 IgG1, lgG2, lgG3, lgG4 또는 lgG4PE에서 선택된 IgG 골격을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 두 개 이상의 항원 결합 부위를 가지고, 예컨대 두 개의 결합 부위를 가지고, 예컨대, 제 1 결합 부위는 항원 상의 제 1 에피토프에 대해 특이성을 가지고 제 2 결합 부위는 동일한 항원 상의 제 2 에피토프에 대해 특이성을 가진다. 추가적 구체예에서는 4개의 항원 결합 부위, 또는 6개의 항원 결합 부위, 또는 8개의 항원 결합 부위, 또는 10개 이상의 항원-결합 부위가 존재한다. 제 1 구체예에서, 항원 결합 작제물은 1개 이상의 항원, 예컨대 두 개의 항원, 또는 세 개 항원, 또는 네 개 항원에 대해 특이성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 구조식 Ⅰ의 두 개 이상의 구조를 포함하는 한 개 이상의 동형이합체를 포함하는 항원-결합 작제물에 관한 것이다:
Figure pct00002
상기 구조식에서,
X는 중쇄 불변 도메인 2 및 중쇄 불변 도메인 3을 포함하는 불변 항체 영역을 나타내고;
R1, R4, R7 및 R8은 에피토프-결합 도메인에서 독립적으로 선택된 도메인을 나타내고;
R2는 중쇄 불변 1, 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
R3은 짝지은 VH 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
R5는 경쇄 불변 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
R6은 짝지은 VL 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
n은 0,1,2,3 및 4에서 독립적으로 선택된 정수를 나타내고;
m은 0 및 1에서 독립적으로 선택된 정수를 나타내고,
상기 중쇄 불변 1과 경쇄 불변 도메인은 연결되어 있고;
한 개 이상의 에피토프 결합 도메인이 존재하며;
R3이 짝지은 VH 도메인을 나타내는 경우, R6은 짝지은 VL 도메인을 나타내어, 상기 두 도메인은 함께 항원에 결합할 수 있다.
제 1 구체예에서, R6은 짝지은 VL을 나타내고 R3은 짝지은 VH를 나타낸다.
추가적 구체예에서, R7 및 R8 둘 중 어느 하나 또는 상기 둘 모두는 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.
추가적 구체예에서, R1 및 R4 둘 중 어느 하나 또는 상기 둘 모두는 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.
제 1 구체예에서 R4가 존재한다.
제 1 구체예에서, R1, R7 및 R8은 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.
제 1 구체예에서, R1, R7 및 R8, 및 R4는 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.
제 1 구체예에서, (R1)n, (R2)m, (R4)m 및 (R5)m = 0, 즉 존재하지 않는 경우, R3은 짝지은 VH 도메인이고, R6은 짝지은 VL 도메인이고, R8 은 VH dAb이고, R7 은 VL dAb이다.
또 다른 구체예에서, (R1)n, (R2)m, (R4)m 및 (R5)m = 0, 즉 존재하지 않는 경우, R3은 짝지은 VH 도메인이고, R6은 짝지은 VL 도메인이고, R8 은 VH dAb이고, (R7)m = 0, 즉 존재하지 않는다.
또 다른 구체예에서, (R2)m, 및 (R5)m이 0, 즉 존재하지 않는 경우, R1은 dAb이고, R4는 dAb이고, R3은 짝지은 VH 도메인이고, R6은 짝지은 VL 도메인이며, (R8)m 및 (R7)m = 0, 즉 존재하지 않는다.
본 발명의 제 1 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 dAb이다.
본원에 기재된 임의의 항원-결합 작제물은 한 개 이상의 항원을 중화시킬수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 항원 결합 작제물에 대해 본 명세서를 통해 사용된 용어 "중화하다" 및 이의 문법적 변형은, 본원 발명의 항원 결합 작제물의 존재에서, 이러한 항원 결합 작제물 부재시의 표적의 활성과 비교하여, 전체적 또는 부분적으로, 표적의 생물학적 특성을 감소시키는 것을 의미한다. 중화는 한개 이상의 리간드 결합 차단에 의한 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 이는 상기 리간드가 수용체에 활성을 띄지 못하게 하며, 수용체 조절을 감소시키거나 효과기 기능성에 영향을 미친다.
중화의 수준은, 예컨대, 하기 실시예 및 방법에 제시된 바와 같은 임의의 분석을 이용함으로서, 예컨대, 방법 12, 19 또는 21 또는 실시예 32 중 임의의 한가지에 기재된 것과 같이 수행될 수 있는, 수용체에의 리간드 결합의 저해를 측정하는 분석과 같은 몇가지 방법으로 측정될 수 있다. 이 분석중 VEGF, IL-4, IL-13 또는 HGF의 중화는 중화된 항원 결합 작제물의 존재하에 리간드 및 이의 수용체 사이의 감소된 결합을 분석함으로써 측정된다.
중화의 수준은 또한, 예컨대, 방법 8, 9, 10, 20 또는 21에서 기재된 바와 같이 수행될 수 있는, TF1 분석으로 측정될 수 있다. 이 분석에서 IL-13, IL-4 또는 둘 모두의 사이토카인의 중화는 중화 항원 결합 작제물의 존재하에 TF1 세포 증식의 저해를 분석함으로서 측정된다. 대안적으로 중화는 예컨대 방법 13에 기재된 것과 같이 수행될 수 있는, EGFR 인산화 분석으로 측정될 수 있다. 이 분석에서 EGFR의 중화는 중화 항원 결합 작제물의 존재하에 수용체의 티로신 키나아제 인산화의 저해를 분석함으로서 측정된다. 또는, 중화는 예컨대 방법 14 또는 15에 기재된 바와 같이 수행될 수 있는, MRC-5 세포 내 IL-8 분비 분석으로 측정될 수 있다. 이 분석에서 TNFα 또는 IL-1R1의 중화는 중화 항원 결합 작제물의 존재하에 IL-8 분비의 저해를 분석함으로서 측정된다.
중화를 분석하는 다른 방법, 예컨대, 중화 항원 결합 작제물의 존재하에 리간드 및 이의 수용체 사이의 감소된 결합을 분석하는 것은 당업계에 공지되어 있고, 이것은 예컨대 Biacore™ 분석을 포함한다.
본원 발명의 대안적 양태에서, 본원에 예시된 항체에 대해 적어도 실질적으로 등가 중화 활성을 가지는 항원 결합 작제물이 제공된다 - 예컨대, TF1 세포 증식 분석에서 586H-TVAAPS-210, 또는 PascoH-G4S-474, 또는 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-474 , PascoL-G4S-474 또는 PascoHL-G4S-474의 중화 활성을 보유한 항원 결합 작제물, 또는 실시예 4 및 20 각각에 제시된 바와 같은 pSTAT6 신호 분석의 저해, 또는 예컨대, VEGFR 결합 분석에서 BPC1603, BPC1604, BPC1605, BPC1606의 중화 활성을 보유하는 항원 결합 작제물 또는 실시예 14.6 및 14.7에서 제시된 바와 같은 IGF-1R 수용체 인산화의 저해.
본 발명의 항원 결합 작제물은 IL-13에 대해 특이성을 갖는 것들을 포함하는데, 예컨대, IL-13에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, IL-13에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다. 상기 항원 결합 작제물은 IL-13에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 작제물은 IL-13에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 한 개 이상의 항원에 대해 특이성을 갖는데, 예컨대, 이는 IL-13, IL-5, 및 IL-4에서 선택된 두개 이상의 항원에 결합할 수 있거나, 예컨대 IL-13 및 IL-4에 결합할 수 있거나, IL-13 및 IL-5에 결합할 수 있거나, IL-5 및 IL-4에 결합할 수 있다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 한 개 이상의 항원에 대해 특이성을 갖는바, 예컨대, 이는 IL-13, IL-5, 및 IL-4 중에서 선택된 두개 이상의 항원에 결합할 수 있거나, 예컨대, IL-13 및 IL-4에 동시에 결합할 수 있거나, 또는 IL-13 및 IL-5에 동시에 결합할 수 있거나, IL-5 및 IL-4에 동시에 결합할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항원-결합 작제물은, 예컨대, 화학량론 측정에 의해 측정되거나, 실시예 섹션, 방법 7에 기재된 바와 같은 적합한 분석을 이용하여, 두개 이상의 항원에 동시에 결합할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 항원-결합 작제물의 예는, 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-4에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대 항-IL-4 dAb)을 갖는 IL-13 항체를 포함한다 - 예컨대 SEQ ID NO:16 내지 39, SEQ ID NO:41 내지 43, SEQ ID NO:87 내지 90, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:152, 또는 SEQ ID NO:155에 제시된 중쇄 서열을 지니는 mAbdAb. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-13에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-13 dAb)을 가진 IL-4 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO:48 내지 53, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:150, 또는 SEQ ID NO:157 내지 160에서 제시된 중쇄 서열, 및/또는 SEQ ID NO:54 내지 59에서 제시된 경쇄 서열을 지니는 mAbdAb.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-5에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-5 dAb)을 가진 IL-13 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-13 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-13에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-13 dAb)을 가진 IL-5 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID 72에서 제시된 경쇄 서열을 지니는 mAbdAb.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-5에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-5 dAb)을 가진 IL-4 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-5 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-4 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-4에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-4 dAb)을 가진 IL-5 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID 71에서 제시된 중쇄 서열을 지니는 mAbdAb.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명은 또한 IL-4, IL-13 및 IL-5에 결합할 수 있는 삼중특이적(trispecific) 결합 작제물을 제공한다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-4에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-4 dAb) 및 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-13에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-13 dAb)을 가진 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-5 항체를 포함한다.
이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 IL-18에 대해 특이성을 갖는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 IL-18에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, IL-18에 결합하는 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 IL-18에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항체 결합 작제물은 IL-18에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 IL-4, IL-13 및 IL-18에 결합할 수 있는 삼중특이적 결합 작제물을 포함한다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-4에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-4 dAb) 및 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-13에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-13 dAb)을 가진 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 c-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 중쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL-4 에피토프 결합 도메인 및 경쇄의 n-말단에 부착된 IL-13 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL-18 항체를 포함한다.
이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 TNFα에 대해 특이성을 갖는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 TNFα에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, 이는 TNFα에 결합하는 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 TNFα에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 TNFα에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 한개 이상의 항원에 대해 특이성을 갖는바, 예컨대 TNFα, EGFR 및 VEGF에서 선택된 두개 이상의 항원에 결합할 수 있고, 예컨대 TNFα 및 EGFR에 결합할 수 있거나, TNFα 및 VEGF에 결합할 수 있거나, EGFR 및 VEGF에 결합할 수 있다. 이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, EGFR에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-EGFR-4 dAb)을 가진 TNFα 항체를 포함한다 -예컨대, SEQ ID NO: 74에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO: 79에 제시된 경쇄 서열을 가진 mAbdAb.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 EGFR 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 EGFR 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 EGFR 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 EGFR 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 EGFR 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 EGFR 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 EGFR 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 EGFR 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, VEGF에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-VEGF dAb)을 가진 TNFα 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO: 75, 78 또는 185에 제시된 중쇄 서열을 지니는 mAbdAb.
본 발명의 항원-결합 작제물은 하나 이상의 항원에 대해 특이성을 갖는바, 예컨대 이는 TNFα, IL-4 및 IL-13 중에서 선택된 한 개 또는 두 가지 항원에 결합할 수 있고, 예컨대 이는 TNFα 및 IL-4에 결합할 수 있거나, TNFα 및 IL-13에 결합할 수 있거나, TNFα 및 IL-13 및 IL-4 에 결합할 수 있다. 이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, TNFα에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-TNFα 애드넥틴)을 가진 IL-13 항체를 포함한다 -예컨대, SEQ ID NO: 134 또는 135에 제시된 중쇄 서열을 가진 mAbdAb. 이러한 항원-결합 작제물의 또 다른 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, TNFα에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-TNFα 애드넥틴)을 가진 IL-4 항체를 포함한다 -예컨대, SEQ ID NO: 146 또는 147에 제시된 중쇄 서열을 가진 mAbdAb.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 CD-20에 대해 특이성을 갖는 것들을 포함할 수 있는바, 예컨대 CD-20에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, CD-20에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 CD-20에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있는바, 예컨대 이는 SEQ ID NO: 120 및 117의 중쇄 및 경쇄 서열을 지니는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 CD-20에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다. CD-20에 대해 특이성을 지니는 mAbdAbs의 예는 SEQ ID NO: 116, 118에 제시된 중쇄 서열을 갖는 것들이거나, SEQ ID NO: 119 또는 121에 제시된 경쇄 서열을 갖는 것들이다.
이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 IL1R1에 대해 특이성을 갖는 것들을 포함할 수 있는바, 예컨대 IL1R1에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, IL1R1에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 IL1R1에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 IL1R1에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 한 개 이상의 항원에 대해 특이성을 갖는바, 예컨대 IL1R1 및 제 2 항원에 결합할 수 있고, 예컨대 IL1R1 및 VEGF에 결합할 수 있다. 이러한 항원-결합 작제물의 예는, 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, VEGF에 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-VEGF dAb)을 갖는 IL1R1 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO: 77에 제시된 경쇄 서열을 지니는 mAbdAb.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL1R1 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL1R1 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL1R1 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 VEGF 에피토프 결합 도메인을 지니는 IL1R1 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 n-말단에 부착된 IL1R1 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 n-말단에 부착된 IL1R1 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 중쇄의 c-말단에 부착된 IL1R1 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 경쇄의 c-말단에 부착된 IL1R1 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 EGFR에 대해 특이성을 지니는 것들을 포함하는바, 예컨대 EGFR에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, EGFR에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 EGFR에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 EGFR에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다. 이러한 항원 결합 작제물의 몇가지 예는 SEQ ID NO:103을 포함하는 EGFR 상 에피토프에 결합할 수 있을 것이다 - 예컨대, 이 항원 결합 작제물은 SEQ ID NO: 97 내지 SEQ ID NO: 102 및 SEQ ID NO: 104 내지 SEQ ID NO: 107에서 제시된 한 개 이상의 CDRs를 포함한다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 하나 이상의 항원에 대해 특이성을 갖는바, 예컨대 EGFR, IGF-1R, VEGFR2 및 VEGF 중에서 선택된 두 개 이상의 항원과 결합할 수 있고, 예컨대 EGFR 및 IGF-1R에 결합할 수 있거나, EGFR 및 VEGF에 결합할 수 있거나, VEGF 및 IGF-1R에 결합할 수 있거나, EGFR 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, IGF-1R 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, VEGF 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, EGFR, IGF-1R 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, VEGF, IGF-1R 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, EGFR, VEGF 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, EGFR, VEGF 및 IGF1R에 결합할 수 있다. 이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, VEGFR2에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-VEGFR2 애드넥틴)을 가진 EGFR 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO: 136, 140 또는 144에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO: 138, 142 또는 145에 제시된 경쇄 서열을 지니는 mAbdAb.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, VEGF에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-VEGF dAb)을 가진 EGFR 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO: 165, 174, 176, 178, 184 또는 186에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO: 188 또는 190에 제시된 경쇄 서열을 지니는 mAbdAb.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, EGFR에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-EGFR dAb)을 가진 VEGF 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO: 180에 제시된 중쇄 서열을 지니는 mAbdAb. 이러한 mAbdAbs는 또한 SEQ ID NO: 182에 제시된 경쇄 서열을 포함할 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, VEGF에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-VEGF 리포칼린)을 가진 IGF-1R 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO: 123 또는 125에 제시된 중쇄 서열을 지니는 mAbdAb. 이러한 mAbdAb는 또한 SEQ ID NO:113에 제시된 경쇄 서열을 포함할 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, VEGFR2에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-VEGFR2 애드넥틴)을 가진 IGF-1R 항체를 포함한다 - 예컨대, SEQ ID NO: 124 또는 133에 제시된 중쇄 서열을 지니는 mAbdAb. 이러한 mAbdAb는 또한 SEQ ID NO:113에 제시된 경쇄 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 IL-23에 대해 특이성을 지니는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 IL-23에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, IL-23에 결합하는 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 IL-23에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 IL-23에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다.
제 1 구체예에서, 본원 발명의 항원-결합 작제물은 한개 이상의 항원에 대해 특이성을 갖는바, 예컨대 TH 17형 사이토카인, IL-17, IL-22, 또는 IL-21에서 선택된 두개 이상의 항원에 결합할 수 있거나, 예컨대 IL-23 및 IL-17에 결합할 수 있거나, IL-23 및 IL-21에 결합할 수 있거나, IL-23 및 IL-22에 결합할 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된, IL-17에 대해 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인(예컨대, 항-IL-17 dAb)을 갖는 IL-23 항체를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 PDGFRα에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 PDGFRα에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, PDGFRα에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다. 항원 결합 작제물은 PDGFRα에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 PDGFRα에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 FGFR1에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 FGFR1에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, FGFR1에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다. 항원 결합 작제물은 FGFR1에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 FGFR1에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 FGFR3에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 FGFR3에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, FGFR3에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다. 항원 결합 작제물은 FGFR3에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 FGFR3에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 VEGFR2에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 VEGFR2에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, VEGFR2에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 VEGFR2에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 VEGFR2에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 VEGFR3에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 VEGFR3에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, VEGFR3에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 VEGFR3에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 VEGFR3에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 VE 카드헤린(VE cadherin)에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 VE 카드헤린에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, VE 카드헤린에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 VE 카드헤린에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 VE 카드헤린에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 뉴로필린(neuropilin)에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 뉴로필린에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, 뉴로필린에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 뉴로필린에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 뉴로필린에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 Flt-3에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 Flt-3에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, Flt-3에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 Flt-3에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 Flt-3에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 론(ron)에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 론에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, 론에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 론에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 론에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 Trp-1에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 Trp-1에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, Trp-1에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 Trp-1에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 Trp-1에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 한 개 이상의 항원에 대해 특이성을 가지는바, 예컨대 이는 암과 관련된 두 개 이상의 항원에 결합할 수 있고, 예컨대 PDGFRα, FGFR1, FGFR3, VEGFR2, VEGFR3, IGF1R, EGFR 및 VEGF, VE 카드헤린, 뉴로필린, Flt-3, 론, Trp-1, CD-20에서 선택된 두 개 이상의 항원에 결합할 수 있고, 예컨대 PDGFRα 및 FGFR1에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 VEGF에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 FGFR3에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 VEGFR3에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 IGF1R에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 EGFR에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 VEGF에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 론에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 Trp1에 결합할 수 있거나, PDGFRα 및 CD-20에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 FGFR3에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 VEGR3에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 IGF1R에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 EGFR에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 VEGF에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 Fit-3에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 론에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, FGFR1 및 CD-20에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 VEGFR3에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 IGF1R에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 EGFR에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 VEGF에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 론에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, FGFR3 및 CD-20에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 VEGFR3에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 IGF1R에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 EGFR에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 VEGF에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 론에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, VEGFR2 및 CD-20에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 IGF-1R에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 EGFR에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 VEGF에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, VEGFR3 및 CD-20에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 EGFR에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 VEGF에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 론에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, IGF1R 및 CD-20에 결합할 수 있거나, EGFR 및 VEGF에 결합할 수 있거나, EGFR 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, EGFR 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, EGFR 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, EGFR 및 론에 결합할 수 있거나, EGFR 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, EGFR 및 CD-20에 결합할 수 있거나, VEGF 및 VE 카드헤린에 결합할 수 있거나, VEGF 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, VEGF 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, VEGF 및 론에 결합할 수 있거나, VEGF 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, VEGF 및 CD-20에 결합할 수 있거나, VE 카드헤린 및 뉴로필린에 결합할 수 있거나, VE 카드헤린 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, VE 카드헤린 및 론에 결합할 수 있거나, VE 카드헤린 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, VE 카드헤린 및 CD-20에 결합할 수 있거나, 뉴로필린 및 Flt-3에 결합할 수 있거나, 뉴로필린 및 론에 결합할 수 있거나, 뉴로필린 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, 뉴로필린 및 CD-20에 결합할 수 있거나, Flt-3 및 론에 결합할 수 있거나, Flt-3 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, Flt-3 및 CD-20에 결합할 수 있거나, 론 및 Trp-1에 결합할 수 있거나, 론 및 CD-20에 결합할 수 있거나, Trp-1 및 CD-20에 결합할 수 있다.
이러한 항원-결합 작제물은 또한 중쇄의 c-말단 및/또는 n-말단 및/또는 경쇄의 c-말단 및/또는 n-말단에 부착된 동일한 또는 상이한 항원-특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인을 한 개 이상 추가적으로 가질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 베타-아밀로이드에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 베타-아밀로이드에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, 베타-아밀로이드에 결합한 짝지은 VH/VL를 포함한다.
항원 결합 작제물은 베타-아밀로이드에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 베타-아밀로이드에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 CD-3에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 CD-3에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, CD-3에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 CD-3에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 CD-3에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 gplllb/lla에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 gplllb/lla에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, gplllb/lla에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 gplllb/lla에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 gplllb/lla에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 TGF베타에 대해 특이성을 가지는 것들을 포함하는바, 예컨대 이는 TGF베타에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하거나, TGF베타에 결합한 짝지은 VH/VL을 포함한다.
항원 결합 작제물은 TGF베타에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 작제물은 TGF베타에 결합할 수 있는 dAb을 포함할 수 있다.
본 발명의 제 1 구체예에서, 본원에 기재된 발명에 의한 항원 결합 작제물이 제공되고, 이는 불변 영역을 포함하여 항체가 ADCC 및/또는 보체 활성 또는 효과기 기능성을 감소시키도록 한다. 이러한 제 1 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 자연히 lgG2 또는 lgG4 이소형의 비활성 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 개질의 예는 EP0307434에 기재되어 있다. 한가지 예는 위치 235 및 237(EU 색인 번호)에서 알라닌 잔기의 치환을 포함한다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 Fc 기능성을 보유할 것인데, 예컨대 ADCC 및 CDC 활성 어느 하나 또는 상기 둘 모두를 가질 수 있다. 이러한 항원-결합 작제물은 경쇄, 예컨대 경쇄의 c-말단에 위치한 에피토프-결합 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 에피토프 결합 도메인을 특히 항체의 경쇄에 위치시킴으로서, 에피토프 결합 도메인을 경쇄의 c-말단에 위치시킴으로서, 항원-결합 작제물의 ADCC 및 CDC 기능을 유지시키는 방법을 제공한다. 이러한 ADCC 및 CDC 기능은 임의의 적합한 분석, 예컨대 실시예 15.3에 제시된 ADCC 분석 및 실시예 15.4에 제시된 CDC 분석에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 에피토프 결합 도메인을 항체의 중쇄에 위치시킴으로서, 특히, 에피토프 결합 도메인을 중쇄의 c-말단에 위치시킴으로서, 항원-결합 작제물의 CDC 기능을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 CDC 기능은 임의의 적합한 분석, 예컨대 실시예 15.4에 제시된 CDC 분석에 의해 측정될 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 VEGF, IGF-1R 및 EGFR에서 선택된 두 개 이상의 항원에 결합할 수 있는바, 예컨대 이는 EGFR 및 VEGF, 또는 EGFR 및 IGF1R, 또는 IGF1R 및 VEGF에 결합할 수 있거나, 예컨대 TNF 및 IL1-R에 결합할 수 있다. IGF-1R 결합 부위를 포함하는 본 발명의 제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물의 IGF-1R 결합 부위는 단백질 골격 내 짝지은 VH/VL 도메인을 포함할 수 있고, 상기 짝지은 VH/VL 도메인은 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 및 SEQ ID NO: 86에서 제시된 서열들에서 선택된 한 개 이상의 CDRs를 포함할 수 있고, 예컨대 이는 SEQ ID NO:80에서 제시된 서열과 같이 적어도 CDRH3을 포함할 수 있고, 예컨대 이는 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 , SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, 및 SEQ ID NO: 86에서 제시된 모든 CDRs를 포함할 수 있다.
EGFR 결합 부위를 포함하는 본 발명의 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 성숙한 또는 정상 또는 야생형 EGFR 서열의 잔기 273-501을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있고, 예컨대 성숙한 또는 정상 또는 야생형 EGFR(SEQ ID NO:103)의 잔기 287-302를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물의 EGFR 결합 부위는 단백질 골격 내 짝지은 VH/VL 도메인을 포함할 수 있고, 상기 짝지은 VH/VL 도메인은 SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, 및 SEQ ID NO: 102에서 제시된 서열들 중에서 선택된 한 개 이상의 CDRs를 포함할 수 있고, 예컨대 이는 SEQ ID NO: 106에서 제시된 서열과 같이 CDRH3을 포함할 수 있거나, 이는 SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, 및 SEQ ID NO: 102에서 제시된 모든 6개의 CDRs를 포함할 수 있다. 이와 같이 짝지은 VH/VL 도메인은, 특히 중쇄 CDRs 내, 추가 잔기를 추가적으로 포함할 수 있고, 제 1 구체예에서, CDRH1은 SEQ ID NO: 104 플러스 최대 5개의 추가 잔기, 예컨대 SEQ ID NO: 97에서 제시된 한개 이상의 5개의 추가 잔기를 포함할 수 있고, CDRH2는 SEQ ID NO: 105 플러스 최대 두 개의 추가 잔기, 예컨대 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 107에 제시된 어느 하나 또는 상기 둘 모두의 두개 추가 잔기 를 포함할 수 있고, CDRH3은 SEQ ID NO: 106 플러스 최대 두 개의 추가 잔기, 예컨대 SEQ ID NO: 99에서 제시된 어느 하나 또는 둘 모두의 두개 추가 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 제 1 구체예에서, 짝지은 VH/VL 도메인은 SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, 및 SEQ ID NO: 102에 제시된 한개 이상의 CDRs를 포함하고, 예컨대 이는 SEQ ID NO:99에 제시된 바와 같이 적어도 CDRH3를 포함할 수 있고, 예컨대 이는 SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 102에 제시된 모든 6개의 CDRs를 포함할 수 있다(적합한 항체의 더욱 상세한 설명은 WO02/092771 및 WO2005/081854에서 발견할 수 있다).
제 1 구체예에서, 항원 결합 작제물은 도메인 항체 (dAb)인 에피토프-결합 도메인을 포함하며, 예컨대 상기 에피토프 결합 도메인은 인간 VH 또는 인간 VL, 또는 카멜리드 VHH 또는 상어 dAb (NARV)일 수 있다.
제 1 구체예에서, 상기 항원 결합 작제물은 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예컨대, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예컨대, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 안키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 압타머; C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아플린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 저해제의 스콜피온 독성쿠니츠형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴);으로 이루어진 군에서 선택된 골격의 유도체인 에피토프-결합 도메인을 포함하고, 천연 리간드 이외의 리간드에 대한 결합을 획득하기 위하여 단백질 조작이 이러한 에피토프-결합 도메인에 적용되었다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 애드넥틴인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 골격, 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 애드넥틴을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 애트넥틴에 부착된 단백질 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 애드넥틴을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 애트넥틴에 부착된 단백질 골격, 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 애드넥틴을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 애트넥틴에 부착된 단백질 골격, 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 애드넥틴을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 CTLA-4인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 CTLA-4를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 CTLA-4를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 CTLA-4를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 CTLA-4를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 리포칼린인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 리포칼린를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 리포칼린를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 리포칼린를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 리포칼린를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 SpA인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 SpA를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 SpA를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 SpA를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 SpA를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 아피바디인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 아피바디를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 아피바디를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 아피바디를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 아피바디를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 아피머(affimer)인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 아피머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 아피머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 아피머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 아피머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 GroEI인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 GroEI를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 GroEI를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 GroEI를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 GroEI를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 트랜스페린인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 트랜스페린을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 트랜스페린을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 트랜스페린을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 트랜스페린을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 GroES인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 GroES를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 GroES를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 GroES를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 GroES를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 DARPin인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 DARPin을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 DARPin을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 DARPin을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 DARPin을 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이는 펩티드 압타머인 에피토프 결합 도메인에 부착된, 단백질 골격, 예컨대 IgG 골격, 예컨대 중쇄의 n-말단에 부착된 펩티드 압타머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 중쇄의 c-말단에 부착된 펩티드 압타머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 n-말단에 부착된 펩티드 압타머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있거나, 이는 예컨대 경쇄의 c-말단에 부착된 펩티드 압타머를 동반한 IgG 골격을 포함할 수 있다.
본 발명의 제 1 구체예에서, 4개의 에피토프 결합 도메인, 예컨대 4개의 도메인 항체가 존재하는바, 상기 에피토프 결합 도메인 중 두 가지가 동일한 항원에 대해 특이성을 가질 수 있거나, 항원-결합 작제물 내 존재하는 모든 에피토프 결합 도메인이 동일한 항원에 대해 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 단백질 골격은 링커의 사용에 의해 에피토프-결합 도메인에 연결될 수 있다. 적합한 링커의 예는 길이 상 1개의 아미노산 내지 150개 아미노산, 또는 1개 아미노산 내지 140개 아미노산, 예컨대 1개 아미노산 내지 130개 아미노산, 또는 1개 아미노산 내지 120개 아미노산, 또는 1개 아미노산 내지 80개 아미노산, 또는 1개 아미노산 내지 50개 아미노산, 또는 1개 아미노산 내지 20개 아미노산, 또는 1개 아미노산 내지 10개 아미노산, 또는 5개 아미노산 내지 18개 아미노산일 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 이들 자신의 제 3차 구조를 가질 수 있는바, 예컨대, 본 발명에 제시된 링커는 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 제 1 구체예의 링커의 크기는 당일 가변 도메인과 동일하다. 적합한 링커는 1 내지 20 옹스트롬, 예컨대 15 옹스트롬 미만, 또는 10 옹스트롬 미만, 또는 5 옹스트롬 미만의 크기일 것이다.
본 발명의 제 1 구체예에서, 1개 이상의 에피토프 결합 도메인은 1 내지 150개 아미노산, 예컨대 1 내지 20개 아미노산, 예컨대 1 내지 10개 아미노산을 포함하는 링커로 Ig 골격에 직접적으로 부착된다. 이러한 링커는 SEQ ID NO: 6 내지 11에 제시된 서열들 중 임의의 한가지, 'STG' (세린, 트레오닌, 글리신), 'GSTG' 또는 'RS'에서 선택될 수 있고, 예컨대 상기 링커는 'TVAAPS'일 수 있거나, 상기 링커는 'GGGGS'일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 작제물 내 사용되는 링커는 단독 또는 다른 링커, GS 잔기의 한 개 이상의 세트, 예컨대 'GSTVAAPS' 또는 'TVAAPSGS' 또는 'GSTVAAPSGS'를 추가하여 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인, 예컨대 dAb 및 Ig 골격 사이에 링커가 존재하지 않는다. 또 다른 구체예에서 상기 에피토프 결합 도메인, 예컨대 dAb는 링커 'TVAAPS'에 의해 Ig 골격에 연결된다. 또 다른 구체예에서 상기 에피토프 결합 도메인, 예컨대 dAb는 링커 'TVAAPSGS'에 의해 Ig 골격에 연결된다. 또 다른 구체예에서 상기 에피토프 결합 도메인, 예컨대 dAb는 링커 'GS'에 의해 Ig 골격에 연결된다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 작제물은 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 한 개 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함한다.
제 1 구체예에서, 3개 이상의 항원 결합 부위가 존재하는바, 예컨대 4, 또는 5 또는 6 또는 8 또는 10개의 항원 결합 부위가 존재하고, 상기 항원 결합 작제물은 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 8 또는 10개 이상의 항원에 결합할 수 있는바, 예컨대 이는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 8 또는 10개 항원에 동시에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 의약(medicine)으로 사용하기 위한, 예컨대 암 또는 염증성 질환, 예컨대 천식, 류마티스 관절염 또는 골관절염을 치료하기 위한 약제(medicament)의 제조에 이용하기 위한 항원-결합 작제물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 항원-결합 작제물의 치료적 양을 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 염증성 질환, 예컨대 천식, 류마티스 관절염, 또는 골관절염에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 암 또는 염증성 질환, 예컨대 천식, 류마티스 관절염, 또는 골관절염의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 몇가지 효과기 기능을 지닐 수 있다 - 예컨대, 상기 단백질 골격이 효과기 기능을 지니는 항체로부터 유도된 Fc 영역을 포함한다면, 예컨대 상기 단백질 골격이 IgG1으로부터 유래한 CH2 및 CH3을 포함한다면. 효과기 기능의 수준은 공지된 기술에 따라, 예컨대 CH2 도메인의 돌연변이에 의해, 변화될 수 있는데, 예컨대 상기 IgG1 CH2 도메인은 239 및 332 및 330에서 선택된 위치에서 한 개 이상의 돌연변이를 갖고, 예컨대 상기 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L 중에서 선택되어 상기 항체가 강화된 효과기 기능을 갖도록 하고/하거나, 예컨대 본 발명의 항원-결합 작제물의 당화 프로파일을 변화시켜 Fc 영역의 푸코실화가 감소되도록 한다.
본 발명에서 사용되는 단백질 골격은 모든 항체 도메인을 포함하는 전체 모노클로날 항체 골격을 포함하거나, 본 발명의 단백질 골격은 비-전통적(non-conventional) 항체 구조, 예컨대 1가 항체를 포함할 수 있다. 이러한 1가 항체는 짝지은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 상기 중쇄의 힌지 영역(hinge region)은 개질되어 상기 중쇄가 동형이합체화(homodimerise)가 되지 않도록 한다(예컨대, WO2007059782에 기재된 1가 항체). 다른 1가 항체는 기능적 가변 영역 및 CH1 영역이 결여된 제 2 중쇄를 동반한 이합체화하는 짝지은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 상기 제 1 및 제 2 중쇄는 이들이 동형이합체보다는 이형이합체를 형성하도록 개질되어, 두 개의 중쇄 및 한개의 경쇄를 동반한 1가 항체, 예컨대 WO2006015371에 기재된 1가 항체를 형성한다. 이러한 1가 항체는 에피토프 결합 도메인이 연결될 수 있는, 본 발명의 단백질 골격, 예컨대 실시예 32에 기재된 항원 결합 작제물을 제공할 수 있다.
본 발명에 사용된 에피토프-결합 도메인은 상이한 V 영역 또는 도메인의 독립적인 에피토프 또는 항체에 특이적으로 결합하는 도메인이고, 이는 도메인 항체일 수 있거나, CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예컨대, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예컨대, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 안키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 압타머; C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아플린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 저해제의 스콜피온 독성쿠니츠형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴);으로 이루어진 군에서 선택된 골격의 유도체인 도메인일 수 있고, 천연 리간드 이외의 리간드에 대한 결합을 획득하기 위하여 단백질 조작이 이러한 에피토프-결합 도메인에 적용되었다. 제 1 구체예에서, 이는 도메인 항체일 수 있거나, 다른 적합한 도메인, 예컨대, CTLA-4, 리포칼린, SpA, 아피바디, 아비머, GroEI, 트랜스페린, GroES 및 피브로넥틴으로 이루어진 군에서 선택된 도메인일 수 있다. 제 1 구체예에서, 이는 dAb, 아피바디, 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 애드넥틴에서 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이는 아피바디, 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 애드넥틴에서 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이는 도메인 항체, 예컨대 인간, 카멜리드 또는 상어(NARV) 도메인 항체에서 선택된 도메인 항체일 수 있다.
에피토프-결합 도메인은 단백질 골격에 한 개 이상의 위치에서 연결될 수 있다. 이 위치는 단백질 골격의 C-말단 및 N-말단, 예컨대 IgG의 중쇄의 C-말단 및/또는 경쇄의 C-말단, 또는 예컨대 IgG의 중쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 N-말단을 포함한다.
제 1 구체예에서, 제 1 에피토프 결합 도메인은 단백질 골격에 연결되고 제 2 에피토프 결합 도메인은 제 1 에피토프 결합 도메인에 연결되는데, 예컨대 단백질 골격이 IgG 골격인 경우, 제 1 에피토프 결합 도메인은 IgG 골격의 중쇄의 C-말단에 연결 될 것이고, 상기 에피토프 결합 도메인은 이의 C-말단에서 제 2 에피토프 결합 도메인에 연결될 수 있거나, 예컨대 제 1 에피토프 결합 도메인은 IgG 골격의 경쇄의 C-말단에 연결될 수 있고, 상기 제 1 에피토프 결합 도메인은 이의 C-말단에서 추가적으로 제 2 에피토프 결합 도메인에 연결될 수 있거나, 예컨대 제 1 에피토프 결합 도메인은 IgG 골격의 경쇄의 N-말단에 연결될 수 있고, 제 1 에피토프 결합 도메인은 이의 N-말단에서 제 2 에피토프 결합 도메인에 추가적으로 연결될 수 있거나, 예컨대 제 1 에피토프 결합 도메인은 IgG 골격의 중쇄의 N-말단에 연결될 수 있고, 제 1 에피토프 결합 도메인은 이의 N-말단에서 제 2 에피토프 결합 도메인에 추가적으로 연결될 수 있다. 이러한 항원 결합 작제물의 예는 실시예 31에 기재되어 있다.
에피토프-결합 도메인이 도메인 항체인 경우, 몇가지 도메인 항체가 골격 내 특수한 위치에 적합할 수 있다.
본 발명에 사용되는 도메인 항체는 기존의 IgGs의 중쇄 및/또는 경쇄의 c-말단에 연결될 수 있다. 게다가 몇가지 dAbs는 기존의 항체의 중쇄 및 경쇄 상기 두가지 모두의 c-말단에 연결될 수 있다.
상기 작제물 중, dAb의 N-말단이 항체 불변 도메인(CH3 또는 CL)에 융합된 경우, 펩티드 링커는 dAb가 항원에 결합하는데 도움을 줄 수 있다. 실제로, dAb의 N-말단은 항원-결합 활성에 관련된 상보성-결정 영역(complementarity determining regions, CDRS)에 근접하여 위치된다. 따라서 짧은 펩티드 링커는 에피토프-결합 도메인과 단백질 골격에 대한 불변 도메인 사이의 스페이서(spacer) 역할을 하고, 이는 dAb CDRs가 더욱 쉽게 항원에 도달하도록 할 수 있고, 따라서 높은 친화력으로 결합할 수 있다.
dAbs가 IgG에 연결되어 있는 주변은 이들이 융합된 항체 쇄에 따라 다를 것이다:
IgG 골격의 항체 경쇄의 C-말단에서 융합된 경우, 각각의 dAb는 항체 힌지 및 Fc 포션 부근에 위치될 것으로 기대된다. 이러한 dAbs는 서로에 대해 멀리 떨어져 위치할 가능성이 있다. 종래의 항체에서, Fab 단편 사이의 각도 및 각각의 Fab 단편 사이의 각도 및 Fc 포션은 매우 상당하게 변화될 수 있다. Fab 단편 사이의 각도(mAbdAbs 동반함)는 광범위하게 다르지 않을 것이나, 몇가지 각도상 제한이 각각의 Fab 단편 및 Fc 포션 사이 각도에서 관찰될 수 있다.
IgG 골격의 항체 중쇄의 C-말단에서 융합된 경우, 각각의 dAb는 Fc 포션의 CH3 도메인 부근에 위치될 것으로 기대된다. 이것은 Fc 수용체(예컨대,FcγRI, II, III, FcRn)에 대한 Fc 결합 특성에 영향을 미칠 것으로 기대되지 않는데, 이는 이 수용체들이 CH2 도메인(수용체의 FcγRI, Ⅱ 및 Ⅲ 종류에 대한)에 관여하거나 CH2 및 CH3 도메인(예컨대, FcRn 수용체) 사이의 힌지에 관여하기 때문이다. 이러한 항원-결합 작제물의 또 다른 특성은 둘 모두의 dAbs가 서로에 대해 공간적으로 근접할 것이 기대된다는 점과 이는 적절한 링커의 제공에 의해 유연성이 제공된다는 점을 전제로 하며, 이 dAbs는 심지어 동형이합체 종을 형성할 수 있고, 따라서 Fc 포션의 '지퍼형'('zipped') 4차 구조를 보급하며, 이는 상기 구조의 안정성을 강화할 수 있다.
이러한 구조적 고려는 단백질 골격, 예컨대 항체 상에 에피토프-결합 도메인, 예컨대 dAb에 연결하기 위한 가장 적합한 포션의 선택에 도움이 될 수 있다.
항원의 크기, 이의 위치(혈액 내 또는 세포 표면 상), 이의 4차 구조(단량체(monomeric) 또는 다량체(multimeric))는 변할 수 있다. 종래의 항체는 힌지 영역의 존재 때문에 아답터(adaptor) 작제물로서 기능하도록 자연적으로 설계되고, Fab 단편의 끝(tip)에서 두 개의 항원-결합 부위의 방향은 광범위하게 변화될 수 있고 따라서 항원 및 이의 주위의 분자 특성에 순응한다. 반면에, 항체 또는 다른 단백질 골격, 예컨대 힌지 영역이 없는 항체를 포함하는 단백질 골격에 연결된 dAbs는 직접적 또는 간접적으로 구조적 유연성을 덜 가질 수 있다.
용액 상태 및 dAb에서의 결합 모드를 이해하는 것 또한 유용하다. 시험관 내 dAbs는 용액 내에서 우세하게 단량체로 존재할 수 있고, 동형이합체 또는 다량체 형태로 존재할 수 있다는 증거가 축적되어 있다(Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698; Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553, Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903; Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1 161-1165; Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365).
이것은 Ig 도메인, 예컨대 벤스-존스(Bence-Jone) 단백질(면역글로불린 경쇄의 이합체(Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952; Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857; Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301) 및 아밀로이드 섬유(James et al. (2007) J Mol Biol. 367:603-8)로 생체내에서 관찰된 다량체화 사건을 상당히 연상시킨다.
예컨대, 이는 용액 내에서 이합체화 하는 경향이 있는 도메인 항체를 경쇄의 c-말단에 우선하여 Fc 포션의 c-말단에 결합하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 Fc의 c-말단에 결합하는 것은 본 발명의 항원-결합 작제물의 정황에 있어서 dAbs가 이합체화하도록 할 것이기 때문이다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 단일 항원에 대해 특이적인 항원-결합 부위를 포함할 수 있거나, 두 개 이상의 항원, 또는 단일 항원 상에 두 개 이상의 에피토프에 대해 특이적인 항원-결합 부위를 가질 수 있거나, 동일 또는 상이한 항원 상 상이한 에피토프에 대해 특이적인 각각의 항원-결합 부위가 존재할 수 있다.
항원-결합 부위는 사이토카인, 성장 인자, 사이토카인 수용체, 성장인자 수용체, 효소(예컨대, 프로테아제), 효소에 대한 공동-인자, 예컨대, DNA 결합 단백질, 지질 및 탄수화물을 포함하는, 각각 항원, 예컨대 인간 또는 동물 단백질에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 사이토카인, 성장 인자, 사이토카인 수용체, 성장인자 수용체 및 다른 단백질을 포함하는, 적합한 표적은 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, CEA, CD40, CD40 리간드, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, 엑소더스(Exodus)-2, FAPα, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장인자-10, FLT3 리간드, 프렉탈카인(Fractalkine)(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인간 혈청 알부민, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체, IL-1 수용체 유형 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈(lnhibin)α, 인히빈β, IP-10, 케라티노사이트(keratinocyte) 성장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포택틴(Lymphotactin), 뮐러리안 억제 물질(Mullerian inhibitory substance), 단핵구 콜로니 저해 인자(monocyte colony inhibitory factor), 단핵구 유인 단백질, M-CSF, c-fms, v-fmsMDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 전구세포 저해 인자-1(myeloid progenitor inhibitor factor-1)(MPIF-1), NAP-2, 뉴투린(Neurturin), 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴(Oncostatin) M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 Ⅱ, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1 , HER 2, HER 3, HER 4, 혈청 알부민, vWF, 아밀로이드 단백질(예컨대, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1 , IgE, 및 본원에 기재된 다른 표적을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이 리스트가 결코 제한적인 것이 아님이 이해될 것이다.
몇 가지 구체예에서, 프로테아제 저항 펩티드 또는 폴리펩티드는 폐 조직에서 표적, TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12, IL-12R, IL-13, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERI, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12(SDF-1), 키마제(chymase), FGF, 퓨린, 엔도셀린(Endothelin)-1, 에오탁신(예컨대, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁신-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, 인테그린, L-셀렉틴, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, 뉴트로필 엘라스타제(neutrophil elastase), 오스테오폰틴(osteopontin), OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, 트롬빈, Tim-1, TNF, TRANCE, 트립타제, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, 알파v베타6, 알파v베타8, cMET, CD8, vWF, 아밀로이드 단백질(예컨대, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, 및 IgE로 이루어진 군에서 선택된 표적에 결합한다.
특히, 본 발명의 항원-결합 작제물은 IL-13, IL-5 및 IL-4와 관련된 질환, 예컨대, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 크론병, COPD, 섬유성 질환 또는 장애, 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신성 경화증, 간 섬유화, 간 육아종, 주혈 흡충증, 리슈만편모충증, 세포 주기 조절 질환, 예컨대 호지킨병(Hodgkins disease), B 세포 만성 림프구성 백혈병의 치료에 유용할 수 있고, 예컨대 상기 작제물은 천식의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 성장 인자, 예컨대, IGF-1R, VEGF 및 EGFR에 관련된 질환, 예컨대 암 또는 류마티스 관절염의 치료에 유용할 수 있고, 암 종류의 예로, 이러한 치료는 유방암, 전립선암, 폐암 및 골수종에 유용할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 TNF에 관련된 질환, 예컨대 관절염, 예컨대 류마티스 관절염 또는 골관절염의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 IL1-R에 관련된 질환, 예컨대 관절염, 예컨대 류마티스 관절염 또는 골관절염의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 CD-20에 관련된 질환, 예컨대 자가 면역 질환, 예컨대, 건선, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 퇴행성 신경 질환, 예컨대 다발성 경화증, 호중구 유래 질환(neutrophil driven diseases), 예컨대, COPD, 베게너 육아종증(Wegeners vasculitis), 낭포성 섬유증, 쇼그렌 증후군(Sjogrens syndrome), 만성 이식 거부, 1 타입 당뇨병 이식 대 숙주 질환(type 1 diabetes graft versus host disease), 천식, 알레르기성 질환 아토피성 피부염, 습진 피부염, 알레르기성 비염, 다른 자가면역 질환(갑상선염, 척추관절염, 강직성 척추염, 포도막염, 다발성연골염 또는 경피증을 포함함), 또는 암, 예컨대, B-세포 림프종 또는 성숙한 B 세포 종양, 예컨대 CLL 또는 SLL을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 작제물은 IL-17 및 IL-23에 관련된 질환, 예컨대 건선, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 퇴행성 신경 질환, 예컨대 다발성 경화증, 호중구 유래 질환, 예컨대, COPD, 베게너 육아종증, 낭포성 섬유증, 쇼그렌 증후군, 만성 이식 거부, 1 타입 당뇨병 이식 대 숙주 질환, 천식, 알레르기성 질환 아토피성 피부염, 습진 피부염, 알레르기성 비염, 다른 자가면역 질환(갑상선염, 척추관절염, 강직성 척추염, 포도막염, 다발성연골염 또는 경피증을 포함함)을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발병의 항원 결합 작제물은 본 발명의 항원 결합 작제물에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킴으로서 생산될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 숙주 세포로부터 분비 및/또는 숙주 세포 내 발현과 복제를 조절할 수 있는 종래의 조절 컨트롤 서열과 함께, 항원 결합 작제물에 대한 이들의 코딩 서열을 작동적인 조합(operative association)내에 위치시킴으로서 생산된다. 조절 서열은 프로모터 서열, 예컨대 CMV 프로모터 및 다른 공지된 항체로부터 유도될 수 있는 신호 서열을 포함한다.
이와 유사하게, 제 2 발현 벡터는 상보적인 항원 결합 작제물 경쇄 또는 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 가지고 생산될 수 있다. 특정 구체예에서, 이 제 2 발현 벡터는 가능한 한 각각의 폴리펩티드 쇄가 기능적으로 발현된다는 것을 보증하는 한, 코딩 서열 및 선택가능 마커에 관해서만 예외로하고, 제 1 발현벡터와 동일하다.
대안적으로, 항원 결합 작제물에 대한 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일 벡터, 예컨대 동일한 벡터 내 두 개의 발현 카세트 내에 존재할 수 있다.
선택된 숙주 세포는 종래 기술에 의해 제 1 및 제 2 벡터 두 가지 모두로(또는 단순히 단일 벡터에 의해 형질감염됨) 공동-형질감염되어, 재조합 또는 합성의 경쇄 및 중쇄 두 가지 모두를 포함하는 본 발명의 형질감염된 숙주 세포를 형성한다. 상기 형질감염된 세포는 그 후 종래의 기술에 의해 배양되어 본 발명의 조작된 항원 결합 작제물을 생성한다.
재조합 중쇄 및/또는 경쇄 두 가지 조합(association)을 포함하는 항원 결합 작제물은 적합한 분석, 예컨대 ELISA 또는 RIA에 의해 배지로부터 스크리닝된다. 유사한 종래 기술은 다른 항원 결합 작제물을 작제하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 클로닝 및 서브클로닝 단계를 위한 적합한 벡터 및 본 발명의 조성물의 구성은 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예컨대, 클로닝 벡터의 종래 pUC 시리즈가 사용될 수 있다. 한가지 벡터, pUC19는 공급 업체, 예컨대 아머샴(Amersham)(Buckinghamshire, United Kingdom) 또는 파마시아(Pharmacia)(Uppsala, Sweden)로부터 상업적으로 이용가능하다.
추가적으로, 손쉽게 대체될 수 있고, 풍부한 클로닝 부위 및 선택가능 유전자(예컨대, 항생제 저항성)을 지니며 간단히 조작된 임의의 벡터가 클로닝에 이용될 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한 인자가 아니다.
발현 벡터는 또한 이종기원의 DNA 서열의 발현을 증폭시키는데 적합한 유전자, 예컨대 포유류 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(dihydrofolate reductase gene, DHFR)에 의해 특징화될 수 있다. 다른 바람직한 벡터 서열은 폴리 A 신호 서열, 에컨대 소 성장 호르몬(BGH) 및 베타글로빈 프로모터 서열(betaglopro)을 포함한다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 합성될 수 있다.
이러한 벡터의 성분, 예컨대 리플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호 서열 및 이와 유사한 것은 상업적 또는 자연적 소스로부터 획득될 수 있거나, 선택된 숙주 내 재조합 DNA의 생산물의 분비 및/또는 발현을 선택하는데 이용하기 위한 공지된 절차에 의해 합성될 수 있다. 포유류, 박테리아, 곤충, 효모, 및 균류 발현의 분야에 공지되어 있는 수많은 유형의 기타 적합한 발현 벡터가 또한 상기 목적을 위해 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 작제물의 코팅 서열을 포함하는 재조합 플라스미드와 함께 형질감염된 세포주를 포함한다. 또한 이 클로닝 벡터의 클로닝 및 다른 조작에 유용한 숙주 세포는 전형적이다. 그러나, 대장균(E. coli)의 다양한 계통으로부터의 세포가 클로닝 벡터의 복제 및 본 발명의 항원 결합 작제물의 작제 내의 다른 단계에 이용될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물의 발현을 위한 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 포유류 세포, 예컨대 NSO, Sp2/0, CHO (예컨대, DG44), COS, HEK, 섬유아세포(예컨대, 3T3), 및 골수종 세포를 포함하고, 예컨대 이는 CHO 또는 골수종 세포 내에서 발현될 수 있다. 인간 세포가 사용될 수 있고, 따라서 분자가 인간 글리코실화 패턴으로 개질되도록 할 수 있다. 대안적으로, 다른 진핵 세포주가 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증식, 스크리닝 및 생산물 생산 및 정제 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 상기 인용된 [Sambrook et al.] 참조.
박테리아 세포는 재조합 Fabs의 발현 또는 본 발명의 다른 구체예에 적합한 숙주 세포로서 유용성이 입증될 수 있다(예컨대, [Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188(1992)] 참조). 그러나, 박테리아 세포 내 발현된 단백질의 비접힘 또는 부적절하게 폴딩된 형태 또는 비-글리코실화된 형태로 존재하는 경향성 때문에, 박테리아 세포 내 생성된 임의의 재조합 Fab는 항원 결합 능력의 보유를 위해 스크리닝되어야 할 것이다. 박테리아 세포에 의해 발현된 분자가 적절하게 폴딩된 형태로 생산된다면, 박테리아 세포는 바람직한 숙주가 되거나, 대안적인 구체예에서 상기 분자가 박테리아 숙주에서 발현할 수 있고 그 후 후속적으로 재-접힘될 수 있다. 예컨대, 발현을 위해 사용된 다양한 계통의 대장균은 생명공학 분야에서 숙주 세포로 잘 알려져 있다. 다양한 계통의 고초균(B. subtilis), 스트렙토마이세스, 다른 바실루스 및 이와 유사한 것이 상기 방법에 또한 이용될 수 있다.
원한다면, 당업자에게 공지된 효모 세포 계통이 또한 숙주세포를 비롯한 곤충 세포, 예컨대 초파리(Drosophila) 및 나비목(Lepidoptera) 및 바이러스성 발현 시스템으로서 이용가능하다. 예컨대 [Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)] 및 본원에 인용된 참조문헌을 참조하라.
벡터가 작제될 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법은 본 발명의 숙주 세포의 생산을 필요로 하고, 이러한 숙주 세포로부터 본 발명의 항원 결합 작제물의 생산에 필수적인 배양 방법은 모두 종래 기술일 수 있다. 일반적으로, 본원 발명의 배양 방법은 보통 현탁액 내 무혈청 세포를 배양함에 의한, 무혈청 배양 방법이다. 마찬가지로, 생산시, 본 발명의 항원 결합 작제물은 황산 암모늄 침전, 친화 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 이와 유사한 것을 포함하는, 업계의 표준 절차에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 존재하고 본 발명을 제한하지 않는다. 예컨대, 변형된 항체의 제조는 WO 99/58679 및 WO 96/16990에 기재되어 있다.
항원 결합 작제물 발현의 또다른 방법은 유전자 변형 동물, 예컨대 미국 특허 제 4,873,316호에 기재된 유전자 변형 동물에서 발현 가능할 것이다. 이것은 동물의 카세인(casein) 프로모터를 이용한 발현 시스템에 관한 것으로, 유전자 변형적으로 포유류에 통합된 경우, 암컷이 자신의 우유에서 원하는 재조합 단백질을 생산하도록 한다.
본 발명의 추가 양태에서, 본 발명의 항체를 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터로 형질전환되거나 형질 감염된 숙주세포를 배양하는 단계 및 이에 따라 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 항원 결합 작제물을 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 하기의 단계를 포함한다;
(a) 항원 결합 작제물의 중쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터를 제공하는 단계;
(b) 항원 결합 작제물의 경쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 제공하는 단계;
(c) 포유류 숙주 세포(예컨대, CHO)를 상기 제 1 및 제 2 벡터로 형질전환 시키는 단계;
(d) 단계 (c)의 숙주 세포를 항원 결합 작제물의 분비에 도움이 되는 조건 하에서 상기 숙주 세포로부터 상기 배양 배지로 배양하는 단계;
(e) 단계 (d)의 분비된 항원 결합 작제물을 회수하는 단계.
원하는 방법에 의해 발현시, 그 후 항원 결합 작제물은 적절한 분석의 이용에 의해 체외 활성이 검사된다. 현재 종래의 ELISA 분석 형식은 항원 결합 작제물의 이의 표적에 대한 결합의 정성 및 정량 분석에 사용된다. 추가적으로, 다른 체외 분석이 또한 중화 효능을 증명하는데 이용될 수 있고, 후속하여 보통의 제거 기전(clearance mechanisms)에도 불구하고, 항원 결합 작제물의 채내에서의 지속력을 평가하기 위해 인간 임상 연구가 수행된다.
치료제의 복용량 및 기간은 인간 순환 내에 본 발명의 분자의 상대적인 지속 기간에 관련이 있고, 환자의 일반적인 건강 및 치료되는 조건에 따라 당업자에 의해 조절될 수 있다. 연장된 기간에 걸친(4달 내지 6달) 반복적인 복용(예컨대, 일주일에 1회 또는 매 2주에 1회)이 최대 치료 효능 달성을 위해 필요할 수 있다는 사실이 파악된다.
본 발명의 치료제의 투여 모드는 상기 치료제를 숙주에 전달하는 임의의 적합한 루트일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 작제물 및 약제 조성물은 특히 비경구 투여, 즉, 피하(s.c), 수강내, 복강내, 근육내(i.m.), 정맥내(i.v.), 비강내 투여에 유용하다.
본 발명의 치료제는 약제학적으로 허용가능한 담체 내 활성 성분으로서, 본 발명의 항원 결합 작제물의 유효량을 포함하는 약제 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 예방제(prophylactic agent)에서, 항원 결합 작제물을 포함하는 수성 현탁액 또는 용액, 바람직하게는 생리적 pH로 완충된, 주사로 투여될 수 있는 형태가 바람직하다. 경구투여를 위한 조성물은 일반적으로 본 발명의 항원 결합 작제물 용액 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 이의 칵테일을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체가 이용될 수 있다 - 예컨대 0.9％ 식염수, 0.3％ 글리신 및 이와 유사한 것. 이 용액은 멸균상태로 만들어지고 일반적으로 미세입자 물질이 존재하지 않을 것이다. 이 용액은 종래, 잘 알려진 멸균 기술(예컨대, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 생리적 조건에 근접시키는데 요구되는, 약제학적으로 허용되는 보조물질, 예컨대 pH 조절 및 완충용액 등을 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 제형 중 본 발명의 항원 결합 작제물의 농도는 매우 다양할 수 있고 - 즉, 약 0.5％ 미만, 보통 약 1％ 또는 약 1％ 이상에서, 15 또는 20 중량％ 까지- 선택된 특정 투여 모드에 따라, 주로 액체 부피, 점도 등에 기초하여 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제 조성물은 1mL의 무균 완충 용액, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg 사이, 예컨대 약 50 ng 내지 약 30 mg, 더욱 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 작제물을 포함하도록 제조될 수 있다. 이와 유사하게, 정맥 내 주입을 위한 본 발명의 약제 조성물은 약 250 ml의 무균 링거 용액(Ringer's solution), 및 링거 용액 1ml 당, 약 1 내지 약 30 및 바람직하게는 5mg 내지 약 25mg의 본 발명의 항원 결합 작제물을 포함하도록 제조될 수 있다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하는 현행 방법은 잘 알려져 있거나, 당업자에게 명백할 것이고, 예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 정맥내 투여가능한 본 발명의 항원 결합 작제물 제형의 제조의 경우, 전체 내용이 본원에 참조문헌으로서 통합되고, 독자가 명확하게 참조된, 문헌[Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern TJ. , Manning M. C, New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274, Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91 , 2252-2264,(2002)]을 참조하라.
약제적 제조의 경우, 본 발명의 치료제는 단위 복용량 형태로 제시되는 것이 바람직하다. 적절한 치료적 유효 복용량은 당업자에 의해 손쉽게 결정될 것이다. 적합한 복용량은 환자의 체중에 따라 환자에 대해 계산될 것인데, 예컨대 적합한 복용량은 0.01 내지 20mg/kg이 될 수 있고, 예컨대 0.1 내지 20mg/kg, 예컨대 1 내지 20mg/kg, 예컨대 10 내지 20mg/kg, 또는 예컨대 1 내지 15mg/kg, 예컨대 10 내지 15mg/kg일 수 있다. 인간에서 본 발명의 사용 조건을 효과적으로 치료하기 위해, 적합한 복용량은 0.01 내지 1000mg 범위 내일 수 있고, 예컨대 0.1 내지 1000mg, 예컨대 0.1 내지 500mg, 예컨대 500mg, 예컨대 0.1 내지 100mg 또는 0.1 내지 80mg, 또는 0.1 내지 60mg, 또는 0.1 내지 40mg, 또는 예컨대 1 내지 100mg, 또는 1 내지 50mg의 본 발명의 항원 결합 작제물일 것이고, 이것은 비경구로, 예컨대 피하, 정맥내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 이러한 복용량은, 필요하다면, 의사에 의해 적절하게 선택된 적절한 시간 간격을 두고 반복적으로 투여될 수 있다.
본원에 상술한 항원 결합 작제물은 저장을 위해 동결건조될 수 있고 사용에 앞서 적절한 운반체로 재구성될 수 있다. 이 기술은 전형적인 면역글로불린에 효과적인 것으로 나타났고 당업계에 알려진 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 에피토프-결합 도메인을 발견하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 몇가지 방법이 존재한다.
용어 "라이브러리"는 이종의 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 지칭한다. 상기 라이브러리는 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 가진 각각의 멤버로 이루어진다. 이 정도까지는, "라이브러리"는 "레퍼토리"와 동의어이다. 라이브러리 멤버 사이의 서열의 차이점은 라이브러리 내 존재하는 다양성을 유발한다. 상기 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물 형태를 취하거나, 라이브러리의 핵산으로 형질전환된, 유기체 또는 세포, 예컨대, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 및 이와 유사한 형태를 취할 수 있다. 제 1 실시예에서, 각 개별적인 유기체 또는 세포는 단지 한 개 또는 제한된 수의 라이브러리 멤버를 포함한다. 유리하게도, 핵산은 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 허용하기 위해, 발현 벡터내로 통합된다. 따라서, 제 1 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체 집단 형식을 취할 수 있고, 핵산 형태의 라이브러리의 단일 멤버를 포함하는 발현 벡터의 복제를 한 개 이상 포함하는 각 유기체는 상응하는 폴리펩티드 멤버를 생산하기 위해 발현될 수 있다. 따라서 숙주 유기체의 집단은 다양한 폴리펩티드의 거대 러퍼토리를 엔코딩하는 가능성을 가진다.
"보편적인 프레임워크(universal framework)"는 카밧(Kabat)("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health 및 인간 Services)에 의해 정의된 서열 내 보존된 항체의 영역에 상응하거나, 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)[(1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 의해 정의된 인간 생식선 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는, 단일 항체 프레임워크 서열이다. 단일 프레임워크 또는 이러한 프레임워크의 세트가 존재할 수 있는데, 이것이 초가변영역 단독 내 변이를 통해 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것이 관찰되었다.
본원에 정의된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 알고리즘 BLAST 2 서열을 이용해, 기본 매개변수를 이용해(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)) 제 1 구체예에서 준비되고 결정된다.
에피토프 결합 도메인과 항원 결합 부위는 일반(generic) 리간드 또는 임의의 원하는 표적 리간드, 예컨대 인간 또는 동물 단백질 - 사이토카인, 성장인자, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 효소(예컨대, 프로테아제), 효소에 대한 공동-인자, DNA 결합 단백질, 지질 및 탄수화물을 포함함 - 에 대해 각각 특이성을 가질 수 있다. 사이토카인, 성장 인자, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체 및 다른 단백질을 포함하는, 적합한 타켓은 하기의 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, CEA, CD40, CD40 리간드, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소더스-2, FAPα, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장인자-10, FLT3 리간드, 프렉탈카인(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인간 혈청 알부민, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체, IL-1 수용체 유형 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈α, 인히빈β, IP-10, 케라티노사이트 성장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포택틴, 뮐러리안 억제 물질, 단핵구 콜로니 저해 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, c-fms, v-fmsMDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수 전구세포 저해 인자-1(MPIF-1), NAP-2, 뉴투린, 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 Ⅱ, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, 혈청 알부민, vWF, 아밀로이드 단백질(예컨대, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, IgE, 및 본원에 기재된 다른 표적. 이 리스트가 결코 제한적인 것이 아님이 이해될 것이다.
몇몇 구체예에서, 결합은 폐조직 내 표적, 예컨대, TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL- 18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERI, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12(SDF-1), 키마제, FGF, 퓨린, 엔도셀린-1, 에오탁신(예컨대, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁신-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, 인테그린, L-셀렉틴, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, 뉴트로필 엘라스타제, 오스테오폰틴, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, 트롬빈, Tim-1, TNF, TRANCE, 트립타제, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, 알파v베타6, 알파v베타8, cMET, CD8, vWF, 아밀로이드 단백질(예컨대, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, 및 IgE로 이루어진 군에서 선택된 표적에서 이루어진다.
디스플레이 시스템(예컨대, 핵산의 코딩 기능 및 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결하는 디스플레이 시스템)이 본원의 방법에 사용된 경우(예컨대 dAb 또는 다른 에피토프 결합 도메인의 선택에서), 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 복제 수를 증폭하거나 증가시키는 것이 종종 유리하다. 이것은 선택의 추가 라운드를 위해 또는 추가 레퍼토리(예컨대, 친화도 성숙 레퍼토리)를 제조하기 위해, 본원에 기재된 방법 또는 다른 적합한 방법을 이용하여, 핵산 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 충분한 양을 획득하는 효과적인 방법을 제공한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 에피토프 결합 도메인을 선택하는 방법은 디스플레이 시스템(예컨대, 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결하는, 예컨대 파지 디스플레이(phage display))을 이용하는 것을 포함하고, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 복제 수를 증폭하거나 증가시키는 것을 추가적으로 포함한다. 핵산은 임의의 적합한 방법, 예컨대 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄반응을 이용해 증폭될 수 있다.
제 1 실시예에서, 상기 방법은 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결하는 디스플레이 시스템을 이용한다. 이러한 디스플레이 시스템은 다수의 복제가능 유전적 패키지, 예컨대, 박테리오파지 또는 세포(박테리아)를 포함할 수 있다. 디스플레이 시스템은 라이브러리, 예컨대 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 포함할 수 있다. 박테리오파지 디스플레이는 디스플레이 시스템의 일 예이다.
다수의 적합한 박테리오파지 디스플레이 시스템(예컨대, 일가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 기재되어 있다(예컨대, 문헌[Griffiths et al., 미국특허출원 제 6,555,313 B1호(참조문헌으로서 본원에 통합됨); Johnson et al., 미국특허출원 제 5,733,743호(참조문헌으로서 본원에 통합됨); McCafferty et al., 미국특허출원 제 5,969,108호(참조문헌으로서 본원에 통합됨); Mulligan-Kehoe, 미국특허출원 제5,702,892호(참조문헌으로서 본원에 통합됨); Winter, G. et ai, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)] 참조). 박테리오파지 디스플레이 시스템에 표시된 펩티드 또는 폴리펩티드는 임의의 적합한 박테리오파지, 예컨대 사상체(filamentous)파지(예컨대, fd, M13, F1), 용해성 파지(예컨대, T4, T7, 람다), 또는 RNA 파지(예컨대, MS2) 상에 표시될 수 있다.
일반적으로, 펩티드 또는 파지폴리펩티드의 레퍼토리를 표시하는 파지의 라이브러리가 적절한 파지 외피 단백질을 동반한 융합 단백질(예컨대, fd plll 단백질)로서, 생산되거나 제공된다. 융합 단백질은 파지 외피 단백질의 끝(tip)에서, 또는 원할 경우 중간 위치에서 펩티드 또는 폴리펩티드를 표시할 수 있다. 예컨대, 표시된 펩티드 또는 폴리펩티드는 plll의 도메인 1(plll의 도메인 1은 또한 N1으로도 불린다)에 대한 아미노-말단인 지점에 존재할 수 있다. 표시된 폴리펩티드는 plll에 직접적으로 융합될 수 있거나, 링커를 이용해 plll에 융합될 수 있다. 원할경우, 상기 융합은 태그(예컨대, myc 에피토프, His 태그)를 추가적으로 포함할 수 있다. 파지 외피 단백질을 동반한 융합 단백질로 표시되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리는, 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예컨대, 표시된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 파지 벡터 또는 파지미드 벡터의 라이브러리를 적합한 숙주 박테리아에 도입하고, 파지를 생산하는 최종 박테리아를 배양함으로서(예컨대, 원한다면, 적합한 헬퍼 파지 또는 보체 플라스미드를 이용하여), 생산될 수 있다. 파지의 라이브러리는 임의의 적합한 방법, 예컨대 침전 및 원심분리를 이용하여 배양액으로부터 회수될 수 있다.
디스플레이 시스템은 임의의 원하는 양의 다양성을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 레퍼토리는 유기체, 유기체군, 원하는 조직 또는 원하는 세포 유형에 의해 발현된 자연적으로 발생하는 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있거나, 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 원한다면, 상기 폴리펩티드는 공통된 모형 또는 골격을 공유할 수 있다. 예컨대, 레퍼토리 또는 라이브러리 내 모든 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 L, 단백질 G, 피브로넥틴 도메인, 안티칼린, CTLA4, 원하는 효소(예컨대, 중합효소, 셀룰라아제), 또는 면역글로불린 상과(superfamily)로부터의 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편(예컨대, 항체 가변 도메인)에서 선택된 골격에 기초할 수 있다. 이러한 레퍼토리 또는 라이브러리 내 폴리펩티드는 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열의 정의된 영역 및 공동된 아미노산 서열의 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 레퍼토리 내 모든 또는 실질적으로 모든 폴리펩티드는 원하는 유형, 예컨대 원하는 효소(예컨대 폴리머라아제) 또는 항체의 원하는 항원-결합 단편(예컨대 인간 VH 또는 인간 VL) 중 하나이다. 몇몇 구체예에서, 상기 폴리펩티드 디스플레이 시스템은 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는데, 상기 각각의 폴리펩티드는 항체 가변 도메인을 포함한다. 예컨대, 상기 레퍼토리 내 각각의 폴리펩티드는 VH , VL , Fv(예컨대, 단일 쇄 Fv)를 포함할 수 있다.
아미노산 서열의 다양성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 골격의 임의의 원하는 영역 내에 도입될 수 있다. 예컨대, 아미노산 서열의 다양성은, 임의의 적합한 돌연변이 유발 방법(예컨대, 저 충실도 PCR, 올리고뉴클레오티드-매개 또는 위치 지정 돌연변이, NNK 코돈을 이용한 다양화) 또는 임의의 기타 적합한 방법을 이용하여 다양화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 라이브러리를 제조함으로서, 표적 영역, 예컨대, 항체 가변 도메인 또는 소수성 도메인의 상보성 결정 영역에 도입될 수 있다. 원한다면, 다양화된 폴리펩티드 영역을 무작위화할 수 있다. 레퍼토리를 구성하고 있는 상기 폴리펩티드의 크기는 주로 선택의 문제이고, 균일한 폴리펩티드 크기를 필요로 하지 않는다. 레퍼토리 내 폴리펩티드는 최소한 3차 구조(1개 도메인 이상에서 형성됨)를 가질 수 있다.
선택/분리/회수
에피토프 결합 도메인 또는 도메인 집단은 임의의 적합한 방법을 이용하여 레퍼토리 또는 라이브러리(예컨대, 디스플레이 시스템)로부터 선택되고, 분리되고/분리되거나 회수될 수 있다. 예컨대, 도메인은 선택가능한 특성(예컨대, 물리적 특성, 화학적 특성, 기능적 특성)에 기초하여 선택되거나 분리된다. 적합한 선택가능 기능적 특성은 레퍼토리 내 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물적 활성, 예컨대 일반적 리간드(예컨대, 초항원)에 결합, 표적 리간드(예컨대, 항원, 에피토프, 기질)에 결합, 항체(예컨대, 펩티드 또는 폴리펩티드에서 발현된 에피토프를 통해)에 결합, 및 촉매 활성을 포함한다(예컨대, 문헌[Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655] 참조).
몇몇 구체예에서, 프로테아제 저항 펩티드 또는 폴리펩티드가, 실질적으로 모든 도메인이 공통 선택가능 특성을 공유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택되고/선택되거나 분리된다. 예컨대, 상기 도메인은 실질적으로 모든 도메인이 공통 일반적 리간드에 결합하거나, 공통 표적 리간드에 결합하거나, 공통 항체에 결합하거나(또는 공통 항체에 의해 결합됨), 공통 촉매 활성을 갖는, 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택될 수 있다. 선택의 유형은 예컨대, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙을 수행하는 경우, 원하는 생물적 활성을 지니는 모 펩티드(parental peptide) 또는 폴리펩티드에 기초한 도메인의 레퍼토리를 제조하는데 특히 유용하다.
공통 일반적 리간드에 결합에 기초한 선택은 기존 라이브러리 또는 레퍼토리의 성분인 모든 도메인 또는 실질적으로 모든 도메인을 포함하는 도메인의 수집 또는 집단을 산출할 수 있다. 예컨대, 표적 리간드 또는 일반적 리간드, 예컨대, 단백질 A, 단백질 L 또는 항체에 결합하는 도메인이 패닝(panning)에 의하거나 적합한 친화성 매트릭스를 이용하여 선택되고, 분리되고/분리되거나 회수될 수 있다. 패닝은 리간드 용액(예컨대, 일반적 리간드, 표적 리간드)을 적합한 용기(관, 페트리 접시)에 첨가하고, 이 리간드가 침전되거나 용기의 벽에 코팅되도록 함으로서 성립될 수 있다. 과량의 리간드는 세척될 수 있고 도메인은 상기 용기에 첨가될 수 있으며, 이 용기는 펩티드 또는 폴리펩티드가 고정된 리간드에 결합하기 적합한 조건을 유지한다. 결합되지 않은 도메인은 세척될 수 있고, 결합된 도메인은 임의의 적합한 방법, 예컨대 긁어내기(scraping) 또는 pH 낮춤을 이용해, 회수될 수 있다.
적합한 리간드 친화성 매트릭스는 일반적으로 고체 지지대 또는 비드(예컨대, 아가로스)를 포함하고, 리간드는 공유 결합 또는 비공유 결합으로 부착된다. 친화성 매트릭스는 배치 공정, 컬럼 공정 또는 임의의 다른 적합한 공정을 이용해, 도메인이 매트릭스 상에서 리간드와 결합하기 적합한 조건하에서, 펩티드 또는 폴리펩티드(예컨대, 프로테아제와 인큐베이션된 레퍼토리)와 결합될 수 있고, 친화성 매트릭스와 결합하지 않는 도메인은 세척되고, 결합된 도메인은 임의의 적합한 방법, 예컨대 낮은 pH 완충용액, 순한 변성제(예건대, 요소), 또는 리간드에 결합을 겨루는 펩티드 또는 도메인에 녹여서 분리하는 것을 이용하여, 녹여서 분리되고 회수될 수 있다. 제 1 실시예에서, 비오티닐화된 표적 리간드는, 레퍼토리 내에서 도메인이 표적 리간드에 결합하기 적합한 조건하에서, 레퍼토리와 결합된다. 결합된 도메인은 고정된 아비딘 또는 스트렙트아비딘(예컨대 비드 상)을 이용하여 회수된다.
몇몇 구체예에서, 일반적 또는 표적 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 실질적으로 라이브러리 또는 레퍼토리의 펩티드 또는 폴리펩티드 내 보존된, 펩티드 또는 폴리펩티드의 구조적 특성에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 특히 일반적 리간드로서 유용하다. 프로테아제 저항 펩티드 또는 폴리펩티드를 분리, 선택 및/또는 회수하기 위한 리간드로서 이용하기 적합한 항체 및 항원 결합 단편은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
라이브러리/레퍼토리
프로테아제 에피토프 결합 도메인을 엔코딩하고/엔코딩하거나 포함하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조되거나 획득될 수 있다. 라이브러리는 관심있는 도메인(예컨대, 라이브러리에서 선택된 도메인) 또는 골격에 기초한 도메인을 엔코딩하도록 설계될 수 있거나, 본원에 기재된 방법을 이용하여 다른 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 도메인 내 풍부한 라이브러리는 적합한 폴리펩티드 디스플레이 시스템을 이용하여 제조될 수 있다.
원하는 유형의 도메인의 레퍼토리를 엔코딩하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 손쉽게 생산될 수 있다. 에컨대, 원하는 유형의 폴리펩티드(예컨대, 면역글로불린 가변 도메인)를 엔코딩하는 핵산 서열이 획득될 수 있으며 한 개 이상의 돌연변이를 각각 포함하는 핵산 집합이 제조될 수 있다, 예컨대, 오류-빈발(error-prone) 중합효소 연쇄반응(PCR) 시스템을 이용한 핵산을 증폭시킴에 의해, 화학적 돌연변이 유발에 의해(Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)), 또는 박테리아 돌연변이 유발 계통(bacterial mutator strains)을 이용하여(Low et al., J. Mol. Biol., 260:359 (1996)).
다른 구체예에서, 핵산의 특정 영역은 다양성을 위해 표적이 될 수 있다. 선택된 위치에 돌연변이를 유발하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이 방법은 예컨대, PCR을 이용하거나, PCR 이용 없이, 부정합된 올리고뉴클레오티드의 이용 또는 올리코뉴클레오티드의 축퇴를 포함한다. 예컨대, 합성 항체 라이브러리는 항원 결합 루프에 돌연변이를 표적화함으로서 생성된다. 무작위 또는 준-무작위 항체 H3 및 L3 영역은 생식선(germline) 면역글로불린 V 유전자 조각을 비돌연변이된 프레임워크 영역에 덧붙여 거대 라이브러리를 생성한다(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al. (1995) supra). 이러한 다양성은 몇몇 또는 모든 기타 항원 결합 루프를 포함하도록 확대된다(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). 다른 구체예에서, 핵산의 특정 영역이 다양성을 위해 표적화될 수 있다, 예컨대, "메가-프라이머(mega-primer)"로서 제 1 PCR의 생산물을 사용하는 2-단계 PCR 방법(예컨대, 문헌[Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990)] 참조). 표적화된 다양성은 또한 예컨대, SOE PCR에 의해 성립될 수 있다(예컨대, 문헌[Horton, R. M. et al., Gene 77:61-68 (1989)] 참조).
선택된 위치에서 서열의 다양성은 폴리펩티드 서열을 구체화하는 코딩 서열을 변화시킴으로서 달성되고, 다수의 가능한 아미노산(예컨대, 20개 전부 또는 이의 하위부분)이 그 위치에 통합될 수 있도록 한다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 융통성 있는 코돈은 모든 아미노산은 물론 TAG 종결 코돈도 엔코딩하는 NNK이다. 상기 NNK 코돈은 원하는 다양성을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 동일한 결과를 달성하는 NNN 코돈을 포함하는, 다른 코돈이 또한 사용되고, 이는 추가 종결 코돈 TGA 및 TAA의 생산을 야기한다. 이러한 표적화된 접근은 표적 영역 내 전체 서열 공간이 조사되도록 허용할 수 있다.
몇몇 라이브러리는 면역글로불린 상과(예컨대, 항체 또는 이의 포션)의 멤버인 도메인을 포함한다. 예컨대, 상기 라이브러리는 알려진 주-쇄 형태(main-chain conformation)를 지니는 도메인을 포함할 수 있다(예컨대, [Tomlinson et al., WO 99/20749] 참조). 라이브러리는 적합한 플라스미드 또는 벡터 내에서 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 벡터는 이종 DNA의 발현 및/또는 복제를 위해 이종 DNA를 세포 내로 도입시키는데 사용되는 개별요소이다. 플라스미드(예컨대, 박테리아 플리스미드), 바이러스성 또는 박테리오파지 벡터, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하는 임의의 적합한 벡터가 사용된다. 이러한 벡터는 단순 클로닝 및 돌연변이 유발에 이용될 수 있거나, 발현 벡터는 라이브러리의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 벡터 및 플라스미드는 보통 한 개 이상의 클로닝부위(예컨대, 폴리링커), 복제 기점 및 한 개 이상의 선택가능 마커 유전자를 포함한다. 발현 벡터는 추가적으로 폴리펩티드의 전사 및 번역을 유도하는 인자, 예컨대 인핸서 인자, 프로모터, 전사 종결 신호, 신호서열 및 이와 유사한 것을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 인자는 폴리펩티드를 엔코딩하는 클로닝된 삽입을 작동적으로 연결되는 방식으로 배열되어, 이러한 발현 벡터가 발현에 적합한 조건 하에(예컨대, 적합한 숙주 세포 내) 유지되는 경우, 상기 폴리펩티드가 발현되고 생산되도록 할 수 있다.
클로닝 및 발현 벡터는 일반적으로 한개 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 벡터가 복제되도록 할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로 클로닝 벡터 내에서, 이 서열은 상기 벡터가 숙주 염색체 DNA를 독립적으로 복제하도록 할 수 있고, 복제기점 또는 자발적 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에서 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2 미크론(micron) 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 각종 바이러스 기원(예컨대, SV40, 아데노바이러스)은 포유류 세포 내 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
일반적으로 복제기점은 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유류 세포, 예컨대 COS 세포 내에서 사용되지 않는 한, 포유류 발현 벡터를 필요로 하지 않는다.
클로닝 또는 발현 벡터는 선택 유전자(선택가능 마커로도 불리는)를 포함할 수 있다. 이러한 마커 유전자는 선택적인 배양 배지 내에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필수적인 단백질을 엔코딩한다. 따라서 선택 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 상기 배양 배지 내에서 살아남지 못할 것이다. 일반적인 선택 유전자는 항생제 및 다른 독소, 예컨대, 엠피실린, 네오마이신, 메톡트렉세이트 또는 테트라사이클린에 저항성을 부여하거나, 영양 요구성 결핍을 보완하거나, 성장 배지에서 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 엔코딩한다.
적합한 발현 벡터는 다수의 성분, 예컨대, 복제 기점, 선택가능 마커 유전자, 한개 이상의 발현 조절 인자, 예컨대 전사 조절인자(예컨대, 프로모터, 인핸서, 종결자) 및/또는 한개 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 리더 서열 및 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 존재한다면, 발현 조절 인자 및 신호 또는 리더 서열이 벡터 또는 다른 소스에 의해 제공될 수 있다. 예컨대, 항체 쇄를 엔코딩하는 복제된 핵산의 전사 및/또는 번역 조절 서열이 직접 발현에 사용될 수 있다.
프로모터는 원하는 숙주 세포 내에서 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구조성 또는 유도성일 수 있다. 예컨대, 프로모터는 항체, 항체 쇄 또는 이의 포션을 엔코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어, 핵산의 전사를 유도할 수 있다. 원핵세포의 경우 각종 적합한 프로모터(β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 인산효소, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 대장균의 경우 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵세포(예컨대, 원숭이(simian) 바이러스 40 초기 또는 후기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 거대세포바이러스 프로모터(cytomegalovirus promoter), 아데노바이러스 후기 프로모터, EG-1a 프로모터) 숙주가 이용가능하다.
게다가, 일반적으로 발현 벡터는 벡터를 운반하는 숙주 세포의 선택을 위한 선택가능 마커를 포함하고, 복제가능 발현 벡터의 경우 복제기점을 포함한다. 항생제 또는 약물 저항성을 부여하는 유전자 코딩 생산물은 공통의 선택가능 마커이고, 원핵세포(예컨대, β-락타마아제 유전자(엠피실린 저항성), 테트라사이클린 저항성의 경우 Tet 유전자) 및 진핵세포(예컨대, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(마이코페놀산), 엠피실린 또는 하이그로마이신 저항성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주 내에서 메톡트렉세이트를 이용한 선택을 가능하게 한다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생산물을 엔코딩하는 유전자(예컨대, LEU2 , URA3 , HIS3)가 효모 내에서 선택가능 마커로서 종종 사용된다. 바이러스(예컨대, 배큘러바이러스) 또는 파지 벡터 및 숙주 세포의 유전체 안으로 통합될 수 있는 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터의 이용이 또한 고려된다.
원핵세포(예컨대, 박테리아 세포, 예컨대 대장균) 또는 포유류 세포 내 발현을 위한 적합한 발현 벡터는, 예컨대, pET vector (예컨대, pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, 노바겐(Novagen)등), 파지 벡터(예컨대, pCANTAB 5E, 파마시아), pRIT2T(단백질 A 융합 벡터, 파마시아), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1(인비트로겐, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1(Stratagene, La JoIIa, CA), pCDEF3(Goldman, L.A., et ai, Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)), pSVSPORT(GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos(Mizushima, S., et ai, Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) 및 이와 유사한 것을 포함한다.
다양한 발현 숙주, 예컨대 진핵 세포(대장균), 곤충 세포(Drosophila Schnieder S2 cells, Sf9), 효모(P. methanolica , P. pastoris , S. cerevisiae ) 및 포유류 세포(예컨대, COS 세포) 내에서 이용되기 적합한 발현 벡터가 이용가능하다.
벡터의 몇가지 예는 폴리펩티드 라이브러리 멤버에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 일반적 및/또는 표적 리간드를 이용한 선택은 폴리펩티드 라이브러리 멤버를 발현하는 단일 클론의 증식 및 발현을 분리함으로서 수행될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 특정 선택 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이이다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터가 사용될 수 있고, 예컨대 벡터는 대장균 복제 기점(이중 가닥 복제의 경우) 및 파지 복제기점(단일가닥 DNA 생산의 경우)을 지니는 파지미드 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 조작 및 발현은 당업계에 잘 알려져 있다(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et ai (1994) supra). 간략히, 상기 벡터는 파지미드에 선택성을 부여하기 위해 β-락타마아제 유전자 및 적합한 리더 서열, 복수 클로닝 부위, 1개 이상의 펩티드 태그, 한개 이상의 TAG 종결 코돈 및 파지 단벡질 plll을 포함할 수 있는 발현 카세트의 lac 프로모터 상류(upstream)를 포함할 수 있다. 따라서, 글루코스, 이소-프로필 티오-β-D-칼락토시드(IPTG) 또는 헬퍼 파지, 예컨대 VCS M13의 추가에 따른, 대장균의 다양한 억제자 및 비-억제자 계통을 이용하여, 상기 벡터는 발현되지 않고 플라스미드로서 복제할 수 있고, 많은 양의 폴리펩티드 멤버만을 또는 파지 생산물을 생산하고, 이들 중 몇몇은 이들의 표면상 폴리펩티드-plll의 한개 이상의 복제를 포함한다.
항체 가변 도메인은 표적 리간드 결합 부위 및/또는 일반적 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 일반적 리간드 결합 부위는 초항원, 예컨대 단백질 A, 단백질 L 또는 단백질 G에 대한 결합부위이다. 상기 가변 도메인은 임의의 원하는 가변 도메인, 예컨대, 인간 VH (예컨대, VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), 인간 Vλ(예컨대, VλⅠ, VλⅡ, VλⅢ, VλlV, VλV, VλVI 또는 Vκ1 ) 또는 인간 VK(예컨대, Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vκ5, Vκ6, Vκ7, Vκ8, Vκ9 또는 Vκ10)에 기초할 수 있다.
더욱 추가적인 기술의 카테고리는 인위적 구분 내 레퍼토리의 선택에 관한것으로, 유전자와 이의 유전자 생산물의 연결되도록 한다. 예컨대, 원하는 유전자 생산물을 엔코딩하는 핵산이 기름속 물 에멀젼(water-in-oil emulsion)에 의해 형성된 마이크로캡슐 내에서 선택될 수 있는, 선택 시스템은 [WO99/02671, WO00/40712 및 Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6]에 기재되어 있다. 원하는 활성을 지니는 유전자 생산물을 엔코딩하는 유전적 인자는 마이크로캡슐로 구획화되고 그 다음 전사 및/또는 번역되어 마이크로캡슐 내로 이들 각각의 유전자 생산물(RNA 또는 단백질)을 생산한다. 그 후 원하는 활성을 지니는 유전자 생산물을 생산하는 유전적 인자가 분류된다. 이 접근법은 다양한 방법에 의해 원하는 활성을 감지함으로서 관심있는 유전자 생산물을 선택한다.
에피토프 결합 도메인의 특성
도메인의 이의 특정 항원 또는 에피토프와의 결합은 당업자에게 친숙하고, ELISA를 포함하는 방법에 의해 테스트될 수 있다. 제 1 실시예에서, 결합은 모노클로날 파지 ELISA를 이용하여 테스트된다.
파지 ELISA는 임의의 적합한 절차에 따라 수행될 수 있다: 대표적인 프로토콜이 하기에 제시되어 있다.
선택의 각 라운드에서 사용된 파지의 집단은 "폴리클로날" 파지 항체를 확인하기 위해, 선택된 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 그 다음 이 집단으로부터 단일 감염된 박테리아 콜로니에서 온 파지는 "모노클로날" 파지 항체를 확인하기 위해, ELISA에 의해 스크리닝 될 수 있다. 또한, 항원 또는 에피토프에 결합하기 위한 가용성 항체 단편을 스크리닝 하는 것이 바람직하며, 이것은 시약, 예컨대 C- 또는 N-말단 태그를 이용한 ELISA에 의해 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55] 및 본원에 인용된 참고문헌 참조).
선택된 파지 모노클로날 항체의 다양성은 PCR 산물의 겔 전기영동(Marks et al. 1991 , supra; Nissim et al. 1994 supra), 프로빙(Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) 또는 벡터 DNA의 서열분석(sequencing)에 의해 분석될 수 있다
dAbs 의 구조
dAbs가 이를테면 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선택된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택된 경우, 이 가변 도메인은 보편적인 프레임워크 영역을 포함하여, 본원에 정의된 특정 일반적 리간드에 의해 인지될 수 있도록 한다. 보편적인 프레임워크, 일반 리간드 및 이와 유사한 것의 이용은 WO99/20749에 기재되어 있다.
V-유전자 레퍼토리가 사용된 경우, 폴리펩티드 서열 내 변이는 가변 도메인의 구조 루프 내에 위치할 수 있다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각 가변 도메인과 이의 상보적인 쌍의 상호작용을 강화하기 위해, DNA 셔플링(DNA shuffling)에 의하거나, 돌연변이에 의해 변화될 수 있다. DNA 셔플링은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, 본원에 참고문헌으로서 통합된 문헌[Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 및 U.S. Patent No. 6,297,053]에 의해 배울 수 있다.
dAbs 작제에 이용하기 위한 골격
주-쇄 형태의 선택
면역글로불린 상과의 멤버는 모두 이들의 폴리펩티드 쇄에 대한 유사한 접힘을 공유한다. 예컨대, 항체가 이들의 1차 서열에 대해 높은 다양성을 갖는다 할지라도, 서열의 비교 및 결정학상 구조는 예상과 달리, 항체의 6개의 항원 결합 루프 중 5개(H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주-쇄 형태 또는 표준 구조를 채택하고 있다고 나타났다(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). 따라서, 루프 길이 및 주요(key) 잔기의 분석은 대부분의 인간 항체 내에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주-쇄 형태의 예측이 가능하게 한다(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조에 대해서는 훨씬 더 다양할지라도(D 세그먼트를 이용하기 때문에), 이것은 또한 루프 및 항체 프레임워크 내 주요 위치에서 길이 및 특정 잔기의 존재 또는 잔기의 유형에 의존하는, 짧은 루프 길이에 대한 제한된 수의 주-쇄 형태를 형성한다(Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
dAbs는 도메인의 라이브러리, 예컨대 VH 도메인의 라이브러리 및/또는 VL 도메인의 라이브러리로부터 조립되는 것이 유리하다. 제 1 양태에서, 도메인의 라이브러리는 멤버의 주-쇄 형태가 공재된 형태로 존재함을 보증할 수 있게 특정 루프 길이 및 주요(key) 잔기가 선택되도록 계획된다. 유리하게도, 상기 논의했듯이, 비-기능성이 될 수 있는 기회를 축소하기 위한, 자연에서 발견된 면역글로불린 상과 분자의 실제 형태가 존재한다. 생식선 V 유전자 세그먼트는 항체 또는 T-세포 수용체 라이브러리 작제를 위한 하나의 적합한 기본 프레임워크 역할을 하고; 다른 서열 또한 사용할 수 있다. 변이가 낮은 빈도로 발생하여 적은 수의 기능적 멤버가 이의 기능에 영향을 미치지 않는, 변형된 주-쇄 형태를 가질 수 있도록 할 수 있다.
또한 표준 구조 이론이 또한 리간드에 의해 엔코딩되는 상이한 주-쇄 형태의 수를 분석하고, 리간드 서열에 기초한 주-쇄 형태를 예측하며, 표준 구조에 영향을 미치지 않는 변형(diversification)을 위한 잔기를 선택하는데 이용된다. 인간 Vκ 도메인에서, L1 루프는 4개의 표준 구조 중 한가지를 택할 수 있고, L2 루프는 단일 표준 구조를 가지며, 인간 Vκ 도메인 중 90％는 L3 루프의 경우 4개 또는 5개의 표준 구조 중 한가지를 택한다고 알려져 있다(Tomlinson et al. (1995) supra); 따라서, Vκ 도메인 단독에서, 상이한 표준 구조는 다양한 범위의 주-쇄 형태를 생성하기 위해 결합될 수 있다. Vλ 도메인은 L1, L2 및 L3 루프에 대한 다양한 범위의 표준 구조를 엔코딩하고, Vκ 및 Vλ 도메인은 H1 및 H2 루프에 대한 몇 개의 기본 구조를 엔코딩할 수 있는 임의의 VH 도메인과 쌍을 이룰 수 있음을 감안할 때, 이 5개 루프에서 관찰된 표준 구조 조합의 수는 매우 클 것이다. 이것은 주-쇄 형태의 다양성의 생성은 광대한 범위의 결합 특이성의 생산에 필수적일 수 있음을 의미한다. 그러나, 공지된 단일 주-쇄 형태에 기초한 항체 라이브러리를 작제함으로서, 기대와 달리, 주-쇄 형태의 다양성은 실질적으로 모든 항원을 표적화 하기 위한 충분한 다양성을 생성하는 것을 요구하지 않는다는 것이 발견되었다. 더욱 놀랍게도, 상기 단일 주-쇄 형태는 공통 구조를 필요로 하지 않는다 - 자연적으로 발생하는 단일 형태가 전체 라이브러리에 대한 기초로 사용될 수 있다. 따라서, 특히 제 1 양태에서, dAbs는 공지된 단일 주-쇄 형태를 가진다.
선택된 단일 주-쇄 형태는 문제의 면역글로불린 상과 유형의 분자들 중에서 일반적인 것일 수 있다. 상당한 수의 자연적으로 생성되는 분자가 해당 형태를 채택하는 것으로 관찰된 경우, 그 형태는 일반적인 것이다. 따라서, 제 1 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각 결합 루프에 대한 상이한 주-쇄 형태의 자연적 발생이 개별적으로 고려되고, 따라서 자연적으로 발생한 가변 도메인이 상이한 루프에 대한 주-쇄 형태의 원하는 조합( combination )을 가지도록 선택된다. 가능한 것이 없다면, 가장 근접한 등가물이 선택될 수 있다. 상이한 루프에 대한 원하는 주-쇄 형태 조합은 원하는 주-쇄 형태를 엔코딩하는 생식선 유전자 세그먼트를 선택함으로서 형성될 수 있다. 제 1 실시예에서, 선택된 생식선 유전자 세그먼트는 자연에서 자주 발현되고, 특히 이것은 모든 자연 생식선 유전자 세그먼트 중에서 가장 빈번하게 발현된 세그먼트 일 수 있다.
라이브러리 설계에서, 6개의 항원 결합 루프 각각에 대한 상이한 주-쇄 형태 발생률이 개별적으로 고려될 수 있다. H1, H2, L1, L2 및 L3의 경우, 자연적으로 발생한 분자의 20% 및 100% 사이의 항원 결합 루프로 채택된 주어진 형태가 선택된다. 일반적으로, 이의 관찰된 발생률은 35％ 이상(즉, 35％ 내지 100％)이고, 이상적으로는, 50％ 이상 또는 심지어 65% 이상이다. 대부분의 H3 루프가 표준구조를 가지지 않기 때문에, 표준 구조를 나타내는 루프들 중에서 일반적인 주-쇄 형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 각각의 루프의 경우, 자연 레퍼토리에서 가장 흔히 관찰되는 형태가 선택된다. 인간 항체에서, 각 루프에 대한 가장 흔한 표준 구조는 하기와 같다: H1 - CS 1(발현된 레퍼토리 중 79%), H2 - CS 3(46%), Vκ의 L1 - CS 2(39%), L2 - CS 1(100%), Vκ의 L3 - CS 1(36%) (calculation assumes a κ:λ ratio of 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp . Quant. Biol, 48: 133). 표준 구조를 지니는 H3 루프의 경우, 잔기 94에서 잔기 101까지의 염다리를 동반한 7개 잔기의 CDR3 길이(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health 및 인간 Services)가 가장 일반적인 것으로 나타난다. 이 형태를 형성하기 위한 필요한 H3 길이 및 주요 잔기와 EMBL 데이타 라이브러리 내에 16개 이상의 인간 항체 서열이 존재하고, 항체 모델링(2cgr 및 1tet)을 위한 기초로 사용될 수 있는 단백질 데이타 은행 내에 2개 이상의 결정학상 구조가 존재한다. 표준 구조의 이 조합에서, 가장 빈번하게 발현되는 생식선 유전자 세그먼트는 VH 세그먼트 3-23(DP-47), JH 세그먼트 JH4b, Vκ 세그먼트 O2/012(DPK9) 및 Jκ 세그먼트 Jκ1이다. VH 세그먼트 DP45 및 DP38가 또한 적합하다. 따라서, 이 세그먼트는 원하는 단일 주-쇄 형태와 결합하여 라이브러리를 작제하는데 기초로서 사용될 수 있다.
대안적으로, 각 결합 루프에 대한 상이한 주-쇄 형태의 자연 발생에 기초한 단일 주-쇄 형태를 별개로 선택하는 대신에, 자연 발생 주-쇄 형태의 조합을 단일 주-쇄 형태를 선택하기 위한 기초로서 사용한다. 항체의 경우, 예컨대, 임의의 두개, 세개, 네개, 다섯 또는 6개 모두의 항원 결합 루프에 대한 자연 발생 표준 구조 조합이 결정될 수 있다. 여기서, 선택된 형태는 자연적으로 발생한 항체 내에서 일반적인 것일 수 있고, 자연 레퍼토리 내에서 가장 빈번하게 관찰될 수 있다. 따라서, 인간 항체에서, 예컨대, 5개의 항원 결합 루프, H1 , H2, L1, L2 및 L3의 자연적 조합이 고려되는 경우, 단일 주-쇄 형태 선택을 위한 기초로서, 표준 구조의 가장 빈번한 조합이 결정되며, 그 다음 H3 루프에 대해 가장 일반적인 형태와 결합될 것이다.
표준 구조의 다양성
선택된 몇가지 공지된 주-쇄 형태 또는 공지된 단일 주-쇄 형태를 갖고 있으므로, dAbs는 구조적 및/또는 기능적 다양성을 가진 레퍼토리를 생성하기 위해, 상기 분자의 결합 부위를 변화시킴으로서 작제될 수 있다. 이것은 변이체가 생성되어 이들의 구조 및/또는 이들의 기능에 충분한 다양성을 갖도록 하여 이들이 활성 범위를 제공할 수 있도록 함을 의미한다.
원하는 다양성은 일반적으로 선택된 분자의 한개 이상의 위치를 변화시킴으로서 생성된다. 변화될 위치는 무작위로 선택될 수 있거나, 선택될 수 있다. 그 다음 상기 변이는, 고유의 아미노산이 임의의 아미노산 또는 이의 아날로그(analogue), 자연적 또는 합성으로 대체되고, 매우 거대한 수의 변이체가 생성되는 무작위화에 의해 달성될 수 있거나, 고유의 아미노산이 한 개 이상의 정의된 아미노산 하위세트로 대체되고, 더욱 제한된 수의 변이체를 생성함으로서 달성될 수 있다.
이러한 다양성을 도입하기 위한 다양한 방법이 보고되고 있다. 오류-빈발 PCR(Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889), 화학적 돌연변이 유발(Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) 또는 박테리아 돌연변이 유발계통(Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359)이 상기 분자를 엔코딩하는 유전자 내에 무작위 돌연변이를 도입하는데 이용될 수 있다. 선택된 위치에 돌연변이를 유발하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, PCR을 이용하거나, PCR 이용 없이, 부정합된 올리고뉴클레오티드의 이용 또는 올리코뉴클레오티드의 축퇴를 포함한다. 예컨대, 몇가지 합성 항체 라이브러리가 항원 결합 루프에 돌연변이를 표적화함에 의해 생성되었다. 인간 테타누스 톡소이드-결합 Fab의 H3 영역이 무작위화되어, 다양한 신규한 결합 특이성을 생성하였다(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). 무작위 또는 준-무작위 H3 및 L3 영역은 간선 V 유전자 세그먼트에 덧붙여져 돌연변이 되지 않은 프레임워크 영역과 함께 거대 라이브러리를 생성하였다(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381 ; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). 이러한 다양성은 몇가지 또는 모든 기타 항원 결합 루프를 포함하기 위해 확대되었다(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra).
루프 무작위와는 H3 단독에 대해 대략 1015개 이상의 구조 및 다른 5개 루프에 대해 유사하게 많은 수의 변이체를 생성할 가능성을 가지기 때문에, 현재 형질전환 기술을 이용하는 것 또는 심지어 무 세포 시스템을 이용함으로서, 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생산하는 것이 가능하지 않다. 예컨대, 데이타로 구성된, 가장 거대한 라이브러리 중 한가지에서, 이 디자인의 한 라이브러리에 대해 가능한 다양성의 오직 한 분획인, 6 x 1010개의 상이한 항체가 생성되었다(Griffiths et al. (1994) supra).
제 1 구체예에서, 원하는 분자의 분획을 생성하거나 개질하는데 직접적으로 관련된 잔기들이 다양화된다. 많은 분자의 경우, 기능은 표적에 결합하는 것일 것이고, 따라서 전반적인 분자 패킹 또는 선택된 주-쇄 형태를 유지하는데 결정적인 잔기가 변화되지 않도록 하면서, 다양성이 표적 결합 부위에 집중되어야 한다.
제 1 양태에서, dAbs의 라이브러리가 사용되고, 단지 항원 결합 부위 내의 이들 잔기만이 변화된다. 이 잔기는 인간 항체 레퍼토리에서 극도로 다양하고, 고-해상도 항체/항원 복합체에 접촉하는 것으로 알려져 있다. 예컨대, L2에서, 위치 50 및 53은 자연적으로 발생하는 항체 내에서 다양하고, 항원과 접촉하는 것이 관찰됨이 알려져 있다. 반면에, 종래 접근법은 카밧(Kabat)등(1991, supra)에 의해 정의된 상보성 결정 영역(CDR1) 내의 모든 잔기를 변화시켜 왔고, 몇가지 7개의 잔기를 라이브러리 내 변화된 두개와 비교하였다. 이것은 다양한 항원 결합 특이성을 형성하는데 필요한 기능적 다양성에 대하여 상당한 개선을 나타낸다.
자연에서, 항체 다양성은 두가지 공정의 결과이다: 원시 1차 레퍼토리를 형성하기 위한 생식선 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 체세포 재조합(생식선 및 접합부위 다양성이라 불림) 및 V 유전자의 재정렬 결과 체세포 과변이(somatic hypermutation). 인간 항체 서열의 분석은 1차 레퍼토리 내 다양성은 항원 결합 부위의 중심에 집중되어 있는 반면, 체세포 과변이는 1차 레퍼토리 내 높게 보전되어 있는 항원 결합 부위의 주변에서 영역에 다양성을 분산시키고 있음을 나타낸다(문헌[Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813] 참조). 이 상보성은 아마도 서열 공간을 찾는 효과적인 전략으로 진화하고, 명백히 항체에 특이하다 할지라도, 이것은 다른 폴리펩티드 레퍼토리에 간단히 적용될 수 있다. 변화된 잔기는 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 것들의 하위세트이다. 표적 결합 부위 내 잔기의 상이한(중첩 포함) 하위세트는 원한다면, 선택되는 동안 상이한 단계에서 다양화된다.
항체 레퍼토리의 경우, 최초 "나이브(naive)" 레퍼토리는, 항원 결합 부위 내 몇가지, 다만 전부가 아닌 잔기가 다양화된 경우, 형성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "나이브" 또는 "더미(dummy)"는 미리-결정된(pre-determined) 표적을 가지지 않은 항체 분자를 지칭한다. 이 분자는 면역 다양화를 겪지 않은 개개의 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩되는 것들과 유사하고, 태아 및 신생아 개인의 경우와 같이, 이들의 면역 시스템은 아직 매우 다양한 항원성 자극에 의해 도전받지 않았다. 그 다음 이 레퍼토리는 다양한 항원 또는 에피토프에 대해 선택된다. 필요하다면, 그 후 최초 레퍼토리 내에서 다양화된 영역 외부에 추가적 다양성이 도입될 수 있다. 이 성숙된 레퍼토리는 개질된 기능, 특이성 또는 친화성에 대해 선택될 수 있다.
본원에 기재된 서열은 실질적으로 동일한 서열, 예컨대, 본원에 기재된 서열에 대해 90％ 이상 동일한, 예컨대, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상 동일한 서열을 포함함이 이해될 것이다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 동일성"은 최적으로 정렬되고 비교된 경우, 두개의 핵산, 또는 이의 지정된 서열이 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결손을 동반하며, 뉴클레오티드의 약 80％ 이상, 보통 약 90％ 내지 95％ 및 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드의 약 98％ 내지 99.5％ 이상이 동일함을 의미한다. 대안적으로, 실질적인 동일성은 상기 세그먼트가 선택적 혼성화 조건에서 상보적 가닥에 혼성화될 경우, 존재한다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 경우, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고 적절한 삽입 또는 결손에 비할 경우, 두개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이에 동일한 정도를 의미한다. 대안적으로, 실질적인 동일성은 상기 DNA 세그먼트가 선택적 혼성화 조건에서 상보적 가닥에 혼성화될 경우, 존재한다.
두개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이고(즉, ％동일성 = 동일한 위치의 개수/ 전체 위치 개수 × 100), 갭(gap)의 수 및 각 갭의 길이를 계산에 넣고, 이는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있다. 서열의 비교 및 두 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비-제한적 실시예에 기재된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 이용하여 성취될 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 중 갭(GAP) 프로그램을 이용하여, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하여 결정될 수 있다. 두개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 통합된 E. 마이어스(Meyers) 및 W. 밀러(Miller)(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 이용하여 PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티(gap penalty)를 이용하여 결정될 수 있다. 게다가, 두개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 중 갭(GAP) 프로그램에 통합된, Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 이용하여, Blossum 62 메트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하여 결정될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열 SEQ ID NO: 122와 동일할 수 있거나(즉 100％ 동일), 상기 참조서열과 비교하여 특정 정수 이하의 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 트랜지션 및 트랜스버젼을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 변화는 개별적으로 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 참조 서열 또는 참조 서열내의 하나 이상의 인접 그룹의 뉴클레오티드간에 배치된 이들 말단 위치사이의 임의위치에서 일어날 수 있다. 뉴클레오티드 변화의 수는 각 퍼센트 동일성(100으로 나누어진)의 숫자 퍼센트에 의해 SEQ ID NO:122 내의 뉴클레오티드의 전체 수를 곱하고 SEQ ID NO:122 내의 뉴클레오티드의 전체 수로부터 생성물을 뺌으로써 결정되거나:
nn≤xn-(xn·y),
상기 식에서, nn은 누클레오티드 변화의 수이고, xn은 SEQ ID NO:122 내의 누클레오티드의 전체 수이고, y는 50%인 경우 0.50, 60%인 경우 0.60, 70%인 경우 0.70, 80%인 경우 0.80, 85%인 경우 0.85, 90%인 경우 0.90, 95%인 경우 0.95, 97%인 경우 0.97, 100%인 경우 1.00이고, 여기서 xn 및 y의 임의의 비-정수 생성물은xn으로부터 이를 빼기 전에 가장 가까운 정수로 끝수를 잘라낸다. SEQ ID NO:122의 폴리뉴클레오티드 서열의 변화는 이 코딩 서열내에 넌센스, 미스센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이를 생성시킴으로써 상기 변화 다음의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 변화시킨다.
유사하게, 또 다른 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:26에 의해 엔코딩되는 참조 서열과 동일, 즉 100% 동일하거나, ％ 동일성이 100% 미만인 참조 서열과 비교했을 때, 특정 정수 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 하나 이상의 아미노산 결실, 보존적 및 비보존적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 변화는 참조 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카복시-말단 위치 또는 개별적으로 참조 서열 또는 참조 서열내의 하나 이상의 인접 그룹내 아미노산 사이에 배치된 말단 위치들 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다. 주어진 ％ 동일성에 대한 아미노산 변화의 수는 각 퍼센트 동일성(100으로 나누어진)의 숫자 퍼센트에 의해 SEQ ID NO:26 내의 아미노산의 전체 수를 곱한 다음 SEQ ID NO:26 내의 아미노산의 전체 수로부터 생성물을 뺌으로써 결정되거나:
na ≤xa-(xa ·y),
상기 식에서, na 는 아미노산 변화의 수이고, xa 는 SEQ ID NO:26 내의 아미노산의 전체 수이고, y는, 예컨대, 70%인 경우 0.70, 80%인 경우 0.80, 85%인 경우 0.85 등이고, 여기서 xa 및 y의 임의의 비-정수 생성물은 xa로부터 이를 빼기 전에 가장 가까운 정수로 끝수를 잘라낸다.
실시예
하기 방법은 본원에 기재된 실시예에서 사용되었다.
방법 1
ELISA 에 의한 대장균( E. Coli )-발현 재조합 인간 IL -13에의 결합
재조합 대장균-발현된 인간 IL-13에 결합을 위해 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 분자를 분석하였다. 간략히, 5μg/ml의 재조합 대장균-발현된 인간 IL-13(GSK에서 제조하고 정제한)를 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 상기 벽을 실온에서 1시간 동안 차단하고, mAbdAb 작제물을 그 후 플레이트를 거쳐 밖으로 적정하였다(3배 희석액 중 보통 약 10OnM에서 약 0.01nM). 항-인간 카파(kappa) 경쇄 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(카탈로그 번호 A7164, Sigma-Aldrich)의 적절한 희석액(dilution) 또는 항-인간 IgGγ 쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 감지 항체(카탈로그 번호 A6029, Sigma-Aldrich)의 적절한 희석액을 이용하여 결합을 감지하였다.
방법 2
ELISA 에 의한 대장균-발현된 재조합 인간 IL -4에의 결합
재조합 대장균-발현된 인간 IL-4에 결합을 위해 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 작제물을 분석하였다. 간략히, 5μg/ml의 재조합 대장균-발현된 인간 IL-4(GSK에서 제조하고 정제한)를 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 상기 벽을 실온에서 1시간 동안 차단하고, mAbdAb 작제물을 그 후 플레이트를 거쳐 밖으로 적정하였다(3배 희석액 중 보통 약 10OnM에서 약 0.01nM). 염소 항-인간 카파(kappa) 경쇄 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(카탈로그 번호 A7164, Sigma-Aldrich)의 적절한 희석액 또는 항-인간 IgGγ 쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 감지 항체(카탈로그 번호 A6029, Sigma-Aldrich)의 적절한 희석액을 이용하여 결합을 감지하였다.
방법 3
ELISA 에 의한 대장균-발현된 재조합 인간 IL -18에의 결합
재조합 대장균-발현된 인간 IL-18에 결합을 위해 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 작제물을 분석하였다. 간략히, 5μg/ml의 재조합 대장균-발현된 인간 IL-18(GSK에서 제조하고 정제한)를 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 상기 벽을 실온에서 1시간 동안 차단하고, mAbdAb 작제물을 그 후 플레이트를 거쳐 밖으로 적정하였다(3배 희석액 중 보통 약 10OnM에서 약 0.01nM). 항-인간 카파(kappa) 경쇄 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(카탈로그 번호 A7164, Sigma-Aldrich)의 1/2000 희석액을 이용하거나, 항-인간 IgGγ 쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 감지 항체(카탈로그 번호 A6029, Sigma-Aldrich)의 1/2000 희석액을 이용하여 결합을 감지하였다.
방법 4
대장균-발현된 재조합 인간 IL -13에의 결합을 위한 Biacore ™ 결합 친화력( affinity ) 평가
재조합 대장균-발현된 인간 IL-13에 대한 mAbdAb 작제물의 결합 친화력은 Biacore™분석에 의해 평가되었다. 분석은 단백질 A 또는 항-인간 IgG 포획물을 이용하여 수행되었다. 간략히, 단백질 A 또는 항-인간 IgG는 제조 권고사항에 따라서 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에서 커플링되었다. 그 다음 mAbdAb 작제물을 표면상에서 포획시켰고, 인간 IL-13(GSK에서 제조하고 정제한)을 정의된 농도로 상기 표면위에 흘려주었다. 상기 표면을 온화한 산성 용리조건(예컨대, 10OmM 인산)을 이용하여 다시 단백질 A로 재생성시켰고, 이것은 후속한 IL-13 결합 사건을 위한 항체를 포획하는 능력에 중대한 영향을 미치지 않았다. 단백질 A 표면에 유사한 조건을 이용하거나 3M MgCl2를 이용하여 상기 항-인간 IgG 표면을 재생성시켰다. 이 작업은 Biacore™ 3000 및/또는 T100 기계에서 수행하였고, 데이타는 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 1:1 결합 모델로 맞추었다. Biacore™ 작업은 25°C 또는 37°C에서 수행되었다.
방법 5
대장균-발현된 재조합 인간 IL -4에의 결합을 위한 Biacore ™ 결합 친화력 평가
재조합 대장균-발현된 인간 IL-4에 대한 mAbdAb 작제물의 결합 친화력은 Biacore™ 분석에 의해 평가되었다. 분석은 단백질 A 또는 항-인간 IgG 포획물을 이용하여 수행되었다. 간략히, 단백질 A 또는 항-인간 IgG는 제조 권고사항에 따라서 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에서 커플링되었다. 그 다음 mAbdAb 작제물을 이 표면상에서 포획하였고 인간 IL-4(GSK에서 제조하고 정제한)를 정의된 농도로 상기 표면위에 흘려주었다. 상기 표면을 온화한 산성 용리조건(예컨대, 10OmM 인산)을 이용하여 다시 단백질 A로 재생성시켰고, 이것은 후속한 IL-4 결합 사건을 위한 항체를 포획하는 능력에 중대한 영향을 미치지 않았다. 단백질 A 표면에 유사한 조건을 이용하거나 3M MgCl2를 이용하여 상기 항-인간 IgG 표면을 재생성시켰다. 이 작업은 Biacore™ 3000 및/또는 T100 및/또는 A100 기계에서 수행하였고, 데이타는 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 1:1 결합 모델로 맞추었다. Biacore™ 작업은 25°C 또는 37°C에서 수행되었다.
방법 6
대장균-발현된 재조합 인간 IL -18에의 결합을 위한 Biacore ™ 결합 친화력 평가
재조합 대장균-발현된 인간 IL-18에 대한 mAbdAb 작제물의 결합 친화력은 Biacore™ 분석에 의해 평가되었다. 분석은 단백질 A 또는 항-인간 IgG 포획물을 이용하여 수행되었다. 간략히, 단백질 A 또는 항-인간 IgG는 제조 권고사항에 따라서 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에서 커플링되었다. 그 다음 mAbdAb 작제물을 이 표면 상에서 포획하고 인간 IL-18(GSK에서 제조하고 정제한)을 정의된 농도로 상기 표면위에 흘려주었다. 상기 표면을 온화한 산성 용리조건(예컨대, 10OmM 인산)을 이용하여 다시 단백질 A로 재생성시켰고, 이것은 후속한 IL-18 결합 사건을 위한 항체를 포획하는 능력에 중대한 영향을 미치지 않았다. 단백질 A 표면에 유사한 조건을 이용하거나 3M MgCl2를 이용하여 상기 항-인간 IgG 표면을 재생성시켰다. 이 작업은 Biacore™ 3000 및/또는 T100 및/또는 A100 기계에서 수행하였고, 데이타는 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 1:1 결합 모델로 맞추었다. Biacore™ 작업은 25°C 에서 수행되었다.
방법 7
IL -13, IL -4 또는 IL -18에 대한 mAbdAb 이특이성 항체 또는 삼특이성 항체의 화학량론 평가( Biacore ™를 이용하여)
항-인간 IgG를 CM5 바이오센서 칩 상에 1차 아민 커플링에 의해 고정시켰다. mAbdAb 작제물을 이 표면에 포획시키고, 그 후 IL-13, IL-4 또는 IL-18 사이토카인의 단일 농도를 넘겼고, 이 농도는 결합 표면 및 총 R-맥스(max)에 도달된 관찰된 결합 신호를 포화시키기에 충분했다. 그 후 주어진 식을 이용하여 화학량론을 계산하였다:
화학량론 = Rmax × Mw(리간드)/Mw(분석물질) × R(고정되거나 포획된 리간드)
화학량론이 1개 이상의 분석물질의 결합에 대해 동시에 계산되는 경우, 상이한 사이토카인을 포화된 사이토카인 농도로 순차적으로 흘려주고 화학량론을 상기식에 따라 계산하였다. 상기 작업은 HBS-EP 영동 완충용액을 이용하여 25°C에서 Biacore 3000을 이용하여 수행되었다.
방법 8
TF -1 세포 증식 바이오분석 중 대장균-발현된 재조합 인간 IL - 13 의 중화
TF-1 세포는 인간 IL-13을 포함하는 다수의 상이한 사이토카인에 대하여 증식한다. 따라서 IL-13에 대한 이 세포의 증식성 반응은 IL-13의 생물활성을 측정하는데 사용될 수 있고, 후속하여 분석은 mAbdAb 작제물의 IL-13 중화 능력(IL-13 생물활성의 저해)을 측정하도록 개발되었다.
이 분석은 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 무균 조건하에 수행되었고 모든 테스트 웰은 3배로 하여 수행되었다. 대략 14ng/ml 재조합 대장균-발현된 인간 IL-13이 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(보통 3배 희석액 중에서 적정된 20OnM 내지 0.02nM)과 함께 총 부피 50μl 내에서 1시간 동안 37°C에서 미리-인큐베이션(pre-incubation)되었다. 그 후 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 상기 샘플에 50μl의 TF-1 세포(ml당 2×105 세포 농도)를 첨가하였다. 따라서 최종 10Oμl 분석 부피는 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(3-배 희석액 중 적정된 100nM 내지 0.01nM의 최종 농도), 재조합 대장균-발현된 인간 IL-13(7ng/ml의 최종 농도) 및 TF-1 세포(ml당 1×105 세포의 최종 농도)를 포함하였다. 상기 분석 플레이트를 37℃에서 대략 3일 동안 습도를 높인(humidified) CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 그 후 세포 증식량을 제조업자 지시방침에 기재된 바와 같이, 프로메가(Promega)사의 'CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay'(카탈로그 번호 G4 100)을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트 내 샘플의 흡광도는 플레이트 판독기 내 570nm에서 판독되었다.
mAbdAb 작제물의 재조합 대장균-발현된 인간 IL-13 생물활성을 중화시키는 능력을, 정의된 양의 인간 IL-13(7ng/ml)의 생물활성을 50% (= ND50)로 중화시키는데 필요한 mAbdAb 작제물의 농도와 같도록 발현시켰다. 요구되는 mAbdAb 작제물의 농도가 낮을수록, 중화 능력은 더욱 강력하다. 본원에 제공된 ND50 데이타는 수동으로 계산되었거나, 마이크로소프트 엑셀 고유의 로보세이지(Robosage) 소프트웨어 패키지를 이용하여 계산되었다.
방법 9
TF -1 세포 증식 바이오분석 중 대장균-발현된 재조합 인간 IL -4의 중화
TF-1 세포는 인간 IL-4을 포함하는 다수의 상이한 사이토카인에 대하여 증식한다. 따라서 IL-4에 대한 이 세포의 증식성 반응은 IL-4의 생물활성을 측정하는데 사용될 수 있고, 후속하여 분석은 mAbdAb 작제물의 IL-4 중화 능력(IL-4 생물활성의 저해)을 측정하도록 개발되었다.
이 분석은 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 무균 조건하에 수행되었고 모든 테스트 웰은 3배로 하여 수행되었다. 대략 2.2ng/ml 재조합 대장균-발현된 인간 IL-4가 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(보통 3배 희석액 중에서 적정된 20OnM 내지 0.02nM)과 함께 총 부피 50μl 내에서 1시간 동안 37°C에서 미리-인큐베이션되었다. 그 후 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 상기 샘플에 50μl의 TF-1 세포(ml당 2×105 세포 농도)를 첨가하였다. 따라서 최종 10Oμl 분석 부피는 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(3-배 희석액 중 적정된 100nM 내지 0.01nM의 최종 농도), 재조합 대장균-발현된 인간 IL-4(1.1ng/ml의 최종 농도) 및 TF-1 세포(ml당 1×105 세포의 최종 농도)를 포함하였다. 상기 분석 플레이트를 37℃에서 대략 3일 동안 습도를 높인 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 그 후 세포 증식량을 제조업자 지시방침에 기재된 바와 같이, 프로메가사의 'CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay'(카탈로그 번호 G4 100)을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트 내 샘플의 흡광도는 플레이트 판독기 내 570nm에서 판독되었다.
mAbdAb 작제물의 재조합 대장균-발현된 인간 IL-4 생물활성을 중화시키는 능력을, 정의된 양의 인간 IL-4(1.1ng/ml)의 생물활성을 50% (= ND50)로 중화시키는데 필요한 mAbdAb 작제물의 농도와 같도록 발현시켰다. 요구되는 mAbdAb 작제물의 농도가 낮을수록, 중화 능력은 더욱 강력하다. 본원에 제공된 ND50 데이타는 수동으로 계산되었거나, 마이크로소프트 엑셀 고유의 로보세이지 소프트웨어 패키지를 이용하여 계산되었다.
방법 10
TF -1 세포 증식 바이오분석 중 대장균-발현된 재조합 인간 IL -13의 및 대장균-발현된 재조합 인간 IL -4의 이중( dual ) 중화
TF-1 세포는 인간 IL-13 및 인간 IL-4을 포함하는 다수의 상이한 사이토카인에 대하여 증식한다. 따라서 IL-13 및 IL-4에 대한 이 세포의 증식성 반응은 IL-13 및 IL-4의 생물활성을 동시에 측정하는데 사용될 수 있고, 후속하여 분석은 mAbdAb 작제물의 IL-13 및 IL-4 이중의 중화 능력(IL-13 및 IL-4 생물활성의 이중 저해)을 측정하도록 개발되었다.
이 분석은 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 무균 조건하에 수행되었고 모든 테스트 웰은 3배로 하여 수행되었다. 대략 14ng/ml의 재조합 대장균-발현된 인간 IL-13 및 대략 2.2ng/ml 재조합 대장균-발현된 인간 IL-4가 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(보통 3배 희석액 중에서 적정된 20OnM 내지 0.02nM)과 함께 총 부피 50μl 내에서 1시간 동안 37°C에서 미리-인큐베이션되었다. 그 후 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 상기 샘플에 50μl의 TF-1 세포(ml당 2×105 세포 농도)를 첨가하였다. 따라서 최종 10Oμl 분석 부피는 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(3-배 희석액 중 적정된 100nM 내지 0.01nM의 최종 농도), 재조합 대장균-발현된 인간 IL-13(7ng/ml의 최종 농도), 재조합 대장균-발현된 인간 IL-4(1.1ng/ml의 최종 농도) 및 TF-1 세포(ml당 1×105 세포의 최종 농도)를 포함하였다. 상기 분석 플레이트를 37℃에서 대략 3일 동안 습도를 높인 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 그 후 세포 증식량을 제조업자 지시방침에 기재된 바와 같이, 프로메가사의 'CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay'(카탈로그 번호 G4 100)을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트 내 샘플의 흡광도는 플레이트 판독기 내 570nm에서 판독되었다.
방법 11
Sf21 -발현된 재조합 인간 IL -5에의 결합을 위한 비아코어 ( Biacore ™ ) 결합 친화력 평가
재조합 Sf21-발현된 인간 IL-5에 대한 mAbdAb 분자의 결합 친화력은 Biacore™분석에 의해 평가되었다. 분석은 단백질 A 또는 항-인간 IgG 포획물을 이용하여 수행되었다. 간략히, 단백질 A 또는 항-인간 IgG는 제조 권고사항에 따라서 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에서 커플링되었다. 그 다음 mAbdAb 분자를 이 표면상에서 포획하였고, 인간 IL-5(GSK에서 제조하고 정제한)를 정의된 농도로 상기 표면위에 흘려주었다. 상기 표면을 온화한 산성 용리조건(예컨대, 10OmM 인산)을 이용하여 다시 단백질 A로 재생성시켰고, 이것은 후속한 IL-5 결합 사건을 위한 항체를 포획하는 능력에 중대한 영향을 미치지 않았다. 단백질 A 표면에 유사한 조건을 이용하거나 3M MgCl2를 이용하여 상기 항-인간 IgG 표면을 재생성시켰다. 이 작업은 Biacore™ 3000, T100 및 A100 기계에서 수행하였고, 데이타는 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 1:1 결합 모델로 맞추었다. Biacore™ 작업은 25°C에서 수행되었다.
방법 12
VEGF 수용체 결합 분석
이 분석은 VEGF165의 VEGF R2 (VEGF 수용체)에의 결합 및 테스트 분자의 이 상호작용 차단 능력을 측정한다. ELISA 플레이트를 VEGF 수용체(R&D Systems, Cat No:357-KD-050)(0.2M 탄산나트륨, 중탄산염 pH 9.4 중 0.5μg/ml 최종 농도)로 밤새 코팅시키고, 세척하고, PBS 중 2％ BSA로 차단시켰다. VEGF (R&D Systems, Cat No: 293-VE-050) 및 테스트 분자(0.05% Tween 20™ PBS 중 0.1％ BSA로 희석됨)를 1시간동안 미리-인큐베이션 시킨 후 플레이트(3ng/ml VEGF 최종 농도)에 첨가하였다. VEGF와 VEGF 수용체의 결합은 비오티닐화 항-VEGF 항체(0.5μg/ml 최종 농도)(R&D Systems, Cat No: BAF293) 및 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항-비오틴 2차 항체(1:5000 희석) (Stratech, Cat No: 200- 032-096)를 이용하여 감지하였고, 1 M HCl의 동일 부피와 반응이 멈춘 뒤, 비색형 기질(colorimetric substrate)(Sure Blue TMB peroxidase substrate, KPL)을 이용하여 OD450에서 시각하였다.
방법 13
EGFR 키나아제 분석
A431 세포 표면상 EGFR활성은 EGF과 이의 상호작용을 통해 수용체의 티로신 카나아제 인산화를 유도한다. EGFR 티로신 키나아제 인산화의 감소는 테스트 분자의 능력을 결정하도록 측정된다. A431 세포가 96 웰 조직 배양 플레이트에 부착되도록 밤새 두고, 그 후 테스트 분자를 첨가하였으며 1시간 동안 둔 후 EGF( 300ng/ml)(R&D Systems 카탈로그 번호 236-EG)와 함께 10분동안 인큐베이션시켰다. 상기 세포가 용해되었고, 용해된 제조물을 항-EGFR 항체(1ug/ml) (R&D Systems, cat # AF231)가 코팅된 ELISA 플레이트로 옮겼다. 상기 용해된 세포 용액 내 존재하는 인산화된 EGFR 및 비-인산화된 EGFR 두 가지 모두를 포획하였다. 비결합된 물질을 세척한 후, 인산화된 EGFR를 HRP 콘쥬게이트된 항-포스포티로신 항체(1:2000 희석)(Upstate Biotechnology, cat # 16-105)를 이용하여 특이적으로 감지하였다. 비색형 기질을 이용하여 결합을 시각화하였다.
방법 14
MRC -5/ TNF 분석
인간 TNFR1와 인간 TNF-a의 결합을 방지하고 IL-8 분비를 중화시키는 테스트 분자의 능력은 인간 폐 섬유아세포 MRC-5 세포를 이용하여 측정되었다. 테스트 샘플의 희석액 연속물을 TNF-a(500pg/ml)(Peprotech)와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 이것을 MRC-5 세포의 현탁액으로 1 대 2의 비율로 희석하였다(ATCC, Cat.# CCL-171)(5×103 세포/웰). 밤새 인큐베이션 한 후, 샘플을 10분의 1로 희석하였고 IL-8 방출을 IL-8 ABI 8200 세포 감지 분석(FMAT) 을 이용하여 측정하는데, 이 분석은 항-IL-8(R&D systems, Cat# 208-IL) 코팅된 폴리스티렌 비드, 비오티닐화된 항-IL-8(R&D systems, Cat# BAF208) 및 스트렙타비딘 Alexafluor 647 (Molecular Probes, Cat#S32357)을 이용하여 IL-8 농도를 측정한다. 상기 분석 판독은 647nm에서 형광 방출이 국부적이었고 비공지된 IL-8 농도는 상기 분석에 포함된 IL-8 표준 곡선을 이용하여 삽입하였다.
방법 15
MRC -5/ IL -1 분석
인간 IL1-R과 인간 IL-1a의 결합을 방지하고 IL-8 분비를 중화시키는 테스트 분자의 능력은 인간 폐 섬유아세포 MRC-5 세포를 이용하여 측정되었다. MRC-5 세포(ATCC, Cat.# CCL-171)를 트립신화(trypsinised)하고, 그 다음 상기 테스트 샘플과 1시간동안 현탁액으로서 인큐베이션시켰다. 그 다음 IL-1a(200pg/ml 최종 농도) (R&D Systems cat no: 200-LA)을 첨가하였다. 밤새 인큐베이션 시킨 후, 항-IL-8 코팅된 ELISA 플레이트, 비오티닐화된 항-IL-8 및 스트렙타비딘-HRP가 함유된, IL-8 정량 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여, IL-8 방출을 측정하였다. 상기 분석 판독은 450nm에서 비색형 흡광도이고, 비공지된 IL-8 농도는 상기 분석에 포함된 IL-8 표준 곡선을 이용하여 삽입되었다.
방법 16
전혈 포스포 - STAT6 바이오분석 중 대장균-발현된 재조합 인간 IL -13 또는 IL-4의 중화력( Neutralisation potency )
전혈 세포는 생체외에서 재조합 대장균-발현된 인간 IL-4(rhlL-14) 또는 IL-13(rhlL-13)에 자극을 받아 포스포 STAT6(pSTAT6)을 발현할 수 있다. 이 분석은 정량적으로 pSTAT6을 측정하고, 그 결과 mAbdAb 작제물의 중화력(IL-4 또는 IL-13 생물활성 저해)을 결정하도록 개발되었다. 이 분석은 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 무균 조건하에 수행되었고 모든 테스트 웰은 3배로 하여 수행하였다. 12ng/ml의 rhlL-13 또는 rhlL-4를 무혈청 세포 배양배지에서 제조하였고 31.2μL을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. mAbdAb 작제물의 9 포인트 희석 곡선 또는 이소형 대조군을 6×최종 분석 농도로 제조하였고, 31.2μL의 각 희석액을 rhlL-4 또는 rhlL-13를 포함한 웰에 첨가하였다. 125μL의 헤파린 처리된(heparinized) 인간 전혈을 모든 웰에 첨가하고 30초동안 진탕기에서 혼합하였다. 최종 분석 부피는 rhlL-13 또는 rhlL-4와 함께 최종 농도 2ng/mL의 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액을 포함하였다. 상기 분석 플레이트를 37℃, 5％ CO2에서 60분동안 인큐베이션 시켰다.
그 다음 상기 세포를 62.5μL 의 4× 용해 완충용액을 첨가함으로서 용해시켰다. 상기 용해 완충용액은 최종 분석 농도 5OmM 트리스 염화수소, 300mM 염화 나트륨, 1% NP40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 5OmM 불화 나트륨, 1 mM 소듐 오르토바나드산염(sodium orthovanadate), 1 mM EDTA 및 프로테아제 억제자 칵테일을 포함하였다. 상기 플레이트를 차가운 상태로 30분 동안 두고, 그 후 pSTAT6에 대한 분석될 때까지 -80℃에서 냉동시켰다.
전혈 샘플 내 pSTAT6의 측정은 전기-화학발광 면역-분석법(Meso-Scale-Discovery, MSD)을 이용하여 수행되었다. 간략히, 아비딘 코팅된 96-웰 MSD 플레이트를 웰당 150μL의 5％ MSD 차단제 A를 이용하여 실온에서 1시간 동안 750rpm에서 진탕기상에서 차단시켰다. 상기 플레이트를 웰당 150μL의 MSD 트리스 세척 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 웰당 25μL의 포획 항체(비오티닐화된 마우스 항-인간 STAT6 모노클로날 항체)를 첨가하고 상기 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 포획 항체를 5OmM 트리스, 15OmM 염화나트륨, 0.2% BSA, 0.5% Tween 20, 1 mM EDTA로 이루어진 분석 완충용액에서 4μg/mL까지 희석시켰다. 상기 플레이트를 MSD 트리스 세척 완충용액을 이용하여 3회 세척하고 150μL의 5％ MSD 차단제 A를 이용하여 실온에서 1시간 동안 진탕기상에서 차단시켰다. 플레이트를 이전에 명시한 바와 같이, 3회 세척하고, 25μL의 전혈 용해물 또는 pSTAT6 보정기(calibrator)를 웰 당 첨가하였다. 플레이트를 3시간 동안 실온에서 진탕기 상에서 인큐베이션 하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 25μL의 토끼 항 인간 pSTAT6 항체(분석 완충용액 800 중 1로 희석)을 첨가하고, 그 후 1시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 추가 세척 후, 웰 당 25μL의 MSD TAG 염소 항-토끼 IgG 항체의 1/500 희석액을 첨가하고 그 후 1시간 동안 실온에서 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 재차 세척하고 웰당 150μL 2× MSD 판독 완충용액(read buffer) T를 첨가하였다. 플레이트를 즉시 MSD SECTOR 영상에서 판독하였다.
mAbdAb 작제물의 rhlL-13 또는 rhlL-4 생물 활성 중화시키는 능력은 2ng/mL의 인간 IL-4 또는 인간 IL-13를 50％(IC5O)로 중화시키는데 요구되는 mAbdAb 작제물의 농도와 같이 발현시켰다. 요구되는 mAbdAb 작제물의 농도가 낮을수록, 중화 능력이 더 강력해진다.
방법 17
ELISA 에 의한 대장균( E. Coli )-발현 재조합 시노몰구스 ( 시노몰구스 ) IL -13에의 결합
재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-13에 결합을 위해 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 분자를 분석하였다. 간략히, 5μg/ml의 재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-13(GSK에서 제조하고 정제한)을 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 상기 벽을 실온에서 1시간 동안 차단하고, mAbdAb 분자를 그 후 플레이트를 거쳐 밖으로 적정하였다(보통 3배 희석액 중 약 10OnM에서 약 0.01nM). 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(카탈로그 번호 A7164, Sigma-Aldrich)의 적절한 희석액(dilution) 또는 항-인간 IgGγ 쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 감지 항체(카탈로그 번호 A6029, Sigma-Aldrich)의 적절한 희석액을 이용하여 결합을 감지하였다.
방법 18
사용되지 않음
방법 19
ELISA 에 의한 인간 IL -4와 인간 IL4 수용체 알파( IL4R α)의 결합 억제
달리 명시되지 않았다면, 모든 시약은 차단 용액(트리스-완충 식염수 중 4% 소 혈청 알부민 및 0.05% Tween20) 내에서 사용에 앞서 필요한 농도로 희석되었다. ELISA 플레이트를 인산염 완충 식염수내에서 밤새 4℃에서 5μg/ml의 재조합 인간 IL4Rα-Fc 키메라(R&D Systems, Cat. No. 604-4R)로 코팅하였다. 모든 후속 단계는 실온에서 수행되었다. 상기 플레이트를 2시간 동안 차단 용액 내에서 차단시켰고 그 후 미리 0.02μg/ml의 재조합 인간 IL-4(GSK 제작)와 혼합된 50μl의 다양한 농도의 mAbdAb(또는 양성 대조군 mAbs 또는 dAbs)을 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시키고 그 후 세척 완충용액(트리스 완충 식염수 및 0.05% Tween20)으로 4회 세척하였다. 항-인간 IL-4(R&D Systems, Cat. No. BAF 204)의 0.5μg/ml 용액의 50μl을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 세척 완충용액으로 4회 세척한 후, 엑스트라바딘(Extravadin)(Sigma, Cat. No. E2886)의 1/2000 희석액 50μl/웰을 첨가하였다. 1시간 후, 상기 플레이트를 4회 세척하고 OPD 퍼옥시다아제 기질(Sigma로부터의)로 인큐베이션함으로서 비색형 신호를 감지하였고, 상기 반응을 종결용액(3M H2SO4 산)을 이용하여 종결시키고, 플레이트-판독기 상에서 판독함으로서 490nm에서 흡광도 데이타를 획득하였다. 평균 흡광도 및 표준 오류를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에서 플로팅하고 캠브리지 소프트 바이오에세이(Cambridge Soft BioAssay)를 이용하여 IC5O 값을 계산하였다.
방법 20
TF -1 세포 증식 바이오분석 중 대장균-발현된 재조합 시노몰구스 IL -13의 중화
TF-1 세포는 시노몰구스 IL-13을 포함하는 다수의 상이한 사이토카인에 대하여 증식한다. 따라서 IL-13에 대한 이 세포의 증식성 반응은 IL-13의 생물활성을 측정하는데 사용될 수 있고, 후속하여 분석은 mAbdAb 작제물의 IL-13 중화 능력(IL-13 생물활성의 저해)을 측정하도록 개발되었다.
이 분석은 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 무균 조건하에 수행되었고 모든 테스트 웰은 3배로 하여 수행되었다. 대략 14ng/ml 재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-13이 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(보통 3배 희석액 중에서 적정된 1000nM 또는 20OnM 내지 1nM 또는 0.02nM)과 함께 총 부피 50μl 내에서 1시간 동안 37°C에서 미리-인큐베이션되었다. 그 후 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 상기 샘플에 50μl의 TF-1 세포(ml당 2×105 세포 농도)를 첨가하였다. 따라서 최종 10Oμl 분석 부피는 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(3-배 희석액 중 적정된 500nM 또는 100nM 내지 0.5nM 또는 0.01nM의 최종 농도), 재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-13(7ng/ml의 최종 농도) 및 TF-1 세포(ml당 1×105 세포의 최종 농도)를 포함하였다. 상기 분석 플레이트를 37℃에서 대략 3일 동안 습도를 높인 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 그 후 세포 증식량을 제조업자 지시방침에 기재된 바와 같이, 프로메가사의 'CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay'(카탈로그 번호 G4 100)을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트 내 샘플의 흡광도는 플레이트 판독기 내 570nm에서 판독되었다.
mAbdAb 작제물의 재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-13 생물활성을 중화시키는 능력을, 정의된 양의 시노몰구스 IL-13(7ng/ml)의 생물활성을 50% (= ND50)로 중화시키는데 필요한 mAbdAb 작제물의 농도와 같도록 발현시켰다. 요구되는 mAbdAb 작제물의 농도가 낮을수록, 중화 능력은 더욱 강력하다. 본원에 제공된 ND50 데이타는 수동으로 계산되었거나, 마이크로소프트 엑셀 고유의 로보세이지 소프트웨어 패키지를 이용하여 계산되었다.
방법 21
TF -1 세포 증식 바이오분석 중 대장균-발현된 재조합 시노몰구스 IL -4의 중화
TF-1 세포는 시노몰구스 IL-4를 포함하는 다수의 상이한 사이토카인에 대하여 증식한다. 따라서 IL-4에 대한 이 세포의 증식성 반응은 IL-4의 생물활성을 측정하는데 사용될 수 있고, 후속하여 분석은 mAbdAb 작제물의 IL-4 중화 능력(IL-4 생물활성의 저해)을 측정하도록 개발되었다.
이 분석은 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 무균 조건하에 수행되었고 모든 테스트 웰은 3배로 하여 수행되었다. 대략 2.2ng/ml의 재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-4가 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(보통 3배 희석액 중에서 적정된 20OnM 내지 0.02nM)과 함께 총 부피 50μl 내에서 1시간 동안 37°C에서 미리-인큐베이션되었다. 그 후 무균 96-웰 조직 배양 플레이트에서 상기 샘플에 50μl의 TF-1 세포(ml당 2×105 세포 농도)를 첨가하였다. 따라서 최종 10Oμl 분석 부피는 mAbdAb 작제물의 다양한 희석액(3-배 희석액 중 적정된 100nM 내지 0.01nM의 최종 농도), 재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-4(1.1ng/ml의 최종 농도) 및 TF-1 세포(ml당 1×105 세포의 최종 농도)를 포함하였다. 상기 분석 플레이트를 37℃에서 대략 3일 동안 습도를 높인 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 그 후 세포 증식량을 제조업자 지시방침에 기재된 바와 같이, 프로메가사의 'CellTitre 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay'(카탈로그 번호 G4 100)을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트 내 샘플의 흡광도는 플레이트 판독기 내 570nm에서 판독되었다.
mAbdAb 작제물의 재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-4의 생물활성을 중화시키는 능력을, 정의된 양의 시노몰구스 IL-4(1.1ng/ml)의 생물활성을 50% (= ND50)로 중화시키는데 필요한 mAbdAb 작제물의 농도와 같도록 발현시켰다. 요구되는 mAbdAb 작제물의 농도가 낮을수록, 중화 능력은 더욱 강력하다. 본원에 제공된 ND50 데이타는 수동으로 계산되었거나, 마이크로소프트 엑셀 고유의 로보세이지 소프트웨어 패키지를 이용하여 계산되었다.
방법 22
ELISA 에 의한 인간 IL -13과 인간 IL13 수용체 알파2 ( IL13R α2)의 결합 억제
달리 명시되지 않았다면, 모든 시약은 차단 용액(트리스-완충 식염수 중 1% 소 혈청 알부민 및 0.05% Tween20) 내에서 사용에 앞서 필요한 농도로 희석되었다. ELISA 플레이트를 코팅 완충용액(0.05M 중탄산염 pH9.6, Sigma C-3041) 내에서 밤새, 4℃에서, Sf21세포에서 발현된 5μg/ml의 재조합 인간 IL13Rα/Fc 키메라(R&D Systems, Cat. No. 614-IR)로 코팅하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 차단 용액(TBST 중 1% BSA) 내에서 차단시키고, 그 후 미리 30μg/ml의 재조합 인간 IL-13(GSK 제작)과 30분 동안 37℃에서 인큐베이션된 다양한 농도의 mAbdAb(또는 양성 대조군 mAbs 또는 dAbs)을 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고 그 후 세척 완충용액(트리스 완충 식염수 및 0.05% Tween20)으로 3회 세척하였다. 비오티닐화된 항-인간 IL-13(R&D Systems, Cat. No. BAF 204)의 0.5μg/ml 용액의 50μl을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 세척 완충용액으로 3회 세척한 후, 엑스트라바딘(Sigma, Cat. No. E2886)의 적절한 희석액을 첨가하였다. 1시간 후, 상기 플레이트를 세척하고 OPD 퍼옥시다아제 기질(Sigma로부터의)로 인큐베이션함으로서 비색형 신호를 감지하였고, 상기 반응을 종결용액(3M 산)을 이용하여 종결시키고, 플레이트-판독기 상에서 판독함으로서 490nm에서 흡광도 데이타를 획득하였다. 평균 흡광도 및 표준 오류를 엑셀 시트에서 플로팅하고 마이크로소프트사의 로보세이지 소프트웨어를 이용하여 IC5O 값을 계산하였다.
방법 23
대장균-발현된 재조합 시노몰구스 IL -13에의 결합을 위한 Biacore ™ 결합 친화력 평가
재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-13에 대한 mAbdAb(또는 mAb) 분자의 결합 친화력은 Biacore™분석에 의해 평가되었다. 분석은 단백질 A 또는 항-인간 IgG 포획물을 이용하여 수행되었다. 간략히, 단백질 A 또는 항-인간 IgG는 제조 권고사항에 따라서 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에서 커플링되었다. 그 다음 mAbdAb(또는 mAb) 분자를 이 표면상에서 포획하였고, 시노몰구스 IL-13(GSK에서 제조하고 정제한)을 정의된 농도로 상기 표면위에 흘려주었다. 상기 표면을 온화한 산성 용리조건을 이용하여 다시 단백질 A로 재생성시켰고, 이것은 후속한 IL-13 결합 사건을 위한 항체를 포획하는 능력에 중대한 영향을 미치지 않았다. 이 작업은 Biacore™ 3000 및/또는 T100 기계에서 수행하였고, 데이타는 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 1:1 결합 모델로 맞추었다. Biacore™ 작업은 25°C 또는 37°C에서 수행되었다.
방법 24
대장균-발현된 재조합 시노몰구스 IL -4에의 결합을 위한 Biacore ™ 결합 친화력 평가
재조합 대장균-발현된 시노몰구스 IL-4에 대한 mAbdAb(또는 mAb) 분자의 결합 친화력은 Biacore™ 분석에 의해 평가되었다. 분석은 단백질 A 또는 항-인간 IgG 포획물을 이용하여 수행되었다. 간략히, 단백질 A 또는 항-인간 IgG는 제조 권고사항에 따라서 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에서 커플링되었다. 그 다음 mAbdAb(또는 mAb) 분자를 이 표면상에서 포획하였고 시노몰구스 IL-4(GSK에서 제조하고 정제한)를 정의된 농도로 상기 표면위에 흘려주었다. 상기 표면을 온화한 산성 용리조건(예컨대, 10OmM 인산)을 이용하여 다시 단백질 A로 재생성시켰고, 이것은 후속한 IL-4 결합 사건을 위한 항체를 포획하는 능력에 중대한 영향을 미치지 않았다. 단백질 A 표면에 유사한 조건을 이용하거나 3M MgCl2를 이용하여 상기 항-인간 IgG 표면을 재생성시켰다. 이 작업은 Biacore™ 3000 및/또는 T100 및/또는 A100 기계에서 수행하였고, 데이타는 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 1:1 결합 모델로 맞추었다. Biacore™ 작업은 25°C 또는 37°C에서 수행되었다.
방법 25
IL -13 세포-기초 중화 분석
IL13에 대해 특이성을 지니는 mAbdAbs의 효능을 조작된 리포터 세포주 HEK Blue-STAT6를 이용하여 IL-13 분석에서 분석하였다. 전사인자 STAT6은 생물학적 기능이 중복된 두개의 사이토카인, IL-4R알파 및 IL-13R알파1로 구성된 수용체 복합체에 결합하는 IL-4 및 IL-13에 의해 주로 활성화된다. 리간드 결합시, 상기 수용체 복합체는 STAT6의 보충 및 이의 인산화를 유도하며 수용체-연관 야누스 키나제(Janus kinases)(JAK1 및 Tyk2)를 활성화시킨다. 활성화된 STAT6은 핵으로 전위하는 동형이합체를 형성하고, 이는 반응적 프로모터의 제어하에 유전자의 전사를 유도한다. HEK Blue-STAT6 세포주는 이러한 프로모터의 제어하에 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase, SEAP)를 발현하도록 조작된다.
세포를 96 웰 플레이트에 플레이팅하고 20-24시간 동안 프리-평형화(pre-equilibrated)된 인간 IL-13 및 테스트 분자와 함께 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 기간 후, IL-13 자극의 결과로서 세포에 의해 생산된 SEAP의 양을 퀀티-블루 시스템(Quanti-blue system)(Invivogen)을 이용하여 측정하였다.
실시예 1
1. 이중 표적 mAbdAbs 의 생성
표 1-4에 제시된 이중 표적 mAbdAbs를 하기 방법으로 작제하였다. 도메인 항체를 엔코딩하는 서열을 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄(또는 둘다)를 엔코딩하는 서열에 접목시킴으로서, 발현 작제물을 생성하여, 발현된 경우, dAb가 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 부착되도록 한다. 몇가지 작제물의 경우, 도메인 항체를 중쇄 CH3 또는 경쇄 CK에 연결시키는데 링커 서열을 사용할 수 있다. 다른 작제물에서, 상기 도메인 항체는 링커 서열없이 중쇄 또는 경쇄에 직접적으로 연결된다. 이 mAbdAb 작제물의 일반적인 개열 구성도(schematic diagram)를 도 8에 도시하였다(mAb 중쇄는 어둡게 도시하였고; mAb 경쇄는 밝게 도시하였으며; dAb는 검게 도시하였다).
도 8에 제시된 mAbdAb 유형 1의 실시예는 PascoH-G4S-474일 것이다. 도 8에 제시된 mAbdAb 유형 2의 실시예는 PascoL-G4S-474일 것이다. 도 8에 제시된 mAbdAb 유형 3의 실시예는 PascoHL-G4S-474일 것이다. mAbdAb 유형 1 및 2는 4가 작제물이고, mAbdAb 유형은 6가 작제물이다.
mAbdAb 중쇄(상단 묘사) 또는 mAbdAb 경쇄(하단 묘사) 작제물을 묘사하는 개열 구성도를 하기에 도시하였다. 다르게 언급하지 않았다면, 이 제한 부위는 표 1-4에 기재된 mAbdAbs 작제물에 이용될 수 있다.
Figure pct00003
중쇄의 경우, 용어 'VH'는 모노클로날 항체 가변 중쇄 서열이고; 'CH1 , CH2 및 CH3'는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 서열이고; '링커'는 사용된 특정 링커 영역의 서열이고; 'dAb'는 도메인 항체 서열임을 주의하라. 경쇄의 경우, 용어 'VL'은 모노클로날 항체 가변 경쇄 서열이고; 'CK'는 인간 경쇄 불변 영역 서열이고; '링커'는 사용된 특정 링커 영역의 서열이고; 'dAb'는 도메인 항체 서열이다.
몇가지 DNA 발현 작제물은 올리고 구조(oligo build)에 의해 새롭게 제작되었다. 또한 다른 DNA 발현 작제물은 제한 클로닝 또는 위치-지정 돌연변이 유발에 의해 존재하는 작제물(본원에 기재된 바와 같이 제작된)에서 유도되었다.
이 작제물(mAbdAb 중쇄 또는 경쇄)를 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 포유류 발현 벡터(RIn, RId 또는 pTT 벡터 시리즈)내로 클로닝시켰다. 포유류 아미노산 신호 서열(SEQ ID NO: 64에 도시한 바와 같은)을 이 작제물의 작제에 이용하였다.
mAbdAbs의 발현의 경우, dAb가 모노클로날 항체의 중쇄의 C-말단에 연결되는 곳에서, 적절한 중쇄 mAbdAb 발현 벡터는 상기 모노클로날 항체를 위해 적절한 경쇄 발현 벡터와 짝을 지었다. mAbdAbs의 발현의 경우, dAb가 모노클로날 항체의 경쇄의 C-말단에 연결되는 곳에서, 적절한 경쇄 mAbdAb 발현 벡터는 상기 모노클로날 항체를 위해 적절한 중쇄 발현 벡터와 짝을 지었다.
mAbdAbs의 발현의 경우, dAb가 모노클로날 항체의 중쇄의 C-말단에 연결되는 곳 및 dAb가 모노클로날 항체의 경쇄의 C-말단에 연결되는 곳에서, 적절한 중쇄 mAbdAb 발현 벡터는 적절한 경쇄 mAbdAb 발현 벡터와 짝을 지었다.
1.1 사용된 학명 및 약어
모노클로날 항체(mAb)
모노클로날 항체들(mAbs)
도메인 항체(dAb)
도메인 항체들(dAbs)
중쇄(H 쇄)
경쇄(L 쇄)
중쇄 가변 영역(VH)
경쇄 가변 영역(VL)
인간 IgG1 불변 중쇄 영역 1(CH1)
인간 IgG1 불변 중쇄 영역 2(CH2)
인간 IgG1 불변 중쇄 영역 3(CH3)
인간 카파 경쇄 불변 영역(CK)
1.2 항- IL13mAb -항- IL4dAbs
이특이성 항-IL13mAb-항-IL4dAbs을 본원에 기재된 바에 의하여 작제하였다. 항-IL4 도메인 항체를 모노클로날 항체에 연결하는데 다수의 상이한 링커를 이용하였다. 몇가지 작제물은 링커를 가지지 않았다.
링커 및 dAbs를 mAb 중쇄의 CH3 또는 mAb 경쇄의 CK에 클로닝하기 위해 BamHI 클로닝 부위(아미노산 잔기 G 및 S를 위한 코드)를 사용하였음을 주목하라. 따라서 주어진 링커 서열 외에도, 추가적으로 G 및 S 아미노산 잔기가 링커 서열 및 중쇄와 경쇄 발현 작제물을 위한 도메인 항체 사이에 존재하거나, CH3 및 중쇄 발현 작제물 전체가 아닌 일부의 링커 서열 사이에 존재한다. 그러나, G4S 링커가 mAbdAb 형식상 mAb 및 dAb 사이에 놓여진 경우, BamHI 클로닝 부위는 이미 제시되었고(G 및 S 아미노산 잔기는 G4S 링커 서열 내에 고유하기 때문에) 따라서 추가적인 G 및 S 아미노산 잔기는 CH3 또는 CK 및 이 링커를 이용하는 작제물 내 도메인 항체 사이에 제시되지 않았다. mAbdAb 형식상 mAb 및 dAb 사이에 사용된 링커 서열이 없는 경우, BamHI 클로닝 부위(및 따라서 G 및 S 아미노산 잔기)는 CH3 또는 CK 및 도메인 항체 사이에 여전히 존재하였다. mAbdAb 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열의 전체 상세한 설명은 표 1에 제시하였다.
몇 가지 하기의 실시예는 대조군 항체로서 IL-4 mAb를 사용한다. 이 실시예에서 사용된 대조군 IL-4 mAb는 SEQ ID NO: 14의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 15의 경쇄 서열을 가진 항체이거나, SEQ ID NO: 166의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 15의 경쇄 서열을 가진 항체일 것이다. 상기 두 가지 IL-4 mAbs는 동일한 CDRs를 공유하고, 동일한 방법으로 결합할 것이 예상되므로, 상기 두 가지 항체는 하기 실시예에서 'Pascolizumab' 또는 'IL-4 mAb'로 지칭된다.
몇가지 하기 실시예는 대조군 항체로서 IL-5 mAb를 사용한다. 이 실시예에서 사용된 대조군 IL-5 mAb는 SEQ ID NO: 65의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 66의 경쇄 서열을 가진 항체이거나, SEQ ID NO: 191의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 66의 경쇄 서열을 가진 항체일 것이다. 상기 두 가지 IL-5 항체는 동일한 CDRs를 공유하고, 동일한 방법으로 결합할 것이 예상되므로, 상기 두 가지 항체는 하기 실시예에서 'Mepolizumab' 또는 'IL-5 mAb'로 지칭된다.
표 1에 제시된 mAbdAbs는 CHOK1 세포 상층액(supernatants)에서 일시적으로 발현되었다. mAbdAb 정량에 따라, 상층액에 포함된 이 mAbdAb의 IL-13 및 IL-4 결합 ELISA에서의 활성에 대해 분석하였다.
표 1
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
표 2에 제시된 mAbdAbs는 다수의 IL-13 및 IL-4 활성 분석에서 정제되고 분석된, CHOK1 또는 CHOE1a 세포 상층액의 하나 또는 둘 모두에서 발현된다.
표 2
Figure pct00008
1.3 항- IL4mAb -항- IL13dAbs
이특이성 항-IL4mAb-항-IL13dAbs를 본원의 기재와 같이 작제하였다. 다수의 상이한 링커는 항-IL13 도메인 항체를 모노클로날 항체에 연결시키는데 사용되었다. 몇가지 작제물은 링커를 가지지 않았다.
링커 및 dAbs를 mAb 중쇄의 CH3 또는 mAb 경쇄의 CK에 클로닝하기 위해 BamHI 클로닝 부위(아미노산 잔기 G 및 S를 위한 코드)를 사용하였음을 주목하라. 따라서 주어진 링커 서열 외에도, 추가적으로 G 및 S 아미노산 잔기가 링커 서열 및 중쇄와 경쇄 발현 작제물을 위한 도메인 항체 사이에 존재하거나, CH3 및 중쇄 발현 작제물 전체가 아닌 일부의 링커 서열 사이에 존재한다. 그러나, G4S 링커가 mAbdAb 형식상 mAb 및 dAb 사이에 놓여진 경우, BamHI 클로닝 부위는 이미 존재하고(G 및 S 아미노산 잔기는 G4S 링커 서열 내에 고유하기 때문에) 따라서 추가적인 G 및 S 아미노산 잔기는 CH3 또는 CK 및 이 링커를 이용하는 작제물 내 도메인 항체 사이에 존재하지 않았다. mAbdAb 형식상 mAb 및 dAb 사이에 사용된 링커 서열이 없는 경우, BamHI 클로닝 부위(및 따라서 G 및 S 아미노산 잔기)는 CH3 또는 CK 및 도메인 항체 사이에 여전히 존재하였다. mAbdAb 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열의 전체 세부사항은 표 3에 제시하였다.
표 3에 제시된 mAbdAbs는 CHOK1 세포 상층액에서 일시적으로 발현되었다. mAbdAb 정량에 따라, 상청액에 포함된 이 mAbdAb의 IL-13 및 IL-4 결합 ELISA에서의 활성에 대해 분석하였다.
표 3
Figure pct00009
표 4에 제시된 mAbdAbs는 CHOK1 , CHOE1a 또는 HEK293-6E 세포 하나 또는 둘 모두에서 발현되었다.
표 4
Figure pct00010
1.4 모노클로날 항체, 도메인 항체 및 링커의 서열목록번호( Sequence ID numbers )
mAbdAbs를 생성하기 위해 사용된 모노클로날 항체(mAb), 도메인 항체(dAb) 및 링커의 서열목록번호는 하기 표 5에 도시되어 있다.
표 5
Figure pct00011
Figure pct00012
성숙한 인간 IL-13 아미노산 서열(신호 서열없음)은 SEQ ID NO: 63에 제시되어 있다.
성숙한 인간 IL-4 아미노산 서열(신호 서열없음)은 SEQ ID NO: 62에 제시되어 있다.
1.5 mAbdAbs 의 발현 및 정제
실시예 1에 기재된 mAbdAb 발현 작제물을, 적게(대략 3mls) 또는 중간(대략 5Omls 내지 10Omls) 또는 대규모(대략 1리터)로 발현된, CHOK1 세포, CHOE1a 세포 또는 HEK293-6E 세포 중 하나 이상으로 형질감염시키고, 상기 작제물 중 일부를 고정된 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하고 280nm에서 흡광도를 판독함으로서 정량화하였다.
1.6 정제된 mAbdAbs 의 크기 배제 크로마토그래피 분석
다수의 mAbdAbs를 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS PAGE)을 이용하여 분석하였다. 이 분자 일부(PascoH-G4S-474, PascoL-G4S-474, PascoH-474 및 PascoHL-G4S-474.)에 대한 대표적인 데이타를 도 9, 10, 11 및 12 각각에 도시하였다. 제거된 'GS' 모티프를 지니는 분자에 대한 SEC 및 SDS 페이지 분석을 도시한 대표 데이타를 도 90-98에 도시하였다.
몇가지 경우, 응결체를 제거하기 위해 상기 분자를 추가 정제하는데 SEC를 사용하였다.
실시예 2
ELISA 에 의한 mAbdAbs 와 인간 IL -13 및 인간 IL -4와의 결합
2.1 항- IL13mAb -항- IL4dAbs 의 IL -13 및 IL -4에의 결합
직접 결합 ELISA(방법 1에 기재됨)에서 인간 IL-13에의 결합에 대해 mAbdAb 상층액을 테스트하였다. 이 데이타를 도 13에 도시하였다.
도 13은 모든 항-IL13mAb-항-IL4dAbs가 IL-13에 결합함을 도시한다. 이 mAbdAbs의 결합 활성은, 또한 IL-13 결합에 대한 양성 대조군으로서, 그리고 mAbdAbs와 직접적으로 비교하기 위해 이 분석에 포함된, 정제된 항-인간 IL13 mAb 단독과 대략 동등하다(2배 내지 3배 내). 정제된 항-인간 IL4 mAb (Pascolizumab)는 IL-13 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
직접 결합 ELISA(방법 2에 기재됨)에서 인간 IL-4에의 결합에 대해 상기 분자를 테스트하였다. 이 데이타를 도 14에 도시하였다.
도 14는 모든 항-IL13mAb-항-IL4dAbs가 IL-4에 결합하나, IL-4 결합 활성내의 약간의 변이가 관찰됨을 도시한다. mAbdAb 작제물 내 항-IL4 dAb가 존재하지 않는 경우, IL-4에의 결합은 관찰되지 않았다. 정제된 항-인간 IL13 mAb은 IL-4에 결합에 대한 음성 대조군으로서 또한 포함되었다. dAbs는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에, 항-IL-4 dAbs 단독은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 정제된 항-인간 IL4 mAb (Pascolizumab)가 이 분석에서 IL-4 결합을 설명하기 위해 양성 대조군으로서 사용되었음을 주목하라.
직접 결합 ELISA(방법 1에 기재됨)에서 인간 IL-13에 결합에 대해 정제된 mAbdAbs 샘플을 또한 테스트하였다. 이 데이타는 도 15에 도시하였다. 이 정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAbs 는 IL-13에 결합하였다. IL-13에 대한 이 mAbdAbs의 결합 활성은 정제된 항-인간 IL13 mAb 단독의 결합 활성과 동일하였다. 이소형-매치된 mAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지니는)가 이 분석에서 IL-13에 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
직접 결합 ELISA(방법 2에 기재됨)에서 인간 IL-4에 결합에 대해 이 정제된 mAbdAbs를 또한 테스트하였다. 이 데이타는 도 16에 도시하였다.
이 항-IL13mAb-항-IL4dAbs 전부가 IL-4에 결합하였다. dAbs는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에, 항-IL-4 dAbs 단독은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 정제된 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 이 분석에서 IL-4 결합을 설명하기 위해 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라. 이소형-매치된 mAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지니는)가 이 분석에서 IL-4에 결합에 대한 음성 대조군으로서 또한 포함되었다.
2.2 항- IL4mAb -항- IL13dAbs 의 IL -13 및 IL -4에의 결합
직접 결합 ELISA(방법 2에 기재됨)에서 인간 IL-4에 결합에 대해 mAbdAb 상층액을 테스트하였다. 이 데이트를 도 17에 도시하였다(일부 샘플을 2배로 하여 제조하고 테스트하였다 - 이하 샘플 1 및 샘플 2).
도 17은 mAbdAbs 전부가 IL-4에 결합함을 도시하고 있다. 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)은 이 분석에서 포함되었으나 결합 곡선을 생성하지 않았는데 이는, 이 분석에서 사용하기 위한 상기 mAb를 희석할 때 오류가 발생하였기 때문이다(Pascolizumab는 모든 다른 후속한 IL-4 결합 ELISA에서 성공적으로 사용되었다). 정제된 항-인간 IL13 mAb는 IL-4 결합을 위한 음성 대조군으로서 포함되었다.
직접 결합 ELISA(방법 1에 기재됨)에서 인간 IL-13에 결합에 대해 동일한 mAbdAb 상층액을 또한 테스트하였다. 이 데이트를 도 18에 도시하였다(일부 샘플을 2배로 하여 제조하고 테스트하였다 - 이하 샘플 1 및 샘플 2)
도 18은 항-IL4mAb-항-IL13dAbs 전부가 IL-13에 결합함을 도시하고 있다. 정제된 항-인간 IL-13 mAb 단독은 이 분석에서 포함되었으나 결합 곡선을 생성하지 않았는데 이는, 이 분석에서 사용하기 위한 상기 mAb를 희석할 때 오류가 발생하였기 때문이다(정제된 항-인간 IL-13 mAb은 모든 다른 후속한 IL-13 결합 ELISA에서 성공적으로 사용되었다). 정제된 항-IL4 mAb(Pascolizumab)는 IL-13에 결합을 위한 음성 대조군으로서 포함되었다. 상기 항-IL-13 dAb 단독(D0M10-53-474)은 이 dAb가 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에, 이 분석에서 테스트되지 않았음을 주의하라.
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, 'PascoH-G4S-474', 'PascoH-474', 'PascoL- G4S-474' 및 'PascoHL-G4S-474'을 직접 결합 ELISA(방법 2에 기재됨)에서 인간 IL-4에 결합에 대해 또한 테스트하였다. 이 데이타는 도 19에 도시하였다.
이 정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs는 IL-4에 결합하였다. 이 mAbdAbs의 결합 활성은 정제된 항-IL4 mAb 단독(Pascolizumab)과 대략 동일하였다(2배 이내). 이소형-매치된 mAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지니는)가 이 분석에서 IL-4에 결합에 대한 음성 대조군으로서 또한 포함되었다.
이 동일한 정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoHL-G4S-474을 직접 결합 ELISA(방법 1에 기재됨)에서 인간 IL-13에 결합에 대해 또한 테스트하였다. 이 데이타는 도 20A에 도시하였다.
이 정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs은 IL-13에 결합하였다. 이소형-매치된 mAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지니는)가 이 분석에서 IL-13에 결합에 대한 음성 대조군으로서 또한 포함되었다. dAb는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에, 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위해 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
정제된 PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 및 PascoH- ELQLE-474을 방법 17에 기재된 직접 결합 ELISA(방법 1에 기재됨)에서 시노몰구스 IL-13에 결합에 대해 또한 테스트하였다(GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474가 이 분석에 또한 포함되었고, 이 분자의 작제물은 실시예 18에 기재되어 있다). 대표적 데이타를 도시한 그래프는 도 20B에 도시하였다.
정제된 PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 및 PascoH- ELQLE-474 전부가 시노몰구스 IL-13에 결합하였다. 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)은 IL-13에 결합을 위한 음성 대조군으로서 이 분석에 포함되었다. 정제된 항-인간 IL13 mAb은 시노몰구스 IL-13 결합을 위한 양성 대조군으로서 이 분석에 포함되었다. dAb는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에, 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위해 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
실시예 3
표면 플라즈몬 공명( BIAcore ™)에 의한 mAbdAbs 의 인간 IL -13 및 인간 IL -4에의 결합
3.1 BIAcore ™ 에 의한 항- IL13mAb -항- IL4dAbs 의 IL -13 및 IL -4에의 결합
mAbdAbs(섹션 1.5에 기재된 바와 같이 제조된, CHO 세포 상층액 내)를 BIAcore™를 이용하여 25℃에서(방법 4에 기재한 바와 같이) 인간 IL-13에의 결합에 대해, 테스트하였다. 이 데이타 세트에서, 두개의 IL-13 농도 곡선(10OnM 및 1 nM)을 평가하였고, 각 mAbdAb 작제물에 대해 1000 및 1300(대략) 사이의 상대적인 반응 포획 수준이 달성되었다. 제한된 수의 IL-13 농도가 사용되었기 때문에, 생성된 데이타는 정밀한 동역학 측정보다는 작제물의 순위(ranking)에 더욱 적합하다. 상기 데이타는 표 6에 도시되어 있다.
표 6
Figure pct00013
Figure pct00014
항-IL13mAb-항-IL4dAbs 전부는 유사한 결합 친화력으로 IL-13에 결합하였고, 이는 대략 정제된 항-인간 IL13 mAb 단독의 결합 친화력과 대략 동일하였다. 이 데이타는, 링커 및/또는 항-IL4 dAbs를 항-IL13 mAb의 중쇄에 추가하는 것은 이 mAbdAb 작제물 내의 mAb 성분의 IL-13 결합 친화력에 영향을 미치지 않는다는 것을 암시하였다.
상기 mAbdAbs를 BIAcore™를 이용하여 25℃에서(방법 5에 기재한 바와 같이) 인간 IL-4에의 결합에 대해 또한 테스트하였다. 이 데이타는 표 7에 도시되어 있다. 이 데이타 세트에서, 네개의 IL-4 농도 곡선(512, 128, 32 및 8nM)을 평가하였고, 테스트된 각 mAbdAb에 대한 대략의 상대적인 반응 포획 수준을 상기 표에 제시하였다. dAbs는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG상에 포획될 수 없기 때문에, 항-IL-4 dAbs 단독은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 IL-4 결합을 설명하기 위해 이 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
표 7
Figure pct00015
Figure pct00016
상기 일부 데이타 세트에 대한 주의점이 관찰되었다. 일부 데이타 세트에서 좋지 못한 곡선 접합(curve fits)이 관찰되었고(*), 따라서 이 데이타에 의해 결정된 실제 결합 친화력 값을 주의해서 다뤄야 한다. 일부 곡선에서 양성 분리(Positive dissociation)가 관찰되었고(**), 따라서 이 데이타에 의해 결정된 실제 결합 친화력 값을 주의해서 다뤄야 한다. 게다가, BIAcore™는 DOM9-112-210 dAb을 포함하는 모든 mAbdAb 작제물에 대한 온 및 오프 속도를 결정할 수 없었는데(즉, 충분히 민감하지 않음), 이는 상기 mAbdAbs와 IL-4의 예외적으로 타이트한 결합 때문이다. IL-4에 대한 상기 mAbdAbs의 결합 동역학의 결정은, 관찰된 양성 분리 효과에 의해 추가적으로 방해되었다. 이 데이타는 도 21에 도시되어 있다.
추가 실험에서 유사한 데이타가 관찰되었다. 이 데이타는 도 22에 도시되어 있다.
이 두가지 독립된 데이타 세트는 항-IL13mAb-항-IL4dAbs 전부가 IL-4에 결합하지만, 결합 친화력은 항-IL4 dAb를 항-IL13 mAb 중쇄에 결합시키는데 사용된 링커에 따라 변화한다는 것을 나타낸다. 이 실험에서, 링커의 존재는 mAbdAb 형식상 항-IL4 dAb 성분(중쇄상에 위치되는 경우)에 대한 결합 친화력을 강화시킨다는 것이 발견되었다. 예컨대, TVAAPS 또는 ELQLEESCAEAQDGELDG 링커를 지니는 분자는 더욱 강력한 바인더(binders)인 것으로 보인다. 항-IL4 dAb가 상기 mAbdAb 작제물에 존재하지 않는 경우, IL-4에의 결합이 관찰되지 않았다. 이 mAbdAbs의 D0M9-1 12-210 성분이 매우 타이트하게 결합하고 그에 따라 오프-속도(off-rate)가 BIAcore™를 이용해 측정하기에 너무 작다는 사실 때문에, IL-4에 대한 586-링커-210 mAbdAbs의 결합 친화력을 측정하는 것이 불가능하였다.
또한 BIAcore™를 이용해 25℃에서(방법 4 및 5에 기재됨) 인간 IL-13 및 인간 IL-4에의 결합에 대해, 정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAbs을 테스트하였다. 이 데이타는 표 8에 도시되어 있다.
표 8
Figure pct00017
586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 및 586H-TVAAPS-210 전부는 유사한 결합 친화력으로 IL-13에 결합하고, 이는 정제된 항-인간 IL13 mAb 단독의 결합 친화력과 대략 동일하였다. 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 및 586H-TVAAPS-210 전부는 IL-4에 결합하였다. 이 mAbdAb의 DO M9-112-210 성분이 매우 타이트하게 결합하고 그에 따라 오프-속도(off-rate)가 BIAcore™를 이용해 측정하기에 너무 작다는 사실 때문에, IL-4에 대한 586-TVAAPS-210의 결합 친화력을 측정하는 것이 불가능하였다. dAbs는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG상에 포획될 수 없기 때문에, 항-IL-4 dAbs 단독(DOM9-155-25, DOM9-155-154 및 DOM9-112-210)은 이 분석 형식에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 IL-4 결합을 설명하기 위해 이 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
3.2 BIAcore ™ 에 의한 항- IL4mAb -항- IL13dAbs 의 IL -4 및 IL -13에의 결합
mAbdAbs(섹션 1.5에 기재된 바와 같이 제조된, CHO 세포 상층액 내)를 BIAcore™를 이용하여 25℃에서(방법 5에 기재한 바와 같이) 인간 IL-4에의 결합에 대해, 테스트하였다. 이 데이타는 표 9에 도시되어 있다(일부 샘플을 2배로 하여 제조하고 테스트하였다 - 이하 샘플 1 및 샘플 2). 이 데이타 세트에서, 네개의 IL-4 농도 곡선(10OnM, 1OnM, 1nM 및 0.1nM)을 평가하였고, 테스트된 각 mAbdAb에 대한 대략의 상대적인 반응 포획 수준을 상기 표에 나타내었다. 이소형-매치된 mAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지니는)가 이 분석에서 IL-4에의 결합에 대한 음성 대조군으로서 또한 포함되었다.
표 9
Figure pct00018
테스트된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs 전부는 유사한 결합 친화력으로 IL-4에 결합하였고, 이는 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)의 결합 친화력과 대략 동일하였다. PascoL-EPKSC-474는 Pascolizumab보다 대략 2-배 덜 강력하게 IL-4에 결합하였다. 이 데이타는 링커 및 항-IL13 dAb을 Pascolizumab의 중쇄 또는 경쇄에 첨가하는 것은 mAbdAb 작제물 내 mAb 성분의 IL-4 결합 친화력에 명백히 영향을 미치지 않는다는 것을 시사하였다.
상기 mAbdAbs를 BIAcore™를 이용하여 25℃에서(방법 4에 기재한 바와 같이) 인간 IL-13에의 결합에 대해, 테스트하였다. 이 데이타는 표 10에 도시되어 있다(일부 샘플을 2배로 하여 제조하고 테스트하였다 - 이하 샘플 1 및 샘플 2). 이 데이타 세트에서, 네개의 IL-13 농도 곡선(128nM, 32nM, 8nM 및 2nM)을 평가하였고, 테스트된 각 mAbdAb에 대한 대략의 상대적인 반응 포획 수준을 상기 표에 나타내었다.
표 10
Figure pct00019
실험 2에서 테스트된 작제물에 대한 결합 친화력이 도 23에 또한 도시되어 있다.
항-IL4mAb-항-IL13dAbs 전부가 IL-13에 결합하였다. 대부분의 경우, 링커의 존재는, 항-IL4 mAb의 중쇄에 위치하는 경우, 항-IL13 dAb 성분의 IL-13에 대한 결합 친화력을 강화시키는 것으로 보이지 않았다. 그러나, 링커의 존재는 항-IL4 mAb의 경쇄에 위치하는 경우 항- IL13 dAb 성분의 IL-13에 대한 결합 친화력을 강화시키는 것으로 보였다. PascoL-TVAAPS-474가 이 실험에서 가장 강력한 IL-13 결합 친화력을 가지는 것으로 보였다.
dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG상에 포획될 수 없기 때문에, 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 정제된 항-인간 IL13 mAb가 IL-13 결합을 설명하기 위해 이 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라. 이소형-매치된 mAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지니는)가 이 분석에서 IL-13에의 결합에 대한 음성 대조군으로서 또한 포함되었다.
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs를 BIAcore™를 이용하여 25℃에서(방법 4 및 5에 기재한 바와 같이) 인간 IL-4 및 인간 IL-13에의 결합에 대해 또한 테스트하였다. 이 데이타는 표 11에 도시되어 있다
표 11
Figure pct00020
이 실험에서, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoHL- G4S-474 전부는 유사한 결합 친화력으로 IL-4에 결합하였고, 이는 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)의 결합 친화력과 대략 동일하였다. 이들은 전부 IL-13에도 결합하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG상에 포획될 수 없기 때문에, 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 IL-13 결합을 설명하기 위해 이 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
3.3 BIAcore ™를 이용한 IL -13 및 IL -4의 항- IL4mAb -항- IL13dAbs 에의 결합 화학량론
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs을 BIAcore™를 이용하여(방법 7에 기재된 바와 같이) IL-13 및 IL-4에 대한 결합 화학량론에 대해 평가하였다. 이 데이타는 표 12에 도시되어 있다.
표 12
Figure pct00021
Figure pct00022
PascoH-G4S-474, PascoH-474 및 PascoL-G4S-474는 IL-13의 두 분자 및 IL-4의 두 분자에 근접하게 결합할 수 있었다. PascoHL-G4S-474는 IL-4의 두 분자 및 IL-13의 네 분자에 근접하게 결합할 수 있었다. 이 데이타는 테스트된 상기 작제물이 예상된 수의 IL-13 또는 IL-4 분자에 의해 충분히 차지될 수 있음을 나타내었다.
실시예 4
IL -13 및 IL -4 생물분석에서 mAbdAbs 의 중화력
4.1 항- IL13mAb -항- IL4dAbs
정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAbs을 TF-1 생물분석(방법 8에 기재한 바와 같은)에서 인간 IL-13의 중화에 대해 조사하였다. 이 데이타는 도 24에 기재되어 있다.
정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAbs, 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 및 586H-TVAAPS-210는 TF-1 세포 생물분석에서 IL-13의 생물활성을 충분히 중화시켰다. 이 mAbdAbs의 상기 중화력은 정제된 항-인간 IL-13 mAb 단독의 2-배 이내였다. 정제된 항-인간 IL-4 mAb(Pascolizumab) 및 정제된 항-IL4 dAbs(DOM9-155-25, DOM9-155-154 또는 DOM9-1 12-210)는 이 분석에서 IL-13의 중화에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAbs, 586H-TVAAPS-25, 586H-TVAAPS-154 및 586H-TVAAPS-210를 TF-1 세포 생물분석(방법 9에서 기재한 바와 같은)에서 인간 IL-4의 중화에 대해 조사하였다. 이 데이타는 도 25에 도시되어 있다.
586H-TVAAPS-210는 TF-1 세포 생물분석에서 IL-4의 생물활성을 충분히 중화시켰다. 이 mAbdAb의 상기 중화력은 정제된 항-인간 IL-4 dAb 단독(DOM9-1 12-210) 의 2-배 이내였다. 586H-TVAAPS-25 및 586H-TVAAPS-154는 IL-4의 생물활성을 중화시키지 않았고 정제된 항-인간 IL-4 dAbs 단독(DOM9-155-25 및 DOM9-155-154)과 대조적이었다. BIAcore™에 의해 설명되었듯이, 정제된 586H-TVAAPS-25 및 586H-TVAAPS-154은 IL-4에 대해 1.1 nM 및 0.49nM 결합 친화력(각각)을 가졌다. IL-4는 IL-4 수용체에 매우 타이트하게 결합하고(문학 출판물에서 대략 5OpM의 결합 친화력이 보고되고 있음) 따라서 상기 두 586H-TVAAPS-25 또는 586H-TVAAPS-154가 TF-1 세포 생물분석에서 IL-4의 생물활성을 효과적으로 중화시킬 수 없다는 관찰은 IL-4 수용체에 대한 IL-4의 능력과 비교하여 IL-4에 대한 이 mAbdAbs의 상대적으로 더 낮은 친화력의 결과일 수 있다.
정제된 항-인간 IL-4 mAb (Pascolizumab)는 이 생물분석에서 IL-4의 중화에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL-13 mAb는 이 생물분석에서 IL-4의 중화에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
4.2 항- IL4mAb -항- IL13dAbs
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoHL-G4S-474를 TF-1 세포 생물 분석에서 인간 IL-4의 중화에 대해 테스트하였다(방법 9에 기재된바와 같이). 이 데이타는 도 26에 도시되어 있다.
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S- 474 및 PascoHL-G4S-474는 TF-1 세포 생물분석에서 IL-4의 생물활성을 충분히 중화시켰다. 이 mAbdAbs의 중화력은 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)의 중화력과 대략 동일하였고, 정제된 항-인간 IL-13 mAb, 정제된 DOM10-53-474 dAb 및 무관한 항원에 대해 특이성을 지니는 dAb(음성 대조군 dAb)는 이 분석에서 IL-4의 중화에 대한 음성 대조군으로서 또한 포함되었다.
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoHL-G4S-474는 TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-13의 중화에 대해 테스트하였다(방법 8에 기재한 바와 같이). 이 데이타는 도 27에 도시되어 있다.
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S- 474 및 PascoHL-G4S-474는 TF-1 세포 생물분석에서 IL-13의 생물활성을 충분히 중화시켰다. 이 mAbdAbs의 중화력은 정제된 항-IL13 dAb 단독(DOM10-53-474)의 3-배 이내였다. 정제된 항-인간 IL-13 mAb는 이 분석에서 IL-13 중화에 대한 양성 대조군으로서 또한 포함되었다. 무관한 항원에 대해 특이성을 지니는 dAb(음성 대조군 dAb) 및 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab) 또한 이 분석에서 IL-4의 중화에 대한 음성 대조군으로 포함되었다.
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoHL-G4S-474를 이중 중화 TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-4 및 인간 IL-13의 동시 중화에 대해 또한 테스트하였다. 이 데이타는 도 28에 도시되어 있다.
정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S- 474 및 PascoHL-G4S-474는 이중 중화 TF-1 세포 생물분석에서 IL-4 및 IL-13 둘 모두의 생물활성을 충분히 중화시켰다. 이 mAbdAbs의 중화력은 정제된 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab) 및 정제된 항-IL13 dAb(DOM10-53-474)의 조합의 중화력과 대략 동일하였다. 정제된 항-인간 IL-13 mAb 단독, 정제된 항-인간 IL-4 mAb 단독(Pascolizumab) 및 항-인간 IL-13 dAb(DOM10-53-474)단독(음성 대조군으로서 포함된)은 이 이중 IL-4 및 IL-13 중화 생물분석에서 상기 두 IL-4 및 IL-13의 생물활성을 충분히 중화시키지 않았다.
실시예 5
dAbs 의 SEC - MALLS 분석
항원-특이적 dAbs는 이들의 용액 상태에 대해 SEC-MALLS (크기-배제 크로마토그래피-다중-각도 레이저 빛 분산)에 의해 특징화되고 그 결과는 표 13에 도시되어 있다: DOM 10-53-474, dAb는 용액에서 모노머로 존재하는 반면, 모든 DOM9 dAbs (DOM9-112-210, DOM9-155-25, DOM9-155-147 및 DOM9-155-154)는 안정한 다이머(및 일부는 대신 테트라머)를 형성할 수 있다.
5.1. 단백질의 제조
샘플을 정제하고 적절한 완충용액, 예컨대 PBS안으로 투석시켰다. 투석 후 샘플을 여과하고 농도를 측정하였다(0.43mg/ml DOM-155-25), (1.35mg/ml DOM9-155-147) 및 1.4mg/ml DOM9-155-159). DOM10-53-474 및 DOM9-112-210를 1 mg/ml으로 조절하였다.
BSA를 시그마사(Sigma)로부터 구매하고 추가 정제없이 사용하였다.
5.2. 크기-배제 크로마토그래피 및 감지기 설정
오토샘플러(SIL-20A)를 동반한 시마즈(Shimadzu) LC-20AD 프로미넌스(Prominence) HPLC 시스템 및 SPD-20A 프로미넌스 UV/Vis 감지기를 와이엇 미니 다운 트레오스(Wyatt Mini Dawn Treos) (MALLS, 다중 각도 레이저 빛 분산 감지기) 및 와이엇 미니 옵티랩(Wyatt Optilab) rEX DRI(미분 굴절률) 감지기에 연결시켰다. 상기 감지기를 하기 순서로 연결하였다-LS-UV-RI. 상기 두 Rl 및 LS 장비는 488nm 파장에서 작동하였다. 5OmM 인산염 완충용액(염 없음)의 이동상, 또는, 1×PBS(상기 둘 모두 pH 7.4)를 동반한 TSK2000 (Tosoh 법인) 컬럼을 사용하였다(실리카-기반 HPLC 컬럼). 사용된 유동 속도는 0.5 또는 1 ml/분이고, 전개(run) 속도는 상이한 유동 속도를 반영하여 조절되었고(45 또는 23분), 분자의 분리에 상당한 영향을 미칠것으로 기대되지 않았다. 단백질을 1 mg/ml의 농도로 완충용액에서 제조하였고, 주입량은 100㎕이었다.
5.3 감지기 보정
빛-분산 감지기는 제조자의 지시사항에 따라 톨루엔으로 보정되었다.
5.4. BSA 를 이용한 감지기 보정
UV 감지기 출력 및 RI 감지기 출력을 빛 분산 기계에 연결시켜 세개의 감지기 모두로부터의 신호가 동시에 와이엇 아스트라(Wyatt ASTRA) 소프트웨어로 수집되도록 할 수 있다. PBS의 이동상(1 ml/min)으로 몇가지 BSA를 주입하는 것은 상기 와이엇 소프트웨어에 의해 수집된 UV, LS 및 RI 신호와 함께 Tosoh TSK2000 컬럼을 거쳐 전개된다. 그 후 상기 흔적은 ASTRA 소프트웨어를 이용하여 분석되고, 상기 신호는 제조업자의 지시사항에 따라 밴드 확장(band broadening)을 보정하고 정렬되어 표준화된다. 그 다음 보정 상수를 평균화하고 추가 샘플 전개를 위해 사용된 주형에 입력한다.
5.5. 절대 몰 질량 계산
각 샘플 100㎕을 적절히 프리-평형화된(pre-equilibrated) 컬럼에 주입하였다. SEC 컬럼 후, 상기 샘플을 3개의 온-라인 감지기를 통해 통과시켰다 - 절대 몰질량 측정이 가능한 UV, MALLS(다중-각 레이저 빛 분산) 및 DRI (미분 굴절률). 컬럼상에서 수행된 희석은 약 10배이고, 용액상태에서의 농도는 적절하게 결정되었다.
배치 샘플 모드에서 종종 전개되는, 아스트라(ASTRA)를 비롯한 짐(Zimm) 작도 기술에서 계산은 하기 짐의 방정식에 기초한다[J. Chem. Phys. 16, 1093-1099 (1948)].
Figure pct00023
상기 식에서,
● c는 용매 내 용질 분자의 질량 농도(g/mL)
● M은 중량 평균 몰 질량(g/mol)
● A2는 제 2 비리얼 계수(mol mL / g2 )
●
Figure pct00024
는 광학계수로서, n 0 은 입사광(진공) 파장에서 용매의 굴절률이고, Io 는 입사광(진공) 파장이고, 나노미터로 표현되었으며, N A 는 아보가드로 숫자이고, 6.022 x 1023 mol-1과 동일하며, dn / dc는 용질 농도 변화에 관한 용매-용질 용액의 미분 굴절률 증분이고, mL/g로 표현되었다(이 인자는 dRI 감지기를 이용하여 독립적으로 측정되어야 한다).
● P(q)는 이론적으로-유도된 형태 인자이고,
Figure pct00025
과 대략적으로 동일하며, 여기서
Figure pct00026
, 및 <r2>는 평균 제곱 반지름이다. P(q)는 분자의 z-평균 크기, 모양 및 구조의 함수이다.
● Rq는 레일리 초과 비율이다(cm-1).
상기 방정식은 수직으로 편광된 입사광선으로 추정하고 c2를 구하는데 유효하다.
Figure pct00027
에 맞춘, 짐 피트 방법(Zimm fit method)을 이용한 계산을 수행하기 위해, 방정식 1의 역수를 c에 관한 1차식으로 전개하는 것이 필요하다:
Figure pct00028
에 맞춘, 짐 피트 방법을 이용해 계산을 수행하기 위해, 방정식 1의 역수를 c에 관한 1차식으로 전개하는 것이 필요하다:
Figure pct00029
이 경우 적합한 결과는
Figure pct00030
및
Figure pct00031
이고, 여기서
Figure pct00032
이다.
상기 계산은 ASTRA 소프트웨어에 의해 자동적으로 수행되었고, 각 조각에 대해 결정된 몰질량과 함께 플로팅되었다[Astra 메뉴얼].
크로마토그램상 관찰된 각 피크에 대한 플롯으로부터 획득한 몰질량을 단백질의 단일 단위의 예측된 분자 질량과 비교하였다. 이것은 상기 단백질의 용액-내 상태에 대한 결과를 형성하는 기초를 제공한다. 대표적인 데이타는 표 13에 도시되어 있다.
표 13: 요약
Figure pct00033
DOM10 -53-474
용액 내 모노머 상태를 나타내는 ~14kDa로 정의된 평균 몰질량과 단일 피크가 도 29에 도시되어 있다.
DOM9 -112-210
용액 내 다이머 상태를 나타내는 30 kDa로 정의되는 몰질량과 단일 피크가 도 30에 도시되어 있다.
DOM9 -155-25
훌륭한 대칭적 피크이나 상기 완충용액에 앞서 전개되었다. 이 피크의 중간이 몰질량 측정에 사용되었다(세개의 모든 신호가 오버레이된(overlaid) 하기 도면 참조). 몰질량은 다이머 dAb를 나타내는 28 kDa이고, 도 31에 도시되어 있다. 세개의 신호 모두가 오버레이되어 있다(도 32).
DOM9 -155-147
주요 피크는 오른쪽 부분의 피크를 걸쳐 26kDa의 몰질량에 배정되어 있고 피크의 왼쪽 부분으로 최대 53kDa까지 가파르게 증가하고 있다. 상기 피크 대부분은 빠른 평형 내에서 다이머 및 테트라머의 작은 분획를 나타내는 것 같다. 7.6분에서 용리한 훨씬 더 작은 피크는 몰질량 51kDa을 가진 테트라머 단백질을 나타낸다(도 33).
DOM9 -155-159
단백질은 용액 내에서 다이머 상태를 나타내는 ~28kDa에 배당된 평균 몰질량과 함께 단일 대칭 피크로 전개한다(도 34).
SEC - MALLS 에 의한 MW 배당에 대한 제어
상기 제시된 각 실험에 대한 각각의 BSA 전개는 예측된 MW, 예컨대, 몰질량 67 및 145kDa (모노머 및 다이머)를 지니는 2개의 피크를 발생시킨다(도 35).
실시예 6
삼중특이적 mAbdAbs 의 생성
어셈블리 PCR에 의한 VH 및 VL 서열을 생성하고 기존 mAbdAb 발현 벡터내로 클로닝 함으로서, 또는 mAb 발현 벡터로부터 기존 VH 및 VL 영역을 기존 mAbdAb 발현 벡터내로 서브-클로닝함으로서, 삼중특이적 mAb-dAbs를 작제하여, 발현될 경우 상기 삼중특이적 mAbdAb가 중쇄 및 경쇄의 C-말단 두가지 모두에 부착된 dAbs를 가지도록 하였다.
링커 서열은 도메인 항체를 중쇄 CH3 또는 경쇄 CK에 연결시키는데 사용하였다. 삼중특이적 mAbdAb 분자의 개열 구성도는 도 36에 도시되어 있다(mAb 중쇄는 회색으로 도시하였고, mAb 경쇄는 흰색으로 도시하였고; dAbs는 검게 도시하였다).
삼중특이적 mAbdAb 중쇄(상단 그림) 및 삼중특이적 mAbdAb 경쇄(하단 그림)의 작제물을 설명한 개열 구성도가 하기에 도시되어 있다.
Figure pct00034
중쇄의 경우, 용어 'VH'는 모노클로날 항체 가변 중쇄 서열이고; 'CH1 , CH2 및 CH3'는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 서열이고; '링커'는 사용된 특정 링커 영역의 서열이고; 'dAb'는 도메인 항체 서열이다. 경쇄의 경우, 'VL'은 모노클로날 항체 가변 경쇄 서열이고; 'CK'는 인간 경쇄 불변 영역 서열이고; '링커'는 사용된 특정 링커 영역의 서열이고; 'dAb'는 도메인 항체 서열이다.
포유류 아미노산 신호 서열(SEQ ID NO: 64에 도시됨)을 이 작제물의 생성에 사용하였다.
6.1 삼중특이적 항- IL18mAb -항- IL4dAb -항- IL13dAb
항-인간 IL-4 도메인 항체(DOM9-1 12-210)를 엔코딩하는 서열을 중쇄를 엔코딩하는 서열에 접목시키고, 항-IL13 도메인 항체(DOM 10-53-474)를 엔코딩하는 서열을 항-인간 IL-18 인간화 모노클로날 항체의 경쇄를 엔코딩하는 서열에 접목시킴으로서, 삼중특이적 항-IL18mAb-항-IL4dAb-항-IL13dAb(또한 IL18mAb-210-474로도 알려짐)를 작제하였다. G4S 링커를 모노클로날 항체의 중쇄에 항-IL4 도메인 항체를 연결하는데 이용하였다. G4S 링커를 또한 모노클로날 항체의 경쇄에 항-IL13 도메인 항체를 연결하는데 이용하였다.
IL18mAb-210-474를 CHOK1 세포 상층액에서 일시적으로 발현시키고, 상기 세포 상층액 내 IL18mAb-210-474의 정량에 이어, 다수의 IL-18, IL-4 및 IL-13 결합 분석에서 분석하였다.
Figure pct00035
6.2 삼중특이적 항- IL5mAb -항- IL4dAb -항- IL13dAb
항-인간 IL-4 도메인 항체 DOM9-112-210를 엔코딩하는 서열(SEQ ID NO: 4)을 항-인간 IL-5 인간화 모노클로날 항체의 중쇄를 엔코딩하는 서열(SEQ ID NO: 65)에 접목시키고, 항-IL13 도메인 항체 DOM 10-53-474를 엔코딩하는 서열(SEQ ID NO: 5)을 항-인간 IL-5 인간화 모노클로날 항체의 경쇄를 엔코딩하는 서열(SEQ ID NO: 66)에 접목시킴으로서, 삼중특이적 항-IL5mAb-항-IL4dAb-항-IL13dAb(Mepo-210-474로도 알려짐)를 작제하였다. G4S 링커를 모노클로날 항체의 중쇄에 항-IL4 도메인 항체를 연결하는데 이용하였다. G4S 링커를 또한 모노클로날 항체의 경쇄에 항-IL13 도메인 항체를 연결하는데 이용하였다.
이 mAbdAb를 CHOK1 및 HEK293-6E 세포 상층액에서 일시적으로 발현시키고, 상기 세포 상층액의 정량에 이어, 다수의 IL-4, IL-5 및 IL-13 결합 분석에서 분석하였다.
Figure pct00036
6.3 모노클로날 항체, 도메인 항체 및 링커의 서열
삼중특이적 mAbdAbs를 생성하는데 사용된(또는 하기 실시예에서 조절제(control reagents)로 사용된) 모노클로날 항체, 도메인 항체 및 링커의 서열이 하기 표 14에 도시되어 있다.
표 14
Figure pct00037
성숙한 인간 IL-4 아미노산 서열(신호 서열 없음)이 SEQ ID NO: 62에 제시되어 있다.
성숙한 인간 IL-13 아미노산 서열(신호 서열 없음)이 SEQ ID NO: 63에 제시되어 있다.
6.4 삼중특이적 mAbdAbs 의 발현 및 정제
삼중특이적 mAbdAb 분자를 엔코딩하는 DNA 서열을 포유류 발현 벡터(RIn, RId or pTT) 내에서 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 클로닝하였다. 상기 삼중특이적 mAbdAb 발현 작제물을 1개 또는 2개의 CHOK1 또는 HEK293-6E 세포로 일시적으로 형질감염시키고, 작은 규모로 발현시켰다(3mls 내지 15Omls). 삼중특이적 mAbdAbs를 생성하는데 사용된 발현 절차는 통상적으로 모노클로날 항체를 발현시키는데 사용된 절차와 동일하다. 일부 작제물을 고정된 단백질 A 컬럼를 이용해 정제하고, 280nm에서의 흡광도 판독에 의해 정량화하였다.
실시예 7
ELISA 에 의한 인간 IL -4, 인간 IL -13 및 인간 IL -18에의 삼중특이적 mAbdAbs 의 결합.
7.1 ELISA 에 의한 IL -4, IL -13 및 IL -18에의 IL -18 mAb -210-474의 결합
실시예 6에 기재된 바와 같이 제조된 삼중특이적 mAbdAb IL 18mAb-210-474(상층액)(SEQ ID NO: 69 및 70)을 직접 결합 ELISA(방법 1, 2 및 3에 기재됨)으로 인간 IL-18, 인간 IL-13 및 인간 IL-4에 결합에 대해 테스트하였고, 이 데이타를 도 37, 38 및 39 각각에 도시하였다(IL18mAb-210-474는 여러 회수에 걸쳐 제조되고 테스트되었다- 이하 도면에서 샘플 1, 샘플 2, 샘플 3 등으로 불림)
이 도면은 IL18mAb-210-474가 ELISA에 의해 IL-4, IL-13 및 IL-18에 결합함을 도시하고 있다. 정제된 항-인간 IL18 mAb은 IL-18 결합에 대한 양성 대조군으로서 IL-18 결합 ELISA에 포함되었다. dAb는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에, 항-IL-4 dAb(DOM9-112-210)는 IL- 4 결합 ELISA에서 테스트되지 않았고; 대신, 정제된 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 IL-4 결합을 설명하기 위해 ELISA 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었다. dAb는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에, 항-IL-13 dAb (DOM10-53-474)는 IL-13 결합 ELISA에서 테스트되지 않았고; 대신, 정제된 항-인간 IL-13 mAb가 IL-13 결합을 설명하기 위해 ELISA 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었다. 도면에서 보여지듯이, 무관한 항원에 대한 음성 대조군 mAbs이 각 결합 ELISA에 포함되었다.
각각의 ELISA에서 IL18mAb-210-474 샘플 5에 대한 결합 곡선은 다른 IL18mAb-210-474 샘플에 대한 결합 곡선과 분리되어 있다. 이 이유는 아직 알려지지 않았으나, 이는 이 특정 IL18mAb-210-474 샘플 5에 대한 인간 IgG 정량 ELISA에서의 정량 문제 때문일 것이다.
7.2 ELISA 에 의한 Mepo -210-474의 IL -4 및 IL -13에의 결합
섹션 1에 기재된 바와 같이 제조된 삼중특이적 mAbdAbs Mepo-210-474(상층액)(SEQ ID NO: 71 및 72)를 직접 결합 ELISA(방법 1 및 2 각각에 기재된 바와 같이)에서 인간 IL-13 및 인간 IL-4에의 결합에 대해 테스트하고, 이 데이타를 도 40 및 41 각각에 도시하였다(Mepo-210-474를 4배로 하여 제조하고 테스트하였으며, 이하에서 샘플 1, 샘플 2, 샘플 3 및 샘플 4로 불림).
이 도면은 Mepo-210-474가 ELISA에 의해 IL-4 및 IL-13에 결합함을 설명한다. dAb가 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에 항-IL-4 dAb(DOM9-112-210)는 IL-4 결합 ELISA에서 테스트되지 않았고; 대신, 정제된 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)이 이 ELISA에서 IL-4 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로 사용되었다. dAb가 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에 항-IL-13 dAb (D0M10-53-474)는 IL-13 결합 ELISA에서 테스트되지 않았고; 대신, 정제된 항-인간 IL-13 mAb이 상기 ELISA에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로 포함되었다. 도 40 및 41에 도시한 바와 같이, 무관한 항원에 대한 음성 대조군 mAbs을 각 결합 ELISA에 포함하였다.
Mepo-210-474 샘플 1 및 샘플 2를 한개의 일시적 형질감염 실험에서 제조하였고, Mepo-210-474 샘플 3 및 샘플 4는 또다른 별개의 일시적 형질감염 실험에서 제조하였다. 4개의 샘플 전부는 IL-13 및 IL-4 in IL-13 및 IL-4 결합 ELISA에 결합하였다. 그러나, 샘플 1와 2 대 샘플 3과 4의 상이한 결합 프로파일에 대한 이유는 알려지지 않았으나, 각 형질감염 실험에서 생성된 mAbdAb(상층액 내)의 질의 차이점을 반영한 것일 수 있다.
실시예 8
표면 플라즈몬 공명( BIAcore ™)에 의한 삼중특이적 mAbdAbs 의 인간 IL -4, 인간 IL -5, 인간 IL -13 및 인간 IL -18에의 결합
8.1 BIAcore ™에 의한 IL -18 mAb -210-474의 IL -4, IL -13 및 IL -18에의 결합
실시예 6.1에 기재된 바와 같이 제조된 삼중특이적 mAbdAb IL18mAb-210-474 (상층액)(SEQ ID NO: 69 및 70)을 BIAcore™ 를 이용하여(방법 4, 5, 6 각각에 기재된 바와 같이) 25℃에서 인간 IL-4, 인간 IL-13 및 인간 IL-18의 결합에 대해 테스트하였다. 포획 수준은 대략적으로 400 내지 850 반응 단위의 범위 이내였다. 각 분석물질의 세가지 농도가 테스트되었다(256, 32 및 4nM). 결과 데이타는 표 15에 도시되어 있다(샘플은 세배로 하여 제조되고 테스트 되었으며, 이하에서 샘플 1 , 샘플 2 및 샘플 3으로 불림).
표 15
Figure pct00038
Figure pct00039
* 양성해리 효과(positive dissociation effects) 및 BIAcore™ 기술의 민감도 수준 때문에 KD 측정이 불가능함.
상기 삼중특이적 mAbdab는 BIAcore™를 이용하여 IL-4, IL-13 및 IL-18에 결합하였다. IL-18에 대한 mAbdAb의 결합 친화력은, 이 분석에서 IL-18 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되고 mAbdab의 결합 친화력을 직접적으로 비교하기 위한 정제된 항-인간 IL18 mAb 단독의 결합 친화력과 대략 동일하였다. 이 삼중특이적 mAbdAb의 D0M9-112-210 성분이 IL-4에 매우 타이트하게 결합하여 오프-속도가 BIAcore™를 이용해 측정하기에 너무 작았기 때문에, IL-4에 대한 mAbdab의 절대적 결합 친화력을 측정하는 것이 불가능하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-4 dAb 단독(D0M9-1 12-210)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 이 분석에서 IL-4 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 포함되었다. 도 40 및 41에 도시한 바와 같이, 무관한 항원에 대한 음성 대조군 mAbs을 각 결합 ELISA에 포함하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 포함되었다.
8.2 BIAcore ™에 의한 Mepo -210-474의 IL -4, IL -5 및 IL -13에의 결합
실시예 6.2(SEQ ID NO: 71 및 72)에 기재된 바와 같이 제조된 삼중특이적 mAbdAb Mepo-210-474(상층액)을 BIAcore™를 이용하여 25℃에서(방법 5, 11 및 4 각각에 기재한 바와 같이) 인간 IL-4, 인간 IL-5 및 인간 IL-13에 결합에 대해 테스트하였다. 포획 수준은 대략적으로 550 내지 900 반응 단계의 범위 이내였다. IL-4 및 IL-13 결합의 경우 각 분석 물질의 5개의 농도가 테스트되었다(256, 64, 16, 4 및 1 nM). IL-5 결합의 경우 각 분석 물질의 4개의 농도가 테스트되었다(64, 16, 4 및 1 nM). 이 결과 데이타는 표 16에 도시되어 있다.
표 16
Figure pct00040
Figure pct00041
Mepo-210-474는 BIAcore™를 이용하여 IL-4, IL-5 및 IL-13에 결합하였다. IL-5에 대한 Mepo-210-474의 결합 친화력은, 이 분석에서 IL-5 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되고 Mepo-210-474의 결합 친화력을 직접적으로 비교하기 위한, 정제된 항-인간 IL5 mAb(Mepolizumab) 단독의 결합 친화력과 대략적으로 동일하다. 이 삼중특이적 mAbdAb의 D0M9-112-210 성분이 IL-4에 매우 타이트하게 결합하여 오프-속도가 BIAcore™를 이용해 측정하기에 너무 작았기 때문에, IL-4에 대한 Mepo-210-474의 절대적 결합 친화력을 측정하는 것이 불가능하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-4 dAb 단독(D0M9-112-210)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 이 분석에서 IL-4 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 포함되었다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 포함되었다.
실시예 9
화학량론
9.1 BIAcore ™를 이용한 IL -4, IL -13 및 IL -18에의 IL -18 mAb -210-474 결합 화학량론
IL18mAb-210-474(섹션 1에 기재된 바와 같이 제조된 CHO 세포 현탁액 내)(SEQ ID NO: 69 및 70)를 BIAcore™를 이용하여(방법 7에 기재된 바와 같이) IL-4, IL-13 및 IL-18에 대한 결합 화학량론에 대해 평가하였다. 이 데이타는 표 17에 기재되어 있다(R-맥스(max)는 포화된 결합 반응이고, 방법 7에서 주어진 공식에 따라서, 화학량론 계산시 필수적이다). 각 사이토카인의 농도는 50OnM이었다. 주입 위치는 각 사이토카인이 첨가되는 순서와 관련이 있었다.
표 17
Figure pct00042
Figure pct00043
상기 화학량론 데이타는 IL18mAb-210-474가 IL-18의 두 분자, IL-13의 두 분자 및 IL-4의 단지 한 분자에 대략적으로 결합함을 나타내었다. 항-IL4 dAb 단독(DOM9-112-210)은 용액 상태에서 다이머로 존재한다고 알려져 있고 IL-4의 한 분자에 결합할 수 있다. 따라서 IL18mAb-210-474가 IL-4의 단지 한 분자에 결합할 것이라고 예상하지 못한바는 아니다. 상기 데이타는 테스트된 분자가 예상된 수의 IL-18, IL-13 및 IL-4 분자에 의해 충분히 차지될 수 있었다는 것을 나타내었다. 상기 화학량론 데이타는 또한, 사이토카인의 포획 순서는 사이토카인의 첨가 순서에 독립적인 것으로 보임을 나타내었다.
실시예 10
10.1 이중 표적화 항- TNF /항- EGFR mAbdAb 의 생성
이 이중 표적화 mAbdAb는 dAb를 mAb 중쇄의 C-말단에 융합시킴으로서 작제하였다. 항-TNF mAb 중쇄 및 경쇄 발현 카세트는 이미 작제해 두었다. 클로닝에 사용된 제한 부위는 하기(도 42)에 제시되어 있다.
dAb 삽입을 위한 제한 부위를 중쇄에 도입시키기 위해, 위치 지정 돌연변이 발생이 mAb 중쇄 발현 벡터를 이용하여 주형으로서 SalⅠ 및 HindⅢ 클로닝 부위 생성하는데 사용되었다. 그 다음 항-EGFR dAb (DOM16-39-542)를 코딩하는 DNA를 PCR(SalⅠ 및 HindⅢ 말단을 코딩하는 프라이머를 이용하여)에 의해 증폭시키고, 개질된 3' 코딩 영역에 삽입하여, mAb 및 dAb 사이의 'STG'(세린, 트레오닌, 글리신) 링커를 생성하였다.
서열 확인된 클론(경쇄 및 중쇄 각각에 대해 SEQ ID NO: 170 및 169)을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따른 퀴아젠 메가 프렙 키트(Qiagen Mega Prep Kit)를 이용하여 대규모로 제작하였다. 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 73 및 74)를 공동-형질감염시킴에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여, mAbdAbs를 포유류 HEK293-6E 세포에서 발현시켰다.
10.2 이중 표적화 항- TNF /항- EGFR mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
확립된 프로토콜에 따라 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 항-TNF/항-EGFR mAbdAb를 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터의 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플의 SDS-PAGE 분석(도 43)은 ~17OkDa에 비-환원된(non-reduced) 샘플 전개를 나타낸 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 ~25 및 ~6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-TNF/항-EGFR mAbdAb를 프리-평형화된 슈퍼덱스(Superdex)-200 10/30 HR 컬럼(Akta Express FPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 0.5ml/분으로 PBS에서 전개하였다. 상기 SEC 프로파일은 대칭 피크로서 단일 종류 전개를 나타낸다(도 44).
10.3 이중 표적화 항- TNF /항- EGFR mAbdAb 의 결합 친화력
EGFR 및 TNF에의 결합 친화력은 방법 13 및 14 각각에 기재된 바에 의해 측정하였다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 분석하였다. 효능값(Potency values)은 시그모이드 도스 반응 곡선(sigMoldal dose response curve)을 이용하여 측정하고 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 이 mAbdAb의 항-EGFR 효능(도 45)는 39.1 nM로 계산된 반면, 대조군, 항-EGFR mAb는 3.4nM의 EC50 값을 나타내었다. 항-TNF 생물분석(도 46)에서, mAbdAb의 효능은 3pM (0.0028nM)인 반면, 항-TNF 대조군 mAb는 104pM의 EC50를 생산하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 10의 작제물, 이중 표적화 항- TNF/항-EGFR mAbdAb이 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
10.4 이중 표적화 항- TNF /항- EGFR mAbdAb 의 래트 ( Rat ) PK
래트 내에서 이의 생체 내 약물동역학 특성에 대해 이 분자를 테스트하였다. 항-TNF/항-EGFR mAbdAb를 세 마리의 래트 생체 내 및 7일(168시간)에 거쳐 수집한 혈청 샘플에 투여하였다. 투여 후 다양한 시간에서 남아있는 약물의 농도를 TNF & EGFR 두가지에 대한 ELISA에 의해 평가하였다. 결과는 도 125에 도시되어 있다.
PK 파라미터들로 이 분자가 비개질된 아달리무맙(adalimumab)에서 이미 관찰된 것과 같이(125시간) 동일한 영역에서, 긴 반감기를 갖는다는 것이 확증되었다. 추가 상세한 설명은 표 17.1에 도시되어 있다.
표 17.1
Figure pct00044

실시예 11
11.1 이중 표적화 항- TNF /항- VEGF mAbdAb 의 생성
항-TNF/항-VEGF mAbdAb를 실시예 10에 기재된 유사한 방법을 이용하여 생산하였다. 중쇄 발현 카세트의 작제의 경우, 실시예 10의 중쇄를 엔코딩하는 벡터 DNA를 개시 지점으로 하였다. 제한 효소 SalⅠ 및 HindⅢ을 이용해 항-EGFR dAb를 적출하였다. DOM15-26-593, 항-VEGF dAb를 PCR(SalⅠ 및 HindⅢ 말단을 코딩하는 프라이머를 이용하여)에 의해 증폭시키고, 동일한 제한 효소를 이용하여 이미 적출한 항-EGFR dAb를 가진 벡터 백본 안으로 라이게이션시켜서, mAb 및 dAb 사이의 'STG'(세린, 트레오닌, 글리신) 링커를 생성하였다.
서열 확인된 클론(경쇄 및 중쇄 각각에 대해 SEQ ID NO: 169 및 168)을 선택하고, 대규모 DNA 제조물을 제작하고, 항-TNF/항-VEGF mAbdAb를 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 73 및 75)를 공동-형질감염시킴에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여, 포유류 HEK293-6E 세포에서 발현시켰다.
11.2 이중 표적화 항- TNF /항- VEGF mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
확립된 프로토콜에 따라 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 항-TNF/항-VEGF mAbdAb(DMS4000 지정됨)를 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터의 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플의 SDS-PAGE 분석(도 47)은 ~17OkDa에서 비-환원된(non-reduced) 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 ~25 및 ~6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-TNF/항-VEGF mAbdAb를 프리-평형화된 슈퍼덱스(Superdex)-200 10/30 HR 컬럼(Akta Express FPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 0.5ml/분으로 PBS에서 전개하였다. 상기 SEC 프로파일은 대칭 피크로서 단일 종류 전개를 나타낸다(도 48).
11.3 이중 표적화 항- TNF /항- VEGF mAbdAb 의 결합 친화력
VEGF 및 TNF에의 결합 친화력을 방법 12 및 14 각각에 기재된 바와 같이 측정하였다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하고, 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 이 mAbdAb의 항-VEGF 효능(도 49)이 57pM로 계산된 반면, 대조군, 항-VEGF mAb는 366pM의 EC50 값을 나타내었다. 항-TNF 생물분석(도 50)에서, 상기 효능은 10pM인 반면, 항-TNF 대조군 mAb는 22pM의 EC50를 생성하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 11의 분자, 이중 표적화 항-TNF/항-VEGF mAbdAb이 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
11.4 이중 표적화 항- TNF /항- VEGF mAbdAb 의 래트 ( Rat ) PK
래트 내에서 이의 생체 내 약물동역학 특성에 대해 이 분자를 테스트하였다. 항-TNF/항-VEGF mAbdAb를 세 마리의 래트 생체 내 및 10일(240시간)에 거쳐 수집한 혈청 샘플에 투여하였다. 투여 후 다양한 시간에서 남아있는 약물의 농도를 TNF & EGFR 두가지에 대한 ELISA에 의해 평가하였다. 결과는 도 126에 도시되어 있다.
PK 파라미터들로 이 분자가 비개질된 아달리무맙(adalimumab)의 생체내 약물동역학 특성과 비교하여 대등한 생체내 약물동역학 특성을 갖는다는 것이 확증되었다. VEGF 성분의 경우 더 짧게 관찰된 t1 /2β는 중요한 것으로 간주되지 않고, 분석 인공물(assay artefact)일 수 있다. 추가 상세한 설명은 표 17.2에 도시되어 있다.
표 17.2
Figure pct00045
11.5 대안적 항- TNF /항- VEGF mAbdAb 의 생성
대안적 항-TNF/항-VEGF mAbdAb를 중쇄의 C-말단에서 STG 링커를 이용하여 VEGF dAb에 연결된 동일한 항-TNF mAb을 이용하여, 상기 실시예 11.1에 기재된 유사한 방법으로 작제하였다. 이 경우 사용된 항-VEGF dAb는 DOM15-10-11이었다. 이 분자는 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 73 및 185)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 발현되었다. 이 분자는 실시예 11.2에 기재된 것과 유사한 발현 수준의 mAbdAb를 갖도록 발현되었으나, 실시예 11.3에 기재된 바와 같은 동일한 VEGF 분석에서 효능에 대해 테스트 되었을 때, VEGF 수용체에 VEGF의 결합을 억제하는 수준이 이 분석에서 감지될 수 없는 정도라는 사실이 발견되었다.
실시예 12
12.1 이중 표적화 항- VEGF /항- IL1 R1 dAb -연장된 IgG 의 생성
더미(Dummy) V 도메인 코딩 영역을 dAb와 상기 두 쇄의 불변 영역 사이에 삽입하는 전략에 이어 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 두개의 이중 표적화 dAb-연장된 IgG 분자를, 작제하였다
경쇄의 경우, 항-IL1 R1 dAb DOM4-130-54를 SalⅠ 및 BsiWI 부위를 지니는 발현 카세트(도 51)에서 미리 클로닝하여 dAb-Ck 쇄를 생성하였다. dAb-연장된 IgG 경쇄를 생성하기 위해, 더미 Vk 영역을 양쪽 말단에서 BsiWI를 코딩하는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭하였다. dAb-Ck 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 BsiWI로 절단시켰다. BsiWI 절단 더미 Vk 도메인을 상기 플라스미드에 라이게이션시켜, 두 가변 도메인 사이에 'TVAAPS' 링커를 지니는, dAb-연장된 IgG 경쇄를 생성하였다.
동일한 전략으로 dAb-연장된 IgG 중쇄를 생성하였는데, 여기서 Nhel 말단을 지니는 PCR 증폭된 더미 VH 도메인은 상기 두 가변 도메인 사이의 'ASTKGPS' 링커와 함께, dAb DOM15-26 및 CH1(도 51)에서 Nhel 다이제스트된 dAb 중쇄내로 라이게이션되었다.
이것은 지정된 DMS2090이고, SEQ ID NO: 163 (DNA 서열 SEQ ID NO: 162)에서 제시된 서열을 갖는다. 이것은 SEQ ID NO: 77 (DNA 서열 SEQ ID NO: 171)에 제시된 경쇄와 짝을 이루었다.
제 2차 중쇄를 동일한 방법이지만 dAb DOM15-26-593을 사용하여 작제하였다. 이것은 지정된 DMS2091이고, SEQ ID NO: 76(DNA 서열 SEQ ID NO: 172)에서 제시된 서열을 갖는다. 이것은 SEQ ID NO: 77(DNA 서열 SEQ ID NO: 171)에 제시된 경쇄와 짝을 이루었다.
서열 확인된 클론을 선택하고, 제조업자 프로토콜에 따라 퀴아젠 맥시 또는 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제조하였다. 작제물 결과물을 경쇄 및 중쇄의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 세포에서 발현시켰다.
12.2 이중 표적화 항- VEGF /항- IL1R1 mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
상기 두가지 항-IL1R1/항-VEGF dAb-연장된 IgG 분자를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터의 분광광도법에 의해 측정하였다. DMS2090에 대한 SDS-PAGE 분석은 도 52에 도시하였고, DMS2091에 대한 SDS-PAGE 분석은 도 53에 도시하였다. 상기 두개의 정제된 샘플은 19OkDa에서 비-환원된(non-reduced) 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 35 및 6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-VEGF/항-IL1 R1 dAb-연장된-lgG를 프리-평형화된 슈퍼덱스(Superdex)-200 10/30 HR 컬럼(Akta Express FPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 0.5ml/분으로 PBS에서 전개하였다. 상기 DMS2090(도 54) 및 DMS2091(도 55)에 대한 SEC 프로파일은 대칭 피크로서 단일 종류 전개를 나타낸다.
12.3 이중 표적화 항- VEGF /항- IL1 R1 mAbdAb 의 결합 친화력
VEGF 및 IL1R1에 대한 결합 친화력은 방법 12 및 15 각각에 기재된 바와 같이 측정되었다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고, 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 이 DMS2090의 항-VEGF 효능(도 57)이 158.4pM로 계산된 반면, 대조군, 항-VEGF mAb는 689.2pM의 EC50 값을 나타내었다. DMS2091의 항-VEGF 효능(도 56)이 55pM로 계산된 반면, 대조군, 항-VEGF mAb는 766pM의 EC50 값을 나타내었다.
항-IL1R1 생물분석에서, 상기 DMS2090의 효능(도 58)은 32pM인 반면, 항-IL1R1 대조군 mAb는 35pM의 EC50를 생성하였다. 상기 DMS2091의 효능(도 59)은 17.47pM인 반면, 항-IL1-R1 대조군 mAb는 35.02pM의 EC50를 생성하였다.
결론적으로, 분석 데이타는 실시예 12의, 이중 표적화 항-IL1R1/항-VEGF dAb-연장된 IgG가 상기 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
12.4 이중 표적화 항- VEGF /항- IL1R1 mAbdAb 래트 PK
래트 내에서 이의 생체 내 약물동역학 특성에 대해 이 분자를 테스트하였다. 항-IL1 R1/항-VEGF dAb-연장된 IgG A를 세 마리의 래트 생체 내 및 7일(168시간)에 거쳐 수집한 혈청 샘플에 투여하였다. 투여 후 다양한 시간에서 남아있는 약물의 농도를 IL1R1 & VEGF 두가지에 대한 ELISA에 의해 평가하였다. 결과는 도 127에 도시되어 있다.
PK 파라미터는 표 17.3에 도시되어 있다.
표 17.3
Figure pct00046

실시예 13
13.1 삼중 표적화 항- TNF /항- VEGF /항- EGFR mAbdAb 의 생성
mAb V 도메인 코딩 영역을 dAb와 두 쇄의 불변 영역 사이에 삽입하는 전략에 이어, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 삼중 표적화 mAb를 작제하였다
경쇄의 경우, 항-EGFR dAb DOM16-39-542를 SalⅠ 및 BsiWI 부위를 지니는 발현 카세트(도 15)에서 미리 클로닝하여 dAb-Ck 쇄를 생성하였다. mAbdAb 경쇄를 생성하기 위해, mAb VL 영역을 양쪽 말단에서 BsiWI를 코딩하는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭하였다. dAb-Ck 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 BsiWI에서 절단시켰다. BsiWI 절단된 mAb VL 도메인을 상기 플라스미드에 라이게이션시켜, mAbdAb 경쇄를 생성하였고, 이는 두 가변 도메인 사이에 'TVAAPS' 링커가 존재하는 결과를 야기시켰다.
동일한 전략으로 mAbdAb 중쇄를 생성하였는데, 여기서 Nhel 말단을 지니는 PCR 증폭된 mAb VH 영역은 dAb(DOM15-26) 및 CH1(도 60) 사이에서 Nhel 다이제스트된 dAb 중쇄내로 라이게이션되어, 상기 두 가변 도메인 사이의 'ASTKGPS' 링커를 생성하였다.
서열 확인된 클론(중쇄 및 경쇄 각각에 대해 SEQ ID NO: 78 및 79)을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따른 퀴아젠 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제작하였다. mAbdAbs를 경쇄 및 중쇄의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여, 포유류 세포에서 발현시켰다.
13.2 삼중 표적화 항- TNF /항- VEGF /항- EGFR mAbdAb 의 정제
항-TNF/항-VEGF/항-EGFR mAbdAb를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터의 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플에 대한 SDS-PAGE 분석(도 61)은 19OkDa에서 비-환원된(non-reduced) 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 35 및 6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
13.3 삼중 표적화 항- TNF /항- VEGF /항- EGFR mAbdAb 의 결합 친화력
VEGF, EGFR 및 TNF에 대한 결합 친화력은 방법 12, 13 및 14 각각에 기재된 바와 같이 측정되었다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고, 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 이 mAbdAb의 항-VEGF 효능(도 62)이 1.885mM로 계산된 반면, 대조군, 항-VEGF mAb는 0.145nM의 EC50 값을 나타내었다.
항-TNF 생물분석에서(도 63), 상기 효능은 87pM인 반면, 항-TNF 대조군 mAb는 104pM의 EC50를 생성하였다. 항-EGFR 분석에서(도 64), 상기 삼중 표적화 mAbdAb는 ~300nM에서 ~20% 저해를 발생시켰다. VEGF 및 TNF 결합에 대해 EC50값이 계산된 반면, EGFR 결합의 경우 전체 곡선은 EC50값이 계산되도록 생성되지 않았다.
실시예 14: IGF -1R/ VEGF mAbdAb
14.1 IGF -1R/ VEGF mAbdAb 의 작제
항 IGF-1 R 가변 중쇄 및 가변 경쇄 유전자 서열은 원래 중복된 올리고뉴클레오티드의 PCR로부터 새롭게 제작되었다. 이 영역을 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 인간 IgGI 또는 포유류 발현 벡터 내 카파 불변 영역에 융합시켰다. 항 VEGF 도메인 항체에 대한 유전자 서열을 이와 유사하게 중복된 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR에 의해 작제하고, 상기 기재된 항 IGF-1R 성분의 중쇄 또는 경쇄 유전자의 3' 말단에 융합하였다. 상기 융합체를 상기 항체와 도메인 항체 성분 사이의 두 개의 아미노산(GS) 링커 또는 8개 아미노산(TVAAPSGS) 링커에 통합하였다. 항체 중쇄 및 경쇄를 도메인 항체 및 링커 서열 없이 또한 작제하였다. 서열 확인된 클론을, 제조업자의 프로토콜에 따른 엔도프리 퀴아젠 맥시프렙 키트(Endofree Qiagen Maxiprep kit)를 이용한 대규모 DNA 제조를 위해 선택하였다.
서열 SEQ ID NO: 108, 109, 111 및 112에서, 항체 및 도메인 항체 사이의 링커 서열의 위치에 밑줄을 그었다. 링커를 전체적으로 제거하거나, 상이한 링커를 사용하여 대안적 변이체를 작제할 수 있었다. 다른 적합한 링커의 예를 SEQ ID NO: 6 및 8 내지 11에 제공하였다. 표 18은 작제되고 발현된 항체의 리스트를 제공한다.
표 18 - 작제되고 테스트된 항체
Figure pct00047
실시예 14.2: IGF -1 R/ VEGF mAbdAb 의 발현, 정제 및 SEC 프로파일
중쇄 및 경쇄 벡터의 조합을 일시적 형질감염된 HEK293-6E에서 발현시켰다. 간략히, 1.5x106 세포/ml의 HEK293-6E세포 50ml를 293펙틴 시약(293fectin reagent)(Invitrogen # 51-0031)으로 미리 인큐베이션시킨 25μg의 중쇄 및 25μg의 경쇄 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 37℃, 5％ CO2, 및 95% 상대 습도에서 진탕 인큐베이터에 두었다. 24시간 후, 트립톤 피드 배지를 첨가하고 상기 세포를 추가 72시간동안 성장시켰다. 원심분리에 의해 상층액을 수확하고, 0.22μm 필터를 이용해 여과시켰다. 발현된 단백질을 단백질 A 세파로스(sepharose) 컬럼을 이용해 정제하고 PBS 안에서 투석하였다. 정제된 단백질을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하고 도 65에 도시하였다.
IGF-1R 항체(HOLO)를 하기 분석에서 비교자(comparator)로 사용하였다. 이 분자는 SEQ ID NO: 110에 제시된 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 113에 제시된 경쇄 서열을 가진다.
무관한 특이성을 지니는 또다른 mAbdAb를 하기 분석에서 비교자로 사용하였다. 이 분자는 SEQ ID NO: 87에 제시된 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 13에 제시된 경쇄 서열을 갖고, 지정된 BPC1601이다.
실시예 14.3: IGF -1R 결합 ELISA
결합 ELISA는 정제된 항-IGF-1 R/VEGF mAbdAbs와 IGF-1R의 결합을 테스트하도록 수행되었다. 간략히, 1μg/ml의 항-폴리히스티딘(AbCam AB9108)으로 코팅되고, 차단 용액(트리스 완충 식염수 중 4% BSA)으로 차단된 ELISA 플레이트를 400ng/ml의 재조합 인간 IGF-1R-히스 태그(R&D 시스템 305-GR)로 PBS 내에서 로딩하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBS + 0.05% 트윈(Tween) 20(TBST)으로 세척하였다. 다양한 농도의 정제된 mAbdAbs를 비롯하여 항 IGF-1R 모노클로날 항체(HOLO) 및 무관한 mAbdAb(BPC1601)를 첨가하였고, 차단 용액으로 희석하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 차단 용액 중 1/1000 희석액에서 퍼옥시다아제 라벨링된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)를 첨가함으로서 결합을 감지하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 상기 플레이트에 OPD 기질(Sigma P9187)을 첨가함으로서 발달시키고 3M H2SO4을 첨가함으로서 발색 현상을 중지시켰다. 플레이트 리더를 이용해 490nm에서 흡광도를 측정하고 평균 흡광도를 플로팅하였다.
결합 ELISA의 결과는 도 66에 제시되어 있고, 테스트된 모든 IGF1R-VEGF mAbdAb 변이체(BPC1603-1606)가 항-IGF-1R 항체 HOLO와 비교될만한 수준으로 IGF-1R에 결합함을 나타낸다는 것을 보여주고 있다. EC50 값을 캠브리지소프트 생물분석 소프트웨어(Cambridgesoft Bioassay software)를 이용해 계산하였고 이는 하기와 같다: HOLO (0.1797μg/ml)), BPC1603 (0.1602μg/ml), BPC1604 (0.1160μg/ml), BPC1605 (0.1975μg/ml), BPC1606 (0.1403μg/ml). 무관한 대조군 이특이성 항체 BPC1601는 현재 IGF-1R와 감지가능한 결합을 함을 보여주고 있다.
실시예 14.4: VEGF 결합 ELISA
결합 ELISA는 정제된 항 IGF-1R/VEGF 이특이성 항체와 VEGF의 결합을 테스트하는데 수행되었다. ELISA 플레이트를 PBS 중 400ng/ml으로 재조합 인간 VEGF (GSK)로 코팅하고, 그 다음 차단 용액(TBS 중 4% BSA)으로 차단하였다. 차단 용액에서 희석된 다양한 농도의 정제된 mAbdAbs를 첨가하고, mAbdAb BPC1601를 음성 대조군으로서 포함하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 차단 용액 중 1/1000 희석액에서 퍼옥시다아제 라벨링된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)를 첨가함으로서 결합을 감지하였다. 상기 플레이트를 40분 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 상기 플레이트에 OPD 기질(Sigma P9187)을 첨가함으로서 발달시키고 3M H2SO4을 첨가함으로서 발색 현상을 중지시켰다. 플레이트 리더를 이용해 490nm에서 흡광도를 측정하고 평균 흡광도를 플로팅하였다.
결합 ELISA의 결과는 도 67에 제시되어 있고, 모든 네개의 항-IGF-1 R/VEGF mAbdAbs(BPC1603-1606)가 고정된 VEGF에 결합할 수 있음이 확인되었다. BPC1605 및 BPC1606의 명백히 더 낮은 결합 활성은 도메인 항체(경쇄의 C-말단에 위치함)와 감지 항체 사이를 방해하는데 기여할 수 있다. EC50값을 캠브리지소프트 생물분석 소프트웨어를 이용해 계산하였고, 이는 하기와 같다: BPC1603 (0.044μg/ml), BPC1604 (0.059μg/ml), BPC1605 (0.571μg/ml). 낮은 반응도 때문에 BPC1606에 대한 정확한 EC50값을 계산하는 것은 불가능하였다. 항-IGF-1R 항체 HOLO 및 무관한 대조군 mAbdAb BPC1601는 현재 VEGF와 감지가능한 결합을 함을 보여주고 있다.
실시예 14.5: VEGF 에의 결합 동역학
인간 IgG에 대한 마우스 모노클로날(Biacore BR-1008-39)을 1차 아민 커플링에 의해 CM5 바이오센서 칩에 고정하였다. 상기 항체 작제물을 상기 칩 표면상에 포획시켰다. 포획 후, VEGF를 상기 표면 위로 흘려주고 그 후 3M MgCl2을 이용하여 재생성시켰다. 동역학을 생성하는데 사용된 VEGF의 농도는 256, 64, 16, 4, 1 및 0.25nM이었고, 이중 참조(double referencing)를 위해 사용된 포획된 표면에 단지 완충용액만을 주입하였다. 상기 실험은 Biacore T100 기계에서 1 × HBS-EP 완충용액(BR-1006-69)을 이용해 25℃에서 수행하였다. 상기 데이타를 이 분석 소프트웨어 내에서 기계 고유의 1:1 모델에 맞추었다. 표 19에 도시한 상기 데이타는 두개의 독립된 실험에서 얻은 것이다.
표 19 - 인간 VEGF에의 결합 동역학
Figure pct00048
실시예 14.6: 수용체에의 VEGF 결합의 저해
mAbdAbs의 활성을 방법 12에 기재한 바와 같은 VEGF 수용체 결합 분석을 이용하여 측정하였다. VEGFR2에의 VEGF 결합 저해에 대한 이 분석에서 획득한 IC50는:
BPC1603 (0.037nM)
BPC1604 (0.010nM)
BPC1605 (0.167nM)
BPC1606 (0.431nM)
이었다.
이 결과로 모든 네개의 항원 결합 작제물이 수용체에의 리간드 결합을 방해한다는 것이 확인되었다.
실시예 14.7: IGF -1R 수용체 인산화의 저해
3T3/LISN c4 세포를 10000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 플레이팅하고 완전한 DMEM(DMEM-헵스 개질 +10% FCS)에서 밤새 인큐베이션하였다. 정제된 mAbdAbs를 상기 세포에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. rhlGF-1를 상기 처리된 세포에 첨가하여 최종 농도 50ng/ml을 달성하고 추가 30분 동안 인큐베이션하여 수용체 인산화를 자극시켰다. 상기 배지를 흡입한 뒤, RIPA 용해 완충용액(15OmM NaCl, 5OmM 트리스HCl, 6mM Na 데옥시콜레이트, 1% Tween 20)을 첨가함으로서 용해된 상기 세포에 프로테아제 억제자 칵테일(Roche 11 697 498 001)를 첨가하였다. 상기 플레이트를 밤새 냉동하였다. 해동 후, 각 웰로부터 온 용해물을 항 IGF-1R 포획 항체 2B9(GSK)로 미리-코팅된 96 웰 ELISA 플레이트에 2μg/ml로 옮기고 4% BSA/TBS로 차단시켰다. 상기 플레이트를 TBST(TBS+0.1% Tween 20)로 세척하고, 4% BSA/TBS 중 1/2500로 희석된 유로피움 라벨링된 항 포스포티로신 항체(PerkinElmer DELFIA Eu-NI PT66)를 각 웰에 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하고 델피아(DELFIA) 강화(PerkinElmer 1244-105) 용액을 첨가하였다. 10분 인큐베이션 후, 수용체 인산화의 수준을 유로피움 시간 분해 형광(time resolved fluorescence, TRF)을 측정하도록 설정된 플레이트 리더를 이용해 측정하였다.
상기 실험의 결과는 도 68 및 69에 제시되어 있다. 상기 결과는, mAbdAbs BPC1603-1606가 IGF-I 매개 수용체 인산화를 항-IGF-1R 모노클로날 항체 H0L0에 비교될만한 수준으로 억제할 수 있음을 확인시키고 있다. 무관한 항체(IgGI, 시그마 15154로 라벨링됨)는 이 분석에서 활성을 보이지 않았다.
실시예 15: 항- CD20 / IL -13 항원 결합 단백질
실시예 15.1 : 분자 생물학
SEQ ID NO: 117 및 120에 제시된 항-CD20 mAb의 중쇄 및 경쇄 서열을 엔코딩하는 포유류 발현 벡터를 PCR 기초 접근법 및 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 신규하게 작제하였다. 항-CD20 mAb 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 서열을, 항-인간 IL-13 도메인 항체(DOM10-53-474)에 융합한 인간 항체 불변 영역을 포함하는 포유류 발현 벡터로 클로닝함으로서 이특이성 항-CD20mAb-항-IL13dAb 중쇄 및 경쇄를 작제하였다.
상기 mAbdAb 발현 작제물을 CHOE1a 세포로 형질감염시켰다. 상층액을 수확한 후, 상기 항체를 고정된 단백질 A를 이용하여 정제하고, 280nm에서 흡광도를 판독함으로서 정량하였다. 작제되고 테스트된 mAbdAbs(및 항-CD20 대조군 mAb)는 표 20에 나열되어 있다.
표 20
Figure pct00049
실시예 15.2: 인간 IL -13에의 결합 동역학
인간 IL-13에 대한 mAbdAb 작제물의 결합 친화력을 BIAcore™ 분석에 의해 평가하였다. 분석은 항-인간 IgG 포획으로 수행되었다. 간략히, 항- 인간 IgG (Biacore BR-1008-39)는 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 커플링되었다. 그 다음 MAbdAb 작제물을 이 표면상에 포획하고 인간 IL-13(GSK가 제작 및 정제)을 정의된 농도만큼 통과시켰다. 상기 표면을 3M MgCl2를 이용하여 항-인간 IgG 표면으로 다시 재생성시켰다. 이 처리는 후속하는 IL-13 결합 사건에 대한 항체를 포획하는 능력에 중대한 영향을 미치지 않았다. 상기 실험은 BIAcore™ T100 기계에서, HBS-EP 완충용액을 이용하여 25℃에서 수행하였다. 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 데이타를 분석하고 1:1 결합 모델로 맞추었다. 이 분석의 결과는 표 48에 제시되어 있으며, 이것은 모든 mAbdAb 작제물에 대해, IL-13에의 결합 동역학이 비교가능함을 보여주고 있다.
표 48 - 표면 플라즈몬 공명(BIAcore™) 데이타
Figure pct00050
CD20에 mAb-dAbs의 결합은 CD20 양성 세포주(Wein133)를 이용한 유세포 분석에 의해 분석될 수 있다. 모든 mAb-dAbs(BPC1401-BPC1404) 및 항-CD20 대조군 항체는 평균 형광 강도(MFI)에서 용량(dose) 의존적 증가를 보였다(데이타 도시되지 않음).
실시예 15.3: 항- CD20 / IL -13 이특이성 항체를 이용한 ADCC 분석
ADCC 분석은 문헌 [Boyd et al. (1995) J. Imm. Meth. 184:29-38]에 기재된 방법에 기초하였다. 간략히, 라지 세포(Raji cells)(표적)을 하기와 같이 유로피움으로 라벨링하였다. 세포를 수확하고, 계수하고, 15ml 팔콘 튜브에서 1×107의 최종 밀도로 조제하고, 헵스 완충용액(5OmM HEPES, 83mM NaCl, 5mM KCl, 2mM MgCl2-H2O, pH7.4)으로 1회 세척하였다. 상기 세포를 펠렛화하고 1 ml의 얼음같이 찬 유로피움 라벨링 완충용액(HEPES buffer plus 600μM EuCI3, 3mM DTPA 및 25mg/ml Dextran sulphate)을 각 튜브에 첨가하였다. 상기 세포 현탁액을 라벨링 시작시 및 그 다음 차가운 상태에서의 30분 인큐베이션 기간 중 매 10분마다, 강하게 손가락으로 쳤다. 10ml의 얼음같이 찬 복구 완충용액(repair buffer)(294mg/l CaCl2.2H2O, 1.8g/l D-글루코스를 포함하는 헵스 완충용액, pH7.4)을 첨가하고 차갑게 하여 추가 10분동안 상기 세포를 인큐베이션하였다. 그 다음 상기 세포를 원심분리하고, 상층액을 디캔팅하고 복구 완충용액으로 2회 세척한 후 완전 배지로 1회 세척하였다. 그 다음 라벨링된 세포를 계수하고 2x105 세포/ml로 무혈청 배지에서 재현탁하고 차가운 상태로 두었다.
인간 정제된 혈액 단핵 세포(PBMC 또는 효과기 세포)를 하기와 같이 제조하였다. 15Omls의 전혈을 2000rpm에서 10분동안 원심분리하여 혈청을 제거하였다. 상기 세포를 PBS(Invitrogen/Gibco, #14190)를 이용해 기존 부피의 2배로 희석하였다. 아쿠스핀(Accuspin) 밀도 기울기 튜브(Sigma, #A2055-10EA)를 15ml 림포프렙(lymphoprep)(Axis shield, #NYC1 114547)을 첨가하여 제조하고, 1500rpm에서 1분동안 원심분리하였다. 25ml의 혈액 현탁액을 밀도 기울기 튜브에 첨가하고 브레이크 해제 원심분리기(centrifuge brake off)를 이용하여 2500rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층액의 상층(top) 10ml을 따라내었다. 남은 부분("버피"층 포함)을 투명 튜브에 담고, PBS로 가득 채우고, 5분동안 1500rpm에서 원심분리하였다. 상기 상층액을 따라내고, 세포 펠렛을 모으고, RPMI 배지에서 1회 세척하고, 재원심분리하고 계수하였다. 효과기 세포는 무혈정 RPMI 배지에서 5x106/ml로 제조하였다.
상기 분석 플레이트는 하기와 같이 96-웰 원형 바닥 플레이트(Nunc 96 maxisorb plate, #735-0199)로 설정하였다. 항체 희석액을 무혈청 RPMI 배지에서 대략 12μg/ml의 시작 농도로 제작하였고, 추가로 11개의 3-배 희석액을 제작하였다. 하기 제시된 플레이트를 이용하여, 50μl 항체 샘플을 적절한 웰(오직 B-G열)에 첨가하여, 희석 당 6개 복제를 허용하였다. 50μl의 RPMI 배지를 A열 및 H열 내의 전체 웰에 첨가하였다. 50μl의 RPMI 배지를 라벨링된 배지 플레이트내 모든 웰에 첨가하였다. RPMI 배지로 4μg/ml까지 희석한 50μl의 재조합 인간 IL-13(1 μg/ml의 최종 농도, GSK 자체 물질)을 +IL13 라벨링된 플레이트 내 모든 웰에 첨가하였다. 모든 플레이트를 30분동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 50μl의 유로피움 라벨링된 표적 세포를 모든 플레이트에 첨가하였다. 20μl의 10X 트리톤을 모든 플레이트 상 H열 내 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 최소 30분동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 50μl의 RPMI 배지를 표적만으로 라벨링된 컬럼 내 모든 웰에 첨가하였다. 50μl PBMCs를 효과기:표적이 25:1 비율로 라벨링된 컬럼 내 모든 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1500rpm에서 3분동안 원심분리하고 3-4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 200μl의 강화 용액(Wallac/Perkin Elmer, Catalogue# 1244-105)을 nunc 면역흡착 ELISA 플레이트(nunc immunosorbant ELISA plates)의 각 웰(각 분석 플레이트에 대한 1 ELISA 플레이트)에 첨가하였다. 20μl의 상층액을 분석 플레이트로부터 ELISA 플레이트로 옮겼다. 상기 ELISA 플레이트를 실온에서 플레이트 진탕기에서 최소 30분동안 인큐베이션하거나 밤새 4℃에서 두었다. 시간-지연 형광분석법(time-delayed fluorimetry)(Wallac Victor 플레이트 리더)을 이용하여 유로피움 방출을 측정한다. 자발적 용해 = 세포 및 배지 단독에서 방출된 유로피움의 측정. 최대 용해 = 트리톤 X100(비-이온성 세제)를 첨가함으로서 표적 세포의 비-특이적 용해.
Figure pct00051
ADCC 분석을 두개의 상이한 공여체 PBMCs를 이용한 두개의 별개의 경우로 수행하였다. 한가지 대표 분석으로부터의 결과가 도 70 및 71에 제시되어 있다. 게다가, 더 짧은 용량(dose) 범위를 이용한 유사한 ADCC 분석을 상이한 공여체 PBMCs를 이용한 별개의 경우로 수행하였다. 이 분석으로부터의 결과가 도 72 및 73에 제시되어 있다.
실시예 15.4: 항- CD20 / IL -13 이특이성 항체를 이용한 CDC 분석
WEIN 세포(표적)을 유로피움으로 하기와 같이 라벨링하였다. 간략히, 세포를 수확하고, 계수하고, 15ml 팔콘 튜브 내 최종 밀도 1x107으로 제조하였으며, 헵스 완충용액(5OmM HEPES, 83mM NaCl, 5mM KCl, 2mM MgCl2 ·H2O, pH7.4)으로 1회 세척하였다. 상기 세포를 펠렛화하고 1ml의 얼음처럼 차가운 유로피움 라벨링 완충용액(HEPES 완충용액 플러스 600μM EuCl3, 3mM DTPA 및 25mg/ml 덱스트란 설페이트)을 각 튜브에 첨가하였다. 상기 세포 현탁액을 라벨링 시작시 및 그 다음 차가운 상태에서의 30분 인큐베이션 기간 중 매 10분마다, 강하게 손가락으로 쳤다. 10ml의 얼음같이 찬 복구 완충용액(repair buffer)(294mg/l CaCl2.2H2O, 1.8g/l D-글루코스를 포함하는 헵스 완충용액, pH7.4)을 첨가하고 차갑게 하여 추가 10분동안 상기 세포를 인큐베이션하였다. 그 다음 상기 세포를 원심분리하고, 상층액을 디캔팅하고 복구 완충용액으로 2회 세척한 후 완전 배지로 1회 세척하였다. 그 다음 라벨링된 세포를 계수하고 2x105 세포/ml로 무혈청 배지에서 재현탁하고 차가운 상태로 두었다.
혈청을 인 하우스 공여체(in house donors)로부터 수집한 전혈로부터 원심분리에 의해 제거하였다. 상기 샘플의 절반을 30분동안 56℃에서 열처리하여 비활성화시켰다. 항체 샘플을 12μg/ml로 시작하여 무혈청 RPMI 배지에서 희석하였고, 5개의 추가 3배 희석액을 제조하였다. 50μl의 항체 샘플을 오직 B-G열(하기 플레이트 레이아웃 당) 내 적절한 웰에 첨가하였다. 50μl의 RPMI 배지를 컬럼 1 내지 6 내 모든 웰에 첨가하였다. 표시된 곳에서, 50μl의 재조합 인간 IL-13(RPMI 배지 중 4μg/ml)를 컬럼 7 내지 12 내 모든 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 최소 30분동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 50μl의 유로피움 라벨링된 표적 세포를 상기 모든 플레이트에 첨가하였고 플레이트를 최소 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 50μl의 혈청(활성 또는 열-비활성화됨)을 적절한 웰(하기 플레이트 레이아웃 참조)에 첨가하였다. 상기 플레이트를 인큐베이터에서 2-3시간동안 인큐베이션하고, 이 시간 후 상기 플레이트를 1500rpm으로 3분동안 원심분리하였다. 200μl의 강화 용액(Wallac/Perkin Elmer, 카탈로그# 1244-105)을 Nunc 면역흡착 ELISA 플레이트(각 분석 플레이트에 대한 1개의 ELISA 플레이트)의 각 웰에 첨가하였다. 20μl의 상층액을 분석 플레이트로부터 ELISA 플레이트로 옮겼다. 상기 ELISA 플레이트를 실온에서 플레이트 진탕기에서 최소 30분동안 인큐베이션하거나 밤새 4℃에서 두었다. 시간-지연 형광분석법(Wallac Victor 플레이트 리더)을 이용하여 유로피움 방출을 측정한다. 자발적 용해 = 세포 및 배지 단독에서 방출된 유로피움의 측정. 최대 용해 = 트리톤 X100(비-이온성 세제)를 첨가함으로서 표적 세포의 비-특이적 용해.
Figure pct00052
CDC 분석을 세개의 상이한 공여체 세라를 이용한 세개의 별개의 경우에서 수행하였다. 1개의 대표적 분석으로부터의 결과를 도 74 및 75에 나타내었으며, 항체 샘플의 CDC 활성이 IL-13의 결핍시와 비교가능함을 보여주고 있다. 과량의 IL-13 존재시, 항체 샘플 PC1401 및 BPC1402(중쇄에 융합된 도메인 항체)의 CDC 활성은 감소한 반면, BPC1403 및 BPC1404(경쇄에 융합된 도메인 항체)의 CDC 활성은 IL-13의 존재에 크게 영향을 받지 않았다.
실시예 16
16.1 대안적 골격으로 이루어진 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질의 설계 및 작제
하기 나열한, 5개의 대안적 골격을 모노클로날 항체와 결합하여, mAb-대안적 골격 이특이성 분자를 생성하였다:
● 항 VEGF 티어 리포칼린(TLPC)
● 항 HER2 아피바디(AFFI)
● 항 HER2 DARPin(DRPN)
● 항 달걀 흰자 리소자임(anti hen egg white lysozyme)(NARV)
● 항-RNaseA 카멜리드 VHH
TLPC의 단백질 서열(추가정보는 US2007/0224633 참조), AFFI의 단백질 서열(추가정보는 WO2005003156A1 참조), DRPN의 단백질 서열(추가정보는 Zahnd, C. et al. (2007), J. Mol. Biol., 369, 1015-1028 참조) 및 NARV의 단백질 서열(추가정보는 US20050043519A 참조)은 DNA에서 역-번역되었고 코돈 최적화되었다. 클로닝을 용이하게 하기 위해 N-말단의 BamHI 부위 및 C-말단의 EcoR1 부위가 이 4개의 대안적 골격상에 포함되었다.
상기 4개의 최종 대안적 골격 DNA 서열을 엔코딩하는 DNA 단편을 PCR-기반 전략 및 올리고뉴클레오티드 중복을 이용해 새롭게 작제하였다. TLPC, AFFI 및 DRPN PCR 산물을 HOLO, 항-hlGF-1R 항체의 중쇄를 포함하는 포유류 발현 벡터내에서 클로닝하였다. 결과물 DNA 서열은 중쇄의 C-말단에 TVAAPSGS 링커 또는 GS 링커에 의해 융합된 대안적 골격을 엔코딩한다. NARV PCR산물을 Pascolizumab(항-IL-4 항체)의 중쇄를 엔코딩하는 DNA를 포함하는 포유류 발현 벡터에서 클로닝하였다. 결과물 DNA 서열은 중쇄의 C-말단에 GS 링커에 의해 융합된 NARV를 엔코딩한다.
항-RNAse A 카멜리드 VHH DNA 서열을 PCR에 의해 개질하여 클로닝을 용이하게 하기 위해 5' 말단에 BamHI 부위 및 3' 말단에 EcoR1 부위를 포함하도록 하였다. 상기 PCR 산물을 Pascolizumab, 항-IL4 항체의 중쇄를 포함하는 포유류 발현 벡터에서 클로닝하였다. 결과물 DNA 서열은 중쇄의 C-말단에 GS 링커에 의해 융합된 카멜리드 VHH를 엔코딩한다.
하기 표 21은 작제된 항원 결합 단백질을 요약한 것이다.
표 21
Figure pct00053
표 21에 제시된 항원 결합 단백질의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 293펙틴(Invitrogen, 12347019)을 이용하여 HEK 293-6E 세포로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 트립톤 피드를 동일한 날 또는 그 다음날 세포 배양 각각에 첨가하였고, 최초 형질감염으로부터 약 2일 내지 6일 후 상기 상층액 물질을 수확하였다. 상기 상층액으로부터 단백질 A 컬럼을 이용하여 항원 결합 단백질을 정제하고 결합 분석에서 테스트하였다.
16.2: rhlGF -1R 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 1μg/ml의 항-히스-태그 항체(Abeam, ab9108)로 코팅하고 밤새 4℃에 보관하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 0.4μg/mL의 rhlGF-1R(R&D 시스템)을 웰 당 50μL로 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간동안 인큐베이션하고 그 다음 세척하였다. 정제된 항원 결합 단백질/항체를 차단용액에서 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다.
또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(VersaMax Tunable Microplate Reader)(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 76, 78 및 80는 ELISA 결과를 도시하고 있고, 항원 결합 단백질 BPC1803-BPC1808이 재조합 인간 IGF-1R에 결합함이 확인되고 있다. 항-IGF-1R 모노클로날 항체 HOLO 또한 재조합 인간 IGF-1R에 결합을 보였으나, 음성 대조군 항체(시그마 15154)는 IGF-1R에 결합을 보이지 않았다.
16.3: VEGF 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 0.4μg/mL의 hVEGF165(R&D 시스템)로 코팅하고 밤새 +4℃에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 정제된 항원 결합 단백질/항체를 차단용액에서 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더((Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 77은 VEGF 결합 ELISA 결과를 도시하고 있고, 이특이성 항체 BPC1803 및 BPC1804이 인간 VEGF에 결합함이 확인되고 있다. 항 VEGF 이특이성 항체 (BPC1603)는 이 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었고 VEGF에의 결합을 나타내었다. 반면 항-IGF-1R 모노클로날 항체 HOLO는 인간 VEGF에 결합을 보이지 않았다.
16.4: HER2 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 1μg/mL의 HER2(R&D 시스템)로 코팅하고 밤새 +4℃에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 정제된 항원 결합 단백질/항체를 차단용액에서 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 79 및 81은 HER2 결합 ELISA 결과를 도시하고 있고, 항원 결합 단백질 BPC1805, BPC1806, BPC1807 및 BPC1808이 재조합 인간 HER2에 결합함이 확인되고 있다. 허셉틴(Herceptin)은 이 분석에서 양성 대조군으로서 사용되었고 HER2에의 결합을 보였다. 반면 항-IGF-1R 모노클로날 항체 HOLO는 인간 HER2에 결합을 보이지 않았다.
16.5: IL -4 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 5μg/ml의 인간 IL-4로 코팅하고 밤새 4℃에 보관하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 정제된 항원 결합 단백질/항체를 차단용액에서 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 82는 상기 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 항원 결합 단백질 BPC1809이 항 IL-4 모노클로날 항체, Pascolizumab에 비교될만한 수준으로, 인간 IL-4에 결합함이 확인되고 있다. 음성 대조군 항체 (시그마 I5154)는 IL-4에 결합을 보이지 않았다.
도 84는 상기 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 항원 결합 단백질 BPC1816이 항 IL-4 모노클로날 항체, Pascolizumab에 비교될만한 수준으로, 인간 IL-4에 결합함이 확인되고 있다. 음성 대조군 항체(시그마 I5154)는 IL-4에 결합을 보이지 않았다.
16.6: RNAse A 결합 ELISA
PBS에서 희석된 5OuL의 1ug/mL RNAse A(Qiagen, 19101)를 96 웰 코스타 플레이트(96 well Costar plate)의 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 PBST로 세척하고 20OuL의 4% BSA/PBS 차단용액을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션 하고, 세척한뒤, 상기 샘플을 첨가하였다. 정제된 항체 및 항원 결합 단백질 BPC1809을 컬럼 1의 웰에 2ug/mL의 농도로 첨가한 뒤, 연속적으로 차단용액에서 플레이트에 걸쳐 1/2로 희석시켰다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션한 뒤 세척하였다. 50ul/웰의 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 1/1000 희석액으로 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션한 뒤 세척하였다. 50μl의 OPD를 각 웰에 첨가하고, 3M 황산을 이용하여 15-30분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 83은 RNAse A 결합 ELIS의 결과를 도시하고 있고, 정제된 인간 모노클로날 항체-카멜리드 VHH 이특이성 항체 BPC1809가 RNAse A에 결합함이 확인되고 있다. 반면, IL-4 모노클로날 항체 Pascolizumab 및 음성대조군(시그마 15154) 두가지는 RNAse A에 결합을 보이지 않았다.
16.7: HEL 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 5μg/ml의 HEL(Hen Egg Lysozyme, Sigma L6876)로 코팅하고 밤새 4℃에 보관하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 정제된 항체를 차단용액에서 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 85는 HEL 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 정제된 인간 모노클로날 항체-NARV 이특이성 항체 BPC1816가 HEL에 결합함이 확인되고 있다. 반면, IL-4 모노클로날 항체 Pascolizumab는 HEL에 결합을 보이지 않았다.
실시예 17
17.1 애드넥틴으로 이루어진 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질의 설계 및 작제
CT01 애드넥틴은 VEGFR2에 대해 특이적이다(더 자세한 설명은 WO2005/056764 참조). CT01 애드넥틴 단백질 서열은 DNA에서 역-번역되었고, 코돈 최적화되었다. 클론을 용이하게 하기 위해 N-말단에 BamHI 부위 및 C-말단에 EcoR1 부위를 포함하였다.
최종 CT01 DNA 서열을 엔코딩하는 DNA 단편을 PCR-기반 전략 및 올리고뉴클레오티드 중복을 이용해 새롭게 작제하였다. PCR 산물을 HOLO(항-hlGF-1R 항체)의 중쇄를 포함하는 포유류 발현 벡터내에서 클로닝하고, 상기 애드넥틴이 중쇄의 C-말단에 GS 링커 또는 TVAAPSGS 링커를 통해 융합되도록 하였다. GF-1R-VEGFR2 이특이성의 중쇄 및 경쇄의 단백질 서열은 SEQ ID NO 124, 113 및 133에 주어져 있다.
항-TNF-α 애드넥틴을 코딩하는 또다른 애드넥틴 단백질 서열(추가 설명은 US20080139791 참조)을 DNA에서 역 번역하고, 코돈 최적화하였으며, 종결 BamHI 및 EcoR1 부위를 포함하도록 개질하였고, 이미 상술한 중복 올리고뉴클레오티드 PCR 방법을 이용하여 작제하였다. PCR 산물을 Pascolizumab(항-IL-4 항체)의 중쇄를 엔코딩하는 DNA를 포함하는 포유류 발현 벡터내에서 클로닝하고, 항-TNF-α 애드넥틴을 엔코딩하는 DNA가 중쇄의 C-말단에 GS 링커 또는 TVAAPSGS 링커를 통해 융합되도록 하였다. IL-4-TNF-α 이특이성의 중쇄 및 경쇄의 단백질 서열은 SEQ ID NO 146, 147 및 15에 주어져 있다.
또한, IL-13 모노클로날 항체의 중쇄 C-말단에 융합된 TNF-α 특이적 애드넥틴을 이용한 항원 결합 단백질을 설계하였다. 예시적 단백질 서열은 SEQ ID's 134, 13 및 135에 제시되어 있다. 게다가, 항-EGFR 항체 얼비툭스(Erbitux) 및 IMC-11 F8의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 CT01의 융합을 기초로 한 이특이성 분자를 설계하였다. 설계된 예시적 단백질 서열은 SEQ ID NO: 136-145에 제시되어 있다.
상기 예시적 서열들 중, 다수의 서열을 작제하였다. SEQ ID NO 136 (얼비툭스 중쇄의 C-말단에 융합된 CT01), SEQ ID NO 144 (얼비툭스 중쇄의 N-말단에 융합된 CT01) 및 SEQ ID NO 138 (얼비툭스 경쇄의 C-말단에 융합된 CT01)을 엔코딩하는 DNA 서열을 작제하였다. 세개의 서열 전부 PCR-기초 클로닝 방법을 이용하여 작제하였으며 포유류 발현 벡터로 클로닝되었다. 하기 표 22는 설계되고/설계되거나 작제된 항원 결합 단백질을 요약한 것이다.
표 22
Figure pct00054
Figure pct00055
BPC1801 , BPC1802, BPC1822, BPC1823, BPC1812, BPC1813 및 BPC1818의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 293펙틴(Invitrogen, 12347019)을 이용하여 HEK 293-6E 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 트립톤 피드를 동일한 날 또는 그 다음날 세포 배양에 첨가하였고, 최초 형질감염으로부터 약 2일 내지 6일 후 상기 상층액 물질을 수확하였다. 어떤 경우에는 상기 상층액 물질을 결합 분석에서 시험 항목으로서 사용하였다. 어떤 경우에는 상기 상층액으로부터 단백질 A 컬럼을 이용하여 항원 결합 단백질을 정제하고 결합 분석에서 테스트하였다.
17.2: rhlGF -1R 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 1μg/ml의 항-히스-태그 항체(Abeam, ab9108)로 코팅하고 밤새 4℃에서 보관하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 0.4μg/mL의 rhlGF-1R(R&D 시스템)을 웰당 50μL로 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간동안 인큐베이션 한 후, 세척하였다. 정제된 항원 결합 단백질/항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 86는 GF-1R 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 정제된 인간 모노클로날 항체-애드넥틴 이특이성 항체(BPC1801 및 BPC 1802)가 항-IGF-1R 모노클로날 항체 HOLO에 비교될만한 수준으로 재조합 인간 IGF-1R에 결합함이 확인되고 있다. 음성 대조군 항체(시그마 15154)는 IGF-1R에 결합을 보이지 않았다.
17.3: VEGFR2 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 0.4μg/mL의 VEGFR2(R&D 시스템)로 코팅하고 밤새 +4℃에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 상기 상층액 또는 정제된 항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 87는 VEGFR2 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 정제된 인간 모노클로날 항체-애드넥틴 이특이성 항체(BPC1801 및 BPC 1802)가 재조합 인간 VEGFR2에 결합함이 확인되고 있다. 반면에, 항-IGF-1R 모노클로날 항체 HOLO는 인간 VEGFR2에 결합을 보이지 않았다.
도 172는 VEGFR2 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 항원 결합 단백질 BPC1818 및 BPC1813가 재조합 인간 VEGFR2에 결합함이 확인되고 있다. 반면에, 얼비툭스는 인간 VEGFR2에 결합을 보이지 않았다. 항원 결합 단백질 BPC1813 및 BPC1818의 경우, 상층액 중 항체의 양은 정량화되지 않았고 따라서 도 172에 제시된 데이타는 가장 깔끔한 상층 물질의 희석 인자로서 대표된다. 얼비툭스의 경우, 정제된 물질은 도 172에서 희석 인자 1에 상당하는, 시작 농도 2μg/ml로 이 분석에서 사용되었다.
도 175는 VEGFR2 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 항원 결합 단백질 BPC1812이 재조합 인간 VEGFR2에 결합함이 확인되고 있다. 반면에 얼비툭스 및 음성 대조군 시그마 IgG 15154 항체는 인간 VEGFR2에 결합을 보이지 않았다. 항원 결합 단백질 BPC1812의 경우, 상층액 중 항체의 양은 정량화되지 않았고, 따라서 도 175에 제시된 데이타는 가장 깔끔한 상층물질의 희석 인자로서 대표된다. 얼비툭스 및 시그마 IgG 15154 정제된 물질은 도 175에서 희석 인자 1에 상당하는, 시작 농도 2μg/ml로 이 분석에서 사용되었다.
17.4: IL -4 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 5μg/ml의 인간 IL-4로 코팅하고 밤새 4℃에 두었다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 상기 상층액 또는 정제된 항체/항원 결합 단백질을 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 88은 IL-4 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고 인간 모노클로날 항체-애드넥틴 이특이성 항체(BPC1823 및 BPC 1822)가 재조합 인간 IL-4에 결합함을 확인시키고 있다. 양성 대조군 항-IL-4 모노클로날 항체 Pascolizumab는 IL-4에 결합을 보이고 있고 음성 대조군 항체(시그마 15154)는 IL-4에 결합을 보이지 않았다.
이 실험을 위한 HEK 형질감염은 더 높은 항체 농도를 가진 상층 물질을 획득하기 위해 반복되었다. 도 88b는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 더 높은 농도의 상층 인간 모노클로날 항체-애드넥틴 이특이성 항체(BPC1823)가 인간 IL-4에 결합함을 도시하고 있다.
항원 결합 단백질 BPC1823 및 BPC1822의 경우, 상층액 중 항체의 양은 정량화되지 않았고 따라서 도 88 및 88b에 제시된 데이타는 가장 깔끔한 상층 물질의 희석 인자로서 대표된다. Pascolizumab 및 음성 대조군 항체(시그마 15154) 경우, 정제된 물질은 도 88 및 88b에서 희석 인자 1에 상당하는, 시작 농도 1μg/ml로 이 분석에서 사용되었다.
17.5: TNF -α 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 0.4μg/ml의 재조합 인간 TNFα(RnD 시스템 210-TA-050/CF)로 코팅하고 밤새 4℃에 두었다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 상기 상층액 또는 정제된 항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 15분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 89는 TNF-α 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 인간 모노클로날 항체-애드넥틴 이특이성 항체(BPC1823 및 BPC1822)가 재조합 인간 TNF-α에 결합함을 확인시키고 있다. 반면, 항-IL-4 모노클로날 항체 Pascolizumab는 재조합 인간 TNF-α에 결합을 보이지 않았다.
이 실험을 위한 HEK 형질감염은 더 높은 항체 농도를 가진 상층 물질을 획득하기 위해 반복되었다. 도 89b는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 더 높은 농도의 상층 인간 모노클로날 항체-애드넥틴 이특이성 항체(BPC1823)가 재조합 인간 TNF-α에 결합함을 도시하고 있다. IgG 대조군은 재조합 인간 TNF-α에 결합을 보이지 않았다.
항원 결합 단백질 BPC1822 및 BPC1823의 경우, 상층액 중 항체의 양은 정량화되지 않았고 따라서 도 89 및 89b에 제시된 데이타는 가장 깔끔한 상층 물질의 희석 인자로서 대표된다. Pascolizumab의 경우, 정제된 물질은 도 89 및 89b에서 희석 인자 1에 상당하는, 시작 농도 1μg/ml로 이 분석에서 사용되었다.
17.6: EGFR 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 0.67μg/ml의 재조합 인간 EGFR 단백질로 코팅하고 밤새 4℃에 두었다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(DPBS 완충용액 중 5% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또다른 세척 단계를 수행하였다. 항원 결합 단백질/항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1μg/mL까지 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 25분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 171는 EGFR 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 이특이성 항체 BPC1818 및 BPC1813가 재조합 인간 EGFR에 결합함을 확인시키고 있다. 양성 대조군 항체, 얼비툭스 또한 재조합 인간 EGFR에 결합을 보였다. 반면, 시그마 IgG 15154는 재조합 인간 EGFR에 결합을 보이지 않았다. 이특이성 항체 BPC1813 및 BPC1818의 경우, 상층액 중 항체의 양은 정량화되지 않았고 따라서 도 171에 제시된 데이타는 가장 깔끔한 상층 물질의 희석 인자로서 대표된다. 얼비툭스 및 음성 대조군 항체(시그마 15154)의 경우, 정제된 물질은 도 171에서 희석 인자 1에 상당하는, 시작 농도 2μg/ml 및 1μg/ml로 이 분석에서 사용되었다.
도 176은 EGFR 결합 ELISA의 결과를 도시하고 있고, 이특이성 항체 BPC1812가 재조합 인간 EGFR에 결합함을 확인시키고 있다. 양성 대조군 항체, 얼비툭스 또한 재조합 인간 EGFR에 결합을 보였다. 반면, 시그마 IgG 15154는 재조합 인간 EGFR에 결합을 보이지 않았다. 이특이성 항체 BPC1812의 경우, 상층액 중 항체의 양은 정량화되지 않았고 따라서 도 176에 제시된 데이타는 가장 깔끔한 상층 물질의 희석 인자로서 대표된다. 얼비툭스 및 음성 대조군 항체(시그마 15154)의 경우, 정제된 물질은 도 176에서 희석 인자 1에 상당하는, 시작 농도 2μg/ml 및 1μg/ml로 이 분석에서 사용되었다.
실시예 18
'G 및 S' 아미노산 잔기가 제거된 IL -13/ IL -4 mAbdAbs 의 결합 활성 데이타
18.1 mAbdAbs 의 작제
G 및 S 아미노산 잔기(링커 서열 옆)가 제거된 mAbdAbs를 작제하였다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 발현 플라스미드를 작제하였다. 이 mAbdAbs는 표 23에 기재되어 있다. 이것을 클로닝하고, 하나 이상의 HEK293-6E 세포, CHOK1 세포 또는 CHOE1a 세포에서 발현시키고, 정제하고(실시예 1, 1.3 및 1.5 각각에 기재된바와 같이), 다수의 IL-13 및 IL-4 활성 분석에서 분석하였다.
표 23
Figure pct00056
18.2 발현 및 정제
이 mAbdAbs를 정제하고 SEC 및 SDS PAGE에 의해 분석하였다. 다수의 정제된 제조물을 제작하였고, 도 90 내지 98에 도시된 SEC 및 SDS PAGE 데이타는 이 제조물을 대표한 것이다.
18.3 직접 결합 ELISA 에서 인간 IL -4에의 결합
GS 제거된 정제된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474를 방법 2에 기재된 바와 같이 직접 결합 ELISA에서 인간 IL-4에의 결합에 대해 테스트하였다(PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 및 PascoH-ELQLE-474 또한 이 분석에서 결합에 대해 테스트되었다). 다수의 ELISA 분석이 이 분자에 대해 완성되었고, 도 99에 제시된 이 데이타가 상기 분석을 대표한다.
GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, 두 가지 모두 인간 IL-4에 결합하였다. 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)이 이 분석에서 IL-4에의 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL13 mAb은 IL-4 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474의 결합 활성은 정제된 항-IL4 mAb 단독(Pascolizumab), PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG- 474 및 PascoH-ELQLE-474과 유사하였다.
18.4 직접 결합 ELISA 에서 인간 IL -13에의 결합
GS 제거된 정제된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474를 방법 1에 기재된 바와 같이 직접 결합 ELISA에서 인간 IL-13에의 결합에 대해 테스트하였다(PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 또한 이 분석에서 결합에 대해 테스트되었고, 이 분자의 생성은 실시예 19에 기재되어 있다). 다수의 ELISA 분석이 이 분자에 대해 완성되었고, 도 100에 제시된 이 데이타가 모든 분석을 대표한다.
GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 전부가 인간 IL-13에 결합하였다. 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)이 이 분석에서 IL-13에의 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL13 mAb은 IL-13 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. dAb는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
18.5 직접 결합 ELISA 에서 시노몰구스 IL -13에의 결합
GS 제거된 정제된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 mAbdAbs를 직접 결합 ELISA(방법 17에 기재된 바와 같이)에서 시노몰구스 IL-13에의 결합에 대해 테스트하였다. 다수의 ELISA 분석이 이 분자에 대해 완성되었고, 도 101의 상기 데이타가 모든 분석을 대표한다.
GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 전부가 시노몰구스 IL-13에 결합하였다. 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)이 이 분석에서 IL-13에의 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL13 mAb은 시노몰구스 IL-13 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. dAb는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에 항-IL-13 dAbs 단독(DOM10-53-474 및 DOM10-53-616)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
18.6 인간 IL -4 및 인간 IL -13에의 결합에 대한 비아코어 분석
정제된 mAbdAbs를 BIAcore™ T100을 이용하여 25℃에서(방법 4 및 5에 기재된바와 같이) 인간 IL-4 및 인간 IL-13에의 결합에 대해 테스트하였다. 이 데이타는 표 24에 도시되어 있다.
실험 1에서, 대략 600의 상대 반응 단위의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-13 및 IL-4 농도 곡선(256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1 nM 및 0.25n M)이 평가되었다. 단지 한개의 IL-13(256nM) 및 IL-4(256nM) 농도 곡선이 실험 1에서 상기 mAbs에 대해 평가되었다.
실험 2에서, 대략 400의 상대 반응 단위의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-4(64nM, 16nM, 4nM, 1nM, 0.25nM 및 0.0625nM) 및 6개의 IL-13 농도 곡선(256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25nM)이 평가되었다. 실험 2에서, 단지 한개의 IL-13 농도 곡선(256nM)이 항-IL13 mAb에 대해 평가되었고, 5개의 IL-4 농도 곡선(64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25nM)이 Pascolizumab에 대해 평가되었다.
실험 3에서, 대략 700의 상대 반응 단위의 mAbdAb 또는 mAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-4 농도 곡선(256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25nM) 및 6개의 IL-13 농도 곡선(256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25nM)이 평가되었다.
표 24
Figure pct00057
실험 1 및 2에서, GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, 두가지 모두 유사한 결합 친화력으로 IL-4와 결합하였고 이것은 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)의 결합 친화력과 대략 동일하였다.
GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474는 또한 유사한 결합 친화력으로 IL-13과 결합하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-474)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
실험 3에서, GS 제거된 586H-210 및 GS 제거된 586H-TVAAPS-210, 두가지 모두 유사한 결합 친화력으로 IL-13에 결합하였고, 이것은 항-인간 IL13 mAb의 결합 친화력과 대략 동일하였다. GS 제거된 586H-210 및 GS 제거된 586H-TVAAPS-210는 또한 IL-4에 매우 타이트하게 결합하였으나, 이 방법은 양성 분리 효과 및 BIAcore™ 기술의 민감도 수준(*) 때문에 결합 친화력을 측정할 수 없게 하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-4 dAb 단독(DOM9-112-210)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 이 분석에서 IL-4 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
18.7 시노몰구스 IL -4 및 시노몰구스 IL -13에 결합에 대한 비어코어 분석
정제된 mAbdAbs를 BIAcore™ T100을 이용하여 25℃에서(방법 24 및 23에 기재된바와 같이) 시노몰구스 IL-4 및 시노몰구스 IL-13에의 결합에 대해 테스트하였다. 이 데이타는 표 25에 도시되어 있다. 대략 600의 상대 반응 단위의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-13 농도 곡선(256, 64, 16, 4, 1, 0.25nM) 및 5개의 IL-4 농도 곡선(64, 16, 4, 1, 0.25nM)이 평가되었다.
표 25
Figure pct00058
GS 제거된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, 2번째 GS 제거된PascoH-ASTKGPT-474, PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474 및 PascoH-ASTKG-474 전부가 유사한 결합 친화력으로 시노몰구스 IL-4에 결합하였다. GS 제거된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, 2번째 GS 제거된PascoH-ASTKGPT-474, PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474 및 PascoH-ASTKG-474 전부는 또한 유사한 결합 친화력으로 IL-13에 결합하였다.
또한 정제된 mAbdAbs를 BIAcore™ T100을 이용하여 25℃에서(방법 24 및 23에 기재된바와 같이) 시노몰구스 IL-4 및 시노몰구스 IL-13에의 결합에 대해 테스트하였다. 이 데이타는 표 26에 도시되어 있다. 대략 600의 상대 반응 단위의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-13 및 6개의 IL-4 농도 곡선(256, 64, 16, 4, 1 및 0.25nM)이 평가되었다.
표 26
Figure pct00059
GS 제거된 586H-210 및 GS 제거된 586 H-TVAAPS-210, 두가지 모두 유사한 결합 친화력으로 시노몰구스 IL-13에 결합하였다; 이 mAbdAbs는 항-인간 IL13 mAb보다 IL-13에 더욱 강력하게 결합하는 것으로 보이나, mAb의 경우 오직 한 개의 농도 곡선이 전체 농도 범위 평가보다 본질적으로 덜 정확하게 완성되었다. GS 제거된 586H-210 및 GS 제거된 586H-TVAAPS-210는 또한 IL-4에 매우 강력하게 결합하나, 이 방법은 양성 분리 효과 및 BIAcore™ 기술의 민감도 수준(*) 때문에 결합 친화력을 측정할 수 없게 하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-4 dAb 단독(DOM9-112-210)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab)가 이 분석에서 IL-4 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
18.8 후속한 IL -13 결합 동역학 및 그 역에서 IL -4와 mAbdAbs 와의 결합 효과 의 비아코어 분석; 및 후속한 IL -4 결합 동역학 및 그 역에서 IL -13과 mAbdAbs 와의 결합 효과의 비아코어 분석.
IL-13 및 IL-4 BIAcore™ 결합 분석은 후속한 IL-13 결합 동역학 및 그 역에서 IL-4의 GS 제거된 PascoH-474에의 결합의 효과; 및 후속한 IL-4 결합 동역학 및 그 역에서 IL-1의 586H-TVAAPS-210에의 결합 효과를 조사하는데 사용되었다. 분석은 BIAcore™ T100 기계에서 25℃에서, mAbdAb(또는 양성 대조군 mAb)의 항-인간 IgG 포획을 이용하여 수행되었다. 간략히, 항-인간 IgG는 제조업자 지시사항에 따라 1차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 커플링되었다. 그 다음 mAbdAb 작제물(또는 양성 대조군 mAb)을 상기 표면상에 포획하고(대략 250 내지 750RUs), 최초 분석물질(인간 IL-13 또는 인간 IL-4)을 256nM으로 4분 동안 통과시켰다. 그 다음 제 2 분석물질(인간 IL-4 또는 인간 IL-13 각각)을 256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1 nM 및 0.25nM 농도로 통과시키고, 이중 참조를 위해 완충용액 주입을 포획 항체 또는 mAbdAb 표면을 거쳐 통과시켰다. 상기 데이타를 상기 기계 내 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였다(1:1 결합 모델로 맞춤). 그 다음 상기 표면을 3M의 염화마그네슘을 이용하여 재생성시켰다. 이 실험으로부터의 데이타는 표 27 및 28에 도시되어 있다.
표 27
Figure pct00060
인간 IL-13에 대한 GS 제거된 PascoH-474의 결합 친화력은, 인간 IL-4가 이 분자에 결합했는지 결합하지 않았는지에 상관없이 유사하였다. 게다가, 인간 IL-13에 대한 586H-TVAAPS-210의 결합 친화력은, 인간 IL-4가 이 분자에 결합하였는지 결합하지 않았는지와 상관없이 유사하였고, 이것은 또한 인간 IL-13에 대한 항-IL13 mAb의 결합 친화력과 유사하였다.
GS 제거된 PascoH-474 및 586H-TVAAPS-210에서 획득된 IL-4 결합에 대한 오프-속도(kd)는 매우 느리고 BIAcore™ T100의 민감도 범위 밖이기 때문에, 결합 친화력의 정확한 측정으로서 사용될 수 없다(데이다가 도시되지 않음). 그러나, 상기 데이타는 테스트된 모든 작제물이 인간 IL-4에 타이트하게 결합함을 나타낸다. 따라서 인간 IL-4에 대한 GS 제거된 PascoH-474의 결합 친화력은, 인간 IL-13이 이 분자에 결합했는지 결합하지 않았는지에 상관없이 매우 타이트하였다. 게다가, 인간 IL-4에 대한 586H-TVAAPS-210의 결합 친화력은, 인간 IL-13이 이 분자에 결합했는지 결합하지 않았는지에 상관없이 매우 타이트하였다.
18.9 mAbdAbs 의 효능
mAbdAbs는 ELISA에 의한 인간 IL-4와 인간 IL-4Rα의 결합 저해에 대해, 방법 19에 기재된 바와 같이 테스트되었다. 표 28에 나타난 분자 전부가 한 실험에서 테스트되었으나, 상기 데이타는 곡선 플롯 사이를 구분하기 위해 두개의 그래프로 플로팅되었다(586H-TVAAPS-210는 두번 실행되었으며, 표 25에서 샘플 1 및 샘플 2로 라벨링되었다). 이 데이타는 도 102 및 103에 도시되어 있다.
GS 제거된 PascoH-474는 인간 IL-4의 인간 IL4Rα에의 결합을 Pascolizumab와 유사하게 저해하였다. GS 제거된 586H-210, GS 제거된 586H-TVAAPS-210, 586H-TVAAPS-210, 586H-210, 586H-G4S-210 및 586H-ASTKG-210 전부는 인간 IL-4의 인간 IL4Rα에의 결합을 D0M9-112-210와 유사하게 저해하였다. Pascolizumab 및 DOM9-112-210는 IL4Rα의 IL-4의 결합 저해에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. DOM10-53-474 및 이소형-매치된 mAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지님)는 IL4Rα에 IL-4의 결합 저해에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
이 데이타는 각 분자에 대한 IC50값을 결정하는데 사용되었다. IC50값은 인간 IL-4 to 인간 IL4Rα의 결합을 50％까지 저해할 수 있는 mAbdAb 또는 mAb 또는 dAb의 농도이다. 상기 IC50값은 표 28에 도시되어 있다.
표 28
Figure pct00061
상기 데이타는 GS 제거된 PascoH-474가 Pascolizumab와 유사하게 행동하고, 모든 586H-210 mAbdAb '페밀리 멤버'가 DOM9-112-21O dAb와 유사하게 행동함을 확인시켜주고 있다.
18.10 TF -1 세포 생물분석에서 mAbdAbs 에 의한 인간 및 시노몰구스 IL -13의 중화
다수의 정제된 mAbdAbs는 TF-1 세포 생물분석(방법 8 및 방법 20 각각에 기재된 바와 같은)에서 인간 및 시노몰구스 IL-13의 중화에 대해 테스트되었다. 각 분자는 상기 분석에서 1회 내지 9회 테스트되었고, 모든 그래프가 도시되진 않았으나, 도 104 및 105가 인간 IL-13 및 시노몰구스 IL-13 각각에 대한 중화 데이타를 나타내는 대표적인 그래프이다. DOM 10-53-474은 상기 생물분석에서 인간 또는 시노몰구스 IL-13의 중화에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 무관한 항원에 대해 특이성을 지니는 dAb(음성 대조군 dAb)가 또한 상기 생물분석에서 인간 또는 시노몰구스 IL-13의 중화에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다
GS 제거된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474 및 2번째 GS 제거된 PascoH-ASTKG-474를 비롯하여 PascoH-616, PascoH-TVAAPS-616 및 DOM10-53-616 (실시예 19에 기재된 것들)은 TF-1 세포 생물분석에서 인간 및 시노몰구스 IL-13 둘 모두의 생물활성을 충분하게 중화시켰다.
18.11 TF -1 세포 생물분석에서 mAbdAbs 에 의한 인간 및 시노몰구스 IL -4의 중화
다수의 정제된 mAbdAbs가 또한 TF-1 세포 생물분석에서(방법 9 및 방법 21 각각에 기재된 바와 같이) 인간 및 시노몰구스 IL-4의 중화에 대해 테스트되었다. 각 분자는 상기 분석에서 2회 테스트되었으며, 모든 그래프가 도시되진 않았으나, 도 106 및 107이 인간 IL-4 및 시노몰구스 IL-4 각각에 대한 중화 데이타를 나타내는 대표적인 그래프(데이타세트로부터 온)이다. 상기 생물분석에서 항-IL13 mAb가 음성 대조군으로서 포함되었고, Pascolizumab가 인간 또는 시노몰구스 IL-4의 중화에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. 게다가, PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 및 PascoH-G4S-474 또한 상기 생물분석에서 인간 및 시노몰구스 IL-4의 중화에 대해 테스트되었다.
GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474는 TF-1 세포 생물분석에서 인간 및 시노몰구스 IL-4 둘 모두의 생물활성을 충분하게 중화시켰다. 게다가 PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474, PascoH-ASTKG-474 및 PascoH-G4S-474 또한 TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-4의 생물활성을 충분하게 중화시켰다.
ND50값은 다수의 상이한 실험으로부터 획득한 데이타를 기초로하여 유도되었다. 상기 ND50값은 IL-13 또는 IL-4의 생물활성을 50％까지 중화시킬 수 있는, mAbdAb 또는 mAb 또는 dAb의 농도이다. 평균 ND50값, 표준 편차(SD) 및 테스트된 횟수(n)가 표 29에 나타나있다.
표 29
Figure pct00062
Figure pct00063
GS 제거된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, 및 2번째 GS 제거된 PascoH-ASTKGPT-474 전부는 TF-1 세포 생물분석에서 인간 및 시노몰구스 IL-13의 생물활성을 충분하게 중화시켰다. 게다가, GS 제거된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, 및 2번째 GS 제거된 PascoH-ASTKGPT-474의 인간 IL-13에 대한 중화력(ND50 값)은 정제된 항-IL13 dAb 단독(DOM10-53-474)에 대한 ND50값과 유사하거나 몇배 이내였다.
GS 제거된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, 두가지 모두는 TF-1 세포 생물분석에서 인간 및 시노몰구스 IL-4의 생물활성을 충분하게 중화시켰다. 게다가, GS 제거된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474의 인간 IL-13 및 시노 IL-13에 대한 중화력(ND50값)은 Pascolizumab에 대한 ND50값과 유사하거나 몇배 이내였다.
18.12 인간 IL -13의 인간 IL -13Rα2에의 결합을 저해시키는 mAbdAbs 의 능력
표 30에 나열된 분자는 인간 IL-13의 인간 IL-13Rα2에 대한 결합의 저해에 대해 ELISA에 의해 방법 22에 기재된 바와 같이 테스트되었다. 모든 분자가 한 실험에서 테스트되었다. 상기 데이타는 도 108에 도시되어 있다.
테스트된 모든 mAbdAbs는 인간 IL-13의 인간 IL13Rα2에 대한 결합을 저해하였다. 저해 수준은 DOM 10-53-474, DOM 10-53-616 및 항-IL 13 mAb의 저해 수준과 유사하였다. Pascolizumab 및 음성 대조군 dAb(무관한 항원에 대해 특이성을 지님)은 IL-13의 IL13Rα2에 대한 결합의 저해에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
상기 데이타는 또한 각 분자에 대한 IC50값을 결정하는데 사용되었다. IC50값은 인간 IL-13의 인간 IL13Rα2에 대한 결합을 50％까지 저해할 수 있는 mAbdAb 또는 mAb 또는 dAb의 농도이다. 상기 IC50은 표 30에 도시되어 있다.
표 30
Figure pct00064
상기 데이타로 GS 제거된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616가 DOM10-53-474, DOM 10-53-616 및 항-IL13 mAb와 유사하게 행동한다는 것이 확인되었다.
실시예 19
항- IL13 DOM10 -53-616 dAb 를 포함하는 mAbdAbs
19.1 항- IL13 DO M 10-53-616 dAb 를 포함하는 mAbdAbs 의 작제
표 31에 제시된 두개의 항-IL4mAb-항-IL13dAbs를 실시예 1에 기재된 바와 같이 위치-지정 돌연변이 유발에 의해 기존 벡터로부터 클로닝하였다.
표 31
Figure pct00065
19.2 항- IL13 DOM10 -53- 616 dAb 를 포함하는 mAbdAbs 의 발현 및 정제
이 mAbdAbs를 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 HEK293-6E 세포 및 CHOE1a 세포에서 발현시켰다
상기 mAbdAbs를 SEC 및 SDS PAGE에 의해 정제하고 분석하였다. 다수의PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 mAbdAbs의 정제된 제조물을 제작하였고, 도 109(PascoH-616에 대한 SEC 프로파일), 110(PascoH-TVAAPS_616에 대한 SEC 프로파일), 111(PascoH-616에 대한 SDS PAGE) 및 112(PascoH-TVAAPS-616에 대한 SDS PAGE)에 도시된 SEC 및 SDS PAGE 데이타가 상기 제조물을 대표한다.
19.3 직접 결합 ELISA 에서 인간 IL -13에 대한 mAbdAbs 의 결합
PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 정제된 mAb dAbs를 직접 결합 ELISA(방법 1에 기재된 바와 같이)에서 인간 IL-13에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 이 데이타는 도 113에 도시되어 있다.
정제된 PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 둘 모두 인간 IL-13에 결합하였다. 정제된 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)은 이 분석에서 IL-13에의 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL13 mAb은 IL-13 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. dAb는 2차 감지 항체에 의해 감지되지 않기 때문에 항-IL-13 dAb 단독(D0M10-53-616)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
19.4 인간 IL -4 및 인간 IL -13에의 결합에 대한 비아코어 분석
정제된 mAbdAbs를 BIAcore™ T100을 이용하여 25℃에서(방법 4 및 5에 기재된바와 같이) 인간 IL-4 및 인간 IL-13에의 결합에 대해 테스트하였다. 이 데이타는 표 32에 도시되어 있다.
실험 1에서, 대략 600의 상대 반응 단위의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-13 및 IL-4 농도 곡선(256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25n M)이 평가되었다. 단지 한개의 IL-13(256nM) 및 IL-4(256nM) 농도 곡선이 실험 1에서 상기 mAbs에 대해 평가되었다.
실험 2에서, 대략 400의 상대 반응 단위의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-4(64nM, 16nM, 4nM, 1nM, 0.25nM 및 0.0625nM) 및 6개의 IL-13 농도 곡선(256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25nM)이 평가되었다. 실험 2에서, 단지 한개의 IL-13 농도 곡선(256nM)이 항-IL13 mAb에 대해 평가되었고, 5개의 IL-4 농도 곡선(64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25nM)이 Pascolizumab에 대해 평가되었다.
표 32
Figure pct00066
PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 두가지 모두 유사한 결합 친화력으로 IL-4에 결합하였고, 이는 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)의 결합 친화력과 유사하였다. PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 두가지 모두 IL-13과 결합하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-616)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
19.5 시노몰구스 IL -13에의 결합에 대한 비아코어 분석
정제된 mAbdAbs를 BIAcore™ T100을 이용하여 25℃에서(방법 30에 기재된바와 같이) 시노몰구스 IL-13에의 결합에 대해 또한 테스트하였다. 이 데이타는 표 33에 도시되어 있다. 대략 400의 상대 반응 단위의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-13 농도 곡선(256, 64, 16, 4, 1 및 0.25nM)이 평가되었다. 단지 한개의 IL-13 농도 곡선(256nM)이 항-IL13 mAb에 대해 평가되었다.
표 33
Figure pct00067
PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616 둘 모두는 시노몰구스 IL-13에 유사한 결합 친화력으로 결합하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-13 dAb 단독(DOM10-53-616)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
19.6 TF -1 세포 생물 분석에서 mAbdAbs 에 의한 인간 및 시노몰구스 IL -13의 중화
정제된 mAbdAbs를 TF-1세포 생물 분석에서(방법 8 및 방법 20에 각각 기재된바와 같이) 인간 IL-13 및 시노몰구스 IL-13의 중화에 대해 테스트하였다.
이 분자는 각 분석당 3회 테스트되었으며, 도 114가 시노 IL-13에 대한 중화 데이타를 나타내는 대표적 그래프이다. 도 114a는 시노 IL-13에 대한 중화 데이타를 나타내는 대표적 그래프이다. DOM10-53-616는 이 생물분석에서 IL-13의 중화에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 무관한 항원에 대해 특이성을 지니는 dAb(음성 대조군 dAb) 또한 이 생물 분석에서 IL-13의 중화에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
평균 ND50값, 표준 편차(SD) 및 테스트된 횟수(n)이 표 34에 나타나있다.
표 34
Figure pct00068
상기 두 PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616를 비롯하여 mAbdAbs, GS제거된 PascoH-TVAAPS-474 및 GS 제거된 PascoH-474도 TF-1 세포 생물 분석에서 인간 및 시노몰구스 IL-13의 생물활성을 충분히 중화시켰다.
게다가, 인간 IL-13에 대한 PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616의 중화력(ND50값)은 정제된 항-IL13 dAb 단독(DOM10-53-616)에 대한 ND50값의 2-배 이내이고 유사하였다.
PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616은 또한 ELISA에 의해 인간 IL-13Rα2에 대한 인간 IL-13 결합의 저해에 대해 방법 22에 기재된 바와 같이 테스트되었다. 이 데이타는 실시예 18.12에 제시되어 있다.
실시예 20
인간 전혈 포스포 STAT6 생물분석에서 mAbdAbs 의 인간 IL -13 또는 IL -4을 중화시키는 능력
인간 전혈 포스포 STAT6 생물분석에서 mAbdAbs의 인간 IL-13 또는 IL-4을 중화시키는 능력은 방법 16에 기재된 바와 같이 수행되었다. 2 mAbdAb 작제물(정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAb, 586H-TVAAPS-210; 및 정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAb, GS제거된 PascoH-474)의 IL-4 또는 IL-13 중화력(즉, IL-4 또는 IL-13 생물활성 저해)을 측정하였다. 정제된 항-인간 IL-4 mAb(Pascolizumab) 및 정제된 항-IL4 dAb(DOM9-112-210)는 이 분석에서 rhlL-4의 중화에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL-13 mAb 및 정제된 항-IL13 dAb(DOM10-53-474)는 rhlL-13의 중화에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. dAb와 혼합된 이소형 매치된 mAb(둘 모두 무관한 항원에 대해 특이성을 지님)는 rhlL-4 또는 rhlL-13의 중화에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. 각 분자는 상이한 공여체에서 온 혈액을 이용하여 2회 이상 테스트되었다. 도 115 내지 124는 대표적 데이타를 나타내는 그래프이다.
정제된 mAbdAbs는 rhlL-13 및 rhlL-4의 생물활성을 충분히 중화시켰다.
방법 16에 기재하였듯이, rhlL-13 또는 rhlL-4 생물활성을 중화시키는 테스트 분자의 능력은 2ng/mL의 인간 IL-4 또는 인간 IL-13을 50％까지 중화시키는데 필요한 분자(예컨대, mAbdAbs)의 농도로서 표현되었다(IC50). 이 데이타는 표 35에 도시되어 있다. 각 분자의 모든 공여체로부터 온 결합된 평균 IC50이 표준편자를 따라 제시되어 있다.
표 35
Figure pct00069
IC50 값의 비교는 586-TVAAPS-210이 pSTAT-6에서 유도된 IL-13 및 IL-4를 항-IL13 mAb 및 DOM9-112-210와 유사하게 저해했다는 사실을 나타내었다(IL-13 및 IL-4 전혈 분석 각각에서). IC50 값의 비교는 또한 GS 제거된 PascoH-474가 pSTAT-6에서 유도된 IL-13 및 IL-4를 DOM10-53-474 및 Pascolizumab와 유사하게 저해했다는 사실을 나타내었다(IL-13 및 IL-4 전혈 분석 각각에서). 대조군 mAb는 모든 공여체에서 최대 테스트된 최대 농도 661nM까지 저해를 나타내지 않았고, 대조군 dAb는 모든 공여체에서 최대 테스트된 최대 농도 2291nM까지 중화를 보이지 않았다.
실시예 21
이중 표적화 항- IL4 /항- IL13 mAbdAb 의 래트 PK 연구
PascoH-G4S-474, PascoL-G4S-474, 586H-TVAAPS-210 및 586H-TVAAPS-154는 PK 연구에서 분석되었다(표 35.1에 요약됨). 간략히, 수컷 스프래그-다우리 래트(Sprague-Dawley rats)(중량으로 대략 200그램 내지 220그램)에 2mg/kg의 표적 용량 수준으로 mAbdAb의 단일 정맥(i/v) 투여가 이뤄졌다. 할당된 시점(0시간 내지 312시간)에서, 100μl 혈액 샘플을 적출하고 플라즈마를 가공하였다. 래트 플라즈마 샘플을 인간 IgG 감지 분석, 및/또는 IL-13 리간드 결합 분석, 및/또는 IL-4 리간드 결합 분석에서 테스트 분자의 존재에 대해 평가하였다. 게다가, Pascolizumab(래트 내)에 대한 플라즈마 내 PK 프로파일을 평가하였고; 이 경우, 상기 래트 플라즈마 샘플을 인간 IgG 감지 분석 및 IL-4 리간드 결합 분석에서 Pascolizumab 존재에 대해 평가하였다.
제 1 실험에서, 4 마리 래트에 pascolizumab가 주어졌다. 제 2 실험에서, 각 그룹 당 4마리의 래트를 가진 4개의 처리 군(2mg/kg PascoH-G4S-474, 2mg/kg PascoL-G4S-474, 2mg/kg 586H-TVAAPS-210 및 2mg/kg 586H-TVAAPS-154)이 존재하였다.
PK 파라미터(표 35.1에 도시됨)를 플라즈마 농도-시간 프로파일 데이타(도시되지 않음)로부터 유도하였다. 일부 플라즈마 샘플을 상기 분석에서 1회 이상 분석하였고, 표 35.1의 PK 파라미터는 오직 이 데이타세트 중 한가지로부터 유도되었음을 주의하라. 또한, PK 파라미터는 개개의 동물 용량에 대해 표준화되지 않았고, 대신 2mg/kg의 명목상 용량으로 가정되었음을 주의하라. PascoH-G4S-474에 대한 IgG PK 분석에서 몇가지 기술적 어려움에 접하였고 따라서 상기 농도가 과대추정될 수 있음을 주의하라. 게다가, IgG 플라즈마 농도-시간 프로파일의 분석은 동일한 경우(표 35.1에서 분석 1 및 분석 2로 불림)에서 2회 수행되었다. IL-13 및 IL-4 리간드 결합 PK 분석으로부터 생성된 상기 플라즈마 농도-시간 프로파일 데이타의 분석은 단지 분석 2에서 수행되었다. PascoL-G4S-474 및 586H-TVAAPS-154에 대한 IL-13 및 IL-4 리간드 결합 분석으로부터 생성된 플라즈마 농도-시간 프로파일 데이타는 이 분자들에 대한 PK 파라미터를 유도하는데 이용되지 않았다.
표 35.1
Figure pct00070
PascoH-G4S-474(및 후속하여 유도된 PK 파라미터)에 대한 IL-13 및 IL-4 분석에서 생성된, 플라즈마 농도-시간 프로파일 데이타는 비교가능한 경향이 있고; 또한 586 H-TVAAPS-210(및 후속하여 유도된 PK 파라미터)에 대한 IL-13, IL-4 및 IgG PK 분석에서 생성된 플라즈마 농도-시간 프로파일 데이타의 경우에도 존재하였다. 이것은 이 mAbdAbs가 상기 연구의 과정을 거친 래트 플라즈마 내에서 '무손상'임을 시사한다. 586H-TVAAPS-154에 대해 유도된 PK 파라미터는 기타 다른 mAbdAbs 보다도 Pascolizumab에 대해 유도된 PK 파라미터와 더욱 유사한 것으로 보였다.
실시예 22
시노 PK 연구
PK 연구는 시노몰구스 원숭이에서 수행되었다. 이 동물에 1 mg/kg의 표적 용량 수준으로 단일 정맥(i/v) 투여가 이뤄졌다. 할당된 시점에서, 500μl의 혈액 샘플을 적출하고 플라즈마를 가공하였다. 그 다음 시노몰구스 플라즈마 샘플을 IL-13 리간드 결합 분석, IL-4 리간드 결합 분석 및 IL-13/IL-4 브릿지 분석에서 테스트 분자의 존재에 대해 평가하였다.
mAbdAbs 'GS 제거된 PascoH-474' 및 '586H-TVAAPS-210'을 이용한 상기 연구로부터의 초기 데이타는 상기 제시된 래트 PK 데이타와 일치하고, 이 분자가 mAb보다 더 빠르게, 그러나 dAb보다는 더 느리게 체순환으로부터 제거됨을 나타내었다.;
실시예 23
23.1 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 생성
이 이중 표적화 mAbdAb를 dAb와 mAb 중쇄의 C-말단을 융합시킴으로서 작제하였다. 항-EGFR mAb 중쇄 및 경쇄 발현 카세트는 미리 작제해 두었다. 클로닝에 사용된 제한 부위는 실시예 10에 제시된 제한부위(SaiⅠ 및 HindⅢ)와 동일하다.
그 다음 항-VEGF dAb(DOM15-26-593)을 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭시키고(SaiⅠ 및 HindⅢ 말단을 코딩하는 프라이머 이용), 개질된 3' 코딩 영역으로 삽입시켜, 상기 mAb 및 상기 dAb 사이에 'STG'(세린, 트레오닌, 글리신)의 링커를 생성하였다.
서열 확인된 클론(경쇄 및 중쇄 각각에 대해 SEQ ID NO: 164 및 243)을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제작하였다. 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 165 및 137)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 mAbdAbs을 발현시켰다.
23.2 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
이 이중 표적화 mAbdAb를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플(DMS4010로 지정됨)의 SDS-PAGE 분석(도 128)은 ~17OkDa에서 비-환원된 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 ~25 및 ~6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb를 프리-평형화된 S-200 10/300 GL 컬럼(HPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 1ml/분으로 PBS에서 전개하였다. SEC 프로파일은 대칭 피크로서 단일 종류 전개를 나타낸다(도 129).
23.3 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 효능
VEGF 및 EGFR를 중화시키는 상기 분자의 효능은 방법 12 및 13 각각에 기재된 바와 같이 측정하였다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 이 mAbdAb(DMS4010로 지정됨)의 항-EGFR 효능(도 130)는 4.784nM로 계산된 반면, 대조군, 항-EGFR mAb는 4.214nM의 EC50 값을 나타내었다. 항-VEGF 수용체 결합 분석(도 131)에서, 상기 mAbdAb(DMS4010로 지정됨)의 EC50 값은 58pM(0.058nM)인 반면, 항-VEGF 대조군 mAb는 214.1pM (0.2141 nM)의 EC50을 생산하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 23의 작제물, 이중 표적화 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb이 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
23.4 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb PK
시노몰구스 원숭이에 투여한 후, 이중 표적화 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb(DMS4010로 지정됨)의 약물동역학 프로파일을 측정하였다. 상기 화합물을 5mg/kg의 용량으로 정맥내로 투여하였고, 투여 후 다중 시점에서 약물의 혈청 수준을 별개의 ELISA 분석에서 상기 두 EGFR 및 VEGF에 대한 결합에 의해 측정하였다. 도 132는 이 분석의 결과를 도시하고 있는데, 상기 데이타는 mAbs 세툭시맙(cetuximab)(항-EGFR) 및 베바시주맙(bevacizumab)(항-VEGF)에 대해 생성된 과거 데이타와 비교되었다. 추가 상세한 설명이 표 36에 도시되어 있다.
표 36
Figure pct00071
23.5 대안적 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 생성
대안적 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb를 STG 링커를 이용하여 중쇄 C-말단에서 VEGF dAb에 연결된 동일한 항-EGFR mAb를 이용하여, 실시예 11.1에 기재된 바와 유사한 방법으로 작제하였다. 상기 경우에서 이용된 항-VEGF dAb는 DOM15-10-11이다. 이 분자는 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 165 및 186)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 발현되었으나, 실시예 23.2에 기재된 분자의 발현에 비해 상당하게 감소된 수준의 발현이 달성되었다. 실시예 23.3에 기재된 동일한 VEGF 분석에서 효능을 테스트하였을 때, 이 분석에서 감지될 수 없는 수준의 VEGF와 VEGF 수용체의 결합의 저해가 관찰되었다.
실시예 24
24.1 링커 없는 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 생성
실시예 23에 기재된 mAbdAb의 유도체를 dAb와 mAb의 CH3 도메인 사이의 'STG' 링커가 제거되도록 제작하였다. SDM은 STG 링커를 엔코딩하는 잔기를 중쇄를 엔코딩하는 플라스미드로부터 제거하는데 사용되었다. 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 서열 확인된 클론(SEQ ID NO: 243 및 SEQ ID NO: 174)을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제작하였다. 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 175 및 137)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 mAbdAbs을 발현시켰다.
24.2 링커 없는 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
이 이중 표적화 mAbdAb를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플(DMS4010로 지정됨)의 SDS-PAGE 분석(도 133)은 ~17OkDa에서 비-환원된 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 ~25 및 ~6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb를 프리-평형화된 S-200 10/300 GL 컬럼(HPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 1ml/분으로 PBS에서 전개하였다. SEC 프로파일은 대칭 피크로서 단일 종류 전개를 나타낸다(도 134).
24.3 링커 없는 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 효능
VEGF 및 EGFR를 중화시키는 분자의 능력은 방법 12 및 13 각각에 기재된 바와 같이 측정되었다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 이 mAbdAb(DMS4011로 지정됨)의 항-EGFR 효능(도 135)는 3.529nM로 계산된 반면, 대조군, 항-EGFR mAb는 3.647nM의 EC50 값을 가졌다. 항-VEGF 수용체 결합 분석(도 136)에서, 상기 mAbdAb(DMS4011로 지정됨)의 EC50 값은 342.9pM(0.3429nM)인 반면, 항-VEGF 대조군 mAb는 214.1pM(0.2141 nM)의 EC50을 생산하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 24의 작제물, 링커 없는 이중 표적화 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb이 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 25
25.1 더 긴 링커를 지니는 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 생성
실시예 23에 기재된 mAbdAb의 유도체를 작제하였는데, 여기서 dAb 및 mAb의 CH3 도메인 사이의 링커는 1개 또는 2개의 반복된 유연한 "GGGGS" 모티프를 중쇄를 엔코딩하는 플라스미트에 삽입시킴으로서 연장되었다.
SEQ ID NO: 175에 제시된 중쇄 서열을 지니는 제 1 분자는 1개 반복된 상기 모티프를 가지므로, 'STGGGGGS'의 링커를 가진다. SEQ ID NO: 177에 제시된 중쇄 서열을 지니는 제 2 분자는 2개 반복된 상기 모티프를 가지므로, 'STGGGGGSGGGGS'의 링커를 가진다. 이들은 상기 둘 모두 실시예 23에서 사용된 것과 동일한 경쇄(SEQ ID NO: 243)와 독립적으로 짝을 지었다.
경쇄 및 중쇄에 대해 서열 확인된 클론을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제작하였다. 경쇄 및 중쇄(DMS4023로 지정된 SEQ ID NO: 176 및 137; 및 DMS4024로 지정된 SEQ ID NO: 178 및 137)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 mAbdAbs을 발현시켰다.
25.2 더 긴 링커를 지니는 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
이 이중 표적화 mAbdAbs를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플 DMS4023 및 DMS4024의 SDS-PAGE 분석(도 137)은 ~17OkDa에서 비-환원된 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 ~25 및 ~6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb를 프리-평형화된 S-200 10/300 GL 컬럼(HPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 1ml/분으로 PBS에서 전개하였다. 상기 두 가지 DMS4023(도 138) 및 DMS4024(도 139)에 대한 SEC 프로파일은 약간 꼬리가 늘어진 피크(tailing peak)로서 단일 종류를 나타내고 있다.
25.3 더 긴 링커를 지니는 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAb 의 효능
VEGF 및 EGFR를 중화시키는 분자의 능력은 방법 12 및 13 각각에 기재된 바와 같이 측정되었다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 상기 mAbdAb DMS4023의 항-EGFR 효능(도 140)은 7.066nM으로 계산되었고, mAbdAb DMS4024의 효능은 6.42OnM으로 계산된 반면, 대조군, 항-EGFR mAb는 7.291 nM의 EC50 값을 가졌다. 항-VEGF 수용체 결합 분석(도 141)에서, 상기 mAbdAb DMS4023의 EC50 값은 91.79pM(0.091 nM)이었고, mAbdAb DMS4024의 EC50 값은 9OpM(0.0906nM)인 반면, 항-VEGF 대조군 mAb는 463.2pM(0.4632nM)의 EC50을 생산하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 25의 작제물, 더 긴 링커를 지니는 이중 표적화 항-EGFR/항-VEGF mAbdAbs이 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 26
26.1 이중 표적화 항- VEGF /항- EGFR mAbdAb 의 생성
dAb를 mAb 중쇄의 C-말단에 융합시킴으로서 이중 표적화 mAbdAb를 작제하였다. 항-VEGF mAb 중쇄 및 경쇄 발현 카세트는 미리 작제해두었다. 클로닝에 사용된 제한 부위는 실시예 10에 제시된 제한부위(SaiⅠ 및 HindⅢ)와 동일하다.
그 다음 항-EGFR dAb(DOM16-39-542)를 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭시키고(SaiⅠ 및 HindⅢ 말단을 코딩하는 프라이머 이용), 개질된 3' 코딩 영역으로 삽입시켜, 상기 mAb 및 상기 dAb 사이에 'STG'(세린, 트레오닌, 글리신)의 링커를 생성하였다.
경쇄 및 중쇄 각각에 대해 서열 확인된 클론(SEQ ID NO: 179 및 181)을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제작하였다. 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 180 및 182)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 mAbdAbs을 발현시켰다.
26.2 이중 표적화 항- VEGF /항- EGFR mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
이 이중 표적화 mAbdAbs를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플(DMS4009로 지정됨)의 SDS-PAGE 분석(도 142)은 ~17OkDa에서 비-환원된 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 ~25 및 ~6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb를 프리-평형화된 S-200 10/300 GL 컬럼(HPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 1ml/분으로 PBS에서 전개하였다. 상기 분자에 대한 SEC 프로파일(도 143)은 대칭적 피크로서 단일 종류를 나타내고 있다.
26.3 이중 표적화 항- VEGF /항- EGFR mAbdAb 의 효능
VEGF 및 EGFR을 중화시키는 분자의 능력은 방법 12 및 13 각각에 기재된 바와 같이 측정하였다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 상기 mAbdAb DMS4009의 항-EGFR 효능(도 144)은 132.4nM으로 계산된 반면, 대조군, 항-EGFR mAb는 6.585nM의 EC50 값을 가졌다. 항-VEGF 수용체 결합 분석(도 145)에서, 상기 mAbdAb의 EC50 값은 539.7pM(0.5397nM)인 반면, 항-VEGF 대조군 mAb는 380.5pM(0.3805nM)의 EC50를 생산하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 26의 작제물, 이중 표적화 항-VEGF/항-EGFR mAbdAb가 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 27
27.1 이중 표적화 항- EGFR /항- IL -13 mAbdAb 의 생성
dAb를 mAb 중쇄의 C-말단에 융합시킴으로서 이중 표적화 mAbdAb를 작제하였다. 항-EGFR mAb 중쇄 및 경쇄 발현 카세트는 미리 작제해두었다. 클로닝에 사용된 제한 부위는 실시예 10에 제시된 제한부위(SaiⅠ 및 HindⅢ)와 동일하다.
그 다음 항-IL-13 dAb(DOM10-53-474)를 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭시키고(SaiⅠ 및 HindⅢ 말단을 코딩하는 프라이머 이용), 개질된 3' 코딩 영역으로 삽입시켜, 상기 mAb 및 상기 dAb 사이에 'STG'(세린, 트레오닌, 글리신)의 링커를 생성하였다.
경쇄 및 중쇄 각각에 대해 서열 확인된 클론(SEQ ID NO: 243 및 183)을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제작하였다. 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO: 137 및 184)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 mAbdAbs을 발현시켰다.
27.2 이중 표적화 항- EGFR /항- IL -13 mAbdAb 의 정제 및 SEC 분석
이 이중 표적화 mAbdAbs를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플(DMS4029로 지정됨)의 SDS-PAGE 분석(도 146)은 ~17OkDa에서 비-환원된 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합된 중쇄 각각과 상응하는 ~25 및 ~6OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-EGFR/항-IL-13 mAbdAb를 프리-평형화된 S-200 10/300 GL 컬럼(HPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 0.5ml/분으로 PBS에서 전개하였다. 상기 분자에 대한 SEC 프로파일(도 147)은 대칭적 피크로서 단일 종류를 나타내고 있다.
27.3 이중 표적화 항- EGFR /항- IL -13 mAbdAb 의 효능
EGFR 및 IL-13를 중화시키는 분자의 능력을 방법 13 및 25 각각에 기재된 바와 같이 측정하였다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 상기 mAbdAb DMS4029의 항-EGFR 효능(도 148)은 9.033nM으로 계산된 반면, 대조군, 항-EGFR mAb는 8.874nM의 EC50 값을 가졌다. IL-13 세포-기초 중화 분석(도 149)에서, 상기 mAbdAb의 EC50 값은 1.654nM인 반면, 항-IL-13 대조군 dAb는 0.996nM의 EC50를 생산하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 27의 작제물, 이중 표적화 항-EGFR/항-IL-13 mAbdAb가 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 28
28.1 dAb 가 경쇄 상에 위치된 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAbs 의 생성
mAb 경쇄의 C-말단에 dAb를 융합함으로서, 이중 표적화 항-EGFR/항-VEGF mAbdAbs를 작제하였다. 상기 항-EGFR mAb의 중쇄 및 경쇄 발현 카세트는 미리 작제해두었다.
dAb 삽입을 위한 제한 부위를 경쇄 내에 도입하기 위해, 위치 지정 돌연변이 유발을 이용하여 mAb 경쇄 발현 벡터를 주형으로 사용한, BamHI 및 HindⅢ 클로닝 부위를 생성하였다. 그 다음 항-VEGF dAb(DOM15-26-593)를 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭시키고(BamHI 및 HindⅢ 말단을 코딩하는 프라이머 이용), 개질된 3' 코딩 영역으로 삽입시켜, 상기 mAb 및 상기 dAb 사이에 'GSTG' 또는 'GSTVAAPS'의 링커를 생성하였다.
SEQ ID NO: 187에 제시된 경쇄 서열을 지니는 제 1 분자는 'GSTG'의 링커를 가졌다.
SEQ ID NO: 189에 제시된 경쇄 서열을 지니는 제 2 분자는 'GSTVAAPS'의 링커를 가졌다.
이들은 둘 모두 SEQ ID NO: 245의 중쇄와 독립적으로 쌍을 이루었다.
경쇄 및 중쇄에 대해 서열 확인된 클론을 선택하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 메가 프렙 키트를 이용하여 대규모 DNA 제조물을 제작하였다. 경쇄 및 중쇄(DMS4013로 지정된 SEQ ID NO: 188 및 139; 및 DMS4027로 지정된 SEQ ID NO: 190 및 139)의 공동-형질감염에 의한 일시적 형질감염 기술을 이용하여 포유류 HEK293-6E 세포에서 mAbdAbs을 발현시켰다.
28.2 dAb 가 경쇄 상에 위치된 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAbs 의 정제 및 SEC 분석
이 이중 표적화 mAbdAbs를 확립된 프로토콜에 따른 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 맑은 발현 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서 빛 흡광도의 측정으로부터 분광광도법에 의해 측정하였다. 정제된 샘플 DMS4013 및 DMS4027의 SDS-PAGE 분석(도 150)은 ~17OkDa에서 비-환원된 샘플 전개를 나타내는 반면, 환원된 샘플은 dAb-융합된 경쇄 및 중쇄 각각과 상응하는 ~38 및 ~5OkDa에서 두 개의 밴드 전개를 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 경우, 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb를 프리-평형화된 S-200 10/300 GL 컬럼(HPLC 시스템에 부착된) 상에 적용하고 1ml/분으로 PBS에서 전개하였다. DMS4013(도 151) 및 DMS4027(도 152)에 대한 SEC 프로파일은 대칭적 피크로서 단일 종류를 나타내고 있다.
28.3 dAb 가 경쇄 상에 위치된 이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF mAbdAbs 의 효능
VEGF 및 EGFR를 중화시키는 분자의 능력을 방법 12 및 13 각각에 기재된 바와 같이 측정하였다. 분석 데이타는 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 효능값은 시그모이드 도스 반응 곡선을 이용하여 측정하였고 상기 데이타를 최고 적합 모델을 이용해 맞추었다. 상기 mAbdAb DMS4013의 항-EGFR 효능(도 153)은 7.384nM으로 계산되었고, mAbdAb DMS4027의 효능은 7.554nM으로 계산된 반면, 대조군, 항-EGFR mAb는 7.093nM의 EC50 값을 가졌다. 항-VEGF 수용체 결합 분석(도 154)에서, 상기 mAbdAb DMS4013의 EC50 값은 1.179nM이고, mAbdAb DMS4027의 EC50 값은 0.1731 nM인 반면, 항-VEGF 대조군 mAb는 0.13OnM의 EC50를 생산하였다. 결론적으로, 분석 데이타는 실시예 28의 작제물, dAb가 경쇄상에 위치한 이중 표적화 항-EGFR/항-VEGF mAbdAbs가 두가지 항원에 대해 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 29
이중 표적화 항- EGFR /항- VEGF 및 항- TNF /항- VEGF mAbdAbs 의 비아코어 분석
실시예 11(항-TNF/항-VEGF mAbdAb) 및 실시예 23, 24, 25 및 28(항-EGFR/항-VEGF mAbdAbs)에 기재된 mAbdAbs를 비아코어 분석하여 이들의 상응하는 항원에의 결합에 대한 동역학적 결합 및 분리상수를 측정하였다. 분석은 BIAcore™ 3000 장치에서 수행하였다. 상기 장치의 온도는 25℃로 설정하였다. HBS-EP 완충용액은 전기영동용 완충용액(running buffer)으로서 사용하였다. 실험 데이타는 상기 장치의 가능한 가장 높은 속도에서 수집하였다. 연구 단계 CM5 칩 상 제 1의 유동 세포를 제조업자의 지시사항에 따른 표준 아민 커플링 화학반응을 이용하여 단백질 A로 코팅하고, 제 2 유동 세포를 동일하게 처리하였으나 단백질 A 대신 완충용액을 사용하여 참조면을 생성하도록 하였다. 그 다음 단백질 A로 코팅된 유동 세포를 mAbdAbs를 포획하는데 이용하였다. 항원을 2×연속적 희석액의 연속으로서 표 37에 상술된 바와 같이 주입하였다. 몇가지 희석액은 2배로 하여 실행되었다. 리간드 대신 완충용액만의 주입은 백그라운드 제거(background subtraction)를 위해 이용되었다. 샘플은 상기 장치 소프트웨어 고유의 동역학 위자드(kinetics Wizard)를 이용하여 무작위적 순서로 주입되었다. 상기 표면은 1OmM 글리신, pH 1.5을 주입함으로서 각 사이클의 마지막에 재생성되었다. 상기 두 데이타 처리 및 동역학 피팅은 BIA평가 소프트웨어(BIAevaluation software) 4.1을 이용하여 수행되었다. 이중 결과(동일한 실행에서 온)의 평균을 나타내는 데이타는 표 37에 도시되어 있다. DMS4010에 대해 나타난 다양한 값은 개별 경우에서의 두개의 실험을 나타내고 있다. 787nM 값은 아마도 분석된 리간드의 농도때문에 친화력을 과대측정한 것이다.
표 37
Figure pct00072

실시예 30
이특이성 항체 골격상에 융합된 단일 도메인 항체를 포함하는 삼중특이적 항체
30.1 작제
IL-18 및 IL-12 항원에 대해 특이성을 지니는 이특이성 항체 분자의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 엔코딩하는 유전자(추가 상세한 설명은 WO 2007/024715 참조)를 적절한 제한 효소 부위 및 첨가된 신호 서열을 이용하여 새롭게 작제하였다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 가변 중쇄 도메인을, 상기 불변 영역의 C-말단에서 TVAAPS 링커를 통해 항-IL4 도메인 항체 DOM9-112-210에 융합된 IgG1 중쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 4)을 포함하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 이와 유사하게 경쇄 가변 도메인을 Ck 불변 영역 서열을 포함하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 작제되고 발현된 상기 항체는 표 38에 나열되어 있다.
표 38
Figure pct00073
30.2 발현 및 정제
간략히, 25 ml의 HEK293 세포를 1.5×106 세포/ml로, 293펙틴 시약(Invitrogen # 51-0031)으로 미리 인큐베이션된 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 이것을 37℃, 5% CO2, 및 95%RH로 진탕 인큐베이터에 두었다. 24시간 후, 트립톤 피드 배지를 첨가하고 상기 세포를 추가 48시간동안 성장시켰다. 원심분리에 의해 상층액을 수확하고, IgG 수준을 ELISA를 이용해 정량화하였다. mAbdAb 결과물은 BPC1616로 지정되었다(SEQ ID NO: 193 및 194).
30.3 IL -12 결합 ELISA
상기 형질감염으로부터의 세포 상층액을 재조합 인간 IL-12에의 결합에 대해 평가하였다. 간략히, ELISA 플레이트를 2μg/ml로, 항-인간 IL-12(R&D 시스템 AF219NA)을 이용하여 코팅시키고, 차단 용액(트리스 완충 식염수 중 4% BSA)으로 차단시켰다. 그 다음 상기 플레이트를 차단 용액에서 25ng/ml 재조합 인간 IL-12 (PeproTech #200-12)와 함께 로딩시켰다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS + 0.05% Tween 20 (TBST)로 세척하였다. 상기 세포 상층액의 다양한 희석액을 비롯하여 차단 용액에 희석시킨 무관한 대조군 항체(Pascolizumab 및 이소형 매치된 대조군 hlgG)를 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 차단 용액 중 1/1000 희석액에서 퍼옥시다아제 라벨링된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)를 첨가함으로서 결합을 감지하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 상기 플레이트에 OPD 기질(Sigma P9187)을 첨가함으로서 발달시키고 3M H2SO4을 첨가함으로서 발색 현상을 중지시켰다. 플레이트 리더를 이용해 490nm에서 흡광도를 측정하고 평균 흡광도를 플로팅하였다. 상기 결과는 도 155에 제시되어 있으며, BPC1616는 재조합 인간 IL-12에 결합하는 반면 두개의 대조군 항체는 결합을 보이지 않음이 나타나있다.
30.4 IL -18 결합 ELISA
상기 형질감염으로부터의 세포 상층액을 재조합 인간 IL-18에의 결합에 대해 평가하였다. 간략히, ELISA 플레이트를 1μg/ml로 인간 IL-18(GSK 제조)을 이용하여 코팅시키고, 차단 용액(트리스 완충 식염수 중 4% BSA)으로 차단시켰다. 상기 세포 상층액의 다양한 희석액을 비롯하여 차단 용액에서 희석시킨 무관한 항체(Pascolizumab 및 이소형 매치된 대조군 hlgG)를 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBS + 0.05% Tween 20 (TBST)로 세척하였다. 차단 용액 중 1/1000 희석액에서 퍼옥시다아제 라벨링된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)를 첨가함으로서 결합을 감지하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 상기 플레이트에 OPD 기질(Sigma P9187)을 첨가함으로서 발달시키고 3M H2SO4을 첨가함으로서 발색 현상을 중지시켰다. 플레이트 리더를 이용해 490nm에서 흡광도를 측정하고 평균 흡광도를 플로팅하였다. 상기 결과는 도 156에 제시되어 있으며, BPC1616는 재조합 인간 IL-18에 결합하는 반면 두개의 대조군 항체는 결합을 보이지 않음이 나타나있다.
30.5 IL -4 결합 ELISA
상기 형질감염으로부터의 세포 상층액을 재조합 인간 IL-4에의 결합에 대해 평가하였다. 간략히, ELISA 플레이트를 1μg/ml로 인간 IL-4(GSK 제조)를 이용하여 코팅시키고, 차단 용액(트리스 완충 식염수 중 4% BSA)으로 차단시켰다. 상기 세포 상층액의 다양한 희석액을 비롯하여 차단 용액에서 희석시킨 항 IL-4 모노클로날 항체(Pascolizumab) 및 무관한 항체(이소형 매치된 대조군 hlgG)를 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBS + 0.05% Tween 20(TBST)으로 세척하였다. 차단 용액 중 1/1000 희석액에서 퍼옥시다아제 라벨링된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)를 첨가함으로서 결합을 감지하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 상기 플레이트에 OPD 기질(Sigma P9187)을 첨가함으로서 발달시키고 3M H2SO4을 첨가함으로서 발색 현상을 중지시켰다. 플레이트 리더를 이용해 490nm에서 흡광도를 측정하고 평균 흡광도를 플로팅하였다.
상기 결과는 도 157에 제시되어 있으며, BPC1616 및 Pascolizumab는 재조합 인간 IL-4에 결합하는 반면 대조군 항체는 결합을 보이지 않음이 나타나있다.
실시예 31
모노클로날 항체의 C-말단에서 일렬로( in - line ) 융합된 두개의 단일 도메인 항체를 포함하는 삼중특이적 mAbdAbs
31.1 작제
두개의 단일 도메인 항체가 모노클로날 항체의 중쇄 C-말단에서 일렬로(in-line) 융합된, 세개의 삼중특이적 항체(mAbdAb-dAb)를 작제하였다.
간략히, N-말단에 BgⅢ 제한 부위 및 C-말단에 BamHI 제한 부위를 PCR에 의해 DOM10-53-474(SEQ ID NO: 5), DOM9-155-154(SEQ ID NO: 3) 및 DOM9-1 12-210 (SEQ ID NO: 4)로 도입시켜 도메인 항체를 엔코딩하는 DNA 서열이 측면에 오도록 하였다.
그 다음 DOM10-53-474 도메인 항체를 엔코딩하는 DNA 단편을, 항 IL-4 도메인 항체 DOM9-112-210와 융합된 항 IL-5 모노클로날 항체의 중쇄(SEQ ID NO: 71)를 엔코딩하는 포유류 발현 벡터의 BamHI 부위로 클로닝하였다. DOM9-155-154 및 DOM9-112-210 도메인 항체를 엔코딩하는 DNA 단편을 둘 모두, 항 IL-13 도메인 항체 DOM 10-53-474와 융합된 항-CD20 모노클로날 항체의 중쇄(SEQ ID NO: 116)를 엔코딩하는 포유류 발현 벡터의 BamHI 부위로 독립적으로 클로닝하였다. 상기 발현 벡터 결과물은 C-말단상에서 융합된 두개의 단일 도메인 항체를 지니는 중쇄를 엔코딩한다. 상기 중쇄의 단백질 서열은 표 39에 제시된 바와 같이 SEQ ID NO: 195, 196 및 197에 주어져 있다.
표 39는 작제된 mAbdAbs를 요약한 것이다.
표 39
Figure pct00074
31.2 발현 및 정제
BPC1008, BPC1009 및 BPC1010의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 293펙틴(Invitrogen, 12347019)을 이용하여 HEK 2936E세포로 형질감염시켰다. 트립톤 피드를 다음날 상기 세포 배양에 첨가하고, 최초 형질감염으로부터 약 2 내지 6일 후 상층 물질을 수확하였다. 단백질 A 컬럼을 이용하여 항체를 정제하고 결합 분석에서 테스트하였다.
31.3: IL -4 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 코팅 완충용액(0.05M 중탄산염 pH9.6, Sigma C-3041)3 내에서 5μg/ml의 인간 IL-4(GSK)로 코팅하고, 밤새 4℃에 두었다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 100μL의 차단 용액(TBST 완충용액 중 1% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 정제된 항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 3회 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1/2000로 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 3회 세척한 후, OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 5분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
상기 ELISA의 결과가 도 158에 도시되어 있으며, 항체 BPC1008, 1009 및 BPC1010가 재조합 인간 IL-4에 결합함을 확인시키고 있다. 양성 대조군 Pascolizumab 또한 재조합 IL-4에 결합을 보였으나, 음성 대조군 항 IL-13 mAb 및 Mepolizumab는 IL-4에 결합을 보이지 않았다. 항체 BPC1009 및 BPC1010는 별개의 실험에서 또한 테스트되었고, 이는 도 158에 도시된 것들에 대해 유사한 결과를 나타낸다.
31.4: IL -5 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 코팅 완충용액(0.05M 중탄산염 pH9.6) 내에서 5.9μg/ml의 인간 IL-5(GSK)로 코팅하고, 밤새 4℃에 두었다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20(TBST)으로 2회 세척하였다. 100μL의 차단 용액(TBST 완충용액 중 1% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 정제된 항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 3회 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1/2000로 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 3회 세척한 후, OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 5분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
상기 ELISA의 결과가 도 159에 도시되어 있으며, 이는 항체 BPC1008가 재조합 인간 IL-5에 결합하는 반면, BPC1009 및 BPC1010는 IL-5에 결합을 보이지 않음을 확인시키고 있다. 양성 대조군 Mepolizumab 또한 재조합 IL-5에 결합을 보였으나, 음성 대조군 항 IL-13 mAb 및 Pascolizumab는 IL-5에 결합을 보이지 않았다.
IL -13 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 코팅 완충용액(0.05M 중탄산염 pH9.6, Sigma C-3041)3 내에서 5μg/ml의 인간 IL-13(GSK)로 코팅하고, 밤새 4℃에 두었다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20(TBST)으로 2회 세척하였다. 100μL의 차단 용액(TBST 완충용액 중 1% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 정제된 항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 3회 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1/2000로 희석시키고 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 3회 세척한 후, OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 5분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
상기 ELISA의 결과가 도 160에 도시되어 있으며, 항체 BPC1008, 1009 및 BPC1010이 재조합 인간 IL-13에 결합함을 확인시키고 있다. 양성 대조군 항 IL-13 mAb 또한 재조합 IL-13에 결합을 보였으나, 음성 대조군 Pascolizumab 및 Mepolizumab는 IL-13에 결합을 보이지 않았다. 항체 BPC1009 및 BPC1010는 별개의 실험에서 또한 테스트되었고, 이는 도 160에 도시된 것들에 대해 유사한 결과를 나타낸다.
실시예 32
1가 골격에 융합된 단일 도메인 항체를 지니는 mAbdAbs
32.1 mAbdAbs 의 작제
1가 항체의 융합을 포함하는 이특이성 항체(추가 정보는 WO2006015371 및 WO2007059782 참조) 및 도메인 항체 DOM-15-26-293를 하기와 같이 작제하였다. 항-c-메트 놉(Met Knob)-인투(into)-홀(hole) 중쇄(SEQ ID NO: 202 및 203)를 엔코딩하는 DNA 서열을 PCR-기초 전략 후 위치 지정 돌연변이 유발을 이용하여 작제하였다. 항-c-메트 유니바디(Met Unibody) 중쇄(SEQ ID NO: 204)를 엔코딩하는 DNA 서열을 PCR-기초 전략 후 PCR-기초 접근법에 의한 힌지 영역의 제거를 이용하여 작제하였다. 추가적으로, 융합 작제물을 위해, BamHI 및 EcoRI 제한 부위를 중쇄 발현 카세트의 C-말단에 포함시켜, 기존 벡터로부터의 BamHI- EcoRI 단편으로서, 항 VEGF-A 도메인 항체(DOM-15-26- 593) DNA 서열(SEQ ID NO: 75의 아미노산 455-570를 엔코딩하는)의 연이은 클로닝을 용이하게 하였다. 발현 벡터의 결과물은 GS 링커를 통해 중쇄의 C-말단상에 융합된 항-VEGFA 도메인 항체를 엔코딩한다(SEQ ID NO: 198, 199 및 201). 항-c-Met 경쇄를 엔코딩하는 DNA 서열(SEQ ID NO: 200)을 PCR-기초 전략에 의해 작제하였다.
BPC1604의 작제는 실시예 14에 기재되어 있다. 하기 표 40은 1가 골격 mAbdAbs 및 생성되고 발현된 항체를 요약한 것이다.
표 40
Figure pct00075
32.2 발현 및 정제
BPC1017, BPC1018, BPC1019 및 BPC1020의 중쇄를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 293펙틴(Invitrogen, 12347019)을 이용하여 HEK 2936E 세포로 형질감염시켰다. 트립톤 피드를 다음날 세포 배양액에 첨가하고, 최초 형질 감염으로부터 약 2 내지 6일 후에 상층 물질을 수확하였다. 항체를 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하고 결합 분석에서 테스트하였다.
32.3 HGF 수용체 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 코팅 완충용액(0.05M 중탄산염 pH9.6, Sigma C-3041)3 내에서 5μg/ml의 재조합 인간 HGFR(c-MET)Fc 키메라(R&D 시스템, 카탈로그 번호: 358-MT/CF)로 코팅하고, 밤새 4℃에 두었다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20(TBST)으로 2회 세척하였다. 100μL의 차단 용액(TBST 완충용액 중 1% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 30분 이상 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 3회 세척하였다. 그 다음 정제된 항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 실온에서 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 3회 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(시그마, A7164)를 차단 용액에서 1/2000로 희석시키고 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 3회 세척한 후, OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 5분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
상기 ELISA의 결과는 도 161에 도시되어 있으며, mAbdAbs BPC1017 및 BPC1018이 항체 BPC1019 및 BPC1020에 비교가능한 활성으로 재조합 인간 c-MET에 결합함을 확인시키고 있다. 음성 대조군 Pascolizumab 및 BPC1604(IGF-1 R/VEGF mAbdAb)는 c-MET에 결합을 보이지 않았다.
32.4 VEGF 결합 ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 내에서 0.4μg/mL의 인간 VEGF(GSK)로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 트리스-완충 식염수와 0.05% Tween-20(TBST)으로 2회 세척하였다. 100μL의 차단 용액(TBST 완충용액 중 4% BSA)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션하였다. 그 다음 또 다른 세척 단계를 수행하였다. 정제된 항체를 차단용액에서 상기 플레이트에 거쳐 성공적으로 희석시켰다. 1시간 실온에서 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척하였다. 염소 항-인간 카파 경쇄 특이적 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체를 차단 용액에서 1/2000로 희석시키고 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계 후, OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 시그마패스트(SigmaFast) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산을 첨가함으로서 5분 후 상기 반응을 중단시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용한 벌사맥스 튜나블 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 162는 ELISA의 결과를 도시하고 있고, mAbdAbs BPC1017 및 BPC1018가 재조합 인간 VEGF에 결합함을 확인시키고 있다. 양성 대조군 BPC1604 또한 재조합 인간 VEGF에 결합을 보였으나, Pascolizumab, BPC1019 및 BPC1020는 VEGF에 결합을 보이지 않았다.
실시예 33
항- IL13 dAbs DOM10 -53-546 dAb 및 DOM10 -53- 567를 포함하는 mAbdAbs
33.1 작제 , 발현 및 정제
표 41에 도시된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs를 클로닝하고 HEK2936E 세포에서 일시적으로 발현시키고, 정제하였다(실시예 1, 1.3 및 1.5 각각에 기재된 바와 같이).
표 41
Figure pct00076
정제된 PascoH-TVAAPS-546 및 PascoH-TVAAPS-567 mAbdAbs를 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 소듐 도데실 설페이트 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)에 의해, 환원 조건하에서 분석하였다. 상기 SEC 및 SDS PAGE 데이타가 도 163, 164, 165 및 166에 도시되어 있다.
33.2 IL -13 및 IL -4에 대한 결합의 비아코어 분석
정제된 PascoH-TVAAPS-546 및 PascoH-TVAAPS-567를 인간 IL-13 및 인간 IL-4에 대한 결합에 대해 BIAcore™ T100을 이용하여 25℃에서(방법 4 및 5에 기재된 바와 같이) 테스트하였다. 이 데이타는 표 42에 도시되어 있다.
표 42
Figure pct00077
이 분석에서 테스트된 mAbdAbs는 IL-4에 매우 높은 친화력(NB, PascoH-TVAAPS-567의 경우, 기계의 민감도를 넘음), 및 항-인간 IL4 mAb 단독(Pascolizumab)과 유사한 결합 친화력으로 결합하였다. PascoH-TVAAPS-546 및 PascoH-TVAAPS-567 둘 모두는 IL-13에 결합하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-13 dAbs 단독(DOM 10-53-546 및 DOM10-53-567)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
이 mAbdAbs를 또한 시노몰구스 IL-13에 대한 결합에 대해 BIAcore™ T100을 이용하여 25℃에서(방법 23에 기재된 바와 같이) 테스트하였다. 이 데이타는 표 43에 도시되어 있다. 500 내지 750의 상대 반응 단위 사이의 mAbdAb 포획 수준이 달성되었고, 6개의 IL-13 농도 곡선(256, 64, 16, 4, 1 및 0.25nM)이 mAbdAbs 및 항-IL13 mAb 둘 모두에 대해 평가되었다.
표 43
Figure pct00078
PascoH-TVAAPS-546 및 PascoH-TVAAPS-567 둘 모두는 유사한 결합 친화력으로 시노몰구스 IL-13에 결합하였다. dAb는 단백질 A 또는 CM5 칩이 코팅된 항-인간 IgG 상에 포획될 수 없기 때문에 항-IL-13 dAbs 단독(DOM 10-53-546 및 DOM 10-53-567)은 이 분석에서 테스트되지 않았고; 대신, 항-인간 IL13 mAb가 이 분석에서 IL-13 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었음을 주의하라.
33.3 TF -1 세포 생물분석에서 인간 IL -13 및 시노몰구스 IL -13의 중화
정제된 PascoH-TVAAPS-546 및 PascoH-TVAAPS-567를 TF-1 세포 생물분석(방법 8 및 방법 20 각각에 기재된 바와 같이)에서 인간 IL-13 및 시노몰구스 IL-13의 중화에 대해 테스트하였다. 도 167 및 168은 인간 IL-13 및 시노몰구스 IL-13 (TF-1 세포 생물분석에서) 각각에 대한 중화 데이타를 도시하고 있다. DOM 10-53-616은 이 생물분석에서 IL-13의 중화에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 무관한 항원에 대해 특이성을 지니는 dAb(음성 대조군 dAb)가 또한 IL-13의 중화에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. 게다가, PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616가 또한 이 분석에 포함되었다.
PascoH-TVAAPS-546 및 PascoH-TVAAPS-567 둘 모두 TF-1 세포 생물분석에서 인간 및 시노몰구스 IL-13의 생물활성을 충분히 중화시켰다.
이 데이타 세트로부터 ND50 값을 계산하였다. 상기 ND50 값은 IL-13의 생물활성을 50％까지 중화시킬 수 있는 mAbdAb 또는 mAb 또는 dAb의 농도이다. 평균 ND50 값, 표준 편차(SD) 및 테스트 횟수(n)가 표 44에 도시되어 있다.
표 44
Figure pct00079
실시예 34
IgG2 , IgG4 및 IgG4PE 중쇄 불변 영역을 지니는 mAbdAbs
34.1 mAbdAbs 의 작제
인간 항체 이소형 IgG2, IgG4 및 변이체 IgG4(IgG4PE) 유전자의 중쇄 불변 영역을 기존 작제물로부터 PCR을 이용하여 증폭시키고, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 PascoH-GS-474 중쇄(SEQ ID NO: 48)를 엔코딩하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 계획되고 테스트된 mAbdAbs 항체가 표 45에 나열되어 있다.
표 45
Figure pct00080
34.2 발현
표 45에 제시된 mAbdAbs를 BPC1000으로 지정된 PascoH-GS-474(SEQ ID NO: 48 및 15)와 함께, 발현시켰다. 간략히, 1.5x106 세포/ml의 HEK293 세포 750μl을 미리 293펙틴 시약(Invitrogen # 51-0031)으로 인큐베이션한 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 이를 37°C, 5% CO2, 및 95%RH로 진탕 인큐베이션안에 두었다. 1시간 후, 트립톤 피드 배지를 첨가하고 상기 세포를 추가 72시간동안 성장시켰다. 원심분리에 의해 상층액을 수확하였다.
34.3 IL -4 결합 ELISA
이 mAbdAbs를 포함하는 상층액을 재조합 인간 IL-4에 대한 결합에 대해 평가하였다. 간략히, ELISA 플레이트를 1 μg/ml의 인간 IL-4(GSK 제조)로 코팅하고, 차단 용액(트리스 완충 식염수 중 4% BSA)으로 차단하였다. 상기 세포 상층액의 다양한 희석액, IL-4 모노클로날 항체(Pascolizumab) 및 무관한 특이성의 항체(586 항 IL-13)를 첨가하였다.
모든 샘플을 차단 용액으로 희석시켰다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS + 0.05% Tween 20 (TBST)로 세척하였다. 결합을 차단 용액 중 1/1000의 희석액에서 퍼옥시다아제 라벨링된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)의 첨가에 의해 감지하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 상기 플레이트에 OPD 기질(Sigma P9187)을 첨가함으로서 발달시키고 3M H2SO4을 첨가함으로서 발색 현상을 중지시켰다. 플레이트 리더를 이용해 490nm에서 흡광도를 측정하고 평균 흡광도를 플로팅하였다.
상기 결과는 도 169에 제시되어 있으며, 이는 대안적 이소형을 포함하는 mAbdAbs 전부가 인간 IL-4에 결합함을 도시하고 있다. mAbdAbs BPC1000, BPC1617, BPC1618 및 BPC1619의 경우, 상층액 내 항체의 양은 정량화되지 않았고 따라서 도 169에 제시된 데이타는 깔끔한 상층 물질의 희석 인자로서 대표된다. 항-IL4 및 IL-13 대조군 항체의 경우, 정제된 물질이 분석에서 사용되었고, 1μg/ml 및 1μg/ml의 시작 농도를 각각 사용하였다(도 169의 희석 인자와 동일).
34.4 IL -13 결합 ELISA
이 mAbdAbs를 포함하는 상층액을 재조합 인간 IL-13에 대한 결합에 대해 평가하였다. 간략히, ELISA 플레이트를 5μg/ml의 인간 IL-13(GSK 제조)으로 코팅하고, 차단 용액(트리스 완충 식염수 중 4% BSA)으로 차단하였다. 상기 세포 상층액의 다양한 희석액, 항 IL-13 모노클로날 항체(586) 및 무관한 특이성의 항체(Pascolizumab 항 IL-4)를 첨가하였다.
모든 샘플을 차단 용액으로 희석시켰다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS + 0.05% Tween 20 (TBST)로 세척하였다. 결합을 차단 용액 중 1/1000의 희석액에서 퍼옥시다아제 라벨링된 항 인간 카파 경쇄 항체(Sigma A7164)의 첨가에 의해 감지하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 TBST로 세척하였다. 상기 플레이트에 OPD 기질(Sigma P9187)을 첨가함으로서 발달시키고 3M H2SO4을 첨가함으로서 발색 현상을 중지시켰다. 플레이트 리더를 이용해 490nm에서 흡광도를 측정하고 평균 흡광도를 플로팅하였다.
상기 결과는 도 170에 제시되어 있으며, 이는 대안적 이소형을 포함하는 이특이성 항체 전부가 인간 IL-13에 결합함을 도시하고 있다. 이특이성 항체 BPC1000, BPC1617, BPC1618 및 BPC1619의 경우, 상층액 내 항체의 양은 정량화되지 않았고 따라서 도 170에 제시된 데이타는 깔끔한 상층 물질의 희석 인자로서 대표된다. 항-IL4 및 IL-13 대조군 항체의 경우, 정제된 물질이 상기 분석에서 1μg/ml 및 1μg/ml 시작 농도로 각각 사용되었다(도 170의 희석 인자와 동일).
실시예 35
대안적 항- IL -13/ IL -4 mAbdAbs
35.1 대안적 가변 영역 서열을 지니는 항- IL -13/ IL -4 mAbdAbs 의 작제
표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 'C1' 및 'D1'로 지정된 대안적 중쇄 가변 영역 항-IL-13 mAb를 엔코딩하는 DNA 서열을 기존 작제물로부터, 상기 불변 영역의 C-말단에서 TVAAPSGS 링커를 통해 항 IL-4 도메인 항체(DOM9-112-210)에 융합된 hlgG1 불변 영역을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 전달하였다. 'MO' 및 'NO'로 지정된 IL-13mAbs의 대안적 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 DNA 서열을 새롭게 조립하고 인간 Ck 불변 영역을 포함하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 이 대안적 중쇄 및 경쇄 항체 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 및 13에 기재된 항-IL-13 항체와 같은 동일한 CDR 영역이지만, 대안적 인간화된 가변 프레임워크 영역을 포함하였다.
35.2 항 IL -13 mAb '656'의 가변 영역을 이용한 mAbdAbs 의 작제
표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 인간화된 항 IL-13 mAb '656'의 중쇄 가변 영역을 포함하는 DNA 서열을, 기존 작제물로부터 전달하고, 상기 불변 영역의 C-말단에서 TVAAPS 링커를 통해 항 IL-4 도메인 항체(DOM9-112-210)에 융합된 hlgG1 불변 영역을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 DNA 서열을 기존 작제물로부터 전달하고 인간 Ck 불변 영역을 포함하는 발현 벡터로 클로닝하였다.
35.3 mAbdAbs 의 발현
간략히, 1.5x106 세포/ml의 HEK293 세포 25ml을 미리 293펙틴 시약(Invitrogen # 51-0031)으로 인큐베이션한 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 이를 37°C, 5% CO2, 및 95%RH에서 진탕 인큐베이션 안에 두었다. 24시간 후, 트립톤 피드 배지를 첨가하고 상기 세포를 추가 72시간동안 성장시켰다. 원심분리에 의해 상층액을 수확하고, ELISA에 의해 IgG 수준을 정량화하였다. 작제되고 발현된 항체는 표 46에 나열되어 있다.
표 46
Figure pct00081
35.4 IL -13에 대한 mAbdAbs 의 결합
IL-13에 대한 mAbdAbs의 결합 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. 간략히, 5μg/ml의 재조합 대장균-발현 인간 IL-13(GSK 제조 및 정제)를 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2시간 동안 차단시키고, 그 다음 mAbdAb 작제물을 상기 플레이트 아래로 적정하였다. 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체(카탈로그 번호 A7164, Sigma-Aldrich)의 1/1000 희석액을 이용하여 결합을 감지하였다.
도 177은 테스트된 분자 전부가 인간 IL-13에 결합할 수 있음을 도시하고 있다.
BPC1615가 상기 ELISA에서 결합을 보였을지라도, 이 분자의 농도를 정확하게 정량화하는 것은 불가능하였고, 따라서 이 분자에 대한 IL-13 결합 ELISA 데이타는 도 177에 플로팅되지 않았다. BPC1615 또한 독립된 비아코어 분석(표 47)에서 IL-13에 대해 높은 결합 친화력을 가지고 있음을 나타내었다.
35.5 BIAcore ™ 에 의한 항- IL13mAb -항- IL4dAbs 의 IL -13에 대한 결합
HEK 세포 형질감염에서 온 세포 상층액을 BIAcore™를 이용하여 25°C에서(방법 4에 기재된 것과 같이) 재조합 대장균-발현된 인간 IL-13에 대한 결합에 대해 또한 테스트하였다. BPC1601를 정제된 단백질로서 테스트하였다. 표 47에 제시된, 결합 친화력은, 모든 항체가 인간 IL-13에 대해 높은 결합 친화력을 나타냄을 확인시키고 있다.
표 47
Figure pct00082

실시예 36
인간 IL -5 및 인간 IL -13에 대해 특이성을 지니는 mAbdAb 의 생성
36.1 mAbdAb 의 작제 및 발현
SEQ ID NO: 65에 제시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 72에 제시된 경쇄를 지니는 mAbdAb 분자를 HEK2936E 세포에서 발현시켰다. 이것은 MepolizumabL-G4S-474 또는 BPC1021으로 지정되었다.
36.2 IL -5 및 IL -13에 대한 항- IL5mAb -항- IL13dAb 의 결합
이 mAbdAb(세포 상층액 내)를 직접 결합 ELISA(방법 1에 기재된 바와 같은)에서 인간 IL-13에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 이 데이타는 도 173에 도시되어 있다. 상기 샘플을 2배로 하여 형질감염시키고 테스트하였고, 이를 이하 샘플 A 및 샘플 B로 표기하였다.
이 mAbdAb는 IL-13과 결합하였다. 정제된 항-인간 IL13 mAb 단독은 이 분석에서 IL-13 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL-4 mAb(Pascolizumab) 및 항-인간 IL-5 mAb(Mepolizumab)는 IL-13 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다.
이 mAbdAb를 또한 직접 결합 ELISA(실시예 31.4에 기재된 바와 같은)에서 인간 IL-5에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 이 데이타는 도 174에 도시되어 있다.
MepolizumabL-G4S-474는 IL-5에 결합하였다. 정제된 항-인간 IL4 mAb(Pascolizumab) 및 정제된 항 인간 13 mAb는 IL-5에의 결합에 대한 음성 대조군으로서 포함되었다. 정제된 항-인간 IL5 mAb(Mepolizumab)는 이 분석에서 IL-5 결합을 설명하기 위한 양성 대조군으로서 포함되었다.
서열
표 49:
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088

도면의 간단한 설명
도 1 내지 7: 항원-결합 작제물의 예시
도 8: mAbdAb 작제물의 개열 구성도.
도 9: PascoH-G4S-474의 SEC 및 SDS 페이지 분석
도 10: PascoL-G4S-474의 SEC 및 SDS 페이지 분석
도 11 : PascoH-474의 SEC 및 SDS 페이지 분석
도 12: PascoHL-G4S-474의 SEC 및 SDS 페이지 분석
도 13: 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 상층액의 인간 IL-13에 대한 결합
도 14: 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 상층액의 인간 IL-4에 대한 결합
도 15: 직접 결합 ELISA에서 정제된 mAbdAbs의 인간 IL-13에 대한 결합
도 16: 직접 결합 ELISA에서 정제된 mAbdAbs의 인간 IL-4에 대한 결합
도 17: 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 상층액의 인간 IL-4에 대한 결합
도 18: 직접 결합 ELISA에서 mAbdAb 상층액의 인간 IL-13에 대한 결합
도 19: 직접 결합 ELISA에서 정제된 mAbdAb의 인간 IL-4에 대한 결합
도 2OA: 직접 결합 ELISA에서 정제된 mAbdAb의 인간 IL-13에 대한 결합
도 2OB: 직접 결합 ELISA에서 정제된 mAbdAb의 시노몰구스 IL-13에 대한 결합
도 21: BIAcore™를 이용한 IL-4에 대한 mAbdAb 결합 동역학
도 22: BIAcore™를 이용한 IL-4에 대한 mAbdAb 결합 동역학
도 23: BIAcore™를 이용한 IL-13에 대한 mAbdAbs 결합 동역학
도 24: TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-13을 중화시키는 정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAbs의 능력.
도 25: TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-4을 중화시키는 정제된 항-IL13mAb-항-IL4dAbs의 능력.
도 26: TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-4을 중화시키는 정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoH L-G4S-474의 능력
도 27: TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-13을 중화시키는 정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoHL-G4S-474의 능력
도 28: 이중 중화 TF-1 세포 생물분석에서 정제된 항-IL4mAb-항-IL13dAbs, PascoH-G4S-474, PascoH-474, PascoL-G4S-474 및 PascoH L-G4S-474의 인간 IL-4 및 인간 IL-13을 동시에 중화시키는 능력
도 29: D0M10-53-474 SEC-MALLS
도 30: DOM9-112-210 SEC-MALLS
도 31 : DOM9-155-25 SEC-MALLS
도 32: 모든 세개 신호의 DOM9-155-25 SEC-MALLS 오버레이
도 33: DOM9-155-147 SEC-MALLS
도 34: D0M9-155-159 SEC-MALLS
도 35: SEC-MALLS에 의한 MW 할당에 대한 대조군: BSA
도 36: 삼중특이적 mAbdAb 분자의 개열 구성도
도 37: 직접 결합 ELISA에서 삼중특이적 mAbdAb IL18mAb-210-474(상층액)의 인간 IL-18에 대한 결합
도 38: 직접 결합 ELISA에서 삼중특이적 mAbdAb IL18mAb-210-474(상층액)의 인간 IL-13에 대한 결합
도 39: 직접 결합 ELISA에서 삼중특이적 mAbdAb IL18mAb-210-474(상층액)의 인간 IL-4에 대한 결합
도 40: 직접 결합 ELISA에서 삼중특이적 mAbdAb Mepo-210-474(상층액)의 인간 IL-13에 대한 결합
도 41: 직접 결합 ELISA에서 삼중특이적 mAbdAb Mepo-210-474(상층액)의 인간 IL-4에 대한 결합
도 42: 항-TNF/항-EGFR mAb-dAb의 클로닝
도 43: 항-TNF/항-EGFR mAb-dAb의 SDS-PAGE 분석
도 44: 항-TNF/항-EGFR mAb-dAb의 SEC 프로파일(실시예 10)
도 45: 실시예 10의 항-EGFR 활성
도 46: 실시예 10의 항-TNF 활성
도 47: 항-TNF/항-VEGF mAb-dAb의 SDS-PAGE 분석(실시예 11)
도 48: 항-TNF/항-VEGF mAb-dAb의 SEC 프로파일(실시예 11)
도 49: 실시예 11의 항-VEGF 활성
도 50: 실시예 11의 항-TNF 활성
도 51: 항-VEGF/항-IL1R1dAb-연장된-lgG의 클로닝(실시예 12)
도 52: 항-TNF/항-VEGF dAb-연장된 IgG A의 SDS-PAGE 분석(실시예 12)
도 53: 항-TNF/항-VEGF dAb-연장된 IgG B의 SDS-PAGE 분석(실시예 12)
도 54: 항-TNF/항-VEGF dAb-연장된 IgG A의 SEC 프로파일(실시예 12)
도 55: 항-TNF/항-VEGF dAb-연장된 IgG B의 SEC 프로파일(실시예 12)
도 56: 실시예 12의 항-VEGF 활성(DMS2091 )
도 57: 실시예 12의 항-VEGF 활성(DMS2090)
도 58: 실시예 12의 항-IL1 R1 활성(DMS2090)
도 59: 실시예 12의 항-IL1 R1 활성(DMS2091)
도 60: 항-TNF/항-VEGF/항-EGFR mAb-dAb의 클로닝(실시예 13)
도 61: 항-TNF/항-VEGF/항-EGFR mAb-dAb의 SDS-PAGE 분석(실시예 13)
도 62: 실시예 13의 항-VEGF 활성
도 63: 실시예 13의 항-TNF 활성
도 64: 실시예 13의 항-EGFR 활성
도 65: 정제된 이특이성 항체, BPC1603(A), BPC1604(B), BPC1605(C), BPC1606(D)의 SEC 분석
도 66: 고정된 IGF-1R에 대한 이특이성 항체의 결합
도 67: 고정된 VEGF에 대한 이특이성 항체의 결합
도 68: 다양한 이특이성 항체에 의한 리간드 매개 수용체 인산화의 저해
도 69: 다양한 이특이성 항체에 의한 리간드 매개 수용체 인산화의 저해
도 70: 항-CD20/IL-13 이특이성 항체를 이용한 ADCC 분석
도 71 : 항-CD20/IL-13 이특이성 항체를 이용한 ADCC 분석
도 72: 짧은 용량 범위를 이용한 항-CD20/IL-13 이특이성 항체의 ADCC 분석
도 73: 짧은 용량 범위를 이용한 항-CD20/IL-13 이특이성 항체의 ADCC 분석
도 74: 항-CD20/IL-13 이특이성 항체를 이용한 CDC 분석
도 75: 항-CD20/IL-13 이특이성 항체를 이용한 CDC 분석
도 76: 재조합 인간 IGF-1R ELISA에서 BPC1803 및 BPC1804의 결합
도 77: 재조합 VEGF 결합 ELISA에서 BPC1803 및 BPC1804의 결합
도 78: 재조합 인간 IGF-1R ELISA에서 BPC1805 및 BPC1806의 결합
도 79: 재조합 인간 HER2 ELISA에서 BPC1805 및 BPC1806의 결합
도 80: 재조합 인간 IGF-1R ELISA에서 BPC1807 및 BPC1808의 결합
도 81: 재조합 인간 HER2 ELISA에서 BPC1807 및 BPC1808의 결합
도 82: 재조합 인간 IL-4 ELISA에서 BPC1809의 결합
도 83: RNAse A ELISA에서 BPC1809의 결합
도 84: 재조합 인간 IL-4 ELISA에서 BPC1816의 결합
도 85: HEL ELISA에서 BPC1816의 결합
도 86: 재조합 인간 IGF-1 R ELISA 에서 BPC1801 및 BPC 1802의 결합
도 87: 재조합 인간 VEGFR2 ELISA에서 BPC1801 및 BPC1802의 결합
도 88: 재조합 인간 IL-4 ELISA에서 BPC1823 및 BPC 1822의 결합
도 88b: 재조합 인간 IL-4 ELISA에서 BPC1823(더 높은 농도의 상층액)의 결합
도 89: 재조합 인간 TNF-α ELISA에서 BPC1823 및 BPC1822의 결합
도 89b: 재조합 인간 TNF-α ELISA에서 BPC1823(더 높은 농도의 상층액)의 결합
도 90: GS 제거된 PascoH-474에 대한 SEC 프로파일
도 91: GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474에 대한 SEC 프로파일
도 92: 2번째 GS 제거된 PascoH-GS-ASTKGPT-474에 대한 SEC 프로파일
도 93: GS 제거된 586H-210의 SEC 프로파일
도 94: GS 제거된 586H-TVAAPS-210의 SEC 프로파일
도 95: GS 제거된 PascoH-474(레인 B) 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474(레인 A)에 대한 SDS PAGE
도 96: 2번째 GS 제거된 PascoH-GS-ASTKGPT-474에 대한 SDS PAGE[A = 비환원조건, B = 환원 조건]
도 97: GS 제거된 586H-210에 대한 SDS PAGE(레인 A)
도 98: GS 제거된 586H-TVAAPS-210에 대한 SDS PAGE(레인 A)
도 99: 인간 IL-4 ELISA에서 GS 제거된 정제된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474의 결합
도 100: 인간 IL-13 ELISA에서 GS 제거된 정제된 PascoH-474 및 GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474의 결합
도 101: 시노몰구스 IL-13 ELISA에서 GS 제거된 정제된 PascoH-474, GS 제거된 PascoH-TVAAPS-474, PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616의 결합
도 102: ELISA에 의한 인간 IL-4의 인간 IL-4Rα에 대한 결합의 mAbdAbs 저해
도 103: ELISA에 의한 인간 IL-4의 인간 IL-4Rα에 대한 결합의 mAbdAbs 저해
도 104: mAbdAbs에 의한 TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-13의 중화
도 105: mAbdAbs에 의한 TF-1 세포 생물분석에서 시노몰구스 IL-13의 중화
도 106: mAbdAbs에 의한 TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-4의 중화
도 107: mAbdAbs에 의한 TF-1 세포 생물분석에서 시노몰구스 IL-4의 중화
도 108: 인간 IL-13 결합의 인간 IL-13Rα2에 대한 결합을 저해하는 mAbdAbs의 능력
도 109: PascoH-616에 대한 SEC 프로파일
도 110: PascoH-TVAAPS_616에 대한 SEC 프로파일
도 111: PascoH-616에 대한 SDS PAGE [E1 = 비-환원 조건, E2 = 환원 조건]
도 112: PascoH-TVAAPS-616에 대한 SDS PAGE [A = 비-환원 조건, B = 환원 조건]
도 113: 인간 IL-13 ELISA에서 정제된 PascoH-616 및 PascoH-TVAAPS-616의 결합
도 114: TF-1 세포 생물분석에서 mAbdAbs에 의한 인간 IL-13의 중화
도 114a: mAbdAbs에 의한 TF-1 세포 생물분석에서 시노몰구스 IL-13의 중화
도 115: GS 제거된 PascoH-474에 의한 IL-4 활성의 억제
도 116: GS 제거된 PascoH-474에 의한 IL-13 활성의 억제
도 117:586-TVAAPS-210에 의한 IL-4 활성의 억제
도 118: 586-TVAAPS-210에 의한 IL-13 활성의 억제
도 119: Pascolizumab에 의한 IL-4 활성의 억제
도 120: DOM9-112-210에 의한 IL-4 활성의 억제
도 121 :항-IL13 mAb에 의한 IL-13 활성의 억제
도 122: DOM 10-53-474에 의한 IL-13 활성의 억제
도 123: IL-4 전혈 분석에서 대조군 mAb 및 dAb의 활성
도 124: IL-13 전혈 분석에서 대조군 mAb 및 dAb의 활성
도 125: TNF & EGFR 둘 모두에 대해 ELISA에서 분석된, 투여-후 다양한 시점에 남아있는 약물의 농도
도 126: TNF & VEGF 둘 모두에 대해 ELISA에서 분석된, 투여-후 다양한 시점에 남아있는 약물의 농도
도 127: IL1R1 & VEGF 둘 모두에 대해 ELISA에서 분석된, 투여-후 다양한 시점에 남아있는 약물의 농도
도 128: 정제된 DMS4010의 SDS-PAGE
도 129: 정제된 DMS4010의 SEC 프로파일
도 130: DMS4010의 항-EGFR 효능
도 131 : 항-VEGF 수용체 결합 분석
도 132: 이중 표적화 항-EGFR/항-VEGF mAbdAb의 약물동역학 프로파일
도 133: 정제된 DMS4011의 SDS-PAGE 분석
도 134: 정제된 DMS4011의 SEC 프로파일
도 135: DMS4011의 항-EGFR 효능
도 136:항-VEGF 수용체 결합 분석에서 DMS4011
도 137: 정제된 샘플 DMS4023 및 DMS4024의 SDS-PAGE 분석
도 138: DMS4023에 대한 SEC 프로파일
도 139: DMS4024에 대한 SEC 프로파일
도 140: mAbdAb DMS4023의 항-EGFR 효능
도 141: 항-VEGF 수용체 결합 분석에서 DMS4023 및 DMS4024
도 142: 정제된 DMS4009의 SDS-PAGE 분석
도 143: DMS4009에 대한 SEC 프로파일
도 144: mAbdAb DMS4009의 항-EGFR 효능
도 145: 항-VEGF 수용체 결합 분석에서 DMS4009
도 146: 정제된 DMS4029의 SDS-PAGE 분석
도 147: DMS4029에 대한 SEC 프로파일
도 148: mAbdAb DMS4029의 항-EGFR 효능
도 149: IL-13 세포-기초 중화 분석에서 DMS4029
도 150: 정제된 샘플 DMS4013 및 DMS4027의 SDS-PAGE 분석
도 151: DMS4013에 대한 SEC 프로파일
도 152: DMS4027에 대한 SEC 프로파일
도 153: mAbdAb DMS4013의 항-EGFR 효능
도 154: 항-VEGF 수용체 결합 분석에서 DMS4013
도 155: 재조합 인간 IL-12 ELISA에서 BPC1616의 결합
도 156: 재조합 인간 IL-18 ELISA에서 BPC1616의 결합
도 157: 재조합 인간 IL-4 ELISA에서 BPC1616의 결합
도 158: 재조합 인간 IL-4 ELISA에서 BPC1008, 1009 및 BPC1010의 결합
도 159: 재조합 인간 IL-5 ELISA에서 BPC1008의 결합
도 160: 재조합 인간 IL-13 ELISA에서 BPC1008, 1009 및 BPC1010의 결합
도 161: 재조합 인간 c-MET ELISA에서 BPC1017 및 BPC1018의 결합
도 162: 재조합 인간 VEGF ELISA에서 BPC1017 및 BPC1018의 결합
도 163: PascoH-TVAAPS-546에 대한 SEC 프로파일
도 164: PascoH-TVAAPS-567에 대한 SEC 프로파일
도 165: PascoH-TVAAPS-546에 대한 SDS PAGE [A = 비-환원 조건, B = 환원 조건]
도 166: PascoH-TVAAPS-567에 대한 SDS PAGE [A = 비-환원 조건, B = 환원 조건]
도 167: TF-1 세포 생물분석에서 인간 IL-13에 대한 중화 데이타
도 168: TF-1 세포 생물분석에서 시노몰구스 IL-13에 대한 중화 데이타
도 169: 인간 IL-4 ELISA에서 대안적 이소형 결합을 포함하는 mAbdAbs
도 170: 인간 IL-13 ELISA에서 대안적 이소형 결합을 포함하는 mAbdAbs
도 171: 재조합 인간 EGFR ELISA에서 BPC1818 및 BPC1813의 결합
도 172: 재조합 인간 VEGFR2 ELISA에서 BPC1818 및 BPC1813의 결합
도 173: IL-13 ELISA에서 항-IL5mAb-항-IL13dAb의 결합
도 174: IL-5 ELISA에서 항-IL5mAb-항-IL13dAb의 결합
도 175: 재조합 인간 VEGFR2 ELISA에서 BPC1812의 결합
도 176: 재조합 인간 EGFR ELISA에서 BPC1812의 결합
도 177: 인간 IL-13 ELISA에서 mAbdAb의 결합
1. 도메인 항체
Figure pct00089
2. 링커
Figure pct00090
Figure pct00091
3. 모노클로날 항체
Figure pct00092
Figure pct00093
4. 이특이성 mAbdAbs
NB, "진한글씨체"의 밑줄 그어진 서열 부분은 링커에 해당한다.
'GS' 아미노산 잔기(BamHI 클로닝 부위로 사용된 DNA 코딩 서열)는 '진한글씨체'는 아니지만 밑줄 그어져 있다.
Figure pct00094
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Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
5. 사이토카인
6. 신호서열
Figure pct00107
7. IGF -1R 결합 CDRs
Figure pct00108
Figure pct00109
8. 삼중특이적 mAbdAbs
Figure pct00110
9. 이중 표적화 항- TNF /항- EGFR mAbdAb
Figure pct00111
10. 이중 표적화 항- TNF /항- VEGF mAbdAb
Figure pct00112
11. 이중 표적화 항- IL1 R1 /항- VEGF dAb -연장된 IgG
Figure pct00113
Figure pct00114
12. 삼중 표적화 항- TNF /항- EGFR /항- VEGF mAbdAb
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
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Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
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Figure pct00178
SEQUENCE LISTING <110> GLAXO GROUP LIMITED ASHMAN Claire BURDEN Neil ELLIS Jonathan Henry CLEGG Stephanie Jane HAMBLIN Paul Andrew DE WILDT Rudolf Maria BATUWANGALA Thil HUSSAIN Farhana JESPERS Laurent LEWIS Alan STEWARD Michael ORECCHIA Martin A SHAH Radha <120> Antigen binding constructs <130> PB62748 <150> US60/991449 <151> 2007-11-30 <150> US61/027858 <151> 2008-02-12 <150> US61/046572 <151> 2008-04-21 <150> US61/081,191 <151> 2008-07-16 <150> US61/084,431 <151> 2008-07-29 <160> 270 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro Ile Ser Asp Trp 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ala Trp Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Glu 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1380 gtcagcggcg gcggcctggt ccagcccgga ggctcactga ggctgagctg cgccgctagc 1440 ggcttcacct tcaaggccta ccccatgatg tgggtcaggc aggcccccgg caaaggcctg 1500 gagtgggtgt ctgagatcag ccccagcggc agctacacct actacgccga cagcgtgaag 1560 ggcaggttca ccatcagcag ggacaacagc aagaacaccc tgtacctgca gatgaactct 1620 ctgagggccg aggacaccgc cgtgtactac tgcgccaagg accccaggaa gctggactat 1680 tggggccagg gcactctggt gaccgtgagc agc 1713 <210> 228 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised <400> 228 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactaca tgaactgggt gcggcaggcc 120 ccaggccagg gactggaatg gatgggcaac atcaacccca acaacggcgg caccaactac 180 aaccagaagt tcaaggaccg ggtcaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc ccggtggatc 300 ctgtactacg gccggtccaa gtggtacttc gacgtgtggg gcaggggcac actagtgacc 360 gtgtccagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc 420 accagcggcg 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Sequence <220> <223> Humanised <400> 267 caggtgaccc tgagggagag cggccccgcc ctggtgaagc ccacccagac cctgaccctg 60 acctgcacct tcagcggctt tagcctcagc acctccggca tgggcgtgag ctggatcagg 120 cagccacccg gcaaaggcct ggagtggctg gcccacatct actgggacga cgacaagagg 180 tacaacccca gcctgaagag ccggctgacc atcagcaagg ataccagcag gaaccaggtg 240 gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcta cctactactg cgccaggagg 300 gagaccgtct tctactggta cttcgacgtg tggggaaggg gcacactagt caccgtgagc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc cctgcagcag aagcaccagc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 agctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaccgtggag 660 cggaagtgct gcgtggagtg ccccccctgc cctgcccctc ctgtggccgg accctccgtg 720 ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgggagg aacagttcaa cagcaccttc 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcctgcc cccatcgaga aaaccatcag caagaccaag 1020 ggccagccca gggaacccca ggtgtacacc ctgcccccca gccgggagga aatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccat gctggacagc 1200 gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg acagtggaca agagccggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 1320 ctgagcctgt cccccggcaa gggatccggc gtgcagctcc tggagagcgg cggaggcctg 1380 gtccagcccg gcggcagcct gaggctgagc tgcgccgcca gcggcttcac cttcgcctgg 1440 tatgatatgg gctgggtgag gcaggccccc ggcaagggcc tggagtgggt gtccagcatc 1500 gactggcacg gggaggtgac ctactacgcc gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc 1560 agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc 1620 gcagtgtact actgcgccac cgccgaggac gaacccggct acgactactg gggccagggc 1680 accctggtga ctgtgagcag c 1701 <210> 268 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised <400> 268 caggtgaccc tgagggagag cggccccgcc ctggtgaagc ccacccagac cctgaccctg 60 acctgcacct tcagcggctt tagcctcagc acctccggca tgggcgtgag ctggatcagg 120 cagccacccg gcaaaggcct ggagtggctg gcccacatct actgggacga cgacaagagg 180 tacaacccca gcctgaagag ccggctgacc atcagcaagg ataccagcag gaaccaggtg 240 gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcta cctactactg cgccaggagg 300 gagaccgtct tctactggta cttcgacgtg tggggaaggg gcacactagt caccgtgagc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc cctgcagcag aagcaccagc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 agctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcaccaag 600 acctacacct gcaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gcgggtggag 660 agcaagtacg gccctccctg ccccagctgc cctgcccccg agttcctggg cggaccctcc 720 gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagccggac ccccgaggtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gatcccgagg tccagttcaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccccggg aggaacagtt caacagcacc 900 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagaatac 960 aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgccc agctccatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1020 aagggccagc ctcgggagcc ccaggtgtac accctgcccc catcccagga agagatgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 agcgacggca gcttcttcct gtacagcagg ctgaccgtgg acaagagccg gtggcaggaa 1260 ggcaacgtct ttagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 agcctgagcc tgtccctggg caagggatcc ggcgtgcagc tcctggagag cggcggaggc 1380 ctggtccagc ccggcggcag cctgaggctg agctgcgccg ccagcggctt caccttcgcc 1440 tggtatgata tgggctgggt gaggcaggcc cccggcaagg gcctggagtg ggtgtccagc 1500 atcgactggc acggggaggt gacctactac gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc 1560 agcagggaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac 1620 accgcagtgt actactgcgc caccgccgag gacgaacccg gctacgacta ctggggccag 1680 ggcaccctgg tgactgtgag cagc 1704 <210> 269 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised <400> 269 caggtgaccc tgagggagag cggccccgcc ctggtgaagc ccacccagac cctgaccctg 60 acctgcacct tcagcggctt tagcctcagc acctccggca tgggcgtgag ctggatcagg 120 cagccacccg gcaaaggcct ggagtggctg gcccacatct actgggacga cgacaagagg 180 tacaacccca gcctgaagag ccggctgacc atcagcaagg ataccagcag gaaccaggtg 240 gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcta cctactactg cgccaggagg 300 gagaccgtct tctactggta cttcgacgtg tggggaaggg gcacactagt caccgtgagc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc cctgcagcag aagcaccagc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 agctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcaccaag 600 acctacacct gcaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gcgggtggag 660 agcaagtacg gccctccctg ccccccctgc cctgcccccg agttcgaggg cggaccctcc 720 gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagccggac ccccgaggtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gatcccgagg tccagttcaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccccggg aggaacagtt caacagcacc 900 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagaatac 960 aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgccc agctccatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1020 aagggccagc ctcgggagcc ccaggtgtac accctgcccc catcccagga agagatgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 agcgacggca gcttcttcct gtacagcagg ctgaccgtgg acaagagccg gtggcaggaa 1260 ggcaacgtct ttagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 agcctgagcc tgtccctggg caagggatcc ggcgtgcagc tcctggagag cggcggaggc 1380 ctggtccagc ccggcggcag cctgaggctg agctgcgccg ccagcggctt caccttcgcc 1440 tggtatgata tgggctgggt gaggcaggcc cccggcaagg gcctggagtg ggtgtccagc 1500 atcgactggc acggggaggt gacctactac gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc 1560 agcagggaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac 1620 accgcagtgt actactgcgc caccgccgag gacgaacccg gctacgacta ctggggccag 1680 ggcaccctgg tgactgtgag cagc 1704 <210> 270 <211> 1641 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised <400> 270 caggtgaccc tgagggagag cggccccgcc ctggtgaagc ccacccagac cctgaccctg 60 acctgcacct tcagcggctt tagcctcagc acctccggca tgggcgtgag ctggatcagg 120 cagccacccg gcaaaggcct ggagtggctg gcccacatct actgggacga cgacaagagg 180 tacaacccca gcctgaagag ccggctgacc atcagcaagg ataccagcag gaaccaggtg 240 gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcta cctactactg cgccaggagg 300 gagaccgtct tctactggta cttcgacgtg tggggaaggg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagagct gtgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctggga 720 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cccgaggtga cctgtgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aagggatccg tgagcgacgt gccaagggac 1380 ctcgaggtgg tggcagccac tcccacctct ctgctgatca gctgggacac acacaacgcc 1440 tacaacggct actacaggat cacctacgga gagaccggcg gcaatagccc cgtgagggag 1500 ttcaccgtgc cccaccccga ggtgaccgcc accattagcg gcctgaagcc cggcgtggac 1560 gataccatca ccgtctacgc cgtgaccaac caccacatgc ccctgaggat cttcggcccc 1620 atcagcatca accataggac c 1641

Claims (49)

  1. 한 개 이상의 에피토프-결합 도메인과 연결된 단백질 골격(protein scaffold)을 포함하는 항원-결합 작제물(construct)로서, 상기 항원-결합 작제물이 두 개 이상의 항원 결합 부위를 가지고, 상기 항원 결합 부위 중 한 개 이상은 에피토프 결합 도메인에서 유래된 것이고 상기 항원 결합 부위 중 한 개 이상은 짝지은(paired) VH/VL 도메인으로부터 유래된 것인, 항원-결합 작제물.
  2. 두 개 이상의 하기 구조식 Ⅰ의 구조를 포함하는 한 개 이상의 동형이합체(homodimer)를 포함하는 항원-결합 작제물:
    Figure pct00179

    상기 구조식에서,
    X는 중쇄 불변 도메인 2 및 중쇄 불변 도메인 3을 포함하는 항체 불변 영역을 나타내고;
    R1, R4, R7 및 R8은 에피토프-결합 도메인에서 독립적으로 선택된 도메인을 나타내고;
    R2는 중쇄 불변 1, 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
    R3은 짝지은 VH 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
    R5는 경쇄 불변 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
    R6은 짝지은 VL 및 에피토프-결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 나타내고;
    n은 0,1,2,3 및 4에서 독립적으로 선택된 정수를 나타내고;
    m은 0 및 1에서 독립적으로 선택된 정수를 나타내고,
    상기 중쇄 불변 1과 경쇄 불변 도메인은 연결되어 있고;
    한 개 이상의 에피토프 결합 도메인이 존재하며;
    R3이 짝지은 VH 도메인을 나타내는 경우, R6은 짝지은 VL 도메인을 나타내어, 상기 두 도메인은 함께 항원에 결합할 수 있다.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 R6이 짝지은 VL을 나타내고, R3 이 짝지은 VH를 나타내는, 항원-결합 작제물.
  4. 제 3항에 있어서, R7 및 R8 중 어느 하나 또는 상기 둘 모두가 에피토프 결합 도메인을 나타내는, 항원-결합 작제물.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R4 중 어느 하나 또는 상기 둘 모두가 에피토프 결합 도메인을 나타내는, 항원-결합 작제물.
  6. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R4가 존재하는, 항원-결합 작제물.
  7. 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1, R7 및 R8이 에피토프 결합 도메인을 나타내는, 항원-결합 작제물.
  8. 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1, R7, R8, 및 R4가 에피토프 결합 도메인을 나타내는, 항원-결합 작제물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 한개 이상의 상기 에피토프 결합 도메인이 dAb인, 항원-결합 작제물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 dAb가 인간 dAb인, 항원-결합 작제물.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 dAb가 카멜리드(camelid) dAb인, 항원-결합 작제물.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 dAb가 상어(shark) dAb(NARV)인, 항원-결합 작제물.
  13. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    한 개 이상의 에피토프 결합 도메인이 CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예컨대, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디(Affibody), SpA), A-도메인(아비머/맥시바디(Avimer/Maxibody)); 열 충격 단백질, 예컨대, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 안키린 반복 단백질(ankyrin repeat protein)(DARPin); 펩티드 압타머; C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아플린(affilins)); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 저해제의 스콜피온 독성쿠니츠형 도메인(scorpion toxinkunitz type domains); 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin)) 중에서 선택된 골격으로부터 유래된,
    항원-결합 작제물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 에피토프 결합 도메인이 아피바디, 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 애드넥틴 중에서 선택된 골격에서 유래된, 항원-결합 작제물.
  15. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프 결합 도메인이 dAb, 아피바디, 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 애드넥틴 중에서 선택된, 항원-결합 작제물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 작제물이 한 개 이상의 항원에 대해 특이성을 가지는, 항원-결합 작제물.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 결합 부위가 항원 상의 제 1 에피토프에 대해 특이성을 가지고, 제 2 결합 부위가 동일한 항원 상의 제 2 에피토프에 대해 특이성을 가지는, 항원-결합 작제물.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 작제물이 IL-13에 결합할 수 있는, 항원-결합 작제물.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 작제물이 IL-13, IL-5, 및 IL-4 중에서 선택된 두 개 이상의 항원에 결합할 수 있는, 항원-결합 작제물.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 항원-결합 작제물이 IL-13 및 IL-4에 동시에 결합할 수 있는, 항원-결합 작제물.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 작제물이 VEGF, IGF-1R 및 EGFR 중에서 선택된 두 개 이상의 항원에 결합할 수 있는, 항원-결합 작제물.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 작제물이 TNF에 결합할 수 있는, 항원-결합 작제물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 항원-결합 작제물이 TNF 및 IL1-R에 결합할 수 있는, 항원-결합 작제물.
  24. 제 1항 또는 제 9항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 골격이 Ig 골격인, 항원-결합 작제물.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 Ig 골격이 IgG 골격인, 항원-결합 작제물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 IgG 골격이 IgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4 중에서 선택된, 항원-결합 작제물.
  27. 제 1항 또는 제 9항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 골격이 1가 항체를 포함하는, 항원-결합 작제물.
  28. 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG 골격이 항체의 도메인을 모두 포함하는, 항원-결합 작제물.
  29. 제 9항 내지 제 12항 또는 제 15항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 도메인 항체를 포함하는, 항원-결합 작제물.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 도메인 항체 중 두 개가 동일한 항원에 대해 특이성을 가지는, 항원-결합 작제물.
  31. 제 29항에 있어서, 상기 도메인 항체 모두가 동일한 항원에 대해 특이성을 가지는, 항원-결합 작제물.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 한 개 이상의 단일 가변 도메인이 1 내지 150개의 아미노산을 포함하는 링커로 Ig 골격에 직접적으로 부착된, 항원-결합 작제물.
  33. 제 32항에 있어서, 한 개 이상의 단일 가변 도메인이 1 내지 20개의 아미노산을 포함하는 링커로 Ig 골격에 직접적으로 부착된, 항원-결합 작제물.
  34. 제 33항에 있어서, 한 개 이상의 에피토프 결합 도메인이 SEQ ID NO: 6 내지 11로 제시된 서열 또는 'GS', 또는 이들의 임의의 조합물 중에서 선택된 링커로 Ig 골격에 직접적으로 부착된, 항원-결합 작제물.
  35. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 한개 이상의 에피토프 결합 도메인이 인간 혈청 알부민과 결합하는, 항원-결합 작제물.
  36. 제 21항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄의 N-말단에서 Ig 골격에 부착된 에피토프 결합 도메인을 포함하는, 항원-결합 작제물.
  37. 제 21항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄의 N-말단에서 Ig 골격에 부착된 에피토프 결합 도메인을 포함하는, 항원-결합 작제물.
  38. 제 21항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄의 C-말단에서 Ig 골격에 부착된 에피토프 결합 도메인을 포함하는, 항원-결합 작제물.
  39. 제 21항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄의 C-말단에서 Ig 골격에 부착된 에피토프 결합 도메인을 포함하는, 항원-결합 작제물.
  40. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 4개의 항원 결합 부위를 지니고, 4개의 항원에 동시에 결합할 수 있는, 항원-결합 작제물.
  41. 제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 의약(medicine)으로 사용하기 위한 항원-결합 작제물.
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 염증성 질환, 예컨대 천식, 류마티스관절염, 골관절염을 치료하기 위한 약제(medicament)의 제조에 사용하기 위한, 항원-결합 작제물.
  43. 제 1항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 기재된 항원-결합 작제물을 치료적 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 염증성 질환, 예컨대 천식, 류마티스관절염, 또는 골관절염에 걸린 환자를 치료하는 방법.
  44. 암 또는 염증성 질환, 예컨대 천식, 류마티스관절염, 또는 골관절염의 치료를 위한 제 1항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 기재된 항원-결합 작제물.
  45. 제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 작제물의 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  46. 제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 작제물의 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  47. 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 작제물의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 한 개 이상 포함하는, 형질전환되거나 형질감염(transfection)된 재조합 숙주 세포.
  48. 제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 작제물의 생산 방법으로서, 상기 방법이 제 47항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항원 결합 작제물을 분리하는 단계를 포함하는, 항원 결합 작제물 생산 방법.
  49. 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제 조성물.
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