JP6797169B2

JP6797169B2 - ヘテロ二量体タンパク質の作出

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Publication number: JP6797169B2
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Inventors: グラマー，マイケル; クンドゥ，アミタバ; デンブレマー，エヴァルトティー．ジェイ．ファン; カンペン，ミュリエルファン; プリーム，パトリック; フランクラブリジン，アラン; アイ．メースターズ，ジョイス; ジェイ．ネイセン，ヨースト; スクールマン，ジャニーヌ; パーレン，ポール; ベルケル，パトリックファン; エル．フォス，ウェルナー; ゲリトセン，アーノウト
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Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2018-11-16
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Description

本発明は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を還元条件下でインキュベートする第１の工程と、第１の工程から得た組成物を酸化条件におく第２の工程を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのｉｎｖｉｔｒｏ法に関する。本発明の方法は、抗体を含むヘテロ二量体タンパク質の大規模作出に特に好適である。

モノクローナル抗体は近年、特に、癌の治療のための、治療用分子として成功している。二重特異性抗体はさらに、モノクローナル抗体療法の有効性を高めることができ、例えば、それらは、薬物もしくは毒性化合物を標的細胞へ向けるために、エフェクター機構を疾患関連部位へ向け直すために、または例えば、腫瘍細胞にのみ認められる標的分子の組合せとの結合によって、腫瘍細胞に対する特異性を高めるために、使用することができる。さらに、２つのモノクローナル抗体の特異性を１つに組み合わせることにより、二重特異性抗体はより多くの作用機序またはそれらの複合作用機序に関与する可能性がある。

最近では、二重特異性抗体の異なる形式および使用がChames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276において総説されている。二重特異性抗体の開発における大きな障害の１つは、ハイブリッドハイブリドーマおよび化学的コンジュゲーション法などの、従来の技術により十分な品質および量で材料を作出する難しさであった(Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)。異なる重鎖および軽鎖からなる２つの抗体の宿主細胞における共発現は、所望の二重特異性抗体の他に、生じ得る抗体産物の混合物をもたらす。

いくつかの戦略は、異なる抗体構築物の共発現によるヘテロ二量体の、すなわち、二重特異性の、産物の形成に有利に働くことが記載されている。

Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219)には、ラット／マウスクアドローマにおける選択的種限定的重鎖／軽鎖対合(preferential species-restricted heavy/light chain pairing)が開示されている。

二重特異性抗体の形成のための技術は、いわゆる「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ」戦略である（米国特許第５，７３１，１６８号）。欧州特許第Ｐ１８７０４５９号（Ｃｈｕｇａｉ)および国際公開第２００９０８９００４号（Ａｍｇｅｎ）には、宿主細胞における異なる抗体ドメインの共発現によるヘテロ二量体形成を促すための他の戦略が記載されている。これらの方法では、重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）において、両方のＣＨ３ドメインのＣＨ３−ＣＨ３境界部を構成する１つ以上の残基が荷電アミノ酸で置換され、これにより、ホモ二量体形成が静電的に不利となり、ヘテロ二量体化が静電的に有利となる。国際公開第２００７１１０２０５号（Ｍｅｒｃｋ）には、ＩｇＡＣＨ３ドメインとＩｇＧＣＨ３ドメインとの間の相違を利用して、ヘテロ二量体化を促進するといった、さらに別の戦略が記載されている。

Dall’Acqua et al. (1998 Biochemistry 37:9266)では、ＣＨ３ホモ二量体の境界部におけるＣＨ３−ＣＨ３接触に関与する５つのエネルギー的に重要なアミノ酸残基（３６６、３６８、４０５、４０７および４０９）が同定されている。

国際公開第２００８１１９３５３号（Ｇｅｎｍａｂ）には、抗体の生成のためのｅｘｖｉｖｏ法が記載されている。

国際公開第１１／１３１７４６号（Ｇｅｎｍａｂ）には、ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその作出のための方法が開示されている。

本発明は、安定なＩｇＧ１二重特異性抗体などの、ヘテロ二量体タンパク質の作出のための方法に関し、前記方法は、安定なヘテロ二量体タンパク質の大規模作出に特に好適であり、この場合、ジスルフィド結合が再酸化される。ホモ二量体のＣＨ３ドメイン内への非対称突然変異の導入により、Ｆａｂアーム交換反応はＣＨ３ドメインの相補性から方向性を持つようにならざるを得なくなり、それによって、極めて安定なヘテロ二量体タンパク質が生じることとなる。

米国特許第５，７３１，１６８号欧州特許第Ｐ１８７０４５９号国際公開第２００９０８９００４号国際公開第２００７１１０２０５号国際公開第２００８１１９３５３号国際公開第１１／１３１７４６号

Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276 Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649 Lindhofer et al. (1995) J Immunol 155:219 Dall’Acqua et al. (1998) Biochemistry 37:9266

一態様では、本発明は、
ａ）第１のホモ二量体タンパク質を第２のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質は、第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含み、前記第２のホモ二量体タンパク質は、第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含み、かつ、
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものである、
ｂ）工程ａ）から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程
を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのｉｎｖｉｔｒｏ法に関する。

別の態様では、本発明工程ａ）は、
ｘ）第１のＣＨ３領域を含む第１の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸構築物を提供する工程、
ｙ）第２のＣＨ３領域を含む第２の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸構築物を提供する工程、
ここで、前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質は、４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、前記第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ／または
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、各ＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例２１に記載のようにアッセイした場合に、０．０１〜１０マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１０マイクロモル濃度の間、より好ましくは、０．０１〜５の間、例えば、０．０５〜５マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、０．０１〜１マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１マイクロモル濃度の間、０．０１〜０．５の間または０．０１〜０．１の間であるものである、
ｚ）前記第１の核酸構築物および前記第２の核酸構築物を宿主細胞において共発現させる工程
と置き換えられる。
本願は、以下の態様を含む。
[1] ａ）第１のホモ二量体タンパク質を第２のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質は、第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含み、前記第２のホモ二量体タンパク質は、第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含み、かつ、
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものである、工程、
ｂ）工程ａ）から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのｉｎｖｉｔｒｏ法。
[2] 工程ｂ）が、工程ａ）から得た少なくとも１０ｍＬの組成物を、酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくことを含む、[1]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[3] ｃ）ヘテロ二量体タンパク質を得る工程をさらに含む、[1]又は[2]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[4] 工程ａ）における還元条件が還元剤を添加することを含む、[1]〜[3]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[5] 前記還元剤が、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカプトエチルアミンの化学誘導体、Ｌ−システインおよびＤ−システインからなる群から選択される、[4]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[6] 工程ａ）が金属キレート剤を添加することを含む、[1]〜[5]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[7] 前記金属キレート剤がＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはクエン酸である、[6]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[8] 工程ａ）における還元条件が工程ａ）における組成物中の酸素の量を減少させることを含む、[1]〜[7]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[9] 工程ａ）が、−１５０〜−６００ｍＶの間、例えば、−３５０〜−４５０ｍＶの間の酸化還元電位を用いる還元条件下で行われる、[1]〜[8]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[10] 工程ａ）が、２−メルカプトエチルアミン、Ｌ−システインおよびＤ−システインからなる群から選択される少なくとも２５ｍＭの還元剤の存在下、少なくとも２０℃の温度で少なくとも３０分間のインキュベーションを含む、[1]〜[9]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[11] 第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質がバッファー中に存在する、[1]〜[10]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[12] 前記バッファーがリン酸塩を１〜１００ｍＭの範囲、例えば、１〜５０ｍＭリン酸塩(phosphate)、または１〜２５ｍＭの範囲、または５〜２０ｍＭの範囲で含む、[11]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[13] 前記バッファーが、４．５〜８．５の範囲、例えば、６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する、[11]又は[12]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[14] 前記バッファーが、ａ）８．１ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ _２ＨＰＯ _４・７Ｈ _２Ｏ）、１．５ｍＭリン酸カリウム（ＫＨ _２ＰＯ _４）、１３８ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２．７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）ｐＨ５．０；ｂ）８．１ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ _２ＨＰＯ _４・７Ｈ _２Ｏ）、１．５ｍＭリン酸カリウム（ＫＨ _２ＰＯ _４）、１３８ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２．７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）ｐＨ７．０；３）２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８からなる群から選択される、[11]〜[13]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[15] 工程ｂ）が６〜８．５の範囲のｐＨを含む、[1]〜[14]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[16] 工程ｂ）が少なくとも−３００ｍＶの酸化還元電位を含む、[1]〜[15]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[17] 工程ｂ）における酸化条件が、少なくとも０．０５ｍＭの酸素の存在を含む、[1]〜[16]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[18] 工程ｂ）における酸化条件が酸素の添加を含む、[1]〜[17]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[19] 酸素の添加が、機械的に、例えば、振盪、撹拌、増圧または流れの創出により行われる、[18]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[20] 酸素の添加が、酸素もしくは空気を用いたスパージングまたは増圧により行われる、[18]又は[19]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[21] 工程ｂ）における酸化条件が酸化剤を含む、[1]〜[20]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[22] 前記酸化剤がデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）である、[21]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[23] 工程ｂ）が、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離することを含む、[1]〜[22]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[24] 工程ｂ）が、工程ａ）から得た組成物をクロマトグラフィーまたは濾過に付すことを含む、[23]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[25] 前記クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである、[24]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[26] 前記濾過がダイアフィルトレーションである、[24]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[27] 前記ダイアフィルトレーションがタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）またはノーマルフローフィルトレーション（ＮＦＦ）である、[26]に記載の方法。
[28] 前記ダイアフィルトレーションがＴＦＦである、[27]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[29] 前記ダイアフィルトレーションが、０．０５〜１ｍ ^２の範囲の表面積を有し、かつ、７０〜２８０ｋＰａの範囲のカートリッジ入口圧を示す、１０〜５０ｋＤａの範囲のカットオフ値を含む中空糸カートリッジを通して前記組成物を、１〜７容量のバッファー交換が行われるまで循環させることにより行われる、[27]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[30] ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離が、工程ａ）から得た組成物のバッファーまたは溶液を、前記還元剤を含まないバッファーまたは溶液と交換することを含む、[23]〜[29]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[31] ３〜１２容量の範囲での、例えば、４〜１０容量の範囲でのバッファーまたは溶液交換を含む、[30]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[32] ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離が連続プロセスである、[24]〜[30]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[33] ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離がバッチプロセスである、[24]〜[30]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[34] 工程ｂ）における酸化条件が、
Ｉ）工程ａ）から得た組成物のダイアフィルトレーション
ＩＩ）工程Ｉ）から得た保持液のインキュベーション
ＩＩＩ）工程ＩＩ）から得た組成物のダイアフィルトレーション
の工程を含む、[1]〜[33]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[35] 工程Ｉ）および／または工程ＩＩＩ）におけるダイアフィルトレーションが３〜１２容量の範囲でのバッファー交換を含む、[34]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[36] 工程ＩＩ）が１５〜３５℃の範囲の温度で１２〜４８時間のインキュベーションを含む、[34]又は[35]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[37] 工程ａ）から得た組成物におけるヘテロ二量体タンパク質の濃度が１〜１００ｇ／Ｌの範囲内である、[1]〜[36]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[38] 工程ｂ）における酸化条件が金属イオンを含む、[1]〜[37]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[39] 工程ｂ）における酸化条件が金属イオンの添加を含む、[38]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[40] 前記金属イオンの濃度が０．１〜１００μＭの範囲内である、[38]又は[39]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[41] 前記金属イオンが、銅、マンガン、マグネシウム、鉄、ニッケルおよびコバルトからなる群から選択される、[38]〜[40]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[42] 工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質と第２のホモ二量体タンパク質との比率が１：１．０１〜１：２の範囲内である、[1]〜[41]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[43] 第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質はいずれかがプロテインＡおよび／またはプロテインＧと結合することができない、[1]〜[42]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[44] 第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質が異なる軽鎖を含む、[1]〜[43]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[45] 工程ｃ）が、一方の軽鎖だけが結合する材料に通すことによりヘテロ二量体タンパク質を残存した第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質から分離することを含む、[44]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[46] 第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域が異なるアロタイプのものである、[1]〜[45]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[47] 工程ｃ）が、一方のアロタイプだけが結合する材料に通すことによりヘテロ二量体タンパク質を残存した第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質から分離することを含む、[44]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[48] 工程ｃ）が、工程ｂ）から得た組成物を精製方法に付すことを含む、[1]〜[47]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[49] 前記精製方法が、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィー、抗原結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィー、抗イディオタイプ抗体に基づいたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー（例えば、ハイドロキシアパタイト）、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよびチオール基吸着クロマトグラフィー（Thiophilic Adsorption Chromatography）からなる群から選択される、[48]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[50] 工程ａ）が、
ｉ）第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含む第１のホモ二量体タンパク質を提供する工程、
ｉｉ）第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含む第２のホモ二量体タンパク質を提供する工程を含み、
ここで、前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ｉｉｉ）前記第１のタンパク質を前記第２のタンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程
を含む、[1]〜[49]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[51] 工程ｂ）が、工程ａ）から得た組成物の少なくとも３０ｍＬを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくことを含む、[1]〜[50]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[52] 工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の総濃度が少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬである、[1]〜[51]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[53] 第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の配列が同一でない位置にアミノ酸置換を含む、[1]〜[52]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[54] 野生型ＣＨ３領域と比べて、第１のホモ二量体タンパク質がＣＨ３領域内にアミノ酸置換を１つだけ有し、第２のホモ二量体タンパク質がＣＨ３領域内にアミノ酸置換を１つだけ有する、[1]〜[53]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[55] 第１のホモ二量体タンパク質が、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質が、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質および前記第２のホモ二量体タンパク質が同じ位置で置換されていない、[1]〜[54]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[56] 第１のホモ二量体タンパク質が４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質が、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する、[1]〜[55]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[57] 第１のホモ二量体タンパク質が４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質が４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸を有する、[1]〜[56]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[58] 第１のホモ二量体タンパク質が４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質が４０５位にＰｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｙ以外のアミノ酸を有する、[1]〜[57]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[59] 第１のホモ二量体タンパク質が４０９位に、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質が４０５位に、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有する、[1]〜[58]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[60] 第１のホモ二量体タンパク質が４０９位に、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質が４０５位にＬｅｕを有する、[59]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[61] 第１のホモ二量体タンパク質が４０９位にＡｒｇを有する、[56]〜[60]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[62] 第２のホモ二量体タンパク質が４０５位にＬｅｕを有する、[56]〜[61]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[63] 第１のホモ二量体タンパク質が４０９位にＡｒｇを有し、第２のホモ二量体タンパク質が４０５位にＬｅｕを有する、[62]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[64] 第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質がＣ末端リジンを含まない、[1]〜[63]のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[65] 第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質が、重鎖のＣ末端リジンを欠くように遺伝子改変されている、[64]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[66] 重鎖からＣ末端リジンを除去する工程を含む、[64]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[67] ｘ）第１のＣＨ３領域を含む第１の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸構築物を提供する工程、
ｙ）第２のＣＨ３領域を含む第２の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸構築物を提供する工程、
ここで、前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質は、４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、前記第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ／または
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、各ＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例２１に記載のようにアッセイした場合に、０．０１〜１０マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１０マイクロモル濃度の間、より好ましくは、０．０１〜５の間、例えば、０．０５〜５マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、０．０１〜１マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１マイクロモル濃度の間、０．０１〜０．５の間または０．０１〜０．１の間であるものである、
ｚ）前記第１の核酸構築物および前記第２の核酸構築物を宿主細胞において共発現させる工程、
ｂ）工程ｚ）から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのｉｎｖｉｔｒｏ法。
[68] [1]〜[66]に記載の特徴のいずれかを含む、[67]に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
[69] 第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質の重鎖がＣ末端リジンを含まない、ヌクレオチド配列。

種間Ｆａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成。表示した抗ＥＧＦＲ（２Ｆ８）ＩｇＧ４抗体とＣＤ２０（７Ｄ８）ＩｇＧ４抗体との間でのＧＳＨ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。濃度系列（総抗体）０〜１μｇ／ｍＬをＥＬＩＳＡにおいて分析した。二重特異性結合は、同じ種の２抗体間の場合よりもアカゲザル（Ｒｈ）ＩｇＧ４抗体とヒト（Ｈｕ）ＩｇＧ４抗体との間でのＦａｂアーム交換後に高かった。ヒトおよびアカゲザルの抗体アイソタイプのコアヒンジ（すなわち、重鎖間ジスルフィド結合を形成する可能性がある２つのシステイン残基と、他のヒトおよびアカゲザルのアイソタイプにおける対応残基を含むヒトＩｇＧ１におけるＣＰＰＣ配列）およびＣＨ３−ＣＨ３境界部のアミノ酸配列のアラインメント。Ｆａｂアーム交換に関与する変異ヒトＩｇＧ１を用いた二重特異性抗体の生成。ヒトＣＤ２０（７Ｄ８）ＩｇＧ４抗体と表示したヒトＥＧＦＲ（２Ｆ８）ＩｇＧ１抗体との間でのＧＳＨ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。示したグラフは３回の独立したＦａｂアーム交換実験の平均数値を示し、これらの実験では、総抗体濃度１μｇ／ｍＬをＥＬＩＳＡに用いた。二重特異性結合は、２つのＩｇＧ４抗体間の場合よりもＩｇＧ１−２Ｆ８−ＣＰＳＣ−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８との間でのＦａｂアーム交換後に高かった。ＩｇＧ４−７Ｄ８と、ＩｇＧ１-２Ｆ８、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＣＰＳＣまたはＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとの組合せでは、使用した条件下で二重特異性抗体は得られなかった。ヒトＩｇＧ４抗体および変異ＩｇＧ１抗体のｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成。ヒトＣＤ２０（７Ｄ８）ＩｇＧ４と表示したヒトＥＧＦＲ（２Ｆ８）ＩｇＧ１変異抗体およびＩｇＧ４変異抗体との間での免疫不全マウスにおけるｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。示したグラフは平均数値（ｎ＝４）を示す。二重特異反応性は、総ＩｇＧ濃度に対する二重特異性抗体の濃度（パーセンテージ）として表される。ＣＨ３ドメイン内に安定化ヒンジ（ＣＰＰＣ）またはＲ４０９Ｋ突然変異を有するヒトＩｇＧ４は、Ｆａｂアーム交換に関与することができない。ＣＨ３ドメイン内に前記ヒンジのＣＰＳＣ配列とＫ４０９Ｒ突然変異の両方を有するＩｇＧ１はＦａｂアーム交換に関与する。（^＊）ＩｇＧ１−２Ｆ８、ＩｇＧ４−２Ｆ８−ＣＰＰＣまたはＩｇＧ４−２Ｆ８−Ｒ４０９Ｋのいずれかを含有する混合物についての二重特異性結合は検出限界に満たなかったため、任意にゼロとした。ヒトＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体との間での２−メルカプト−エチルアミン・ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）誘導によるＦａｂアーム交換を用いた二重特異性抗体の生成。表示したヒトＥＧＦＲ（２Ｆ８）抗体とＣＤ２０（７Ｄ８）抗体との間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。濃度系列０〜４０ｍＭの２−ＭＥＡを試験した。示したグラフはＥＬＩＳＡの結果を示し、これらの試験では、総抗体濃度２０μｇ／ｍＬを用いた。２−ＭＥＡは、安定化ヒンジ（ＣＰＰＣ）を含有する抗体間でも、Ｆａｂアーム交換を効率的に誘導した。ＣＨ３ドメインに関して、三重突然変異Ｔ３５０Ｉ−Ｋ３７０Ｔ−Ｆ４０５Ｌを有するヒトＩｇＧ４×ヒトＩｇＧ１の組合せでは、２つの野生型ＩｇＧ４抗体よりも高いレベルの二重特異反応性が得られた。ヒトＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体との間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を用いた二重特異性抗体の生成。表示したヒトＥＧＦＲ（２Ｆ８）抗体とＣＤ２０（７Ｄ８）抗体との間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成を、質量分析により濃度系列０〜４０ｍＭの２−ＭＥＡの全サンプルについて判定した。（Ａ）０ｍＭ、７ｍＭおよび４０ｍＭ２−ＭＥＡの場合のＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間でのＦａｂアーム交換反応のサンプルについての質量分析プロフィールの代表例を示す。（Ｂ）質量分析データの定量化後、二重特異性抗体のパーセンテージを算出し、Ｆａｂアーム交換反応における２−ＭＥＡの濃度に対してプロットした。ＩｇＧ４−２Ｆ８×ＩｇＧ４−７Ｄ８では、ほぼ５０％の二重特異性抗体を生じた。ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣでは、ほぼ９５％の二重特異性抗体を生じた。（図６−１の続き）２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により得られたヘテロ二量体の二重特異性抗体の安定性解析。ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ（Ａ）、またはＩｇＧ４−２Ｆ８×ＩｇＧ４−７Ｄ８（Ｂ）のいずれかを組み合わせることによって２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性サンプルの安定性を、表示濃度の無関係のＩｇＧ４の存在下でのＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換反応後にＥＬＩＳＡにおいてＥＧＦＲ／ＣＤ２０二重特異性結合を測定することにより試験した。二重特異性結合は、出発材料の二重特異性結合（対照）（１００％とした）と比較して表される。（Ａ）ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣに由来する、２−ＭＥＡ誘導による二重特異性産物の二重特異性結合は保存されていたことから、ＧＳＨ条件下でＦａｂアーム交換に関与しなかった安定な産物であることが示された。（Ｂ）ＩｇＧ４−２Ｆ８×ＩｇＧ４−７Ｄ８に由来する、２−ＭＥＡ誘導による二重特異性産物の二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ２０結合は減少したことから、ＧＳＨ条件下で無関係のＩｇＧ４とのＦａｂアーム交換に関与した産物であることが示された。２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成されたヘテロ二量体の二重特異性抗体の血漿クリアランス率。３群のマウス（１群あたりマウス３匹）に表示した抗体を注射した：（１）ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体１００μｇ；（２）二重特異性抗体１００μｇ＋無関係のＩｇＧ４１，０００μｇ；（３）ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ５０μｇ＋ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ５０μｇ。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって判定した、経時的な総抗体濃度。総抗体血漿中濃度の曲線は全ての抗体について同じであった。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって判定した二重特異性抗体濃度。注射した抗体の二重特異性は、過剰な無関係のＩｇＧ４の添加を行った場合も行わなかった場合も同じであった。（^＊）ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ＋ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ混合物についての二重特異性結合は検出限界に満たなかったため、対応する記号をこのグラフにプロットすることはできなかった。２回のＥＬＩＳＡ実験の平均値を示す。ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８とＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの間でのＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の純度。（Ａ）還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ａ）は、二重特異性サンプルおよびＩｇＧ１対照サンプルの両方の重鎖および軽鎖のバンドを示す。非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｂ）は完全ＩｇＧを示す。（Ｂ）ＨＰ−ＳＥＣ分析からのピーク結果は、二重特異性サンプルの＞９８％が同一構造を有し、実質的に抗体凝集体が検出できなかったことを示す。（Ｃ）質量分析は、Ｆａｂアーム交換によりおよそ１００％の二重特異性産物が生じたことを示す。（図９−１の続き）三重変異体（ＩＴＬ）、二重変異体（ＩＴ、ＩＬ、ＴＬ）および単一変異体（Ｌ）のヒトＩｇＧ１−２Ｆ８の間での、ヒトＩｇＧ４−７Ｄ８とのＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成における比較。ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８の三重変異体および二重変異体と、ＣＰＳＣヒンジを有する野生型ＩｇＧ４−７Ｄ８（Ａ）または安定化ヒンジを有する変異体ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ（Ｂ）との間、あるいは単一変異体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌと野生型ＣＰＳＣヒンジもしくは安定化ＣＰＰＣヒンジを有するＩｇＧ４−７Ｄ８との間（Ｃ）での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。二重変異体および単一変異体を伴う実験でのＥＬＩＳＡでは、それぞれ、濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬまたは０〜１０μｇ／ｍＬを分析した。ＩｇＧ４と、二重変異体であるＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＬおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−ＴＬとの組合せでは、三重変異体であるＩｇＧ１−ＩＴＬと同じような二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ２０結合を生じる。ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴとの組合せでは、二重特異性産物は得られない。ＩｇＧ４野生型および安定化ヒンジを有するＩｇＧ４はどちらも単一変異体であるＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌとの組合せにより、二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ２０結合を生じる。異なる温度での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を用いた二重特異性抗体の生成。０℃、２０℃および３７℃での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換反応において表示したヒトＥＧＦＲ（２Ｆ８）抗体とＣＤ２０（７Ｄ８）抗体を組み合わせることによる二重特異性抗体の生成を、ＥＬＩＳＡにより一定の時間で追跡した。二重特異性結合の誘導は３７℃で最も効率がよく、２０℃ではいっそう緩慢であった。０℃では、測定される二重特異性結合の生成はなかった。異なる還元剤により誘導されたｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成。表示した還元剤の濃度系列での還元反応においてヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣを組み合わせることによる二重特異性抗体の生成を測定するために、ＥＬＩＳＡを用いた。二重特異性結合は、ＤＴＴ（２．５ｍＭＤＴＴで最大を得た）および２−ＭＥＡ（２５ｍＭ２−ＭＥＡで最大を得た）での反応後に測定されたが、ＧＳＨでは測定されなかった。（^＊）抗体凝集体の形成のため、ＧＳＨ濃度＞１０ｍＭのデータは除外した。ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｘ変異体との間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換。ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬと表示したＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｘ変異体との間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。（Ａ）濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬを分析した。陽性対照は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣに由来する二重特異性抗体の精製バッチである。（Ｂ）交換は、陽性対照（黒色バー）に対する２０μｇ／ｍＬでの二重特異性結合として表される。濃灰色バーは、ＩｇＧ４対照（ＩｇＧ４−７Ｄ８×ＩｇＧ４−２Ｆ８）間、陰性対照（ＩｇＧ１−２Ｆ８×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）間、およびＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの間での二重特異性結合を表す。薄灰色バーは、表示したＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｘ変異体とＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとの間で同時に行われたＦａｂアーム交換反応の結果を表す。抗体の脱グリコシル化は２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成に影響を及ぼさない。表示したＥＧＦＲ（２Ｆ８）抗体とＣＤ２０（７Ｄ８）抗体との間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。７Ｄ８抗体との交換は、それらの酵素的脱グリコシル化変種と比較した。濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬをＥＬＩＳＡにおいて分析した。脱グリコシル化（ｄｅｇｌｙｃ）抗体を伴うＦａｂアーム交換反応は、それらの抗体の由来となるグリコシル化変種と同一の二重特異性結合曲線を示した。Ｆａｂアーム交換に関与する能力はＣＨ３−ＣＨ３相互作用強度と相関がある。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）経時的なＥＬＩＳＡでの二重特異性結合として表した、表示した突然変異を有する、ＩｇＧ１−２Ｆ８とＩｇＧ１−７Ｄ８構築物（Ａ）またはＩｇＧ４−２Ｆ８とＩｇＧ４−７Ｄ８構築物（ＢおよびＣ）の間でのＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成。二重特異性は、２４時間後のＩｇＧ４−２Ｆ８×ＩｇＧ４−７Ｄ８対照と比較して表される。（Ｄ）および（Ｅ）ＩｇＧ１に基づく分子（Ｄ）またはＩｇＧ４に基づく分子（Ｅ）についての見かけのＫ_Ｄ（表２）と２４時間後の二重特異性抗体の生成（図１５Ａ／Ｂ／Ｃ）との間の関係。（図１５−１の続き）ＩｇＧ１、ＩｇＧ４および（部分的）ＩｇＧ３主鎖における抗ＥＧＦｒ抗体２Ｆ８の配列アラインメント。Ｋａｂａｔによるアミノ酸ナンバリングおよびＥＵインデックスによるアミノ酸ナンバリングを示す（どちらもKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)に記載されている）。２Ｆ８−Ｇ１を配列番号１０に示し、２Ｆ８−Ｇ３（一部）を配列番号１１に示し、２Ｆ８−Ｇ４を配列番号１２に示す。異なる還元剤により誘導されたｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成。表示した還元剤の濃度系列での還元反応においてヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒを組み合わせることによる二重特異性抗体の生成を測定するために、ＥＬＩＳＡを用いた。ＯＤ測定値を、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換に由来する二重特異性対照サンプルのシグナル（１００％とした）に対して正規化した。最大の二重特異性結合は、濃度範囲０．５〜５０ｍＭのＤＴＴ、濃度範囲２５〜５０ｍＭの２−ＭＥＡおよび濃度範囲０．５〜５．０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での反応後に測定されたが、ＧＳＨでは測定されなかった。（^＊）抗体凝集体の形成のため、ＧＳＨ濃度≧２５ｍＭのデータは除外した。ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を用いた二重特異性抗体の生成。（Ａ）２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。示したグラフはＥＬＩＳＡの結果を示し、これらの試験では、総抗体濃度２０μｇ／ｍＬを用いた。２−ＭＥＡは、ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間でのＦａｂアーム交換を効率的に誘導した。（Ｂ）２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成を、質量分析により濃度系列０〜４０ｍＭの２−ＭＥＡの全サンプルについて判定した。質量分析データの定量化後、二重特異性抗体のパーセンテージを算出し、Ｆａｂアーム交換反応における２−ＭＥＡの濃度に対してプロットした。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間でのＦａｂアーム交換では、試験した最大２−ＭＥＡ濃度において約１００％の二重特異性抗体を生じ、ＥＬＩＳＡデータが裏付けられた。ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間でのＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の純度。質量分析は、Ｆａｂアーム交換によりおよそ１００％の二重特異性産物が生じたことを示す。２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の血漿クリアランス。２群のマウス（１群あたりマウス３匹）に表示した抗体を注射した：（１）ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体１００μｇ；（２）二重特異性抗体１００μｇ＋無関係のＩｇＧ４１，０００μｇ（１０×ＩｇＧ４）。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって判定した、経時的な総抗体濃度。総抗体血漿中濃度の曲線は全ての抗体について同じであった。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって判定した二重特異性抗体濃度。注射した抗体の二重特異性は、過剰な無関係のＩｇＧ４の添加を行った場合も行わなかった場合も同じであった。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体によるＣＤ２０発現細胞のＣＤＣ媒介による細胞死滅。表示した抗体の濃度系列を用いて、Ｄａｕｄｉ細胞（Ａ）およびＲａｊｉ細胞（Ｂ）においてＣＤＣを媒介するそれらの能力を試験した。どちらの細胞株もＣＤ２０を発現するが、ＥＧＦＲを発現しない。ＩｇＧ１−７Ｄ８へのＫ４０９Ｒの導入は、ＣＤＣを誘導するその能力に影響を及ぼさなかった。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換に由来する二重特異性抗体はなおＣＤＣを誘導することができた。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体によるＥＧＦＲ発現細胞のＡＤＣＣ媒介による細胞死滅。表示した抗体の濃度系列を用いて、Ａ４３１細胞においてＡＤＣＣを媒介するそれらの能力を試験した。ＩｇＧ１−７Ｄ８は、ＣＤ２０陰性Ａ４３１細胞と結合することができず、その結果として、ＡＤＣＣを誘導しなかった。ＡＤＣＣは、ＣＨ３ドメインへのＦ４０５Ｌ突然変異の導入後も、ＥＧＦＲ抗体ＩｇＧ１−２Ｆ８によって誘導された。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬのＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間でのＦａｂアーム交換により得られた二重特異性形式において保持された。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換。表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。（Ａ）濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬをＥＬＩＳＡにおいて分析した。陽性対照は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒに由来する二重特異性抗体の精製バッチである。（Ｂ）交換は、陽性対照（黒色バー）に対する２０μｇ／ｍＬ抗体濃度での二重特異性結合として表される。濃灰色バーは、ＩｇＧ４対照（ＩｇＧ４−７Ｄ８×ＩｇＧ４−２Ｆ８）および陰性対照（ＩｇＧ１−２Ｆ８×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）の間での二重特異性結合を表す。薄灰色バーは、表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒまたは対照との間で同時に行われたＦａｂアーム交換反応の結果を表す。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｙ４０７Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換。表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｙ４０７Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡによって判定した。（Ａ）濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬをＥＬＩＳＡにおいて分析した。陽性対照は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒに由来する二重特異性抗体の精製バッチである。（Ｂ）交換は、陽性対照（黒色バー）に対する２０μｇ／ｍＬ抗体濃度での二重特異性結合として表される。濃灰色バーは、ＩｇＧ４対照（ＩｇＧ４−７Ｄ８×ＩｇＧ４−２Ｆ８）および陰性対照（ＩｇＧ１−２Ｆ８×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）の二重特異性結合を表す。薄灰色バーは、表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｙ４０７Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒまたは対照との間で同時に行われたＦａｂアーム交換反応の結果を表す。２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体についての、非還元条件（図２５（Ａ））および還元条件（図２５（Ｂ））下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（図２６（Ｂ））、ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（図２６（Ａ））、両方のホモ二量体の混合物（１：１）（図２６（Ｃ））、およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物（図２６（Ｄ））のＨＰ−ＳＥＣプロフィール。ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（図２７（Ｂ））、ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（図２７（Ａ））、両方のホモ二量体の混合物（１：１）（図２７（Ｃ））、およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物（図２７（Ｄ））の質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）。ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（図２８（Ａ））、ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（図２８（Ｂ））、両方のホモ二量体の混合物（１：１）（図２８（Ｃ））、およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物（図２８（Ｄ））のキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）プロフィール。ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（図２９（Ａ））、ホモ二量体出発材料ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（図２９（Ｂ））、両方のホモ二量体の混合物（１：１）（図２９（Ｃ））、およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物（図２９（Ｄ））のＨＰＬＣ−ＣＩＥＸプロフィール。異なる時点での注入後に高圧液体クロマトグラフィー・陽イオン交換（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸ）によってモニタリングした、ホモ二量体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの交換反応。ＣＩＥＸ法で検出した、交換反応後の残存ホモ二量体（矢印で示す）。ＥＬＩＳＡによって判定した、二重特異性抗体の生成に及ぼすＩｇＧ濃度、２−ＭＥＡ濃度、インキュベーション温度およびインキュベーション時間の影響。（図３２−１の続き）（図３２−２の続き）ＥＬＩＳＡによって判定し、対照（任意に１００％とした）と比較した、様々なＩｇＧ濃度、２−ＭＥＡ濃度、インキュベーション温度および時間での二重特異性抗体の生成。（図３３−１の続き）ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸによって分析した、様々なＩｇＧ濃度、２−ＭＥＡ濃度、インキュベーション温度および時間での二重特異性抗体の生成。（図３４−１の続き）（図３４−２の続き）（図３４−３の続き）表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成を、ＥＬＩＳＡにより、濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬを用いて判定した（図３５（Ａ））。陽性対照は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒに由来する二重特異性抗体の精製バッチである。図３５（Ｂ）は、陽性対照（黒色バー）に対する２０μｇ／ｍＬでの二重特異性結合を示す。濃灰色バーは、ＩｇＧ４対照（ＩｇＧ４−７Ｄ８×ＩｇＧ４−２Ｆ８）および陰性対照（ＩｇＧ１−２Ｆ８×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）の二重特異性結合を表す。薄灰色バーは、表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間で同時に行われたＦａｂアーム交換反応の結果を表す。表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｋ３７０Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成を、ＥＬＩＳＡにより、濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬを用いて判定した（図３６（Ａ））。陽性対照は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒに由来する二重特異性抗体の精製バッチである。図３６（Ｂ）は、陽性対照（黒色バー）に対する２０μｇ／ｍＬでの二重特異性結合を示す。濃灰色バーは、ＩｇＧ４対照（ＩｇＧ４−７Ｄ８×ＩｇＧ４−２Ｆ８）および陰性対照（ＩｇＧ１−２Ｆ８×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）の二重特異性結合を表す。薄灰色バーは、表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３７０Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間で同時に行われたＦａｂアーム交換反応の結果を表す。表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３９９Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成を、ＥＬＩＳＡにより、濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬを用いて判定した（図３７（Ａ））。図３７（Ｂ）は、陽性対照（黒色バー）に対する２０μｇ／ｍＬ抗体濃度での二重特異性結合を示す。濃灰色バーは、ＩｇＧ４対照（ＩｇＧ４−７Ｄ８×ＩｇＧ４−２Ｆ８）および陰性対照（ＩｇＧ１−２Ｆ８×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）の二重特異性結合を表す。薄灰色バーは、表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３９９Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間で同時に行われたＦａｂアーム交換反応の結果を表す。表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｔ３６６Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換後の二重特異性抗体の生成を、ＥＬＩＳＡにより、濃度系列（総抗体）０〜２０μｇ／ｍＬを用いて判定した（図３８（Ａ））。図３８（Ｂ）は、陽性対照（黒色バー）に対する２０μｇ／ｍＬ抗体濃度での二重特異性結合を示す。濃灰色バーは、ＩｇＧ４対照（ＩｇＧ４−７Ｄ８×ＩｇＧ４−２Ｆ８）および陰性対照（ＩｇＧ１−２Ｆ８×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）の二重特異性結合を表す。薄灰色バーは、表示したＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｔ３６６Ｘ変異体とＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間で同時に行われたＦａｂアーム交換反応の結果を表す。サンドイッチＥＬＩＳＡによって判定した、０分、３０分、６０分、１０５分および２００分のインキュベーション後の１５℃での４つの異なるＩｇＧ１変異体組合せ（表示したもの）の間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換。サンドイッチＥＬＩＳＡによって判定した、１５℃で９０分間の抗体インキュベーション後の異なるＩｇＧ１変異体組合せの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換。二重特異性抗体を分析的ＣＩＥＸにより分析し、異なるバッファー（凡例中に表示）中で経時的に形成されたヘテロ二量体のパーセンテージを以下のとおりに算出した：ヘテロ二量体（％）＝１００％−［ピーク面積％ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ＋ピーク面積％ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ］。１０ｍｇ／ｍＬの各抗体を含有する混合物を用いて作出された二重特異性抗体の４０ｍＬバッチを、０℃で一晩（Ａ、Ｂ）または４℃で６日間（Ｃ、Ｄ）保存後に、非還元条件（Ａ、Ｃ）および還元条件（Ｂ、Ｄ）下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。各ゲルのレーン１はＭＷマーカーを含み、レーン２はＩｇＧ１内部アッセイ対照を含む。Ａ、Ｂ：レーン３：１０ｍｇ／ｍＬの各抗体を含有する混合物を用いて作出された二重特異性抗体の４０ｍＬバッチ；Ｃ、Ｄ：レーン４：１０ｍｇ／ｍＬの各抗体を含有する混合物を用いて作出された４０ｍＬバッチ。非還元条件では、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の異なる組合せが示される：１４８ｋＤａ（ＬＨＨＬ）、１２５ｋＤａ（ＨＨＬ）、９９ｋＤａ（ＨＨ）、６７ｋＤａ（ＨＬ）、５１ｋＤａ（Ｈ）および２５ｋＤａ（Ｌ）。ＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位および酸素飽和度。還元および酸化段階の間の酸化還元電位および酸素飽和度を、酸化還元プローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを用いて追跡した。左のｙ軸および実線は、酸化還元電位を示し；右のｙ軸および破線は、矢印で示す異なるプロセス段階の間に溶液中で測定した酸素飽和度を示す。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＨＰ−ＳＥＣ分析。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルをＨＰ−ＳＥＣにより分析した。サンプル２（Ｓ０００２）：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；サンプル３〜８：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：１時間、２時間、３時間、４時間、４１／２時間、５時間）；サンプル９〜１２：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（１時間、２時間、３時間、４時間の時点におけるサンプル）；サンプル１３：一晩インキュベーション後の抗ＣＤ３８抗体；サンプル１４：溶液へのＣｕＳＯ_４の添加後の抗ＣＤ３８抗体。比較のため、２−ＭＥＡ単独の場合と、２−ＭＥＡと２−ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）の場合のＨＰ−ＳＥＣプロフィールを太線で示す。７．７１５および９．１９３にあるピークは二量体および単量体のＩｇＧ１を表す。１１．０７３にあるピークの性質は分からない。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；レーン２：ＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；レーン３〜８：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（図の上部に示したインキュベーション時間）；レーン９〜１２：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体；レーン１３：一晩インキュベーション後の抗ＣＤ３８抗体；レーン１４：溶液へのＣｕＳＯ_４の添加後の抗ＣＤ３８抗体。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＥＳＩ−ＭＳ分析。抗ＣＤ３８抗体の還元および再酸化の間に採取したサンプルをクエンチし、ＥＳＩ−ＭＳ分析により分析した。サンプル１（Ｓ０００１）：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；サンプル２：ＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；サンプル３〜８：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：１時間、２時間、３時間、４時間、４時間半、５時間）；サンプル９〜１２：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（１時間、２時間、３時間、４時間の時点におけるサンプル）；サンプル１３：一晩インキュベーション後の抗ＣＤ３８抗体；サンプル１４：溶液へのＣｕＳＯ_４の添加後の抗ＣＤ３８抗体。ＬＣ−ＭＳはＬＣシステム中でのまたはエレクトロスプレープロセスの間での還元体除去により再酸化プロセスを促進し、サンプルは空気、すなわち、酸素に曝されるということを注記しておく。サンプルは、クエンチ工程の間にＩＡＡによるキャッピングが施されなかった、共有結合還元体分子を喪失する可能性がある。従って、共有結合による影響を受けていない再酸化ＩｇＧは、ＥＳＩ−ＭＳによればＳＤＳ−ＰＡＧＥと比べて過大評価される。重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の異なる組合せが示される：ＬＨＨＬ、ＨＨＬ、ＨＨ、ＨＬ、ＨおよびＬ。質量詳細は軽鎖（Ｌ）についてのみ図に示す；＋２−ＭＥＡ＝＋７５Ｄａ；＋２−ヨードアセトアミド＝＋５７Ｄａ。ＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位および酸素飽和度−高速ダイアフィルトレーションおよび二次ダイアフィルトレーション工程。還元および酸化段階の間の酸化還元電位および酸素飽和度を、酸化還元プローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを用いて追跡した。左のｙ軸および実線は、酸化還元電位を示し；右のｙ軸および破線は、矢印で示す異なるプロセス段階の間に溶液中で測定した酸素飽和度を示す。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＨＰ−ＳＥＣ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび二次ダイアフィルトレーション工程。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルをＨＰ−ＳＥＣにより分析した。サンプル１（Ｓ０００１）：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体、サンプル２：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；サンプル３〜９：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間５分、１０分、１５分、３０分、６０分、２時間および３時間）；サンプル１０〜１５：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（１０分、２０分、３０分、４０分、５０分および６０分後のサンプル）；サンプル１６〜１８：ダイアフィルトレーションから１時間、２時間および２５時間後の抗ＣＤ３８抗体；サンプル１９：２回目のダイアフィルトレーションから１時間後の抗ＣＤ３８抗体。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび二次ダイアフィルトレーション工程。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；レーン２：ＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；レーン３〜９：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間５分、１０分、１５分、３０分、６０分、２時間および３時間）；レーン１０〜１５：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（１０分、２０分、３０分、４０分、５０分および６０分後のサンプル）；レーン１６〜１８：ダイアフィルトレーションから１時間、２時間および２５時間後の抗ＣＤ３８抗体；レーン１９：２回目のダイアフィルトレーションから１時間後の抗ＣＤ３８抗体。ＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位および酸素飽和度−高速ダイアフィルトレーションおよび低い２−ＭＥＡ濃度。還元および酸化段階の間の酸化還元電位および酸素飽和度を、酸化還元プローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを用いて追跡した。左のｙ軸および実線は、酸化還元電位を示し；右のｙ軸および破線は、矢印で示す異なるプロセス段階の間に溶液中で測定した酸素飽和度を示す。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＨＰ−ＳＥＣ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび低い２−ＭＥＡ濃度。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルをＨＰ−ＳＥＣにより分析した。サンプル１（Ｓ０００１）：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；サンプル２：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；サンプル３〜６：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：２０分、６０分、３時間および４時間）；サンプル７〜１０：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（１０分、２０分、４０分および６０分後のサンプル）；サンプル１１〜１４：ダイアフィルトレーション停止から１時間、２時間、３時間および２４時間後の抗ＣＤ３８抗体。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび低い２−ＭＥＡ濃度。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；レーン２：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；レーン３〜６：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：２０分、６０分、３時間および４時間）；レーン７〜１０：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（１０分、２０分、４０分および６０分後のサンプル）；レーン１１〜１４：ダイアフィルトレーション終了から１時間、２時間、３時間および２４時間後の抗ＣＤ３８抗体。ＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位および酸素飽和度−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階の間のＥＤＴＡの存在。（Ａ）還元および酸化段階の間の酸化還元電位および酸素飽和度を、酸化還元プローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを用いて追跡した。左のｙ軸および実線は、酸化還元電位を示し；右のｙ軸および破線は、矢印で示す異なるプロセス段階の間に溶液中で測定した酸素飽和度を示す。（Ｂ）ＥＤＴＡの有無によるＤＯ減少の比較（実施例４６［ＥＤＴＡ不在］および実施例４７［ＥＤＴＡ存在］から採取）。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階の間のＥＤＴＡの存在。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；レーン２：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；レーン３〜７：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：１０分、１時間、２時間、３時間および４時間）；レーン８〜１１：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（ダイアフィルトレーション開始から１０分、３０分、４０分および６０分の時点におけるサンプル）；レーン１２〜１４：ダイアフィルトレーション停止から１時間、２４時間および６日後の抗ＣＤ３８抗体。ＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位および酸素飽和度−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後のＮ２の存在。還元および酸化段階の間の酸化還元電位および酸素飽和度を、酸化還元プローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを用いて追跡した。左のｙ軸および実線は、酸化還元電位を示し；右のｙ軸および破線は、矢印で示す異なるプロセス段階の間に溶液中で測定した酸素飽和度を示す。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後のＮ_２の存在。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；レーン２：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；レーン３〜７：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：１０分、１時間、２時間、３時間および４時間）；レーン８〜１０：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（ダイアフィルトレーション開始から１０分、３０分および６０分後の時点におけるサンプル）；レーン１１：ダイアフィルトレーション停止から２４時間後の抗ＣＤ３８抗体；レーン１２および１３：窒素によるエアレーションを停止し、酸素によるエアレーションを開始した１時間および２４時間後の抗ＣＤ３８抗体。ＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位および酸素飽和度−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後のＥＤＴＡの存在。還元および酸化段階の間の酸化還元電位および酸素飽和度を、酸化還元プローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを用いて追跡した。左のｙ軸および実線は、酸化還元電位を示し；右のｙ軸および破線は、矢印で示す異なるプロセス段階の間に溶液中で測定した酸素飽和度を示す。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後のＥＤＴＡの存在。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；レーン２：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；レーン３〜６：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：１０分、２時間、３時間および４時間）；レーン７〜９：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（ダイアフィルトレーション開始から１０分、３０分および６０分後の時点におけるサンプル）；レーン１０：ダイアフィルトレーション停止から２４時間後の抗ＣＤ３８抗体；レーン１１：硫酸銅の添加から３０分後の抗ＣＤ３８抗体。ＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位および酸素飽和度−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後の硫酸銅の存在。還元および酸化段階の間の酸化還元電位および酸素飽和度を、酸化還元プローブおよび溶存酸素（ＤＯ）プローブを用いて追跡した。左のｙ軸および実線は、酸化還元電位を示し；右のｙ軸および破線は、矢印で示す異なるプロセス段階の間に溶液中で測定した酸素飽和度を示す。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析−高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後の硫酸銅の存在。抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。レーン１：製剤バッファー中の抗ＣＤ３８抗体；レーン２：製剤バッファーからＰＢＳへのバッファー交換後の抗ＣＤ３８抗体；レーン３〜７：還元段階の間の抗ＣＤ３８抗体（インキュベーション時間：１０分、１時間、２時間、３時間および４時間）；レーン８および９：ダイアフィルトレーションプロセスの間の抗ＣＤ３８抗体（ダイアフィルトレーション開始から１０分および６０分後の時点におけるサンプル）；レーン１０：ダイアフィルトレーション停止から２４時間後の抗ＣＤ３８抗体；レーンＭ：ＭＷマーカー。再酸化プロセスの間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＥＤＴＡまたはＣｕ^２＋を含有するＰＢＳ中での異なるインキュベーション時間後にサンプルを採取し、非還元条件（Ａ、Ｃ）および還元条件（Ｂ、Ｄ）下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。レーン１：ＩｇＧ１、内部アッセイ対照、レーン２：０時間のサンプル、レーン３：１時間のサンプル、レーン４：２時間のサンプル、レーン５：３時間のサンプル、レーン６：４時間のサンプル、レーン７：２４時間のサンプル、レーン８：ＭＷマーカー。Ｃｕ^２＋の存在下での異なるインキュベーション時間後の重鎖−軽鎖組合せの相対量。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから各分子種をデンシトメトリーにより定量した。スキャンした全バンドの合計強度を１００％とした。反応器流路、材料およびプロセスの案。流路を、０．２ＮＮａＯＨを用いて消毒し、ＷＦＩで洗い流した。交換反応当日の朝、適当な量のＰＢＳをバッファーバッグからシステムに加えた。ホモ二量体を、重力送りにより加え、７ＬＰＭでシステムに循環させて内容物を混合した。２−ＭＥＡ保存溶液の重力添加により反応を開始させた。透過物バルブを閉じ、還元プロセスのために、供給ポンプを３０ＲＰＭ（７ＬＰＭ）に設定した。５時間後に、透過物バルブを開け、ダイアフィルトレーションのために、ポンプ速度を上げて目標供給圧７０ｋＰａを達成した。１ｇ／Ｌ条件では、供給ポンプを１６５ＲＰＭ（３１ＬＰＭ）に設定した。２０ｇ／Ｌ条件では、供給ポンプを１４０ＲＰＭ（２６ＬＰＭ）に設定した。ＰＢＳ入路を開き、ダイアフィルトレーションポンプ速度を制御して反応器バッグ内で一定重量を維持した。この手順により、１ｇ／Ｌ条件ではダイアフィルトレーション速度２５０Ｌ／時間を、２０ｇ／Ｌ条件では１２５Ｌ／時間を得た。一度、５００Ｌ廃棄物バッグ内に目標ダイアフィルトレーション容量が回収されたら、透過物バルブを閉じ、ダイアフィルトレーションポンプを停止させた。酸化時間中に供給ポンプを３０ＲＰＭ（７ＬＰＭ）循環に戻した。一晩インキュベーション後に、２回目のダイアフィルトレーションを行った（１ｇ／Ｌ条件では３ダイアフィルトレーション容量(diavolumes)および２０ｇ／Ｌ条件では４ダイアフィルトレーション容量(diavolumes)）。総てのプロセスを周囲温度（２２〜２５℃）で実施した。サンプルはバッグから直接またはバルブ１から取り出した（図１）。材料の案１）１／２ゼロスタティックＴ字型継手(zero-static tee)ダイヤフラムバルブ、ＳＥＤ、３１６ＬＳＳ。２）５０Ｌバッグ、ＳａｒｔｏｒｕｉｓＳｔｅｄｉｍ社製、ＦＦＢ２０７００４型、５０Ｌウエーブミキサー、ＥＨＴｒｅｖＡ型、上に載せる。３）ツインビームスケール(Twin beam scale)、Ｉｎｔｅｒｃｏｍｐ社製、ＴＢ８３０型。４）内径１／２インチのチューブ、白金硬化シリコーン、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ９６４１０−８２。５）内径３／８インチのチューブ、白金硬化シリコーン、Ｔｙｇｏｎ３３５０。６）チューブピンチクランプ。７）内径１インチの高圧ホース、強化型白金硬化シリコーン、３１６ＬＳＳＴＣ端、Page International社製、ＳＷＰＶ型。８）０〜３０ｐｓｉｇの圧力計、Ａｎｄｅｒｓｏｎ社製、ＥＭ０６６０１００４１０２５Ａ型。９）１インチゲージＴ字型継手、３１６ＬＳＳ。１０）１／２フィートゲージＴ字型継手、３１６ＬＳＳ。１１）１／２インチ×１インチＴＣ径違い継手、３１６ＬＳＳ。１２）蠕動式供給ポンプ、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｗ社製、７２０ＤＵＮ／ＲＥ型、Ｓｔａｐｕｒｅチューブ要素、９６０．０２５４．ＰＦＴ型、０〜３３ＬＰＭ。１３）溶存酸素センサーおよびトランスミッター、Ｍｅｔｔｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ社製、４１００ｅ型およびＩｎｐｒｏ６８００／１２／１２０型（センサー）。１４）酸化還元センサーおよびトランスミッター、ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ社製、２１００ｅ型および３２５０ＳＧ型（センサー）。１５）１インチＷｅｄｇｅｗｏｏｄ社製フローセル、３１６ＬＳＳ。１６）１／２インチＴ字型継手、Ｋｙｎａｒ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ社製ＥＷ−３０７０３−７８型。１７）１／２インチダイヤフラムバルブ、ＳＥＤ、３１６ＬＳＳ。１８）Ｐａｌｌ社製ディスポーザブルポリプロピレンインサートを備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製ＵＦメンブレンホルダー、およびPall社製Ｏｍｅｇａ３０ｋＤＰＥＳメンブレン、ＯＳ０３０Ｆ２６型。１９）Ｍ型ＫｌｅｅｎｐａｋＨＴコネクター、Ｐａｌｌ社製、ＫＰＣＨＴ０２Ｍ６型。２０）Ｆ型ＫｌｅｅｎｐａｋＨＴコネクター、Ｐａｌｌ社製、ＫＰＣＨＴ０２Ｆ６型。２１）蠕動式ダイアフィルトレーションポンプ、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｗ社製、６２０Ｄｉ／Ｒ型、Ｓｔａｐｕｒｅチューブ要素、９６０．０１７０．ＰＦＴ型、０〜９ＬＰＭ。２２）０．２ミクロンフィルター、Ｐａｌｌ社製、ＫＡ３ＮＦＰ１型。２３）５００Ｌバッグ、ＳａｒｔｏｒｕｉｓＳｔｅｄｉｍ社製、ＦＸＢ２１１９０５型。２４）２００Ｌバッグ、ＳａｒｔｏｒｕｉｓＳｔｅｄｉｍ社製、ＰＤＬ２００ＬＷＳ型。２５）２０Ｌバッグ、ＳａｒｔｏｒｕｉｓＳｔｅｄｉｍ社製、ＦＦＢ２０８７２１型。２６）５Ｌバッグ、ＳａｒｔｏｒｕｉｓＳｔｅｄｉｍ社製、型ＦＦＢ２０８７２３型。^＊ＴＣガスケットは全て、白金硬化シリコーンであった。^＊５／２０／５０ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍ社製バッグは全て、ＥＶＡ（エチレン酢酸ビニル）生成物接触層およびＥＶＯＨ（エチレンビニルアルコール）ガス障壁層を有する多層フィルムを使用する。^＊２００／５００ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍ社製バッグは全て、ＵＬＤＰＥ（超低密度ポリエチレン）産物接触層およびＥＶＯＨガス障壁層を有する多層フィルムを使用する。３つの異なる条件での初期産物および最終産物のＣＩＥＸプロフィール。初期産物および最終産物の還元型（左）および非還元型（右）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：ＩｇＧ１−ｂ１２アッセイ対照。レーン２：初期のＩｇＧ１−Ｆ４０５Ｌ−２Ｆ８。レーン３：初期のＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒ−７Ｄ８。レーン４：１ｇ／Ｌにおける最終の２５Ｌの泳動。レーン５：２０ｇ／Ｌにおける最終の２５Ｌの泳動。還元および再酸化の間の溶存酸素および酸化還元電位。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間の酸素飽和度および酸化還元電位を、酸化還元プローブおよびＤＯプローブを用いて追跡した。水平の破線は、ＤＯおよび酸化還元電位の両方の初期値を示す。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるＤＯおよび酸化還元電位の大幅な減少と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間のｐＨプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間のｐＨをｐＨプローブにより測定した。水平の破線は、初期のｐＨ値を示す。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるｐＨの大幅な減少と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元段階の間の酸素消費速度（ＯＣＲ［ｍＭ／時間］）、総Ｏ_２消費量（ｍＭ）およびＤＯ（％）。酸素消費速度および総Ｏ_２消費量を算出し、ＤＯを評価した。垂直の点線は、還元の開始および終了を表す。還元および再酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。Ｍ：ＭＷマーカー；Ｃ：ＩｇＧ１対照；レーン１：２−ＭＥＡ添加前；レーン２、３、４および５：還元から３０分、１時間、２時間および３時間後、レーン６、７、８、９および１０：ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌおよび７Ｌとなった後のダイアフィルトレーション結果、レーン１１および１２：ダイアフィルトレーション後の１時間および一晩のインキュベーション。分子量マーカーの質量は左側に示す。還元／再酸化されたＩｇＧ種は、Ｈ（重鎖）および／またはＬ（軽鎖）ならびにそれらの組合せにより示される。還元および再酸化の間のＣＩＥＸプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に表示した時点においてサンプルを、採取し、急速凍結し、分析的ＣＩＥＸにより分析した。一晩インキュベーション後の最終サンプルのＨＰ−ＳＥＣ分析。ダイアフィルトレーション後の一晩インキュベーション後に採取したサンプルをＨＰ−ＳＥＣにより分析した。７．５９９および１０．７９２にあるピークはそれぞれ、二量体および単量体のＩｇＧを表す。還元および再酸化の間の溶存酸素および酸化還元電位。２ｍＭＥＤＴＡの存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間の酸素飽和度および酸化還元電位を、酸化還元プローブおよびＤＯプローブを用いて追跡した。水平の破線は、酸化還元電位およびＤＯの両方の初期値を示す。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるＤＯおよび酸化還元電位の大幅な減少と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。泳動の後半（ｔ＝２４時間）における酸化還元電位の増加およびＤＯの減少は、ＣｕＳＯ_４の添加と一致する。還元および再酸化の間のｐＨプロフィール。２ｍＭＥＤＴＡの存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間のｐＨを、ｐＨプローブを用いて追跡した。水平の破線は、初期のｐＨ値を示す。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるｐＨの大幅な減少と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。２ｍＭＥＤＴＡの存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。Ｍ：ＭＷマーカー；Ｃ：ＩｇＧ１対照；レーン１：２−ＭＥＡ添加前；レーン２、３、４および５：還元から３０分、１時間、２時間および３時間後、レーン６、７、８、９および１０：ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌおよび７Ｌとなった後のダイアフィルトレーション結果、レーン１１および１２：ダイアフィルトレーション後の１時間および一晩のインキュベーション、レーン１３：ＣｕＳＯ_４の添加から１０分後。分子量マーカーの質量は左側に示す。還元／再酸化されたＩｇＧ種は、Ｈ（重鎖）および／またはＬ（軽鎖）ならびにそれらの組合せにより示される。還元および再酸化の間のＣＩＥＸプロフィール。２ｍＭＥＤＴＡの存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを分析的ＣＩＥＸにより分析した。表示した時点においてサンプルを採取し、ＣＩＥＸ分析まで急速凍結した。還元および再酸化の間の溶存酸素および酸化還元電位。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間の酸素飽和度および酸化還元電位を、酸化還元プローブおよびＤＯプローブを用いて追跡した。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるＤＯおよび酸化還元電位の大幅な減少と一致した。水平の破線は、酸化還元電位およびＤＯの両方の初期値を示す。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間の振盪速度。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始付近での振盪速度の大幅な増加と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間のｐＨプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間のｐＨをｐＨプローブにより測定した。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるｐＨの大幅な減少と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。Ｍ：ＭＷマーカー；Ｃ：ＩｇＧ１対照；レーン１：２−ＭＥＡ添加前；レーン２、３、４および５：還元から３０分、１時間、２時間および３時間後、レーン６、７、８、９および１０：ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌおよび７Ｌとなった後のダイアフィルトレーション結果、レーン１１および１２：ダイアフィルトレーション後の１時間および一晩のインキュベーション。分子量マーカーの質量は左側に示す。還元／再酸化されたＩｇＧ種は、Ｈ（重鎖）および／またはＬ（軽鎖）ならびにそれらの組合せにより示される。還元および再酸化の間のＣＩＥＸプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを分析的ＣＩＥＸにより分析した。表示した時点においてサンプルを採取し、ＣＩＥＸ分析まで急速凍結した。還元および再酸化の間の溶存酸素および酸化還元電位。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間の酸素飽和度および酸化還元電位を、酸化還元プローブおよびＤＯプローブを用いて追跡した。水平の破線は、酸化還元電位およびＤＯの両方の初期値を示す。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるＤＯおよび酸化還元電位の大幅な減少と一致した。水平の破線は、酸化還元電位およびＤＯの両方の初期値を示す。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間の振盪速度。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始付近での振盪速度の大幅な増加と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間のｐＨプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間のｐＨをｐＨプローブにより測定した。水平の破線は、初期値を示す。２−ＭＥＡの添加（矢印で示す）は、泳動開始時におけるｐＨの大幅な減少と一致した。水平の破線は、初期のｐＨ値を示す。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８-Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。Ｍ：ＭＷマーカー；Ｃ：ＩｇＧ１対照；レーン１：２−ＭＥＡ添加前；レーン２、３、４および５：還元から３０分、１時間、２時間および３時間後、レーン６、７、８、９および１０：ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌおよび７Ｌとなった後のダイアフィルトレーション結果、レーン１１および１２：ダイアフィルトレーション後の１時間および一晩のインキュベーション。分子量マーカーの質量は左側に示す。還元／再酸化されたＩｇＧ種は、Ｈ（重鎖）および／またはＬ（軽鎖）ならびにそれらの組合せにより示される。還元および再酸化の間のＣＩＥＸプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを分析的ＣＩＥＸにより分析した。表示した時点においてサンプルを採取し、ＣＩＥＸ分析まで急速凍結した。還元および再酸化の間の溶存酸素および酸化還元電位。窒素の存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間の酸素飽和度および酸化還元電位を、酸化還元プローブおよびＤＯプローブを用いて追跡した。０時間における２−ＭＥＡの添加は、泳動開始時における酸化還元電位の大幅な減少と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始、ダイアフィルトレーションの終了、ダイアフィルトレーション後１時間のサンプリングポイント、およびダイアフィルトレーション後３時間のサンプリングポイントを示す。ダイアフィルトレーション終了時にヘッドスペースを空気でフラッシングした。還元および再酸化の間のｐＨプロフィール。窒素の存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および酸化の間のｐＨをｐＨプローブにより測定した。水平の破線は、初期のｐＨ値を示す。０時間における２−ＭＥＡの添加は、泳動開始時におけるｐＨの大幅な減少と一致した。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。還元および再酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析。窒素の存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。Ｍ：ＭＷマーカー；Ｃ：ＩｇＧ１対照；レーン１：２−ＭＥＡ添加前；レーン２、３、４および５：還元から３０分、１時間、２時間および３時間後、レーン６、７、８、９および１０：ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌおよび７Ｌとなった後のダイアフィルトレーション結果、レーン１１および１２：ダイアフィルトレーションから１時間および３時間後、レーン１３：ダイアフィルトレーション後の一晩インキュベーション。分子量マーカーの質量は左側に示す。還元／再酸化ＩｇＧ種は、Ｈ（重鎖）および／またはＬ（軽鎖）ならびにそれらの組合せにより示される。還元および再酸化の間のＣＩＥＸプロフィール。窒素の存在下でのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを分析的ＣＩＥＸにより分析した。表示した時点においてサンプルを採取し、ＣＩＥＸ分析まで急速凍結した。空気の導入後の酸素消費量。グラフは、空気の添加をしたときの、ダイアフィルトレーション直後からの値を示す。実際のＤＯはシステム中で測定されたＤＯである。ＤＯ（消費なし）は算出値であり、酸素消費のない場合を企図している。Ｏ_２消費量は、予め決定されたｋｌａを用いた算出酸素消費量であり、システム中の酸素の飽和は０．２ｍＭであると推測される。還元および再酸化の間の溶存酸素および酸化還元電位。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間の酸素飽和度および酸化還元電位を、酸化還元プローブおよびＤＯプローブを用いて追跡した。水平の破線は、酸化還元電位およびＤＯの初期値を示す。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。２−ＭＥＡの添加は、泳動開始時におけるＤＯおよび酸化還元電位の大幅な減少と一致した。ダイアフィルトレーションの直前にｐＨを５．０に調整した。一晩インキュベーション後にｐＨを調整し、７．４に戻した。還元および再酸化の間のｐＨプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間のｐＨをｐＨプローブにより測定した。水平の破線は、初期値を示す。垂直の破線は、ダイアフィルトレーションの開始および停止を示す。２−ＭＥＡの添加は、泳動開始時におけるｐＨの減少と一致した。ｐＨ５．０のバッファーに備えて、ダイアフィルトレーションの直前にｐＨを５．０に調整した。一晩インキュベーション後にｐＨを７．４に再調整した。還元および再酸化の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。Ｍ：ＭＷマーカー；Ｃ：ＩｇＧ１対照；レーン１：２−ＭＥＡ添加前；レーン２、３、４および５：還元から３０分、１時間、２時間および３時間後、レーン６、７、８、９および１０：ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌおよび７Ｌとなった後のダイアフィルトレーション結果、レーン１１および１２：ダイアフィルトレーション後の１時間および一晩のインキュベーション、レーン１３、１４および１５：Ｔｒｉｓ添加直後、Ｔｒｉｓ添加から１時間および２時間。分子量マーカーの質量は左側に示す。還元／再酸化されたＩｇＧ種は、Ｈ（重鎖）および／またはＬ（軽鎖）ならびにそれらの組合せにより示される。還元および再酸化の間のＣＩＥＸプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１：１混合物）の還元および再酸化の間に採取したサンプルを分析的ＣＩＥＸにより分析した。表示した時点においてサンプルを採取し、ＣＩＥＸ分析まで急速凍結した。シスタミン添加後の溶存酸素および酸化還元電位。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ１：１混合物へのシスタミンの添加後の酸素飽和度および酸化還元電位を、酸化還元プローブおよびＤＯプローブを用いて追跡した。シスタミンの添加後のＣＩＥＸプロフィール。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒへのシスタミンの添加後に採取したサンプルを分析的ＣＩＥＸにより分析した。示した時点にサンプルを採取した。１０ｍＭシステインを用いた還元のＣＩＥＸプロフィール。サンプルを、５５分おきにカラムにロードし、分析的ＣＩＥＸにより分析した。選択したプロフィールを示し、インキュベーション時間を示す。２５ｍＭシステインでの還元のＣＩＥＸプロフィール。サンプルを、５５分おきにカラムにロードし、分析的ＣＩＥＸにより分析した。選択したプロフィールを示し、インキュベーション時間を示す。５０ｍＭシステインでの還元のＣＩＥＸプロフィール。サンプルを、５５分おきにカラムにロードし、分析的ＣＩＥＸにより分析した。選択したプロフィールを示し、インキュベーション時間を示す。７５ｍＭシステインでの還元のＣＩＥＸプロフィール。サンプルを、５５分おきにカラムにロードし、分析的ＣＩＥＸにより分析した。選択したプロフィールを示し、インキュベーション時間を示す。１００ｍＭシステインでの還元のＣＩＥＸプロフィール。サンプルを、５５分おきにカラムにロードし、分析的ＣＩＥＸにより分析した。選択したプロフィールを示し、インキュベーション時間を示す。システインを用いた還元、システインの除去、およびインキュベーションの後のＣＩＥＸプロフィール。５０ｍＭシステインにおける３０℃で３８５分間の還元、続いて、脱塩カラムを用いたシステインの除去、その後に、２時間および１８時間のインキュベーションを行った後のＣＩＥＸプロフィールを示す。固定化還元体カラムからの溶出後の残存ホモ二量体および新たに形成された二重特異性抗体のＣＩＥＸプロフィール。ホモ二量体であるＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの混合物を、固定化還元体カラムに入れ、インキュベートし、溶出した。二重特異性抗体の形成を分析的ＣＩＥＸにより分析した。二重特異性抗体の検出のためのアロタイプのＥＬＩＳＡ。ＩｇＧ１ｍ（ｆ）−Ｋ４０９Ｒ−ＣＤ２０およびＩｇＧ１ｍ（ｚａ）−Ｆ４０５Ｌ−ＥＧＦＲの混合物を２５ｍＭ２−ＭＥＡとともに３７℃で９０分間インキュベートした。二重特異性抗体の形成をサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて測定した。二重特異性ＩｇＧ１ｍ（ｆ，ｚａ）−ＣＤ２０×ＥＧＦＲ抗体の形成についての指標として、４０５ｎｍにおける光学濃度をＹ軸にプロットした。ＩｇＧ１ｍ（ｆａ）抗体を陽性対照として含めた。ＳＮＥＥＰ後のＣＩＥＸ分析。ＳＮＥＥＰ後にＣＩＥＸ分析を行い、このＳＮＥＥＰでは、ＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒを過剰に加えた。定量化は、交換反応後に１１．４％のＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒ（^＊）、８８．５％の二重特異性抗体およびわずか０．１％のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（＋）ホモ二量体が存在することを示した。ＳＮＥＥＰ後のＣＩＥＸ分析。ＳＮＥＥＰ後にＣＩＥＸ分析を行い、このＳＮＥＥＰでは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｒを過剰に用いた。定量化は、交換反応後に０．４％のＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（^＊）、８８．４％の二重特異性抗体および１１．２％のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（＋）が存在することを示した。ＳＮＥＥＰ後のＣＩＥＸ分析。ＳＮＥＥＰ後にＣＩＥＸ分析を行い、このＳＮＥＥＰでは、過剰のＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒを用いた。定量化は、交換反応後に２５．５％のＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒ（^＊）、７３．３％の二重特異性抗体および１．２％のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（＋）が存在することを示した。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体のパーセンテージは最適な交換条件下ではさらに減少することを注記しておく（図１０５）。プロテインＡ中高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）プロフィール。５０％過剰のＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒホモ二量体を用いた交換後に作出された二重特異性抗体のプロテインＡＦＰＬＣプロフィール。左軸にはＡ_２８０シグナルをｍＡＵで示し（黒色出力）、右軸にはｐＨを示す（灰色出力）。２つの印の付いたピークの間にある山形に折れた部分は分画開始時における気泡を表す。フロースルー画分のＣＩＥＸ分析（図１０８において^＊で示すピーク。二重特異性抗体（保持時間約１６．４分）もＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（保持時間約１９．２分）も検出されなかった；１３．６分にあるピークは（非結合）ＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒホモ二量体に相当する。溶出した産物（図１０８において＋で示すピーク）のＣＩＥＸ分析。１６．４分にあるピークは二重特異性抗体に相当し、１３．６分ではピークは検出されず（ＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒ）、１９．２分に小さなピークが検出された（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ）（１．４％）。これは、残存したホモ二量体を除去するために、ＳＮＥＥＰをプロテインＡポリッシングと組み合わせて用いることができることを示した。一緒にプロテインＡ精製したＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９ＲのＦＰＬＣクロマトグラム。出力はＡ２８０シグナルを示す。ローディングは、約５ｍＬの後にＡ２８０シグナルの増加として観察される。洗浄工程および溶出工程の開始を矢印で示す。１００ｍＬにある溶出後ピークは最初の低ｐＨ再生工程の間に観察された。このピークは、分析しなかったが、少量のタンパク質不純物を示す。一緒にプロテインＡ精製したＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒ（^＊）およびＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌ（＋）のＣＩＥＸプロフィール。一緒にプロテインＡ精製したＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒから作出された二重特異性抗体のＨＰ−ＳＥＣプロフィール。７．５分にあるピーク（^＊）は二量体種に相当し、９．０分にあるピークは単量体種（＋）に相当する。一緒にプロテインＡ精製したＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒから作出された二重特異性抗体のＣＩＥＸプロフィール。２６分にあるピーク（^＊）は二重特異性抗体に相当し；３６分にあるピークはＩｇＧ−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌホモ二量体（＋）に相当する。ＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒは検出されなかった。二重特異性抗体およびホモ二量体の１：１：１混合物のＦＰＬＣプロフィール。ほぼ定組成の条件下でＷＣＩＥＸカラムにおいて分離された、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（^＊）、二重特異性抗体（＋）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（＃）の１：１：１混合物のＦＰＬＣプロフィール（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌの溶出だけ緩やかな勾配によりやや加速させた）。算出分離度。クエン酸バッファーおよびリン酸バッファーについての算出分離度（Ｒ、式５を用いて算出）を示す。２０ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．４について最適な分離度を見出した。分離度１．７５〜２．００が、十分な分離を得るために許容されると考えられた(John W. Dolan, Peak Tailing and Resolution, LC Resources Inc., Walnut Creek, California, USA)。ＦＰＬＣプロフィール。ｐＨ６．４、２０ｍＭクエン酸塩において１０％のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体（＋）を加えたＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（^＊）二重特異性抗体のＦＰＬＣプロフィール。ローディングは４．４ｍｇ／ｍＬ樹脂であった。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ二重特異性抗体のＣＩＥＸプロフィール。図１１７においてアスタリスク（^＊）により示されるＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲのＣＩＥＸプロフィールを示す。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒホモ二量体（^＊）、二重特異性抗体およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体（＋）のパーセンテージは４．３、９４．８、および０．９であった。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒホモ二量体は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌを加えた元のバッチの残存したホモ二量体であった。ＦＰＬＣクロマトグラム。Ａ）２０ｍｇ二重特異性抗体の７５ｍＭ２−ＭＥＡ含有ＰＢＳ溶液（総容量３ｍＬ）のプロテインＡ溶出プロフィール。実線はＡ_２５４シグナル（左軸）であり、破線はＡ_２８０（左軸）シグナルであり、長破点線はｐＨである（値は示しておらず、ｐＨは、約６５ｍＬ時点で７．４から３．０まで減少させ、基準のみ示す）。Ｂ）プロテインＡにロードした７５ｍＭ２−ＭＥＡ含有ＰＢＳ（総容量３ｍＬ）。実線はＡ_２５４シグナル（左軸）であり、破線はＡ_２８０（左軸）シグナルであり、長破点線はｐＨである（値は示しておらず、ｐＨは、約４０ｍＬ時点で７．４から３．０まで減少させ、基準のみ示す）。（図１１９−１の続き）漏出点判定。Ａ）漏出点（図に矢印で示す）を、プロテインＡカラムの２−ＭＥＡへの曝露の前（左のパネル）および後（右のパネル）に判定した。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（５ｍｇ／ｍＬ）を、滞留時間１分を用いてロードした。７５ｍＭ２−ＭＥＡへの曝露の前でも後でも、漏出点は約１５ｍＬであり、カラム性能は２−ＭＥＡの存在によって強い影響を受けないことを示す。示したデータはＡ２８０値（ｍＡＵ）である。Ｂ）両方の出力を重ね合わせた場合のＡ）のズーム。（図１２０−１の続き）２−ＭＥＡ除去後の溶出タンパク質の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーンは、カラムローディング前の２−ＭＥＡの存在下でのマーカー、対照抗体（ＩｇＧ１−ｂ１２）、二重特異性反応混合物、および２−ＭＥＡ除去後の最終産物を含む。プロテインＡは検出されず、カラムは元の状態のままであることを示す。重鎖および軽鎖を矢印で示し、プロテインＡの推定分子量（４５ｋＤａ）をアスタリスク（^＊）で示す。二重特異性λ−κ抗体のＣＩＥＸプロフィール。λ軽鎖を含有するＢＭＡ０３１−Ｋ４０９Ｒ抗体の推定位置をプラス記号（＋）により示し、ピークは検出されなかった。κ軽鎖を含むＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ抗体をアスタリスク（^＊）で示す。二重特異性抗体は中間にある。ＢＭＡ０３１−Ｋ４０９Ｒ、二重特異性抗体およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌのパーセンテージはそれぞれ、１１．２、８８．８および０であった。異なる期間および異なる温度での保存後の二重特異性抗体（黒色）、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（灰色）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（白色）のＡ２８０データ。Ａ２８０測定はＮａｎｏｄｒｏｐにて行い、結果は、１ｍｍ路長においてＡ２８０（ＡＵ）として示す。２〜８℃でおよび２５℃でｔ＝０およびｔ＝１２ヶ月における二重特異性抗体（Ｄ）、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（２）の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｃ＝内部ＩｇＧ１アッセイ対照。２〜８℃でおよび２５℃でｔ＝０およびｔ＝１２ヶ月における二重特異性抗体（Ｄ）、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（２）の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｃ＝内部ＩｇＧ１アッセイ対照。４０℃でｔ＝０およびｔ＝３ヶ月における二重特異性（Ｄ）、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（２）の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｃ＝内部ＩｇＧ１アッセイ対照。４０℃でｔ＝０およびｔ＝３ヶ月における二重特異性抗体（Ｄ）、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（２）の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｃ＝内部ＩｇＧ１アッセイ対照。二重特異性抗体（実線）、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（破線）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（点線）のＨＰ−ＳＥＣクロマトグラム。保存条件はＡ：ｔ＝０；Ｂ：２〜８℃でｔ＝１２ヶ月；Ｃ：２５℃でｔ＝１２ヶ月およびＤ：４０℃でｔ＝３ヶ月あった。二重特異性抗体（実線）、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（破線）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（点線）のＣＩＥＸクロマトグラム。保存条件はＡ：ｔ＝０；Ｂ：２〜８℃でｔ＝１２ヶ月；Ｃ：２５℃でｔ＝１２ヶ月である。（留意点：ｔ＝０時点とｔ＝１２ヶ月時点での材料の保持時間の差はバッファー組成の小さな変化および／または異なるカラムロットの使用が原因である可能性がある。各泳動における内部ＩｇＧ１対照の分析もｔ＝１２ヶ月において、ｔ＝０に対して＋１．６４分のシフトを示した、データは示していない）。

発明の詳細な説明
定義
「免疫グロブリン」という用語は、２対のポリペプチド鎖、すなわち、１対の低分子量軽（Ｌ）鎖および１対の重（Ｈ）鎖からなる、構造的に関連した糖タンパク質のクラスを意味し、４つは全てジスルフィド結合によって相互に連結されている。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))参照。簡単に述べると、各重鎖は、一般に、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、一般に、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」においてジスルフィド結合を介して相互に連結される。各軽鎖は、一般に、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、一般に、１つのドメイン、ＣＬからなる。一般には、定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)に記載されているように、ＥＵインデックスに従って行われる。図１６は、抗体２Ｆ８の異なるアイソタイプ型についてのＥＵおよびＫａｂａｔナンバリングの概略を示す（国際公開第０２／１００３４８号）。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存性の高い領域が点在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される超可変性の領域（すなわち、構造的に定義されたループの配列および／または形態において超可変性であり得る超可変領域）にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、一般に、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)も参照）。

本明細書において用いられる場合、「Ｆａｂアーム」という用語は、抗体の１つの重鎖−軽鎖対を意味する。

本明細書において用いられる場合、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」という用語は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む抗体領域を意味する（例えば、Kabat EA, in US Department of Health and Human Services, NIH publi陽イオン n° 91-3242, Edn. 5^th edition 662, 680, 689 (1991)参照。Ｆｃ領域はパパインでの抗体の消化により生成することができ、この場合、Ｆｃ領域は、それによって得られるフラグメントであり、免疫グロブリンの２つのＣＨ２−ＣＨ３領域と、ヒンジ領域を含む。抗体重鎖の定常ドメインによって、抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥが定義される。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のタンパク質とともに抗体のエフェクター機能を媒介する。

本明細書において用いられる「ＣＨ２領域」または「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリンのＣＨ２領域を意味することを意図する。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、ＥＵナンバリングシステムによるアミノ酸２２８−３４０に相当する。しかしながら、ＣＨ２領域は、本明細書に記載する他の抗体アイソタイプのものであってもよい。

本明細書において用いられる「ＣＨ３領域」または「ＣＨ３ドメイン」という用語は、免疫グロブリンのＣＨ３領域を指すことを目的としている。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、ＥＵナンバリングシステムによるアミノ酸３４１−４４７に相当する。しかしながら、ＣＨ３領域は、本明細書に記載する他の抗体アイソタイプのものであってもよい。

本発明に関して「抗体」（Ａｂ）という用語は、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子のフラグメント、またはそれらのいずれかの誘導体を指し、それらは、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間（ｈ）、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間（ｈ）、約２４時間以上、約４８時間以上、約３日、４日、５日、６日、７日以上などといった相当な期間、または任意の他の適切な、機能的に規定された期間（例えば、抗原との抗体の結合に関連する生理応答を誘導し、促進し、増強し、かつ／または調節するのに十分な時間、ならびに／あるいは抗体がエフェクター活性を動員するのに十分な時間）の半減期を有して、典型的な生理条件下で抗原と特異的に結合する能力を有するものである。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および補体活性化の古典的経路の第１の成分であるＣ１ｑなどの補体系の成分を含む、宿主組織または因子との免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体はまた、二重特異性抗体、ダイアボディーまたは類似の分子であってもよい。「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なるエピトープ、一般には、重複しないエピトープに対する特異性を有する抗体、または２つの異なる抗原結合部位を含む抗体を指す。上記のとおり、本明細書における抗体という用語は、特に断りのない限りまたは文脈上明らかに否定しない限り、抗原と特異的に結合する能力を保有する抗体のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、任意の公知の技術、例えば、酵素的切断、ペプチド合成および組換え発現の技術によって提供することができる。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメント、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントによって果たされ得ることが示されている。また、抗体という用語は、特に断りのない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗体様ポリペプチド、例えば、キメラ抗体およびヒト化抗体も含むことも理解されるはずである。生成された抗体は任意のアイソタイプを有し得る。

本明細書において用いられる場合の「全長抗体」という用語は、そのアイソタイプの抗体において通常見られる全ての重鎖および軽鎖の定常ドメインおよび可変ドメインを含む抗体を意味する。

本明細書において用いられるように、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）を意味する。

本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを目的としている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発によってあるいはｉｎｖｉｖｏ体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含まないことを目的としている。

本明細書において用いられる場合、「重鎖抗体」または「重鎖抗体」という用語は、重鎖だけからなり、通常見られる軽鎖を欠いている抗体を指す。重鎖抗体は、例えば、ラクダ科の動物において天然に存在するものであり、ＶＨドメインしか持たないにもかかわらず抗原と結合することができる。

「エピトープ」という用語は、抗体と特異的に結合することができるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの表面分子集団からなり、通常、特異的な三次元構造特性だけでなく、特異的な電荷特性も有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下では前者との結合は消失するが、後者との結合は消失しないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与しているアミノ酸残基および結合に直接関与していない他のアミノ酸残基、例えば、抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基（すなわち、このアミノ酸残基は抗原結合ペプチドのフットプリント内にある）を含み得る。

本明細書において用いられるように、所定の抗原との抗体の結合に関して「結合」という用語は、一般に、例えば、抗原をリガンドとして、抗体を分析物として用い、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合に、約１０^−６Ｍ以下、例えば、１０^−７Ｍ以下、例えば、約１０^−８Ｍ以下、例えば、約１０^−９Ｍ以下、約１０^−１０Ｍ以下、または約１０^−１１Ｍもしくはさらにそれ未満のＫ_Ｄに相当する親和性を有する結合であり、この場合、抗体は、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合親和性のせいぜい１０分の１、例えば、せいぜい１００分の１、例えば、せいぜい１，０００分の１、例えば、せいぜい１０，０００分の１、例えば、せいぜい１００，０００分の１のＫ_Ｄに相当する親和性で所定の抗原と結合する。親和性の低下量は抗体のＫ_Ｄに依存し、そのため、抗体のＫ_Ｄが非常に低い（すなわち、抗体が高度に特異的である）場合には、非特異的抗原に対する親和性と比べての、所定の抗原に対する親和性の低下量はせいぜい１０，０００分の１であり得る。本明細書において用いられる「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する
本明細書において用いられる場合、「第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用」という用語は、第１のＣＨ３／第２のＣＨ３ヘテロ二量体タンパク質における第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間の相互作用を意味する。

本明細書において用いられる場合、「第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用」という用語は、第１のＣＨ３／第１のＣＨ３ホモ二量体タンパク質における第１のＣＨ３領域と別の第１のＣＨ３領域との間の相互作用、ならびに第２のＣＨ３／第２のＣＨ３ホモ二量体タンパク質における第２のＣＨ３領域および別の第２のＣＨ３領域との間の相互作用を意味する。

本明細書において用いられる「単離された抗体」とは、材料がその本来の環境（例えば、天然に存在するものであれば自然環境または組換え発現させたものであれば宿主細胞）から取り出されていることを示す。抗体は精製された形態であることも有利である。「精製された」という用語は、絶対純度を必要とするものではなく、むしろ、相対的な定義として意図されており、出発材料と比べた場合の、組成物における夾雑物の濃度に対する抗体濃度の増加を示す。

本明細書において用いられる「宿主細胞」という用語は、発現ベクター、例えば、本発明の抗体をコードする発現ベクターが導入された細胞を意味することを意図して。組換え宿主細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ／０細胞およびリンパ球細胞などのトランスフェクトーマが挙げられる。

本明細書において用いられる場合、２つの以上の核酸構築物の「共発現」という用語は、単一の宿主細胞内での２つの構築物の発現を意味する。

本明細書において用いられる「腫瘍細胞タンパク質」という用語は、腫瘍細胞の細胞表面に位置するタンパク質を意味する。

本明細書において用いられるように、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識段階および活性化段階ではなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を意味する。例示的な免疫細胞としては、骨髄起源またはリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む））、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、肥満細胞および好塩基球が挙げられる。一部のエフェクター細胞は特異的なＦｃ受容体を発現し、特異的な免疫機能を奏する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食することができる。

「還元条件」または「還元的環境」という用語は、抗体のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な条件を意味する。

本発明におけるアミノ酸位置についての言及は、文脈上否定しない限り、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)に記載されているように、ＥＵインデックスに従うものである。

「ｒｐｍ」または「ＲＰＭ」という用語は、１分間当たりの回転数を意味し、本発明に関連しては、ｒｐｍまたはＲＰＭとして示す。

本発明の方法
本発明は、
ａ）第１のホモ二量体タンパク質を第２のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質は、第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含み、前記第２のホモ二量体タンパク質は、第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含み、かつ、
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものである、
ｂ）工程ａ）から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程
を含む、ヘテロ二量体タンパク質の作出のためのｉｎｖｉｔｒｏ法に関する。

本発明の工程ａ）はまた、
ｚ）第１のＣＨ３領域を含む第１の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸構築物を提供する工程、
ｙ）第２のＣＨ３領域を含む第２の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸構築物を提供する工程、
ここで、前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質は、４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、前記第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつ／または
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、各ＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例２１に記載のようにアッセイした場合に、０．０１〜１０マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１０マイクロモル濃度の間、より好ましくは、０．０１〜５の間、例えば、０．０５〜５マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、０．０１〜１マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１マイクロモル濃度の間、０．０１〜０．５の間または０．０１〜０．１の間であるものである、
ｚ）前記第１の核酸構築物(nucleic-acid concstructs)および前記第２の核酸構築物を宿主細胞において共発現させる工程
を含んでもよい。

さらなる実施形態では、工程ｚ）は、宿主細胞において軽鎖をコードする１つ以上の核酸構築物(nucleic-acid concstructs)を共発現させることをさらに含む。

本発明の方法は、より大量のヘテロ二量体タンパク質を作出する場合に特に好適である。

従って、特定の実施形態では、工程ｂ）は、
ｂ）工程ａ）から得た組成物の少なくとも１０ｍＬを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくこと
を含んでよい。

一実施形態では、本発明の方法はヘテロ二量体タンパク質を得る工程をさらに含み、例えば、本発明の方法は、工程ｃ）：
ｃ）ヘテロ二量体タンパク質を得る工程
を含んでよい。

さらなる実施形態では、本発明の工程ａ）は、
ｉ）第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含む第１のホモ二量体タンパク質を提供する工程、
ｉｉ）第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含む第２のホモ二量体タンパク質を提供する工程を含み、
ここで、前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ｉｉｉ）前記第１のタンパク質を前記第２のタンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程
を含んでよい。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、一緒にまたは別々に作出および／または精製され得る。例えば、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を宿主細胞における発現により作出する場合には、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を、同じ反応槽、例えば、同じバイオリアクター内で作出することができる。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を同じ反応槽内で作出する場合には、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を同じ宿主細胞において作出することができ、または異なる宿主細胞によっても作出することができる。あるいは、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を２つの異なる反応槽内、例えば、２つの異なるバイオリアクター内で作出してもよい。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を異なる宿主細胞によって作出する場合には、そのような宿主細胞は同じ細胞種由来のものでも異なる細胞種由来のものでもよい。同じ反応槽内での作出は、コストもしくはタイミングの面から有利であり得、または第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質を発現する宿主細胞によって放出される、細胞質型チオレドキシン１およびチオレドキシン２（ＴＸＮ１およびＴＸＮ２）などの酸化還元酵素を利用するために有利であり得る。これらの酵素は、例えば、多数の生存細胞の溶解によって、ある特定の条件下に存在することができ、その結果、酸素濃度が非常に低いとともに還元に必要な酵素および補因子が放出され、それらが第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を触媒し、それによって、バイオリアクター内でのまたは後の回収工程での重鎖交換の発生が容易になる(Kao et al., 2010, Biotechnol. Bioeng 107; 622-632)。よって、さらなる実施形態では、本発明の工程ａ）は、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の作出と同じ反応槽内で行うことができる。さらなる実施形態では、工程ｂ）もまた、工程ａ）と同じ反応槽内で行うことができ、または工程ａ）ならびに第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の作出の両方と同じ反応槽内で行うことができる。この場合、反応物中に既に存在している酸素および二価金属イオンは工程ｂ）の再酸化プロセスを促すこともできる。

第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の作出のためのさらなる条件には、工程ａ）に関連して記載したもののいずれもが含まれる。異なるバッチでの第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の作出は、管理の観点（各ホモ二量体の品質を再現しやすく、かつ／または決定しやすいこと）から有利であり得、または一方のホモ二量体を用いて、それを複数の異なる他のホモ二量体と組み合わせることにより多様な異なる二重特異性抗体を生み出す場合に有利であり得る。

さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、工程ａ）におけるインキュベーションの前に精製され得る。ホモ二量体タンパク質の精製のための方法としては、限定されるものではないが、プロテインＡおよびプロテインＧクロマトグラフィー（その他のアフィニティークロマトグラフィー様式）、例えば、抗原結合または抗イディオタイプ抗体に基づいた、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、疎水性相互作用、κまたはλ選択、チオ親和性、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーならびに他の混合様式樹脂が挙げられる。他の精製方法としては、限定されるものではないが、精製タンパク質を得るための、例えば、塩またはポリエチレングリコールによる沈降が挙げられる。異なる精製方法の組合せも企図される。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を別々に作出する場合には、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を別々に精製することもできる。

代替実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を別々に作出する場合、それらを一緒に、例えば、プロテインＡ精製により、精製することができる。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を合わせての精製は作業効率性および／または経済効率性を与え得る。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を一緒に作出する場合には、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を一緒に、例えば、プロテインＡ精製により、精製することもできる。

工程ａ）の前の第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の精製により、１つ以上の方法工程；例えば、工程ａ）の還元および／もしくは交換プロセスならびに／または工程ｂ）の酸化プロセスの速度または程度に影響を与え得、あるいはさらにまたは代わりにヘテロ二量体タンパク質の品質に影響を与え得る成分を除去することができる。上記のように、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、別々に(seperately)または一緒に作出することができる。よって、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を一緒に作出する場合には、第１および第２のホモ二量体タンパク質を、特に一緒に精製することができる。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を別々に作出する場合には、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質を、別々に(seperately)または一緒に、例えば、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を合わせ、その後、それらを精製することによって、精製することができる。

さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、溶液またはバッファー中に存在し得る。例えば、このバッファーが、工程ａ）において起こる還元および交換プロセスの性能に最適ではない場合には、このバッファーを別の溶液またはバッファーと置き換えることができる。よって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、工程ａ）の前に、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質が含まれている溶液またはバッファーを別の溶液またはバッファーに置き換える工程をさらに含み得る。

さらなる実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は精製され得る。ヘテロ二量体タンパク質の精製のための方法には、限定されるものではないが、本明細書に記載したもののいずれもが含まれ得る。ヘテロ二量体タンパク質の精製に適切な方法としては、限定されるものではないが、プロテインＡおよびプロテインＧクロマトグラフィー（その他のアフィニティークロマトグラフィー様式）、例えば、抗原結合または抗イディオタイプ抗体に基づいた、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、疎水性相互作用、κまたはλ選択、チオ親和性、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーならびに他の混合様式樹脂が挙げられる。他の方法は、精製タンパク質を得るために、クロマトグラフィーよりもむしろ、例えば、塩またはポリエチレングリコールによる沈降を用いる。

従って、本発明の方法は、ヘテロ二量体タンパク質を精製する工程をさらに含み得る。ヘテロ二量体タンパク質を精製することにより、過剰の試薬、例えば、還元剤、および不純物を除去することができる。ヘテロ二量体タンパク質の精製には、残存した第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の除去も含まれ得る。下記のように、工程ａ）において第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかを過剰に用いて、残存した第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の除去を容易にすることができる。

ヘテロ二量体タンパク質を精製する工程は工程ａ）と工程ｂ）の間であってよいが、ほとんどの用途では、一般に、工程ｂ）の後にあり得る。

第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質が改変されている、例えば、第１のＣＨ３領域または第２のＣＨ３領域が、プロテインＡまたはプロテインＧ結合が減少または消失するように改変されている場合には、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、特に、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーによって精製することができる。精製のための他の方法も、例えば、プロテインＡおよび／またはプロテインＧクロマトグラフィーと組み合わせて、用いてよく、そのような他の方法としては、限定されるものではないが、その他のアフィニティークロマトグラフィー様式、例えば、抗原結合または抗イディオタイプ抗体に基づいた、アフィニティークロマトグラフィー、κまたはλ選択、チオ親和性、イオン交換、疎水性相互作用、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーならびに他の混合様式樹脂が挙げられる。他の方法は、精製タンパク質を得るために、クロマトグラフィーよりもむしろ、例えば、塩またはポリエチレングリコールによる沈降を用いる。

ヘテロ二量体タンパク質は、精製までまたは精製の後で、ヘテロ二量体タンパク質の保存に好適な、例えば、ヘテロ二量体タンパク質の安定性を確保する状態に処方され得る。ヘテロ二量体抗体の場合、そのような製剤は、一般に、溶液またはバッファーであり得る。あるいは、ヘテロ二量体タンパク質は凍結乾燥され得る。

本発明の方法のプロセスに好適な設備は当業者に周知である。宿主細胞によるホモ二量体抗体の発現は、例えば、一般には、反応槽、例えば、バイオリアクター内で行うことができる。還元工程ａ）および酸化工程ｂ）は、上記のように、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の発現と同じバイオリアクター内で起こり得、または異なる反応槽内でも起こり得る。同様に、還元工程ａ）および酸化工程ｂ）も、同じ反応槽内で起こり得、または異なる反応槽内でも行うことができる。還元工程ａ）および酸化工程ｂ）が同じ反応槽内で起こる場合には、条件は、本明細書に記載するように、工程ａ）から工程ｂ）へと変更され得る。反応槽および支持プロセス配管は、ディスポーザブルまたは再利用可能なものであってよく、標準的な材料（プラスチック、ガラス、ステンレス鋼など）製であってよい。反応槽は、混合、スパージング、ヘッドスペースガス供給、温度管理の機能が備わっているものでよく、かつ／または温度、重量／容量、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）および酸化還元電位の測定用プローブによりモニタリングすることができる。そのような技術は全て、製造プラントの標準的な単位操作の中で共通しており、当業者に周知である。

本発明の方法の各工程は、本明細書に記載するとおりに行うことができる。

一実施形態では、本発明の方法は細胞外法である。上記のように、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の作出は、好適には、宿主細胞における発現により行うことができる。従って、工程ａ）、工程ｂ）および工程ｃ）は、特定の実施形態では、細胞外で行うことができる。さらなる実施形態では、工程ａ）、工程ｂ）、工程ｃ）、ならびに工程ａ）、工程ｂ）および工程ｃ）のいずれかの間の任意の工程、ならびにその後の任意の工程も細胞外で行うことができる。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質
本発明の方法を様々に用いて、ヘテロ二量体タンパク質の所望の組合せを生成することができ、その方法は二重特異性抗体の大規模作出に特に好適である。異なる抗原を標的とする抗体を組み合わせて選択的結合を得ることが可能であることに加え、その方法を用いて、同じ抗原を標的とする２つの異なる抗体を組み合わせることにより、所望の特性を変える、例えば、ＣＤＣを高めることもできる。さらに、その方法を用いて、無関係の（不活性な）抗体を用いてその非対称抗体を作製することにより、アンタゴニスト抗体の部分的アゴニスト活性を取り除き、またはアゴニスト抗体をアンタゴニスト抗体(antbody)へ変換することができる。

一実施形態では、ホモ二量体タンパク質は、（ｉ）Ｆｃ領域、（ｉｉ）抗体、（ｉｉｉ）Ｆｃ領域を含む融合タンパク質、例えば、受容体、サイトカインもしくはホルモンと融合されたＦｃ領域、および（ｉｖ）プロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素とコンジュゲートされたＦｃ領域からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、Ｆｃ領域に加えて、抗体の他の領域、すなわち、ＣＨ１領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域および／またはＶＬ領域のうちの１つ以上または全てを含む。よって、一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は全長抗体である。別の実施形態では、第２のホモ二量体タンパク質は全長抗体である。

重要な実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質はともに抗体、好ましくは、全長抗体であり、異なるエピトープと結合する。そのような実施形態では、生成されるヘテロ二量体タンパク質は二重特異性抗体である。前記エピトープは、異なる抗原上に位置しても同じ抗原上に位置してもよい。

しかしながら、他の実施形態では、ホモ二量体タンパク質の一方だけが全長抗体であり、もう一方のホモ二量体タンパク質は全長抗体ではなく、例えば、受容体、サイトカインもしくはホルモンのような別のタンパク質もしくはペプチド配列とともに発現されるか、またはプロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素とコンジュゲートしている、Ｆｃ領域である。第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質が抗体(anantibody)、例えば、全長抗体である場合には、一実施形態では、それはプロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素とコンジュゲートしていてよく、またはそのアクセプター基を含む。さらなる実施形態では、どちらのホモ二量体タンパク質も全長抗体ではない。例えば、どちらのホモ二量体タンパク質も、受容体、サイトカインもしくはホルモンのような別のタンパク質もしくはペプチド配列と融合しているか、またはプロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素とコンジュゲートしているＦｃ領域であり得る。これは、例えば、本発明の方法において２つの異なる化合物；例えば、プロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素と結合している第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を用いることによって、２つの異なる化合物；例えば、プロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素とコンジュゲートしているヘテロ二量体タンパク質を作出するために、用いることができる。また、これは、薬物の添加のプロセスまたは化学が他の薬物の添加に適合しない場合にも適切であり得、その場合、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質それぞれへの２つの薬物各々の添加のプロセスは、別々にかつ本発明の方法の前に行うことができる。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプ（本明細書に示した突然変異は少なくとも例外とする）に由来するＦｃ領域と類似もしくは同一であるか、または、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプ（本明細書に示した突然変は少なくとも例外とする）のものであり、第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプ（本明細書に示した突然変異は少なくとも例外とする）に由来するＦｃ領域と類似もしくは同一であるか、または、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプ（本明細書に示した突然変異は少なくとも例外とする）のものである。好ましい実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の両方のＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ（本明細書に示した突然変異は少なくとも例外とする）に由来するＦｃ領域と類似もしくは同一であるか、または、ＩｇＧ１アイソタイプ（本明細書に示した突然変異は少なくとも例外とする）のものである。別の好ましい実施形態では、ホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の一方は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来するＦｃ領域と類似もしくは同一であるか、またはＩｇＧ１アイソタイプのものであり、もう一方は、ＩｇＧ４アイソタイプ（本明細書に示した突然変異は少なくとも例外とする）に由来するＦｃ領域と類似もしくは同一であるか、またはＩｇＧ４アイソタイプ（本明細書に示した突然変異は少なくとも例外とする）のものである。後者の実施形態では、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質はＩｇＧ１のＦｃ領域およびＩｇＧ４のＦｃ領域を含み、そのため、エフェクター機能の活性化に関して興味深い中間の性質を有し得る。第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質が、Ａｓｎ結合型グリコシル化のアクセプター部位を取り除く突然変異を含むか、またはそうでなければグリコシル化特性を変化させるように操作される場合には、類似の産物を得ることができる。

さらなる実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２００９３１７８６９号に記載されているようにまたはvan Berkel et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. 105:３５０に記載されているように、抗体の作出中の培養培地への化合物の添加により、あるいは、例えば、Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotechnol. Bioeng 87:614に記載されているように、ＦＵＴ８ノックアウト細胞を用いることにより、フコースを低減し、その結果として、例えば、ホモ二量体タンパク質ＡＤＣＣを増強するように、ホモ二量体タンパク質の一方または両方は糖鎖操作される。また、Umana et al. (1999) Nature Biotechnol 17:176により記載されている方法を用いてＡＤＣＣを最適化することもできる。あるいは、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質を、フコースを増加させない宿主細胞において発現させることもできる（例えばＢｉｏｗａ／ＫＨＫ）。

さらなる実施形態では、例えば、Natsume et al. (2009) Cancer Sci. 100:2411に記載されているように、ホモ二量体タンパク質の一方または両方は、補体活性化を増強するように操作または改変されている。

さらなる実施形態では、ホモ二量体タンパク質の一方または両方は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合を減少または増加させて、ヘテロ二量体タンパク質の血清半減期を操作するように操作されている。

さらなる実施形態では、ホモ二量体の出発タンパク質の一方は、プロテインＡもしくはプロテインＧ、またはプロテインＡおよびプロテインＧの組合せと結合しないように操作または改変されており、そのため、産物をプロテインＡまたはプロテインＧのカラムに通すことによるホモ二量体の出発タンパク質からのヘテロ二量体タンパク質の分離が可能になる。これは、特に、出発材料として、一方のホモ二量体タンパク質がもう一方のホモ二量体タンパク質に対して過剰に用いられる場合の実施形態に有用であり得る。そのような実施形態では、過剰に用いられるホモ二量体タンパク質のプロテインＡまたはプロテインＧ結合部位を、そのような樹脂と結合するその能力が破壊されように操作または改変することが有用であり得る。このタイプの改変としては、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／１５１７９２号に開示されているＣＨ３ドメイン内の改変が挙げられる。よって、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、ＩｇＧのプロテインＡとの結合を減少または消失させる、国際公開第２０１０／１５１７９２号に記載されているＣＨ３ドメイン内の改変の１つ以上を含んでよい。よって、特定の実施形態では、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、限定されるものではないが、ａ）４３５Ｒならびにｂ）４３５Ｒおよび４３６Ｆからなる群から選択される改変を含んでよい。別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、以下の突然変異：Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａ（ＡＡＡ）を含んでよく、これらの突然変異もまたプロテインＡとの結合を消失させる。その場合、ヘテロ二量体化反応後、プロテインＡカラムに通すことにより、交換されなかったホモ二量体タンパク質の余剰分からヘテロ二量体タンパク質を分離することができる。ヘテロ二量体タンパク質の精製にプロテインＧが使用される場合には、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、限定されるものではないが、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３３およびＮ４３４からなる群から選択される改変を含んでよい(Sloan, D., et al., Prot. Sci. 1999; 8: 1643-1648; Sauer-Eriksson, E., et al., Structure 1995; 3: 265-278)。その場合、ヘテロ二量体化反応後、プロテインＧカラムに通すことにより、交換されなかったホモ二量体タンパク質の余剰分からヘテロ二量体タンパク質を分離することができる。他の精製方法には、本明細書に記載したもののいずれもが含まれる。従って、一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、異なる軽鎖、例えば、κ軽鎖およびλ軽鎖を含んでよく、または第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、本明細書に記載するような異なるアロタイプのものであってよい。

さらなる実施形態では、ホモ二量体タンパク質の一方は（１）Ｆｃ領域または（２）無関係のエピトープを認識する全長抗体である。

本発明のホモ二量体出発材料に用いられる可変領域は、例えば、Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作出してよく、または組換えＤＮＡ法により作出してもよい。また、可変領域は、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991)に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。可変領域は、任意の好適な起源から得てもよい。よって、例えば、可変領域は、目的の抗原で免疫化したマウスから得られたネズミ脾臓Ｂ細胞から調製されたハイブリドーマのモノクローナル抗体から、例えば、表面でその抗原を発現する細胞の形で、または目的の抗原をコードする核酸の形で得てもよい。また、可変領域は、免疫したヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ラット、イヌ、霊長類などの抗体発現細胞に由来するハイブリドーマのモノクローナル抗体から得てもよい。

第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体であってよい。別の実施形態では、ホモ二量体出発タンパク質の一方または両方は、任意の特定の突然変異を除き、ヒト抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖および軽鎖レパートリーの全体または一部をコードするミニ染色体を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソーマル(transchromosomal)マウス、例えば、ＨｕＭＡｂマウスまたはＴＣマウスを用いて生成し得る。ＨｕＭＡｂマウスは、再配置されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(minilocus)を、内因性のμおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的突然変異とともに含む(Lonberg, N. et al., Nature 368, 856 859 (1994))。従って、そのマウスはマウスＩｇＭまたはκ軽鎖の発現の低減を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、免疫に応答して高親和性のヒトＩｇＧ、κモノクローナル抗体を生成する(Lonberg, N. et al. (1994)、前掲；Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994)、Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995)およびHarding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995)において総説されている)。ＨｕＭＡｂマウスの調製は、Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992)、Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993)、Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994)、Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994)、Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845 851 (1996)において詳細に記載されている。米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、同第５，７７０，４２９号、同第５，５４５，８０７号、国際公開第９８／２４８８４号、同第９４／２５５８５号、同第９３／１２２７号、同第９２／２２６４５号、同第９２／０３９１８号および同第０１／０９１８号も参照。これらのトランスジェニックマウス由来の脾細胞を用いて、周知の技術によりヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成することができる。

さらに、本発明のヒト抗体または他の種由来の本発明の抗体は、当技術分野で周知の技術を用いて、限定されるものではないが、ファージクローニングまたはディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、および他の技術を含む、直接クローニングまたはディスプレイ型技術を通じて同定
することができ、結果として得られる分子は、成熟技術は当技術分野で周知であるため、さらなる成熟、例えば、親和性成熟に付すことができる。

本発明のさらなる実施形態では、抗体またはその部分、例えば、１つ以上のＣＤＲは、ラクダ科(Camelidae)の種由来のもの（国際公開第２０１０００１２５１号参照）、または軟骨魚類の種、例えば、テンジクザメ由来のものであり、あるいは重鎖またはドメイン抗体である。

本発明の方法の一実施形態では、工程ａ）におけるまたは工程ａ）において提供される第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は精製される。ホモ二量体の精製のための方法は、本明細書に記載したもののいずれであっても、例えば、下記のもののいずれであってもよい。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、薬物、プロドラッグもしくは毒素とコンジュゲートされるか、またはそのアクセプター基を含む。そのようなアクセプター基は、例えば、非天然アミノ酸であってよい。特定の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、異なる化合物とコンジュゲートしていてよく、または異なる改変を含んでいてよく、その結果、両方の化合物または改変を含むヘテロ二量体タンパク質が作出される。

上記のように、ホモ二量体出発タンパク質の第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものである。

一実施形態では、各ホモ二量体相互作用との比較でのヘテロ二量体相互作用の強度の増大は、共有結合、システイン残基または荷電残基の導入以外のＣＨ３改変によるものである。

ほとんどの実施形態では、本発明の産物であるヘテロ二量体タンパク質は、極めて安定であり、ｉｎｖｉｔｒｏ、緩和な還元条件下でまたは、重要なことには、ヒトもしくは動物への投与によりｉｎｖｉｖｏでＦａｂアーム交換を受けない。よって、一実施形態では、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用は、実施例１３に記載する条件下、０．５ｍＭＧＳＨではＦａｂアーム交換が起こり得ないものである。

別の実施形態では、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用は、実施例１４に記載する条件下、マウスにおいてｉｎｖｉｖｏでＦａｂアーム交換が起こらないようなものである。

別の実施形態では、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用は、例えば、実施例３０に記載するように決定した場合に、２つのホモ二量体相互作用のうちで最も強いものよりも、２倍を超える強さ、例えば、３倍を超える強さ、例えば、５倍を超える強さである。

さらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の配列は、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用の解離定数が、実施例３０に記載するようにアッセイした場合に、０．０５マイクロモル濃度（μＭ）未満であるものである。

さらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の配列は、両方のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例２１に記載のようにアッセイした場合に、０．０１μＭを超える、例えば、０．０５μＭを超える、好ましくは、０．０１〜１０μＭの間、例えば、０．０５〜１０μＭの間、より好ましくは、０．０１〜５μＭの間、例えば、０．０５〜５μＭの間、さらに好ましくは、０．０１〜１μＭの間、例えば、０．０５〜１μＭの間、０．０１〜０．５μＭの間または０．０１〜０．１μＭの間であるものである。ホモ二量体出発タンパク質が比較的安定な場合の実施形態は、大量の出発タンパク質を作出することおよび例えば、凝集またはミスフォールディングを回避することがより容易であるという利点を有し得る。

いくつかの実施形態では、安定なヘテロ二量体タンパク質は、ＣＨ３領域内にごく少数の、かなり保存的な、非対称突然変異を含む２つのホモ二量体出発タンパク質に基づき本発明の方法を用いて高収量で得ることができる。

よって、一実施形態では、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の配列は、同一でない位置にアミノ酸置換を含む。

アミノ酸置換基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよい。非天然アミノ酸の例は、例えば、Xie J and Schultz P. G., Current Opinion in Chemical Biology (2005), 9:548-554、およびWang Q. et al., Chemistry & Biology (2009), 16:323-336に開示されている。

一実施形態では、アミノ酸は天然アミノ酸である。

一実施形態では、野生型、例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＣＨ３領域と比べて、第１のホモ二量体タンパク質はＣＨ３領域内に１つ以下のアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質はＣＨ３領域内に１つ以下のアミノ酸置換を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質および前記第２のホモ二量体タンパク質は同じ位置で置換されていない。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３６６位にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。一実施形態では、３６６位のアミノ酸は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、ＧｌｕおよびＧｌｙから選択される。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３６８位にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３７０位にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３９９位にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、４０５位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０５位にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０７位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０７位にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０９位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にアミノ酸置換を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。

従って、一実施形態では、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の配列は、非対称突然変異、すなわち、２つのＣＨ３領域における異なる位置での突然変異、例えば、一方のＣＨ３領域内で４０５位に１つの突然変異およびもう一方のＣＨ３領域内で４０９位に１つの突然変異を含む。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノを有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇ、Ｈｉｓ、ＩｌｅおよびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇを有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｙ以外のアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、４０５位にＬｅｕを有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は３６６位にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐ以外のアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は３６６位にＰｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒ以外のアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は３６６位にＩｌｅおよびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＰｈｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＰｈｅ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＴｒｐからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有する。

そのような一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸を有する。これについてのさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｙ以外のアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＬｅｕを有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇ、Ｈｉｓ、ＩｌｅおよびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＬｅｕを有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇを有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＬｅｕを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３６６位にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３６６位にＰｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｙ以外のアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３６６位にＩｌｅおよびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３６６位にＩｌｅおよびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＬｅｕを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸および４０９位にＬｙｓを含む。これについてのさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｙ以外のアミノ酸および４０９位にＬｙｓを含む。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＬｅｕおよび４０９位にＬｙｓを含む。これについてのさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｙ以外のアミノ酸および４０９位にＬｙｓを含む。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０５位にＬｅｕおよび４０９位にＬｙｓを含む。

さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３７０位にＬｙｓ、４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓならびにａ）３５０位にＩｌｅおよび４０５位にＬｅｕ、またはｂ）３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓならびにａ）３５０位にＩｌｅおよび４０５位にＬｅｕ、またはｂ）３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３５０位にＴｈｒ、３７０位にＬｙｓ、４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓならびにａ）３５０位にＩｌｅおよび４０５位にＬｅｕ、またはｂ）３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は３５０位にＴｈｒ、３７０位にＬｙｓ、４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体タンパク質は３５０位にＩｌｅ、３７０位にＴｈｒ、４０５位にＬｅｕおよび４０９位にＬｙｓを含む。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｈｒ以外のアミノ酸を有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＴｒｐを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＡｓｎまたはＴｒｐを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｈｒ以外のアミノ酸および４０９位にＬｙｓを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＴｒｐおよび４０９位にＬｙｓを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＡｓｎまたはＴｒｐおよび４０９位にＬｙｓを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒおよび４０９位にＡｒｇを有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｈｒ以外のアミノ酸および４０９位にＬｙｓを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒおよび４０９位にＡｒｇを有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＴｒｐおよび４０９位にＬｙｓを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０７位にＴｙｒおよび４０９位にＡｒｇを有し、第２のホモ二量体タンパク質は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＡｓｎまたはＴｒｐおよび４０９位にＬｙｓを有する。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６６位にＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐ以外のアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６６位にＰｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒ以外のアミノ酸を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＰｈｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＰｈｅ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＴｒｐからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＴｒｐからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇ、Ｈｉｓ、ＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸を有する。なおさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇを有し、第２のホモ二量体タンパク質は３６８位にＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体タンパク質は
（ｉ）３６８位にＰｈｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔ以外のアミノ酸、または
（ｉｉ）３７０位にＴｒｐ、または
（ｉｉｉ）３９９位にＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、ＧｌｕもしくはＧｌｎ以外のアミノ酸を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇ、Ａｌａ、ＨｉｓまたはＧｌｙを有し、第２のホモ二量体タンパク質は
（ｉ）３６８位にＬｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐ、または
（ｉｉ）３７０位にＴｒｐ、または
（ｉｉｉ）３９９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＴｙｒ
を有する。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は４０９位にＡｒｇを有し、第２のホモ二量体タンパク質は
（ｉ）３６８位にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌもしくはＴｒｐ、または
（ｉｉ）３７０位にＴｒｐ、または
（ｉｉｉ）３９９位にＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＴｙｒを有する。

上記のアミノ酸置換に加えて、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、野生型、例えば、ヒトＩｇＧ、Ｆｃ配列と比べて、さらなるアミノ酸置換、欠失または挿入を含んでよい。

さらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域は、特定の突然変異を除き、配列番号１に記載の配列を含む（ＩｇＧ１ｍ（ａ））：
配列番号１：
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
さらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域は、特定の突然変異を除き、配列番号２に記載の配列を含む（ＩｇＧ１ｍ（ｆ））：
配列番号２：
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
さらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域は、特定の突然変異を除き、配列番号３に記載の配列を含む（ＩｇＧ１ｍ（ａｘ））：
配列番号３：
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
本発明によるヘテロ二量体タンパク質の作出は、第１のホモ二量体タンパク質と第２のホモ二量体タンパク質のＣＨ３領域の間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の間の各ホモ二量体相互作用よりも強いことを含む。この効果は、特に、上記のように、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の上述のＣＨ３改変例を用いて得ることができる。しかしながら、本明細書に記載のもの以外の突然変異を含む第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質も本発明の方法において用いてよいことは予測される。例えば、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、Lindhofer et al. (1995) J Immunol 155:219により記載されているように、ラット抗体およびマウス抗体であってよく（上記参照）、または米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているように、いわゆるｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ変種抗体であってよい（上記参照）。よって、本発明の一実施形態では、本発明の第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ単一または二重改変を含んでよい。

本発明の方法はまた、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているように、二重特異性抗体を作出するためにも用いることができる。

本発明において有用な第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の別の好適な実施例としては、国際公開第２００９／０８９００４号に開示されているもののような、第１のホモ二量体タンパク質と第２のホモ二量体タンパク質のＣＨ３領域の間の静電相互作用に基づいたものが挙げられる。この技術は静電ステアリング（electrostatic steering）とも呼ばれる。

しかしながら、場合によっては、後者のホモ二量体出発タンパク質は、ホモ二量体のＣＨ３−ＣＨ３相互作用が極めて弱いことから、作出することがより困難であることがある。よって、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位および４０９位のうちの１箇所以上に突然変異を有する本明細書に記載の変種が好ましいことがある。３５０位、３７０位、４０５位および４０９位のうちの１箇所以上に突然変異を有する本明細書に記載の変種が好ましいことがある。

ホモ二量体出発タンパク質のヒンジ領域の配列は可変である。しかしながら、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質は、ヒンジ領域がＩｇＧ４様ではない場合には、好ましくは、ＩｇＧ１様である場合には、ある状況下でより安定であり得る。

よって、一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質も第２のホモ二量体タンパク質も（コア）ヒンジ領域内にＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ配列を含まない。

さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質はどちらも（コア）ヒンジ領域内にＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ配列を含む。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質が抗体である場合の多くの実施形態では、前記抗体は軽鎖をさらに含む。上に説明したように、前記軽鎖は異なっていてよく、例えば、配列が異なり、各々は重鎖の一方だけと機能的抗原結合ドメインを形成する。しかしながら、別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は重鎖抗体であり、これらは抗原結合に軽鎖を必要としない、例えばHamers-Casterman (1993) Nature 363:446参照。

工程ａ）
上記のように、本発明の方法の工程ａ）は、第１のホモ二量体タンパク質を第２のホモ二量体タンパク質とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートすることを含む。「ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件」に関して「十分な」という用語は、Ｆａｂアーム交換反応を起こさせるという点に関するものであり得る。よって、特定の実施形態では、「ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件」とは、５０％を超えるヘテロ二量体タンパク質、例えば、６０％を超えるヘテロ二量体タンパク質、または７０％を超えるヘテロ二量体タンパク質、または８０％を超えるヘテロ二量体タンパク質、または９０％を超えるヘテロ二量体タンパク質、または９５％を超えるヘテロ二量体タンパク質、または９９％を超えるヘテロ二量体タンパク質、または９９．５％を超えるヘテロ二量体タンパク質、例えば、１００％のヘテロ二量体タンパク質の作出をもたらす条件である。これに関しては、ヘテロ二量体タンパク質のパーセンテージは、第１のホモ二量体タンパク質、第２のホモ二量体タンパク質およびヘテロ二量体タンパク質の総量に対するものである。ヘテロ二量体タンパク質の量またはパーセンテージは、例えば、本明細書における実施例に記載のようにＣＩＥＸにより測定することができる。

本発明に関連して、「工程ａ」の還元条件」についての言及は、「ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件」を指すことを目的としている。好適な条件の例を本明細書において示す。ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元のための最低必要条件は、ホモ二量体出発タンパク質に応じて、特に、ヒンジ領域の正確な配列に応じて異なり得る。特定の理論に縛られるものではないが、ヒンジ領域内のシステイン残基は、ジスルフィド結合の還元後、例えば、還元剤、例えば、２−ＭＥＡと結合した状態になるか、または鎖内ジスルフィド結合を形成するか、または結合していないシステイン残基と反応する可能性がある。

工程ａ）におけるヘテロ二量体タンパク質の形成は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のヒンジ領域内のジスルフィド結合の還元と、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換に基づいている。

従って、工程ａ）の還元条件は、さらに、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換と、その結果としての、ヘテロ二量体タンパク質の作出を可能にしている可能性がある。第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質の形成をもたらす２つの第１のホモ二量体タンパク質または２つの第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換も工程ａ）において起こり得る。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＣＨ３領域の間のヘテロ二量体相互作用は前記ＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強い。その結果、特定の理論に縛られるものではないが、ヘテロ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換と比べて不利であり得る。よって、工程ａ）は、一般的に、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のどちらよりも多くのヘテロ二量体タンパク質の作出をもたらし得る。従って、一般的に、本発明の方法は、得られた産物の、すなわち、第１のホモ二量体タンパク質、第２のホモ二量体タンパク質およびヘテロ二量体タンパク質の総量の、５０％を超える、例えば、６０％を超える、または７０％を超える、または８０％を超える、または９０％を超える、または９５％を超える、または９９％を超える、ヘテロ二量体タンパク質をもたらす。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、上にも記載したように、一緒にまたは別々に作出することができる。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質を一緒に作出する場合には、工程ａ）は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の作出と同じ容器、例えば、バイオリアクター内で起こり得る。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質、例えば、抗体の作出のための方法は当業者に周知である。

工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の濃度は同じである必要はない。原則として、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の濃度に関して制限はないが、最も実際的には、工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の各濃度は、一般に、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内、例えば、０．５〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内、または１〜７５ｍｇ／ｍＬの範囲内、または１〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であり得る。工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の総濃度は少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬであり得る。上限は、主に、２００ｍｇ／ｍＬを超える濃度でタンパク質は非常に粘性があるためにそれらの取り扱いが困難であること、溶解限度に達すること、またはタンパク質凝集速度が非常に速いことによるものである。従って、工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の総濃度は、一般に、０．２ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲内、例えば、０．５〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内、または１〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であり得る。

本発明の一実施形態では、本方法の工程ａ）において第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかを過剰に用いることができる。これは、特に、例えば、第１のホモ二量体タンパク質が、産物の安全性もしくは効力に強い影響を与えるか、またはヘテロ二量体タンパク質からの分離が第２のホモ二量体タンパク質よりも困難である（またはその逆も同様）場合に、あるいは本方法によって作出されたヘテロ二量体タンパク質の精製を単純化するまたは容易にする目的に、関連し得る。ホモ二量体タンパク質の一方、すなわち、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質を過剰に用いることで、本明細書に記載するように、ヘテロ二量体タンパク質の後の精製を容易にし得るが、これは、工程ａ）における交換プロセスを、不十分なタンパク質に関して完了状態により近づけるからである。よって、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質が制限するものとなるため、その大部分は工程ａ）において用いられ、そのため、後の精製は、主に、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の両方からではなく、過剰に用いられたホモ二量体タンパク質からヘテロ二量体タンパク質を分離することにある。従って、工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの過剰使用は、特に、精製を容易にする相違点を含む第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の使用と組み合わせることができる。そのような相違点としては、本明細書に記載の点、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧとの非結合、異なる軽鎖および／または異なるアロタイプが挙げられる。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の非等モル量の使用は、ステアード非等モル交換プロセス(steered non-equimolar exchange process)（ＳＮＥＥＰ）として知られていると考えられ、例えば、本明細書において実施例６４に記載するように行うことができる。

よって、一実施形態では、工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質と第２のホモ二量体タンパク質との比率は１：１と異なっていてよく、例えば、第１のホモ二量体タンパク質と第２のホモ二量体タンパク質との比率は、１：１．０３〜１：２の範囲内；例えば、１：１．０５〜１：１．５の範囲内、または１：１．１〜１：１．５の範囲内、または１：１．１〜１：１．４の範囲内；または１：１．１５〜１：１．３５の範囲内、または１：１．２〜１：１．３の範囲内の比率であってよい。

従って、一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、工程ａ）において、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの５％〜６０％過剰量、例えば、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの１５％〜５５％過剰量、例えば、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの２０％〜５５％過剰量、あるいは第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの３０〜５０％過剰量、あるいは特に、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの１５％〜３５％過剰量、例えば、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの２０％〜３０％過剰量で用いられ得る。

工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、特に、溶液中、例えば、バッファー中に存在してよい。よって、一実施形態では、工程ａ）は溶液中、例えば、バッファー中で行われる。溶液は、特に、水溶液であり得る。好適なバッファーは、還元および交換プロセスを助けし、かつ第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質に悪影響を及ぼさないもの、例えば、第１のホモ二量体タンパク質、第２のホモ二量体タンパク質およびヘテロ二量体タンパク質が安定するバッファーであり得る。工程ａ）において用いられるバッファーは、プロセス操作を最小限に抑えるために、前の処理工程の結果として第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質が存在するバッファーと同じであってよい。あるいは、それは、標準条件または最適な還元を可能にするために異なるバッファーであり得る。例えば、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は工程ａ）前に精製されることがあり、バッファーまたは溶液は精製の間に変更されることがある。

工程ａ）に好適なバッファーの例としては、限定されるものではないが、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）、ＰＢＳＢｒａｕｎ（実施例４４）、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、ヒスチジンバッファー、リン酸バッファーまたはＴｒｉｓバッファーが挙げられる。そのようなバッファーの具体例としては、本発明の実施例に記載するものが挙げられる。実施例４３にも示すように、バッファーの選択はヘテロ二量体タンパク質の形成の速度論に影響を及ぼし得る。よって、特定の実施形態では、本発明の工程ａ）にＴｒｉｓバッファーまたはリン酸バッファーを用いてよい。工程ａ）において用いられるバッファーは、例えば、本明細書において実施例４３に記載するリン酸バッファーまたはＴｒｉｓバッファーであってよく、あるいは本明細書において実施例５３に記載するＰＢＳバッファーであってよい。

一実施形態では、工程ａ）におけるバッファーは、バッファーを１〜１００ｍＭの範囲で、例えば、１〜５０ｍＭバッファーを含んでよく、または１〜２５ｍＭの範囲で、または５〜２０ｍＭの範囲で含んでよい。

一実施形態では、工程ａ）におけるバッファーは、リン酸塩を１〜１００ｍＭの範囲で、例えば、１〜５０ｍＭリン酸塩(phoshate)を含んでよく、または１〜２５ｍＭの範囲で、または５〜２０ｍＭの範囲で含んでよい。

工程ａ）の還元条件のｐＨは、ｐＨ３〜１０の範囲内、例えば、ｐＨ４〜９、またはｐＨ４．５〜８．５の範囲内であってよい。実施例４３から分かるように、ｐＨ値はヘテロ二量体タンパク質の形成の速度論に影響を及ぼし得る。よって、特定の実施形態では、工程ａ）における還元条件のｐＨは、ｐＨ５〜８の範囲内、例えば、ｐＨ６〜８の間、またはｐＨ６．５〜７．５の間であってよく、例えば、ｐＨは、特に、およそ５．５、または６、または６．５、または７、または７．５、または７．８または８であってよい。

好適なバッファーの例としては、実施例４３のもの、特に、１）１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）：８．１ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、１．５ｍＭリン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、１３８ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２．７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）ｐＨ５．０；２）１×ＤＰＢＳｐＨ７．０；３）２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８からなる群から選択されるものが挙げられる。

代替実施形態では、工程ａ）におけるバッファーは、限定されるものではないが、ａ）１０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭリン酸カリウム、１３７ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０；ｂ）１０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭリン酸カリウム、１３７ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０；ｃ）２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．９；ｄ）２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；およびｅ）２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８からなる群から選択され得る。

一実施形態では、工程ａ）における還元条件は、還元剤、例えば、スルフヒドリル還元剤を含む。「還元剤」および「還元体」という用語は、本発明に関連して、互換的に用いられ(used interchangably)得る。一般には、工程ａ）における還元条件は、還元剤、例えば、スルフヒドリル還元剤を添加することを含む。還元剤は、例えば、限定されるものではないが、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、β−メルカプト−エタノールおよびそれらの化学誘導体からなる群から選択することができ、好ましくは、還元剤は、２−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、Ｌ−システイン、Ｄ−システインおよびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される。よって、還元剤は、一実施形態では、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）の化学誘導体、Ｌ−システインおよびＤ−システインからなる群から選択され得る。より詳細には、還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、またはＬ−システイン、またはＤ−システインである。還元剤である２−メルカプトエチルアミンは、２−ＭＥＡおよびシステアミンなどの他の化学名を有し、そのような用語は、本発明に関連して、互換的に用いられ得る。２−ＭＥＡという用語はまた、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌを記述するためにも用いられ、これは、例えば、本発明の実施例において用いられる。

還元剤、その濃度および工程ａ）のインキュベーション時間の選択は、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合が還元された状態になり、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換が可能であるようなものでなければならない。しかしながら、同時に、厳しすぎる条件、例えば、高すぎる還元剤濃度または長すぎるインキュベーション時間を用いないようにすることも有利でもあり得、例えば、それは不必要である可能性があり、厳しすぎる条件は第１のホモ二量体タンパク質および／もしくは第２のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質に損傷を与え得るためである。最適な条件は、異なるパラメーター、例えば、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、ホモ二量体濃度、バッファーの選択、微量金属およびキレート剤、ならびに還元剤の選択および濃度によって影響を受け得る。

還元剤の好適な濃度は０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲内であってよい。還元剤が２−ＭＥＡであるならば、濃度は、一般に、１０〜５００ｍＭの範囲内、例えば、２５〜５００ｍＭの範囲内、または４０〜３５０ｍＭの範囲内、または１０〜１００ｍＭの範囲内、例えば、２５〜１００ｍＭの範囲内、または１０〜７５ｍＭの範囲内、例えば、２５〜７５ｍＭの範囲内、または１０〜６０ｍＭの範囲内、例えば、２５〜６０ｍＭの範囲内、または１０〜５０ｍＭの範囲内、例えば、２５〜５０ｍＭの範囲内、例えば、およそ１０ｍＭ、またはおよそ２５ｍＭ、またはおよそ３０ｍＭ、またはおよそ４０ｍＭ、またはおよそ５０ｍＭであってよい。還元剤がＬ−システインまたはＤ−システインであるならば、濃度は、一般に、１０〜５００ｍＭの範囲内、例えば、１０〜４００ｍＭの範囲内、または１０〜３００ｍＭの範囲内、または１０〜２００ｍＭの範囲内、または２０〜１５０ｍＭの範囲内、または２０〜１２５ｍＭの範囲内、または２５〜１００ｍＭの範囲内、例えば、およそ２５ｍＭ、またはおよそ５０ｍＭ、またはおよそ７５ｍＭまたはおよそ１００ｍＭであってよい。

さらなる実施形態では、工程ａ）は、少なくとも１５分間、例えば、少なくとも２０分間もしくは少なくとも３０分間、または少なくとも６０分間もしくは少なくとも９０分間、例えば、１５分〜１０時間、または１５分〜６時間、または１５分〜５時間、または１５分〜４．５時間、または１５分〜４時間、または３０分〜１０時間、または３０分〜６時間、または３０分〜５時間、または３０分〜４．５時間、または３２０分〜４時間、または９０分〜１０時間、または９０分〜６時間、または９０分〜５時間、または９０分〜４．５時間、または９０分〜４時間、例えば、２〜５時間、または２〜４．５時間、または２〜４時間、または３〜５時間、または３〜４．５時間、または３〜４時間、または３．５〜５時間、または３．５〜４．５時間、例えば、およそ２時間、３時間、４時間もしくは５時間のインキュベーションを含む。実施例４５および実施例５３に示すように、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元と、ヘテロ二量体タンパク質を作出するための第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換は、４時間以内に完了する一定の条件のもとにあった。

工程ａ）の最適な温度は還元剤の選択に依存し得る。一般には、その温度は、２〜４５℃の範囲内、例えば、２〜１０℃の範囲内、または１５〜４５℃の範囲内、または２０〜４０℃の範囲内、または２０〜３０℃の範囲内、または３０〜４０℃の範囲内、または２２〜３９℃の範囲内、例えば、２１〜２６℃の範囲内、または２２〜２５℃の範囲内、例えば、およそ２５℃もしくはおよそ３７℃であり得る。一実施形態では、工程ａ）は、少なくとも２５ｍＭの、２−メルカプトエチルアミン、Ｌ−システインおよびＤ−システインからなる群から選択される還元剤の存在下、少なくとも２０℃の温度で少なくとも３０分間のインキュベーションを含む。一実施形態では、制御されたＦａｂアーム交換、すなわち、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元と、その後の、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換を可能にする還元条件は、必要な酸化還元電位の観点から記載される。トリペプチドグルタチオン（ＧＳＨ）は、細胞において主要な低分子量チオールであり、ｉｎｖｉｖｏでの正常な酸化還元シグナル伝達に不可欠なチオール・ジスルフィド酸化還元状態を制御する。細胞の酸化還元バランスの力学は、還元型ＧＳＨおよびその酸化型ＧＳＳＧのチオール・ジスルフィド状態の維持により達成される。還元電位の値は、Rost and Rapoport, Nature 201: 185 (1964)およびAslund et al., J. Biol. Chem. 272:30780-30786 (1997)の場合と同様に測定することができる。酸化還元電位Ｅ_ｈは、１ＧＳＳＧあたり２ＧＳＨの酸化という化学量論を考慮に入れた、酸化還元状態の定量的尺度である。Ｅ_ｈはネルンストの式（式１）：Ｅ_ｈ＝Ｅ_０＋（ＲＴ／ｎＦ）ｌｎ（［ＧＳＳＧ（ｏｘ）］／［ＧＳＨ（ｒｅｄ）］^２）によって算出される。Ｅ_０は規定のｐＨでの酸化還元対の標準電位であり、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度であり、Ｆはファラデー定数であり、ｎは移動した電子の数である。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ対のＥｈのｉｎｖｉｖｏ推定値は−２６０〜−２００ｍＶの範囲内である(Aw, T., News Physiol. Sci. 18:201-204 (2003))。それに関して、最終分化した細胞はＥｈをほぼ−２００ｍＶ程度で維持するが、活発に増殖する細胞はおよそ−２６０ｍＶのさらに低下したＥｈを維持する。

ＤＴＴの標準酸化還元電位は−３３０ｍＶである(Cleland et al. Biochemistry 3: 480-482 (1964))。ＴＣＥＰは、溶液中でＤＴＴを還元することが示されており、それゆえに、ＤＴＴよりも酸化還元電位の負値が大きい。しかしながら、正確な値は報告されていない。従って、本発明の工程ａ）に好適な還元条件は必要な酸化還元電位Ｅ_ｈの観点から記載することができ、その値は、最適には、ｉｎｖｉｖｏでの正常な血漿条件のもとで達成される値よりも低く、ヒンジ領域内に位置しかつ鎖間ジスルフィド結合形成に関与するか、または軽鎖および重鎖の間のジスルフィド結合に関与するもの以外の抗体ジスルフィド結合を還元する酸化還元電位よりも高い。

よって、一実施形態またはさらなる実施形態では、工程ａ）は、−５０ｍＶ未満、例えば、−１５０ｍＶ未満、好ましくは、−１５０〜−６００ｍＶの間、例えば、−２００〜−５００ｍＶの間、より好ましくは、−２５０〜−４５０ｍＶの間、例えば、−２５０〜−４００ｍＶの間、さらに好ましくは、−３５０〜−４５０ｍＶの間に及ぶ酸化還元電位を用いる還元条件下で行われる。

一実施形態またはさらなる実施形態では、工程ａ）は、少なくとも２５ｍＭ２−メルカプトエチルアミンの存在下または少なくとも０．５ｍＭジチオトレイトールの存在下または少なくとも２５ｍＭＬ−もしくはＤ−システインの存在下、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも３０分間、例えば、９０分間のインキュベーションを含む。

一実施形態またはさらなる実施形態では、工程ａ）は、少なくとも２５ｍＭ２−メルカプトエチルアミンの存在下または少なくとも０．５ｍＭジチオトレイトールの存在下または少なくとも２５ｍＭＬ−もしくはＤ−システインの存在下、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０またはｐＨ７．４で、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも３０分間、例えば、９０分間のインキュベーションを含む。

別の実施形態またはさらなる実施形態では、工程ａ）は、少なくとも２５ｍＭ２−メルカプトエチルアミンの存在下、または少なくとも２５ｍＭＬ−もしくはＤ−システインの存在下、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも３０分間、例えば、９０分間のインキュベーションを含む。インキュベーションは、ｐＨ６〜８、例えば、ｐＨ７〜８で行うことができる。

さらなる実施形態では、工程ａ）は、２５〜７５ｍＭ２−メルカプトエチルアミンの存在下、または２５〜１００ｍＭＬ−もしくはＤ−システインの存在下、２０〜３０℃の温度で、４〜６時間のインキュベーションを含む。インキュベーションは、ｐＨ６〜８、例えば、ｐＨ７〜８で行うことができる。

なおさらなる実施形態では、工程ａ）は、５０ｍＭ２−メルカプトエチルアミンの存在下、または２５〜１００ｍＭＬ−もしくはＤ−システインの存在下、２５℃の温度で、５時間のインキュベーションを含む。インキュベーションは、ｐＨ６〜８、例えば、ｐＨ７〜８で行うことができる。

一実施形態またはさらなる実施形態では、工程ａ）は、金属キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはクエン酸を添加することを含む。本発明の工程ａ）において２−ＭＥＡを還元剤として使用する場合、酸化速度が低いことによって気付くように、工程ａ）におけるＥＤＴＡの添加または包有がこの工程における２−ＭＥＡ自動酸化の速度を低下させることを本発明の発明者らは示した（例えば、実施例４７および５４参照）。特定の理論に縛られるものではないが、これは、工程ａ）において存在する金属イオンがＥＤＴＡによってキレート化され、これにより、金属イオンによる２−ＭＥＡの自動酸化が低下し得ることが理由であろう。一般的には、還元剤の自動酸化により還元剤は消費され、結果として、還元剤の濃度が効果的に低下する。よって、金属キレート剤を添加することにより、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元速度は高められ、かつ／またはヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合を還元するのに必要な還元剤は低減され得る。金属イオンは、例えば、反応に用いられる溶液またはバッファー中に存在してもよく、かつ／または反応に用いられる設備から抽出され得る。

工程ａ）において添加または包有し得る好適な金属キレート剤の例としては、限定されるものではないが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびクエン酸が挙げられる。

金属キレート剤の濃度は、工程ａ）における組成物中の金属イオンの濃度に依存し、それは、例えば、工程ａ）において用いられる成分によって影響を受け得る。しかしながら、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの適切な濃度は、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内、例えば、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内、例えば、０．５ｍＭ〜５ｍＭの範囲内、または１ｍＭ〜５ｍＭの範囲内、例えば、およそ１ｍＭ、またはおよそ２ｍＭ、またはおよそ３ｍＭ、またはおよそ４ｍＭもしくはおよそ５ｍＭであり得る。

工程ａ）における酸素、例えば、溶存酸素の濃度もまた、鎖間ジスルフィド結合の還元ならびに／または第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換に影響を及ぼし得る。よって、さらなる実施形態では、工程ａ）における還元条件は、工程ａ）において存在する酸素、例えば、溶存酸素の量、例えば、工程ａ）の組成物中に溶解している酸素の量を減少させることを含む。

工程ａ）における組成物中の、酸素の存在または酸素、例えば、溶存酸素または酸化体の量は、異なる因子、例えば、空気から溶液中への酸素の移動を減少または増加させることができる異なる化合物または機械的効果の存在によって影響を受け得る。よって、さらなる実施形態では、本発明の工程ａ）は、混合速度を制限すること、酸素スパージングを制限すること、ヘッドスペースからの酸素移動を最小限に抑えることまたはそれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、混合速度は、例えば、５０〜２００ｒｐｍの間、例えば、７５〜１５０ｒｐｍの間、または７５〜１２５ｒｐｍの間、例えば、およそ１００ｒｐｍであり得る。ヘッドスペースガス供給速度は、例えば、５〜２５ｍＬ／分の範囲内、例えば、１０〜２０ｍＬ／分の範囲内、例えば、およそ１５ｍＬ／分であり得る。

酸素移動速度は、下式２を用いて決定することができる：
ＯＴＲ＝ｋｌａ×ｌｎ（ＤＯ^＊−ＤＯ）×ｓ、
（式中、
ＯＴＲ＝酸素移動速度（ｍＭ／時間）
ｋｌａ＝酸素移動容量係数（１／時間）
ＤＯ^＊＝平衡ＤＯ濃度（窒素＝０％、空気＝１００％、酸素＝５００％）
ＤＯ＝実際の溶存酸素濃度
ｓ＝酸素溶解度（およそ０．２ｍＭ／１００％））
酸素移動範囲の最適な範囲は、還元剤のタイプおよび濃度によって異なる。

実施例５７では、窒素をガスとして用い、交換反応の前にシステムのＤＯを０％の状態とした。式２によれば、ＤＯ^＊＝０およびＤＯ＝０の場合、ＯＴＲ＝０ｍＭ／時間。この条件により好適な交換を得た。

実施例５３では、気相に空気を用いたため、ＤＯ^＊＝１００％。実施例５３（１００ＲＰＭでの振盪）でのｋｌａは０．７６／時間であった。システムのＤＯは１００％の飽和値から０．２％の定常値に低下した。従って、式２によるこの条件の酸素移動速度は０．１５ｍＭ／時間である。この条件により好適な交換を得た。

実施例５５では、気相に空気を用いたため、ＤＯ^＊＝１００％。実施例５５（４００ＲＰＭでの振盪）でのｋｌａは４．０／時間であった。システムのＤＯは１００％の飽和値から３％の定常値に低下した。従って、式２によるこの条件の酸素移動速度は０．７８ｍＭ／時間である。この条件では、還元は不完全で、ヘテロ二量体産物へ変換は低かった。

これらの結果は、５０ｍＭ２−ＭＥＡを還元剤として用いた場合に、０〜０．１５ｍＭ／時間のＯＴＲは好適な結果をもたらすが、０．７８ｍＭ／時間以上のＯＴＲでは最適結果には至らなかったことを示している。

酸素(oygen)の移動に空気を用いる場合には、工程ａ）における酸素移動容量係数（ｋｌａ）は、例えば、３／時間未満、例えば、２／時間未満、または１／時間未満、または０．９０／時間未満、または０．８０／時間未満、例えば、０．７６／時間未満、例えば、およそ０．７６／時間であり得る。

工程ａ）において組成物中に溶解している酸素の量を制限またはパージする別の方法は、工程ａ）に不活性ガス、例えば、窒素を加えて、組成物の酸素を移動させることを含む。

よって、さらなる実施形態では、工程ａ）における還元条件は、不活性ガス、例えば窒素を用いて、工程ａ）の組成物中に溶解している酸素を移動させること、パージすることまたは置き換えることを含む。これは、例えば、窒素を用いたヘッドスペースガス供給および／または十分な振盪を用いたスパージングを通じて達成し得る。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のヒンジ領域内のジスルフィド結合の還元の進行は、酸化還元電位をモニタリングすることによりおよび／または溶存酸素の濃度をモニタリングすることにより追跡することができる。そのようなモニタリングのための手段は当業者に周知であり、例えば、異なるタイプのプローブ、例えば、本明細書において記載または使用されるもののいずれもが含まれる。

代替実施形態では、工程ａ）は、第１のヘテロ二量体タンパク質および第２のヘテロ二量体タンパク質を、還元剤を含む材料に通すことにより行うことができる。そのような方法の例は、還元剤を含むカラム、例えば、固定化還元体カラム、例えば、本明細書に記載の還元剤を含むもの、例えば、実施例６１に記載するものであり得る。

その後、ヘテロ二量体タンパク質は、例えば、カラムから溶出させ、材料から得ることができる。この方法により得られるヘテロ二量体タンパク質は、還元剤を含まないか、または微量の還元剤しか含まないが、これは、例えば、カラム中の、材料と結合しているためである。温度、溶存酸素の濃度、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の濃度、酸化還元電位およびｐＨは上記の場合と同様であってよい。

工程ｂ）
本発明の方法は、
ｂ）工程ａ）から得た組成物を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程
をさらに含む。

特定の実施形態では、本発明の工程ｂ）は、
ｂ）工程ａ）から得た組成物の少なくとも１０ｍＬを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくこと
を含む。

工程ａ）の還元条件は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を引き起こす。ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合に加えて、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質には他のジスルフィド結合、例えば、抗体の重鎖および軽鎖の間のジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合も存在し得る。工程ａ）の還元条件は、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質において、そのような他の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合の還元も引き起こす可能性がある。

工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の交換後、ヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の間でのヒンジ領域内のジスルフィド結合と、所望により、他のジスルフィド結合が再編成されるならば有利であり得る。それによって、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を少なくとも含み、所望により、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の場合と同様の位置に他のジスルフィド結合をさらに含むヘテロ二量体タンパク質の作出がもたらされる。そのようなジスルフィド結合の存在はヘテロ二量体タンパク質の安定性を高める。

実施例４１は、本発明の工程ａ）により作出した二重特異性抗体のバッファー交換後、前記二重特異性抗体は部分的にしか再酸化されなかったことを示している。従って、実施例４１により、その実施例における工程ａ）の条件は、前記二重特異性抗体のヒンジ領域内のジスルフィド結合の再酸化に十分なものではなかったことが示される。さらに、実施例４８および実施例５７はまた、窒素の添加により置き換えることによって溶存酸素濃度を低下させる場合に、抗体中のシステインのジスルフィド結合への再酸化が阻害されることを示している。システインのジスルフィド結合への酸化では、２つのシステインは互いに十分に近接していなければならない。本発明のプロセスは、一般的に、ヘテロ二量体タンパク質の自然再構築をもたらす。よって、例えば、本方法により作出した二重特異性抗体中のシステインは、一般的に、第１の抗体および第２の抗体（第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質）の場合と同様に位置し得るため、それらの抗体中に存在するジスルフィド結合は二重特異性抗体中でも形成される。本発明に関連して、「工程ｂ）の酸化条件」についての言及は、「ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件」を意味することを意図している。さらなる実施形態では、工程ｂ）における酸化条件は、ヘテロ二量体タンパク質における全ての関連ジスルフィド結合；例えば、鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合の両方の形成に十分なものである。

本発明に関連して、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合(inter-chain disfulfide bonds)への酸化を可能にするのに十分な条件とは、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または１００％の鎖間ジスルフィド結合が形成されることを意味する。本明細書において他の場所で記載するように、ヘテロ二量体タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合の両方を形成することができるシステイン残基を含み得る。システインのジスルフィド結合への酸化に適切な時間枠は、例えば、製造条件に依存し、一般には、４８時間以内、例えば、２４時間以内、または１５時間以内、または１０時間以内、または５時間以内、または４時間以内、または３時間以内、または２時間以内であり得る。

工業生産目的では、製品に悪影響を及ぼさない生産速度の上昇が、一般的に、有利と認識されている。実施例５５および実施例５６により、酸素量の増加がジスルフィド結合の再酸化速度を高めることが示される。これは、より大量のヘテロ二量体タンパク質の作出に特に適切であり得る。よって、本発明の方法は、工程ｂ）工程ａ）から得た組成物の少なくとも１０ｍＬを、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくことを含む。

さらなる実施形態では、工程ｂ）において用いられる、工程ａ）から得た組成物の容量は、少なくとも１５ｍＬ、例えば、少なくとも２０ｍＬ、または少なくとも２５ｍＬ、または少なくとも３０ｍＬ、または少なくとも４０ｍＬ、または少なくとも５０ｍＬ、または少なくとも７５ｍＬ、または少なくとも１００ｍＬ、または少なくとも１２５ｍＬ、または少なくとも１５０ｍＬ、または少なくとも２００ｍＬ、または少なくとも２５０ｍＬ、または少なくとも３００ｍＬ、または少なくとも３５０ｍＬ、または少なくとも４００ｍＬ、または少なくとも４５０ｍＬ、または少なくとも５００ｍＬ、または少なくとも５５０ｍＬ、または少なくとも６００ｍＬ、または少なくとも６５０ｍＬ、または少なくとも７００ｍＬ、または少なくとも７５０ｍＬ、または少なくとも８００ｍＬ、または少なくとも８５０ｍＬ、または少なくとも９００ｍＬ、または少なくとも９５０ｍＬ、または少なくとも１Ｌ、または少なくとも２Ｌ、または少なくとも３Ｌ、または少なくとも４Ｌ、または少なくとも５Ｌ、または少なくとも１０Ｌであり得る。原則として、特に、連続プロセス(a continous process)としてプロセスが実行されないならば上限はない。しかしながら、多くのプロセス条件では、このタイプの作出に好適な反応槽は１Ｌ〜１０，０００Ｌのサイズのものであり得る。

一実施形態またはさらなる実施形態では、例えば、工程ｂ）において用いられる、工程ａ）から得た組成物におけるヘテロ二量体タンパク質の濃度は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．７５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１６ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも２０ｍｇ／ｍＬであり得る。ヘテロ二量体タンパク質の濃度の上限は、１００〜２００ｍｇ／ｍＬの間、例えば、およそ１００ｍｇ／ｍＬ、またはおよそ１５０ｍｇ／ｍＬ、またはおよそ２００ｍｇ／ｍＬであり得る。従って、工程ａ）から得た組成物におけるヘテロ二量体タンパク質の濃度は、一実施形態では、０．１〜２００ｇ／Ｌの範囲内、例えば、１〜１００ｇ／Ｌの範囲内であり得る。本発明は、特定の濃度のヘテロ二量体タンパク質に限定されないが、タンパク質（それが第１のホモ二量体タンパク質であろうと第２のホモ二量体タンパク質であろうとヘテロ二量体タンパク質であろうと）の濃度が高すぎると組成物は不安定になるかまたは粘性が高すぎて取り扱いにくい状態になり、かつ／またはタンパク質凝集体が生じる可能性がある。これに対し、ヘテロ二量体タンパク質の濃度が低すぎると経済的実現可能性はないものと思われる。

ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件を得るために、例えば、工程ｂ）における酸素の供給により、必要な酸素の量は、種々の因子によって異なる。そのような因子としては、例えば、工程ａ）から得た組成物の容量、ヘテロ二量体タンパク質の濃度、酸化を必要とするジスルフィド結合の数および工程ａ）から得た組成物における酸素の濃度が挙げられ、この濃度は、例えば、バッファーにおける酸素の溶解度に依存する可能性があり、特定の溶液またはバッファー、ｐＨ、イオン強度、温度、圧力および周囲酸素濃度に依存し得る。工程ａ）から得た組成物を、本発明の工程ｂ）の酸化条件におくことにより、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化速度を高めることができる。一般的には、ヘテロ二量体タンパク質(the heterodimeric protien)中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化に十分または必要な、工程ｂ）における酸素の量は、ジスルフィド結合１モルあたり酸素（Ｏ_２）およそ０．５モル、例えば、ジスルフィド結合１モルあたり酸素（Ｏ_２）０．２５〜０．７５モルの範囲内、例えば、ジスルフィド結合１モルのあたり酸素（Ｏ_２）０．３〜０．７モルであってよい、またはである。これは、システイン２モルあたり酸素（Ｏ_２）１モル、例えば、システイン２モルあたり酸素（Ｏ_２）０．６〜１．４モルの範囲内に相当する。よって、一実施形態では、工程ｂ）における「酸化条件」とは、ジスルフィド結合１モルあたり酸素０．３〜０．７モル、例えば、ジスルフィド結合１モルあたりに存在する酸素０．５モル、またはシステイン２モルあたり酸素０．６〜１．４モルの範囲内、例えば、システイン２モルあたり酸素１モルを含む。

従って、酸素とジスルフィド結合またはシステインとのそのような比率を得るのに適切な酸素濃度は、工程ａ）から得た組成物におけるヘテロ二量体タンパク質の濃度に依存する。

一実施形態では、工程ｂ）における酸化条件は、少なくとも０．０５ｍＭ酸素、例えば、少なくとも０．０７５ｍＭ酸素、または少なくとも０．１ｍＭ酸素、または少なくとも０．１２５ｍＭ酸素、または少なくとも０．１５ｍＭ酸素、または少なくとも０．１７５ｍＭ酸素、または少なくとも０．２ｍＭ酸素の濃度を含み得る。

酸素の分子溶解度は、海水において、１気圧、２５℃で０．２０６ｍＭである。しかしながら、本方法の条件、例えば、バッファー、温度などでは、工程ａ）から得た組成物における酸素の濃度は０．２ｍＭ未満であり得る。

酸素溶解度は気相中の酸素分圧に依存しているため、酸素移動の増加はシステム中の空気圧を増加させることにより得ることができる。例えば、圧力の２倍増加は平衡溶存酸素濃度の２倍増加および酸素移動速度の上昇をもたらす。あるいは、気相中の酸素分圧は空気の代わりに酸素を用いることにより増加させることができる。空気はおよそ２１％の酸素を含有するため、純酸素の使用ではおよそ５倍高い濃度の平衡溶存酸素および酸素移動速度の上昇がもたらされる。圧力および純酸素を組み合わせて、酸素溶解度および移動速度をさらに高めることができる。

一実施形態では、工程ｂ）における酸化条件は、工程ａ）から得た組成物を酸素で飽和させることを含む。

工程ａ）から得た組成物は、一般的に、少量の酸素を含み、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の適正な還元を確保する。よって、本発明の方法の工程ｂ）において酸素を供給することが必要であり得る。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、上記のように、溶液、例えば、バッファー中に存在し得る。よって、工程ａ）から得た組成物は、特定の実施形態では、溶液、例えば、バッファーであり得る。この実施形態では、それは溶液中に溶解している酸素の量、すなわち、溶存酸素の濃度であり、これがヘテロ二量体タンパク質中のシステインの酸化に重要である。

よって、一実施形態では、「工程ｂ）の酸化条件」とは、溶存酸素のレベルを制御することを意味し、それは、例えば、工程ａ）から得た組成物中の溶存酸素の量または濃度を増加させることを含み得る。

本発明の方法では、工程ｂ）の酸化条件を得るまたは生み出すための異なる手段を使用することができ、限定されるものではないが、本明細書に記載のものが含まれる。

一実施形態では、本発明の工程ｂ）の酸化条件は、酸素の添加を含む。「酸素の添加」という用語は、本発明に関して、工程ａ）から得た組成物中の酸素、例えば、溶存酸素量を増加させ、その結果、それがヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分であるようにすることと理解されるべきである。酸素添加の手段または方法としては、限定されるものではないが、機械的手段、工程ａ）から得た組成物の溶液またはバッファーを、より多くの量の酸素を含むバッファーの溶液、例えば、本明細書に記載のダイアフィルトレーションに用いられるバッファーの１つに変更する方法、工程ａ）から得た組成物の溶液またはバッファーを、十分な酸素を含む溶液またはバッファーで希釈する方法、酸素を発生させることができる化合物を添加する方法、圧力を高める方法あるいは酸素、例えば、酸素ガスを直接添加するまたは包有することによる方法が挙げられる。そのような方法の組合せもまた用いることができる。

工程ｂ）における酸素の量または濃度は、例えば、連続的に(continously)測定して、工程ｂ）の間中十分な酸素が存在することを確保することができる。酸素を測定するための方法または設備は当業者に周知であり、例えば、本明細書に記載したもののいずれもが含まれ得る、例えば、実施例４４に記載するプローブ。

酸素は、例えば、酸素または空気を用いたスパージングを行うことまたは増圧により、工程ｂ）に加えることができる。別の方法は、周囲、例えば空気からの酸素の移動を増加させることであってよい。これは、例えば、機械的手段による、例えば、撹拌、振盪、増圧または流れの創出により行うことができる。例えば、工程ｂ）における組成物が容器、例えば、中空製品中に存在するならば、酸素は、例えば、ヘッドスペース、または工程ｂ）の組成物に適用し得る振盪または撹拌のための手段から、例えば、工程ｂ）の組成物中に移動させることができる。工程ｂ）における組成物の振盪または撹拌の速度を制御することにより、周囲からの酸素の移動速度を制御することができる、すなわち、振盪もしくは撹拌速度または流れが速くなるほど、工程ａ）から得た組成物中に移動する酸素が多くなる。圧力を高めるための手段も適用することができる。工程ｂ）への酸素の添加は異なる手段の組合せによって行うこともでき、例えば、振盪および／または撹拌を、工程ｂ）における組成物の酸素または空気を用いたスパージングおよび／または圧力上昇と組み合わせてもよい。

別の実施形態では、本発明の工程ｂ）における酸化条件は酸化剤を含む。酸化剤は、好ましくは、ヘテロ二量体タンパク質における鎖間ジスルフィド結合の酸化を確保すると同時に前記ヘテロ二量体タンパク質の他の部分、例えば、酸化に対して感受性が高いことが分かっている、メチオニンおよびトリプトファンのようなアミノ酸の酸化を回避することが可能であるものである。好適な酸化剤の例はデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）である。工程ａ）において存在する還元剤を酸化するためにｄｈＡＡを用いるならば、ｄｈＡＡの典型的な濃度は、還元剤の濃度の１〜２倍の範囲内、例えば、５０〜１００ｍＭの範囲内であり得る。工程ａ）において存在する還元剤をｄｈＡＡ添加の前に除去するならば、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化剤の量はより少なく、例えば、０．０１〜１ｍＭの範囲内、例えば０．１〜１ｍＭであり得る。酸化剤、例えば、ｄｈＡＡを本発明の工程ｂ）において添加するならば、それはその後標準的な濾過技術および／またはクロマトグラフィー技術を用いて除去され得る。

工程ｂ）において酸素を添加するまたは増加させるための異なる手段または方法は、組み合わせて用いることができる。

例えば、酸素を添加する方法、例えば、酸素を用いたスパージング、撹拌、振盪または流れの創出による方法には関係なく、それは、一実施形態では、酸化剤の添加と組み合わせることができる。

本発明の一実施形態では、工程ａ）の還元条件は還元剤を含み、この還元剤は工程ａ）から得た組成物中にも存在し得るため、工程ｂ）において酸化条件におかれる。工程ｂ）における還元剤の存在は、工程ｂ）の酸化条件に対して有害であり得る。よって、一実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は還元剤から分離され得る。下記のように、本発明の発明者らは、ヘテロ二量体タンパク質から還元剤を分離するための特定の方法がヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件をもたらすまたは生み出すことを見出した。

還元剤の除去または還元剤からのヘテロ二量体タンパク質の分離は、方法によっては、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに必ずしも十分であるわけではなく、特に、大量のヘテロ二量体タンパク質、すなわち、工程ａ）において高濃度および／または高容量のヘテロ二量体タンパク質が作出される場合（例えば、実施例４１、実施例５２および実施例５３参照）は十分ではない。しかしながら、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離することが他の理由で有利である場合があり、そのため、本発明の方法は、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離する工程をさらに含んでよい。ヘテロ二量体タンパク質から還元剤を分離するための実施形態は以下にさらに記載する。

工程ａ）から得た組成物中の還元剤の量を減少させることための別の方法は、前記組成物の容量を増加させ、それによって、工程ａ）から得た組成物中の還元剤の濃度を低下させることである。従って、さらなる実施形態では、工程ａ）から得た組成物の容量は、例えば、工程ａ）の還元剤を含まないことを除いて、工程ａ）から得た組成物のバッファーと同じバッファーを加えることにより、または工程ａ）の還元剤を含まない、工程ａ）から得た組成物のバッファーとは異なるバッファーを加えることにより、増加させることができる。工程ａ）から得た組成物の容量の増加は、還元剤とヘテロ二量体タンパク質を分離するための方法を含む、本明細書に記載の他の実施形態と組み合わせて用いることができる。

工程ｂ）における酸素および／または酸化剤の組成物への添加は、上記のように、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分なものであり得る。さらに、工程ａ）が還元剤を含むならば、これらの条件は還元剤の酸化にも十分なものであり得るため、その還元剤はヘテロ二量体タンパク質の鎖間ジスルフィド結合をさらに還元することができない。よって、さらなる実施形態では、工程ｂ）の酸化条件は、工程ａ）の還元剤の酸化を可能にするのに十分なものである。例えば、工程ａ）において２−ＭＥＡを還元剤として使用するならば、工程ｂ）の酸化条件は２−ＭＥＡが自動酸化するようなものであり、その結果、その還元剤はいかなるジスルフィド結合も還元することができなくなる（例えば、実施例５９参照）。還元剤が酸化されるか否かには関係なく、その後、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離することが適切であり得る。従って、さらなる実施形態では、本発明の方法は、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離も含み得る。還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離するための方法には、本明細書において、例えば、下に、記載するもののいずれもが含まれる。ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は、工程ｂ）の一部であってよく、または別の工程であってもよい。

よって、一実施形態では、工程ｂ）は、酸素または酸化剤を添加することを含み、所望により、その後、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離することを含む。還元剤からのヘテロ二量体タンパク質の分離は、別の工程として、工程ｂ）後に行うこともできる。

工程ｂ）における酸素および／または酸化剤の添加によって、還元剤の酸化ももたらされ得るが、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインは完全にはジスルフィド結合へと酸化されない。この場合、ヘテロ二量体タンパク質は還元剤から分離され、その後、前記ヘテロ二量体タンパク質のシステインは、例えば、上記のように、酸素および／または酸化剤の添加によって、鎖間ジスルフィド結合へと酸化され得る。よって、工程ｂ）は、一実施形態では、工程ａ）から得た組成物を、還元剤を酸化するのに十分な酸化条件におくこと、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離すること、および前記ヘテロ二量体タンパク質を、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な条件におくことを含み得る。還元剤とヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化は、同様に、例えば、上記のように、酸素および／または酸化剤の添加によって実施または実行することができる。しかしながら、還元剤の酸化とヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化では、必要な酸素の量、インキュベーション時間などに関していくつかの相違点がある場合がある。還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離するための方法には、限定されるものではないが、下記のもののいずれもが含まれ、例えば、透析、沈降、クロマトグラフィーまたは濾過がある。従って、一実施形態では、工程ｂ）は、工程ａ）から得た組成物を、クロマトグラフィー、例えば、カラムクロマトグラフィー、または濾過、例えば、ダイアフィルトレーション、例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションもしくはノーマルフローフィルトレーションに付すことを含み得る。クロマトグラフィーまたは濾過を実施するための方法には、限定されるものではないが、下記のもののいずれもが含まれる。

別の実施形態では、工程ｂ）の酸化条件は、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離と同時に、ヘテロ二量体タンパク質のシステインが鎖間ジスルフィド結合へと酸化されるようなものであり得る。この場合、本発明の工程ｂ）は、上記のように、酸素および／または酸化剤を添加することを含み、それと同時に、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離することを含み得る。従って、一実施形態では、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離するための方法または条件は、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を導きまたは可能にすることができる。よって、工程ｂ）は、一実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離することを含み得る。還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離するための方法には、限定されるものではないが、下記のもののいずれもが含まれ、例えば、透析、沈降、クロマトグラフィーまたは濾過がある。従って、一実施形態では、工程ｂ）は、工程ａ）から得た組成物を、クロマトグラフィー、例えば、カラムクロマトグラフィー、または濾過、例えば、ダイアフィルトレーション、例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションもしくはノーマルフローフィルトレーションに付すことを含み得る。クロマトグラフィーまたは濾過を実施するための方法には、限定されるものではないが、下記のもののいずれもが含まれる。

さらに別の実施形態では、本発明の方法は、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離すること、その後、前記ヘテロ二量体タンパク質を、ヘテロ二量体タンパク質におけるシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におくことを含み得る。この実施形態では、還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離する工程は、工程ｂ）の前の別の工程として考えてよく、または工程ｂ）の一部として考えてもよい。還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離するための方法には、限定されるものではないが、下記のもののいずれもが含まれ、例えば、透析、沈降、クロマトグラフィーまたは濾過がある。ヘテロ二量体タンパク質におけるシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件は、上記のように、例えば、酸素および／または酸化剤を、ヘテロ二量体タンパク質を含む組成物に添加することによって得ることができる。

還元剤からヘテロ二量体タンパク質を分離するための方法は、原則として、ヘテロ二量体タンパク質に悪影響を及ぼさずに２つのものの分離を導きまたは可能にする任意の方法であり得る。そのような方法としては、限定されるものではないが、透析、沈降、クロマトグラフィーまたは濾過が挙げられる。ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は、連続プロセス(a continous process)として行うことができ、またはバッチプロセスとして行うこともできる。

工程ａ）から得た、ヘテロ二量体タンパク質を含む組成物は、特に、溶液、例えば、バッファーであり得る。還元剤からのヘテロ二量体タンパク質の分離は、工程ａ）から得た組成物のバッファーまたは溶液を、還元剤を含まない別のバッファーまたは溶液と交換することによっても行うことができる。バッファーまたは溶液は、還元剤が存在することを除き、工程ａ）から得た組成物と同じバッファーまたは溶液と交換されることがあり、あるいは別のバッファーまたは溶液、例えば、後の工程またはヘテロ二量体タンパク質の最終製剤に好適なバッファーまたは溶液と交換されることもある。工程ａ）から得た組成物の溶液またはバッファーと交換される溶液またはバッファーは、一実施形態では、酸素、例えば、溶存酸素、または任意の酸化剤も含み得る。従って、工程ｂ）における、工程ａ）から得た組成物の溶液またはバッファーの交換または希釈は、「ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件」を生み出すことができる。工程ｂ）の酸化条件は、上記のように、異なる手段により得ることができる；例えば、還元剤の除去（ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離）、機械的手段、例えば、クロマトグラフィーまたは濾過方法による、および／または工程ａ）から得た組成物のバッファーまたは溶液の、より多くの量の酸素または酸化剤を含むバッファーまたは溶液との交換による、酸素または酸化剤の添加。「より多くの量の酸素」とは、これに関連しては、工程ａ）から得た組成物のバッファーまたは溶液中に存在する酸素の量との比較におけるものと理解されるべきである。工程ａ）から得た組成物のバッファーまたは溶液の交換は、例えば、クロマトグラフィーまたは濾過によって行うことができる。よって、一実施形態では、本発明の方法は、工程ａ）から得た組成物の溶液、例えばバッファーをクロマトグラフィーまたは濾過により交換する工程を含む。

工程ａ）から得た組成物の溶液またはバッファーの交換は、例えば、還元剤を含まないバッファーまたは溶液の少なくとも３容量を用いて行うことができる。原則として、交換可能な容量数に上限はないが、最も実際的には、３〜１２容量のバッファーまたは溶液を交換することができ、例えば、還元剤の濃度を適切に低下させまたは工程ａ）から得た組成物から還元剤を除去するのに十分であり得る量は、４〜１１容量の範囲内、または４〜１０容量の範囲内、または５〜１０容量の範囲内、例えば、５容量、６容量、７容量、８容量、９容量もしくは１０容量である。

クロマトグラフィーまたは濾過によるヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は、溶液またはバッファーの交換、すなわち、上記のようなバッファーまたは溶液の交換を必要とし得る。

ヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離するためのクロマトグラフィー方法の好適な例は、特定の実施形態では、結合と溶出に基づいたクロマトグラフィー方法であり得る。「結合と溶出(bind and elute)」または「結合と溶出(binding and elution)」という用語は、還元剤またはヘテロ二量体タンパク質の一方のクロマトグラフィー材料との結合に基づき、それに対して、もう一方の成分は結合しない。クロマトグラフィー材料と結合していない成分はフロースルー工程および洗浄工程により回収され得るが、それに対して、結合した材料は、カラムから成分を溶出するためにバッファー条件を変更した後に別々に回収され得る。種々のクロマトグラフィー方法が存在するが、最も好適なものは還元剤とヘテロ二量体タンパク質の選択によって異なる。好適な例としては、限定されるものではないが、プロテインＡおよびプロテインＧクロマトグラフィー（その他のアフィニティークロマトグラフィー様式）、例えば、抗原結合または抗イディオタイプ抗体に基づいた、アフィニティークロマトグラフィー、κまたはλ選択、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、例えば、ハイドロキシアパタイト、イオン交換、疎水性相互作用、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよびチオール基吸着クロマトグラフィー（Thiophilic Adsorption Chromatography）が挙げられる。

一実施形態では、クロマトグラフィーはカラムクロマトグラフィーであり得る。クロマトグラフィーは、上記のように、工程ａ）から得た組成物のバッファーまたは溶液の、還元剤を含まない別のバッファーまたは溶液との交換を必要とし得る。これは、例えば、３〜１２容量の範囲でのバッファーまたは溶液の交換を必要とし得る。クロマトグラフィー方法はバッチプロセスとして行われることが多く、そのため、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤をクロマトグラフィーにより分離する場合には、その方法は、一実施形態では、バッチプロセスとして行うことができる。

上記のように、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤は濾過によっても分離することができる。濾過方法の好適な例はダイアフィルトレーションである。本発明の発明者らは、大量の、工程ａ）から得た組成物を使用する場合でも、ダイアフィルトレーションの条件は、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分であり得ることを見出した（例えば、実施例４１参照）。よって、ダイアフィルトレーションによるヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化と同時に行うことができる。よって、本発明の工程ｂ）は、特定の実施形態では、工程ａ）から得た組成物のダイアフィルトレーションを含み得る。ダイアフィルトレーションは、上記のように、少なくとも３容量のバッファーまたは溶液の交換を必要とし得る。ダイアフィルトレーションの方法としては、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）およびノーマルフローフィルトレーション（ＮＦＦ）が挙げられ、これらはどちらも本発明の方法において用いることができる。ＴＦＦおよびＮＦＦはどちらも連続プロセス(continous processes)として行うことができ、またはバッチプロセスとして行うこともできる。よって、一実施形態では、本発明の工程ｂ）は、工程ａ）から得た組成物を、以下の方法：連続ＴＦＦ(continous TFF)、バッチＴＦＦ、連続ＮＦＦ(continous NFF)またはバッチＮＦＦの１つに付すことを含む。

ダイアフィルトレーションの種々の方法は当業者に公知である。本発明の目的では、ダイアフィルトレーションは、例えば、カットオフ値が１０〜５０ｋＤａの範囲内、例えば２０〜４０ｋＤａ、例えば、およそ３０ｋＤａであるメンブレンを用いて行うことができる。メンブレンは、例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）、再生セルロース（ＲＣ）、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、親水化二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロースまたはナイロンなどの材料から作られたものであってよい。メンブレン構造は、例えば、中空糸、平板または螺旋状に巻回されたものであってよい。

一実施形態では、ダイアフィルトレーションに、中空カートリッジ、例えば、繊維カートリッジが使用することができる。中空カートリッジの表面積はダイアフィルトレーション速度に影響を及ぼす、すなわち、表面積が大きくなるほどダイアフィルトレーション速度は速くなる。ダイアフィルトレーション速度は、例えば、Ｌ／時間として測定することができる。表面積は、０．０５〜１ｍ^２の範囲内、例えば、０．０５〜０．５ｍ^２の範囲内、例えば、およそ０．１ｍ^２、またはおよそ０．１６ｍ^２、またはおよそ０．４ｍ^２であり得る。

カートリッジ入口圧は、１０〜４０ｐｓｉｇ（７０〜２８０ｋＰａ）の範囲内、好ましくは、２０〜３０ｐｓｉｇ（１４０〜２１０ｋＰａ）の範囲内であり得る。

「ｐｓｉｇ」という用語は、ポンド／平方インチゲージ圧を意味し、単位Ｐａ（パスカル）との相関関係は１０１，３２５Ｐａ＝１４．７ｐｓｉｇである。

「ＰＳＩ」という用語は、ポンド／平方インチを意味する。

ダイアフィルトレーションは、適切な容量数のバッファー／溶液の交換を実施するのに必要な期間で行うことができる。好適な期間は、例えば、メンブレンの表面積、メンブレンのタイプ、ヘテロ二量体タンパク質の濃度、システム圧力、循環速度、フィルターカートリッジの形状、温度、溶液の粘度、濾過処理する容量、ダイアフィルトレーションプロセスにおいて溶液によって起こるフィルターファウリングの量によって異なる。一般には、ダイアフィルトレーションは３０分〜２０時間の間で行うことができる。

一実施形態では、ダイアフィルトレーションは、１０〜５０ｋＤａの範囲のカットオフ値を有し、表面積が０．０５〜１ｍ^２の範囲であり、カートリッジ入口圧が７０〜２８０ｋＰａの範囲である中空糸カートリッジを通して組成物を循環させることにより、１〜７容量、例えば、３〜７容量、または５〜７容量もしくは７容量のバッファーの交換が起こるまで行うことができる。

一実施形態では、ダイアフィルトレーションは、表面積が０．１ｍ^２であり、カートリッジ入口圧が２５ＰＳＩ（１７０ｋＰａ）であり、透過物流２５ｍＬ／分をもたらす３０ｋＤａ修飾ポリエーテルスルホン中空糸カートリッジを通して組成物を循環させることにより、５〜７容量、例えば、７容量のバッファーの交換が起こるまで行うことができる。

一実施形態では、ダイアフィルトレーションは、表面積が０．４ｍ^２であり、カートリッジ入口圧が２５ＰＳＩ（１７０ｋＰａ）であり、透過物流１００ｍＬ／分をもたらす３０ｋＤａ修飾ポリエーテルスルホン中空糸カートリッジを通して組成物を循環させることにより、５〜７容量、例えば、７容量のバッファーの交換が起こるまで行うことができる。

一実施形態では、ダイアフィルトレーションは、表面積が０．１６ｍ^２であり、カートリッジ入口圧が２５ＰＳＩ（１７０ｋＰａ）であり、透過物流１００ｍＬ／分をもたらす３０ｋＤａ修飾ポリエーテルスルホン中空糸カートリッジを通して組成物を循環させることにより、５〜７容量、例えば、７容量のバッファーの交換が起こるまで行うことができる。

連続プロセス(a continous process)としての濾過の実施は、一般的に、バッファーまたは溶液を、透過物の除去と同じ速度でシステムに加え、それによって、システム内の溶液／バッファーの量を一定に保つことを含む。よって、本発明に関連して、これは、工程ｂ）では、工程ａ）から得た組成物に、透過物の除去と同じ速度でバッファー／溶液が加えられるということになる。ヘテロ二量体タンパク質は、保持液(rententate)から回収することができる。一方、本発明の方法におけるバッチプロセスとしてのクロマトグラフィーまたは濾過の実施は、一般に、工程ａ）から得た組成物中に存在するヘテロ二量体タンパク質を濃縮すると同時に、工程ａ）から得た組成物の溶液を除去することを必要とし得る。あるいは、ヘテロ二量体タンパク質を含む工程ａ）から得た組成物を希釈し、その後、クロマトグラフィーまたは濾過により濃縮してもよい。そのプロセスを２回以上行う場合には、濃縮されたヘテロ二量体タンパク質を、その後、クロマトグラフィーまたは濾過の工程を繰り返す前に、バッファーまたは溶液で再度希釈してもよい。

一実施形態では、工程ａ）から得た組成物は、還元剤とヘテロ二量体タンパク質の分離の前に希釈され得る。

一実施形態では、クロマトグラフィーまたは濾過、例えば、ダイアフィルトレーションによるヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は１回行うことができる。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーまたは濾過によるヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は、例えば、間に異なる工程を含み、２回以上繰り返され得る。よって、一実施形態では、本発明の方法は、工程Ｉ）〜工程ＩＩＩ）を含み得る。特定の実施形態では、本発明の工程ｂ）は、工程Ｉ）〜工程ＩＩＩ）：
Ｉ）工程ａ）から得た組成物のヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離する工程、
ＩＩ）工程Ｉ）から得た、ヘテロ二量体タンパク質を含む組成物をインキュベートする工程、
ＩＩＩ）工程ＩＩ）から得た組成物のヘテロ二量体タンパク質と還元剤を分離する工程を含み得る。

ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は工程Ｉ）で完了していない可能性があるため、工程Ｉ）から得た、ヘテロ二量体タンパク質を含む組成物は還元剤をまだ含む可能性がある。

工程Ｉ）および工程ＩＩＩ）におけるヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離は、本明細書に記載の方法、例えば、上記の方法によって行うことができる。特に、その分離はダイアフィルトレーションによって行うことができる。上に記載したクロマトグラフィーおよび濾過の条件は工程Ｉ）および工程ＩＩＩ）にも適用される。工程Ｉ）から得たヘテロ二量体タンパク質の工程ＩＩ）でのインキュベーションは、例えば、１時間〜１０日間、または１時間〜５日間、または１時間〜３日間、または１時間〜４８時間、例えば、５〜２４時間、または８〜１８時間の期間、１０〜４５℃の範囲内、例えば、１５〜４０℃の範囲内、または１５〜３５℃の範囲内、または２０〜４０℃の範囲内、または２０〜３５℃の範囲内の温度で行うことができる。さらなる実施形態では、工程Ｉ）から得たヘテロ二量体タンパク質の工程ＩＩ）でのインキュベーションは、１〜２４時間の期間、１５〜４０℃の範囲内の温度で行うことができる。

さらなる実施形態では、工程Ｉ）は、工程ａ）から得た組成物のダイアフィルトレーションを含み得る。よって、さらなる実施形態では、工程Ｉ）、工程ＩＩ）および工程ＩＩＩ）は、下記工程：
Ｉ）工程ａ）から得た組成物のダイアフィルトレーション工程
ＩＩ）工程Ｉ）から得た保持液のインキュベーション工程
ＩＩＩ）工程ＩＩ）から得た組成物のダイアフィルトレーション工程
を含み得る。

さらなる実施形態では、工程Ｉ）および／または工程ＩＩＩ）におけるダイアフィルトレーションは、バッファー交換、例えば、３〜１２容量の範囲内でのバッファー交換を含み得る。

なおさらなる実施形態では、工程ＩＩ）は、１５〜３５℃の範囲内の温度で１２〜４８時間の期間のインキュベーションを含む。

実施例４５に示すように、ヘテロ二量体タンパク質と還元剤の分離の繰返しは、いくつかの条件では、例えば、工程ａ）の還元条件によれば、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への完全な再酸化の確保および／またはヘテロ二量体タンパク質を含む組成物中の還元剤の量のさらなる最小化を助けることができる。

本発明の発明者らは、さらに、金属キレート剤であるＥＤＴＡの存在（実施例４９参照）が、ホモ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化速度の低下をもたらし、その場合、前記ホモ二量体タンパク質はヘテロ二量体タンパク質の一例として用いられることを見出した。同様に、観察結果はヘテロ二量体タンパク質の状態であるように考えられた（実施例５４）。これにより、工程ｂ）における金属イオンの存在が、少なくとも、金属イオンが存在しない状況と比べて、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化速度を増加させることが示される。よって、さらなる実施形態では、工程ｂ）、例えば、工程ｂ）における酸化条件は、金属イオンを含み得る。金属イオンは、工程ｂ）において、工程ａ）から得た組成物に添加され得るか、または、例えば、工程ａ）におけるバッファーまたは溶液の選択によって、工程ａ）から得た組成物中に存在し得る。従って、一実施形態では、工程ｂ）における酸化条件は、金属イオンを添加することを含む。工程ａ）から得た組成物中に金属イオンが既に存在していたとしても、特に、金属イオンの濃度が、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化の律速となるほど低いならば、または金属キレート剤が存在するならば、工程ｂ）にまたはその間中、さらなる金属イオンが添加され得る。好適な金属イオンの例は、特に、二価遷移金属イオン、例えば、銅、例えば、硫酸銅の形態のもの、マンガン、鉄、ニッケル、マグネシウムおよびコバルト。金属イオンは、好適には、０．０１〜１００ｐｐｍの範囲の濃度、または０．１〜１００μＭで存在し得るか、または添加され得る。銅は、工程ｂ）に、例えば、硫酸銅として添加され得る。

二価遷移金属、例えば、銅、例えば、硫酸銅の形態での添加は、特に、本方法の工程ａ）において金属キレート剤が存在する場合に追加され得る。硫酸銅は、酸素による酸化の触媒として働くことができる。

本発明の発明者らはまた、工程ｂ）における酸化還元電位が、ヘテロ二量体タンパク質中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への再酸化についての、特に、速度だけでなくある程度収率にも影響を及ぼすことを見出した。本発明の発明者らは、重鎖間の鎖間ジスルフィド結合の再酸化はおよそ−３５０ｍＶで開始するのに対して、重鎖と軽鎖との間の鎖間結合の場合はおよそ−２８０ｍＶで開始することを見出した。ヘテロ二量体タンパク質中の全てのジスルフィド結合の完全な形成は、一般的に、酸化還元電位が−５０ｍＶより高くなったときに起こり、同時に、最適なプロセス頑健性を得るには、酸化還元電位は、好ましくは、少なくとも５０ｍＶでなければならない。従って、さらなる実施形態では、工程ｂ）における酸化還元電位は、−３００ｍＶより高く、例えば、−２８０ｍＶより高く、または−７５ｍＶより高く、または−５０ｍＶより高く、または０ｍＶより高く、または２５ｍＶより高く、または５０ｍＶより高くあり得る。ヘテロ二量体タンパク質中のシステインのジスルフィド結合への酸化を得るには、それが適切な酸化還元電位の下限である。工程ｂ）における酸化還元電位の上限は、およそ１００〜３００ｍＶ、例えば、１００〜２００ｍＶ、例えば、およそ１００ｍＶ、またはおよそ２００ｍＶもしくはおよそ２５０ｍＶ、またはおよそ３００ｍＶであり得る。従って、工程ｂ）の酸化還元電位は、−３００ｍＶ〜３００ｍＶの範囲内、または−３００ｍＶ〜２００ｍＶ、または−２８０ｍＶ〜３００ｍＶの範囲内、または−２８０ｍＶ〜２００ｍＶ、または−７５ｍＶ〜３００ｍＶの範囲内、または−７５ｍＶ〜２００ｍＶ、または−５０ｍＶ〜３００ｍＶの範囲内、または−５０ｍＶ〜２００ｍＶ、または０ｍＶ〜３００ｍＶの範囲内、または０ｍＶ〜２００ｍＶ、または２５ｍＶ〜３００ｍＶの範囲内、または２５ｍＶ〜２００ｍＶ、または５０ｍＶ〜３００ｍＶの範囲内、または５０ｍＶ〜２００ｍＶであり得る。

本発明の発明者らは、さらに、工程ａ）から得た組成物が溶液であるの場合の実施形態では、工程ｂ）におけるｐＨもまたヘテロ二量体タンパク質中のシステインのジスルフィド結合への酸化に影響を及ぼすことを見出した。従って、さらなる実施形態では、工程ｂ）におけるｐＨは、特定の実施形態では、ｐＨ６〜８．５の範囲内、例えば、ｐＨ６．５〜８の範囲、またはｐＨ６．５〜８．５の範囲内、またはｐＨ６〜８の範囲内、またはｐＨ６．５〜７．５の範囲、またはｐＨ７〜７．５の範囲、例えば、およそｐＨ７．４であり得る。

工程ｂ）における組成物のｐＨが特定の範囲内、例えばｐＨ６〜８．５にあることの確保は、例えば、好適なｐＨを有する工程ａ）の溶液またはバッファーを選択することにより、あるいはｐＨを調整することができる成分、例えば、濃縮ｐＨ調整溶液を工程ｂ）の組成物に添加することにより行うことができる。工程ｂ）における組成物のｐＨが特定の範囲内にあることの確保は、バッファー交換を含む上記方法の１つを用いることよっても行うことができ、その結果、交換処理を受けたバッファーまたは溶液は適切な範囲内のｐＨを有する。

例えば、工程ａ）から得た組成物が、例えば、ダイアフィルトレーションによって、変化を受ける、工程ｂ）におけるバッファーまたは溶液には、限定されるものではないが、本明細書に記載したもののいずれも、例えば、実施例に記載するもののいずれもが含まれ得る。そのようなバッファーの例としては、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＰＢＳ、ｐＨ７．４が挙げられる。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元の進行は、酸化還元電位をモニタリングすることによりおよび／または溶存酸素の濃度をモニタリングすることにより追跡することができる。そのようなモニタリングのための手段は当業者に周知であり、例えば、異なるタイプのプローブ、例えば、実施例４４に記載するプローブの１つの使用が含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、８０％を超える、例えば、９０％を超える、例えば、９５％を超える、例えば、９９％を超える抗体分子が所望の二重特異性抗体である抗体産物を与える。

本明細書に記載の作出後プロセスは、共発現に基づく方法と比べて、より柔軟性があり、制御しやすい。

精製
本発明の方法は、多くの場合、高収量のヘテロ二量体タンパク質をもたらすが、本発明の方法によって得られた産物または組成物中に残存する第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の量も存在し得る。

さらに、本発明の方法によって得られた産物は、還元剤および／または他の成分、例えば、バッファーまたは塩も含む可能性があり、それらは本方法の間中、存在した。特定の場合には、そのような成分が最終産物中に存在しないようにそれらを除去することが好ましいことがある。

上記のように、還元剤、バッファー成分または塩は、いくつかの実施形態では、本発明の工程ｂ）において除去され得る。これらの成分の除去は、本方法の別の方法として行うことができ、または還元剤の除去と同時に(concomittant with)、例えば、上に記載する方法のいずれによっても、例えば、工程ａ）から得た組成物のバッファー交換を伴う方法のいずれによっても行うことができる。

従って、さらなる実施形態では、本発明の方法は、ヘテロ二量体タンパク質の精製の工程さらに含み得る。ヘテロ二量体タンパク質の精製は、ヘテロ二量体タンパク質を得る工程ｃ）と考えてもよい。従って、一実施形態では、工程ｃ）は工程ｂ）から得た組成物を精製方法に付すことを含む。

好適な精製方法の例としては、限定されるものではないが、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィー（その他のアフィニティークロマトグラフィー様式）、例えば、抗原結合または抗イディオタイプ抗体に基づいた、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、κまたはλ選択、チオ親和性、混合様式クロマトグラフィー、例えば、ハイドロキシアパタイト、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーまたはチオール基吸着クロマトグラフィー（Thiophilic Adsorption Chromatography）からなる群から選択される方法が挙げられる。他の精製方法としては、限定されるものではないが、精製タンパク質を得るための、例えば、塩またはポリエチレングリコールによる沈降が挙げられる。異なる精製方法の組合せも企図される。

ヘテロ二量体タンパク質を精製の工程または精製方法に付すこととは、ヘテロ二量体タンパク質の任意の種類の精製；例えば、残存する第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の量からヘテロ二量体タンパク質を分離すること、あるいは他の成分、例えば、還元剤、塩もしくはバッファー、または他の産物もしくはプロセスに関連する不純物からヘテロ二量体タンパク質を分離することを意味する。

残存する第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の量からのヘテロ二量体タンパク質の精製または分離は、ヘテロ二量体タンパク質が第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質と極めてよく似ていることから困難になるであろう。よって、残存する第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質の量からのヘテロ二量体タンパク質の分離は、存在する他の成分、例えば、還元剤、バッファーまたは塩からのヘテロ二量体タンパク質の分離よりも難しいであろう。

本明細書において他の場所で記載するように、本発明の方法は、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの量がヘテロ二量体タンパク質の形成に関して制限するように行うことができる。そのような方法の例はステアード非等モル交換プロセス（ＳＮＥＥＰ）として知られている。よって、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質の一方が、工程ａ）においてもう一方のホモ二量体タンパク質より過剰に存在し得る。工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質と第２のホモ二量体タンパク質との比率は、特に、一方のホモ二量体タンパク質に対してもう一方のホモ二量体タンパク質の過剰量または制限量を含めることにより調整することができ、その結果、工程ａ）において制限されたホモ二量体タンパク質が完全に使用されることになる。これは、組成物、すなわち、工程ａ）から得られる、ヘテロ二量体タンパク質を、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の両方ではなく、それらの一方だけの残存量とともに含む組成物の作出をもたらす。残存するホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体タンパク質のその後の精製は、それによって容易になるが、それは、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質の両方からではなくそれらの一方からヘテロ二量体タンパク質を分離するだけでよいからである。

従って、一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質は、工程ａ）において第２のホモ二量体タンパク質より過剰に存在する、またはその逆も同様である。第１のホモ二量体タンパク質と第２のホモ二量体タンパク質との比率は、特に、本明細書に記載するとおりであり得る。

さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかを過剰に用いる方法の実施を、定組成溶出の精製工程と組み合わせることができる。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかを過剰に用いる方法の実施を、過剰に用いられたホモ二量体の抗原結合または抗イディオタイプ抗体結合に基づいた精製工程と組み合わせることができる。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体タンパク質の精製または分離は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の相違点に基づいた方法により行うことができる。そのような方法は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質相互の分離を容易にし得、方法によっては、ヘテロ二量体タンパク質からのホモ二量体タンパク質の分離もまた容易にし得る。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の相違点に基づいたそのような精製または分離方法の例としては、限定されるものではないが、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかがプロテインＡまたはプロテインＧと結合しないか、あるいは第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質が異なる軽鎖、例えば、κ軽鎖およびλ軽鎖を含むか、あるいは第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域が異なるアロタイプを含む方法が挙げられる。そのような方法は、ヘテロ二量体タンパク質からの第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの分離を容易にし得る。これは、さらなる実施形態では、定組成溶出の精製工程と組み合わせることができる。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の相違点に基づいた精製または分離方法を、上記のような過剰の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質の使用と組み合わせることができる。その場合、残存するホモ二量体からのヘテロ二量体タンパク質の後の精製または分離は、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の相違点を利用することができ、これは、ヘテロ二量体タンパク質が、制限量で使用されたホモ二量体のＦｃ領域を含む点で残存するホモ二量体とは異なっているためである。

一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかは、プロテインＡもしくはプロテインＧ、またはプロテインＡおよびプロテインＧの組合せと結合しないように操作または改変されていてよい。その場合、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の少なくとも１つからのヘテロ二量体タンパク質の精製または分離は、それをプロテインＡまたはプロテインＧカラムに通すことにより行われ得、このカラムにはヘテロ二量体タンパク質と、プロテインＡまたはプロテインＧ結合に関して改変されていないホモ二量体タンパク質だけが結合する。これは、プロテインＡまたはプロテインＧと結合しない(does not to bind to)ホモ二量体タンパク質のヘテロ二量体タンパク質からの分離を容易にする。第１のホモ二量体タンパク質がプロテインＡと結合せず、第２のホモ二量体タンパク質がプロテインＧと結合しない（またはその逆も同様）場合には、ヘテロ二量体タンパク質を含む組成物をプロテインＡおよびプロテインＧ材料に通すことにより、ヘテロ二量体タンパク質は第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質から分離され得る。第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、本明細書に記載するように、プロテインＡおよび／またはプロテインＧと結合しないように改変されていてよい。これは、ヘテロ二量体タンパク質から還元剤を分離するためにも用いることができる。これは、本明細書に記載するように、他の精製方法と組み合わせることができる。

プロテインＡ、またはプロテインＧ、またはプロテインＡおよびプロテインＧと結合しないように改変されている第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質の、工程ａ）における使用は、特に、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質の一方が、工程ａ）におけるもう一方のホモ二量体タンパク質に対して過剰に用いられる場合の実施形態に有用であり得る。そのような実施形態では、過剰に用いられるホモ二量体タンパク質のプロテインＡまたはプロテインＧ結合部位を、そのような樹脂と結合するその能力が破壊されように操作または改変することが有用であり得る。このタイプの改変としては、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／１５１７９２号に開示されているＣＨ３ドメイン内の改変が挙げられる。よって、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、ＩｇＧのプロテインＡとの結合を減少または消失させる、国際公開第２０１０／１５１７９２号に記載されているＣＨ３ドメイン内の改変の１つ以上を含んでよい。よって、特定の実施形態では、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、限定されるものではないが、ａ）４３５Ｒならびにｂ）４３５Ｒおよび４３６Ｆからなる群から選択される改変を含んでよい。あるいは、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質は、以下の突然変異：Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａを含んでよく、これらの突然変異はプロテインＡとの結合を消失させる。その場合、プロテインＡカラムに通すことにより、交換されなかったホモ二量体タンパク質の余剰分からヘテロ二量体タンパク質を分離することができる。これは、本明細書に記載するように、他の精製方法と組み合わせることができる。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質が軽鎖を含む場合の別の実施形態では、工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の軽鎖は異なっていてよい。例えば、第１のホモ二量体タンパク質はκ軽鎖を含んでよく、第２のホモ二量体タンパク質はλ軽鎖を含んでよく、またはその逆も同様である。その場合、κ軽鎖またはλ軽鎖の一方だけが結合することができる、カラムクロマトグラフィーに好適な材料または樹脂を、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体タンパク質の精製または分離に用いることができる。そのような材料または樹脂の例としては、例えば、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＬａｍｂｄＦａｂＳｅｌｅｃｔとして知られている親和性媒体が挙げられる。異なる軽鎖、例えば、κ軽鎖およびλ軽鎖を含む第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の使用は、工程ａ）においてホモ二量体タンパク質の一方を過剰に使用することと組み合わせることができる。例えば、工程ａ）は、κ軽鎖を含む第１のホモ二量体タンパク質およびλ軽鎖を含む第２のホモ二量体タンパク質を用い、第１のホモ二量体タンパク質が第２のホモ二量体タンパク質より過剰に存在させることにより行うことができる。また、過剰に用いられるのがκ軽鎖を含むホモ二量体タンパク質であるかまたはλ軽鎖を含むホモ二量体タンパク質であるかに関してその逆も同様である。その場合、工程ｃ）は、λ軽鎖だけが結合することができるカラムにヘテロ二量体タンパク質を通すことを含み得る。工程ｃ）は、さらに、残存する、κ軽鎖を含む第１のホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体タンパク質の分離をもたらす。同様に、工程ａ）において過剰に用いられるのがλ軽鎖を含むホモ二量体である場合には、工程ｃ）は、κ軽鎖だけが結合することができるカラムにヘテロ二量体タンパク質を通すことを含んでよい。これは、本明細書に記載するように、他の精製方法と組み合わせることができる。

あるいは、異なる材料に対するκまたはλ軽鎖(kappa of lambda light chains)の結合における相違点に基づいたヘテロ二量体タンパク質の精製または分離は、ホモ二量体タンパク質の一方を過剰に用いることなく行うことができる。この実施形態では、工程ｃ）は、ヘテロ二量体タンパク質を、κ軽鎖が結合する材料に通し、その後、λ軽鎖が結合する材料に通すこと（またはその逆も同様）を含み得る。ヘテロ二量体タンパク質はκ軽鎖およびλ軽鎖の両方を含むが、一方、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質はκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかを含むため、それによって、ヘテロ二量体タンパク質を第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質から分離することができる。これは、本明細書に記載するように、他の精製方法と組み合わせることができる。

第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質が異なる軽鎖、例えば、κ軽鎖およびλ軽鎖を含み、ホモ二量体タンパク質の一方が過剰に用いられる方法により作出されたヘテロ二量体タンパク質についての、非過剰量で用いられるホモ二量体タンパク質の軽鎖が結合する材料にヘテロ二量体タンパク質を通すことによる精製は、本発明とは別のヘテロ二量体タンパク質作出方法に適用することができる。例えば、宿主細胞における重鎖および軽鎖の共発現に基づいた方法または他の方法。

別の実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の定常領域は異なるアロタイプのものであってよい。アロタイプは集団内で自然に見られるアミノ酸配列の変化である。例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖の異なるアロタイプは知られている、Ｇ１ｍ（ｆ）［Ｇ１ｍ（３）とも呼ばれる］、Ｇ１ｍ（ｚ）［Ｇ１ｍ（１７）とも呼ばれる］、Ｇ１ｍ（ａ）［Ｇ１ｍ（１）とも呼ばれる］およびＧ１ｍ（ｘ）［Ｇ１ｍ（２）とも呼ばれる］(Jefferis, R., mAbs 2009; 1:4, 1-7)。よって、本発明の一実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の定常領域は、異なるアロタイプであってよく、例えば、それらはＩｇＧ１アイソタイプであってよく、第１のホモ二量体タンパク質の定常領域は、例えば、ＩｇＧ１ｍ（ｚａ）［＝ＩｇＧ１ｍ（１，１７）］またはＩｇＧ１ｍ（ｚａｘ）［＝ＩｇＧ１ｍ（１，２，１７）］アロタイプであってよい一方で、第２のホモ二量体タンパク質の定常領域は、例えば、ＩｇＧ１ｍ（ｆ）［＝ＩｇＧ１ｍ（３）］またはＩｇＧ１ｍ（ｆａ）［＝ＩｇＧ１ｍ（１，３）］アロタイプであってよい。同様に、κ軽鎖およびλ軽鎖が用いられる場合の上記実施形態のように、異なるアロタイプの定常領域を含む第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の使用は、工程ａ）における第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかの過剰使用と組み合わせることができる。この実施形態では、工程ｃ）は、さらに、過剰に用いられなかったホモ二量体タンパク質中に存在するアロタイプが結合する材料、例えば、アロタイプ特異的抗体でコーティングしたビーズに、ヘテロ二量体タンパク質を通すことを含み得る。それによって、工程ａ）において過剰に用いられたホモ二量体タンパク質からヘテロ二量体タンパク質を精製することができる。これは、本明細書に記載するように、他の精製方法と組み合わせることができる。

代替実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のパーセンテージは工程ａ）において調整されず、それによって、第１のホモ二量体タンパク質も第２のホモ二量体タンパク質も工程ａ）において完全には用いられなかった結果、ヘテロ二量体タンパク質、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質のいずれもを含む組成物の作出がもたらされた。この実施形態では、工程ｃ）は、ヘテロ二量体タンパク質を、アロタイプの一方が結合する材料に通し、その後、もう一方アロタイプが結合する別の材料に通すことを含み得る。これは、本明細書に記載するように、他の精製方法と組み合わせることができる。

ホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体タンパク質の分離と組み合わせた、異なるアロタイプのＦｃ領域を含む第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の使用はまた、本発明の方法とは別のヘテロ二量体タンパク質作出方法にも適用され得る。そのような方法は、第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のいずれかを過剰に使用することをさらに含み得る。そのような方法の例としては、同じ宿主細胞における第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質の共発現に基づいたものが挙げられる。

Ｃ末端リジン
カルボキシペプチダーゼによる重鎖からのＣ末端リジンの除去は、哺乳動物細胞における抗体の組換え発現でも、ｉｎｖｉｖｏにおいてヒト血清でもよく見られる抗体改変である(Cai et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. Sep 9)。除去は部分的であることが多く、Ｃ末端リジンが０（Ｋ０）、１つ（Ｋ１）または２つ（Ｋ２）の抗体の混合集団が生じる。特に、Ｂ細胞ハイブリドーマはＫ０分子、Ｋ１分子およびＫ２分子の混合物を産生する(Dick et al. (2008) Biotech. Bioeng. 100:1132)。

一実施形態では、本発明の方法によって作出されたヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体のＣ末端リジンが除去され得る。「Ｃ末端リジン残基」という用語は、ＣＨ３領域のＣ末端、例えば、抗体の重鎖のＣ末端にあるリジン残基を意味し、ＩｇＧ１ではＣ末端は４４７位である。

Ｃ末端リジンが有し得る様々な効果に加えて、Ｃ末端リジンの除去は、ヘテロ二量体タンパク質、例えば、ヘテロ二量体タンパク質の２つ以上の分子を含む、Ｃ末端リジンの存在に関してより均質な組成物または集団をもたらす。

よって、さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。

Ｃ末端リジンは、Ｃ末端リジンを含まないように第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質を操作することにより、あるいは例えば、酵素触媒作用により、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質からＣ末端リジンを除去することにより、あるいは例えば、酵素触媒作用により、ヘテロ二量体タンパク質からＣ末端リジンを除去することにより除去することができる。

従って、さらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、例えば、重鎖中に、Ｃ末端リジンを含まないように遺伝子改変される。

別の実施形態では、本発明の方法は、例えば、重鎖から、例えば、カルボキシペプチダーゼとのインキュベーションにより、Ｃ末端リジンを除去する工程をさらに含む。

第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質がＣ末端リジンを含まないように操作される場合には、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、
ｉ）第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域をコードしかつ／または第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域を含むヌクレオチド構築物を提供すること、
ここで、前記構築物は、前記第１のＣＨ３領域および／または前記第２のＣＨ３領域のＣ末端にあるリジン残基をコードしない、
ｉｉ）宿主細胞において前記ヌクレオチド構築物を発現させること、
および
ｉｉｉ）前記宿主細胞の細胞培養物から前記第１のホモ二量体タンパク質および／または前記第２のホモ二量体タンパク質を回収すること
によって作出され得る。

第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、一実施形態では、抗体であり得、これは、ほとんどの実施形態では、軽鎖も含み、そのため、宿主細胞は軽鎖をコードする構築物を同じベクターまたは異なるベクターのいずれかにおいてさらに発現し得る。

ヌクレオチド構築物を調製するための方法は当業者に周知である。

同様に、宿主細胞におけるヌクレオチド構築物の発現方法もまた当業者に周知である。

本発明の上記方法のさらなる実施形態では、工程ｉ）において提供されるヌクレオチド構築物は、Ｃ末端リジン残基のコドンを有する元の重鎖配列から誘導されるか、またはＣ末端リジン残基のコドンを有する元の重鎖配列に基づいて設計される。よって、前記ヌクレオチド構築物は、元の重鎖配列と比べて、Ｃ末端リジン残基のコドンの欠失を含み得る。

別の実施形態では、Ｃ末端リジン残基は、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質から、例えば、酵素的切断によって除去され得る。よって、Ｃ末端リジンは、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質が作出された後にそれらから除去され得る。Ｃ末端リジンの酵素的除去方法としては、限定されるものではないが、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質をカルボキシペプチダーゼとのインキュベーションに付すことが挙げられる。従って、例えば、重鎖から、Ｃ末端リジンを除去する工程は工程ａ）の前に行うことができる。よって、本発明の方法は、一実施形態では、工程ａ）の前に第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質をカルボキシペプチダーゼ下におくさらなる工程を含み得る。

同様に、Ｃ末端リジンは、ヘテロ二量体タンパク質からも除去され得る。よって、一実施形態では、本発明の方法は、工程ａ）後に、ヘテロ二量体タンパク質をカルボキシペプチダーゼ下におくさらなる工程を含み得る。この工程は、工程ａ）と工程ｂ）の間であってよく、または工程ｂ）後であってもよい。よって、一実施形態では、例えば、重鎖から、Ｃ末端リジンを除去する工程は工程ａ）の後に行うことができる。別の実施形態では、例えば、重鎖から、Ｃ末端リジンを除去する工程は工程ｂ）の後に行うことができる。原則として、本発明の方法は、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質と、ヘテロ二量体タンパク質の両方をカルボキシペプチダーゼ下におくことを含み得る。しかしながら、ほとんどの用途では、Ｃ末端リジンを除去するために上述の工程の１つを含むことで十分であるはずである。好適なカルボキシペプチダーゼの例としては、限定されるものではないが、カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＮ(Cai et al. Biotechnol. Bioeng. Sep 9 (2010) 前掲)が挙げられる。カルボキシペプチダーゼ処理に好適な条件は当業者に周知である。Ｃ末端リジンを除去するための別の方法は、カルボキシペプチダーゼを発現する宿主細胞において第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質を発現させることである。第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質を宿主細胞培養培地中に、カルボキシペプチダーゼが活性である温度で十分な時間入れておくことによってもＣ末端リジンの除去がもたらされる(Luo JL, Ahang J, Ren D, Tsai W-L, Li F (2102) Probing of C-Terminal Lysine Variation in a Recombinant Monoclonal Antibody Production Using Chinese Hamster Ovary Cells with Chemically Defined Media. Biotechnol. Bioeng. 109:2306-2315)。

核酸配列
さらなる態様において、本発明はまた、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質をコードする核酸配列に関し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。前記第１のホモ二量体タンパク質および前記第２のホモ二量体タンパク質は、本方法に関連して上に記載したもののいずれであってもよい。

さらなる態様では、本発明はまた、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質をコードする発現ベクターに関し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。

なおさらなる実施形態では、本発明はまた、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞に関し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。

本発明に関連する発現ベクターは、染色体核酸ベクター、非染色体核酸ベクターおよび合成核酸ベクター（好適な一連の発現制御エレメントを含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであってよい。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域をコードする核酸配列は、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質がＣ末端リジンを含まない場合、例えば、線状発現エレメントを含む、裸のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクター（例えば、Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)に記載されているとおり）、圧縮された核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号および／または国際公開第００／７００８７号に記載されているとおり）、プラスミドベクター、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８もしくはｐＵＣ１１８／１１９、「ｍｉｄｇｅ」最小サイズ核酸ベクター（例えば、Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)に記載されているとおり）の中に含まれていてよく、または沈殿した核酸ベクター構築物、例えば、ＣａＰＯ４沈殿した構築物として含まれていてよい（例えば、国際公開第００／４６１４７号、Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986)、Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)およびCoraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)に記載されているとおり）。そのような核酸ベクターおよびそれらの使用は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号および同第５，９７３，９７２号参照）。

一実施形態では、ベクターは細菌細胞における発現に好適である。そのようなベクターの例としては、発現ベクター、例えば、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）など）が挙げられる。

発現ベクターは、さらにまたは代わりに、酵母システムにおける発現に好適なベクターであってもよい。酵母系における発現に好適な任意のベクターを採用してもよい。好適なベクターとしては、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨを含むベクターが挙げられる（F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)およびGrant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)に総説されている）。

発現ベクターは、さらにまたは代わりに、哺乳動物細胞における発現に好適なベクター、例えば、選択マーカーとしてグルタミンシンセターゼを含むベクター、例えば、Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175に記載されているベクターであってもよい。

核酸および／またはベクターはまた、分泌／局在配列をコードする核酸配列を含んでよく、それらはポリペプチド、例えば、新生ポリペプチド鎖を、ペリプラズム空間にまたは細胞培養培地中に向けることができる。そのような配列は当技術分野で公知であり、分泌リーダーまたはシグナルペプチドが含まれる。

本発明の発現ベクターにおいて、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質をコードする核酸配列は、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質がＣ末端リジンを含まない場合、任意の好適なプロモーター、エンハンサーおよび他の発現促進エレメントを含んでよくまたは関連付けられていてよい。そのようなエレメントの例としては、強い発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶＩＥプロモーター／エンハンサー、ならびにＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターおよびＨＩＶＬＴＲプロモーター）、有効ポリ（Ａ）ターミネーション配列、大腸菌(E. coli)におけるプラスミド産物の複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または便宜なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。核酸はまた、構成的プロモーターに対する誘導性プロモーター、例えば、ＣＭＶＩＥを含んでよい。

一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターを介して、宿主細胞または宿主動物の中に位置付けられ、および／または送達され得る。

なおさらなる態様では、本発明は、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質を産生する組換え真核宿主細胞または原核宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマに関し、ここで、本明細書において定義されるように、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。宿主細胞の例としては、酵母細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞が挙げられる。例えば、一実施形態では、本発明は、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質のＦｃ領域の発現をコードする配列を含む、細胞ゲノムに安定に組み込まれる核酸を含む細胞を提供し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。別の実施形態では、本発明は、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質の発現をコードする配列を含む、組み込まれない核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線状発現エレメントを含む細胞を提供し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。

さらなる態様において、本発明は、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質を産出するハイブリドーマに関し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まない。なおさらなる態様では、本発明は、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質をコードする核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物または植物に関し、ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質または前記第２のホモ二量体タンパク質はＣ末端リジンを含まず、この場合、前記動物または植物は、Ｃ末端リジンを含まない、本発明の第１のホモ二量体タンパク質または第２のホモ二量体タンパク質を産生する。

ヘテロ二量体タンパク質
本発明はまた、本発明の方法によって得られたヘテロ二量体タンパク質に関する。

本発明の方法は、非対称分子、各Ｆａｂアーム上もしくは各ＣＨ３ドメイン上に異なる特徴を有する分子、または分子全体にわたって独特な改変を有する分子、例えば、コンジュゲーションのために非天然アミノ酸置換を有する分子の形成を可能にする。そのような非対称分子は任意の好適な組合せで生成することができる。これはいくつかの限定されない例により下にさらに例示する。

二重特異性抗体を用いて、限定されるものではないが、腫瘍細胞を含む、対象となる標的細胞へ造影剤または免疫治療薬を送達することができる。

本発明の方法の実施形態では、二重特異性分子の第１のＦａｂアームは、腫瘍細胞、例えば、腫瘍細胞表面タンパク質または腫瘍細胞表面炭水化物、例えば、本明細書において記載する腫瘍細胞表面タンパク質の１つと結合し、第２のＦａｂアームは放射性エフェクター分子を認識し、放射性エフェクター分子には、限定されるものではないが、ペプチドまたはハプテンと（キレート剤を介して）カップリングまたは連結された放射性標識が含まれる。そのような放射性標識ペプチドの例はインジウム標識ジエチレントリアミン五酢酸(anti-DTPA(In) van Schaijk et al. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 7230s-7126s)である。別の例はハプテン標識コロイド粒子、例えば、リポソーム、例えば、テクネチウム−９９などの放射性核種を保有する高分子ミセルのナノ粒子の使用である(Jestin et al. Q J Nucl Med Mol Imaging 2007; 51:51-60)。

別の実施形態では、第２のＦａｂアームによって認識されるエフェクター分子として、ハプテンがカップリングした別の細胞増殖抑制分子、例えば、毒素が用いられる。

本発明の方法のさらなる実施形態では、二重特異性分子の第１のＦａｂアームはＮ２９７の位置（ＥＵナンバリング）でグリコシル化され、二重特異性分子の第２のＦａｂアームは無グリコシル化される（例えば、Ｎ２９７をＱまたはＡまたはＥ変異へ突然変異させることにより、非グリコシル化される(Bolt S et al., Eur J Immunol 1993, 23:403-411)）。Ｆｃ領域における非対称グリコシル化はＦｃγ−受容体との相互作用に影響を与え、抗体の抗体依存性細胞傷害性効果(Ha et al., Glycobiology 2011, 21(8): 1087-1096)だけでなく、他のエフェクター機能分子、例えば、Ｃ１ｑとの相互作用にも影響を及ぼす。

本発明の方法の別の実施形態では、二重特異性分子の第１のＦａｂアームは、新生児Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎと相互作用し(Roopenian DC, et al. Nat. Rev. Immunol. 2007, 7:715-725、第２のＦａｂアームは、前記分子のＦｃＲｎ相互作用部位の突然変異により、例えば、Ｈ４３５Ａ突然変異を引き起こすことによりＦｃＲｎとの結合が損なわれている (Shields, R.L., et al, J Biol Chem, 2001, Firan, M., et al, Int Immunol, 2001)。

別の実施形態では、Ｃ１ｑとの結合が二重特異性分子の２つのＦａｂアームの一方において改善または低減される。

別の実施形態では、二重特異性分子の２つのＦａｂアームの一方または両方において補体活性化を増強するようにタンパク質が操作されている。

別の実施形態では、二重特異性分子中に存在する各Ｆａｂアームは異なるＩｇＧサブクラスに由来する。

別の実施形態では、二重特異性分子中に存在する各Ｆａｂアームは異なるアロタイプ変異を保有する(Jefferis & Lefranc, 2009, MABs 1 :332-8)。

別の実施形態では、別のカテゴリーの免疫治療用非対称分子は、免疫活性、免疫刺激または免疫抑制サイトカインによる二重特異性分子のＦａｂアームの一方のＦａｂの置き換えによって生成される。そのようなサイトカインの限定されない例はＩＬ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３である。あるいは、増殖因子またはホルモン促進剤もしくは阻害剤も分子に含まれる。

別の実施形態では、Ｆａｂアームの一方のＦａｂは、細胞溶解性ペプチド、すなわち、限定されるものではないが、マゲイニン、メリチン、セクロピン、ＫＬＡＫＫＬＡＫおよびそれらの変種のような抗微生物ペプチドを含む、腫瘍細胞、細菌、真菌などを溶解することができるペプチド(Schweizer et al. Eur. J. Pharmacology 2009; 625: 190-194、Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39: 3107-3113、Marks et al, Cancer Res 2005; 65:2373-2377、Rege et al, Cancer Res. 2007; 67:6368-6375)または陽イオン性細胞溶解性ペプチド（CLYP technology、米国特許出願第２００９／０２６９３４１号）によって置き換えられる。

別の実施形態では、ＦａｂアームのＦａｂの一方または両方は、サイトカインおよび／または増殖因子の受容体によって置き換えられ、いわゆるデコイ受容体が生み出される。このうち、ＴＮＦ−αを標的とするエンブレル(登録商標)（エタネルセプト）、およびＶＥＧＦを標的とするＶＥＧＦ−ｔｒａｐが周知の例である。これら２つのデコイ受容体を組み合わせて１つの分子にすることにより、単一のデコイ受容体と比べて優れた活性が示された(Jung, J.Biol. Chem. 2011; 286:14410-14418)。

別の実施形態では、別のカテゴリーの免疫治療用非対称分子は、二重特異性分子中に存在するＦａｂアームの一方または両方のＮ末端またはＣ末端との免疫活性、免疫刺激または免疫抑制サイトカインの融合により生成される。これは二重特異性分子の抗腫瘍活性にプラスの影響を与え得る。しかしながら、そのような分子の例は、下のリストに限定されるものではないが、ＩＬ−２(Fournier et al., 2011, Int. J. Oncology, doi: 10.3892/ijo.2011.976)、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γ(Huan et al., 2007; J.Immunol. 179:6881-6888、Rossie et al., 2009; Blood 114: 3864-3871)、ＴＮＦ−αである。あるいは、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６またはＩＬ−１３などのサイトカインのＮ末端またはＣ末端融合は、二重特異性抗体分子エフェクター機能にプラスの影響を与え得る。あるいは、増殖因子またはホルモン促進剤もしくは阻害剤はＮ末端またはＣ末端において分子に含まれる。

別の実施形態では、Ｆａｂアーム(the Fab-ams)の一方または両方における、例えば、マゲイニン、メリチン、セクロピン、ＫＬＡＫＫＬＡＫおよびそれらの変種のような抗微生物ペプチドなどの細胞溶解性ペプチド(Schweizer et al. Eur. J. Pharmacology 2009; 625: 190-194、Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39: 3107-3113、Marks et al, Cancer Res 2005; 65:2373-2377、Rege et al, Cancer Res. 2007; 67:6368-6375)または陽イオン性細胞溶解性ペプチド（CLYP technology、米国特許出願第２００９／０２６９３４１号）のＮ末端またはＣ末端融合は分子の活性を増強し得る。

別の実施形態では、別のカテゴリーの免疫治療用非対称分子は一価抗体、すなわち、選択標的に対する一方のＦａｂアームと相互作用する分子である。そのような分子では、二重特異性分子中に存在するＦａｂアームの一方は選択標的分子に対して向けられ、前記分子の第２のＦａｂアームはＦａｂを保有しないかまたはＭｅｔＭａｂ（Genentech；国際公開第９６／３８５５７号）について記載されているような非結合性／非機能性Ｆａｂを有する。あるいは、単量体Ｆｃ融合タンパク質、例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子について記載されているもの(Peters et al., Blood 2010; 115: 2057-2064)を生成することができる。

あるいは、上述の非対称分子のいずれかの組合せを本発明の方法により生成することができる。

本発明の方法によって作出されたヘテロ二量体タンパク質は、第１のＣＨ３領域を含む第１の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第１のポリペプチドと、第２のＣＨ３領域を含む第２の免疫グロブリンＦｃ領域を含む第２のポリペプチドを含み得、ここで、前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、
ここで、前記第１のホモ二量体タンパク質は、４０９位に、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、前記第２のホモ二量体タンパク質は、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ／または
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、各ＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例２１に記載のようにアッセイした場合に、０．０１〜１０マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１０マイクロモル濃度の間、より好ましくは、０．０１〜５の間、例えば、０．０５〜５マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、０．０１〜１マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１マイクロモル濃度の間、０．０１〜０．５の間または０．０１〜０．１の間であるようなものである。

一実施形態では、第１のＣＨ３領域は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のＣＨ３領域は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸を有し、
かつ／あるいは
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は、各ＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例２１に記載のようにアッセイした場合に、０．０１〜１０マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１０マイクロモル濃度の間、より好ましくは、０．０１〜５の間、例えば、０．０５〜５マイクロモル濃度の間、さらに好ましくは、０．０１〜１マイクロモル濃度の間、例えば、０．０５〜１マイクロモル濃度の間、０．０１〜０．５の間または０．０１〜０．１マイクロモル濃度の間であるようなものである。

ヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のＣＨ３領域は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸、例えば、４０５位にＰｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｙ以外のものを有し、
あるいは
第１のＣＨ３領域は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のＣＨ３領域は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｈｒ以外のアミノ酸を有する。

さらなる実施形態では、本発明によるヘテロ二量体タンパク質は、作出方法について上に記載したさらなる特徴のいずれかを含む。

よって、本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドは抗体、好ましくは、ヒト抗体の全長重鎖である。

本発明のヘテロ二量体タンパク質の別の実施形態では、第２のポリペプチドは抗体、好ましくは、ヒト抗体の全長重鎖である。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドはともに、２つの抗体、好ましくは、ともに、異なるエピトープと結合するヒト抗体の全長重鎖であり、よって、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質は二重特異性抗体である。この二重特異性抗体は、重鎖抗体、または重鎖に加えて、同一であってもまたは異なってもよい２つの全長軽鎖を含む抗体であり得る。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプ（特定の突然変異を除く）のものに由来するＦｃ領域と類似もしくは同一であり、第２のポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプ（特定の突然変異を除く）のものである。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のＣＨ３領域は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸および４０９位にＬｙｓを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のＣＨ３領域は４０５位にＬｅｕおよび４０９位にＬｙｓを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のＣＨ３領域は４０５位にＬｅｕおよび４０９位にＬｙｓを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は４０９位にＬｙｓ、ＬｅｕまたはＭｅｔ以外のアミノ酸を含み、第２のＣＨ３領域は４０９位にＬｙｓ、ならびにａ）３５０位にＩｌｅおよび４０５位にＬｅｕ、またはｂ）３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は４０９位にＡｒｇを含み、第２のＣＨ３領域は４０９位にＬｙｓ、ならびにａ）３５０位にＩｌｅおよび４０５位にＬｅｕ、またはｂ）３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は３５０位にＴｈｒ、３７０位にＬｙｓ、４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のＣＨ３領域は４０９位にＬｙｓ、ならびにａ）３５０位にＩｌｅおよび４０５位にＬｅｕ、またはｂ）３７０位にＴｈｒおよび４０５位にＬｅｕを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のＣＨ３領域は３５０位にＴｈｒ、３７０位にＬｙｓ、４０５位にＰｈｅおよび４０９位にＡｒｇを含み、第２のＣＨ３領域は３５０位にＩｌｅ、３７０位にＴｈｒ、４０５位にＬｅｕおよび４０９位にＬｙｓを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドも第２のポリペプチドもヒンジ領域内にＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ配列を含まない。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドはどちらもヒンジ領域内にＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ配列を含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドは、Ａｓｎ結合型グリコシル化のアクセプター部位を取り除く突然変異を含む。

標的抗原
上に説明したように、本発明の重要な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、結合特異性が異なる、すなわち、異なるエピトープと結合する２つの可変領域を含む二重特異性抗体である。

原則として、特異性の任意の組合せが可能である。上述のように、モノクローナル抗体療法の有効性をさらに高めるために、二重特異性抗体を潜在的に用いることができる。単一特異性抗体について考えられる制約の１つは、抗体結合が望まれない他の細胞種での標的抗原の発現により所望の標的細胞に対する特異性が欠如していることである。例えば、腫瘍細胞で過剰発現される標的抗原は健常組織において発現されることもあり、そしてそのことから、その抗原に対して向けられた抗体での治療により望ましくない副作用を引き起こし得る。標的細胞タイプで排他的に発現されるタンパク質に対してさらなる特異性を有する二重特異性抗体は腫瘍細胞との特異的結合を潜在的に改善し得る。

従って、一実施形態では、ホモ二量体タンパク質はともに抗体であり、ここで、第１の抗体および第２の抗体は同じ腫瘍細胞の異なるエピトープと結合する。

別の実施形態では、ホモ二量体タンパク質はともに抗体であり、ここで、第１の抗体は腫瘍細胞のエピトープと結合し、もう一方の抗体は、目的とする用途に関連のあるｉｎｖｉｖｏ結合活性のない無関係のまたは不活性な抗体と結合する。

よって、本発明の一実施形態では、第１のエピトープおよび第２のエピトープは同じ細胞、例えば、腫瘍細胞に位置する。腫瘍細胞における好適な標的としては、限定されるものではないが、以下のもの：ｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＭＵＣ−１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ５、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲＶエンベロープタンパク質、ペリオスチン、Ｂｉｇｈ３、ＳＰＡＲＣ、ＢＣＲ、ＣＤ７９、ＣＤ３７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＡＸＬ、組織因子（ＴＦ）、ＣＤ７４、ＥｐＣＡＭおよびＭＲＰ３が挙げられる。腫瘍細胞標的の考えられる組合せとしては、限定されるものではないが、ｅｒｂＢ１＋ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ２＋ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ１＋ｅｒｂＢ３、ＣＤ１９＋ＣＤ２０、ＣＤ３８＋ＣＤ３４、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５、ＣＤ３８＋ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８＋ＣＸＣＲ４、ＣＤ２０＋ＣＸＣＲ４、ＣＤ２０＋ＣＣＲ７、ＣＤ２０＋ＣＸＣＲ５、ＣＤ２０＋ＲＡＮＫＬ、ｅｒｂＢ２＋ＡＸＬ、ｅｒｂＢ１＋ｃＭｅｔ、ｅｒｂＢ２＋ｃ−Ｍｅｔ、ｅｒｂＢ２＋ＥｐＣＡＭ、ｃ−Ｍｅｔ＋ＡＸＬ、ｃ−Ｍｅｔ＋ＴＦ、ＣＤ３８＋ＣＤ２０、ＣＤ３８＋ＣＤ１３８が挙げられる。

さらなる実施形態では、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、同じ標的抗原に位置してよく、ここで、標的抗原における２つのエピトープの位置は、一方のエピトープとの抗体の結合がもう一方のエピトープとの抗体結合を妨げないようなものである。これについてのさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、同じ標的抗原に位置する２つの異なるエピトープと結合するが、標的細胞、例えば、腫瘍細胞の死滅に関して異なる作用様式を有する抗体である。例えば、一実施形態では、標的抗原はｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）であり、二重特異性抗体はペルツズマブおよびトラスツズマブの抗原結合部位を兼ね備える。別の実施形態では、標的抗原はｅｒｂＢ１（ＥＧＦｒ）であり、二重特異性抗体はザルツムマブおよびニモツズマブの抗原結合部位を兼ね備える。

二重特異性抗体はまた、エフェクター機構を疾患関連組織、例えば、腫瘍に新たに向けるためのメディエーターとして用いることもできる。よって、さらなる実施形態では、第１のエピトープまたは第２のエピトープは腫瘍細胞、例えば、腫瘍細胞タンパク質または腫瘍細胞炭水化物に位置し、他方のエピトープはエフェクター細胞に位置する。

一実施形態では、エフェクター細胞はＴ細胞である。

エフェクター細胞における考えられる標的としては、以下のもの：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）（単球およびマクロファージならびに活性化好中球において発現される）；ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（ナチュラルキラーおよびマクロファージにおいて発現される）；ＣＤ３（循環Ｔ細胞において発現される）；ＣＤ８９（ＰＭＮ（多形核好中球）、好酸球、単球およびマクロファージにおいて発現される）；ＣＤ３２ａ（マクロファージ、好中球、好酸球において発現される）；ＦｃεＲＩ（好塩基球および肥満細胞において発現される）が挙げられる。一実施形態では、エピトープは、Ｔ細胞において発現されるＣＤ３に位置する。

別の実施形態では、第１の抗体は病原微生物に対する結合特異性を有し、第２の抗体はエフェクター細胞タンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ８９、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＦｃεＲＩまたはＣＤ１に対する結合特異性を有する。

さらに、二重特異性抗体を用いて、化学療法薬を、前記薬剤が作用すべき細胞により特異的に向けることができる。よって、一実施形態では、ホモ二量体タンパク質の一方は、小分子もしくはペプチドを認識するか、または、例えば、Rader et al, (2003) PNAS 100:5396に記載されている原理に従って、そのような分子と共有結合を形成することができる抗体である。本発明の方法のさらなる実施形態では、第１の抗体は腫瘍細胞または腫瘍細胞表面タンパク質、例えば、ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＥＧＦＲ３ｖＩＩＩ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４、ＣＤ３８、ＥｐＣＡＭ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＸＬ、Ｌ１−ＣＡＭ、組織因子、ＣＤ７４またはＣＸＣＲ５に対する結合特異性を有し（すなわち、それらにおけるエピトープと結合し）、第２の抗体は化学療法薬、例えば、毒素（放射性標識ペプチドを含む）、放射性アイソタイプ(radioisotype)、所望により、ペプチドまたはハプテンとカップリングまたは連結されていてよい薬物またはプロドラッグに対する結合特異性を有する。

二重特異性抗体はまた、毒素、薬物もしくはプロドラッグを含有するベシクル、例えば、高電子密度ベシクルまたはミニ細胞を腫瘍に向けるためにも用いることができる。例えばMacDiarmid et al. (2009) Nature Biotech 27:64参照。ミニ細胞は、染色体ＤＮＡを含まない、異常な細胞分裂の産物である無染色体細胞である。よって、別の実施形態では、第１のエピトープまたは第２のエピトープは、腫瘍細胞、例えば、腫瘍細胞タンパク質または腫瘍細胞炭水化物に位置し、他方のエピトープは、高電子密度ベシクルまたはミニ細胞に位置する。

さらに、二重特異性抗体中に血清タンパク質に対する結合特異性を含めることにより抗体の血清半減期を変えることができる。例えば、二重特異性抗体中に血清アルブミンに対する結合特異性を含めることにより、血清半減期を延長することができる。よって、本発明の方法のさらなる実施形態では、第１の抗体は腫瘍細胞または腫瘍細胞タンパク質、例えば、ｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＭＵＣ−１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ５、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲＶエンベロープタンパク質、ペリオスチン、Ｂｉｇｈ３、ＳＰＡＲＣ、ＢＣＲ、ＣＤ７９、ＣＤ３７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＡＸＬ、組織因子（ＴＦ）、ＣＤ７４、ＥｐＣＡＭまたはＭＲＰ３、ＣＥＡに対する結合特異性を有し、第２の抗体は血液タンパク質、例えば、血清アルブミンに対する結合特異性を有する。また、第２の結合特異性を用いて、特定の組織、例えば、中枢神経系または脳（血液脳関門を越えて）に抗体を向けることができる。よって、本発明の方法のさらなる実施形態では、第１の抗体は脳特異的な標的、例えば、アミロイド−β（例えば、アルツハイマー病の治療の場合）、Ｈｅｒ−２（例えば、脳における乳癌転移の治療の場合）、ＥＧＦＲ（例えば、原発性脳腫瘍の治療の場合）、ＮｏｇｏＡ（例えば、脳損傷の治療の場合）、ＴＲＡＩＬ（例えば、ＨＩＶの治療の場合）、α−シヌクレイン（例えば、パーキンソン病の治療の場合）、Ｈｔｔ（例えば、ハンチントンの治療の場合）、プリオン（例えば、狂牛病の治療の場合）、ウエストナイルウイルスタンパク質に対する結合特異性を有し、第２の抗体は血液脳関門タンパク質、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、メラノトランスフェリン受容体（ＭＴｆＲ）、ラクトフェリン受容体（ＬｆＲ）、アポリポタンパク質Ｅ受容体２（ＡｐｏＥＲ２）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質１および２（ＬＲＰ１およびＬＲＰ２）、糖化最終産物の受容体（ＲＡＧＥ）、ジフテリア毒素受容体＝ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＤＴＲ＝ＨＢ−ＥＧＦ）、ｇｐ１９０(Abbott et al, Neurobiology of Disease 37 (2010) 13-25)に対する結合特異性を有する。

また、血液脳関門タンパク質に対する結合特異性を用いて、別の非抗体分子を特定の組織、例えば、中枢神経系または脳（血液脳関門を越えて）に向けることもできる。よって、さらなる実施形態では、ホモ二量体タンパク質の一方は血液脳関門タンパク質（例えば、ＴｆＲ、インスリン受容体、ＭＴｆＲ、ＬｆＲ、ＡｐｏＥＲ２、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、ＲＡＧＥ、ＤＴＲ（＝ＨＢ−ＥＧＦ）またはｇｐ１９０）に対する結合特異性を有する全長抗体であり、もう一方のホモ二量体タンパク質は別のタンパク質、例えば、サイトカイン、可溶性受容体または他のタンパク質、例えば、ＶＩＰ（血管作用性小腸ペプチド）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、複数のＦＧＦ、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ＮＴ−４／５、グリア由来神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子、ニュールツリン、ニューレグリン、インターロイキン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、エリスロポエチン、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、アルテミン、パーセフィン、ネトリン、カルジオトロフィン−１、幹細胞因子、ミドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質、サポシン、セマフォリン、白血球阻害因子、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−６−スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸α−グルコシダーゼまたはスフィンゴミエリナーゼとＮ末端またはＣ末端において連結されたＦｃ領域である(Pardridge, Bioparmaceutical drug targeting to the brain, Journal of Drug Targeting 2010, 1-11; Pardridge, Re-engineering Biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses. Bioconjugate Chemistry 2008, 19: 1327-1338)。

本発明の方法のさらなる実施形態では、第１の抗体は腫瘍細胞または腫瘍細胞タンパク質、例えば、ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＭＵＣ−１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４またはＣＸＣＲ５に対する結合特異性を有し、第２の抗体は血液凝固に関与するタンパク質、例えば、組織因子に対する結合特異性を有する。

さらなる特に興味深い結合特異性の組合せとしては、以下もの：ＣＤ３＋ＨＥＲ２、ＣＤ３＋ＣＤ２０、ＩＬ−１２＋ＩＬ１８、ＩＬ−１ａ＋ＩＬ−１ｂ、ＶＥＧＦ＋ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ３、ＧＤ２＋ＣＤ３、ＧＤ３＋ＣＤ３、ＨＥＲ２＋ＣＤ６４、ＥＧＦＲ＋ＣＤ６４、ＣＤ３０＋ＣＤ１６、ＮＧ２＋ＣＤ２８、ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３、ＣＤ２０＋ＣＤ２８、ＨＥＲ２＋ＣＤ１６、Ｂｃｌ２＋ＣＤ３、ＣＤ１９＋ＣＤ３、ＣＥＡ＋ＣＤ３、ＥＧＦＲ＋ＣＤ３、ＩｇＥ＋ＣＤ３、ＥｐｈＡ２＋ＣＤ３、ＣＤ３３＋ＣＤ３、ＭＣＳＰ＋ＣＤ３、ＰＳＭＡ＋ＣＤ３、ＴＦ＋ＣＤ３、ＣＤ１９＋ＣＤ１６、ＣＤ１９＋ＣＤ１６ａ、ＣＤ３０＋ＣＤ１６ａ、ＣＥＡ＋ＨＳＧ、ＣＤ２０＋ＨＳＧ、ＭＵＣ１＋ＨＳＧ、ＣＤ２０＋ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ７９、ＰＤＧＦＲ＋ＶＥＧＦ、ＩＬ１７ａ＋ＩＬ２３、ＣＤ３２ｂ＋ＣＤ２５、ＣＤ２０＋ＣＤ３８、ＨＥＲ２＋ＡＸＬ、ＣＤ８９＋ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ３８＋ＣＤ１３８、ＴＦ＋ｃ−Ｍｅｔ、Ｈｅｒ２＋ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ＋ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ＋ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｅｔ＋非結合性アームおよびＧタンパク質共役受容体の組合せが挙げられる。

さらなる実施形態では(In a futher embodiment)、本発明による二重特異性抗体を用いて、本質的には、Taylor et al. J. Immunol. 158:842-850 (1997)およびTaylor and Ferguson, J. Hematother. 4:357-362, 1995に記載されているように、赤血球に向けることにより、循環から病原体、病原性自己抗体または有害化合物、例えば、毒液および毒素を取り除くことができる。第１のエピトープは、限定されるものではないが、赤血球補体受容体１を含む、赤血球タンパク質に位置し、第２のエピトープは、クリアランスの標的とされる化合物または生物に位置する。

さらなる実施形態では、第２のＦａｂアームは融合タンパク質を含み、自己抗原またはｄｓＤＮＡなどの自己抗原を付着するコンジュゲーション部位を提示する。従って、本発明の二重特異性抗体による病原体、自己抗体または有害化合物のターゲッティングと、その後の、赤血球媒介によるクリアランスは、様々な疾患および症候群の治療において治療的有用性を有し得る。

コンジュゲーション
本発明のさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、以下からなる群から選択される化合物と連結される：毒素（放射性同位元素を含む）、プロドラッグまたは薬物。そのような化合物は、例えば、癌療法において、より効果的に標的細胞を死滅させることができる。従って、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質は免疫複合体である。あるいは、化合物を、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質と、すなわち、Ｆａｂアーム交換が行われた後にカップリングしてもよい。

従って、さらなる実施形態では、本発明の方法は、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質を別の化合物、例えば、毒素、プロドラッグまたは薬物と連結またはコンジュゲートする工程をさらに含む。

あるいは、本発明の方法は、ヘテロ二量体タンパク質を別の化合物、例えば、毒素、プロドラッグまたは薬物と連結またはコンジュゲートする工程をさらに含む。

本明細書において他の場所で記載するように、第１のホモ二量体タンパク質および第２のホモ二量体タンパク質は、異なる化合物とコンジュゲートすることができ、それによって、２つの異なる化合物；例えば、毒素、プロドラッグおよび／または薬物とコンジュゲートしているヘテロ二量体タンパク質の作出がもたらされる。これは、第１の化合物のコンジュゲーション方法が第２の化合物のコンジュゲーション方法と適合しない場合に特に有用であり得る。異なる化合物は、例えば、２つの異なる毒素、または２つの異なるプロドラッグ、または２つの異なる薬物であってよく、あるいは一方の化合物が毒素であり、もう一方がプロドラッグもしくは薬物であってよく、あるいは一方の化合物がプロドラッグであり、もう一方が薬物であってよい。任意の好適な組合せを用いてよい。

あるいは、本発明の方法は、還元酸化を用いてヘテロ二量体タンパク質の形成と毒素のコンジュゲーションを組み合わせることを含む。

本発明の免疫複合体の形成に好適な化合物としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロ−テストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン(decarbazine)、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ(thioepa)、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよび他の白金誘導体、例えば、カルボプラチン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、ジフテリア毒素および関連分子（例えば、ジフテリアＡ鎖およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子）、リシン毒素（例えば、リシンＡまたは脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素）、コレラ毒素、志賀毒素様毒素（ＳＬＴ−Ｉ、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬＴ−ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風菌毒素、大豆ボーマン・バ−クプロテアーゼ阻害剤、緑膿菌外毒素、アロリン(alorin)、サポリン、モデシン、ゲルニン(gelnin)、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolacca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ならびにエノマイシン毒素が挙げられる。他の好適なコンジュゲート分子としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素、緑膿菌内毒素、マイタンシノイド、オーリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、カリケアマイシンおよびデュオカルマイシン類似体(Ducry and Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21: 5-13)、ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、イリノテカンまたはその活性代謝産物ＳＮ３８、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ’ｓ）が挙げられる。

本発明のさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、限定されるものではないが、トリウム−２２７、ラジウム−２２３、ビスマス−２１２およびアクチニウム−２２５を含むアルファ放射体と連結される。

本発明のさらなる実施形態では、第１のホモ二量体タンパク質および／または第２のホモ二量体タンパク質は、限定されるものではないが、ヨウ素−３１３、イットリウム−９０、フッ素−１８、レニウム−１８６、ガリウム−６８、テクネチウム−９９、インジウム−１１１およびルテチウム−１７７を含むベータ放射性核種と連結される。

別の実施形態では、コンジュゲートされる化合物は核酸または核酸関連分子を含む。本発明のそのような一様相では、コンジュゲートされる核酸は細胞毒性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、阻害ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）または免疫刺激核酸（例えば、免疫刺激ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子）である。

Hunter et al., Nature 144, 945 (1962)、David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974)、Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981)およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)により記載されている方法を含め、当技術分野で公知の任意のコンジュゲート方法を採用することができる。コンジュゲート体は、他の部分を、タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側と化学的にコンジュゲートすることによって作出することができる（例えば、抗体工学入門(Antibody Engineering Handbook)、金光修編、地人書館出版(1994)参照）。そのようなコンジュゲート抗体誘導体は、必要に応じて、内部の残基または糖でのコンジュゲーションにより生成することができる。薬剤は本発明のタンパク質と直接的にまたは間接的にカップリングすることができる。第２の薬剤の間接的カップリングの一例はスペーサー部分によるカップリングである。薬物コンジュゲート体の連結技術は最近、Ducry and Stump (2010) Bioconjugate Chem. 21: 5によって要約されている。

組成物および使用
本発明の方法によって作出されたヘテロ二量体タンパク質は、製薬上許容される担体を含む医薬組成物において用いることができる。

医薬組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されているものなどの従来の技術に従って製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、希釈剤、増量剤、塩、バッファー、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０もしくはＴｗｅｅｎ−８０）、安定剤（例えば、糖またはタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または医薬組成物中に含めるのに好適な他の材料を含むことができる。

医薬上許容される担体には、本発明の化合物と生理学的に適合するあらゆる好適な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張化剤、酸化防止剤ならびに吸収遅延剤などが含まれる。本発明の医薬組成物において採用することができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）が挙げられる。医薬上許容される担体には、無菌の水溶液または分散液および無菌の注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌の粉末が含まれる。適正な流動性は、例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。

本発明の医薬組成物はまた、医薬上許容される酸化防止剤、例えば、（１）水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；ならびに（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸なども含むことができる。

本発明の医薬組成物はまた、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、グリセロールまたは塩化ナトリウムも組成物中に含むことができる。

本発明の医薬組成物はまた、医薬組成物の有効期限または有効性を向上させることができる、選択投与経路に適当な１種以上の補助薬、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、防腐剤またはバッファーも含むことができる。本発明の化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出性製剤のように、化合物の迅速な放出を防ぐ担体を用いて調製することができる。そのような担体は、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリル、単独もしくは蝋を伴う生体分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸、または当技術分野で周知の他の材料を含むことができる。そのような製剤の調製のための方法は、一般的に、当業者に公知である。

無菌の注射用溶液は、必要な量の活性化合物を適当な溶媒に、必要に応じて、例えば、上に列挙した成分の１つまたは組合せとともに配合し、続いて精密濾過除菌を行うことにより調製することができる。

医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって有害でなく、特定の患者、組成物および投与様式で望まれる治療効果を達成するのに有効な有効成分の量を得るように変更することができる。選択される投与量レベルは、採用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時期、採用される特定の化合物の排出速度、処置期間、採用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物および／または材料、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、病態、健康状態および過去の病歴、ならびに医学分野において周知の同様な因子を含む、様々な薬物動態因子に応じて異なる。

医薬組成物は、任意の好適な経路および様式によって投与することができる。一実施形態では、本発明の医薬組成物は非経口的に投与される。本明細書において用いられる「非経口的に投与される」とは、経腸投与および局所投与以外の投与様式、通常は注射による投与様式を意味し、これには、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。

一実施形態では、医薬組成物は静脈内または皮下の注射または注入により投与される。

主要な態様では、本発明は、医薬として用いる、本発明によるヘテロ二量体タンパク質、例えば、本発明による二重特異性抗体に関する。本発明のヘテロ二量体タンパク質は複数の用途に用いることができる。特に、上に説明したように、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、転移性癌および難治性癌を含む、様々な形態の癌の治療に用いることができる。

よって、一態様では、本発明は、腫瘍細胞の成長および／もしくは増殖を阻害するための、ならびに／または腫瘍細胞を死滅させるための方法に関し、前記方法は、本明細書に記載する本発明によるヘテロ二量体タンパク質を、それを必要する個体へ投与することを含む。

別の実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は免疫疾患および自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、心血管疾患、ＣＮＳならびに筋骨格疾患の治療に用いられる。

上記の治療および使用の方法における投与方式は、最適な所望の効果（例えば、治療効果）を与えるように調整される。例えば、単回のボーラスを投与してよく、数回の分割用量を経時的に投与してよく、または治療状況の必要性により指定されるように、用量を比例的に増減してもよい。

ヘテロ二量体タンパク質についての有効な投与量および投与方式は、治療される疾患または状態に応じて異なり、当業者によって判断され得る。本発明の二重特異性抗体の治療上有効な量の例示的な、限定されない範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、または約８ｍｇ／ｋｇである。

当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、製剤化することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物において採用されるヘテロ二量体タンパク質の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルより低いレベルで始め、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができるであろう。一般的に、本発明の組成物の好適な用量は治療効果をもたらすのに有効な最少用量である化合物の量となる。投与は、例えば、非経口的、例えば、静脈内、筋肉内または皮下などであってよい。

本発明のヘテロ二量体タンパク質はまた、疾患、例えば、癌を発症する危険性を低下させ、疾患進行における事象の発生の始まりを遅らせ、および／または疾患、例えば、癌が寛解期にある場合には、再発の危険性を低下させるために予防的に投与することもできる。

本発明のヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体はまた、併用療法において投与することもでき、すなわち、治療される疾患または状態に適切な他の治療薬と組み合わせることもできる。従って、一実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質を含有する医薬は、１種以上のさらなる治療薬、例えば、細胞毒性薬、化学療法薬または血管新生阻害薬との組合せに向けたものである。そのような併用投与は同時、別々または逐次であってよい。さらなる実施形態では、本発明は、疾患、例えば、癌を治療するための方法を提供し、前記方法は、放射線療法および／または外科手術と組み合わせて、本発明のヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体の治療上有効な量を、それを必要とする対象へ投与することを含む。

本発明のヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体はまた、診断目的で用いることもできる。

実施例１：ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８およびＩｇＧ１−７Ｄ８の発現のための発現ベクター
ＨｕＭａｂ２Ｆ８（国際公開第０２／１００３４８号）およびＨｕＭａｂ７Ｄ８（国際公開第０４／０３５６０７号）のＶＨコード領域およびＶＬコード領域を、ヒトＩｇＧ１重鎖の作出のために発現ベクターｐＣｏｎＧ１ｆ（ヒトＩｇＧ１ｍ（ｆ）アロタイプ定常領域のゲノム配列を含有（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ））に、κ軽鎖の作出のためにｐＣｏｎＫａｐｐａ（ヒトκ軽鎖定常領域を含有、ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）にクローニングした。ＩｇＧ４抗体の場合、ＶＨ領域をｐＴｏｍＧ４ベクター（ｐＥＥ１２．４ベクター（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）中にヒトＩｇＧ４定常領域のゲノム配列を含有）に挿入した。あるいは、追跡構築物において、ｐＥＥ１２．４ベクター中に重鎖（ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４）またはｐＥＥ６．４ベクター（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）中にＨｕＭａｂ２Ｆ８もしくはＨｕＭａｂ７Ｄ８のヒトκ軽鎖の完全にコドン最適化されたコード領域を含有するベクターを用いた。さらに、ＨｕＭａｂ−２Ｆ８のコドン最適化されたＶＨコード領域を、Ｆ４０５Ｌ突然変異を含有するヒトＩｇＧ１ｍ（ｚａ）アロタイプ定常領域のコドン最適化された配列とともに、ｐｃＤＮＡ３．３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、発現ベクターｐ３３Ｇ１ｚａ−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌを得た。

実施例２：ヒンジ欠失ＩｇＧ１−２Ｆ８フラグメント、ならびに特定の突然変異を含有するヒトＩｇＧ１フラグメントおよびＩｇＧ４ＣＨ２−ＣＨ３フラグメントの発現のための発現ベクター
抗体重鎖のヒンジ領域およびＣＨ３領域に突然変異を導入するために、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホヤ，カナダ）を製造業者の推奨に従って用いた。あるいは、構築物を完全に合成し、またはＶＨ領域を、特定のアミノ酸をコードする置換を既に有しているベクターにクローニングした。

ＣＨ２フラグメントおよびＣＨ３フラグメントをコードする構築物をＰＣＲまたは完全に合成されたコドンの最適化のいずれかにより構築した。これらの構築物はＮ末端シグナルペプチドおよび６アミノ酸Ｈｉｓタグを有し、ヒトＩｇＧ１／４定常領域のアミノ酸３４１〜４４７を含有した。構築物をｐＥＥ１２．４にクローニングした。

ヒンジ欠失ＩｇＧ１（Ｕｎｉ−Ｇ１）分子を構築するために、ＥＧＦＲ特異性を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプのＵｎｉ−Ｇ１形式をコードする合成ＤＮＡ構築物を作製した。この構築物では、天然ヒンジ領域（ヒンジエキソンによって規定される）を欠失させた。ＩｇＧ１構築物において１５８位にＳｅｒからＣｙｓへの追加の突然変異を作製して、このアイソタイプにおいてＨＣ鎖とＬＣ鎖の間のＣｙｓ結合を得た。タンパク質配列を下に示す（配列番号４）。構築物をｐＥＥ６．４ベクターに挿入し、ｐＨＧ１−２Ｆ８と呼称した。

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
実施例３：アカゲザルＩｇＧ４−２Ｆ８およびＩｇＧ４−７Ｄ８の発現のための発現ベクター
中国アカゲザルのＩｇＧ４重鎖およびκ軽鎖ならびにＨｕｍａｂ２Ｆ８および７Ｄ８のＶＨ領域およびＶＬ領域のコード領域を含有するベクターを合成し、完全にコドン最適化し、ｐＥＥ１２．４（重鎖）およびｐＥＥ６．４（軽鎖）に挿入した。使用した重鎖定常領域配列（Scinicariello et al., Immunology 111: 66-74, 2004により記載されている配列に基づく）は以下であった（ヒト配列とアラインした）：

実施例４：ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞での一過性発現による抗体作出
２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用い、無血清条件下で、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において関連する重鎖および軽鎖発現ベクターを同時トランスフェクトすることにより、抗体を作出した。

実施例５：ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体の精製
ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。細胞培養上清を０．２０μＭのデッドエンドフィルターで濾過し、その後、５ｍＬのプロテインＡカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＦＦ，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ，スウェーデン）への添加および０．１Ｍクエン酸−ＮａＯＨ、ｐＨ３でのＩｇＧの溶出を行った。溶出液を２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９ですぐに中和し、１２．６ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｂ．Ｂｒａｕｎ，オス，オランダ）に対して一晩透析した。透析後、サンプルを０．２０μＭのデッドエンドフィルターで濾過除菌した。精製されたＩｇＧの濃度を比濁法および２８０ｎｍでの吸光度により決定した。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、質量分析および糖鎖分析(glycoanalysis)により分析した。

実施例６：ＣＨ２−ＣＨ３フラグメントの精製
Ｈｉｓタグ付きＣＨ２−ＣＨ３タンパク質を固定化金属イオン（Ｎｉ^２＋）アフィニティークロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌＧｍｂＨ，デューレン，ドイツ）により精製し、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩し、０．２μＭのデッドエンドフィルターで濾過滅菌した。精製タンパク質の濃度を２８０ｎｍでの吸光度により決定した。精製タンパク質の品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

実施例７：ヒトＩｇＧ４抗体とアカゲザルＩｇＧ４抗体との間でのＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成
ヒトＩｇＧ４抗体とアカゲザルＩｇＧ４抗体との間でのＦａｂアーム交換について試験するために、ヒトＩｇＧ４−２Ｆ８（抗ＥＧＦＲ）、ヒトＩｇＧ４−７Ｄ８（抗ＣＤ２０）、アカゲザルＩｇＧ４−２Ｆ８およびアカゲザルＩｇＧ４−７Ｄ８を用いて、２つの抗体の考えられる全ての組合せを作製した。ｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換では、０．５ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）を含むＰＢＳ０．５ｍＬ中終濃度４μｇ／ｍＬで各抗体を含有する抗体混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。還元反応を停止させるために、０．５ｍＬのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を反応混合物に加えた。

サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた二重特異性結合の判定により二重特異性抗体の存在を試験した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ−ｏｎｅ，フリッケンハウゼン，ドイツ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）のＥＧＦＲの組換え細胞外ドメインで、４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで１回洗浄した。ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ（ＰＢＳＴＢ）での抗体サンプルの希釈系列（３倍希釈により０〜１μｇ／ｍＬ）をコーティング処理したＥＬＩＳＡプレートに移し（１００μＬ／ウェル）、プレートシェーカー（３００ｒｐｍ）上、室温（ＲＴ）で６０分間インキュベートした。サンプルを廃棄し、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で１回洗浄した。次に、プレートをプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）上で、２μｇ／ｍＬのマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体２Ｆ２ＳＡＢ１．１（７Ｄ８に対して作製されたもの；Ｇｅｎｍａｂ）のＰＢＳＴＢ溶液（１００μＬ／ウェル）とともに６０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で１回洗浄した。次に、プレートをプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）上で、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１５Ｇ；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ウエストグローブ，ＰＡ，ＵＳＡ；１：５．０００）のＰＢＳＴＢ溶液（１００μＬ／ウェル）とともに室温で６０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で１回洗浄した。ＡＢＴＳ（５０ｍｇ／ｍＬＰＢＳ溶液；ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ，マンハイム，ドイツ）を加え（１００μＬ／ウェル）、室温で３０分間遮光してインキュベートした。反応を２％シュウ酸（１００μＬ／ウェル；リーデルデハーン，ドイツ）を用いて停止させた。室温で１０分後、４０５ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。

図１は、ヒトＩｇＧ４とアカゲザルＩｇＧ４の組合せにより、同じ種のＩｇＧ４分子の各組合せと比べて、より多くの二重特異性結合（より高いＯＤ４０５ｎｍ）がもたらされたことを示している。これらのデータは、ヒトＩｇＧ４とアカゲザルＩｇＧ４との間でＦａｂアーム交換が起こることを示している。さらに、より高い二重特異性結合は、ヒトＩｇＧ４半分子がアカゲザルＩｇＧ４半分子との選択的な二量体化（ヘテロ二量体化）を示し、５０％のヘテロ二量体および５０％のホモ二量体との確率論的な交換の代わりに二重特異性ヘテロ二量体の方へとシフトしたＦａｂアーム交換反応の平衡をもたらすことを示唆している。

実施例８：ヒトおよびアカゲザルＩｇＧ４の配列解析
同じ種のＩｇＧ４分子間でのＦａｂアーム交換と比べての、ヒトＩｇＧ４とアカゲザルＩｇＧ４との間でのＦａｂアーム交換の増加を解明しようとして、ヒトおよびアカゲザル抗体のコアヒンジおよびＣＨ３−ＣＨ３境界部のアミノ酸を解析した（例えば、ヒトＣＨ３−ＣＨ３境界部の残基の概観については、Dall’Acqua, et al (1998) Biochemistry 37:9266参照）。図２は、中国アカゲザルＩｇＧ４のコアヒンジ配列は２２６−ＣＰＡＣ−２２９であること、およびＣＨ３ドメインは４０９位にリジン（Ｋ）を含むことを示している。さらに、配列アラインメントにより、アカゲザルＩｇＧ４は、ヒトＩｇＧ４との比較で、ＣＨ３−ＣＨ３境界部においてさらに３つのアミノ酸置換を特徴とすることが示された：アカゲザルでは３５０位にイソロイシン（ｉ）であるのに対してヒトではトレオニン（Ｔ）であり；アカゲザルでは３７０位にトレオニン（Ｔ）であるのに対してヒトではリジン（Ｋ）であり；アカゲザルでは４０５位にロイシン（Ｌ）であるのに対してヒトではフェニルアラニン（Ｆ）である。

実施例９：ヒトＩｇＧ４と、アカゲザルＩｇＧ４ＣＨ３配列を含有するヒトＩｇＧ１との間でのＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換を用いた二重特異性抗体の生成
実施例７に記載したヒトＩｇＧ４とアカゲザルＩｇＧ４との間でのＦａｂアーム交換に基づき、中国アカゲザルＩｇＧ４ＣＨ３配列がヒトＩｇＧ１をＦａｂアーム交換に関与させ得るかどうかを解析した。そのため、ヒンジ配列ＣＰＳＣをもたらすＰ２２８Ｓ突然変異に加えて、三重突然変異Ｔ３５０Ｉ−Ｋ３７０Ｔ−Ｆ４０５Ｌ（以後ＩＴＬと称する）をヒトＩｇＧ１−２Ｆ８に導入した。ｉｎｖｉｔｒｏＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換のために、ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８変異体をヒトＩｇＧ４−７Ｄ８と組み合わせた。０．５ｍＭのＧＳＨを含むＰＢＳ０．５ｍＬ中終濃度４μｇ／ｍＬで各抗体を含有する抗体混合物を３７℃で０−３−６−２４時間インキュベートした。還元反応を停止させるために、０．５ｍＬのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を反応混合物に加えた。ＥＬＩＳＡによる二重特異性結合の測定は、実施例７に記載するように行った。

図３より、ヒトＩｇＧ４−７Ｄ８と組み合わせた場合、ＣＰＳＣヒンジ単独の導入では、ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８をＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換に関与させられないことが確認される。また、アカゲザルＩｇＧ４特異的なＣＨ３境界部のアミノ酸（ＩＴＬ）のヒトＩｇＧ１−２Ｆ８への導入では、野生型ＩｇＧ１ヒンジを保存しているが、これらの条件下でヒトＩｇＧ４−７Ｄ８と組み合わせた場合、Ｆａｂアーム交換への関与は得られなかった。これに対して、ヒンジ中のＣＰＳＣ配列およびアカゲザルＩｇＧ４特異的ＣＨ３境界部アミノ酸（ＩＴＬ）の両方を保有する変種ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８主鎖配列は、２つのヒトＩｇＧ４抗体と比べて、ヒトＩｇＧ４−７Ｄ８とのＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換後に二重特異性結合の増加を示した。これらのデータは、ＣＰＳＣを含有するヒンジと、３５０位、３７０位および４０５位にそれぞれ、Ｉ、ＴおよびＬを含有するＣＨ３ドメインとの組合せが、ヒトＩｇＧ１をＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換に関与させるのに十分なものであること、ならびにヒトＩｇＧ４と組み合わせた場合、交換反応の平衡が交換された二重特異性産物の方へとシフトすることを示している。

実施例１０：ヒトＩｇＧ４とＩｇＧ１またはＩｇＧ４変異体との間でのｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成
Ｆａｂアーム交換への関与に必要な特徴をさらに特定するために、ヒトＩｇＧ４およびＩｇＧ１変種をｉｎｖｉｖｏ解析した。１群あたり４匹の雌ＳＣＩＤマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ，マーストリヒト，オランダ）に、総容量３００μＬ中６００μｇの抗体（５００μｇの７Ｄ８＋１００μｇの２Ｆ８）を含有する抗体混合物をｉ．ｖ．注射した。注射から３時間、２４時間、４８時間および７２時間後に伏在静脈から血液サンプルを採取した。ヘパリン含有バイアルに中に採血し、１０，０００ｇで５分間遠心分離し、細胞から血漿を分離した。実施例７に記載するように、ＰＢＳＴＢで連続希釈した血漿サンプルを用いてＥＬＩＳＡによりＣＤ２０およびＥＧＦＲ二重特異反応性を評価することによって、二重特異性抗体の生成を追跡した。非線形回帰曲線適合法（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，サンディエゴ，カナダ）により、ｉｎｖｉｔｒｏ交換した抗体混合物を基準として用いて、血漿サンプル中の二重特異性抗体を定量した。

図４は、ヒンジ配列またはＣＨ３配列のいずれかが対応するヒトＩｇＧ１配列（それぞれ、ＣＰＰＣまたはＲ４０９Ｋ）へと変換されているヒトＩｇＧ４−２Ｆ８は、もはやｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換に関与しないことを示している。逆に、ヒンジ領域およびＣＨ３境界部配列の両方が対応するヒトＩｇＧ４配列（ＣＰＳＣおよびＫ４０９Ｒ）へと変換されているヒトＩｇＧ１は、ｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換に関与することができる。これらのデータは、ＣＰＳＣを含有するヒンジ（２２８位にＳ）と、４０９位にアルギニン（Ｒ）を含有するＣＨ３ドメインとの組合せは、ヒトＩｇＧ１とヒトＩｇＧ４との間でのｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換を可能にするのに十分なものであることを示している。

実施例１１：２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成：安定化ヒンジの回避／破壊
２−メルカプトエチルアミン・ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）は、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を保存しながら、抗体のヒンジ領域内のジスルフィド結合を選択的に切断することが記載されている緩和な還元剤である。２−ＭＥＡの濃度系列を、ＣＰＳＣまたはＣＰＰＣヒンジ領域を含有する２つの抗体の間でのＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導するその能力について試験した。各抗体を終濃度０．５ｍｇ／ｍＬで含有する抗体混合物を、総容量１００μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）中の２−ＭＥＡの濃度系列（０、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、５．０ｍＭ、７．０ｍＭ、１０．０ｍＭ、１５．０ｍＭ、２５．０ｍＭおよび４０．０ｍＭ）とともに３７℃で９０分間インキュベートした。還元反応を停止させるために、スピンカラム（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心式フィルター、３０ｋ、Millipore社製）を製造業者の推奨に従って用いてサンプルを脱塩することにより還元剤２−ＭＥＡを除去した。実施例７に記載するように、ＥＬＩＳＡにより二重特異性結合を測定した。

２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を、ＣＰＳＣヒンジ領域を含有し、ＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換に関与することが分かっている組合せＩｇＧ４−２Ｆ８×ＩｇＧ４−７Ｄ８と、安定化ヒンジ領域によってＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換に関与しない組合せＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ（実施例９に記載、図３）について試験した。驚くべきことに、２−ＭＥＡは、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定した場合に（データは示していない）、重鎖からの軽鎖の分離を誘導することが見出された。それにもかかわらず、図５に示すように、機能的二重特異性抗体が生成された。野生型ヒトＩｇＧ４−２Ｆ８とＩｇＧ４−７Ｄ８との間でのＦａｂアーム交換後の二重特異性結合の最大レベルは、２．０ｍＭ２−ＭＥＡの濃度で達成され、実施例９に記載するように、０．５ｍＭＧＳＨで達成されたレベルと同程度であった（図３）。しかしながら、２−ＭＥＡは、ヒト抗体ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ（安定化ヒンジ領域を有する）との間でのＦａｂアーム交換を用量依存的に誘導することができた。恐らく両抗体のヒンジ領域内のＣＰＰＣ配列の存在により、低い２−ＭＥＡ濃度ではほとんどまたは全く二重特異性抗体が形成されなかったが、より高い濃度の２−ＭＥＡでは二重特異性抗体の生成は非常に効率的であった。最大の二重特異性結合は２５ｍＭ２−ＭＥＡで達成され、２つの野生型ＩｇＧ４抗体の間でのＦａｂアーム交換後の最大結合を越えた。これらの最大結合レベルは、ＣＰＳＣヒンジを有する対応抗体（ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＣＰＳＣ−ＩＴＬ）のＧＳＨ処理について実施例９に記載したレベルと同程度であった（図３）。ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよびＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣはともにＣＰＰＣヒンジを含有するため、これらのデータは、２−ＭＥＡがｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換のためのＣＰＳＣヒンジの要件を無視することができたことを示す。

実施例１２：２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成を追跡するための質量分析
２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成は実施例１１に記載しており、そこでは、ＥＬＩＳＡにより二重特異性結合を示した（図５）。二重特異性抗体が形成されることを確認するために、サンプルをエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析し、分子量を決定した。まず、２００μｇの抗体を０．００５ＵのＮ−グリカナーゼ（カタログ番号ＧＫＥ−５００６Ｄ；Prozyme）のＰＢＳ溶液１８０μＬともに３７℃で一晩インキュベートすることによりサンプルを脱グリコシル化した。サンプルを、ＢＥＨ３００Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍカラムの付いたＡｑｕｉｔｙＵＰＬＣ(商標）（Ｗａｔｅｒｓ，ミルフォード，ＵＳＡ）において６０℃で脱塩し、０．０５％ギ酸（ＦｌｕｋａＲｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａeｎ，ブーフス，ドイツ）を含有する、ＭＱ水（エルエンス(Eluens)Ａ）およびＬＣ−ＭＳ用アセトニトリル（エルエンス(eluens)Ｂ）（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ，ファルケンスワールト，オランダ）の混合物の勾配により溶出した。飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルは、ｍｉｃｒＯＴＯＦ(商標)質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ，ブレーメン，ドイツ）において陽イオンモードで動作させ、オンラインで記録した。分析の前に、５００〜４０００ｍ／ｚスケールをＥＳｔｕｎｉｎｇｍｉｘ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，サンタクララ，ＵＳＡ）で較正した。ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ(商標)ソフトウェアｖ．３．４（Ｂｒｕｋｅｒ，ブレーメン，ドイツ）を用いて提供される最大エントロピーを用いることにより、質量スペクトルをデコンボリューション処理した。この実験においてＦａｂアーム交換に用いられた抗体の分子量に基づき、二重特異性抗体を元の抗体と識別することができた（ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣについては実施例１５、図９Ｃにも記載している）。二重特異性抗体のピークについては、曲線下面積を決定し、総曲線下面積で除して、各サンプルにおける二重特異性抗体のパーセンテージを算出した。図６Ａは、０ｍＭ２−ＭＥＡ（親抗体に相当する２つのピーク）、７ｍＭ２−ＭＥＡ（親抗体および二重特異性抗体に相当する３つのピーク）および４０ｍＭ２−ＭＥＡ（二重特異性抗体に相当する１つのピーク）を用いた、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの間でのＦａｂアーム交換反応の３つの代表的な質量分析プロフィールを示している。二重特異性産物の均一なピークは、細かく分かれたピークをもたらしたであろう軽鎖の誤対合が起こらなかったことを示す。定量化したデータは、図６Ｂに示しており、これらのデータは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよびＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの間でのＦａｂアーム交換によりほぼ１００％の二重特異性抗体がもたらされたことを示す。これに対して、野生型ＩｇＧ４抗体の間でのＦａｂアーム交換でもたらされた二重特異性産物は５０％未満であった。これらのデータから、実施例１１に記載した二重特異性結合ＥＬＩＳＡの結果が確認される（図５）。

実施例１３：２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の安定性
２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の安定性を試験した。そのため、７．０ｍＭ２−ＭＥＡを用いてＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよびＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣから生成された二重特異性サンプル２μｇ（実施例１１に記載、図５）を、二重特異性試験サンプル２μｇに対して０、１倍、１０倍、５０倍過剰のＩｇＧ４−ＭＧに相当する濃度系列（０、２μｇ、２０μｇ、１００μｇ）の無関係のＩｇＧ４（アセチルコリン受容体に対するＩｇＧ４−ＭＧ）の存在下で、ＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換反応に用いた。この反応におけるＦａｂアーム交換は、二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ２０結合の喪失を引き起こすと思われる。ＧＳＨ還元反応の条件は、実施例７に記載したものと同じであった（ＰＢＳ／０．５ｍＭＧＳＨ０．５ｍＬ中、３７℃で２４時間）。還元反応を停止させるために、０．５ｍＬのＰＢＳＴＢを反応混合物に加えた。実施例７に記載するように、ＥＬＩＳＡにより二重特異性結合を測定した。ＧＳＨ還元反応後の二重特異性結合は、出発材料（対照）（１００％とした）で測定した二重特異性結合と比較して表している。

図７Ａは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ由来の二重特異性サンプルでは、無関係のＩｇＧ４の存在下でのＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換後に、ＥＧＦＲ／ＣＤ２０二重特異性結合は著しく変化しないことを示している。これは、二重特異性産物が安定している、すなわち、ＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換に関与しないことを示す。対照として、図７Ｂからは、ＩｇＧ４−２Ｆ８×ＩｇＧ４−７Ｄ８由来のサンプルは無関係のＩｇＧ４の存在下でのＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換後にＥＧＦＲ／ＣＤ２０二重特異性結合の減少を示すことが示されており、これは、この産物は安定していないことを示す。これらのデータから、ＣＨ３ドメイン内に三重突然変異Ｔ３５０Ｉ−Ｋ３７０Ｔ−Ｆ４０５Ｌを含有するヒトＩｇＧ１重鎖と、安定化ヒンジ（ＣＰＰＣ）をもたらすＳ２２８Ｐ置換を含有するヒトＩｇＧ４重鎖からなるヘテロ二量体は安定していることが示される。

実施例１４：２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の薬物動態および安定性のｉｎｖｉｖｏ解析
ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体（実施例１１、図５、７ｍＭ２−ＭＥＡ）をＳＣＩＤマウスに注射して、その安定性（ｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換）および薬物動態特性（血漿クリアランス率）を親抗体ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよびＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの比較により解析した。３群のマウス（１群あたりマウス３匹）の尾静脈に、精製抗体２００μＬ：（１）二重特異性抗体１００μｇ；（２）二重特異性抗体１００μｇ＋無関係のＩｇＧ４（ナタリズマブ、抗α４−インテグリン）１，０００μｇ；（３）ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ５０μｇ＋ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ５０μｇを静脈内注射した。抗体投与後の所定の時間間隔（１０分、３時間、１日、２日、７日、１４日、２１日）で頬部穿刺により血液サンプル（５０〜１００μＬ）を採取した。ヘパリン含有バイアル中に採血し、１４，０００ｇで１０分間遠心分離した。さらなる解析まで、血漿を−２０℃で保存した。

血漿サンプル中の総ＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡによりアッセイした。続く工程のアッセイ条件は実施例７に記載したＥＬＩＳＡの場合と同じであった。総ＩｇＧ測定に用いた特定の化合物は以下であった：２μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＩｇＧ（クローンＭＨ１６−１；CLB；カタログ番号Ｍ１２６８）でのコーティング；血清サンプルの希釈（１群および３群については１：５００および１：２，５００）および（２群については１：２，５００および１：１０，０００）；コンジュゲート体：ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（クローン１１Ｈ；Ｊａｃｋｓｏｎ；カタログ番号１０９−０３５−０９８；１：１０，０００）。血漿サンプル中の二重特異性抗体の存在を、実施例１０に記載するように、ＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２０およびＥＧＦＲ二重特異反応性によりアッセイし、定量した。

図８Ａは総抗体血漿中濃度を示している。血漿クリアランス曲線の形状は全ての群において同一であり、これは、二重特異性抗体の血漿クリアランスが、解析した時間間隔にわたって親抗体ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよびＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの場合と同じであったことを示している。図８Ｂは経時的な二重特異性抗体の血漿中濃度を示している。二重特異性抗体への１０倍過剰の無関係のＩｇＧ４の添加は二重特異性抗体濃度に影響を与えず、ｉｎｖｉｖｏでＦａｂアーム交換が起こらなかったことを示している。親抗体（ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ＋ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ）の注射後、血漿中に二重特異性抗体は検出できず、このことから、これらの抗体はｉｎｖｉｖｏでＦａｂアーム交換に関与しないことが確認される。これらのデータは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体産物はｉｎｖｉｖｏで安定しており（Ｆａｂアーム交換は起こらない）、親の一価抗体と同程度の薬物動態特性（血漿クリアランス率）を示したことを示している。

実施例１５：２つの抗体の間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の純度
ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体のバッチをＰＤ−１０脱塩カラム（カタログ番号１７−０８５１−０１；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）において精製した。次に、二重特異性産物の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）および質量分析により分析した。生成された二重特異性抗体の機能性をＥＬＩＳＡにおいて二重特異性結合により確認した（データは示していない）。

サンプルを中性ｐＨで泳動させるＬａｅｍｍｌｉ変法(Laemmli 1970 Nature 227(5259): 680-5)を用い、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ブレダ，オランダ）において、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシーで染色し、ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ（Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ，ケンブリッジ，ＵＫ）を用いてデジタル画像を取得した。図９Ａは、Ｆａｂアーム交換後の抗体サンプルは完全ＩｇＧからなり、非還元ゲル上で微量の半分子（Ｈ１Ｌ１）が検出できることを示している（図９Ａ−ｂ）。

ＨＰ−ＳＥＣ分画を、ＴＳＫＨＰ−ＳＥＣカラム（Ｇ３０００ＳＷ_ｘｌ;ＴｏｓｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｍｎｉｌａｂｏ経由，ブレダ，オランダ）およびＷａｔｅｒｓ社製２４８７ｄｕａｌ λ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）と接続されたＷａｔｅｒｓ社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５分離装置（Ｗａｔｅｒｓ，エッテンルール，オランダ）を用いて行った。サンプルを１ｍＬ／分で泳動させた。結果を、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアバージョン２００２を用いて処理し、ピークごとに、全ピーク高さのパーセンテージとして表した。図９Ｂは、サンプルの＞９８％は完全ＩｇＧからなり、凝集体は事実上形成されないことを示している。

実施例１２に記載するように、質量分析を行った。図９Ｃは、出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよびＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣならびにＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間でのＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物の質量分析プロフィールを示している。Ｆａｂアーム交換サンプルにおける産物は１４５，９０１ｋＤａであり、これは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ（１４６，２５９．５／２＝７３，１３０）＋ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ（１４５，５４２．０／２＝７２，７７１）に由来する二重特異性産物と完全に一致する。さらに、二重特異性抗体産物は均一なピークを示したが、これは、細かく分かれたピークをもたらしたであろう軽鎖の誤対合が起こらなかったことを示している。これらのデータは、Ｆａｂアーム交換により１００％の二重特異性抗体がもたらされたことを示す。ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣおよび二重特異性サンプルの主要なピーク（Ｋ０）に加えて検出された小さなピークは、抗体の重鎖に１つ（Ｋ１）または２つ（Ｋ２）のＣ末端リジンが存在することによるものである。

これらのデータは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により約１００％の機能的二重特異性抗体サンプルが生成されたことを示す。

実施例１６：ヒトＩｇＧ１のＦａｂアーム交換関与のためのＴ３５０Ｉ、Ｋ３７０ＴおよびＦ４０５Ｌ置換の要件の解明
ＩｇＧ１がＦａｂアーム交換に関与するために必要なＩｇＧ１ＣＨ３ドメインにおける決定因子をさらに特定するために、三重突然変異Ｔ３５０Ｉ−Ｋ３７０Ｔ−Ｆ４０５Ｌ（ＩＴＬ）を含有するＩｇＧ１を、二重変異体Ｔ３５０Ｉ−Ｋ３７０Ｔ（ＩＴ）、Ｔ３５０Ｉ−Ｆ４０５Ｌ（ＩＬ）およびＫ３７０Ｔ−Ｆ４０５Ｌ（ＴＬ）と比較した。また、単一変異体Ｆ４０５Ｌ（Ｌ）も試験した。ｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換を誘導するために、２−ＭＥＡを還元体として用いた（各抗体５０μｇを１００μＬＰＢＳ／２５ｍＭ２−ＭＥＡ中で、３７℃で９０分間）。単一変異体Ｆ４０５Ｌ抗体の場合、一過性トランスフェクションの上清からの未精製抗体を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心式装置（３０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号ＵＦＣ８０３０９６）を用いたＰＢＳへのバッファー交換後に用いた。還元反応を停止させるために、実施例１１に記載するように、スピンカラムを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤２−ＭＥＡを除去した。実施例７に記載するように、ＥＬＩＳＡにより測定した二重特異性結合によって二重特異性抗体の生成を判定した。

三重突然変異（ＩＴＬ）、二重突然変異（ＩＴ、ＩＬおよびＴＬ）および単一突然変異（Ｌ）をＩｇＧ１−２Ｆ８に導入した。これらの変異体を、２５ｍＭ２−ＭＥＡを３７℃で９０分間用いるＦａｂアーム交換のために、ＣＰＳＣヒンジを含有するＩｇＧ４−７Ｄ８（野生型）または安定化ヒンジを含有するＩｇＧ４−７Ｄ８（ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ）と組み合わせた。図１０Ａ〜Ｂは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＬ変異体およびＩｇＧ１−２Ｆ８−ＴＬ変異体は、組み合わせたＩｇＧ４−７Ｄ８（ＣＰＳＣまたはＣＰＰＣヒンジ）に関係なく、三重変異体ＩＴＬと同じレベルまでＦａｂアーム交換を示したことを示している。これに対して、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴ変異体との組合せでは二重特異性結合は認められなかった。図１０Ｃは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ変異体も同様に、組み合わせたＩｇＧ４−７Ｄ８（ＣＰＳＣまたはＣＰＰＣヒンジ）に関係なく、Ｆａｂアーム交換を示したことを示している。これらのデータは、Ｆ４０５Ｌ突然変異は、上述の条件下でヒトＩｇＧ１をＦａｂアーム交換に関与させるのに十分なものであることを示す。

実施例１７：異なる温度での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成
２つの異なる抗体の間でのＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導する２−ＭＥＡの能力を異なる温度で試験した。Ｆａｂアーム交換反応は、１６０μｇのヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬを１６０μｇのＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとともに、３２０μｌのＰＢＳ／２５ｍＭ２−ＭＥＡ（各抗体につき終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）中、０℃、２０℃（室温）または３７℃のいずれかでインキュベートすることにより開始した。これらの反応から、異なる時点（０分、２．５分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分および２４０分）において２０μＬのサンプルを採取した。各サンプルに２０μＬのＰＢＳを加え、その後、Ｚｅｂａ９６ウェルスピン脱塩プレート（７ｋ、カタログ番号８９８０８ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の推奨に従って用いてサンプルを脱塩することにより還元剤２−ＭＥＡを除去した。ＮａｎｏｄｒｏｐＮＤ−１０００分光光度計（ＩｓｏｇｅｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，マールセン，オランダ）を用いて波長２８０ｎｍで吸光度を測定することにより総抗体濃度を決定した。実施例７に記載するように、抗体サンプルの希釈系列（２５倍希釈により総抗体濃度０〜２０μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡに用いて、二重特異性結合を測定した。

図１１は、ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成は３７℃で最も効率的であることが見出され、４５分後に最大二重特異性結合に達したことを示している。室温では、二重特異性抗体の生成はより遅く、２４０分後に最大二重特異性結合に達した。０℃では、分析時間の間に二重特異性結合の生成は見られなかった。

実施例１８；異なる還元剤がｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導する能力の解析
０．５ｍＭＧＳＨは、ヒトＩｇＧ４とＩｇＧ１−ＣＰＳＣ−ＩＴＬとの間でｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換を誘導することができるが、ヒトＩｇＧ４と、安定なヒンジを含有するＩｇＧ１−ＩＴＬとの間ではｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換を誘導することができないことが上で示された（図３）。さらに、２−ＭＥＡは、安定化ヒンジ領域を有する抗体の間、例えば、ＩｇＧ１−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−ＣＰＰＣでＦａｂアーム交換を誘導することができることが見出された（図５）。他の濃度のＧＳＨもしくは２−ＭＥＡまたは他の還元剤が２つの異なる抗体の間でｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換を誘導することができるかどうかを調べるために、２−ＭＥＡ、ＧＳＨおよびＤＴＴ（ジチオトレイトール）の濃度系列を試験した。そのため、１０μｇのヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよび１０μｇのＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣの組合せのＰＢＳ溶液２０μｌ（各抗体につき終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を、異なる還元剤の濃度系列（０．０ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５．０ｍＭおよび５０．０ｍＭ）とともに、３７℃でインキュベートした。９０分後、各サンプルに２０μＬのＰＢＳを加え、実施例１７に記載するように、スピン脱塩プレートを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤を除去した。実施例１７に記載するように、総抗体濃度を決定した。実施例７に記載するように、抗体サンプルの希釈系列（３倍希釈により総抗体濃度０〜２０μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡに用いて、二重特異性結合を測定した。

図１２から、２−ＭＥＡは２５ｍＭ２−ＭＥＡの濃度で最大の二重特異性結合を誘導することが確認される。ＤＴＴは、二重特異性抗体の生成において非常に有効であることが見出され、２．５ｍＭＤＴＴで最大の二重特異性結合に達した。０〜５ｍＭ範囲のＧＳＨ濃度では、安定化ヒンジ領域をともに含有する、ＩｇＧ１−ＩＴＬ抗体とＩｇＧ４−ＣＰＰＣ抗体との間でのＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導することができなかった。より高いＧＳＨ濃度（１２．５〜５０ｍＭ）では、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定した場合に、抗体凝集体の形成が引き起こされた（データは示していない）。従って、これらのサンプルは解析から除外した。これらのデータは、２つの異なる抗体の間でのＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成は種々の還元剤により誘導され得ることを示している。

実施例１９：ＩｇＧ１−ＩＴＬとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１４０９位にある決定因子
２−ＭＥＡは、実施例１１に記載するように、ヒトＩｇＧ１−ＩＴＬとＩｇＧ４−ＣＰＰＣとの間でのＦａｂアーム交換を誘導することができる（図５）。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＣＨ３界面残基は４０９位だけ異なっている：ＩｇＧ１でのリジン（Ｋ）およびＩｇＧ４でのアルギニン（Ｒ）（実施例８に記載、図２）。そのため、アルギニンまたは任意の他のアミノ酸による４０９位のリジン（Ｋ４０９Ｘ）の置換は、ＩｇＧ１−ＩＴＬとの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換へのＩｇＧ１の関与を可能にするかどうかを試験した。１０μｇのヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬおよび１０μｇのＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｘの組合せのＰＢＳ／２５ｍＭ２−ＭＥＡ溶液２０μｌ（各抗体につき終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を３７℃で９０分間インキュベートした。一過性トランスフェクションの上清からの未精製抗体を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心式装置（３０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号ＵＦＣ８０３０９６）を用いたＰＢＳへのバッファー交換後に用いた。Ｆａｂアーム交換反応後、各サンプルに２０μＬのＰＢＳを加え、実施例１７に記載するように、スピン脱塩プレートを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤を除去した。実施例７に記載するように、抗体サンプルの希釈系列（３倍希釈により総抗体濃度０〜２０μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡに用いて、二重特異性結合を測定した。

図１３Ａは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｘの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性結合の結果を示している。図１３Ｂでは、交換は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換に由来する二重特異性抗体の精製バッチ（１００％に設定）に対する二重特異性結合として表される。これらのデータはまた、表１に示すように、（−）Ｆａｂアーム交換なし、（＋／−）Ｆａｂアーム交換低率、（＋）Ｆａｂアーム交換中間率または（＋＋）Ｆａｂアーム交換高率としても評価した。ＩｇＧ１−７Ｄ８における４０９位がＫ（＝野生型ＩｇＧ１）、ＬまたはＭであった場合に、Ｆａｂアーム交換なし（−）と判定した。ＩｇＧ１−７Ｄ８における４０９位がＦ、Ｉ、ＮまたはＹであった場合には、Ｆａｂアーム交換は中間率（＋）であると判定し、ＩｇＧ１−７Ｄ８における４０９位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷであった場合には、高率（＋＋）であると判定した。

実施例２０：抗体脱グリコシル化は２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成に影響を及ぼさない
２００μｇの抗体を０．００５ＵのＮ−グリカナーゼ（カタログ番号ＧＫＥ−５００６Ｄ；Ｐｒｏｚｙｍｅ）のＰＢＳ溶液１８０μＬとともに３７℃で一晩インキュベートすることによりＩｇＧ４−７Ｄ８およびＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣサンプルを脱グリコシル化した。これらのサンプルをそのままＦａｂアーム交換反応に用いた。Ｆａｂアーム交換は、５０μｇの各抗体を１００μｌのＰＢＳ／２５ｍＭ２−ＭＥＡ（各抗体につき終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）中、３７℃で９０分間インキュベートすることによりを行った。実施例１１に記載するように、スピンカラムを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤２−ＭＥＡを除去した。実施例７に記載するように、抗体サンプルの希釈系列（３倍希釈により総抗体濃度０〜２０μｇ／ｍＬ）をサンドイッチＥＬＩＳＡに用いて、二重特異性結合を測定した。

質量分析は、脱グリコシル化反応により１００％の脱グリコシル化抗体産物がもたらされたことを示した（データは示していない）。図１４は、脱グリコシル化抗体を伴うＦａｂアーム交換は、対応するグリコシル化抗体とのＦａｂアーム交換と違いがなかったことを示している（ＩｇＧ４−２Ｆ８×脱グリコシル化ＩｇＧ４−７Ｄ８対ＩｇＧ４−２Ｆ８×ＩｇＧ４−７Ｄ８およびＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×脱グリコシル化ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ対ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬ×ＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣ）。これらのデータは、脱グリコシル化は２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成に影響を及ぼさなかったことを示す。

実施例２１：非共有結合性ＣＨ３−ＣＨ３相互作用の定量化
ＣＨ３界面での相互作用の強度は、親抗体における両方の重鎖がＦａｂアーム交換反応において解離することが可能であり、かつ、それらがその後、ヘテロ二量体化反応において結合することが可能であるようなものでなければならない。そのため、Ｆａｂアーム交換に関与する能力と非共有結合性ＣＨ３−ＣＨ３相互作用の強度との間の相関関係（解離定数、Ｋ_Ｄ）を解析した。以下のヒト抗体組合せについて、実施例９に記載するように、ＧＳＨ誘導によるＦａｂアーム交換を行った（３７℃で０．５ｍＭＧＳＨ）：
IgG1-2F8 x IgG1-7D8
IgG1-2F8-CPSC x IgG1-7D8-CPSC
IgG1-2F8-CPSC-T350I x IgG1-CPSC-7D8-T350I
IgG1-2F8-CPSC-K370T x IgG1-7D8-CPSC-K370T
IgG1-2F8-CPSC-ITL x IgG1-7D8-CPSC-ITL
IgG1-2F8-CPSC-K409R x IgG1-7D8-CPSC-K409R
IgG4-2F8 x IgG4-7D8
IgG4-2F8-R409K x IgG4-7D8-R409K
IgG4-2F8-R409A x IgG4-7D8-R409A
IgG4-2F8-R409L x IgG4-7D8-R409L
IgG4-2F8-R409M x IgG4-7D8-R409M
IgG4-2F8-R409T x IgG4-7D8-R409T
IgG4-2F8-R409W x IgG4-7D8-R409W
IgG4-2F8-F405A x IgG4-7D8-F405A
IgG4-2F8-F405L x IgG4-7D8-F405L
IgG4-2F8-Y349D x IgG4-7D8-Y349D
IgG4-2F8-L351K x IgG4-7D8-L351K
IgG4-2F8-E357T x IgG4-7D8-E357T
IgG4-2F8-S364D x IgG4-7D8-S364D
IgG4-2F8-K370Q x IgG4-7D8-K370Q
IgG4-2F8-K370E x IgG4-7D8-K370E
実施例７に記載するように、サンドイッチＥＬＩＳＡによる二重特異性結合の判定により二重特異性抗体の生成を測定した。図１５Ａ／Ｂ／Ｃは、Ｆａｂアーム交換反応後の二重特異性結合の結果を示している。

ＣＨ３−ＣＨ３相互作用の強度に及ぼす上述のＣＨ３突然変異の影響を測定するために、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのみからなるフラグメントを作製した。これらのフラグメントにおけるヒンジ領域の欠如により、共有結合による重鎖間ジスルフィド結合は阻止された。フラグメントをネイティブ質量分析により分析した。１０ｋＤａＭＷＣＯスピンフィルターカラムを用いて、サンプルに対して、１００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ７へのバッファー交換を行った。ＬＣＴ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）での分析のために、連続希釈したサンプル（２０μＭ〜２５ｎＭ；単量体当量）のアリコート（約１μＬ）を金メッキホウケイ酸塩キャピラリーにロードした。単量体シグナル、Ｍ_ｓは、スペクトルにおける全ピークの面積に対する割合としての単量体ピークの面積（Ｍ_ｓ／（Ｍ_ｓ＋Ｄ_ｓ）（式中、Ｄ_ｓ＝二量体シグナル））と定義した。平衡状態での単量体の濃度、［Ｍ］_ｅｑは、Ｍ_ｓ．［Ｍ］_０（式中、［Ｍ］_０は、単量体単位での全体的なタンパク質濃度である）と定義した。平衡状態での二量体の濃度、［Ｄ］_ｅｑは、（［Ｍ］_０−［Ｍ］_ｅｑ）／２と定義した。次に、Ｋ_Ｄを［Ｄ］_ｅｑと［Ｍ］_ｅｑ ^２との関係を示すプロットの勾配から抽出した。非共有結合性ＣＨ３−ＣＨ３相互作用のＫ_Ｄを表２に示す。

Ｆａｂアーム交換に関与する能力と非共有結合性ＣＨ３−ＣＨ３相互作用の強度との相関関係を解析した。図１５Ｄ／Ｅは、対応するＣＨ２−ＣＨ３フラグメントのＫ_Ｄ測定値に対してプロットしたＦａｂアーム交換後の二重特異性結合のパーセンテージを示している（図１５ＤはＩｇＧ１についてのグラフ；図１５ＥはＩｇＧ４についてのグラフ）。これらのデータから、試験条件下では、効率的なＦａｂアーム交換を可能にするＣＨ３−ＣＨ３相互作用の見かけのＫ_Ｄ値に特定の範囲があることが示唆される。

実施例２２：異なる還元体(reductantia)の、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間でのｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導する能力についての解析
２−ＭＥＡおよびＤＴＴは、ヒトＩｇＧ１−ＩＴＬとＩｇＧ４−ＣＰＰＣとの間でのｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換を誘導することが見出された（図１２）。これらの還元体(reductantia)は同様に、ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間でのｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換も誘導することができるかどうかを試験した。２−ＭＥＡ、ＤＴＴ、ＧＳＨおよびＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）の濃度系列を試験した。実施例１８に記載するように、Ｆａｂアーム交換を行った。試験した濃度系列の異なる還元剤は以下のとおりであった：０．０ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５．０ｍＭ、２５．０ｍＭ、５０．０ｍＭ２−ＭＥＡ、ＧＳＨ、ＤＴＴまたはＴＣＥＰ。

図１７から、２−ＭＥＡは２５ｍＭ２−ＭＥＡの濃度で最大のＦａｂアーム交換を誘導することが確認され、これは、より高い濃度の５０．０ｍＭ２−ＭＥＡでも維持された。ＤＴＴは、二重特異性抗体の生成において非常に有効であることが見出され、０．５ｍＭＤＤＴで最大のＦａｂアーム交換に達し、これも、より高い濃度のＤＴＴ（１．０〜５０．０ｍＭ）を通して維持された。同様に、ＴＣＥＰも二重特異性抗体の生成において非常に有効であることが見出され、０．５ｍＭで最大のＦａｂアーム交換に達した。≧２５．０ｍＭの濃度では、ＴＣＥＰによるＦａｂアーム交換は妨げられた。０．０〜５．０ｍＭの範囲のＧＳＨ濃度では、Ｆａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成を誘導することができなかった。より高いＧＳＨ濃度（２５．０〜５０．０ｍＭ）では、抗体凝集体の形成が引き起こされた（データは示していない）。従って、これらのサンプルは解析から除外した。これらのデータは、２つの異なる抗体の間でのＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成は種々の還元剤により誘導され得ることを示している。

実施例２３：ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成
ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の形成を確認するために、２−ＭＥＡの濃度系列を用いたＦａｂアーム交換反応からのサンプルの分子量をＥＳＩ−ＭＳにより決定した。試験した濃度系列は以下のとおりであった：０．０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、５．０ｍＭ、７．０ｍＭ、１０．０ｍＭ、１５．０ｍＭ、２５．０ｍＭおよび４０．０ｍＭ２−ＭＥＡ。Ｆａｂアーム交換（ＰＢＳ中）およびサンドイッチＥＬＩＳＡを、実施例１１に記載するように行った。ＥＳＩ−ＭＳを、実施例１２に記載するように行った。

図１８Ａは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換は、用量依存的に、二重特異性抗体の生成を効率的にもたらし、１５．０ｍＭ２−ＭＥＡの濃度で二重特異性結合が最大レベルになることを示している。定量化したＥＳＩ−ＭＳデータは図１８Ｂに示しており、これらのデータは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間でのＦａｂアーム交換によりほぼ１００％の二重特異性抗体がもたらされたことを示し、このことから、二重特異性結合ＥＬＩＳＡの結果が確認される。

実施例２４：ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の純度
ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体のバッチをＰＤ−１０脱塩カラム（カタログ番号１７−０８５１−０１；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。次に、二重特異性産物の純度を、実施例１２に記載するように、質量分析により分析した。

図１９は、出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲならびにＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間でのＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物の質量分析プロフィールを示している。Ｆａｂアーム交換サンプルにおける産物は１４６，１６０．７ｋＤａであり、これは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（１４６，６０６．８／２＝７３，３０３．３）×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１４６，３１２．２／２＝７３，１５６．１）に由来する二重特異性産物（＝１４６，４５９．４ｋＤａ）と一致する。さらに、二重特異性抗体産物は均一なピークを示したが、これは、細かく分かれたピークをもたらしたであろう軽鎖の誤対合が起こらなかったことを示している。これらのデータは、Ｆａｂアーム交換によりおよそ１００％の二重特異性抗体がもたらされたことを示す。

実施例２５：２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換によりＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒから生成された二重特異性抗体の安定性および薬物動態のｉｎｖｉｖｏ解析
実施例１４に記載するように、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体をＳＣＩＤマウスに注射して、その安定性（ｉｎｖｉｖｏＦａｂアーム交換）および薬物動態特性を解析した。２群のマウス（１群あたりマウス３匹）を解析した：（１）二重特異性抗体１００μｇ；（２）二重特異性抗体１００μｇ＋無関係のＩｇＧ４（ＩｇＧ４−６３７、ＷＯ２００７０６８２５５に記載されている）１，０００μｇ。実施例１４に記載するように、血漿サンプル中の総ＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡによりアッセイした。ただし、この実施例では、検出用のコンジュゲート体としてＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９−０３５−０９８、１／１０，０００）を用いた。血漿サンプル中の二重特異性抗体の存在を、実施例１４に記載するように、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２０およびＥＧＦＲ二重特異反応性によりアッセイし、定量した。

図２０Ａは経時的な総抗体血漿中濃度を示している。血漿クリアランス曲線の形状は両群において同一であった。図２０Ｂは経時的な二重特異性抗体の血漿中濃度を示している。二重特異性抗体への１０倍過剰の無関係のＩｇＧ４の添加は二重特異性抗体濃度に影響を与えず、ｉｎｖｉｖｏでＦａｂアーム交換が起こらなかったことを示している。これらのデータは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるｉｎｖｉｔｒｏＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体産物はｉｎｖｉｖｏで安定していた（Ｆａｂアーム交換は起こらない）ことを示している。

実施例２６：ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体によるＣＤＣ媒介性細胞死滅
ＣＤ２０抗体ＩｇＧ１−７Ｄ８は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によりＣＤ２０発現細胞を効率的に死滅させることができる。これに対して、ＥＧＦＲ抗体ＩｇＧ１−２Ｆ８は、ＥＧＦＲを発現する標的細胞に対してＣＤＣの媒介をしない。変異体ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体は、依然として、ＣＤ２０発現細胞に対してＣＤＣを誘導することができるかどうかを試験した。１０^５個のＤａｕｄｉ細胞またはＲａｊｉ細胞を、シェーカー中で、０．１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ培地８０μＬ中の抗体の濃度系列とともに、室温で１５分間プレインキュベートした。正常ヒト血清（ＮＨＳ）２０μＬを補体の供給源として加え（終濃度２０％ＮＨＳ）、３７℃で４５分間インキュベートした。０．１％ＢＳＡを添加した氷冷ＲＰＭＩ培地３０μＬを加えて、ＣＤＣ反応を停止させた。１０μｇ／ｍＬのプロピジウムヨージド（ＰＩ）１０μＬ（終濃度１μｇ／ｍＬ）の添加およびＦＡＣＳ分析によって死滅細胞と生存細胞を識別した。

図２１は、ＩｇＧ１−７Ｄ８による、ＣＤ２０を発現するＤａｕｄｉ細胞（図２１Ａ）およびＲａｊｉ細胞（図２１Ｂ）のＣＤＣ媒介性細胞死滅はＫ４０９Ｒ突然変異の導入によって影響を受けなかったことを示している。Ｄａｕｄｉ細胞およびＲａｊｉ細胞はともにＥＧＦＲを発現せず、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の一価結合を引き起こす。それにもかかわらず、二重特異性抗体は依然として、ＣＤ２０発現細胞のＣＤＣ媒介性細胞死滅を誘導した。これらのデータから、親抗体のＣＤＣ能力は二重特異性形式において維持されたことが示される。

実施例２７：ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体によるＡＤＣＣ媒介性細胞死滅
ＥＧＦＲ抗体ＩｇＧ１−２Ｆ８は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によりＥＧＦＲ発現細胞、例えば、Ａ４３１を死滅させることができる。Ａ４３１細胞はＣＤ２０を発現せず、そのため、ＣＤ２０抗体ＩｇＧ１−７Ｄ８はこれらの細胞に対してＡＤＣＣを誘導しない。変異体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体は依然として、Ａ４３１細胞に対してＡＤＣＣを誘導することができるかどうかを試験した。エフェクター細胞の単離のため、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ(登録商標) チューブ（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号２２７２９０）を製造業者の推奨に従って用いて、健常ドナーの全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。０．１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ培地１ｍＬ中の５×１０^６個のＡ４３１細胞に１００μＣｉ ^５１Ｃｒを加え、３７℃の振盪水槽中で６０分間インキュベートすることによって、標的細胞を標識した。標識した細胞を洗浄し、０．１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ中に再懸濁した。０．１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ中の５×１０^４個の標識標的細胞を、１００μＬで、抗体濃度系列（３倍希釈によりＡＤＣＣアッセイでの終濃度、範囲０〜１０μｇ／ｍＬ）とともに室温で１５分間プレインキュベートした。ＡＤＣＣアッセイは、エフェクター細胞５０μＬ（５×１０^６個の細胞）をＥ：Ｔ比１００：１で加えることによって開始した。３７℃で４時間後、シンチレーションカウンターで１分間あたりのカウント数（ｃｐｍ）として、３反復実験での^５１Ｃｒ放出を測定した。細胞毒性のパーセンテージを、下式を用いて算出した：特異的溶解のパーセンテージ＝（実験値ｃｐｍ−基礎値ｃｐｍ）／（最大値ｃｐｍ−基礎値ｃｐｍ）×１００。５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００５０μＬを標的細胞５０μＬ（５×１０^４個の細胞）に加えることにより最大の^５１Ｃｒ放出を決定し、感作抗体およびエフェクター細胞の不在下で基礎放出を測定した。

図２２は、ＣＤ２０特異的抗体ＩｇＧ１−７Ｄ８はＣＤ２０陰性Ａ４３１細胞に対してＡＤＣＣを誘導しなかったことを示している。ＩｇＧ１−２Ｆ８および変異体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬはともにＡ４３１細胞に対してＡＤＣＣを誘導することが可能であったことから、ＩｇＧ１−２Ｆ８へのＦ４０５Ｌ突然変異の導入はそのＡＤＣＣエフェクター機能に影響を及ぼさなかったことが示される。また、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒに由来する二重特異性抗体はＡ４３１細胞に対してＡＤＣＣを用量依存的に誘導したことから、ＡＤＣＣエフェクター機能は二重特異性形式において維持されたことが示される。

実施例２８：ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１４０５位にある決定因子
実施例１６では、ＩｇＧ４−７Ｄ８と組み合わせた場合に、Ｆ４０５Ｌ突然変異がＦａｂアーム交換へのヒトＩｇＧ１の関与を可能にするのに十分なものであることを記載している。ヒトＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１４０５位にある決定因子をさらに調べるために、考えられる全てのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｘ変異体（ＣおよびＰを除く）をＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた。実施例１９に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。

図２３は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＸとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性結合の結果を示している。これらのデータはまた、表３に示すように、（−）Ｆａｂアーム交換なし、（＋／−）Ｆａｂアーム交換低率、（＋）Ｆａｂアーム交換中間率または（＋＋）Ｆａｂアーム交換高率としても評価した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における４０５位がＦ（＝野生型ＩｇＧ１）であった場合に、Ｆａｂアーム交換なし（−）と判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における４０５位がＧまたはＲであった場合には、Ｆａｂアーム交換は低率（＋／−）であると判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における４０５位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであった場合には、Ｆａｂアーム交換は高率（＋＋）であると判定した。これらのデータから、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、ＩｇＧ１４０５位における特定の突然変異が２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換へのＩｇＧ１の関与を可能にすることが示される。

実施例２９：ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１４０７位にある決定因子
実施例２８では、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、Ｆ４０５の位置におけるある特定の単一突然変異がＦａｂアーム交換へのヒトＩｇＧ１の関与を可能にするのに十分なものであることを記載している。ＣＨ３ドメインにおけるＦｃ：Ｆｃ界面位置に関係している他の決定因子もＦａｂアーム交換機構を媒介し得るかどうかを調べるために、ＩｇＧ１４０７位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｙ４０７Ｘ変異体（ＣおよびＰを除く）をＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた。実施例１９に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。

図２４は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｙ４０７Ｘ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性結合の結果を示している。これらのデータはまた、表４に示すように、（−）Ｆａｂアーム交換なし、（＋／−）Ｆａｂアーム交換低率、（＋）Ｆａｂアーム交換中間率または（＋＋）Ｆａｂアーム交換高率としても評価した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における４０７位がＹ（＝野生型ＩｇＧ１）、Ｅ、Ｋ、ＱまたはＲであった場合に、Ｆａｂアーム交換なし（−）と判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における４０７位がＤ、Ｆ、Ｉ、ＳまたはＴであった場合には、Ｆａｂアーム交換は低率（＋／−）であると判定し、ＩｇＧ１−２Ｆ８における４０７位がＡ、Ｈ、ＮまたはＶであった場合には、中間率（＋）であると判定し、ＩｇＧ１−２Ｆ８における４０７位がＧ、Ｌ、ＭまたはＷであった場合には、高率（＋＋）であると判定した。これらのデータから、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、ＩｇＧ１４０７位における特定の単一突然変異が２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換へのＩｇＧ１の関与を可能にすることが示される。

実施例３０：ＩｇＧ１ヘテロ二量体における非共有結合性ＣＨ３−ＣＨ３相互作用の定量化
実施例２１では、効率的なＦａｂアーム交換を可能にするＣＨ３−ＣＨ３ホモ二量体の相互作用の強度には特定の範囲があることを記載している。ＣＨ３界面における相互作用の強度は、親抗体（ホモ二量体）における両方の重鎖がＦａｂアーム交換反応において解離することが可能であり、かつ、それらがその後、ヘテロ二量体化反応において結合することが可能であるようなものでなければならない。安定なヘテロ二量体を生成するためには、ヘテロ二量体相互作用の強度は、それがホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利に働くように、ホモ二量体相互作用の強度よりも高くなければならない。これを確認するために、ヘテロ二量体におけるＣＨ３−ＣＨ３相互作用の強度を測定し、ホモ二量体における強度と比較した。ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−ＩＴＬホモ二量体に由来するＣＨ２−ＣＨ３フラグメントのＫ_Ｄを、実施例２１に記載のように測定した。ヘテロ二量体におけるＫ_Ｄの決定のため、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインフラグメント（Ｇ１−Ｆ４０５ＬおよびＧ１−ＩＴＬ）を、ヒンジを除く全ての抗体ドメインを含む、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲのＩｇＧ１Δヒンジフラグメントと混合した。両方のフラグメントにおけるヒンジ領域の欠如により、共有結合による重鎖間ジスルフィド結合は妨げられた。フラグメントを混合し、実施例２１に記載のように、２４時間後にネイティブ質量分析により分析した。表示したＣＨ２−ＣＨ３フラグメントまたはＣＨ２−ＣＨ３フラグメントとＩｇＧ１Δヒンジの混合物における非共有結合性ＣＨ３−ＣＨ３相互作用のＫ_Ｄ値を表５に示す。これらのデータから、試験条件下では、ヘテロ二量体相互作用の強度は対応するホモ二量体相互作用よりも高い（Ｋ_Ｄはより低い）ことが示唆される。

実施例３１：２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の生化学分析
ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体のバッチをＰＤ−１０脱塩カラム（カタログ番号１７−０８５１−０１；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）において精製した。次に、二重特異性産物の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）、質量分析、ＨＰＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸ）、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）により分析した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、実施例１５に記載するように、非還元条件下（図２５Ａ）および還元条件下（図２５Ｂ）で行った。図２５Ａは、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換後の抗体サンプルは完全なＩｇＧからなり、非還元ゲル上で微量の半分子（Ｈ１Ｌ１）が検出できることを示している。

ＨＰ−ＳＥＣを、実施例１５に記載するように行った。図２６（Ｂ）および図２６（Ａ）は、出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲそれぞれのＨＰ−ＳＥＣプロフィールを示している。両方の抗体の混合物（１：１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物をそれぞれ、図２６Ｃおよび図２６Ｄに示している。さらに、図２６Ｄは、サンプルの＞９９％は完全なＩｇＧからなり、凝集体は事実上形成されないことを示している。

質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を、実施例１２に記載するように行った。図２７（Ｂ）および図２７（Ａ）は、出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒそれぞれの質量分析プロフィールを示している。両方の抗体の混合物（１：１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物をそれぞれ、図２７Ｃおよび図２７Ｄに示している。２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換サンプルにおける産物は１４６，１５９．７ｋＤａであり、これは、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（１４６，２８９．０／２＝７３，１４５）×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１４６，０２８．０／２＝７３，０１４）に由来する二重特異性産物と完全に一致する。さらに、二重特異性抗体産物は均一なピークを示したが、これは、細かく分かれたピークをもたらしたであろう軽鎖の誤対合が起こらなかったことを示している。これらのデータは、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により二重特異性ＩｇＧがもたらされたことを示す。（^＊）により示している小さなピークは、分析の前の不完全な脱グリコシル化によって生じたものである。これらのデータは、二重特異性抗体サンプルがＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成されたことを示す。

キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を、ｉＣＥ２８０アナライザー（ＣｏｎｖｅｒｇｅｎｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。図２８Ａおよび図２８Ｂは、出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲそれぞれのｃＩＥＦプロフィールを示している。両方の抗体の混合物（１：１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間でのＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物をそれぞれ、図２８Ｃおよび図２８Ｄに示している。使用前に全サンプルを脱塩した。アッセイ混合物における終濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬＩｇＧ（０．３５％メチルセルロース；２％担体両性電解質３−１０；６％担体両性電解質８−１０．５；０．５％ｐＩマーカー７．６５および０．５％ｐＩマーカー１０．１０）であった。フォーカシングを３０００Ｖで７分間行い、電荷結合素子カメラでキャピラリー吸収全体像を記録した。ピークプロフィールの較正後、データをＥＺＣｈｒｏｍソフトウェアにより解析した。ｐＩマーカーを（^＊）により示している。これらのデータは、二重特異性抗体サンプルがＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成されたことを示す。

モノクローナル抗体の荷電アイソフォームを調査するための別の技術は、高圧液体クロマトグラフィー陽イオン交換（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸ）である。図２９Ａおよび図２９Ｂは、出発材料ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲそれぞれのＨＰＬＣ−ＣＩＥＸプロフィールを示している。両方の抗体の混合物（１：１）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性産物をそれぞれ、図２９Ｃおよび図２９に示している。ＨＰＬＣへ注入するために、サンプルを移動相Ａ（１０ｍＭＮａＰＯ４、ｐＨ７．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＰｒｏＰａｃ(登録商標)ＷＣＸ−１０、４ｍｍ×２５０ｍｍの分析カラムを流速１ｍＬ／分で用いることにより異電荷のＩｇＧ分子を分離した。移動相Ａと移動相Ｂ（１０ｍＭＮａＰＯ_４、ｐＨ７．０、０．２５ＭＮａＣｌ）の勾配により溶出を行い、検出を２８０ｎｍで行った。これらのデータは、二重特異性抗体サンプルがＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成されたことを示す。また、陽イオン交換はヘテロ二量体から残存したホモ二量体を分離するための強力なツールであることも示される。そのため、陽イオン交換クロマトグラフィーの別の用途は、二重特異性ヘテロ二量体のポリッシング、すなわち、交換後に残存した全てのホモ二量体を精製除去することである。

実施例３２：２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換の反応速度のモニタリングおよびＨＰＬＣ−ＣＩＥＸを用いることによる交換後に残存したホモ二量体の定量
２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成は、実施例１１に記載している。この実施例では、交換反応中に様々な時点において高圧液体クロマトグラフィー陽イオン交換（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸ；実施例３１に記載）を実施することによって交換反応をモニタリングした。

ホモ二量体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒを、各１ｍｇ／ｍＬの濃度にて１：１のモル比で混合した。２５ｍＭ２−ＭＥＡの添加後、サンプルを、２５℃に予め加温しておいたＨＰＬＣのオートサンプラーに入れた。図３０Ａ〜３０Ｈはそれぞれ、２−ＭＥＡの添加後の、ｔ＝０分からｔ＝４５０分までの、ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸによって得られた異なる時間間隔での８つの連続注入を示す。これらのデータから、二重特異性ＩｇＧがかなり迅速に形成され、ホモ二量体の大部分が１３５分後に交換されたことが示される。４５分後に現れている不均一なヘテロ二量体のピークはおよそ１８０分後により均一なピークに変わり、交換が異なる段階で行われることが示唆される。さらに、図３１Ａは、残存したホモ二量体のおよそ３％がＣＩＥＸ法で検出されたことを示している（矢印で示す）。示されるように、この方法は、交換反応がほぼ完了した時点で残存しているホモ二量体の含量の定量に好適である（ホモ二量体の溶出を図３１Ｂに示している）。

実施例３３：様々な２−ＭＥＡ濃度、温度およびインキュベーション時間で、高抗体濃度での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性抗体の生成
２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を高ＩｇＧ濃度で行った。交換量に及ぼす２−ＭＥＡ濃度、インキュベーション温度および時間の影響を調査した。

ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ×ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌの組合せを用いて交換プロセスを行った。プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーで両方の材料を精製した。材料を＞２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した後、ＨｉＰｒｅｐＱＦＦ１６／１０（ＧＥＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、＃２８−９３６５−４３）を用いて（フロースルーモードで）連続陰イオン交換工程を行った。最終精製材料に対してＰＢＳへのバッファー交換を行った。

二重特異性交換を、ＰＢＳ中最終ＩｇＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬ（終濃度１０ｍｇ／ｍＬの各ホモ二量体）および１０ｍｇ／ｍＬ（終濃度５ｍｇ／ｍＬの各ホモ二量体）で調査した。両方のＩｇＧ濃度について、２−ＭＥＡを終濃度１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭおよび１００ｍＭで含む別個の混合物を調製した。混合物をエッペンドルフチューブ中に、１００μＬアリコートに分け入れ、１５℃、２５℃および３７℃で保存した。各温度での異なるインキュベーション時間９０分、５時間および２４時間用に別個のチューブを用いた。

また、両方のＩｇＧ濃度について、２−ＭＥＡを含めずに混合物を調製し、未処理の対照として４℃で保存した。適当なインキュベーション時間の後、９０分および５時間のサンプルを脱塩のために採取し、２−ＭＥＡを除去した（９０分のサンプルは、最初に氷上に置き、交換反応を停止させた）。Ｚｅｂａ９６ウェル脱塩プレート（７ｋ、カタログ番号８９８０８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてサンプルを脱塩した。２４時間のサンプルは、２４時間のインキュベーション後に別々に脱塩した。

実施例７に記載するように、抗体サンプルの連続希釈物（９０分および５時間のサンプルについては３倍希釈により総抗体濃度１０〜０．１２３μｇ／ｍＬ；２４時間サンプルについては３倍希釈により１０〜０．０４１μｇ／ｍＬ）をサンドイッチＥＬＩＳＡに用いて、二重特異性結合を測定した。プレートごとに、ＩｇＧ１−２Ｆ８−ＩＴＬとＩｇＧ４−７Ｄ８−ＣＰＰＣとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換に由来する二重特異性抗体の精製バッチ（実施例１５に記載）の対照を含めた。図３２（Ａ）〜（Ｆ）は、各ＥＬＩＳＡプレートにおいて測定した二重特異性結合の結果を示している。最も高いＯＤ４０５値（ＥＬＩＳＡにより１０μｇ／ｍＬ濃度について決定した場合）を用い、対照（１００％に任意設定）に対する二重特異性結合を算出した。これにより、各２−ＭＥＡ濃度について図３３（Ａ）〜（Ｄ）に示されるように、対照との比較での制御されたＦａｂアーム交換のパーセンテージ（％ｃＦＡＥ）が得られた。

データから、両方のＩｇＧ濃度について、全ての温度−時間条件において、二重特異性結合の最大レベル（対照に対して８９〜１０９％）に１００ｍＭ２−ＭＥＡの濃度で達したことが示される。５０ｍＭ２−ＭＥＡでは、最大の結合（８８〜１０７％）に、２５℃および３７℃で、さらに２４時間のインキュベーション後には１５℃で達した。より低い濃度の２５ｍＭおよび１０ｍＭ２−ＭＥＡについては、交換は、より高い温度でより効率的であり、インキュベーション時間の延長とともに増加し、２５ｍＭ２−ＭＥＡでの２４時間のインキュベーションにより３７℃で最大の交換に至った。１０ｍＭ２−ＭＥＡで試験した条件では、１００％の二重特異性産物は生成されなかった。交換プロセスは、２０ｍｇ／ｍＬの総ＩｇＧと比べ、ＩｇＧ濃度１０ｍｇ／ｍＬでは少し速かった。

二重特異性抗体が形成されたことを確認し、二重特異性産物をより詳細に調査するために、サンプルを陽イオン交換（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸ）分析で分析した。ＩｇＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬに関する５時間および２４時間のインキュベーション後の、全ての２−ＭＥＡ濃度のサンプルについて、実施例３１に記載するように、ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸ分析を行った。

図３４（Ａ）〜（Ｄ）のＣＩＥＸクロマトグラムは、５０ｍＭおよび１００ｍＭ２−ＭＥＡで二重特異性産物の最も高い収量が得られたことを示し、このことから、二重特異性ＥＬＩＳＡの結果が確認された。しかしながら、５０ｍＭおよび１００ｍＭ２−ＭＥＡでは少量の残存ホモ二量体が依然として検出された（２５℃および３７℃でインキュベートしたサンプルでは各ホモ二量体の２〜３．５％）。より高い温度、より長い（２４時間の）インキュベーション時間および２−ＭＥＡ濃度増加での交換は、ＣＩＥＸプロフィールにおいて２２〜２４分にさらなるピークの出現をもたらす。

交換が５時間以内で完了した場合には、最少量のさらなるピークが得られた。これらのピークの性質を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＨＰ−ＳＥＣ分析を行った。ＨＰ−ＳＥＣは、全ての条件で凝集体の量が１％未満であったことを示し、さらなるピークが凝集体に相当しないことが示唆された。しかしながら、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥは追加のピークが、１つまたは２つの軽鎖を欠いているヘテロ二量体に相当し得ることを示した。少量の半分子も検出された。

実験から、交換反応が高いホモ二量体濃度で起こり、これによって、このプロセスが商業規模で魅力的なものになること、ならびに二重特異性抗体の収量が２−ＭＥＡ濃度、温度およびインキュベーション時間によって異なることが示される。

実施例３４：ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１３６８位にある決定因子
実施例２８および実施例２９は、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、Ｆ４０５およびＹ４０７の位置におけるある特定の単一突然変異がＦａｂアーム交換へのヒトＩｇＧ１の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、ＣＨ３ドメインにおけるＦｃ：Ｆｃ界面位置に関係しているさらなる決定因子もＦａｂアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、ＩｇＧ１３６８位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｘ変異体（ＣおよびＰを除く）をＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた。実施例１９に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。

図３５は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｘ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性結合の結果を示している。これらのデータはまた、表６に示すように、（−）Ｆａｂアーム交換なし、（＋／−）Ｆａｂアーム交換低率、（＋）Ｆａｂアーム交換中間率または（＋＋）Ｆａｂアーム交換高率としても評価した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３６８位がＬ（＝野生型ＩｇＧ１）、ＦまたはＭであった場合に、Ｆａｂアーム交換なし（−）と判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３６８位がＹであった場合には、Ｆａｂアーム交換は低率（＋／−）であると判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３６８位がＫであった場合には、Ｆａｂアーム交換は中間率（＋）であると判定し、ＩｇＧ１−２Ｆ８における３６８位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷであった場合には、高率（＋＋）であると判定した。これらのデータから、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、ＩｇＧ１３６８位における特定の突然変異が２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換へのＩｇＧ１の関与を可能にすることが示される。

実施例３５：ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１３７０位にある決定因子
実施例２８、実施例２９および実施例３４は、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、Ｆ４０５、Ｙ４０７またはＬ３６８の位置におけるある特定の単一突然変異がＦａｂアーム交換へのヒトＩｇＧ１の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、ＣＨ３ドメインにおけるＦｃ：Ｆｃ界面位置に関係しているさらなる決定因子もＦａｂアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、ＩｇＧ１３７０位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｋ３７０Ｘ変異体（ＣおよびＰを除く）をＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた。実施例１９に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。

図３６は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｋ３７０Ｘ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性結合の結果を示している。これらのデータはまた、表７に示すように、（−）Ｆａｂアーム交換なし、（＋／−）Ｆａｂアーム交換低率、（＋）Ｆａｂアーム交換中間率または（＋＋）Ｆａｂアーム交換高率としても評価した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３７０位がＫ（＝野生型ＩｇＧ１）、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹであった場合に、Ｆａｂアーム交換なし（−）と判定した。Ｋ３７０がＷと置換されている場合のみ、中間率のＦａｂアーム交換（＋）を生じた。これらのデータから、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、ＩｇＧ１３７０位におけるただ１つの突然変異（Ｋ３７０Ｗ）だけが２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換へのＩｇＧ１の関与を可能にすることが示される。

実施例３６：ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１３９９位にある決定因子
実施例２８、実施例２９、実施例３４および実施例３５は、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｌ３６８またはＫ３７０の位置におけるある特定の単一突然変異がＦａｂアーム交換へのヒトＩｇＧ１の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、ＣＨ３ドメインにおけるＦｃ：Ｆｃ界面位置に関係しているさらなる決定因子もＦａｂアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、ＩｇＧ１３９９位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３９９Ｘ変異体（ＣおよびＰを除く）をＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた。実施例１９に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。

図３７は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３９９Ｘ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性結合の結果を示している。これらのデータはまた、表８に示すように、（−）Ｆａｂアーム交換なし、（＋／−）Ｆａｂアーム交換低率、（＋）Ｆａｂアーム交換中間率または（＋＋）Ｆａｂアーム交換高率としても評価した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３９９位がＤ（＝野生型ＩｇＧ１）、ＥおよびＱであった場合に、Ｆａｂアーム交換なし（−）と判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３９９位がＶであった場合には、Ｆａｂアーム交換は低率（＋／−）であると判定し、ＩｇＧ１−２Ｆ８における３９９位がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＷであった場合には、中間率（＋）であると判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３９９位がＡ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＹであった場合には、Ｆａｂアーム交換は高率（＋＋）であると判定した。これらのデータから、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、ＩｇＧ１３９９位における特定の突然変異が２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換へのＩｇＧ１の関与を可能にすることが示される。

実施例３７：ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与のためのＩｇＧ１３６６位にある決定因子
実施例２８、実施例２９、実施例３４、実施例３５および実施例３６は、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｌ３６８、Ｋ３７０またはＤ３９９の位置におけるある特定の単一突然変異がＦａｂアーム交換へのヒトＩｇＧ１の関与を可能にするのに十分なものであることを示している。この実施例において例示するように、ＣＨ３ドメインにおけるＦｃ：Ｆｃ界面位置に関係しているさらなる決定因子もＦａｂアーム交換機構を媒介し得る。この趣旨で、ＩｇＧ１３６６位の突然変異誘発を行い、変異体を、ヒトＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒとの組合せでの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換への関与について試験した。考えられる全てのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｔ３６６Ｘ変異体（ＣおよびＰを除く）をＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた。実施例１９に記載するように、精製抗体を用いてその手順を行った。

図３８は、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｔ３６６ＸおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換による二重特異性結合の結果を示している。これらのデータはまた、表Ｘに示すように、（−）Ｆａｂアーム交換なし、（＋／−）Ｆａｂアーム交換低率、（＋）Ｆａｂアーム交換中間率または（＋＋）Ｆａｂアーム交換高率としても評価した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３６６位がＴ（＝野生型ＩｇＧ１）、Ｋ、Ｒ、ＳまたはＷであった場合に、Ｆａｂアーム交換なし（−）と判定した。ＩｇＧ１−２Ｆ８における３６６位がＦ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＹであった場合には、Ｆａｂアーム交換は低率（＋／−）であると判定し、ＩｇＧ１−２Ｆ８における３６６位がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、ＶまたはＱであった場合には、中間率（＋）であると判定した。これらのデータから、ＩｇＧ１−Ｋ４０９Ｒと組み合わせた場合に、ＩｇＧ１３６６位における特定の突然変異が２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換へのＩｇＧ１の関与を可能にすることが示される。

実施例３８：高効率のＩｇＧ１変異体で識別するために２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換が準最適に行われる条件範囲の決定
２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換のプロセスは、２５ｍＭ２−ＭＥＡを用いる場合、３７℃で効率的に行われる。これらの条件下で、許容ＩｇＧ１変異体（実施例１９、実施例２８、実施例２９および実施例３４〜３７に記載するように、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位および／または４０９位にある特定の単一突然変異を有するＩｇＧ１）の大部分は、高レベルの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換（８０％〜１００％）を示す。最大効率を有するＩｇＧ１変異体での識別を可能にする実験条件を特定するために、４つの異なる変異体組合せ（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｓ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ａ、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３９９Ｒ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｇ、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｒ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＨおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ）についての２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアームをそれぞれ、１５℃でおよび２０℃で経時的に調査した。温度、期間および抗体希釈（２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬおよび０．０２μｇ／ｍＬ）の変更を除き、実施例１９に記載するように、その手順を行った。

２０℃では、４つの変異体組合せの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換は、最大の交換（陽性対照）と比べて異なる割合で行われた。１０５分のインキュベーション後、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｒ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｈは最大レベルの交換に達したが、一方、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｓ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ａ、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３９９Ｒ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＧおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒは２００分後に、それぞれ、最大９０％、８５％および８５％に達した。

１５℃での異なるＩｇＧ１変異体組合せのインキュベーションは、交換率において最も顕著な差を示した（図３９に示す）。６０分および１０５分のインキュベーション後に、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換、４つの変異体組合せの間での差は最も極端であった。２００分のインキュベーション後のＦａｂアーム交換は、陽性対照に対して、１００％（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｒ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｈ）、８５％（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９ＲおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｄ３９９Ｒ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｇ）または６５％（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｓ×ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ａ）の効率を示した。

実施例３９：準最適条件での変異体の２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換効率の解析２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換のプロセスは、２５ｍＭ２−ＭＥＡを用いる場合、３７℃で効率的に行われる。これらの条件下で、許容ＩｇＧ１変異体（実施例１９、実施例２８、実施例２９および実施例３４〜３７に記載するように、３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位および４０７位および／または４０９位にある特定の単一突然変異を有するＩｇＧ１）の大部分は、高レベルの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換（８０％〜１００％）を示す。実施例３８では、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換効率の差は、いわゆる準最適条件、すなわち、１５℃で６０〜１０５分間でのインキュベーション後に最も顕著であることを記載している。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換＞９０％を示す、Ｌ３６８、Ｄ３９９、Ｆ４０５およびＹ４０７（表１１参照）についての合計２４のＩｇＧ１−２Ｆ８変異体（実施例２８、実施例２９および実施例３４〜３７）を選択し、（実施例１９に示した結果に基づき）ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ａ、Ｇ、ＨまたはＲとのＦａｂアーム交換の解析を行った。これらの変異体組合せを二重特異性抗体の生成効率によって分類するために、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を１５℃で９０分間（準最適条件）行った。ＩｇＧ１−７Ｄ−Ｋ４０９Ｒとのインキュベーション後に弱い、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を示した２つのＩｇＧ１−２Ｆ８変異体（Ｙ４０７Ｑ）および（Ｄ３９９Ｑ）（実施例２９および実施例３６）をさらなる陰性対照として取り入れ、それらを用いて、Ｋ４０９位の別のアミノ酸（Ｇ、ＨまたはＷ）とのインキュベーションが異なる結果をもたらすかどうかを調査した。温度の変更および抗体希釈の変更（２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬおよび０．０２μｇ／ｍＬ）を除き、実施例１９に記載するように、その手順を行った。

全ての異なるＩｇＧ１変異体組合せ（表１０に示す）の１５℃で９０分間のインキュベーションにより、種々の、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換効率の範囲が示された。抗体濃度２０μｇ／ｍＬでの二重特異性結合の結果を表１０に示す。下表１０で凡例に明記するように、結果を４つの種類に分類した；二重特異性結合無し（−）、低二重特異性結合効率（＋／−）中間二重特異性結合効率（＋）および高二重特異性結合効率（＋＋）。これらの結果から、準最適条件下でＩｇＧ１分子におけるアミノ酸突然変異のいくつかの組合せは２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換に有利であることが明らかになる。

先に得られた結果（表１０）を確認するための二次解析のために、試験した突然変異ＩｇＧ１−２Ｆ８分子（表１０）から６つを選択した。高い、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換効率（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｒ）および中間の、２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換効率（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｌ３６８Ｗ、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｉ、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｙ４０７Ｗ）に関していくつかの変異体を選択した。また、２回目にＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｙ４０７Ｑも解析したが、その理由はそれがＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｈとの２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換反応で予想外の陽性を示したためである。概して、図４０に示されたこれらの結果から、一次解析（表１０）が確認され、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｈとの突然変異ＩｇＧ１−２Ｆ８分子の２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換反応が最大効率を示したことが示される。さらに、実施例２８、実施例２９および実施例３４〜３７において陰性と報告した、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと突然変異ＩｇＧ１−２Ｆ８分子との間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換反応は、それでも、ＩｇＧ１の２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換を潜在的に促進することから、興味深いものである。

実施例４０：ホモ二量体タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の生成
ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒを発現する安定なＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞株を、ＩｇＧ重鎖および軽鎖配列をコードするグルタミンシンターゼ（ＧＳ）発現ベクターシステム（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，スラウ，ＵＫ）でＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ宿主細胞（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，スラウ，ＵＫ）をトランスフェクトすることにより生成した。タンパク質フリー既知組成培地（ＣＤ−ＣＨＯ；カタログ番号１０７４３−０２９;Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ブレダ，オランダ）中でヌクレオフェクション（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，スラウ，ＵＫ）を用いて細胞をトランスフェクトした。細胞をグルタミン欠乏ＣＤ−ＣＨＯ培地に０．１細胞／ウェルで播種した。グルタミン欠乏培地での増殖に対して耐性のクローン細胞株の選択後、細胞をＣＤ−ＣＨＯでの懸濁増殖に適応させ、凍結バイアルとして確保した。細胞に対して遺伝子増幅は行わなかった。ＩｇＧを生産するために、細胞をμ−２４Ｍｉｃｒｏ−Ｒｅａｃｔｏｒ中に、０．７ｇ／ＬＬ−チロシン二ナトリウム塩（カタログ番号Ｔ１１４５−５００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ズウェインドレヒト，オランダ）および０．１５ｇ／ＬＬ−システイン（カタログ番号Ｃ７３５２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＣＤ−ＣＨＯ中４．０×１０^５個細胞／ｍＬの濃度で接種し、３７℃で１５日間インキュベートした、ｐＨ７．００、初期振盪速度７０ｒｐｍ、ガス流速２０ｓｌｐｍ、最大酸素流速８５％およびＤＯ３０％。供給は、３日目に開始し、１４日目まで続けた。供給は、既知組成培地を含有するＣＨＯ効率の良い供給材料で構成し、ＩｇＧ−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒそれぞれを発現するＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞株について約１．３〜３．４ｇ／Ｌおよび０．１〜３．５ｇ／Ｌの集菌量で生産レベルを得た。その後、生産性の最も良い細胞株を用い、同様のフェドバッチプロセスを用いて２Ｌバイオリアクターを運転した。ＩｇＧをプロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。精製後、ＩｇＧをＰＢＳで処方した。

実施例４１：ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の形成
ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成された二重特異性抗体の４０ｍＬバッチを作出した。各抗体を終濃度１０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、合計２０ｍｇ／ｍＬ）で含有する抗体混合物を、ＰＢＳ中、５０ｍＭ２−ＭＥＡの存在下、２５℃で５時間インキュベートした。抗体混合物を氷上で一晩保存した。そのバッチに対して、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（カタログ番号１７−５０８７−０１、ＧＥＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を用いて脱塩することによりバッファー交換を行い、精製後にまたはさらに４℃で６日間保存を行った後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、上記のように、還元条件下および非還元条件下で行った。図４２は、完全なＩｇＧバンド（ＬＨＨＬ）の他に、半分子に相当するバンド（ＨＬ）と、他の組合せに相当するバンドが存在することによって示されるように、バッファー交換直後には部分的な再酸化しか見られなかったことを示している（Ａ、レーン３）。４℃で６日の保存後の分析は、再酸化が完了していることを示した（Ｃ、レーン４）。還元ゲル（Ｂ、Ｄ）は単一の重鎖と軽鎖を示している。

これにより、再酸化は非常にゆっくりと大量に起こり、一晩インキュベーション後には完了していなかったことが示される。

実施例４２：再酸化プロセスにおける微量金属の役割
再酸化プロセスにおける微量金属の役割を調べるために、抗ＣＤ３８抗体を５０ｍＭ２−ＭＥＡの存在下で２５℃で５時間インキュベートした（１５ｍｇ／ｍＬ；１ｍＬ）。サンプルを、ＰＤ−１０カラム(ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いて脱塩し、０．５ｍｇ／ＬＣｕ^２＋を含有するＰＢＳ（ＣｕＳＯ_４；カタログ番号４５１６５７−１０Ｇ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）または２ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳへバッファーを交換した。サンプルを、室温で異なる期間のインキュベーション後に採取し、３μＬの１Ｍ２−オドアセトアミド(2-odoacetamide)（ＩＡＡ；カタログ番号Ｉ−１１４９、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）でクエンチし、暗所で室温で３０分間保存した。その後、さらなる解析までサンプルを５℃で保存した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、上記のように、非還元条件下および還元条件下で行った。

図６１Ａは、ＥＤＴＡを含有するＰＢＳへのバッファー交換が再酸化を妨げたことを示している。ＥＤＴＡの存在下では（レーン２〜７）、遊離した軽鎖（Ｌ）と重鎖（Ｈ）が全ての時点において存在した。さらに、抗体半分子（ＨＬ）および１つの軽鎖を欠いている抗体（ＨＨＬ）または２つの軽鎖を欠いている抗体（ＨＨ）など、他の不完全に再酸化された種が存在した。Ｃｕ^２＋を含有するＰＢＳへのバッファー交換は再酸化を誘導した（図６１Ｂレーン２〜７、および図６２）。完全な再酸化には達していなかったが、全ての時点において、抗体の著しい再酸化と遊離した軽鎖および重鎖の完全な不在が観察された。還元ゲル（Ｂ、Ｄ）は単一の重鎖と軽鎖を示している。

実施例４３：異なるバッファー条件下で、ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８-Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成される二重特異性抗体の形成
二重特異性抗体のバッチを、異なるバッファー条件下、０．５ｍＬスケールで、ヒトＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬとＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの間での２−ＭＥＡ誘導によるＦａｂアーム交換により生成した。抗体を以下のバッファーにより５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した：１）１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）：８．１ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、１．５ｍＭリン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、１３８ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２．７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）ｐＨ５．０（１０×ＤＰＢＳ、カタログ番号１４２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから希釈した）；２）１×ＤＰＢＳｐＨ７．０３）２０ｍＭクエン酸ナトリウム（カタログ番号０１１９−０１、ＪＴＢａｋｅｒ）、ｐＨ４．９；４）２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；および５）２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（カタログ番号Ｔ６６６６およびＴ６７９１、Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭＮａＣｌ（カタログ番号３６２４−０１、ＪＴＢａｋｅｒ）、ｐＨ７．８。その後、抗体、終濃度各２ｍｇ／ｍＬ（すなわち、総抗体濃度４ｍｇ／ｍＬ）を、４５ｍＭまたは６０ｍＭ２−ＭＥＡの存在下、２５℃で２〜５時間インキュベートした。２−ＭＥＡは、抗体と同じバッファーを用いて調製した３００ｍＭ保存溶液から加えた。様々な時点において、サンプルを採取し、製造業者の使用説明書に従って、ｉｌｌｕｓｔｒａｍｉｃｒｏｓｐｉｎＧ−２５カラム（カタログ番号２７−５３２５−０１、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（リン酸二ナトリウム、カタログ番号３８２８−０１およびリン酸一ナトリウム、カタログ番号３８１８−０１、両方ＪＴＢａｋｅｒ）、ｐＨ７．０へ抽出した。次に、サンプルを上記のように、分析的ＣＩＥＸにより分析して、ヘテロ二量体化のパーセンテージを決定した。図４１は、最終のヘテロ二量体レベルはＴｒｉｓの場合とリン酸バッファーの場合は同程度であったが、ヘテロ二量体形成の速度論は明らかに、バッファーの種類およびｐＨにより影響を受けたことを示している。反応速度は、クエン酸バッファー、ｐＨ４．９の場合、リン酸バッファー、ｐＨ５．０およびクエン酸バッファー、ｐＨ６．０の場合よりも遅く見えた。反応速度は、１×ＤＰＢＳｐＨ５．０の場合、１×ＤＰＢＳｐＨ７．０の場合と比べて遅かった。

実施例４４：ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体の還元および酸化の間の酸化還元電位、酸素飽和度および中間体の形成
ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ３８抗体（国際出願第２００６０９９８７５号（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されている００５を用いて、還元プロセスおよび再酸化プロセスを評価するためのモデルシステムを開発した。抗ＣＤ３８抗体（２０ｇ／Ｌ）を、中空糸カートリッジ、３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、０．１ｍ^２（カタログ番号Ｐ−Ｎ１−０３０Ｅ−２００−０１Ｎ、Ｊ＆ＭＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ティルブルク，オランダ）を用いて製剤バッファー（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、６０ｍＭ塩化ナトリウム［カタログ番号３６２４−０１、ＪＴＢａｋｅｒ］、１４０ｍＭマンニトール、０．００６％ポリソルベート２０、ｐＨ５．５）からＰＢＳ（カタログ番号３６２３１４０、Ｂ．Ｂｒａｕｎ，オス，オランダ）、ｐＨ７．４中へダイアフィルトレーション処理し、２Ｌ反応器において総容量８３３ｍＬで２４ｇ／Ｌに濃縮した。温度を２５℃で、振盪を１００ｒｐｍで制御した。反応を追跡するために、酸化還元プローブ（ＡｐｐｌｉｃｏｎＢｉｏｔｅｃｈ，スキーダム，オランダ）および溶存酸素（ＤＯ）プローブ（ＡｐｐｌｉｃｏｎＢｉｏｔｅｃｈ）を用いて溶液をモニタリングした。実験の開始時に、溶液の酸化還元電位は２５９．６ｍＶであり、ＤＯは１００％（酸素の空気飽和）であった。０時間において、還元体２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、システアミン）を反応器に終濃度３００ｍＭで添加し、これにより、２０ｇ／Ｌ抗ＣＤ３８抗体および３００ｍＭ２−ＭＥＡの初期溶液を得た。２−ＭＥＡの添加により、酸化還元電位はすぐに約−４００ｍＶに低下した（図４３）。また、ＤＯもこの時点で酸素の最初の１００％空気飽和の２．６％に低下し、これは、２−ＭＥＡが二量体型シスタミンへと自動酸化を受けたことを示している。５時間後に、ＰＢＳ、ｐＨ７．４でのダイアフィルトレーションによって過剰の２−ＭＥＡ（およびシスタミン）を除去した。これを行うために、反応器内容物を、３０ｋＤａ修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸カートリッジ（カタログ番号Ｐ−Ｎ１−０３０Ｅ−２００−０１Ｎ、Ｊ＆ＭＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ティルブルク，オランダ）３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、０．１ｍ^２を通して循環させた。カートリッジ入口圧を２５ＰＳＩ（１７０ｋＰａ）で制御し、これにより、透過物流を２５ｍＬ／分とした。ダイアフィルトレーションバッファー、例えば、ＰＢＳは、透過物がシステムを出発するのと同じ速度でシステムに加えた。ダイアフィルトレーションは、最初の容量の７倍（７ダイアフィルトレーション容量；約７Ｌ）がシステムを通過するまで継続し、それには、４時間半を要した。その時点以降、能動的温度および振盪制御によりシステムを一晩インキュベートした。翌日、ＤＯおよび酸化還元電位値は開始レベルより実質的に低いままであり、反応が完了しなかったことが示唆される。この仮説を評価するために、硫酸銅を終濃度０．５ｍｇ／Ｌに加えた（ＣｕＳＯ_４；カタログ番号４５１６５７−１０Ｇ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）。Ｃｕ^２＋などの二価金属イオンはスルフヒドリル酸化の触媒である。硫酸銅の添加により、すぐにさらなるＤＯの減少が起こり、酸素がすぐに消費されたこと、例えば、（再）酸化が示唆される。実験を通して、反応器から１４サンプルを採取し、すぐに、２−ヨードアセトアミド（ＩＡＡ、カタログ番号Ｉ−１１４９、Ｓｉｇｍａ）でクエンチした（反応器のサンプル１ｍＬに対して１Ｍ２−ヨードアセトアミド２０μＬを加えた）。２−ヨードアセトアミドはシステインのチオール基と共有結合するため、鎖間ジスルフィド結合を再編成する還元型システインの能力が妨げられる。このようにして、２−ＭＥＡによる還元および酸素による抗体の再酸化の反応速度を追跡することができる。ＨＰ−ＳＥＣ（図４４）、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４５）および液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）（図４６）によりサンプルを分析した。サンプル１およびサンプル２は、製剤バッファーからＰＢＳ中への移行前および移行後の抗ＣＤ３８抗体を示す対照である。サンプル３〜８は、５時間の還元段階中の産物を示す。ＨＰ−ＳＥＣ（２８０ｎｍでのモニタリング）によれば、抗体は完全な産物として溶出した；後に溶出する産物はシスタミンである（２−ＭＥＡは２８０ｎｍで強く吸収しない）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、産物は、非還元ゲルの変性条件下で重鎖および軽鎖の２つの独立したバンドとして泳動した。まとめると、これらのデータは、産物は１時間のうちに十分に還元された（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が、ネイティブ条件下では重鎖および軽鎖は非共有相互作用により結合したままであった（ＨＰ−ＳＥＣ）ことを示している。サンプル９〜１２はダイアフィルトレーションプロセスの間に採取した。ＨＰ−ＳＥＣによれば、産物はネイティブ条件下で完全なままであった；遅れて溶出するシスタミンのピークは徐々に消失し、その後、２−ＭＥＡと反応する２−ヨードアセトアミドに相当するピークが出現した。これらの結果は、２−ヨードアセトアミドと反応する２−ＭＥＡが溶液中にまだ過剰にあること、または２−ＭＥＡはタンパク質と結合し、一晩でもしくは２−ヨードアセトアミドの添加により放出されたことを示唆している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、単一の重鎖および単一の軽鎖のバンドから未知の組成物の複数のバンドへの変化があった；しかしながら、ダイアフィルトレーションの終了（サンプル１３）までに、産物は、硫酸銅の添加（サンプル１４）前でさえも、天然型へと十分に再酸化された。

抗体の還元および再酸化のプロセスをモニタリングするために、サンプルをＥＳＩ−ＭＳにより分析し、分子量を決定した。プロフィールにおける異なるピークは、プロセス中に形成された、半分子などの中間体に相当する。サンプルを、ＢＥＨ３００Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍカラムの付いたＡｑｕｉｔｙＵＰＬＣ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ，ミルフォード，ＵＳＡ）において６０℃で脱塩し、０．０５％ギ酸（ＦｌｕｋａＲｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａeｎ，ブーフス，ドイツ）を含有する、ＭＱ水（エルエンス(Eluens)Ａ）およびＬＣ−ＭＳ用アセトニトリル（エルエンス(eluens)Ｂ）（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ，ファルケンスワールト，オランダ）の混合物の勾配により溶出した。飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルは、ｍｉｃｒＯＴＯＦ(商標)質量分析計において陽イオンモードで動作させ、オンラインで記録した。分析の前に、５００〜４０００ｍ／ｚスケールをＥＳｔｕｎｉｎｇｍｉｘ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，サンタクララ，ＵＳＡ）で較正した。ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ(商標)ソフトウェアｖ．３．４（Ｂｒｕｋｅｒ，ブレーメン，ドイツ）を用いて提供される最大エントロピーを用いて、質量スペクトルをデコンボリューション処理した。

図４６は、抗ＣＤ３８抗体の還元および再酸化の間の質量分析プロフィールを示している。還元段階の間に採取したサンプル（サンプル３〜８）は、２−ＭＥＡが還元型軽鎖と共有結合した（質量差７５Ｄａ）ことを示した。これは、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４５）における複数の軽鎖バンドの説明となりそうである。還元段階の間に採取したＥＳＩ−ＭＳサンプルによって検出された全長ＩｇＧは、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４５）では検出されなかったことから、質量分析手法までに全長ＩｇＧへの再酸化が誘導されたことは明らかである。ダイアフィルトレーション開始により、全長抗体への再酸化が起こり、ＨＬフラグメント（質量およそ７５ｋＤａ）およびＨＨＬフラグメント（質量およそ１２０ｋＤａ）が中間体として存在した。これらのデータはまた、ダイアフィルトレーションによる還元体（例えば２−ＭＥＡ）除去の間に、その天然の、共有結合によるシステイン結合が再編成されたことにより抗体が再酸化されたことも示している。

実施例４５：再酸化プロセスに及ぼす高速ダイアフィルトレーションおよび２回目のダイアフィルトレーションの影響
以下の点を除いて、実施例４４の実験を繰り返した。第１に、還元工程を５時間から４時間へ短縮した。これは、還元が４時間以内に既に完了していたことが観察されたためであった。第２に、プロセスを加速するために、より大きな中空糸カートリッジ３０ｋＤａ、０．４ｍ^２を用いることによって、ダイアフィルトレーション時間を１時間に短縮した。１ｃｍ^２当たりの透過物流を実施例４４の場合と同じにし、４倍速いダイアフィルトレーション工程とした。第３に、一晩の酸化期間後、さらに７ダイアフィルトレーション容量を用いて２回目のダイアフィルトレーションを行った。これは、１回目の実験により一晩インキュベーション後に２−ＭＥＡが出現することが示されたためであった。２−ヨードアセトアミド処理サンプルの酸化還元電位およびＤＯの出力の傾向（図４７）ならびにＨＰ−ＳＥＣ（図４８）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４９）の結果は、２回目のダイアフィルトレーションポイントまで実施例４４での結果と一致した（実施例４４と本実施例では酸化還元電位および酸素飽和度の時間尺度が異なることに留意されたい）。２回目のダイアフィルトレーションの直前に、産物は、前日のダイアフィルトレーションの終了と比べて少し減少しているように見えた（図４９、レーン１８とレーン１５）。２回目のダイアフィルトレーション後（レーン１９）、産物は元の状態のものに戻り、２−ＭＥＡ−２−ヨードアセトアミドピークはＨＰ−ＳＥＣプロフィールから消失した。さらに、２回目のダイアフィルトレーション後、酸化還元プローブおよびＤＯプローブの値（図４７）は実験開始時の値と同様であり、このことから、反応は完了し、システムから２−ＭＥＡおよびシスタミンの痕跡が、実施例４４に記載した実験の場合よりも十分に除去されたことが示唆される。さらに、２回目のダイアフィルトレーション後の硫酸銅の添加により酸化還元電位またはＤＯの変化は起こらず、感知できるレベルの易酸化性スルフヒドリルが存在しないことが示された。これらの結果は、２回目のダイアフィルトレーションが、溶液中に残っているかまたは一晩インキュベーション後にタンパク質から遊離した過剰の２−ＭＥＡを除去するのに有用であったことを示している。

実施例４６：高速ダイアフィルトレーションと低い２−ＭＥＡ濃度との組合せの影響
実施例４４において一晩インキュベーション後に観察された残存２−ＭＥＡから、２−ＭＥＡ濃度が高すぎたことが示唆された。そのため、２−ＭＥＡ濃度を３００ｍＭから５０ｍＭへ下げ、実施例４５の場合と同様に、還元工程を４時間へ短縮し、ダイアフィルトレーション時間を１時間に速めたことを除いて、実施例４４の実験を繰り返した。還元およびダイアフィルトレーション後に、ＤＯプローブおよび酸化還元プローブは元の値に戻った。このことから、反応が完了したことが示唆される（図５０）。銅の添加は何の影響も与えず、このことからも、反応が完了したことがさらに示唆される。実施例４４および実施例４５で観察されるように、ＨＰ−ＳＥＣ分析では産物はネイティブ条件下で完全なままであった（図５１）；さらに、遅れて溶出するシスタミンのピークは徐々に消失し、その後、２−ＭＥＡと結合する２−ヨードアセトアミドに相当するピークが出現した。しかしながら、この場合、後に溶出するピークは全て、一晩インキュベーション後に消えた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図５２）は、還元段階の間に完全な抗体が存在しないことを示した（レーン３〜６）が、この場合、分子は別々の重鎖と軽鎖へと十分には還元されなかった。ダイアフィルトレーション（レーン７〜１０）によって、抗体は元のバンディングパターンに再編成し、一晩インキュベーションによってそのように残った（レーン１１〜１４）ことはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって明らかであった。

実施例４７：高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階の間のＥＤＴＡの存在の影響抗ＣＤ３８抗体に対して、製剤バッファーから、２ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳへ交換したことを除いて、実施例４６の実験を繰り返した。ＥＤＴＡを添加する目的は、還元段階の間の２−ＭＥＡの自動酸化を阻害することおよび潜在的には、遊離タンパク質のスルフヒドリルとの２−ＭＥＡの結合を制限することであった。２−ＭＥＡの添加により、実施例４６（図５０）に示したように、酸化還元電位はすぐに低下した（図５３）。しかしながら、ＤＯ減少率は実施例４６で観察されたものよりもずっと低かった（図５３Ｂ参照）。金属キレート剤であるＥＤＴＡの添加による酸化速度の減少は、バッファー試薬中の微量金属不純物が還元段階の間の２−ＭＥＡの自動酸化を触媒していたことを示唆している。しかしながら、ＥＤＴＡは２−ＭＥＡの自動酸化を十分には阻害できず、これは、ＤＯが最終的にゼロ近くまで減少したためであった。このことから、実験条件下では、最後には、酸素移動が２−ＭＥＡの自動酸化の律速であったことが示唆される。ＥＤＴＡを含まないＰＢＳに対するダイアフィルトレーション後に、ＤＯは１００％の開始点にほぼ戻り、酸素消費速度が遅いことが示唆されたが、一方、酸化還元電位は依然として開始点より実質的に低かった。０．５ｍｇ／Ｌの硫酸銅の添加により少量の沈殿が生成したが、これは残存したＥＤＴＡが銅イオンと結合したことによる可能性が高い。さらに、ＤＯはほぼ１０％減少し、これは、銅イオンの添加による酸化の増加を示している。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図５４）は実施例４６で観察されたものと類似しており、還元の間のＥＤＴＡの添加は、抗体の全体的な還元に対してはっきりとした影響を与えなかったことを示した（レーン３〜７）。さらに、ダイアフィルトレーション後の再酸化は影響を受けなかった（レーン１２〜１４）。

実施例４８：高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後のＮ_２の存在の影響
いくつかの変更を加えて、実施例４６の実験を繰り返した。１回目のダイアフィルトレーションの間、中空製品のヘッドスペースを窒素によりエアレーションを行った。この結果、溶存酸素濃度は２０％となった。還元の間、５０ｍＬ／分の窒素の連続流を、中空製品を通して送った。還元後、システムへ必要以上に酸素が添加されないように、窒素で１００％飽和したＰＢＳ中で２回目のダイアフィルトレーションを行った。

ＤＯ濃度は、２−ＭＥＡを添加した時点で２０％であった。２−ＭＥＡによって全ての酸素がすぐに消費された（図５５）。２−ＭＥＡの添加により酸化還元電位はすぐに−４４０ｍＶへ低下した。ダイアフィルトレーション後の酸化還元電位は開始時の値（＋２００ｍＶ）よりも低かった（−２５０ｍＶ）。これは再酸化が完了しなかったことを示している。

空気エアレーションによって窒素を交換した後、酸化還元電位は上昇した、これは再酸化が再び始まったことを示している。酸化還元電位は上昇して開始時の値に戻った。これは再酸化が完了したことを示している。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図５６）は、還元段階まで実施例４６で観察されたものと類似していた（レーン３〜７）。しかしながら、酸素の欠乏は、明らかに、再酸化プロセスを阻害した（レーン８〜１１）。空気流による窒素の交換後にのみ、再酸化が起こった（レーン１２、１３）。

実施例４９：高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後のＥＤＴＡの存在の影響
ＰＢＳ単独の代わりに２ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いたダイアフィルトレーションにより２−ＭＥＡを除去したことを除いて、実施例４６の実験を繰り返した。

ダイアフィルトレーションの間に、酸化還元電位は上昇した。これは、主に、酸化還元電位に影響を及ぼす酸素の増加によるものであった（図５７）。還元段階の間に採取したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５８）は、実施例４６で観察されたものと類似していた（レーン３〜６）。ＥＤＴＡの存在は、微量元素を捕捉することによって、明らかに再酸化に影響を及ぼし、再酸化速度の低下に至らせた（レーン７〜１０）。ダイアフィルトレーションから２４時間後でさえも、全ての抗体はまだ再酸化されていなかった（レーン１０）。硫酸銅の添加は、酸化還元電位の即時増加とＤＯの減少を誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、再酸化は硫酸銅の添加後にのみ完了し（レーン１１）、添加前には完了しなかった（レーン１０）ことが確認された。

実施例５０：高速ダイアフィルトレーションおよび還元段階後の硫酸銅の存在の影響
ＰＢＳ単独の代わりに０．５ｍｇ／Ｌの硫酸銅を含有するＰＢＳを用いたダイアフィルトレーションにより２−ＭＥＡを除去したことを除いて、実施例４６の実験を繰り返した。

ＤＯおよび酸化還元プロフィールは、上記の全ての実施例で観察されたものよりも再酸化が速いことを示した。ダイアフィルトレーション後、酸化還元電位はその開始時の値であった。これは再酸化が完了したことを示している（図５９）。

これはＳＤＳ−ｐａｇｅにおいて確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図６０）は、ダイアフィルトレーション工程まで実施例４６で記載したことと類似していた。再酸化段階の間のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、硫酸銅の存在が抗体の再酸化速度を増加させたことを明らかに示した。再酸化は６０分のダイアフィルトレーション後にはすでにほぼ完了していた（レーン９）。

実施例５１：Ｃ末端リジンを欠いている二重特異性抗体の作出
Ｆ４０５ＬまたはＫ４０９Ｒの突然変異に加えて、重鎖においてＣ末端リジンを完全に欠いている単一特異性抗体（Ｃ末端リジンを欠失させることによる；ｄｅｌＫ）の発現のための哺乳動物発現ベクターは、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的技術により生み出される。これにより発現ベクターｐｉｇＧ１ｆ−Ｆ４０５Ｌ−ｄｅｌＫおよびｐｉｇＧ１ｆ−Ｋ４０９Ｒ−ｄｅｌＫが得られる。２つの重鎖ベクターに、対象となる２つの抗体に相当する関連ＶＨ配列が挿入される。さらに、軽鎖の発現ベクターは、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的技術により生み出される。これらの軽鎖ベクターに、対象となる２つの抗体に相当する関連ＶＬ配列が挿入される。

どちらの抗体変異体も、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド，カナダ）を用い、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用い、無血清条件下で、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において関連する重鎖および軽鎖発現ベクターを一過性に同時トランスフェクトすることにより作出される。抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ，スウェーデン）により精製し、ＰＢＳに対して一晩透析し、０．２μＭのデッドエンドフィルターで濾過滅菌する。精製ＩｇＧ１変種の濃度は２８０ｎｍでの吸光度によって決定される。本明細書に記載の方法に従って、精製抗体を用いて二重特異性抗体を作製する。これらの二重特異性抗体は両方のＣ末端リジンを完全に欠いている。

実施例５２：１０００Ｌスケールでのホモ二量体作出および６０ｍｇスケールから０．５ｋｇスケールへのヘテロ二量体タンパク質作出のスケールアップ
２つのホモ二量体各々の１バッチを作出し、標準的なプロセス（細胞株に対してまたは指定の抗体に対して個別に最適化されたものではない）を用いて１０００Ｌスケールで精製した。このプロセスに用いる細胞株は実施例４０に記載している。細胞を融解し、１０００Ｌ反応器への接種のために、５００ｍＬ振盪フラスコ（融解）、１Ｌ振盪フラスコ、３Ｌ振盪フラスコ（全てのフラスコはＣｏｒｎｉｎｇ社製）、ウェーブバッグ（ＷａｖｅＢｉｏｔｅｃｈ）、１００Ｌシードバイオリアクターを含む５継代工程によって、最後に、１０００Ｌ生産用バイオリアクターへと１７日でスケールアップした。振盪フラスコおよびウェーブバッグは、５％ＣＯ_２および３７℃に制御されたインキュベーター内に入れた。シードバイオリアクターおよび生産用バイオリアクターは、ｐＨ７．０（ＣＯ_２および炭素ａｔｅ）、ＤＯ３０％（空気／Ｏ_２および振盪）および温度３７℃（水ジャケット）に制御した。生産用バイオリアクターには、５００Ｌで、３日目に開始し生産終了まで毎日供給材料を添加することにより接種した。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ細胞株は予想通り生じ、十分な材料を用いて１１日目（すなわち、１．８５ｇ／Ｌ）に生産を停止させた。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ細胞株は、スケールアップするための元の貯蔵物から生産性を損失し、１５日目に０．６ｇ／Ｌにおいて生産を停止させた。その後、各場合において、バイオリアクターを１２℃に冷却し、２Ｍクエン酸を用いてｐＨを４．５に下げ、産物を遠心分離により回収した。次に、深層濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を適用し、０．２μｍ濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を行って、細胞を除去し、２ＭＴｒｉｓを用いてｐＨを中性にした。集菌回収率はＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒでは９３％であり、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌでは８０％であった。

無細胞集菌物をＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅプロテインＡ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーカラムにロードした。結合した抗体を、移動相のｐＨのステップ変化を用いて樹脂から放出させた。この初期精製工程の後に、周囲温度で６０分間、低ｐＨでインキュベーションすることによりウイルス不活性化を行った。その後、後の陰イオン交換工程のために、滴定によりｐＨをｐＨ７．８に高めた。次に、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したフロースルー（非結合）型陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーカラムにホモ二量体をロードした。その後、各精製ホモ二量体に対して、３０ｋＤａカットオフＰａｌｌ社製Ｏｍｅｇａメンブレンをタンジェンシャルフローモードで用いて、リン酸緩衝生理食塩水（１．９２ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４ ^＊Ｈ_２０、８．６６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ、１４０．３１ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４）へのバッファー交換を行い、ディスポーザブルＦｌｅｘｂｏｙバッグ（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍ）に入れて５℃で保存した。最後に、材料を０．２μｍ滅菌処理用フィルターに通して１ＬＰＥＴＧボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に入れ、５℃で保存した。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの終濃度は２６．０ｇ／Ｌであり、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌの終濃度は２８．２ｇ／Ｌであった。全体的な下流収率はＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒでは８６％であり、ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌでは９２％であった。ＨＰ−ＳＥＣにより分析した単量体レベルはそれぞれ、１００％および９９．９％であった。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ材料では、漏出したプロテインＡの残存レベルは、検出限界に満たない０．０７８ｎｇ／ｍＬであり、ＥＬＩＳＡにより測定した残存ＣＨＯ宿主細胞タンパク質レベル（Ｃｙｇｎｕｓ）は０．５７ｐｐｍであった（もう一方材料は評価しなかった）。

３つの条件下でホモ二量体から二重特異性抗体を作出した（表１１）。第１の条件は、１０ｇ／Ｌの各ホモ二量体を、５０ｍＭ２−ＭＥＡが入っているポリプロピレンチューブに入れて、周囲温度（２２〜２５℃）で５時間という標準的なベンチスケール条件であった。次に、脱塩カラムを用いて２−ＭＥＡを除去し、溶液を周囲温度、一晩インキュベートした。６０ｍｇの二重特異性抗体の作出のために、この交換を総容量３ｍＬで行った。第２の条件は、２５ｇの二重特異性抗体の作出のための０．５ｇ／Ｌの各ホモ二量体を用いた２５Ｌへのスケールアップであった。ベンチスケールプロセスの場合と同様に、還元段階を５０ｍＭ２−ＭＥＡにより周囲温度で５時間行った。しかしながら、この場合、反応は揺動プレート上に載せたバッグ中で行われ、ＰＢＳｐＨ７．４を用いたダイアフィルトレーションによって２−ＭＥＡを除去した（図６３）。材料を周囲温度で一晩維持し、ＰＢＳｐＨ７．４を用いてもう一度ダイアフィルトレーション処理した。追加のダイアフィルトレーションを用いて、潜在的な残存２−ＭＥＡを除去した。第３の条件は、１０ｇ／Ｌの各ホモ二量体を２５Ｌで用いて、０．５ｋｇバッチの二重特異性抗体を作出したことを除いて第２の条件と同様であった。

３つの生産からの最終産物のＣＩＥＸ分析は同様のプロフィールを示した（図６４）。ホモ二量体は高効率で二重特異性抗体へと変換された（表１２）。ＨＰ−ＳＥＣによって判定した場合、このプロセスによって誘導された凝集または分解は少なく、システムから回収された終濃度は予想した結果に近いものであった（表１２）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は十分に再酸化された完全な産物を示した（図６５）。

実施例５３：１Ｌスケールでの二重特異性抗体（ヘテロ二量体タンパク質）の生成
以下の変更を加えて、本質的には、実施例４６の実験を繰り返した：第１に、１種（抗ＣＤ３８抗体）ではなく２つの異なるホモ二量体を用いた；第２に、還元時間を４時間から３時間へと短縮した；第３に、異なるダイアフィルトレーションカートリッジを用いた；最後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ではサンプルにＩＡＡを加えるだけにした。

ヒトＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１０ｇ）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（１０ｇ）を、使用容量２Ｌのバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）において９９０ｍＬＰＢＳ、ｐＨ７．４に入れた。ＰＢＳは、ホモ二量体を処方するために使用される社内で調製した溶液（１．９２ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４ ^＊Ｈ_２０、８．６６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ、１４０．３１ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）と、Ｂ．Ｂｒａｕｎ社製処方物との混合物であった；これら２つの処方物は本質的に同等であった。温度を２５℃に、振盪速度を１００ＲＰＭに、ヘッドスペースガス供給を１５ｍＬ／分空気に制御した。反応器にはさらに、ＤＯ、ｐＨおよび酸化還元プローブが備わっていた。交換反応は、２−ＭＥＡを終濃度５０ｍＭに添加することにより開始した（新しく調製したシステアミン塩酸塩５Ｍ溶液１０ｍＬを、ホモ二量体を含有するＰＢＳ９９０ｍＬに加えた）。３時間後に、７ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）に対するダイアフィルトレーション（ＤＦ）によって２−ＭＥＡを除去した。ＤＦは０．１６ｍ^２、３０ｋＤａ修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸カートリッジ（カタログ番号ＰＮ−Ｓ０４−Ｅ０３０−０５−Ｎ、Ｊ＆ＭＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ティルブルク，オランダ）を用いて行った。最初の３００ｍＬのＰＢＳを用いて、システムの容量を１３００ｍＬに増やし、ダイアフィルトレーションを実施した。カートリッジ入口圧を２５ＰＳＩ（１７０ｋＰａ）に制御した。これは、最大ポンプ速度１７５０ｍＬ／分の蠕動ポンプと、システムの保持液流に配置したバルブを用いることにより達成され、これにより、透過物流およそ５２．５ｍＬ／分とした。二重特異性産物を、２５℃、１００ＲＰＭの振盪および１５ｍＬ／分のヘッドスペースガス供給で一晩維持した。サンプル（およそ５ｍＬ）は、２−ＭＥＡ添加直前、２−ＭＥＡ添加から０．５時間、１時間、２時間および３時間後、ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌおよび７Ｌの時点、ダイアフィルトレーション完了から１時間後、最後に翌日に採取した。各サンプリングポイントにおいて、サンプルの０．４ｍＬ分を１ＭＩＡＡ保存溶液８μＬに加えた。全サンプルをすぐに液体窒素を用いて急速凍結し、分析まで−８０℃で保存した。凍結／融解手順はサンプルの完全性に影響を与えなかった（データは示していない）。ＩＡＡを用いなかったサンプルをＣＩＥＸにより分析して、交換の程度を決定し、ＨＰ−ＳＥＣにより、産物の凝集を判定した。ＩＡＡを用いたサンプルを非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、鎖間ジスルフィド結合形成の程度を決定した。

２−ＭＥＡの添加は、酸化還元電位の１５５ｍＶから−２９０ｍＶへの即時低下を引き起こしたが、これは、２−ＭＥＡの酸化還元電位が低いことによるものであった。酸化還元電位は最初の１時間をかけて一層徐々に−４１０ｍＶに低下した。これは、この時間をかけてＤＯが１００％から０％まで減少したことによる可能性が高い（図６６）。ＤＯの減少は２−ＭＥＡの自動酸化による酸素消費によるものであった。ｐＨは、２−ＭＥＡ塩酸塩の酸度によって、７．４から６．７まで低下した（図６７）。酸化還元電位およびＤＯは還元期間の間比較的安定していたが、一方、ｐＨは徐々に上昇した。これは、２−ＭＥＡのシスタミンへの自動酸化が原因で酸度が低下したことによると考えられる。ダイアフィルトレーション後、ＤＯは数時間で１００％に戻ったが、一方、酸化還元電位は−２０ｍＶに高まり、一晩１０９ｍＶへ徐々に上昇した。ダイアフィルトレーションの間に、ｐＨは高まり、開始時の値７．４近くで安定した；初期ｐＨと最終ｐＨとのわずかなオフセットは異なるロットのＰＢＳを使用したことによるものであった。ダイアフィルトレーション後に全ての２−ＭＥＡが除去されたわけではなく、一晩でのゆっくりとした酸化還元電位の増加が２−ＭＥＡのシスタミンへの自動酸化を完了するための最終のアプローチを示しているというのがデータの最も有力な解釈である。この時間の間、２−ＭＥＡ自動酸化による酸素消費速度は、表面を通る酸素移動と比べて十分に遅く、その結果、ＤＯは飽和値に近いままであった。後の実験で、清浄手順は、カートリッジの全ての孔から障害物を取り除くのに十分なものではなく、この実施の間の予想された２−ＭＥＡ除去よりも低下し得ることを発見した。最初の清浄手順は、水で３回洗い流し、その後、０．２ＭＮａＯＨとともに周囲温度で６時間インキュベートし、さらに、水で３回洗い流すことであった。この清浄手順は、実施例５３以前および実施例５４以前に用いた。結果として、これら２つの実施例には同じ問題があった。実施例５５の前に、清浄手順を、水で３回洗い流し、その後、０．５ＭＮａＯＨおよび２５０ｐｐｍ次亜塩素酸ナトリウム中、周囲温度で６０分間インキュベートし、最後に水で３回洗い流すことに改変した。そこで（実施例５５以降）、問題を解決した（ダイアフィルトレーション後に酸化還元電位が正常値に戻ることにより示される）より強力な清浄手順を用いた。

２−ＭＥＡ自動酸化の速度および程度は、還元段階の間の酸素消費速度を決定することにより評価し、１モルのＯ_２が２モルの２−ＭＥＡを酸化すると推測された。式３を用いて（１分間にわたっての）酸素消費量（ＯＣ）を算出した。溶液中の酸素の空気飽和は０．２ｍＭであると推測された。これらの条件でのｋｌａは、動的ガス発生法を用いて０．７６／時間であると予め決定した。

式３：

ＯＣ＝１分間にわたる酸素消費量（ｍＭ）
ｋｌａ＝酸素移動容量係数（１／時間）
ＤＯ^＊＝平衡ＤＯ濃度（１００％）
ＤＯ＝時間１および時間２の間での平均ＤＯ濃度（％）
ＤＯ_１＝初期ＤＯ濃度
ＤＯ_２＝最終ＤＯ濃度
ｓ＝酸素溶解度（０．２ｍＭ／１００％）
ｔ_２−ｔ_１＝経過時間（時間）
１分間ごとの酸素消費量を合計することにより、総酸素消費量を決定した。

次に、式４を用いて、各１分間での酸素消費速度（ＯＣＲ［ｍＭ／時間］）を算出した：

２−ＭＥＡの添加により、酸素消費速度は急速におよそ１．４ｍＭ／時間に加速した（図６８）。しかしながら、ＤＯが０％に減少したことから、この速度は０．１５ｍＭ／時間近くまで急速に減速した。これらの結果は、移動した全ての酸素がプロセスですぐに消費されたため、２−ＭＥＡ自動酸化は中空製品への酸素の移動によって制限されたことを示している。３時間の還元期間にわたって消費した酸素の総量は０．６４ｍＭ／Ｌであった。従って、還元段階の間に１．２８ｍＭ２−ＭＥＡ、または存在する２−ＭＥＡの２．６％が自動酸化されたと推定した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図６９）により、３０分以内での鎖間ジスルフィド結合の完全な還元が示された。ダイアフィルトレーションにおいて、分子は、１ダイアフィルトレーション容量ほどですぐに再酸化を開始し、その時点で酸化還元電位は−２７５ｍＶであった。ダイアフィルトレーションの間、重鎖および軽鎖の考えられる全ての組合せ（Ｌ、Ｈ、ＨＬ、ＨＨＬ、ＬＨＨＬ）の推定移動に相当するバンドがはっきりと見えた。分子は７ダイアフィルトレーション容量以内に完全に再酸化され、その時点で酸化還元電位は−４５ｍＶであった。これらのデータは、鎖間ジスルフィド結合の完全な再酸化には、初期の酸化還元電位に戻す必要がないことを示唆している。

ＣＩＥＸ分析により、ホモ二量体のヘテロ二量体産物への効率的な交換が示された（図７０）；３０分の還元の間に実質的な交換が既に行われていた。最終産物は９３．６％の二重特異性抗体、５．８％の７Ｄ８ホモ二量体、および０．４％の２Ｆ８ホモ二量体であった。ＯＤ２８０測定による開始時のサンプルおよび最終のサンプルの濃度の決定により、ほぼ完全な回収（９８％）が示された。最終のサンプルのＨＰ−ＳＥＣ分析により、プロセスは産物の凝集を誘導しなかったことが示された（＞９９％単量体）（図７１）。

実施例５４：１Ｌスケールでの二重特異性抗体の生成に及ぼすＥＤＴＡおよび銅イオンの影響
以下の変更を加えて、実施例５３の実験を繰り返した。２ｍＭＥＤＴＡ（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号０３６７７；二ナトリウム二水和物）を還元バッファーおよびダイアフィルトレーションバッファーの両方に加え、２ＭＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に再調整した。ＥＤＴＡは、還元期間の間の金属触媒による２−ＭＥＡの自動酸化およびダイアフィルトレーション／再酸化段階の間のヘテロ二量体の再酸化を阻害し得る金属と結合する。

実施例５３（ＥＤＴＡを用いない）で観察されたように、２−ＭＥＡの添加は、酸化還元電位の１６２ｍＶから−２９０ｍＶへの即時低下を引き起こしたが、その後、ＤＯが減少したため、最初の１時間をかけて−４１６ｍＶに低下した。ＤＯが１時間で０％まで減少した実施例５３（ＥＤＴＡを用いない）とは対照的に、２ｍＭＥＤＴＡの存在下では、ＤＯは初めに１０％に減少し、その後、３時間の還元期間の終了までに徐々に３％に減少した。酸素の消費がより少ないというこの発見は、微量金属イオンが２−ＭＥＡの自動酸化を加速させるという前提と一致する。ＥＤＴＡの存在は、実施のｐＨプロフィールに影響を与えなかった（図７３、図６７と比較）。

ダイアフィルトレーション後、ＤＯは数時間で１００％に戻ったが、一方、酸化還元電位は、−１１５ｍＶにしか高まらなかった。実施例５３（ＥＤＴＡを用いない）の場合と同様に、酸化還元電位が開始時の値に戻らなかったという事実は、次善の２−ＭＥＡ除去をもたらす使用前の無効な清浄手順を用いたことによるものであった。しかしながら、ＥＤＴＡを用いない（実施例５３）場合に、酸化還元電位は一晩で徐々に上昇したのに対し、ＥＤＴＡの存在下では、酸化還元電位は本質的には変化せず（図７２）、酸化の阻害が示された。この場合、一晩酸化後、０．５ｍｇ／ｍＬのＣｕＳＯ_４（終濃度；Sigma、カタログ番号４５１６５７）を反応器に加えた。これにより、ＤＯの即時減少が起こり、酸化還元電位の増加を伴った。この発見は、反応器中に易酸化性物質が残存し、微量金属イオンが再酸化プロセスを加速させるという前提と一致する。

還元段階の間の２−ＭＥＡ自動酸化の速度および程度は、実施例５３に記載するように決定した。ＥＤＴＡは自動酸化を阻害したが、ＥＤＴＡの存在下での酸素消費量は０．６０ｍＭであった。この値は、ＥＤＴＡを用いない（実施例５３）場合の０．６４ｍＭよりもやや少ない。実施例の条件下では、どちらの場合もＤＯが１０％未満であったため、酸素消費はヘッドスペースから溶液中への酸素移動の速度によって制限されるというのが最も有力な説明である。

実施例５３の場合と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図７４）により、３０分以内での鎖間ジスルフィド結合の完全な還元が示された。しかしながら、ダイアフィルトレーションの間の再酸化は、ＥＤＴＡを用いない条件（図６９、実施例５３）と比べて遅れた。ダイアフィルトレーションにおいて、１ダイアフィルトレーション容量後に重鎖鎖間結合のわずかな再酸化が観察された。その際の酸化還元電位は−３２６ｍＶであった。ダイアフィルトレーション処理したバッファーが２Ｌになった後に、予想される全ての形態の抗体（Ｌ、Ｈ、ＨＬ、ＨＨ、ＨＨＬ、ＬＨＨＬ）が観察された。その際の酸化還元電位は−２８２ｍＶであった。ダイアフィルトレーションの完了から１時間以内で（酸化還元電位−１１５ｍＶ）または一晩インキュベーション後に（酸化還元電位−１１０ｍＶ）は完全な再酸化は観察されず、ＥＤＴＡを用いない条件（図６９）とは対照的であった。ＣｕＳＯ_４の添加後に、完全な再酸化が観察された。これらの結果は、十分な量の金属イオンを添加することによりＥＤＴＡの影響を克服することができることを示している。

ＣＩＥＸ分析により、ホモ二量体のヘテロ二量体産物への効率的な交換が示された（図７５）；３０分の還元の間に実質的な交換が既に行われていた。最終産物は９２．７％の二重特異性抗体、４．７％の７Ｄ８ホモ二量体、および２．６％の２Ｆ８ホモ二量体であった。ＯＤ２８０測定によるこれらの同じサンプルの濃度の決定により、９８％のほぼ完全な回収が示された。最終のサンプルのＨＰ−ＳＥＣ分析により、プロセスは産物の凝集または分解を誘導しなかったことが示された；サンプルは＞９９％完全な単量体であった（データは示していない）。

実施例５５：１Ｌスケールでの二重特異性抗体の生成に及ぼす振盪増加の影響
ＤＯ制御設定点を５０％ＤＯに設定したことを除いて、実施例５３の実験を繰り返し、酸素濃度の増加および酸素移動速度の増加の影響を判定した。制御戦略は、最低限の振盪１００ＲＰＭを維持し、その後、ＤＯが５０％未満に減少した場合には２−ＭＥＡ添加により振盪を自動的に増加させて５０％ＤＯ設定点を維持することとした。最初に、最大振盪速度を５００ＲＰＭに設定した。

２−ＭＥＡの添加によって、ＤＯは減少し、振盪はすぐに５００ＲＰＭに増加した（図７６〜７７）。しかしながら、気泡の生成が観察されたため、最大振盪速度を４００ＲＰＭに下げ、還元時間全体にわたってそこで維持した。この速度では、ＤＯを５０％に維持することができず；その代わりに、ＤＯは３％近くまで減少した。４００ＲＰＭでは、表面を通る空気のエントレインメントがまだ観察された。

１００ＲＰＭでの条件下（実施例５３）では、２−ＭＥＡの添加は、酸化還元電位の１５１ｍＶから−２９７ｍＶへの即時低下を引き起こしたが、１時間以内にさらに−４１６ｍＶへの低下ももたらした；しかしながら、酸素移動を増加させた条件下では、酸化還元電位は１時間で−３６６ｍＶへ低下しただけであった。ｐＨは７．４から６．９まで低下し、還元段階の間に少し上昇した（図７８）。

ダイアフィルトレーションの間に、ＤＯは、２−ＭＥＡが除去されることで、また、ダイアフィルトレーションバッファーを通じたより多くの酸素の導入によって増加した。ＤＯの増加は、振盪速度の減少をもたらした。ダイアフィルトレーションの終了までに、ｐＨは開始時の値に戻った。ＤＯおよび酸化還元電位の値は、ダイアフィルトレーション直後に初期開始値に近くなり、一晩インキュベーションの終了までに徐々に開始時の値に達した。

還元段階の間の２−ＭＥＡ自動酸化の速度および程度は、実施例５３に記載するように決定した。４００ＲＰＭの増加した振盪速度では、ｋｌａ値は４．０／時間であり、還元段階の間に２．３１ｍＭの酸素の消費が起こった。１００ＲＰＭでは還元体の２．６％であったのに対して、これは、４．６２ｍＭ２−ＭＥＡ、または還元体の９．２％の自動酸化に相当した。

１００ＲＰＭでの条件とは対照的に、４００ＲＰＭでの条件では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した場合、鎖間重鎖結合の完全な還元がもたらされた（図７９）。これは、これらの条件下での酸化還元電位の上昇による可能性が高い（１００ＲＰＭの条件下では−４１１ｍＶであったのに対して、−３６０ｍＶ近くであった）。ダイアフィルトレーション処理したバッファーが１Ｌになった後、酸化還元電位は−２８２ｍＶであり、予想される全ての形態の抗体が観察された（Ｌ、Ｈ、ＨＬ、ＨＨ、ＨＨＬ、ＬＨＨＬ）。ダイアフィルトレーション処理したバッファーが５Ｌになった後に酸化の程度は完全であり、その時点で酸化還元電位は−５３ｍＶであった。

１００ＲＰＭでの実施例（実施例５３）と同様に、本実施のＣＩＥＸ分析により、３０分の還元の間に実質的な交換が既に行われていたことが示された（図８０）。しかしながら、１００ＲＰＭ条件（図７０）とは対照的に、本実施の間でホモ二量体のピークはダイアフィルトレーション中に増加した。結果として、一晩サンプルは、７９．８％のヘテロ二量体しか含有せず、９．２％の残存ホモ二量体ＩｇＧ１−７Ｄ８Ｋ４０９Ｒおよび１１．０％の残存ホモ二量体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌを含有した。ＯＤ２８０測定によるこれらの同じサンプルの濃度の決定により、１００％回収が示された。最終のサンプルのＨＰ−ＳＥＣにより、プロセスは産物の凝集または分解を誘導しなかったことが示された；サンプルは＞９９％完全な単量体であった（データは示していない）。

この実施例での、還元の間の不完全な鎖間ジスルフィド結合（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および最終のサンプルの低率交換（ＣＩＥＸ）という発見は、還元段階の間の剪断の増加および／または酸素移動の増加が原因である可能性がある。

実施例５６：１Ｌスケールでの二重特異性抗体の生成に及ぼす振盪およびスパージングの増加の影響
ＤＯ制御設定点を５０％ＤＯに設定したことを除いて、実施例５３の実験を繰り返し、酸素濃度の増加および酸素移動速度の増加の影響を判定した。制御戦略は最低限の空気流０ｍＬ／分および振盪１００ＲＰＭを維持し、ＤＯが５０％未満に減少した場合には、まず、空気流スパージングを４０ｍＬ／分まで増加させ、次に、振盪を４００ＲＰＭまで増加させてこの設定点を維持することとした。

２−ＭＥＡの添加時、ＤＯは減少し、空気流および振盪はともに、すぐに最大レベルまで増加した（図８１〜８２）。しかしながら、気泡の生成が観察されたため、最大スパージング速度を３０ｍＬ／分に下げた。この速度では、ＤＯを５０％に維持することができず；その代わりに、ＤＯは２５％近くまで減少し、その後、還元段階の終了までに５０％に増加した。これらの条件下では、表面を通る空気のエントレインメントがまだ観察された。

１００ＲＰＭでの実施（実施例５３、図６６）で観察されたように、２−ＭＥＡの添加は、酸化還元電位の１５５ｍＶから−２８５ｍＶへの即時低下を引き起こした（図８１）；しかしながら、酸素移動の増加により、酸化還元電位は１時間でさらに、−３２３ｍＶへ低下しただけであったが、ところが、１００ＲＰＭでは、酸化還元電位は１時間でさらに、−４１６ｍＶへ低下した。さらに、酸化還元電位は３時間の還元期間の終了までに−２６１ｍＶへ増加していた。振盪およびスパージングの増加により、ｐＨはｐＨ７．４から６．９まで低下し、３時間の還元期間をかけてｐＨ７．０へ上昇した。これは、２−ＭＥＡが酸度の低い型のシスタミンへと酸化されたことによるものと推定される（図８３）。

ダイアフィルトレーションの間に、ＤＯは、２−ＭＥＡが除去されることで、また、ダイアフィルトレーションバッファーを通じたより多くの酸素の導入によって増加した。ＤＯの増加は、振盪速度およびスパージング速度の減少をもたらした。ダイアフィルトレーションの終了までに、ｐＨは開始時の値に戻った。ＤＯおよび酸化還元電位は、ダイアフィルトレーション後に開始時の値に近くなり、一晩インキュベーションの終了までに徐々に開始時の値に達した。

還元段階の間の２−ＭＥＡ自動酸化の速度および程度は、実施例５３に記載するように決定した。４００ＲＰＭの増加した振盪速度および３０ｍＬ／分のスパージングでは、ｋｌａ値は５．２／時間であり、還元段階の間に１．９４ｍＭの酸素の消費が起こった。これは、３．８８ｍＭ２−ＭＥＡ、または還元体の７．８％の自動酸化に相当した。これは、予想外に、振盪だけで決定された９．２％よりも少し低い値である。この相違はプロセス条件のわずかな変動（中でも注目すべきは、インペラーの上部付近にあった液高）が原因である可能性があり、この変動はｋｌａを変えることがあり、計算誤差を導く。それでも、両方の数値は、１００ＲＰＭで、スパージングを行わない条件（実施例５３）で算出された２．６％よりもかなり高い。

１００ＲＰＭでの条件とは対照的に、振盪およびスパージングの増加によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した場合、還元期間の終了前に鎖間重鎖結合（酸化還元電位−３２３ｍＶで）ならびに重鎖・軽鎖間結合（酸化還元電位−２６１ｍＶで）が現れた（図８４）。これは、これらの条件下での酸化還元電位の上昇による可能性が高い。ダイアフィルトレーションプロセスによって、予想される全ての形態の抗体が観察された（Ｌ、Ｈ、ＨＬ、ＨＨ、ＨＨＬ、ＬＨＨＬ）。ダイアフィルトレーション処理したバッファーが５Ｌになった後に酸化の程度は完全であり、その時点で酸化還元電位は２８ｍＶであった。バンディングパターンから、再編成しなかった鎖間ジスルフィド結合が存在したことが示唆される。これはＩｇＧ１対照にも存在するため、アッセイによる産物である可能性が高い。

１００ＲＰＭでの実施例（実施例５３、図７０）と同様に、本実施例のＣＩＥＸ分析により、３０分の還元の間に実質的な交換が既に行われていたことが示された（図８５）。しかしながら、１００ＲＰＭ条件とは対照的に、本実施の間でホモ二量体のピークはダイアフィルトレーション中に増加した。結果として、一晩サンプルは、８０．２％のヘテロ二量体しか含有せず、９．８％の残存ホモ二量体７Ｄ８および１０．１％の残存ホモ二量体２Ｆ８を含有した。ＯＤ２８０測定によるこれらの同じサンプルの濃度の決定により、完全な回収（１０３％）が示された。最終のサンプルのＨＰ−ＳＥＣ分析により、プロセスは産物の凝集または分解を誘導しなかったことが示された；サンプルは＞９９％完全な単量体であった（データは示していない）。

この実施例での、最終のサンプルの低率交換という発見は、還元段階の間の剪断の増加および／または酸素移動の増加が原因である可能性がある。これらの結果は、スパージングを行わずに増加した振盪を用いた実施例と類似している；スパージングを行わない実施例（実施例５５）と本実施例との間の主な相違は、重鎖／軽鎖間結合の出現に相当する、還元期間にわたるＤＯ、ｐＨおよび酸化還元電位のさらなる増加であった。

実施例５７：１Ｌスケールでの二重特異性抗体の生成に及ぼす窒素の影響
以下の変更を加えて、実施例５３の実験を繰り返した。還元前の時期からダイアフィルトレーションの完了直後まで、システムから酸素をパージした。

２００ＲＰＭで振盪を行いながら２５℃のシステムにホモ二量体を入れた；ヘッドスペースに窒素ガスを３００ｍＬ／分で供給し、同時に、１５ｍＬ／分で窒素スパージングを行った。ホモ二量体混合物を、ダイアフィルトレーションカートリッジを通してゆっくりと一晩循環させ、システム全体から酸素をパージした。これらのパラメーターを還元工程およびダイアフィルトレーション工程を通して維持した。ただし、ダイアフィルトレーションに必要な循環速度の上昇は除いた。ダイアフィルトレーションバッファーも３００ｍＬ／分で窒素スパージングを行った。空気交換を最小限に抑えるためにパラフィルムでラップしたＰｈａｒｍｅｄｍａｓｔｅｒｆｌｅｘチューブ（ＳａｉｎｔＧｏｂａｉｎ）を用いた。ダイアフィルトレーションカートリッジをバッグに入れ、そのシステムの周囲に窒素ブランケットを準備した。酸素曝露を最小限に抑えるために、既にＩＡＡが入っている空気が全く入っていないシリンジ中へ反応器からサンプルを取り込むことにより、ＩＡＡを用いるサンプルを採取した。これらの処置は、再酸化プロセスの酸素要件を立証するために、システム中に酸素が入るのを防ぐのに必要であった。商業的生産では、そのような条件を用いてよいが、他のもので十分であることもある（例えば、単純窒素オーバーレイ）。ダイアフィルトレーションの完了時に、窒素ガス供給（スパージングおよびオーバーレイ）を止め、空気オーバーレイを開始した（５００ｍＬ／分で５分間、残りの実施時間を１５ｍＬ／分で行う）。

この実施における初期酸化還元電位は、実施例５３では１５６ｍＶであったのに対して、８４ｍＶであった。この相違は、本実施例では初期ＤＯが０％であることと実施例５３では１００％であったことの相違にある。本実施例では、２−ＭＥＡの添加は、酸化還元電位の−４４７ｍＶへの急速な低下と、ｐＨの７．４から７．０への低下を引き起こした（図８６〜８７）。ｐＨと酸化還元電位の値はどちらも３時間の還元段階にわたって安定した状態を保った；これらの結果は、酸素の欠乏により、２−ＭＥＡ自動酸化が妨げられ、それによって、還元工程の頑健性が増すことを裏付けている。

ｐＨは、ダイアフィルトレーションの終了までに７．４に近い最終値に上昇していたが、酸化還元電位は−２６８ｍＶまでしか上昇していなかった（図８６〜８７）。低い酸化還元電位値は、恐らく、低ＤＯと、まだ還元型のタンパク質、潜在的には、まだ還元型の残存２−ＭＥＡとが組み合わさって生じている。ダイアフィルトレーション後、ヘッドスペースに空気を導入した。ＤＯおよび酸化還元電位は急速に上昇し、数時間比較的安定な状態を保ち、その後、新たな安定した値１０２％ＤＯ、酸化還元電位については１７８ｍＶに高まった。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３０分以内での鎖間ジスルフィド結合の完全な還元が示された。（図８８）。抗体は、他の実施例（実施例５３〜５６）では部分的酸化が観察された範囲の酸化還元電位（−２６８ｍＶ）であるにもかかわらず、残りの還元期間の間およびダイアフィルトレーション期間全体にわたって還元状態を保った。これらの結果から、鎖間ジスルフィド結合を再編成するのに酸素が必要であることが確認される。酸素導入から１時間以内に鎖間ジスルフィド結合形成がはっきりと見えたが、３時間後に再酸化は完了しておらず、その時点で酸化還元電位は−８３ｍＶであった。ダイアフィルトレーションの間に酸素が存在する実施例（実施例５３〜５６）の間に、速いジスルフィド結合形成が起こった。これは、ダイアフィルトレーションの間の、それらの実施例での酸素濃度がより高いことと酸化還元電位がより高いことによる可能性が高い。一晩サンプルは、抗体の酸化の増加を示した。残存する少量の低分子量バンドは、恐らく、カートリッジを通しての材料の連続循環に起因する。２−ＭＥＡ添加前に溶液に濁りが観察された。これは、一晩の循環が産物に対して影響を及ぼしたことを示している。２−ＭＥＡの添加により、濁りはなくなったが、ダイアフィルトレーションの完了後、一晩連続循環後に再び現れた。タンパク質回収率（９６％）は、この実施例では、実施例５５〜５６の場合より少し低かった。

ＣＩＥＸ分析により、ホモ二量体のヘテロ二量体産物への効率的な交換が示された（図８９）；３０分の還元の間に実質的な交換が既に行われていた。最終産物は９４．８％の二重特異性抗体、４．０％の７Ｄ８ホモ二量体、および１．２％の２Ｆ８ホモ二量体であった。最終のサンプルのＨＰ−ＳＥＣ分析により、プロセスは産物の凝集を誘導しなかったことが示された（＞９９％完全な単量体）。

実施例５３の場合と同様の数学的手法を用いて、データを解析して、ダイアフィルトレーション後の酸素消費量の計算値を決定した（図９０）。総酸素消費量の計算値は、初めに０．３３ｍＭへ増加し、その後、減少し、０．３０ｍＭに安定した。総酸素消費量の計算値の減少は、酸素遊離か、むしろ、実験誤差が原因である可能性がある。計算値は、計算に用いるｋｌａの影響を非常に受けやすく、ｋｌａは、ＰＢＳ中での別の実験により決定した。別の論理的可能性は、低還元体濃度での金属触媒によるスルフヒドリルの自動酸化から生成することが知られている過酸化物からの酸素の放出である(Fedorcsak et al., Exp Cell Res 108: 331-339, 1977; Jeitner and Lawrence, Toxicological Sciences 63: 57-64, 2001)。ｋｌａ推定値の誤差に加えて、解釈を複雑にする他の因子も存在する可能性が高い。例えば、反応器中の２Ｌのヘッドスペースは、５００ｍＬ／分で５分間の空気パージ、その後の、１５ｍＬ／分での空気オーバーレイでは、窒素から空気へとすぐに交換されなかったことが考えられる。また、低レベルの２−ＭＥＡが残留し、酸素消費に寄与したことも考えられる。最後に、分子中の他のシステインは還元され、その後、再酸化されるが、一般に、これらのジスルフィドが還元を受けるには、６Ｍ尿素などの強い溶液による変性が必要であることも考えられる。

実施例５８：１Ｌスケールでの二重特異性抗体の再酸化に及ぼす低ｐＨの影響
還元期間の終了まで、実施例５３の実験を繰り返した。その時点、ダイアフィルトレーションの直前、および３時間還元サンプルの採取の直前に、６．４ｍＬの２Ｍ酢酸を用いてｐＨを５．０に下げた；振盪は、酸を添加する間、２００ＲＰＭへ高め、その後、ダイアフィルトレーションの前に下げて１００ＲＰＭに戻した。２Ｍ酢酸の添加によりｐＨ５．０に調整したＰＢＳを、ダイアフィルトレーションバッファーとして用いた。実施例５３の場合と同様に、産物を一晩維持した（２５℃、１００ＲＰＭ、１５ｍＬ／分のヘッドスペースガス供給で）。翌日、サンプルを採取し、ＨＣｌでｐＨ９に調整した２ＮＴｒｉｓ塩基８．８ｍＬの溶液を用いて産物を調整してｐＨ７．４に戻し、ｐＨ調整の直後、その後、ｐＨ調整から１時間後および２時間後にサンプルを採取した。

予想通り、還元期間の間の酸化還元電位、ＤＯ、ｐＨ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＩＥＸプロフィール（図９１〜９４）は実施例５３のもの（図６６〜６７；図６９〜７０）と類似していた。３時間の還元期間の終了時に、酸化還元電位は−４２３ｍＶから−１４４ｍＶへと増加したが、これは、ｐＨを６．９９から５．０３へ調整したためである。ｐＨ調整前後では、鎖間結合は完全還元状態を保った。ｐＨ７．４バッファー中での他の実施例（例えば、実施例５３、実施例５５および実施例５６）では、酸化還元電位がおよそ−３６０ｍＶに近づくにつれて、２−ＭＥＡ除去前でさえ、重鎖間でのジスルフィド結合が観察された。また、酸化還元電位が−２８０ｍＶに近づくにつれて、重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合がはっきりと見えた。ｐＨ５．０でのダイアフィルトレーションの間に、酸化還元電位は２８ｍＶへ増加し、重鎖と軽鎖の予想される全ての組合せがはっきりと見えた（Ｌ、Ｈ、ＨＬ、ＨＨ、ＨＨＬ、ＬＨＨＬ）。しかしながら、より高いｐＨでダイアフィルトレーションを行う他の実施例とは対照的に、鎖間結合のかなりの部分が未形成状態のままであった。ダイアフィルトレーションから１時間以内に、酸化還元電位はさらに、５１ｍＶへ増加し、その後、一晩インキュベーション後に５３ｍＶへ増加した。この時点までに、鎖間結合形成は少し増加していた。ダイアフィルトレーションの間にＤＯは０％から８３％へ増加し、ダイアフィルトレーションから２時間後に８０％で安定した。最初のＤＯ値１００％とのオフセットは、溶存酸素の平衡値に及ぼすｐＨの影響に起因し得るが、潜在的にシリコーンメンブレンを通過し、プローブ較正に影響を与え得た酢酸の揮発性によってもさらに影響を受け得た。ｐＨ７．４への中和により、ｐＨ調整の結果として、酸化還元電位は−１０９ｍＶに低下した。酸化還元電位が低くなったにもかかわらず、上昇したｐＨにより鎖間結合形成の即時増加がもたらされた。ｐＨ調整後にＤＯが減少したことから、酸素消費は明らかであった。ｐＨ上昇後、酸化還元電位は次の２時間にわたって−７８ｍＶへ増加し、その時間までに、産物はほぼ完全に酸化された。さらなるインキュベーション後に、ＤＯは８０％に戻り、酸化還元電位は１３５ｍＶで安定した。これは、恐らく、産物の酸化が完了したことを示している（サンプルは解析していない）。初期酸化還元電位と最終酸化還元電位とのわずかなオフセットはバッファー組成の相違によるものであるかもしれない。

ＣＩＥＸ分析により、ホモ二量体のヘテロ二量体産物への効率的な交換が示された（図９４）；３０分の還元の間に実質的な交換が既に行われていた。最終産物は９３．７％の二重特異性抗体、４．８％のＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒホモ二量体、および１．５％のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体であった。ＯＤ２８０測定によるこれらの同じサンプルの濃度の決定により、１０３％の完全な回収が示された。最終のサンプルのＨＰ−ＳＥＣ分析により、プロセスは産物の凝集または分解を誘導しなかったことが示された；サンプルは＞９９％完全な単量体であった（データは示していない）。

これらの結果は、再酸化プロセスは、ｐＨ５では、ｐＨ７．４と比べて遅く、達成度が低いことを示している。ｐＨは、プロセスの速度論および／または平衡に影響を与え得る。

実施例５９：交換プロセスに及ぼすシスタミンの影響
シスタミンはシステアミン（２−ＭＥＡ）の酸化型二量体である。

１０ｇ／ＬのヒトＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒおよび１０ｇ／ＬのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌを含有し、５Ｍシスタミン（終濃度５０ｍＭのシスタミン）１ｍＬを加えたＰＢＳｐＨ７．４溶液９９ｍＬの少容量で５時間交換を行ったことを除いて、実施例５３の実験を繰り返した。シスタミンの添加により、酸化還元電位は１９４ｍＶから１３０ｍＶへと低下し、ｐＨは７．４１から７．０７へと低下した（図９５）。開始時および０．５時間、１時間、３時間および５時間のシスタミン中でのホモ二量体のインキュベーション後にサンプルを採取し、ＣＩＥＸにより分析した。二重特異性抗体の形成は認められなかった（図９６）。これらの結果から、シスタミンはＩｇＧ１Ｆａｂアーム交換を誘導しないこと、または抗体のジスルフィド結合を還元することができるのは還元型の試薬だけであることが確認される。

実施例６０：還元体としてのシステインの使用および還元体を除去するためのイオン交換システインは、ＧＭＰの作出に好適な大量で入手可能な天然、公定の非毒性化合物であり、システインも還元体／還元剤として使用可能である。システインの還元体としての効力を試験した。システイン（ＳｉｇｍａＣ５３６０）の酸化還元電位を、実施例５３に記載するように、１−Ｌ反応器システムにて２−ＭＥＡの酸化還元電位と比較した。この反応器に９９０ｍＬのＰＢＳｐＨ７．４（Ｐ．Ｂｒａｕｎ）を満たし、窒素を用い、ＤＯを０％の状態とした。５Ｍ２−ＭＥＡ保存溶液をこの反応器に徐々に加え（終濃度４５ｍＭまで）、ｐＨ、ＤＯ、および酸化還元電位を記録した。ＰＢＳ単独の酸化還元電位は８７．５ｍＶであった（表１３）。酸化還元電位は最初に０．５ｍＭ２−ＭＥＡで−２１８．７ｍＶに急に減少し、次いで、４５ｍＭ２−ＭＥＡで徐々に−３４５ｍＶに減少した。この時点で、ｐＨは２−ＭＥＡの酸度のために６．９２に低下した。

この実験を、２−ＭＥＡの代わりにシステインの０．５Ｍ保存溶液で繰り返した。このシステイン保存溶液は、この溶液が極めて低い酸度を有するために、使用前に２ＭＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。ＰＢＳ単独の酸化還元電位は１０２．５ｍＶであった（表１４）。酸化還元電位は最初に１ｍＭシステインで−１８６．２ｍＶで急に減少し、次いで、４５．９ｍＭシステインで−３０９．６ｍＶで徐々に減少した。

まとめると、４５．９ｍＭシステインｐＨ７．４では、４１２ｍＶの酸化還元電位の総減少が見られ、４５．０ｍＭ２−ＭＥＡｐＨ６．９２では４３３ｍＶの酸化還元電位の減少が見られた（表１３〜１４）。前記実施例に記載のように、２−ＭＥＡを用いて行った１−Ｌ交換実験で見られた酸化還元電位に基づけば、システインは、ホモ二量体の還元および交換による二重特異性抗体の取得を助けるはずである。

交換を助けるシステインの能力を評価するため、種々の濃度のシステインを用いて経時的推移研究を行った。ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１．８ｍｇ）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（１．８ｍｇ）を、総容量１．０ｍＬ中、陽イオン交換（ＣＩＥＸ）バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）＋１０〜１００ｍＭシステインでインキュベートした。反応混合物を３０℃のＨＰＬＣチャンバー内に置き、２８．０μＬの混合物を３８５分まで５５分おきにカラムにロードした。各注入サイクル前に、カラム（ＤｉｏｎｅｘＰｒｏＰａｃＷＣＸ−１０カラム、直径４ｍｍ長さ２５０ｍｍ）をＣＩＥＸバッファーで平衡化した。カラム温度は３０℃に維持した。ＣＩＥＸバッファーで３分間洗浄した後、ＣＩＥＸバッファー中、０から６０ｍＭＮａＣｌへの直線的塩勾配を流速１．０ｍＬ／分で１８．５分間適用した。このカラムをＣＩＥＸバッファー中、７５０ｍＭＮａＣｌで５分間再生した後、次のサンプルの準備としてＣＩＥＸバッファーで１８．５分間平衡化した。溶出液のＵＶ吸光度を２８０ｎｍの波長でモニタリングした。

図９７〜１０１は、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭおよび１００ｍＭシステインの、０〜３８５分のＣＩＥＸ出力を示す。タンパク質を含まないシステインの予備的注入およびブランクバッファーの注入に基づけば、各出力において１分付近に溶出する最初のピークは、サンプル中のシステインの存在、および／またはシステイン、酸化二量体型のシステインに割り付けられた。各グラフに表示されるホモ二量体および二重特異性抗体はかなり後に溶出した。これらの結果は、ＣＩＥＸカラムが還元体除去に使用可能であることを示す。

１０ｍＭシステインでは（図９７）、還元は遅く、３８５分までにまだ完了しなかった。これに対し、交換は速く、２５ｍＭ（図９８）、５０ｍＭ（図９９）、および７５ｍＭ（図１００）システインで３８５分までに完了した。交換は１００ｍＭシステインの場合にいっそう速いと思われたが（図１０１）、３８５分での二重特異性抗体ピークはダブレットであった。このダブレットは、より低いシステイン濃度の中間的な時間でも見られた。各場合において、高濃度のシステインほど、より塩基性のダブレットピーク（保持時間１４．３分）の初期割合が高く、このより塩基性のピークが経時的により酸性のピーク（保持時間１４．０分）にシフトし、この保持時間は二重特異性抗体の予想保持時間であった。最も可能性の高い説明は、ダブレットの、より塩基性のピークが中間体の形態であるということであり、この場合には、鎖間ジスルフィド結合の再形成がもはや見られなかった。３８５分の時点で形成された二重特異性抗体の最終量を表１５に示す。１０ｍＭシステインで、ホモ二量体の二重特異性抗体への変換率は５４．９％に過ぎなかった。２５ｍＭでは、これは９１．０％に増加し、さらに５０ｍＭおよび７５ｍＭシステインでは９３．５％および９４．７％に増加した。１００ｍＭシステインにおける交換は最高の９５．１％であったが、酸性および塩基性の両ダブレットピークは二重特異性抗体と呼んだ。

システインの還元体としての使用を、還元体除去のための脱塩カラムを用いてさらに調べた。前掲のものと同じ条件を、５０ｍＭシステインを還元体として用いる還元（ＣＩＥＸバッファー、サンプル１ｍＬ、３０℃、総タンパク質量３．６ｍｇ／ｍＬ）に３８５分間適用した。サイズ排除（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＧ−２５マイクロスピンカラム）を用いてシステインを除去した後、二重特異性抗体を室温にて、３０℃で２時間または室温で１８時間、ＣＩＥＸ平衡バッファーで再酸化した。ＣＩＥＸプロフィールを図１０２に示す。表１６は、残存ホモ二量体および再酸化後に形成された二重特異性抗体のパーセンテージを示す。これらの結果は、交換が十分であったこと、およびこれらの出力は残存システイン／シスチンの存在を示すが、３０℃で２時間の再酸化は室温で１８時間の再酸化と同等であったことを示す。

実施例６１：固定化還元体カラムを用いたヘテロ二量体タンパク質の形成および精製
二重特異性抗体の形成と二重特異性抗体からの還元体の除去を一工程で可能にするために、固定化還元体カラムを用いた。ホモ二量体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの混合物を、製造業者の使用説明書に従って調製した固定化還元体カラム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ；カタログ番号７７７０１）に、ＰＢＳ（Ｐ．Ｂｒａｕｎ）中、各２．５ｍｇ／ｍＬの濃度にて１：１のモル比で添加し、室温で３時間インキュベートした。抗体を、２ｍＬのＰＢＳを適用することにより溶出させ、回収した。サンプルをＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより分析した。図１０３は、元のホモ二量体間での二重特異性抗体の形成を示す（２５．３％二重特異性、３６．４％ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌおよび３８．３％ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９％）。

実施例６２：アロタイプの相違点を用いた二重特異性ＩｇＧ１の評価
二重特異性抗体調製物中の残存量のホモ二量体の除去を可能にするために、異なるアロタイプの２つのホモ二量体から二重特異性抗体が作出できるかどうかを検討した。

Ｋ４０９Ｒ突然変異を含むＩｇＧ１ｍ（ｆ）アロタイプ主鎖中の抗ＣＤ２０抗体７Ｄ８およびＦ４０５Ｌ突然変異を含むＩｇＧ１ｍ（ｚａ）アロタイプ主鎖中の抗ＥＧＦｒ抗体２Ｆ８の発現ベクターを当技術分野で公知の方法によって作製した（下記の配列番号８および９）。実施例１、２および５に記載のように、タンパク質を発現させ、精製した。等モル量の、得られたＩｇＧ１ｍ（ｆ）−Ｋ４０９Ｒ−ＣＤ２０およびＩｇＧ１ｍ（ｚａ）−Ｆ４０５Ｌ−ＥＧＦＲタンパク質を総容量１ｍＬ中、２５ｍＭ２−ＭＥＡの存在下で、３７℃にて９０分間でインキュベートした。総抗体の終濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。次に、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＥｕｒｏｐｅＧｍｂＨ，ディーゲム，ベルギー）を用いて、ＰＢＳ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）とのバッファー交換により、この混合物から２−ＭＥＡを除去した。二重特異性抗体の連続希釈サンプル（２．３〜５，０００ｎｇ／ｍＬの範囲）を下記のＥＬＩＳＡで親抗体と比較した。両アロタイプを含有する主鎖を有する抗体ＩｇＧｍ（ｆａ）を対照抗体として含めた。サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、二重特異性抗体の形成を決定した。このアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ−ｏｎｅ，フリッケンハウゼン，ドイツ）をＰＢＳ中、４℃、一晩、１μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）のマウス抗ヒトＧ１ｍ（ｆ）抗体５Ｆ１０（Ｓａｎｑｕｉｎ，アムステルダム，オランダ Jefferis, R., et al. Immunol. Lett. 1992 31: 143-168; de Lange, G.G., Exp. Clin. Immunogenet. 1989 6: 7-17)でコーティングした。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、プレートシェーカー（３００ＲＰＭ）上、室温で６０分間インキュベートすることにより、ＰＢＳＴでブロッキングした。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、サンプルをＰＢＳＴで希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（１００μＬ／ウェル）に移した。プレートシェーカー（３００ｒｐｍ）上、室温で６０分間インキュベートした後、このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、１００μＬのＨＲＰ標識マウス抗ヒトＧ１ｍ（ａ）抗体４Ｅ３（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，バーミンガム，アラバマ州，ＵＳＡ；カタログ番号９０５２−０５；ＰＢＳＴ中１０，０００倍希釈）を加え、プレートシェーカー（３００ｒｐｍ）上、室温で６０分間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。５０ｍｇのＡＢＴＳ錠（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ，マンハイム，ドイツ）をＡＢＴＳバッファー（Ｒｏｃｈｅ）に溶かし、ＥＬＩＳＡプレート（１００μＬ／ウェル）に加えた。このプレートをプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）上、暗所にて、室温で３０分間（または必要であればさらに長く）インキュベートした。反応を、２％シュウ酸（終濃度１％、ＲｉｅｄｅｌｄｅＨａｅｎＳｅｅｌｚｅ，ドイツ）１ウェルあたり１００μＬを用いて停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを室温で１０分置いた後、４０５ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。図１０４は、二重特異性抗体の濃度依存的検出を示すが、２つの親抗体は検出されなかった。対照抗体ＩｇＧ１ｍ（ｆａ）は、各重鎖に両方のアロタイプ決定因子を含んでいたことから、ＥＬＩＳＡにおいてより高いシグナルを生成した。

実施例６３：アロタイプ特異的抗体による二重特異性ＩｇＧ１の精製
Ｋ４０９ＲおよびＦ４０５Ｌ突然変異を含むＩｇＧ１ｍ（ｆ）およびＩｇＧ１ｍ（ｚａ）アロタイプ主鎖として発現される抗体を当技術分野で公知の方法によって作製する。その後、実施例１、２および５に記載のようにタンパク質を発現させ、精製する。二重特異性抗体を、実施例６４に記載するように、ステアード非等モル交換により生成する。この結果、二重特異性ＩｇＧ１ｍ（ｆ，ｚａ）抗体と過剰に加えた親抗体の残りを含有する反応混合物が得られる（ＳＮＥＥＰ）。

アフィニティークロマトグラフィーを用いて、二重特異性ＩｇＧ１ｍ（ｆ，ｚａ）抗体を特異的に精製する。従って、マウス抗ヒトＧ１ｍ（ｆ）抗体５Ｆ１０（Ｓａｎｑｕｉｎ）またはマウス抗ヒトＧ１ｍ（Ａ）抗体４Ｅ３（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を製造業者の使用説明書に従ってビーズに結合させる。二重特異性ＩｇＧ１ｍ（ｆ，ｚａ）抗体と過剰に加えた親抗体の残りを含有する反応混合物を、適当なビーズ（二重特異性ＩｇＧ１ｍ（ｆ，ｚａ）抗体上に存在するアロタイプ決定因子に特異的であるが、過剰に加えた親抗体には特異的でない）を含有するカラムにロードする。カラムをよく洗浄して過剰な親抗体を除去した後、製造業者の使用説明書に従って二重特異性ＩｇＧ１ｍ（ｆ，ｚａ）抗体をカラムから溶出させる。

実施例６４：ステアード非等モル交換プロセス（ＳＮＥＥＰ）と一方のホモ二量体におけるプロテインＡ結合部位を消失させる突然変異の組合せ
交換プロセス（ステアード非等モル交換プロセス；ＳＮＥＥＰ）において、交換産物中の一方のホモ二量体の存在を過剰な他方のホモ二量体を使用することで減少させることができるかどうかを検討した。交換産物中のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（プロテインＡで精製）ホモ二量体の存在を減少させるために過剰量のＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（プロテインＡで精製）を用いる場合、ＳＮＥＥＰがもたらした、交換産物中のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体はわずか０．１％であった（図１０５）。用いた条件は、３ｍＬのＰＢＳ中、７．２ｍｇＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ、６．０ｍｇＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ、７５ｍＭ２−ＭＥＡ、３１℃で５時間のインキュベーションであった。過剰量のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体を用いた場合、交換産物中のＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒのパーセンテージはわずか０．４％であった（図１０６）（６ｍｇのＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒおよび７．２ｍｇＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌを用いて同条件）。

次に、一方のホモ二量体はプロテインＡ結合部位を消失させるように突然変異したもの以下の突然変異：Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、およびＨ４３５Ａ（ＡＡＡ変異体）を導入）ともう一方はプロテインＡとなお結合できるものを用い、ＳＮＥＥＰとプロテインＡクロマトグラフィーの組合せを用いて純度の高い二重特異性抗体が作出できるかどうか検討した。プロテインＡ結合部位を欠くように突然変異したホモ二量体がプロテインＡ結合部位を含有するホモ二量体との交換が可能かどうかを調べるため、ホモ二量体ＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９ＲおよびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬをそれぞれプロテインＧおよびプロテインＡで精製した。ＳＮＥＥＰでは、以下の条件を用いた：１ｍｇＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒおよび０．５ｍｇＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌｉｎ２５ｍＭ２−ＭＥＡを含有する１．２ｍＬのＰＢＳ中、３７℃で９０分。この手順を用いたところ、交換産物中のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ変異体のパーセンテージは１．２％であった（図１０７）。低いパーセンテージのＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒホモ二量体（交換反応で過剰に用いた）を含有する二重特異性抗体は、予めＰＢＳ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）で平衡化した１ｍＬＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムを用いて精製した。得られたＣＩＥＸクロマトグラム（図１０８）は、フロースルー画分に１つのピーク（ピークＦＴ）と溶出画分に１つのピーク（ピークＥ）を示し、これは非結合画分と結合画分を示す。非結合画分と結合画分の比率は、ＳＮＥＥＰで用いた５０％過剰のＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒホモ二量体にだいたい一致した。

ＣＩＥＸによるピークＦＴの分析（図１０９）は、この画がもっぱらＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒホモ二量体を含んでおり、二重特異性抗体およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体の量は検出できないほど低いことを示した。このことは、単一のプロテインＡ結合部位を有する二重特異性抗体がＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅと十分結合すること、および予想されたように、過剰なＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒホモ二量体はカラムに結合しなかったことを示す。ＳＮＥＥＰ中に残存した低量のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬはピークＦＴ中には検出されなかったが、このことはそれがＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅと結合することを示している。

溶出した画分（ピークＥ）をＣＩＥＸにより分析した（図１１０）。ＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒホモ二量体が検出された。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌの量は２．０％であり、中間生成物中に１．２％が検出されたこととよく一致していた。

よって、ＳＮＥＥＰ後のＣＩＥＸ分析は、十分な量ではないがホモ二量体の十分な還元を示した。さらに、プロテインＡ結合部位が消失した多量のホモ二量体がアフィニティークロマトグラフィーにより除去された。ＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡホモ二量体が最終産物で検出された。最終産物は９８．０％のＩｇＧ１−７Ｄ８−ＡＡＡ−Ｋ４０９Ｒ×ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ二重特異性抗体と２．０％のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体を含んでいた。まとめると、ＳＮＥＥＰと、プロテインＡ結合部位を欠如するように突然変異した１つのホモ二量体との組合せを用いて、純度の高いヘテロ二量体タンパク質（最終純度９８％）を作出することができる。

実施例６５：プロテインＡとホモ二量体の共精製とその後の交換
単回のプロテインＡ捕捉工程を用いてともに精製されたホモ二量体から二重特異性抗体が作出できるかどうかを検討するために、１７．５ｍＬのＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌ（２８０μｇ／ｍＬ濃度）を６６ｍＬのＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒ（７５μｇ／ｍＬ濃度）と混合した。合わせた上清（総タンパク質量に基づき１：１混合物）を、２０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した１ｍＬプロテインＡカラムにロードした。結合した材料を洗浄し、標準的な手順を用いて溶出した（７カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０での洗浄；３ＣＶの２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．０での予備溶出；１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．５での溶出）。

ｇｐ１２０に対する抗体ＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌとｃ−ＭＥＴ受容体に対する抗体ＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒの共精製の中高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）プロフィール（ＡＫＴＡＦＰＬＣシステムで測定）は、ｐＨ３．５での溶出において単一のピークを示した（図１１１）。このことは、ホモ二量体がプロテインＡ精製に関する標準的プロセスを調整することなく共精製できることを示す。このプロセスに関する回収率（上清についてはＯＣＴＥＴ測定の基づき、最終産物についてはＡ２８０測定に基づいて算出）は＞８０％であり、突然変異のないＩｇＧ１ホモ二量体の場合と同等であった。

プールした画分を、ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ（０．５〜３ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ）での一晩の透析を用いて、ＰＢＳ（Ｐ．Ｂｒａｕｎ、ｐＨ７．４）とバッファー交換した。翌日、サンプルをポリプロピレンチューブに移し、最終容量は１．５ｍＬであった。

共精製されたホモ二量体のＣＩＥＸ分析は、予想されたとおり２つのピークを示し（図１１２）。第１のピーク（ｒＴ＝１４．９）はＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒに相当し、第２のピークはＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌに相当する。特異的吸光係数を考慮してピーク面積を定量化したところ、５７％のＩｇＧがＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌであり、４３％がＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒであることが示され、予測された上清における濃度決定の不正確さとよく一致した。その後、０．１６５ｍＬの７５０ｍＭ２−ＭＥＡを加え、３１℃で５時間、交換を行った。この場合にも、最終産物はＰＢＳ（Ｐ．Ｂｒａｕｎ、ｐＨ７．４）に対して透析した。

ＨＰ−ＳＥＣによって判定した最終産物中のマルチマーのパーセンテージ（２．０％）（図１１３）は、二重特異性産物がホモ二量体に比べて追加のプロテインＡ精製工程を受けたとしても、同じ手順を用いて精製した他のＩｇＧ１分子と同程度であった（ＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌでは＜１％、ＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒでは１．８％）。このことは、一緒に精製されたホモ二量体の製品品質が、それらの共存によって影響を受けなかったことを示す。最終産物のＣＩＥＸプロフィールにおいてＩｇＧ１−０５８−Ｋ４０９Ｒホモ二量体は検出されず、ヘテロ二量体タンパク質およびＩｇＧ１−ｂ１２−Ｆ４０５Ｌホモ二量体のパーセンテージは８６％および１４％であった（図１１４）。

実施例６６：交換後ポリッシングＣＩＥＸとＳＮＥＥＰの組合せ
ＳＮＥＥＰと定組成モードでの弱い陽イオン交換（ＷＣＩＥＸ）クロマトグラフィーの組合せを用い、二重特異性産物から両方のホモ二量体を除去することが可能かどうか検討した。ホモ二量体は、共精製（実施例６５）に記載した標準的アプローチを用いて、プロテインＡ上で首尾よく精製された。ＳＮＥＥＰは実施例６４に記載され、交換産物中に０．１％（ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ；過剰量のＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒとの交換反応の場合；図１０５）および０．４％（ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ；過剰量のＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌとの交換反応の場合；図１０６）のホモ二量体を示した。これは別々の実験で示されたものであるが、これらの数値はＳＮＥＥＰの効率の指標となると思われる。

ＳＮＥＥＰ後のホモ二量体除去（ポリッシング）の最適条件を見出すために、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ×２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ、およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌの１：１：１混合物を調製した。従って、この最適化は、３成分混合物に対して、それをより一般化するために行ったが、ＳＮＥＥＰは２成分混合物を作出する。しかしながら、これらの条件は同様に、３成分のうち２つを含む２成分混合物の分離に代表的なものであると考えられる。この混合物を弱い陽イオン交換（ＷＣＩＥＸ）カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし（最終のロード０．４ｍｇ／ｍＬ樹脂）、種々の組成（下記参照）の低塩バッファーを用いて定組成で溶出した。良好な分離が見られた条件下でのクロマトグラムを図１１５に示す。左のピークはＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒに相当し、中間のピークはＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ×２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌに相当し、右のピークはＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌに相当する。右のピークとヘテロ二量体タンパク質の分離に関する分離度を、下式５を用いて決定した。

（式５）
ｔ_ｂ：ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体の保持時間
ｔ_ａ：二重特異性抗体の保持時間
Ｗ_ａ：半分の高さにあるヘテロ二量体タンパク質ピークの幅
Ｗ_ｂ：半分の高さにあるＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体ピークの幅
図１１６では、式５を用いて算出した分離度を、イオン強度の異なる２つのバッファー（１０ｍＭおよび２０ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０〜６．８と１０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．８および７．２）について、ｐＨ領域を重複させてｐＨの関数としてプロットした。分離度はクエン酸バッファーｐＨ６．４で最適であった。この条件を定組成モードでのＷＣＩＥＸのために選択した。

ヘテロ二量体タンパク質に、ＳＮＥＥＰを用いて得られたヘテロ二量体タンパク質産物を模倣する１０％ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌホモ二量体を加えた。この陽イオン交換カラム（２．５ｍＬスカウティングカラム、ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＭ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した１０ｃｍベッド高）に２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．４中１．０ｍＬの混合物をロードした（樹脂１ｍＬ当たりＩｇＧ４ｍｇ）。

ＦＰＬＣ溶出プロフィールは、大きなピークの後に小さなピークを示す（図１１７）。図１１８には、大きなピーク（Ｓ０００２）のプール画分の分析的ＣＩＥＸプロフィールを示す。溶出後のＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ×２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ、およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌのパーセンテージは４．３％、９４．８％、および０．９％であり、定組成溶出を用いてほとんどのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ変異体が除去されたことを示す。予想されたように、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒホモ二量体とヘテロ二量体タンパク質の間の分離度は、ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒホモ二量体の残り４．３％により示されるように不十分であった。しかしながら、上記で示したように、ＳＮＥＥＰを用いてＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒホモ二量体の量を減少させることができると推測される。

まとめると、ＳＮＥＥＰとＷＣＩＥＸカラムでの定組成溶出との組合せを用いて、高純度のヘテロ二量体タンパク質を作出した。あるいは、ＳＮＥＥＰとその後のプロテインＡクロマトグラフィーと、プロテインＡ結合を消失するＡＡＡ突然変異（実施例６４に記載のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、およびＨ４３５Ａ）を用いて、二重特異性産物中の各ホモ二量体の量を１％未満に減少させることができる。

実施例６７：２−ＭＥＡ除去のための結合・溶出クロマトグラフィー
ヘテロ二量体タンパク質調製物から還元剤２−ＭＥＡを除去するために結合・溶出クロマトグラフィー（限定されるものではないが、ＣＩＥＸ、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＩＣを含む）を使用することができるかどうかを検討した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを原理証明として用い、還元剤への曝露前後のカラム性能を漏出点の決定により調べた。

ヘテロ二量体タンパク質産物を、７５ｍＭ２−ＭＥＡを含む３ｍＬ中、１０ｍｇのＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒおよび１０ｍｇのＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌを３１℃で５時間インキュベートすることにより調製した。３ｍＬのタンパク質産物（総タンパク質量濃度約２０ｍｇ／ｍＬ）を、平衡化および洗浄工程にＰＢＳを、また、溶出に２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０を用いて、５ｍＬプロテインＡカラムに適用した。ＡＫＴＡで測定されたＦＰＬＣ溶出プロフィールを図１１９Ａに示す。８ｍＬで、タンパク質の溶出がＡ_２５４およびＡ_２８０における強い増強によって示された。およそ６５ｍＬで、タンパク質の溶出がＡ_２５４における強い増強によって示された。このＡ_２８０シグナルの増強は、二重特異性抗体の還元の際のシスタミンの形成によるものである。対照実験を、タンパク質を含まない７５ｍＭ２−ＭＥＡ含有ＰＢＳを用いて行った（図１１９Ｂ）。およそ８ｍＬでのＡ_２５４の増強は、２−ＭＥＡの溶出を示す。このＡ_２８０シグナルは、シスタミンが存在しないために、図１１９Ａに比べてわずかしか増強しなかったことに留意されたい。両クロマトグラムともＦＴ画分に同等の強度のピークが存在するが、このことは２−ＭＥＡがカラムに結合しなかったこと、およびタンパク質が溶出したことを示している。

カラムの健全性が２−ＭＥＡの存在によって影響を受けたかどうかを調べるため、２−ＭＥＡの除去前後のプロテインＡカラムの漏出点を決定した（図１２０）。漏出点は、２−ＭＥＡへの暴露前後で同等であり、このことは、カラム性能が２−ＭＥＡの存在によって影響を受けなかったことを示している。

プロテインＡが２−ＭＥＡ除去の際にカラムから漏出したかどうかを確認するために、精製した産物で還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図１２１）。重鎖（５０ｋＤａ）および軽鎖（２５ｋＤａ）の予想バンド以外にバンドは見られなかったが、このことは、カラムが２−ＭＥＡに曝された際にプロテインＡの有意な損失はないことを示している。

まとめると、７５ｍＭ２−ＭＥＡを伴うヘテロ二量体タンパク質のＦＰＬＣクロマトグラムは、フロースルー中の２−ＭＥＡの存在の指標となるＡ２８０／Ａ２１５比を有するピークを示した。プロテインＡカラムの漏出点は２−ＭＥＡへの曝露前後で同等であったが、このことは、その性能が２−ＭＥＡの存在によって影響を受けなかったことを示している。還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥは完全なＩｇＧを示し、プロテインＡの漏出の兆候を示さなかったが、このことは、このカラムが２−ＭＥＡ耐性を持っていたことを示している。このことは産物からの２−ＭＥＡの除去を示した。

実施例６８：１つのκ軽鎖と１つのλ軽鎖を含有するホモ二量体で開始する二重特異性抗体の形成およびＬａｍｂｄＦａｂＳｅｌｅｃｔおよびＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔを用いた精製
二重特異性抗体調製物中の残存量のホモ二量体の除去を可能にするために、１つのκ軽鎖と１つのλ軽鎖を有する二重特異性抗体が作出できるかどうかを検討した。κ軽鎖を含有するあるＩｇＧ４分子とλ軽鎖を含有する別のＩｇＧ４分子との間でのＦａｂアーム交換の可能性が、ｉｎｖｉｖｏにおいてナタリズマブ(Labrijn et al. 2009 Nature Biotechnology p767)で処置した患者で示された。

κ軽鎖を含有するあるＩｇＧ１分子とλ軽鎖を含有する別のＩｇＧ１分子との間でのＦａｂアーム交換が可能であったことを示すために、ＩｇＧ１ホモ二量体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＢＭＡ０３１−Ｎ２９７Ｑ−Ｋ４０９Ｒ（Ｎ２９７ＱおよびＫ４０９Ｒ突然変異を有するＴ細胞受容体α鎖に対するＩｇＧ１／λ抗体(Shearman et al. 1991 J. Immunol. 147(12): 4366-4373)；Ｎ２９７Ｑ突然変異はグリコシル化部位をノックアウトし；これは交換プロセスに影響を及ぼさない）を、１５０μＬＰＢＳ中、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬの濃度にて１：１モル比で混合し、７５ｍＭ２−ＭＥＡの存在下、３１℃で５時間インキュベートした。次に、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５（１０，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いたＰＢＳ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、ｐＨ７．４）に対するダイアフィルトレーションにより、この混合物から２−ＭＥＡを除去した。図１２２は、分析的ＣＩＥＸにより分析した場合に、κ軽鎖を含有するＩｇＧ１分子とλ軽鎖を含有する別のＩｇＧ１分子との間でのＦａｂアーム交換が可能であったことを示す。

夾雑ホモ二量体から二重特異性抗体を精製するために、プロテインＡからの溶出の後にＴｒｉｓ、ｐＨ９．０を用いて中和が行われる。４℃で一晩の透析によりバッファーをＰＢＳに交換した。結合していないκ軽鎖含有ホモ二量体を除去するために、ＬａｍｂｄＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂１ｍＬあたり４ｍｇの二重特異性抗体を添加流速０．１ｍＬ／分（滞留時間４分）でロードした（１ｍＬＨｉＴｒａｐカラム、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ウプサラ，スウェーデン；カタログ番号１７−５４８２）。０．１Ｍ酢酸塩、ｐＨ３．５で溶出を行う。Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０を用いて中和を行う。４℃で一晩の透析によりバッファーをＰＢＳに交換する。結合していないλ軽鎖含有ホモ二量体を除去するために、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ１ｍＬあたり４ｍｇの溶出二重特異性抗体(bispefic antibody)を添加流速０．１ｍＬ／分（滞留時間４分）でロードした（１ｍＬＨｉＴｒａｐカラム、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１７−５４５８）。０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出を行い、Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０を用いて中和を行う。４℃で一晩の透析によりバッファーをＰＢＳに交換する。

ＳＮＥＥＰでは、３０％モル過剰の、κ軽鎖含有ホモ二量体またはλ軽鎖含有ホモ二量体のいずれかを用いる。不十分量の種（すなわち、それぞれλ軽鎖を含有する、およびκ軽鎖を含有するホモ二量体）をそれぞれＬａｍｂｄＦａｂＳｅｌｅｃｔまたはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔと結合させる。このようにして、過剰量のκ軽鎖含有ホモ二量体またはλ軽鎖含有ホモ二量体を除去する。ホモ二量体に関して上記したような洗浄および溶出条件を二重特異性抗体の精製に用いる。

あるいは、ＳＮＥＥＰを行わない場合には、全てのホモ二量体を除去するために、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＬａｍｂｄＦａｂＳｅｌｅｃｔを用いて２つの連続的ポリッシング工程を行う。

実施例６９：リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中でのデュオボディーおよびホモ二量体のリアルタイム・ストレス安定性
２〜８℃および２５℃で１２ヶ月の保存時のＰＢＳバッファー中でのヘテロ二量体タンパク質の生化学安定性を元のホモ二量体と比較して調べた。４０℃の昇温下で３ヶ月の保存も含めた。ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒと対応するホモ二量体ＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５ＬおよびＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒの交換により形成されたヘテロ二量体を用いて安定性試験を行った。これら３つの材料をＰＢＳｐＨ７．４（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、カタログ番号３６２３１４０；８．７ｍＭＨＰＯ_４ ^２−、１．８ｍＭＨ_２ＰＯ_４ ⁻、１６３．９ｍＭＮａ^＋、１４０．３ｍＭＣｌ⁻、ｐＨ７．４）中に５ｍｇ／ｍＬで調製した。これらのバッチを、２〜８℃でのインキュベーションの場合には１．０ｍＬクライオバイアル中に、２５℃および４０℃でのインキュベーションの場合には共栓および蓋付きガラスバイアル中に、３００μＬアリコートとして無菌的に分注した。材料を０、１、２、３、６、９および１２ヶ月の時点でＮａｎｏｄｒｏｐ（Ａ２８０およびＡ３５０）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰ−ＳＥＣおよびＣＩＥＸにて分析した。

測定されたＡ２８０値を、図１２３に示すように、異なる時点および温度で保存した全サンプルについて比較した。同じサンプルで３５０ｎｍでの吸光度（Ａ３５０）も測定し、サンプル濁度に関する示唆を得る。ヘテロ二量体タンパク質およびホモ二量体のＡ３５０の値は保存に増大しなかったが、このことは、これらの条件下で著しい粒状物質の形成は起こらなかったことを示している。

図１２４および１２５は、試験の開始時と２〜８℃および２５℃で１２ヶ月保存後の材料の非還元型および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。２〜８℃での保存時に有意な変化は見られなかった。２５℃での保存は、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては少量の断片化を誘導し、また、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては７１ｋＤａおよび１１３ｋＤａに付加的なバンドの形成を誘導し、これは、ホモ二量体の場合よりもヘテロ二量体タンパク質で少し高いと思われた。これらの付加的バンドの性質は、保存時のＩｇＧ分子における非還元型チオ−エーテル結合の形成（ジスルフィド結合からの硫黄の欠損）により説明することができる。４０℃のストレス条件は、この断片化プロセスを加速させ、２５℃でのインキュベーションの結果が確認された（図１２６および１２７）。

これらの材料を、ＨＰ−ＳＥＣを用いて断片化および多量体化に関して分析し、代表的なクロマトグラムを図１２８に示す。表１７のデータサマリーは、試験の開始時も２〜８℃で１２ヶ月の保存後もヘテロ二量体タンパク質およびホモ二量体は単量体であった（＞９９％単量体）ことを示す。材料を２５℃で１２ヶ月保存した場合に、断片化はいくらか見られたが、多量体化は見られなかった。ヘテロ二量体タンパク質の断片化の程度（２．３％）は、２つの個々のホモ二量体ＩｇＧ１−７Ｄ８−Ｋ４０９Ｒ（１．５％）およびＩｇＧ１−２Ｆ８−Ｆ４０５Ｌ（６．３％）の値の中間にあり、このことは、ヘテロ二量体タンパク質はホモ二量体よりも不安定であるわけではないことを示している。４０℃での保存は、著しく高い多い断片化（ヒンジの断片化およびＦａｂフラグメントの欠損）を誘導したが、これはホモ二量体の場合よりヘテロ二量体タンパク質でやや高いと思われた（３．５％および１０．６％に対して１５．６％）。他方、これらのクロマトグラムでは、分離が不十分なために、ピークの割り付けおよびピークパーセンテージの決定は困難であった。

ｔ＝０およびｔ＝１２ヶ月でのＣＩＥＸ分析（電荷プロフィール）の結果を図１２９に示す。ヘテロ二量体タンパク質のピークプロフィールは、同じ条件下で保存されたホモ二量体のものと同程度であった。２５℃での保存時は、全ての材料で、中性ピークの面積の減少を伴う酸性ピークの増大が明らかに見られた。温度およびｐＨの上昇下でのこのＩｇＧの酸性化はＩｇＧに共通の現象であり、主として、Ａｓｎ残基の脱アミド化によるＡｓｐの形成のためである。２５℃保存時のピークプロフィールは、ヘテロ二量体タンパク質がホモ二量体材料と同程度の脱アミド化感受性であったことを示した。

結論として、Ａ２８０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰ−ＳＥＣおよびＣＩＥＸ分析に基づけば、安定性データは、ヘテロ二量体タンパク質が２〜８℃、ＰＢＳｐＨ７．４中５ｍｇ／ｍＬで少なくとも１２ヶ月保存した際に、生化学的に安定であったことを示す。２５℃および４０℃の高温下では、ヘテロ二量体タンパク質の挙動はホモ二量体材料と同程度であったが、断片化はやや多いと思われた。ストレス条件下でのヘテロ二量体タンパク質の断片化の量は、より低いｐＨ（ｐＨ６、データは示していない）を有する他のバッファー中に材料を配合することにより低減することができる。

Claims

ａ）第１のホモ二量体抗体を第２のホモ二量体抗体とともに、ヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程、
ここで、前記第１のホモ二量体抗体のＣＨ３領域は、第１のＣＨ３領域であり、４０９位にＡｒｇを有し、前記第２のホモ二量体抗体のＣＨ３領域は、第２のＣＨ３領域であり、以下：
（ｉ）３６８位にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＴｒｐを有し、
（ｉｉ）３９９位にＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＴｙｒを有し、
（ｉｉｉ）４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ、および４０９位にＬｙｓを有し、前記第１のＣＨ３領域はさらに４０７位にＴｙｒを有し、または
（ｉｖ）４０５位にＰｈｅ、Ａｒｇ、またはＧｌｙ以外のアミノ酸を有し、４０９位にＬｙｓを有し、前記第１のＣＨ３領域はさらに４０５位にＰｈｅを有し、
前記第１のＣＨ３領域および前記第２のＣＨ３領域の配列は異なっており、前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用が前記第１のＣＨ３領域と前記第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いものであり、アミノ酸位置はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従ってナンバリングされている、工程、
ｂ）工程ａ）から得た組成物の少なくとも３０ｍＬを、二重特異性抗体中のシステインの鎖間ジスルフィド結合への酸化を可能にするのに十分な酸化条件におく工程、および
ｃ）二重特異性抗体を得る工程
を含む、二重特異性抗体の作出のためのｉｎｖｉｔｒｏ法。
第１のホモ二量体抗体および第２のホモ二量体抗体はいずれもヒンジ領域内にＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ配列を含む、請求項１に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
工程ａ）における還元条件が、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカプトエチルアミンの化学誘導体、Ｌ−システインまたはＤ−システインなどの還元剤を添加することを含む、請求項１または２に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
工程ａ）が、２−メルカプトエチルアミン、Ｌ−システインおよびＤ−システインからなる群から選択される少なくとも２５ｍＭの還元剤の存在下、少なくとも２０℃の温度で少なくとも３０分間のインキュベーションを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
工程ｂ）が少なくとも−３００ｍＶの酸化還元電位を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
工程ｂ）における酸化条件が、少なくとも０．０５ｍＭの酸素の存在を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
工程ｂ）における酸化条件が、デヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）などの酸化剤を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
工程ａ）から得た組成物における二重特異性抗体の濃度が１〜１００ｇ／Ｌの範囲内である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
工程ａ）における第１のホモ二量体抗体と第２のホモ二量体抗体との比率が１：１．０１〜１：２の範囲内である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
第１のホモ二量体抗体および第２のホモ二量体抗体が異なる軽鎖を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
野生型ＣＨ３領域と比べて、第１のホモ二量体抗体がＣＨ３領域内にアミノ酸置換を１つだけ有し、第２のホモ二量体抗体がＣＨ３領域内にアミノ酸置換を１つだけ有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。
第１のホモ二量体抗体が４０５位にＰｈｅ、および４０９位にＡｒｇを含み、第２のホモ二量体抗体が４０５位にＬｅｕ、および４０９位にＬｙｓを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ法。