JP6475017B2 - ヘテロ二量体タンパク質の作出 - Google Patents
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Description
a)第1のホモ二量体タンパク質を第2のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、前記第2のホモ二量体タンパク質は、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、かつ、
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものである、
b)工程a)から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程
を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのin vitro法に関する。
x)第1のCH3領域を含む第1の免疫グロブリンFc領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸構築物を提供する工程、
y)第1のCH3領域を含む第2の免疫グロブリンFc領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸構築物を提供する工程、
ここで、前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、409位にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、前記第2のホモ二量体タンパク質は、366位、368位、370位、399位、405位および407位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ/または
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、各CH3領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記載のようにアッセイした場合に、0.01〜10マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜10マイクロモル濃度の間、より好ましくは、0.01〜5の間、例えば、0.05〜5マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、0.01〜1マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜1マイクロモル濃度の間、0.01〜0.5の間または0.01〜0.1の間であるものである、
z)前記第1の核酸構築物および前記第2の核酸構築物を宿主細胞において共発現させる工程
と置き換えられる。
本発明はまた以下に関する。
[項目1]
a)第1のホモ二量体タンパク質を第2のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、前記第2のホモ二量体タンパク質は、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、かつ、
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものである、工程、
b)工程a)から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのin vitro法。
[項目2]
工程b)が、工程a)から得た少なくとも10mLの組成物を、酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくことを含む、項目1に記載のin vitro法。
[項目3]
c)ヘテロ二量体タンパク質を得る工程をさらに含む、項目1又は2に記載のin vitro法。
[項目4]
工程a)における還元条件が還元剤を添加することを含む、項目1〜3のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目5]
前記還元剤が、2−メルカプトエチルアミン、2−メルカプトエチルアミンの化学誘導体、L−システインおよびD−システインからなる群から選択される、項目4に記載のin vitro法。
[項目6]
工程a)が金属キレート剤を添加することを含む、項目1〜5のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目7]
前記金属キレート剤がEDTA、EGTAまたはクエン酸である、項目6に記載のin vitro法。
[項目8]
工程a)における還元条件が工程a)における組成物中の酸素の量を減少させることを含む、項目1〜7のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目9]
工程a)が、−150〜−600mVの間、例えば、−350〜−450mVの間の酸化還元電位を用いる還元条件下で行われる、項目1〜8のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目10]
工程a)が、2−メルカプトエチルアミン、L−システインおよびD−システインからなる群から選択される少なくとも25mMの還元剤の存在下、少なくとも20℃の温度で少なくとも30分間のインキュベーションを含む、項目1〜9のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目11]
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質がバッファー中に存在する、項目1〜10のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目12]
前記バッファーがリン酸塩を1〜100mMの範囲、例えば、1〜50mMリン酸塩(phosphate)、または1〜25mMの範囲、または5〜20mMの範囲で含む、項目11に記載のin vitro法。
[項目13]
前記バッファーが、4.5〜8.5の範囲、例えば、6.5〜7.5の範囲のpHを有する、項目11又は12に記載のin vitro法。
[項目14]
前記バッファーが、a)8.1mMリン酸ナトリウム(Na 2 HPO 4 ・7H 2 O)、1.5mMリン酸カリウム(KH 2 PO 4 )、138mM塩化ナトリウム(NaCl)、2.7mM塩化カリウム(KCl)pH5.0;b)8.1mMリン酸ナトリウム(Na 2 HPO 4 ・7H 2 O)、1.5mMリン酸カリウム(KH 2 PO 4 )、138mM塩化ナトリウム(NaCl)、2.7mM塩化カリウム(KCl)pH7.0;3)20mM Tris−HCl、pH7.8からなる群から選択される、項目11〜13のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目15]
工程b)が6〜8.5の範囲のpHを含む、項目1〜14のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目16]
工程b)が少なくとも−300mVの酸化還元電位を含む、項目1〜15のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目17]
工程b)における酸化条件が、少なくとも0.05mMの酸素の存在を含む、項目1〜16のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目18]
工程b)における酸化条件が酸素の添加を含む、項目1〜17のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目19]
酸素の添加が、機械的に、例えば、振盪、撹拌、増圧または流れの創出により行われる、項目18に記載のin vitro法。
[項目20]
酸素の添加が、酸素もしくは空気を用いたスパージングまたは増圧により行われる、項目18又は19に記載のin vitro法。
[項目21]
工程b)における酸化条件が酸化剤を含む、項目1〜20のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目22]
前記酸化剤がデヒドロアスコルビン酸(dhAA)である、項目21に記載のin vitro法。
[項目23]
工程b)が、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離することを含む、項目1〜22のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目24]
工程b)が、工程a)から得た組成物をクロマトグラフィーまたは濾過に付すことを含む、項目23に記載のin vitro法。
[項目25]
前記クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである、項目24に記載のin vitro法。
[項目26]
前記濾過がダイアフィルトレーションである、項目24に記載のin vitro法。
[項目27]
前記ダイアフィルトレーションがタンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)またはノーマルフローフィルトレーション(NFF)である、項目26に記載の方法。
[項目28]
前記ダイアフィルトレーションがTFFである、項目27に記載のin vitro法。
[項目29]
前記ダイアフィルトレーションが、0.05〜1m 2 の範囲の表面積を有し、かつ、70〜280kPaの範囲のカートリッジ入口圧を示す、10〜50kDaの範囲のカットオフ値を含む中空糸カートリッジを通して前記組成物を、1〜7容量のバッファー交換が行われるまで循環させることにより行われる、項目27に記載のin vitro法。
[項目30]
ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離が、工程a)から得た組成物のバッファーまたは溶液を、前記還元剤を含まないバッファーまたは溶液と交換することを含む、項目23〜29のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目31]
3〜12容量の範囲での、例えば、4〜10容量の範囲でのバッファーまたは溶液交換を含む、項目30に記載のin vitro法。
[項目32]
ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離が連続プロセスである、項目24〜30のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目33]
ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離がバッチプロセスである、項目24〜30のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目34]
工程b)における酸化条件が、
I)工程a)から得た組成物のダイアフィルトレーション
II)工程I)から得た保持液のインキュベーション
III)工程II)から得た組成物のダイアフィルトレーション
の工程を含む、項目1〜33のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目35]
工程I)および/または工程III)におけるダイアフィルトレーションが3〜12容量の範囲でのバッファー交換を含む、項目34に記載のin vitro法。
[項目36]
工程II)が15〜35℃の範囲の温度で12〜48時間のインキュベーションを含む、項目34又は35に記載のin vitro法。
[項目37]
工程a)から得た組成物におけるヘテロ二量体タンパク質の濃度が1〜100g/Lの範囲内である、項目1〜36のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目38]
工程b)における酸化条件が金属イオンを含む、項目1〜37のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目39]
工程b)における酸化条件が金属イオンの添加を含む、項目38に記載のin vitro法。
[項目40]
前記金属イオンの濃度が0.1〜100μMの範囲内である、項目38又は39に記載のin vitro法。
[項目41]
前記金属イオンが、銅、マンガン、マグネシウム、鉄、ニッケルおよびコバルトからなる群から選択される、項目38〜40のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目42]
工程a)における第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質との比率が1:1.01〜1:2の範囲内である、項目1〜41のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目43]
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質はいずれもプロテインAおよび/またはプロテインGと結合することができない、項目1〜42のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目44]
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が異なる軽鎖を含む、項目1〜43のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目45]
工程c)が、一方の軽鎖だけが結合する材料に通すことによりヘテロ二量体タンパク質を残存した第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質から分離することを含む、項目44に記載のin vitro法。
[項目46]
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質のFc領域が異なるアロタイプのものである、項目1〜45のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目47]
工程c)が、一方のアロタイプだけが結合する材料に通すことによりヘテロ二量体タンパク質を残存した第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質から分離することを含む、項目44に記載のin vitro法。
[項目48]
工程c)が、工程b)から得た組成物を精製方法に付すことを含む、項目1〜47のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目49]
前記精製方法が、プロテインAまたはプロテインGクロマトグラフィー、抗原結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィー、抗イディオタイプ抗体に基づいたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー(例えば、ハイドロキシアパタイト)、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよびチオール基吸着クロマトグラフィーからなる群から選択される、項目48に記載のin vitro法。
[項目50]
工程a)が、
i)第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含む第1のホモ二量体タンパク質を提供する工程、
ii)第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含む第2のホモ二量体タンパク質を提供する工程を含み、
ここで、前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
iii)前記第1のタンパク質を前記第2のタンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程
を含む、項目1〜49のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目51]
工程b)が、工程a)から得た組成物の少なくとも30mLを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくことを含む、項目1〜50のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目52]
工程a)における第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質の総濃度が少なくとも0.25mg/mLである、項目1〜51のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目53]
第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列が同一でない位置にアミノ酸置換を含む、項目1〜52のいずれか一項に記載のin vitro。
[項目54]
野生型CH3領域と比べて、第1のホモ二量体タンパク質がCH3領域内にアミノ酸置換を1つだけ有し、第2のホモ二量体タンパク質がCH3領域内にアミノ酸置換を1つだけ有する、項目1〜53のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目55]
第1のホモ二量体タンパク質が、366位、368位、370位、399位、405位、407位および409位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質が、366位、368位、370位、399位、405位、407位および409位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質および前記第2のホモ二量体タンパク質が同じ位置で置換されていない、項目1〜54のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目56]
第1のホモ二量体タンパク質が409位にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質が、366位、368位、370位、399位、405位および407位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する、項目1〜55のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目57]
第1のホモ二量体タンパク質が409位にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質が405位にPhe以外のアミノ酸を有する、項目1〜56のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目58]
第1のホモ二量体タンパク質が409位にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質が405位にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸を有する、項目1〜57のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目59]
第1のホモ二量体タンパク質が409位に、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質が405位に、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択されるアミノ酸を有する、項目1〜58のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目60]
第1のホモ二量体タンパク質が409位に、Arg、Gly、His、ValおよびIleからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質が405位にLeuを有する、項目59に記載のin vitro法。
[項目61]
第1のホモ二量体タンパク質が409位にArgを有する、項目56〜60のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目62]
第2のホモ二量体タンパク質が405位にLeuを有する、項目56〜61のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目63]
第1のホモ二量体タンパク質が409位にArgを有し、第2のホモ二量体タンパク質が405位にLeuを有する、項目62に記載のin vitro法。
[項目64]
第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質がC末端リジンを含まない、項目1〜63のいずれか一項に記載のin vitro法。
[項目65]
第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質が、重鎖のC末端リジンを欠くように遺伝子改変されている、項目64に記載のin vitro法。
[項目66]
重鎖からC末端リジンを除去する工程を含む、項目64に記載のin vitro法。
[項目67]
x)第1のCH3領域を含む第1の免疫グロブリンFc領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸構築物を提供する工程、
y)第2のCH3領域を含む第2の免疫グロブリンFc領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸構築物を提供する工程、
ここで、前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、409位にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、前記第2のホモ二量体タンパク質は、366位、368位、370位、399位、405位および407位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ/または
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、各CH3領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記載のようにアッセイした場合に、0.01〜10マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜10マイクロモル濃度の間、より好ましくは、0.01〜5の間、例えば、0.05〜5マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、0.01〜1マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜1マイクロモル濃度の間、0.01〜0.5の間または0.01〜0.1の間であるものである、
z)前記第1の核酸構築物および前記第2の核酸構築物を宿主細胞において共発現させる工程、
b)工程z)から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのin vitro法。
[項目68]
項目1〜66に記載の特徴のいずれかを含む、項目67に記載のin vitro法。
[項目69]
第1のホモ二量体タンパク質または第2のホモ二量体タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記第1のホモ二量体タンパク質または前記第2のホモ二量体タンパク質の重鎖がC末端リジンを含まない、ヌクレオチド配列。
定義
「免疫グロブリン」という用語は、2対のポリペプチド鎖、すなわち、1対の低分子量軽(L)鎖および1対の重(H)鎖からなる、構造的に関連した糖タンパク質のクラスを意味し、4つは全てジスルフィド結合によって相互に連結されている。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))参照。簡単に述べると、各重鎖は、一般に、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、一般に、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3からなる。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」においてジスルフィド結合を介して相互に連結される。各軽鎖は、一般に、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、一般に、1つのドメイン、CLからなる。一般には、定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)に記載されているように、EUインデックスに従って行われる。図16は、抗体2F8の異なるアイソタイプ型についてのEUおよびKabatナンバリングの概略を示す(国際公開第02/100348号)。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と称されるより保存性の高い領域が点在した、相補性決定領域(CDR)とも称される超可変性の領域(すなわち、構造的に定義されたループの配列および/または形態において超可変性であり得る超可変領域)にさらに細分され得る。各VHおよびVLは、一般に、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された3つのCDRおよび4つのFRからなる(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)も参照)。
本明細書において用いられる場合、「第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用」という用語は、第1のCH3/第2のCH3ヘテロ二量体タンパク質における第1のCH3領域と第2のCH3領域との間の相互作用を意味する。
本発明は、
a)第1のホモ二量体タンパク質を第2のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、前記第2のホモ二量体タンパク質は、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、かつ、
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものである、
b)工程a)から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程
を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのin vitro法に関する。
z)第1のCH3領域を含む第1の免疫グロブリンFc領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸構築物を提供する工程、
y)第1のCH3領域を含む第2の免疫グロブリンFc領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸構築物を提供する工程、
ここで、前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、409位にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、前記第2のホモ二量体タンパク質は、366位、368位、370位、399位、405位および407位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつ/または
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、各CH3領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記載のようにアッセイした場合に、0.01〜10マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜10マイクロモル濃度の間、より好ましくは、0.01〜5の間、例えば、0.05〜5マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、0.01〜1マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜1マイクロモル濃度の間、0.01〜0.5の間または0.01〜0.1の間であるものである、
z)前記第1の核酸構築物(nucleic-acid concstructs)および前記第2の核酸構築物を宿主細胞において共発現させる工程
を含んでもよい。
b)工程a)から得た組成物の少なくとも10mLを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくこと
を含んでよい。
c)ヘテロ二量体タンパク質を得る工程
を含んでよい。
i)第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含む第1のホモ二量体タンパク質を提供する工程、
ii)第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含む第2のホモ二量体タンパク質を提供する工程を含み、
ここで、前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
iii)前記第1のタンパク質を前記第2のタンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程
を含んでよい。
本発明の方法を様々に用いて、ヘテロ二量体タンパク質の所望の組合せを生成することができ、その方法は二重特異性抗体の大規模作出に特に好適である。異なる抗原を標的とする抗体を組み合わせて選択的結合を得ることが可能であることに加え、その方法を用いて、同じ抗原を標的とする2つの異なる抗体を組み合わせることにより、所望の特性を変える、例えば、CDCを高めることもできる。さらに、その方法を用いて、無関係の(不活性な)抗体を用いてその非対称抗体を作製することにより、アンタゴニスト抗体の部分的アゴニスト活性を取り除き、またはアゴニスト抗体をアンタゴニスト抗体(antbody)へ変換することができる。
することができ、結果として得られる分子は、成熟技術は当技術分野で周知であるため、さらなる成熟、例えば、親和性成熟に付すことができる。
(i)368位にPhe、LeuおよびMet以外のアミノ酸、または
(ii)370位にTrp、または
(iii)399位にAsp、Cys、Pro、GluもしくはGln以外のアミノ酸を有する。
(i)368位にLys、Gln、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または
(ii)370位にTrp、または
(iii)399位にAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Trp、Phe、His、Lys、ArgもしくはTyr
を有する。
(i)368位にAsp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または
(ii)370位にTrp、または
(iii)399位にPhe、His、Lys、ArgもしくはTyrを有する。
配列番号1:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
さらなる実施形態では、第1のCH3領域および第2のCH3領域は、特定の突然変異を除き、配列番号2に記載の配列を含む(IgG1m(f)):
配列番号2:
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
さらなる実施形態では、第1のCH3領域および第2のCH3領域は、特定の突然変異を除き、配列番号3に記載の配列を含む(IgG1m(ax)):
配列番号3:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
本発明によるヘテロ二量体タンパク質の作出は、第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のCH3領域の間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の間の各ホモ二量体相互作用よりも強いことを含む。この効果は、特に、上記のように、第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質の上述のCH3改変例を用いて得ることができる。しかしながら、本明細書に記載のもの以外の突然変異を含む第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質も本発明の方法において用いてよいことは予測される。例えば、第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質は、Lindhofer et al. (1995) J Immunol 155:219により記載されているように、ラット抗体およびマウス抗体であってよく(上記参照)、または米国特許第5,731,168号に記載されているように、いわゆるknob−in−hole変種抗体であってよい(上記参照)。よって、本発明の一実施形態では、本発明の第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質は、米国特許第5,731,168号に記載されているknob−in−hole単一または二重改変を含んでよい。
上記のように、本発明の方法の工程a)は、第1のホモ二量体タンパク質を第2のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートすることを含む。「ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件」に関して「十分な」という用語は、Fabアーム交換反応を起こさせるという点に関するものであり得る。よって、特定の実施形態では、「ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件」とは、50%を超えるヘテロ二量体タンパク質、例えば、60%を超えるヘテロ二量体タンパク質、または70%を超えるヘテロ二量体タンパク質、または80%を超えるヘテロ二量体タンパク質、または90%を超えるヘテロ二量体タンパク質、または95%を超えるヘテロ二量体タンパク質、または99%を超えるヘテロ二量体タンパク質、または99.5%を超えるヘテロ二量体タンパク質、例えば、100%のヘテロ二量体タンパク質の作出をもたらす条件である。これに関しては、ヘテロ二量体タンパク質のパーセンテージは、第1のホモ二量体タンパク質、第2のホモ二量体タンパク質およびヘテロ二量体タンパク質の総量に対するものである。ヘテロ二量体タンパク質の量またはパーセンテージは、例えば、本明細書における実施例に記載のようにCIEXにより測定することができる。
OTR=kla×ln(DO*−DO)×s、
(式中、
OTR=酸素移動速度(mM/時間)
kla=酸素移動容量係数(1/時間)
DO*=平衡DO濃度(窒素=0%、空気=100%、酸素=500%)
DO=実際の溶存酸素濃度
s=酸素溶解度(およそ0.2mM/100%))
酸素移動範囲の最適な範囲は、還元剤のタイプおよび濃度によって異なる。
本発明の方法は、
b)工程a)から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程
をさらに含む。
b)工程a)から得た組成物の少なくとも10mLを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくこと
を含む。
I)工程a)から得た組成物のヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離する工程、
II)工程I)から得た、ヘテロ二量体タンパク質を含む組成物をインキュベートする工程、
III)工程II)から得た組成物のヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離する工程
を含み得る。
I)工程a)から得た組成物のダイアフィルトレーション工程
II)工程I)から得た保持液のインキュベーション工程
III)工程II)から得た組成物のダイアフィルトレーション工程
を含み得る。
本発明の方法は、多くの場合、高収量のヘテロ二量体タンパク質をもたらすが、本発明の方法によって得られた産物または組成物中に残存する第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質の量も存在し得る。
カルボキシペプチダーゼによる重鎖からのC末端リジンの除去は、哺乳動物細胞における抗体の組換え発現でも、in vivoにおいてヒト血清でもよく見られる抗体改変である(Cai et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. Sep 9)。除去は部分的であることが多く、C末端リジンが0(K0)、1つ(K1)または2つ(K2)の抗体の混合集団が生じる。特に、B細胞ハイブリドーマはK0分子、K1分子およびK2分子の混合物を産生する(Dick et al. (2008) Biotech. Bioeng. 100:1132)。
i)第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域をコードしかつ/または第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含むヌクレオチド構築物を提供すること、
ここで、前記構築物は、前記第1のCH3領域および/または前記第2のCH3領域のC末端にあるリジン残基をコードしない、
ii)宿主細胞において前記ヌクレオチド構築物を発現させること、
および
iii)前記宿主細胞の細胞培養物から前記第1のホモ二量体タンパク質および/または前記第2のホモ二量体タンパク質を回収すること
によって作出され得る。
さらなる態様において、本発明はまた、本発明の第1のホモ二量体タンパク質または第2のホモ二量体タンパク質をコードする核酸配列に関し、ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質または前記第2のホモ二量体タンパク質はC末端リジンを含まない。前記第1のホモ二量体タンパク質および前記第2のホモ二量体タンパク質は、本方法に関連して上に記載したもののいずれであってもよい。
本発明はまた、本発明の方法によって得られたヘテロ二量体タンパク質に関する。
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、409位に、Lys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、前記第2のホモ二量体タンパク質は、366位、368位、370位、399位、405位および407位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ/または
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、各CH3領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記載のようにアッセイした場合に、0.01〜10マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜10マイクロモル濃度の間、より好ましくは、0.01〜5の間、例えば、0.05〜5マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、0.01〜1マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜1マイクロモル濃度の間、0.01〜0.5の間または0.01〜0.1の間であるようなものである。
かつ/あるいは
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、各CH3領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記載のようにアッセイした場合に、0.01〜10マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜10マイクロモル濃度の間、より好ましくは、0.01〜5の間、例えば、0.05〜5マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、0.01〜1マイクロモル濃度の間、例えば、0.05〜1マイクロモル濃度の間、0.01〜0.5の間または0.01〜0.1マイクロモル濃度の間であるようなものである。
あるいは
第1のCH3領域は409位にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のCH3領域は407位にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸を有する。
上に説明したように、本発明の重要な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、結合特異性が異なる、すなわち、異なるエピトープと結合する2つの可変領域を含む二重特異性抗体である。
本発明のさらなる実施形態では、第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質は、以下からなる群から選択される化合物と連結される:毒素(放射性同位元素を含む)、プロドラッグまたは薬物。そのような化合物は、例えば、癌療法において、より効果的に標的細胞を死滅させることができる。従って、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質は免疫複合体である。あるいは、化合物を、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質と、すなわち、Fabアーム交換が行われた後にカップリングしてもよい。
本発明の方法によって作出されたヘテロ二量体タンパク質は、製薬上許容される担体を含む医薬組成物において用いることができる。
HuMab 2F8(国際公開第02/100348号)およびHuMab 7D8(国際公開第04/035607号)のVHコード領域およびVLコード領域を、ヒトIgG1重鎖の作出のために発現ベクターpConG1f(ヒトIgG1m(f)アロタイプ定常領域のゲノム配列を含有(Lonza Biologics))に、κ軽鎖の作出のためにpConKappa(ヒトκ軽鎖定常領域を含有、Lonza Biologics)にクローニングした。IgG4抗体の場合、VH領域をpTomG4ベクター(pEE12.4ベクター(Lonza Biologics)中にヒトIgG4定常領域のゲノム配列を含有)に挿入した。あるいは、追跡構築物において、pEE12.4ベクター中に重鎖(IgG1もしくはIgG4)またはpEE6.4ベクター(Lonza Biologics)中にHuMab 2F8もしくはHuMab 7D8のヒトκ軽鎖の完全にコドン最適化されたコード領域を含有するベクターを用いた。さらに、HuMab−2F8のコドン最適化されたVHコード領域を、F405L突然変異を含有するヒトIgG1m(za)アロタイプ定常領域のコドン最適化された配列とともに、pcDNA3.3ベクター(Invitrogen)にクローニングし、発現ベクターp33G1za−2F8−F405Lを得た。
抗体重鎖のヒンジ領域およびCH3領域に突然変異を導入するために、Quickchange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene,ラホヤ,カナダ)を製造業者の推奨に従って用いた。あるいは、構築物を完全に合成し、またはVH領域を、特定のアミノ酸をコードする置換を既に有しているベクターにクローニングした。
実施例3:アカゲザルIgG4−2F8およびIgG4−7D8の発現のための発現ベクター
中国アカゲザルのIgG4重鎖およびκ軽鎖ならびにHumab 2F8および7D8のVH領域およびVL領域のコード領域を含有するベクターを合成し、完全にコドン最適化し、pEE12.4(重鎖)およびpEE6.4(軽鎖)に挿入した。使用した重鎖定常領域配列(Scinicariello et al., Immunology 111: 66-74, 2004により記載されている配列に基づく)は以下であった(ヒト配列とアラインした):
実施例4:HEK−293F細胞での一過性発現による抗体作出
293fectin(Invitrogen)を製造業者の使用説明書に従って用い、無血清条件下で、HEK−293F細胞(Invitrogen)において関連する重鎖および軽鎖発現ベクターを同時トランスフェクトすることにより、抗体を作出した。
IgG1抗体およびIgG4抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。細胞培養上清を0.20μMのデッドエンドフィルターで濾過し、その後、5mLのプロテインAカラム(rProtein A FF,GE Healthcare,ウプサラ,スウェーデン)への添加および0.1Mクエン酸−NaOH、pH3でのIgGの溶出を行った。溶出液を2M Tris−HCl、pH9ですぐに中和し、12.6mMリン酸ナトリウム、140mM NaCl、pH7.4(B.Braun,オス,オランダ)に対して一晩透析した。透析後、サンプルを0.20μMのデッドエンドフィルターで濾過除菌した。精製されたIgGの濃度を比濁法および280nmでの吸光度により決定した。精製タンパク質をSDS−PAGE、IEF、質量分析および糖鎖分析(glycoanalysis)により分析した。
Hisタグ付きCH2−CH3タンパク質を固定化金属イオン(Ni2+)アフィニティークロマトグラフィー(Macherey−Nagel GmbH,デューレン,ドイツ)により精製し、PBSで平衡化したPD−10カラム(GE Healthcare)を用いて脱塩し、0.2μMのデッドエンドフィルターで濾過滅菌した。精製タンパク質の濃度を280nmでの吸光度により決定した。精製タンパク質の品質をSDS−PAGEにより分析した。
ヒトIgG4抗体とアカゲザルIgG4抗体との間でのFabアーム交換について試験するために、ヒトIgG4−2F8(抗EGFR)、ヒトIgG4−7D8(抗CD20)、アカゲザルIgG4−2F8およびアカゲザルIgG4−7D8を用いて、2つの抗体の考えられる全ての組合せを作製した。in vitro Fabアーム交換では、0.5mMの還元グルタチオン(GSH)を含むPBS0.5mL中終濃度4μg/mLで各抗体を含有する抗体混合物を37℃で24時間インキュベートした。還元反応を停止させるために、0.5mLのPBS/0.05%Tween 20(PBST)を反応混合物に加えた。
同じ種のIgG4分子間でのFabアーム交換と比べての、ヒトIgG4とアカゲザルIgG4との間でのFabアーム交換の増加を解明しようとして、ヒトおよびアカゲザル抗体のコアヒンジおよびCH3−CH3境界部のアミノ酸を解析した(例えば、ヒトCH3−CH3境界部の残基の概観については、Dall’Acqua, et al (1998) Biochemistry 37:9266参照)。図2は、中国アカゲザルIgG4のコアヒンジ配列は226−CPAC−229であること、およびCH3ドメインは409位にリジン(K)を含むことを示している。さらに、配列アラインメントにより、アカゲザルIgG4は、ヒトIgG4との比較で、CH3−CH3境界部においてさらに3つのアミノ酸置換を特徴とすることが示された:アカゲザルでは350位にイソロイシン(i)であるのに対してヒトではトレオニン(T)であり;アカゲザルでは370位にトレオニン(T)であるのに対してヒトではリジン(K)であり;アカゲザルでは405位にロイシン(L)であるのに対してヒトではフェニルアラニン(F)である。
実施例7に記載したヒトIgG4とアカゲザルIgG4との間でのFabアーム交換に基づき、中国アカゲザルIgG4 CH3配列がヒトIgG1をFabアーム交換に関与させ得るかどうかを解析した。そのため、ヒンジ配列CPSCをもたらすP228S突然変異に加えて、三重突然変異T350I−K370T−F405L(以後ITLと称する)をヒトIgG1−2F8に導入した。in vitro GSH誘導によるFabアーム交換のために、ヒトIgG1−2F8変異体をヒトIgG4−7D8と組み合わせた。0.5mMのGSHを含むPBS0.5mL中終濃度4μg/mLで各抗体を含有する抗体混合物を37℃で0−3−6−24時間インキュベートした。還元反応を停止させるために、0.5mLのPBS/0.05%Tween 20(PBST)を反応混合物に加えた。ELISAによる二重特異性結合の測定は、実施例7に記載するように行った。
Fabアーム交換への関与に必要な特徴をさらに特定するために、ヒトIgG4およびIgG1変種をin vivo解析した。1群あたり4匹の雌SCIDマウス(Charles River,マーストリヒト,オランダ)に、総容量300μL中600μgの抗体(500μgの7D8+100μgの2F8)を含有する抗体混合物をi.v.注射した。注射から3時間、24時間、48時間および72時間後に伏在静脈から血液サンプルを採取した。ヘパリン含有バイアルに中に採血し、10,000gで5分間遠心分離し、細胞から血漿を分離した。実施例7に記載するように、PBSTBで連続希釈した血漿サンプルを用いてELISAによりCD20およびEGFR二重特異反応性を評価することによって、二重特異性抗体の生成を追跡した。非線形回帰曲線適合法(GraphPad Software,サンディエゴ,カナダ)により、in vitro交換した抗体混合物を基準として用いて、血漿サンプル中の二重特異性抗体を定量した。
2−メルカプトエチルアミン・HCl(2−MEA)は、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を保存しながら、抗体のヒンジ領域内のジスルフィド結合を選択的に切断することが記載されている緩和な還元剤である。2−MEAの濃度系列を、CPSCまたはCPPCヒンジ領域を含有する2つの抗体の間でのFabアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導するその能力について試験した。各抗体を終濃度0.5mg/mLで含有する抗体混合物を、総容量100μLのTris−EDTA(TE)中の2−MEAの濃度系列(0、0.5mM、1.0mM、2.0mM、5.0mM、7.0mM、10.0mM、15.0mM、25.0mMおよび40.0mM)とともに37℃で90分間インキュベートした。還元反応を停止させるために、スピンカラム(Microcon遠心式フィルター、30k、Millipore社製)を製造業者の推奨に従って用いてサンプルを脱塩することにより還元剤2−MEAを除去した。実施例7に記載するように、ELISAにより二重特異性結合を測定した。
2−MEA誘導によるFabアーム交換による二重特異性抗体の生成は実施例11に記載しており、そこでは、ELISAにより二重特異性結合を示した(図5)。二重特異性抗体が形成されることを確認するために、サンプルをエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)により分析し、分子量を決定した。まず、200μgの抗体を0.005UのN−グリカナーゼ(カタログ番号GKE−5006D;Prozyme)のPBS溶液180μLともに37℃で一晩インキュベートすることによりサンプルを脱グリコシル化した。サンプルを、BEH300 C18、1.7μm、2.1×50mmカラムの付いたAquity UPLC(商標)(Waters,ミルフォード,USA)において60℃で脱塩し、0.05%ギ酸(Fluka Riedel−de Haen,ブーフス,ドイツ)を含有する、MQ水(エルエンス(Eluens)A)およびLC−MS用アセトニトリル(エルエンス(eluens)B)(Biosolve,ファルケンスワールト,オランダ)の混合物の勾配により溶出した。飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルは、micrOTOF(商標)質量分析計(Bruker,ブレーメン,ドイツ)において陽イオンモードで動作させ、オンラインで記録した。分析の前に、500〜4000m/zスケールをES tuning mix(Agilent Technologies,サンタクララ,USA)で較正した。DataAnalysis(商標)ソフトウェアv.3.4(Bruker,ブレーメン,ドイツ)を用いて提供される最大エントロピーを用いることにより、質量スペクトルをデコンボリューション処理した。この実験においてFabアーム交換に用いられた抗体の分子量に基づき、二重特異性抗体を元の抗体と識別することができた(IgG1−2F8−ITL×IgG4−7D8−CPPCについては実施例15、図9Cにも記載している)。二重特異性抗体のピークについては、曲線下面積を決定し、総曲線下面積で除して、各サンプルにおける二重特異性抗体のパーセンテージを算出した。図6Aは、0mM 2−MEA(親抗体に相当する2つのピーク)、7mM 2−MEA(親抗体および二重特異性抗体に相当する3つのピーク)および40mM 2−MEA(二重特異性抗体に相当する1つのピーク)を用いた、IgG1−2F8−ITLとIgG4−7D8−CPPCとの間でのFabアーム交換反応の3つの代表的な質量分析プロフィールを示している。二重特異性産物の均一なピークは、細かく分かれたピークをもたらしたであろう軽鎖の誤対合が起こらなかったことを示す。定量化したデータは、図6Bに示しており、これらのデータは、IgG1−2F8−ITLおよびIgG4−7D8−CPPCとの間でのFabアーム交換によりほぼ100%の二重特異性抗体がもたらされたことを示す。これに対して、野生型IgG4抗体の間でのFabアーム交換でもたらされた二重特異性産物は50%未満であった。これらのデータから、実施例11に記載した二重特異性結合ELISAの結果が確認される(図5)。
2−MEA誘導によるin vitro Fabアーム交換により生成された二重特異性抗体の安定性を試験した。そのため、7.0mM 2−MEAを用いてIgG1−2F8−ITLおよびIgG4−7D8−CPPCから生成された二重特異性サンプル2μg(実施例11に記載、図5)を、二重特異性試験サンプル2μgに対して0、1倍、10倍、50倍過剰のIgG4−MGに相当する濃度系列(0、2μg、20μg、100μg)の無関係のIgG4(アセチルコリン受容体に対するIgG4−MG)の存在下で、GSH誘導によるFabアーム交換反応に用いた。この反応におけるFabアーム交換は、二重特異性EGFR/CD20結合の喪失を引き起こすと思われる。GSH還元反応の条件は、実施例7に記載したものと同じであった(PBS/0.5mM GSH 0.5mL中、37℃で24時間)。還元反応を停止させるために、0.5mLのPBSTBを反応混合物に加えた。実施例7に記載するように、ELISAにより二重特異性結合を測定した。GSH還元反応後の二重特異性結合は、出発材料(対照)(100%とした)で測定した二重特異性結合と比較して表している。
IgG1−2F8−ITLとIgG4−7D8−CPPCとの間での2−MEA誘導によるin vitro Fabアーム交換により生成された二重特異性抗体(実施例11、図5、7mM 2−MEA)をSCIDマウスに注射して、その安定性(in vivo Fabアーム交換)および薬物動態特性(血漿クリアランス率)を親抗体IgG1−2F8−ITLおよびIgG4−7D8−CPPCとの比較により解析した。3群のマウス(1群あたりマウス3匹)の尾静脈に、精製抗体200μL:(1)二重特異性抗体100μg;(2)二重特異性抗体100μg+無関係のIgG4(ナタリズマブ、抗α4−インテグリン)1,000μg;(3)IgG1−2F8−ITL 50μg+IgG4−7D8−CPPC 50μgを静脈内注射した。抗体投与後の所定の時間間隔(10分、3時間、1日、2日、7日、14日、21日)で頬部穿刺により血液サンプル(50〜100μL)を採取した。ヘパリン含有バイアル中に採血し、14,000gで10分間遠心分離した。さらなる解析まで、血漿を−20℃で保存した。
ヒトIgG1−2F8−ITL×IgG4−7D8−CPPCの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換により生成された二重特異性抗体のバッチをPD−10脱塩カラム(カタログ番号17−0851−01;GE Healthcare)において精製した。次に、二重特異性産物の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HP−SEC)および質量分析により分析した。生成された二重特異性抗体の機能性をELISAにおいて二重特異性結合により確認した(データは示していない)。
IgG1がFabアーム交換に関与するために必要なIgG1 CH3ドメインにおける決定因子をさらに特定するために、三重突然変異T350I−K370T−F405L(ITL)を含有するIgG1を、二重変異体T350I−K370T(IT)、T350I−F405L(IL)およびK370T−F405L(TL)と比較した。また、単一変異体F405L(L)も試験した。in vitro Fabアーム交換を誘導するために、2−MEAを還元体として用いた(各抗体50μgを100μL PBS/25mM 2−MEA中で、37℃で90分間)。単一変異体F405L抗体の場合、一過性トランスフェクションの上清からの未精製抗体を、Amicon Ultra遠心式装置(30k、Millipore社製、カタログ番号UFC803096)を用いたPBSへのバッファー交換後に用いた。還元反応を停止させるために、実施例11に記載するように、スピンカラムを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤2−MEAを除去した。実施例7に記載するように、ELISAにより測定した二重特異性結合によって二重特異性抗体の生成を判定した。
2つの異なる抗体の間でのFabアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導する2−MEAの能力を異なる温度で試験した。Fabアーム交換反応は、160μgのヒトIgG1−2F8−ITLを160μgのIgG4−7D8−CPPCとともに、320μlのPBS/25mM 2−MEA(各抗体につき終濃度0.5mg/mL)中、0℃、20℃(室温)または37℃のいずれかでインキュベートすることにより開始した。これらの反応から、異なる時点(0分、2.5分、5分、10分、15分、30分、45分、60分、75分、90分、120分、150分、180分および240分)において20μLのサンプルを採取した。各サンプルに20μLのPBSを加え、その後、Zeba 96ウェルスピン脱塩プレート(7k、カタログ番号89808 Thermo Fisher Scientific)を製造業者の推奨に従って用いてサンプルを脱塩することにより還元剤2−MEAを除去した。Nanodrop ND−1000分光光度計(Isogen Life Science,マールセン,オランダ)を用いて波長280nmで吸光度を測定することにより総抗体濃度を決定した。実施例7に記載するように、抗体サンプルの希釈系列(25倍希釈により総抗体濃度0〜20μg/mL)をELISAに用いて、二重特異性結合を測定した。
0.5mM GSHは、ヒトIgG4とIgG1−CPSC−ITLとの間でin vitro Fabアーム交換を誘導することができるが、ヒトIgG4と、安定なヒンジを含有するIgG1−ITLとの間ではin vitro Fabアーム交換を誘導することができないことが上で示された(図3)。さらに、2−MEAは、安定化ヒンジ領域を有する抗体の間、例えば、IgG1−ITL×IgG4−CPPCでFabアーム交換を誘導することができることが見出された(図5)。他の濃度のGSHもしくは2−MEAまたは他の還元剤が2つの異なる抗体の間でin vitro Fabアーム交換を誘導することができるかどうかを調べるために、2−MEA、GSHおよびDTT(ジチオトレイトール)の濃度系列を試験した。そのため、10μgのヒトIgG1−2F8−ITLおよび10μgのIgG4−7D8−CPPCの組合せのPBS溶液20μl(各抗体につき終濃度0.5mg/mL)を、異なる還元剤の濃度系列(0.0mM、0.04mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.5mM、5.0mM、12.5mM、25.0mMおよび50.0mM)とともに、37℃でインキュベートした。90分後、各サンプルに20μLのPBSを加え、実施例17に記載するように、スピン脱塩プレートを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤を除去した。実施例17に記載するように、総抗体濃度を決定した。実施例7に記載するように、抗体サンプルの希釈系列(3倍希釈により総抗体濃度0〜20μg/mL)をELISAに用いて、二重特異性結合を測定した。
2−MEAは、実施例11に記載するように、ヒトIgG1−ITLとIgG4−CPPCとの間でのFabアーム交換を誘導することができる(図5)。ヒトIgG1およびIgG4のCH3界面残基は409位だけ異なっている:IgG1でのリジン(K)およびIgG4でのアルギニン(R)(実施例8に記載、図2)。そのため、アルギニンまたは任意の他のアミノ酸による409位のリジン(K409X)の置換は、IgG1−ITLとの2−MEA誘導によるFabアーム交換へのIgG1の関与を可能にするかどうかを試験した。10μgのヒトIgG1−2F8−ITLおよび10μgのIgG1−7D8−K409Xの組合せのPBS/25mM 2−MEA溶液20μl(各抗体につき終濃度0.5mg/mL)を37℃で90分間インキュベートした。一過性トランスフェクションの上清からの未精製抗体を、Amicon Ultra遠心式装置(30k、Millipore社製、カタログ番号UFC803096)を用いたPBSへのバッファー交換後に用いた。Fabアーム交換反応後、各サンプルに20μLのPBSを加え、実施例17に記載するように、スピン脱塩プレートを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤を除去した。実施例7に記載するように、抗体サンプルの希釈系列(3倍希釈により総抗体濃度0〜20μg/mL)をELISAに用いて、二重特異性結合を測定した。
200μgの抗体を0.005UのN−グリカナーゼ(カタログ番号GKE−5006D;Prozyme)のPBS溶液180μLとともに37℃で一晩インキュベートすることによりIgG4−7D8およびIgG4−7D8−CPPCサンプルを脱グリコシル化した。これらのサンプルをそのままFabアーム交換反応に用いた。Fabアーム交換は、50μgの各抗体を100μlのPBS/25mM 2−MEA(各抗体につき終濃度0.5mg/mL)中、37℃で90分間インキュベートすることによりを行った。実施例11に記載するように、スピンカラムを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤2−MEAを除去した。実施例7に記載するように、抗体サンプルの希釈系列(3倍希釈により総抗体濃度0〜20μg/mL)をサンドイッチELISAに用いて、二重特異性結合を測定した。
CH3界面での相互作用の強度は、親抗体における両方の重鎖がFabアーム交換反応において解離することが可能であり、かつ、それらがその後、ヘテロ二量体化反応において結合することが可能であるようなものでなければならない。そのため、Fabアーム交換に関与する能力と非共有結合性CH3−CH3相互作用の強度との間の相関関係(解離定数、KD)を解析した。以下のヒト抗体組合せについて、実施例9に記載するように、GSH誘導によるFabアーム交換を行った(37℃で0.5mM GSH):
IgG1-2F8 x IgG1-7D8
IgG1-2F8-CPSC x IgG1-7D8-CPSC
IgG1-2F8-CPSC-T350I x IgG1-CPSC-7D8-T350I
IgG1-2F8-CPSC-K370T x IgG1-7D8-CPSC-K370T
IgG1-2F8-CPSC-ITL x IgG1-7D8-CPSC-ITL
IgG1-2F8-CPSC-K409R x IgG1-7D8-CPSC-K409R
IgG4-2F8 x IgG4-7D8
IgG4-2F8-R409K x IgG4-7D8-R409K
IgG4-2F8-R409A x IgG4-7D8-R409A
IgG4-2F8-R409L x IgG4-7D8-R409L
IgG4-2F8-R409M x IgG4-7D8-R409M
IgG4-2F8-R409T x IgG4-7D8-R409T
IgG4-2F8-R409W x IgG4-7D8-R409W
IgG4-2F8-F405A x IgG4-7D8-F405A
IgG4-2F8-F405L x IgG4-7D8-F405L
IgG4-2F8-Y349D x IgG4-7D8-Y349D
IgG4-2F8-L351K x IgG4-7D8-L351K
IgG4-2F8-E357T x IgG4-7D8-E357T
IgG4-2F8-S364D x IgG4-7D8-S364D
IgG4-2F8-K370Q x IgG4-7D8-K370Q
IgG4-2F8-K370E x IgG4-7D8-K370E
実施例7に記載するように、サンドイッチELISAによる二重特異性結合の判定により二重特異性抗体の生成を測定した。図15A/B/Cは、Fabアーム交換反応後の二重特異性結合の結果を示している。
2−MEAおよびDTTは、ヒトIgG1−ITLとIgG4−CPPCとの間でのin vitro Fabアーム交換を誘導することが見出された(図12)。これらの還元体(reductantia)は同様に、ヒトIgG1−2F8−F405LとIgG1−7D8−K409Rとの間でのin vitro Fabアーム交換も誘導することができるかどうかを試験した。2−MEA、DTT、GSHおよびTCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン)の濃度系列を試験した。実施例18に記載するように、Fabアーム交換を行った。試験した濃度系列の異なる還元剤は以下のとおりであった:0.0mM、0.04mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、5.0mM、25.0mM、50.0mM 2−MEA、GSH、DTTまたはTCEP。
ヒトIgG1−2F8−F405LとIgG1−7D8−K409Rとの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換による二重特異性抗体の形成を確認するために、2−MEAの濃度系列を用いたFabアーム交換反応からのサンプルの分子量をESI−MSにより決定した。試験した濃度系列は以下のとおりであった:0.0mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、5.0mM、7.0mM、10.0mM、15.0mM、25.0mMおよび40.0mM 2−MEA。Fabアーム交換(PBS中)およびサンドイッチELISAを、実施例11に記載するように行った。ESI−MSを、実施例12に記載するように行った。
ヒトIgG1−2F8−F405L×IgG1−7D8−K409Rの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換により生成された二重特異性抗体のバッチをPD−10脱塩カラム(カタログ番号17−0851−01;GE Healthcare)を用いて精製した。次に、二重特異性産物の純度を、実施例12に記載するように、質量分析により分析した。
実施例14に記載するように、IgG1−2F8−F405L×IgG1−7D8−K409Rの間での2−MEA誘導によるin vitro Fabアーム交換により生成された二重特異性抗体をSCIDマウスに注射して、その安定性(in vivo Fabアーム交換)および薬物動態特性を解析した。2群のマウス(1群あたりマウス3匹)を解析した:(1)二重特異性抗体100μg;(2)二重特異性抗体100μg+無関係のIgG4(IgG4−637、WO2007068255に記載されている)1,000μg。実施例14に記載するように、血漿サンプル中の総IgG濃度をELISAによりアッセイした。ただし、この実施例では、検出用のコンジュゲート体としてHRP結合ヤギ抗ヒトIgG(Jackson、カタログ番号109−035−098、1/10,000)を用いた。血漿サンプル中の二重特異性抗体の存在を、実施例14に記載するように、サンドイッチELISAにおいてCD20およびEGFR二重特異反応性によりアッセイし、定量した。
CD20抗体IgG1−7D8は、補体依存性細胞傷害性(CDC)によりCD20発現細胞を効率的に死滅させることができる。これに対して、EGFR抗体IgG1−2F8は、EGFRを発現する標的細胞に対してCDCの媒介をしない。変異体IgG1−7D8−K409RおよびIgG1−2F8−F405L×IgG1−7D8−K409Rの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換により生成された二重特異性抗体は、依然として、CD20発現細胞に対してCDCを誘導することができるかどうかを試験した。105個のDaudi細胞またはRaji細胞を、シェーカー中で、0.1%BSAを添加したRPMI培地80μL中の抗体の濃度系列とともに、室温で15分間プレインキュベートした。正常ヒト血清(NHS)20μLを補体の供給源として加え(終濃度20%NHS)、37℃で45分間インキュベートした。0.1%BSAを添加した氷冷RPMI培地30μLを加えて、CDC反応を停止させた。10μg/mLのプロピジウムヨージド(PI)10μL(終濃度1μg/mL)の添加およびFACS分析によって死滅細胞と生存細胞を識別した。
EGFR抗体IgG1−2F8は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)によりEGFR発現細胞、例えば、A431を死滅させることができる。A431細胞はCD20を発現せず、そのため、CD20抗体IgG1−7D8はこれらの細胞に対してADCCを誘導しない。変異体IgG1−2F8−F405LおよびIgG1−2F8−F405L×IgG1−7D8−K409Rの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換により生成された二重特異性抗体は依然として、A431細胞に対してADCCを誘導することができるかどうかを試験した。エフェクター細胞の単離のため、Leucosep(登録商標) チューブ(Greiner Bio−one、カタログ番号227290)を製造業者の推奨に従って用いて、健常ドナーの全血から末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。0.1%BSAを添加したRPMI培地1mL中の5×106個のA431細胞に100μCi 51Crを加え、37℃の振盪水槽中で60分間インキュベートすることによって、標的細胞を標識した。標識した細胞を洗浄し、0.1%BSAを添加したRPMI中に再懸濁した。0.1%BSAを添加したRPMI中の5×104個の標識標的細胞を、100μLで、抗体濃度系列(3倍希釈によりADCCアッセイでの終濃度、範囲0〜10μg/mL)とともに室温で15分間プレインキュベートした。ADCCアッセイは、エフェクター細胞50μL(5×106個の細胞)をE:T比100:1で加えることによって開始した。37℃で4時間後、シンチレーションカウンターで1分間あたりのカウント数(cpm)として、3反復実験での51Cr放出を測定した。細胞毒性のパーセンテージを、下式を用いて算出した:特異的溶解のパーセンテージ=(実験値cpm−基礎値cpm)/(最大値cpm−基礎値cpm)×100。5%Triton X−100 50μLを標的細胞50μL(5×104個の細胞)に加えることにより最大の51Cr放出を決定し、感作抗体およびエフェクター細胞の不在下で基礎放出を測定した。
実施例16では、IgG4−7D8と組み合わせた場合に、F405L突然変異がFabアーム交換へのヒトIgG1の関与を可能にするのに十分なものであることを記載している。ヒトIgG1−K409Rとの組合せでの2−MEA誘導によるFabアーム交換への関与のためのIgG1 405位にある決定因子をさらに調べるために、考えられる全てのIgG1−2F8−F405X変異体(CおよびPを除く)をIgG1−7D8−K409Rと組み合わせた。実施例19に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。
実施例28では、IgG1−K409Rと組み合わせた場合に、F405の位置におけるある特定の単一突然変異がFabアーム交換へのヒトIgG1の関与を可能にするのに十分なものであることを記載している。CH3ドメインにおけるFc:Fc界面位置に関係している他の決定因子もFabアーム交換機構を媒介し得るかどうかを調べるために、IgG1 407位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトIgG1−K409Rとの組合せでの2−MEA誘導によるFabアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのIgG1−2F8−Y407X変異体(CおよびPを除く)をIgG1−7D8−K409Rと組み合わせた。実施例19に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。
実施例21では、効率的なFabアーム交換を可能にするCH3−CH3ホモ二量体の相互作用の強度には特定の範囲があることを記載している。CH3界面における相互作用の強度は、親抗体(ホモ二量体)における両方の重鎖がFabアーム交換反応において解離することが可能であり、かつ、それらがその後、ヘテロ二量体化反応において結合することが可能であるようなものでなければならない。安定なヘテロ二量体を生成するためには、ヘテロ二量体相互作用の強度は、それがホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利に働くように、ホモ二量体相互作用の強度よりも高くなければならない。これを確認するために、ヘテロ二量体におけるCH3−CH3相互作用の強度を測定し、ホモ二量体における強度と比較した。IgG1−K409R、IgG1−F405LおよびIgG1−ITLホモ二量体に由来するCH2−CH3フラグメントのKDを、実施例21に記載のように測定した。ヘテロ二量体におけるKDの決定のため、CH2−CH3ドメインフラグメント(G1−F405LおよびG1−ITL)を、ヒンジを除く全ての抗体ドメインを含む、IgG1−7D8−K409RのIgG1Δヒンジフラグメントと混合した。両方のフラグメントにおけるヒンジ領域の欠如により、共有結合による重鎖間ジスルフィド結合は妨げられた。フラグメントを混合し、実施例21に記載のように、24時間後にネイティブ質量分析により分析した。表示したCH2−CH3フラグメントまたはCH2−CH3フラグメントとIgG1Δヒンジの混合物における非共有結合性CH3−CH3相互作用のKD値を表5に示す。これらのデータから、試験条件下では、ヘテロ二量体相互作用の強度は対応するホモ二量体相互作用よりも高い(KDはより低い)ことが示唆される。
ヒトIgG1−2F8−F405L×IgG1−7D8−K409Rの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換により生成された二重特異性抗体のバッチをPD−10脱塩カラム(カタログ番号17−0851−01;GE Healthcare)において精製した。次に、二重特異性産物の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HP−SEC)、質量分析、HPLC陽イオン交換クロマトグラフィー(HPLC−CIEX)、キャピラリー等電点電気泳動(cIEF)により分析した。
2−MEA誘導によるFabアーム交換による二重特異性抗体の生成は、実施例11に記載している。この実施例では、交換反応中に様々な時点において高圧液体クロマトグラフィー陽イオン交換(HPLC−CIEX;実施例31に記載)を実施することによって交換反応をモニタリングした。
2−MEA誘導によるFabアーム交換を高IgG濃度で行った。交換量に及ぼす2−MEA濃度、インキュベーション温度および時間の影響を調査した。
実施例28および実施例29は、IgG1−K409Rと組み合わせた場合に、F405およびY407の位置におけるある特定の単一突然変異がFabアーム交換へのヒトIgG1の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、CH3ドメインにおけるFc:Fc界面位置に関係しているさらなる決定因子もFabアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、IgG1 368位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトIgG1−K409Rとの組合せでの2−MEA誘導によるFabアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのIgG1−2F8−L368X変異体(CおよびPを除く)をIgG1−7D8−K409Rと組み合わせた。実施例19に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。
実施例28、実施例29および実施例34は、IgG1−K409Rと組み合わせた場合に、F405、Y407またはL368の位置におけるある特定の単一突然変異がFabアーム交換へのヒトIgG1の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、CH3ドメインにおけるFc:Fc界面位置に関係しているさらなる決定因子もFabアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、IgG1 370位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトIgG1−K409Rとの組合せでの2−MEA誘導によるFabアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのIgG1−2F8−K370X変異体(CおよびPを除く)をIgG1−7D8−K409Rと組み合わせた。実施例19に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。
実施例28、実施例29、実施例34および実施例35は、IgG1−K409Rと組み合わせた場合に、F405、Y407、L368またはK370の位置におけるある特定の単一突然変異がFabアーム交換へのヒトIgG1の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、CH3ドメインにおけるFc:Fc界面位置に関係しているさらなる決定因子もFabアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、IgG1 399位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトIgG1−K409Rとの組合せでの2−MEA誘導によるFabアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのIgG1−2F8−D399X変異体(CおよびPを除く)をIgG1−7D8−K409Rと組み合わせた。実施例19に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。
実施例28、実施例29、実施例34、実施例35および実施例36は、IgG1−K409Rと組み合わせた場合に、F405、Y407、L368、K370またはD399の位置におけるある特定の単一突然変異がFabアーム交換へのヒトIgG1の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、CH3ドメインにおけるFc:Fc界面位置に関係しているさらなる決定因子もFabアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、IgG1 366位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトIgG1−K409Rとの組合せでの2−MEA誘導によるFabアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのIgG1−2F8−T366X変異体(CおよびPを除く)をIgG1−7D8−K409Rと組み合わせた。実施例19に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。
2−MEA誘導によるFabアーム交換のプロセスは、25mM 2−MEAを用いる場合、37℃で効率的に行われる。これらの条件下で、許容IgG1変異体(実施例19、実施例28、実施例29および実施例34〜37に記載するように、366位、368位、370位、399位、405位および407位および/または409位にある特定の単一突然変異を有するIgG1)の大部分は、高レベルの2−MEA誘導によるFabアーム交換(80%〜100%)を示す。最大効率を有するIgG1変異体での識別を可能にする実験条件を特定するために、4つの異なる変異体組合せ(IgG1−2F8−F405S×IgG1−7D8−K409A、IgG1−2F8−D399R×IgG1−7D8−K409G、IgG1−2F8−L368R×IgG1−7D8−K409HおよびIgG1−2F8−F405L×IgG1−7D8−K409R)についての2−MEA誘導によるFabアームをそれぞれ、15℃でおよび20℃で経時的に調査した。温度、期間および抗体希釈(20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mLおよび0.02μg/mL)の変更を除き、実施例19に記載するように、その手順を行った。
2−MEA誘導によるFabアーム交換のプロセスは、25mM 2−MEAを用いる場合、37℃で効率的に行われる。これらの条件下で、許容IgG1変異体(実施例19、実施例28、実施例29および実施例34〜37に記載するように、366位、368位、370位、399位、405位および407位および/または409位にある特定の単一突然変異を有するIgG1)の大部分は、高レベルの2−MEA誘導によるFabアーム交換(80%〜100%)を示す。実施例38では、2−MEA誘導によるFabアーム交換効率の差は、いわゆる準最適条件、すなわち、15℃で60〜105分間でのインキュベーション後に最も顕著であることを記載している。IgG1−7D8−K409Rとの2−MEA誘導によるFabアーム交換>90%を示す、L368、D399、F405およびY407(表11参照)についての合計24のIgG1−2F8変異体(実施例28、実施例29および実施例34〜37)を選択し、(実施例19に示した結果に基づき)IgG1−7D8−K409A、G、HまたはRとのFabアーム交換の解析を行った。これらの変異体組合せを二重特異性抗体の生成効率によって分類するために、2−MEA誘導によるFabアーム交換を15℃で90分間(準最適条件)行った。IgG1−7D−K409Rとのインキュベーション後に弱い、2−MEA誘導によるFabアーム交換を示した2つのIgG1−2F8変異体(Y407Q)および(D399Q)(実施例29および実施例36)をさらなる陰性対照として取り入れ、それらを用いて、K409位の別のアミノ酸(G、HまたはW)とのインキュベーションが異なる結果をもたらすかどうかを調査した。温度の変更および抗体希釈の変更(20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mLおよび0.02μg/mL)を除き、実施例19に記載するように、その手順を行った。
先に得られた結果(表10)を確認するための二次解析のために、試験した突然変異IgG1−2F8分子(表10)から6つを選択した。高い、2−MEA誘導によるFabアーム交換効率(IgG1−2F8−L368R)および中間の、2−MEA誘導によるFabアーム交換効率(IgG1−2F8−L368W、IgG1−2F8−F405I、IgG1−2F8−F405LおよびIgG1−2F8−Y407W)に関していくつかの変異体を選択した。また、2回目にIgG1−2F8−Y407Qも解析したが、その理由はそれがIgG1−7D8−K409Hとの2−MEA誘導によるFabアーム交換反応で予想外の陽性を示したためである。概して、図40に示されたこれらの結果から、一次解析(表10)が確認され、IgG1−7D8−K409Hとの突然変異IgG1−2F8分子の2−MEA誘導によるFabアーム交換反応が最大効率を示したことが示される。さらに、実施例28、実施例29および実施例34〜37において陰性と報告した、IgG1−7D8−K409Rと突然変異IgG1−2F8分子との間での2−MEA誘導によるFabアーム交換反応は、それでも、IgG1の2−MEA誘導によるFabアーム交換を潜在的に促進することから、興味深いものである。
IgG1−2F8−F405LおよびIgG1−7D8−K409Rを発現する安定なCHO−K1SV細胞株を、IgG重鎖および軽鎖配列をコードするグルタミンシンターゼ(GS)発現ベクターシステム(Lonza Biologics,スラウ,UK)でCHO−K1SV宿主細胞(Lonza Biologics,スラウ,UK)をトランスフェクトすることにより生成した。タンパク質フリー既知組成培地(CD−CHO;カタログ番号10743−029;Invitrogen, Life Sciences,ブレダ,オランダ)中でヌクレオフェクション(Lonza Biologics,スラウ,UK)を用いて細胞をトランスフェクトした。細胞をグルタミン欠乏CD−CHO培地に0.1細胞/ウェルで播種した。グルタミン欠乏培地での増殖に対して耐性のクローン細胞株の選択後、細胞をCD−CHOでの懸濁増殖に適応させ、凍結バイアルとして確保した。細胞に対して遺伝子増幅は行わなかった。IgGを生産するために、細胞をμ−24 Micro−Reactor中に、0.7g/L L−チロシン二ナトリウム塩(カタログ番号T1145−500;Sigma−Aldrich,ズウェインドレヒト,オランダ)および0.15g/L L−システイン(カタログ番号C7352;Sigma−Aldrich)を添加したCD−CHO中4.0×105個細胞/mLの濃度で接種し、37℃で15日間インキュベートした、pH7.00、初期振盪速度70rpm、ガス流速20slpm、最大酸素流速85%およびDO30%。供給は、3日目に開始し、14日目まで続けた。供給は、既知組成培地を含有するCHO効率の良い供給材料で構成し、IgG−2F8−F405LおよびIgG1−7D8−K409Rそれぞれを発現するCHO−K1SV細胞株について約1.3〜3.4g/Lおよび0.1〜3.5g/Lの集菌量で生産レベルを得た。その後、生産性の最も良い細胞株を用い、同様のフェドバッチプロセスを用いて2Lバイオリアクターを運転した。IgGをプロテインAクロマトグラフィーを用いて精製した。精製後、IgGをPBSで処方した。
ヒトIgG1−2F8−F405LとIgG1−7D8−K409Rとの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換により生成された二重特異性抗体の40mLバッチを作出した。各抗体を終濃度10mg/mL(すなわち、合計20mg/mL)で含有する抗体混合物を、PBS中、50mM 2−MEAの存在下、25℃で5時間インキュベートした。抗体混合物を氷上で一晩保存した。そのバッチに対して、HiPrep 26/10脱塩カラム(カタログ番号17−5087−01、GE Health Care)を用いて脱塩することによりバッファー交換を行い、精製後にまたはさらに4℃で6日間保存を行った後にSDS−PAGEにより分析した。SDS−PAGE分析は、上記のように、還元条件下および非還元条件下で行った。図42は、完全なIgGバンド(LHHL)の他に、半分子に相当するバンド(HL)と、他の組合せに相当するバンドが存在することによって示されるように、バッファー交換直後には部分的な再酸化しか見られなかったことを示している(A、レーン3)。4℃で6日の保存後の分析は、再酸化が完了していることを示した(C、レーン4)。還元ゲル(B、D)は単一の重鎖と軽鎖を示している。
再酸化プロセスにおける微量金属の役割を調べるために、抗CD38抗体を50mM 2−MEAの存在下で25℃で5時間インキュベートした(15mg/mL;1mL)。サンプルを、PD−10カラム(GE Healthcare)を用いて脱塩し、0.5mg/L Cu2+を含有するPBS(CuSO4;カタログ番号451657−10G、Sigma Aldrich)または2mM EDTAを含有するPBSへバッファーを交換した。サンプルを、室温で異なる期間のインキュベーション後に採取し、3μLの1M 2−オドアセトアミド(2-odoacetamide)(IAA;カタログ番号I−1149、Sigma Aldrich)でクエンチし、暗所で室温で30分間保存した。その後、さらなる解析までサンプルを5℃で保存した。
二重特異性抗体のバッチを、異なるバッファー条件下、0.5mLスケールで、ヒトIgG1−2F8−F405LとIgG1−7D8−K409Rとの間での2−MEA誘導によるFabアーム交換により生成した。抗体を以下のバッファーにより5mg/mLの濃度に希釈した:1)1×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS):8.1mMリン酸ナトリウム(Na2HPO4・7H2O)、1.5mMリン酸カリウム(KH2PO4)、138mM塩化ナトリウム(NaCl)、2.7mM塩化カリウム(KCl)pH5.0(10×DPBS、カタログ番号14200、Invitrogenから希釈した);2)1×DPBS pH7.0 3)20mMクエン酸ナトリウム(カタログ番号0119−01、JT Baker)、pH4.9;4)20mM クエン酸ナトリウム、pH6.0;および5)20mM Tris−HCl(カタログ番号T6666およびT6791、Sigma)、20mM NaCl(カタログ番号3624−01、JT Baker)、pH7.8。その後、抗体、終濃度各2mg/mL(すなわち、総抗体濃度4mg/mL)を、45mMまたは60mM 2−MEAの存在下、25℃で2〜5時間インキュベートした。2−MEAは、抗体と同じバッファーを用いて調製した300mM保存溶液から加えた。様々な時点において、サンプルを採取し、製造業者の使用説明書に従って、illustra microspin G−25カラム(カタログ番号27−5325−01、GE Healthcare)を用いて脱塩し、10mMリン酸ナトリウム(リン酸二ナトリウム、カタログ番号3828−01およびリン酸一ナトリウム、カタログ番号3818−01、両方JT Baker)、pH7.0へ抽出した。次に、サンプルを上記のように、分析的CIEXにより分析して、ヘテロ二量体化のパーセンテージを決定した。図41は、最終のヘテロ二量体レベルはTrisの場合とリン酸バッファーの場合は同程度であったが、ヘテロ二量体形成の速度論は明らかに、バッファーの種類およびpHにより影響を受けたことを示している。反応速度は、クエン酸バッファー、pH4.9の場合、リン酸バッファー、pH5.0およびクエン酸バッファー、pH6.0の場合よりも遅く見えた。反応速度は、1×DPBS pH5.0の場合、1×DPBS pH7.0の場合と比べて遅かった。
ヒトIgG1抗CD38抗体(国際出願第2006099875号(Genmab)に記載されている005を用いて、還元プロセスおよび再酸化プロセスを評価するためのモデルシステムを開発した。抗CD38抗体(20g/L)を、中空糸カートリッジ、30kDa分子量カットオフ(MWCO)、0.1m2(カタログ番号P−N1−030E−200−01N、J & M Separations,ティルブルク,オランダ)を用いて製剤バッファー(25mM酢酸ナトリウム、60mM塩化ナトリウム[カタログ番号3624−01、JT Baker]、140mMマンニトール、0.006%ポリソルベート20、pH5.5)からPBS(カタログ番号3623140、B.Braun,オス,オランダ)、pH7.4中へダイアフィルトレーション処理し、2L反応器において総容量833mLで24g/Lに濃縮した。温度を25℃で、振盪を100rpmで制御した。反応を追跡するために、酸化還元プローブ(Applicon Biotech,スキーダム,オランダ)および溶存酸素(DO)プローブ(Applicon Biotech)を用いて溶液をモニタリングした。実験の開始時に、溶液の酸化還元電位は259.6mVであり、DOは100%(酸素の空気飽和)であった。0時間において、還元体2−MEA(2−メルカプトエチルアミン−HCl、システアミン)を反応器に終濃度300mMで添加し、これにより、20g/L 抗CD38抗体および300mM 2−MEAの初期溶液を得た。2−MEAの添加により、酸化還元電位はすぐに約−400mVに低下した(図43)。また、DOもこの時点で酸素の最初の100%空気飽和の2.6%に低下し、これは、2−MEAが二量体型シスタミンへと自動酸化を受けたことを示している。5時間後に、PBS、pH7.4でのダイアフィルトレーションによって過剰の2−MEA(およびシスタミン)を除去した。これを行うために、反応器内容物を、30kDa修飾ポリエーテルスルホン(mPES)中空糸カートリッジ(カタログ番号P−N1−030E−200−01N、J & M Separations,ティルブルク,オランダ)30kDa分子量カットオフ(MWCO)、0.1m2を通して循環させた。カートリッジ入口圧を25PSI(170kPa)で制御し、これにより、透過物流を25mL/分とした。ダイアフィルトレーションバッファー、例えば、PBSは、透過物がシステムを出発するのと同じ速度でシステムに加えた。ダイアフィルトレーションは、最初の容量の7倍(7ダイアフィルトレーション容量;約7L)がシステムを通過するまで継続し、それには、4時間半を要した。その時点以降、能動的温度および振盪制御によりシステムを一晩インキュベートした。翌日、DOおよび酸化還元電位値は開始レベルより実質的に低いままであり、反応が完了しなかったことが示唆される。この仮説を評価するために、硫酸銅を終濃度0.5mg/Lに加えた(CuSO4;カタログ番号451657−10G、Sigma Aldrich)。Cu2+などの二価金属イオンはスルフヒドリル酸化の触媒である。硫酸銅の添加により、すぐにさらなるDOの減少が起こり、酸素がすぐに消費されたこと、例えば、(再)酸化が示唆される。実験を通して、反応器から14サンプルを採取し、すぐに、2−ヨードアセトアミド(IAA、カタログ番号I−1149、Sigma)でクエンチした(反応器のサンプル1mLに対して1M 2−ヨードアセトアミド20μLを加えた)。2−ヨードアセトアミドはシステインのチオール基と共有結合するため、鎖間ジスルフィド結合を再編成する還元型システインの能力が妨げられる。このようにして、2−MEAによる還元および酸素による抗体の再酸化の反応速度を追跡することができる。HP−SEC(図44)、非還元型SDS−PAGE(図45)および液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析(LC−ESI−MS)(図46)によりサンプルを分析した。サンプル1およびサンプル2は、製剤バッファーからPBS中への移行前および移行後の抗CD38抗体を示す対照である。サンプル3〜8は、5時間の還元段階中の産物を示す。HP−SEC(280nmでのモニタリング)によれば、抗体は完全な産物として溶出した;後に溶出する産物はシスタミンである(2−MEAは280nmで強く吸収しない)。SDS−PAGEでは、産物は、非還元ゲルの変性条件下で重鎖および軽鎖の2つの独立したバンドとして泳動した。まとめると、これらのデータは、産物は1時間のうちに十分に還元された(SDS−PAGE)が、ネイティブ条件下では重鎖および軽鎖は非共有相互作用により結合したままであった(HP−SEC)ことを示している。サンプル9〜12はダイアフィルトレーションプロセスの間に採取した。HP−SECによれば、産物はネイティブ条件下で完全なままであった;遅れて溶出するシスタミンのピークは徐々に消失し、その後、2−MEAと反応する2−ヨードアセトアミドに相当するピークが出現した。これらの結果は、2−ヨードアセトアミドと反応する2−MEAが溶液中にまだ過剰にあること、または2−MEAはタンパク質と結合し、一晩でもしくは2−ヨードアセトアミドの添加により放出されたことを示唆している。SDS−PAGEによれば、単一の重鎖および単一の軽鎖のバンドから未知の組成物の複数のバンドへの変化があった;しかしながら、ダイアフィルトレーションの終了(サンプル13)までに、産物は、硫酸銅の添加(サンプル14)前でさえも、天然型へと十分に再酸化された。
以下の点を除いて、実施例44の実験を繰り返した。第1に、還元工程を5時間から4時間へ短縮した。これは、還元が4時間以内に既に完了していたことが観察されたためであった。第2に、プロセスを加速するために、より大きな中空糸カートリッジ30kDa、0.4m2を用いることによって、ダイアフィルトレーション時間を1時間に短縮した。1cm2当たりの透過物流を実施例44の場合と同じにし、4倍速いダイアフィルトレーション工程とした。第3に、一晩の酸化期間後、さらに7ダイアフィルトレーション容量を用いて2回目のダイアフィルトレーションを行った。これは、1回目の実験により一晩インキュベーション後に2−MEAが出現することが示されたためであった。2−ヨードアセトアミド処理サンプルの酸化還元電位およびDOの出力の傾向(図47)ならびにHP−SEC(図48)およびSDS−PAGE(図49)の結果は、2回目のダイアフィルトレーションポイントまで実施例44での結果と一致した(実施例44と本実施例では酸化還元電位および酸素飽和度の時間尺度が異なることに留意されたい)。2回目のダイアフィルトレーションの直前に、産物は、前日のダイアフィルトレーションの終了と比べて少し減少しているように見えた(図49、レーン18とレーン15)。2回目のダイアフィルトレーション後(レーン19)、産物は元の状態のものに戻り、2−MEA−2−ヨードアセトアミドピークはHP−SECプロフィールから消失した。さらに、2回目のダイアフィルトレーション後、酸化還元プローブおよびDOプローブの値(図47)は実験開始時の値と同様であり、このことから、反応は完了し、システムから2−MEAおよびシスタミンの痕跡が、実施例44に記載した実験の場合よりも十分に除去されたことが示唆される。さらに、2回目のダイアフィルトレーション後の硫酸銅の添加により酸化還元電位またはDOの変化は起こらず、感知できるレベルの易酸化性スルフヒドリルが存在しないことが示された。これらの結果は、2回目のダイアフィルトレーションが、溶液中に残っているかまたは一晩インキュベーション後にタンパク質から遊離した過剰の2−MEAを除去するのに有用であったことを示している。
実施例44において一晩インキュベーション後に観察された残存2−MEAから、2−MEA濃度が高すぎたことが示唆された。そのため、2−MEA濃度を300mMから50mMへ下げ、実施例45の場合と同様に、還元工程を4時間へ短縮し、ダイアフィルトレーション時間を1時間に速めたことを除いて、実施例44の実験を繰り返した。還元およびダイアフィルトレーション後に、DOプローブおよび酸化還元プローブは元の値に戻った。このことから、反応が完了したことが示唆される(図50)。銅の添加は何の影響も与えず、このことからも、反応が完了したことがさらに示唆される。実施例44および実施例45で観察されるように、HP−SEC分析では産物はネイティブ条件下で完全なままであった(図51);さらに、遅れて溶出するシスタミンのピークは徐々に消失し、その後、2−MEAと結合する2−ヨードアセトアミドに相当するピークが出現した。しかしながら、この場合、後に溶出するピークは全て、一晩インキュベーション後に消えた。SDS−PAGEの結果(図52)は、還元段階の間に完全な抗体が存在しないことを示した(レーン3〜6)が、この場合、分子は別々の重鎖と軽鎖へと十分には還元されなかった。ダイアフィルトレーション(レーン7〜10)によって、抗体は元のバンディングパターンに再編成し、一晩インキュベーションによってそのように残った(レーン11〜14)ことはSDS−PAGEによって明らかであった。
抗CD38抗体に対して、製剤バッファーから、2mM EDTAを含有するPBSへ交換したことを除いて、実施例46の実験を繰り返した。EDTAを添加する目的は、還元段階の間の2−MEAの自動酸化を阻害することおよび潜在的には、遊離タンパク質のスルフヒドリルとの2−MEAの結合を制限することであった。2−MEAの添加により、実施例46(図50)に示したように、酸化還元電位はすぐに低下した(図53)。しかしながら、DO減少率は実施例46で観察されたものよりもずっと低かった(図53B参照)。金属キレート剤であるEDTAの添加による酸化速度の減少は、バッファー試薬中の微量金属不純物が還元段階の間の2−MEAの自動酸化を触媒していたことを示唆している。しかしながら、EDTAは2−MEAの自動酸化を十分には阻害できず、これは、DOが最終的にゼロ近くまで減少したためであった。このことから、実験条件下では、最後には、酸素移動が2−MEAの自動酸化の律速であったことが示唆される。EDTAを含まないPBSに対するダイアフィルトレーション後に、DOは100%の開始点にほぼ戻り、酸素消費速度が遅いことが示唆されたが、一方、酸化還元電位は依然として開始点より実質的に低かった。0.5mg/Lの硫酸銅の添加により少量の沈殿が生成したが、これは残存したEDTAが銅イオンと結合したことによる可能性が高い。さらに、DOはほぼ10%減少し、これは、銅イオンの添加による酸化の増加を示している。
いくつかの変更を加えて、実施例46の実験を繰り返した。1回目のダイアフィルトレーションの間、中空製品のヘッドスペースを窒素によりエアレーションを行った。この結果、溶存酸素濃度は20%となった。還元の間、50mL/分の窒素の連続流を、中空製品を通して送った。還元後、システムへ必要以上に酸素が添加されないように、窒素で100%飽和したPBS中で2回目のダイアフィルトレーションを行った。
PBS単独の代わりに2mM EDTAを含有するPBSを用いたダイアフィルトレーションにより2−MEAを除去したことを除いて、実施例46の実験を繰り返した。
PBS単独の代わりに0.5mg/Lの硫酸銅を含有するPBSを用いたダイアフィルトレーションにより2−MEAを除去したことを除いて、実施例46の実験を繰り返した。
F405LまたはK409Rの突然変異に加えて、重鎖においてC末端リジンを完全に欠いている単一特異性抗体(C末端リジンを欠失させることによる;delK)の発現のための哺乳動物発現ベクターは、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的技術により生み出される。これにより発現ベクターpigG1f−F405L−delKおよびpigG1f−K409R−delKが得られる。2つの重鎖ベクターに、対象となる2つの抗体に相当する関連VH配列が挿入される。さらに、軽鎖の発現ベクターは、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的技術により生み出される。これらの軽鎖ベクターに、対象となる2つの抗体に相当する関連VL配列が挿入される。
2つのホモ二量体各々の1バッチを作出し、標準的なプロセス(細胞株に対してまたは指定の抗体に対して個別に最適化されたものではない)を用いて1000Lスケールで精製した。このプロセスに用いる細胞株は実施例40に記載している。細胞を融解し、1000L反応器への接種のために、500mL振盪フラスコ(融解)、1L振盪フラスコ、3L振盪フラスコ(全てのフラスコはCorning社製)、ウェーブバッグ(Wave Biotech)、100Lシードバイオリアクターを含む5継代工程によって、最後に、1000L生産用バイオリアクターへと17日でスケールアップした。振盪フラスコおよびウェーブバッグは、5%CO2および37℃に制御されたインキュベーター内に入れた。シードバイオリアクターおよび生産用バイオリアクターは、pH7.0(CO2および炭素ate)、DO30%(空気/O2および振盪)および温度37℃(水ジャケット)に制御した。生産用バイオリアクターには、500Lで、3日目に開始し生産終了まで毎日供給材料を添加することにより接種した。IgG1−7D8−K409R細胞株は予想通り生じ、十分な材料を用いて11日目(すなわち、1.85g/L)に生産を停止させた。IgG1−2F8−F405L細胞株は、スケールアップするための元の貯蔵物から生産性を損失し、15日目に0.6g/Lにおいて生産を停止させた。その後、各場合において、バイオリアクターを12℃に冷却し、2Mクエン酸を用いてpHを4.5に下げ、産物を遠心分離により回収した。次に、深層濾過(Millipore)を適用し、0.2μm濾過(Sartorius)を行って、細胞を除去し、2M Trisを用いてpHを中性にした。集菌回収率はIgG1−7D8−K409Rでは93%であり、IgG1−2F8−F405Lでは80%であった。
以下の変更を加えて、本質的には、実施例46の実験を繰り返した:第1に、1種(抗CD38抗体)ではなく2つの異なるホモ二量体を用いた;第2に、還元時間を4時間から3時間へと短縮した;第3に、異なるダイアフィルトレーションカートリッジを用いた;最後に、SDS−PAGE分析ではサンプルにIAAを加えるだけにした。
kla=酸素移動容量係数(1/時間)
DO*=平衡DO濃度(100%)
DO=時間1および時間2の間での平均DO濃度(%)
DO1=初期DO濃度
DO2=最終DO濃度
s=酸素溶解度(0.2mM/100%)
t2−t1=経過時間(時間)
1分間ごとの酸素消費量を合計することにより、総酸素消費量を決定した。
以下の変更を加えて、実施例53の実験を繰り返した。2mM EDTA(Fluka、カタログ番号03677;二ナトリウム二水和物)を還元バッファーおよびダイアフィルトレーションバッファーの両方に加え、2M NaOHを用いてpHを7.4に再調整した。EDTAは、還元期間の間の金属触媒による2−MEAの自動酸化およびダイアフィルトレーション/再酸化段階の間のヘテロ二量体の再酸化を阻害し得る金属と結合する。
DO制御設定点を50%DOに設定したことを除いて、実施例53の実験を繰り返し、酸素濃度の増加および酸素移動速度の増加の影響を判定した。制御戦略は、最低限の振盪100RPMを維持し、その後、DOが50%未満に減少した場合には2−MEA添加により振盪を自動的に増加させて50%DO設定点を維持することとした。最初に、最大振盪速度を500RPMに設定した。
DO制御設定点を50%DOに設定したことを除いて、実施例53の実験を繰り返し、酸素濃度の増加および酸素移動速度の増加の影響を判定した。制御戦略は最低限の空気流0mL/分および振盪100RPMを維持し、DOが50%未満に減少した場合には、まず、空気流スパージングを40mL/分まで増加させ、次に、振盪を400RPMまで増加させてこの設定点を維持することとした。
以下の変更を加えて、実施例53の実験を繰り返した。還元前の時期からダイアフィルトレーションの完了直後まで、システムから酸素をパージした。
還元期間の終了まで、実施例53の実験を繰り返した。その時点、ダイアフィルトレーションの直前、および3時間還元サンプルの採取の直前に、6.4mLの2M酢酸を用いてpHを5.0に下げた;振盪は、酸を添加する間、200RPMへ高め、その後、ダイアフィルトレーションの前に下げて100RPMに戻した。2M酢酸の添加によりpH5.0に調整したPBSを、ダイアフィルトレーションバッファーとして用いた。実施例53の場合と同様に、産物を一晩維持した(25℃、100RPM、15mL/分のヘッドスペースガス供給で)。翌日、サンプルを採取し、HClでpH9に調整した2N Tris塩基8.8mLの溶液を用いて産物を調整してpH7.4に戻し、pH調整の直後、その後、pH調整から1時間後および2時間後にサンプルを採取した。
シスタミンはシステアミン(2−MEA)の酸化型二量体である。
システインは、GMPの作出に好適な大量で入手可能な天然、公定の非毒性化合物であり、システインも還元体/還元剤として使用可能である。システインの還元体としての効力を試験した。システイン(Sigma C5360)の酸化還元電位を、実施例53に記載するように、1−L反応器システムにて2−MEAの酸化還元電位と比較した。この反応器に990mLのPBS pH7.4(P.Braun)を満たし、窒素を用い、DOを0%の状態とした。5M 2−MEA保存溶液をこの反応器に徐々に加え(終濃度45mMまで)、pH、DO、および酸化還元電位を記録した。PBS単独の酸化還元電位は87.5mVであった(表13)。酸化還元電位は最初に0.5mM 2−MEAで−218.7mVに急に減少し、次いで、45mM 2−MEAで徐々に−345mVに減少した。この時点で、pHは2−MEAの酸度のために6.92に低下した。
二重特異性抗体の形成と二重特異性抗体からの還元体の除去を一工程で可能にするために、固定化還元体カラムを用いた。ホモ二量体IgG1−2F8−F405LおよびIgG1−7D8−K409Rの混合物を、製造業者の使用説明書に従って調製した固定化還元体カラム(Thermo Scientific/Pierce、ロックフォード、IL、USA;カタログ番号77701)に、PBS(P.Braun)中、各2.5mg/mLの濃度にて1:1のモル比で添加し、室温で3時間インキュベートした。抗体を、2mLのPBSを適用することにより溶出させ、回収した。サンプルをHPLC−CIEXにより分析した。図103は、元のホモ二量体間での二重特異性抗体の形成を示す(25.3%二重特異性、36.4%IgG1−2F8−F405Lおよび38.3%IgG1−7D8−K409%)。
二重特異性抗体調製物中の残存量のホモ二量体の除去を可能にするために、異なるアロタイプの2つのホモ二量体から二重特異性抗体が作出できるかどうかを検討した。
K409RおよびF405L突然変異を含むIgG1m(f)およびIgG1m(za)アロタイプ主鎖として発現される抗体を当技術分野で公知の方法によって作製する。その後、実施例1、2および5に記載のようにタンパク質を発現させ、精製する。二重特異性抗体を、実施例64に記載するように、ステアード非等モル交換により生成する。この結果、二重特異性IgG1m(f,za)抗体と過剰に加えた親抗体の残りを含有する反応混合物が得られる(SNEEP)。
交換プロセス(ステアード非等モル交換プロセス;SNEEP)において、交換産物中の一方のホモ二量体の存在を過剰な他方のホモ二量体を使用することで減少させることができるかどうかを検討した。交換産物中のIgG1−2F8−F405L(プロテインAで精製)ホモ二量体の存在を減少させるために過剰量のIgG1−7D8−K409R(プロテインAで精製)を用いる場合、SNEEPがもたらした、交換産物中のIgG1−2F8−F405Lホモ二量体はわずか0.1%であった(図105)。用いた条件は、3mLのPBS中、7.2mg IgG1−7D8−K409R、6.0mg IgG1−2F8−F405L、75mM 2−MEA、31℃で5時間のインキュベーションであった。過剰量のIgG1−2F8−F405Lホモ二量体を用いた場合、交換産物中のIgG1−7D8−K409Rのパーセンテージはわずか0.4%であった(図106)(6mgのIgG1−7D8−K409Rおよび7.2mg IgG1−2F8−F405Lを用いて同条件)。
単回のプロテインA捕捉工程を用いてともに精製されたホモ二量体から二重特異性抗体が作出できるかどうかを検討するために、17.5mLのIgG1−b12−F405L(280μg/mL濃度)を66mLのIgG1−058−K409R(75μg/mL濃度)と混合した。合わせた上清(総タンパク質量に基づき1:1混合物)を、20mMクエン酸塩、150mM NaCl、pH7.0で平衡化した1mLプロテインAカラムにロードした。結合した材料を洗浄し、標準的な手順を用いて溶出した(7カラム容量(CV)の20mMクエン酸塩、150mM NaCl、pH7.0での洗浄;3CVの20mMクエン酸塩、pH7.0での予備溶出;10mMクエン酸塩、pH3.5での溶出)。
SNEEPと定組成モードでの弱い陽イオン交換(WCIEX)クロマトグラフィーの組合せを用い、二重特異性産物から両方のホモ二量体を除去することが可能かどうか検討した。ホモ二量体は、共精製(実施例65)に記載した標準的アプローチを用いて、プロテインA上で首尾よく精製された。SNEEPは実施例64に記載され、交換産物中に0.1%(IgG1−2F8−F405L;過剰量のIgG1−7D8−K409Rとの交換反応の場合;図105)および0.4%(IgG1−7D8−K409R;過剰量のIgG1−2F8−F405Lとの交換反応の場合;図106)のホモ二量体を示した。これは別々の実験で示されたものであるが、これらの数値はSNEEPの効率の指標となると思われる。
tb:IgG1−2F8−F405Lホモ二量体の保持時間
ta:二重特異性抗体の保持時間
Wa:半分の高さにあるヘテロ二量体タンパク質ピークの幅
Wb:半分の高さにあるIgG1−2F8−F405Lホモ二量体ピークの幅
図116では、式5を用いて算出した分離度を、イオン強度の異なる2つのバッファー(10mMおよび20mMクエン酸塩pH6.0〜6.8と10mMリン酸塩pH6.8および7.2)について、pH領域を重複させてpHの関数としてプロットした。分離度はクエン酸バッファーpH6.4で最適であった。この条件を定組成モードでのWCIEXのために選択した。
ヘテロ二量体タンパク質調製物から還元剤2−MEAを除去するために結合・溶出クロマトグラフィー(限定されるものではないが、CIEX、アフィニティークロマトグラフィー、HICを含む)を使用することができるかどうかを検討した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを原理証明として用い、還元剤への曝露前後のカラム性能を漏出点の決定により調べた。
二重特異性抗体調製物中の残存量のホモ二量体の除去を可能にするために、1つのκ軽鎖と1つのλ軽鎖を有する二重特異性抗体が作出できるかどうかを検討した。κ軽鎖を含有するあるIgG4分子とλ軽鎖を含有する別のIgG4分子との間でのFabアーム交換の可能性が、in vivoにおいてナタリズマブ(Labrijn et al. 2009 Nature Biotechnology p767)で処置した患者で示された。
2〜8℃および25℃で12ヶ月の保存時のPBSバッファー中でのヘテロ二量体タンパク質の生化学安定性を元のホモ二量体と比較して調べた。40℃の昇温下で3ヶ月の保存も含めた。IgG1−2F8−F405LおよびIgG1−7D8−K409Rと対応するホモ二量体IgG1−2F8−F405LおよびIgG1−7D8−K409Rの交換により形成されたヘテロ二量体を用いて安定性試験を行った。これら3つの材料をPBS pH7.4(B.Braun、カタログ番号3623140;8.7mM HPO4 2−、1.8mM H2PO4 −、163.9mM Na+、140.3mM Cl−、pH7.4)中に5mg/mLで調製した。これらのバッチを、2〜8℃でのインキュベーションの場合には1.0mLクライオバイアル中に、25℃および40℃でのインキュベーションの場合には共栓および蓋付きガラスバイアル中に、300μLアリコートとして無菌的に分注した。材料を0、1、2、3、6、9および12ヶ月の時点でNanodrop(A280およびA350)、SDS−PAGE、HP−SECおよびCIEXにて分析した。
Claims (56)
- a)第1のホモ二量体タンパク質を第2のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質は、第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、前記第2のホモ二量体タンパク質は、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含み、かつ、
前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、第1のホモ二量体タンパク質が409位にArgを有し、第2のホモ二量体タンパク質が405位にLeuを有する、工程、
b)工程a)から得た組成物の少なくとも30mLを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程、および
c)ヘテロ二量体タンパク質を得る工程
を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのin vitro法であって、本方法はヘテロ二量体タンパク質をもたらし、総産物の80%超がヘテロ二量体タンパク質である、方法。 - 工程a)における還元条件が還元剤を添加することを含む、請求項1に記載のin vitro法。
- 前記還元剤が、2−メルカプトエチルアミン、2−メルカプトエチルアミンの化学誘導体、L−システインおよびD−システインからなる群から選択される、請求項2に記載のin vitro法。
- 工程a)が金属キレート剤を添加することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 前記金属キレート剤がEDTA、EGTAまたはクエン酸である、請求項4に記載のin vitro法。
- 工程a)における還元条件が工程a)における組成物中の酸素の量を減少させることを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程a)が、−150〜−600mVの間の酸化還元電位を用いる還元条件下で行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程a)が、2−メルカプトエチルアミン、L−システインおよびD−システインからなる群から選択される少なくとも25mMの還元剤の存在下、少なくとも20℃の温度で少なくとも30分間のインキュベーションを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質がバッファー中に存在する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 前記バッファーがリン酸塩を1〜100mMの範囲で含む、請求項9に記載のin vitro法。
- 前記バッファーが、4.5〜8.5の範囲のpHを有する、請求項9又は10に記載のin vitro法。
- 前記バッファーが、a)8.1mMリン酸ナトリウム(Na2HPO4・7H2O)、1.5mMリン酸カリウム(KH2PO4)、138mM塩化ナトリウム(NaCl)、2.7mM塩化カリウム(KCl)pH5.0;b)8.1mMリン酸ナトリウム(Na2HPO4・7H2O)、1.5mMリン酸カリウム(KH2PO4)、138mM塩化ナトリウム(NaCl)、2.7mM塩化カリウム(KCl)pH7.0;3)20mM Tris−HCl、pH7.8からなる群から選択される、請求項9〜11のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)が6〜8.5の範囲のpHを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)が少なくとも−300mVの酸化還元電位を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)における酸化条件が、少なくとも0.05mMの酸素の存在を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)における酸化条件が酸素の添加を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 酸素の添加が、機械的に行われる、請求項16に記載のin vitro法。
- 酸素の添加が、酸素もしくは空気を用いたスパージングまたは増圧により行われる、請求項16又は17に記載のin vitro法。
- 工程b)における酸化条件が酸化剤を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 前記酸化剤がデヒドロアスコルビン酸(dhAA)である、請求項19に記載のin vitro法。
- 工程b)が、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離することを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)が、工程a)から得た組成物をクロマトグラフィーまたは濾過に付すことを含む、請求項21に記載のin vitro法。
- 前記クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである、請求項22に記載のin vitro法。
- 前記濾過がダイアフィルトレーションである、請求項22に記載のin vitro法。
- 前記ダイアフィルトレーションがタンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)またはノーマルフローフィルトレーション(NFF)である、請求項24に記載の方法。
- 前記ダイアフィルトレーションがTFFである、請求項25に記載のin vitro法。
- 前記ダイアフィルトレーションが、0.05〜1m2の範囲の表面積を有し、かつ、70〜280kPaの範囲のカートリッジ入口圧を示す、10〜50kDaの範囲のカットオフ値を含む中空糸カートリッジを通して前記組成物を、1〜7容量のバッファー交換が行われるまで循環させることにより行われる、請求項25に記載のin vitro法。
- ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離が、工程a)から得た組成物のバッファーまたは溶液を、前記還元剤を含まないバッファーまたは溶液と交換することを含む、請求項21〜27のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 3〜12容量の範囲でのバッファーまたは溶液交換を含む、請求項28に記載のin vitro法。
- ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離が連続プロセスである、請求項22〜28のいずれか一項に記載のin vitro法。
- ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離がバッチプロセスである、請求項22〜28のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)における酸化条件が、
I)工程a)から得た組成物のダイアフィルトレーション
II)工程I)から得た保持液のインキュベーション
III)工程II)から得た組成物のダイアフィルトレーション
の工程を含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載のin vitro法。 - 工程I)および/または工程III)におけるダイアフィルトレーションが3〜12容量の範囲でのバッファー交換を含む、請求項32に記載のin vitro法。
- 工程II)が15〜35℃の範囲の温度で12〜48時間のインキュベーションを含む、請求項32又は33に記載のin vitro法。
- 工程a)から得た組成物におけるヘテロ二量体タンパク質の濃度が1〜100g/Lの範囲内である、請求項1〜34のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)における酸化条件が金属イオンを含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程b)における酸化条件が金属イオンの添加を含む、請求項36に記載のin vitro法。
- 前記金属イオンの濃度が0.1〜100μMの範囲内である、請求項36又は37に記載のin vitro法。
- 前記金属イオンが、銅、マンガン、マグネシウム、鉄、ニッケルおよびコバルトからなる群から選択される、請求項36〜38のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程a)における第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質との比率が1:1.01〜1:2の範囲内である、請求項1〜39のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 第1のホモ二量体タンパク質または第2のホモ二量体タンパク質はいずれかがプロテインAおよび/またはプロテインGと結合することができない、請求項1〜40のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が異なる軽鎖を含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程c)が、一方の軽鎖だけが結合する材料に通すことによりヘテロ二量体タンパク質を残存した第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質から分離することを含む、請求項42に記載のin vitro法。
- 第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質のFc領域が異なるアロタイプのものである、請求項1〜43のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 工程c)が、一方のアロタイプだけが結合する材料に通すことによりヘテロ二量体タンパク質を残存した第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質から分離することを含む、請求項44に記載のin vitro法。
- 工程c)が、工程b)から得た組成物を精製方法に付すことを含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 前記精製方法が、プロテインAまたはプロテインGクロマトグラフィー、抗原結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィー、抗イディオタイプ抗体に基づいたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよびチオール基吸着クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項46に記載のin vitro法。
- 工程a)が、
i)第1のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含む第1のホモ二量体タンパク質を提供する工程、
ii)第2のCH3領域を含む免疫グロブリンFc領域を含む第2のホモ二量体タンパク質を提供する工程を含み、
ここで、前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
iii)前記第1のタンパク質を前記第2のタンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程
を含む、請求項1〜47のいずれか一項に記載のin vitro法。 - 工程a)における第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質の総濃度が少なくとも0.25mg/mLである、請求項1〜48のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列が同一でない位置にアミノ酸置換を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 野生型CH3領域と比べて、第1のホモ二量体タンパク質がCH3領域内にアミノ酸置換を1つだけ有し、第2のホモ二量体タンパク質がCH3領域内にアミノ酸置換を1つだけ有する、請求項1〜50のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 第1のホモ二量体タンパク質が、366位、368位、370位、399位、405位、407位および409位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質が、366位、368位、370位、399位、405位、407位および409位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、ここで、前記第1のホモ二量体タンパク質および前記第2のホモ二量体タンパク質が同じ位置で置換されていない、請求項1〜51のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質がC末端リジンを含まない、請求項1〜52のいずれか一項に記載のin vitro法。
- 第1のホモ二量体タンパク質および/または第2のホモ二量体タンパク質が、重鎖のC末端リジンを欠くように遺伝子改変されている、請求項53に記載のin vitro法。
- 重鎖からC末端リジンを除去する工程を含む、請求項53に記載のin vitro法。
- x)第1のCH3領域を含む第1の免疫グロブリンFc領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸構築物を提供する工程、
y)第2のCH3領域を含む第2の免疫グロブリンFc領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸構築物を提供する工程、
ここで、前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の配列は、異なっており、前記第1のCH3領域と前記第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第1のCH3領域および前記第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第1のポリペプチドは、409位にArgを有し、前記第2のポリペプチドは、405位にLeuを有する、
z)前記第1の核酸構築物および前記第2の核酸構築物を宿主細胞において共発現させる工程、
b)工程z)から得た組成物の少なくとも30mLを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程、および
c)ヘテロ二量体タンパク質を得る工程
を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのin vitro法であって、本方法はヘテロ二量体タンパク質をもたらし、総産物の80%超がヘテロ二量体タンパク質である、方法。
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