KR20140091014A - 이종이량체 단백질의 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이종이량체 단백질의 생산을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.

Description

이종이량체 단백질의 생산 {PRODUCTION OF HETERODIMERIC PROTEINS}
본 발명은 제1 및 제2 동종이량체 단백질을 환원 조건 하에 인큐베이션하는 제1 단계 및 제1 단계로부터 얻은 조성물을 산화 조건에 적용하는 제2 단계를 포함하는, 이종이량체 단백질의 생산을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 항체를 포함한 이종이량체 단백질의 대규모 생산을 위해 특히 적합하다.
모노클로날 항체는 최근에 특히 암의 치료를 위한 성공적인 치료 분자가 되고 있다. 이중특이적 항체는 추가로 모노클로날 항체 요법의 효력 및 효능을 증가시킬 수 있고, 예를 들어 이들은 약물 또는 독성 화합물을 표적 세포로 유도하기 위해, 이펙터 메카니즘을 질병 연관 부위에 다시 유도하기 위해, 또는 예를 들어 종양 세포에서만 발견되는 표적 분자의 조합물에 결합함으로써 종양 세포에 대한 특이성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 2개의 모노클로날 항체의 특이성을 하나로 조합함으로써, 이중특이적 항체는 매우 많은 작용 메카니즘 또는 이들의 조합된 작용 메카니즘에 잠재적으로 참여할 수 있다.
이중특이적 항체의 상이한 포맷 (format) 및 용도는 최근에 문헌 [Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276]에서 검토되었다. 이중특이적 항체 개발에서 주요한 장애 중의 하나는 전통적인 기술, 예컨대 하이브리드 (hybrid) 하이브리도마 및 화학적 접합 방법에 의해 물질을 충분한 품질 및 양으로 생산하는 것의 어려움이었다 (문헌 [Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26: 649]). 상이한 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 2개의 항체의 숙주 세포에서의 공발현은 목적하는 이중특이적 항체에 추가로, 가능한 항체 생성물의 혼합물을 생성한다.
상이한 항체 구축물의 공발현시에 이종이량체, 즉 이중특이적 생성물의 형성을 촉진하기 위한 몇몇 전략이 제시된 바 있다.
문헌 [Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155: 219)]은 래트/마우스 쿼드로마 (quadroma)에서 우선적인 종-제한된 중쇄/경쇄 쌍형성 (pairing)을 개시하고 있다.
이중특이적 항체의 형성을 위한 기술은 소위 "놉-인투-홀 (knob-into-hole)" 전략 (미국 특허 5,731,168)이다. EP1870459 (추가이 (Chugai)) 및 WO 2009089004 (암젠 (Amgen))는 숙주 세포에서 상이한 항체 도메인의 공발현시에 이종이량체 형성을 촉진하기 위한 다른 전략을 설명하고 있다. 이들 방법에서, 중쇄 불변 도메인 3 (CH3)인 두 CH3 도메인 내의 CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 잔기는, 동종이량체 형성은 정전기적으로 불리하고 이종이량체화는 정전기적으로 유리하도록 하전된 아미노산으로 대체된다. WO2007110205 (머크 (Merck))는 IgA와 IgG CH3 도메인 사이의 차이를 이종이량체화 촉진에 이용하는 또 다른 전략을 설명하고 있다.
문헌 [Dall'Acqua et al. (1998 Biochemistry 37:9266)]에서는 CH3 동종이량체의 계면에서 CH3-CH3 접촉에 관여하는 5개의 강력한 핵심 아미노산 잔기 (366, 368, 405, 407 및 409)를 확인하였다.
WO 2008119353 (젠맵 (Genmab))에는 항체의 생성을 위한 생체외 방법이 기재되어 있다.
WO 11/131746 (젠맵)에는 이종이량체 항체 Fc-함유 단백질 및 그의 생산 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 이종이량체 단백질, 예컨대 안정한 IgG1 이중특이적 항체의 생산 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 방법은 안정한 이종이량체 단백질의 대규모 생산에 특히 적합하고, 디술피드 결합은 재산화된다. 동종이량체의 CH3 도메인 내에 비대칭적 돌연변이를 도입함으로써, Fab-아암 (arm) 교환 반응은 CH3 도메인의 상보성 때문에 강제로 지향성 (directional)이 되고, 이에 의해 고도로 안정한 이종이량체 단백질을 생성할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 이종이량체 단백질의 시험관내 생산 방법에 관한 것으로, 다음 단계를 포함한다:
a) 제1 동종이량체 단백질을 제2 동종이량체 단백질과 함께, 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계로서,
여기서 상기 제1 동종이량체 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제2 CH3 영역을 포함하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열인 단계, 및
b) 단계 a)로부터 얻은 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계.
본 발명의 또 다른 측면에서, 단계 a)는 다음 단계로 대체된다:
x) 이뮤노글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 구축물을 제공하고, 상기 제1 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
y) 이뮤노글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 구축물을 제공하고, 상기 제2 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
- 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열이고,
상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고/갖거나,
상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 실시예 21에서 설명되는 바와 같이 검정할 때 각각의 CH3 영역의 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 0.01 내지 10 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 10 마이크로몰, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5, 예컨대 0.05 내지 5 마이크로몰, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 내지 1 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 1 마이크로몰, 0.01 내지 0.5 또는 0.01 내지 0.1이 되도록 하는 서열임-
z) 숙주 세포에서 상기 제1 및 제2 핵산 구축물을 공발현시키는 단계.
도 1: 종간 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성. 표시된 항-EGFR (2F8)과 CD20 (7D8) IgG4 항체 사이의 GSH-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후에 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. 0-1 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을 ELISA로 분석하였다. 이중특이적 결합은 동일한 종의 두 항체 사이보다 레서스 (Rh)와 인간 (Hu) IgG4 항체 사이의 Fab-아암 교환 후에 더 높았다.
도 2: 코어 힌지 (즉, 잠재적으로 중쇄간 디술피드 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기 및 다른 인간 및 레서스 원숭이 이소형 내의 대응하는 잔기를 포함하는 인간 IgG1 내의 CPPC 서열) 및 인간 및 레서스 항체 이소형의 CH3 - CH3 계면의 아미노산 서열의 정렬.
도 3: Fab - 아암 교환에 참여하는 돌연변이체 인간 IgG1 을 사용한 이중특이적 항체의 생성. 인간 CD20 (7D8) IgG4 항체와 표시된 인간 EGFR (2F8) IgG1 항체 사이의 GSH-유도 시험관내 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. 제시된 그래프는 1 ㎍/ml의 총 항체 농도가 ELISA에 사용되는 3개의 독립적인 Fab-아암 교환 실험의 평균 수치를 보여준다. 이중특이적 결합은 2개의 IgG4 항체 사이보다 IgG1-2F8-CPSC-ITL과 IgG4-7D8 사이의 Fab-아암 교환 후에 더 높았다. IgG4-7D8과 IgG1-2F8, IgG1-2F8-CPSC 또는 IgG1-2F8-ITL의 조합은 사용된 조건 하에서 이중특이적 항체를 생성하지 않았다.
도 4: 인간 IgG4 및 돌연변이체 IgG1 항체의 생체내 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성. 인간 CD20 (7D8) IgG4와 표시된 인간 EGFR (2F8) IgG1 및 IgG4 돌연변이체 항체 사이의 면역결핍 마우스에서의 생체내 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. 제시된 그래프는 평균 수치 (n=4)를 보여준다. 이중특이적 반응성은 총 IgG 농도에 대한 이중특이적 항체 농도 (%)로서 제시된다. 안정된 힌지 (CPPC) 또는 CH3 도메인 내의 R409K 돌연변이를 갖는 인간 IgG4는 Fab-아암 교환에 참가할 수 없다. 힌지 내의 CPSC 서열 및 CH3 도메인 내의 K409R 돌연변이를 모두 갖는 IgG1은 Fab-아암 교환에 참여한다. (*) IgG1-2F8, IgG4-2F8-CPPC 또는 IgG4-2F8-R409K를 함유하는 혼합물에 대한 이중특이적 결합은 검출 한계 미만이었고, 따라서 임의로 0으로 설정하였다.
도 5: 인간 IgG1 과 IgG4 항체 사이의 2-메르캅토- 에틸아민 · HCl - (2- MEA -) 유도 Fab - 아암 교환을 사용한 이중특이적 항체의 생성. 표시된 인간 EGFR (2F8)과 CD20 (7D8) 항체 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. 0-40 mM 2-MEA의 농도 계열을 시험하였다. 제시된 그래프는 20 ㎍/ml의 총 항체 농도가 사용된 ELISA의 결과를 보여준다. 2-MEA는 또한 안정된 힌지 (CPPC)를 함유하는 항체 사이의 Fab-아암 교환을 효율적으로 유도하였다. CH3 도메인에 대해, 인간 IgG4 x 인간 IgG1과 삼중 돌연변이 T350I-K370T-F405L의 조합은 2개의 야생형 IgG4 항체에 비해 보다 높은 수준의 이중특이적 반응성을 유발하였다.
도 6: 인간 IgG1 과 IgG4 항체 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환을 사용한 이중특이적 항체의 생성.
표시된 인간 EGFR (2F8)과 CD20 (7D8) 항체 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성은 0-40 mM 2-MEA의 농도 계열의 모든 샘플에 대해 질량 분광법에 의해 결정하였다. (a) 0 mM, 7 mM 및 40 mM 2-MEA를 사용한 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 Fab-아암 교환 반응의 샘플에 대한 질량 분광법 프로파일의 대표적인 예가 제시된다. (b) 질량 분광법 데이터의 정량 후에, 이중특이적 항체 비율을 계산하고, Fab-아암 교환 반응에서 2-MEA 농도에 대해 플로팅하였다. IgG4-2F8 x IgG4-7D8은 최대 대략 50%의 이중특이적 항체를 생성하였다. IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC는 최대 대략 95%의 이중특이적 항체를 생성하였다.
도 7: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 얻은 이종이량체 이중특이적 항체의 안정성 분석. IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC (a), 또는 IgG4-2F8 x IgG4-7D8 (b)을 조합함으로써 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 샘플의 안정성을, 표시된 농도의 무관한 IgG4의 존재 하의 GSH-유도 Fab-아암 교환 반응 후에 ELISA에서 EGFR/CD20 이중특이적 결합을 측정함으로써 시험하였다. 이중특이적 결합은 100%로 설정된 출발 물질 (대조군)의 이중특이적 결합에 비교하여 제시된다. (a) IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC로부터 유래된 2-MEA-유도 이중특이적 생성물의 이중특이적 결합은 보존되었고, 이것은 GSH 조건 하에 Fab-아암 교환에 참여하지 않은 안정한 생성물을 나타낸다. (b) IgG4-2F8 x IgG4-7D8로부터 유래된 2-MEA-유도 이중특이적 생성물의 이중특이적 EGFR/CD20 결합은 감소하였고, 이것은 생성물이 GSH 조건 하에 무관한 IgG4와의 Fab-아암 교환에 참여함을 나타낸다.
도 8: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이종이량체 이중특이적 항체의 혈장 클리어런스율. 3개의 군의 마우스 (군당 3마리의 마우스)에게 표시된 항체를 주사하였다: (1) IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 시험관내 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 100 ㎍ 이중특이적 항체; (2) 100 ㎍ 이중특이적 항체 + 1,000 ㎍ 무관한 IgG4; (3) 50 ㎍ IgG1-2F8-ITL + 50 ㎍ IgG4-7D8-CPPC. (a) ELISA에 의해 결정된, 시간에 걸친 총 항체 농도. 총 항체 혈장 농도의 곡선은 모든 항체에 대해 동일하였다. (b) ELISA에 의해 결정된 이중특이적 항체 농도. 주사된 항체의 이중특이성은 과량의 무관한 IgG4를 첨가한 경우 및 첨가하지 않은 경우 모두 동일하였다. (*) IgG1-2F8-ITL + IgG4-7D8-CPPC 혼합물에 대한 이중특이적 결합은 검출 한계 미만이었고, 따라서 상응하는 기호는 상기 그래프에서 플로팅할 수 없었다. 2개의 ELISA 실험의 평균값이 제시된다.
도 9: 인간 IgG1 -2F8과 IgG4 -7 D8 - CPPC 사이의 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 순도. (a) 환원 SDS-PAGE (a)는 이중특이적 샘플 및 IgG1 대조군 샘플 둘 모두에 대한 중쇄 및 경쇄의 밴드를 보여준다. 비-환원 SDS-PAGE (b)는 무손상 IgG를 보여준다. (b) HP-SEC 분석의 피크 결과는 >98%의 이중특이적 샘플이 균일함을 보여주고, 실제적으로 항체 응집체는 검출가능하지 않았다. (c) 질량 분광법은 Fab-아암 교환이 대략 100% 이중특이적 생성물을 생성함을 보여준다.
도 10: 인간 IgG4 -7 D8 과의 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성에서 삼중 돌연변이체 ( ITL ), 이중 돌연변이체 ( IT , IL , TL ) 및 단일 돌연변이체 (L) 인간 IgG1 -2F8 사이의 비교. 인간 IgG1-2F8 삼중 및 이중 돌연변이체와 CPSC 힌지를 갖는 야생형 IgG4-7D8 (a) 또는 안정된 힌지를 갖는 돌연변이체 IgG4-7D8-CPPC (b), 또는 단일 돌연변이체 IgG1-2F8-F405L 및 야생형 CPSC 또는 안정된 CPPC 힌지를 갖는 IgG4-7D8 (c) 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. 0-20 ㎍/ml 또는 0-10 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을, 각각 이중 및 단일 돌연변이체를 포함하는 실험에 대해 ELISA로 분석하였다. IgG4와 이중 돌연변이체 IgG1-2F8-IL 및 -TL의 조합은 삼중 돌연변이체 IgG1-ITL과 유사한 이중특이적 EGFR/CD20 결합을 생성한다. IgG1-2F8-IT과의 조합은 이중특이적 생성물을 생성하지 않는다. IgG4 야생형 및 안정된 힌지를 갖는 IgG4와 단일 돌연변이체 IgG1-2F8-F405L의 조합은 모두 이중특이적 EGFR/CD20 결합을 생성한다.
도 11: 상이한 온도에서 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환을 사용한 이중특이적 항체의 생성. 0℃, 20℃ 및 37℃에서의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 반응에서 표시된 인간 EGFR (2F8) 및 CD20 (7D8) 항체를 조합하여 이중특이적 항체를 생성한 후, ELISA를 수행하였다. 이중특이적 결합의 유도는 37℃에서 가장 효율적이고, 20℃에서 더 느렸다. 0℃에서는, 어떠한 이중특이적 결합의 생성도 측정되지 않았다.
도 12: 상이한 환원제에 의해 유도된 시험관내 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성. 표시된 환원제의 농도 계열을 사용한 환원 반응에서 인간 IgG1-2F8-ITL 및 IgG4-7D8-CPPC의 조합에 의한 이중특이적 항체의 생성을 측정하기 위해 ELISA를 사용하였다. 이중특이적 결합은 DTT (최대치는 2.5 mM DTT에서 얻어짐) 및 2-MEA (최대치는 25 mM 2-MEA에서 얻어짐)와의 반응 후에 측정되었지만, GSH와의 반응시에는 측정되지 않았다. (*) > 10 mM의 GSH 농도에 대한 데이터는 항체 응집체의 형성 때문에 제외되었다.
도 13: IgG1 -2F8- ITL 과 IgG1 -7 D8 - K409X 돌연변이체 사이의 2- MEA -유도 Fab -아암 교환. IgG1-2F8-ITL과 표시된 IgG1-7D8-K409X 돌연변이체 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. (a) 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을 분석하였다. 양성 대조군은 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC로부터 유래된 이중특이적 항체의 정제된 배치 (batch)이다. (b) 교환은 양성 대조군 (흑색 막대)과 비교한 20 ㎍/ml에서의 이중특이적 결합으로서 제시된다. 암회색 막대는 IgG4 대조군 (IgG4-7D8 x IgG4-2F8), 음성 대조군 (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) 및 IgG1-2F8-ITL과 IgG4-7D8-CPPC 사이의 이중특이적 결합을 나타낸다. 연회색 막대는 표시된 IgG1-7D8-K409X 돌연변이체와 IgG1-2F8-ITL 사이의 동시에 수행된 Fab-아암-교환 반응의 결과를 나타낸다.
도 14: 항체 탈글리코실화는 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성에 영향을 주지 않는다. 표시된 EGFR (2F8)과 CD20 (7D8) 항체 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. 7D8 항체와의 교환을 그의 효소에 의해 탈글리코실화된 변이체와 비교하였다. 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을 ELISA에서 분석하였다. 탈글리코실화된 (deglyc) 항체를 수반하는 Fab-아암 교환 반응은 이들이 유래되는 글리코실화된 변이체와 동일한 이중특이적 결합 곡선을 보였다.
도 15: Fab - 아암 교환에 참여하는 능력은 CH3 - CH3 상호작용 강도에 상호관련된다. (a), (b) 및 (c) 시간에 걸쳐 ELISA에서 이중특이적 결합으로 제시된, 표시된 돌연변이를 갖는 IgG1-2F8과 IgG1-7D8 (a) 또는 IgG4-2F8과 IgG4-7D8 (b 및 c) 구축물 사이의 GSH-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성. 이중특이성은 24 h 후에 IgG4-2F8 x IgG4-7D8 대조군에 비교하여 제시된다. (d) 및 (e) IgG1-기반 (d) 또는 IgG4-기반 (e) 분자에 대한, 겉보기 KD (표 2)와 24시간 후의 이중특이적 항체 생성 (도 15a/b/c) 사이의 관계.
도 16: IgG1 , IgG4 및 (부분적인) IgG3 골격 ( backbone ) 내의 항- EGFr 항체 2F8의 서열 정렬. 카바트 (Kabat)에 따른 및 EU-인덱스 (index)에 따른 아미노산 넘버링이 제시된다 (둘 모두 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재됨). 2F8-G1은 서열 10에 제시되고, 2F8-G3 (부분적으로)은 서열 11에 제시되고, 2F8-G4는 서열 12에 제시된다.
도 17: 상이한 환원제에 의해 유도된 시험관내 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성. 표시된 환원제의 농도 계열을 사용한 환원 반응에서 인간 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 조합에 의한 이중특이적 항체의 생성을 측정하기 위해 ELISA를 사용하였다. 측정된 OD 값은 100%로 설정된, IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환으로부터 유래된 이중특이적 대조군 샘플의 신호로 정규화하였다. 최대 이중특이적 결합은 0.5-50 mM 농도의 DTT, 25-50 mM 농도의 2-MEA 및 0.5-5.0 mM 농도의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 사용한 반응 후에 측정되었지만, GSH를 사용한 반응 후에는 측정되지 않았다. (*) ≥ 25 mM의 GSH 농도에 대한 데이터는 항체 응집체의 형성으로 인해 제외되었다.
도 18: 인간 IgG1 -2F8-F405L과 IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환을 사용한 이중특이적 항체의 생성.
(a) 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. 제시된 그래프는 20 ㎍/ml의 총 항체 농도가 사용된 ELISA의 결과를 보여준다. 2-MEA는 인간 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R 사이의 Fab-아암 교환을 효율적으로 유도하였다. (b) 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성은 0-40 mM 2-MEA의 농도 계열의 모든 샘플에 대한 질량 분광법에 의해 결정하였다. 질량 분광법 데이터의 정량 후에, 이중특이적 항체의 비율을 계산하고, Fab-아암 교환 반응에서 2-MEA의 농도에 대해 플로팅하였다. IgG1-2F8-F405L과 IgG1-7D8-K409R 사이의 Fab-아암 교환은 시험된 가장 높은 2-MEA 농도에서 ~100% 이중특이적 항체를 생성하였고, 이것은 ELISA 데이터를 확인해 주었다.
도 19: 인간 IgG1 -2F8-F405L x IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 순도. 질량 분광법은 Fab-아암 교환이 대략 100% 이중특이적 생성물을 생성함을 보여준다.
도 20: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 혈장 클리어런스. 2개의 군의 마우스 (군당 3마리의 마우스)에게 표시된 항체를 주사하였다: (1) IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 시험관내 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 100 ㎍ 이중특이적 항체; (2) 100 ㎍ 이중특이적 항체 + 1,000 ㎍ 무관한 IgG4 (10 x IgG4); (a) ELISA에 의해 결정된, 시간에 걸친 총 항체 농도. 총 항체 혈장 농도의 곡선은 모든 항체에 대해 동일하였다. (b) ELISA에 의해 결정된 이중특이적 항체 농도. 주사된 항체의 이중특이성은 과량의 무관한 IgG4를 첨가한 경우 및 첨가하지 않은 경우 모두 동일하였다.
도 21: IgG1 -2F8-F405L x IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체에 의한 CD20 -발현 세포의 CDC - 매개된 세포 사멸. 표시된 항체의 농도 계열을 사용하여 다우디 (Daudi) (a) 및 라지 (Raji) (b) 세포에 대한 CDC를 매개하는 그의 능력을 시험하였다. 두 세포주는 CD20을 발현하지만, EGFR은 발현하지 않는다. IgG1-7D8 내에 K409R의 도입은 CDC를 유도하는 그의 능력에 영향을 주지 않았다. IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환으로부터 유래된 이중특이적 항체는 CDC를 계속 유도할 수 있었다.
도 22: IgG1 -2F8-F405L x IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체에 의한 EGFR -발현 세포의 ADCC - 매개된 세포 사멸. 표시된 항체의 농도 계열을 사용하여 A431 세포에 대한 ADCC를 매개하는 그의 능력을 시험하였다. IgG1-7D8은 CD20-음성 A431 세포에 결합할 수 없고, 따라서 ADCC에 영향을 주지 않았다. ADCC는 또한 CH3 도메인 내의 F405L 돌연변이의 도입 후에, EGFR 항체 IgG1-2F8에 의해 유도되었다. IgG1-2F8-F405L의 ADCC 이펙터 기능은 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 Fab-아암 교환에 의해 얻은 이중특이적 포맷에 유지되었다.
도 23: IgG1 -2F8-F405X 돌연변이체 및 IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab-아암 교환. 표시된 IgG1-2F8-F405X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. (a) 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)를 ELISA로 분석하였다. 양성 대조군은 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R로부터 유래된 이중특이적 항체의 정제된 배치이다. (b) 교환은 양성 대조군 (흑색 막대)과 비교한 20 ㎍/ml 항체 농도에서의 이중특이적 결합으로서 제시된다. 암회색 막대는 IgG4 대조군 (IgG4-7D8 x IgG4-2F8)과 음성 대조군 (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) 사이의 이중특이적 결합을 나타낸다. 연회색 막대는 표시된 IgG1-2F8-F405X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 또는 대조군 사이의 동시에 수행된 Fab-아암-교환 반응의 결과를 나타낸다.
도 24: IgG1 -2F8- Y407X 돌연변이체 및 IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab-아암 교환. 표시된 IgG1-2F8-Y407X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 ELISA에 의해 결정하였다. (a) 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)를 ELISA로 분석하였다. 양성 대조군은 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R로부터 유래된 이중특이적 항체의 정제된 배치이다. (b) 교환은 양성 대조군 (흑색 막대)과 비교한 20 ㎍/ml 항체 농도에서의 이중특이적 결합으로서 제시된다. 암회색 막대는 IgG4 대조군 (IgG4-7D8 x IgG4-2F8)과 음성 대조군 (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) 사이의 이중특이적 결합을 나타낸다. 연회색 막대는 표시된 IgG1-2F8-Y407X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 또는 대조군 사이의 동시에 수행된 Fab-아암-교환 반응의 결과를 나타낸다.
도 25: 비-환원 (도 25(a)) 및 환원 (도 25(b)) 조건 하에 SDS-PAGE에 의한, 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 분석.
도 26: 동종이량체 출발 물질 IgG1-2F8-F405L (도 26(b)), 동종이량체 출발 물질 IgG1-7D8-K409R (도 26(a)), 두 동종이량체의 혼합물 (1:1) (도 26(c)), 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물 (도 26(d))의 HP-SEC 프로파일.
도 27: 동종이량체 출발 물질 IgG1-2F8-F405L (도 27(b)), 동종이량체 출발 물질 IgG1-7D8-K409R (도 27(a)), 두 동종이량체의 혼합물 (1:1) (도 27(c)), 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물 (도 27(d))의 질량 분광법 (ESI-MS).
도 28: 동종이량체 출발 물질 IgG1-2F8-F405L (도 28(a)), 동종이량체 출발 물질 IgG1-7D8- K409R (도 28(b)), 두 동종이량체의 혼합물 (1:1) (도 28(c)), 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물 (도 28(d))의 모세관 등전 포커싱 (cIEF) 프로파일.
도 29: 동종이량체 출발 물질 IgG1-2F8-F405L (도 29(a)), 동종이량체 출발 물질 IgG1-7D8-K409R (도 29(b)), 두 동종이량체의 혼합물 (1:1) (도 29(c)), 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물 (도 29(d))의 HPLC-CIEX 프로파일.
도 30: 상이한 시점에서의 주사 후에 고압 액체 크로마토그래피 양이온 교환 (HPLC-CIEX)에 의해 모니터링된 동종이량체 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 교환 반응.
도 31: CIEX 방법으로 검출할 때 교환 반응 후의 잔류 동종이량체 (화살표로 표시됨).
도 32: ELISA에 의해 결정된, 이중특이적 항체의 생성에 대한 IgG 농도, 2-MEA 농도, 인큐베이션 온도 및 인큐베이션 시간의 영향.
도 33: ELISA에 의해 결정하고 임의로 100%로 설정된 대조군과 비교한, 다양한 IgG 농도, 2-MEA 농도, 인큐베이션 온도 및 시간에서 이중특이적 항체의 생성.
도 34: HPLC-CIEX에 의해 분석된, 다양한 IgG 농도, 2-MEA 농도, 인큐베이션 온도 및 시간에서 이중특이적 항체의 생성.
도 35: 표시된 IgG1-2F8-L368X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다 (도 35(a)). 양성 대조군은 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R로부터 유래된 이중특이적 항체의 정제된 배치이다. 도 35(b)는 양성 대조군 (흑색 막대)과 비교한 20 ㎍/ml에서의 이중특이적 결합을 보여준다. 암회색 막대는 IgG4 대조군 (IgG4-7D8 x IgG4-2F8)과 음성 대조군 (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) 사이의 이중특이적 결합을 나타낸다. 연회색 막대는 표시된 IgG1-2F8-L368X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 동시에 수행된 Fab-아암-교환 반응의 결과를 나타낸다.
도 36: 표시된 IgG1-2F8-K370X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다 (도 36(a)). 양성 대조군은 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R로부터 유래된 이중특이적 항체의 정제된 배치이다. 도 36(b)는 양성 대조군 (흑색 막대)과 비교한 20 ㎍/ml에서의 이중특이적 결합을 보여준다. 암회색 막대는 IgG4 대조군 (IgG4-7D8 x IgG4-2F8)과 음성 대조군 (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) 사이의 이중특이적 결합을 나타낸다. 연회색 막대는 표시된 IgG1-2F8-D370X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 동시에 수행된 Fab-아암-교환 반응의 결과를 나타낸다.
도 37: 표시된 IgG1-2F8-D399X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다 (도 37(a)). 도 37(b)는 양성 대조군 (흑색 막대)과 비교한 20 ㎍/ml에서의 이중특이적 결합을 보여준다. 암회색 막대는 IgG4 대조군 (IgG4-7D8 x IgG4-2F8)과 음성 대조군 (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) 사이의 이중특이적 결합을 나타낸다. 연회색 막대는 표시된 IgG1-2F8-D399X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 동시에 수행된 Fab-아암-교환 반응의 결과를 나타낸다.
도 38: 표시된 IgG1-2F8-T366X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 항체의 생성을 0-20 ㎍/ml의 농도 계열 (총 항체)을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다 (도 38(a)). 도 38(b)는 양성 대조군 (흑색 막대)과 비교한 20 ㎍/ml에서의 이중특이적 결합을 보여준다. 암회색 막대는 IgG4 대조군 (IgG4-7D8 x IgG4-2F8)과 음성 대조군 (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) 사이의 이중특이적 결합을 나타낸다. 연회색 막대는 표시된 IgG1-2F8-T366X 돌연변이체와 IgG1-7D8-K409R 사이의 동시에 수행된 Fab-아암-교환 반응의 결과를 나타낸다.
도 39: 샌드위치 ELISA에 의해 결정된, 0, 30, 60, 105 및 200 min 인큐베이션 후에 15℃에서 4개의 상이한 IgG1 돌연변이체 조합물 (표시된 바와 같은 것) 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환.
도 40: 샌드위치 ELISA에 의해 결정된, 15℃에서 90 min 동안 항체 인큐베이션 후에 상이한 IgG1 돌연변이체 조합물 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환.
도 41: 이중특이적 항체를 분석적 CIEX에 의해 분석하고, 상이한 완충제 (설명문에 표시된) 내에서 시간에 걸쳐 형성된 이종이량체의 비율은 다음과 같이 계산하였다: 이종이량체 (%) = 100% - [피크 면적 % IgG1-2F8-F405L + 피크 면적 % IgG1-7D8-K409R].
도 42: 10 mg/ml의 각각의 항체를 함유하는 혼합물을 사용하여 생성된 40 ml 배치의 이중특이적 항체를, 0℃, O/N (a, b) 또는 4℃에서 6일 동안 (c, d) 보관한 후 비-환원 (a, c) 및 환원 (b, d) 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 각각의 겔의 레인 1은 MW 마커를 함유하고, 레인 2는 IgG1 내부 검정 대조군을 함유한다. a, b: 레인 3: 10 mg/ml의 각각의 항체를 함유하는 혼합물을 사용하여 생산된 이중특이적 항체의 40 ml 배치; c, d: 레인 4: 10 mg/ml의 각각의 항체를 함유하는 혼합물을 사용하여 생산된 40 ml 배치. 비-환원 조건의 경우, 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)의 상이한 조합이 표시된다: 148 kDa (LHHL), 125 kDa (HHL), 99 kDa (HH), 67 kDa (HL), 51 kDa (H) 및 25 kDa (L).
도 43: IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위 ( redox potential) 및 산소 포화. 환원 및 산화기 동안 산화환원 전위 및 산소 포화는 산화환원 프로브 및 용존 산소 (DO) 프로브를 사용하여 측정하였다. 좌측 y-축 및 실선은 산화환원 전위를 보여주고; 우측 y-축 및 파선은 화살표로 표시된 상이한 기 동안 용액 내에서 측정된 산소 포화를 보여준다.
도 44: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 HP - SEC 분석. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 HP-SEC에 의해 분석하였다. 샘플 2 (S0002): 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 샘플 3 내지 8: 환원기 동안 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 1, 2, 3, 4, 4½, 5 h); 샘플 9 내지 12: 정용여과 (diafiltration) 과정 동안 항-CD38 항체 (1, 2, 3, 4 h에서의 샘플); 샘플 13: O/N 인큐베이션 후의 항-CD38 항체; 샘플 14: 용액에 CuSO4 첨가 후의 항-CD38 항체. 비교를 위해, 2-MEA 단독 및 2-MEA와 2-아이오도아세트아미드 (IAA)의 HP-SEC 프로파일이 굵은 선으로 제시된다. 7.715 및 9.193에서의 피크는 이량체 및 단량체 IgG1을 나타낸다. 11.073에서의 피크의 특성은 알려지지 않았다.
도 45: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 SDS - PAGE 분석. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 레인 1: 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 레인 2: PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 레인 3 내지 8: 환원기 동안 항-CD38 항체 (상기 도면에 나타낸 인큐베이션 시간); 레인 9 내지 12: 정용여과 과정 동안 항-CD38 항체; 레인 13: O/N 인큐베이션 후의 항-CD38 항체; 레인 14: 용액에 CuSO4의 첨가 후의 항-CD38 항체.
도 46: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 ESI - MS 분석. 항-CD38 항체의 환원 및 재-산화 동안 채취한 샘플을 켄칭하고, ESI-MS 분석에 의해 분석하였다. 샘플 1 (S0001): 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 샘플 2: PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 샘플 3 내지 8: 환원기 동안 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 1, 2, 3, 4, 4½, 5 h); 샘플 9 내지 12: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (1, 2, 3, 4 h에서의 샘플); 샘플 13: O/N 인큐베이션 후의 항-CD38 항체; 샘플 14: 용액에 CuSO4의 첨가 후의 항-CD38 항체. LC-MS는 LC 시스템 내의 환원제 제거에 의해 또는 샘플이 공기, 즉, 산소에 노출되는 전기분무 과정 동안 재-산화 과정을 용이하게 함을 유의하여야 한다. 샘플은 켄칭 단계 동안 IAA에 의해 캡핑되지 (capped) 않은 공유 부착된 환원제 분자를 상실할 수 있다. 따라서, 공유 무손상 재-산화된 IgG는 따라서 SDS-PAGE에 의해 ESI-MS에 의해 과다평가된다. 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)의 상이한 조합이 표시된다: LHHL, HHL, HH, HL, H 및 L. 상세한 질량은 도면에서 경쇄 (L)에 대해서만 제시된다; + 2-MEA = + 75 Da; + 2-아이오도아세트아미드 = + 57 Da.
도 47: IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위 및 산소 포화 - 보다 신속한 정용여과 및 제2 정용여과 단계. 환원 및 산화기 동안 산화환원 전위 및 산소 포화는 산화환원 프로브 및 용존 산소 (DO) 프로브를 사용하여 측정하였다. 좌측 y-축 및 실선은 산화환원 전위를 보여주고; 우측 y-축 및 파선은 화살표로 표시된, 과정의 상이한 기 동안 용액 내에서 측정된 산소 포화를 보여준다.
도 48: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 HP - SEC 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 제2 정용여과 단계. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 HP-SEC에 의해 분석하였다. 샘플 1 (S0001): 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체, 샘플 2: 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 샘플 3 내지 9: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간 5, 10, 15, 30 및 60 min 및 2 및 3 h); 샘플 10 내지 15: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (10, 20, 30, 40, 50 및 60 min 후의 샘플); 샘플 16 내지 18: 정용여과 1, 2 및 25시간 후의 항-CD38 항체; 샘플 19: 제2 정용여과 1시간 후의 항-CD38 항체.
도 49: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 SDS - PAGE 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 제2 정용여과 단계. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 레인 1: 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 레인 2: PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 레인 3 내지 9: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간 5, 10, 15, 30 및 60 min 및 2 및 3 h); 레인 10 내지 15: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (10, 20, 30, 40, 50 및 60 min 후의 샘플); 레인 16 내지 18: 정용여과 1, 2 및 25시간 후의 항-CD38 항체; 레인 19: 제2 정용여과 1시간 후의 항-CD38 항체.
도 50: IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위 및 산소 포화 - 보다 신속한 정용여과 및 보다 낮은 2- MEA 농도. 환원 및 산화기 동안 산화환원 전위 및 산소 포화는 산화환원 프로브 및 용존 산소 (DO) 프로브를 사용하여 측정하였다. 좌측 y-축 및 실선은 산화환원 전위를 보여주고; 우측 y-축 및 파선은 화살표로 표시된, 과정의 상이한 기 동안 용액 내에서 측정된 산소 포화를 보여준다.
도 51: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 HP - SEC 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 보다 낮은 2- MEA 농도. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 HP-SEC에 의해 분석하였다. 샘플 1 (S0001): 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 샘플 2: 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 샘플 3 내지 6: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 20 및 60 min 및 3 및 4시간); 샘플 7 내지 10: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (10, 20, 40 및 60 min 후의 샘플); 샘플 11 내지 14: 정용여과 중지 1, 2, 3 및 24시간 후의 항-CD38 항체.
도 52: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 SDS - PAGE 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 보다 낮은 2- MEA 농도. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 레인 1: 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 레인 2: 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 레인 3 내지 6: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 20 및 60 min 및 3 및 4시간); 레인 7 내지 10: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (10, 20, 40 및 60 min 후의 샘플); 레인 11 내지 14: 정용여과 중지 1, 2, 3 및 24시간 후의 항-CD38 항체.
도 53: IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위 및 산소 포화 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 동안 EDTA 의 존재. (a) 환원 및 산화기 동안 산화환원 전위 및 산소 포화는 산화환원 프로브 및 용존 산소 (DO) 프로브를 사용하여 측정하였다. 좌측 y-축 및 실선은 산화환원 전위를 보여주고; 우측 y-축 및 파선은 화살표로 표시된, 과정의 상이한 기 동안 용액 내에서 측정된 산소 포화를 보여준다. (b) EDTA의 존재 및 부재 하에서 DO 저하의 비교 (실시예 46 [EDTA 부재] 및 47 [EDTA 존재]로부터 얻음).
도 54: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 SDS - PAGE 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 동안 EDTA 의 존재. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 레인 1: 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 레인 2: 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 레인 3 내지 7: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 10 min 및 1, 2, 3 및 4시간); 레인 8 내지 11: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (정용여과 개시 10, 30, 40 및 60 min 후의 샘플); 레인 12 내지 14: 정용여과 중지 1 및 24시간 및 6일 후의 항-CD38 항체.
도 55: IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위 및 산소 포화 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 N 2 의 존재. 환원 및 산화기 동안 산화환원 전위 및 산소 포화는 산화환원 프로브 및 용존 산소 (DO) 프로브를 사용하여 측정하였다. 좌측 y-축 및 실선은 산화환원 전위를 보여주고; 우측 y-축 및 파선은 화살표로 표시된, 과정의 상이한 기 동안 용액 내에서 측정된 산소 포화를 보여준다.
도 56: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 SDS - PAGE 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 N 2 의 존재. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 레인 1: 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 레인 2: 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 레인 3 내지 7: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 10 min 및 1, 2, 3 및 4시간); 레인 8 내지 10: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (정용여과 개시 10, 30, 및 60 min 후의 샘플); 레인 11: 정용여과 중지 24시간 후의 항-CD38 항체; 레인 12 및 13: 질소 통기를 중지하고 산소 통기를 개시한 1 및 24시간 후의 항-CD38 항체.
도 57: IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위 및 산소 포화 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 동안 EDTA 의 존재. 환원 및 산화기 동안 산화환원 전위 및 산소 포화는 산화환원 프로브 및 용존 산소 (DO) 프로브를 사용하여 측정하였다. 좌측 y-축 및 실선은 산화환원 전위를 보여주고; 우측 y-축 및 파선은 화살표로 표시된, 과정의 상이한 기 동안 용액 내에서 측정된 산소 포화를 보여준다.
도 58: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 SDS - PAGE 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 EDTA 의 존재. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 레인 1: 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 레인 2: 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 레인 3 내지 6: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 10 min 및 2, 3 및 4시간); 레인 7 내지 9: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (정용여과 개시 10, 30 및 60 min 후의 샘플); 레인 10: 정용여과 중지 24시간 후의 항-CD38 항체; 레인 11: 황산구리 첨가 30 min 후의 항-CD38 항체.
도 59: IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위 및 산소 포화 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 황산구리의 존재. 환원 및 산화기 동안 산화환원 전위 및 산소 포화는 산화환원 프로브 및 용존 산소 (DO) 프로브를 사용하여 측정하였다. 좌측 y-축 및 실선은 산화환원 전위를 보여주고; 우측 y-축 및 파선은 화살표로 표시된, 과정의 상이한 기 동안 용액 내에서 측정된 산소 포화를 보여준다.
도 60: 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 SDS - PAGE 분석 - 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 황산구리의 존재. 항-CD38 항체의 환원 및 산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. 레인 1: 제제화 완충제 내의 항-CD38 항체; 레인 2: 제제화 완충제로부터 PBS로의 완충제 교환 후의 항-CD38 항체; 레인 3 내지 7: 환원기 동안의 항-CD38 항체 (인큐베이션 시간: 10 min 및 1, 2, 3 및 4시간); 레인 8 및 9: 정용여과 과정 동안의 항-CD38 항체 (정용여과 개시 10 및 60 min 후의 샘플) ; 레인 10: 정용여과 중지 24시간 후의 항-CD38 항체; 레인 M: MW 마커.
도 61: 재-산화 과정 동안 SDS - PAGE 분석. 샘플을 EDTA 또는 Cu2 +을 함유하는 PBS 내에서의 상이한 인큐베이션 시간 후에 채취하고, 비-환원 (a, c) 및 환원 (b, d) 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 레인 1: IgG1, 내부 검정 대조군, 레인 2: 0 h 샘플, 레인 3: 1 h 샘플, 레인 4: 2 h 샘플, 레인 5: 3 h 샘플, 레인 6: 4 h 샘플, 레인 7: 24 h 샘플, 레인 8: MW 마커.
도 62: Cu 2 + 의 존재 하의 상이한 인큐베이션 시간 후에 중쇄 - 경쇄 조합물의 상대적인 양. 개별적인 분자 종은 SDS-PAGE 겔로부터 농도 측정에 의해 정량하였다. 모든 스캐닝된 밴드의 총 강도는 100%로 설정되었다.
도 63: 반응기 유동로 , 부품표 및 공정. 유동로를 0.2 N NaOH로 위생 처리하고, WFI로 세정하였다. 교환 반응일 아침에, 적절한 양의 PBS를 완충제 백 (bag)으로부터 시스템에 첨가하였다. 동종이량체는 중력에 의한 공급에 의해 첨가하고, 시스템을 내용물을 혼합하기 위해 7 LPM에서 순환시켰다. 반응을 2-MEA 원액의 중력에 의한 첨가에 의해 개시시켰다. 투과액 밸브를 닫고, 공급 펌프를 환원 과정을 위해 30 RPM (7 LPM)으로 설정하였다. 5시간 후에, 투과액 밸브을 개방하고, 펌프 속도를 정용여과를 위한 70 kPa의 표적 공급압을 충족하기 위해 증가시켰다. 1 g/L 조건을 위해, 펌프를 165 RPM (31 LPM)으로 설정하였다. 20 g/L 조건을 위해, 펌프를 140 RPM (26 LPM)으로 설정하였다. PBS 첨가로를 개방하고, 정용여과 펌프 속도를 반응기 백 내의 일정한 중량을 유지하기 위해 제어하였다. 상기 절차는 1 g/L 조건에 대해 250 L/h 및 20 g/L 조건에 대해 125 L/h의 정용여과 속도를 생성하였다. 표적 정용여과 부피가 500-L 폐액 백에 수거되면, 투과액 밸브를 닫고, 정용여과 펌프를 중지시켰다. 공급 펌프를 산화 시간 동안 30 RPM (7 LPM) 순환으로 복귀시켰다. O/N 인큐베이션 후에, 제2 정용여과를 수행하였다 (1 g/L 조건에 대해 3 투석 부피 (diavolume) 및 20 g/L 조건에 대해 4 투석 부피). 모든 과정은 주변 온도 (22-25℃)에서 수행하였다. 샘플은 직접 백으로부터 또는 밸브 1로부터 제거하였다 (도 1).
부품표
1) ½" 제로-스태틱 (zero-static) 티자형 격판 (tee diaphragm) 밸브, SED, 316L SS
2) 50 L 백, 사르토루이스 스테딤 (Sartoruis Stedim), 모델 FFB207004, 50 L 웨이브 믹서 (Wave Mixer) 상, 모델 EHT rev A
3) 트윈 빔 (Twin beam) 스케일, 인터콤프 (Intercomp), 모델 TB830
4) ½" ID 배관 (tubing), 백금 경화 실리콘, 매스터플렉스 (Masterflex) 96410-82
5) 3/8" ID 배관, 백금 경화 실리콘, 타이곤 (Tygon) 3350
6) 배관 핀치 클램프 (pinch clamp)
7) 1" ID 고압 호스, 보강된 백금 경화 실리콘, 316L SS TC 단부, 페이지 인터내셔날 (Page International), 모델 SWPV
8) 0-30 psig 압력 게이지, 앤더슨 (Anderson), 모델 EM066010041025A
9) 1" 게이지 티자형, 316L SS
10) ½" 게이지 티자형, 316L SS
11) ½" x 1" TC 감속기 (reducer), 316L SS
12) 공급 연동 펌프, 왓슨 말로우 (Watson Marlow), 모델 720 DUN/RE, 스타퓨어 (Stapure) 배관 요소, 모델 960.0254.PFT, 0-33 LPM
13) 용존 산소 센서 및 송신기, 메터-톨레도, 모델 4100e 및 인프로 (Inpro) 6800/12/120(센서)
14) 산화환원 센서 및 송신기, 메틀러 톨레도, 모델 2100e 및 3250SG(센서)
15) 1" 웨지우드 (Wedgewood) 유동 셀, 316L SS
16) ½" 티자형, 카이나르 (Kynar), 코울-파머 (Cole-Parmer) 모델 EW-30703-78
17) ½" 격판 밸브, SED, 316L SS
18) 폴 (Pall) 일회용 폴리프로필렌 삽입물이 존재하는 밀리포어 (Millipore) UF 막 홀더 (holder), 및 폴 오메가 (Pall Omega) 30kD PES 막, 모델 OS030F26
19) 수형 클린팍 (Kleenpak) HT 연결기, 폴, 모델 KPCHT02M6
20) 암형 클린팍 HT 연결기, 폴, 모델 KPCHT02F6
21) 다이어필터 (diafilter) 연동 펌프, 왓슨 말로우, 모델 620 Di/R, 스타퓨어 배관 요소, 모델 960.0170.PFT, 0-9 LPM
22) 0.2 마이크로미터 필터, 폴, 모델 KA3NFP1
23) 500 L 백, 사르토루이스 스테딤, 모델 FXB211905
24) 200 L 백, 사르토루이스 스테딤, 모델 PDL200LWS
25) 20 L 백, 사르토루이스 스테딤, 모델 FFB208721
26) 5 L 백, 사르토루이스 스테딤, 모델 FFB208723
* 모든 TC 가스켓은 백금 경화 실리콘이었다.
* 모든 5/20/50 L 사르토리우스 스테딤 (Sartorius Stedim) 백은 EVA(에틸렌 비닐 아세테이트) 제품 접촉부 및 EVOH (에틸렌 비닐 알콜) 기체 장벽층이 존재하는 다층 필름을 이용한다.
* 모든 200/500 L 사르토리우스 스테딤 백은 ULDPE (초저밀도 폴리에틸렌) 제품 접촉부 및 EVOH 기체 장벽층이 존재하는 다층 필름을 이용한다.
도 64: 3개의 상이한 조건으로부터의 초기 및 최종 생성물의 CIEX 프로파일.
도 65: 초기 및 최종 생성물의 환원 (좌측) 및 비-환원 (우측) SDS - PAGE 분석. 레인 1: IgG1-b12 검정 대조군. 레인 2: 초기의 IgG1-F405L-2F8. 레인 3: 초기의 IgG1-K409R-7D8. 레인 4: 1 g/L에서 최종 25-L 실행. 레인 5: 20 g/L에서 최종 25-L 실행.
도 66: 환원 및 재-산화 동안의 용존 산소 및 산화환원 전위. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 산소 포화 및 산화환원 전위는 산화환원 프로브 및 DO 프로브를 사용하여 측정하였다. 수평 파선은 DO 및 산화환원 둘 모두의 초기값을 보여준다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 DO 및 산화환원의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 67: 환원 및 재-산화 동안의 pH 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 pH는 pH 프로브에 의해 측정하였다. 수평 파선은 초기의 pH 값을 보여준다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 pH의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 68: 환원기 동안 산소 소비 속도 ( OCR [ mM /h]), 소비된 총 O 2 ( mM ) 및 DO (%). 산소 소비 속도 및 소비된 총 O2를 계산하고, DO를 측정하였다. 수직 점선은 환원의 개시 및 종료를 나타낸다.
도 69: 환원 및 재-산화 동안의 SDS - PAGE (비-환원) 분석. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. M: MW 마커; C: IgG1 대조군; 레인 1: 2-MEA 첨가 전; 레인 2, 3, 4 및 5: 환원 30 min, 1시간, 2시간 및 3시간 후, 레인 6, 7, 8, 9 및 10: 1, 2, 3, 5, 및 7 L 정용여과 완충제 후의 정용여과 결과, 레인 11 및 12: 정용여과 1시간 후 및 O/N 인큐베이션. 분자량 마커의 질량은 좌측에 표시한다. 환원/재-산화된 IgG 종은 H (중쇄) 및/또는 L (경쇄) 및 이들의 조합에 의해 표시된다.
도 70: 환원 및 재-산화 동안의 CIEX 프로파일. 샘플을 나타낸 시점에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취하고 급속 동결하고, 분석적 CIEX에 의해 분석하였다.
도 71: O/N 인큐베이션 후 최종 샘플의 HP - SEC 분석. 정용여과 후의 O/N 인큐베이션 후에 채취한 샘플을 HP-SEC에 의해 분석하였다. 7.599 및 10.792에서의 피크는 각각 이량체 및 단량체 IgG를 나타낸다.
도 72: 환원 및 재-산화 동안의 용존 산소 및 산화환원 전위. 2 mM EDTA의 존재 하에서 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 산소 포화 및 산화환원 전위는 산화환원 프로브 및 DO 프로브를 사용하여 측정하였다. 수평 파선은 산화환원 및 DO 둘 모두의 초기값을 보여준다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 DO 및 산화환원의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다. 실행 후기 (t = 24 h)에 산화환원 증가 및 DO 저하는 CuSO4의 첨가와 동시에 발생한다.
도 73: 환원 및 재-산화 동안의 pH 프로파일. 2 mM EDTA의 존재 하에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 pH는 pH 프로브를 사용하여 측정하였다. 수평 파선은 초기의 pH 값을 보여준다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 pH의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 74: 환원 및 재-산화 동안의 SDS - PAGE 분석. 2 mM EDTA의 존재 하에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취한 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. M: MW 마커; C: IgG1 대조군; 레인 1: 2-MEA 첨가 전; 레인 2, 3, 4 및 5: 환원 30 min, 1시간, 2시간 및 3시간 후, 레인 6, 7, 8, 9 및 10: 1, 2, 3, 5, 및 7 L 정용여과 완충제 후의 정용여과 결과, 레인 11 및 12: 정용여과 1시간 후 및 O/N 인큐베이션, 레인 13: CuSO4 첨가 10 min 후. 분자량 마커의 질량은 좌측에 표시한다. 환원/재-산화된 IgG 종은 H (중쇄) 및/또는 L (경쇄) 및 이들의 조합에 의해 표시된다.
도 75: 환원 및 재-산화 동안의 CIEX 프로파일. 2 mM EDTA의 존재 하에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취한 샘플을 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 샘플을 나타낸 시점에 채취하고, CIEX 분석시까지 급속 동결하였다.
도 76: 환원 및 재-산화 동안의 용존 산소 및 산화환원 전위. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 산소 포화 및 산화환원 전위는 산화환원 프로브 및 DO 프로브를 사용하여 측정하였다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 DO 및 산화환원의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수평 파선은 산화환원 및 DO 둘 모두의 초기값을 보여준다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 77: 환원 및 재-산화 동안의 교반 속도. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시 즈음에 교반 속도의 큰 증가와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 78: 환원 및 재-산화 동안의 pH 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 pH를 pH 프로브에 의해 측정하였다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 pH의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 79: 환원 및 재-산화 동안의 SDS - PAGE (비-환원) 분석. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. M: MW 마커; C: IgG1 대조군; 레인 1: 2-MEA 첨가 전; 레인 2, 3, 4 및 5: 환원 30 min, 1시간, 2시간 및 3시간 후, 레인 6, 7, 8, 9 및 10: 1, 2, 3, 5, 및 7 L 정용여과 완충제 후의 정용여과 결과, 레인 11 및 12: 정용여과 1시간 후 및 O/N 인큐베이션. 분자량 마커의 질량은 좌측에 표시한다. 환원/재-산화된 IgG 종은 H (중쇄) 및/또는 L (경쇄) 및 이들의 조합에 의해 표시된다.
도 80: 환원 및 재-산화 동안의 CIEX 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 샘플을 나타낸 시점에 채취하고, CIEX 분석시까지 급속 동결하였다.
도 81: 환원 및 재-산화 동안의 용존 산소 및 산화환원 전위. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 산소 포화 및 산화환원 전위를 산화환원 프로브 및 DO 프로브를 사용하여 측정하였다. 수평 파선은 산화환원 및 DO 둘 모두의 초기값을 보여준다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 DO 및 산화환원의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수평 파선은 산화환원 및 DO 둘 모두의 초기값을 보여준다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 82: 환원 및 재-산화 동안의 교반 속도. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시 즈음에 교반 속도의 큰 증가와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 83: 환원 및 재-산화 동안의 pH 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 pH를 pH 프로브에 의해 측정하였다. 수평 파선은 초기값을 보여준다. 2-MEA의 첨가 (화살표로 나타냄)는 실행 개시시에 pH의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수평 파선은 초기의 pH 값을 보여준다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 84: 환원 및 재-산화 동안의 SDS - PAGE (비-환원) 분석. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. M: MW 마커; C: IgG1 대조군; 레인 1: 2-MEA 첨가 전; 레인 2, 3, 4 및 5: 환원 30 min, 1시간, 2시간 및 3시간 후, 레인 6, 7, 8, 9 및 10: 1, 2, 3, 5, 및 7 L 정용여과 완충제 후의 정용여과 결과, 레인 11 및 12: 정용여과 1시간 후 및 O/N 인큐베이션. 분자량 마커의 질량은 좌측에 표시한다. 환원/재-산화된 IgG 종은 H (중쇄) 및/또는 L (경쇄) 및 이들의 조합에 의해 표시된다.
도 85: 환원 및 재-산화 동안의 CIEX 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 샘플을 나타낸 시점에 채취하고, CIEX 분석시까지 급속 동결하였다.
도 86: 환원 및 재-산화 동안의 용존 산소 및 산화환원 전위. 질소의 존재 하에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 산소 포화 및 산화환원 전위를 산화환원 프로브 및 DO 프로브를 사용하여 측정하였다. 시간 0에서 2-MEA의 첨가는 실행 개시시에 산화환원의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시, 정용여과의 종료, 정용여과 1-hr 후의 샘플 지점, 및 정용여과 3-hr 후의 샘플 지점을 보여준다. 상부 공간 (headspace)을 정용여과 종료시에 공기로 씻어내었다.
도 87: 환원 및 재-산화 동안의 pH 프로파일. 질소의 존재 하에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 pH를 pH 프로브에 의해 측정하였다. 수평 파선은 초기의 pH 값을 보여준다. 시간 0에서 2-MEA의 첨가는 실행 개시시에 pH의 큰 저하와 동시에 발생하였다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다.
도 88: 환원 및 재-산화 동안의 SDS - PAGE (비-환원) 분석. 질소의 존재 하에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. M: MW 마커; C: IgG1 대조군; 레인 1: 2-MEA 첨가 전; 레인 2, 3, 4 및 5: 환원 30 min, 1시간, 2시간 및 3시간 후, 레인 6, 7, 8, 9 및 10: 1, 2, 3, 5, 및 7L 정용여과 완충제 후의 정용여과 결과, 레인 11 및 12: 정용여과 1 및 3시간 후, 레인 13: 정용여과 후 O/N 인큐베이션. 분자량 마커의 질량은 좌측에 표시한다. 환원/재-산화된 IgG 종은 H (중쇄) 및/또는 L (경쇄) 및 이들의 조합에 의해 표시된다.
도 89: 환원 및 재-산화 동안의 CIEX 프로파일. 질소의 존재 하에 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 샘플을 나타낸 시점에 채취하고, CIEX 분석시까지 급속 동결하였다.
도 90: 공기의 도입 후의 산소 소비. 그래프는 공기 첨가시에 정용여과 직후로부터의 값을 보여준다. 실제 DO는 시스템에서 측정된 DO이다. DO (소비 없음)는 산소 소비가 없음을 가정하여 계산된 값이다. 소비된 O2는 이전에 결정된 kla를 사용하고 시스템 내의 산소의 포화가 0.2 mM임을 가정하여 계산된 소비된 산소의 양이다.
도 91: 환원 및 재-산화 동안의 용존 산소 및 산화환원 전위. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 산소 포화 및 산화환원 전위는 산화환원 프로브 및 DO 프로브를 사용하여 측정하였다. 수평 파선은 산화환원 및 DO의 초기값을 보여준다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다. 2-MEA의 첨가는 실행 개시시에 DO 및 산화환원의 큰 저하와 동시에 발생하였다. pH는 정용여과 직전에 5.0으로 조정되었다. pH는 O/N 인큐베이션 후에 7.4로 다시 조정되었다.
도 92: 환원 및 재-산화 동안의 pH 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안의 pH를 pH 프로브에 의해 측정하였다. 수평 파선은 초기값을 보여준다. 수직 파선은 정용여과의 개시 및 중지를 보여준다. 2-MEA의 첨가는 실행 개시시에 pH의 저하와 동시에 발생하였다. pH는 pH 5.0 완충제에 대한 정용여과 직전에 5.0으로 조정되었다. pH는 O/N 인큐베이션 후에 7.4로 재조정되었다.
도 93: 환원 및 재-산화 동안의 SDS - PAGE (비-환원) 분석. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 비-환원 SDS-PAGE 분석에 의해 분석하였다. M: MW 마커; C: IgG1 대조군; 레인 1: 2-MEA 첨가 전; 레인 2, 3, 4 및 5: 환원 30 min, 1시간, 2시간 및 3시간 후, 레인 6, 7, 8, 9 및 10: 1, 2, 3, 5, 및 7 L 정용여과 완충제 후의 정용여과 결과, 레인 11 및 12: 정용여과 1시간 후 및 O/N 인큐베이션, 레인 13, 14 및 15: 트리스 (Tris) 첨가 직후 및 1 및 2시간 후. 분자량 마커의 질량은 좌측에 표시한다. 환원/재-산화된 IgG 종은 H (중쇄) 및/또는 L (경쇄) 및 이들의 조합에 의해 표시된다.
도 94: 환원 및 재-산화 동안의 CIEX 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R (1:1 혼합물)의 환원 및 재-산화 동안 채취된 샘플을 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 샘플을 나타낸 시점에 채취하고, CIEX 분석시까지 급속 동결하였다.
도 95: 시스타민 첨가 후의 용존 산소 및 산화환원 전위. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R 1:1 혼합물에 대한 시스타민 첨가 후의 산소 포화 및 산화환원 전위는 산화환원 프로브 및 DO 프로브를 사용하여 측정하였다.
도 96: 시스타민 첨가 후의 CIEX 프로파일. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R에 대한 시스타민 첨가 후에 채취한 샘플을 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 샘플을 표시된 시점에 채취하였다.
도 97: 10 mM 시스테인을 사용한 CIEX 환원 프로파일. 샘플을 칼럼에 55 min마다 로딩하고, 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 선택된 프로파일을 제시하고, 인큐베이션 시간을 나타낸다.
도 98: 25 mM 시스테인에서 CIEX 환원 프로파일. 샘플을 칼럼에 55 min마다 로딩하고, 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 선택된 프로파일을 제시하고, 인큐베이션 시간을 나타낸다.
도 99: 50 mM 시스테인에서 CIEX 환원 프로파일. 샘플을 칼럼에 55 min마다 로딩하고, 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 선택된 프로파일을 제시하고, 인큐베이션 시간을 나타낸다.
도 100: 75 mM 시스테인에서 CIEX 환원 프로파일. 샘플을 칼럼에 55 min마다 로딩하고, 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 선택된 프로파일을 제시하고, 인큐베이션 시간을 나타낸다.
도 101: 100 mM 시스테인에서 CIEX 환원 프로파일. 샘플을 칼럼에 55 min마다 로딩하고, 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 선택된 프로파일을 제시하고, 인큐베이션 시간을 나타낸다.
도 102: 시스테인을 사용한 환원, 시스테인의 제거, 및 인큐베이션 후의 CIEX 프로파일. 30℃에서 50 mM 시스테인 내에서의 385분 동안의 환원, 이어서 탈염 (desalting) 칼럼을 사용한 시스테인의 제거 및 2시간 및 18시간 동안의 후속 인큐베이션 후의 CIEX 프로파일이 제시된다.
도 103: 고정형 환원제 칼럼으로부터의 용리 후에 잔류하는 동종이량체 및 새로 형성된 이중특이적 항체의 CIEX 프로파일. 동종이량체 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 혼합물을 고정형 환원제 칼럼에 첨가하고, 인큐베이션하고, 용리하였다. 이중특이적 항체의 형성을 분석적 CIEX에 의해 분석하였다.
도 104: 이중특이적 항체의 검출을 위한 동종이형 ELISA . IgG1m(f)-K409R-CD20 및 IgG1m(za)-F405L-EGFR의 혼합물을 25 mM 2-MEA와 함께 37℃에서 90 min 동안 인큐베이션하였다. 이중특이적 항체의 형성은 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 405 nm에서의 광학 밀도는 이중특이적 IgG1m(f,za)-CD20xEGFR 항체의 형성에 대한 척도로서 Y-축 상에 플로팅된다. IgG1m(fa) 항체를 양성 대조군으로서 포함하였다.
도 105: SNEEP 이후 CIEX 분석. IgG1-7D8-AAA-K409R이 과량 첨가된 SNEEP 후에 CIEX 분석을 수행하였다. 정량은 11.4%의 IgG1-7D8-AAA-K409R (*), 88.5% 이중특이적 항체 및 단지 0.1%의 IgG1-2F8-F405L (+) 동종이량체가 교환 반응 후에 존재함을 보여주었다.
도 106: SNEEP 이후 CIEX 분석. IgG1-2F8-F405R이 과량 사용된 SNEEP 후에 CIEX 분석을 수행하였다. 정량은 0.4%의 IgG1-7D8-K409R (*), 88.4% 이중특이적 항체 및 11.2% IgG1-2F8-F405L (+)이 교환 반응 후에 존재함을 보여주었다.
도 107: SNEEP 이후 CIEX 분석. 과량의 IgG1-7D8-AAA-K409R이 사용된 SNEEP 후에 CIEX 분석을 수행하였다. 정량은 25.5% IgG1-7D8-AAA-K409R (*), 73.3% 이중특이적 항체 및 1.2%의 IgG1-2F8-F405L (+)이 교환 반응 후에 존재함을 나타내었다. IgG1-2F8-F405L 동종이량체의 비율은 최적 교환 조건 하에서 추가로 감소되었다 (도 105).
도 108: 단백질 A 신속 단백질 액체 크로마토그래피 ( FPLC ) 프로파일. 50% 과량의 IgG1-7D8-AAA-K409R 동종이량체를 사용한 교환 후에 이중특이적 항체의 단백질 A FPLC 프로파일을 생성하였다. 좌측 축에 mAU의 A280 신호가 제시되고 (흑색선), 우측 축에 pH가 제시된다 (회색선). 두 표시된 피크 사이의 스파이크 (spike)는 분류 개시시의 기포를 나타낸다.
도 109: 관류 ( flow - through ) 분획 (도 108에 * 로 표시된 피크)의 CIEX 분석. 이중특이적 항체 (체류 시간 ~16.4분) 및 IgG1-2F8-F405L (체류 시간 ~19.2분)은 검출되지 않았고; 13.6분의 피크는 (비-결합) IgG1-7D8-AAA-K409R 동종이량체에 대응한다.
도 110: 용리된 생성물 (도 108의 +로 표시한 피크)의 CIEX 분석. 16.4분의 피크는 이중특이적 항체에 대응하고, 어떠한 피크도 13.6에서 검출되지 않았고 (IgG1-7D8-AAA-K409R), 19.2분에서 작은 피크 (IgG1-2F8-F405L)가 검출되었다 (1.4%). 이것은 단백질 A 연마 (polishing)와 조합한 SNEEP가 잔류 동종이량체의 제거를 위해 사용될 수 있음을 입증하였다.
도 111: 공동으로 단백질 A-정제된 IgG1 - b12 -F405L 및 IgG1 -058- K409R 의 FPLC 크로마토그램 . 선은 A280 신호를 보여준다. 로딩은 ~ 5 ml 후에 A280 신호의 증가로서 관찰된다. 세척 및 용리 단계의 개시는 화살표로 표시된다. 100 ml에서 용리 후 피크가 처음의 낮은 pH 재생 단계 동안 관찰되었다. 상기 피크는 분석하지 않았지만, 소량의 단백질 불순물을 나타낸다.
도 112: 공동으로 단백질 A-정제된 IgG1 -058- K409R ( * ) 및 IgG1 - b12 -F405L (+)의 CIEX 프로파일.
도 113: 공동으로 단백질 A-정제된 IgG1 - b12 -F405L 및 IgG1 -058- K409R 로부터 생성된 이중특이적 항체의 HP - SEC 프로파일. 7.5분의 피크 (*)는 이량체 종에 대응하고, 9.0분의 피크는 단량체 종 (+)에 대응한다.
도 114: 공동으로 단백질 A-정제된 IgG1 - b12 -F405L 및 IgG1 -058- K409R 로부터 생성된 이중특이적 항체의 CIEX 프로파일. 26분의 피크 (*)는 이중특이적 항체에 대응하고; 36분의 피크는 IgG-b12-F405L 동종이량체 (+)에 대응한다. IgG1-058-K409R은 검출되지 않았다.
도 115: 이중특이적 항체 및 동종이량체의 1:1:1 혼합물의 FPLC 프로파일. 거의 등용매 (isocratic) 조건 하에 WCIEX 칼럼에서 분리된 IgG1-7D8-K409R (*), 이중특이적 항체 (+), 및 IgG1-2F8-F405L (#)의 1:1:1 혼합물의 FPLC 프로파일 (IgG1-2F8-F405L의 용리만이 얕은 구배에 의해 경미하게 촉진되었다).
도 116: 계산된 분리능 . 계산된 분리능 (R, 식 5를 사용하여 계산)이 시트레이트 및 포스페이트 완충제에 대해 제시된다. 최적 분리능은 20 mM 시트레이트 (pH 6.4)에서 관찰되었다. 1.75-2.00의 분리능은 만족스러운 분리를 위해 허용되는 것으로 생각되었다 (John W. Dolan, Peak Tailing and Resolution, LC Resources Inc., Walnut Creek, California, USA).
도 117: FPLC 프로파일. pH 6.4, 20 mM 시트레이트에서 10%의 IgG1-2F8-F405L 동종이량체 (+)로 스파이킹된 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R (*) 이중특이적 항체의 FPLC 프로파일. 로딩은 4.4 mg/ml 수지이었다.
도 118: IgG1 -2F8-F405L x IgG17D8 - K409R 이중특이적 항체의 CIEX 프로파일. 도 117에 별표 (*)로 표시된 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R의 CIEX 프로파일이 제시된다. IgG1-7D8-K409R 동종이량체 (*), 이중특이적 항체, 및 IgG1-2F8-F405L 동종이량체 (+)의 비율은 4.3, 94.8, 및 0.9이었다. IgG1-7D8-K409R 동종이량체는 IgG1-2F8-F405L로 스파이킹된 본래의 배치로부터의 잔류 동종이량체이었다.
도 119: FPLC 크로마토그램 . a) 75 mM 2-MEA가 존재하는 PBS 내의 20 mg 이중특이적 항체 (총 부피 3 ml)의 단백질 A 용리 프로파일. 실선은 A254 신호 (좌측 축)이고, 파선은 A280 (좌측 축) 신호, 긴 일점쇄선은 pH이다 (값은 제시되지 않았지만, pH는 ~65 ml에서 7.4로부터 3.0으로 감소하고, 단지 참고를 위해 표시된다). b) 단백질 A 상에 로딩된 75 mM 2-MEA가 존재하는 PBS (총 부피 3 ml). 실선은 A254 신호 (좌측 축)이고, 파선은 A280 (좌측 축) 신호이고, 긴 일점쇄선은 pH이다 (값은 제시되지 않았지만, pH는 ~40 ml에서 7.4로부터 3.0으로 감소하고, 단지 참고를 위해 표시된다)
도 120: 파괴 ( breakthrough ) 지점 결정. a) 파괴 지점 (도면에 화살표로 나타낸)은 단백질 A 칼럼의 2-MEA에 대한 노출 전 (좌측 패널) 및 후 (우측 패널)에 결정하였다. IgG1-7D8-K409R (5 mg/ml)은 1분의 체류 시간을 사용하여 로딩하였다. 75 mM 2-MEA에 대한 노출 전과 후에, 파괴 지점은 ~15 ml이었고, 이것은 칼럼 성능이 2-MEA의 존재에 의해 큰 영향을 받지 않음을 나타낸다. 제시된 데이터는 A280 값 (mAU)이다. b) 두 선이 중첩된 A)의 확대도.
도 121: 2- MEA 제거 후에 용리된 단백질의 환원 SDS - PAGE 분석. 레인은 마커, 대조군 항체 (IgG1-b12), 칼럼 로딩 전에 2-MEA의 존재 하의 이중특이적 반응 혼합물, 및 2-MEA 제거 후의 최종 생성물을 포함한다. 어떠한 단백질 A도 검출되지 않았고, 이것은 칼럼이 무손상 상태로 유지되었음을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄는 화살표로 표시되고, 단백질 A의 예상된 분자량 (45 kDa)은 별표 (*)로 표시된다.
도 122: 이중특이적 람다 - 카파 항체의 CIEX 프로파일. λ 경쇄를 함유하는 BMA 031-K409R 항체가 예상되는 위치를 플러스 표시 (+)로 나타내고, 피크는 검출되지 않았고, κ 경쇄를 갖는 IgG12F8-F405L 항체는 별표 (*)로 표시한다. 이중특이적 항체는 중앙에 위치한다. BMA 031-K409R, 이중특이적 항체, 및 IgG12F8-F405L의 비율은 각각 11.2, 88.8, 및 0이었다.
도 123: 상이한 기간 동안 상이한 온도에서 보관한 후 이중특이적 항체 (흑색), IgG1 -7 D8 - K409R (회색) 및 IgG1 -2F8-F405L (백색)의 A280 데이터. A280 측정을 나노드롭 (Nanodrop)에서 수행하고, 그 결과를 1 mm 경로 (path) 길이에서 A280 (AU)으로 제시한다.
도 124: 2 - 8℃ 및 25℃에서 t = 0 및 t = 12개월에서 이중특이적 항체 (D), IgG1 -7 D8 - K409R (1) 및 IgG1 -2F8-F405L (2)의 비-환원 SDS - PAGE . C=내부 IgG1 검정 대조군.
도 125: 2 - 8℃ 및 25℃에서 t = 0 및 t = 12개월에서 이중특이적 항체 (D), IgG1 -7 D8 - K409R (1) 및 IgG1 -2F8-F405L (2)의 환원 SDS - PAGE . C=내부 IgG1 검정 대조군.
도 126: 40℃에서 t = 0 및 t = 3개월에서 이중특이적 항체 (D), IgG1 -7 D8 -K409R (1) 및 IgG1 -2F8-F405L (2)의 비-환원 SDS - PAGE . C=내부 IgG1 검정 대조군.
도 127: 40℃에서 t = 0 및 t = 3개월에서 이중특이적 항체 (D), IgG1 -7 D8 -K409R (1) 및 IgG1 -2F8-F405L (2)의 환원 SDS - PAGE . C=내부 IgG1 검정 대조군.
도 128: 이중특이적 항체 (실선), IgG1 -7 D8 - K409R (줄무늬) 및 IgG1 -2F8-F405L (점선)의 HP - SEC 크로마토그램 . 보관 조건은 다음과 같았다; A: t = 0; B: 2 - 8℃에서 t = 12개월; C: 25℃에서 t = 12개월 및 D: 40℃에서 t = 3개월.
도 129: 이중특이적 항체 (실선), IgG1 -7 D8 - K409R (줄무늬) 및 IgG1 -2F8-F405L (점선)의 CIEX 크로마토그램 . 보관 조건은 다음과 같다; A: t = 0; B: 2 - 8℃에서 t = 12개월; C: 25℃에서 t = 12개월. (주: t= 12개월에 비해 t=0에서 물질의 체류 시간의 차이는 완충제 조성의 작은 변화 및/또는 상이한 칼럼 로트의 사용에 의한 것일 수 있다. 또한, 각각의 실행에서 내부 IgG1 대조군의 분석은 t=0에 비해 t=12개월에 +1.64 min의 이동을 보여주었다 (데이터 미제시)).
정의
용어 "이뮤노글로불린"은 4개 모두가 디술피드 결합에 의해 상호연결된 한 쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 한 쌍의 중쇄 (H)의 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어지는, 구조상 관련된 당단백질의 클래스를 나타낸다. 이뮤노글로불린의 구조의 특성은 잘 규명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 간단히 설명하면, 각각의 중쇄는 일반적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로서 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호-연결된다. 각각의 경쇄는 일반적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로서 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 일반적으로 하나의 도메인, 즉 CL로 이루어진다. 일반적으로, 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 설명된 바와 같이 EU-인덱스에 따라 수행된다. 도 16은 항체 2F8 (WO 02/100348)의 상이한 이소형 형태에 대한 EU 및 카바트 넘버링의 개요를 제시한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 언급되는 초가변성 영역 (또는 서열이 초가변이고/이거나 구조적으로 규정된 루프의 형태일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있고, 이들 영역에는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 일반적으로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한, 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)] 참조).
본원에서 사용될 때, 용어 "Fab-아암"은 항체의 하나의 중쇄-경쇄쌍을 의미한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 적어도 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 항체 영역을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Kabat EA, in US Department of Health and Human Services, NIH publication no 91-3242, Edn. 5th edition 662, 680, 689 (1991) 참조). Fc 영역은 파파인을 사용한 항체의 소화에 의해 생성될 수 있고, 여기서 Fc 영역은 이에 의해 얻은 단편이고, 이뮤노글로불린의 2개의 CH2-CH3 영역 및 힌지 영역을 포함한다. 항체 중쇄의 불변 도메인은 항체 이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE를 규정한다. Fc-도메인은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체 및 보체 시스템의 단백질과 항체의 이펙터 기능을 매개한다.
본원에서 사용되는 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 이뮤노글로불린의 CH2 영역을 나타내고자 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 EU 넘버링 시스템에 따른 아미노산 228-340에 대응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본원에서 설명되는 바와 같은 임의의 다른 항체 이소형일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 이뮤노글로불린의 CH3 영역을 나타내고자 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 EU 넘버링 시스템에 따른 아미노산 341-447에 대응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본원에서 설명되는 바와 같은 임의의 다른 항체 이소형일 수 있다.
본 발명의 문맥에서 용어 "항체" (Ab)는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 이들의 유도체를 지칭하고, 이는 전형적인 생리학적 조건 하에 유의한 기간의 시간, 예컨대 적어도 약 30 min, 적어도 약 45 min, 적어도 약 1시간 (h), 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 또는 그 초과, 약 48시간 또는 그 초과, 약 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 등과 같은 유의한 기간의 시간, 또는 임의의 다른 관련된 기능적으로 정의된 기간 (예컨대, 항원에 대한 항체 결합과 관련된 생리학적 응답을 유도하고/하거나, 촉진하고/하거나, 증강시키고/시키거나 조정하는데 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성을 동원하는데 충분한 시간)의 반감기로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체 시스템의 성분, 예를 들어 고전적인 보체 활성화 경로의 제1 성분인 C1q가 포함되는 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 또한, 항체는 이중특이적 항체, 디아바디 (diabody), 또는 유사 분자일 수 있다. 용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 에피토프, 일반적으로 비-중복 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 2개의 별개 항원-결합 부위를 함유하는 항체를 의미한다. 상기 나타낸 바와 같이, 본원에서 용어 항체는 달리 언급되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한, 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체의 단편을 포함한다. 상기 단편은 임의의 공지의 기술, 예컨대 효소에 의한 절단, 펩티드 합성 및 재조합 발현 기술에 의해 제공될 수 있다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편, 예를 들어 Fab 또는 F(ab')2 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 달리 특정되지 않으면 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 (chimera) 항체 및 인간화 항체도 포함함을 이해되어야 한다. 생성된 항체는 임의의 이소형을 가질 수 있다.
용어 "전장 항체"는 본원에서 사용될 때 이소형의 항체에서 통상적으로 발견되는 모든 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인을 함유하는 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 클래스 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용될 때, 용어 "중쇄 항체" 또는 "중-쇄 항체"는 중쇄만으로 이루어지고, 대체로 항체에서 발견되는 경쇄가 결여된 항체를 의미한다. 예를 들어 낙타류 (camelid)에서 천연적으로 발생하는 중쇄 항체는 VH 도메인만을 갖는 항원에 결합할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 표면 군으로 일반적으로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 손실되지만 비-입체형태적 에피토프에 대해서는 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관련되는 아미노산 잔기 및 결합에 직접 관련되지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기 (즉, 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트 (footprint) 내에 존재함)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 소정의 항원에 대한 항체의 결합이라는 맥락에서 용어 "결합"은 일반적으로 예를 들어 항원을 리간드로, 항체를 분석물로 사용하여 BIAcore 3000 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정하는 경우, 약 10-6 M 이하, 예를 들어 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 이하의 KD에 상응하는 친화도의 결합이고, 항체는 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예컨대, BSA, 카제인)에 대한 결합을 위한 그의 결합 친화도보다 10배 이상 낮은, 예컨대 100배 이상 낮은, 예를 들어 1,000배 이상 낮은, 예컨대 10,000배 이상 낮은, 예를 들어 100,000배 이상 낮은 KD에 상응하는 친화도로 소정의 항원에 결합한다. 친화도가 보다 낮은 양은 항체의 KD에 의존적이기 때문에, 항체의 KD가 매우 낮으면 (즉, 항체가 고도로 특이적이면), 항원에 대한 친화도가 비-특이적 항원에 대한 친화도보다 더 낮은 양은 10,000배 이상일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.
본원에서 사용될 때 용어 "제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용"은 제1-CH3/제2-CH3 이종이량체 단백질에서 제1 CH3 영역과 제2 CH3 영역 사이의 상호작용을 의미한다.
본원에서 사용될 때 용어 "제1 및 제2 CH3 영역의 동종이량체 상호작용"은 제1-CH3/제1-CH3 동종이량체 단백질에서 제1 CH3 영역과 또 다른 제1 CH3 영역 사이의 상호작용 및 제2-CH3/제2-CH3 동종이량체 단백질에서 제2 CH3 영역과 또 다른 제2 CH3 영역 사이의 상호작용을 의미한다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 물질이 그의 본래의 환경 (예를 들어, 천연적으로 생성되는 경우 천연 환경 또는 재조합 방식으로 발현될 경우 숙주 세포)으로부터 제거됨을 나타낸다. 또한, 항체는 정제된 형태가 유리하다. 용어 "정제된"은 절대적인 순도를 필요로 하지 않고; 오히려 출발 물질에 비교할 때 조성물 내의 오염물의 농도에 비해 항체 농도의 증가를 나타내는 상대적인 정의로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 발현 벡터, 예를 들어 본 발명의 항체를 코딩하는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하도록 의도된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어, 트랜스펙토마 (transfectoma), 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, NS/0 세포, 및 림프구성 세포를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 2개 이상의 핵산 구축물의 "공발현"은 단일 숙주 세포에서 2개의 구성체의 발현을 의미한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "종양 세포 단백질"은 종양 세포의 세포 표면에 위치하는 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인지 및 활성화 단계와 대조적으로, 면역 반응의 이펙터 단계에 수반되는 면역 세포를 지칭한다. 예시적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대, 세포용해성 T 세포 (CTL)가 포함되는 B 세포 및 T 세포), 킬러 (killer) 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예컨대 호중구, 과립구, 비만 (mast) 세포 및 호염기구가 포함된다. 일부 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하고, 특정 면역 기능을 수행한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있고, 예컨대 천연 킬러 세포가 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 포식할 수 있다.
용어 "환원 조건" 또는 "환원 환경"은 항체의 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 조건을 의미한다.
본 발명에서 아미노산 위치에 대한 언급은 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 설명된 바와 같이 EU-인덱스에 따른다.
용어 "rpm" 또는 "RPM"은 분당 회전수를 의미하고, 본 발명의 문맥에서 rpm 또는 RPM으로 표시될 수 있다.
본 발명의 방법
본 발명은 이종이량체 단백질의 시험관내 생산 방법에 관한 것으로, 다음 단계를 포함한다:
a) 제1 동종이량체 단백질을 제2 동종이량체 단백질과 함께, 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계로서,
여기서 상기 제1 동종이량체 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제2 CH3 영역을 포함하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열인 단계, 및
b) 단계 a)로부터 얻은 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계.
본 발명의 단계 a)는 별법으로 다음 단계를 포함할 수 있다:
z) 이뮤노글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 구축물을 제공하고, 상기 제1 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
y) 이뮤노글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 구축물을 제공하고, 상기 제2 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
- 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열이고,
상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고/갖거나,
상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 실시예 21에서 설명되는 바와 같이 검정할 때 각각의 CH3 영역의 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 0.01 내지 10 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 10 마이크로몰, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5, 예컨대 0.05 내지 5 마이크로몰, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 내지 1 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 1 마이크로몰, 0.01 내지 0.5 또는 0.01 내지 0.1이 되도록 하는 서열임 -
z) 숙주 세포에서 상기 제1 및 제2 핵산 구축물을 공발현시키는 단계.
추가의 실시양태에서, 단계 z)는 상기 숙주 세포에서 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 구축물을 공발현시키는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 방법은 보다 큰 부피의 이종이량체 단백질이 생산될 때 특히 적합하다.
따라서, 특정 실시양태에서 단계 b)는
b) 단계 a)로부터 얻은 적어도 10 ml의 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계
를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 이종이량체 단백질을 얻는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 이종이량체 단백질을 얻는 단계 c)를 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 단계 a)는 다음 단계를 포함할 수 있다:
i) 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 단백질을 제공하고, 상기 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
ii) 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 단백질을 제공하고, 상기 Fc 영역은 제2 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
- 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열임 -
iii) 상기 제1 단백질을 상기 제2 단백질과 함께 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계.
제1 및 제2 동종이량체 단백질은 함께 또는 따로 생산 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 숙주 세포 내에서의 발현에 의해 생산될 경우, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 동일한 반응 베슬 (vessel), 예를 들어 동일한 생물반응기에서 생산될 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 동일한 반응 베슬에서 생산될 경우, 상기 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 동일한 숙주 세포에서 또는 상이한 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 별법으로, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 2개의 별개의 반응 베슬, 예를 들어 2개의 별개의 생물반응기에서 생산될 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 상이한 숙주 세포에 의해 생산될 경우, 상기 숙주 세포는 동일한 또는 상이한 세포 종류로부터 유래될 수 있다. 동일한 반응 베슬에서의 생산이, 비용 또는 시간적인 고려 때문에, 또는 매우 낮은 산소 농도와 조합되어 환원에 필요한 효소 및 보조인자가 방출되고, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 촉매하여 생물반응기 또는 후속 수거 단계에서 중쇄 교환 (swapping)의 발생을 촉진하도록, 예를 들어 매우 많은 생존가능 세포의 용해에 의해 특정 조건 하에서 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 방출되는 산화환원 효소, 예컨대 시토졸 티오레독신 1 및 2 (TXN1 및 TXN2)를 이용하기 위해서 유리할 수 있다 (문헌 [Kao et al., 2010, Biotechnol. Bioeng 107; 622-632]). 따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명의 단계 a)는 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 생산과 동일한 반응 베슬에서 수행할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 단계 b)는 또한 단계 a)와 동일한 반응 베슬에서, 또는 단계 a) 및 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 생산 둘 모두와 동일한 반응 베슬에서 수행할 수 있다. 이 경우에, 반응물에 이미 존재하는 산소 및 2가 금속 이온은 또한 단계 b)의 재-산화 과정을 자극할 수 있다.
제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 생산을 위한 추가의 조건은 단계 a)와 관련하여 설명한 임의의 것을 포함한다. 별개의 배치에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 생산은 제어 관점 (보다 용이한 재생산 및/또는 각각의 동종이량체의 품질의 결정)에서 또는 동종이량체 중의 하나가, 그를 많은 상이한 다른 동종이량체와 조합함으로써 다수의 상이한 이중특이적 항체를 생성하기 위해 사용될 경우 유리할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 단계 a)에서 인큐베이션 전에 정제될 수 있다. 동종이량체 단백질의 정제를 위한 방법은 단백질 A 및 단백질 G 크로마토그래피 (또는 다른 친화도 크로마토그래피 방법), 예를 들어 항원-결합 또는 항-이디오타입 항체를 기초로 한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환, 소수성 상호작용, 선택된 카파 또는 람다, 황친화도 (thioaffinity), 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 다른 혼합 방식 수지를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 정제 방법은 예를 들어 정제된 단백질을 얻기 위해 염 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 침전을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상이한 정제 방법의 조합도 고려된다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질이 따로 생산될 경우, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 또한 따로 정제될 수 있다.
별도의 실시양태에서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 따로 생산되는 경우에, 이들은 예를 들어 단백질 A 정제에 의해 함께 정제될 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 공동 정제는 몇몇의 작동상 및/또는 경제적 효율을 제공할 수 있다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질이 함께 생산될 경우, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 또한 예를 들어 단백질 A 정제에 의해 함께 정제될 수 있다.
단계 a) 전에 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 정제에 의해, 방법의 하나 이상의 단계, 예컨대 단계 a)의 환원 및/또는 교환 과정 및/또는 단계 b)의 산화 과정의 속도 또는 정도에 영향을 줄 수 있거나, 또는 추가로 또는 별법으로 이종이량체 단백질의 품질에 영향을 줄 수 있는 성분을 제거할 수 있다. 상기한 바와 같이, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 따로 또는 함께 생산될 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 함께 생산될 경우, 상기 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 특히 함께 정제될 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 따로 생산될 경우, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 예를 들어 제1 및 제2 동종이량체 단백질를 합한 후, 이들을 정제함으로써 따로 또는 함께 정제될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 용액 또는 완충제 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 완충제가 단계 a)에서 발생하는 환원 및 교환 과정의 성능에 최적이 아닐 경우, 완충제는 또 다른 용액 또는 완충제로 교체될 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 존재하는 용액 또는 완충제를 단계 a) 전에 또 다른 용액 또는 완충제로 교체하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 이종이량체 단백질은 정제될 수 있다. 이종이량체 단백질의 정제를 위한 방법은 본원에서 설명되는 임의의 방법을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 이종이량체 단백질의 정제에 관련된 방법은 단백질 A 및 단백질 G 크로마토그래피 (또는 다른 친화도 크로마토그래피 방식), 예를 들어 항원-결합 또는 항-이디오타입 항체를 기초로 한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환, 소수성 상호작용, 선택된 카파 또는 람다, 황친화도, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 다른 혼합된 방식 수지를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 방법은 예를 들어 정제된 단백질을 얻기 위해 크로마토그래피가 아니라 염 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 침전을 이용한다.
따라서, 본 발명의 방법은 이종이량체 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이종이량체 단백질을 정제함으로써, 과량의 시약, 예컨대 환원제, 및 불순물을 제거할 수 있다. 이종이량체 단백질을 정제하는 것은 또한 잔류 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 제거를 포함할 수 있다. 아래에서 설명되는 바와 같이, 과량의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 잔류 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 제거를 촉진하기 위해 단계 a)에 사용될 수 있다.
이종이량체 단백질의 정제 단계는 단계 a) 및 b) 사이에서 수행될 수 있지만, 대부분의 목적을 위해 일반적으로 단계 b) 후에 수행될 수 있다.
제1 또는 제2 동종이량체 단백질이 변형된 경우, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 감소시키거나 제거하기 위해 제1 또는 제2 CH3 영역이 변형된 경우, 본 발명의 본 발명의 이종이량체 단백질은 특히 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 정제를 위한 다른 방법이 또한 예를 들어 단백질 A 및/또는 단백질 G 크로마토그래피와 조합하여 사용될 수 있고, 상기 다른 방법은 다른 친화도 크로마토그래피 방식, 예를 들어 항원-결합 또는 항-이디오타입 항체, 선택된 카파 또는 람다를 기초로 한 친화도 크로마토그래피, 황친화도, 이온 교환, 소수성 상호작용, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 다른 혼합된 방식 수지를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 방법은 예를 들어 정제된 단백질을 얻기 위해 크로마토그래피가 아니라 염 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 침전을 이용한다.
이종이량체 단백질은 정제에 의해 또는 정제 후에, 이종이량체 단백질의 보관, 예를 들어 이종이량체 단백질의 안정성을 보장하는 조건에 적합하도록 제제화될 수 있다. 이종이량체 항체에 대해, 상기 제제는 일반적으로 용액 또는 완충제일 수 있다. 별법으로, 이종이량체 단백질은 동결 건조될 수 있다.
본 발명의 방법의 과정에 적합한 장비는 당업자에게 공지되어 있다. 숙주 세포에 의한 동종이량체 항체의 발현은 예를 들어 일반적으로 반응 베슬, 예컨대 생물반응기에서 수행될 수 있다. 환원 및 산화 단계 a) 및 b)는 상기한 바와 같이 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 발현과 동일한 생물반응기에서 수행될 수 있거나 또는 별개의 반응기 베슬에서 수행될 수 있다. 유사하게, 환원 및 산화 단계 a) 및 b)는 또한 동일한 반응 베슬에서 수행될 수 있거나, 또는 별개의 반응기 베슬에서 수행될 수 있다. 환원 및 산화 단계 a) 및 b)가 동일한 반응 베슬에서 수행될 경우, 조건은 상기한 단계 a)로부터 단계 b)로 변경될 수 있다. 반응 베슬 및 지지하는 공정 배관은 일회용 또는 재사용가능할 수 있고, 표준 물질 (플라스틱, 유리, 스테인레스 스틸 등)로 제조될 수 있다. 반응 베슬은 혼합, 살포 (sparging), 상부 공간 기체 발생 (gassing), 온도 제어 기기가 설치되고/되거나 온도, 중량/부피, pH, 용존 산소 (DO), 및 산화환원 전위 측정을 위한 프로브로 모니터링될 수 있다. 모든 그러한 기술은 제조 플랜트의 표준 유닛 운전 내에서 통상적인 것이고, 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 방법의 개별 단계는 본원에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세포외 방법이다. 상기한 바와 같이, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 생산은 숙주 세포 내에서의 발현에 의해 적합하게 수행될 수 있다. 따라서, 단계 a), b) 및 c)는 특정 실시양태에서 세포 외에서 수행될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 단계 a), 단계 b), 단계 c), 및 임의의 단계 a), b) 및 c) 사이의 임의의 단계 및 임의의 후속 단계도 또한 세포 외에서 수행될 수 있다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질
본 발명의 방법은 이종이량체 단백질의 요구되는 조합을 생성하기 위해 많은 방식에서 사용될 수 있고, 이중특이적 항체의 대규모 생산에 특히 적합하다. 선택적인 결합을 얻기 위해 상이한 항원을 표적화하는 항체를 조합할 수 있는 능력 이외에, 이 방법은 목적하는 특성을 변경하기 위해, 예를 들어 동일한 항원을 표적화하는 2개의 상이한 항체를 조합함으로써 CDC를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 길항 항체의 부분적인 효능제 활성을 제거하거나 또는 무관한 (불활성) 항체를 갖는 그의 비대칭적 항체를 제조함으로써 효능제 항체를 길항 항체로 전환하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 동종이량체 단백질은 (i) Fc 영역, (ii) 항체, (iii) Fc 영역, 예컨대 수용체, 시토카인 또는 호르몬에 융합된 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 (iv) 전구약물, 펩티드, 약물 또는 독소에 접합된 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 Fc 영역 이외에, 항체의 하나 이상의 또는 모든 다른 영역, 즉 CH1 영역, VH 영역, CL 영역 및/또는 VL 영역을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 전장 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 동종이량체 단백질은 전장 항체이다.
중요한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 둘 모두 항체, 바람직하게는 전장 항체이고, 상이한 에피토프에 결합한다. 상기 실시양태에서, 생성된 이종이량체 단백질은 이중특이적 항체이다. 상기 에피토프는 상이한 항원 상에 또는 동일한 항원 상에 위치할 수 있다.
그러나, 다른 실시양태에서, 동종이량체 단백질 중의 하나만이 전장 항체이고, 다른 동종이량체 단백질은 전장 항체가 아니고, 예를 들어 수용체, 시토카인 또는 호르몬과 같은 또 다른 단백질 또는 펩티드 서열과 함께 발현되거나 또는 전구약물, 펩티드, 약물 또는 독소에 접합된 Fc 영역이다. 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 항체, 예를 들어 전장 항체일 경우, 이것은 한 실시양태에서 전구약물, 펩티드, 약물 또는 독소에 접합될 수 있거나 또는 이에 대한 수용자 (acceptor) 기를 함유한다. 추가의 실시양태에서, 어떤 동종이량체 단백질도 전장 항체가 아니다. 예를 들어, 두 동종이량체 단백질은 수용체, 시토카인 또는 호르몬과 같은 또 다른 단백질 또는 펩티드 서열에 융합되거나 또는 전구약물, 펩티드, 약물 또는 독소에 접합된 Fc 영역일 수 있다. 이것은 예를 들어 본 발명의 방법에 2개의 상이한 화합물; 예를 들어, 전구약물, 펩티드, 약물 또는 독소에 접합된 제1 및 제2 동종이량체 단백질을 사용함으로써 2개의 상이한 화합물; 예를 들어, 전구약물, 펩티드, 약물 또는 독소에 접합된 이종이량체 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 또한 약물 첨가 과정 또는 화학이 다른 약물의 첨가와 적합하지 않은 경우에 관련될 수 있고, 이때 각각의 2가지 약물을 각각 제1 및 제2 동종이량체 단백질에 첨가하는 과정은 따로 및 본 발명의 방법 전에 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형으로부터 유래된 Fc 영역과 유사하거나 동일하거나, 또는 상기 군 중에서 선택되는 이소형의 것이고 (적어도 본원에 나타낸 돌연변이 제외), 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형으로부터 유래된 Fc 영역과 유사하거나 동일하거나, 또는 상기 군 중에서 선택되는 이소형의 것이다 (적어도 본원에 나타낸 돌연변이 제외). 바람직한 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 동종이량체 단백질 둘 모두의 Fc 영역은 IgG1 이소형으로부터 유래된 Fc 영역과 유사하거나 동일하거나, 또는 IgG1 이소형의 것이다 (적어도 본원에 나타낸 돌연변이 제외). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 동종이량체 단백질의 Fc 영역 중의 하나는 IgG1 이소형으로부터 유래된 Fc 영역과 유사하거나 동일하거나, 또는 IgG1 이소형의 것이고 다른 하나는 IgG4 이소형으로부터 유래된 Fc 영역과 유사하거나 동일하거나, 또는 IgG4 이소형의 것이다 (적어도 본원에 나타낸 돌연변이 제외). 후자의 실시양태에서, 생성되는 이종이량체 단백질은 IgG1의 Fc 영역 및 IgG4의 Fc 영역을 포함하고, 따라서 이펙터 기능의 활성화에 대해 흥미로운 중간 특성을 가질 수 있다. 상기 제1 및/또는 상기 제2 동종이량체 단백질이 Asn-연결 글리코실화를 위한 수용자 부위를 제거하는 돌연변이를 포함하거나 또는 글리코실화 특성을 변경하기 위해 달리 조작될 경우, 유사한 생성물이 얻어질 수 있다.
추가의 실시양태에서, 동종이량체 단백질 중의 하나 또는 둘 모두는 예를 들어 US2009317869에 기재되거나 또는 문헌 [van Berkel et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350]에 기재된 바와 같이 이종이량체 단백질, 예를 들어 항체 생산 동안 배양 배지에 화합물을 첨가하거나 또는 예를 들어 문헌 [Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotechnol. Bioeng 87:614]에 기재된 바와 같은 FUT8 녹아웃 (knockout) 세포를 사용함으로써 푸코스를 감소시키고 따라서 ADCC를 향상시키기 위해 당-조작된다. ADCC는 별법으로 문헌 [Umana et al. (1999) Nature Biotechnol 17: 176]에 기재된 방법을 사용하여 최적화될 수 있다. 별법으로, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 푸코스를 첨가하지 않은 숙주 세포에서 발현될 수 있다 (예를 들어, 바이오와(Biowa)/KHK).
추가의 실시양태에서, 동종이량체 단백질 중의 하나 또는 둘 모두는 예를 들어 문헌 [Natsume et al. (2009) Cancer Sci. 100:2411]에 기재된 바와 같이 보체 활성화를 향상시키기 위해 조작 또는 변형되었다.
추가의 실시양태에서, 동종이량체 단백질 중의 하나 또는 둘 모두는 이종이량체 단백질의 혈청 반감기를 조작하기 위해 신생 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합을 감소시키거나 증가시키기 위해 조작되었다.
추가의 실시양태에서, 동종이량체 출발 단백질 중의 하나는 단백질 A 또는 단백질 G, 또는 단백질 A 및 G의 조합물에 결합하지 않고, 따라서 생성물을 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼에 통과시킴으로써 이종이량체 단백질을 상기 동종이량체 출발 단백질로부터 분리할 수 있도록 조작 또는 변형되었다. 이것은 출발 물질로서의 다른 동종이량체 단백질에 비해 과량의 하나의 동종이량체 단백질이 사용되는 실시양태에서 특히 유용할 수 있다. 상기 실시양태에서, 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하는 그의 능력을 상실하도록 과량으로 사용될 동종이량체 단백질의 단백질 A 또는 단백질 G 결합 부위를 조작 또는 변형하는 것이 유용할 수 있다. 상기 종류의 변형은 본원에 참고로 포함된 WO 2010/151792에 개시된 CH3 도메인의 변형을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 IgG의 단백질 A에 대한 결합을 감소시키거나 제거하는, WO 2010/151792에 기재된 CH3 도메인의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 a) 435R 및 b) 435R 및 436F로 이루어지고 이로 제한되지 않는 군 중에서 선택되는 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 또한 단백질 A에 대한 결합을 제거하는 다음 돌연변이를 포함할 수 있다: I253A, H310A, 및 H435A (AAA). 이종이량체화 반응 후에, 이종이량체 단백질은 단백질 A 칼럼의 통과에 의해 과잉의 비교환된 동종이량체 단백질로부터 분리될 수 있다. 단백질 G가 이종이량체 단백질의 정제에 사용될 경우, 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 I253, S254, H433 및 N434로 이루어지고 이로 제한되지 않는 군 중에서 선택되는 변형을 포함할 수 있다 (문헌 [Sloan, D., et al., Prot. Sci. 1999; 8: 1643-1648]; [Sauer-Eriksson, E., et al., Structure 1995; 3: 265-278]). 이종이량체화 반응 후에, 이종이량체 단백질은 단백질 G 칼럼의 통과에 의해 과잉의 비교환된 동종이량체 단백질로부터 분리될 수 있다. 다른 정제 방법은 본원에 설명되는 임의의 방법을 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 상이한 경쇄, 예컨대 카파 및 람다 경쇄를 포함할 수 있거나, 또는 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 본원에서 설명되는 바와 같은 상이한 동종이형의 것일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 동종이량체 단백질 중의 하나는 (1) Fc 영역 또는 (2) 비-관련 에피토프를 인식하는 전장 항체이다.
본 발명의 동종이량체 출발 물질로서 사용되는 가변 영역은 예를 들어 문헌 [Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 생산될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 가변 영역은 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 가변 영역은 임의의 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 따라서, 예를 들어 가변 영역은 예를 들어 표면에 항원을 발현하는 세포 또는 관심있는 항원을 코딩하는 핵산 형태의 관심있는 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 얻은 뮤린 비장 B 세포로부터 제조한 하이브리도마의 모노클로날 항체로부터 입수할 수 있다. 가변 영역은 또한 면역화된 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 래트, 개, 영장류 등의 항체-발현 세포로부터 유래된 하이브리도마의 모노클로날 항체로부터 얻을 수 있다.
제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 동종이량체 출발 단백질 중의 하나 또는 둘 모두는 임의의 특정된 돌연변이를 제외하고 인간 항체이다. 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 및 경쇄 레파토리 (repertoire)의 전부 또는 일부를 코딩하는 미니염색체 (minichromosome)를 보유하는 트랜스제닉 (transgenic) 또는 트랜스크로모소말 (transchromosomal) 마우스, 예를 들어 HuMAb 마우스 또는 TC 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. HuMAb 마우스는 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌 (minilocus)를, 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 함유한다 (문헌 [Lonberg, N. et al., Nature 368, 856 859 (1994)]). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ 경쇄의 감소된 발현을 보이고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진 (transgene)에서는 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나 고친화도 인간 IgG,κ 모노클로날 항체가 생성된다 (문헌 [Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌]; [Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994)]에서 검토됨, [Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995)] 및 [Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995)]). HuMAb 마우스의 제조는 문헌 [Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992)], [Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993)], [Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994)], [Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994)], [Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845 851 (1996)]에 상세하게 설명되어 있다. 또한, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187을 참조한다. 공지된 기술에 따라 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위해서 상기 트랜스제닉 마우스의 비장 세포가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 항체 또는 다른 종으로부터의 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 파지 클로닝 또는 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 포유동물 디스플레이, 및 다른 기술을 포함하고 이로 제한되지 않는 직접 클로닝 또는 디스플레이-유형의 기술을 통해 확인될 수 있고, 생성되는 분자는 추가의 성숙, 예를 들어 친화도 성숙에 적용될 수 있고, 그러한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 항체 또는 그의 일부, 예를 들어 하나 이상의 CDR은 낙타과 (Camelidae)의 종 (WO2010001251 참조), 또는 연골 어류의 종, 예컨대 수염 상어 (nurse shark)로부터 유래되거나 또는 중쇄 또는 도메인 항체이다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 상기 단계 a)의 또는 단계 a)에 제시되는 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 정제된다. 동종이량체의 정제를 위한 방법은 본원에서 설명되는 임의의 방법, 예를 들어 아래에서 설명되는 임의의 방법일 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 약물, 전구약물 또는 독소에 접합되거나 또는 이에 대한 수용자 기를 함유한다. 상기 수용자 기는 예를 들어 비천연 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 상이한 화합물에 접합되거나, 또는 상이한 변형을 함유하여, 화합물 또는 변형을 모두 포함하는 이종이량체 단백질을 생산할 수 있다.
상기한 바와 같이, 동종이량체 출발 단백질의 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열이다.
한 실시양태에서, 각각의 동종이량체 상호작용에 비해 이종이량체 상호작용의 증가된 강도는 공유 결합, 시스테인 잔기 또는 하전된 잔기의 도입 이외의 다른 CH3 변형에 의한 것이다.
대부분의 실시양태에서, 본 발명의 생성물인 이종이량체 단백질은 크게 안정하고, 시험관내에서 약한 환원 조건 하에 또는, 중요하게는, 인간에게 투여될 때 생체내에서 Fab-아암 교환을 겪지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 생성되는 이종이량체 단백질에서 상기 제1 및 제2 단백질 사이의 이종이량체 상호작용은 Fab-아암 교환이 실시예 13에서 설명되는 조건 하에서 0.5 mM GSH에서 발생할 수 없도록 하는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 생성되는 이종이량체 단백질에서 상기 제1 및 제2 단백질 사이의 이종이량체 상호작용은 실시예 14에서 설명되는 조건 하에서 마우스의 생체내에서 Fab-아암 교환이 발생하지 않도록 하는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 생성되는 이종이량체 단백질에서 상기 제1 및 제2 단백질 사이의 이종이량체 상호작용은 예를 들어 실시예 30에서 설명되는 바와 같이 결정할 때 2개의 동종이량체 상호작용의 최대치보다 2배 초과, 예컨대 3배 초과, 예를 들어 5배 초과로 더 크다.
추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 생성되는 이종이량체 단백질에서 상기 제1 및 제2 단백질 사이의 이종이량체 상호작용의 해리 상수가 실시예 30에 기재된 바와 같이 검정될 때 0.05 마이크로몰 (μM) 미만이 되도록 하는 것이다
추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 두 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 실시예 21에 기재된 바와 같이 검정될 때 0.01 μM 초과, 예컨대 0.05 μM 초과, 바람직하게는 0.01 내지 10 μM, 예컨대 0.05 내지 10 μM, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 μM, 예컨대 0.05 내지 5 μM, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 내지 1 μM, 예컨대 0.05 내지 1 μM, 또는 0.01 내지 0.5 μM 또는 0.01 내지 0.1 μM이 되도록 하는 것이다. 동종이량체 출발 단백질이 상대적으로 안정한 실시양태는 매우 다량의 출발 단백질을 생산하고 예를 들어 응집 또는 오류폴딩 (misfolding)을 방지하기가 쉽다는 잇점을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 안정한 이종이량체 단백질은 CH3 영역에 단지 몇 개의 상당히 보존성인 비대칭 돌연변이만을 보유하는 2개의 동종이량체 출발 단백질을 기초로 하여 본 발명의 방법을 사용하여 고수율로 얻을 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 동일하지 않은 위치에 아미노산 치환을 함유한다.
아미노산 치환체는 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 비천연 아미노산의 실시예는 예를 들어 문헌 [Xie J and Schultz P. G., Current Opinion in Chemical Biology (2005), 9:548-554], 및 [Wang Q. et al., Chemistry & Biology (2009), 16:323-336]에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 아미노산은 천연 아미노산이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 야생형, 예를 들어 인간 IgG, 예컨대 인간 IgG1, CH3 영역에 비해 CH3 영역에 1개 이하의 아미노산 치환을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 CH3 영역에 1개 이하의 아미노산 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제1 동종이량체 단백질 및 상기 제2 동종이량체 단백질은 동일한 위치에서 치환되지 않는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 366에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서, 위치 366의 아미노산은 Arg, Lys, Asn, Gln, Tyr, Glu 및 Gly으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 368에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 370에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 399에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 405에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 407에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405, 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405, 및 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다.
따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 비대칭 돌연변이, 즉 2개의 CH3 영역 내의 상이한 위치에 돌연변이, 예를 들어 CH3 영역 중의 하나의 위치 405에 돌연변이 및 다른 CH3 영역의 위치 409에 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg, Gly, His, Val 및 Ile로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg, His, Ile, 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Leu을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 366에 Lys, Arg, Ser, Thr 또는 Trp 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 366에 Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 366에 Ile 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Phe, Leu, 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Phe, Leu, Lys, 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는다.
하나의 상기 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 그의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고 상기 제2 동종이량체 단백질은 405에 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg, Gly, His, Val 및 Ile으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Leu을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg, His, Ile 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Leu을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Leu을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 366에 Lys, Arg, Ser, Thr 또는 Trp 이외의 다른 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 366에 Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 366에 Ile 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 366에 Ile 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Leu을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 및 위치 409 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Lys을 포함한다. 그의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Leu 및 위치 409에 Lys을 포함한다. 그의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 405에 Leu 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 370에 Lys, 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, 및 a) 위치 350에 Ile 및 위치 405에 Leu, 또는 b) 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, 및 a) 위치 350에 Ile 및 위치 405에 Leu, 또는 b) 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 350에 Thr, 위치 370에 Lys, 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, 및 a) 위치 350에 Ile 및 위치 405에 Leu, 또는 b) 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 350에 Thr, 위치 370에 Lys, 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 350에 Ile, 위치 370에 Thr, 위치 405에 Leu 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr 및 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산 및 위치 409에 Lys을 갖는다..
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr 및 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp 및 위치 409에 Lys을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr 및 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp 및 위치 409에 Lys을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr 및 위치 409에 Arg을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산 및 위치 409에 Lys을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr 및 위치 409에 Arg을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp 및 위치 409에 Lys을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 407에 Tyr 및 위치 409에 Arg을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 407에 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp 및 위치 409에 Lys을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 위치 366에 Lys, Arg, Ser, Thr 또는 Trp 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 위치 366에 Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 이외의 다른 아미노산을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Phe, Leu, 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Phe, Leu, Lys, 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg, Gly, His, Val 및 Ile으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg, His, Val 및 Ile으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Asp 및 Glu을 갖는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 위치 368에 Asp 및 Glu로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은
(i) 위치 368에 Phe, Leu 및 Met 이외의 다른 아미노산, 또는
(ii) 위치 370에 Trp, 또는
(iii) 위치 399에 Asp, Cys, Pro, Glu 또는 Gln 이외의 다른 아미노산
을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg, Ala, His 또는 Gly을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은
(i) 위치 368에 Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, 또는 Trp, 또는
(ii) 위치 370에 Trp, 또는
(iii) 위치 399에 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg 또는 Tyr
을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Arg을 갖고, 제2 동종이량체 단백질은
(i) 위치 368에 Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, 또는 Trp, 또는
(ii) 위치 370에 Trp, 또는
(iii) 위치 399에 Phe, His, Lys, Arg 또는 Tyr
을 갖는다.
상기 특정된 아미노산 치환 이외에, 상기 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 야생형, 예를 들어 인간 IgG, Fc 서열에 비해 추가의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역은 특정된 돌연변이를 제외하고, 서열 1에 제시된 서열 (IgG1m(a))을 포함한다:
Figure pct00001
추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역은 특정된 돌연변이를 제외하고 서열 2에 제시된 서열 (IgG1m(f))을 포함한다:
Figure pct00002
추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역은 특정된 돌연변이를 제외하고 서열 3에 제시된 서열 (IgG1m(ax))을 포함한다:
Figure pct00003
본 발명에 의한 이종이량체 단백질의 생산은 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 CH3 영역의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 큰 것을 포함한다. 상기 효과는 특히 상기한 바와 같이 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질의 CH3 변형의 상기 언급된 예를 사용하여 얻을 수 있다. 그러나, 본원에서 설명되는 것 이외의 다른 돌연변이를 포함하는 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질도 본 발명의 방법에 사용될 수 있음이 예상된다. 예를 들어, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 문헌 [Lindhofer et al. (1995) J Immunol 155:219 (상기 참조)]에 기재된 래트 항체 및 마우스 항체, 또는 미국 특허 5,731,168 (상기 참조)에 기재된 바와 같은 소위 놉-인 홀 (knob-in-hole) 변이체 항체일 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 US 5,731,168에 기재된 놉-인-홀 단일 또는 이중 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 WO2011/143545에 기재된 바와 같이 이중특이적 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 유용한 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 또 다른 적합한 예는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 CH3 영역 사이의 정전기적 상호작용을 기초로 한 것, 예를 들어 WO 2009/089004에 개시된 것을 포함한다. 상기 기술은 또한 정전기적 스티어링 (electrostatic steering)으로 언급될 수 있다.
그러나, 일부의 경우에, 후자의 동종이량체 출발 단백질은 너무 약한 동종이량체 CH3-CH3 상호작용 때문에 생산이 보다 어려울 수 있다. 따라서, 위치 366, 368, 370, 399, 405, 407 및 409 중 하나 이상에 돌연변이를 갖는 본원에서 설명되는 변이체가 바람직할 수 있다. 위치 350, 370, 405 및 409 중 하나 이상에 돌연변이를 갖는 본원에서 설명되는 변이체가 바람직할 수 있다.
동종이량체 출발 단백질의 힌지 영역의 서열은 상이할 수 있다. 그러나, 생성되는 이종이량체 단백질은 힌지 영역이 IgG4-유사가 아니고, 바람직하게는 IgG1-유사인 경우에 몇몇의 상황 하에서 보다 안정할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 동종이량체 단백질은 (코어) 힌지 영역에 Cys-Pro-Ser-Cys 서열을 포함하지 않는다.
추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 동종이량체 단백질은 모두 (코어) 힌지 영역에 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다.
제1 및 상기 제2 동종이량체 단백질이 항체인 많은 실시양태에서, 상기 항체는 경쇄를 추가로 포함한다. 상기 설명한 바와 같이, 상기 경쇄는 상이할 수 있고, 즉 서열이 상이하고, 각각 단지 하나의 중쇄와 기능적 항원-결합 도메인을 형성한다. 그러나, 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 중쇄 항체이고, 이는 항원 결합을 위해 경쇄를 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446]을 참조한다.
단계 a)
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법의 단계 a)는 상기 제1 동종이량체 단백질을 상기 제2 동종이량체 단백질과 함께 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 것을 포함한다. "힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건"의 문맥에서 용어 "충분한"은 Fab-아암 교환 반응의 발생을 허용한다는 측면에서 특히 적용될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 "힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건"은 50% 초과의 이종이량체 단백질, 예컨대 60% 초과의 이종이량체 단백질, 또는 70% 초과의 이종이량체 단백질, 또는 80% 초과의 이종이량체 단백질, 또는 90% 초과의 이종이량체 단백질, 또는 95% 초과의 이종이량체 단백질, 또는 99% 초과의 이종이량체 단백질, 또는 99.5% 초과의 이종이량체 단백질, 예컨대 100%의 이종이량체 단백질을 생산하는 조건이다. 이종이량체 단백질의 비율은 상기 내용에서 제1 동종이량체 단백질, 제2 동종이량체 단백질 및 이종이량체 단백질의 총량을 기준으로 한 것이다. 이종이량체 단백질의 양 또는 비율은 예를 들어 본원의 실시예에서 설명되는 바와 같이 CIEX에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 측면에서, "단계 a)에서의 환원 조건"이라는 언급은 "힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건"을 나타내고자 의도된다. 적합한 조건의 예가 본원에 제시된다. 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 위한 최소 요건은 동종이량체 출발 단백질에 따라, 특히 힌지 영역 내의 정확한 서열에 따라 상이할 수 있다. 임의의 이론에 매이지 않지만, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기는 디술피드 결합의 환원 후에, 예를 들어 환원제, 예컨대 2-MEA에 결합하게 되거나, 또는 쇄내 디술피드 결합을 형성하거나 또는 미결합된 시스테인 잔기와 반응할 수 있다.
단계 a)에서 이종이량체 단백질의 형성은 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 힌지 영역 내의 디술피드 결합의 환원 및 상기 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환을 기초로 한다.
따라서, 단계 a)에서의 환원 조건은 또한 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환을 가능하게 하고, 따라서 이종이량체 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 2개의 제1 또는 2개의 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환은 단계 a)에서 발생하여, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 형성을 유도할 것이다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용은 상기 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 크다. 임의의 이론에 매이지 않지만, 이종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환은 따라서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환에 비해 불리할 수 있다. 따라서, 단계 a)는 일반적으로 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 어느 하나보다 많은 이종이량체 단백질을 생산할 수 있다. 따라서, 일반적으로 본 발명의 방법은 얻어진 생성물, 즉 제1 및 제2 동종이량체 단백질 및 이종이량체 단백질의 총량의 50% 초과, 예컨대 60% 초과, 또는 70% 초과, 또는 80% 초과, 또는 90% 초과, 또는 95% 초과, 또는 99% 초과의 이종이량체 단백질을 생성한다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질은 상기한 바와 같이 함께 또는 따로 생산될 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 함께 생산될 경우, 단계 a)는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 생산과 동일한 용기, 예를 들어 생물반응기에서 수행될 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질, 예컨대 항체의 생산을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
단계 a)에서 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체 단백질의 농도가 동일할 필요는 없다. 원칙적으로, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 농도에 관하여 제한되지 않지만, 대부분의 실제적인 목적을 위해 단계 a)에서 각각의 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 농도는 대개 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml 범위, 예컨대 0.5-100 mg/ml 범위, 또는 1-75 mg/ml 범위, 또는 1-50 mg/ml 범위일 수 있다. 단계 a)에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 총 농도는 적어도 0.25 mg/ml일 수 있다. 상한은 주로 200 mg/ml을 초과하는 농도에서, 단백질이 점성이어서 취급하기 어렵게 될 수 있거나, 용해도의 한계에 도달될 수 있거나, 단백질 응집률이 너무 높기 때문이다. 따라서, 단계 a)에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 총 농도는 일반적으로 0.2 mg/ml 내지 200 mg/ml 범위, 예컨대 0.5-100 mg/ml 범위, 또는 1-50 mg/ml 범위일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 과량의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질이 방법의 단계 a)에서 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 제1 동종이량체 단백질이 생성물 안전성 또는 효능에 강한 영향을 미치거나, 제2 동종이량체 단백질보다 이종이량체 단백질로부터 분리하게 더 어려운 경우, 또는 그 반대의 경우에, 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 이종이량체 단백질의 정제를 간단하게 하거나 손쉽게 하기 위해 특히 적절할 수 있다. 과량의 동종이량체 단백질 중 하나; 즉 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 사용하는 것은 본원에 설명된 이종이량체 단백질의 후속 정제를 손쉽게 할 수 있고, 이것은 단계 a)에서 교환 과정을 충분히 풍부하지는 않은 (underabundant) 단백질에 관하여 완료에 근접하도록 할 것이기 때문이다. 따라서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질이 제한될 대, 그의 대부분은 단계 a)에서 사용될 것이고, 따라서 후속 정제는 주로 이종이량체 단백질을 제1 및 제2 동종이량체 단백질 둘 모두로부터가 아니라 과량으로 사용된 동종이량체 단백질로부터 분리하는 것에 있을 것이다. 따라서, 단계 a)에서 과량의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 사용하는 것은 특히 정제를 용이하게 하는 차이를 갖는 제1 및 제2 동종이량체 단백질을 사용하는 것과 조합될 수 있다. 그러한 차이는 본원에 기재된 것, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 비-결합, 상이한 경쇄 및/또는 상이한 동종이형을 포함한다. 비-등몰량의 제1 및 제2 동종이량체 단백질을 사용하는 것은 스티어드 (steered) 비-등몰 교환 과정 (SNEEP)으로서 공지될 수 있고, 예를 들어 본원에서 실시예 64에 설명된 바와 같이 수행할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 단계 a)에서 제1 동종이량체 단백질 대 제2 동종이량체 단백질의 비는 1:1로 상이할 수 있고, 예를 들어 제1 동종이량체 단백질 대 제2 동종이량체 단백질의 비는 1:1.03 내지 1:2 범위, 예컨대 1:1.05 내지 1:1.5 범위, 또는 1:1.1 내지 1:1.5 범위, 또는 1:1.1 내지 1:1.4 범위; 또는 1:1.15 내지 1:1.35 범위, 또는 1:1.2 내지 1:1.3 범위일 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 단계 a)에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 과량의 5%-60%의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질, 예컨대 과량의 15%-55%의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질, 예를 들어 과량의 20%-55%의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질, 또는 과량의 30-50%의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질, 또는 특히 과량의 15%-35%의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질, 예컨대 과량의 20%-30%의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질로 사용될 수 있다.
단계 a)에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 특히 용액, 예컨대 완충제 내에 존재할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 단계 a)는 용액, 예컨대 완충제 내에서 수행될 수 있다. 용액은 특히 수용액일 수 있다. 적합한 완충제는 환원 및 교환 과정을 지지하고 제1 및 제2 동종이량체 단백질 또는 이종이량체에 유해한 영향을 주지 않는 것, 예를 들어 제1 및 제2 동종이량체 단백질 및 이종이량체 단백질이 그 내에서 안정한 완충제일 수 있다. 단계 a)에서 사용된 완충제는 공정 조작을 최소화하기 위해 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 이전의 처리 단계의 결과로서 그 내에 존재하는 완충제와 동일할 수 있다. 별법으로, 완충제는 표준화된 조건 또는 최적 환원을 가능하게 하는 상이한 완충제일 수 있다. 예를 들어 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 단계 a) 전에 정제될 수 있고, 완충제 또는 용액은 정제 동안 변경될 수 있다.
단계 a)에 적합한 완충제의 예는 PBS (포스페이트-완충 염수), DPBS (둘베코 (Dulbecco) 포스페이트-완충 염수), PBS 브라운 (Braun) (실시예 44), 시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제, 포스페이트 완충제 또는 트리스 완충제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 완충제의 구체적인 예는 본 발명의 실시예에서 설명되는 것을 포함한다. 또한 실시예 43에 제시되는 바와 같이, 완충제의 선택은 이종이량체 단백질의 형성 동역학에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 트리스 또는 포스페이트 완충제가 본 발명의 단계 a)에서 사용될 수 있다. 단계 a)에서 사용된 완충제는 예를 들어 본원의 실시예 43에서 설명되는 포스페이트 또는 트리스 완충제일 수 있거나, 또는 본원의 실시예 53에서 설명되는 PBS 완충제일 수 있다.
한 실시양태에서, 단계 a)에서 완충제는 1-100 mM 완충제, 예컨대 1-50 mM 완충제 또는 1-25 mM, 또는 5-20 mM 완충제를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 단계 a)에서 완충제는 1-100 mM 포스페이트, 예컨대 1-50 mM 포스페이트 또는 1-25 mM, 또는 5-20 mM 포스페이트를 포함할 수 있다.
단계 a)에서의 환원 조건의 pH는 pH 3-10, 예컨대 pH 4-9, 또는 pH 4.5-8.5의 범위일 수 있다. 실시예 43에서 볼 수 있는 바와 같이, pH 값은 이종이량체 단백질의 형성 동역학에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 단계 a)에서의 환원 조건의 pH는 pH 5-8, 예컨대 pH 6-8, 또는 pH 6.5-7.5의 범위일 수 있고, 예를 들어 pH는 특히 약 5.5, 또는 6, 또는 6.5, 또는 7, 또는 7.5, 또는 7.8 또는 8일 수 있다.
적합한 완충제의 예는 실시예 43의 것, 특히 1) 1 x 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS): 8.1 mM 인산나트륨 (Na2HPO4-7H2O), 1.5 mM 인산칼륨 (KH2PO4), 138 mM 염화나트륨 (NaCl), 2.7 mM 염화칼륨 (KCl), pH 5.0; 2) 1 x DPBS, pH 7.0; 3) 20 mM 트리스-HCl, pH 7.8로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
대체 실시양태에서, 단계 a)에서 완충제는 a) 10 mM 인산나트륨, 2 mM 인산칼륨, 137 mM NaCl, pH 5.0; b) 10 mM 인산나트륨, 2 mM 인산칼륨, 137 mM NaCl, pH 7.0; c) 20 mM 시트르산나트륨, pH 4.9; d) 20 mM 시트르산나트륨, pH 6.0; 및 e) 20 mM 트리스-HCl, 20 mM NaCl, pH 7.8로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 단계 a)에서의 환원 조건은 환원제, 예를 들어 술프히드릴 환원제를 포함한다. 용어 "환원 작용제" 및 "환원제"는 본 발명의 측면에서 교환가능하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 단계 a)에서의 환원 조건은 환원제, 예를 들어 술프히드릴-환원제의 첨가를 포함한다. 환원제는 예를 들어 2-메르캅토에틸아민 (2-MEA), 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), L-시스테인, D-시스테인, 베타-메르캅토-에탄올 및 그의 화학 유도체로 이루어지고 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 디티오트레이톨, L-시스테인, D-시스테인 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 환원제는 한 실시양태에서 2-메르캅토에틸아민 (2-MEA), 2-메르캅토에틸아민 (2-MEA)의 화학 유도체, L-시스테인, 및 D-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 특히, 환원제는 2-메르캅토에틸아민 (2-MEA), 또는 L-시스테인, 또는 D-시스테인이다. 환원제 2-메르캅토에틸아민은 다른 화학명, 예컨대 2-MEA, 및 시스테아민을 갖고, 상기 용어는 본 발명의 측면에서 교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 2-MEA는 또한 예를 들어 본 발명의 실시예에서 사용되는 2-메르캅토에틸아민-HCl을 설명하기 위해 사용된다.
단계 a)의 환원제, 그의 농도 및 인큐베이션 시간은 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합이 감소되고, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환이 가능하도록 선택되어야 한다. 그러나, 이와 동시에 너무 가혹한 조건, 예컨대 환원제의 너무 높은 농도 또는 너무 긴 인큐베이션 시간의 사용은 피하는 것이 유리할 수 있고, 그 이유는 예를 들어 이것은 불필요할 수 있고, 너무 가혹한 조건은 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질 또는 이종이량체 단백질을 손상시킬 수 있기 때문이다. 최적 조건은 상이한 파라미터, 예컨대 온도, pH, 용존 산소 농도, 동종이량체 농도, 완충제의 선택, 미량 금속 및 킬레이터, 및 환원제의 선택 및 농도에 의해 영향받을 수 있다.
환원제의 적합한 농도는 0.1 mM 내지 1 M일 수 있다. 환원제가 2-MEA이면, 농도는 일반적으로 10-500 mM, 예컨대 25-500 mM, 또는 40-350 mM, 또는 10-100 mM, 예를 들어 25-100 mM, 또는 10-75 mM, 예를 들어 25-75 mM, 또는 10-60 mM, 예를 들어 25-60 mM, 또는 10-50 mM, 예를 들어 25-50 mM, 예컨대 약 10 mM, 또는 약 25 mM, 또는 약 30 mM, 또는 약 40 mM, 또는 약 50 mM일 수 있다. 환원제가 L-시스테인 또는 D-시스테인일 경우, 농도는 일반적으로 10-500 mM, 예컨대 10-400 mM, 또는 10-300 mM, 또는 10-200 mM, 또는 20-150 mM, 또는 20-125 mM, 또는 25-100 mM, 예컨대 약 25 mM, 또는 약 50 mM, 또는 약 75 mM 또는 약 100 mM일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 단계 a)는 적어도 15분, 예컨대 적어도 20분 또는 적어도 30분, 또는 적어도 60분 또는 적어도 90분, 예컨대 15분 내지 10시간, 또는 15분 내지 6시간, 또는 15분 내지 5시간, 또는 15분 내지 4.5시간, 또는 15분 내지 4시간, 또는 30분 내지 10시간, 또는 30분 내지 6시간, 또는 30분 내지 5시간, 또는 30분 내지 4.5시간, 또는 320분 내지 4시간, 또는 90분 내지 10시간, 또는 90분 내지 6시간, 또는 90분 내지 5시간, 또는 90분 내지 4.5시간, 또는 90분 내지 4시간, 예컨대 2-5시간, 또는 2-4.5시간, 또는 2-4시간, 또는 3-5시간, 또는 3-4.5시간, 또는 3-4시간, 또는 3.5-5시간, 또는 3.5-4.5시간, 예를 들어 대략 2시간, 3시간, 4시간 또는 5시간 동안의 인큐베이션을 포함한다. 실시예 45 및 실시예 53에서 제시되는 바와 같이, 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원, 및 이종이량체 단백질을 생산하기 위한 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환은 주어진 조건 하에서 4시간 내에 완료되었다.
단계 a)의 최적 온도는 환원제의 선택에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 온도는 2-45℃, 예컨대 2-10℃, 또는 15-45℃, 또는 20-40℃, 또는 20-30℃, 또는 30-40℃, 또는 22-39℃, 예컨대 21-26℃, 또는 22-25℃, 예컨대 약 25℃ 또는 약 37℃일 수 있다. 한 실시양태에서, 단계 a)는 2-메르캅토에틸아민, L-시스테인 및 D-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 25 mM의 환원제의 존재 하에 적어도 20℃의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 제어된 Fab-아암 교환, 즉 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원 및 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 후속 교환을 가능하게 하는 환원 조건은 요구되는 산화환원 전위의 측면에서 설명된다. 트리펩티드 글루타티온 (GSH)은 세포 내의 주요 저-분자량 티올이고, 생체내에서 정상적인 산화환원 신호전달에 필수적인 티올-디술피드 산화환원 상태를 제어한다. 세포성 산화환원 균형의 역학은 환원된 GSH 및 그의 산화된 형태 GSSG의 티올-대-디술피드 상태의 유지에 의해 달성된다. 환원 전위의 값은 문헌 [Rost and Rapoport, Nature 201:185 (1964)] 및 [Aslund et al., J. Biol. Chem. 272: 30780-30786 (1997)]에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. GSSG당 산화된 2개의 GSH의 화학양론을 고려하는 산화환원 전위 (Eh)는 산화환원 상태에 대한 정량적 척도이다. Eh는 네른스트 (Nernst) 식에 의해 계산된다: Eh = Eo + (RT/nF)ln([GSSG (ox)]/[GSH (red)]2). Eo는 규정된 pH에서 산화환원 커플에 대한 표준 전위이고, R은 기체 상수이고, T는 절대 온도이고, F는 패러데이 (Faraday) 상수이고, n은 전달된 전자의 수이다. GSH/GSSG 커플에 대한 Eh의 생체내 추정치는 -260 내지 -200 mV이다 (문헌 [Aw, T., News Physiol. Sci. 18:201-204 (2003)]). 이에 의해, 최종적으로 분화된 세포는 Eh를 대략 -200 mV로 유지하는 반면에, 활발하게 증식하는 세포는 약 -260 mV의 보다 환원된 Eh를 유지한다.
DTT에 대한 표준 산화환원 전위는 -330 mV이다 (문헌 [Cleland et al. Biochemistry 3: 480-482 (1964)]). TCEP는 용액 내에서 DTT를 감소시키는 것으로 밝혀졌고, 따라서 DTT보다 더 음성인 산화환원 전위를 갖는다. 그러나, 정확한 값은 보고되지 않았다. 따라서, 본 발명의 단계 a)에 적합한 환원 조건은 요구되는 산화환원 전위 Eh의 측면에서 설명되고, 이것은, 생체내에서 정상 혈장 조건 하에서 달성되고 힌지 영역에 위치하고 쇄간 디술피드 결합 형성에 관여하거나 또는 경쇄와 중쇄 사이의 디술피드 결합에 관여하는 것 외부의 항체 디술피드 결합을 환원시키는 산화환원 전위를 초과하는 값 미만이 최적이다.
따라서, 하나의 또는 추가의 실시양태에서, 단계 a)는 산화환원 전위가 -50 mV 미만, 예컨대 -150 mV 미만, 바람직하게는 -150 내지 -600 mV, 예컨대 -200 내지 -500 mV, 보다 바람직하게는 -250 내지 -450 mV, 예컨대 -250 내지 -400 mV, 훨씬 더 바람직하게는 -350 내지 -450 mV인 환원 조건 하에 수행된다.
하나의 또는 추가의 실시양태에서, 단계 a)는 적어도 25 mM 2-메르캅토에틸아민의 존재 하에 또는 적어도 0.5 mM 디티오트레이톨의 존재 하에 또는 적어도 25 mM L- 또는 D-시스테인의 존재 하에 적어도 20℃의 온도에서 적어도 30분, 예를 들어 90분 동안의 인큐베이션을 포함한다.
하나의 또는 추가의 실시양태에서, 단계 a)는 적어도 25 mM 2-메르캅토에틸아민의 존재 하에 또는 적어도 0.5 mM 디티오트레이톨의 존재 하에 또는 적어도 25 mM L- 또는 D-시스테인의 존재 하에 5 내지 8의 pH, 예컨대 pH 7.0 또는 pH 7.4에서 적어도 20℃의 온도에서 적어도 30분, 예를 들어 90분 동안의 인큐베이션을 포함한다.
또 다른 또는 추가의 실시양태에서, 단계 a)는 적어도 25 mM 2-메르캅토에틸아민의 존재 하에 또는 적어도 25 mM L- 또는 D-시스테인의 존재 하에 적어도 20℃의 온도에서 적어도 30분, 예를 들어 90분 동안의 인큐베이션을 포함한다. 인큐베이션은 6 내지 8의 pH, 예컨대 pH 7-8에서 수행될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 단계 a)는 25-75 mM 2-메르캅토에틸아민의 존재 하에 또는 25-100 mM L- 또는 D-시스테인의 존재 하에 적어도 20-30℃의 온도에서 4-6시간 동안의 인큐베이션을 포함한다. 인큐베이션은 6 내지 8의 pH, 예컨대 pH 7-8에서 수행될 수 있다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 단계 a)는 50 mM 2-메르캅토에틸아민의 존재 하에 또는 25-100 mM L- 또는 D-시스테인의 존재 하에 25℃의 온도에서 5시간 동안의 인큐베이션을 포함한다. 인큐베이션은 6 내지 8의 pH, 예컨대 pH 7-8에서 수행될 수 있다.
하나의 또는 추가의 실시양태에서, 단계 a)는 금속 킬레이팅제, 예컨대 EDTA, EGTA 또는 시트르산의 첨가를 포함한다. 본 발명의 발명자는 2-MEA가 본 발명의 단계 a)에서 환원제로서 사용될 때, 단계 a)에서 EDTA를 첨가하거나 포함시키면, 보다 낮은 산화 속도에 의해 관찰되는 바와 같이 상기 단계에서 2-MEA 자가-산화 속도가 저하됨을 밝혀내었다 (예를 들어, 실시예 47 및 54 참조). 임의의 이론에 매이지 않지만, 이것은 EDTA에 의해 킬레이팅되는 단계 a)에 존재하는 금속 이온에 의한 것일 수 있고, 이것은 금속 이온에 의한 2-MEA의 자가-산화를 감소시킬 수 있다. 일반적으로, 환원제의 자가-산화는 환원제를 소비하여, 효과적으로 보다 낮은 농도의 환원제를 생성한다. 따라서, 금속 킬레이팅제를 첨가함으로써 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원 속도는 증가될 수 있고/있거나 보다 적은 환원제가 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합을 감소시키기 위해 필요할 수 있다. 금속 이온은 예를 들어 반응에 사용되는 용액 또는 완충제에 존재할 수 있고/있거나 반응을 위해 사용되는 장비로부터 침출될 수 있다.
단계 a)에 첨가되거나 포함될 수 있는 적합한 금속 킬레이팅제의 예는 EDTA, EGTA 및 시트르산을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
금속 킬레이팅제의 농도는 예를 들어 단계 a)에 사용되는 성분에 의해 영향받을 수 있는, 단계 a)에서 조성물 내의 금속 이온의 농도에 따라 결정된다. 그러나, EDTA 또는 EGTA의 관련 농도는 0.01 mM 내지 10 mM, 예컨대 0.1 mM 내지 10 mM, 예컨대 0.5 mM 내지 5 mM, 또는 1 mM 내지 5 mM, 예컨대 약 1 mM, 또는 약 2 mM, 또는 약 3 mM, 또는 약 4 mM 또는 약 5 mM일 수 있다.
단계 a)에서 산소, 예를 들어 용존 산소의 농도도 쇄간 디술피드 결합의 환원 및/또는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 a)에서의 환원 조건은 단계 a)에 존재하는 산소, 예를 들어 용존 산소의 양, 예를 들어 단계 a)의 조성물에 용해된 산소의 양의 감소를 포함한다.
단계 a)의 조성물 내의 산소의 존재 또는 산소, 예를 들어 용존 산소 또는 산화제의 양은 상이한 인자, 예컨대 공기로부터 용액 내로의 산소의 전달을 감소시키거나 증가시킬 수 있는 상이한 화합물 또는 기계적 효과의 존재에 의해 영향받을 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명의 단계 a)는 혼합 속도의 제한, 산소 살포의 제한, 상부 공간으로부터 산소 전달의 최소화 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합 속도는 예를 들어 50-200 rpm, 예컨대 75-150 rpm, 또는 75-125 rpm, 예를 들어 약 100 rpm일 수 있다. 상부 공간 기체 발생 속도는 예를 들어 5-25 ml/min, 예를 들어 10-20 ml/min, 예를 들어 약 15 ml/min일 수 있다.
산소 전달 속도는 다음 식 2를 사용하여 결정될 수 있다:
OTR = kla x ln(DO* - DO) x s
여기서,
OTR = 산소 전달 속도 (mM/hr)
kla = 산소 전달 계수 (1/시간)
DO* = 평형 DO 농도 (질소 = 0%, 공기 = 100%, 산소 = 500%)
DO = 실제 용존 산소 농도
s = 산소 용해도 (대략 0.2 mM/100%)
최적 산소 전달 범위는 환원제의 종류 및 농도에 따라 결정된다.
실시예 57에서, 질소가 기체로서 사용되었고, 시스템 DO는 교환 반응 전에 0%로 설정되었다. DO* = 0 및 DO=0인 식 2에 따르면, OTR = 0 mM/hr. 상기 조건은 적합한 교환을 유도하였다.
실시예 53에서, 공기가 기체상으로 사용되었고, 따라서 DO* = 100%이었다. 실시예 53 (100 RPM에서 교반)에서 kla는 0.76/hr이었다. 시스템의 DO는 100%의 포화값으로부터 0.2%의 항정 상태 (steady state) 값으로 저하되었다. 식 2에 따른 상기 조건의 산소 전달 속도는 0.15 mM/hr이다. 상기 조건은 적합한 교환을 유도하였다.
실시예 55에서, 공기가 기체상으로 사용되었고, 따라서 DO* = 100%이었다. 실시예 55 (400 RPM에서 교반)에서 kla는 4.0/hr이었다. 시스템의 DO는 100%의 포화값으로부터 3%의 항정 상태 값으로 저하되었다. 식 2에 따른 상기 조건의 산소 전달 속도는 0.78 mM/hr이다. 상기 조건은 불완전한 환원 및 이종이량체 생성물로의 낮은 전환율 유도하였다.
이들 결과는 50 mM 2-MEA가 환원제로서 사용될 때, 0-0.15 mM/hr의 OTR이 적합한 결과를 제공하는 반면, 0.78 mM/hr 또는 그 초과의 OTR은 최적 미만의 결과를 제공함을 입증한다.
공기가 산소 전달을 위해 사용될 경우, 단계 a)에서 산소 전달 계수 (kla)는 예를 들어 3/시간 미만, 예컨대 2/시간 미만, 또는 1/시간 미만, 또는 0.90/시간 미만, 또는 0.80/시간 미만, 예를 들어 0.76/시간 미만, 예컨대 대략 0.76/시간일 수 있다.
단계 a)의 조성물에 용해된 산소의 양을 제한하거나 제거하는 또 다른 방법은 산소를 조성물로부터 대체하기 위해 불활성 기체, 예컨대 질소를 단계 a)에 첨가하는 것을 포함한다.
따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 a)에서의 환원 조건은 단계 a)의 조성물에 용해된 산소를 불활성 기체, 예를 들어 질소로 대체, 제거 또는 교체하는 것을 포함한다. 이것은 예를 들어 질소를 사용한 상부 공간 기체 발생 및/또는 충분한 교반을 사용한 살포를 통해 수행할 수 있다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질의 힌지 영역 내의 디술피드 결합의 환원의 진행 후에, 산화환원 전위의 모니터링 및/또는 용존 산소의 농도 모니터링이 수행될 수 있다. 상기 모니터링을 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 상이한 종류의 프로브, 예컨대 본원에서 설명되거나 사용되는 임의의 것을 포함한다.
대체 실시양태에서, 단계 a)는 제1 및 제2 이종이량체 단백질을 환원제를 포함하는 물질에 통과시킴으로써 수행될 수 있다. 그러한 방법의 예는 환원제를 포함하는 칼럼, 예를 들어 본원에 기재된 환원제, 예컨대 실시예 61에 기재된 것을 포함하는 고정형 환원제 칼럼일 수 있다.
이어서, 이종이량체 단백질은 물질로부터, 예를 들어 칼럼으로부터 그를 용리시킴으로써 얻을 수 있다. 상기 방법에 의해 얻어진 이종이량체 단백질은, 예를 들어 환원제가 칼럼 내의 물질에 결합하기 때문에 환원제를 포함하지 않거나 단지 미량의 환원제만을 포함할 수 있다. 온도, 용존 산소의 농도, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 농도, 산화환원 전위 및 pH는 상기 설명된 것과 유사할 수 있다.
단계 b)
본 발명의 방법은 b) 단계 a)로부터 얻은 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단계 b)는 b) 단계 a)로부터 얻은 적어도 10 ml의 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계를 포함한다.
단계 a)에서의 환원 조건은 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 야기한다. 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합 이외에, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질 내의 다른 디술피드 결합, 예컨대 항체의 중쇄와 경쇄 사이의 디술피드 결합 또는 쇄내 디술피드 결합이 존재할 수 있다. 단계 a)에서의 환원 조건은 또한 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질 내의 상기 다른 쇄간 또는 쇄내 디술피드 결합의 환원을 야기할 수 있다.
단계 a)에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 교환 후에, 이종이량체 단백질의 제1 및 제2 Fc 영역 사이의 힌지 영역 내의 디술피드 결합, 및 임의로 다른 디술피드 결합이 재형성되는 것이 유리할 수 있다. 이에 의해, 힌지 영역 내의 적어도 디술피드 결합, 및 임의로 또한 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질 내의 것과 유사한 위치에 다른 디술피드 결합을 포함하는 이종이량체 단백질이 생산된다. 그러한 디술피드 결합의 존재는 이종이량체 단백질의 안정성을 증가시킨다.
실시예 41은 본 발명의 단계 a)에 따라 생산된 이중특이적 항체의 완충제 교환 후에 이중특이적 항체가 단지 부분적으로 재-산화되었음을 보여준다. 따라서, 실시예 41은 이 실시예에서 단계 a)의 조건이 이중특이적 항체의 힌지 영역 내의 디술피드 결합의 재-산화를 위해 충분하지 않음을 나타낸다. 또한, 실시예 48 및 실시예 57은 또한 용존 산소 농도가 산소를 질소 첨가에 의해 교체함으로써 감소될 때, 항체 내의 시스테인의 디술피드 결합으로의 재-산화가 억제됨을 보여준다. 시스테인의 디술피드 결합으로의 산화를 위해, 2개의 시스테인은 서로 충분히 근접하여 존재하여야 한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 이종이량체 단백질의 천연적인 재회합을 유도한다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 생산된 이중특이적 항체 내의 시스테인은 일반적으로 제1 및 제2 항체 (제1 및 제2 동종이량체 단백질)에서처럼 위치할 수 있고, 이에 의해 항체에 존재하는 디술피드 결합이 또한 이중특이적 항체 내에 형성된다. 본 발명의 측면에서, "단계 b)에서의 산화 조건"의 언급은 "이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건"을 나타내고자 의도된다. 추가의 실시양태에서, 단계 b)에서의 산화 조건은 이종이량체 단백질 내의 모든 관련 디술피드 결합; 예를 들어 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합의 형성을 위해 충분하다.
본 발명의 측면에서, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 조건은 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 쇄간 디술피드 결합이 형성됨을 의미한다. 본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, 이종이량체 단백질은 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합을 모두 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 시스테인의 디술피드 결합으로의 산화를 위한 관련 시간은 예를 들어 제조 조건에 따라 결정되고, 일반적으로 48시간 내, 예컨대 24시간 내, 또는 15시간 내, 또는 10시간 내, 또는 5시간 내, 또는 4시간 내, 또는 3시간 내, 또는 2시간 내일 수 있다.
산업적 생산을 위해, 생성물에 유해한 영향을 주지 않으면서 생산 속도를 증가시키는 것은 일반적으로 유리한 것으로 인정된다. 실시예 55 및 56은 산소의 양 증가가 디술피드 결합의 재-산화의 속도를 증가시킴을 나타낸다. 이것은 보다 큰 부피의 이종이량체 단백질의 생산과 특히 관련될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 단계 a)로부터 얻은 적어도 10 ml의 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계 b)를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 단계 b)에서 사용되는, 단계 a)로부터 얻은 조성물의 부피는 적어도 15 ml, 예컨대 적어도 20 ml, 또는 적어도 25 ml, 또는 적어도 30 ml, 또는 적어도 40 ml, 또는 적어도 50 ml, 또는 적어도 75 ml, 또는 적어도 100 ml, 또는 적어도 125 ml, 또는 적어도 150 ml, 또는 적어도 200 ml, 또는 적어도 250 ml, 또는 적어도 300 ml, 또는 적어도 350 ml, 또는 적어도 400 ml, 또는 적어도 450 ml, 또는 적어도 500 ml, 또는 적어도 550 ml, 또는 적어도 600 ml, 또는 적어도 650 ml, 또는 적어도 700 ml, 또는 적어도 750 ml, 또는 적어도 800 ml, 또는 적어도 850 ml, 또는 적어도 900 ml, 또는 적어도 950 ml, 또는 적어도 1 L, 또는 적어도 2 L, 또는 적어도 3 L, 또는 적어도 4 L, 또는 적어도 5 L, 또는 적어도 10 L일 수 있다. 원칙적으로, 특히 공정이 연속 공정으로 실시되지 않으면, 상한은 존재하지 않는다. 그러나, 많은 공정 조건에 대해, 상기 종류의 생산에 적합한 반응기 베슬의 크기는 1 L 내지 10,000 L일 수 있다.
하나의 또는 추가의 실시양태에서, 예를 들어 단계 b)에서 사용되는, 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 이종이량체 단백질의 농도는 적어도 0.1 mg/ml, 예컨대 적어도 0.2 mg/ml, 또는 적어도 0.3 mg/ml, 또는 적어도 0.4 mg/ml, 또는 적어도 0.5 mg/ml, 또는 적어도 0.75 mg/ml, 또는 적어도 1 mg/ml, 또는 적어도 1.5 mg/ml, 또는 적어도 2 mg/ml, 또는 적어도 3 mg/ml, 또는 적어도 4 mg/ml, 또는 적어도 5 mg/ml, 또는 적어도 10 mg/ml, 또는 적어도 15 mg/ml, 또는 적어도 16 mg/ml, 또는 적어도 20 mg/ml일 수 있다. 이종이량체 단백질의 농도에 대한 상한은 100-200 mg/ml, 예컨대 약 100 mg/ml, 또는 약 150 mg/ml, 또는 약 200 mg/ml일 수 있다. 따라서, 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 이종이량체 단백질의 농도는 한 실시양태에서 0.1-200 g/L, 예컨대 1-100 g/L일 수 있다. 본 발명은 특정 농도의 이종이량체 단백질로 제한되지 않지만, 단백질 (제1 또는 제2 동종이량체 단백질 또는 이종이량체 단백질이든 상관없이)의 농도가 너무 높으면, 조성물은 불안정하거나 너무 점성으로 되어, 작업이 곤란하게 되고/되거나 단백질 응집체가 형성될 수 있다. 이와 대조적으로, 너무 낮은 농도의 이종이량체 단백질은 경제적으로 실현가능하지 않을 수 있다.
예를 들어 산소를 단계 b)에 공급함으로써, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건을 얻기 위해 필요한 산소의 양은 상이한 인자에 따라 결정된다. 상기 인자는 예를 들어 단계 a)로부터 얻은 조성물의 부피, 이종이량체 단백질의 농도, 산화를 필요로 하는 디술피드 결합의 수 및 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 산소의 농도를 포함하고, 이것은 예를 들어 완충제 내의 산소의 용해도에 따라 결정될 수 있고, 이것은 특정 용액 또는 완충제, pH, 이온 강도, 온도, 압력 및 주위 산소 농도에 따라 결정될 수 있다. 단계 a)로부터 얻은 조성물을 본 발명의 단계 b)에서의 산화 조건에 적용하면, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화 속도가 증가할 수 있다. 일반적으로, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화에 충분하거나 필요한 단계 b)의 산소의 양은 디술피드 결합 1 몰당 0.5 몰의 산소 (O2), 예를 들어 디술피드 결합 1 몰당 0.25-0.75 몰의 산소 (O2), 예컨대 디술피드 결합 1 몰당 0.3-0.7 몰의 산소 (O2)일 수 있거나 대략 상기 값이다. 이것은 시스테인 2 몰당 1 몰의 산소 (O2), 예컨대 시스테인 2 몰당 0.6-1.4 몰의 산소 (O2)에 대응한다. 따라서, 한 실시양태에서, 단계 b)의 "산화 조건"은 디술피드 결합 1 몰당 0.3-0.7 몰의 산소, 예컨대 디술피드 결합 1 몰당 0.5 몰의 산소, 또는 시스테인 2 몰당 0.6-1.4 몰의 산소, 예를 들어 시스테인 2 몰당 1 몰의 산소를 포함한다.
따라서, 산소 대 디술피드 결합 또는 시스테인의 상기 비를 달성하기 우한 산소의 관련 농도는 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 이종이량체 단백질의 농도를 결정한다.
한 실시양태에서, 단계 b)에서의 산화 조건은 적어도 0.05 mM 산소, 예컨대 적어도 0.075 mM 산소, 또는 적어도 0.1 mM 산소, 또는 적어도 0.125 mM 산소, 또는 적어도 0.15 mM 산소, 또는 적어도 0.175 mM 산소, 또는 적어도 0.2 mM 산소의 농도를 포함할 수 있다.
산소의 분자 용해도는 1 atm, 25℃에서 해수 내의 0.206 mM이다. 그러나, 본 발명의 방법의 조건, 예를 들어 완충제, 온도 등에서, 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 산소의 농도는 0.2 mM 미만일 수 있다.
산소 용해도는 기체상 내의 산소의 부분압에 의해 결정되기 때문에, 산소 전달의 증가는 시스템 내의 공기의 압력을 증가시킴으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 압력의 2배 증가는 평형 용존 산소 농도의 2배 증가 및 산소 전달 속도의 증가를 유도한다. 별법으로, 기체상 내의 산소의 부분압은 공기 대신에 산소를 사용함으로써 증가될 수 있다. 공기는 대략 21% 산소를 함유하므로, 순수한 산소의 사용은 대략 5배 더 높은 평형 용존 산소 농도 및 증가된 산소 전달 속도를 제공한다. 압력 및 순수한 산소는 조합하여 산소 용해도 및 전달 속도를 추가로 증가시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 단계 b)에서의 산화 조건은 단계 a)로부터 얻은 조성물을 산소로 포화시키는 것을 포함한다.
단계 a)로부터 얻은 조성물은 일반적으로 힌지 영역 내의 적합한 쇄간 디술피드 결합의 환원을 보장하기 위해 소량의 산소를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 산소를 공급하는 것이 필요할 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 상기한 바와 같이 용액, 예컨대 완충제 내에 존재할 수 있다. 따라서, 단계 a)로부터 얻은 조성물은 특정 실시양태에서 용액, 예를 들어 완충제일 수 있다. 상기 실시양태에서, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 산화에 중요한 것은 용액 내에 용해된 산소의 양, 즉 용존 산소의 농도이다.
따라서, 한 실시양태에서, "단계 b)에서의 산화 조건"은 용존 산소 수준의 제어를 의미하고, 이것은 예를 들어 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 용존 산소의 양 또는 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
단계 b)에서의 산화 조건을 얻거나 생성하기 위한 상이한 수단이 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 본원에서 설명되는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단계 b)에서의 산화 조건은 산소의 첨가를 포함한다. 용어 "산소의 첨가"는 본 발명의 측면에서 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분하도록 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 산소, 예를 들어 용존 산소의 양을 증가시키는 것으로 이해되어야 한다. 산소를 첨가하는 수단 또는 방법은 기계적 수단, 단계 a)로부터 얻은 조성물의 용액 또는 완충제를 보다 다량의 산소를 포함하는 완충제, 예컨대 본원에 기재된 정용여과에 사용되는 완충제 중의 하나의 용액으로 변경하기, 단계 a)로부터 얻은 조성물의 용액 또는 완충제를 충분한 산소를 포함하는 용액 또는 완충제로 희석하기, 산소를 생성할 수 있는 화합물의 첨가, 압력의 증가 또는 산소, 예를 들어 산소 기체의 직접 첨가 또는 포함시킴을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그러한 방법의 조합도 사용될 수 있다.
단계 b)의 산소의 양 또는 농도는 단계 b) 동안 항상 충분한 산소가 존재하는 것을 보장하기 위해 예를 들어 연속적으로 측정될 수 있다. 산소를 측정하기 위한 방법 또는 장비는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 본원에서 설명되는 임의의 것, 예컨대 실시예 44에서 설명되는 프로브를 포함할 수 있다.
산소는 산소 또는 공기의 살포 또는 압력의 증가에 의해 단계 b)에 첨가될 수 있다. 또 다른 방법은 주위, 예를 들어 공기로부터 산소의 전달을 증가시키는 것일 수 있다. 이것은 예를 들어 기계적 수단, 예를 들어 교반, 진탕, 압력의 증가 또는 유동의 생성에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 b)의 조성물이 용기, 예컨대 베슬에 존재할 경우, 산소는 예를 들어 예를 들어 상부 공간으로부터 단계 b)의 조성물 내로 수송될 수 있거나, 또는 단계 b)의 조성물을 진탕 또는 교반하기 위한 수단이 적용될 수 있다. 단계 b)의 조성물의 진탕 또는 교반 속도를 제어함으로써, 주위로부터 산소의 전달 속도는 제어될 수 있고, 즉 진탕 또는 교반 속도, 또는 유동이 높을수록 보다 많은 산소가 단계 a)로부터 얻은 조성물 내로 전달될 수 있다. 압력을 증가시키기 위한 수단이 또한 적용될 수 있다. 산소를 단계 b)에 첨가하는 것은 또한 상이한 수단의 조합에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어 진탕 및/또는 교반은 산소 또는 공기를 사용한 살포 및/또는 단계 b) 내의 조성물의 압력의 증가와 조합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단계 b)에서의 산화 조건은 산화제를 포함한다. 산화제는 바람직하게는 이종이량체 단백질 내의 쇄간 디술피드 결합의 산화를 보장하고 이와 동시에 이종이량체 단백질의 다른 부분, 예컨대 산화에 감수성인 것으로 알려진 메티오닌 및 트립토판과 같은 아미노산의 산화를 방지할 수 있는 것이다. 적합한 산화제의 예는 데히드로아스코르브산 (dhAA)이다. dhAA가 단계 a)에 존재하는 환원제를 산화시키기 위해 사용될 경우, dhAA의 일반적인 농도는 환원제 농도의 1-2배, 예를 들어 50-100 mM일 수 있다. 단계 a)에 존재하는 환원제가 dhAA 첨가 전제 제거될 경우, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화제의 양은 보다 낮은 값, 예컨대 0.01-1 mM, 예를 들어 0.1-1 mM일 수 있다. 산화제, 예컨대 dhAA가 본 발명의 단계 b)에 첨가될 경우, 이것은 표준 여과 및/또는 크로마토그래피 기술을 사용하여 후속적으로 제거될 수 있다.
단계 b)에서 산소를 첨가하거나 증가시키기 위한 상이한 수단 또는 방법이 조합하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 산소가 첨가되는 방법, 예를 들어 산소의 살포, 교반, 진탕 또는 유동의 생성과 무관하게, 이것은 한 실시양태에서 산화제의 첨가와 조합될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단계 a)에서의 환원 조건은 환원제를 포함하고, 이것은 또한 단계 a)로부터 얻은 조성물에 존재하고 따라서 단계 b)에서의 산화 조건에 적용될 수 있다. 단계 b)에서 환원제의 존재는 단계 b)에서의 산화 조건에 유해할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 이종이량체 단백질은 환원제로부터 분리될 수 있다. 아래에서 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 환원제를 이종이량체 단백질로부터 분리하기 위한 특정 방법이 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건을 유도하거나 생성함을 밝혀내었다.
환원제를 제거하거나 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하는 것이, 방법에 따라, 특히 다량의 이종이량체 단백질, 즉 고농도 및/또는 고부피의 이종이량체 단백질이 단계 a)에서 생산되지 않을 때 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 반드시 충분한 것은 아닐 수 있다 (예를 들어, 실시예 41, 52 및 53 참조). 그러나, 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하는 것이 다른 이유 때문에 유리할 수 있고, 본 발명의 방법은 따라서 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 환원제를 이종이량체 단백질로부터 분리하기 위한 실시양태를 아래에서 추가로 설명한다.
단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 환원제의 양을 감소시키기 위한 또 다른 방법은 상기 조성물의 부피를 증가시켜 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 환원제의 농도를 감소시키는 것이다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 a)로부터 얻은 조성물의 부피는 예를 들어 단계 a)의 환원제를 함유하지 않는 것을 제외하고 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제와 동일한 완충제를 첨가하거나 또는 단계 a)의 환원제를 함유하지 않는 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제와 상이한 완충제를 첨가함으로써 증가될 수 있다. 단계 a)로부터 얻은 조성물의 부피를 증가시키는 것은 환원제 및 이종이량체 단백질을 분리하기 위한 방법을 비롯하여 본원에 기재된 다른 실시양태와 조합하여 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이 단계 b)에서 조성물에 산소 및/또는 산화제를 첨가하는 것이 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분할 수 있다. 또한, 단계 a)가 환원제를 포함할 경우, 이들 조건은 또한 이종이량체 단백질의 쇄간 디술피드 결합을 추가로 환원시킬 수 없도록 환원제의 산화에 충분할 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 b)에서의 산화 조건은 단계 a)의 환원제의 산화를 허용하기에 충분하다. 예를 들어, 2-MEA가 단계 a)에서 환원제로서 사용될 경우, 단계 b)에서의 산화 조건은 2-MEA가 자가-산화하여 임의의 디술피드 결합을 환원시킬 수 없도록 하는 것일 수 있다 (예를 들어, 실시예 59 참조). 환원제의 산화 여부와 무관하게, 이것은 이종이량체 단백질을 환원제로부터 후속적으로 분리하는 것과 관련될 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리를 포함할 수 있다. 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하기 위한 방법은 임의의 본원에서, 예를 들어 설명되는 것을 포함한다. 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리는 단계 b)의 일부일 수 있거나 또는 별개의 단계일 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 단계 b)는 산소 또는 산화제를 첨가하고, 임의로, 후속적으로 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하는 것을 포함한다. 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하는 것은 또한 단계 b) 후에 별개의 단계로서 수행될 수 있다.
단계 b)에서 산소 및/또는 산화제를 첨가하는 것은 또한 이종이량체 단백질 내의 시스테인은 디술피드 결합으로 완전히 산화되지 않으면서 환원제의 산화를 유도한다. 이 경우에, 이종이량체 단백질은 환원제로부터 분리될 수 있고, 이어서 후속적으로 이종이량체 단백질의 시스테인은 예를 들어 상기한 바와 같이 산소 및/또는 산화제의 첨가에 의해 쇄간 디술피드 결합으로 산화될 수 있다. 따라서, 단계 b)는 한 실시양태에서 단계 a)로부터 얻은 조성물을 환원제를 산화시키기 위해 충분한 산화 조건에 적용하고, 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하고, 이종이량체 단백질을 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 환원제 및 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화는 예를 들어 상기한 바와 같이 산소 및/또는 산화제를 첨가함으로써 유사하게 실시되거나 수행될 수 있다. 그러나, 환원제의 산화 및 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 위해 필요한 산소의 양, 인큐베이션 시간 등에 있어서 일부 차이가 존재할 수 있다. 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하기 위한 방법은 아래에서 설명되는 임의의 방법, 예를 들어 투석, 침전, 크로마토그래피 또는 여과를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 단계 b)는 단계 a)로부터 얻은 조성물을 크로마토그래피, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 또는 여과, 예를 들어 정용여과, 예컨대 접선 유동 여과 또는 정상 유동 여과에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 크로마토그래피 또는 여과를 수행하기 위한 방법은 아래에서 설명되는 임의의 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 단계 b)에서의 산화 조건은 이종이량체 단백질의 시스테인이, 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리와 함께 쇄간 디술피드 결합으로 산화되도록 하는 것일 수 있다. 이 경우에, 본 발명의 단계 b)는 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것과 함께 상기한 바와 같이 산소 및/또는 산화제를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하기 위한 방법 또는 조건은 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화을 유도하거나 허용할 수 있다. 따라서, 단계 b)는 한 실시양태에서 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하기 위한 방법은 아래에서 설명되는 임의의 방법, 예를 들어 투석, 침전, 크로마토그래피 또는 여과를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 단계 b)는 단계 a)로부터 얻은 조성물을 크로마토그래피, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 또는 여과, 예를 들어 정용여과, 예컨대 접선 유동 여과 또는 정상 유동 여과에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 크로마토그래피 또는 여과를 수행하기 위한 방법은 아래에서 설명되는 임의의 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하고, 후속적으로 이종이량체 단백질을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 실시양태에서, 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하는 단계는 단계 b) 전의 별개의 단계로서 간주될 수 있거나 또는 단계 b)의 일부로서 간주될 수 있다. 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하기 위한 방법은 아래에서 설명되는 임의의 방법, 예를 들어 투석, 침전, 크로마토그래피 또는 여과를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건은 상기한 바와 같이, 예를 들어 이종이량체 단백질을 포함하는 조성물에 산소 및/또는 산화제를 첨가함으로써 얻을 수 있다.
이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하기 위한 방법은 원칙적으로 이종이량체 단백질에 유해한 영향을 주지 않으면서 이들의 분리를 유도하거나 분리할 수 있는 임의의 방법일 수 있다. 그러한 방법은 투석, 침전, 크로마토그래피 또는 여과를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것은 연속 공정으로서 수행될 수 있거나 또는 배치 공정으로서 수행될 수 있다.
이종이량체 단백질을 포함하는 단계 a)로부터 얻은 조성물은 특히 용액, 예컨대 완충제일 수 있다. 이종이량체 단백질을 환원제로부터 분리하는 것은 또한 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제 또는 용액을 환원제가 없는 또 다른 완충제 또는 용액으로 교환함으로써 수행될 수 있다. 환원제의 존재를 제외하고, 완충제 또는 용액은 단계 a)로부터 얻은 조성물과 동일한 완충제 또는 용액으로 교환할 수 있거나, 또는 또 다른 완충제 또는 용액, 예컨대 후속 단계 또는 이종이량체 단백질의 최종 제제화에 적합한 완충제 또는 용액으로 교환될 수 있다. 단계 a)로부터 얻은 조성물의 용액 또는 완충제가 그로 교환되는 용액 또는 완충제는 한 실시양태에서 또한 산소, 예를 들어 용존 산소, 또는 산화제를 포함하랴. 따라서, 단계 b)에서 단계 a)로부터 얻은 조성물의 용액 또는 완충제의 교환 또는 희석은 "이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건"을 생성할 수 있다. 단계 b)에서의 산화 조건은 상기한 바와 같이 상이한 수단; 예를 들어, 산소, 또는 산화제의 첨가, 환원제의 제거 (이종이량체 단백질 및 환원제의 분리), 기계적 수단, 예를 들어 크로마토그래피 또는 여과 방법, 및/또는 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제 또는 용액의 보다 다량의 산소 또는 산화제를 포함하는 완충제 또는 용액으로의 교환에 의해 얻을 수 있다. 상기 측면에서 "보다 다량의 산소"는 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제 또는 용액에 존재하는 산소의 양에 비교되는 것으로 이해되어야 한다. 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제 또는 용액의 교환은 예를 들어 크로마토그래피 또는 여과에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 크로마토그래피 또는 여과에 의한, 단계 a)로부터 얻은 조성물의 용액, 예를 들어 완충제의 교환 단계를 포함한다.
단계 a)로부터 얻은 조성물의 용액 또는 완충제의 교환은 예를 들어 환원제가 없는 적어도 3 부피의 완충제 또는 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 원칙적으로, 교환될 수 있는 부피의 수에 대한 상한은 존재하지 않지만, 대부분의 실제적인 목적을 위해 3-12 부피의 완충제 또는 용액이 교환될 수 있고, 예컨대 4-11 부피, 또는 4-10 부피, 또는 5-10 부피, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 부피가 환원제의 농도를 적절하게 감소시키거나, 또는 환원제를 단계 a)로부터 얻은 조성물로부터 제거하기에 충분할 수 있다.
크로마토그래피 또는 여과에 의해 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것은 용액 또는 완충제의 교환, 즉 상기한 바와 같은 완충제 또는 용액 교환을 수반할 수 있다.
이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하기 위한 크로마토그래피 방법의 적합한 예는 특정 실시양태에서 결합하고 용리하기를 기초로 한 크로마토그래피 방법일 수 있다. 용어 "결합하고 용리하기" 또는 "결합 및 용리"는 다른 성분은 결합하지 않으면서 환원제 또는 이종이량체 단백질의 크로마토그래피 물질에 대한 결합을 기초로 한다. 크로마토그래피 물질에 결합하지 않는 성분은 관류 및 세척 단계에서 수집될 수 있는 반면, 결합된 물질은 칼럼으로부터 성분을 용리하기 위해 완충제 조건을 변경한 후에 따로 수집될 수 있다. 상이한 크로마토그래피 방법이 존재하고, 가장 적합한 것은 환원제 및 이종이량체 단백질의 선택에 따라 결정된다. 적합한 예는 단백질 A 및 단백질 G 크로마토그래피 (또는 다른 친화도 크로마토그래피 방식), 예를 들어 항원-결합 또는 항-이디오타입 항체, 선택된 카파 또는 람다를 기초로 한 친화도 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피, 예를 들어 히드록시아파타이트, 이온 교환, 소수성 상호작용, 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 및 친황성 (thiophilic) 흡착 크로마토그래피를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피일 수 있다. 크로마토그래피는 상기한 바와 같이 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제 또는 용액의 환원제가 없는 또 다른 완충제 또는 용액으로의 교환을 수반할 수 있다. 이것은 예를 들어 3-12 부피의 완충제 또는 용액 교환을 수반할 수 있다. 크로마토그래피 방법은 종종 배치 공정으로 수행되고, 따라서, 이종이량체 단백질 및 환원제가 크로마토그래피에 의해 분리되면, 이것은 한 실시양태에서 배치 공정으로서 수행될 수 있다.
상기한 바와 같이, 이종이량체 단백질 및 환원제는 또한 여과에 의해 분리될 수 있다. 여과 방법의 적합한 예는 정용여과이다. 본 발명자들은 정용여과 조건이, 단계 a)로부터 얻은 큰 부피의 조성물이 사용될 경우에도 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분할 수 있음을 밝혀내었다 (예를 들어, 실시예 41 참조). 따라서, 정용여과에 의한 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리는 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화와 함께 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단계 b)는 특정 실시양태에서 단계 a)로부터 얻은 조성물의 정용여과를 포함할 수 있다. 정용여과는 상기한 바와 같이 적어도 3 부피의 완충제 또는 용액 교환을 수반할 수 있다. 정용여과의 방법은 접선 유동 여과 (TFF) 및 정상 유동 여과 (NFF)를 포함하고, 이 둘은 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. TFF 및 NFF 둘 모두는 연속 공정 또는 배치 공정으로서 수행될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 단계 b)는 단계 a)로부터 얻은 조성물을 다음 방법 중의 하나에 적용하는 것을 포함한다: 연속적인 TFF, 배치 TFF, 연속적인 NFF 또는 배치 NFF.
상이한 정용여과 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 목적에서, 정용여과는 예를 들어, 10-50 kDa 범위, 예를 들어 20-40 kDa, 예컨대 약 30 kDa의 컷오프 (cut-off) 값을 갖는 막을 사용하여 수행할 수 있다. 막은 예를 들어, 폴리에테르술폰 (PES), 변형 폴리에테르술폰 (mPES), 재생 셀룰로스 (RC), 셀룰로스 트리아세테이트 (CTA), 친수화 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 니트로셀룰로스 또는 나일론과 같은 물질로 제조될 수 있다. 막의 입체형상은 예를 들어, 중공 섬유 (hollow fiber), 평평한 시트 (sheet) 또는 나선형으로 감긴 형상일 수 있다.
한 실시양태에서, 중공 카트리지 (cartridge), 예컨대 섬유 카트리지를 정용여과를 위해 사용할 수 있다. 중공 카트리지의 표면적은 정용여과의 속도에 영향을 끼치고, 즉, 표면적이 클수록 정용여과의 속도가 더 빠르다. 정용여과의 속도는 예를 들어 L/시간으로서 측정할 수 있다. 표면적은 0.05-1 m2 범위, 예를 들어 0.05-0.5 m2 범위, 예컨대 약 0.1 m2, 또는 약 0.16 m2, 또는 약 0.4 m2일 수 있다.
카트리지 주입구 압력은 10-40 psig (70-280 kPa) 범위, 바람직하게는 20-30 psig (140-210 kPa) 범위일 수 있다.
용어 "psig"는 대기압 초과의 제곱인치당 파운드를 나타내고, 단위 Pa (파스칼 (Pascal))에 대한 상관성은 101,325 Pa = 14.7 psig이다.
용어 "PSI"는 제곱인치당 파운드를 의미한다.
정용여과는 관련 수의 부피의 완충제/용액 교환을 수행하기 위해 필요한 시간 동안 수행할 수 있다. 적합한 시간은 예를 들어, 정용여과 공정에서 막의 표면적, 막의 종류, 이종이량체 단백질의 농도, 시스템 압력, 순환 속도, 필터 카트리지의 기하학, 온도, 용액의 점도, 여과할 부피, 용액에 의해 야기된 필터 오염 (fouling)의 양에 따라 결정된다. 대개, 정용여과는 30분 내지 20시간 동안 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 정용여과는 조성물을 1 내지 7, 예컨대 3 내지 7, 또는 5 내지 7, 또는 7 부피의 완충제 교환이 일어날 때까지, 10-50 kDa 범위의 컷오프 값을 갖고 표면적이 0.05-1 m2 범위이고 70-280 kPa 범위의 카트리지 주입구 압력을 갖는 중공 섬유 카트리지를 통해 순환시킴으로써 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 정용여과는 조성물을 5 내지 7, 예컨대 칠 (7) 부피의 완충제 교환이 일어날 때까지, 25 ml/min의 투과액 유동을 일으키는 25 PSI (170 kPa)의 카트리지 주입구 압력을 갖고 0.1 m2의 표면적을 갖는 30 kDa 변형 폴리에테르술폰 중공 섬유 카트리지를 통해 순환시킴으로써 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 정용여과는 조성물을 5 내지 7, 예컨대 칠 (7) 부피의 완충제 교환이 일어날 때까지, 100 ml/min의 투과액 유동을 일으키는 25 PSI (170 kPa)의 카트리지 주입구 압력을 갖고 0.4 m2의 표면적을 갖는 30 kDa 변형 폴리에테르술폰 중공 섬유 카트리지를 통해 순환시킴으로써 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 정용여과는 조성물을 5 내지 7, 예컨대 칠 (7) 부피의 완충제 교환이 일어날 때까지, 100 ml/min의 투과액 유동을 일으키는 25 PSI (170 kPa)의 카트리지 주입구 압력을 갖고 0.16 m2의 표면적을 갖는 30 kDa 변형 폴리에테르술폰 중공 섬유 카트리지를 통해 순환시킴으로써 수행할 수 있다.
여과를 연속 공정으로서 수행하는 것은 일반적으로 완충제 또는 용액을 투과액을 제거하는 것과 동일한 속도로 시스템에 첨가하여, 시스템 내의 용액/완충제의 양을 일정하게 유지하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 측면에서, 이것은 단계 b)에서, 완충제/용액이 투과액이 제거되는 것과 동일한 속도로 단계 a)로부터 얻은 조성물에 첨가되는 것을 의미할 것이다. 이종이량체 단백질은 보유물 (retentate)로부터 수집할 수 있다. 한편, 본 발명의 방법에서 크로마토그래피 또는 여과를 배치 공정으로서 수행하는 것은 대개 단계 a)로부터 얻은 조성물의 용액을 제거하면서 단계 a)로부터 얻은 조성물 내에 존재하는 이종이량체 단백질을 농축하는 것을 포함한다. 별법으로, 이종이량체 단백질을 포함하는 단계 a)로부터 얻은 조성물을 희석하고 크로마토그래피 또는 여과에 의해 후속적으로 농축시킬 수 있다. 농축시킨 이종이량체 단백질은 공정이 1회 초과로 수행되면 후속적으로 완충제 또는 용액 내에 다시 희석시킨 후, 크로마토그래피 또는 여과 단계를 반복할 수 있다.
한 실시양태에서, 환원제 및 이종이량체 단백질을 분리하기 전에 단계 a)로부터 얻은 조성물을 희석할 수 있다.
한 실시양태에서, 크로마토그래피 또는 여과, 예를 들어 정용여과에 의해 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것은 단 1회 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피 또는 여과에 의해 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것은 예를 들어, 그 사이에 상이한 단계를 가지면서 2회 이상 반복할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 I)-III)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서 본 발명의 단계 b)는 단계 I)-III)을 포함할 수 있다:
I) 단계 a)로부터 얻은 조성물의 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 단계,
II) 이종이량체 단백질을 포함하는 단계 I)로부터 얻은 조성물을 인큐베이션하는 단계,
III) 단계 II)로부터 얻은 조성물의 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 단계.
이종이량체 단백질 및 환원제의 분리는 단계 I)에서 완료되지 않을 수 있고, 따라서, 단계 I)로부터 얻은 이종이량체 단백질을 포함하는 조성물은 여전히 환원제를 포함할 수 있다.
단계 I) 및 III)에서 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것은 상기 설명된 것과 같이 본원에 설명된 방법에 의해 수행할 수 있다. 이것은 특히 정용여과에 의해 수행할 수 있다. 상기 설명된 크로마토그래피 및 여과의 조건이 또한 단계 I) 및 III)에 적용된다. 단계 II)에서, 단계 I)로부터 얻은 이종이량체 단백질을 인큐베이션하는 것은 예를 들어 1시간 내지 10일, 또는 1시간 내지 5일, 또는 1시간 내지 3일, 또는 1시간 내지 48시간, 예컨대 5-24시간, 또는 8-18시간 동안 10-45℃, 예를 들어 15-40℃, 또는 15-35℃, 또는 20-40℃, 또는 20-35℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 단계 II)에서, 단계 I)로부터 얻은 이종이량체 단백질을 인큐베이션하는 것은 1 내지 24시간 동안 15-40℃의 온도에서 수행할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 단계 I)은 단계 a)로부터 얻은 조성물의 정용여과를 포함할 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 I), II) 및 III)은 다음을 포함할 수 있다:
I) 단계 a)로부터 얻은 조성물의 정용여과 단계,
II) 단계 I)로부터 얻은 보유물의 인큐베이션 단계,
III) 단계 II)로부터 얻은 조성물의 정용여과 단계.
추가의 실시양태에서, 단계 I) 및/또는 III)에서 정용여과는 완충제 교환, 예컨대 3-12 부피 범위의 완충제 교환을 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 단계 II)는 15-35℃ 범위의 온도에서 12-48시간 동안의 인큐베이션을 포함한다.
실시예 45에 제시되는 바와 같이, 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리를 반복하는 것은 몇몇 조건에 대해, 예를 들어 단계 a)에서의 환원 조건에 따라 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 완전한 재-산화의 보장을 돕고/돕거나 이종이량체 단백질을 포함하는 조성물 내의 환원제의 양을 추가로 최소화한다.
본 발명자들은 또한 금속 킬레이팅제인 EDTA의 존재 (실시예 49 참조)가 동종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화 속도를 감소시킴을 발견하였고, 여기서 동종이량체 단백질은 이종이량체 단백질의 예로서 사용된다. 유사한 현상이 이종이량체 단백질에서 관찰되었다 (실시예 54). 이것은 단계 b)에서 금속 이온의 존재가 적어도 금속 이온이 존재하지 않는 상황에 비해 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화 속도를 증가시킴을 나타낸다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 b), 예를 들어 단계 b)에서의 산화 조건은 금속 이온을 포함할 수 있다. 금속 이온은 단계 b)에서, 단계 a)로부터 얻은 조성물에 첨가할 수 있거나, 또는 예를 들어 단계 a)에서 완충제 또는 용액의 선택에 의해 단계 a)로부터 얻은 조성물 내에 존재할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 단계 b)에서의 산화 조건은 금속 이온의 첨가를 포함한다. 금속 이온이 단계 a)로부터 얻은 조성물 내에 이미 존재하는 경우에도, 특히 금속 이온의 농도가 너무 낮아서 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 위한 속도-제한 인자가 되거나 또는 금속 킬레이팅제가 존재하면, 추가의 금속 이온이 단계 b)에 또는 이 단계 동안 첨가될 수 있다. 적합한 금속 이온의 예는 특히 2가 전이 금속 이온, 예컨대 구리, 예를 들어 황산구리의 형태, 망가니즈, 철, 니켈, 마그네슘 및 코발트이다. 금속 이온은 적합하게는 0.01-100 ppm, 또는 0.1-100 μM의 농도로 존재하거나 첨가될 수 있다. 구리는 단계 b)에 예를 들어 황산구리로서 첨가될 수 있다.
2가 전이 금속, 예를 들어 구리, 예를 들어 황산구리 형태는 특히 금속 킬레이팅제가 방법의 단계 a)에 존재할 경우에 첨가될 수 있다. 황산구리는 산소를 사용한 산화를 위한 촉매로서 기능할 수 있다.
본 발명자들은 또한 단계 b)에서 산화환원 전위가 특히 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 재-산화의 속도에 영향을 주지만, 또한 그 수율에도 어느 정도 영향을 줌을 밝혀내었다. 본 발명자들은 중쇄 사이의 쇄간 디술피드 결합의 재-산화가 대략 -350 mV에서 시작하고, 중쇄와 경쇄 사이의 쇄간 결합은 대략 -280 mV에서 시작함을 밝혀내었다. 이종이량체 단백질 내의 모든 디술피드 결합의 완전한 형성은 일반적으로 -50 mV보다 높을 때 발생하지만, 최적 공정의 활기를 위해 산화환원 전위는 바람직하게는 적어도 50 mV이어야 한다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 b)에서 산화환원 전위는 -300 mV 초과, 예컨대 -280 mV 초과, 또는 -75 mV 초과, 또는 -50 mV 초과, 또는 0 mV 초과, 또는 25 mV 초과, 또는 50 mV 초과일 수 있다. 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 디술피드 결합으로의 산화를 위해, 이것은 관련 산화환원 전위의 하한이다. 단계 b)에서 산화환원 전위의 상한은 약 100-300 mV, 예를 들어 100-200 mV, 예컨대 약 100 mV, 또는 약 200 mV 또는 약 250 mV, 또는 약 300 mV일 수 있다. 따라서, 단계 b)의 산화환원 전위는 -300 mV 내지 300 mV, 또는 -300 mV 내지 200 mV 범위, 또는 -280 mV 내지 300 mV, 또는 -280 mV 내지 200 mV 범위, 또는 -75 mV 내지 300 mV, 또는 -75 mV 내지 200 mV 범위, 또는 -50 mV 내지 300 mV, 또는 -50 mV 내지 200 mV 범위, 또는 0 mV 내지 300 mV, 또는 0 mV 내지 200 mV 범위, 또는 25 mV 내지 300 mV, 또는 25 mV 내지 200 mV 범위, 또는 50 mV 내지 300 mV, 또는 50 mV 내지 200 mV 범위일 수 있다.
본 발명자들은 또한 단계 a)로부터 얻은 조성물이 용액인 실시양태에서, 단계 b)에서 pH는 또한 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 디술피드 결합으로의 산화에 영향을 줌을 밝혀내었다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 단계 b)에서 pH는 특정 실시양태에서 pH 6-8.5 범위, 예컨대 pH 6.5-8 범위, 또는 pH 6.5-8.5 범위, 또는 pH 6-8 범위, 또는 pH 6.5-7.5 범위, 또는 pH 7-7.5 범위, 예를 들어 약 pH 7.4일 수 있다.
단계 b)에서 조성물의 pH가 특정 범위, 예를 들어 pH 6-8.5가 되도록 보장하는 것은 예를 들어 단계 a)에서 적합한 pH를 갖는 용액 또는 완충제를 선택함으로써, 또는 단계 b)에서 pH를 조정할 수 있는 성분, 예를 들어 농축된 pH 조정 용액을 조성물에 첨가함으로써 수행할 수 있다. 단계 b)에서 조성물의 pH가 특정 범위 내가 되도록 보장하는 것은 또한 교환되는 완충제 또는 용액이 관련 범위 내의 pH를 포함하도록 완충제 교환을 포함하는 상기 설명된 방법 중의 하나를 사용함으로써 수행할 수 있다.
예를 들어 단계 a)로부터 얻은 조성물이 예를 들어 정용여과에 의해 변경되는 단계 b)의 완충제 또는 용액은 본원에서 설명되는 임의의 것, 예컨대 실시예에서 설명되는 임의의 것을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 상기 완충제의 예는 예를 들어 PBS (포스페이트 완충 염수), PBS, pH 7.4를 포함한다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질 내의 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원의 진행 후에, 산화환원 전위 모니터링 및/또는 용존 산소의 농도 모니터링이 수행될 수 있다. 상기 모니터링을 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 상이한 종류의 프로브, 예를 들어 실시예 44에 기재된 프로브 중의 하나의 사용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 80% 초과, 예컨대 90% 초과, 예를 들어 95% 초과, 예컨대 99% 초과의 항체 분자가 목적하는 이중특이적 항체인 항체 생성물을 생성한다.
본원에 기재된 생산후 공정은 공발현에 기초한 방법에 비해 보다 가변적이고 제어가 더 쉽다.
정제
본 발명의 방법이 종종 높은 수율의 이종이량체 단백질을 생성하지만, 잔류량의 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 또한 본 발명의 방법에 의해 얻은 생성물 또는 조성물에 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 생성물은 또한 방법 동안 존재하는 환원제 및/또는 다른 성분, 예컨대 완충제 또는 염을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 최종 생성물에 존재하지 않도록 상기 성분을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
상기한 바와 같이, 환원제, 완충제 성분, 또는 염은 일부 실시양태에서, 본 발명의 단계 b)에서 제거될 수 있다. 이들 성분의 제거는 본 방법과 별개의 방법으로서 또는 환원제의 제거와 동시에 예를 들어, 상기 설명된 임의의 방법, 예컨대 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제의 교환을 수반한 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다.
따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 이종이량체 단백질의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이종이량체 단백질의 정제는 c) 이종이량체 단백질을 얻는 단계로서 간주할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 단계 c)는 단계 b)로부터 얻은 조성물을 정제 방법에 적용하는 것을 포함한다.
적합한 정제 방법의 예는 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피 (또는 다른 친화도 크로마토그래피 방식), 예를 들어 항원-결합 또는 항-이디오타입 항체를 기초로 한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 선택된 카파 또는 람다, 황친화도, 혼합된 방식 크로마토그래피, 예를 들어 히드록시아파타이트, 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 또는 친황성 흡착 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 정제 방법은 예를 들어 정제된 단백질을 얻기 위해 염 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 침전을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상이한 정제 방법들의 조합이 또한 고려된다.
이종이량체 단백질을 정제의 단계 또는 정제 방법에 적용하는 것은 이종이량체 단백질의 임의의 종류의 정제, 예컨대 잔류량의 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질을 분리하거나, 다른 성분, 예를 들어 환원제, 염 또는 완충제 또는 다른 생성물- 또는 공정-관련 불순물로부터 이종이량체 단백질을 분리하는 것을 나타낸다.
잔류량의 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질의 정제 또는 분리는 이종이량체 단백질이 제1 및 제2 동종이량체 단백질과 매우 유사한 것 때문에 복잡해질 수 있다. 따라서, 잔류량의 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질의 분리는 존재하는 다른 성분, 예를 들어 환원제, 완충제 또는 염으로부터 이종이량체 단백질의 분리보다 더 어려울 수 있다.
본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 제1 또는 제2 동종이량체 단백질 중 어느 하나의 양이 이종이량체 단백질의 형성에 관하여 제한되도록 수행할 수 있다. 그러한 방법의 예는 스티어드 비-등몰 교환 과정 (SNEEP)으로 공지되어 있다. 따라서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질 중 어느 하나는 단계 a)에서 다른 동종이량체 단백질의 과량으로 존재할 수 있다. 단계 a)에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 비는 특히 제한된 동종이량체 단백질이 단계 a)에서 완전히 사용되도록 하기 위해 다른 것에 비해 과량의 또는 제한된 양의 하나의 동종이량체 단백질을 포함함으로써 조정할 수 있다. 이것은 이종이량체 단백질을 제1 및 제2 동종이량체 단백질 둘 모두가 아니라, 잔류량의 제1 및 제2 동종이량체 단백질 중 단지 하나와 함께 포함하는 조성물, 즉, 단계 a)로부터 얻은 조성물을 생산시킨다. 따라서, 이종이량체 단백질을 둘 모두로부터가 아니라 단지 제1 또는 제2 동종이량체 단백질 중 어느 하나로부터 분리해야 하므로, 잔류 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질의 후속적인 정제는 보다 쉬워진다.
따라서, 한 실시양태에서, 제1 동종이량체 단백질은 단계 a)에서 제2 동종이량체 단백질보다 과량으로 존재하거나, 또는 그 반대이다. 제1 동종이량체 단백질 대 제2 동종이량체 단백질의 비는 특히 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.
추가의 실시양태에서, 방법을 과량의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질 중 어느 하나를 사용하여 수행하는 것은 등용매 용리의 정제 단계와 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 방법을 과량의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질 중 어느 하나를 사용하여 수행하는 것은 과량으로 사용된 동종이량체에 결합하는 항원-결합 또는 항-이디오타입 항체를 기초로 한 정제 단계와 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질의 정제 또는 분리는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 차이에 기반한 방법에 의해 수행할 수 있다. 그러한 방법은 서로로부터 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 분리를 용이하게 할 수 있고, 또한 방법에 따라, 이종이량체 단백질로부터 동종이량체 단백질의 분리를 용이하게 할 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 차이에 기반한 그러한 정제 또는 분리 방법의 예는 제1 또는 제2 동종이량체 단백질 중 어느 하가가 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하지 않는, 또는 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 상이한 경쇄, 예를 들어 카파 및 람다 경쇄를 포함하는, 또는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역이 상이한 동종이형을 포함하는 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그러한 방법은 이종이량체 단백질로부터 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 분리를 용이하게 한다. 추가의 실시양태에서, 이것은 등용매 용리의 정제 단계와 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 차이를 기초로 한 정제 또는 분리 방법은 상기한 바와 같이 과량의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 사용과 조합될 수 있다. 이어서, 잔류 동종이량체로부터 이종이량체 단백질의 후속적인 정제 또는 분리는 이종이량체 단백질이, 제한되는 양으로 사용된 동종이량체로부터의 Fc 영역을 포함함으로써 잔류 동종이량체와 상이하기 때문에 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 차이를 이용할 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G, 또는 단백질 A와 G의 조합물에 결합하지 않도록 조작되거나 변형될 수 있다. 이어서, 적어도 하나의 제1 및 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질의 정제 또는 분리는 단백질 A 또는 단백질 G 결합에 대해 변형되지 않은 이종이량체 단백질 및 동종이량체 단백질만이 그에 대해 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 상에 통과시킴으로써 수행할 수 있다. 이것은 이종이량체 단백질로부터 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하지 않은 동종이량체 단백질의 분리를 용이하게 한다. 제1 동종이량체 단백질이 단백질 A에 결합하지 않고 제2 동종이량체 단백질이 단백질 G에 결합하지 않거나, 또는 그 반대이면; 이종이량체 단백질은 이종이량체 단백질을 포함하는 조성물을 단백질 A 및 단백질 G 물질 상에 통과시킴으로써 제1 및 제2 동종이량체 단백질로부터 분리될 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 단백질 A 및/또는 단백질 G에 결합하지 않도록 변형될 수 있다. 이것은 또한 환원제를 이종이량체 단백질로부터 분리하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 바와 같은 다른 정제 방법과 조합될 수 있다.
단계 a)에서 단백질 A, 또는 단백질 G, 또는 단백질 A 및 단백질 G에 결합하지 않도록 변형된 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 사용하는 것은 단계 a)에서 다른 동종이량체 단백질에 비해 과량의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질이 사용되는 실시양태에서 특히 유용할 수 있다. 상기 실시양태에서, 상기 수지에 결합하는 그의 능력을 상실하도록 과량으로 사용될 동종이량체 단백질의 단백질 A 또는 단백질 G 결합 부위를 조작 또는 변형하는 것이 유용할 수 있다. 상기 종류의 변형은 본원에 참고로 포함된 WO 2010/151792에 개시된 CH3 도메인의 변형을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 IgG의 단백질 A에 대한 결합을 감소시키거나 제거하는, WO 2010/151792에 기재된 CH3 도메인의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 a) 435R 및 b) 435R 및 436F로 이루어지고 이로 제한되지 않는 군 중에서 선택되는 변형을 포함할 수 있다. 별법으로, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 단백질 A에 대한 결합을 제거하는 다음 돌연변이를 포함할 수 있다: I253A, H310A, 및 H435A. 이어서, 이종이량체 단백질은 단백질 A 칼럼 통과에 의해 과잉의 비교환된 동종이량체 단백질로부터 분리될 수 있다. 이것은 본원에 설명되는 다른 정제 방법과 조합될 수 있다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질이 경쇄를 포함하는 또 다른 실시양태에서, 단계 a)에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 경쇄는 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 동종이량체 단백질은 카파 경쇄를 포함할 수 있고, 제2 동종이량체 단백질은 람다 경쇄를 포함할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 카파 또는 람다 경쇄만이 결합할 수 있는 칼럼 크로마토그래피에 적합한 물질 또는 수지가, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질의 정제 또는 분리를 위해 사용될 수 있다. 상기 물질 또는 수지의 예는 예를 들어 지이 헬쓰케어 라이프 싸이언시스 (GE Healthcare Life Sciences)의 KappaSelect 및 LambdaFabSelect로 알려진 친화도 매질을 포함한다. 상이한 경쇄, 예를 들어 카파 및 람다 경쇄를 포함하는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 사용은 단계 a)에서 과량의 동종이량체 단백질 중의 하나의 사용과 조합될 수 있다. 예를 들어, 단계 a)는 카파 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체 단백질 및 람다 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체 단백질을 사용하여 수행할 수 있고, 여기서 제1 동종이량체 단백질은 제2 동종이량체 단백질의 과량으로 존재하거나, 또는 과량으로 사용되는 것이 카파 경쇄 또는 람다 경쇄를 포함하는 동종이량체 단백질인지에 관하여 그 반대로 존재한다. 이어서, 단계 c)는 이종이량체 단백질을 람다 경쇄만이 결합할 수 있는 칼럼 위로 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 단계 c)는 카파 경쇄를 포함하는 잔류 제1 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질을 분리시킨다. 이와 유사하게, 단계 a)에서 과량으로 사용되는 것이 람다 경쇄를 포함하는 동종이량체인 경우에, 단계 c)는 이종이량체 단백질을 카파 경쇄만이 결합하는 칼럼 위로 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 이것은 본원에 기재된 것과 같은 다른 정제 방법과 조합될 수 있다.
별법으로, 상이한 물질에 대한 카파 경쇄 또는 람다 경쇄의 결합의 차이에 기초한 이종이량체 단백질의 정제 또는 분리는 또한 동종이량체 단백질 중 어느 하나를 과량으로 사용하지 않으면서 수행할 수 있다. 상기 실시양태에서, 단계 c)는 이종이량체 단백질을 카파 경쇄가 결합하는 물질 위로, 후속적으로 람다 경쇄가 결합하는 물질 위로, 또는 그 반대로 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 카파 또는 람다 경쇄 중 어느 하나를 포함하는 반면 이종이량체 단백질은 카파 및 람다 경쇄를 둘 모두 포함하므로, 그에 의해 이종이량체 단백질은 제1 및 제2 동종이량체 단백질로부터 분리될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 것과 같은 다른 정제 방법과 조합될 수 있다.
제1 및 제2 동종이량체 단백질이 상이한 경쇄, 예를 들어 카파 및 람다 경쇄를 포함하고, 동종이량체 단백질 중 하나가 과량으로 사용되는 방법에 의해 생산된 이종이량체 단백질을 그를 비-과량으로 사용된 동종이량체 단백질의 경쇄가 결합하는 물질 위로 통과시킴으로써 정제하는 것은 본 발명 이외의 다른 이종이량체 단백질 생산 방법, 예를 들어 숙주 세포 내에서 중쇄 및 경쇄의 공발현에 기반한 방법 또는 다른 방법에 적용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 불변 영역은 상이한 동종이형의 것일 수 있다. 동종이형은 집단 내에서 천연적으로 발견되는 아미노산 서열의 변이이다. 예를 들어, 인간 IgG1 중쇄의 상이한 동종이형, 즉 G1m(f) [또한, G1m(3)으로도 언급됨], G1m(z) [G1m(17)로도 언급됨], G1m(a) [G1m(1)로도 언급됨] 및 G1m(x) [G1m(2)로도 언급됨]이 공지되어 있다 (문헌 [Jefferis, R., mAbs 2009; 1:4, 1-7]). 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 불변 영역은 상이한 동종이형일 수 있고; 예를 들어, 이들은 IgG1 이소형일 수 있고, 제1 동종이량체 단백질의 불변 영역은 예를 들어 IgG1m(za) [= IgG1m(1,17)] 또는 IgG1m(zax) [= IgG1m(1,2,17)] 동종이형일 수 있고, 제2 동종이량체 단백질의 불변 영역은 예를 들어 IgG1m(f) [= IgG1m(3)] 또는 IgG1m(fa) [= IgG1m(1,3)] 동종이형일 수 있다. 이와 유사하게, 카파 및 람다 경쇄가 사용되는 상기 설명된 실시양태처럼, 상이한 동종이형의 불변 영역을 포함하는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 사용은 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 단계 a)에서 과량으로 사용하는 것과 조합될 수 있다. 이어서, 상기 실시양태에서, 단계 c)는 이종이량체 단백질을, 과량으로 사용되지 않은 동종이량체 단백질 내에 존재하는 동종이형이 결합하는 물질, 예를 들어 동종이형-특이적 항체로 코팅된 비드 상에 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 이에 의해, 이종이량체 단백질은 단계 a)에서 과량으로 사용된 동종이량체 단백질로부터 정제될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 것과 같은 다른 정제 방법과 조합될 수 있다.
대체 실시양태에서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 비는 단계 a)에서 조정되지 않았고, 따라서 제1 또는 제2 동종이량체 단백질은 단계 a)에서 완전히 사용되지 않고, 이종이량체 단백질, 제1 및 제2 동종이량체 단백질을 포함하는 조성물의 생산을 유도하였다. 상기 실시양태에서, 단계 c)는 이종이량체 단백질을 동종이형 중 하나가 결합하는 물질 위로, 후속적으로 다른 동종이형이 결합하는 또 다른 물질 위로 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 이것은 본원에 기재된 것과 같은 다른 정제 방법과 조합될 수 있다.
동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질의 분리와 조합된, 상이한 동종이형의 Fc 영역을 포함하는 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 사용은 또한 본 발명 중의 하나보다 이종이량체 단백질을 생산하는 다른 방법에 적용될 수 있다. 그러한 방법은 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 과량으로 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 방법의 예는 동일한 숙주 세포에서 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 공발현을 기초로 한 것을 포함한다.
C-말단 리신
중쇄로부터 카르복시펩티다제에 의한 C-말단 리신의 제거는 포유동물 세포 내에서 항체의 재조합 발현 시에, 및 인간 혈청에서 생체내에서 모두 흔히 관찰되는 항체 변형이다 (문헌 [Cai et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. Sep 9]). 제거는 종종 부분적이어서, 0개 (K0), 1개 (K1) 또는 2개 (K2)의 C-말단 리신을 갖는 항체들의 혼합된 집단을 생성한다. 특히, B-세포 하이브리도마는 K0, K1 및 K2 분자의 혼합물을 생산한다 (문헌 [Dick et al. (2008) Biotech. Bioeng. 100: 1132]).
한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 이종이량체 단백질, 예를 들어 이중특이적 항체의 C-말단 리신은 제거될 수 있다. 용어 "C-말단 리신 잔기"는 CH3 영역의 C-말단, 예를 들어 항체의 중쇄의 C-말단에서 리신 잔기를 나타내고, 이것은 IgG1 내에서 위치 447이다.
C-말단 리신이 가질 수 있는 다양한 효과 외에, C-말단 리신의 제거는 이종이량체 단백질, 예를 들어 이종이량체 단백질의 하나 초과의 분자를 포함하는 조성물 또는 집단을 생성시키고, 이것은 C-말단 리신의 존재에 관하여 보다 균질이다.
따라서, 추가의 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 C-말단 리신을 함유하지 않는다.
C-말단 리신은 C-말단 리신을 함유하지 않도록 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 조작함으로써, 또는 예를 들어 효소 촉매 작용에 의해 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 C-말단 리신을 제거함으로써 또는, 예컨대 효소 촉매 작용에 의해 이종이량체 단백질로부터 C-말단 리신을 제거함으로써 제거될 수 있다.
따라서, 추가의 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 예를 들어 중쇄 내에 C-말단 리신을 함유하지 않도록 유전자 변형된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 예를 들어 카르복시펩티다제와 함께 인큐베이션함으로써, 예를 들어 중쇄로부터 C-말단 리신을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 C-말단 리신을 함유하지 않도록 조작될 경우, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은
i) 제1 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린의 Fc 영역, 및/또는 제2 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 구축물을 제공하고, 상기 구축물은 상기 제1 및/또는 제2 CH3 영역의 C-말단에서 리신 잔기를 코딩하지 않고,
ii) 상기 뉴클레오티드 구축물을 숙주 세포 내에서 발현시키고,
iii) 상기 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 상기 숙주 세포의 세포 배양액으로부터 회수함으로써 생산될 수 있다.
한 실시양태에서 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질은 대부분의 실시양태에서 또한 경쇄를 포함하는 항체일 수 있고, 따라서 상기 숙주 세포는 동일한 또는 상이한 벡터 상에서 경쇄-코딩 구축물을 추가로 발현할 수 있다.
뉴클레오티드 구축물의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
유사하게, 숙주 세포 내에서 뉴클레오티드 구축물의 발현을 위한 방법도 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 상기 방법의 추가의 실시양태에서, 단계 i)에서 제공된 뉴클레오티드 구축물은 C-말단 리신 잔기에 대한 코돈을 갖는 원래의 중쇄 서열로부터 유래되거나 이를 기초로 하여 설계된다. 따라서, 상기 뉴클레오티드 구축물은 상기 원래의 중쇄 서열에 비해 C-말단 리신 잔기에 대한 코돈의 결실을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, C-말단 리신 잔기는 예를 들어, 효소 절단에 의해 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 제거될 수 있다. 따라서, C-말단 리신은 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 생산된 후에 이들로부터 제거될 수 있다. C-말단 리신의 효소에 의한 제거 방법은 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 카르복시펩티다제와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 따라서, 예를 들어 중쇄로부터 C-말단 리신을 제거하는 단계는 단계 a) 전에 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 한 실시양태에서 단계 a) 전에 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 카르복시펩티다제에 적용하는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
이와 유사하게, C-말단 리신은 이종이량체 단백질로부터 제거될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 a) 후에, 이종이량체 단백질을 카르복시펩티다제에 적용하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계는 단계 a) 및 단계 b) 사이에 있을 수 있거나, 단계 b) 후에 있을 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 예를 들어 중쇄로부터 C-말단 리신을 제거하는 단계는 단계 a) 후에 수행할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 중쇄로부터 C-말단 리신을 제거하는 단계는 단계 b) 후에 수행할 수 있다. 원칙적으로, 본 발명의 방법은 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질 및 이종이량체 단백질 둘 모두를 카르복시펩티다제에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 대부분의 목적을 위해, C-말단 리신을 제거하기 위해 상기 언급된 단계 중 하나를 포함하는 것이 충분할 것이다. 적합한 카르복시펩티다제의 예는 카르복시펩티다제 B 또는 카르복시펩티다제 N (문헌 [Cai et al. Biotechnol. Bioeng. Sep 9 (2010), 상기 문헌])을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 카르복시펩티다제 처리를 위한 적합한 조건은 당업자에게 공지되어 있다. C-말단 리신을 제거하기 위한 또 다른 방법은 카르복시펩티다제를 발현하는 숙주 세포에서 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 발현하는 것이다. 또한, 카르복시펩티다제가 활성인 온도에서 충분한 시간 동안 숙주 세포 배양 배지에 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 두면, C-말단 리신의 제거가 유도될 것이다 (문헌 [Luo JL, Ahang J, Ren D, Tsai W-L, Li F (2102) Probing of C-Terminal Lysine Variation in a Recombinant Monoclonal Antibody Production Using Chinese Hamster Ovary Cells with Chemically Defined Media. Biotechnol. Bioeng. 109: 2306-2315]).
핵산 서열
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 방법과 관련하여 상기 설명된 것 중 임의의 것일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 코딩하는 발현 벡터에 관한 것이다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
발현 벡터는 본 발명의 측면에서 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터 (적합한 세트의 발현 제어 요소를 포함하는 핵산 서열)를 비롯한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 그러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 세균 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어 선형 발현 요소 (예를 들어 문헌 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)]에 설명된 바와 같은 것)를 포함하는 네이키드 (naked) DNA 또는 RNA 벡터, 압축된 (compacted) 핵산 벡터 (예를 들어 US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 설명된 바와 같은 것), 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "미지 (midge)" 최소 크기 핵산 벡터 (예를 들어 문헌 [Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)]에 설명된 바와 같은 것), 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaPO4-침전된 구축물 (예를 들어 WO 00/46147, [Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986)], [Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)], 및 [Coraro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)]에 설명된 바와 같은 것)에 포함될 수 있다. 그러한 핵산 벡터 및 그의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).
한 실시양태에서, 벡터는 세균 세포 내에서의 발현을 위해 적합하다. 그러한 벡터의 예는 발현 벡터, 예컨대 블루스크립트 (BlueScript) (스트라타젠 (Stratagene)), pIN 벡터 (문헌 [Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)]), pET 벡터 (노바겐 (Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨)) 등)를 포함한다.
발현 벡터는 또한, 또는 별법으로 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 예를 들어 구성적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터를 포함한다 (문헌 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)], 및 [Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)]에서 검토됨).
발현 벡터는 또한, 또는 별법으로 포유동물 세포에서 발현하기 적합한 벡터, 예를 들어 선택가능 마커로서 글루타민 합성효소를 포함하는 벡터, 예컨대 문헌 [Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10: 169-175]에 기재된 벡터일 수 있다.
핵산 및/또는 벡터는 또한 폴리펩티드, 예컨대 신생 폴리펩티드 쇄을 원형질막 주위공간으로 또는 세포 배양 배지 내로 표적화할 수 있는 분비/국재화 (localization) 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 서열은 당업계에 공지되어 있고, 분비 리더 또는 신호 펩티드를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터에서, C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현-촉진 요소를 포함하거나 이와 연합될 수 있다. 상기 요소의 예는 강력한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 및 RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리 (A) 종결 서열, 이. 콜라이 (E. coli)에서 플라스미드 생성물을 위한 복제 기점, 선택가능 마커로서의 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)를 포함한다. 핵산은 또한 CMV IE와 같은 구성적 프로모터에 반대되는 유도성 프로모터를 또한 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물 내에 배치되고/되거나 전달될 수 있다.
또한 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 규정되는 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마에 관한 것이다. 숙주 세포의 예는 효모, 세균 및 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 또는 HEK 세포를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 세포 게놈 내로 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는, 비-통합된 핵산, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 또한 추가의 측면에서, 본 발명은 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물에 관한 것이고, 여기서 동물 또는 식물은 본 발명의 C-말단 리신을 포함하지 않는 본 발명의 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 생산한다.
이종이량체 단백질
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻은 이종이량체 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 방법에 따르면 비대칭 분자, 각각의 Fab-아암 상에 또는 각각의 CH3 도메인 상에 상이한 특징을 갖는 분자 또는 분자 전체에 걸쳐 별개의 변형을 갖는 분자, 예를 들어 접합을 위한 비천연 아미노산 치환(들)을 갖는 분자의 형성이 가능하다. 그러한 비대칭 분자는 임의의 적합한 조합으로 생성될 수 있다. 이것은 몇몇의 비-제한적인 예에 의해 아래에서 추가로 예시된다.
이중특이적 항체는 영상화 또는 면역치료제를 종양 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는 관심있는 표적 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, 이중특이적 분자의 제1 Fab-아암은 종양 세포, 예컨대 종양 세포 표면 단백질 또는 종양 세포 표면 탄수화물, 예컨대 본원에서 제시되는 종양 세포 표면 단백질의 하나에 결합하고, 제2 Fab-아암은 펩티드 또는 합텐에 커플링된 또는 연결된 (킬레이터를 통해) 방사성 표지를 포함하고 이로 제한되지 않는 방사성 이펙터 분자를 인식한다. 상기 방사성 표지된 펩티드의 예는 인듐-표지된 디에틸렌트리아민펜타아세트산이다 (문헌 [anti-DTPA(In) van Schaijk et al. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 7230s-7126s]). 또 다른 예는 합텐-표지된 콜로이드 입자, 예컨대 리포좀, 예를 들어 테크네튬-99와 같은 방사성 핵종을 보유하는 중합성 미셀의 나노입자를 사용하는 것이다 (문헌 [Jestin et al. Q J Nucl Med Mol Imaging 2007; 51:51-60]).
또 다른 실시양태에서, 합텐-커플링된 다른 세포증식 억제 분자, 예컨대 독소가 제2 Fab 아암에 의해 인식되는 이펙터 분자로서 사용된다.
본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 이중특이적 분자의 제1 Fab-아암은 위치 N297 (EU 넘버링)에서 글리코실화되고, 이중특이적 분자의 제2 Fab-아암은 비글리코실화된다 (예를 들어 N297을 Q 또는 A 또는 E 돌연변이로 돌연변이시킴으로써 비글리코실화된다 (문헌 [Bolt S et al., Eur J Immunol 1993, 23:403-411]). Fc-영역 내의 비대칭 글리코실화는 Fcγ-수용체에 대한 상호작용에 영향을 주고, 항체의 항체-의존성 세포성 세포독성 효과 (문헌 [Ha et al., Glycobiology 2011, 21(8): 1087-1096]) 및 다른 이펙터 기능 분자, 예컨대 C1q와의 상호작용에 영향을 준다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, 이중특이적 분자의 제1 Fab-아암은 신생 Fc 수용체인 FcRn과 상호작용하고 (문헌 [Roopenian DC, et al. Nat. Rev. Immunol. 2007, 7:715-725]), 제2 Fab-아암은 예를 들어 H435A 돌연변이를 형성함으로써 분자 상의 FcRn 상호작용 부위의 돌연변이에 의해 FcRn에 대한 결합이 손상된다 (문헌 [Shields, R.L., et al., J Biol Chem, 2001], [Firan, M., et al., Int Immunol, 2001]).
또 다른 실시양태에서, C1q에 대한 결합은 이중특이적 분자의 2개의 Fab-아암 중의 하나에서 개선되거나 감소된다.
또 다른 실시양태에서, 단백질은 분자의 2개의 Fab-아암 중의 하나 또는 둘 모두에 대해 보체 활성화를 향상시키기 위해 조작되었다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 분자에 존재하는 각각의 Fab-아암은 상이한 IgG 하위클래스로부터 유래한다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 분자에 존재하는 각각의 Fab-아암은 상이한 동종이형 돌연변이를 보유한다 (문헌 [Jefferis & Lefranc, 2009, MABs 1: 332-8]).
또 다른 실시양태에서, 비대칭 면역치료 분자의 또 다른 범주는 이중특이적 분자의 Fab-아암 중의 하나의 Fab를 면역 활성, 자극성 또는 억제성 시토카인으로 교체함으로써 생성된다. 상기 시토카인의 비-제한적인 예는 IL-2, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-4, IL-6, IL-13이다. 별법으로, (성장) 인자 또는 호르몬 자극제 또는 억제제가 분자에 포함된다.
또 다른 실시양태에서, Fab-아암 중의 하나의 Fab는 용해 펩티드, 즉 마가이닌, 멜리틴, 세크로핀, KLAKKLAK 및 그의 변이체와 같은 항미생물 펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는, 종양 세포, 세균, 진균 등을 용해시킬 수 있는 펩티드 (문헌 [Schweizer et al. Eur. J. Pharmacology 2009; 625: 190-194], [Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39:3107-3113], [Marks et al., Cancer Res 2005; 65:2373-2377], [Rege et al., Cancer Res. 2007; 67:6368-6375]) 또는 양이온성 용해 펩티드 (CLYP 테크놀로지 (CLYP technology), US2009/0269341)에 의해 교체된다.
또 다른 실시양태에서, Fab 아암 상의 Fab 중의 하나 또는 둘 모두는 시토카인 및/또는 성장 인자에 대한 수용체로 교체되어 소위 디코이 (decoy) 수용체를 생성하고, TNF-α를 표적화하는 엔브렐(Enbrel)® (에타네르셉트) 및 VEGF를 표적화하는 VEGF-트랩 (trap)이 그의 잘 알려진 예이다. 이들 2개의 디코이 수용체를 한 분자로 조합하면 단일 디코이 수용체보다 우수한 활성을 보였다 (문헌 [Jung, J.Biol. Chem. 2011; 286:14410-14418]).
또 다른 실시양태에서, 비대칭 면역치료 분자의 또 다른 범주는 면역 활성, 자극성 또는 억제성 시토카인을 이중특이적 분자에 존재하는 Fab-아암 중의 하나 또는 둘 모두의 N-말단 또는 C-말단에 융합시킴으로써 생성된다. 이것은 이중특이적 분자의 항-종양 활성에 좋은 영향을 끼친다. 상기 분자의 예는 IL-2 (문헌 [Fournier et al., 2011, Int. J. Oncology, doi: 10.3892/ijo.2011.976]), IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ (문헌 [Huan et al., 2007; J. Immunol. 179: 6881-6888], [Rossie et al., 2009; Blood 114: 3864-3871]), TNF-α이고 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 시토카인, 예컨대 예를 들어 G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-4, IL-6, 또는 IL-13의 N-말단 또는 C-말단 융합은 이중특이적 항체 분자 이펙터 기능에 좋은 영향을 끼칠 수 있다. 별법으로, 성장 인자 또는 호르몬 자극제 또는 억제제는 N-말단 또는 C-말단 상에서 분자에 포함된다.
또 다른 실시양태에서, Fab-아암 중의 하나 또는 둘 모두에 대한 용해 펩티드, 예를 들어 마가이닌, 멜리틴, 세크로핀, KLAKKLAK 및 그의 변이체와 같은 항미생물 펩티드 (문헌 [Schweizer et al. Eur. J. Pharmacology 2009; 625: 190-194], [Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39: 3107-3113], [Marks et al., Cancer Res 2005; 65: 2373-2377], [Rege et al., Cancer Res. 2007; 67: 6368-6375]) 또는 양이온성 용해 펩티드 (CLYP 테크놀로지, US2009/0269341)의 N-말단 또는 C-말단 융합은 분자의 활성을 향상시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 비대칭 면역치료 분자의 또 다른 범주는 선택된 표적과 상호작용하는 한 Fab-아암을 갖는 분자인 일가 항체이다. 상기 분자에서, 이중특이적 분자에 존재하는 Fab-아암의 하나는 선택된 표적 분자에 대해 작용하고, 분자의 제2 Fab-아암은 Fab를 보유하지 않거나 또는 MetMab (제넨테크 (Genentech); WO 96/38557)에 대해 설명된 바와 같은 비-결합/비-기능적 Fab를 갖는다. 별법으로, 인자 VIII 및 IX (문헌 [Peters et al., Blood 2010; 115: 2057-2064])에 대해 기재된 바와 같은 단량체 Fc-융합 단백질이 생성될 수 있다.
별법으로, 상기한 임의의 비대칭 분자의 조합이 본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 이종이량체 단백질은 제1 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 제2 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열이고,
상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고/갖거나,
상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 실시예 21에서 설명되는 바와 같이 검정할 때 각각의 CH3 영역의 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 0.01 내지 10 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 10 마이크로몰, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5, 예컨대 0.05 내지 5 마이크로몰, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 내지 1 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 1 마이크로몰, 0.01 내지 0.5 또는 0.01 내지 0.1이 되도록 하는 서열이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에 Phe 이외의 다른 아미노산을 갖고/갖거나
상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 실시예 21에서 설명되는 바와 같이 검정할 때 각각의 CH3 영역의 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 0.01 내지 10 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 10 마이크로몰, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5, 예컨대 0.05 내지 5 마이크로몰, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 내지 1 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 1 마이크로몰, 0.01 내지 0.5 또는 0.01 내지 0.1이 되도록 하는 서열이다.
이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서,
상기 제1 CH3 영역은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에 Phe 이외의 다른 아미노산, 예컨대 위치 405에 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산을 갖거나 또는
상기 제1 CH3 영역은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 407에 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 이종이량체 단백질은 생산 방법에 대해 상기 설명한 임의의 추가의 특징을 포함한다.
따라서, 본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 폴리펩티드는 항체, 바람직하게는 인간 항체의 전장 중쇄이다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 폴리펩티드는 항체, 바람직하게는 인간 항체의 전장 중쇄이다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 2개의 항체의 두 전장 중쇄, 바람직하게는 상이한 에피토프에 결합하는 두 인간 항체이고, 따라서 생성되는 이종이량체 단백질은 이중특이적 항체이다. 상기 이중특이적 항체는 중쇄 항체, 또는 중쇄에 추가로 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형으로부터 유래된 Fc 영역에 유사하거나 동일하고 (특정된 돌연변이 제외), 제2 폴리펩티드의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형의 것이다 (특정된 돌연변이 제외).
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 405에 Phe을 및 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에 Phe 이외의 다른 아미노산을 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 405에 Phe을 및 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에 Leu을 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 405에 Phe을 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에 Leu을 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 포함하고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 409에 Lys을, 및 a) 위치 350에 Ile 및 위치 405에 Leu, 또는 b) 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 409에 Lys을, 및 a) 위치 350에 Ile 및 위치 405에 Leu, 또는 b) 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 350에 Thr, 위치 370에 Lys, 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 409에 Lys을, 및 a) 위치 350에 Ile 및 위치 405에 Leu, 또는 b) 위치 370에 Thr 및 위치 405에 Leu을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 350에 Thr, 위치 370에 Lys, 위치 405에 Phe 및 위치 409에 Arg을 포함하고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 350에 Ile, 위치 370에 Thr, 위치 405에 Leu 및 위치 409에 Lys을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 폴리펩티드는 힌지 영역에 Cys-Pro-Ser-Cys 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 폴리펩티드 둘 모두가 힌지 영역에 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다.
본 발명의 이종이량체 단백질의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 Asn-연결된 글리코실화를 위한 수용자 부위를 제거하는 돌연변이를 포함한다.
표적 항원
상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 중요한 실시양태에서, 이종이량체 단백질은 결합 특이성이 상이한, 즉 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.
원칙적으로, 임의의 특이성의 조합이 가능하다. 상기한 바와 같이, 이중특이적 항체는 모노클로날 항체 요법의 효력 및 효능을 추가로 증가시키기 위해 잠재적으로 사용될 수 있다. 단일특이적 항체의 가능한 하나의 제한은 항체 결합이 요구되지 않는 다른 세포 종류 상의 표적 항원의 발현 때문에 요구되는 표적 세포에 대한 특이성의 결여이다. 예를 들어, 종양 세포 상에서 과다발현되는 표적 항원은 또한 그 항원에 대해 작용하는 항체의 처리시에 요구되지 않는 부작용을 야기할 수 있는 건강한 조직에서 발현될 수 있다. 표적 세포 종류 상에서만 발현되는 단백질에 대한 추가의 특이성을 갖는 이중특이적 항체는 종양 세포에 대한 특이적 결합을 잠재적으로 개선할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 동종이량체 단백질은 제1 항체 및 제2 항체가 동일한 종양 세포 상의 상이한 에피토프에 결합하는 두 개의 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 동종이량체 단백질은 제1 항체가 종양 세포 상의 에피토프에 결합하고 다른 항체는 의도되는 용도를 위한 임의의 관련 생체내 결합 활성을 보이지 않는 무관한 또는 불활성 항체인 두 개의 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 에피토프는 동일한 세포, 예를 들어 종양 세포 상에 위치할 수 있다. 종양 세포 상의 적합한 표적은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-외피 단백질, 페리오스틴, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, L1-CAM, AXL, 조직 인자 (TF), CD74, EpCAM 및 MRP3. 종양 세포 표적의 가능한 조합은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: erbB1 + erbB2, erbB2 + erbB3, erbB1 + erbB3, CD19 + CD20, CD38 + CD34, CD4 + CXCR5, CD38 + RANKL, CD38 + CXCR4, CD20 + CXCR4, CD20 + CCR7, CD20 + CXCR5, CD20 + RANKL, erbB2 + AXL, erbB1 + cMet, erbB2 + c-Met, erbB2 + EpCAM, c-Met + AXL, c-Met + TF, CD38 + CD20, CD38 + CD138.
추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 에피토프는 동일한 표적 항원 상에 위치할 수 있고, 여기서, 표적 항원 상의 2개의 에피토프의 위치는 하나의 에피토프에 대한 항체의 결합이 다른 에피토프에 대한 항체 결합을 방해하지 않도록 하는 것이다. 그의 추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 동일한 표적 항원 상에 위치하는 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체이지만, 표적 세포, 예를 들어 종양 세포를 사멸시키기 위해 상이한 작용 방식을 갖는다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 표적 항원은 erbB2 (HER2)이고, 이중특이적 항체는 퍼투주맙 및 트라스투주맙 항원-결합 부위를 조합한다. 또 다른 실시양태에서, 표적 항원은 erbB1 (EGFr)이고, 이중특이적 항체는 잘루투무맙 및 니모투주맙 항원-결합 부위를 조합한다.
이중특이적 항체는 또한 이펙터 메카니즘을 질환 연관 조직, 예를 들어 종양으로 재표적화하기 위한 매개자로서 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 상기 제1 또는 상기 제2 에피토프는 종양 세포, 예컨대 종양 세포 단백질 또는 종양 세포 탄수화물 상에 위치하고, 다른 에피토프는 이펙터 세포 상에 위치한다.
한 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포이다.
이펙터 세포 상의 가능한 표적은 다음을 포함한다: FcγRI (CD64): 단핵구 및 대식세포 및 활성화된 호중구 상에서 발현됨; FcγRIII (CD16): 천연 킬러 및 대식세포 상에서 발현됨; CD3: 순환 T 세포 상에서 발현됨; CD89: PMN (다형핵 호중구), 호산구, 단핵구 및 대식세포 상에서 발현됨; CD32a: 대식세포, 호중구, 호산구 상에서 발현됨; FcεRI: 호염기구 및 비만 세포 상에서 발현됨. 한 실시양태에서, 에피토프는 T 세포 상에서 발현되는 CD3 상에 위치한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 항체는 병원성 미생물에 대한 결합 특이성을 갖고, 제2 항체는 이펙터 세포 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD40, CD25, CD28, CD16, CD89, CD32, CD64, FcεRI 또는 CD1에 대한 결합 특이성을 갖는다.
또한, 이중특이적 항체는 화학치료제를 화학치료제가 작용하여야 하는 세포에 보다 특이적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 동종이량체 단백질 중의 하나는 소분자 또는 작은 펩티드를 인식하는 항체이거나, 또는 예를 들어 문헌 [Rader et al., (2003) PNAS 100: 5396]에 기재된 원칙에 따라 상기 분자와 공유 결합을 형성할 수 있다. 본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 제1 항체는 종양 세포 또는 종양 세포 표면 단백질, 예컨대 erbB1, erbB2, erbB3, erbB4, EGFR3vIII, CEA, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, EpCAM, c-Met, AXL, L1-CAM, 조직 인자, CD74 또는 CXCR5에 대한 결합 특이성을 갖고 (즉, 이들 상의 에피토프에 결합함), 제2 항체는 화학치료제, 예컨대 임의로 펩티드 또는 합텐에 커플링되거나 연결될 수 있는 독소 (방사성 표지된 펩티드 포함), 방사성 동위원소, 약물 또는 전구약물에 대한 결합 특이성을 갖는다.
이중특이적 항체는 또한 독소, 약물 또는 전구약물을 함유하는 소포, 예를 들어 전자 고밀도 (electron dense) 소포, 또는 미니세포 (minicell)를 종양에 대해 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [MacDiarmid et al. (2009) Nature Biotech 27: 643]을 참조한다. 미니세포는 염색체 DNA를 함유하지 않는, 비정상적인 세포 분열의 생성물인 무염색체 (achromosomal) 세포이다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 또는 상기 제2 에피토프가 종양 세포, 예컨대 종양 세포 단백질 또는 종양 세포 탄수화물 상에 위치하고, 다른 에피토프는 전자 고밀도 소포 또는 미니세포 상에 위치한다.
또한, 항체의 혈청 반감기는 혈청 단백질에 대한 결합 특이성을 이중특이적 항체에 포함시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 혈청 반감기는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 이중특이적 항체에 포함시킴으로써 연장될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 제1 항체는 종양 세포 또는 종양 세포 단백질, 예컨대 erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-외피 단백질, 페리오스틴, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, L1-CAM, AXL, 조직 인자 (TF), CD74, EpCAM 또는 MRP3, CEA에 대한 결합 특이성을 갖고, 제2 항체는 혈액 단백질, 예컨대 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는다. 제2 결합 특이성은 또한 항체를 특이적 조직, 예컨대 중추신경계 또는 뇌 (혈액 뇌 장벽을 가로질러)에 대해 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 제1 항체는 뇌-특이적 표적, 예컨대 아밀로이드-베타 (예를 들어, 알츠하이머 (Alzheimer) 병 치료를 위해), Her-2 (예를 들어, 뇌에서 유방암 전이의 치료를 위해), EGFR (예를 들어, 원발성 뇌암의 치료를 위해), Nogo A (예를 들어, 뇌 손상의 치료를 위해), TRAIL (예를 들어, HIV의 치료를 위해), 알파-시누클레인 (예를 들어, 파킨슨 (Parkinson) 병의 치료를 위해), Htt (예를 들어, 헌팅턴 (Huntington) 병의 치료를 위해), 프리온 (예를 들어, 광우병의 치료를 위해), 웨스트 나일 (West Nile) 바이러스 단백질에 대한 결합 특이성을 갖고, 제2 항체는 혈액 뇌 장벽 단백질, 예컨대 트랜스페린 수용체 (TfR), 인슐린 수용체, 멜라노트랜스페린 수용체 (MTfR), 락토페린 수용체 (LfR), 아포지단백질 E 수용체 2 (ApoER2), LDL-수용체-관련 단백질 1 및 2 (LRP1 및 LRP2), 진행성 글리코실화 최종-생성물에 대한 수용체 (RAGE), 디프테리아 독소-수용체 = 헤파린-결합 표피 성장 인자-유사 성장 인자 (DTR = HB-EGF), gp190 (문헌 [Abbott et al., Neurobiology of Disease 37 (2010) 13-25])에 대한 결합 특이성을 갖는다.
혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 결합 특이성은 또한 또 다른 비-항체 분자를 특이적 조직, 예컨대 중추신경계 또는 뇌 (혈액 뇌 장벽을 가로질러)에 대해 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 동종이량체 단백질 중의 하나는 혈액 뇌 장벽 단백질 (예컨대 TfR, 인슐린 수용체, MTfR, LfR, ApoER2, LRP1, LRP2, RAGE, DTR (= HB-EGF) 또는 gp190)에 대한 결합 특이성을 갖는 전장 항체이고, 다른 동종이량체 단백질은 또 다른 단백질, 예컨대 시토카인, 가용성 수용체 또는 다른 단백질, 예를 들어 VIP (혈관작용성 장 펩티드), BDNF (뇌-유래 신경친화성 (neurotrophic) 인자), FGF (섬유모세포 성장 인자), 다중 FGF, EGF (표피 성장 인자), PNA (펩티드 핵산), NGF (신경 성장 인자), 뉴로트로핀 (NT)-3, NT-4/5, 신경교 유래 신경친화성 인자, 섬모 신경친화성 인자, 뉴르투린, 뉴레굴린, 인터류킨, 전환 성장 인자 (TGF)-알파, TGF-베타, 에리트로포이에틴, 간세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 아르테민, 페르세핀, 네트린, 카디오트로핀-1, 줄기 세포 인자, 미드킨, 플레이오트로핀, 골 형성 단백질, 사포신, 세마포린, 백혈구 억제 인자, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-술파타제, N-아세틸-갈락토사민-6-술파타제, 아릴술파타제 B, 산 알파-글루코시다제, 또는 스핑고미엘리나제에 N- 또는 C-말단에서 연결된 Fc 영역이다 (문헌 [Pardridge, Bioparmaceutical drug targeting to the brain, Journal of Drug Targeting 2010, 1-11]; [Pardridge, Re-engineering Biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses. Bioconjugate Chemistry 2008, 19: 1327-1338]).
본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 제1 항체는 종양 세포 또는 종양 세포 단백질, 예컨대 erbB1, erbB2, erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4 또는 CXCR5에 대한 결합 특이성을 갖고, 제2 항체는 혈액 응고에 관여하는 단백질, 예컨대 조직 인자에 대한 결합 특이성을 갖는다.
추가의 특히 흥미로운 결합 특이성 조합은 다음을 포함한다: CD3 + HER2, CD3 + CD20, IL-12 + IL18, IL-1a + IL-1b, VEGF + EGFR, EpCAM + CD3, GD2 + CD3, GD3 + CD3, HER2 + CD64, EGFR + CD64, CD30 + CD16, NG2 + CD28, HER2 + HER3, CD20 + CD28, HER2 + CD16, Bcl2 + CD3, CD19 + CD3, CEA + CD3, EGFR + CD3, IgE + CD3, EphA2 + CD3, CD33 + CD3, MCSP + CD3, PSMA + CD3, TF + CD3, CD19 + CD16, CD19 + CD16a, CD30 + CD16a, CEA + HSG, CD20 + HSG, MUC1 + HSG, CD20 + CD22, HLA-DR + CD79, PDGFR + VEGF, IL17a + IL23, CD32b + CD25, CD20 + CD38, HER2 + AXL, CD89 + HLA 클래스 II, CD38+CD138, TF + cMet, Her2 + EpCAM, HER2 + HER2, EGFR + EGFR, EGFR + c-Met, c-Met + 비-결합 아암 및 G-단백질 커플링된 수용체의 조합.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 본질적으로 문헌 [Taylor et al. J. Immunol. 158: 842-850 (1997)] 및 [Taylor and Ferguson, J. Hematother. 4:357-362, 1995]에 기재된 바와 같이 적혈구를 표적화함으로써 순환계로부터 병원체, 병원성 자가항체 또는 해로운 화합물, 예컨대 독 및 독소를 클리어링하기 위해 사용될 수 있다. 상기 제1 에피토프는 적혈구 보체 수용체 1을 포함하고 이로 제한되지 않는 적혈구 (red blood cell) 단백질 상에 위치하고, 상기 제2 에피토프는 클리어런스를 위해 표적화되는 화합물 또는 유기체 상에 위치할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제2 Fab-아암은 자가항원 또는 dsDNA와 같은 자가항원을 부착하기 위한 접합 부위를 제시하는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항체에 의한 병원체, 자가항체 또는 해로운 화합물의 표적화, 이어서 적혈구-매개 클리어런스는 따라서 다양한 질환 및 증후군의 치료에서 치료 유용성을 갖는다.
접합
본 발명의 추가의 실시양태에서, 제1 및/또는 제2동종이량체 단백질은 독소 (방사성 동위원소 포함), 전구약물 또는 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물에 연결된다. 상기 화합물은 예를 들어 암 요법에서 표적 세포의 사멸을 보다 효과적으로 만들 수 있다. 생성되는 이종이량체 단백질은 따라서 면역접합체이다. 화합물은 별법으로 생성되는 이종이량체 단백질에, 즉 Fab-아암 교환이 발생한 후에 커플링될 수 있다.
따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질을 또 다른 화합물; 예를 들어, 독소, 전구약물 또는 약물에 연결하거나 커플링시키는 단계를 추가로 포함한다.
별법으로, 본 발명의 방법은 이종이량체 단백질을 또 다른 화합물; 예를 들어, 독소, 전구약물 또는 약물에 연결하거나 커플링시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 다른 부분에서 설명되는 바와 같이, 제1 및 제2 동종이량체 단백질은 상이한 화합물에 접합되어, 2개의 상이한 화합물; 예를 들어, 독소, 전구약물 및/또는 약물에 접합된 이종이량체 단백질의 생산을 유도할 수 있다. 이것은 특히 제1 화합물의 접합이 제2 화합물의 접합 방법에 적합하지 않을 경우에 유용할 수 있다. 상이한 화합물은 예를 들어 2개의 상이한 독소, 또는 2개의 상이한 전구약물, 또는 2개의 상이한 약물일 수 있거나, 또는 하나의 화합물은 독소일 수 있고 다른 화합물은 전구약물 또는 약물이거나, 또는 하나의 화합물은 전구약물일 수 있고 다른 화합물은 약물이다. 임의의 적합한 조합이 사용될 수 있다.
별법으로, 본 발명의 방법은 이종이량체 단백질의 형성을 환원-산화를 사용한 독소의 접합과 조합하는 것을 포함한다.
본 발명의 면역접합체 형성에 적합한 화합물은 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로-테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올 및 퓨로마이신, 항대사물질 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 클라드리빈), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 다른 백금 유도체, 예를 들어 카르보플라틴), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (이전의 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC)), 디프테리아 독소 및 관련 분자 (예컨대, 디프테리아 A 쇄 및 그의 활성 단편 및 혼성체 분자), 리신 독소 (예컨대, 리신 A 또는 탈글리코실화 리신 A 쇄 독소), 콜레라 독소, 시가 (Shiga)-유사 독소 (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크 (Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 겔라닌, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 (saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신 독소를 포함한다. 다른 적합한 접합된 분자는 리보뉴클레아제 (RNase), DNase I, 스타필로코커스 장독소-A, 억새풀 항바이러스 단백질, 디프테린 독소, 슈도모나스 내독소, 메이탄시노이드, 오리스타틴 (MMAE, MMAF), 칼리케아미신 및 듀오카르마이신 유사체 (문헌 [Ducry and Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21: 5-13]), 돌로스타틴-10, 돌로스타틴-15, 이리노테칸 또는 그의 활성 대사물질 SN38, 피롤로벤조디아제핀 (PBD)을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 제1 및/또는 제2동종이량체 단백질은 토륨-227, 라듐-223, 비스무트-212, 및 악티늄-225를 포함하고 이로 제한되지 않는 알파 방출체에 연결된다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 제1 및/또는 제2동종이량체 단백질은 아이오듐-313, 이트륨-90, 플루오린-18, 레늄-186, 갈륨-68, 테크네튬-99, 인듐-111, 및 루테튬-177을 포함하고 이로 제한되지 않는 베타 방출 방사성 핵종에 연결된다.
또 다른 실시양태에서, 접합되는 화합물은 핵산 또는 핵산-회합 분자를 포함한다. 본 발명의 상기 한 측면에서, 접합되는 핵산은 세포독성 리보뉴클레아제, 안티센스 핵산, 억제성 RNA 분자 (예를 들어, siRNA 분자) 또는 면역자극성 핵산 (예를 들어, 면역자극성 CpG 모티프-함유 DNA 분자)이다.
문헌 [Hunter et al., Nature 144, 945 (1962)], [David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974)], [Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981)] 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)]에 기재된 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 접합 방법이 사용될 수 있다. 접합체는 다른 모이어티 (moiety)를 단백질의 N-말단측 또는 C-말단측에 화학적으로 접합시킴으로써 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)] 참조). 상기 접합된 항체 유도체는 또한 적절한 경우 내부 잔기 또는 당에서의 접합에 의해 생성될 수 있다. 이 작용제는 본 발명의 단백질에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 제2 작용제의 간접 커플링의 일례는 스페이서 모이어티에 의한 커플링이다. 약물-접합체에 대한 연결 기술은 최근에 문헌 [Ducry and Stump (2010) Bioconjugate Chem. 21:5]에 요약되었다.
조성물 및 용도
본 발명의 방법에 의해 생산된 이종이량체 단백질은 제약상 허용되는 담체와 함께 제약 조성물에서 사용될 수 있다.
제약 조성물은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 개시된 것과 같은 통상적인 기술에 따라 제제화될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 예를 들어 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제 (예컨대, 비이온성 세제, 예를 들어 트윈 (Tween)-20 또는 트윈-80), 안정화제 (예컨대, 당 또는 단백질-유리 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제 및/또는 제약 조성물에 포함시키기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 본 발명의 화합물과 생리학상 상용성인 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜)을 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 조성물 내에 등장화제, 예컨대 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 제약 조성물의 저장 수명 또는 유효성을 향상시킬 수 있는, 선택된 투여 경로에 적절한 하나 이상의 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제를 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달계를 포함한 제어 방출 제형과 같은, 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 그러한 담체는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성의 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르, 및 폴리락트산을 단독으로 또는 왁스와 함께, 또는 당업계에 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.
멸균 주사가능 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 적절한 용매 내에, 요구되는 경우에 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 혼입한 후, 멸균 미세여과하여 제조할 수 있다.
제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 및 사전 의료력, 및 의학 분야에 잘 공지된 기타 인자와 같은 다양한 약동학적 인자에 따라 결정될 것이다.
제약 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구로 투여된다. "비경구로 투여되는"은 본원에서 사용될 때 장관 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식, 대체로 주사에 의한 것을 의미하고, 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 건내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 거미막하, 척수내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
주요 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 이종이량체 단백질, 예컨대 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명의 이종이량체 단백질은 많은 목적을 위해 사용될 수 있다. 특히, 상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 이종이량체 단백질은 전이암 및 불응성 암을 비롯한 다양한 형태의 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 바와 같은 본 발명에 따른 이종이량체 단백질을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하고/하거나 종양 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이종이량체 단백질은 면역 및 자가면역 질환, 염증성 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환, CNS 및 근골격 질환의 치료를 위해 사용된다.
상기 치료 및 사용 방법에서 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예컨대, 치료 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스를 투여할 수 있거나, 몇몇 분할 용량을 일정 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 치료 상황의 응급성에 따라 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다.
이종이량체 단백질에 대한 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료할 질환 또는 병태에 의존적이고 당업자가 결정할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체의 치료 유효량에 대한 예시적인 비-제한적 범위는 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 약 0.1-50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-20 mg/kg, 예컨대 약 0.1-10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 예컨대 약 0.3, 약 1, 약 3, 약 5, 또는 약 8 mg/kg이다.
당업계의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 요구되는 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에서 사용되는 이종이량체 단백질의 용량을 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 더 낮은 수준에서 시작하여 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 용량은 치료 효과를 생성하기 위해 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 투여는 예를 들어 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여일 수 있다.
본 발명의 이종이량체 단백질은 또한 질환, 예컨대 암 발병 위험을 감소시키고/시키거나, 질환 진행에서 사건 발현의 발생을 지연시키고/시키거나, 질환, 예컨대 암이 관해 상태일 때 재발 위험을 감소시키기 위해 예방 목적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 이종이량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체는 또한 조합 요법으로, 즉, 치료할 질환 또는 병태에 관련된 다른 치료제와 조합으로 투여될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 이종이량체 단백질-함유 의약은 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 세포독성제, 화학요법제 또는 항-혈관신생제와 조합하기 위한 것이다. 그러한 조합 투여는 동시, 별개 또는 순차적일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 이종이량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체를 방사선 치료 및/또는 수술과 조합하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병, 예컨대 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 이종이량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체는 또한 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간 IgG1 -2F8 및 IgG1 -7 D8 의 발현을 위한 발현 벡터
HuMab 2F8 (WO 02/100348) 및 HuMab 7D8 (WO 04/035607)의 VH 및 VL 코딩 영역을 인간 IgG1 중쇄의 생산을 위해 발현 벡터 pConG1f (인간 IgG1m(f) 동종이형 불변 영역의 게놈 서열을 함유함 (론자 바이올로지스 (Lonza Biologies)) 및 카파 경쇄의 생산을 위해 pConKappa (인간 카파 경쇄 불변 영역을 함유함, 론자 바이올로지스) 내에 클로닝하였다. IgG4 항체에 대해, VH 영역은 pTomG4 벡터 (pEE12.4 벡터 내에 인간 IgG4 불변 영역의 게놈 서열을 함유함 (론자 바이올로지스)) 내에 삽입되었다. 별법으로, 후속 구축물에서, pEE12.4 벡터 내에 중쇄의 완전 코돈-최적화된 코딩 영역 (IgG1 또는 IgG4) 또는 pEE6.4 벡터 내에 HuMab 2F8 또는 HuMab 7D8의 인간 카파 경쇄를 함유하는 벡터 (론자 바이올로지스)를 사용하였다. 추가로, F405L 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1m(za) 동종이형 불변 영역의 코돈-최적화된 서열과 함께 HuMab-2F8의 코돈 최적화된 VH 코딩 영역을 pcDNA3.3 벡터 (인비트로젠 (Invitrogen))에 클로닝하여 발현 벡터 p33G1za-2F8-F405L을 생성하였다.
실시예 2: 힌지 -결실- IgG1 -2F8, 및 특이적 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 및 IgG4 CH2-CH3 단편의 발현을 위한 발현 벡터
항체 중쇄의 힌지 및 CH3 영역 내에 돌연변이를 도입하기 위해, 퀵체인지 (Quickchange) 부위-지정 돌연변이 유발 키트 (스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 홀라))를 제조자의 권장사항에 따라 사용하였다. 별법으로, 구축물을 완전히 합성하거나, VH 영역을 이미 치환을 코딩하는 특이적 아미노산을 함유하는 벡터 내에 클로닝하였다.
CH2 및 CH3 단편을 코딩하는 구축물을 PCR에 의해 제작하거나, 완전 코돈 최적화되도록 합성하였다. 이들 구축물은 N-말단 신호 펩티드 및 6 아미노산 His 태그를 갖고, 인간 IgG1/4 불변 영역의 아미노산 341-447을 함유하였다. 구축물을 pEE12.4 내에 클로닝하였다.
힌지-결실-IgG1 (Uni-G1) 분자를 제작하기 위해, EGFR 특이성을 가진 인간 IgG1 이소형에 대한 Uni-G1 포맷을 코딩하는 합성 DNA 구축물을 제조하였다. 상기 구축물에서, 천연 힌지 영역 (힌지 엑손에 의해 규정된 바와 같이)은 결실되었다. 상기 이소형 내에서 HC 및 LC 쇄 사이의 Cys 결합을 회복하기 위해 IgG1 구축물 내에 위치 158에서 추가의 Ser의 Cys으로의 돌연변이를 만들었다. 단백질 서열을 아래에 제시한다 (서열 4). 구축물을 pEE6.4 벡터 내에 삽입하고, pHG1-2F8로 명명하였다.
Figure pct00004
실시예 3: 레서스 IgG4 -2F8 및 IgG4 -7 D8 의 발현을 위한 발현 벡터
차이니즈 레서스 원숭이의 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄, 및 Humab 2F8 및 7D8의 VH 및 VL 영역을 위한 코딩 영역을 함유하는 벡터를 합성하고, 완전 코돈-최적화하고, pEE12.4 (중쇄) 및 pEE6.4 (경쇄) 내에 삽입하였다. 사용된 중쇄 불변 영역 서열 (문헌 [Scinicariello et al., Immunology 111: 66-74, 2004]에 기재된 서열에 기초함)은 다음과 같았다 (인간 서열에 대해 정렬됨):
Figure pct00005
사용된 레서스 경쇄 불변 영역 (CL) 서열은 다음과 같았다:
Figure pct00006
실시예 4: HEK -293F 세포 내에서 일시적 발현에 의한 항체 생산
제조자의 지시에 따라 293fectin (인비트로젠)을 사용하여 HEK-293F 세포 (인비트로젠) 내에서 관련 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 동시형질감염함으로써 무혈청 상태 하에 항체를 생산하였다.
실시예 5: IgG1 및 IgG4 항체의 정제
IgG1 및 IgG4 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 세포 배양 상청액을 0.20 μM 전량 (dead-end) 필터 상에서 여과한 후, 5 ml 단백질 A 칼럼 (rProtein A FF, 지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)) 상에 로딩하고, IgG를 0.1 M 시트르산-NaOH (pH 3)으로 용리하였다. 용리액을 2 M 트리스-HCl (pH 9)로 즉시 중화시키고, 12.6 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl (pH 7.4) (비. 브라운 (B. Braun, 네덜란드 오스)) 내로 밤새 투석하였다. 투석 후에, 샘플을 0.20 μM 전량 필터 위로 멸균 여과하였다. 정제된 IgG의 농도는 혼탁법 및 280 nM에서 흡광도에 의해 결정하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE, IEF, 질량 분광법 및 당분석에 의해 분석하였다.
실시예 6: CH2 - CH3 단편의 정제
His-태깅된 CH2-CH3 단백질을 고정된 금속 이온 (Ni2 +) 친화도 크로마토그래피 (마세레이-나겔 (Macherey-Nagel GmbH, 독일 뒤렌))에 의해 정제하고, PBS로 평형화시킨 PD-10 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 이용하여 탈염하고, 0.2 μM 전량 필터 위에서 멸균 여과하였다. 정제된 단백질의 농도를 280 nM에서 흡광도에 의해 결정하였다. 정제된 단백질의 품질은 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
실시예 7: 인간 및 레서스 IgG4 항체 사이에서 GSH -유도된 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성
인간 및 레서스 IgG4 항체 사이의 Fab-아암 교환에 대해 시험하기 위해, 인간 IgG4-2F8 (항-EGFR), 인간 IgG4-7D8 (항-CD20), 레서스 IgG4-2F8 및 레서스 IgG4-7D8을 사용하여 2개의 항체의 모든 가능한 조합물을 제조하였다. 시험관내 Fab-아암 교환을 위해, 0.5 mM 환원된 글루타티온 (GSH)과 함께 0.5 ml PBS 내에 각각의 항체를 4 ㎍/ml의 최종 농도로 함유하는 항체 혼합물을 37℃에서 24 h 동안 인큐베이션하였다. 환원 반응을 중지시키기 위해, 0.5 ml PBS/0.05% 트윈 20 (PBST)을 반응 혼합물에 첨가하였다.
이중특이적 항체의 존재는 샌드위치 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하는 이중특이적 결합의 결정에 의해 시험하였다. ELISA 플레이트 (그라이너 바이오-원 (Greiner bio-one, 독일 프릭켄하우젠))를 4℃에서 PBS 내의 2 ㎍/ml (100 ㎕/웰)의 EGFR의 재조합 세포외 도메인으로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. PBST/0.2% BSA (PBSTB) 내의 항체 샘플의 희석 계열 (3배 희석액 내의 0-1 ㎍/ml)을 코팅된 ELISA 플레이트 (100 ㎕/웰)로 옮기고, 주변 온도 (RT)에서 60 min 동안 플레이트 진탕기 (300 rpm)에서 인큐베이션하였다. 샘플을 폐기하고, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20 (PBST)로 1회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 60 min 동안 PBSTB (100 ㎕/웰) 내의 2 ㎍/ml 마우스 항-이디오타입 (idiotypic) 모노클로날 항체 2F2 SAB1.1 (7D8에 대해 작용함; 젠맵)와 함께 플레이트 진탕기 (300 rpm)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20 (PBST)로 1회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 60 min 동안 RT에서 PBSTB (100 ㎕/웰) 내의 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG (15G; 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 미국 펜실베니아주 웨스트그로브); 1:5.000)와 함께 플레이트 진탕기 (300 rpm)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20 (PBST)로 1회 세척하였다. ABTS (PBS 중 50 mg/ml; 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하 (Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임))를 첨가하고 (100 ㎕/웰), 차광하여 30 min 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 반응을 2% 옥살산 (100 ㎕/웰; 리델 데 헨 (Riedel de Haen, 독일 젤제)으로 중지시켰다. RT에서 10 min 후에, 405 nM에서 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기에서 측정하였다.
도 1은 인간 및 레서스 IgG4의 조합이 동일한 종의 각각의 IgG4의 조합에 비해 보다 높은 이중특이적 결합 (보다 높은 OD 405 nm)을 생성함을 보여준다. 상기 데이터는 Fab-아암 교환이 인간 IgG4와 레서스 IgG4 사이에서 발생함을 보여준다. 또한, 보다 높은 이중특이적 결합은 인간 IgG4 1/2 분자가 레서스 IgG4 1/2 분자에 대한 우선적인 이량체화 (이종이량체화)를 보이고, Fab-아암 교환 반응의 평형이 50% 이종이량체 및 50% 동종이량체의 확률적인 교환 대신에 이중특이적 이종이량체를 향해 이동함을 시사한다.
실시예 8: 인간 및 레서스 IgG4 의 서열 분석
동일한 종의 IgG4 분자 사이의 Fab-아암 교환에 비해 증가된 인간 및 레서스 IgG4 사이의 Fab-아암 교환을 규명하기 위한 시도에서, 인간 및 레서스 항체 사이의 코어 힌지 및 CH3-CH3 계면 아미노산을 분석하였다 (예를 들어, 인간 CH3-CH3 계면의 잔기의 개요에 대해서는 문헌 [Dall'Acqua, et al. (1998) Biochemistry 37:9266] 참조). 도 2는 차이니즈 레서스 IgG4 내의 코어 힌지 서열은 226-CPAC-229이고, CH3 도메인은 위치 409에 리신 (K)을 함유함을 보여준다. 또한, 서열 정렬은 레서스 IgG4가 다음과 같이 인간 IgG4에 비해 CH3-CH3 계면에 3개 더 많은 아미노산 치환을 특징으로 함을 보여주었다: 위치 350에서 레서스의 이소류신 (I) 대 인간의 트레오닌 (T); 위치 370에서 레서스의 트레오닌 (T) 대 인간의 리신 (K); 및 위치 405에서 레서스에서 류신 (L) 대 인간의 페닐알라닌 (F).
실시예 9: 인간 IgG4 와 레서스 IgG4 CH3 서열을 함유하는 인간 IgG1 사이의 GSH -유도 Fab - 아암 교환을 사용한 이중특이적 항체의 생성
실시예 7에서 설명된 인간 및 레서스 IgG4 사이의 Fab-아암 교환을 기초로 하여, 차이니즈 레서스 IgG4 CH3 서열이 Fab-아암 교환을 위해 인간 IgG1에 참여할 수 있는지를 분석하였다. 따라서, 힌지 서열 CPSC을 생성하는 P228S 돌연변이 이외에 삼중 돌연변이 T350I-K370T-F405L (이후에 ITL로 언급됨)을 인간 IgG1-2F8에 도입하였다. 인간 IgG1-2F8 돌연변이체를 시험관내 GSH-유도 Fab-아암 교환을 위해 인간 IgG4-7D8과 조합하였다. 각각의 항체를 0.5 ml PBS 내의 4 ㎍/ml의 최종 농도로 0.5 mM GSH와 함께 함유하는 항체 혼합물을 37℃에서 0-3-6-24h 동안 인큐베이션하였다. 환원 반응을 중지시키기 위해, 0.5 ml PBS/0.05% 트윈 20 (PBST)을 반응 혼합물에 첨가하였다. ELISA에서 이중특이적 결합의 측정은 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 3은 CPSC 힌지 단독의 도입은 인간 IgG4-7D8과 조합될 때 GSH-유도 Fab-아암 교환을 위해 인간 IgG1-2F8에 참여하지 않음을 확인해준다. 또한, 야생형 IgG1 힌지를 보존하면서, 레서스 IgG4-특이적 CH3 계면 아미노산 (ITL)의 인간 IgG1-2F8 내로의 도입은 상기 조건 하에서 인간 IgG4-7D8과 조합될 때 Fab-아암 교환을 위해 참여하지 않았다. 이와 대조적으로, 힌지 내의 CPSC 서열 및 레서스 IgG4-특이적 CH3 계면 아미노산 (ITL)을 모두 보유하는 변이체 인간 IgG1-2F8 백본 서열은 2개의 인간 IgG4 항체에 비해 인간 IgG4-7D8을 사용한 GSH-유도 Fab-아암 교환 후에 증가된 이중특이적 결합을 보였다. 상기 데이터는 위치 350, 370 및 405에 각각 I, T 및 L을 함유하는 CH3 도메인과 조합된 CPSC-함유 힌지가 GSH-유도 Fab-아암 교환을 위해 인간 IgG1에 참여하기 위해 충분하고, 교환 반응의 평형은 인간 IgG4와 조합될 때 교환된 이중특이적 생성물을 향해 이동함을 보여준다.
실시예 10: 인간 IgG4 및 IgG1 또는 IgG4 돌연변이체 사이의 생체내 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성
Fab-아암 교환 참여를 위해 필요한 특징을 추가로 확인하기 위해, 인간 IgG4 및 IgG1 변이체를 생체내에서 분석하였다. 군당 4마리의 암컷 SCID 마우스 (챨스 리버 (Charles River, 네덜란드 마스트리히트))에게 300 ㎕의 총 부피에 600 ㎍ 항체 (500 ㎍ 7D8 + 100 ㎍ 2F8)을 함유하는 항체 혼합물을 i.v. 주사하였다. 혈액 샘플을 주사 3, 24, 48 및 72시간 후에 복재 정맥으로부터 채취하였다. 혈액을 헤파린-함유 바이알에 모으고, 세포로부터 혈장을 분리하기 위해 10,000 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 이중특이적 항체의 생성 후에, 실시예 7에 기재된 바와 같이 PBSTB 내의 연속 희석 혈장 샘플을 사용하여 CD20 및 EGFR 이중특이적 반응성을 ELISA로 평가하였다. 참조물질로서 시험관내에서 교환된 항체 혼합물을 사용하여 혈장 샘플 중의 이중특이적 항체를 비-선형 회귀 곡선-피팅 (fitting) (그래프패드 소프트웨어 (GraphPad 소프트웨어), 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 의해 정량하였다.
도 4는 힌지 또는 CH3 서열이 대응하는 인간 IgG1 서열 (각각 CPPC 또는 R409K)로 전환된 인간 IgG4-2F8이 생체내에서 Fab-아암 교환에 더 이상 참여하지 않음을 보여준다. 이와 달리, 힌지 영역 및 CH3 계면 서열 둘 모두가 대응하는 인간 IgG4 서열 (CPSC 및 K409R)로 전환된 인간 IgG1은 생체내에서 Fab-아암 교환에 참여할 수 있다. 상기 데이터는 위치 409에 아르기닌 (R)을 함유하는 CH3 도메인과 조합된 CPSC-함유 힌지 (위치 228에 S 존재)가 생체내에서 인간 IgG1과 인간 IgG4 사이의 Fab-아암 교환을 가능하게 하기에 충분함을 보여준다.
실시예 11: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성: 안정화된 힌지의 우회/붕괴
2-메르캅토에틸아민·HCl (2-MEA)은 중쇄와 경쇄 사이에 디술피드 결합을 보존하면서 항체의 힌지 영역 내의 디술피드 결합을 선택적으로 절단하는 것으로 설명된 약한 환원제이다. 따라서, 2-MEA의 농도 계열은 CPSC 또는 CPPC 힌지 영역을 함유하는 2개의 항체 사이의 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성을 유도하는 그의 능력에 대해 시험되었다. 각각의 항체를 0.5 mg/ml의 최종 농도로 함유하는 항체 혼합물을 37℃에서 90 min 동안 100 ㎕ 트리스-EDTA (TE)의 총 부피 내의 2-MEA (0, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0, 25.0 및 40.0 mM)의 농도 계열과 함께 인큐베이션하였다. 환원 반응을 중지시키기 위해, 환원제 2-MEA를 스핀칼럼 (마이크로콘 (Microcon) 원심분리 필터, 30k, 밀리포어 (Millipore))을 제조자의 권장사항에 따라 사용하여 샘플을 탈염함으로써 제거하였다. 이중특이적 결합은 실시예 7에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정하였다.
2-MEA-유도 Fab-아암 교환을, CPSC 힌지 영역을 함유하고 GSH-유도 Fab-아암 교환에 참여하는 것으로 알려진 IgG4-2F8 x IgG4-7D8 조합, 및 안정화된 힌지 영역 때문에 GSH-유도 Fab-아암 교환에 참여하지 않는 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 조합 (실시예 9, 도 3에 제시된 바와 같은 것)에 대해 시험하였다. 놀랍게도, 2-MEA는 비-환원 SDS-PAGE에 의해 결정시에 중쇄로부터 경쇄의 분리를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (데이터 미제시). 그럼에도 불구하고, 기능적 이중특이적 항체는 도 5에 제시된 바와 같이 생성되었다. 야생형 인간 IgG4-2F8과 IgG4-7D8 사이의 Fab-아암 교환 후에 이중특이적 결합의 최대 수준은 2.0 mM 2-MEA의 농도에서 도달하였고, 실시예 9에 기재된 바와 같이 0.5 mM GSH에서 도달한 수준과 대등하였다 (도 3). 그러나, 2-MEA는 용량-의존성 방식으로 인간 항체 IgG1-2F8-ITL과 IgG4-7D8-CPPC (안정화된 힌지 영역을 갖는) 사이의 Fab-아암 교환을 유도할 수 있었다. 아마도 두 항체의 힌지 영역 내의 CPPC 서열의 존재 때문에 이중특이적 항체가 낮은 2-MEA 농도에서 거의 또는 전혀 형성되지 않지만, 이중특이적 항체의 생성은 보다 높은 농도의 2-MEA에서 매우 효율적이었다. 최대 이중특이적 결합은 25 mM 2-MEA에서 도달하였고, 2개의 야생형 IgG4 항체 사이의 Fab-아암 교환 후의 최대 결합을 초과하였다. 상기 최대 결합 수준은 CPSC 힌지를 갖는 대응하는 항체 (IgG1-2F8-CPSC-ITL)의 GSH 처리에 대해 실시예 9 (도 3)에서 설명된 바와 대등하였다. IgG1-2F8-ITL 및 IgG4-7D8-CPPC 둘 모두는 CPPC 힌지를 함유하기 때문에, 상기 데이터는 2-MEA가 시험관내 Fab-아암 교환을 위한 CPSC 힌지의 필요성을 제거할 수 있음을 나타낸다.
실시예 12: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성 후의 질량 분광법
2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성은 실시예 11에서 설명되었고, 여기서 이중특이적 결합은 ELISA에 의해 제시되었다 (도 5). 이중특이적 항체가 형성되었는지를 확인하기 위해, 샘플을 분자량을 결정하기 위해 전기분무 이온화 질량 분광법 (ESI-MS)에 의해 분석하였다. 먼저, 샘플을 200 ㎍ 항체를 180 ㎕ PBS 내의 0.005 U N-글리카나제 (cat. no. GKE-5006D; 프로자임 (Prozyme))와 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 탈글리코실화시켰다. 샘플을 60℃에서 BEH300 C18, 1.7 ㎛, 2.1 x 50 mm 칼럼을 사용하여 애쿼티 (Aquity) UPLC™ (워터스 (Waters, 미국 밀포드)) 상에서 탈염하고, MQ 물 (용리액 A) 및 0.05% 포름산 (플루카 리델-데 헨 (Fluka Riedel-de Haen, 독일 부크스))을 함유하는 LC-MS 등급 아세토니트릴 (용리액 B) (바이오솔브 (Biosolve, 네덜란드 팔켄스바르트))의 혼합물의 구배로 용리시켰다. 비행시간형 (time-of-flight) 전기분무 이온화 질량 스펙트럼을 양이온 모드로 작동하는 micrOTOF™ 질량 분광계 (브루커 (Bruker, 독일 브레멘))로 온라인으로 기록하였다. 분석 전에, 500-4000 m/z 스케일을 ES 튜닝 믹스 (tuning mix) (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies, 미국 산타 클라라))를 사용하여 검정하였다. 질량 스펙트럼은 데이터어낼리시스 (DataAnalysis™) 소프트웨어 v. 3.4 (브루커, 독일 브레멘)가 제공된 맥시멀 엔트로피 (Maximal Entropy)를 사용하여 데컨벌루션 (deconvolution)하였다. 상기 실험에서 Fab-아암 교환에 사용되는 항체의 분자 질량을 기초로 하여, 이중특이적 항체는 본래의 항체와 구별될 수 있다 (또한 IgG1-2F8-ITLxIgG4-7D8-CPPC에 대해서는 실시예 15, 도 9c에 설명됨). 이중특이적 항체의 피크에 대해, 곡선하 면적을 결정하고, 각각의 샘플 내의 이중특이적 항체의 비율을 계산하기 위해 곡선하 총 면적으로 나누었다. 도 6a는 0 mM 2-MEA (모 항체에 대응하는 2개의 피크), 7 mM 2-MEA (모 및 이중특이적 항체에 대응하는 3개의 피크), 및 40 mM 2-MEA (이중특이적 항체에 대응하는 1개의 피크)를 사용한, IgG1-2F8-ITL과 IgG4-7D8-CPPC 사이의 Fab-아암 교환의 3개의 대표적인 질량 분광 프로파일을 보여준다. 이중특이적 생성물의 균일한 피크는 하위 분할된 피크를 생성하는 경쇄 미스쌍형성이 발생하지 않았음을 나타낸다. 정량된 데이터는 도 6b에 제시되고, IgG1-2F8-ITL과 IgG4-7D8-CPPC 사이의 Fab-아암 교환이 거의 100% 이중특이적 항체를 생성함을 보여준다. 이와 대조적으로, 야생형 IgG4 항체 사이의 Fab-아암 교환은 50% 미만의 이중특이적 생성물을 생성하였다. 이들 데이터는 실시예 11 (도 5)에 기재된 이중특이적 결합 ELISA로부터의 결과를 확인해준다.
실시예 13: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 안정성
2-MEA-유도 시험관내 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 안정성을 시험하였다. 따라서, 7.0 mM 2-MEA를 사용하여 IgG1-2F8-ITL 및 IgG4-7D8-CPPC로부터 생성된 2 ㎍의 이중특이적 샘플 (실시예 11, 도 5에 기재됨)을, 2 ㎍ 이중특이적 시험 샘플에 비해 0, 1, 10, 50x 과량의 IgG4-MG를 나타내는 무관한 IgG4 (아세틸콜린 수용체에 대한 IgG4-MG)의 농도 계열 (0, 2, 20, 100 ㎍)의 존재 하에 GSH-유도 Fab-아암 교환 반응에 사용하였다. 상기 반응에서 Fab-아암 교환은 이중특이적 EGFR/CD20 결합의 상실을 야기할 것이다. GSH 환원 반응의 조건은 실시예 7에 기재된 바와 동일하였다 (0.5 ml PBS/0.5 mM GSH 내에서 37℃에서 24h). 환원 반응을 중지시키기 위해, 0.5 ml PBSTB를 반응 혼합물에 첨가하였다. 이중특이적 결합은 실시예 7에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정하였다. GSH 환원 반응 후에 이중특이적 결합은 100%로 설정된 출발 물질 (대조군)에서 측정된 이중특이적 결합에 대해 제시된다.
도 7a는 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 유래 이중특이적 샘플에서 EGFR/CD20 이중특이적 결합이 무관한 IgG4의 존재 하에 GSH-유도 Fab-아암 교환 후에 유의하게 변화되지 않음을 보여준다. 이것은 이중특이적 생성물이 안정함을, 즉 GSH-유도 Fab-아암 교환에 참여하지 않음을 나타낸다. 대조군으로서, 도 7b는 IgG4-2F8 x IgG4-7D8 유래 샘플이 무관한 IgG4의 존재 하에 GSH-유도 Fab-아암 교환 후에 약화된 EGFR/CD20 이중특이적 결합을 보여주고, 이것은 상기 생성물이 안정하지 않음을 나타낸다. 상기 데이터는 CH3 도메인에 삼중 돌연변이 T350I-K370T-F405L을 함유하는 인간 IgG1 중쇄, 및 안정화된 힌지 (CPPC)를 생성하는 S228P 치환을 함유하는 인간 IgG4 중쇄로 이루어진 이종이량체가 안정함을 보여준다.
실시예 14: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 약동학 및 안정성에 대한 생체내 분석
모 항체 IgG1-2F8-ITL 및 IgG4-7D8-CPPC에 비해 그의 안정성 (생체내 Fab-아암 교환) 및 약동학적 특성 (혈장 클리어런스율)을 분석하기 위해 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 시험관내 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 (실시예 11, 도 5, 7 mM 2-MEA)에 의해 생성된 이중특이적 항체를 SCID 마우스에 주사하였다. 3개의 마우스 군 (3마리의 마우스/군)에게 200 ㎕의 정제된 항체를 꼬리 정맥에 정맥 내로 주사하였다: (1) 100 ㎍ 이중특이적 항체; (2) 100 ㎍ 이중특이적 항체 + 1,000 ㎍ 무관한 IgG4 (나탈리주맙, 항-α4-인테그린); (3) 50 ㎍ IgG1-2F8-ITL + 50 ㎍ IgG4-7D8-CPPC. 혈액 샘플 (50-100 ㎕)을 항체 투여 후에 소정의 시간 간격 (10 min, 3h, 1, 2, 7, 14, 21일)에서 볼에 구멍을 내어 수집하였다. 혈액을 헤파린 함유 바이알 내로 수집하고, 14,000 g에서 10 min 동안 원심분리하였다. 혈장을 추가의 분석 전에 -20℃에서 보관하였다.
혈장 샘플 내의 총 IgG 농도를 ELISA에 의해 검정하였다. 계속되는 단계의 검정 조건은 실시예 7에서 설명된 ELISA에 대한 것과 동일하였다. 총 IgG 측정을 위해 사용된 특이적 화합물은 다음과 같았다: 2 ㎍/ml 마우스 항-인간 IgG (클론 MH16-1; CLB; cat. no. M1268)의 코트; 혈청 샘플 희석액 (군 1 및 3에 대해 1:500 및 1:2,500) 및 (군 2에 대해 1:2,500 및 1:10,000); 접합체: HRP-접합된 염소 항-인간 IgG (클론 11H ; 잭슨; cat. no. 109-035-098; 1:10,000). 혈장 샘플 내의 이중특이적 항체의 존재는 실시예 10에 기재된 ELISA에서 CD20 및 EGFR 이중특이적 반응성에 의해 검정 및 정량하였다.
도 8a는 총 항체 혈장 농도를 보여준다. 혈장 클리어런스율 곡선이 형태는 모든 군에서 동일하였고, 이것은 이중특이적 항체의 혈장 클리어런스율이 분석된 시간 간격에 걸쳐 모 항체 IgG1-2F8-ITL 및 IgG4-7D8-CPPC에 대해 동일함을 나타낸다. 도 8b는 시간에 따른 이중특이적 항체의 혈장 농도를 보여준다. 이중특이적 항체에 대한 10배 과량의 무관한 IgG4의 투여는 이중특이적 항체 농도에 영향을 주지 않았고, 이것은 Fab-아암 교환이 생체내에서 발생하지 않았음을 나타낸다. 모 항체 (IgG1-2F8-ITL + IgG4-7D8-CPPC)의 주사 후에, 이중특이적 항체가 혈장에서 검출가능하지 않았고, 이를 통해 상기 항체가 생체내에서 Fab-아암 교환에 참여하지 않음을 확인할 수 있다. 상기 데이터는 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 시험관내 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체 생성물은 생체내에서 안정하고 (Fab-아암 교환 없음), 모 일가 항체와 대등한 약동학적 특성 (혈장 클리어런스율)을 보였음을 나타낸다.
실시예 15: 2개의 항체 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 순도
인간 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 일군의 이중특이적 항체를 PD-10 탈염 칼럼 (cat. no. 17-0851-01; 지이 헬쓰케어) 상에서 정제하였다. 이어서, 이중특이적 생성물의 순도를 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC) 및 질량 분광법에 의해 분석하였다. 생성된 이중특이적 항체의 기능성은 ELISA에서 이중특이적 결합에 의해 확인하였다 (데이터 미제시).
SDS-PAGE를 샘플이 중성 pH에서 이동하는 변형된 램리 (Laemmli) 방법 (Laemmli 1970 Nature 227(5259): 680-5)을 사용하여 4-12% NuPAGE Bis-Tris 겔 (인비트로젠, 네덜란드 브레다) 상에서 환원 및 비-환원 조건 하에 수행하였다. SDS-PAGE 겔을 쿠마시 (Coomassie)로 염색하고, 진지니어스 (GeneGenius) (시놉틱스 (Synoptics, 영국 캠브리지))를 사용하여 디지탈 영상을 찍었다. 도 9a는 Fab-아암 교환 후의 항체 샘플이 무손상 IgG로 이루어짐을, 비-환원된 겔 상에서 검출가능한 1/2 분자 (H1L1)의 흔적과 함께 보여준다 (도 9a-b).
HP-SEC 분류를 TSK HP-SEC 칼럼 (G3000SWXl; 토소 바이오사이언시스 (Toso Biosciences), 옴닐라보 (Omnilabo, 네덜란드 브레다)) 및 워터스 2487 듀얼 λ 흡광도 검출기 (워터스)에 연결된 워터스 얼라이언스 (Alliance) 2695 분리 유닛 (워터스, 네덜란드 에텐-루어)를 사용하여 수행하였다. 샘플은 1 ml/min로 이동하였다. 결과를 Empower 소프트웨어 버전 2002를 사용하여 처리하고, 총 피크 높이의 비율로서 피크마다 표현하였다. 도 9b는 >98%의 샘플이 무손상 IgG로 이루어지고, 사실상 응집체가 형성되지 않음을 보여준다.
질량 분광법을 실시예 12에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 9c는 출발 물질 IgG1-2F8-ITL 및 IgG4-7D8-CPPC, 및 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물의 질량 분광 프로파일을 보여준다. Fab-아암 교환된 샘플 내의 생성물은 145,901 kDa이고, 이것은 IgG1-2F8-ITL (146,259.5/2=73,130) + IgG4-7D8-CPPC (145,542.0/2=72,771)로부터 유래한 이중특이적 생성물과 완벽하게 일치한다. 또한, 이중특이적 항체 생성물은 균일한 피크를 보였고, 이것은 하위 분할된 피크를 생성하는 경쇄 미스쌍형성이 발생하지 않았음을 나타낸다. 상기 데이터는 Fab-아암 교환에 의해 100% 이중특이적 항체가 생성되었음을 보여준다. IgG4-7D8-CPPC 및 이중특이적 샘플의 주 피크 (K0) 이외에 검출된 작은 피크는 항체의 중쇄 내의 하나 (K1) 또는 2개의 (K2) C-말단 리신의 존재에 의한 것일 수 있다.
이들 데이터는 ~100% 기능적 이중특이적 항체 샘플이 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성되었음을 보여준다.
실시예 16: 인간 IgG1 의 Fab - 아암 교환 참여를 위한 T350I , K370T 및 F405L 치환의 필요성의 규명
IgG1이 Fab-아암 교환에 참여하기 위해 필요한, IgG1 CH3 도메인 내의 결정자를 추가로 확인하기 위해서, 삼중 돌연변이 T350I-K370T-F405L (ITL)을 함유하는 IgG1을 이중 돌연변이체 T350I-K370T (IT), T350I-F405L (IL) 및 K370T-F405L (TL)과 비교하였다. 또한, 단일 돌연변이체 F405L (L)을 시험하였다. 시험관내 Fab-아암 교환을 유도하기 위해 2-MEA를 환원제로서 사용하였다 (90 min 동안 37℃에서 100 ㎕ PBS/25 mM 2-MEA 중 50 ㎍의 각각의 항체). 단일 돌연변이체 F405L 항체의 경우, 일시적 형질감염의 상청액으로부터의 비정제된 항체를 아미콘 울트라 (Amicon Ultra) 원심분리 장치 (30k, 밀리포어, cat. no. UFC803096)를 사용하여 PBS로의 완충제-교환 후에 사용하였다. 환원 반응을 중지시키기 위해, 환원제 2-MEA를 실시예 11에 기재된 바와 같이 스핀 칼럼을 사용하여 샘플을 탈염함으로써 제거하였다. 이중특이적 항체의 생성을 실시예 7에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정된 이중특이적 결합에 의해 결정하였다.
삼중 (ITL), 이중 돌연변이 (IT, IL 및 TL) 및 단일 돌연변이 (L)를 IgG1-2F8에 도입하였다. 상기 돌연변이체를 90 min 동안 37℃에서 25 mM 2-MEA를 사용한 Fab-아암 교환을 위해 CPSC 힌지 (야생형) 또는 안정화된 힌지 (IgG4-7D8-CPPC)를 함유하는 IgG4-7D8과 조합하였다. 도 10a-b는 IgG1-2F8-IL 및 -TL 돌연변이체가 조합된 IgG4-7D8 (CPSC 또는 CPPC 힌지)과 관계없이 삼중 돌연변이체 ITL과 동일한 수준의 Fab-아암 교환을 보였음을 제시한다. 이와 대조적으로, IgG1-2F8-IT 돌연변이체와의 조합에 대해서는 이중특이적 결합이 관찰되지 않았다. 도 10c는 또한 IgG1-2F8-F405L 돌연변이체가 조합된 IgG4-7D8 (CPSC 또는 CPPC 힌지)과 관계없이 Fab-아암 교환을 보였음을 제시한다. 상기 데이터는 F405L 돌연변이가 상기 언급한 조건 하에서 인간 IgG1을 Fab-아암 교환에 참여하도록 하기에 충분함을 나타낸다.
실시예 17: 상이한 온도에서 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성.
2개의 상이한 항체 사이의 Fab-아암 교환에 의해 이중특이적 항체의 생성을 유도하는 2-MEA의 능력을 상이한 온도에서 시험하였다. Fab-아암 교환 반응은 0℃, 20℃ (RT) 또는 37℃에서 320 ㎕ PBS/25 mM 2-MEA (각각의 항체에 대해 0.5 mg/ml의 최종 농도) 내에서 160 ㎍ 인간 IgG1-2F8-ITL을 160 ㎍ IgG4-7D8-CPPC와 함께 인큐베이션함으로써 출발하였다. 상기 반응으로부터, 20 ㎕ 샘플을 상이한 시점 (0, 2.5, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180 및 240 min)에서 채취하였다. 20 ㎕ PBS를 각각의 샘플에 첨가한 후, 환원제 2-MEA를 제바 (Zeba) 96-웰 스핀 탈염 플레이트 (7k, cat# 89808 써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific))를 제조자의 권장사항에 따라 사용하여 샘플을 탈염함으로써 제거하였다. 총 항체 농도는 나노드롭 ND-1000 분광광도계 (이소겐 라이프 사이언스 (Isogen Life Science, 네덜란드 마르선))를 사용하여 280 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 항체 샘플의 희석 계열 (25배 희석액 내의 총 항체 농도 0-20 ㎍/ml)을 실시예 7에 기재된 바와 같이 이중특이적 결합을 측정하기 위해 ELISA에 사용하였다.
도 11은 인간 IgG1-2F8-ITL과 IgG4-7D8-CPPC 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성이 37℃에서 가장 효율적임이 밝혀졌고, 최대 이중특이적 결합은 45 min 후에 도달함을 보여준다. 주변 온도에서, 이중특이적 항체의 생성은 보다 느렸고, 240 min 후에 최대 이중특이적 결합에 도달하였다. 0℃에서, 분석된 시간 경로 동안 이중특이적 결합의 생성은 관찰되지 않았다.
실시예 18: 시험관내 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성을 유도하는 능력에 대한 상이한 환원제의 분석
0.5 mM GSH는 인간 IgG4 및 IgG1-CPSC-ITL 사이의 시험관내 Fab-아암 교환을 유도할 수 있지만, 인간 IgG4 및 안정한 힌지를 함유하는 IgG1-ITL 사이에서는 그렇지 않음이 밝혀졌다 (도 3). 또한, 2-MEA는 안정화된 힌지 영역을 갖는 항체, 예컨대 IgG1-ITL x IgG4-CPPC 사이에서 Fab-아암 교환을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 5). 다른 농도의 GSH 또는 2-MEA 또는 다른 환원제가 2개의 상이한 항체 사이에서 시험관내 Fab-아암 교환을 유도할 수 있는지를 시험하기 위해서, 2-MEA, GSH 및 DTT (디티오트레이톨)의 농도 계열을 시험하였다. 따라서, 20 ㎕ PBS 내의 10 ㎍ 인간 IgG1-2F8-ITL 및 10 ㎍ IgG4-7D8-CPPC의 조합물 (각각의 항체에 대해 0.5 mg/ml의 최종 농도)을 상이한 환원제 (0.0, 0.04, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 12.5, 25.0 및 50.0 mM)의 농도 계열과 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 90 min 후에, 20 ㎕ PBS를 각각의 샘플에 첨가하고, 환원제를 실시예 17에 기재된 바와 같이 스핀 탈염 플레이트를 사용하여 샘플을 탈염함으로써 제거하였다. 총 항체 농도는 실시예 17에 기재된 바와 같이 결정하였다. 항체 샘플의 희석 계열 (3배 희석액 내의 총 항체 농도 0-20 ㎍/ml)을 실시예 7에 기재된 바와 같이 이중특이적 결합을 측정하기 위해 ELISA에 사용하였다.
도 12는 2-MEA가 25 mM 2-MEA의 농도에서 최대 이중특이적 결합을 유도함을 확인해준다. DTT는 이중특이적 항체의 생성에 매우 효과적이고 최대 이중특이적 결합은 2.5 mM DTT에서 도달함이 밝혀졌다. 0-5 mM의 GSH 농도는 둘 모두 안정화된 힌지 영역을 함유하는 IgG1-ITL 및 IgG4-CPPC 항체 사이의 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성을 유도할 수 없었다. 보다 높은 GSH 농도 (12.5-50 mM)는 비-환원 SDS-PAGE에 결정될 때 항체 응집체의 형성을 유발하였다 (데이터 미제시). 따라서, 상기 샘플은 분석으로부터 제외하였다. 상기 데이터는 2개의 상이한 항체 사이의 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성이 상이한 환원제에 의해 유도될 수 있음을 보여준다.
실시예 19: IgG1 - ITL 과 함께 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 409 위치의 결정자
2-MEA는 실시예 11에 기재된 바와 같이 인간 IgG1-ITL과 IgG4-CPPC 사이의 Fab-아암 교환을 유도할 수 있다 (도 5). 인간 IgG1 및 IgG4의 CH3 계면 잔기는 위치 409에서만 상이하다: IgG1의 리신 (K) 및 IgG4의 아르기닌 (R) (실시예 8, 도 2에 기재됨). 따라서, 아르기닌 또는 임의의 다른 아미노산에 의한 위치 409에서 리신의 치환 (K409X)이, IgG1-ITL과의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 IgG1이 참여가능하도록 할 수 있는지 시험하였다. 20 ㎕ PBS/25 mM 2-MEA 내의 10 ㎍ 인간 IgG1-2F8-ITL 및 10 ㎍ IgG1-7D8-K409X의 조합물 (각각의 항체에 대해 0.5 mg/ml의 최종 농도)을 90 min 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 일시적 형질감염의 상청액으로부터의 비정제된 항체를 아미콘 울트라 원심분리 장치 (30k, 밀리포어, cat. no. UFC803096)를 사용하여 PBS로의 완충제-교환 후에 사용하였다. Fab-아암 교환 반응 후에, 20 ㎕ PBS를 각각의 샘플에 첨가하고, 환원제를 실시예 17에 기재된 바와 같이 스핀 탈염 플레이트를 사용하여 샘플을 탈염함으로써 제거하였다. 항체 샘플의 희석 계열 (3배 희석액 내의 총 항체 농도 0-20 ㎍/ml)을 실시예 7에 기재된 바와 같이 이중특이적 결합을 측정하기 위해 ELISA에 사용하였다.
도 13a는 IgG1-2F8-ITL x IgG1-7D8-K409X 사이의 2-MEA 유도 Fab-아암 교환시에 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 도 13b에서, 교환은 100%로 설정된, IgG1-2F8-ITL과 IgG4-7D8-CPPC 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환으로부터 유래된 이중특이적 항체의 정제된 군과 비교한 이중특이적 결합으로서 제시된다. 상기 데이터는 또한 표 1에 제시된 바와 같이 (-) Fab-아암 교환 부재, (+/-) 낮은, (+) 중간 또는 (++) 높은 Fab-아암 교환으로서 평가된다. Fab-아암 교환 부재 (-)는 IgG1-7D8의 409 위치가 K (= 야생형 IgG1), L 또는 M일 때 발견되었다. Fab-아암 교환은 IgG1-7D8의 409 위치가 F, I, N 또는 Y일 때 중간 (+)이고, IgG1-7D8의 409 위치가 A, D, E, G, H, Q, R, S, T, V 또는 W일 때 높은 (++) 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00007
실시예 20: 항체 탈글리코실화는 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성에 영향을 주지 않는다.
200 ㎍ 항체를 180 ㎕ PBS 내의 0.005 U N-글리카나제 (cat. no. GKE-5006D; 프로자임)와 함께 밤새 37℃에서 인큐베이션함으로써 IgG4-7D8 및 IgG4-7D8-CPPC 샘플을 탈글리코실화시켰다. 상기 샘플을 직접 Fab-아암 교환 반응에 사용하였다. Fab-아암 교환은 100 ㎕ PBS/25 mM 2-MEA (각각의 항체에 대해 0.5 mg/ml의 최종 농도) 내의 50 ㎍의 각각의 항체를 90 min 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 수행하였다. 환원제 2-MEA를 실시예 11에 기재된 바와 같이 스핀 칼럼을 사용하여 샘플을 탈염함으로써 제거하였다. 항체 샘플의 희석 계열 (3배 희석액 내의 총 항체 농도 0-20 ㎍/ml)을 실시예 7에 기재된 바와 같이 이중특이적 결합을 측정하기 위해 샌드위치 ELISA에 사용하였다.
질량 분광법 분석은 탈글리코실화 반응이 100% 탈글리코실화된 항체 생성물을 유발함을 보여주었다 (데이터 미제시). 도 14는 탈글리코실화된 항체를 수반하는 Fab-아암 교환이 대응하는 글리코실화된 항체의 Fab-아암 교환과 상이하지 않음을 보여준다 (IgG4-2F8 x IgG4-7D8-탈글리코실화된 대 IgG4-2F8 x IgG4-7D8 및 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC-탈글리코실화된 대 IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC). 상기 데이터는 탈글리코실화가 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성에 영향을 주지 않음을 나타낸다.
실시예 21: 비-공유 CH3 - CH3 상호작용의 정량
CH3 계면에서 상호작용의 강도는 모 항체 내의 두 중쇄가 Fab-아암 교환 반응에서 해리되고 후속적으로 이종이량체화 반응에서 회합될 수 있도록 하는 것이어야 한다. 따라서, Fab-아암 교환에 참여하는 능력과 비-공유 CH3-CH3 상호작용의 강도 (해리 상수, KD) 사이의 상호관련성을 분석하였다. GSH-유도 Fab-아암 교환은 다음 조합의 인간 항체에 대해 실시예 9 (37℃에서 0.5 mM GSH)에 기재된 바와 같이 수행하였다:
Figure pct00008
이중특이적 항체의 생성은 실시예 7에 기재된 바와 같이 샌드위치 ELISA에서 이중특이적 결합의 결정에 의해 측정하였다. 도 15a/b/c는 Fab-아암 교환 반응 후의 이중특이적 결합의 결과를 보여준다.
CH3-CH3 상호작용의 강도에 대한 상기 언급된 CH3 돌연변이의 효과를 측정하기 위해, CH2-CH3 도메인만으로 이루어진 단편을 제작하였다. 상기 단편 내의 힌지 영역의 결여는 공유 중쇄간 디술피드 결합을 방지하였다. 단편을 천연 질량 분광법에 의해 분석하였다. 샘플을 10 kDa MWCO 스핀-필터 칼럼을 사용하여 100 mM 암모늄 아세테이트 (pH 7)로 완충제를 교환하였다. 연속 희석된 샘플 (20 μM - 25 nM; 단량체 동등물)의 분취액 (~1 ㎕)을 LCT 질량 분광계 (워터스)로 분석을 위해 금-도금된 보로실리케이트 모세관 내로 로딩하였다. 단량체 신호 (MS)는 스펙트럼 내의 모든 피크의 면적에 대한 단량체 피크의 면적의 비율로서 규정되었다 (MS/(MS+DS) (여기서, DS = 이량체 신호). 평형시의 단량체의 농도 [M]eq는 MS·[M]0로서 규정되고, 여기서 [M]0는 단량체 기준에서 총 단백질 농도이다. 평형시의 이량체 농도 [D]eq는 ([M]0-[M]eq)/2로 규정되었다. 이어서, KD를 [D]eq 대 [M]eq 2의 그래프의 구배로부터 추출하였다. 비-공유 CH3-CH3 상호작용의 KD를 표 2에 제시한다.
Fab-아암 교환에 참여하는 능력과 비-공유 CH3-CH3 상호작용의 강도 사이의 상호관련성을 분석하였다. 도 15d/e는 대응하는 CH2-CH3 단편의 측정된 KD에 대해 그래프로 표시된 Fab-아암 교환 후의 이중특이적 결합의 비율을 보여준다 (IgG1은 도 15d; IgG4는 도 15e 참조). 상기 데이터는 시험된 조건 하에 효율적인 Fab-아암 교환을 허용하는 CH3-CH3 상호작용의 겉보기 KD 값의 특정 범위가 존재함을 시사한다.
Figure pct00009
실시예 22: IgG1 -2F8-F405L과 IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 시험관내 Fab - 아암 -교환에 의한 이중특이적 항체의 생성을 유도하는 그의 능력에 대한 상이한 환원제의 분석
2-MEA 및 DTT는 인간 IgG1-ITL과 IgG4-CPPC 사이의 시험관내 Fab-아암-교환을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (도 12). 상기 환원제가 또한 인간 IgG1-2F8-F405L과 IgG1-7D8-K409R 사이의 시험관내 Fab-아암-교환을 유도할 수 있는지 시험하였다. 2-MEA, DTT, GSH 및 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)의 농도 계열을 시험하였다. Fab-아암-교환을 실시예 18에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상이한 환원제의 시험된 농도 계열은 다음과 같았다: 0.0, 0.04, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0, 25.0, 50.0 mM 2-MEA, GSH, DTT 또는 TCEP.
도 17은 2-MEA가 25 mM 2-MEA의 농도에서 최대 Fab-아암-교환을 유도함을 확인해주고, 이것은 보다 고농도의 50.0 mM 2-MEA에서 지속되었다. DTT는 이중특이적 항체의 생성에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌고, 최대 Fab-아암-교환은 0.5 mM DDT에서 도달하였고, 이것은 또한 보다 고농도의 DTT (1.0-50.0 mM)에 걸쳐서 지속되었다. 또한, TCEP는 이중특이적 항체의 생성에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌고, 최대 Fab-아암-교환은 0.5 mM에서 도달하였다. 농도 ≥ 25.0 mM에서, TCEP에 의한 Fab-아암-교환은 붕괴되었다. 0.0-5.0 mM의 GSH 농도는 Fab-아암-교환에 의한 이중특이적 항체의 생성을 유도할 수 없었다. 보다 높은 GSH 농도 (25.0-50.0 mM)는 항체 응집체의 형성을 유발하였다 (데이터 미제시). 따라서, 상기 샘플은 분석으로부터 제외하였다. 상기 데이터는 2개의 상이한 항체 사이의 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성이 상이한 환원제에 의해 유도될 수 있음을 보여준다.
실시예 23: IgG1 -2F8-F405L과 IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성
인간 IgG1-2F8-F405L과 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 형성을 확인하기 위해, 2-MEA의 농도 계열을 사용한 Fab-아암-교환 반응으로부터의 샘플의 분자량을 ESI-MS에 의해 결정하였다. 시험된 농도 계열은 다음과 같다: 0.0, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0, 25.0 및 40.0 mM 2-MEA. Fab-아암- 교환 (PBS 내의) 및 샌드위치 ELISA를 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다. ESI-MS를 실시예 12에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 18a는 2-MEA가 IgG1-2F8-F405L과 IgG1-7D8-K409R 사이의 Fab-아암-교환을 용량-의존성 방식으로 유도하고, 이중특이적 항체의 생성을 효율적으로 유발하고, 이중특이적 결합의 최대 수준은 15.0 mM 2-MEA의 농도에서 도달함을 보여준다. 정량된 ESI-MS 데이터는 도 18b에 제시되고, IgG1-2F8-F405L과 IgG1-7D8-K409R 사이의 Fab-아암-교환이 거의 100%의 이중특이적 항체를 생성함을 보여주고, 이중특이적-결합 ELISA로부터의 결과를 확인해준다.
실시예 24: 인간 IgG1 -2F8-F405L x IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 -교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 순도
인간 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 군을 PD-10 탈염 칼럼 (cat. no. 17-0851-01; 지이 헬쓰케어)을 사용하여 정제하였다. 이어서, 이중특이적 생성물의 순도를 실시예 12에 기재된 바와 같이 질량 분광법에 의해 분석하였다.
도 19는 출발 물질 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R, 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 Fab-아암-교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물의 질량 분광 프로파일을 보여준다. Fab-아암-교환된 샘플 내의 생성물은 146,160.7 kDa이고, IgG1-2F8-F405L (146,606.8/2=73,303.3) x IgG1-7D8-K409R (146,312.2/2=73,156.1)로부터 유래된 이중특이적 생성물 (= 146,459.4 kDa)과 일치한다. 또한, 이중특이적 항체 생성물은 균일한 피크를 보였고, 이것은 하위 분할된 피크를 생성하는 경쇄 미스쌍형성이 발생하지 않았음을 나타낸다. 상기 데이터는 Fab-아암-교환이 약 100% 이중특이적 항체를 생성함을 보여준다.
실시예 25: 2- MEA -유도 Fab - 아암 -교환에 의해 IgG1 -2F8-F405L x IgG1 -7 D8 - K409R 로부터 생성된 이중특이적 항체의 안정성 및 약동학에 대한 생체내 분석
실시예 14에 기재된 바와 같이 그의 안정성 (생체내 Fab-아암-교환) 및 약동학적 특성을 분석하기 위해 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 시험관내 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 의해 생성된 이중특이적 항체를 SCID 마우스에 주사하였다. 2개의 군의 마우스 (3마리의 마우스/군)를 분석하였다: (1) 100 ㎍ 이중특이적 항체; (2) 100 ㎍ 이중특이적 항체 + 1,000 ㎍ 무관한 IgG4 (IgG4-637, WO2007068255에 기재됨). 혈장 샘플 내의 총 IgG 농도를 실시예 14에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하되, 본 실시예에서는 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG (잭슨, cat. no. 109-035-098, 1/10,000)를 검출을 위한 접합체로서 사용하였다. 혈장 샘플 내의 이중특이적 항체의 존재를 실시예 14에 기재된 바와 같이 샌드위치 ELISA로 CD20 및 EGFR 이중특이적 반응성에 의해 검정하고 정량하였다.
도 20a는 시간에 따른 총 항체 혈장 농도를 보여준다. 혈장 클리어런스율 곡선의 형태는 두 군에서 동일하였다. 도 20b는 시간에 따른 이중특이적 항체의 혈장 농도를 보여준다. 10배 과량의 무관한 IgG4를 이중특이적 항체에 첨가하여도 이중특이적 항체 농도에 영향을 주지 않았고, 이것은 Fab-아암-교환이 생체내에서 발생하지 않았음을 나타낸다. 상기 데이터는 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 시험관내 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 의해 생성된 이중특이적 항체 생성물이 생체내에서 안정함 (Fab-아암-교환 부재)을 보여준다.
실시예 26: 인간 IgG1 -2F8-F405L x IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 -교환에 의해 생성된 이중특이적 항체에 의한 CDC -매개 세포 사멸
CD20 항체 IgG1-7D8은 보체-의존성 세포독성 (CDC)에 의해 CD20-발현 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있다. 이와 대조적으로, EGFR 항체 IgG1-2F8은 EGFR을 발현하는 표적 세포에 대한 CDC를 매개하지 않는다. 돌연변이체 IgG1-7D8-K409R, 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 의해 생성된 이중특이적 항체가 여전히 CD20-발현 세포에 대해 CDC를 유도할 수 있는지 시험하였다. 105개의 다우디 또는 라지 세포를 주변 온도에서 진탕기에서 0.1% BSA로 보충된 80 ㎕ RPMI 배지에서 항체의 농도 계열과 함께 15 min 동안 예비-인큐베이션하였다. 20 ㎕의 정상 인간 혈청 (NHS)을 보체 (20% NHS 최종 농도)의 공급원으로서 첨가하고, 45 min 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 0.1% BSA로 보충된 30 ㎕ 빙냉 RPMI 배지를 첨가하여 CDC 반응을 중지시켰다. 죽은 및 생존가능 세포는 10 ㎕의 10 ㎍/ml 아이오딘화프로피듐 (PI) (1 ㎍/ml 최종 농도)을 첨가하고 FACS 분석에 의해 구별하였다.
도 21은 IgG1-7D8에 의한 CD20-발현 다우디 (도 21a) 및 라지 (도 21b) 세포의 CDC-매개 세포 사멸은 K409R 돌연변이의 도입에 의해 영향받지 않음을 보여준다. 다우디 및 라지 세포 둘 모두는 EGFR을 발현하지 않고, IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 일가 결합을 유발한다. 그럼에도 불구하고, 이중특이적 항체는 CD20-발현 세포의 CDC-매개 세포 사멸을 계속 유도하였다. 상기 데이터는 모 항체의 CDC 능력이 이중특이적 포맷에서 유지됨을 나타낸다.
실시예 27: 인간 IgG1 -2F8-F405L x IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 -교환에 의해 생성된 이중특이적 항체에 의한 ADCC -매개 세포 사멸
EGFR 항체 IgG1-2F8은 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 의해 EGFR-발현 세포, 예컨대 A431을 사멸시킬 수 있다. A431 세포는 CD20을 발현하지 않고, 따라서 CD20 항체 IgG1-7D8은 상기 세포에 대해 ADCC를 유도하지 않는다. 돌연변이체 IgG1-2F8-F405L, 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 의해 생성된 이중특이적 항체가 여전히 A431 세포에 대해 ADCC를 유도할 수 있는지 시험하였다. 이펙터 세포 단리, 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 류코세프 (Leucosep)® 관 (그라이너 바이오-원, cat.# 227290)를 제조자의 권장사항에 따라 사용하여 건강한 공여자의 전혈로부터 단리하였다. 100 μCi 51Cr을 0.1% BSA로 보충된 1 ml RPMI 배지 내의 5x106개의 A431 세포에 첨가함으로써 표적 세포를 표지하고, 37℃ 진탕 수조에서 60 min 동안 인큐베이션하였다. 표지된 세포를 세척하고, 0.1% BSA로 보충된 RPMI 내에 재현탁시켰다. 0.1% BSA로 보충된 RPMI 내의 5x104개의 표지된 표적 세포를 주변 온도에서 항체 농도 계열 (3배 희석액 내의 ADCC 검정에서의 0-10 ㎍/ml 최종 농도 범위)과 함께 15 min 동안 100 ㎕에서 예비인큐베이션하였다. ADCC 검정은 100:1의 E:T 비에서 50 ㎕ 이펙터 세포 (5x106 세포)를 첨가함으로써 출발하였다. 37℃에서 4시간 후에, 삼중 실험으로부터의 51Cr 방출을 분당 계수 (cpm)로서 섬광계수기로 측정하였다. 세포 독성의 비율은 다음 식을 사용하여 계산하였다: 특이적 용해의 비율 = (실험 cpm - 기초 cpm)/(최대 cpm - 기초 cpm) X 100. 최대 51Cr 방출은 50 ㎕의 5% 트리톤 (Triton) X-100을 50 ㎕ 표적 세포 (5x104개의 세포)에 첨가함으로써 결정하고, 기초 방출은 감작 (sensitizing) 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에 측정하였다.
도 22는 CD20-특이적 항체 IgG1-7D8이 CD20-음성 A431 세포에 대한 ADCC를 유도하지 않았음을 보여준다. IgG1-2F8 및 돌연변이체 IgG1-2F8-F405L은 모두 A431 세포에 대해 ADCC를 유도할 수 있었고, 이것은 IgG1-2F8에 대한 F405L 돌연변이의 도입이 그의 ADCC 이펙터 기능에 영향을 주지 않았음을 나타낸다. 또한, IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R로부터 유래된 이중특이적 항체가 A431 세포에 대한 ADCC를 용량-의존성 방식으로 유도하고, 이것은 ADCC 이펙터 기능이 이중특이적 포맷에서 유지됨을 나타낸다.
실시예 28: IgG1 - K409R 과 함께 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 405 위치의 결정자
실시예 16에서 F405L 돌연변이가 IgG4-7D8과 조합될 때 인간 IgG1을 Fab-아암 교환에 참여하도록 하기에 충분함이 설명되었다. 인간 IgG1-K409R과 조합되어 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 405 위치의 결정자를 추가로 시험하기 위해, 모든 가능한 IgG1-2F8-F405X 돌연변이체 (C 및 P를 제외한)를 IgG1-7D8-K409R과 조합하였다. 절차를 실시예 19에 기재된 바와 같이 정제된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 23은 IgG1-2F8-F405X x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA 유도 Fab-아암 교환시에 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 상기 데이터는 또한 표 3에 제시된 바와 같이 (-) Fab-아암 교환 부재, (+/-) 낮은, (+) 중간 또는 (++) 높은 Fab-아암 교환으로서 평가된다. Fab-아암 교환 부재 (-)는 IgG1-2F8의 405 위치가 F (= 야생형 IgG1)일 때 발견되었다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 405 위치가 G 또는 R일 때 낮은 (+/-) 것으로 밝혀졌다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 405 위치가 A, D, E, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W 또는 Y일 때 높은 (++) 것으로 밝혀졌다. 상기 데이터는 IgG1 405 위치의 특정 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 IgG1이 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 참여하도록 할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00010
실시예 29: IgG1 - K409R 과 함께 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 407 위치의 결정자
실시예 28에서 위치 F405에서 특정 단일 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 인간 IgG1을 Fab-아암 교환에 참여하도록 하기에 충분함이 설명되었다. CH3 도메인 내의 Fc:Fc 계면 위치에 관련되는 다른 결정자가 또한 Fab-아암-교환 메카니즘을 매개할 수 있는지 시험하기 위해, IgG1 407 위치의 돌연변이 유발을 수행하고, 돌연변이체가 인간 IgG1-K409R과 조합하여 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 참여하는지 시험하였다. 모든 가능한 IgG1-2F8-Y407X 돌연변이체 (C 및 P를 제외한)를 IgG1-7D8-K409R과 조합하였다. 절차를 실시예 19에 기재된 바와 같이 정제된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 24는 IgG1-2F8-Y407X x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암-교환 시에 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 상기 데이터는 또한 표 4에 제시된 바와 같이 (-) Fab-아암 교환 부재, (+/-) 낮은, (+) 중간 또는 (++) 높은 Fab-아암 교환으로서 평가하였다. Fab-아암 교환 부재 (-)는 IgG1-2F8의 407 위치가 Y (= 야생형 IgG1), E, K, Q, 또는 R일 때 발견되었다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 407 위치가 D, F, I, S 또는 T일 때 낮고 (+/-), IgG1-2F8의 407 위치가 A, H, N 또는 V일 때 중간 (+)이고, IgG1-2F8의 407 위치가 G, L, M 또는 W일 때 높은 (++) 것으로 밝혀졌다. 상기 데이터는 IgG1 407 위치의 특정 단일 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 IgG1이 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 참여하도록 할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00011
실시예 30: IgG1 이종이량체에서 비-공유 CH3 - CH3 상호작용의 정량
효율적인 Fab-아암-교환을 허용하는, CH3-CH3 동종이량체 상호작용의 강도의 특이적인 범위가 존재한다고 실시예 21에서 설명하였다. CH3 계면에서 상호작용의 강도는 모 항체 (동종이량체) 내의 두 중쇄가 Fab-아암 교환 반응에서 해리되고 후속적으로 이종이량체화 반응에서 회합될 수 있도록 하는 것이어야 한다. 안정한 이종이량체를 생성하기 위해서, 이종이량체 상호작용의 강도는 동종이량체화보다 이종이량체화에 유리하도록 동종이량체 상호작용의 강도보다 더 커야 한다. 이를 확인하기 위해서, 이종이량체에서 CH3-CH3 상호작용의 강도를 측정하고 동종이량체에서의 강도와 비교하였다. IgG1-K409R, IgG1-F405L 및 IgG1-ITL 동종이량체로부터 유래된 CH2-CH3 단편의 KD는 실시예 21에 기재된 바와 같이 측정하였다. 이종이량체에서 KD의 결정을 위해, CH2-CH3 도메인 단편 (G1-F405L 및 G1-ITL)을 힌지를 제외하고 모든 항체 도메인을 함유하는 IgG1-7D8-K409R의 IgG1△힌지 단편과 혼합하였다. 두 단편에서 힌지 영역의 결여는 공유 중쇄간 디술피드 결합을 방지하였다. 단편을 혼합하고, 실시예 21에 기재된 바와 같이 천연 질량 분광법에 의해 24시간 후에 분석하였다. 표시된 CH2-CH3 단편 또는 CH2-CH3 단편과 IgG1△힌지의 혼합물에서 비-공유 CH3- CH3 상호작용의 KD 값을 표 5에 제시한다. 상기 데이터는 시험된 조건 하에 이종이량체 상호작용의 강도가 대응하는 동종이량체 상호작용보다 더 큼 (더 낮은 KD)을 시사한다.
Figure pct00012
실시예 31: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 생화학적 분석
인간 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 군을 PD-10 탈염 칼럼 (cat. no. 17-0851-01; 지이 헬쓰케어) 상에서 정제하였다. 이어서, 이중특이적 생성물의 순도를 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC), 질량 분광법, HPLC 양이온 교환 크로마토그래피 (HPLC-CIEX), 모세관 등전집중 (cIEF)에 의해 분석하였다.
SDS-PAGE를 실시예 15에 기재된 바와 같이 비-환원 (도 25a) 및 환원 (도 25b) 조건 하에서 수행하였다. 도 25a는 2-MEA 유도 Fab-아암 교환 후의 항체 샘플이 무손상 IgG로 이루어짐을, 비-환원된 겔 상에서 검출가능한 1/2 분자 (H1L1)의 흔적과 함께 보여준다.
HP-SEC를 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 26(b) 및 도 26(a)는 각각 출발 물질 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 HP-SEC 프로파일을 보여준다. 두 항체, 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA 유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물의 혼합물 (1:1)을 각각 도 26c 및 도 26d에 제시한다. 또한, 도 26d는 >99%의 샘플이 무손상 IgG로 이루어지고, 사실상 응집체가 형성되지 않았음을 보여준다.
질량 분광법 (ESI-MS)을 실시예 12에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 27(b) 및 도 27(a)는 각각 출발 물질 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 질량 분광 프로파일을 보여준다. 두 항체, 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA 유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물의 혼합물 (1:1)을 각각 도 27c 및 도 27d에 제시한다. 2-MEA 유도 Fab-아암 교환된 샘플 내의 생성물은 146,159.7 kDa이고, 이것은 IgG1-2F8-F405L (146,289.0/2=73,145) x IgG1-7D8-K409R (146,028.0/2=73,014)로부터 유래된 이중특이적 생성물과 완벽하게 일치한다. 또한, 이중특이적 항체 생성물은 균일한 피크를 보였고, 이것은 하위 분할된 피크를 생성하는 경쇄 미스쌍형성이 발생하지 않았음을 나타낸다. 상기 데이터는 2-MEA 유도 Fab-아암 교환이 이중특이적 IgG를 생성함을 보여준다. (*)로 표시된 작은 피크는 분석 전의 불완전한 탈글리코실화에 의한 것이었다. 상기 데이터는 이중특이적 항체 샘플이 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성되었음을 보여준다.
모세관 등전집중 (cIEF)은 iCE280 애널라이저 (Analyzer) (컨버전트 바이오사이언시스 (Convergent Biosciences))를 사용하여 수행하였다. 도 28a 및 도 28b는 각각 출발 물질 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 cIEF 프로파일을 보여준다. 두 항체, 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물의 혼합물 (1:1)을 각각 도 28c 및 도 28d에 제시한다. 모든 샘플은 사용 전에 탈염하였다. 검정 믹스 내의 최종 농도는 0.3 mg/ml IgG (0.35% 메틸 셀룰로스; 2% 담체 암폴라이트 3-10; 6% 담체 암폴라이트 8-10.5; 0.5% pI 마커 7.65 및 0.5% pI 마커 10.10)이었다. 집중은 7 min 동안 3000 V에서 수행하였고, 전체 모세관 흡수 영상은 전하 결합 소자 카메라에 의해 캡쳐하였다. 피크 프로파일의 교정 후에, 데이터를 EZChrom 소프트웨어에 의해 분석하고, pI 마커는 (*)로 표시한다. 상기 데이터는 이중특이적 항체 샘플이 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성되었음을 보여준다.
모노클로날 항체의 하전된 이소형을 연구하기 위한 또 다른 기술은 고압 액체 크로마토그래피 양이온 교환 (HPLC-CIEX)이다. 도 29a 및 도 29b는 각각 출발 물질 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 HPLC-CIEX 프로파일을 보여준다. 두 항체, 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA 유도된 Fab-아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 생성물의 혼합물 (1:1)을 각각 도 29c 및 도 29d에 제시한다. 샘플을 HPLC 내로의 주입을 위해 이동상 A (10 mM NaPO4, pH 7.0) 내에 1 mg/ml로 희석하였다. 상이하게 하전된 IgG 분자를 1 ml/min의 유속에서 ProPac® WCX-10, 4 mm x 250 mm, 분석 칼럼을 사용하여 분리하였다. 용리는 이동상 A에서 이동상 B (10 mM NaPO4, pH 7.0, 0.25 M NaCl)로의 구배를 사용하여 수행하고, 검출은 280 nM에서 발생하였다. 상기 데이터는 이중특이적 항체 샘플이 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성되었음을 보여준다. 이것은 또한 양이온 교환이 잔류 동종이량체를 이종이량체로부터 분리하기 위한 강력한 도구임을 보여준다. 양이온 교환 크로마토그래피의 또 다른 용도는 따라서 이중특이적 이종이량체의 제거, 즉 교환 후에 임의의 잔류 동종이량체를 정제하는 것이다.
실시예 32: 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환의 동역학의 모니터링 및 HPLC - CIEX 를 사용한 교환 후에 잔류 동종이량체의 정량
2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성은 실시예 11에서 설명하였다. 상기 실시예에서, 교환 반응은 교환 반응 동안 다양한 시점에서 고압 액체 크로마토그래피 양이온 교환 (HPLC-CIEX; 실시예 31에 기재된 바와 같이)을 수행함으로써 모니터링하였다.
동종이량체 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R을 각각 1 mg/ml의 농도에서 몰비 1:1로 혼합하였다. 25 mM 2-MEA의 첨가 후에, 샘플을 HPLC의 자동 샘플주입기에 넣고, 25℃에서 예열하였다. 도 30a 내지 30h는 2-MEA의 첨가 후에 각각 t = 0 min 내지 t = 450 min에 걸쳐 HPLC-CIEX에 의해 얻은, 상이한 시간 간격의 8회의 연속 주사를 보여준다. 데이터는 이중특이적 IgG가 보다 신속하게 형성되고 대부분의 동종이량체가 135 min 후에 교환됨을 보여준다. 45 min 후에 나타나는 불균일 이종이량체 피크는 약 180 min 후에 보다 균질한 피크로 분해되고, 이것은 교환이 상이한 상에서 발생함을 제시한다. 또한, 도 31a는 약 3%의 잔류 동종이량체가 CIEX 방법으로 검출됨을 보여준다 (화살표로 표시됨). 제시된 바와 같이, 상기 방법은 남아있는 동종이량체 함량의 정량에 적합하다 (교환 반응이 거의 완전할 때 동종이량체의 용리는 도 31b에 도시됨).
실시예 33: 다양한 2- MEA 농도, 온도 및 인큐베이션 시간에서 높은 항체 농도에서의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성
2-MEA 유도 Fab-아암 교환을 높은 IgG 농도에서 수행하였다. 교환의 양에 대한 2-MEA 농도, 인큐베이션 온도 및 시간의 영향을 연구하였다.
교환 과정은 IgG1-7D8-K409R x IgG1-2F8-F405L의 조합을 사용하여 수행하였다. 두 물질을 단백질 A를 사용하여 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. >20 mg/ml으로의 물질의 농축 후에, 연속적인 음이온 교환 단계를 HiPrep Q FF 16/10 (지이 헬쓰 케어, #28-9365-43)을 사용하여 수행하였다 (관류 방식으로). 최종 정제된 물질에 대해 PBS로 완충제를 교환하였다.
이중특이적 교환을 PBS 내의 20 mg/ml (최종 농도 10 mg/ml의 각각의 동종이량체) 및 10 mg/ml (최종 농도 5 mg/ml의 각각의 동종이량체)의 최종 IgG 농도에서 연구하였다. 별개의 혼합물을 10, 25, 50 및 100 mM의 최종 농도에서 2-MEA를 포함하는 두 IgG 농도에 대해 제조하였다. 혼합물을 에펜도르프관에 100 ㎕ 분취액으로 나누어 15, 25 및 37℃에서 보관하였다. 별개의 관을 각각의 온도에서 90 min, 5시간 및 24시간의 상이한 인큐베이션 시간 동안 사용하였다.
혼합물을 또한 두 IgG 농도에 대해 2-MEA 없이 제조하고 미처리된 대조군으로서 4℃에서 보관하였다. 적절한 인큐베이션 시간 후에, 90 min 및 5시간 샘플을 2-MEA를 제거하기 위해 탈염을 위해 수거하였다 (90 min 샘플은 교환 반응을 중지시키기 위해서 초기에 얼음 상에 두었다). 샘플을 제바 96-웰 탈염 플레이트 (7k, cat# 89808, 써모 피셔 사이언티픽)를 이용하여 탈염하였다. 24시간 샘플들을 24시간 인큐베이션 후에 따로 탈염하였다.
항체 샘플의 연속 희석액 (90 min 및 5시간 샘플에 대해 3배 희석액 내의 총 항체 농도 10 - 0.123 ㎍/ml; 24시간 샘플에 대해 3배 희석액 내의 10 - 0.041 ㎍/ml)을 실시예 7에 기재된 바와 같이 이중특이적 결합을 측정하기 위해 샌드위치 ELISA에 사용하였다. 각각의 플레이트에 대해, IgG1-2F8-ITL과 IgG4-7D8-CPPC 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환으로부터 유래된 이중특이적 항체의 정제된 군 (실시예 15에 기재된 바와 같이)의 대조군을 포함시켰다. 도 32(a)-(f)는 개개의 ELISA 플레이트에서 측정된 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 최고 OD405 값 (ELISA에서 10 ㎍/ml 농도에 대해 결정된)을 임의로 100%로 설정된 대조군에 비해 이중특이적 결합을 계산하기 위해 사용하였다. 이를 통해 각각의 2-MEA 농도에 대해 도 33(a)-(d)에서 제시된 바와 같이 대조군에 비해 제어된 Fab-아암 교환 비율 (% cFAE)을 얻었다.
데이터는 이중특이적 결합의 최대 수준 (대조군에 대해 89-109%)이 모든 온도-시간 조건에서 두 IgG 농도에 대해 100 mM 2-MEA의 농도에서 도달하였음을 보여준다. 50 mM 2-MEA에서, 최대 결합 (88-107%)은 25℃ 및 37℃ 및 또한 15℃에서 24시간 인큐베이션 후에 달성되었다. 25 mM 및 10 mM 2-MEA의 보다 낮은 농도에 대해, 교환은 보다 높은 온도에서 더 효율적이었고, 긴 인큐베이션 시간에서 증가하여, 25 mM 2-MEA에서 24시간 인큐베이션시에 37℃에서 최대 교환을 유도하였다. 10 mM 2-MEA에서 시험된 어떠한 조건도 100% 이중특이적 생성물을 생성하지 않았다. 교환 과정은 20 mg/ml 총 IgG에 비해 10 mg/ml의 IgG 농도에서 약간 더 빨랐다.
이중특이적 항체가 형성되었는지 확인하고 이중특이적 생성물을 보다 상세하게 연구하기 위해서, 샘플을 양이온 교환 (HPLC-CIEX) 분석으로 분석하였다. HPLC-CIEX 분석을 5시간 및 24시간 인큐베이션 후의 20 mg/ml의 IgG 농도 및 모든 2-MEA 농도를 사용하여 샘플에 대해 실시예 31에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 34(a)-(d)의 CIEX 크로마토그램은 이중특이적 생성물의 최고 수율이 50 및 100 mM 2-MEA에서 얻어짐을 보여주고, 이것은 이중특이적 ELISA의 결과를 확인해준다. 그러나, 소량의 잔류 동종이량체가 50 및 100 mM 2-MEA에서 계속 검출되었다 (25℃ 및 37℃에서 인큐베이션된 샘플에 대해 2 - 3.5%의 각각의 동종이량체). 보다 높은 온도, 보다 긴 (24시간) 인큐베이션 시간 및 증가하는 2-MEA 농도에서의 교환은 CIEX 프로파일에서 22-24 min에서의 추가의 피크의 출현을 유발한다.
최소량의 추가의 피크는 교환이 5시간 내에 종료될 때 얻어졌다. 상기 피크의 특성을 확인하기 위해, SDS-PAGE 분석 및 HP-SEC 분석을 수행하였다. HP-SEC는 응집체의 양이 모든 조건에 대해 1% 미만임을 보여주고, 이것은 추가의 피크가 응집체를 나타내지 않음을 시사한다. 그러나, 비-환원 SDS-PAGE는 추가의 피크가 하나 또는 2개의 경쇄가 결여된 이종이량체를 제시할 수 있음을 나타내었다. 소량의 1/2-분자도 검출되었다.
실험은 교환 반응이 높은 동종이량체 농도에서 발생하고 (이것은 공정을 상업적 규모에서 매력적인 것으로 만든다), 이중특이적 항체의 수율이 2-MEA 농도, 온도 및 인큐베이션 시간에 따라 결정됨을 보여준다.
실시예 34: IgG1 - K409R 과 함께 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 368 위치의 결정자
실시예 28 및 29는 위치 F405 및 Y407의 특정 단일 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 인간 IgG1이 Fab-아암 교환에 참여할 수 있도록 하기에 충분함을 보여준다. 본 실시예에서 입증되는 바와 같이, CH3 도메인 내의 Fc:Fc 계면 위치에 관련되는 추가의 결정자는 또한 Fab-아암 교환 메카니즘을 매개할 수 있다. 상기 효과에 IgG1 368 위치의 돌연변이 유발을 수행하고, 돌연변이체를 인간 IgG1-K409R과 함께 2-MEA-유도 Fab-아암-교환의 참여에 대해 시험하였다. 모든 가능한 IgG1-2F8-L368X 돌연변이체 (C 및 P를 제외한)를 IgG1-7D8-K409R과 조합하였다. 절차를 실시예 19에 기재된 바와 같이 정제된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 35는 IgG1-2F8-L368X x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 시의 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 이들 데이터는 또한 표 6에 제시된 바와 같이 (-) Fab-아암 교환 부재, (+/-) 낮은, (+) 중간 또는 (++) 높은 Fab-아암 교환으로서 평가되었다. Fab-아암 교환 부재 (-)는 IgG1-2F8의 368 위치가 L (= 야생형 IgG1), F 또는 M일 때 발견되었다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 368 위치가 Y일 때 낮은 (+/-) 것으로 밝혀졌다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 368 위치가 K일 때 중간 (+)이고, IgG1-2F8의 368 위치가 A, D, E, G, H, I, N, Q, R, S, T, V, 또는 W일 때 높은 (++) 것으로 밝혀졌다. 상기 데이터는 IgG1 368 위치의 특정 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 IgG1이 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 참여하도록 할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00013
실시예 35: IgG1 - K409R 과 함께 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 370 위치의 결정자
실시예 28, 29 및 34는 위치 F405, Y407 또는 L368에서의 특정 단일 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 인간 IgG1이 Fab-아암 교환에 참여할 수 있도록 하기에 충분함을 보여준다. 본 실시예에서 입증되는 바와 같이, CH3 도메인 내의 Fc:Fc 계면 위치에 관련되는 추가의 결정자는 또한 Fab-아암 교환 메카니즘을 매개할 수 있다. 상기 효과에 IgG1 370 위치의 돌연변이 유발을 수행하고, 돌연변이체를 인간 IgG1-K409R과 함께 2-MEA-유도 Fab-아암-교환의 참여에 대해 시험하였다. 모든 가능한 IgG1-2F8-K370X 돌연변이체 (C 및 P를 제외한)를 IgG1-7D8-K409R과 조합하였다. 절차를 실시예 19에 기재된 바와 같이 정제된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 36은 IgG1-2F8-K370X x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 시의 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 상기 데이터는 또한 표 7에 제시된 바와 같이 (-) Fab-아암 교환 부재, (+/-) 낮은, (+) 중간 또는 (++) 높은 Fab-아암 교환으로서 평가된다. Fab-아암 교환 부재 (-)는 IgG1-2F8의 370 위치가 K (= 야생형 IgG1), A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V 또는 Y일 때 발견되었다. 단지 K370의 W에 의한 치환만이 중간 Fab-아암 교환 (+)을 유발하였다. 상기 데이터는 IgG1 370 위치의 하나의 돌연변이 (K370W)만이 IgG1-K409R과 조합될 때 IgG1이 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 참여하도록 할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00014
실시예 36: IgG1 - K409R 과 함께 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 399 위치의 결정자
실시예 28, 29, 34 및 35는 위치 F405, Y407, L368 또는 K370에서 특정 단일 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 인간 IgG1이 Fab-아암 교환에 참여할 수 있도록 하기에 충분함을 보여준다. 본 실시예에서 입증되는 바와 같이, CH3 도메인 내의 Fc:Fc 계면 위치에 관련되는 추가의 결정자는 또한 Fab-아암 교환 메카니즘을 매개할 수 있다. 상기 효과에 IgG1 399 위치의 돌연변이 유발을 수행하고, 돌연변이체를 인간 IgG1-K409R과 함께 2-MEA-유도 Fab-아암-교환의 참여에 대해 시험하였다. 모든 가능한 IgG1-2F8-D399X 돌연변이체 (C 및 P를 제외한)를 IgG1-7D8-K409R과 조합하였다. 절차를 실시예 19에 기재된 바와 같이 정제된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 37은 IgG1-2F8-D399X x IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 시의 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 상기 데이터는 또한 표 8에 제시된 바와 같이 (-) 부재, (+/-) 낮은, (+) 중간 또는 (++) 높은 Fab-아암 교환으로서 평가하였다. Fab-아암 교환 부재 (-)는 IgG1-2F8의 399 위치가 D (= 야생형 IgG1), E 및 Q일 때 발견되었다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 399 위치가 V일 때 낮고 (+/-), IgG1-2F8의 399 위치가 G, I, L, M, N, S, T 또는 W일 때 중간 (+)인 것으로 밝혀졌다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 399 위치가 A, F, H, K, R 또는 Y일 때 높은 (++) 것으로 밝혀졌다. 상기 데이터는 IgG1 399 위치의 특정 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 IgG1이 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 참여하도록 할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00015
실시예 37: IgG1 - K409R 과 함께 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 참여하기 위한 IgG1 366 위치의 결정자
실시예 28, 29, 34, 35 및 36은 위치 F405, Y407, L368, K370 또는 D399에서 특정 단일 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 인간 IgG1이 Fab-아암 교환에 참여할 수 있도록 하기에 충분함을 보여준다. 본 실시예에서 입증되는 바와 같이, CH3 도메인 내의 Fc:Fc 계면 위치에 관련되는 추가의 결정자는 또한 Fab-아암 교환 메카니즘을 매개할 수 있다. 상기 효과에 IgG1 366 위치의 돌연변이 유발을 수행하고, 돌연변이체를 인간 IgG1-K409R과 함께 2-MEA-유도 Fab-아암-교환의 참여에 대해 시험하였다. 모든 가능한 IgG1-2F8-T366X 돌연변이체 (C 및 P를 제외한)를 IgG1-7D8-K409R과 조합하였다. 절차를 실시예 19에 기재된 바와 같이 정제된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 38은 IgG1-2F8-T366X와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 시의 이중특이적 결합의 결과를 보여준다. 상기 데이터는 또한 표 X에 제시된 바와 같이 (-) 부재, (+/-) 낮은, (+) 중간 또는 (++) 높은 Fab-아암 교환으로서 평가하였다. Fab-아암 교환 부재 (-)는 IgG1-2F8의 366 위치가 T (= 야생형 IgG1), K, R, S 또는 W일 때 발견되었다. Fab-아암 교환은 IgG1-2F8의 366 위치가 F, G, I, L, M 또는 Y일 때 낮고 (+/-), IgG1-2F8의 366 위치가 A, D, E, H, N, V 또는 Q일 때 중간 (+)인 것으로 밝혀졌다. 상기 데이터는 IgG1 366 위치의 특정 돌연변이가 IgG1-K409R과 조합될 때 IgG1이 2-MEA-유도 Fab-아암-교환에 참여하도록 할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00016
실시예 38: 고도로 효율적인 IgG1 돌연변이체를 구별하기 위해 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환이 최적 미만으로 발생하는 조건 범위의 결정
2-MEA-유도 Fab-아암 교환의 과정은 25 mM 2-MEA가 사용될 때 37℃에서 효율적으로 발생한다. 상기 조건 하에서, 대부분의 허용성 IgG1 돌연변이체 (실시예 19, 28, 29, 및 34-37에 기재된 바와 같이 위치 366, 368, 370, 399, 405 및 407 및/또는 409에 특정 단일 돌연변이를 갖는 IgG1)는 높은 수준의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 (80% - 100%)을 보인다. 최고 효능을 갖는 IgG1 돌연변이체의 구별을 가능하도록 하는 실험 조건을 확인하기 위해, 4개의 상이한 돌연변이체 조합 (IgG1-2F8-F405S x IgG1-7D8-K409A, IgG1-2F8-D399R x IgG1-7D8-K409G, IgG1-2F8-L368R x IgG1-7D8-K409H 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R)에 대한 2-MEA-유도 Fab-아암 교환을 각각 15℃ 및 20℃에서 경시적으로 연구하였다. 온도, 기간 및 항체 희석액 (20, 2, 0.2 및 0.02 ㎍/ml) 변화와 무관하게, 절차는 실시예 19에 기재된 바와 같이 수행하였다.
20℃에서, 4개의 돌연변이체 조합의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환이 최대 교환 (양성 대조군)에 비해 상이한 속도로 발생하였다. 105 min 인큐베이션 후에, IgG1-2F8-L368R x IgG1-7D8-K409H는 최대 교환 수준에 도달한 반면, IgG1-2F8-F405S x IgG1-7D8-K409A, IgG1-2F8-D399R x IgG1-7D8-K409G 및 IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R은 200 min 후에 각각 최대치의 90%, 85% 및 85%에 도달하였다.
15℃에서 상이한 IgG1 돌연변이체 조합의 인큐베이션은 가장 현저한 교환 속도 차이를 보였다 (도 39에 제시됨). 4개의 돌연변이체 조합에서 2-MEA-유도 Fab-아암 교환의 차이는 60 및 105 min 인큐베이션 후에 가장 컸다. 200 min 인큐베이션 후의 Fab-아암 교환은 양성 대조군에 비해 100% (IgG1-2F8-L368R x IgG1-7D8-K409H), 85% (IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R 및 IgG1-2F8-D399R x IgG1-7D8-K409G) 또는 65% (IgG1-2F8-F405S x IgG1-7D8-K409A)의 효율을 보였다.
실시예 39: 최적 미만 조건에서 돌연변이체의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환 효율의 분석
2-MEA-유도 Fab-아암 교환의 과정은 25 mM 2-MEA가 사용될 때 37℃에서 효율적으로 발생한다. 상기 조건 하에서, 대부분의 허용성 IgG1 돌연변이체 (실시예 19, 28, 29, 및 34-37에 기재된 바와 같이 위치 366, 368, 370, 399, 405 및 407 및/또는 409에 특정 단일 돌연변이를 갖는 IgG1)는 높은 수준의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 (80-100%)을 보인다. 실시예 38에서, 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 효율의 차이는 소위 최적 미만 조건, 즉 60 내지 105 min 동안 15℃에서 인큐베이션 후에 가장 현저하다고 설명되었다. IgG1-7D8-K409R (실시예 28, 29, 및 34-37)을 사용한 >90% 2-MEA-유도 Fab-아암 교환을 보이는, L368, D399, F405 및 Y407에서의 총 24개의 IgG1-2F8 돌연변이체 (표 11 참조)를 선택하고, IgG1-7D8-K409A, G, H 또는 R (실시예 19에 보고된 결과를 기초로 함)을 사용한 Fab-아암 교환 분석에 적용하였다. 상기 돌연변이체 조합을 이중특이적 항체를 생성하는 효율에 대해 분류하기 위해, 2-MEA-유도 Fab-아암 교환을 15℃에서 90 min 동안 (최적 미만 조건) 수행하였다. IgG1-7D-K409R (실시예 29 및 36)을 사용한 인큐베이션 후에 약한 2-MEA-유도 Fab-아암 교환을 보인 2개의 IgG1-2F8 돌연변이체 (Y407Q) 및 (D399Q)를 추가의 음성 대조군으로서 함께 사용하고, K409 위치의 또 다른 아미노산 (G, H, 또는 W)을 사용한 인큐베이션이 상이한 결과를 유발하는지 연구하기 위해 사용하였다. 온도 변화 및 항체 희석액의 변화 (20, 2, 0.2 및 0.02 ㎍/ml)과 무관하게, 절차를 실시예 19에 기재된 바와 같이 수행하였다.
모든 상이한 IgG1 돌연변이체 조합 (표 10로부터 분명히 알 수 있는)의 15℃에서 90 min 동안의 인큐베이션은 다양한 상이한 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 효율을 보였다. 20 ㎍/ml의 항체 농도에서 이중특이적 결합의 결과를 표 10에 제시한다. 결과를 다음과 같이 4 클래스로 분류한다; 표 10의 아래에 제시된 기호의 설명에 구체적으로 제시된 바와 같이 부재 (-), 낮은 (+/-), 중간 (+) 및 높은 (++) 이중특이적 결합 효율. 상기 결과로부터, 최적 미만의 조건 하에서 IgG1 분자의 아미노산 돌연변이의 몇몇의 조합이 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 유리할 것임이 분명해진다.
Figure pct00017
Figure pct00018
시험된 돌연변이된 IgG1-2F8 분자 (표 10)로부터, 이전에 얻은 결과 (표 10)를 확인하기 위한 제2 분석을 위해 6개를 선택하였다. 몇몇의 돌연변이체는 높은 (IgG1-2F8-L368R) 및 중간 (IgG1-2F8-L368W, IgG1-2F8-F405I, IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-2F8-Y407W) 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 효율에 대해 선택되었다. 또한, IgG1-2F8-Y407Q는 IgG1-7D8-K409H와 예상치 못한 양성 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 반응을 보였기 때문에 다시 분석하였다. 일반적으로, 도 40에 제시된 상기 결과는 1차 분석 (표 10)을 확인해주고, 돌연변이된 IgG1-2F8 분자의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 반응을 보여주고, IgG1-7D8-K409H가 최고 효능을 보였다. 또한, 실시예 28, 29, 및 34-37에서 음성으로 보고된, 돌연변이된 IgG1-2F8 분자와 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환 반응은 IgG1 2-MEA-유도 Fab-아암 교환을 잠재적으로 촉진하는 것으로 계속 관심을 끌고 있다.
실시예 40: 동종이량체 단백질을 발현하는 CHO 세포의 생성
IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R을 발현하는 안정한 CHO-K1SV 세포주를, CHO-K1SV 숙주 세포 (론자 바이올로지스, 영국 슬라우)를 IgG 중쇄 및 경쇄 서열을 코딩하는 글루타민 합성효소 (GS) 발현 벡터 시스템 (론자 바이올로지스, 영국 슬라우)으로 형질감염시킴으로써 생성하였다. 세포를 단백질 미함유의 화학적으로 규정된 배지 (CD-CHO; cat. no. 10743-029; 인비트로젠, 라이프 싸이언시스, 네덜란드 브레다)에서 뉴클레오펙션 (nucleofection) (론자 바이올로지스, 영국 슬라우)을 사용하여 형질감염시켰다. 세포를 0.1 세포/웰로 글루타민-결핍 CD-CHO 배지에 플레이팅하였다. 글루타민-결핍 배지에서의 성장에 대해 저항성인 복제 세포주의 선택 후에, 세포를 CD-CHO 내에서의 현탁액 성장에 적응시키고, 동결 바이알에 보관하였다. 세포를 유전자 증폭에 적용하지 않았다. IgG를 생산하기 위해, 세포를 0.7 g/L L-타이로신 이나트륨 염 (cat. no. T1145-500; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 네덜란드 즈비인드레히트) 및 0.15 g/L L-시스테인 (cat. no. C7352; 시그마-알드리치)을 보충된 CD-CHO에 4.0 x 105 세포/ml의 농도로 μ-24 마이크로-반응기에 접종하고, 37℃에서 15일 동안, pH 7.00, 초기 교반 속도 70 rpm, 기체 유동 속도 20 slpm, 최대 산소 유동 속도 85% 및 DO 30%에서 인큐베이션하였다. 공급은 제3 일에 개시하고, 제14 일까지 지속하였다. 공급물은 화학적 규정 배지가 존재하는 CHO-효율적인 공급물로 이루어졌고, 각각 IgG-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R을 발현하는 CHO-K1SV 세포주에 대해 수거시에 ~ 1.3 - 3.4 및 0.1 - 3.5 g/L의 생산 수준을 제공하였다. 최고의 생산 세포주를 후속적으로 유사한 유가식 (fed-batch) 공정을 사용한 2-L 생물반응기의 가동을 위해 사용하였다. IgG를 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제 후에, IgG를 PBS 내에 제제화하였다.
실시예 41: 인간 IgG1 -2F8-F405L과 IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 형성
인간 IgG1-2F8-F405L과 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 생성된 40-mL 배치의 이중특이적 항체를 생산하였다. 최종 농도 10 mg/ml (즉, 총 20 mg/ml)의 각각의 항체의 항체 혼합물을 50 mM 2-MEA의 존재 하에 25℃에서 5시간 동안 PBS 내에서 인큐베이션하였다. 항체 혼합물을 얼음 상에서 O/N 보관하였다. 배치를 HiPrep 26/10 탈염 칼럼 (cat. no. 17-5087-01, 지이 헬쓰케어)을 사용한 탈염에 의해 완충제-교환하고, 정제 후에, 또는 4℃에서 6일 동안 추가의 보관 후에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. SDS-PAGE 분석을 환원 및 비-환원 조건 하에 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. 도 42는 완전한 IgG 밴드 (LHHL) 이외에 1/2 분자를 제시하는 밴드 (HL) 및 다른 조합을 제시하는 밴드의 존재에 의해 입증되는 바와 같이 단지 부분적인 재-산화가 완충제-교환 직후에 관찰됨을 보여준다 (a, 레인 3). 4℃에서 6일 보관한 후의 분석은 재-산화가 완료되었음을 보여준다 (c, 레인 4). 환원된 겔 (b, d)은 단일 중쇄 및 경쇄를 보여준다.
이것은 재-산화가 큰 부피에서 매우 느리게 발생하고 O/N 인큐베이션 후에 완료되지 않았음을 나타낸다.
실시예 42: 재-산화 과정에서 미량 금속의 역할
재-산화 과정에서 미량 금속의 역학을 조사하기 위해서, 항-CD38 항체를 50 mM 2-MEA의 존재 하에 25℃에서 5 h 동안 인큐베이션하였다 (15 mg/ml; 1 ml). 샘플을 PD-10 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 탈염하고, 완충제를 0.5 mg/L Cu2 + (CuSO4; cat. no. 451657-10G, 시그마 알드리치)를 함유하는 PBS로 또는 2 mM EDTA를 함유하는 PBS로 교환하였다. 샘플을 RT에서 상이한 시간 동안 인큐베이션한 후 채취하고, 3 ㎕의 1 M 2-아이오도아세트아미드 (IAA; cat. no. I-1149, 시그마 알드리치)로 켄칭하고, 암소에서 RT에서 30분 동안 보관하였다. 이어서, 샘플을 5℃에서 추가의 분석시까지 보관하였다.
SDS-PAGE 분석을 비-환원 및 환원 조건 하에 상기 설명된 바와 같이 수행하였다.
도 61a는 EDTA를 함유하는 PBS로의 완충제 교환이 재-산화를 억제하였음을 보여준다. EDTA (레인 2 내지 7)의 존재 하에, 유리 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)는 모든 시점에 존재하였다. 또한, 다른 불완전하게 재-산화된 종, 예컨대 항체 1/2 분자 (HL) 및 하나의 경쇄 (HHL) 또는 2개의 경쇄 (HH)가 상실된 항체가 존재하였다. Cu2+를 함유하는 PBS로의 완충제 교환은 재-산화를 유도하였다 (도 61b 레인 2 내지 7, 및 도 62). 완전한 재-산화에 도달하지 않는지만, 항체의 유의한 재-산화 및 유리 경쇄 및 중쇄의 완전한 부재가 모든 시점에서 관찰되었다. 환원된 겔 (B, D)은 단일 중쇄 및 경쇄를 제시한다.
실시예 43: 상이한 완충제 조건 하에서 인간 IgG1 -2F8-F405L과 IgG1 -7 D8 - K409R 사이의 2- MEA -유도 Fab - 아암 교환에 의해 생성된 이중특이적 항체의 형성
0.5 ml 규모에서 상이한 완충제 하에서 인간 IgG1-2F8-F405L과 IgG1-7D8-K409R 사이의 2-MEA-유도 Fab-아암 교환에 의해 이중특이적 항체의 배치를 생성하였다. 항체를 다음 완충제 내에 5 mg/ml의 농도로 희석하였다: 1) 1 x 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS): 8.1 mM 인산나트륨 (Na2HPO4-7H2O), 1.5 mM 인산칼륨 (KH2PO4), 138 mM 염화나트륨 (NaCl), 2.7 mM 염화칼륨 (KCl), pH 5.0 (10 x DPBS로부터 희석됨, cat. no. 14200, 인비트로젠); 2) 1 x DPBS pH 7.0; 3) 20 mM 시트르산나트륨 (cat. no. 0119-01, 제이티 베이커 (JT Baker)), pH 4.9; 4) 20 mM 시트르산나트륨, pH 6.0; 및 5) 20 mM 트리스-HCl (cat. no. T6666 및 T6791, 시그마), 20 mM NaCl (cat. no. 3624-01, 제이티 베이커), pH 7.8. 후속적으로, 항체를 각각 2 mg/ml의 최종 농도 (즉, 총 항체 농도 4 mg/ml)에서 45 또는 60 mM 2-MEA의 존재 하에 25℃에서 2 - 5시간 동안 인큐베이션하였다. 2-MEA를 항체와 동일한 완충제를 사용하여 제조한 300 mM 원액으로부터 첨가하였다. 다양한 시점에서, 샘플을 채취하고, 제조자의 지시에 따라 일러스타 마이크로스핀 (illustra microspin) G-25 칼럼 (cat. no. 27-5325-01, 지이 헬쓰케어)을 사용하여 10 mM 인산나트륨 (이염기성 인산나트륨, cat. no. 3828-01 및 일염기성 인산나트륨, cat. no. 3818-01, 둘 모두 제이티 베이커), pH 7.0으로 탈염하였다. 이어서, 샘플을 상기 설명한 바와 같이 이종이량체화 비율을 결정하기 위해 분석적 CIEX에 의해 분석하였다. 도 41은 최종 이종이량체 수준이 트리스 및 포스페이트 완충제에서 대등하지만, 이종이량체 형성의 동역학은 완충제의 종류 및 pH에 의해 분명하게 영향받음을 보여준다. 동역학은 포스페이트 완충제, pH 5.0 및 시트레이트 완충제, pH 6.0에서보다 시트레이트 완충제, pH 4.9에서 더 늦은 것으로 보였다. 동역학은 1 x DPBS pH 7.0에 비해 1 x DPBS pH 5.0에서 더 늦었다.
실시예 44: 인간 IgG1 항- CD38 항체의 환원 및 산화 동안 산화환원 전위, 산소 포화 및 중간체의 형성
인간 IgG1 항-CD38 항체 (005, WO 2006099875 (젠맵)에 기재됨)를 환원 및 재-산화 과정을 평가하기 위한 모델 시스템을 개발하기 위해 사용하였다. 항-CD38 항체 (20 g/L)를 중공 섬유 카트리지, 30 kDa 분자량 컷오프 (MWCO), 0.1 m2 (cat. no. P-N1-030E-200-01N, J & M 세퍼레이션스 (J & M Separations), 네덜란드 틸버그)를 사용하여 제제화 완충제 (25 mM 아세트산나트륨, 60 mM 염화나트륨 [cat. no. 3624-01, 제이티 베이커], 140 mM 만니톨, 0.006% 폴리소르베이트 20, pH 5.5)로부터 PBS (cat. no. 3623140, 비. 브라운, 네덜란드 오스), pH 7.4로 정용여과하고, 2-L 반응기 내에서 833 ml 총 부피로 24 g/L로 농축하였다. 온도를 25℃에서 제어하고, 100 rpm에서 교반하였다. 반응을 지켜보기 위해, 용액을 산화환원 프로브 (애플리콘 바이오테크 (Applicon Biotech), 네덜란드 쉬담) 및 용존 산소 (DO) 프로브 (애플리콘 바이오테크)를 사용하여 모니터링하였다. 실험 개시 시에, 용액 산화환원는 259.6 mV이었고, DO는 100% (산소의 공기 포화)이었다. 시간 0에서, 환원제 2-MEA (2-메르캅토에틸아민-HCl, 시스테아민)를 반응기에 300 mM의 최종 농도로 첨가하여 20 g/L 항-CD38 항체 및 300 mM 2-MEA의 초기의 용액을 생성하였다. 2-MEA의 첨가 시에, 산화환원 전위는 즉시 ~-400 mV로 저하되었다 (도 43). DO는 또한 이때 본래의 100% 산소의 공기 포화의 2.6%로 저하되었고, 이것은 2-MEA가 이량체 형태 시스타민으로 자가산화되고 있음을 나타낸다. 5시간 후에, 과량의 2-MEA (및 시스타민)을 PBS, pH 7.4를 사용한 정용여과를 통해 제거하였다. 이를 수행하기 위해, 반응기 내용물을 30 kDa 변형 폴리에테르술폰 (mPES) 중공 섬유 카트리지 (cat. no. P-N1-030E-200-01N, J & M 세퍼레이션스, 네덜란드 틸버그) 30 kDa 분자량 컷오프 (MWCO), 0.1 m2를 통해 순환시켰다. 카트리지 주입구 압력을 25 ml/min의 투과액 유동을 일으키는 25 PSI (170 kPa)에서 제어하였다.
정용여과 완충제, 예를 들어 PBS를 투과액이 시스템에서 배출되는 것과 동일한 속도로 시스템에 첨가하였다. 정용여과는 본래 부피의 7배 (7 투석 부피; ~ 7 L)가 시스템을 통과할 때가지 진행하였고, 4½시간이 소요되었다. 이어서, 시스템을 활성 온도 및 교반 제어 하에 O/N 인큐베이션하였다. 다음날, DO 및 산화환원 값은 실질적으로 출발 수준 미만으로 유지되었고, 이것은 반응이 완료되지 않았음을 시사한다. 상기 가설을 평가하기 위해, 황산구리를 0.5 mg/L의 최종 농도 (CuSO4; cat. no. 451657-10G, 시그마 알드리치)로 첨가하였다. 2가 금속 이온, 예컨대 Cu2 +는 술프히드릴 산화를 위한 촉매이다. 황산구리의 첨가 시에, 즉각적으로 DO가 추가로 감소하였고, 이것은 산소의 즉각적인 소비, 예를 들어 (재-)산화를 시사한다. 실험 내내, 14개의 샘플을 반응기로부터 채취하고, 즉시 2-아이오도아세트아미드 (IAA, cat. no. I-1149, 시그마)로 켄칭하였다 (20 ㎕의 1 M 2-아이오도아세트아미드를 1 ml의 반응기 샘플에 첨가하였다). 2-아이오도아세트아미드는 시스테인의 티올기에 공유 결합하고, 따라서 임의의 환원된 시스테인이 쇄간 디술피드 결합을 재형성하는 능력을 차단하였다. 상기 방식으로, 항체의 2-MEA에 의한 환원 및 산소에 의한 재-산화의 동역학이 추적될 수 있다. 샘플을 HP-SEC (도 44), 비-환원 SDS-PAGE (도 45) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 질량 분광법 (LC-ESI-MS) (도 46)에 의해 분석하였다. 샘플 1 및 2는 제제화 완충제의 PBS 내로의 전달 전 및 후에 항-CD38 항체를 보여주는 대조군이다. 샘플 3 내지 8은 5-시간 환원기 동안의 생성물을 보여준다. HP-SEC (280 nm에서 모니터링)에 의해, 항체는 무손상 생성물로서 용리되고; 추후의 용리 생성물은 시스타민이다 (2-MEA는 280 nm에서 강하게 흡수하지 않는다). SDS-PAGE에서, 생성물은 비-환원 겔의 변성 조건 하에서 중쇄 및 경쇄의 2개의 독립적인 밴드로서 이동하였다. 함께 분석할 때, 이들 데이터는 생성물이 1시간 이내에 완전히 환원되었지만 (SDS-PAGE), 중쇄 및 경쇄는 천연 조건 하에서 비-공유 상호작용에 의해 회합된 상태로 유지됨을 보여준다 (HP-SEC). 샘플 9-12는 정용여과 과정 동안 채취하였다. HP-SEC에 의해, 생성물은 천연 조건 하에서 무손상으로 유지되었고; 늦게 용리되는 시스타민 피크는 점진적으로 사라진 후, 2-MEA와 반응한 2-아이오도아세트아미드에 대응하는 피크가 나타났다. 이들 결과는 용액 내에 2-아이오도아세트아미드와 반응하는 과량의 2-MEA가 계속 존재하고 2-MEA가 단백질에 결합하고 O/N 또는 2-아이오도아세트아미드의 첨가시에 방출됨을 시사한다. SDS-PAGE에 의해, 단일 중쇄 및 단일 경쇄 밴드로부터 미지의 조성물의 다중 밴드로의 이동이 존재하였지만; 정용여과 종료시에 (샘플 13), 생성물은 황산구리의 첨가 전에도 (샘플 14) 천연 형태로 완전히 재-산화되었다.
항체의 환원 및 재-산화 과정을 모니터링하기 위해, 샘플을 ESI-MS에 의해 분석하여 분자량을 결정하였다. 프로파일 내의 상이한 피크는 과정 동안 형성된 중간체, 예컨대 1/2 분자를 나타낸다. 샘플을 60℃에서 BEH300 C18, 1.7 ㎛, 2.1 x 50 mm 칼럼을 사용하여 애쿼티 UPLC™ (워터스, 미국 밀포드) 상에서 탈염하고, MQ 물 (용리액 A) 및 0.05% 포름산 (플루카 리델-데 헨, 독일 부크스)을 함유하는 LC-MS 등급 아세토니트릴 (용리액 B) (바이오솔브, 네덜란드 팔켄스바르트)의 혼합물의 구배로 용리시켰다. 비행시간형 전기분무 이온화 질량 스펙트럼을 양이온 모드로 작동하는 micrOTOF™ 질량 분광계 (브루커, 독일 브레멘))로 온라인으로 기록하였다. 분석 전에, 500-4000 m/z 스케일을 ES 튜닝 믹스 (애질런트 테크놀로지스, 미국 산타 클라라)를 사용하여 검정하였다. 질량 스펙트럼은 데이터어낼리시스 (DataAnalysis™) 소프트웨어 v. 3.4 (브루커, 독일 브레멘)가 제공된 맥시멀 엔트로피를 사용하여 데컨벌루션하였다.
도 46은 항-CD38 항체의 환원 및 재-산화 동안의 질량 분광법 프로파일을 보여주었다. 환원기 동안 채취한 샘플 (샘플 3-8)은 2-MEA가 환원된 경쇄 (질량 차이 75 Da)에 공유 결합함을 보여주었고, 이것은 비-환원 SDS-PAGE 상의 여러 경쇄 밴드를 설명할 수 있을 것이다 (도 45). 분명히, 전장 IgG로의 재-산화는 질량 분광법 절차에 의해 유도되었고, 이것은 환원기 동안 채취한 ESI-MS 샘플에 의해 검출된 전장 IgG가 비-환원 SDS-PAGE에 의해 검출되지 않았기 때문이다 (도 45). 정용여과의 개시 시에, 중간체로서 HL (질량 약 75 kDa) 및 HHL 단편 (질량 약 120 kDa)과 함께 전장 항체로의 재-산화가 발생하였다. 이들 데이터는 또한 정용여과에 의한 환원제 (예를 들어, 2-MEA) 제거 동안, 항체가 그의 천연 공유 시스테인 다리의 재형성에 의해 재-산화됨을 보여주었다.
실시예 45: 재-산화 과정에 대한 보다 신속한 정용여과 및 제2 정용여과의 영향
실시예 44의 실험을 다음과 같은 차이를 제외하고 반복하였다. 먼저, 환원 단계는 5시간으로부터 4시간으로 단축하였고, 그 이유는 환원이 4시간 이내에 이미 완료된 것으로 관찰되었기 때문이다. 두 번째로, 공정을 가속하기 위해서, 정용여과 시간은 보다 큰 중공 섬유 카트리지 30 kDa, 0.4 m2를 사용함으로써 1시간으로 단축되었다. cm2당 투과액 유동은 실시예 44와 동일하였고, 이에 의해 정용여과 단계는 4배 더 빨리 수행되었다. 세 번째로, O/N 산화 기간 이후, 제2 정용여과를 추가의 7 투석 부피를 사용하여 수행하였고, 그 이유는 제1 실험이 O/N 인큐베이션 후에 2-MEA의 출현을 입증하였기 때문이다. 2-아이오도아세트아미드-처리 샘플의 산화환원 및 DO 흔적의 경향 (도 47) 및 HP-SEC (도 48) 및 SDS-PAGE (도 49) 결과는 제2 정용여과 지점까지 실시예 44의 결과와 일치하였다 (실시예 44 및 본 실시예의 산화환원 전위 및 산소 포화에 대한 시간 규모가 상이함에 유의한다). 제2 정용여과 직전에, 생성물은 전날의 정용여과 종료시에 비해 약간 더 환원된 것으승로 보였다 (도 49, 레인 18 대 레인 15). 제2 정용여과 후에 (레인 19), 생성물은 본래의 상태의 것으로 되돌아갔고, 2-MEA-2-아이오도아세트아미드 피크는 HP-SEC 프로파일로부터 사라졌다. 또한, 제2 정용여과 후에, 산화환원 및 DO 프로브 값 (도 47)은 실험 개시시의 것과 유사하였고, 이것은 반응이 완료되었고 2-MEA 및 시스타민의 흔적이 실시예 44에서 설명된 실험에서보다 시스템으로부터 보다 완전히 제거되었음을 시사한다. 또한, 제2 정용여과 후의 황산구리의 첨가는 산화환원 또는 DO의 변화를 유도하지 않았고, 이것은 산화가능한 술프히드릴의 평가가능한 수준의 부재를 입증한다. 이들 결과는 제2 정용여과가 용액에 잔류하거나 또는 O/N 인큐베이션 후에 용액에 단백질로부터 방출된 임의의 과량의 2-MEA를 제거하기 위해 유용함을 나타낸다.
실시예 46: 보다 낮은 2- MEA 농도와 조합된 보다 신속한 정용여과의 영향
실시예 44에서 O/N 인큐베이션 후에 관찰된 잔류 2-MEA는 2-MEA 농도가 너무 높음을 제시하였다. 따라서, 실시예 44의 실험을 반복하되, 2-MEA 농도를 300 mM로부터 50 mM로 감소시키고, 실시예 45에서처럼, 환원 단계를 4시간으로 단축하고, 정용여과 시간을 1시간으로 단축하였다. 환원 및 정용여과 후에, DO 및 산화환원 프로브는 원래의 값으로 되돌아갔고, 이것은 반응이 완료되었음을 시사한다 (도 50). 구리 첨가는 효과를 보이지 않았고, 이것은 반응이 완료되었음을 추가로 시사한다. 실시예 44 및 45에서 관찰된 것처럼, 생성물은 HP-SEC 분석에서 천연 조건 하에 무손상 상태로 유지되었고 (도 51); 또한, 나중에 용리되는 시스타민 피크는 점진적으로 사라지고, 이어서 2-MEA에 결합된 2-아이오도아세트아미드에 대응하는 피크가 출현하였다. 그러나, 이 경우에, 모든 더 나중에 용리되는 피크는 O/N 인큐베이션 후에 사라졌다. SDS-PAGE 결과 (도 52)는 환원기 동안 무손상 항체의 부재를 보였지만 (레인 3 내지 6), 이 경우에, 분자는 별개의 중쇄 및 경쇄로 완전히 환원되지 않았다. 정용여과 시에 (레인 7 내지 10), 항체가 원래의 밴드 패턴을 재형성하고 O/N 인큐베이션을 통해 이를 계속 유지함이 SDS-PAGE에 의해 분명해졌다 (레인 11 내지 14).
실시예 47: 보다 신속한 정용여과 및 환원기 동안 EDTA 의 존재의 영향
실시예 46의 실험을 반복하되, 항-CD38 항체를 제제화 완충제로부터 2 mM EDTA를 함유하는 PBS 내로 교환하였다. EDTA의 첨가 목적은 환원기 동안 2-MEA의 자가-산화를 억제하고 잠재적으로 2-MEA의 유리 단백질 술프히드릴에 대한 결합을 제한하는 것이었다. 2-MEA의 첨가 시에, 산화환원 전위는 실시예 46에 제시된 바와 같이 (도 50) 즉시 저하되었다 (도 53). 그러나, DO 저하 속도는 실시예 46에서 관찰된 것보다 훨씬 더 낮았다 (도 53b 참조). 금속-킬레이팅제 EDTA의 첨가 시에 산화 속도의 감소는 완충제 시약 내의 미량 금속 불순물이 환원기 동안 2-MEA의 자가-산화를 촉매하였음을 시사한다. 그러나, EDTA는 DO가 최종적으로 0에 가깝게 감소하였기 때문에 2-MEA의 자가-산화를 충분히 억제할 수 없었고, 이것은 실험 조건 하에서 산소 전달이 최종적으로 2-MEA의 자가-산화의 속도 제한 용인임을 시사한다. EDTA가 없는 PBS로의 정용여과 후에, DO는 거의 100%의 출발점으로 회복하였고, 이것은 산화환원 전위가 실질적으로 출발점 미만으로 계속 유지되면서 낮은 산소 소비 속도를 시사한다. 0.5 mg/L 황산구리의 첨가 시에, 소량의 침전물이 형성되고, 이것은 잔류 EDTA에 의한 구리 이온의 결합에 의한 것일 수 있다. 또한, DO는 거의 10% 저하되고, 이것은 구리 이온의 첨가 시에 산화의 증거를 나타낸다.
SDS-PAGE 결과 (도 54)는 실시예 46에 관찰된 것과 대등하였고, 환원 동안 EDTA의 첨가가 항체의 전체적인 환원에 대해 분명한 효과를 갖지 않음을 입증하였다 (레인 3 내지 7). 또한, 정용여과 후의 재-산화는 영향받지 않았다 (레인 12 내지 14).
실시예 48: 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 N2 의 존재의 영향
실시예 46의 실험을 일부 변경하면서 반복하였다. 제1 정용여과 동안, 용기의 상부 공간에 질소를 공급하였다. 이것은 20%의 용존 산소 농도를 유도하였다. 환원 동안, 50 ml/min 질소의 연속적인 유동이 용기를 통해 공급되었다. 환원 후에, 과량의 산소가 시스템으로 첨가되는 것을 방지하기 위해 질소로 100% 포화된 PBS 내로 제2 정용여과를 수행하였다.
DO 농도는 2-MEA 첨가시에 20%이었다. 모든 산소는 2-MEA에 의해 즉시 소비되었다 (도 55). 산화환원 전위는 2-MEA의 첨가 시에 즉시 -440 mV로 감소하였다. 정용여과 후의 산화환원 전위는 출발값 (+ 200 mV)보다 더 낮았고 (- 250 mV), 이것은 재-산화가 완료되지 않았음을 나타낸다.
질소가 공기 통기에 의해 교체된 후, 산화환원 전위는 상승하였고, 이것은 재-산화가 다시 시작되었음을 나타낸다. 산화환원 전위는 출발값으로 다시 상승하였고, 이것은 재-산화가 완료되었음을 나타낸다.
SDS-PAGE 결과 (도 56)는 환원기까지 실시예 46에서 관찰된 것과 대등하였다 (레인 3 내지 7). 그러나, 산소의 결여는 재-산화 과정을 분명하게 억제하였다 (레인 8 내지 11). 질소의 공기 유도에 의한 교체 후에만, 재-산화가 발생하였다 (레인 12, 13).
실시예 49: 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 EDTA 존재의 영향
실시예 46의 실험을 반복하되, 2-MEA를 PBS 단독 대신에 2 mM EDTA를 함유하는 PBS를 사용한 정용여과에 의해 제거하였다.
정용여과 동안, 산화환원 전위는 증가하였다. 이것은 주로 산화환원 전위에 영향을 준 산소의 증가에 의한 것이었다 (도 57). 환원기 동안 채취한 샘플의 SDS-PAGE (도 58)는 실시예 46에서 관찰된 것과 대등하였다 (레인 3 내지 6). EDTA의 존재는 미량-요소를 포획함으로써 재-산화에 분명한 영향을 주고, 이에 따라 재-산화 속도는 보다 느려졌다 (레인 7 내지 10). 정용여과 24시간 후에도, 아직 모든 항체가 재-산화되지는 않았다 (레인 10). 황산구리의 첨가는 산화환원 전위의 즉각적인 증가 및 DO의 감소를 유도하였다. SDS-PAGE 결과는 재-산화가 황산구리의 첨가 후에만 완료되었고 (레인 11), 첨가 전에는 그렇지 않음 (레인 10)을 확인해 주었다.
실시예 50: 보다 신속한 정용여과 및 환원기 후의 황산구리의 존재의 영향
실시예 46의 실험을 반복하되, 2-MEA를 PBS 대신에 0.5 mg/L 황산구리를 함유하는 PBS를 사용한 정용여과에 의해 제거하였다.
DO 및 산화환원 프로파일은 재-산화가 상기 설명된 모든 실시예에서 관찰된 것보다 더 빠름을 보여주었다. 정용여과 후에, 산화환원 전위는 그의 출발값이 되었고, 이것은 재-산화가 완료되었음을 나타낸다 (도 59).
이것은 SDS-page에서 확인되었다. SDS-PAGE 결과 (도 60)는 정용여과 단계까지 실시예 46에서 설명된 것과 대등하였다. 재-산화기 동안 샘플의 SDS-PAGE 결과는 황산구리의 존재가 항체의 재-산화 속도를 증가시킴을 분명하게 보여주었다. 재-산화는 정용여과 60 min 후에 이미 거의 완료되었다 (레인 9).
실시예 51: C-말단 리신이 결여된 이중특이적 항체의 생산
F405L 또는 K409R 돌연변이 이외에, 중쇄에 C-말단 리신이 완전히 결여된 단일특이적 항체의 발현 (C-말단 리신의 결실에 의한; delK)을 위한 포유동물 발현 벡터는 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 기술에 의해 생성될 것이다. 이것은 발현 벡터 pIgG1f-F405L-delK 및 pIgG1f-K409R-delK를 생성할 것이다. 관심있는 2개의 항체에 대응하는 관련 VH 서열이 2개의 중쇄 벡터 내로 삽입될 것이다. 추가로, 경쇄를 위한 발현 벡터는 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 기술에 의해 생성될 것이다. 관심있는 2개의 항체에 대응하는 관련 VL 서열이 이들 경쇄 벡터 내로 삽입될 것이다.
두 항체 돌연변이체는 제조자의 지시에 따라 293fectin (인비트로젠)을 사용하여 HEK293F 세포 (인비트로젠)에서 관련 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 일시적으로 동시 형질감염시킴으로써 프리스타일 (Freestyle) 배지 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 무혈청 조건 하에서 생산될 것이다. 항체는 단백질 A 친화도 크로마토그래피 (MabSelect SuRe, 지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)에 의해 정제하고, PBS로 O/N 투석되고, 0.2 μM 전량 필터 상에서 필터-여과될 것이다. 정제된 IgG1 변이체의 농도는 280 nm에서 흡광도에 의해 결정할 것이다. 정제된 항체는 본원에 기재된 방법에 따라 이중특이적 항체를 제조하기 위해 사용될 것이다. 이들 이중특이적 항체는 두 C-말단 리신이 모두 완전히 결여될 것이다.
실시예 52: 1000-L 규모의 동종이량체 생산 및 60 mg -규모로부터 0.5 kg -규모로 이종이량체 단백질 생산의 규모 확대 ( scale up )
각각의 2개의 동종이량체의 한 배치를 표준 과정 (세포주 또는 지정된 항체에 대해 특이적으로 최적화되지 않은)을 사용하여 1000-L 규모로 생산하고 정제하였다. 상기 과정에 사용된 세포주는 실시예 40에서 설명된 것이다. 세포를 해동하고, 500-mL 진탕 플라스크 (해동), 1-L 진탕 플라스크, 3-L 진탕 플라스크 (모든 플라스크는 코닝 (Corning) 제품), 웨이브 백 (웨이브 바이오테크 (Wave Biotech)), 100-L 씨드 (seed) 생물반응기를 포함하는 5회의 계대배양 단계를 통해 1000-L 반응기로, 및 최종적으로 1000-L 생산 생물반응기로 접종을 위해 17일 동안 규모를 확대하였다. 진탕 플라스크 및 웨이브 백은 5% CO2 및 37℃에서 제어된 인큐베이터에 배치되었다. 씨드 생물반응기 및 생산 생물반응기는 pH 7.0 (CO2 및 카르보네이트), DO 30% (공기/O2 및 교반), 및 37℃ (물 재킷)의 온도에서 제어되었다. 제3일에 시작하여 실행 종료시까지 매일 공급물을 첨가하여 500 L의 생산 생물반응기를 접종하였다. IgG1-7D8-K409R 세포주는 예상된 바와 같이 생산하였고, 실행은 충분한 물질 (즉 1.85 g/L)을 얻은 후 제11일에 중지되었다. IgG1-2F8-F405L 세포주는 원래의 생산 (banking)으로부터 규모가 확대되면서 생산성을 상실하였고, 실행은 제15일에 0.6 g/L에서 중지되었다. 이어서, 각각의 경우에, 생물반응기를 12℃로 냉각하고, pH를 2 M 시트르산을 사용하여 4.5로 저하시키고, 생성물을 원심분리에 의해 수거하였다. 다음으로, 심층 여과 (밀리포어)를 적용하고, 0.2 ㎛ 여과 (사르토리우스)를 수행하여 세포를 제거하고, pH를 2 M 트리스를 사용하여 중화하였다. 수거율은 IgG1-7D8-K409R에 대해 93%, IgG1-2F8-F405L에 대해 80%이었다.
세포-미함유 수거물을 MabSelect SuRe 단백질 A (지이 헬쓰케어) 크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. 결합된 항체를 이동상의 pH의 단계적인 변화를 사용하여 수지로부터 방출시켰다. 상기 초기의 정제 단계 후에, 바이러스 불활성화는 주변 온도에서 낮은 pH에서 60 min 동안 인큐베이션함으로써 수행하였다. 후속적으로, pH를 후속 음이온 교환 단계를 위해 pH 7.8로 적정함으로써 증가시켰다. 이어서, 동종이량체를 Q 세파로스 (Sepharose) 패스트 플로우 (FAST Flow) (지이 헬쓰케어)가 충전된 관류 (비-결합) 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하였다. 각각의 정제된 동종이량체를 이어서 접선 유동 방식으로 30 kDa 컷오프 폴 오메가 막을 사용하여 포스페이트 완충 염수 용액 (1.92 mM NaH2PO4-H2O, 8.66 mM Na2HPO4-7H2O, 140.31 mM NaCl; pH 7.4)로 완충제-교환하고, 5℃에서 일회용 플렉스보이 (Flexboy) 백 (사르토리우스 스테딤) 내에서 보관하였다. 물질을 최종적으로 0.2 ㎛ 멸균 등급 필터를 통해 1-L PETG 병 (날젠 (Nalgene)) 내로 통과시키고, 5℃에서 보관하였다. IgG1-7D8-K409R의 최종 농도는 26.0 g/L이었고, IgG1-2F8-F405L의 농도는 28.2 g/L이었다. 총 하류 수율은 IgG1-7D8-K409R에 대해 86%, IgG1-2F8-F405L에 대해 92%이었다. HP-SEC에 의해 분석한 단량체 수준은 각각 100% 및 99.9%이었다. IgG1-7D8-K409R 물질은 0.078 ng/ml의 검출 한계 미만인 침출된 단백질 A의 잔류 수준을 갖고, ELISA (시그너스 (Cygnus))에 의해 측정된 잔류 CHO 숙주 세포 단백질 수준 (다른 물질은 평가하지 않음)은 0.57 ppm이었다.
이중특이적 항체를 3개의 조건 하에서 동종이량체로부터 생산하였다 (표 11). 제1 조건은 주변 온도 (22-25℃)에서 5시간 동안 50 mM 2-MEA를 함유하는 폴리프로필렌 관 내의 10 g/L의 각각의 동종이량체의 표준 벤치-규모 조건이었다. 이어서, 2-MEA를 탈염 칼럼을 사용하여 제거하고, 용액을 주변 온도에서 O/N 인큐베이션하였다. 상기 교환은 60 mg 이중특이적 항체의 생산을 위해 총 부피 3 ml에서 수행하였다. 제2 조건은 25 g 이중특이적 항체의 생산을 위해 0.5 g/L의 각각의 동종이량체를 사용한 25 L로의 규모 확대이었다. 벤치-규모 공정에서처럼, 환원기를 50 mM 2-MEA 내에서 주변 온도에서 5시간 동안 수행하였다. 그러나, 이 경우에, 반응은 로커 (rocker) 플레이트 상에서 백 내에서 수행되었고, 2-MEA를 PBS (pH 7.4)를 사용하여 정용여과를 통해 제거하였다 (도 63). 물질을 주변 온도에서 O/N 유지하고, PBS (pH 7.4)를 사용하여 한번 더 정용여과하였다. 추가의 정용여과를 사용하여 잠재적인 잔류 2-MEA를 제거하였다. 제3 조건은 제2 조건과 유사하되, 0.5 kg 배치의 이중특이적 항체를 생산하기 위해 10 g/L의 각각의 동종이량체를 25 L에 사용하였다.
3개의 실행으로부터의 최종 생성물에 대한 CIEX 분석은 유사한 프로파일을 제시하였다 (도 64). 동종이량체는 높은 수율로 이중특이적 항체로 교환되었다 (표 12). 공정은 HP-SEC에 의해 결정된 바와 같이 유의한 응집 또는 분해를 유도하지 않았고, 시스템으로부터 회수된 최종 농도는 예상된 결과와 유사하였다 (표 12). 또한, SDS-PAGE 결과는 완전히 재-산화된 무손상 생성물을 보여주었다 (도 65).
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 53: 1-L 규모에서 이중특이적 항체 ( 이종이량체 단백질)의 생성
실시예 46의 실험을 본질적으로 다음과 같이 변화를 두고 반복하였다: 먼저, 2개의 상이한 동종이량체를 하나 (항-CD38 항체) 대신에 사용하고; 두 번째로, 환원 시간을 4시간으로부터 3시간으로 단축하고; 세 번째로, 상이한 정용여과 카트리지를 사용하고; 마지막으로, SDS-PAGE 분석을 위해 샘플에 IAA만을 첨가하였다.
인간 IgG1-7D8-K409R (10 g) 및 IgG1-2F8-F405L (10 g)을 990 ml PBS, pH 7.4 내에서 2-L 작업 부피의 생물반응기 (애플리콘 (Applikon))에 넣었다. PBS는 동종이량체를 제제화하기 위해 사용된 사내 제조된 용액 (1.92 mM Na2HPO4-H2O, 8.66 mM Na2HPO4-7H2O, 140.31 mM NaCl, pH 7.4) 및 비. 브라운 제제의 혼합물이었고; 이들 2개의 제제는 본질적으로 동등한 것이다. 온도를 25℃로, 교반 속도를 100 RPM으로, 상부 공간 기체 발생을 15 ml/min 공기로 제어하였다. 반응기에 DO, pH 및 산화환원 프로브를 추가로 설치하였다. 교환 반응은 50 mM의 최종 농도로 2-MEA를 첨가함으로써 개시시켰다 (시스테아민 염산염의 10 ml의 새로 조제한 5 M 용액을 동종이량체를 함유하는 990 ml PBS에 첨가하였다). 3시간 후에, 2-MEA는 7 L의 PBS, pH 7.4 (비. 브라운)에 대한 정용여과 (DF)를 통해 제거하였다. DF는 0.16 m2, 30 kDa 변형 폴리에테르술폰 (mPES) 중공 섬유 카트리지 (cat. no. PN-S04-E030-05-N, J & M 세퍼레이션스, 네덜란드 틸버그)를 사용하여 수행하였다. 정용여과를 수행하기 위해 시스템의 부피를 1300 ml로 증가시키기 위해 300 ml의 제1 PBS를 사용하였다. 카트리지 주입구 압력을 25 PSI (170 kPa)에서 제어하였다. 이것은 대략 52.5 ml/min의 투과액 유동을 일으키는, 최대 펌프 속도 1750 ml/min의 연동 펌프, 및 시스템의 보유물 유동로 상에 배치된 밸브를 사용함으로써 달성하였다. 이중특이적 생성물을 25℃, 100 RPM 교반, 및 15 ml/min 상부 공간 기체 발생으로 O/N 유지하였다. 샘플 (약 5 ml)을 2-MEA 첨가 직전에, 2-MEA 첨가 0.5, 1, 2, 및 3시간 후에, 1, 2, 3, 5, 및 7L의 정용여과된 완충제 첨가시에, 정용여과 완료 1시간 후에 및 최종적으로 다음 날 채취하였다. 각각의 샘플 채취 시점에, 샘플의 0.4 ml 분획을 8 ㎕의 IAA의 1 M 원액에 첨가하였다. 모든 샘플을 액체 질소를 사용하여 즉시 급속 동결하고, 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. 동결/해동 절차는 샘플 통합성에 영향을 미치지 않았다 (데이터를 제시하지 않음). IAA가 없는 샘플을 교환 정도를 결정하기 위해 CIEX에 의해 및 생성물 응집을 결정하기 위해 HP-SEC에 의해 분석하였다. IAA가 있는 샘플은 쇄간 디술피드 결합 형성의 정도를 결정하기 위해 비-환원 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
2-MEA의 첨가는 2-MEA의 낮은 산화환원 전위 때문에 155 mV에서 -290 mV로 산화환원 전위의 즉각적인 저하를 일으켰다. 산화환원는 처음 1시간에 걸쳐 아마도 상기 시간에 걸쳐 100%에서 0%로의 DO 감소 때문에 -410 mV로 보다 점진적으로 저하하였다 (도 66). DO 감소는 2-MEA의 자가-산화에 의한 산소 소비 때문이었다. 2-MEA 염산염의 산성도 때문에 pH는 7.4에서 6.7로 저하하였다 (도 67). 산화환원 및 DO는 환원기 동안 비교적 안정한 반면, 아마도 시스타민으로의 2-MEA의 자가-산화에 의해 유발된 산도의 감소 때문에 pH는 점진적으로 상승하였다. 정용여과 이후, DO는 수시간 내에 100%로 돌아간 반면, 산화환원는 -20 mV로 증가하고 109 mV로 점진적으로 증가하였다 (O/N). 정용여과 동안, pH는 증가하고, 7.4의 출발값 가까이 안정하였고; 초기 pH 및 최종 pH 사이의 약간의 오프셋 (offset)은 상이한 로트의 PBS의 사용 때문이다. 데이터의 가장 가능한 해석은 모든 2-MEA가 정용여과 후에 제거되지는 않았다는 것이고, 산화환원의 느린 상승 (O/N)은 시스타민으로 2-MEA의 자가-산화를 완료하기 위한 최종 방안을 나타낸다. 상기 시간 동안, 2-MEA 자가-산화에 의한 산소 소비의 속도는 표면을 통한 산소 전달에 비해 충분히 느렸고, 따라서, DO는 포화값 부근에 유지되었다. 나중의 실험에서, 세척 절차는 카트리지 내의 모든 공극을 뚫기 위해서는 충분하지 않은 것으로 밝혀졌고, 아마도 상기 실행 동안 예상된 것보다 더 낮은 2-MEA 제거를 일으킨다. 원래의 세척 절차는 물로 3회 세척한 후, 6시간 동안 주변 온도에서 0.2 M NaOH와 함께 인큐베이션한 후, 물로 3회 세척하는 것이었다. 상기 세척 절차를 실시예 53에 앞서 및 실시예 54에 앞서 사용하였다. 그 결과, 이들 2개의 실시예는 동일한 문제가 있었다. 실시예 55에 앞서, 세척 절차를 물로 3회 세정한 후, 0.5 M NaOH 및 250 ppm 하이포염소산나트륨 내에서 주변 온도에서 60 min 동안 인큐베이션하고, 마지막으로 물로 3회 세정하는 것으로 변형하였다. 여기서 보다 강한 세척 절차를 사용하였고 (실시예 55 이후로부터), 이것은 문제를 해결하였다 (정용여과 후에 정상적인 값으로 되돌아가는 산화환원 전위에 의해 보이는 바와 같이).
2-MEA 자가-산화의 속도 및 정도는 환원기 동안 산소 소비 속도를 결정함으로써 추정하였고, 여기서 1 몰의 O2가 2 몰의 2-MEA를 산화시키는 것으로 가정한다. 산소 소비 (OC) (1분 간격에 걸쳐)는 다음 식 3을 이용하여 계산하였다. 용액 내의 산소의 공기 포화는 0.2 mM인 것으로 가정되었다. 이들 조건에서 kla는 동적 기체 방출 (dynamic outgassing) 방법을 이용하여 0.76/h인 것으로 이전에 결정되었다.
식 3:
Figure pct00021
여기서, OC = 1분에 걸친 산소 소비 (mM)
kla = 산소 전달 계수 (1/시간)
DO* = 평형 DO 농도 (100%)
DO = 시간 1과 시간 2 사이의 평균 DO 농도 (%)
DO1 = 초기 DO 농도
DO2 = 최종 DO 농도
s = 산소 용해도 (0.2 mM/100%)
t2 - t1 = 경과 시간 (시간)
총 산소 소비는 각각의 1분 간격 동안 소비된 산소를 합산함으로써 결정하였다.
각각의 1분 간격에서 산소 소비 속도 (OCR [mM/h])를 다음 식 4를 사용하여 계산하였다:
Figure pct00022
2-MEA의 첨가 시에, 산소 소비 속도는 대략 1.4 mM/h로 급속하게 증가하였다 (도 68). 그러나, DO가 0%로 저하함에 따라 상기 속도는 0.15 mM/h 부근으로 급속하게 저하하였다. 이들 결과는 전달된 모든 산소가 공정에 의해 즉시 소비되므로, 2-MEA 자가-산화가 용기로의 산소 전달에 의해 제한되었음을 입증한다. 3-시간 환원기에 걸쳐 소비된 산소의 총량은 0.64 mM/L이었다. 따라서, 환원기 동안 1.28 mM 2-MEA, 또는 존재한 2-MEA의 2.6%가 자가-산화된 것으로 추정되었다.
SDS-PAGE 분석 (도 69)은 30 min 이내에 쇄간 디술피드 결합의 완전한 환원을 입증하였다. 정용여과 시에, 분자는 1 투석 부피 정도에서 빨리 재-산화하기 시작하였고, 이때 산화환원 전위는 -275 mV이었다. 정용여과 동안, 중쇄 및 경쇄의 모든 가능한 조합 (L, H, HL, HHL, LHHL)의 예상된 이동에 상응하는 밴드가 명백하였다. 분자는 7 투석 부피 이내에 완전히 재-산화되었고, 이때 산화환원 전위는 -45 mV이었다. 이들 데이터는 쇄간 디술피드 결합의 완전한 재-산화는 초기 산화환원로 돌아가는 것을 요구하지 않음을 제안한다.
CIEX 분석은 이종이량체 생성물로의 동종이량체의 효율적인 교환을 입증하였고 (도 70); 실질적인 교환은 환원의 30 min 이내에 이미 일어났다. 최종 생성물은 93.6% 이중특이적, 5.8% 7D8 동종이량체, 및 0.4% 2F8 동종이량체이었다. OD280 측정에 의한 출발 및 최종 샘플의 농도의 결정은 거의 완전한 회수 (98%)를 입증하였다. 최종 샘플의 HP-SEC 분석은 공정이 생성물 응집을 유도하지 않았음을 입증하였다 (> 99% 단량체) (도 71).
실시예 54: 1-L 규모에서 이중특이적 항체의 생성에 대한 EDTA 및 구리 이온의 영향.
실시예 53의 실험을 다음 변화를 두고 반복하였다. 2 mM EDTA (플루카, cat. no 03677; 이나트륨염 이수화물)를 2 M NaOH를 사용하여 pH 7.4로 재조정한 환원 및 정용여과 완충제 모두에 첨가하였다. EDTA는 금속에 결합하고, 이것은 환원기 동안 2-MEA의 금속-촉매된 자가-산화 및 정용여과/재-산화기 동안 이종이량체의 재-산화를 억제할 수 있다.
실시예 53 (EDTA를 사용하지 않은)에서 관찰된 바와 같이, 2-MEA의 첨가는 162 mV에서 -290 MV로 산화환원 전위의 즉각적인 저하, 이어서 DO가 저하함에 따라 처음 1시간에 걸쳐 -416 mV로 저하를 일으켰다. DO가 1시간 내에 0%로 저하한 실시예 53 (EDTA를 사용하지 않은)과 반대로, 2 mM EDTA의 존재 하에 DO는 초기에 10%로 저하한 후, 3-시간 환원기의 끝에 점진적으로 3%로 저하하였다. 이러한 보다 적은 산소 소비의 발견은 미량 금속 이온이 2-MEA의 자가-산화를 가속화한다는 전제와 일치한다. EDTA의 존재는 본 실행의 pH 프로파일에 영향을 미치지 않았다 (도 73, 도 67에 비해).
정용여과 이후, DO는 수시간 내에 100%로 회복한 반면, 산화환원는 단지 -115 mV로 증가하였다. 실시예 53 (EDTA를 사용하지 않은)에서와 같이, 산화환원가 출발값으로 돌아가지 않았다는 사실은 최적 미만 2-MEA 제거를 일으킨 사용 전의 효과적이지 않은 세척 절차의 사용 때문이다. 그러나, EDTA를 사용하지 않을 때 (실시예 53) 산화환원 O/N이 점진적으로 상승한 반면, EDTA의 존재 하에 산화환원는 본질적으로 변화되지 않고 유지되었고 (도 72), 이것은 산화의 억제를 나타낸다. 이 경우에, O/N 산화 이후, 0.5 mg/ml CuSO4 (최종 농도; 시그마, cat. no 451657)를 반응기에 첨가하였다. 이것은 산화환원의 상승과 함께 DO의 즉각적인 저하를 일으켰다. 상기 발견은 반응기 내에 잔류하는 산화성 물질이 존재하고, 미량 금속 이온이 재산화 과정을 가속화한다는 전제와 일치한다.
환원기 동안 2-MEA 자가-산화의 속도 및 정도를 실시예 53에 설명된 바와 같이 결정하였다. EDTA는 자가-산화를 억제하였지만, EDTA의 존재 하에 소비된 산소의 양은 0.60 mM이고, 이것은 0.64 mM의 EDTA를 사용하지 않을 때 (실시예 53)보다 단지 약간 더 적다. 가장 가능한 설명은 두 경우 모두 DO가 10% 미만이었으므로, 본 실시예의 조건 하에, 산소 소비가 상부 공간으로부터 용액 내로 산소 전달의 속도에 의해 제한된다는 것이다.
실시예 53에서와 같이, SDS-PAGE 분석 (도 74)은 30 min 이내에 쇄간 디술피드 결합의 완전한 환원을 입증하였다. 그러나, 정용여과 동안 재-산화는 EDTA를 사용하지 않은 조건 (도 69, 실시예 53)에 비해 지연되었다. 정용여과 시에, 중쇄 쇄간 결합의 근소한 재-산화가 1 투석 부피 후에 관찰되었고, 이때 산화환원 전위는 -326 mV이었다. 2 L 정용여과된 완충제 후에 모든 예상된 형태의 항체 (L, H, HL, HH, HHL, LHHL)가 관찰되었고, 이때 산화환원 전위는 -282 mV이었다. EDTA를 사용하지 않은 조건 (도 69)과 반대로, 정용여과의 완료 1시간 이내에 (산화환원 -115 mV) 또는 O/N 인큐베이션 후에 (산화환원 -110 mV) 완전한 재-산화는 관찰되지 않았다. CuSO4의 첨가 후에, 완전한 재-산화가 관찰되었다. 이들 결과는 충분한 양의 금속 이온의 첨가가 EDTA의 영향을 극복할 수 있음을 입증한다.
CIEX 분석은 이종이량체 생성물로의 동종이량체의 효율적인 교환을 입증하였고 (도 75); 실질적인 교환은 환원의 30 min 이내에 이미 일어났다. 최종 생성물은 92.7% 이중특이적 항체, 4.7% 7D8 동종이량체, 및 2.6% 2F8 동종이량체이었다. OD280 측정에 의한 이들 동일한 샘플의 농도의 결정은 98%의 거의 완전한 회수를 입증하였다. 최종 샘플의 HP-SEC 분석은 공정이 생성물 응집 또는 분해를 유도하지 않았음을 입증하였고; 샘플은 >99% 무손상 단량체이었다 (데이터를 제시하지 않음).
실시예 55: 1-L 규모에서 이중특이적 항체의 생성에 대한 증가된 교반의 영향
실시예 53의 실험을 반복하되, 증가된 산소 농도 및 증가된 산소 전달 속도의 영향을 결정하기 위해 DO 제어 설정값을 50% DO로 설정하였다. 제어 전략은 100 RPM의 최소 교반을 유지하고, 후속적으로 50% DO 설정값을 유지하기 위해 DO가 50% 미만으로 저하한 경우에 2-MEA 첨가 시에 교반을 자동으로 증가시키는 것이다. 초기에, 최대 교반 속도를 500 RPM으로 설정하였다.
2-MEA의 첨가 시에, DO는 저하하고, 교반은 500 RPM으로 즉시 증가하였다 (도 76-77). 그러나, 발포의 관찰 때문에, 최대 교반 속도를 400 RPM으로 낮추고, 전체 환원 시간에 걸쳐 여기서 유지하였다. 상기 속도에서, DO는 50%에서 유지될 수 없고; 대신에 3% 부근으로 저하하였다. 표면을 통한 공기의 일부 유입이 400 RPM에서 여전히 관찰되었다.
100 RPM의 조건 하에 (실시예 53), 2-MEA의 첨가는 151 mV에서 -297 mV로 산화환원 전위의 즉각적인 저하, 및 1시간 이내에 -416 mV로 추가의 저하를 일으켰지만; 증가된 산소 전달의 조건 하에, 산화환원는 1시간 이내에 단지 -366 mV로 저하하였다. pH는 7.4에서 6.9로 저하하였고, 환원기 동안 약간 증가하였다 (도 78).
정용여과 동안, 2-MEA의 제거 시에 및 정용여과 완충제를 통한 보다 많은 산소의 도입 때문에 DO는 증가하였다. 증가된 DO는 교반 속도를 감소시켰다. 정용여과의 끝에, pH는 출발값으로 돌아갔다. DO 및 산화환원 값은 정용여과 직후에 초기 출발값에 가까워지고, O/N 인큐베이션의 끝에 점진적으로 출발값에 도달하였다.
환원기 동안 2-MEA 자가-산화의 속도 및 정도를 실시예 53에 설명된 바와 같이 결정하였다. 400 RPM의 증가된 교반 속도에서, kla 값은 4.0/h이었고, 이것은 환원기 동안 2.31 mM의 산소 소비를 일으켰다. 이것은 4.62 mM 2-MEA의 자가-산화, 또는 100 RPM에서 2.6%의 환원제에 비해 9.2%의 환원제에 상응한다.
100 RPM의 조건과 반대로, 400 RPM의 조건은 SDS-PAGE 분석에 의해 평가할 때 쇄간 중쇄 결합의 불완전한 환원을 일으켰다 (도 79). 이것은 아마도 이들 조건 하에 상승된 산화환원 전위 때문이다 (100 RPM의 조건 하에 -411 mV에 비해 -360 mV 부근). 1L 정용여과된 완충제 후에, 산화환원는 -282 mV이고, 모든 예상된 형태의 항체가 관찰되었다 (L, H, HL, HH, HHL, LHHL). 산화의 정도는 5L 정용여과된 완충제 후에 완전하였고, 이때 산화환원 전위는 -53 mV이었다.
100 RPM의 실시예 (실시예 53)와 유사하게, 본 실행에 대한 CIEX 분석은 실질적인 교환이 환원의 30 min 이내에 이미 일어났음을 입증하였다 (도 80). 그러나, 100 RPM 조건과 반대로 (도 70), 본 실행 동안 동종이량체 피크는 정용여과 동안 증가하였다. 그 결과, O/N 샘플은 단지 79.8% 이종이량체를 함유하였고, 9.2% 잔류 동종이량체 IgG1-7D8K409R 및 11.0% 잔류 동종이량체 IgG1-2F8-F405L을 가졌다. OD280 측정에 의한 이들 동일한 샘플의 농도의 결정은 100% 회수를 입증하였다. 최종 샘플의 HP-SEC는 공정이 생성물 응집 또는 분해를 유도하지 않았음을 입증하였고; 샘플은 >99% 무손상 단량체이었다 (데이터를 제시하지 않음).
본 실시예에서 최종 샘플에 대한 환원 동안 불완전한 쇄간 디술피드 결합 형성 (SDS-PAGE) 및 낮은 교환 백분율 (CIEX)은 환원기 동안 증가된 전단력 (shear) 및/또는 증가된 산소 전달 때문일 수 있다.
실시예 56: 1-L 규모에서 이중특이적 항체의 생성에 대한 증가된 교반 및 살포의 영향
실시예 53의 실험을 반복하되, 증가된 산소 농도 및 증가된 산소 전달 속도의 영향을 결정하기 위해 DO 제어 설정값을 50% DO로 설정하였다. 제어 전략은 0 ml/min의 최소 기류 및 100 RPM의 교반을 유지하는 것이고, DO가 50% 미만으로 저하하면, 상기 설정값을 유지하기 위해 먼저 기류 살포를 40 ml/min로 증가시킨 후, 교반을 400 RPM까지 증가시킨다.
2-MEA의 첨가 시에, DO는 저하하고, 기류 및 교반은 둘 모두 최대 수준으로 즉시 증가하였다 (도 81-82). 그러나, 발포의 관찰 때문에, 최대 살포 속도를 30 ml/min로 감소시켰다. 상기 속도에서, DO는 50%에서 유지될 수 없고; 대신에 25% 부근으로 저하한 후, 환원기의 끝에 50%로 증가하였다. 표면을 통한 공기의 일부 유입이 이들 조건 하에 여전히 관찰되었다.
100 RPM에서 실행에서 관찰된 바와 같이 (실시예 53, 도 66), 2-MEA의 첨가는 155 mV에서 -285 MV로 산화환원 전위의 즉각적인 저하를 일으켰지만 (도 81); 증가된 산소 전달과 함께, 산화환원는 단지 1시간 이내에 -323 mV로 추가로 저하한 반면, 100 RPM에서 산화환원는 1시간 이내에 -416 mV로 추가로 저하하였다. 또한, 산화환원는 3-시간 환원기의 끝에 -261 mV로 증가하였다. 증가된 교반 및 살포와 함께, pH는 pH 7.4에서 6.9로 저하하고, 3-시간 환원기에 걸쳐 pH 7.0으로 상승하였고, 이것은 아마도 덜 산성 형태의 시스타민으로 2-MEA의 산화 때문이다 (도 83).
정용여과 동안, 2-MEA 제거 시에 및 정용여과 완충제를 통한 보다 많은 산소의 도입 때문에 DO는 증가하였다. 증가된 DO는 교반 및 살포 속도를 감소시켰다. 정용여과의 끝에, pH는 출발값으로 돌아갔다. DO 및 산화환원는 정용여과 후에 출발값 부근이고, O/N 인큐베이션의 끝에 점진적으로 출발값에 도달하였다.
환원기 동안 2-MEA 자가-산화의 속도 및 정도를 실시예 53에 설명된 바와 같이 결정하였다. 400 RPM의 증가된 교반 속도 및 30 ml/min 살포에서, kla 값은 5.2/h이었고, 이것은 환원기 동안 1.94 mM의 산소 소비를 일으켰다. 이것은 3.88 mM 2-MEA의 자가-산화, 또는 7.8%의 환원제에 상응하고, 이것은 9.2%의 교반 단독에 대해 결정된 값보다 예상치 않게 약간 더 낮았다. 상기 불일치는 계산에서 오차를 일으키는, kla를 변경시킬 수 있는 공정 조건 (가장 특히, 임펠러 (impeller)의 상단 부근에 있는 액체 높이)의 약간의 변동 때문일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 두 수치는 살포 없이 100 RPM의 조건 (실시예 53)에 대해 계산된 2.6%보다 상당히 더 높다.
100 RPM의 조건과 반대로, 증가된 교반 및 살포는 SDS-PAGE에 의해 평가할 때, 환원기의 끝에 앞서 쇄간 중쇄 결합 (-323 mV의 산화환원에서) 및 중쇄 및 경쇄간 결합 (-261 mV의 산화환원에서)을 출현시켰다 (도 84). 이것은 아마도 이들 조건 하에 상승된 산화환원 전위 때문이다. 정용여과 과정 내내, 모든 예상된 형태의 항체가 관찰되었다 (L, H, HL, HH, HHL, LHHL). 산화의 정도는 5 L 정용여과된 완충제 후에 완전하였고, 이때 산화환원 전위는 28 mV이었다. 밴드 형성 패턴은 재형성되지 않은 일부 쇄간 디술피드 결합이 존재하였음을 제안하고, 이것은 아마도 IgG1 대조군 내에도 또한 존재하는 것과 같은 검정 인공물 (assay artifact)이다.
100 RPM의 실시예 (실시예 53, 도 70)와 유사하게, 본 실시예에 대한 CIEX 분석은 실질적인 교환이 환원의 30 min 이내에 이미 일어났음을 입증하였다 (도 85). 그러나, 100 RPM 조건과 반대로, 본 실행 동안, 동종이량체 피크는 정용여과 동안 증가하였다. 그 결과, O/N 샘플은 단지 80.2% 이종이량체를 함유하였고, 9.8% 잔류 동종이량체 7D8 및 10.1% 잔류 동종이량체 2F8을 가졌다. OD280 측정에 의한 이들 동일한 샘플의 농도의 결정은 완전한 회수 (103%)를 입증하였다. 최종 샘플의 HP-SEC 분석은 공정이 생성물 응집 또는 분해를 유도하지 않았음을 입증하였고; 샘플은 >99% 무손상 단량체이었다 (데이터를 제시하지 않음).
본 실시예에서 최종 샘플에 대한 낮은 교환 백분율의 발견은 환원기 동안 증가된 전단력 및/또는 증가된 산소 전달 때문일 수 있다. 이들 결과는 살포 없이 증가된 교반을 사용한 실시예와 유사하고; 살포 없는 실시예 (실시예 55) 및 본 실시예 사이의 주요 차이는 중쇄/경쇄 쇄간 결합의 출현에 대응하는, 환원기에 걸쳐 DO, pH 및 산화환원의 추가의 증가이다.
실시예 57: 1-L 규모에서 이중특이적 항체의 생성에 대한 질소의 영향
실시예 53의 실험을 다음 변화를 두고 반복하였다. 환원에 앞선 시간부터 정용여과의 완료 직후까지 시스템에서 산소를 제거하였다.
동종이량체를 200 RPM에서 교반하면서 25℃에서 시스템 내에 넣고; 상부 공간을 15 ml/min의 질소 살포와 함께 300 ml/min에서 질소로 기체 발생시켰다. 전체 시스템의 산소를 제거하기 위해 동종이량체 혼합물을 정용여과 카트리지를 통해 O/N으로 서서히 순환시켰다. 이들 파라미터를 환원 및 정용여과 단계 내내 유지하되, 정용여과를 위해 순환 속도의 증가가 요구되었다. 정용여과 완충제에 또한 질소를 300 ml/min으로 살포하였다. 파메드 (Pharmed) 매스터플렉스 배관 (세인트 고바인 (Saint Gobain))을 사용하고, 공기 교환을 최소화하기 위해 파라필름으로 감쌌다. 시스템 둘레에 질소 블랭킷을 제공하기 위해 정용여과 카트리지를 백 내에 넣었다. IAA을 갖는 샘플은 반응기로부터의 샘플을 산소 노출을 최소화하기 위해 공기를 제거하고 이미 IAA를 함유한 시린지 내로 채취함으로써 취하였다. 이들 수단은 재-산화 과정을 위한 산소 요구를 입증하기 위해, 산소가 시스템 내로 누출하는 것을 방지하기 위해 요구되었다. 상업적인 제조를 위해, 상기 조건이 사용될 수 있지만, 다른 것, 예를 들어 단순한 질소 오버레이 (overlay)도 충분할 수 있다. 정용여과의 완료 시에, 질소 기체 발생 (살포 및 오버레이)를 중단하고, 공기 오버레이를 5 min 동안 500 ml/min에서 및 나머지 실행에 대해 15 ml/min에서 개시하였다.
본 실행에서 초기 산화환원 전위는 실시예 53에서 156 mV에 비해 84 mV이었다. 차이는 실시예 53에서 100%에 대해 본 실시예에서 0%의 초기 DO의 차이에 기인한다. 본 실시예에서, 2-MEA의 첨가는 -447 mV로 산화환원의 급속한 저하 및 7.4에서 7.0으로 pH의 저하를 일으켰다 (도 86-87). pH 및 산화환원 값은 둘 모두 3-시간 환원기에 걸쳐 안정하게 남았고; 이들 결과는 산소의 결여가 2-MEA 자가-산화를 방지하고, 그에 의해 환원 단계의 강력함을 증가시킨다는 것을 지지한다.
pH는 정용여과의 끝에 7.4에 가까운 최종 값으로 증가하였지만, 산화환원는 단지 -268 mV로 증가하였다 (도 86-87). 낮은 산화환원 값은 아마도 여전히 감소된 단백질 및 잠재적으로 여전히 감소된 잔류 2-MEA와 조합된 낮은 DO의 조합 때문이다. 정용여과 이후에, 공기를 상부 공간 내로 도입하고, DO 및 산화환원는 급속하게 상승하고, 수시간 동안 비교적 안정하게 유지되었고, 후속적으로 102% DO 및 178 mV 산화환원의 새로운 안정한 값으로 증가하였다.
SDS-PAGE 분석은 30 min 이내에 쇄간 디술피드 결합의 완전한 환원을 입증하였다 (도 88). 다른 실시예 (실시예 53-56)에서 부분적 산화가 관찰된 범위의 산화환원 전위 (-268 mV)에도 불구하고, 항체는 나머지 환원기 동안 및 정용여과의 전체 기간 내내 환원 상태로 유지되었다. 이들 결과는 쇄간 디술피드 결합을 재형성하기 위해 산소에 대한 필요를 확인한다. 쇄간 디술피드 결합 형성은 산소를 도입한 후 1시간 이내에 명백하였지만, 재-산화는 3시간 후에 완전하지 않았고, 이때 산화환원 전위는 -83 mV이었다. 보다 빠른 디술피드 결합 형성은 정용여과 동안 산소가 존재한 실시예 (실시예 53-56) 동안 일어났다. 이것은 아마도 정용여과 동안 상기 실시예에서 보다 높은 농도의 산소 및 보다 높은 산화환원 전위 때문이다. O/N 샘플은 항체의 증가된 산화를 보여주었다. 잔류하는 근소한 저분자량 밴드는 아마도 카트리지를 통한 물질의 연속적인 순환에 의해 일어난다. 2-MEA 첨가 전에 용액의 일부 혼탁이 관찰되었고, 이것은 밤샘 순환이 생성물에 대해 영향을 미쳤음을 나타낸다. 혼탁은 2-MEA의 첨가 시에 사라졌지만, 정용여과의 완료 후에 연속적인 순환 O/N 후에 다시 나타났다. 실시예 55-56보다 본 실시예에서 단백질 회수 (96%)가 약간 더 낮았다.
CIEX 분석은 이종이량체 생성물로의 동종이량체의 효율적인 교환을 입증하였고 (도 89); 실질적인 교환은 환원의 30 min 이내에 이미 일어났다. 최종 생성물은 94.8% 이중특이적, 4.0% 7D8 동종이량체, 및 1.2% 2F8 동종이량체이었다. 최종 샘플의 HP-SEC 분석은 공정이 생성물 응집을 유도하지 않았음을 입증하였다 (>99% 무손상 단량체).
실시예 53에서와 유사한 수학적인 절차를 이용하여, 데이터를 분석하여 정용여과 후에 계산된 산소 소비를 결정하였다 (도 90). 소비 산소의 계산된 총량은 초기에 0.33 mM로 증가한 후, 0.30 mM로 감소하고 안정되었다. 계산된 총 소비 산소의 저하는 산소 유래 또는 더 아마도 실험 오차 때문일 수 있다. 계산은 계산에 사용된 kla에 대해 매우 민감하고, kla는 PBS 내의 별개의 실험으로 결정하였다. 또 다른 이론적인 가능성은 낮은 환원제 농도에서 술프히드릴의 금속-촉매된 자가-산화로부터 형성하는 것으로 보이는 과산화물로부터 산소의 방출이다 (문헌 [Fedorcsak et al., Exp Cell Res 108: 331-339, 1977]; [Jeitner and Lawrence, Toxicological Sciences 63: 57-64, 2001]). 더 아마도, 추정된 kla의 오차 외에, 해석을 복잡하게 하는 다른 인자가 있을 수 있다. 예를 들어, 아마도 5 min 동안 500 ml/min 공기 제거에 이어 15 ml/min 공기 오버레이를 이용하여 반응기 내의 2 L의 상부 공간은 질소로부터 공기로 즉시 전환되지 않는다. 또한, 낮은 수준의 2-MEA이 유지되고 산소 소비에 기여하는 것이 가능하다. 마지막으로, 대개 이들 디술피드가 환원되기 위해서는 6 M 우레아와 같은 강한 용액 내에서 변성을 요구하지만 분자 내의 다른 시스테인이 환원된 후 재-산화되는 것이 가능하다.
실시예 58: 1-L 규모에서 이중특이적 항체의 재-산화에 대한 낮은 pH 의 영향
실시예 53의 실험을 환원기의 끝까지 반복하였다. 이 시점에서, 정용여과 직전에 및 3-시간 환원 샘플을 취하기 직전에, 6.4 ml의 2 M 아세트산을 사용하여 pH를 5.0으로 감소시키고; 산을 첨가하면서 교반을 200 RPM으로 증가시킨 후, 정용여과 전에 다시 100 RPM으로 감소시켰다. 2 M 아세트산을 첨가하여 pH 5.0으로 조정한 PBS를 정용여과 완충제로서 사용하였다. 실시예 53에서와 같이, 생성물을 O/N (25℃, 100 RPM, 15 ml/min 상부 공간 기체 발생에서) 유지하였다. 다음날, 샘플을 취하고, HCl로 pH 9로 조정한 8.8 ml 2N 트리스 염기의 용액을 사용하여 생성물을 다시 pH 7.4로 조정하고, pH 조정 직후에 및 이어서 pH 조정 1 및 2시간 후에 샘플을 취하였다.
예상된 바와 같이, 환원기 동안 산화환원, DO, pH, SDS-PAGE, 및 CIEX 프로파일 (도 91-94)은 실시예 53 (도 66-67; 69-70)과 유사하였다. 3-시간 환원기의 끝에, pH를 6.99에서 5.03으로 조정할 때 산화환원는 -423 mV에서 -144 mV로 증가하였다. pH 조정 전후에, 쇄간 결합은 완전하게 환원되어 남아있었다. pH 7.4 완충제 내의 다른 실시예 (예를 들어, 실시예 53, 55 및 56)에서, 심지어 2-MEA 제거 이전에도 산화환원가 대략 -360 mV에 접근할 때 중쇄 사이의 디술피드 결합이 관찰되었고, 산화환원가 -280 mV에 접근할 때 중쇄 및 경쇄 사이의 디술피드 결합은 명백하였다. pH 5.0에서 정용여과 동안, 산화환원는 28 mV로 증가하였고, 중쇄 및 경쇄의 모든 예상된 조합이 명백하였다 (L, H, HL, HH, HHL, LHHL). 그러나, 보다 높은 pH에서의 정용여과의 다른 실시예와 반대로, 쇄간 결합의 실질적인 부분은 파괴되지 않고 남아있었다. 산화환원는 정용여과 후 1시간 이내에 51 mV로 추가로 증가한 다음, O/N 인큐베이션 후에 53 mV로 증가하였다. 이때까지, 쇄간 결합 형성은 약간 증가하였다. DO는 정용여과 동안 0%에서 83%로 증가하고, 정용여과 2시간 후에 80%에서 안정되었다. 100%의 원래의 DO 값으로부터 오프셋은 용존 산소의 평형값에 대한 pH의 영향 때문일 수 있고, 잠재적으로 실리콘 막을 가로지르고 프로브 보정에 영향을 미칠 수 있는 아세트산의 휘발성에 의해 추가로 영향을 받을 수 있다. pH 7.4로 중화 시에, 산화환원는 pH 조정의 결과로서 -109 mV로 저하하였다. 보다 낮은 산화환원에도 불구하고, 증가한 pH는 쇄간 결합 형성을 즉시 증가시켰다. pH 조정 이후 DO가 저하할 때, 산소 소비는 명백하였다. pH 증가 이후, 산화환원는 다음 2시간에 걸쳐 -78 mV로 증가하였고, 이때 생성물은 거의 완전히 산화되었다. 추가의 인큐베이션 후에, DO는 80%로 되돌아갔고, 산화환원는 135 mV에서 안정되었고, 아마도 이것은 생성물 산화가 완료되었음을 나타낸다 (샘플을 분석하지 않았다). 초기 및 최종 산화환원 사이의 약간의 오프셋은 완충제 조성의 차이 때문일 수 있다.
CIEX 분석은 이종이량체 생성물로의 동종이량체의 효율적인 교환을 입증하였고 (도 94); 실질적인 교환은 환원의 30 min 이내에 이미 일어났다. 최종 생성물은 93.7% 이중특이적, 4.8% IgG1-7D8-K409R 동종이량체, 및 1.5% IgG1-2F8-F405L 동종이량체이었다. OD280 측정에 의한 이들 동일한 샘플의 농도의 결정은 103%의 완전한 회수를 입증하였다. 최종 샘플의 HP-SEC 분석은 공정이 생성물 응집 또는 분해를 유도하지 않았음을 입증하였고; 샘플은 >99% 무손상 단량체이었다 (데이터를 제시하지 않음).
이들 결과는 pH 7.4에 비해 pH 5에서 재-산화 과정이 더 느리고 덜 완전함을 입증한다. pH는 과정의 동역학 및/또는 평형에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 59: 교환 과정에 대한 시스타민의 영향
시스타민은 시스테아민의 산화된 이량체이다 (2-MEA).
5시간 동안 10 g/L 인간 IgG1-7D8-K409R 및 10 g/L IgG1-2F8-F405L + PBS pH 7.4 내에 1 ml 5 M 시스타민 (최종 농도 50 mM 시스타민)을 함유하는 99 ml의 보다 적은 부피로 교환을 수행한 것을 제외하고는, 실시예 53의 실험을 반복하였다. 시스타민의 첨가 시에, 산화환원는 194 mV에서 130 mV로 저하하고, pH는 7.41에서 7.07로 저하하였다 (도 95). 샘플을 시스타민 내에서 동종이량체의 인큐베이션의 시작 및 0.5, 1, 3, 및 5시간 후에 취하고, CIEX에 의해 분석하였다. 이중특이적 항체의 형성은 관찰되지 않았다 (도 96). 이들 결과는 시스타민이 IgG1 Fab-아암 교환을 유도하지 않거나, 또는 단지 환원된 형태의 시약이 항체의 디술피드 결합을 환원시킬 수 있음을 확인한다.
실시예 60: 환원제로서 시스테인의 사용 및 환원제를 제거하기 위해 이온 교환
시스테인은 GMP 생산을 위해 적합한 다량으로 쉽게 이용가능한 천연의 간단한 비-독성 화합물이고; 시스테인은 또한 환원제/환원화제로서 사용될 수 있다. 환원제로서 시스테인의 효능을 시험하였다. 시스테인 (시그마 C5360)의 산화환원 전위를 실시예 53에 설명된 바와 같이 1-L 반응기 시스템에서 2-MEA에 비교하였다. 반응기를 990 ml PBS (pH 7.4) (피. 브라운)로 채우고, 질소를 사용하여 DO를 0%로 하였다. 5 M 2-MEA의 원액을 반응기에 점차 첨가하고 (45 mM 최종 농도까지), pH, DO, 및 산화환원를 기록하였다. PBS 단독의 산화환원는 87.5 mV이었다 (표 13). 산화환원는 0.5 mM 2-MEA에서 초기에 -218.7 mV로 급속하게 저하한 후, 45 mM 2-MEA에서 -345 mV로 보다 점진적으로 저하하였다. 상기 시점에서, 2-MEA의 산도 때문에 pH는 6.92로 저하하였다.
2-MEA 대신에 시스테인의 0.5 M 원액을 사용하여 실험을 반복하였다. 시스테인 원액을 사용하기 전에 2 M NaOH를 사용하여 pH 7.4로 조정하였고, 이것은 상기 용액이 매우 낮은 산도를 갖기 때문이다. PBS 단독의 산화환원는 102.5 mV이었다 (표 14). 산화환원는 1 mM 시스테인에서 초기에 -186.2 mV로 급속하게 저하한 후, 45.9 mM 시스테인에서 -309.6 mV로 보다 점진적으로 저하하였다.
요약하면, pH 7.4에서 45.9 mM 시스테인에 대해 산화환원의 412 mV 총 저하가 관찰되었고, pH 6.92에서 45.0 mM 2-MEA에 대해 산화환원의 433 mV 저하가 관찰되었다 (표 13-14). 선행 실시예에 설명된 바와 같이, 2-MEA를 사용하여 수행된 1-L 교환 실험에서 관찰된 산화환원 전위에 기초하여, 시스테인은 이중특이적 항체로의 동종이량체 환원 및 교환을 지지할 것이다.
교환을 지지하는 시스테인의 능력을 평가하기 위해, 다양한 농도의 시스테인을 사용하여 시간-경과 연구를 수행하였다. IgG1-7D8-K409R (1.8 mg) 및 IgG1-2F8-F405L (1.8 mg)을 양이온-교환 (CIEX) 완충제 (10 mM 인산나트륨, pH 7.0) + 10 - 100 mM 시스테인 내에서 1.0 ml의 총 부피로 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 HPLC 챔버 내에 넣고, 28.0 ㎕의 혼합물을 칼럼 상에 385분까지 55분마다 로딩하였다. 각각의 주입 사이클 전에, 칼럼 (다이오넥스 프로팩 (Dionex ProPac) WCX-10 칼럼, 4 mm 직경 250 mm 길이)을 CIEX 완충제 내에 평형화시켰다. 칼럼 온도를 30℃로 유지하였다. CIEX 완충제를 사용하여 3분 동안 세척한 후에, CIEX 완충제 내의 0 내지 60 mM NaCl의 선형 염 구배를 1.0 ml/min의 유동 속도로 18.5분 동안 적용하였다. 칼럼을 5분 동안 CIEX 완충제 내의 750 mM NaCl을 사용하여 재생한 후, 다음 샘플의 주입을 위한 준비로 CIEX 완충제 내에 18.5분 동안 평형화시켰다. 유출액의 UV 흡광도를 280 nm의 파장에서 모니터링하였다.
도 97-101은 0 - 385 min에서 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM 및 100 mM 시스테인에 대한 CIEX 흔적을 보여준다. 단백질 및 블랭크 (blank) 완충제 주입 없이 시스테인의 예비 주입에 기초하여, 각각의 흔적에서 1 min 근처에서 용리하는 초기 피크를 샘플 내에 시스테인의 존재로 및/또는 시스틴 (산화된 이량체 형태의 시스테인)으로 지정하였다. 각각의 그래프에 표지된 동종이량체 및 이중특이적 항체는 훨씬 더 나중에 용리되었다. 이들 결과는 CIEX 칼럼이 환원제 제거를 위해 사용될 수 있음을 입증한다.
10 mM 시스테인에서 (도 97), 환원은 385 min에 느리고 아직 완전하지 않았다. 이와 반대로, 25 mM (도 98), 50 mM (도 99), 및 75 mM (도 100) 시스테인에서 교환은 385 min에 보다 빠르고 완전하였다. 교환은 100 mM 시스테인에서 훨씬 더 빠른 것으로 나타났지만 (도 101); 385 min에 이중특이적 항체 피크는 이중선 (doublet)이었다. 상기 이중선은 보다 낮은 시스테인 농도에서 중간 시점에서 또한 관찰되었다. 각각의 경우에, 보다 높은 농도의 시스테인은 보다 높은 초기 비율의 보다 염기성 이중선 피크를 생성시키고 (체류 시간 14.3 min); 시간에 걸쳐, 보다 염기성 피크는 보다 산성 피크로 옮겨졌고 (체류 시간 14.0 min), 이것은 이중특이적 항체에 대한 예상된 체류 시간이었다. 가장 가능한 해석은 이중선으로부터의 보다 염기성 피크는 중간 형태이고, 여기서 쇄간 디술피드 결합의 재형성이 아직 일어나지 않았다는 것이다. 385분에 형성된 이중특이적 항체의 최종 양을 표 15에 제시한다. 10 mM 시스테인에서, 동종이량체는 이중특이적 항체로 단지 54.9% 전환되었다. 25 mM에서, 이것은 91.0%로 증가하고, 50 mM 및 75 mM 시스테인에서 93.5% 및 94.7%로 추가로 증가하였다. 100 mM 시스테인에서 교환이 가장 높아서 95.1%이었지만; 산성 및 염기성 이중선 피크가 둘 모두 이중특이적 항체로서 지정되었다.
환원제로서 시스테인의 사용을 환원제 제거를 위해 탈염 칼럼을 사용하여 추가로 탐구하였다. 상기 설명된 바와 동일한 조건을 385분 동안 환원제로서 50 mM 시스테인을 사용하는 환원을 위해 적용하였다 (CIEX 완충제, 1 ml 샘플, 30℃, 3.6 mg/ml 총 단백질). 크기 배제 (G-25 마이크로스핀 칼럼, 지이 헬쓰케어)를 사용하는 시스테인의 제거 후에, 이중특이적 항체를 RT에서 CIEX 평형화 완충제 내에서 30℃에서 2시간 동안 또는 RT에서 18시간 동안 재-산화시켰다. CIEX 프로파일을 도 102에 제시한다. 표 16은 재-산화 후에 형성된 잔류 동종이량체 및 이중특이적 항체의 백분율을 보여준다. 결과는 교환이 효율적이고, 흔적은 잔류 시스테인/시스틴의 존재를 지시하지만 30℃에서 2시간 동안 재-산화가 RT에서 18시간 동안 재-산화와 동등하였음을 보여준다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 61: 고정형 환원제 칼럼을 이용한 이종이량체 단백질의 형성 및 정제.
하나의 단계에서 이중특이적 항체의 형성 및 그로부터 환원제 제거를 가능하게 하기 위해, 고정형 환원제 칼럼을 사용하였다. 동종이량체 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 혼합물을 제조자의 지시에 따라 제조한 고정형 환원제 칼럼 (써모 사이언티픽/피어스 (Thermo Scientific/Pierce, 미국 일리노이주 록포드; cat. no 77701)에 1:1 몰비로 각각 PBS (피. 브라운) 내의 2.5 mg/ml의 농도에서 첨가하고, RT에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 2 ml의 PBS를 적용하여 항체를 용리하고, 수집하였다. 샘플을 HPLC-CIEX에 의해 분석하였다. 도 103은 원래의 동종이량체들 사이에서 이중특이적 항체의 형성을 보여준다 (25.3% 이중특이적, 36.4% IgG1-2F8-F405L 및 38.3% IgG1-7D8-K409%).
실시예 62: 동종이형 차이를 이용하는 이중특이적 IgG1 의 평가.
이중특이적 항체 제제 내에서 잔류량의 동종이량체의 제거를 가능하게 하기 위해, 이중특이적 항체가 상이한 동종이형의 2개의 동종이량체로부터 생산될 수 있는지 여부를 조사하였다.
K409R 돌연변이를 포함한, IgG1m(f) 동종이형 골격 내의 항-CD20 항체 7D8에 대한 발현 벡터, 및 F405L 돌연변이를 포함한, IgG1m(za) 동종이형 골격 내의 항-EGFR 항체 2F8을 당업계에 공지된 방법에 의해 제조하였다 (아래 설명된 서열 8 및 9). 단백질을 실시예 1, 2 및 5에 설명된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 등몰량의 생성되는 IgG1m(f)-K409R-CD20 및 IgG1m(za)-F405L-EGFR 단백질을 25 mM 2-MEA의 존재 하에 1 ml의 총 부피로 37℃에서 90 min 동안 인큐베이션하였다. 총 항체의 최종 농도는 1 mg/ml이었다. 이어서, PD-10 탈염 칼럼 (지이 헬쓰케어 유럽 게엠베하 (GE Healthcare Europe GmbH, 벨기에 디헴))을 사용하는 PBS (비. 브라운)로의 완충제 교환에 의해 혼합물로부터 2-MEA를 제거하였다. 이중특이적 항체의 연속 희석한 샘플 (2.3 - 5,000 ng/ml 범위)을 아래 설명된 ELISA에서 모 항체에 비교하였다. 두 동종이형을 모두 함유하는 골격을 갖는 항체, 즉, IgGm(fa)를 대조군 항체로서 포함시켰다. 이중특이적 항체 형성을 샌드위치 ELISA를 이용하여 결정하였다. 상기 검정을 위해, ELISA 플레이트 (그라이너 바이오-원, 독일 프릭켄하우젠)를 1 ㎍/ml (100 ㎕/웰)의 마우스 항-인간 G1m(f) 항체 5F10 (생퀸 (Sanquin, 네덜란드 암스테르담); 문헌 [Jefferis, R., et al. Immunol. Lett. 1992 31: 143-168]; [de Lange, G.G., Exp. Clin. Immunogenet. 1989 6: 7-17])로 PBS 내에서 4℃에서 O/N 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 플레이트 진탕기 (300 RPM) 상에서 RT에서 60 min 동안 인큐베이션함으로써 PBST를 사용하여 차단하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 샘플을 PBST 내에 희석시키고, ELISA 플레이트로 옮겼다 (100 ㎕/웰). 플레이트 진탕기 (300 rpm) 상에서 RT에서 60 min 동안 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 이어서, 100 ㎕의 HRP-표지된 마우스 항-인간 G1m(a) 항체 4E3 (서던 바이오테크 (Southern Biotech, 미국 앨러배마주 버밍엄; cat. no 9052-05; PBST 내에 10,000배 희석으로)를 첨가하고, 플레이트 진탕기 (300 rpm) 상에서 RT에서 60 min 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 50 mg ABTS 정제 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임)를 ABTS 완충제 (로슈) 내에 용해시키고, ELISA 플레이트에 첨가하였다 (100 ㎕/웰). 플레이트를 플레이트 진탕기 (300 rpm) 상에서 암소에서 RT에서 30 min 동안 (또는 원하는 경우에 더 오래) 인큐베이션하였다. 웰 당 100 ㎕의 2% 옥살산 (최종 농도 1%, 리델 데 헨, 독일 셀제)을 사용하여 반응을 중지시켰다. ELISA 플레이트를 RT에서 10 min 동안 방치한 후, ELISA 플레이트 판독기에서 405 nm에서 흡광도를 판독하였다. 도 104는 이중특이적 항체의 농도-의존적 검출을 보여주지만, 2개의 모 항체는 검출되지 않았다. 대조군 항체 IgG1m(fa)는 각각의 중쇄 상의 두 동종이형 결정자를 모두 함유하기 때문에 ELISA에서 보다 큰 신호를 생성하였다.
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 63: 동종이형 -특이적 항체에 의한 이중특이적 IgG1 의 정제
K409R 및 F405L 돌연변이를 포함하는, IgG1m(f) 및 IgG1m(za) 동종이형 골격으로 발현된 항체를 당업계에 공지된 방법에 의해 제조할 것이다. 실시예 1, 2 및 5에 설명된 바와 같이 단백질을 후속적으로 발현시키고 정제할 것이다. 이중특이적 항체는 실시예 64에 설명된 바와 같이 스티어드 비-등몰 교환에 의해 생성할 것이다. 이것은 이중특이적 IgG1m(f,za) 항체 및 과량으로 첨가된 모 항체의 나머지를 함유하는 반응 혼합물을 생성시킬 것이다 (SNEEP).
친화도 크로마토그래피를 사용하여 이중특이적 IgG1m(f,za) 항체를 특이적으로 정제할 것이다. 따라서, 마우스 항-인간 G1m(f) 항체 5F10 (생퀸) 또는 마우스 항-인간 G1m(a) 항체 4E3 (서던 바이오테크)은 제조자의 지시에 따라 비드에 결합될 것이다. 이중특이적 IgG1m(f,za) 항체 및 과량으로 첨가된 나머지 모 항체를 함유하는 반응 혼합물을 적절한 비드 (이중특이적 IgG1m(f,za) 항체 상에 존재하는 동종이형 결정자에 대해 특이적이지만, 과량으로 첨가된 모 항체 상에 존재하는 것에 대해서는 그렇지 않은)를 함유하는 칼럼 상에 로딩할 것이다. 칼럼을 철저하게 세척하여 과잉의 모 항체를 제거할 것이고, 이어서, 이중특이적 IgG1m(f,za) 항체를 제조자의 지시에 따라 칼럼으로부터 용리시킬 것이다.
실시예 64: 스티어드 비- 등몰 교환 과정 ( SNEEP )과 단백질 A 결합 부위를 제거하는 동종이량체 중 하나에서의 돌연변이와의 조합.
교환된 생성물 내에 1개의 동종이량체의 존재가 교환 과정 (스티어드 비-등몰 교환 과정; SNEEP)에서 과량의 다른 동종이량체를 사용함으로써 감소될 수 있는지 조사하였다. SNEEP (교환된 생성물 내에 IgG1-2F8-F405L (단백질 A 상에서 정제된) 동종이량체의 존재를 감소시키기 위해 과량의 IgG1-7D8-K409R (단백질 A 상에서 정제된)을 사용하는)는 교환된 생성물 내에 단지 0.1% IgG1-2F8-F405L 동종이량체를 생성시킬 것이다 (도 105). 사용된 조건은 7.2 mg IgG1-7D8-K409R, 6.0 mg IgG1-2F8-F405L, 3 ml PBS 중 75 mM 2-MEA, 31℃에서 5시간 인큐베이션이었다. 과량의 IgG1-2F8-F405L 동종이량체를 사용할 때, 교환된 생성물 내의 IgG1-7D8-K409R의 백분율은 단지 0.4%이었다 (도 106) (6 mg의 IgG1-7D8-K409R 및 7.2 mg IgG1-2F8-F405L을 사용하여 동일한 조건).
이어서, 단백질 A 결합 부위를 제거하도록 돌연변이된 1개의 동종이량체 (다음 돌연변이를 입하였다: I253A, H310A, 및 H435A (AAA 돌연변이체)), 및 단백질 A에 여전히 결합할 수 있는 1개를 사용하여, SNEEP 및 단백질 A 크로마토그래피의 조합을 이용하여 고도로 순수한 이중특이적 항체를 생산할 수 있는지 조사하였다. 단백질 A 결합 부위가 결여되도록 돌연변이된 동종이량체가 단백질 A 결합 부위를 함유하는 동종이량체와 교환될 수 있는지 시험하기 위해, 동종이량체 IgG1-7D8-AAA-K409R 및 IgG1-2F8-F405L을 각각 단백질 G 및 단백질 A 상에서 정제하였다. SNEEP를 위해, 다음 조건을 사용하였다: 25 mM 2-MEA를 함유하는 1.2 ml PBS 중에서 1 mg IgG1-7D8-AAA-K409R 및 0.5 mg IgG1-2F8-F405L, 37℃, 90 min. 상기 절차를 이용할 때, 교환된 생성물 내의 IgG1-2F8-F405L 돌연변이체의 백분율은 1.2%이었다 (도 107). 낮은 백분율의 IgG1-7D8-AAA-K409R 동종이량체 (교환 반응에서 과량으로 사용된)를 함유하는 이중특이적 항체를 PBS (비. 브라운)로 예비-평형화시킨 1 ml MabSelectSure 칼럼을 사용하여 정제하였다. 생성되는 CIEX 크로마토그램 (도 108)은 관류 분획에서 피크 (피크 FT) 및 용리 분획에서 피크 (피크 E)를 보여주었고, 이것은 비-결합 및 결합 분획을 나타낸다. 비-결합 분획 및 결합 분획의 비는 SNEEP에서 사용된 50% 과량의 IgG1-7D8-AAA-K409R 동종이량체와 대략 상응하였다.
CIEX에 의한 피크 FT의 분석 (도 109)은 상기 분획이 검출가능하지 않게 소량의 이중특이적 항체 및 IgG1-2F8-F405L 동종이량체를 가지면서 독점적으로 IgG1-7D8-AAA-K409R 동종이량체를 함유하였음을 보여주었다. 이것은 예상된 바와 같이 단일 단백질 A 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체가 MabSelectSure에 잘 결합하였고, 과잉의 IgG1-7D8-AAA-K409R 동종이량체는 칼럼에 결합하지 않았음을 나타낸다. SNEEP 후에 남은 소량의 IgG1-2F8-F405L은 피크 FT에서 검출되지 않았고, 이것은 MabSelectSure에 결합하였음을 나타낸다.
용리된 분획 (피크 E)를 CIEX에 의해 분석하였다 (도 110). IgG1-7D8-AAA-K409R 동종이량체가 검출되지 않았다. IgG1-2F8-F405L의 양은 2.0%이었고, 이것은 중간 생성물 내에서 검출된 1.2%와 아주 일치한다.
따라서, SNEEP 후의 CIEX 분석은 충분히 풍부하지는 않은 동종이량체의 양의 효율적인 감소를 입증하였다. 또한, 과도하게 풍부한 (over-abundant) 동종이량체 (단백질 A 결합 부위가 제거된)를 친화도 크로마토그래피를 통해 제거하였다. IgG1-7D8-AAA 동종이량체는 최종 생성물 내에서 검출되지 않았다. 최종 생성물은 98.0% IgG1-7D8-AAA-K409R x IgG1-2F8-F405L 이중특이적 항체, 및 2.0% IgG1-2F8-F405L 동종이량체를 함유하였다. 요약하면, SNEEP는 단백질 A 결합 부위가 결여되도록 돌연변이된 1개의 동종이량체와 함께, 고도로 순수한 이종이량체 단백질 (98% 최종 순도)을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 65: 단백질 A 공동 동종이량체 정제 및 후속적인 교환
단일 단백질 A 포획 단계를 이용하여 함께 정제된 동종이량체로부터 이중특이적 항체가 생산될 수 있는지 조사하기 위해, 17.5 ml의 IgG1-b12-F405L (280 ㎍/ml 농도)을 66 ml의 IgG1-058-K409R (75 ㎍/ml 농도)과 혼합하였다. 합한 상청액 (1:1 혼합물, 총 단백질 기준)을 20 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 7.0으로 평형화시킨 1-mL 단백질 A 칼럼 상에 로딩하였다. 결합된 물질을 세척하고, 표준 절차를 이용하여 용리하였다 (7 칼럼 부피 (CV)의 20 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 7.0을 사용한 세척; 3 CV의 20 mM 시트레이트, pH 7.0을 사용한 예비-용리; 10 mM 시트레이트, pH 3.5를 사용한 용리).
IgG1-b12-F405L (gp120에 대한 항체), 및 IgG1-058-K409R (c-MET 수용체에 대해 작용성인 항체)의 공동 정제의 신속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 프로파일 (AKTA FPLC 시스템 상에서 측정된)은 pH 3.5에서 용리 시에 단일 피크를 보여주었다 (도 111). 이것은 동종이량체들이 단백질 A 정제를 위한 표준 공정에 대한 조정 없이 동시-정제될 수 있음을 나타낸다. 회수율 (상청액에 대한 OCTET 측정치 및 최종 생성물에 대한 A280 측정치에 기준하여 계산됨)은 상기 공정에 대해 >80%이었고, 이것은 돌연변이가 없는 IgG1 동종이량체에 대한 것과 유사하였다.
모아진 분획을 슬라이드-어-라이저 (slide-a-lyzer; 0.5-3 ml, 써모 (Thermo)) 내에서 밤샘 투석을 이용하여 PBS (피. 브라운, pH 7.4)로 완충제 교환하였다. 다음날, 샘플을 폴리프로필렌 관에 옮겼고, 최종 부피는 1.5 ml이었다.
동시-정제된 동종이량체의 CIEX 분석은 예상된 바와 같이 2개의 피크를 보여주었다 (도 112). 제1 피크 (rT = 14.9)는 IgG1-058-K409R에 상응하고, 제2 피크는 IgG1-b12-F405L에 상응한다. 비흡광 계수를 고려한 피크 면적의 정량은 57%의 IgG가 IgG1-b12-F405L이고 43%는 IgG1-058-K409R임을 보여주었고, 이것은 상청액 내의 농도 결정에서 예상된 부정확성과 아주 일치한다. 후속적으로, 0.165 ml 750 mM 2-MEA를 첨가하고, 31℃에서 5시간 동안 교환을 수행하였다. 다시 최종 생성물을 PBS (피. 브라운, pH 7.4)에 대해 투석하였다.
HP-SEC에 의해 결정할 때 (도 113) 최종 생성물 내의 다량체의 백분율 (2.0%)은 동종이량체에 비해 이중특이적 생성물이 추가의 단백질 A 정제 단계를 거치더라도, 동일한 절차를 이용하여 정제된 다른 IgG1 분자에 대등하였다 (IgG1-b12-F405L에 대해 < 1% 및 IgG1-058-K409R에 대해 1.8%). 이것은 공동으로 정제된 동종이량체의 생성물 품질이 그들의 상호 존재에 의해 영향을 받지 않았음을 나타낸다. IgG1-058-K409R 동종이량체는 최종 생성물의 CIEX 프로파일에서 검출되지 않았고, 이종이량체 단백질 및 IgG1-b12-F405L 동종이량체의 백분율은 86% 및 14%이었다 (도 114).
실시예 66: SNEEP 와 조합한 교환 후 연마 CIEX
SNEEP 및 등용매 방식의 약한 양이온 교환 (WCIEX) 크로마토그래피의 조합을 이용하여 이중특이적 생성물로부터 두 동종이량체를 모두 제거하는 것이 가능한지 조사하였다. 동종이량체를 공동 정제에 대해 설명된 표준 방안을 이용하여 단백질 A 상에서 성공적으로 정제하였다 (실시예 65). SNEEP는 실시예 64에 설명되어 있고, 0.1% (IgG1-2F8-F405L; 과량의 IgG1-7D8-K409R을 사용한 교환 반응에서; 도 105) 및 0.4% (IgG1-7D8-K409R; 과량의 IgG1-2F8-F405L을 사용한 교환 반응에서; 도 106) 동종이량체가 교환된 생성물 내에 존재함을 보여주었다. 이것이 별개의 실험에서 나타났지만, 이들 수치는 SNEEP의 효율을 표시하는 것으로 가정된다.
SNEEP 후에 동종이량체 제거 (연마)를 위한 최적 조건을 찾기 위해, IgG1-7D8-K409R, IgG1-7D8-K409Rx2F8-F405L, 및 IgG1-2F8-F405L의 1:1:1 혼합물을 제조하였다. 따라서, 상기 최적화는 3성분 (ternary) 혼합물에 대해 이루어져서 이를 더 일반적으로만들지만, SNEEP은 2성분 (binary) 혼합물을 생산한다. 그러나, 이들 조건은 3개의 성분 중 2개를 갖는 2성분 혼합물의 분리를 위해서도 또한 대표적인 것으로 생각된다. 혼합물을 약한 양이온 교환 (WCIEX) 칼럼 (지이 헬쓰케어, 최종 부하량 0.4 mg/ml 수지) 상에 로딩하고, 다양한 조성의 낮은 염 완충제를 사용하여 등용매 용리하였다 (아래 참조). 우수한 분리가 발견된 조건 하의 크로마토그램을 도 115에 제시한다. 좌측 피크는 IgG1-7D8-K409R에 상응하고, 중간 피크는 IgG1-7D8-K409Rx2F8-F405L에 상응하고, 우측 피크는 IgG1-2F8-F405L에 상응한다. 우측 피크 및 이종이량체 단백질의 분리를 위한 분리능을 다음 식 5를 이용하여 결정하였다:
Figure pct00029
(식 5)
tb: IgG1-2F8-F405L 동종이량체의 체류 시간
ta: 이중특이적 항체의 체류 시간
Wa: 절반 높이에서 이종이량체 단백질 피크의 폭
Wb: 절반 높이에서 IgG1-2F8-F405L 동종이량체 피크의 폭.
도 116에서, 식 5를 이용하여 계산된 분리능을 겹치는 pH 영역을 갖는 상이한 이온 강도를 갖는 2개의 완충제 (10 및 20 mM 시트레이트, pH 6.0 - 6.8 및 10 mM 포스페이트 pH 6.8 및 7.2)에 대해 pH의 함수로서 그래프로 그렸다. 분리능은 시트레이트 완충제, pH 6.4 내에서 최적이었다. 상기 조건을 등용매 방식의 WCIEX을 위해 선택하였다.
이종이량체 단백질을 SNEEP를 사용하여 얻은 이종이량체 단백질 생성물을 흉내내는, 10% IgG1-2F8-F405L 동종이량체로 스파이킹하였다. 양이온 교환 칼럼 (2.5 ml 스카우팅 (scouting) 칼럼, 고성능 세파로스 CM (지이 헬쓰케어)이 충전된 10 cm 층 높이)에 20 mM 시트레이트, pH 6.4 내의 1.0 ml의 혼합물을 로딩하였다 (1 ml 수지당 4 mg IgG).
FPLC 용리 프로파일은 큰 피크에 이어진 작은 피크를 보여준다 (도 117). 도 118에, 큰 피크 (S0002)의 모아진 분획의 분석적 CIEX 프로파일을 제시한다. 용리 후에 IgG1-7D8-K409, IgG1-7D8-K409Rx2F8-F405L, 및 IgG1-2F8-F405L의 백분율은 4.3%, 94.8%, 및 0.9%이고, 이것은 대부분의 IgG1-2F8-F405L 돌연변이체가 등용매 용리를 사용하여 제거되었음을 입증한다. 예상된 바와 같이, 나머지 4.3%의 IgG1-7D8-K409R 동종이량체에 의해 보이는 바와 같이 IgG1-7D8-K409R 동종이량체 및 이종이량체 단백질 사이의 분리능은 불충분하였다. 그러나, 상기한 바와 같이, IgG1-7D8-K409R 동종이량체의 양은 SNEEP를 이용하여 감소시킬 수 있는 것으로 가정된다.
요약하면, SNEEP는 WCIEX 칼럼 상에서 등용매 용리와 함께 고도로 순수한 이종이량체 단백질을 생산하기 위해 사용되었다. 별법으로, SNEEP에 이어 단백질 A 크로마토그래피는 단백질 A 결합을 제거하는 AAA 돌연변이 (I253A, H310A, 및 H435A, 실시예 64에 설명됨)와 함께 이중특이적 생성물 내의 각각의 동종이량체의 양을 1% 미만으로 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
실시예 67: 2- MEA 제거를 위한 결합 및 용리 크로마토그래피
이종이량체 단백질 제제로부터 환원제 2-MEA를 제거하기 위해 결합 및 용리 크로마토그래피 (CIEX, 친화도 크로마토그래피, HIC를 포함하고 이로 제한되지 않는)가 사용될 수 있는지 조사하였다. 단백질 A 친화도 크로마토그래피는 원리 증명 (proof-of-principle)으로서 사용되었고, 환원제에 대한 노출 전후에 칼럼의 성능을 파괴 지점의 결정에 의해 시험하였다.
이종이량체 단백질 생성물을 10 mg IgG1-7D8-K409R 및 10 mg IgG1-2F8-F405L을 3 ml로 75 mM 2-MEA와 함께 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션함으로써 제조하였다. 3 ml 단백질 생성물 (총 단백질 농도 ~20 mg/ml)을 평형화 및 세척 단계를 위해 PBS를 사용하고 용리를 위해 20 mM 시트레이트, pH 3.0을 사용하여 5-mL 단백질 A 칼럼에 적용하였다. FPLC 용리 프로파일을 AKTA 상에서 측정하였고, 도 119a에 제시한다. 8 ml에서, 단백질의 용리는 A254 및 A280에서 강한 증가에 의해 표시된다. 대략 65 ml에서, 단백질의 용리는 A254에서 강한 증가에 의해 표시된다. A280 신호의 증가는 이중특이적 항체의 환원 동안 시스타민의 형성 때문이다. 대조군 실행을 단백질 없이 75 mM 2-MEA를 사용하여 PBS를 사용하여 수행하였다 (도 119b). 대략 8 ml에서 A254의 증가는 2-MEA의 용리를 표시한다. A280 신호는 시스타민의 부재 때문에 도 119a에 비해 단지 미미하게 증가하였음에 주목한다. FT 분획에서 동일한 강도의 피크가 두 크로마토그램 모두에 존재하였고, 이것은 2-MEA가 칼럼에 결합하지 않았고, 단백질이 용리되었음을 나타낸다.
칼럼 통합성이 2-MEA의 존재에 의해 영향을 받는지 시험하기 위해, 단백질 A 칼럼의 파괴 지점을 2-MEA의 제거 전후에 결정하였다 (도 120). 파괴 지점은 2-MEA에 노출 전후에 유사하였고, 이것은 칼럼 성능이 2-MEA의 존재에 의해 영향을 받지 않음을 나타낸다.
단백질 A가 2-MEA 제거 동안 칼럼에서 누출되는지 검토하기 위해, 정제된 생성물에 대해 환원 SDS-PAGE 분석을 수행하였다 (도 121). 중쇄 (50 kDa) 및 경쇄 (25 kDa)의 예상된 밴드 이외의 밴드가 관찰되지 않았고, 이것은 칼럼이 2-MEA에 노출될 때 단백질 A의 유의한 상실이 없음을 나타낸다.
요약하면, 75 mM 2-MEA를 사용한 이종이량체 단백질의 FPLC 크로마토그램은 관류액 내에 2-MEA의 존재를 표시하는 A280/A215 비를 갖는 피크를 보여주었다. 2-MEA에의 노출 전후에 단백질 A 칼럼의 파괴 지점은 유사하였고, 이것은 성능이 2-MEA의 존재에 의해 영향을 받지 않음을 나타낸다. 환원 SDS-PAGE는 무손상 IgG를 보여주고 단백질 A 누출의 징후가 없음을 보여주었고, 이것은 칼럼이 2-MEA에 저항성임을 나타낸다. 이것은 생성물로부터 2-MEA의 제거를 나타냈다.
실시예 68: 1개의 κ 경쇄 - 및 1개의 λ 경쇄 -함유 동종이량체를 출발물질로 사용한 이중특이적 항체의 형성, 및 LambdaFabSelect 및 KappaSelect 를 이용하는 정제.
이중특이적 항체 제제 내에서 잔류량의 동종이량체의 제거를 가능하게 하기 위해, 1개의 κ 및 1개의 λ 경쇄를 갖는 이중특이적 항체가 생산될 수 있는지 여부를 조사하였다. κ 경쇄를 함유하는 1개의 IgG4 분자 및 λ 경쇄를 함유하는 또 다른 IgG4 분자 사이의 Fab-아암 교환의 가능성은 나탈리주맙을 사용하여 치료한 환자에서 생체내에서 나타났다 (문헌 [Labrijn et al. 2009 Nature Biotechnology p767]).
κ 경쇄를 함유하는 IgG1 분자 및 λ 경쇄를 함유하는 또 다른 IgG1 분자 사이에서 Fab-아암 교환이 가능한지 보여주기 위해, IgG1 동종이량체 IgG1-2F8-F405L 및 BMA 031-N297Q-K409R (N297Q 및 K409R 돌연변이를 갖는, T-세포 수용체 알파 쇄에 대한 IgG1/람다 항체 (문헌 [Shearman et al. 1991 J. Immunol. 147(12): 4366-4373]); N297Q 돌연변이는 글리코실화 부위를 녹아웃시키고; 이것은 교환 과정에 영향을 미치지 않는다)을 각각 150 ㎕ PBS 내에 0.5 mg/ml의 농도에서 1:1 몰비로 혼합하고, 75 mM 2-MEA의 존재하에 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 아미콘 울트라 0.5 (10,000 MWCO, 밀리포어)를 사용하여 PBS (비. 브라운, pH 7.4)에 대한 정용여과에 의해 혼합물로부터 2-MEA을 제거하였다. 도 122는 분석적 CIEX에 의해 분석할 때 κ 경쇄를 함유하는 IgG1 분자 및 λ 경쇄를 함유하는 또 다른 IgG1 분자 사이의 Fab-아암 교환이 가능하였음을 보여준다.
오염시키는 동종이량체로부터 이중특이적 항체를 정제하기 위해, 단백질 A로부터 용리 후에 Tris, pH 9.0을 사용하여 중화를 수행할 것이다. 완충제는 4℃에서 O/N 투석에 의해 PBS로 교환할 것이다. 비-결합을 제거하기 위해, κ 경쇄-함유 동종이량체, 1 ml LambdaFabSelect 수지 (1 ml HiTrap 칼럼, 지이 헬쓰케어 라이프 싸이언시스, 스웨덴 웁살라; cat. no 17-5482) 당 4 mg 이중특이적 항체를 0.1 ml/min의 로딩 유동 속도 (4 min 체류 시간)로 로딩할 것이다. 용리는 0.1 M 아세테이트, pH 3.5 내에서 수행할 것이다. 중화는 Tris, pH 9.0을 사용하여 수행할 것이다. 완충제는 4℃에서 O/N 투석에 의해 PBS로 교환할 것이다. 비-결합 λ 경쇄-함유 동종이량체를 제거하기 위해, 1 ml KappaSelect (1 ml HiTrap 칼럼, 지이 헬쓰케어 라이프 싸이언시스; cat. no 17-5458) 당 4 mg의 용리된 이중특이적 항체를 0.1 ml/min의 로딩 유동 속도 (4 min 체류 시간)로 로딩할 것이다. 용리는 0.1 M 글리신, pH 2.7 내에서 수행할 것이고, 중화는 Tris, pH 9.0을 사용하여 수행할 것이다. 완충제는 4℃에서 O/N 투석에 의해 PBS로 교환할 것이다.
SNEEP를 위해, κ 경쇄-함유 동종이량체 또는 λ 경쇄-함유 동종이량체 중 어느 하나를 30% 몰 과량으로 사용할 것이다. 충분히 풍부하지는 않은 종 (즉, 각각 λ 경쇄- 및 κ 경쇄-함유 동종이량체)는 각각 LambdaFabSelect 또는 KappaSelect에 결합될 것이다. 상기 방식에서, 과량의 κ 경쇄-함유 동종이량체 또는 λ 경쇄-함유 동종이량체가 제거될 것이다. 동종이량체에 대해 상기 설명된 바와 같은 세척 및 용리 조건을 이중특이적 항체의 정제를 위해 사용할 것이다.
별법으로, SNEEP이 수행되지 않으면, 모든 동종이량체를 제거하기 위해 KappaSelect 및 LambdaFabSelect를 이용하여 2회의 연속 연마 단계를 수행할 것이다.
실시예 69: 포스페이트 완충 염수, pH 7.4 내에서 듀오바디 ( DuoBody ) 및 동종이량체의 실시간 및 스트레스 하 ( Stressed ) 안정성.
PBS 완충제 내의 이종이량체 단백질의 생화학적 안정성을 원래의 동종이량체와 비교하여 12개월 동안 2 - 8℃에서 및 25℃에서 보관 시에 검사하였다. 3개월 동안 40℃의 승온에서 보관을 또한 포함시켰다. IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R 및 상응하는 동종이량체 IgG1-2F8-F405L 및 IgG1-7D8-K409R의 교환에 의해 형성된 이종이량체를 사용하여 안정성 시험을 수행하였다. 3가지 물질을 PBS (pH 7.4) (비. 브라운, cat. no 3623140; 8.7 mM HPO4 2 -, 1.8 mM H2PO4 -, 163.9 mM Na+, 140.3 mM Cl-, pH 7.4) 내에 5 mg/ml로 제제화하였다. 배치를 2 - 8℃에서 인큐베이션을 위해 1.0 ml 냉동 바이알 내에 및 25 및 40℃에서 인큐베이션을 위해 스토퍼 및 마개가 있는 유리 바이알 내에 300 ㎕ 분취액으로서 멸균 분배하였다. 물질을 나노드롭 (A280 및 A350), SDS-PAGE, HP-SEC 및 CIEX에서 0, 1, 2, 3, 6, 9 및 12개월에 분석하였다.
측정된 A280 값은 도 123에 제시된 바와 같이 상이한 시점 및 온도에서 보관된 모든 샘플에 대해 대등하였다. 동일한 샘플에서 350 nm에서 흡광도 (A350)를 또한 측정하였고, 이것은 샘플 혼탁도에 대한 표시를 제공한다. 이종이량체 단백질 및 동종이량체에 대한 A350 값은 보관 시에 증가하지 않았고, 이것은 이들 조건 하에 광범위한 미립자 형성이 일어나지 않았음을 나타낸다.
도 124 및 125는 연구의 출발에서 및 2 - 8℃에서 및 25℃에서 12개월 보관 후에 물질의 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석의 결과를 보여준다. 2 - 8℃에서 보관 시에 유의한 변화가 일어나지 않았다. 25℃에서 보관은 비-환원 SDS-PAGE에서 소량의 단편화, 및 환원 SDS-PAGE에서 71 및 113 kDa에서 추가의 밴드의 형성을 유도하였고, 이것은 동종이량체에 대한 것보다 이종이량체 단백질에 대해 약간 더 많은 것으로 보였다. 이들 추가의 밴드의 성질은 보관 시에 IgG 분자 내에 비환원성 티오-에테르 연결기의 형성 (디술피드 결합으로부터 황의 상실)에 의해 설명될 수 있었다. 40℃의 스트레스 조건은 단편화 과정을 가속화하였고, 25℃에서 인큐베이션의 결과를 확인하였다 (도 126 및 127).
HP-SEC를 이용하여 물질을 단편화 및 다량체화에 대해 분석하였고, 대표적인 크로마토그램을 도 128에 제시한다. 표 17의 데이터 개요는 이종이량체 단백질 및 동종이량체가 연구의 시작에서 및 2 - 8℃에서 12개월 보관 후에 단량체성이었음을 보여준다 (>99% 단량체). 물질을 25℃에서 12개월 동안 보관할 때 일부 단편화가 관찰되었지만 다량체화는 관찰되지 않았다. 이종이량체 단백질에 대한 단편화의 정도 (2.3%)는 2개의 각각의 동종이량체, 즉, IgG1-7D8-K409R (1.5%) 및 IgG1-2F8-F405L (6.3%)의 값 사이에 있고, 이것은 이종이량체 단백질이 동종이량체보다 더 취약하지 않았음을 나타낸다. 40℃에서 보관은 상당히 더 많은 단편화 (힌지 단편화, 및 Fab 단편의 상실)를 유도하였고, 이것은 동종이량체보다 이종이량체 단백질에 대해 다소 더 높은 것으로 보인다 (3.5% 및 10.6%에 비해 15.6%). 한편, 부적당한 분리능 때문에 이들 크로마토그램에 대해 피크 대입 및 피크 백분율의 결정은 어려웠다.
t = 0 및 t = 12개월에서 CIEX 분석 (전하 프로파일)의 결과를 도 129에 제시한다. 이종이량체 단백질의 피크 프로파일은 동일한 조건 하에 보관된 동종이량체와 대등하였다. 25℃에서 보관 시에, 감소하는 중성 피크 면적을 갖는 산성 피크의 증가가 모든 물질에 대해 명백하게 보였다. 승온 및 상승된 pH에서 IgG의 산성화는 IgG에 대해 일반적인 현상이고, 주로 Asp를 형성하는 Asn 잔기의 탈아미드화로 설명된다. 25℃ 보관에서 피크 프로파일은 이종이량체 단백질이 동종이량체 물질만큼 탈아미드화에 감수성임을 보여주었다.
결론적으로, 안정성 데이터는 A280, SDS-PAGE, HP-SEC 및 CIEX 분석에 기반하여, 이종이량체 단백질이 적어도 12개월 동안 PBS (pH 7.4) 내에서 5 mg/ml에서 2 - 8℃에서 보관 시에 생화학적으로 안정하였음을 보여준다. 25℃ 및 40℃의 승온에서, 이종이량체 단백질의 거동은 동종이량체 물질과 대등하였지만, 단편화는 약간 더 많은 것으로 보였다. 스트레스 조건 하에 이종이량체 단백질의 단편화의 양은 물질을 보다 낮은 pH (pH 6, 데이터를 제시하지 않음)를 갖는 다른 완충제 내에 제제화함으로써 감소시킬 수 있다.
Figure pct00030
SEQUENCE LISTING <110> Genmab A/S <120> Production of Heterodimeric Proteins <130> P/0071-WO <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 4 <211> 440 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Val Met Lys Asp Tyr Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Ala 210 215 220 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 305 310 315 320 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 6 Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 1 5 10 15 Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Lys 20 <210> 7 <211> 106 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 7 Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Glu Asp Gln 1 5 10 15 Val Lys Ser Gly Thr Val Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Ser Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Leu Lys Thr 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Asn Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ser Thr Asp Tyr Gln Ser 65 70 75 80 His Asn Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 8 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 9 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 10 <211> 455 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Val Met Lys Asp Tyr Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 11 <211> 97 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 11 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro 50 55 60 Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu 65 70 75 80 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 85 90 95 Thr <210> 12 <211> 452 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Val Met Lys Asp Tyr Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys 450

Claims (69)

  1. a) 제1 동종이량체 단백질을 제2 동종이량체 단백질과 함께, 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계로서,
    여기서 상기 제1 동종이량체 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하고, 상기 Fc 영역은 제2 CH3 영역을 포함하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열인 단계, 및
    b) 단계 a)로부터 얻은 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계
    를 포함하는, 이종이량체 단백질의 생산을 위한 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 b)가 적어도 10 ml의 단계 a)로부터 얻은 조성물을 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, c) 이종이량체 단백질을 얻는 단계를 추가로 포함하는 시험관내 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서의 환원 조건이 환원제의 첨가를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  5. 제4항에 있어서, 환원제가 2-메르캅토에틸아민, 2-메르캅토에틸아민의 화학 유도체, L-시스테인, 및 D-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시험관내 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)가 금속 킬레이팅제의 첨가를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  7. 제6항에 있어서, 금속 킬레이팅제가 EDTA, EGTA 또는 시트르산인 시험관내 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서의 환원 조건이 단계 a)에서 조성물 내의 산소의 양을 감소시키는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)가, 산화환원 전위가 -150 내지 -600 mV, 예컨대 -350 내지 -450 mV인 환원 조건 하에 수행되는 것인 시험관내 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)가 2-메르캅토에틸아민, L-시스테인 및 D-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 25 mM의 환원제의 존재 하에 적어도 20℃의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 완충제 내에 존재하는 것인 시험관내 방법.
  12. 제11항에 있어서, 완충제가 1-100 mM 범위의 포스페이트, 예컨대 1-50 mM의 포스페이트, 또는 1-25 mM 범위 또는 5-20 mM 범위의 포스페이트를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 완충제의 pH가 4.5-8.5 범위, 예컨대 6.5-7.5 범위인 시험관내 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 a) 8.1 mM 인산나트륨 (Na2HPO4-7H2O), 1.5 mM 인산칼륨 (KH2PO4), 138 mM 염화나트륨 (NaCl), 2.7 mM 염화칼륨 (KCl), pH 5.0; b) 8.1 mM 인산나트륨 (Na2HPO4-7H2O), 1.5 mM 인산칼륨 (KH2PO4), 138 mM 염화나트륨 (NaCl), 2.7 mM 염화칼륨 (KCl), pH 7.0; c) 20 mM 트리스-HCl, pH 7.8로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시험관내 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서의 pH가 6-8.5 범위인 시험관내 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서의 산화환원 전위가 적어도 -300 mV인 시험관내 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서의 산화 조건이 적어도 0.05 mM 산소의 존재를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서의 산화 조건이 산소의 첨가를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  19. 제18항에 있어서, 산소의 첨가가 기계적으로, 예를 들어 진탕, 교반, 압력의 증가 또는 유동의 생성에 의해 수행되는 것인 시험관내 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 산소의 첨가가 산소 또는 공기의 살포 또는 압력의 증가에 의해 수행되는 것인 시험관내 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서의 산화 조건이 산화제를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  22. 제21항에 있어서, 산화제가 데히드로아스코르브산 (dhAA)인 시험관내 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 이종이량체 단백질 및 환원제를 분리하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 b)가 단계 a)로부터 얻은 조성물을 크로마토그래피 또는 여과에 적용하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  25. 제24항에 있어서, 크로마토그래피가 칼럼 크로마토그래피인 시험관내 방법.
  26. 제24항에 있어서, 여과가 정용여과인 시험관내 방법.
  27. 제26항에 있어서, 정용여과가 접선 유동 여과 (TFF) 또는 정상 유동 여과 (NFF)인 시험관내 방법.
  28. 제27항에 있어서, 정용여과가 TFF인 시험관내 방법.
  29. 제27항에 있어서, 정용여과가, 1 내지 7 부피의 완충제 교환이 일어날 때까지, 10-50 kDa 범위의 컷오프 (cut-off) 값을 갖고 표면적이 0.05-1 m2 범위이고 카트리지 주입구 압력이 70-280 kPa 범위인 중공 섬유 카트리지를 통해 조성물을 순환시킴으로써 수행되는 것인 시험관내 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리가 단계 a)로부터 얻은 조성물의 완충제 또는 용액을 상기 환원제가 존재하지 않는 완충제 또는 용액으로 교환하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  31. 제30항에 있어서, 3-12 부피 범위, 예컨대 4-10 부피 범위의 완충제 또는 용액 교환을 포함하는 시험관내 방법.
  32. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리가 연속 공정인 시험관내 방법.
  33. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 단백질 및 환원제의 분리가 배치 공정인 시험관내 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서의 산화 조건이
    I) 단계 a)로부터 얻은 조성물의 정용여과 단계,
    II) 단계 I)로부터 얻은 보유물의 인큐베이션 단계,
    III) 단계 II)로부터 얻은 조성물의 정용여과 단계
    를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  35. 제34항에 있어서, 단계 I) 및/또는 III)에서의 정용여과가 3-12 부피 범위의 완충제 교환을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 단계 II)가 15-35℃ 범위의 온도에서 12-48시간의 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)로부터 얻은 조성물 내의 이종이량체 단백질의 농도가 1-100 g/L 범위인 시험관내 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서의 산화 조건이 금속 이온을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  39. 제38항에 있어서, 단계 b)에서의 산화 조건이 금속 이온의 첨가를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 금속 이온의 농도가 0.1 내지 100 μM 범위인 시험관내 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 이온이 구리, 망가니즈, 마그네슘, 철, 니켈 및 코발트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시험관내 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 제1 동종이량체 단백질 대 제2 동종이량체 단백질의 비가 1:1.01 내지 1:2 범위인 시험관내 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 동종이량체 단백질이 단백질 A 및/또는 단백질 G에 결합할 수 없는 것인 시험관내 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질이 상이한 경쇄를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  45. 제44항에 있어서, 단계 c)가 이종이량체 단백질을 상기 경쇄 중의 하나만이 결합하는 물질 상에 통과시킴으로써 잔류 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질을 분리하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 동종이량체 단백질의 Fc 영역이 상이한 동종이형의 것인 시험관내 방법.
  47. 제44항에 있어서, 단계 c)가 이종이량체 단백질을 상기 동종이형 중의 하나만이 결합하는 물질 상에 통과시킴으로써 잔류 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 단백질을 분리하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 단계 b)로부터 얻은 조성물을 정제 방법에 적용하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  49. 제48항에 있어서, 정제 방법이 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피, 항원-결합을 기초로 한 친화도 크로마토그래피, 항-이디오타입 항체를 기초로 한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피 (예컨대 히드록시아파타이트), 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 및 친황성 (thiophilic) 흡착 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시험관내 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)가
    i) 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 단백질을 제공하고, 상기 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
    ii) 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 단백질을 제공하고, 상기 Fc 영역은 제2 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
    - 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열임 -
    iii) 상기 제1 단백질을 상기 제2 단백질과 함께, 힌지 영역 내의 쇄간 디술피드 결합의 환원을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계
    를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 적어도 30 ml의 단계 a)로부터 얻은 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 것을 포함하는 것인 시험관내 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체 단백질의 총 농도가 적어도 0.25 mg/ml인 시험관내 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에 아미노산 치환을 함유하는 것인 시험관내 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 CH3 영역에 비해, 상기 제1 동종이량체 단백질이 CH3 영역에 1개 이하의 아미노산 치환을 갖고, 제2 동종이량체 단백질이 CH3 영역에 1개 이하의 아미노산 치환을 갖는 것인 시험관내 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 366, 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질이 366, 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고, 상기 제1 동종이량체 단백질 및 상기 제2 동종이량체 단백질이 동일한 위치에서 치환되지 않는 것인 시험관내 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질이 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖는 것인 시험관내 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질이 위치 405에 Phe 이외의 다른 아미노산을 갖는 것인 시험관내 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질이 위치 405에 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산을 갖는 것인 시험관내 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 위치 409에 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질이 위치 405에 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는 것인 시험관내 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 위치 409에 Arg, Gly, His, Val 및 Ile으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질이 위치 405에 Leu을 갖는 것인 시험관내 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 위치 409에 Arg을 갖는 것인 시험관내 방법.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 동종이량체 단백질이 위치 405에 Leu을 갖는 것인 시험관내 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 제1 동종이량체 단백질이 위치 409에 Arg을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질이 위치 405에 Leu을 갖는 것인 시험관내 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 C-말단 리신을 함유하지 않는 것인 시험관내 방법.
  65. 제64항에 있어서, 제1 및/또는 제2 동종이량체 단백질이 중쇄 내에 C-말단 리신이 결여되도록 유전자 변형되는 것인 시험관내 방법.
  66. 제64항에 있어서, 중쇄로부터 C-말단 리신을 제거하는 단계를 포함하는 시험관내 방법.
  67. x) 이뮤노글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 구축물을 제공하고, 상기 제1 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
    y) 이뮤노글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 구축물을 제공하고, 상기 제2 Fc 영역은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
    - 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 서열이고,
    상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고/갖거나,
    상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 실시예 21에서 설명되는 바와 같이 검정할 때 각각의 CH3 영역의 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 0.01 내지 10 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 10 마이크로몰, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5, 예컨대 0.05 내지 5 마이크로몰, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 내지 1 마이크로몰, 예컨대 0.05 내지 1 마이크로몰, 0.01 내지 0.5 또는 0.01 내지 0.1이 되도록 하는 서열임 -
    z) 숙주 세포에서 상기 제1 및 제2 핵산 구축물을 공발현시키는 단계,
    b) 단계 z)로부터 얻은 조성물을, 이종이량체 단백질 내의 시스테인의 쇄간 디술피드 결합으로의 산화를 허용하기에 충분한 산화 조건에 적용하는 단계
    를 포함하는, 이종이량체 단백질의 생산을 위한 시험관내 방법.
  68. 제67항에 있어서, 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 특징을 포함하는 시험관내 방법.
  69. 제1 또는 제2 동종이량체 단백질을 코딩하며, 상기 제1 또는 제2 동종이량체 단백질의 중쇄는 C-말단 리신을 포함하지 않는 것인, 뉴클레오티드 서열.
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