WO2003085102A1 - Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport - Google Patents

Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport Download PDF

Info

Publication number
WO2003085102A1
WO2003085102A1 PCT/JP2003/004506 JP0304506W WO03085102A1 WO 2003085102 A1 WO2003085102 A1 WO 2003085102A1 JP 0304506 W JP0304506 W JP 0304506W WO 03085102 A1 WO03085102 A1 WO 03085102A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gdp
protein
fucose
seq
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/004506
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yutaka Kanda
Mitsuo Satoh
Katsuhiro Mori
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=28786450&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2003085102(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to JP2003582281A priority Critical patent/JP4628679B2/ja
Priority to AT03720896T priority patent/ATE503829T1/de
Priority to DE60336548T priority patent/DE60336548D1/de
Priority to EP03720896A priority patent/EP1500698B1/en
Priority to AU2003236020A priority patent/AU2003236020B2/en
Priority to CA002481656A priority patent/CA2481656A1/en
Publication of WO2003085102A1 publication Critical patent/WO2003085102A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to a cell in which the activity of a protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is reduced or deleted compared to the parent cell, a method for producing an antibody composition using the cell, Transgenic non-human animal or plant whose genome has been modified so that the activity of a protein involved in the transport of the sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is reduced or deleted, or a progeny thereof, or an antibody derived from the animal or plant.
  • the present invention relates to a method for producing the composition, and a medicament containing the antibody composition.
  • N-glycoside-type sugar chain binding sites there are two N-glycoside-type sugar chain binding sites in the Fc region of an antibody IgG molecule.
  • IgG in serum usually contains sialic acid or N-acetyl Complex sugar chains with multiple branches with little addition of dalcosamine are attached. It is known that the addition of galactose at the non-reducing end of this complex type sugar chain and the addition of fucose to N-acetyldarcosamine at the reducing end are known to be diverse. Biochemistry), 36. 130, 1997].
  • sugar chain structure is defined by a glycosyltransferase that synthesizes sugar chains and a glycolytic enzyme that degrades sugar chains.
  • Glycoproteins undergo sugar chain modification in the lumen of the endoplasmic reticulum (hereinafter referred to as ER).
  • ER endoplasmic reticulum
  • relatively large sugar chains are transferred to growing polypeptide chains in the ER lumen.
  • the sugar chain is first added sequentially to the phosphate group of a long-chain lipid carrier containing about 20 ⁇ ; -isoprene units called dolichol phosphate (hereinafter also referred to as P-Dol).
  • N-acetyl-darcosamine (hereinafter also referred to as GlcNAc) is transferred to dolichol phosphate to form GlcNAc-P-P-Dol, and then another GlcNAc is transferred to GlcNAc-GlcNAc-P-P-Do. It becomes 1.
  • Man mannose
  • GlcNAc Man 5- (GlcNAc) 2-P-P-Dol
  • Glc Man and glucose
  • the precursor sugar chains called core oligosaccharide (Glc) 3 - (Man) 9 - (GlcNAc) can 2 -PP-Dol.
  • the precursor of the sugar chain consisting of these 14 sugars is converted to a polypeptide having an asparagine-X-serine or asparagine-X-threonine sequence (X indicates an arbitrary amino acid residue). It is transferred.
  • dolichol pyrophosphate (P-P-Dol) bound to the core oligosaccharide is released, but undergoes pyrophosphatase decomposition to be reused as redolichol phosphate.
  • Sugar chain trimming is started immediately after the sugar chain binds to the polypeptide.
  • N-acetyldarcosamine transferase I that adds GlcNAc on the first outer side of the complex N-glycoside-linked sugar chain
  • ⁇ -mannosidase II that removes two Man
  • N-acetylglycosyltransferase II (GnTII), which adds the second GlcNAc from the outside
  • ⁇ 1,6-fucosinotransferase which adds fucose to N-acetyldarcosamine at the reducing end.
  • CAMPATH-1H human IgGl subclass
  • CH0 cells Chinese hamster ovary cells
  • NS0 cells NS0 cells derived from mouse myeloma cells
  • One method to modulate the sugar chain structure of the glycoprotein produced by regulating the activity of the enzyme involved in the modification of the sugar chain in the host cell is to apply an inhibitor of the enzyme involved in the modification of the bran chain. Have been.
  • Inhibitors of enzymes involved in sugar chain modification include tsuyumycin, which selectively inhibits the formation of GlcNAc-PP-Dol, which is the first step in the formation of core oligosaccharides, which are precursors of N-daricoside-linked sugar chains.
  • Glycosidase I inhibitor castanospermine and N-methyl-1-deoxynojirimycin, glucosidase II inhibitor promoconduritol, mannosidase I inhibitor 1-deoxynojirimycin and 1 , 4-Dioxy-1,4-imino-D-mannitol and swansonine, an inhibitor of mannosidase II, are known.
  • glycosyltransferases As specific inhibitors of glycosyltransferases, deoxy derivatives of substrates for N-acetyldarcosamine transferase V (GnTV) etc. are being developed [Glycobiology Series 2-Fate of sugar chains in cells (Kodansha) Sanentifi) Nagai Katsutaka. Hakomori Senichiro 'Kobata Yo (ed. 1993)]. It is also known that 1-deoxynojirimycin suppresses the synthesis of complex type sugar chains and increases the ratio of high mannose type ⁇ ⁇ hybrid type sugar chains. In fact, stanospermine, N-methyl-1-deoxynojirimycin, swansonine or . Hybridomas are produced by adding an inhibitor such as tsuyumycin to the medium
  • fucose human -galactoside 2-hyfucosyltransferase
  • Fuc fucose
  • Fuc ⁇ l-2Gal H antigen
  • GnTIII ⁇ 1, 4_ ⁇ -C0 cells transfected with -acetyldarcosamine transferase ⁇
  • the present invention relates to the following (1) to (70).
  • Intracellular sugar nucleotide A cell in which the activity of a protein involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi apparatus is reduced or deleted as compared with the parent cell line.
  • the genetic engineering technique is a technique selected from the group consisting of the following (a), (b), (c) and (d).
  • the N-terminal deletion of the protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is due to the N-terminal deletion of the protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus 30
  • (6) The cell according to (3), wherein the technique for suppressing transcription or translation of a protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is an RNAi (RNA interference) method.
  • the RNAi method comprises an RNA selected from the group consisting of the following (, (b), (c) and (d) and its complementary RNA, and converts the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus.
  • double stranded RNA capable of decreasing the m RNA of a protein relating to transport of a method for introducing or expressed intracellularly, the cells according to (6).
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 30 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 30 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a nucleotide sequence represented by 10 to 30 consecutive nucleotide sequences in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30.
  • RNA RNA selected from the group consisting of the following (a;), (b), (c) and (d) and its complementary RA into cells: The cell according to (6) or (7), wherein the amount of mRNA of a protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is reduced by the application of the protein.
  • RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33;
  • the double-stranded RNA is introduced into a cell by a vector into which a DNA corresponding to the RNA according to (7) or (8) and a complementary DNA thereof have been incorporated, and the double-stranded RNA is introduced into the cell according to (7) or (8). cell.
  • the GDP-fucose transporter is a DNA selected from the group consisting of the following (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), and (h):
  • the GDP-fucose transporter is (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j (10)
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having GDP-fucose transporter activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and having GDP-fucose transporter activity;
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 with one or more amino acids deleted, substituted, inserted and / or added, and having GDP-fucose transporter activity;
  • SEQ ID NO: 32 a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, and which has a GDP-fucose transporter activity ;
  • SEQ ID consists Amino acid sequence having the amino acid sequence homology of 80% or more represented by 2, and GDP- fucose protein having a transporter activity I 1 production;
  • (k) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 and having GDP-fucose transporter activity;
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, and having GDP-fucose transporter activity.
  • the cell is selected from the group consisting of the following (a), (b), (c), (d), (, (f), (g), (h), (i) and (j) The cell according to any one of (1) to (15), which is a cell to be obtained.
  • An antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxicity activity is obtained by, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains binding to the Fc region contained in the antibody composition, the N- ⁇ at the reducing end of the sugar chain.
  • the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end of sugar chains is the percentage of all N-glycoside-linked sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the sugar chain to which fucose is not bound is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex type sugar chain.
  • a method for producing an antibody composition comprising:
  • An antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxicity activity is the N-glycan at the reducing end of the sugar chain among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • (26) The method according to (26), wherein the ratio of sugar chains in which fucose is not bound to cetyldarcosamine is higher than that of the antibody composition produced by the parent cell.
  • the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyltyl glucosamine at the reducing end of sugar chains is the percentage of all N-glycoside-linked sugar chains bound to the Fc region contained in the antibody composition.
  • a bran chain to which fucose is not bound has an N-glycoside linkage at position 1 of the fucose.
  • (27) The method according to (27), wherein the sugar chain is a sugar chain which is not ⁇ -linked to the 6- position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the combined sugar chain.
  • transgenic non-human according to any one of (30) to (32), wherein the protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus is a GDP-fucose transporter. Animals or plants, or their progeny.
  • the GDP-fucose transporter (a), (b), (c), (d), (e), The transgenic non-human according to (33), which is a protein selected from the group consisting of (f), (g), (h), (i), (j), (k) and (1). Animals or plants, or their progeny.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z- or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and which has a GDP-fucose transporter activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z- or amino-acid-added, and which has a GDP-fucose transporter activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, and which has GDP-fucose transporter activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or inserted Z or added, and having GDP-fucose transporter activity ;
  • (k) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 and having GDP-fucose transporter activity;
  • a protein consisting of an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, and having GDP-fucose transporter activity.
  • the transgenic non-human animal is an animal selected from the group consisting of a red sea lion, a sheep, a goat, a stag, a poma, a mouse, a rat, a -bird, a monkey, and a heron.
  • the transgenic non-human animal according to any one of to (35), or a progeny thereof.
  • the antibody molecule is selected from the group consisting of the following (a;), (b), (c) and (d): The transgenic non-human animal or plant according to (37), or a progeny thereof.
  • transgenic non-human animal or plant according to any one of (37) to (39), or the progeny thereof, and a tissue or body fluid containing the antibody composition from the bred animal or plant.
  • a method for producing an antibody composition comprising the steps of: obtaining a target antibody composition from the obtained tissue or body fluid.
  • a cell that produces the antibody molecule of the transgenic non-human animal or plant or the progeny thereof according to any one of (35) to (37), and the obtained antibody-producing cells are obtained.
  • a method for producing an antibody composition comprising the steps of: culturing E. coli in a medium, producing and accumulating the antibody composition in the culture, and collecting the antibody composition from the culture.
  • the antibody composition is an antibody composition having a higher antibody-dependent cytotoxic activity than an antibody composition obtained from a non-human animal or plant whose genome has not been modified, or a progeny thereof, (40) or The method according to (41).
  • the antibody-dependent cytotoxic activity is high, and the antibody composition is a sugar chain reducing terminal N-acetyl of all N-daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the ratio of sugars in which fucose is not bound to dalcosamine and the proportion of sugar chains is higher than that of an antibody composition produced by a non-human animal or plant whose genome has not been modified or its progeny; ).
  • the sugar chain to which fucose is not bound is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex type sugar chain. , (43).
  • a medicament comprising the antibody composition according to (46) or (47) as an active ingredient.
  • compositions are used for diseases with tumors, diseases with allergies, diseases with inflammation,
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and which has a GDP-fucose transporter activity.
  • a target vector for homologous recombination targeting a GDP-fucose transporter comprising the full-length or partial DNA of SEQ ID NO: 1.
  • the GDP-fucose transporter is: (a;), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (i)
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, or added, and having GDP-fucose transporter activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and having GDP-fucose transporter activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and which has a GDP-fucose transporter activity ;
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, and which has a GDP-fucose transporter activity;
  • (k) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 and having GDP-fucose transporter activity;
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, and having GDP-fucose transporter activity.
  • RNA A double-stranded RNA composed of RNA selected from the group consisting of the following (a) and (b) and its complementary RNA:
  • RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33;
  • RNA having substantially the same RNAi activity as a SEQ ID NO: 33 on a protein An RNA having substantially the same RNAi activity as a SEQ ID NO: 33 on a protein.
  • a recombinant thigh comprising the DNA of (60) or (61) and its complementary DNA in a vector.
  • (64) A transformant obtained by introducing the recombinant DNA according to (62) or (63) into a cell.
  • N- glycoside-linked complex type sugar chain of N- ⁇ cetyl Darco 6-position of Sa Min and 1-position of fucose is cells with a resistant to a lectin which recognizes the bound sugar chain structure alpha, at least, the following The method according to (65) or (66), which is a cell having resistance to one of lectins selected from the group consisting of (a), (b), (c) and (d).
  • the cell is selected from the group consisting of the following (a), (b), (, (d), (, (f), (g), (h), (i) and (j) The cell according to any one of (65) to (68), which is:
  • a cell in which the activity of a protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus of the present invention is lower or deleted than that of a parent cell (hereinafter, abbreviated as “host cell J of the present invention”) Is a cell in which the activity of a protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus (hereinafter abbreviated as “GDP-fucose transport protein”) is lower or deleted than that of the parent cell line.
  • GDP-fucose transport protein Such cells are also included.
  • a parent cell is a cell before a method for reducing or deleting the activity of GDP-fucose transport protein has been applied.
  • the parent cells of NSO cells are described in the literature such as Bio / Technology (BI0 / TECHN0L0GY), 10, 169 (1992), and Biotechnology (Biotechnol. Bioeng.), 73, 261, (2001).
  • NS0 cells that have been used.
  • RRB0213 registered with the RIKEN Cell Development Bank, or a substrain obtained by adapting these strains to a growth medium.
  • SP2 / 0-Agl4 cells include J. Immunol., 126, 317 (1981), Nature, 276, 269 (1978), and Hyuman's Antibody.
  • SP2 / 0_Agl4 cells described in literatures such as “And” noisybri dormas (Human Antibodies and Hybridomas), 3, 129 (1992).
  • SP2 / 0-Agl4 cells ATCC CRL-1581 registered with the ATCC, or a substrain (ATCC CRL-158.1) obtained by adapting these strains to a growth medium.
  • CH0 cells derived from Chinese hamster ovary tissue include Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968). , Chroraosoma, 41.129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77.4216 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968), Cell, 6, 121 (1975), and Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (p883_900).
  • CH0-K1 strain ATCC CCL-61
  • DUXB11 strain ATCC CRL-9096
  • Pro-5 strain ATCC CRL-1781 registered with ATCC
  • commercially available CH0-S strain (Lifetechnologies) Cat # 11619)
  • a substrain obtained by adapting these strains to a medium in which they can grow is also a specific example.
  • Gil. 16Ag. 20 cells is a cell line established from Y3 / Agl. 2.3 cells (ATCC CRL-1631), Cell. Biol. 93 , 576 (1982), Methods Enzymol. 73B, 1 (1981), etc., and YB2 / 3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 cells. Also, there are YB2 / 3HL. P2. G11. 16Ag. 20 cells (ATCC CRL-1662) registered with the ATCC, or a substrain obtained by adapting these strains to a viable medium.
  • any method for reducing or deleting the activity of GDP-fucose transport protein can be used. Although any of these methods can be used, a genetic engineering method is preferable. The specific method is as follows.
  • a method for selecting a lectin-resistant cell line that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked is used.
  • cells in which the activity of the GDP-fucose transport protein of the present invention is lower or deleted than in the parent cell line can be obtained.
  • Lectin-resistant cells are cells whose growth is not inhibited even when cell culture is performed with an effective concentration of lectin in the culture medium.
  • the effective lectin concentration at which growth is not inhibited may be appropriately determined depending on the cell line, but is usually from 10 / g / ml to 10.0 mg / ml, preferably from 0.5 to 2.0 mg / ml. ml.
  • the effective concentration of lectin when a mutation is introduced into the parent cell line is not less than the concentration at which the parent cell cannot grow normally, preferably the same concentration as the concentration at which the parent cell cannot grow normally, more preferably 2 to 5 Fold, more preferably 10 fold, most preferably 20 fold or more.
  • a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex-type sugar chain and the 1-position of fucose is linked is a lectin that can recognize the sugar chain structure If so, any lectin is included.
  • Specific examples include lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin from Lens Culinaris), endome lectin PSA (Pea Lectin from Pi sum sativum), fava berelectin VFA (Agglutinin from Vicia faba), and Hylochawantake Lectin ML (Lectin from Aleuria aurantia) and the like.
  • the GDP-fucose transport protein includes the GDP-fucose transporter.
  • proteins that affect the activity or expression of GDP-fucose transport protein are also included in GDP-fucose transport protein.
  • Examples of the GDP-fucose transporter of the present invention include proteins encoded by DNA selected from the group consisting of the following (a) to (h).
  • the GDP-fucose transporter of the present invention includes a protein selected from the group consisting of the following (i) to (t).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having GDP-fucose transporter activity ;
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and having GDP-fucose transporter activity;
  • (0) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 with one or more amino acids deleted, substituted, inserted and / or added, and having GDP-fucose transporter activity
  • (p) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 with one or more amino acids deleted, substituted, inserted and / or added, and having GDP-fucose transporter activity
  • (r) consists of SEQ ID NO: 4 represented by Amino acid sequence and amino acid sequence having a homology of 80% or more, and GDP- fucose protein having a transporter activity I 1 production;
  • examples of the DNA that hybridizes under stringent conditions include, for example, DNA such as DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 29 or 30, or a fragment thereof as a probe.
  • examples include DNA obtained by using the hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method, and the like. Specifically, after performing hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M sodium chloride using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized, 0.:! DNA that can be identified by washing the filter with a 2-fold concentration SSC solution (the composition of a 1-fold concentration SSC solution is composed of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) at 65 ° C be able to.
  • 2-fold concentration SSC solution the composition of a 1-fold concentration SSC solution is composed of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate
  • a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 29, or 30, preferably 70% or more, more preferably 80% DNA having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably 98% or more is more preferable.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 31 or 32 has one or more amino acids deleted, substituted, inserted and / or added, and has a GDP-fucose transporter activity.
  • a protein having the following structure is described as "Moleki Yura I. Cloning 2nd Edition, Current Protocols 'in' Moleki Yura I.
  • a protein that can be obtained by introducing a site-specific mutation into a DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 31, or 32 using a selective mutagenesis method. can give.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited. The number is such that it can be lost, substituted or added, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • a protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 31, or 32 and having GDP-fucose transporter activity is defined as BLAST [ When calculated using analysis software such as J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] or FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)], SEQ ID NO: 2, 4, 31, or 32 And at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more. Proteins having homology and having one activity of GDP-fucose transporter can be mentioned.
  • the host cell of the present invention may be any cell as long as it can express an antibody molecule, and includes yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like, and preferably animal cells.
  • animal cells include CH0 cells derived from Chinese hamster ovary tissue, rat myeloma cell line YB2 / 3HL. P2.
  • Gil. 16Ag. 20 cells mouse myeloid cells Strain NS0 cell, mouse myeoma cell line SP2 / 0-Agl4 cell, Syrian hamster kidney tissue-derived BHK cell, antibody-producing hybridoma cell, human leukemia cell line Namalpa cell, embryonic stem cell, fertilized egg cell, etc.
  • Can be An antibody composition is produced by introducing a gene encoding an antibody molecule into the host cell of the present invention or, if the host cell has the ability to produce the antibody molecule, using the host cell as it is. can do.
  • the present invention also provides an antibody composition characterized by using a transgenic non-human animal or plant, or a progeny thereof, whose genome has been modified so that the activity of GDP-fucose transport protein is reduced. About the method.
  • the antibody composition refers to a composition containing an antibody molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region.
  • Antibodies are tetramers in which two types of polypeptide chains, a heavy chain and a light chain (hereinafter, referred to as “H chain” and “L chain”, respectively), are associated with each other by two molecules. About one-fourth of the N-terminal side of the H chain and about one-half of the N-terminal side of the L chain (each more than 100 amino acids) are called variable regions (hereinafter referred to as “V regions”). It is highly sexual and is directly involved in binding to antigens. Most of the part other than the V region is called the constant region (hereinafter referred to as “C region”). Antibody molecules are classified into IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE classes according to the homology of the C region.
  • the IgG class is further classified into IgG1 to IgG4 subclasses based on the homology of the C region.
  • the H chain is divided into four immunoglobulin domains, VH, CH1, CH2, and CH3, from the N-terminal side.There is a highly flexible peptide region called the hinge region between CH1 and CH2, which separates CH1 and CH2.
  • Can be The structural unit consisting of CH2 and CH3 after the hinge region is called the Fc region, to which N-glycoside-linked sugar chains are bound. This region is where the Fc receptor and complement bind. (Immunology Illustrated Original 5th edition, published February 10, 2000, Nankodo edition, Introduction to antibody engineering, January 25, 1994 First edition, Citizen Library).
  • N-Glycoside-linked sugar chains have a basic common core structure represented by the following structural formula (I) [Biochemical Experimental Method 23-Glycoprotein Glycan Research Method (Society Press Center) Takahashi Reiko (ed. 1989) )]. 3 Man j8 1 »-4GlcNAc ⁇ 1» -4GlcNAc
  • the terminal of the sugar chain that binds to asparagine is called the reducing end, and the opposite side is called the non-reducing end.
  • the N-glycoside-linked sugar chain may be any as long as it has the core structure of the above structural formula (I), but it is a high-mannose type in which only mannose is bonded to the non-reducing end of the core structure, and a non-core structure. It has one or more parallel branches of galactose-N-acetyl-cosamine (hereinafter referred to as Gal-GlcNAc) on the reducing end, and sialic acid and pi-secting on the non-reducing end of Gal-GlcNAc.
  • Examples include a complex type (complex type) having a structure such as N-acetyldarcosamine, and a hybrid type having both a high mannose type and a complex type branch at the non-reducing end of the core structure.
  • the Fc region of the antibody molecule has a region where N-glycoside-linked bran chains bind one by one, two sugar chains are bound per antibody molecule. Since the N-darcoside-linked sugar chain that binds to the antibody molecule includes any sugar chain containing the core structure represented by the structural formula (I), two N-darcoside-linked sugar chains that bind to the antibody are included. Has many combinations of sugar chains.
  • the antibody composition of the present invention produced using cells in which the activity of the GDP-fucose transport protein has been deleted or reduced is a single antibody composition as long as the effects of the present invention can be obtained. It may be composed of an antibody molecule having a sugar chain structure, or may be composed of an antibody molecule having a plurality of different sugar chain structures. As such an antibody composition of the present invention, preferably, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, N-acetylglycosamide at the reducing end of the sugar chain is preferably used.
  • an antibody composition in which the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to the protein is higher than that produced by parental cells that have not been treated to delete or reduce the activity of the GDP-fucose transport protein is higher. can give.
  • the antibody composition of the present invention produced using a transgenic non-human animal or plant, or a progeny thereof, in which the genome is modified so that the activity of the GDP-fucose transport protein is reduced As long as the effects of the present invention can be obtained, it may be composed of an antibody molecule having a single sugar chain structure, or may be composed of a plurality of antibody molecules having different sugar chain structures.
  • N-acetylethyl glucoside at the sugar chain reducing end is preferably used.
  • the ratio of sugar chains in which no fucose is bound to samin is higher than that of antibody compositions produced by non-human animals or plants whose genomes have not been modified, or by their progeny (hereinafter referred to as parent individuals). And antibody compositions.
  • the ratio of the sugar chain in which fucose is not bonded to N-acetyltyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain among the total N-daricoside-linked complex sugar chains binding to the Fc region contained in the antibody composition is as follows. All N-glycosidic bonds that bind to the Fc region contained in the composition Regarding the total number of complex-type sugar chains, non-fucose is not linked to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain. Means the percentage of the number.
  • a sugar chain in which fucose is not bonded to N-acetyltyldarcosamine at the reducing end of N-dalicoside-linked complex type sugar chain is defined as fucose that is linked to N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • a sugar chain that is not ⁇ -linked is defined as fucose that is linked to N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • a sugar chain that is not ⁇ -linked Specifically, a sugar chain in which the 1-position of fucose is not a-linked to the 6-position of ⁇ -acetyldarcosamine of the ⁇ -glycoside-linked complex-type sugar chain can be mentioned.
  • an antibody composition having a high ADCC activity among all N-daricoside-linked complex-type sugar chains binding to the Fc region contained in the antibody composition, fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain
  • the ratio of the sugar chain is higher than that of the antibody composition produced by the parent cell line or the parent individual.
  • an antibody composition in which the ratio is at least 2 times, preferably at least 3 times, more preferably at least 5 times, particularly preferably at least 10 times higher than that of the parent cell line or parent individual can be mentioned.
  • the ratio of the sugar chain in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain in the total N-glycoside-linked complex sugar chain binding to the Fc region is the parent strain. If higher than the antibody composition produced by the cell or parent individual, The antibody composition of the invention has higher ADCC activity than an antibody composition consisting of an antibody molecule produced by a parent strain or parent individual.
  • ADCC activity means that in vivo, an antibody that binds to a cell surface antigen such as a tumor cell activates the effector cell through the binding between the antibody Fc region and the Fc receptor present on the effector cell surface.
  • a cell surface antigen such as a tumor cell
  • the effector cells include killer cells, natural killer cells, activated macrophages, and the like.
  • the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyltyldarcosamine at the sugar chain reducing end, which is contained in a composition comprising an antibody molecule having an N-daricoside-linked complex-type sugar chain in the Fc region, is determined by the ratio of the antibody Using known methods such as hydrazinolysis and enzymatic digestion from molecules [Biological Chemistry Experimental Method 23-Glycoprotein Sugar Chain Research Method (Society Press Center), edited by Reiko Takahashi (1989)], release sugar chains and release them.
  • the sugar chain thus obtained can be determined by labeling the sugar chain with a fluorescent label or an isotope and separating the labeled sugar chain by a chromatography method.
  • the released sugar chains can be determined by analysis using the HPAED-PAD method [Journal of Liquid 'Chromatography (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)]. Can be.
  • the antibody molecule encompasses any molecule containing the Fc region of the antibody.
  • Specific examples include an antibody, an antibody fragment, and a fusion protein containing an Fc region.
  • Examples of the antibody include a monoclonal antibody secreted by a hybridoma cell, an antibody prepared by gene recombination technology, that is, an antibody obtained by introducing an antibody expression vector into which an antibody gene has been inserted into a host cell. Is raised.
  • Specific examples include antibodies produced by hybridomas, humanized antibodies, and human antibodies.
  • a hybridoma is a monoclonal antibody having a desired antigen specificity obtained by cell fusion of a B cell obtained by immunizing a non-human mammal with an antigen and a myeloma cell derived from a mouse or the like. Refers to cells that produce
  • humanized antibody examples include a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
  • the human chimeric antibody is composed of a non-human animal H chain V region (hereinafter also referred to as HV or VH) and an antibody L chain V region (hereinafter also referred to as LV or VL) and a human antibody H chain.
  • CH chain C region
  • CL L chain C region
  • any animal such as a mouse, a rat, a hamster, and a rabbit can be used as long as a hybridoma can be produced.
  • a human chimeric antibody is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody, and expressing the expression vector for a host cell having genes encoding human antibody CH and human antibody CL.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting each, and can be expressed and produced by introducing it into a host cell.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any CH as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hlg), but is preferably of the hlgG class, and furthermore, hIgGl, hIgG2, Any of the subclasses MgG3 and hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and those having the ⁇ class and those of the L class can be used.
  • the human CDR-grafted antibody means an antibody obtained by grafting the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of an antibody of a non-human animal to an appropriate position of VH and VL of a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody constructs a cDNA encoding the V region obtained by grafting the VH and VL CDR sequences of a non-human animal antibody to the VH and VL CDR sequences of a human antibody.
  • a human CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting each into a host cell expression vector having genes encoding the antibody CH and the human antibody CL, and introducing the expression vector into the host cell.
  • a human CDR-grafted antibody can be expressed and produced.
  • the CH of human CDR-grafted antibody may be any so long as it belongs to the hlg but it is preferable that the hlgG class, further hIgGl belonging to hlgG class, hIgG2, hI g G3, any subclass such hIgG Can be used.
  • the CL of the human-type CDR-transplanted antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and may be of the ⁇ class or the ⁇ ⁇ ⁇ class.
  • a human antibody originally means an antibody naturally occurring in a human body, but a human antibody phage library and a human antibody phage library created by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques have been developed.
  • Antibodies obtained from transgenic non-human animals producing human antibodies or transgenic plants producing human antibodies are also included.
  • Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting EB virus and the like, immortalizing, and cloning, thereby culturing lymphocytes producing the antibodies.
  • the antibody can be purified.
  • the human antibody phage library 1 is a library in which antibody fragments such as Fab and single-chain antibodies are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, phage expressing an antibody fragment having the desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted to a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
  • a transgenic non-human animal producing a human antibody refers to an animal in which a human antibody gene has been integrated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic non-human animal can be produced by introducing a mouse ES cell hepatocyte antibody gene, transplanting the ES cell into an early embryo of another mouse, and then developing the embryo. it can.
  • a transgenic non-human animal that produces human antibody acid can be prepared by introducing a human antibody gene into a fertilized egg of an animal and generating the fertilized egg.
  • a human antibody-producing transgenic non-human animal can be prepared by the method of producing a human antibody-producing hybridoma according to a hybridoma production method used in a mammal other than a normal human. By doing so, human antibodies can be produced and accumulated in the culture.
  • Transgenic non-human animals include porcupines, sheep, goats, pigs, pomas, mice, rats, -birds, monkeys, and egrets.
  • the host cell of the present invention can produce an antibody composition having higher ADCC activity than the antibody composition produced by the parent cell line.
  • the antibody may be an antibody that recognizes a tumor-associated antigen, an antibody that recognizes an antigen that is associated with allergy or inflammation, an antibody that recognizes an antigen that is associated with a circulatory disease, or an antigen that is associated with an autoimmune disease.
  • the antibody is an antibody that recognizes an antigen associated with Winores or bacterial infection.
  • IgG is preferred.
  • An antibody fragment refers to a fragment containing at least a part of the Fc region of the antibody.
  • the Fc region means a C-terminal region of the H chain of an antibody, a CH2 region and a CH3 region, and includes a natural type and a mutant type thereof.
  • At least a part of the Fc region is preferably a fragment containing the CH2 region, more preferably the first asparagine existing in the CH2 region. This refers to the area containing PC leaked acid.
  • a fusion protein having a part of the Fc region is a substance obtained by fusing an antibody or a fragment of an antibody containing a part of the Fc region of an antibody with a protein such as an enzyme or cytokin (hereinafter referred to as Fc Fusion protein).
  • the host cell of the present invention can be prepared by the method described below.
  • the host cell of the present invention can be prepared by targeting the gene for the GDP-fucose transport protein and using a gene disruption method.
  • Specific examples of the GDP-fucose transport protein include the GDP-fucose transporter.
  • the gene referred to here includes DNA or RNA.
  • the method for gene disruption includes any method capable of disrupting the gene of the target protein. Examples thereof include an antisense method, a ribozyme method, a homologous recombination method, an RNA-DNA oligonucleotide (RD0) method, an RNA interference (RNAi) method, a method using a retrovirus, and a method using a transposon.
  • an antisense method a ribozyme method, a homologous recombination method, an RNA-DNA oligonucleotide (RD0) method, an RNA interference (RNAi) method, a method using a retrovirus, and a method using a transposon.
  • RD0 RNA-DNA oligonucleotide
  • RNAi RNA interference
  • the host cell of the present invention targets the gene of the GDP-fucose transport protein, and is a cell engineering, 12, 239 (1993), bio-Z technology (BI0 / TECHN0L0GY), 17, 1097 (1999), human 'molecular' dienetics ( Hum. Mol. Genet.), 5, 1083 (1995), Cell Engineering, i3 ⁇ 4 255 (1994), Procedures 'op' the 'National' Academy 'ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1886 Attack on 06
  • genomic DNA encoding the GDP-fucose transport protein SEQ ID NO: 3 4 or consists of the nucleotide sequence represented by 35 GDP-fucose transporter that encoding a genomic DNA and the like.
  • an antisense gene or ribozyme construct of an appropriate length including a DNA portion encoding the GDP-fucose transport protein, a non-translated region portion or an intron portion is designed.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the host cell of the present invention can be obtained by selecting a transformant using the activity of the GDP-fucose transport protein as an indicator.
  • the host cell of the present invention can also be obtained by selecting a transformant using the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane or the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index.
  • any host cell such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, which has the gene for the target GDP-fucose transport protein, can be used. Can be used. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the above-mentioned host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a designed antisense gene or a promoter containing a promoter at a position where the ribozyme can be transcribed are used. Specific examples include the expression vectors described in 3. below.
  • the method for introducing a gene into various host cells As a method for introducing a gene into various host cells, the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • Methods for obtaining cDNA and genomic DNA of GDP-fucose transport protein include, for example, the methods described below.
  • a cDNA library is prepared from the prepared total RNA or mRNA.
  • GDP-fucose transport protein is prepared by using the known amino acid sequence of fucose transport protein, for example, the amino acid sequence of human. Obtain the gene fragment to be coded.
  • a cDNA library can be screened to obtain a cDNA encoding GDP-fucose transport protein.
  • the mRNA of various host cells may be a commercially available one (for example, manufactured by Clontech) or may be prepared from various host cells as described below.
  • Methods for preparing total RNA from various host cells include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology, 154.3 (1987)], and acid thiocyanate.
  • Guanidine-phenol-chloroform (AGPC) method [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental Medicine, £, 1937 (1991)].
  • oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular 'Cloning 2nd edition) can be mentioned.
  • mRNA can be prepared by using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • a cDNA library is prepared from the prepared various host cell mRNAs.
  • Methods for preparing a cDNA library include those described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current Protocols' in Molecular Biology, etc., or kits for sale, such as Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and cDNA. Plasmid Cloning (manufactured by Life Technologies), a method using ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by STRATAGENE), and the like.
  • any of a phage vector, a plasmid vector, and the like can be used as long as it can replicate autonomously in Escherichia coli K12 strain.
  • ZAP Express [STRATAGENE, Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleates 'Acid' Research, Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • Lambda ZAP II (manufactured by STRATAGENE), gtlO, Lgtll [DNA cloning 'A Practical approach Approach), 1, 49 (1985)]
  • Escherichia coli is preferably used. Specifically, Escherichia coli XL1-Blue MRF '[STRATAGENE, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] ], Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 [Journal of Molexa Biology (J. Mol.
  • This cDNA library can be used as is for subsequent analyses, but in order to reduce the percentage of incomplete-length cDNAs and obtain full-length cDNAs as efficiently as possible, the oligocap method developed by Sugano et al. [Gene , 138, 171 (1994); Gene, 200, 149 (1997); Protein nucleic acid enzyme, ⁇ , 603 (1996); Experimental medicine, U, 2491 (1993); cDNA cloning (Yodosha) (1996). CDNA library prepared using the method for preparing a gene library (Yodosha) (1994)] may be used for the following analysis.
  • a digieneative primer specific to the nucleotide sequence at the 5 'end and 3' end of the nucleotide sequence predicted to encode the amino acid sequence was prepared and prepared.
  • a DNA fragment encoding the GDP-fucose transport protein was amplified by amplifying the DNA using the cDNA library as a type II by PCR (PCR Protocols, Academic Press (1990)). Can be obtained.
  • the fact that the obtained gene fragment is a DNA encoding the GDP-fucose transport protein can be determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the didoxy method of Sanger et al. [Proceding's of the National 'Academy of Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABIPRISM377 DNA Sequencer (manufactured by PE Biosystems), etc. It can be confirmed by analysis using a base sequence analyzer.
  • a cDNA or a cDNA library synthesized from mRNA contained in various host cells was used to colony hybridize ⁇ "Scholar Plaque Hybridization (Molecular. Clawing 2nd Edition). By doing so, the DNA of GDP-fucose transport protein can be obtained.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA encoding the GDP-fucose transport protein can be analyzed from the end by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Procedures of the 'National' Tech. Analyzes using a base sequence analyzer such as 'OB' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABIPRISM377 DNA Sequencer (manufactured by PE Biosystems). The base sequence of the DNA is determined.
  • a base sequence analyzer such as 'OB' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABIPRISM377 DNA Sequencer (manufactured by PE Biosystems). The base sequence of the DNA is determined.
  • a base sequence database such as GenBank, EMBL and DDBJ is searched using a homology search program such as BLAST to find the GDP-fucose transport protein among the genes in the database.
  • the gene coding for can also be determined.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the GDP-fucose transport protein obtained by the above method includes, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 29 or 30.
  • the cDNA for GDP-fucose transport protein is chemically synthesized using a phosphoramidite-based DNA synthesizer such as the DNA synthesizer model 392 of Parkin Elma. Can also be obtained.
  • Methods for preparing genomic DNA of GDP-fucose transport protein include, for example, the methods described below. How to prepare genomic DNA
  • genomic DNA of GDP-fucose transport protein can be isolated by using a genomic DNA library screening system (Genome Systems) or Universal GenomeWalker TM Kits (CL0NTECH).
  • Methods for selecting a transformant using the activity of GDP-fucose transport protein as an index include, for example, the following methods. How to select transformants
  • a biochemical method for example, there is a method in which GDP-fucose is used as a substrate to evaluate the activity of transport to the Golgi apparatus.
  • the genetic engineering method include Northern analysis for measuring the mRNA level of the gene for the GDP-fucose transport protein and the RT-PCR method.
  • Methods for selecting cells based on changes in traits resulting from a decrease or deletion in the activity of GDP-fucose transport protein include, for example, selecting transformants using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index. And a method of selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on the cell surface as an indicator. Methods for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5. below.
  • Transformants can be selected using the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell surface as an indicator.
  • a sugar in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-daricoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are linked A technique for selecting a strain that is resistant to a lectin that recognizes the chain structure can be mentioned.
  • a specific example is Somatake 'Cell' A method using a lectin described in PC Leakage 506 and "Molecular" Genetics (Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51 (1986).
  • any lectin can be used as long as it recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -acetylcholcamine at the reducing end of ⁇ -daricoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked.
  • lentil lectin LCA Lientil Agglutinin from Lens Culinaris
  • endome lectin PSA Pe Lectin from Pi sum sativum
  • fava bean lectin VFA Agglutinin from Vicia faba
  • AAL Aleuria aur Lectin
  • 10 I g / ml ⁇ :. 10mg / ml preferably from 0.5 to 2 1 day to 2 weeks in medium containing the above lectin at a concentration of Omg / ml, preferably from 3 days to 1
  • the cells are transferred to another incubator, and further cultured in a lectin-containing medium, whereby the host cells of the present invention can be selected.
  • the host cell of the present invention can also be obtained by directly introducing an antisense oligonucleotide or ribozyme designed based on the nucleotide sequence of the GDP-fucose transport protein into the host cell without using an expression vector.
  • Antisense oligonucleotides or ribozymes can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer. Specifically, it corresponds to 5 to 150 consecutive nucleotides, preferably 5 to 60 nucleotides, more preferably 10 to 40 nucleotides in the nucleotide sequence of cDNA and genomic DNA of GDP-fucose transport protein. It can be prepared by synthesizing an oligonucleotide (antisense oligonucleotide) corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide or a liposome containing the sequence of the oligonucleotide based on the sequence information of the oligonucleotide having the sequence. it can.
  • oligonucleotide derivatives examples include oligo RNA and derivatives of the oligonucleotide (hereinafter, referred to as oligonucleotide derivatives).
  • the oligonucleotide derivatives include an oligonucleotide derivative wherein the phosphodiester diester le bond is converted to a phosphorothioate Chio oleate bond in an oligonucleotide, O Rigo phosphodiester bond N 3 in the nucleotide '- P 5' phosphodiester Fore Mi dating Oligonucleotide derivative converted to bond, oligonucleotide derivative in which ribose and phosphoric acid diester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond, oligo in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C-5 propylperacyl Nucleotide derivative, oligonucleotide derivative in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole peracyl, oligonucleotide derivative in which cytosine in oligonucleotide is substituted with C-5
  • the host cell of the present invention can be prepared by targeting the gene for the GDP-fucose transport protein and modifying the target gene on the chromosome using homologous recombination.
  • Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (hereinafter abbreviated as "Manipulating 'the' mouse 'Emprio' a 'Laboratory' Manual") Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Biomanual Series 8 Gene Targeting, Generation of Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha (1995) (hereinafter referred to as “ Abbreviated mutant mouse ”) can be performed as follows, for example.
  • a target vector for homologous recombination of a target gene to be modified (for example, a structural gene of a GDP-fucose transport protein or a promoter gene) is prepared.
  • the cell of the present invention can be prepared by introducing the prepared target vector into a host cell and selecting a cell in which homologous recombination has occurred between the target gene and the target vector.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have the gene of the target GDP-fucose transport protein. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • Target vectors for homologous recombination of the target gene are as follows: Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Novice Manual Series 8 Gene targeting, Production of mutant mice using ES cells ( (Yodosha) (1995) and the like.
  • the target vector can be used in either a replacement type or an insertion type.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, Gene Targeting, A
  • the host cell of the present invention can be prepared using the RDO (RNA-DNA oligonucleotide) method by targeting the GDP-fucose transport protein gene, for example, as follows.
  • RDO RNA-DNA oligonucleotide
  • an RD0 construct of appropriate length, including the portion encoding the GDP-fucose transport protein, the untranslated region or the intron.
  • the host cell of the present invention can be produced by introducing the synthesized RD0 into a host cell and selecting a target protein, that is, a transformant in which the GDP-fucose transport protein has a mutation.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have the gene of the target GDP-fucose transport protein. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • PC listening 06 For the introduction of RD0 into various host cells, the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3 below can be used.
  • the DNA base sequence is digested with an appropriate restriction enzyme or the like, cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and subjected to a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceding of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74, 5463 (1977)], etc.
  • the nucleotide sequence of the DNA can be determined by analysis using ALF DNA Sequencer (Pharmacia) or the like.
  • RD0 can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • Methods for introducing RD0 into host cells and selecting cells with mutations in the target protein, the gene for GDP-fucose transport protein include Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols' in 'Molecular'. Examples include a method for directly detecting a mutation of a gene on a chromosome described in biology or the like.
  • the method for selecting a transformant using the activity of GDP-fucose transport protein as an index according to the above item (1) (a), and the method using the transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index can also be used.
  • RD0 The construction of RD0 is described in Science, 273, 1386 (1996); Nature Medicine, 4, 285 (1998); Hepatology, 25, 1462 (1997); Gene. 'Therapy (Gene Therapy), 5, 1960 (1999); Gene' Therapy, 5, 1960 (1999); Journal 'Ob. Molecular' Medicine (J. Mol. Med.), 75, 829 ( 1997); Proceedings 'ob' the 'National' Academy 'op' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774 (1999); Me'ob'Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768 (1999); Nuku Reitsk 'Acid' Research (Nuc. Acids.
  • the host cell of the present invention can be prepared as follows using the RNAi (RNA interference) method, targeting the GDP-fucose transport protein gene.
  • RNAi RNA interference
  • RNAi gene construct of an appropriate length including a portion encoding the GDP-fucose transport protein or a portion of the untranslated region is designed.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the host cell of the present invention can be obtained by selecting a transformant based on the activity of the GDP-fucose transport protein or the sugar chain structure of the produced antibody molecule or the glycoprotein on the cell surface.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as it has the gene of the target GDP-fucose transport protein.
  • Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the above host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed are used. Specific examples include an expression vector of a type in which transcription is performed by polymerase III, and an expression vector described in 3. below.
  • the methods for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in the following section 3 can be used.
  • a method of selecting transformants using the activity of GDP-fucose transport protein as an index, or a method of selecting transformants using the sugar chain structure of glycoprotein on the cell membrane as an index examples include the method described in the above item 1 (1) (a). Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5. below.
  • the host cell of the present invention can also be obtained by directly introducing the RNAi gene designed based on the nucleotide sequence of the GDP-fucose transport protein into the host cell without using an expression vector.
  • the RNAi gene can be prepared by a conventional method or using a DNA synthesizer.
  • RNAi gene The construct of the RNAi gene is described in [Nature, 391, 806 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 95, Science of Proc. Natl. Acad. 15502 (1998); Nature, 395, 854 (1998); Pudding Seedings Off, The National 'Academy' Ob 'Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049 (1999); Cell, 95, 1017 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1451 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959 (1998); Nature Cell Biol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998); ), 2, 70, (2000)].
  • RNA used in the RNAi method of the present invention examples include RNAs corresponding to DNA encoding GDP-fucose transport protein and the like.
  • the RNA corresponding to the above-mentioned GDP-fucose transporter is used as the GDP-fucose transport protein.
  • the RNA used in the RNAi method of the present invention is a double-stranded RA composed of RNA and its complementary RNA and capable of reducing the amount of mRNA of GDP-fucose transport protein such as GDP-fucose transporter.
  • the length of the RNA is preferably 1 to 30, more preferably 5 to 29, still more preferably 10 to 29, and most preferably 15 to 29.
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 30 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 29;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 30 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 30,
  • RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33;
  • RNAJ having substantially the same RNAi activity as SEQ ID NO: 33 '' includes RNA represented by SEQ ID NO: 33 and any RNAJ having similar RNAi activity to GDP-fucose transport protein. Often, quantitative factors such as the length of the RNA may be different.
  • the nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been deleted or added refers to a nucleotide sequence in which one or several nucleotides at both ends of SEQ ID NO: 33 have been deleted and / or added.
  • Examples of the base sequence include a continuous RNA of preferably 1 to 30 bases, more preferably 5 to 29 bases, still more preferably 10 to 29 bases, and most preferably 15 to 29 bases.
  • DNAs corresponding to these RNAs and complementary DNAs thereof are also included in the present invention, and specific examples of the DNAs corresponding to the RNA include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • a recombinant DNA containing the DNA and its complementary DNA in a vector and a transformant obtained by introducing the recombinant DNA into cells are also encompassed by the present invention, and express the double-stranded RNA. Can be used to
  • the host cell of the present invention can be prepared by using the transposon system described in Nature Genet., 25, 35, (2000), etc., for the activity of GDP-fucose transport protein, or for the production antibody molecule or sugar on the cell membrane.
  • the host cell of the present invention can be prepared by selecting a mutant using the sugar chain structure of the protein as an indicator.
  • PC Listening 06 The transposon system is a system that induces a mutation by inserting a foreign gene into a chromosome at random, and usually uses the foreign gene inserted in the transposon as a vector to induce mutation. At the same time, a transposase expression vector for randomly inserting this gene into a chromosome is introduced into cells.
  • transposase Any transposase can be used as long as it is suitable for the sequence of the transposon to be used.
  • any gene can be used as long as it can induce mutation in the DNA of the host cell.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have the gene of the target GDP-fucose transport protein.
  • Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • a method for selecting a mutant using the activity of GDP-fucose transport protein as an index or a method for selecting a mutant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index includes, for example, The method described in (a) of (1) can be mentioned.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5. below.
  • the host cell of the present invention can be prepared by targeting the GDP-fucose transport protein and introducing a dominant negative form of the protein.
  • Specific examples of the GDP-fucose transport protein include the GDP-fucose transporter.
  • intracellular sugar nucleotide transporters function by forming dimers on the membrane of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus [Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 275, 17718 (2000)] 0 in addition, by Rukoto variants of transporter of an intracellular sugar nucleotide forcibly expressed intracellularly, to form a wild-type transporter and heterodimer formation Heterodimers have been reported to exhibit inhibitory activity against wild-type homodimers [J. Biol. Chem., 275, 17718 (2000)].
  • mutants of the intracellular sugar nucleotide transporter and introducing it into the cell, it is possible to function as a dominant negative body.
  • Such mutants can be prepared by using a site-directed mutagenesis method described in Molecular 'Clawing, 2nd edition, Current. Protocols' Molecular biology and the like.
  • intracellular bran nucleotides N-terminal deletions of proteins involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi apparatus, preferably intracellular sugar nucleotides
  • N-terminal deletion form in which the N-terminal 30 amino acids of the protein involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi apparatus is mentioned.
  • Specific examples include the N-terminal deletion of the GDP-fucose transporter described in Example 1.
  • the host cell of the present invention uses the dominant-negative gene of the target protein prepared as described above, and is used for molecular cloning, second edition, current 'protocols' in' molecular biology, manipulating mice, O According to the method for gene transfer described in the second edition, etc., for example, it can be prepared as follows.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared as necessary.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length DNA downstream of an appropriate expression vector promoter.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the host cell of the present invention can be prepared by selecting a transformant based on the activity of the GDP-fucose transport protein or the sugar chain structure of the produced antibody molecule or the glycoprotein on the cell membrane as an index.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have the gene of the target GDP-fucose transport protein. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • a DNA encoding the desired dominant negative body which is capable of autonomous replication in the above-mentioned host cell or capable of integration into a chromosome, is used.
  • Those containing a promoter at a position where transcription can be performed are used. Specific examples include the expression vectors described in 3. below.
  • a method for selecting a mutant using the activity of GDP-fucose transport protein as an index or a method for selecting a mutant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index includes, for example, The method described in (a) of (1) can be mentioned.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5. below.
  • the host cell of the present invention can be prepared by introducing a mutation into the gene of the GDP-fucose transport protein and selecting a desired cell line in which the protein has a mutation.
  • GDP- fucose transport protein genes include GDP -fucose transporter.
  • any treatment that induces a point mutation, deletion or frame shift mutation in the DNA of the cell line of the parent strain can be used.
  • Specific examples include treatment with ethylnitrosoperrea, nitrosoguanidine, benzopyrene, and athalidine dye, and irradiation with radiation.
  • various alkynoletics and carcinogens can also be used as mutagens. Examples of a method for causing a mutagen to act on cells include, for example, the third edition of tissue culture technology (Asakura Shoten), edited by The Japanese Society for Tissue Culture (1996), Nature Genet., 24, 314, ( 2000) and the like. Spontaneously occurring mutants include those spontaneously generated by continuing subculture under normal cell culture conditions without special mutagenesis treatment. .
  • Examples of a method for measuring the activity of GDP-fucose transport protein or a method for identifying the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane include the method described in the above (1) ( a ) (1).
  • Methods for identifying the sugar chain structure of the produced antibody molecule include, for example, the method described in 5. below.
  • the host cell of the present invention targets the gene for the GDP-fucose transport protein and uses antisense RNA / DNA technology [Bioscience and Industri-1, 50, 322 (1992), Chemistry, 46, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992), Cell engineering, 13 ⁇ 41463 (1997)], Trypnoline. Helix technology [Trends in Biotechnology, 10 , 132 (1992)], and the like, by suppressing the transcription or translation of the target gene.
  • Transgenic non-human animals or plants or their progeny in which the genomic gene has been modified so that the activity of GDP-fucose transport protein is controlled can target the GDP-fucose transport protein gene using the method described in 1. From the embryonic stem cell, fertilized egg cell, or plant cell of the present invention prepared using the above method, it can be prepared by a known method.
  • the target non-human animal for example, embryonic stem cells such as a pig, a sheep, a goat, a pig, a pig, a mouse, a rat, a chick, a monkey, a rabbit, etc.
  • embryonic stem cells of the present invention in which the activity of the GDP-fucose transport protein is controlled can be produced.
  • a gene encoding a GDP-fucose transport protein on a chromosome can be obtained by a known homologous recombination technique [eg, Nature, 326, 6110, 295 (1987), Cell, 51, 3, 503 (1987). Etc.), inactive or mutated clones substituted with an arbitrary sequence. I can do it.
  • a chimera consisting of an embryonic stem cell clone and a normal cell is obtained by using the produced embryonic stem cells (for example, the mutant clone) and injecting chimera or injecting chimera into an animal blastocyst. Individuals can be prepared. By crossing this chimeric individual with a normal individual, a transgenic non-human animal in which the activity of the GDP-fucose transport protein is reduced in cells of the whole body can be obtained.
  • the target vector for homologous recombination of the target gene is Gene Targeting, A
  • any of a replacement type, an insertion type, and a gene trap type can be used.
  • any method for introducing a target vector into embryonic stem cells any method can be used as long as it introduces DNA into animal cells.
  • electoporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2-227075
  • lipofection method [Procedures 'ob' the 'national' academy 'op' science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 84,
  • Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, positive selection and promoter selection described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), creation of mutant mice using ES cells, etc. , Negative selection, poly A selection, and the like.
  • a target vector containing the hprt gene after introduction into an embryonic stem cell lacking the hprt gene, the embryonic stem cell is cultured in a medium containing aminopterin, hypoxanthine and thymidine, and By selecting resistant strains, positive selection for selecting homologous recombinants containing the hprt gene can be performed.
  • a target vector containing the DT gene embryonic stem cells into which the vector has been introduced are cultured, and the growing strain is selected.
  • Recombinants randomly inserted into the chromosome other than homologous recombination have the DT gene in the chromosome. Therefore, it cannot be grown due to the toxicity of DT), so that negative selection for selecting a homologous recombinant containing no DT gene can be performed.
  • Methods for selecting the desired homologous recombinant from the selected cell lines include Southern hybridization (genomic DNA, second edition) for genomic DNA and PCR [PCA]. ⁇ Protocols (PCR Protocols), Academic Press (1990)].
  • embryonic stem cells When embryonic stem cells are incorporated into a fertilized egg by using the chimeric assembly method, it is generally preferable to use a fertilized egg at a developmental stage before the 8-cell stage. When embryonic stem cells are incorporated into a fertilized egg using the injection chimera method, it is generally preferable to use a fertilized egg from the 8-cell stage to the stage of blastocyst development.
  • pseudopregnant female mice When a fertilized egg is transplanted into a female mouse, the fertilized egg obtained in a pseudopregnant female mouse in which fertilization has been induced is artificially transplanted by mating with a vasectomized male non-human mammal. ⁇ Implantation is preferable, and pseudopregnant female mice can be obtained by natural mating. After administration of luteinizing hormone-releasing hormone (hereinafter abbreviated as LHRH) or an analog thereof, the mice are mated with male mice. Pseudopregnant female mice with induced fertility can also be obtained.
  • LHRH luteinizing hormone-releasing hormone
  • the method described in 1. can be used for fertilized egg cells of a target non-human animal, for example, a porcupine, a sheep, a goat, a septum, a poma, a mouse, a rat, a chick, a monkey, a rabbit, etc.
  • fertilized egg cells of the present invention in which the activity of GDP-fucose transport protein has been reduced or deleted can be produced.
  • the fertilized egg cells thus prepared are transplanted into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female using the method of embryo transfer described in Mar-Purifying 'Mouse' Embrio, 2nd edition, etc., and give birth to produce GDP-fucose transport protein.
  • Transgenic non-human animals with reduced or deleted activity can also be generated.
  • the target plant virulent or cell is subjected to the method described in 1 above to reduce or delete the activity of the GDP-fucose transport protein, and the virulent ruth comprising the plant cell of the present invention.
  • PC leak 06 The prepared callus was used in a known method [tissue culture, 20 (1994); tissue culture, ⁇ 1 (1995); trendyin, Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997).
  • tissue culture, 20 (1994); tissue culture, ⁇ 1 (1995); trendyin, Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997) By culturing the cells in a medium containing auxin and cytokinin according to the above-mentioned method, transgenic plants in which the activity of the GDP-fucose transport protein has been reduced or deleted can be produced.
  • Antibody compositions are described in Molecular Biology, Cloning, 2nd Edition, Current Protocols, Molecular Biology, 1 -Nylon, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (hereinafter abbreviated as Antibodies).
  • Monoclonal Antibodies principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (hereinafter abbreviated as "Monoclonal Antibodies"), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (hereinafter T, For example, it can be obtained by expressing in a host cell as follows, using a method described in “Zonchi body engineering”.
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length cDNA downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant that produces an antibody molecule can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell that is compatible with the expression vector.
  • any yeast cell, animal cell, insect cell, plant cell or the like can be used as long as it can express the gene of interest, but animal cells are preferred.
  • Enzymes involved in the modification of N-glycoside-linked sugar chains that bind to the Fc region of an antibody molecule are introduced using genetic engineering techniques.
  • Cells such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells are used as host cells. It can also be used.
  • Examples of the host cells used in the method for producing the antibody composition of the present invention include the cells produced in the above item 1 in which the activity of the GDP-fucose transport protein is deleted or reduced compared to the parent cell.
  • As the expression vector those which are capable of autonomous replication in the above-mentioned various host cells or can be integrated into a chromosome, and which contain a promoter at a position where the DNA encoding the antibody molecule of interest can be transcribed are used.
  • the cDNA can be obtained from a human or non-human animal tissue or cell by using a probe specific to the target antibody molecule according to the “cDNA preparation method” described in (1)-(a) of 1. above. It can be prepared using primers.
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains. Examples thereof include promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter. Promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, promoter, CUp1 promoter and the like.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, an electoral port method [Methods. Enzymol., 194, 182] (1990)], Supguchi Plast Method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • examples of expression vectors include pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Bunakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3 -3 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [Journal of Ob Biochemis] Tree (J. Biochemistry), 101, 1307 (1987)], pAGE210 and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV) the early promoter of SV40, the promoter of retro-inoles, Meta mouth thionein promoter, heat shock promoter, SR ct promoter and the like.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include Namalwa cells, human cells, COS cells, monkey cells, CH0 cells, Chinese hamster cells, HBT5637 (JP-A-63-299), rat myeloma cells, and mice.
  • Myeloma cells, Syrian hamsters, kidney-derived cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells and the like can be mentioned.
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • electoporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate Method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • Lipofxion method [Proceedings 'op' the 'national' academy 'ob' science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 84, 7413 (1987)]
  • Injection method Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)] (hereinafter abbreviated as Mayupi mouse.
  • T protein When an insect cell is used as a host, for example, Ryrent, Protocols, Molecular, Neurology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), / T protein can be expressed by the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • the recombinant gene transfer vector and paculovirus are co-transfected into insect cells to obtain the recombinant virus in the culture supernatant of insect cells, and then the insect virus is further infected with the recombinant virus to express the protein. be able to.
  • the gene transfer vector used in the method can be exemplified pVL1392, P VL1393, pBlueBacIII (both manufactured by Invitorogen Co., Ltd.) and the like.
  • paculoviruses are viruses that infect insects of the night roth moth family.
  • Sf9 As insect cells, Sf9, Sf21 which are ovarian cells of Spodopterafrugiperda [current 'protoconoles in molecular biology, Baculovirus Jixpression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], and Trichoplusia ni ovary cells, High 5 (manufactured by Invitrogen), and the like.
  • Examples of the method for co-transferring the above-mentioned recombinant gene introduction vector and the above-mentioned paculovirus into insect cells to prepare a recombinant virus include the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the ribofusion method [Procedure Ding's' The 'National' Academia's Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 84, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include Ti plasmid and tobacco mosaic virus vector.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the geneactin 1 promoter.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • Examples of the host cell include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, abrana, alfaalpha, rice, wheat, and wheat.
  • any method for introducing DNA into plant cells can be used.
  • a method using Agrobacterium (ARrobacterium) Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 59-140885, 60-78080, TO94 / 00977), electoral-portion method (JP-A-60-251887), method using particle gun (gene gun) (Japanese Patent No. 2606856, Japanese Patent No. 2517813) can be.
  • an antibody molecule having a sugar or a sugar chain added by the introduced gene may be obtained. it can.
  • the antibody composition can be produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating antibody molecules in the culture, and collecting from the culture.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism to efficiently culture the transformant.
  • a eukaryote such as yeast
  • a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism to efficiently culture the transformant.
  • the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, carbohydrates containing these such as nectar, starch or starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. And alcohols such as ethanol, propanol and the like.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc., other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, Corn chiple liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells and digests thereof can be used.
  • ammonia ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc., other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, Corn chiple liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells and digests thereof can be used.
  • potassium potassium phosphate potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, man sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the cultivation temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the cultivation time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH during the culture is maintained between 3.0 and 9.0.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, and the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a yeast transformed with a recombinant vector using a lac promoter a yeast transformed with a recombinant vector using a tr promoter with isopropyl-J3-D-thiogalactopyranoside, etc.
  • indol acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medici American Medical Association ;, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], Whitten's Medium [Development Engineering Experiment Manual-Transgene ⁇ How to make Nick Mouse (Kodansha) Motoya Katsuki (ed., 1987)] or a culture medium supplemented with fetal calf serum or the like.
  • Culture is carried out usually pH6 ⁇ 8, 30 ⁇ 40 ° C, 5% C0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. Culture can be carried out for one day to several months using culture methods such as Fued batch culture and holofiber culture.
  • antibiotics such as kanamycin and pesillin may be added to the medium during the culture.
  • Culture media for transformants obtained using insect cells as a host include commonly used T-band FH media (Pharmingen), Sf-900II SFM medium (Ufe Technologies), ExCell400, ExCell405 (all manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C, etc. for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige and Sturg (MS) medium, white medium, or a medium obtained by adding plant hormones such as auxin and cytokinin to these mediums is used. Can be used.
  • the cultivation is usually performed at pH 5 to 9 and 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a yeast, animal cell, or plant cell-derived transformant harboring a recombinant vector into which a DNA encoding an antibody molecule has been incorporated is cultured according to a conventional culture method to produce and accumulate the antibody composition.
  • An antibody composition can be produced by collecting the antibody composition from the culture.
  • Methods for producing the antibody composition include a method of producing the antibody composition in a host cell, a method of secreting the antibody out of the host cell, and a method of producing the antibody composition on the host cell outer membrane. The method can be selected by changing the structure.
  • the DNA encoding the antibody molecule and the DNA encoding the signal peptide suitable for the expression of the antibody molecule are inserted into an expression vector using a gene recombination technique, and the expression vector is introduced into host cells.
  • the desired antibody molecule can be actively secreted out of the host cell.
  • the production amount can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase 'gene or the like.
  • transgenic animal or plant cells are redifferentiated to create an animal (transgenic non-human animal) or plant (transgene plant) into which the gene has been introduced. Can be used to produce an antibody composition.
  • the transformant is an animal or plant individual
  • the animal is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the antibody composition, and the antibody composition is collected from the animal or plant individual.
  • the antibody composition can be produced.
  • Examples of a method for producing an antibody composition using an animal individual include, for example, a known method [American 'Giananole' ov Tali-Cal 'DURATION (American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S (1996); American 'Journal of Clinical' Nutrition), 63. 627S (1996); Bio / Technology, 9, 830 (1991)], and a method for producing a desired antibody composition in an animal constructed by introducing a gene. can give.
  • an antibody composition is produced and accumulated in the animal, and the antibody composition is collected from the animal.
  • An antibody composition can be produced.
  • the production and accumulation site in the animal include milk (eg, JP-A-63-309192) and eggs of the animal.
  • the promoter used in this case any promoter that can be expressed in animals can be used. Examples thereof include ⁇ -casein promoter, which is a mammary cell-specific promoter,] 3 casein promoter, ⁇ ratatoglobulin promoter, and whey.
  • An acidic protein promoter or the like is preferably used.
  • a transgenic plant into which DNA encoding an antibody molecule has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, ⁇ (1994); tissue culture, ⁇ 1 (1995). ); Cultivated according to Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] to produce and accumulate an antibody composition in the plant, and collect the antibody composition from the plant
  • a method for producing an antibody composition can be mentioned.
  • An antibody composition produced by a transformant into which a gene encoding an antibody molecule has been introduced is, for example, when the antibody composition is expressed in a lysed state in cells, after completion of the culture, the cells are collected by centrifugation. After suspension in an aqueous buffer, the cells are disrupted using an ultrasonic crusher, French press, Mentongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using a resin such as getylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAI0N HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and a resin using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as ptinoresepharose, pheno-resepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity mouth chromatography, chromatofocusing, isoelectric point Using a method such as electrophoresis such as electrophoresis alone or in combination, a purified sample of the antibody composition can be obtained.
  • a resin such as getylaminoethyl (DEAE)
  • the cells When the antibody composition is expressed by forming an insoluble substance in the cells, the cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged to remove the insoluble antibody thread component as a precipitated fraction. to recover.
  • the recovered insoluble form of the antibody composition is solubilized with a protein denaturant.
  • a purified sample of the antibody composition can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the antibody composition When the antibody composition is secreted extracellularly, the antibody composition can be collected in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and the antibody composition is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. A purified sample can be obtained.
  • Examples of the antibody composition thus obtained include an antibody, a fragment of the antibody, a fusion protein having an Fc region of the antibody, and the like.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which genes encoding human antibody CH and CL have been incorporated. The genes encoding human antibody CH and CL are cloned into the expression vector for animal cells, respectively. Can be constructed.
  • the C region of the human antibody can be CH and CL of any human antibody.
  • the C region of the IgG1 subclass of the H chain of the human antibody hereinafter referred to as hCy1
  • the human antibody can be used.
  • the C region of the / c class of the L chain hereinafter referred to as hC / c).
  • genes encoding CH and CL of the human antibody chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, and cDNA can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can integrate and express the gene encoding the C region of the human antibody.
  • PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [Journal of Piochemistry (J. Biochem.), 101, 1307 (1987)]
  • PHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proceedings op. The 'National' Academy ⁇ Op 'Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 78, 1527 (1981)]
  • pSGl 13d2-4 [Cytotechnology, 4, 173] (1990)].
  • the promoter and Enhansa one used for the expression vector for animal cell, early promoter of SV 4 0 and Enha Nsa Journal 'O-flop' Biochemistry (J. Biochem.), 101, 1307 (1987)], Moroni one murine leukemia Viral LTR radiochemical 'and' pie officinale research communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 (1987)], immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 ( 1985)] and Enhanser [Cell, 33. 717 (1983)].
  • the humanized antibody expression vector can be used for both types in which the antibody H chain and L chain are present on separate vectors or types in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector (hereinafter, referred to as tandem type).
  • tandem type expression of tandem humanized antibody in terms of ease of construction of humanized antibody expression vector, ease of introduction into animal cells, and balanced expression of antibody H and L chains in animal cells Vectors for use are preferred [Journal of Immunological Methods], 167, 271 (1994)].
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used for expression of a human chimeric antibody or a human CDR-transplanted antibody in animal cells.
  • CDNAs encoding non-human animal antibodies for example, VH and VL of mouse antibodies, can be obtained as follows.
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing the desired mouse antibody, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library. From the library, using the C region or V region of the existing mouse antibody as a probe, a recombinant phage or recombinant plasmid having a cDNA encoding VH and a recombinant plasmid having a cDNA encoding VL Isolate the recombinant phage or recombinant plasmid, respectively.
  • the entire nucleotide sequence of VH and VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • any animal can be used as long as it can produce hybridoma cells, such as mice, rats, hamsters, and egrets.
  • Methods for preparing total RNA from hybridoma cells include guanidine thiocyanate-cesium acetate method in trifluoromethyl mouth [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)]
  • Examples of a method for preparing mRNA include an oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular 'Cloning 2nd edition) and the like.
  • Kits for preparing mRNA from hybridoma cells include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), and the like.
  • cDNA For the synthesis of cDNA, use a standard method for preparing a cDNA library (Molecular Cloning 2nd edition; Current Protocols, In Molecular Molecular Biosystems, Supplement 1-34], or a commercially available kit
  • a method using a Super Script TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL) or a ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) may be used.
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized as a type II mRNA extracted from hybridoma cells, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ zap II (Stratagene), L gtlO, X gtll [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech) , L ExCell, (manufactured by Pharmacia Co.) pT7T3 18U, pcD2 [Molecular 'and' cellular 'Biology (Mol. Cell. Biol.) , 3, 280 (1983)] and P UC18 [Gene (Gene), 33> 103 (1985)].
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL1-Blue MRF ' [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], ⁇ 522 (J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)), K802 (Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.) Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] and JM105 [Gene, 38> 275 (1985)].
  • Methods for selecting cDNA clones encoding the VH and VL of non-human animal antibodies from the cDNA library include colony hybridization or plaque hybridization using isotopes or fluorescently labeled probes. Method (Molecular 'Cloning 2nd edition).
  • primers are prepared, and cDNA or a cDNA library synthesized from mRNA is designated as type III, and is used as a polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR method; mole cycling 1 'cloning second edition; current protocols CDNA encoding VH and VL can also be prepared by Molecular Biotechnology, Supplement 1-34).
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Sanger ( Sanger) et al., The dideoxy method [Proceedings Off, The National Academy Off, Science (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74. 5463 (1977)]
  • the base sequence of the cDNA can be determined by analysis using a base sequence automatic analyzer such as ALF DNA Sequencer (Pharmacia).
  • amino acid sequence of VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence
  • the amino acid sequence of the known antibody VH and VL (Sequences of protein and protein of interest). By doing so, the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and the subgroup to which they belong can be known.
  • amino acid sequence of each CDR of VH and VL It can be found by comparing the VH and VL amino acid sequences of known antibodies (Sequences of proteins or Proteins of interest).
  • the cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody is cloned upstream of the gene encoding CH and CL of the human antibody of the humanized antibody expression vector described in (1) of Section 3 Type chimeric antibody expression vectors can be constructed.
  • a cDNA encoding VH and VL of an antibody of a non-human animal can be obtained by combining the base sequence at the 3 'end of the antibody of a non-human animal VH and VL with the nucleotide at the 5' end of CH and CL of a human antibody.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning upstream of the CL-encoding gene so that they are expressed in an appropriate form.
  • CDNA encoding VH and VL of the human CDR-grafted antibody can be constructed as follows. First, the amino acid sequence of the VH and VL framework (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to which the VH and VL CDRs of the desired non-human animal antibody are transplanted is selected. As the amino acid sequence of FRs of VH and VL of a human antibody, any amino acid sequence derived from a human antibody can be used.
  • FR amino acid sequences of human antibody VH and VL registered in databases such as Protein Data Bank, and common amino acid sequences of each subgroup of FRs of human antibody VH and VL (Sequences 'ob') Proteins' ob 'immunological cannole' interest).
  • VH and VL of antibodies of animals other than the target human are necessary. It is desirable to select an amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the amino acid sequence of the FR.
  • the amino acid sequences of the CDRs of the VH and VL of the antibody of the non-human animal of interest are transplanted into the amino acid sequences of the FRs of the VH and VL of the selected human antibody.
  • Design the amino acid sequence The designed amino acid sequence is based on the frequency of codon usage found in the nucleotide sequence of the antibody gene.
  • the DNA sequence is converted into a DNA sequence in consideration of the DNA sequence of interest, and the DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL of the human CDR-grafted antibody is designed. Based on the designed DNA sequence, several synthetic DNAs having a length of about 100 bases are synthesized, and PCR is performed using them. In this case, it is preferable to design six synthetic DNAs for both the H chain and the L chain in consideration of the reaction efficiency in PCR and the length of the DNA that can be synthesized.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 3, and the desired human CDR-grafted antibody is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL is obtained.
  • a human CDR-grafted antibody has the antigen-binding activity of the original non-human animal by simply grafting only the VH and VL CDRs of the target non-human animal antibody to the human antibody VH and VL FR. Radio / technology known to decrease compared to antibodies (BI0 / TECHN0L0GY), 9, 266 (1991)]. This is due to the fact that not only the CDRs but also some amino acid residues of FRs are directly or indirectly involved in antigen-binding activity in VH and VL of antibodies of animals other than the original human. It is considered that amino acid residues are changed to different amino acid residues in FRs of VH and VL of human antibodies with CDR transplantation.
  • human CDR-grafted antibodies contain amino acid residues that are directly involved in antigen binding or amino acid residues of CDR in the amino acid sequence of FRs of human antibody VH and VL. Identifies amino acid residues that interact with or maintain the antibody's conformation and indirectly participate in antigen binding, and replace them with amino acids found in the antibody of the non-human animal.
  • Radi / Technology (BI0 / TECHN0L0GY), 9, 266 (1991)] has been modified to residues to increase the decreased antigen binding activity.
  • Amino acid residues in FRs of VH and VL of a human antibody can be modified by the PCR method described in 3 (5) of this section using synthetic DNA for modification.
  • the nucleotide sequence of the amplified product after PCR is determined by the method described in (2) of this section 3 to confirm that the target modification has been performed.
  • the humanized CDR transplant constructed in (5) and (6) of this section 3 was upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector described in (1) of this section 3.
  • the cDNA encoding the VH and VL of the antibody can be cloned to construct a human CDR-grafted antibody expression vector.
  • an appropriate restriction enzyme at the 5 'end of the synthetic DNA located at both ends By introducing the recognition sequence, the clones can be cloned so that they can be expressed in an appropriate form upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector described in (1) of this section 3.
  • a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed.
  • a human chimeric antibody or a human CDR-grafted antibody (hereinafter, also referred to as a humanized antibody) ) Can be obtained stably.
  • Examples of a method for introducing a humanized antibody expression vector into animal cells include the electoporation method [Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any animal cell that can produce a humanized antibody can be used. Specifically, it is derived from mouse myeloma cells, NS0 cells, SP2 / 0 cells, chick hamster ovary cells, CHO / dhfr- cells, CH0 / DG44 cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, IR983F cells, and Syrian hamster kidney.
  • B HK cells B HK cells, namalpa cells, human myeloma cells, and the like, preferably, CH0 / DG44 cells, Chinese hamster ovary cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, and the cells described in 1.
  • CH0 / DG44 cells CH0 / DG44 cells
  • Chinese hamster ovary cells Chinese hamster ovary cells
  • rat myeloma YB2 / 0 cells and the cells described in 1.
  • a transformant that stably produces the humanized antibody can be obtained by using G418 sulfate (hereinafter, referred to as G418; manufactured by SIGMA) according to the method disclosed in JP-A-2-257891. And the like.
  • the medium for animal cell culture is RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical), GIT medium (Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (JRH), IMDM medium (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM A medium (manufactured by GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS) to these mediums can be used.
  • a humanized antibody By culturing the obtained transformed strain in a medium, a humanized antibody can be produced and accumulated in the culture supernatant.
  • the production amount and antigen-binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter, referred to as an ELISA method; antibodies, Monoclonal ⁇ antibodies).
  • the transformant can increase the amount of humanized antibody produced using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in JP-A-2-257891.
  • the humanized antibody can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column (antibodies, monoclonal 'antipodis').
  • a protein A column antibodies, monoclonal 'antipodis'
  • other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration, and the like.
  • the molecular weight of the purified humanized antibody H chain, L chain or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter referred to as SDS-PAGE; Nature, 227, 680 (1970)] or Western blot. It can be measured by plotting methods (antibodies, monoclonal 'antibodies').
  • An expression vector for an Fc fusion protein is an expression vector for animal cells into which a gene encoding a protein to be fused with the Fc region of a human antibody is incorporated, and a protein to be fused to the expression vector for animal cells with the Fc region of a human antibody. It can be constructed by cloning the gene encoding
  • the Fc region of a human antibody includes a region containing the CH2 and CH3 regions, as well as a region containing the hinge region and a part of CH1. Any substance may be used as long as at least one amino acid of CH2 or CH3 has been deleted, substituted, added or inserted, and has substantially the binding activity to the Fey receptor.
  • chromosomal DNA consisting of exons and introns
  • cDNA can also be used.
  • a method for linking these genes to the Fc region each gene sequence is used as a type II PCR method ( recruiter's 'cloning 2nd edition; Current' Protocols 'in' Moreluxurer ⁇ . Pirology 1, Supplement 1-34 ).
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can integrate and express the gene encoding the C region of the human antibody. For example, PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAGE103 [Journal of Biochemistry, (J. Biochera.), 101.
  • promoters and enhancers used in expression vectors for animal cells include the early promoter and enhancer of SV40 [Journal of Biochemistry, J. Biochem., 101. 1307 (1987)], and the Moroni mouse leukemia virus. LTR Reo Chemical 'and' Pai off-the-power force 'Research. Communications (Biochem.
  • MRNA is extracted from cells or tissues that express the protein to be fused with the desired Fc, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or a recombinant plasmid having a cDNA encoding the target protein is isolated using the gene sequence portion of the target protein as a probe.
  • the entire nucleotide sequence of the target protein on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence is estimated from the nucleotide sequence.
  • any animal such as a mouse, a rat, a hamster, and a heron, can be used as long as cells and tissues can be removed therefrom.
  • Methods for preparing total RNA from cells and tissues include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in EnzyraoL, 154, 3 (1987)], and mRNA preparation from total RNA.
  • a method for carrying out the method there can be mentioned the oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular 'Cloning 2nd edition) and the like.
  • kits for preparing mRNA from cells and tissues include Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen: ⁇ ), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia), and the like.
  • Methods for synthesizing cDNA and preparing a cDNA library include conventional methods (Molecular 'Cross Jung, 2nd edition; Ryrent' Protocols', 'Molecular' biology, Supplement 1-34), or commercially available kits, For example, a method using a Super Script TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL) or a ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) can be used.
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized as a type II mRNA extracted from cells or tissues, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ zapll Stratagene
  • L gtl0, L gtll [DNA cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)]
  • Lambda BlueMid (Clontech),!
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL1-Blue MRF ' [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778] (1983)]
  • hired 522 [Jan Mole. Biol. Biol., 166, 1 (1983)]
  • K802 J. Mol. Biol. Biol. Biol. Biol.
  • JM105 Gene, 38, 275 (1985)
  • Methods for selecting cDNA clones encoding the desired protein from the cDNA library include colony 'hybridization' or plaque 'hybridization' (molecula-1) cloning using an isotope or fluorescently labeled probe. 2nd edition) can be selected.
  • primers can be prepared, and a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA can be used as a type III cDNA to prepare a cDNA encoding the target protein by PCR.
  • a PCR method can be used as a method for fusing the target protein with the Fc region of a human antibody. For example, an arbitrary synthetic DNA (primer) is set on the 5 ′ side and 3 ′ side of the gene sequence of the target protein, and PCR is performed to obtain a PCR product. Similarly, an arbitrary primer is set for the gene sequence of the Fc region of the human antibody to be fused, and a PCR product is obtained. At this time, a primer is set so that the same restriction enzyme site or the same gene sequence exists on the 3 ′ side of the PCR product of the protein to be fused and the 5 ′ side of the PCR product of the Fc region.
  • primer is set so that the same restriction enzyme site or the same gene sequence exists on the 3 ′ side of the PCR product of the protein to be fused and the 5 ′ side of the PCR product of the Fc region.
  • the mutation is introduced by using a primer into which the mutation has been introduced. Both genes are ligated by performing further PCR using the obtained two types of PCR fragments. Alternatively, ligation can be performed by performing ligation after treating with the same restriction enzyme.
  • the gene sequence ligated by the above method is digested with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cleaved into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Sanger et al. Dideoxy method [Procedural seeding 'ob' the 'national' academy 'ob' science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM 377 DNA sequencing
  • the base sequence of the DNA can be determined by analysis using a base sequence analyzer such as Taencer (manufactured by PE Biosystems).
  • a transformant that stably produces the Fc fusion protein By introducing the Fc fusion protein expression vector described in the above (1) into an appropriate animal cell, a transformant that stably produces the Fc fusion protein can be obtained.
  • Examples of a method for introducing an Fc fusion protein expression vector into animal cells include an electroporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 257891/1990; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any animal cell that can produce the Fc fusion protein can be used. Specifically, it is derived from mouse myeloma NS0 cells, SP2 / 0 cells, Chinese hamster ovary cells CH0 / dhfr_ cells, CH0 / DG44 cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, IR983F cells, and Syrian hamster kidney.
  • BHK cells BHK cells, Namalba cells which are human myeloma cells, and the like, preferably, CH0 / DG44 cells which are Chiyuzhamster monoovary cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, and the method of the present invention according to the above item 1,
  • the host cell to be used is exemplified.
  • a transformant that stably produces the Fc fusion protein can be selected using a medium for culturing animal cells containing a drug such as G418 according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • a medium for culturing animal cells containing a drug such as G418 As culture media for animal cells, RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical), GIT medium (Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (JRH), IMDM medium (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM medium (Manufactured by GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as fetal bovine serum to these media.
  • the Fc fusion protein can be produced and accumulated in the culture supernatant by culturing the obtained transformant in a medium.
  • the production amount and antigen-binding activity of the Fc fusion protein in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • the transformant can increase the production amount of the Fc fusion protein using a dhfr gene amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • the Fc fusion protein can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column or a protein G column (Antibodies, Chapter 8, Monoclonal Antibody). In addition, other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration, and the like.
  • the molecular weight of the whole purified Fc fusion protein molecule can be determined by SDS-PAGE [Nature, 227, 680 (1970)], Western blotting method (Antibodies, Chapter 12, Monoclonal Antibody), etc. Can be measured.
  • the method for producing an antibody using an animal cell as a host has been described above. However, as described above, the antibody can be produced in an enzyme, an insect cell, a plant cell, an animal individual, or a plant individual.
  • the antibody composition of the present invention can be produced by collecting the desired antibody composition from the above.
  • the binding activity to an antigen and the binding activity to an antigen-positive cultured cell line are determined by ELISA and immunofluorescence [Cancer Immunology]. (Cancer Immunol. Iramunother.), 36, 373 (1993)]. Cytotoxic activity against antigen-positive cultured cell lines can be evaluated by measuring CDC activity, ADCC activity, etc. [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373] (1993)].
  • the safety and therapeutic effect of the antibody composition in humans can be evaluated using an appropriate model of an animal species relatively close to humans, such as a cynomolgus monkey. 5. Analysis of sugar chain of antibody composition
  • the sugar chain structure of the antibody molecule expressed in various cells can be determined according to the analysis of the sugar chain structure of a normal glycoprotein.
  • sugar chains bound to IgG molecules are composed of neutral sugars such as galatose, mannose, and fucose, amino sugars such as N-acetyldarcosamine, and acidic sugars such as sialic acid.
  • the analysis can be performed using techniques such as composition analysis and sugar chain structure analysis using a two-dimensional sugar chain mapping method or the like.
  • composition analysis of the sugar chain of an antibody molecule neutral sugar or amino sugar is released by acid hydrolysis of the sugar chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • BioLC sugar composition analyzer
  • HPAEC-PAD high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection
  • the composition ratio can also be analyzed by a fluorescent labeling method using 2-aminopyridine. Specifically, a sample obtained by acid hydrolysis according to a known method [Agricultural 'and' Biological Chemistry (Agruc. Biol. Chem.), 55 (1), 283-284 (1991)] is used to prepare 2-aminopyridyl. Fluorescence labeling can be performed, and the composition ratio can be calculated by HPLC analysis.
  • Structural analysis of the sugar chain of the antibody molecule can be performed by two-dimensional sugar chain mapping [Analytical 'Biochemistry., 171, 73 (1988), Biochemistry experiment method 23-glycoprotein sugar chain research method (Academic Society) Publishing Center) edited by Reiko Takahashi (1989)].
  • the two-dimensional glycan map method for example, plots the retention time or elution position of the reversed-phase chromatography glycan on the X-axis, and the retention time or elution position of the glycan by normal-phase chromatography on the Y-axis. This is a method for estimating the sugar chain structure by comparing the results with those of known sugar chains.
  • an antibody is degraded by hydrazine to release a sugar chain from the antibody, and fluorescent labeling of the sugar chain with 2-aminopyridine (hereinafter abbreviated as PA) is performed.
  • PA 2-aminopyridine
  • the sugar chains are separated from the excess PA reagent, etc. by gel filtration, and reversed phase chromatography is performed.
  • normal phase chromatography is performed on each peak of the separated sugar chain. Based on these results, a two-dimensional sugar chain map was plotted and compared with the bran chain standard (TaKaRa) and the literature [Analytical 'Piochemistry (Anal. Biochem.), 171, 73 (1988)].
  • the sugar chain structure can be estimated from the comparison of the spots.
  • mass spectrometry such as MALDI-T0F-MS of each sugar chain can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain mapping method.
  • the antibody composition obtained according to the present invention has high ADCC activity.
  • Antibodies having high ADCC activity are useful in the prevention and treatment of various diseases including cancer, inflammatory diseases, autoimmune diseases, immune diseases such as allergies, cardiovascular diseases, and viral or bacterial infections.
  • Cancer cells ie, malignant tumors, have proliferating cancer cells.
  • Ordinary anticancer drugs are characterized by inhibiting the growth of cancer cells.
  • Antibodies having high ADCC activity can treat cancer by damaging cancer cells by a cell-killing effect, and thus are more effective as therapeutic agents than ordinary anticancer agents.
  • the antitumor effect of antibody drugs alone is often insufficient at present and is used in combination with chemotherapy [Science, 280, 1197, 1998]. If a stronger antitumor effect of the antibody composition alone is observed, the dependence on chemotherapy is reduced, and side effects are reduced.
  • the in vivo reaction in those diseases is triggered by the release of mediator molecules by the immune cells, so the immune cells are eliminated using antibodies with high ADCC activity Thereby, the energy reaction can be suppressed.
  • Cardiovascular diseases include arteriosclerosis. Atherosclerosis is currently treated with a balloon catheter, but cardiovascular disease can be prevented and treated by suppressing the proliferation of arterial cells in post-treatment restenosis using antibodies with high ADCC activity. . By suppressing the proliferation of cells infected with a virus or a bacterium using an antibody having high ADCC activity, various diseases including a virus or a bacterium infection can be prevented and treated.
  • Antibodies that recognize tumor-associated antigens, recognize allergy or inflammation-related antigens, recognize circulatory disease-related antigens, recognize autoimmune disease-related antigens, or respond to viral or bacterial infections Specific examples of antibodies that recognize related antigens are described below.
  • Anti-GD2 antibodies Anticancer Res., 13, 331-336, 1993
  • anti-GD3 antibodies Cancer Immunol. Immunother., 36, 260-266, 1993
  • anti-GM2 antibodies Cancer Res., 54 »1511-1516, 1994
  • anti-HER2 antibody Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992
  • anti-CD52 antibody Nature, 332, 323-327, 1988
  • Anti-MAGE antibody British J. Cancer, 83, 493-497, 2000
  • anti-H Ml Anti-H Ml.
  • Antibodies that recognize antigens associated with allergy or inflammation include anti-interleukin-6 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992) and anti-interleukin-6 receptor antibody (Molecular Immunol., 31, 371- 381, 1994), anti-interleukin 5 antibody (Immunol.
  • Antibodies that recognize antigens associated with cardiovascular diseases include anti-GpIIbZlIIa antibody (J. Immunol., 152, 2968-2976, 1994), anti-platelet-derived growth factor antibody (Science, 253, 1129-1132, 1991), Antiplatelet-derived growth factor receptor antibody (J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 1997) or anticoagulation factor antibody (Circulation, 101, 1158-1164, 2000).
  • Antibodies that recognize antigens associated with autoimmune diseases include anti-self DNA antibodies (Immunol. Letters, 72, 61-68, 2000).
  • Antibodies that recognize antigens associated with virus or bacterial infection include anti-gp120 antibody (Structure, 8, 385-395, 2000), anti-CD4 antibody (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998), anti-CCR4 Antibodies or anti-verotoxin antibodies (J. Clin. Microbiol., 37, 396-399, 1999).
  • the above antibodies can be obtained from public institutions such as ATCC (The American Type Culture Collection), RIKEN Cell Development Bank, Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, or Dai Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., R & D SYSTEMS, PharMingen It can be obtained from commercial reagent sales companies such as Cosmo Bio Inc. and Funakoshi Co., Ltd.
  • the medicament containing the antibody composition obtained by the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the pharmaceutical art.
  • intravenous administration is preferred.
  • Dosage forms include nebulizers, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsenoles, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, and P-hydroxy. It can be manufactured using preservatives such as benzoic acid esters, and flappers such as strawberry flapper and peppermint as additives. Capsules, tablets, powders, granules, etc.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polybutyl It can be produced using a binder such as alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like. Injectables are prepared using a carrier consisting of a salt solution, a pudose solution, or a mixture of both. Alternatively, a powder injection can be prepared by freeze-drying the antibody composition according to a conventional method and adding sodium chloride thereto.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids. Sprays are prepared using the antibody composition itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory tract mucosa of the recipient and disperses the antibody composition as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the antibody composition and the carrier used. Also, in these parenteral preparations, the components exemplified as additives in the oral preparation can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually lO / ig / k ⁇ SOmg / kg per adult per day.
  • Methods for examining the antitumor effect of the antibody composition on various tumor cells include CDC activity measurement and ADCC activity measurement in in vitro experiments, and in vivo experiments in experimental animals such as mice. Antitumor experiments using such tumor systems.
  • Figure 1 shows the results of measuring the binding activity between the anti-CCR chimeric antibody produced by the CHO / GDPft ⁇ 30-CCR4 strain and the CHO / pcDNA-CCR4 strain and the CCR4 partial peptide by changing the antibody concentration. Things.
  • the vertical axis of the graph indicates the binding activity to the CCR4 partial peptide by absorbance at a wavelength of 490 nm.
  • the horizontal axis shows the concentration of the anti-CCR4 chimeric antibody in the reaction solution.
  • ⁇ indicates the antigen binding activity of the CHO / GDPft ⁇ 30-CCR4 antibody, and ⁇ indicates the antigen binding activity of the CH0 / pcDNA_CCR4 antibody.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody produced by the CHO / GDPft ⁇ 30-CCR4 strain and the CH0 / pcDNA-CCR4 strain by changing the antibody concentration.
  • the vertical axis of the graph shows the cytotoxic activity, and the horizontal axis shows the concentration of the anti-CCR4 chimeric antibody in the reaction solution.
  • ⁇ indicates the activity of the CHO / GDPftA 30-CCR4 antibody, and ⁇ indicates the activity of the CHO / pcDNA-CCR4 antibody.
  • FIG. 3 shows the separation diagrams obtained by reverse-phase HPLC analysis of PA-glycans prepared from anti-CCR4 chimeric antibodies produced by CHO / GDPft ⁇ 30-CCR4 strain and CH0 / pcDNA_CCR4 strain, respectively. It is shown.
  • the vertical axis shows the relative fluorescence intensity, and the horizontal axis shows the elution time.
  • FIG. 4 is a diagram showing the nucleotide sequences of the untranslated portion and the adjacent translated region of the Chinese hamster GDP-fucose transporter. Primers designed for obtaining full-length cDNA are underlined. The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown below the nucleotide sequence in the translation region.
  • FIG. 5 is a diagram showing a construction process of a plasmid U6_pre-sense.
  • FIG. 6 is a diagram showing the construction process of a plasmid P BS_BglII.
  • FIG. 7 is a diagram showing a construction process of a plasmid U6_pre_antisense.
  • FIG. 8 is a diagram showing a construction process of a plasmid U6_sense_H.
  • FIG. 9 is a diagram showing a construction process of plasmid U6_antisense_H.
  • FIG. 10 is a diagram showing a construction process of a plasmid U6_GFT_H.
  • FIG. 11 is a diagram showing the steps of constructing plasmid U6_GFT_H-puro.
  • FIG. 12 is a photograph showing changes in the expression levels of actin and GDP-fucose transporter due to expression of siRA.
  • the transformed Escherichia coli was suspended in an LB medium (manufactured by DIFC0) and inoculated on an LB agar plate supplemented with 50 / ig / ml ampicillin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the plate was cultured overnight at 37 ° C., and a syndal colony of a transformant was obtained on an agar medium.
  • the obtained single colony was peeled off with a sterile toothpick, and was incubated at 37 ° C and 150 rpm (reciprocal shaking) in 50 ml of LB medium supplemented with 50 Aig / ml ampicillin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). It was cultured.
  • the obtained culture solution is collected in a centrifuge tube (Bettaton Dickinson), and the mixture is incubated at 4 ° C. 06
  • Plasmid DNA was purified from the obtained cells using Qiaprep Midi Plasmid DNA Purification Kit (QIAGEN) according to the protocol attached to the kit. The purity of the purified plasmid DNA was confirmed by agarose gel electrophoresis, and the absorbance at a wavelength of 260 nra was measured using a spectrophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation) to calculate the concentration.
  • QIAGEN Qiaprep Midi Plasmid DNA Purification Kit
  • the recombinant DNA sequence of l.lkbp was decoded, and it was confirmed that the total length of the GDP-fucose transporter was 0RF.
  • the nucleotide sequence of the sequenced human GDP-fucose transporter cDNA is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the human GDP-fucose transporter based on the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the resulting plasmid DNA was named pCR / hGDPfT.
  • a primer set [GDPfTA30-Fw Primer (SEQ ID NO: 7) and GDPfTA30_Rv Primer (SEQ ID NO: 8)] for amplifying a cDNA sequence in which 30 amino acids have been deleted from the N-terminal side of human GDP-fucose transporter
  • the GDPfTA30-Fw Primer contains an expression plasmid for animal cells pcDNA3.IHyg (+) (Invitrogen) at the 5 'end of the DNA sequence encoding amino acid 31 of the human GDP-fucose transporter. Restriction enzyme dlll site for integration into Kozak sequence (CCGCC) and translation initiation codon ATG.
  • the GDPfTA30-Rv Primer contains an expression plasmid for animal cells pcDNA3.IHyg (+) (Invitrogen) outside the 5 'end of the DNA sequence encoding the translation stop codon of the human GDP-fucose transporter.
  • the design was made by connecting restriction enzyme sites for integration.
  • DNA was purified from the sample treated with the restriction enzyme using the Qiaquick PCR Purification Kit (QIAGEN), mixed with 5 iL of the N-terminal deletion cDNA solution and pcDNA3.lHyg (+) solution, and then Ligation High (Toyo (Manufactured by Spinning Co., Ltd.) was added to the mixture for 6 minutes, and the ligation reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction mixture is separated into two, mixed with 50 ⁇ of E. coli XL-1 Blue competent cells (Stratagene), left on ice for 15 minutes, and heated in a 42 ° C water bath for 45 seconds. Transformation of E. coli by heat shock was performed.
  • QIaquick PCR Purification Kit QIAGEN
  • Ligation High Toyo (Manufactured by Spinning Co., Ltd.) was added to the mixture for 6 minutes, and the ligation reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes.
  • the reaction mixture is separated into two
  • the transformed Escherichia coli was suspended in an LB medium (DIFC0) and inoculated on an LB agar plate supplemented with 50 ig / ml ampicillin (Wako Pure Chemical Industries).
  • the plate was cultured at 37 ° C for 1 hour, and a single colony of the transformant was obtained on an agar medium.
  • the obtained single-cole mouth-one was peeled off with a sterilized toothpick, and the mixture was shaken at 37 ° C and 150 rpm (reciprocal shaking) in 50 ml of LB medium supplemented with SOig / ml ampicillin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the cells were cultured under the conditions.
  • the obtained culture solution was collected in a centrifuge tube (manufactured by Becton Dickinson), centrifuged at 8,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C, and the supernatant was removed to obtain E. coli cells.
  • Plasmid DNA was purified from the obtained cells using Qiapr-marked Midi Plasmid DNA Purification Kit (manufactured by QIAGEN) according to the protocol attached to the kit. After confirming the purity of the purified plasmid DNA by agarose gel electrophoresis, the absorbance at a wavelength of 260 nm was measured using a spectrophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation) to calculate the concentration.
  • lO ⁇ ug of pcDNA / hGDPfT ⁇ 30 and 10 ⁇ g of CCR4 chimeric antibody expression plasmid PKANTEX2160 (described in W001 / 64754) were combined with 1.6 x 10 6 CH0 / DG44 cells [G. Urlaub and LA Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)] by the electoral-portion method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • LHyg and (+) 10 ⁇ g pKANTEX2160 of was similarly co-introduced into the CH0 / DG44 cells.
  • IMDM-dFBS 10ml of IMDM -dFBS (10) -Hyg (500 ) '[ dialyzed fetal bovine serum 10%, hygromycin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 500 ⁇ ⁇ / ⁇ 1.
  • IMDM medium And seeded in a T75 flask (Grainer). In 5% C0 2 incubator 37 ° C, and cultured for 2 weeks to obtain hygromycin-resistant transformants. Next, the medium was replaced with a medium obtained by adding 50 nM MTX to IMDM-dFBS (10) -Hyg (500) and cultured for 2 'weeks to obtain a 50 nM MTX-resistant strain.
  • the medium was replaced with a medium obtained by adding 200 nM MTX to IMDM-dFBS (10) -Hyg (500), and cultured for 2 weeks to obtain a 200 nM MTX-resistant strain.
  • the expression of the anti-CCR4 chimeric antibody in these 200 nM MTX-resistant strains was confirmed by ELISA using the CCR4-peptide-immobilized plate described in Example (6).
  • the transformant into which the N-terminal deletion of human GDP-fucose transporter has been introduced is referred to as CHO / GDPft ⁇ 30-CCR4 strain
  • the transformant into which pcH3.IHyg (+) has been introduced is referred to as CHO / pcDNA-CCR4 strain.
  • the anti-CCR4 chimeric antibody produced by the prepared CHO / GDPft 30-CCR4 strain and CHO / pcDNA-CCR4 strain was purified as follows.
  • the purified antibody obtained was named CHO / GDPf t ⁇ 30-CCR strain-producing antibody as CHO / GDPf ⁇ 30-CCR4 antibody and CHO / pcDNA-CCR4 strain-producing antibody as CH0 / pcDNA-CCR4 antibody, respectively.
  • the purified antibody obtained was named CHO / GDPf t ⁇ 30-CCR strain-producing antibody as CHO / GDPf ⁇ 30-CCR4 antibody and CHO / pcDNA-CCR4 strain-producing antibody as CH0 / pcDNA-CCR4 antibody, respectively.
  • each of the two purified anti-CCR4 chimeric antibodies obtained in (4) of this example was subjected to SDS-PAGE according to a known method [Nature, 227, 680 (1970)] to determine the molecular weight and molecular weight. The degree of purification was analyzed. In each of the purified anti-CCR4 chimeric antibodies, a single band having a molecular weight of about 150 Kd was observed under non-reducing conditions, and two bands of about 50 Kd and about 25 Kd were observed under reducing conditions.
  • the binding activity of the two types of anti-CCR4 chimeric antibodies obtained in (4) of this example to CCR4 partial peptides was measured by the following method according to an ELISA method using a CCR4-peptide immobilized plate.
  • Compound 1 (SEQ ID NO: 15) was selected as a human CCR4 extracellular domain peptide to which the anti-CCR4 chimeric antibody can react.
  • a conjugate with BSA Bovine Serum Albumin (manufactured by Nacalai Testa) was prepared by the following method and used as an antigen for use in measuring the activity by the ELISA method.
  • the conjugate prepared as above is dispensed into a 96-well EIA plate (manufactured by Glyna Co., Ltd.) at 0.05 g / mL in 50 ⁇ l / well, and left at 4 ° C for adsorption. I let it. After washing with PBS, 1% BSA-PBS was added at 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups. After washing each well with PBS containing 0.05% TVeen20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), the culture supernatant of the transformant was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • Tween-PBS PBS containing 0.05% TVeen20
  • the CH0 / GDPft A 30-CCR4 antibody and the CHO / pcDNA-CCR4 antibody showed almost the same antigen binding activity to the CCR4 peptide.
  • the amount of spontaneously dissociated 51 Cr was determined by performing the same operation as above using only the medium instead of the human effector cell solution and the antibody solution, and measuring the amount of 51 Cr in the supernatant.
  • the total dissociated 51 Cr was determined by adding the lmol / L hydrochloric acid solution instead of the antibody solution and the human fectoecta cell solution, performing the same operation as above, and measuring the amount of sl Cr in the supernatant.
  • ADCC activity (%) was determined by the following equation (1). 5 i C r weight one of spontaneously released amount of 51 Cr in sample supernatant
  • ADCC activity (%) X 100 (1 ) total dissociated 51 Cr amount one natural dissociation 51 Cr amount
  • CHO / GDPf t ⁇ 3 0- CCR 4 antibodies of the ADCC activity It was significantly higher than the CHO / pcDNA-CCR4 antibody! /.
  • the sugar chain structures of the two anti-CCR4 chimeric antibodies obtained in (4) of this example were analyzed. Each antibody purified, the solution was replaced with the lOraM K P0 4 with ⁇ Li tiger free 0. 5-10K (Millipore). The replacement magnification was 80 times or more. The concentration of the substituted antibody was measured using UV-1600 (manufactured by Shimadzu Corporation). The molar absorption constant was calculated from the amino acid sequence of the antibody 06 using the following formula (2) [Advances in Protein Chemistry, 12, 303 (1962)], and the absorbance at 280 nm was calculated. The concentration was determined by setting 1.0 to 1.38 mg / ral. Equation (2)
  • E lraol / 1 AX nl + BX n2 + CX n3
  • nl Number of triptophans per antibody molecule
  • n2 Number of tyrosine per antibody molecule
  • n3 Number of cystine per antibody molecule
  • a test tube was charged with 250 ⁇ l of acetylation reagent, an acetylation reagent manufactured by Honen, and 25 ⁇ l of acetic anhydride, and the mixture was stirred well and reacted at room temperature for 30 minutes. Further, 250 ⁇ l of acetylation reagent and 25 ⁇ l of acetic anhydride were added, and the mixture was stirred well and reacted at room temperature for 1 hour. Samples were frozen in a -80 ° C freezer and lyophilized for about 17 hours. Sugar chains were recovered from the freeze-dried sample using a cellulose cartridge glycan preparation kit manufactured by TaKaRa.
  • a 2-Taminopyridine solution was prepared by adding 760 ⁇ l of HC1 to lg of 2-aminopyridine (IX PA solution) and diluting the solution 10-fold with reverse osmosis purified water (10-fold diluted PA solution). liquid).
  • Sodium borohydride solution is sodium borohydride
  • the eluent was lOmM ammonium bicarbonate, the flow rate was 0.5 ml / min, the column temperature was room temperature, and the fluorescence detector was an excitation wavelength of 320 nm and a fluorescence wavelength of 400 nm.
  • the eluate was collected 20 to 30 minutes after the sample was added, and was dried with a centrifugal concentrator to obtain a purified PA-glycan group.
  • a CLC-0DS column ⁇ 6.0 ⁇ ⁇ ⁇ 150 ⁇ , manufactured by Shimadzu
  • a reversed-phase HPLC analysis of the purified glycans was performed.
  • the column temperature was 55 ° C, the flow rate was lml / ml, and the fluorescence detector was performed at an excitation wavelength of 320 nm and a fluorescence wavelength of 400 nm.
  • the column was washed with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 3.8) and then eluted with a linear gradient of 0.5% 1-butanol for 80 minutes.
  • the identification of each PA-glycan was determined by post-source decomposition analysis (MALDI-TOF-MS analysis) of matrix-assisted laser ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS analysis) of the fractionated PA-glycan.
  • the elution position was compared with that of a PA-glycan standard manufactured by the company, and after digestion of each PA-glycan with various enzymes, reverse-phase HPLC analysis was performed.
  • the sugar chain content was calculated from the peak area of each PA-linked sugar chain in reverse phase HPLC analysis.
  • PA-glycans having a reducing end other than N-acetyl-darcosamine were excluded from the peak area calculation because they were derived from impurities or were by-products during the preparation of PA-glycans.
  • Figure 3 shows the HPLC analysis chart. Using sodium phosphate buffer (pH 3.8) as buffer A and sodium phosphate buffer (pH 3.8) containing 0.5% topanol as buffer B, analysis was performed with the following gradient.
  • Buffer B (%) 0 60 60 0 0
  • the peaks (1) to (4) shown in FIG. 3 correspond to the following structures (1) to (8), respectively.
  • GlcNAc indicates N-acetyldarcosamine
  • Gal indicates galactose
  • Man indicates mannose
  • Fuc indicates fucose
  • PA indicates pyridylamino group.
  • the ratio of sugar groups without al, 6-fucose is the area occupied by peaks 1 to 8 among 1 to 1, and the ratio of sugar chains linked to 1,6-fucose is Calculated from the area occupied by peaks 158 among 1 18.
  • Table 1 shows the results.
  • Antibody CK I 6-fucose-free sugar chain ratio (%)
  • CH0 / DG44 cells [G. Urlaub and LA Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)] were added to 10% fetal calf serum (manufactured by Ife Technologies) and 1 suspended doubled concentration of HT supplement (Life Technologies Inc.) IMDM medium supplemented with (Life Technologies, Inc.), 15 ml inoculated into 2 X 10 6 cells / ml in density for adherent cell culture T75 flask (Greiner Co.) did. And cultured at 37 5% C0 2 incubator in ° C, after collecting the 10 7 IX to 2 days of culture, total RNA was extracted according to the attached theory Akirasho by RNAeasy (QIAGEN Inc.).
  • RNA prepared in (1) above in 45 ⁇ l of sterile water, and add 1 ⁇ l of RQ1 RNase-Free DNase (Promega), 5 ⁇ l of the attached 10X DNase buffer, RNasin Ribonuclease inhibitor (Promega).
  • RQ1 RNase-Free DNase Promega
  • 5 ⁇ l of the attached 10X DNase buffer 5 ⁇ l
  • RNasin Ribonuclease inhibitor Promega
  • the genomic DNA mixed in the sample was decomposed by adding 0.5 / l to each and reacting at 37 ° C for 30 minutes. After the reaction, all RA was repurified by RNAeasy (manufactured by QIAGEN) and dissolved in 50 ⁇ l of sterilized water.
  • a single-stranded cDNA was synthesized by performing a reverse transcription reaction in a 20 ⁇ 1 system using Rigo (dT) as a primer.
  • the PCR Kuroyungu using 5 0-fold diluted aqueous solution of the reaction solution. Stored at -80 ° C until use.
  • the primer set GDPfT-Fw Primer designed based on the human GDP-fucose transporter sequence described in (1) of Example 1 was used for the single-stranded cDNA derived from CH0 / DG44 prepared in (2) above.
  • a polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify a chimeric GDP-fucose transporter in which the primer portion was a human GFT sequence and the amplified portion was a CHO sequence.
  • PCR was performed using ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.) and a 25 z 1 reaction solution containing single-stranded cDNA derived from CH0 / DG44 [ExTaq buffer, 0.2 raM dNTPs, ⁇ . ⁇ ⁇ ⁇ After heating at 94 ° C for 5 minutes, the reaction consisting of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute constitutes one cycle, and after 30 cycles, Heating was performed at 72 ° C for 5 minutes.
  • the reaction mixture was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and about 10 lObp of the specific broad fragment was purified using the GENECLEAN SPIN Kit (manufactured by BIOIOI) (hereinafter, this method is used to purify DNA fragments from agarose gel). And eluted with 201 sterile water.
  • a ligation reaction of 9 ⁇ l of the above amplified fragment with 50 ng of T7blue T-Vector was performed in a 20 ⁇ l reaction system using Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and Escherichia coli DH5 was ligated using 2 ⁇ l of the reaction solution.
  • the base sequence is attached using DNA Sequencer 377 (Perkin Elmer) and Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit (Perkin Elmer) 3 ⁇ 4 " After comparing the nucleotide sequences of the four clones thus determined and eliminating base reading errors due to PCR, the inserted DNA force S determined by this method was determined. It was confirmed that it encodes the human / CHO chimeric GDP-fucose transporter.
  • a 50 ⁇ reaction solution containing the single-stranded cDNA for RACE derived from CH0 / DG44 prepared in Example (4) [Advantage2 PCR buffer (CLONTECH ), 0.2 mM dNTPs, 0.2 ⁇ mol / 1 diatom hamster, a primer for RACE specific for GDP-fucose transporter, and a 1-fold concentration common primer (CLONTECH).
  • Polymerase chain reaction (PCR) was performed. PCR 64 at 94 ° C for 5 seconds. The reaction was performed under the conditions that a reaction consisting of 10 seconds at C and 2 minutes at 72 ° C. was repeated 20 times as one cycle.
  • ⁇ was used as a template from the reaction solution to prepare a reaction solution again, and PCR was performed under the same conditions.
  • Table 2 shows the template and primer combinations used in the first and second PCRs and the lengths of the DNA fragments to be amplified.
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis to purify the specific amplified fragment of interest, and eluted with sterile water 201.
  • the nucleotide sequence of the PCR product obtained by 5 'RACE and 3' RACE was determined using DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) and Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit (Perkin Elmer).
  • Figure 4 shows the base sequence of the 5 'and 3 untranslated regions adjacent to the ORF of the Chinese hamster GDP-fucose transporter. Primer combinations and PCR product lengths used for Chinese hamster GDP-fucose transporter c DNARACE
  • SEQ ID NO: 1 shows the Chinese hamster GDP-fucose transporter cDNA sequenced by this method.
  • SEQ ID NO: 2 shows the Chinese hamster GDP-fucose transporter amino acid sequence (365 amino acids) deduced from the ORF (base Nos. 117 to 1214) present in the determined full-length cDNA sequence.
  • Example 3 Production of siRNA-introduced plasmid-introduced cells targeting the GDP-fucose transporter and production of an antibody composition using the cells
  • RNAi target sequences The 19 bases shown in SEQ ID NO: 16 were used as RNAi target sequences. This sequence corresponds to nucleotides 803 to 821 of the nucleotide sequence shown in the Chinese hamster-derived GDP-fucose transporter cDNA (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 2.
  • the short interfering RA targeting the sequence (hereinafter referred to as siRNA) is referred to as siRNA_GFT_H.
  • the method for constructing a plasmid U6_GFT_H_puro that expresses siRNA—GFT_H in animal cells is described below.
  • the basic structure of the expression plasmid was designed according to the method of Miyagishi et al. [Natya's Biotechnol., 20, 5 (2002)].
  • the plasmid U6_presense was constructed according to the following procedure (FIG. 5).
  • the polymerase chain reaction (PCR) was performed using primers (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) designed from the human U6 snRNP gene sequence registered in GenBank (GenBank No. X07425 and M14486), and the human U6 snRNP gene was Was amplified.
  • PCR was performed using a 50 ⁇ L reaction solution containing 200 ng of Human Genomic DNA (Clontech) [1X EX Taq Buffer (Takara Shuzo), 0.2 raM dNTP, s, 2.5 units of EX Taq polymerase (Takara Shuzo) 0.5 ⁇ of the above primers (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18)] Made using a GeneAmp PGR system 9700 (PerkinElmer) 94. After heating at C for 5 minutes, 30 cycles of 1 minute at 94 ° C and 2 minutes at 68 ° C were performed
  • the PCR-amplified fragment was recovered by the ethanol precipitation method. After digesting the amplified fragment with 1 (Takara Shuzo), phenol / chloroform extraction was performed, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • the plasmid pBS_BglII was constructed according to the following procedure (FIG. 6). Dissolve the synthetic oligo DNAs shown in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 (phosphoric at the 5 'end) in distilled water, heat at 90 ° C for 10 minutes, and leave to return to room temperature I did it. 0.1 mol) of the synthetic oligo annealed from the reaction solution was added to a pBluescript SK (-) vector (STRATAGENE) previously cut with £ l (Takara Shuzo) using a DNA Ligation Kit (Takara Shuzo).
  • Plasmid U6-pre-antisense was constructed by the following procedure (Fig. 7). Human U6 was subjected to polymerase chain reaction (PCR) using primers (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22) designed from the human U6 snRNP gene sequence (GenBank Accession No. X07425, M14486) registered in GenBank. The promoter region of the snRNP gene was widened.
  • PCR For PCR, a 50 L reaction solution containing 200 ng of Human Genomic DNA (Clontech) [1 XEX Taq Buffer (Takara Shuzo), 0.2 mM dNTP, s, 2.5 units of EX Taq polymerase (Takara Shuzo) , 0.5 ⁇ M of the above primers (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22)] and heated at 94 ° C. for 5 minutes using GeneAmp PCR system 9700 (manufactured by PerkinElmer). A cycle of 1 minute at ° C and 2 minutes at 68 ° C was performed for 30 cycles.
  • the PCR-amplified fragment was recovered by the ethanol precipitation method. After digestion of this amplified fragment with Takara Shuzo Co., Ltd., phenol / chloroform extraction was performed, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin-resistant colonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the U6 promoter nucleotide sequence contained in the plasmid was determined using a DNA sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by PerkinElmer) in accordance with a conventional method. From the determined clones, a plasmid with no PCR-induced base mutation was selected and named U6-pre-antisense.
  • Brasmid U6_sense-H was constructed by the following procedure (Fig. 8). Dissolve the synthetic oligo DNAs shown in SEQ ID NOs: 23 and 24 (phosphoric at the 5 'end) in distilled water each time, heat at 90 ° C for 10 minutes, and then return to room temperature And allowed to anneal. Using a DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), 0.2 pmol of the synthetic oligo annealed from the reaction solution was previously used for PmaCI (Takara Shuzo) and BaraHI (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli DH5 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed with the obtained recombinant plasmid DNA.
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from the obtained multiple ampicillin-positive colonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence derived from the synthetic oligo contained in the plasmid was determined using a DNA sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by PerkinElmer) in accordance with an ordinary method.
  • a plasmid into which the nucleotides of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were correctly introduced was selected from the determined clones, and named U6-sensejl.
  • Plasmid U6-antisense-H was constructed by the following procedure (Fig. 9). Dissolve the synthetic oligo DNAs (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26, phosphorylated at the 5 'end) in distilled water at lOpmol, heat at 90 ° C for 10 minutes, and allow to return to room temperature. We did annealing. Using a DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), 0.2 pmol of the synthetic oligo annealed from the reaction solution was added to plasmid U6—pre_antisense previously cut with ECI (Takara Shuzo) and ⁇ RI (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed with the obtained recombinant plasmid DNA.
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from a plurality of the obtained ampicillin metamura colonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen).
  • the nucleotide sequence derived from the synthetic oligonucleotide contained in the plasmid was determined using a DNA sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by PerkinElmer) in accordance with an ordinary method.
  • a plasmid into which the nucleotides of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 were correctly introduced was selected from the determined clones and named U6_antisense_H.
  • the plasmid U6_GFT_H was constructed by the following procedure (Fig. 10). Plasmid U6-antisense-H was digested with (Takara Shuzo Co., Ltd.), followed by phenol / chloroform extraction, and the DNA fragment was recovered by the ethanol precipitation method, followed by digestion with JI (Takara Shuzo Co., Ltd.). After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 370 bp was purified using a Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • the recovered DNA fragments using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) was ligated to previously (Takara Shuzo Co., Ltd.) and ⁇ SHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) with the cut plasmid U6_sen S e_H, resulting pairs Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid DNA.
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin-resistant colonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence contained in the plasmid was determined using DNA Sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by PerkinElmer) according to a conventional method.
  • a plasmid having the desired nucleotide sequence was selected from the determined clones and named U6_GFT-H.
  • the plasmid U6_GFT_H_puro was constructed by the following procedure (Fig. 11). After cutting the plasmid U6_GFT_H with ⁇ (Takara Shuzo), the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1150 bp was purified using a Gel Extraction Kit (Qiagen). The recovered DNA fragment was ligated to a plasmid pPUR (manufactured by Clontech), which had been cut with £ ⁇ ⁇ (manufactured by Takara Shuzo) using a DNA Ligation Kit (manufactured by Takara Shuzo), and the resulting recombinant plasmid DNA was obtained.
  • Plasmid U6-GFTJL puro was linearized by cutting with restriction enzyme £ ⁇ (NEW ENGLAND BI0LABS). After cleavage, the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis to confirm that the plasmid was correctly linearized.
  • dFBS dialyzed fetal bovine serum
  • IMDM-dFBS 10 (IMDM medium containing 10% dialysis FBS), and the cells were cultured for 1 to 2 weeks.
  • the culture supernatant was collected from the cell where the growth of the transformed strain appeared and the growth was observed, and the concentration of the anti-CCR4 chimeric antibody in the supernatant was measured using the CCR4 peptide described in (6) of Example 1. It was measured by an ELISA method using a tide-immobilized plate.
  • IMDM-dFBS containing 5 OnM of MTX was used for the purpose of increasing antibody production using the DHFR gene amplification system.
  • the cells were suspended in a medium at a concentration of 1-2 ⁇ 10 5 cells / ml, and 0.5 ml was dispensed into 24 ⁇ l plates (manufactured by Asahi Techno Glass). 5% C0 by 1 to 2 weeks of culture at 37 ° C for within 2 incubator to induce transformants showing the .50NM MTX resistance.
  • the MTX concentration was raised to 200 nM in the same manner as above for the transformed transformant of Dwell in which growth was observed.
  • a transformant capable of growing in the IMDM-dFBS (10) medium containing MTX at a concentration of 500 nM and expressing the anti-CCR4 chimeric antibody was obtained.
  • the obtained transformant was suspended at a density of 0.5 cells / well in a medium obtained by adding 500 nM MTX to IMDM-dFBS (10) and seeded on a 96-well plate (Asahi Techno Glass Co., Ltd.). As a result, single cells were separated by the limiting dilution method.
  • each plate was observed under a microscope, and a well in which single colony growth was confirmed was expanded and cultured to obtain a clone expressing the anti-CCR4 chimeric antibody, strain 32-05-09. Was.
  • siRNA expression vector U6_GFT_H_puro into anti-CCR4 chimeric antibody-producing cells
  • the siRNA expression vector constructed in section 1 of this example was prepared in (1) of section 2 of this example. -09 shares were introduced.
  • siRNA expression vector into the 32-05-09 strain was performed according to the following procedure according to the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • K-PBS buffer [137 t ol / l KC1, 2.7 mmol / l NaCl, 8. lmmol / 1 Na 2 HP04, 1. 5mmol / l KH 2 P0 4, 4.
  • a 0 ⁇ ol / l was suspended in MgCl 2] 8 X 10 6 cells / ml, cell suspension 200 1 (1.8 X 10 6 ) were mixed with the linearized plasmid lO ⁇ ug prepared in section 1 of this example.
  • the cell-DNA mixture was transferred to a Gene Pulser Cuvette (distance between electrodes: 2 mm) (BIO-RAD). Transfer After that, introduction was performed using a cell fusion device Gene Pulser (manufactured by BIO-RAD) under the conditions of a pulse voltage of 0.35 KV and an electric capacity of 250 ⁇ F.
  • This cell suspension was treated with Iscove's Modified Dulbecco's Medium (Invitrogen) supplemented with 30 ml of a base medium (10% fetal dialysis serum (Invitrogen) and 50 g / ml Gentamycin (Nacalai Tester)). )) And dispensed into three 96-well plates for tissue culture (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) at 100 ⁇ l / well. 5% C0 2, the medium was aspirated after 24 hours of incubation under the conditions of 37 ° C, the basal medium supplemented with 12 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 puromycin (SIGMA Corp.) was dispensed in 100 Ueru.
  • a base medium 10% fetal dialysis serum (Invitrogen) and 50 g / ml Gentamycin (Nacalai Tester)
  • tissue culture manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.
  • 5% C0 2
  • the medium was aspirated off and the basic medium supplemented with 0.4 rag / ml LCA (Lens Curinalis Aggulutinin) (Vector) and 12 ⁇ g / ml puromycin (SIGMA) was added at 100 L / well.
  • the surviving strain was obtained by culturing for 10 days.
  • the expression of the anti-CCR4 chimeric antibody in the culture supernatant was confirmed by ELISA using the CCR4 peptide-immobilized plate described in (1) of Example 1. .
  • the obtained strain is treated with trypsin, detached from the incubator, transplanted to a 24-well plate for tissue culture (Asahi Techno Glass Co., Ltd.), and added to a basal medium supplemented with 12 g / ml puromycin (SIGMA). Cultured for 5 days. After the culture, For each strain in the plate each Ueru, 12 Ai g / tnl puromycin ( SIGMA Co.) using a basal medium supplemented with the culture expanded into tissue culture flasks (manufactured by Asahi Techno Glass Corporation) Done.
  • One of the siRNA expression vector U6-GFT-H_puro-introduced strains thus obtained was named strain 32-05-09-H12.
  • the 32-05-09-H12 strain is the cell name of the 32-05-09-H12 strain, and was filed on March 27, 2003 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Ibaraki, Japan) It has been deposited as FERM BP-8345 at Tsukuba East Higashi 1-chome, Central 6th).
  • the 32-05-09-H12 strain obtained in paragraph 2 of this Example was suspended in a basic medium supplemented with 12 ⁇ g / ml puromycin (manufactured by Sigma) at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / ml, and used for adherent cells.
  • the cells were seeded in a T75 flask (Greiner) and cultured for 3 days. Each cell suspension was recovered by trypsinization, and the suspension was centrifuged at 1200 rpm and 4 ° C for 5 minutes to remove the supernatant. Suspend the cells in Dulbecco's PBS (Invitrogen) and resuspend at 1200 rpm at 4 ° C.
  • RNAeasy manufactured by QIAGEN
  • RNA Dissolve the total RNA in 45 ⁇ 1 sterile water and add RQ1 RNase-Free DNase (Promega) 11, attached lO X DNase buffer 5 ⁇ 1, RNasin Ribonuclease inhibitor (Promega) 0.5 ⁇ 1
  • RQ1 RNase-Free DNase Promega
  • attached lO X DNase buffer 5 ⁇ 1
  • RNasin Ribonuclease inhibitor Promega
  • reaction mixtures [1 X EX Taq Buffer (Takara Shuzo), 0.2 mM dNTP, s, 2.5 units of EX Taq polymerase hot start version (Takara Shuzo), 0.5 ⁇ M
  • the above primers (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) were prepared and heated at 94 ° C for 3 minutes using GeneAmp PCR system 9700 (manufactured by PerkinElmer), and then heated at 94 ° C for 1 minute. 32 cycles of 1 minute at ° C and 2 minutes at 72 ° C were performed.
  • the anti-CCR4 chimeric antibody produced by the obtained 32-05-09-H12 strain and 32-05-09 strain was obtained by the following procedure.
  • each cell suspension was recovered. After the supernatant was recovered by centrifugation of 3000 r P m, 4 10 minutes at a ° C To a suspension was filtered using a 0. 22 ram pore size PES Membrane (manufactured by Asahi Techno Glass Corporation).
  • a 0.8 cm diameter column is filled with 0.5 ml of Mab Select (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), 3.0 ml of purified water and 0.2 mol / l boric acid-0.15 mol / l NaCl buffer (pH 7.5) 3.0 ml was sequentially passed through the cylinder. In addition, wash sequentially with 2.0 ml of 0.1 mol / 1 citrate buffer (pH 3.5) and 1.5 ml of 0.2 raol / l boric acid-0.15 mol / l NaCl buffer (pH 7.5). Thus, the carrier was equilibrated.
  • Monosaccharide composition analysis of the anti-CCR4 chimerized antibody purified in Section 4 of this Example was performed according to a known method [Journal of Liquid Chromatography, 6, 1577 (1983)]. Was done.
  • Table 3 shows the ratio of complex sugar chains without fucose to all complex sugar chains, calculated from the monosaccharide composition ratio of each antibody. While the proportion of fucose have a have a sugar chain of production to antibodies of 32-05-09 strain parent subjected to siRNA delivery was 8%, to produce siRNA delivery lines 32- 05- 0 9 _H12 strain The ratio of sugar chains without fucose in the antibody was .56%, indicating that the ratio of sugar chains without fucose was significantly increased.
  • the biological activity of the anti-CCR4 chimerized antibody purified in Section 4 of this Example was measured using the method for measuring ADCC activity described in Example 1 (7), and the antigen described in Example 1 (6).
  • the binding activity was measured according to the measurement method.
  • Table 3 shows the results. No difference in antigen binding activity was observed between the antibody produced by the parent strain 32-05-09 and the siRNA-transferred strain 32-05-09-H12, but the ADCC activity was higher in the siRNA-transduced strain 32-05 It was confirmed that the antibody produced by -09-H12 strain was significantly increased.
  • Table 3 Percentage of fucose-free sugar chains of anti-CCR4 quinula antibody produced by each strain
  • a cell in which the activity of a protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is reduced or deleted as compared to the parent cell a method for producing an antibody composition using the cell, Intracellular sugar nucleotides GDP-Fucose transport to Golgi apparatus A transgenic non-human animal or plant whose genome has been modified such that the activity of a protein involved in the protein is reduced or deleted, or a progeny thereof, a method for producing an antibody composition from the animal or plant, and the antibody A medicament containing the composition can be provided. Sequence listing free text

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

明 細 書
GDP-フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞 技術分野
本発明は、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する 蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞、 該細胞を用いた抗体組 成物の製造方法、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与 する蛋白質の活性が低下または欠失するように、 ゲノムが改変されたトランスジ エニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫、 該動物あるいは植物から抗 体組成物を製造する方法、 および該抗体組成物を含有する医薬に関する。 背景技術
抗体 IgG分子の Fc領域には、 2個所の N—グリコシド型の糖鎖結合部位が存在 しており、 血清中の IgGでは、 通常、 この部位に、 シアル酸やパイセクティング の N-ァセチルダルコサミンの付加の程度が少ない複数本の枝を持つコンプレック ス型糖鎖が結合している。 このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクト ースの付加おょぴ還元末端の N-ァセチルダルコサミンへのフコースの付加に関し ては多様性があることが知られている レィオケミストリー （Biochemistry) , 36. 130， 1997]。
このような糖鎖の構造は、 糖鎖を合成する糖転移酵素と糖鎖を分解する糖分解 酵素によって規定されていると考えられている。
以下に、 N-グリコシド結合糖鎖の生合成に関して述べる。
糖蛋白質は、 小胞体 （以下、 E Rと表記する） 内腔で糖鎖の修飾を受ける。 N ーグリコシド結合糖鎖の生合成過程では、 比較的大きな糖鎖が、 E R内腔で伸長 しつつあるポリペプチド鎖に転移される。 この際、 糖鎖はまず、 ドリコールリン 酸 （以下、 P-Dol とも表記する） と呼ばれる ο;—イソプレン単位を 20個程度含む 長鎖の脂質担体のリン酸基に順次付加される。 すなわち、 ドリコールリン酸に N- ァセチル-ダルコサミン （以下、 GlcNAc とも表記する） が転移され GlcNAc - P - P - Dolとなり、 続いてもう 1個 GlcNAcが転移され GlcNAc- GlcNAc - P - P - Do 1となる。 次いで、 マンノース （以下、 Man とも表記する） が 5 個転移され （Man) 5 - (GlcNAc) 2-P - P- Dolに、 さらに、 Manが 4個、 グルコース （以下、 Glcとも表記す る） 3 個転移される。 このようにして、 コアオリゴ糖と呼ばれる糖鎖の前駆体 (Glc) 3- (Man) 9- (GlcNAc) 2-P-P-Dol ができる。 この 14個の糖からなる糖鎖の前駆 体はァスパラギン一 X—セリンまたはァスパラギン一X—スレオニン配列 （X は任 意のアミノ酸残基を示す） を持ったポリべプチドへ E R内腔でひとかたまりのま ま転移される。 この際、 コアオリゴ糖に結合していたドリコールピロリン酸 （P- P-Dol) は遊離するが、 ピロホスファターゼの分解を受けて再ぴドリコールリン酸 となり再利用される。 糖鎖のトリミングは、 糖鎖がポリペプチドに結合すると直 ちに開始される。 すなわち、 3個の Glc と 1ないし 2個の Manが E R上で除去さ れ、 この除去には α 1， 2 -ダルコシダーゼ I、 a l， 3-グノレコシダーゼ II およびひ 1，2_マンノシダーゼが関与することが知られている。 E R上でトリミングを受け た糖蛋白質はゴルジ体へ輸送され様々な修飾を受ける。 ゴルジ体シス部には、 マ ンノースリン酸を付加する Ν-ァセチルダルコサミンホスホトランスフェラーゼ、 Ν-ァセチルグルコサミン 1 -ホスホジエステル α -Ν-ァセチルダルコサミニダーゼ およぴひ-マンノシダーゼ Iが存在し、 Man残基を 5個にまで減少させる。 ゴルジ 体メディア部には、 コンプレックス型の N-グリコシド結合糖鎖の最初の外側の GlcNAcを付加する N-ァセチルダルコサミン転移酵素 I (GnTI)、 2個の Manを除去 する α -マンノシダーゼ II、 外側から 2個目の GlcNAcを付加する N -ァセチルグル コサミン転移酵素 II (GnTII)、 還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースを 付加する α 1, 6 -フコシノレトランスフエラーゼが存在する。 ゴルジ体トランス部に はガラクトースを付加するガラクトース転移酵素、 Ν -ァセチルノイラミン酸など のシアル酸を付加するシアル酸転移酵素が存在する。 このような各種酵素の作用 を受けて Ν-グリコシド結合糖鎖が作られることが知られている。
抗体の糖鎖に関しては、 ボイド （Boyd) らは、 チャイニーズハムスター卵巣細 胞 （CH0細胞） 或いはマウスミエローマ細胞由来の NS0細胞で生産したヒト型 CDR 移植抗体 CAMPATH- 1H (ヒト IgGl サブクラス) を各種糖分解酵素で処理し、 糖鎖 の抗体依存性細胞障害活性 （以下、 ADCC活性とも表記する）、 補体依存性細胞障 害活性 （以下、 CDC活性とも表記する） に対する影響を検討した結果、 非還元末 端のシアル酸の除去は、 両活性に影響を与えないが、 更にガラクトース残基を除 去することで CDC活性のみが影響を受け、 約 50%程度活性が低下すること、 糖鎖 の完全な除去は、 両活性を消失させることを報告している [モレキュラー ·ィム ノ ロジー (Molecular Immunol. ) , 32, 1311 (1995) ]。 また、 ライ フ リ ー (Lifely) らは、 CH0細胞、 NS0細胞或いはラットミエローマ Y0細胞で生産したヒ ト型 CDR移植抗体 CAMPATH - 1H (ヒト IgGlサブクラス） の糖鎖の分析および ADCC 活性を測定した結果、 Y0細胞由来の CAMPATH- 1Hが最も高い ADCC活性を示し、 そ の活性にはパイセクティングに位置する N-ァセチルダルコサミン （以下、 GlcNAc とも表記する） が重要であることを示唆している [グリコバイオロジー (Glycobiology) , 5, 813 (1995)、 W099/54342]o
さらに、 抗体の N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンへの フコースの付加修飾によって、 抗体の ADCC活性が大きく変化することが報告され ている （W000/61739)。 これらの報告は、 ヒト IgGl サブクラスの抗体のエフエタ ター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしていることを示している。
一般的に、 医薬への応用が考えられているヒト化抗体の多くは、 遺伝子組換え 技術を用いて作製され、 動物細胞、 例えばチャイニーズハムスター卵巣糸且織由来 CH0細胞などを宿主細胞として用い製造されているが、 上述したように、 抗体の エフ タター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、 宿主細胞 によつて発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違いが観察されることから、 より高い エフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望まれ ている。
宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節し、 生産される糖蛋白質の糖 鎖構造を改変する一つの方法として、 糠鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤を応用す ることが試みられている。
糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤としては、 N -ダリコシド結合糖鎖の前駆体で あるコアオリゴ糖形成の最初のステップである GlcNAc- P-P-Dolの形成を選択的に 阻害するツユ力マイシン、 グリコシダーゼ I の阻害剤であるカスタノスペルミン や N -メチル -1-デォキシノジリマイシン、 グルコシダーゼ IIの阻害剤であるプロ モコンヅリ トール、 マンノシダーゼ Iの阻害剤である 1 -デォキシノジリマイシン や 1， 4-ジォキシ- 1, 4-イミノ- D -マンニトール、 マンノシダーゼ II の阻害剤であ るスワンソニンなどが知られている。 糖転移酵素の特異的な阻害剤としては、 N - ァセチルダルコサミン転移酵素 V (GnTV) などに対する基質のデォキシ誘導体が 開発されつつある [グライコバイオロジーシリーズ 2 -糖鎖の細胞における運命 (講談社サンェンティフィック） 永井克孝.箱守仙一朗 '木幡陽編 （1993) ]。 また、 1 -デォキシノジリマイシンはコンプレックス型糖鎖の合成を抑え、 ハイマンノー ス型ゃハイブリッド型糖鎖の割合を増加させることが知られている。 実際に、 力 スタノスペルミン、 N-メチル- 1-デォキシノジリマイシン、 スワンソニンあるいは . ツユ力マイシンなどの阻害剤を培地に添加することでハイブリ ドーマが産生する
IgGの糖鎖構造が変化し、 抗原結合性や ADCC活性などが変化することが報告され ている [モレキユラ一'ィムノロジー (Molecular. Immunol. ) , 26, 1113 (1989) ]。 しかしながら、 これら阻害剤の特異性は弱く、 また標的とする酵素を十分に阻害 することも難しいため、 生産抗体の糖鎖構造を確実に制御することは難しい。
また、 糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、 生産される糠 蛋白質の糠鎖構造を改変することも試みられており、 その具体的な例としては、 1) ラッ トの β -ガラク トシド ct 2， 6-シァリルトランスフェラーゼを CH0細胞に導 入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が可能 であること [ジャーナル ·ォブ 'バイオロジカル'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 261, 13848, 1989]、 2) ヒ トの -ガラク トシド 2-ひフコシルトランスフェラー ゼをマウス L細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース （以下、 Fuc と も表記する） が付加された H抗原 （Fuc α l-2Gal ]3 1-) の発現が可能であること [サイエンス (Science) , 252, 1668, 1991]、 3) β 1， 4_Ν-ァセチルダルコサミン 転移酵素 ΠΙ (GnTIII) を導入した CH0細胞を用いて抗体を生産することで N-グ リコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置する N-ァセチルダルコサミンの付カロ の割合が高い抗体の生産が可能であること [グリコバイオロジー （Glycobiology) , 5, 813 (1995)、 W099/54342] が報告されている。 GnTIII を導入した CH0細胞を 用いて抗体を発現させた場合には、 親株で発現させた抗体と比べて 16 倍高い ADCC活性を示した。 し力 しながら、 GnTIIIあるいは ]3 1， 4 - N -ァセチルダルコサミ ン転移酵素 V (GnTV) の過剰発現は CH0細胞に対して毒性を示すと報告されてい るため、 抗体医薬の生産には適切ではない。
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として 用いることで、 生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されてお り、 その具体的な例としては、 N-ァセチルダルコサミン転移酵素 I (GnTI) の活 性が欠損している CH0細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する抗 体を生産した報告が挙げることができる [ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー （J. Immunol. ) , 160, 3393， 1998]。 また、 CMP-シアル酸トランスポーターや UDP-ガ ラタトーストランスポーターの欠損株を用いて、 糖鎖非還元末端側にシアル酸が 付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、 ガラクトースの付加のない抗体 の発現例が報告されているが、 医薬への応用に適したエフェクター作用が向上し た抗体の発現には成功していなレ、 [ジャーナル.ォブ 'ィムノ ロジー (J. Immunol. ) , 160, 3393， 1998]。 これら変異株は、 変異剤処理によりランダムに変 異が導入された結果の株として取得されており、 医薬品製造に用いる株として適 切ではない。
このように、 生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、 宿主細胞の糖 鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、 実際には糖鎖の 修飾機構は多様かつ複雑であり、 かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは 言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。 特に、 抗体のエフヱク タ一機能は糖鎖構造により大きな影響を受ける事が明らかになりつつあるが、 最 適な糖鎖構造で修飾された抗体分子を産生しうる宿主細胞の取得には至っていな レ、。 発明の開示
本発明は、 以下の （1)〜（70) に関する。
(1) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞。
(2) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の活性が遺伝子工学的な手法により低下または欠失した （1) に記載の細胞。
(3) 遺伝子工学的な手法が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群か ら選ばれる手法である、 (2)〜（5) のいずれか 1項に記載の細胞。
(a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の遺伝子を標的した遺伝子破壌の手法；
(b) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質のドミナントネガティブ体を導入する手法；
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質についての突然変異を導入する手法；
(d) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の転写または翻訳を抑制する手法。
(4) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質のドミナントネガティブ体が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体 への輸送に関与する蛋白質の N末端欠失体である、 （3) に記載の細胞。
(5) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の N末端欠失体が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に 関与する蛋白質の N末端 30アミノ酸が欠失した N末端欠失体である、 （4) に記載 の細胞。 (6) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の転写または翻訳を抑制する手法が、 RNAi (RNA interference) 法である、 （3) に記載の細胞。
(7) RNAi 法が、 以下の （ 、 （b)、 （c) および （d) からなる群から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成され、 かつ細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの ゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の mRNA量を減少させることが可能な 2本鎖 RNAを細胞内に導入または発現させる方法である、 （6) に記載の細胞。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表される 塩基配列からなる DNAに対応する RNA；
(b) 配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表される 塩基配列からなる DNAに対応する RNA；
(c) 配列番号 29で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表され る塩基配列からなる DNAに対応する R A；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表され る塩基配列からなる DNAに対応する RNA。
(8) 以下の （a；)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれる RNAおよぴそ の相補 R Aで構成される 2本鎖 RNAを細胞内に導入または発現させることで、 細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の mRNA 量を減少させた、 （6) または （7) に記載の細胞。
(a) 配列番号 33で表される塩基配列からなる RNA；
(b) 配列番号 33で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失ま たは付加された塩基配列からなり、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ 体への輸送に関与する蛋白質に対して配列番号 33 と実質的に同一の RNAi活性を 有する R A。
(9) 2本鎖 RNAが、 （7) または （8) に記載の RNAに対応する DNAおよびその相補 DNAを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、 （7) または （8) に記載の 細胞。
(10) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質が GDP-フコーストランスポーターである、 （1)〜（9) のいずれか 1項に記載の 細胞。
(11) GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 (f)、 (g) および （h) からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 (10) に記載の細胞。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA； (b) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNA；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNA；
(e) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA ;
(f) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(g) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(h) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA。
(12) GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 (c) , (d)、 (e) , (f)、 （g)、 （h)、 （i)、 （j)、 （k) および （1) からなる群から選ばれる蛋白質であ る、 （10) に記載の細胞。
(a) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 31で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(d) 配列番号 32で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(e) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入およぴ /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(g) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(h) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入およぴ /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質； (i) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活 I1生を有する蛋白質；
(j) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ 酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(k) 配列番号 31 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(1) 配列番号 32 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
(13) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、 （1)〜（12) のいずれか 1項に記載の細胞。
(14) 少なくとも、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれ るレクチンの一つに耐性である、 （13) に記載の細胞。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d) ヒィロチャワンタケレクチン。
(15) 細胞が、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞おょぴ植物細胞からなる群から選ば れる細胞である、 （1)〜（14) のいずれか 1項に記載の細胞。
(16) 細胞が、 以下の （a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （ 、 （f)、 （g)、 （h)、 (i) および (j) からなる群から選ばれる細胞である、 （1)〜（15) のいずれか 1項に記載の細 胞。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
(c) マウスミエローマ細胞株 NS0細胞；
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0-Agl4細胞；
(e) シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞；
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h) 胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞；
(j) 植物細胞。
(17) (1)〜（16) のいずれか 1項に記載の細胞に、 抗体分子をコードする遺伝 子を導入した細胞。 (18) 抗体分子が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれ る分子である、 （17) に記載の細胞。
(a) ヒト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a) または （b) の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a) または （b) の Fc領域を有する融合蛋白質。
(19) 抗体分子のクラスが IgGである、 （17) または 8) に記載の細胞。
(20) 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害 活性が高い抗体組成物である、 （17)〜（19) のいずれか 1項に記載の細胞。
(21) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 該抗体組成物中に含まれ る Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N- ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生 産する抗体糸且成物よりも高いことを特徴とする、 （20) に記載の細胞。
(22) 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複 合型糖鎖の 20%以上である （21) に記載の細胞。
(23) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 （21) に記載の細胞。
(24) (17)〜（23) のいずれか 1項に記載の細胞を用いること特徴とする、 抗体 組成物を製造する方法。
(25) (17)〜(23) のいずれか 1項に記載の細胞を培地に培養し、 培養物中に抗 体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体 組成物を製造する方法。
(26) 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害 活性が高い抗体組成物である、 （24) または （25) に記載の方法。
(27) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 該抗体組成物中に含まれ る Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N - ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生 産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、 （26) に記載の方法。
(28) 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複 合型糖鎖の 20%以上である （27) に記載の方法。
(29) フコースが結合していない糠鎖が、 該フコースの 1位が N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 （27) に記載の方法。
(30) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の活性が低下または欠失するように、 ゲノムが改変されたトランスジエニック 非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(31) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の遺伝子がノックアウトされた、 （30) に記載のトランスジエニック非ヒト動物 あるいは植物、 またはその子孫。
(32) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、 031) に記載のトラン スジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(33) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質が GDP-フコーストランスポーターである、 （30)〜（32) のいずれか 1項に記載 のトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(34) GDP -フコーストランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 (f)、 (g) および （h) からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 (33) に記載のトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA ;
(c) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNA；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNA;
(e) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジ ントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(f) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(g) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件 でハイプリダイズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(h) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活^¾を有する蛋白質を コードする DNA。
(35) GDP-フコース トランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 (c) , (d)、 （e)、 (f)、 （g)、 （h)、 （i)、 （j)、 （k) および （1) からなる群から選ばれる蛋白質であ る、 （33) に記載のトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(a) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(d) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(e) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Zまたは付カ卩されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(g) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および / または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(h) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入おょぴ Zまたは付カ卩されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(i) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(j) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(k) 配列番号 31 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(1) 配列番号 32 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
(36) トランスジエニック非ヒト動物が、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 -ヮトリ、 サルおよぴゥサギからなる群から選ばれる動物であ る、 （30)〜（35) のいずれか 1項に記載のトランスジエニック非ヒト動物、 または その子孫。
(37) (30)〜（36) のいずれか 1項に記載のトランスジ ニック非ヒト動物ある いは植物、 またはその子孫に抗体分子をコードする遺伝子を導入した、 トランス ジヱニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(38) 抗体分子が、 以下の （a；)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれ る分子である、 （37) に記載のトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物、 また はその子孫。
(a) ヒ ト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a) または （b) の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a) または （b) の Fc領域を有する融合蛋白質。
(39) 抗体分子のクラスが IgGである、 （37) または （38) に記載のトランスジ ェエック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
(40) (37)〜（39) のいずれか 1項に記載のトランスジエニック非ヒト動物ある いは植物、 またはその子孫を飼育し、 飼育した動物あるいは植物から抗体組成物 を含む組織あるいは体液を取得し、 取得した組織あるいは体液から目的とする抗 体組成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
(41) (35)〜（37)のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック非ヒト動物ある いは植物、 またはその子孫の抗体分子を産生する細胞を取得し、 取得した抗体産 生細胞を培地に培養し、 培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗 体組成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
(42) 抗体組成物がゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、 また はその子孫から得られる抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体 組成物である、 （40) または （41) に記載の方法。
(43) 抗体依存性細胞障害活性が高 、抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していなレ、糖鎖の割合が、 ゲノムが改変さ れていない非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫が産生する抗体組成物より 髙いことを特徴とする、 （42) に記載の方法。
(44) 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複 合型糖鎖の 20%以上である （43) に記載の方法。
(45) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 （43) に記載の方法。
(46) (24)〜（29) のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
(47) (40)〜（45) のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
(48) (46) または （47) に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
(49) 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 （48) に記載の医薬。
(50) 以下の （a) または （b) から選ばれる蛋白質。
(a) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入およぴ /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質。
(51) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA。
(52) 配列番号 1に記載の全長あるいは一部 DNAを含む、 GDP-フコーストラン スポーターを標的とした相同組換えのためのターゲットベクター。
(53) GDP-フコーストランスポーターの機能を阻害する蛋白質。
(54) GDP-フコーストランスポーターの機能を阻害する蛋白質が、 GDP-フコー ストランスポーターのドミナントネガティブ蛋白質である、 （53) に記載の蛋白質。
(55) GDP-フコーストランスポーターのドミナントネガティブ蛋白質が、 GDP - フコーストランスポーターの N末端欠失体である、 （54) に記載の蛋白質。
(56) GDP -フコーストランスポーターの N末端欠失体が、 GDP-フコーストラン スポーターの N末端 30ァミノ酸が欠失した N末端欠失体である、 （55) に記載の 蛋白質。
(57) GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a；)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 (f)、 （g)、 （h)、 （i)、 （j)、 （k) および （1) 力 らなる群から選ばれる蛋白質であ る、 （53)〜（56) のいずれか 1項に記載の蛋白質。
(a) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(d) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(e) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入おょぴ Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入およぴ /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(g) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付カ卩されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活~生を有する蛋白質； (h) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入およぴ /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(i) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(j) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(k) 配列番号 31 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(1) 配列番号 32 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
(58) (53)〜（57) のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする DNA。
(59) 以下の（a)および (b)からなる群から選ばれる RNAおよびその相捕 RNAで 構成される 2本鎖 RNA。
(a) 配列番号 33で表される塩基配列からなる RNA；
(b) 配列番号 33で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失ま たは付加された塩基配列からなり、 細胞内糠ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ 体への輸送に関与する蛋白質に対して配列番号 33 と実質的に同一の RNAi活性を 有する RNA。
(60) (59) に記載の RNAに対応する DNAおよびその相補 DNA。
(61) RNAに対応する DNAが配列番号 16で表される塩基配列からなる DNAである (60) に記載の DNA。
(62) (60) または （61) に記載の DNAおよびその相補 DNAをベクターに含む、 組 換え体腿。
(63) (59) に記載の 2本鎖 RNAを発現させるために構築されている、 （62に記 載の組換え体 DNA。
(64) (62) または （63) に記載の組換え体 DNAを細胞に導入して得られる形質 転 体。
(65) (59) に記載の 2本鎖 RNAを細胞内に導入または発現させることにより、 N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコー スの 1位が α結合した糠鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を作製す る方法。
(66) 2本鎖 RNAの細胞内への導入が、 （62) または （63) に記載の RNAの相補 DNA を組み込んだベクターの細胞内への導入である、 （65) に記載の方法。 (67) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 が、 少なくとも、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれるレ クチンの一つに耐性を有する細胞である、 （65) または （66) に記載の方法。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d) ヒィロチャワンタケレクチン。
(68) 細胞が、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞おょぴ植物細胞からなる群から選ば れる細胞である、 （65)〜（67) のいずれか 1項に記載の方法。
(69) 細胞が、 以下の （a)、 （b)、 （ 、 （d)、 （ 、 （f)、 （g)、 （h)、 (i) および (j) からなる群から選ばれる細胞である、 （65)〜（68) のいずれか 1項に記載の細 胞。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0-Agl4細胞；
(e) シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞；
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h) 胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞；
(j) 植物細胞。
(70) (48) または （49) に記載の医薬を製造するための、 （43) または （44) に記載の抗体組成物の使用。 本発明の細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋 白質の活性が親細胞よりも低下または欠失した細胞 （以下、 「本発明の宿主細 胞 J と略記する） としては、 親株細胞よりも細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコース のゴルジ体への輸送に関与する蛋白質 （以下、 「GDP-フコース輸送蛋白質」 と略 記する） の活性を低下または欠失させた細胞であれば 、かなる細胞も包含される。 親株細胞とは、 GDP -フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための 方法を施す前の細胞をいう。 NSO 細胞の親株細胞としては、 バイオ/テクノロジー （BI0/TECHN0L0GY)， 10, 169 (1992) 、 ノ ィォテクノロジー 'バイオエンジニアリング （Biotechnol. Bioeng. ) , 73, 261, (2001) 等の文献に記載されている NS0細胞があげられる。 また、 理化学研究所細胞開発銀行に登録されている NS0細胞株 （RCB0213)、 ある いはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
SP2/0 - Agl4 細胞の親株細胞としては、 ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー （J. Immunol. ) , 126, 317 (1981)、 ネイチヤー （Nature) , 276, 269 (1978)、 ヒユー マン'アンチイボディズ 'アンド 'ノヽイブリ ドーマズ （Human Antibodies and Hybridomas) , 3, 129 (1992) 等の文献に記載されている SP2/0_Agl4細胞があげ られる。 また、 ATCCに登録されている SP2/0- Agl4細胞 (ATCC CRL-1581) あるい はこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株 (ATCC CRL-1581. 1) などもあげら れる。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞の親株細胞としては、 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、 Genetics, 55, 513 (1968)、 Chroraosoma, 41. 129 (1973)、 Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、 Radiation Research, 148, 260 (1997)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 4216 (1980)、 Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、 Cell, 6, 121 (1975)、 Molecular Cell Genetics, Appendix I， II (p883_900)等の文献に記載されている CH0細胞があげられる。 ま た、 ATCC に登録されている CH0 - K1 株 （ATCC CCL- 61)、 DUXB11 株 （ATCC CRL- 9096)、 Pro- 5株 （ATCC CRL- 1781) や、 市販の CH0-S株 (Lifetechnologies 社 Cat#11619)、 あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株なども具体的 な例としてあげられる。
ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 細胞の親株細胞としては、 Y3/Agl. 2. 3細胞 （ATCC CRL - 1631) から樹立された株化細胞、 Cell. Biol. 93, 576 (1982)、 Methods Enzymol. 73B, 1 (1981) 等の文献に記載されている YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞をあげることができる。 また、 ATCCに登録されてい る YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20細胞 (ATCC CRL - 1662) あるいはこれら株を生育可能 な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
GDP -フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法としては、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法であればレヽず 6 れの手法でも用いることができるが、 遺伝子工学的な手法が望ましい。 その具体 的な方法としては、
(a) GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的した遺伝子破壌の手法；
(b) GDP-フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法；
(c) GDP -フコース輸送蛋白質についての突然変異を導入する手法；
(d) GDP-フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法
などがあげられる。
また、 N -ダリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選別する 方法を用いることにより、 本発明の GDP-フコース輸送蛋白質の活性が親株細胞よ りも低下または欠失した細胞を取得することができる。
レクチンに耐性な細胞とは、 培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を 行ったときにも、 生育が阻害されない細胞をいう。
本発明において、 生育が阻害されないレクチン有効濃度は、 細胞株に応じて適 宜定めればよいが、 通常 lO / g/ml〜； 10. 0mg/ml、 好ましくは 0. 5〜2. Omg/ml であ る。 親株細胞に変異が導入された場合のレクチンの有効濃度とは、 親株細胞が正 常に生育できない濃度以上であり、 好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃 度と同濃度、 より好ましくは 2〜5倍、 さらに好ましくは 10倍、 最も好ましくは 20倍以上である。
N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、 該糖鎖構造を認 識できるレクチンであれば、 いずれのレクチンも包含される。 その具体的な例と しては、 レンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin) , エンドゥマメレクチン PSA (Pi sum sativum由来の Pea Lectin) , ソラマメレクチ ン VFA (Vicia faba 由来の Agglutinin)、 ヒィロチャワンタケレクチン ML (Aleuria aurantia由来の Lectin) などがあげられる。
GDP-フコース輸送蛋白質としては、 GDP -フコーストランスポーターなどがあげ られる。 また、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性に影響を与えたり、 発現に影響を 与える蛋白質も GDP -フコース輸送蛋白質に包含される。
本発明の GDP-フコーストランスポーターとしては、 以下の （a)〜（h) からなる 群から選ばれる DNAがコードする蛋白質があげられる。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA； (b) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 29で表される塩基酉己列からなる DNA；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNA；
(e) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件で ハイプリダイズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコ 一ドする DNA；
(f) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件で ハイプリダイズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコ 一ドする DNA;
(g) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件で ハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコ 一ドする DNA；
(h) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件で ハイプリダイズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活4を有する蛋白質をコ 一ドする DNA。
さらに、 本発明の GDP-フコーストランスポーターとしては、 以下の （i)〜（t) からなる群から選ばれる蛋白質があげられる。
(i) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(j) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(k) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(1) 配列番号 32で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(m) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入およぴ /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(n) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(0) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質； (p) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(q) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(r) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活 I1生を有する蛋白質；
(s) 配列番号 31 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(t) 配列番号 32 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
本発明において、 ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA として は、 例えば、 配列番号 1、 3、 29または 30で表される塩基配列を有する DNAなど の DNA またはその一部の断片をプローブとして、 コ口-一 'ハイプリダイゼーシ ヨン法、 プラーク ·ハイプリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイプリ ダイゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNA などがあげられる。 具体的 には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNA を固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの塩化ナトリゥム存在下、 65°Cでハイプリダイゼーションを行った後、 0.：！〜 2倍濃度の SSC溶液 (1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄す ることにより同定できる DNA をあげることができる。 ハイプリダイゼーシヨンは、 Molecular し loning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (以下、 モレキュラー 'クローニング第 2版と略 す)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987 - 1997 (以下、 カレント'プロトコールズ 'イン'モレキュラー 'バイオロジーと略す）、 DNA Cloning 1 : し ore Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) 等に記載されている方法に準じて行うことができる。 ハイブ リダイズ可能な DNA として具体的には、 配列番号 1、 3、 29または 30で表される 塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 70%以上、 よ り好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 特に好ましくは 95%以上、 最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。 本発明において、 配列番号 2、 4、 31または 32で表されるアミノ酸配列におい て 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列 からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質とは、 モレキ ユラ一 .クローニング第 2 版、 力レント ·プロトコールズ 'イン 'モレキユラ 一 . ノ ィォロジ一、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34> 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) 等に 記載の部位特異的変異導入法を用いて、 例えば、 配列番号 2、 4、 31または 32で 表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA に部位特異的変異を導入 することにより取得することができる蛋白質などがあげられる。 欠失、 置換、 揷 入および/または付カ卩されるアミノ酸の数は 1 個以上でありその数は特に限定さ れないが、 上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、 欠失、 置換もし くは付加できる程度の数であり、 例えば、 1〜数十個、 好ましくは 1〜20個、 より 好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜5個である。
また、 本発明において、 配列番号 2、 4、 31または 32で表されるアミノ酸配列 と 80%以上の相同性を有し、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋 白質してとは、 BLAST [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)〕 や FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕 等の解析ソフトを用いて計算したときに、 配列番 号 2、 4、 31または 32に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも 80%以 上、 好ましくは 85%以上、 より好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以 上、 特に好ましくは 97%以上、 最も好ましくは 99%以上の相同性を有し、 かつ GDP -フコーストランスポータ一活性を有する蛋白質などがあげられる。
本発明の宿主細胞としては、 抗体分子を発現できる細胞であればいかなる細胞 でもよいが、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞などがあげられ、 好ましくは、 動物細胞があげられる。 動物細胞の好ましい具体例としては、 チャイニーズハム ス タ ー卵巣組織由 来の CH0 細胞、 ラ ッ ト ミ エ ロ ーマ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞、 マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞、 マウスミエ口 一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞、 シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞、 抗体を 産生するハイプリ ドーマ細胞、 ヒト白血病細胞株ナマルパ細胞、 胚性幹細胞、 受 精卵細胞などがあげられる。 本発明の宿主細胞に抗体分子をコードする遺伝子を導入することにより、 ある いは、 宿主細胞が抗体分子を生産する能力を有する場合は、 そのまま当該宿主細 胞を用いることにより抗体組成物を製造することができる。
本発明は、 また、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下するようにゲノムが改 変された、 トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫を用い ることを特徴とする抗体組成物を製造する方法に関する。
本発明において、 抗体組成物とは、 N -グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有 する抗体分子を含有する組成物をいう。
抗体は、 重鎖および軽鎖 （以下、 それぞれ 「H鎖」 および 「L鎖」 と表記する） の 2種類のポリぺプチド鎖がそれぞれ 2分子ずつ会合した 4量体である。 H鎖の N 末端側の約 4分の 1 と L鎖の N末端側の約 2分の 1 (それぞれ 100余アミノ酸） は可変領域 （以下、 「V領域」 と表記する） と呼ばれ、 多様性に富み、 抗原との 結合に直接関与する。 V領域以外の部分の大半は定常領域 （以下、 「C領域」 と表 記する） と呼ばれる。 抗体分子は C領域の相同性により IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgEの各クラスに分類される。
また IgGクラスは C領域の相同性により、 さらに IgGl〜IgG4のサブクラスに分 類される。
H鎖は N末端側より VH、 CH1、 CH2、 CH3の 4つのィムノグロブリンドメインに 分かれ、 CH1 と CH2 の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域が あり、 CH1 と CH2とが区切られる。 ヒンジ領域以降の CH2 と CH3からなる構造単 位は Fc領域と呼ばれ、 N -グリコシド結合型糖鎖が結合している。 また、 この領域 は、 Fc レセプター、 補体などが結合する領域である （免疫学イラストレイテッド 原書第 5版、 2000年 2月 10日発行、 南江堂版、 抗体工学入門、 1994年 1月 25日 初版、 地人書館)。
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、 蛋白質部分との結合様式により、 ァスパラギン と結合する糖鎖 （N -グリコシド結合糖鎖） とセリン、 スレオニンなどと結合する 糖鎖 （0 -グリコシル結合糖鎖） の 2種類に大別される。 N -グリコシド結合糖鎖は、 以下の構造式 （I) に示す基本となる共通のコア構造を有する [生物化学実験法 23 -糖蛋白質糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989年) ]。 3 Man j8 1 »-4GlcNAc β 1 »-4GlcNAc
Figure imgf000023_0001
構造式 （I )
上記構造式 ( I ) において、 ァスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、 反対側を非還元末端という。
N -グリコシド結合糖鎖としては、 上記構造式 （ I ) のコァ構造を有するもので あればいかなるものでもよいが、 コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合 するハイマンノース型、 コア構造の非還元末端側にガラクトース- N-ァセチルダル コサミン （以下、 Gal-GlcNAc と表記する） の枝を並行して 1ないしは複数本有し、 更に Gal-GlcNAc の非還元末端側にシアル酸、 パイセクティングの N-ァセチルダ ルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型 （複合型)、 コア構造の非還元末 端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型な どがあげられる。
抗体分子の Fc領域には、 N-グリコシド結合糠鎖が 1力所ずつ結合する領域を有 しているので、 抗体 1分子あたり 2本の糖鎖が結合している。 抗体分子に結合す る N -ダルコシド結合糖鎖としては、 前記構造式 （I) で示されるコア構造を含む いかなる糖鎖も包含されるので、 抗体に結合する 2本の N-ダルコシド結合糖鎖に は多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、 本発明において、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が欠失または低 下した細胞を用いて製造した本発明の抗体組成物は、 本発明の効果が得られる範 囲であれば、 単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、 複 数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。 そのような本 発明の抗体組成物として、 好ましくは、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合す る全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミ ンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性を 欠失または低下させるような処置が施されていない親株細胞が生産する抗体組成 物よりも高い抗体組成物があげられる。 また、 本発明において、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下するようにゲノ ムが改変された、 トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫 を用いて製造した本発明の抗体組成物も、 本発明の効果が得られる範囲であれば、 単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、 複数の異なる糖 鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。 そのような本発明の抗体組 成物として、 好ましくは、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリ コシド結合複合型糠鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンにフコー スが結合していない糖鎖の割合が、 ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるい は植物、 またはその子孫 （以下、 親個体と称す） が生産する抗体組成物よりも高 V、抗体組成物があげられる。
抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖の うち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 の割合とは、 該組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ての N-グリコシド結合 複合型糖鎖の合計数に対して、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコー スが結合していなレヽ糖鎖の数が占める割合をいう。
N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが 結合していない糖鎖とは、 フコースが、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンに α結合していない糖鎖をいう。 具体的には、 フコース の 1位が Ν-グリコシド結合複合型糖鎖の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合 していない糖鎖があげられる。
ADCC活性が高い抗体組成物としては、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合 する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサ ミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞または親個体が生産す る抗体組成物の該割合よりも高いものがあげられる。 具体的には、 該割合が親株 細胞または親個体よりも 2倍以上、 好ましくは 3倍以上、 より好ましくは 5倍以 上、 特に好ましくは 10倍以上高い抗体組成物があげられ、 抗体組成物中に含まれ る Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖の全てが糖鎖還元末端の N- ァセチルダルコサミンにフコースが結合していなレ、糖鎖である抗体組成物が最も 好ましい。
本発明の抗体組成物において、 Fc領域に結合する全 N -グリコシド結合複合型糖 鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない 糖鎖の割合が、 親株細胞または親個体が生産する抗体組成物よりも高い場合、 本 発明の抗体組成物は、 親株または親個体が生産する抗体分子からなる抗体組成物 より高い ADCC活性を有する。
ADCC活性とは、 生体内で、 腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、 抗体 Fc領域とエフヱクタ一細胞表面上に存在する Fc レセプターとの結合を介し てエフェクター細胞を活性化し、 腫瘍細胞等を障害する活性をいう [モノクロ一 ナル · アンティボディズ： プリンシプルズ ' アンド ' アプリケーションズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wiley-Liss, ェ nc.， Capter 2. 1 (1995) ]。 エフェクター細胞としては、 キラー細胞、 ナチュラルキラ 一細胞、 活性化されたマクロファージ等があげられる。
N -ダリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる組成物中に含 まれる、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合は、 抗体分子からヒ ドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [生物化 学実験法 23—糖タンパク質糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989) ] を用い、 糖鎖を遊離させ、 遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、 標 識した糖鎖をクロマトグラフィ一法にて分離することによつて決定することがで きる。 また、 遊離させた糖鎖を HPAED - PAD法 [ジャーナル'ォブ'リキッド 'クロマ トグラフィー （J. Liq. Chromatogr. ) , 6, 1577 (1983) ] によって分析すること によつても決定することができる。
抗体分子とは、 抗体の Fc領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。 具体的には、 抗体、 抗体の断片、 Fc領域を含む融合蛋白質などがあげられる。 抗体としてはハイブリ ドーマ細胞が分泌するモノクローナル抗体、 遺伝子糸且換 え技術により作製された抗体、 すなわち、 抗体遺伝子を挿入した抗体発現べクタ 一を、 宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。 具体的 には、 ハイプリ ドーマが生産する抗体、 ヒト化抗体、 ヒト抗体などをあげること ができる。
ハイプリ ドーマとは、 ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞 と、 マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、 所望の抗 原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられ る。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体 H鎖 V領域 （以下、 HVまたは VH とも称す） および抗体 L鎖 V領域 （以下、 LVまたは VLとも称す） とヒト抗体の H 鎖 C領域 （以下、 CH とも称す） およびヒ ト抗体の L鎖 C領域 （以下、 CL とも称 す） とからなる抗体をいう。 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムス ター、 ラビット等、 ハイプリ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなるも のも用いることができる。
ヒ ト型キメラ抗体は、 モノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマより、 VH および VLをコードする cDNAを取得し、 ヒ ト抗体 CHおよぴヒ ト抗体 CLをコード する遺伝子を有する宿主細胞用発現べクタ一にそれぞれ挿入してヒ ト型キメラ抗 体発現ベクターを構築し、 宿主細胞へ導入することにより発現させ、 製造するこ とができる。
ヒ ト型キメラ抗体の CH としては、 ヒトイムノグロブリン （以下、 hlg と表記す る） に属すればいかなるものでもよいが、 hlgG クラスのものが好適であり、 更に hlgG クラスに属する hIgGl、 hIgG2、 MgG3、 hIgG4 といったサブクラスのいずれ も用いることができる。 また、 ヒ ト型キメラ抗体の CL としては、 hlgに属すれば いかなるものでもよく、 κクラスあるレ、は; Lクラスのものを用いることができる。 ヒ ト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ 酸配列をヒ ト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒ ト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列を任 意のヒ ト抗体の VHおよび VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構 築し、 ヒト抗体の CHおよぴヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞 用発現ベクターにそれぞれ揷入してヒ ト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒ ト型 CDR移植抗体を発現させ、 製造することができる。
ヒ ト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、 更に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移 植抗体の CL としては、 hlgに属すればいかなるものでもよく、 κクラスあるいは えクラスのものを用いることができる。
ヒ ト抗体は、 元来、 ヒ ト体内に天然に存在する抗体を意味するが、 最近の遺伝 子工学的、 細胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒ ト抗体ファ ージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジエニック非ヒ ト動物あるいは ヒ ト抗体産生トランスジヱニック植物から得られる抗体等も含まれる。 ヒ ト体内に存在する抗体は、 例えば、 ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EB ウィル ス等を感染させ不死化、 クローユングすることにより、 該抗体を産生するリンパ 球を培養でき、 培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリ一は、 ヒ ト B 細胞から調製した抗体遺伝子をファ ージ遺伝子に挿入することにより Fab、 一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面 に発現させたライブラリーである。 該ライブラリーより、 抗原を固定化した基質 に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現して いるファージを回収することができる。 該抗体断片は、 更に遺伝子工学的手法に より、 2本の完全な H鎖おょぴ 2本の完全な L鎖からなるヒ ト抗体分子へも変換 することができる。
ヒト抗体産生トランスジ ニック非ヒ ト動物は、 ヒ ト抗体遺伝子が細胞内に組 込まれた動物を意味する。 具体的には、 マウス ES細胞ヘヒ ト抗体遺伝子を導入し、 該 ES細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、 発生させることによりヒト抗体産生ト ランスジエニック非ヒ ト動物を作製することができる。 また、 動物の受精卵にヒ ト抗体遺伝子を導入し、 該受精卵を発生させることにヒ ト抗体酸産生トランスジ エニック非ヒ ト動物を作製することもできる。 ヒ ト抗体産生トランスジヱニック 非ヒ ト動物からのヒ ト抗体の作製方法は、 通常のヒ ト以外の哺乳動物で行われて いるハイプリ ドーマ作製方法によりヒ ト抗体産生ハイプリ ドーマを得、 培養する ことで培養物中にヒ ト抗体を産生蓄積させることができる。
トランスジエニック非ヒ ト動物は、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 -ヮトリ、 サルまたはゥサギ等があげられる。
本発明の宿主細胞は、 親株細胞が生産する抗体組成物より、 ADCC活性が高い抗 体組成物を生産することができる。
また、 本発明において、 抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーある いは炎症に関連する抗原を認識する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する 抗体、 自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、 またはウイノレスあるいは細 菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、 抗体のクラスは
IgGが好ましい。
抗体の断片は、 上記抗体の少なくとも Fc 領域の一部を含んだ断片をいう。 Fc 領域とは、 抗体の H鎖の C末端側の領域、 CH2領域および CH3領域を意味し、 天 然型およびその変異型を包含する。 少なくとも Fc 領域の一部とは、 好ましくは CH2領域を含む断片、 より好ましくは CH2領域内に存在する 1番目のァスパラギ PC漏細 06 ン酸を含む領域をいう。 IgG クラスの Fc 領域は、 力バット （Kabat) らの EU Index [シーケンシズ ·ォプ ·プロティンズ ·ォブ 'ィムノロジカル ·インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ] のナ ンパリングで 226番目の Cysから C末端、 あるいは 230番目の Proから C末端ま でを意味する。 抗体の断片としては、 H鎖の単量体、 H鎖の 2量体などがあげられ る。
Fc領域の一部を有する融合蛋白質とは、 抗体の Fc領域の一部を含んだ抗体あ るいは抗体の断片と、 酵素、 サイト力インなどの蛋白質とを融合させた物質 （以 下、 Fc融合蛋白質と称す） を意味する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1. 本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、 以下に述べる手法により作製することができる。
(1) GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本宪明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 遺伝子破 壊の方法を用いることにより作製することができる。 GDP-フコース輸送蛋白質と しては、 具体的には、 GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、 DNAまたは RNAを含む。
遺伝子破壌の方法としては、 標的とする蛋白質の遺伝子を破壊することができ る方法であればいかなる方法も包含される。 その例としては、 アンチセンス法、 リボザィム法、 相同組換え法、 RNA- DNA oligonucleotide (RD0) 法、 RNA interference (RNAi) 法、 レトロウイルスを用いた方法、 トランスポゾンを用い た方法等があげられる。 以下これらを具体的に説明する。
(a) アンチセンス法またはリボザィム法による本発明の細胞の作製
本発明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 細胞工学， 12, 239 (1993)、 バイオ Zテクノロジー （BI0/TECHN0L0GY) , 17, 1097 (1999)、 ヒューマン 'モレキュラー ' ジエネテイクス （Hum. Mol. Genet. ) , 5, 1083 (1995)、 細胞工学， i¾ 255 (1994)、 プロシーディンダス'ォプ'ザ'ナショナル' アカデミー'ォブ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 96, 1886 画襲 06
(1999) 等に記載されたアンチセンス法またはリボザィム法を用いて、 例えば、 以 下のように作製することができる。
GDP-フコース輸送蛋白質をコードする c DNAあるいはゲノム DNAを調製する。 調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
GDP-フコース輸送蛋白質をコードするゲノム DNAの例としては、 配列番号 34ま たは 35 で表される塩基配列からなる GDP-フコース トランスポーターをコードす るゲノム DNAがあげられる。
決定した DNAの配列に基づき、 GDP-フコース輸送蛋白質をコードする DNA部分、 非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝 子またはリボザィムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、 またはリポザィムを細胞内で発現させるために、 調製 した DNA の断片、 または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入 することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。
GDP -フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、 本発明の宿主細胞を得ることができる。 また、 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造ま たは産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、 本 発明の宿主細胞を得ることもできる。
本発明の宿主細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、 酵母、 動物 細胞、 昆虫細胞、 植物細胞など、 標的とする GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を 有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計したアンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを転写 できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述 の 3. に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、 後述の 3. に記載の各種宿主細 胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP -フコース輸送蛋白質の cDNAおよびゲノム DNAを取得する方法としては、 例 えば、 以下に記載の方法があげられる。 cDNAの調製方法
各種宿主細胞から全 RNAまたは mRNAを調製する。
調製した全 RNAまたは mRNAから cDNAライプラリ一を作製する。
GDP -フコース輸送蛋白質の既知アミノ酸配列、 例えばヒ トのアミノ酸配列に基 づいて、 デジエネレイティブプライマーを作製し、 作製した cDNAライブラリーを 铸型として PCR法にて、 GDP -フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得 する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 cDNA ライブラリーをスクリーニン グし、 GDP -フコース輸送蛋白質をコードする cDNAを取得することができる。
各種宿主細胞の mRNAは、 市販のもの（例えば Clontech社製）を用いてもよいし、 以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。 各種宿主細胞から全 RNA を調製 する方法としては、 チォシアン酸グァ-ジン-トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソ ッズ 'イン ·ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology) , 154. 3 (1987) ]、 酸 性チオシアン酸グァニジン ·フエノール ·クロロホルム (AGPC) 法 [アナリティ カル .バイオケミストリー （Analytical Biochemistry) , 162, 156 (1987) ; 実験 医学、 £， 1937 (1991) ] などがあげられる。
また、 全 RNAから poly (A)+ RNA として mRNAを調製する方法としては、 オリゴ (dT) 固定化セルロースカラム法 （モレキュラー 'クロー-ング第 2版） 等があげ られる。
さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製）、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） などのキットを用いることにより mRNA を調製することができる。
調製した各種宿主細胞 mRNAから cDNAライブラリ一を作製する。 cDNAライブラ リー作製法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント ·プロトコ ールズ 'イン .モレキュラー 'バイオロジー等に記載された方法、 あるいは巿販 のキッ 卜 、 例兄ば Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies 社製） 、 ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE社製） を用いる方法などがあげられる。
cDNA ライプラリーを作製するためのクローユングベクターとしては、 大腸菌 K12株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミ ドベクタ 一等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社、 ストラ テジーズ （Strategies) , 5， 58 (1992) ]、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイツ ク 'アシッド ' リサーチ （Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989)]、 Lambda ZAP II (STRATAGENE社製）、 gtlO、 Lgtll [ディーェヌエー ' クロー-ング ' ァ ·プラクティカル ·アプローチ （DNA cloning, A Practical Approach) , 1, 49 (1985)]、 λ TriplEx (Clontech 社製）、 ExCell (Pharmacia 社製）、 pT7T318U (Pharmacia社製）、 pcD2 [モレキュラー 'セルラー 'バイオロジー（Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] および pUC18 [ジーン（Gene), 33. 103 (1985)] 等をあ げることができる。
cDNA ライプラリーを作製するための宿主微生物としては、 微生物であればいず れでも用いることができるが、 好ましくは大腸菌が用いられる。 具体的には、 Escherichia coli XL1- Blue MRF' [STRATAGENE 社、 ス ト ラ テ ジー ズ (Strategies), 5, 81 (1992)]、 Escherichia coli C600 [ジエネテイ クス (Genetics), 39, 440 (1954)]、 Escherichia coli Y1088 [サイ エ ンス (Science), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coli Y1090 [サイエンス （Science), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coli NM522 [ジャーナル ·ォブ ·モレキユラ 一 ·バイオロジー (J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)]、 Escherichia coli K802 [ジャーナノレ 'ォプ 'モレキュラー ·バイオロジー （J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] および Escherichia coli JM105 [ジーン （Gene), 38, 275 (1985)] 等 が用いられる。
この cDNA ライプラリーを、 そのまま以降の解析に用いてもよいが、 不完全長 cDNA の割合を下げ、 なるべく完全長 cDNA を効率よく取得するために、 菅野らが 開発したオリゴキャップ法 [ジーン （Gene), 138, 171 (1994)； ジーン （Gene), 200, 149 (1997)； 蛋白質核酸酵素， ϋ， 603 (1996); 実験医学， U, 2491 (1993)； cDNA クローユング （羊土社） (1996)； 遺伝子ライブラリーの作製法 （羊 土社） （1994)] を用いて調製した cDNAライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
GDP -フコース輸送蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、 該アミノ酸配列をコード することが予測される塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に特異的なデジエネ レイティブプライマーを作製し、 作製した cDNAライブラリーを铸型として PCR法 [ピーシーア一ル 'プロトコールズ (PCR Protocols), Academic Press (1990)] を用いて DNA の増幅を行うことにより、 GDP-フコース輸送蛋白質をコードする遺 伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が GDP-フコース輸送蛋白質をコードする DNAであることは、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイングス'ォブ ·ザ ·ナショナル 'ァカデミ一 ·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] あるいは ABIPRISM377DNA シーク ェンサ一 （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することに より、 確認することができる。
該遺伝子断片を DNAプローブとして、 各種宿主細胞に含まれる mRNAから合成し た cDNAあるいは cDNAライブラリ一対してコロニーハイプリダイゼ^"ションゃプ ラークハイブリダィゼーシヨン （モレキュラー .クローユング第 2版） を行うこ とにより、 GDP-フコース輸送蛋白質の DNAを取得することができる。
また、 GDP -フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得するために用い たプライマーを用い、 各種宿主細胞に含まれる mRNAから合成した cDNAあるいは cDNA ライプラリーを錡型として、 PCR法を用いてスクリーニングを行うことによ り、 GDP -フコース輸送蛋白質をコードする DNAを取得することもできる。
取得した GDP -フコース輸送蛋白質をコードする DNAの塩基配列を末端から、 通 常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイングス'ォブ 'ザ'ナショナル 'ァカデミ一'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] あるいは ABIPRISM377DNA シーク ェンサ一 （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することに より、 該 DNAの塩基配列を決定する。
決定した cDNAの塩基配列をもとに、 BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、 GenBank、EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、 データベース中の遺伝子の中で GDP-フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子 を決定することもできる。
上記の方法で得られる GDP-フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子の塩基 配列としては、 例えば、 配列番号 1、 3、 29または 30に記載の塩基配列があげら れる。
決定された DNA の塩基配列に基づいて、 フォスフォアミダイト法を利用したパ —キン ·エルマ一社の DNA合成機 model 392等の DNA合成機で化学合成すること により、 GDP-フコース輸送蛋白質の cDNAを取得することもできる。
GDP -フコース輸送蛋白質のゲノム DNA を調製する方法としては、 例えば、 以下 に記載の方法があげられる。 ゲノム DNAの調製方法
ゲノム DNAを調製する方法としては、 モレキュラー ·クローニング第 2版や力 レント .プロトコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された公 知の方法があげられる。 また、 ゲノム DNA ライプラリースクリーニングシステム (Genome Systems社製） や Universal GenomeWalker™ Kits (CL0NTECH社製） など を用いることにより、 GDP -フコース輸送蛋白質のゲノム DNA を単離することもで さる。
GDP-フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法として は、 例えば、 以下の方法があげられる。 形質転換体を選択する方法
GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した細胞を選択する方法とし ては、 文献 ほ生化学実験講座 3—糖質 I，糖タンパク質 (東京化学同人）日本生ィ匕 学会編 （1988) ]、 文献 [細胞工学， 別冊， 実験プロトコールシリーズ，グライコバ ィォロジ一実験プロトコール， 糖タンパク質 '糖脂質'プロテオダリカン （秀潤社 製)， 谷口直之 '鈴木明美 '古川清♦菅原一幸監修 （1996) ]、 モレキュラー 'クロ 一ユング第 2版、 カレント 'プロトコールズ 'イン'モレキユラ■ ~·バイオロジー等 に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。 生 化学的な方法としては、 例えば、 GDP -フコースを基質として用いゴルジ体への輸 送活性を評価する方法があげられる。 遺伝子工学的な方法としては、 例えば、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子の mRNA量を測定するノーザン解析や R T- PCR 法等があげられる。
また、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した結果生じる形質の 変化を指標に細胞を選択する方法としては、 例えば、 産生抗体分子の糖鎖構造を 指標として形質転換体を選択する方法や、 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指 標として形質転換体を選択する方法などがあげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造 を指標として形質転換体を選択する方法としては、 後述の 5. に記載の方法があ げられる。 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する 方法としては、 N -ダリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選 択する手法を挙げることができる。 その具体的な例としては、 ソマテイク 'セル' PC漏雇 506 アンド'モレキュラー'ジエネテイクス （Somatic Cell Mol. Genet. ) , 12, 51 (1986) 等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、 Ν -ダリコシド結合糖鎖還元末端の Ν -ァセチルダルコサミン の 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいず れのレクチンでも用いることができるが、 好ましくはレンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin) , エンドゥマメレクチン PSA (Pi sum sativum 由来の Pea Lectin)、 ソラマメ レクチン VFA (Vicia faba 由来の Agglutinin)、 ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleuria aurantia 由来の Lectin) 等があげられる。
具体的には、 10 I g/ml〜： 10mg/ml、 好ましくは 0. 5〜2. Omg/mlの濃度の上述のレ クチンを含む培地に 1 日〜 2週間、 好ましくは 3日〜 1週間培養し、 生存している 細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、 別の培養器に移し、 さらに引き続き レクチンを含む培地で培養を続けることで、 本発明の宿主細胞を選択することが できる。
また、 発現ベクターを用いず、 GDP-フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて 設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムを、 直接宿主細胞に 導入することで、 本発明の宿主細胞を得ることもできる。
ァンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムは、 常法または DNA合成機 を用いることにより調製することができる。 具体的には、 GDP -フコース輸送蛋白 質の cDNAおよぴゲノム DNAの塩基配列のうち、 連続した 5〜150塩基、 好ましく は 5〜60塩基、 より好ましくは 10〜40塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレ ォチドの配列情報に基づき、 該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するォ リゴヌクレオチド (アンチセンスオリゴヌクレオチド) または該オリゴヌクレオ チドの配列を含むリポザィムを合成することで調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、 オリゴ RNAおよぴ該ォリゴヌクレオチドの誘導 体 （以下、 オリゴヌクレオチド誘導体という） 等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステ ル結合がホスフォロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ォ リゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3' - P 5'ホスフォアミデート結合 に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリボースとリ ン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C-5 プロピ -ルゥラシルで置換されたオリゴ ヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C-5 チアゾールゥラシ ルで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C - 5 プロピ -ルシトシンで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌタレ ォチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン （phenoxazine- modified cytosine) で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリ ボースが 2，-0 -プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ある いはオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，-メ トキシエトキシリボースで置換さ れたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる [細胞工学， 1463 (1997) ]。
(b) 相同組換え法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 染色体上 の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。 染色体上の標的遺伝子の改変は、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (以下、 「マニピュレイティング'ザ'マウス'ェンプリオ 'ァ'ラボラトリー' マニュアル」と略す)、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッ ティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 （1995) (以下、 「E S細胞 を用いた変異マウスの作製」と略す） 等に記載の方法を用い、 例えば以下のように 行うことができる。
GDP-フコース輸送蛋白質のゲノム DNAを調製する。
該ゲノム DNA の塩基配列にも基づき、 改変する標的遺伝子 （例えば、 GDP-フコ ース輸送蛋白質の構造遺伝子、 あるいはプロモーター遺伝子） を相同組換えする ためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、 標的遺伝子とターゲットべ クタ一の間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、 本発明の細胞を 作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることがで きる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
GDP -フコース輸送蛋白質のゲノム DNAを調製する方法としては、 上記 1の （1) の （a) に記載の「ゲノム DNAの調製方法」などがあげられる。 標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ノヽ 才マ ニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッティング， E S細胞を用いた変異マウスの作 製 （羊土社） （1995) 等に記載の方法にしたがって作製することができる。 ターグ ットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型いずれでも用いること ができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、 後述の 3. に記載の各種宿 主細胞に適した糸且換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A
Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ノ ォマ -ュアルシリーズ 8 ジーンターゲッティング， E S細胞を用いた変異マウスの作 製 （羊土社） (1995) 等に記載のポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガティブ 選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 選別した細胞株の中から目 的とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNA に対するサザンハイ ブリダィゼーシヨン法 （モレキュラー ·クローニング第 2版） や PCR法 [ピーシ 一アール .プロトコールズ （PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] 等があげ られる。
(c) RD0方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 RDO (RNA- DNA oligonucleotide) 法を用い、 例えば、 以下のように作製することができる。
GDP-フコース輸送蛋白質の cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した DNA の配列に基づき、 GDP -フコース輸送蛋白質をコードする部分、 非 翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さの RD0 のコンストラク トを設計し合成する。
合成した RD0を宿主細胞に導入し、 標的とした蛋白質、 すなわち GDP-フコース 輸送蛋白質に変異が生じた形質転換体を選択することにより、 本発明の宿主細胞 を作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることがで きる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。 PC漏聽 06 各種宿主細胞への RD0 の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適した 組み換えべクターの導入方法を用いることができる。
GDP-フコース輸送蛋白質の cDNA を調製する方法としては、 例えば、 上記 1 の (1) の （a) に記載の 「cDNAの調製方法」 などがあげられる。
GDP -フコース輸送蛋白質のゲノム DNA を調製する方法としては、 例えば、 上記 1の （1) の （a) に記載の 「ゲノム DNAの調製方法」 などがあげられる。
DNA の塩基配列は、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-） (Stratagene社製） 等のプラスミドにクローニングし、 通常用いられる塩基配列 解析方法、 例えば、 サンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイング ス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.， U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] 等の反応を行い、 塩基配列自動分析装置、 例 えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 （Pharmacia社製） 等を用いて解析すること で該 DNAの塩基配列を決定することができる。
RD0は、 常法または DNA合成機を用いることにより調製することができる。
RD0 を宿主細胞に導入し、 標的とした蛋白質、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝 子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2 版、 カレント 'プロトコールズ'イン'モレキュラー 'バイオロジー等に記載された 染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、 前記 1 の （1) の （a) に記載の、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性を指標 として形質転換体を選択する方法、 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として 形質転換体を選択する方法、 あるいは、 後述の 5. に記載の産生抗体分子の糖鎖 構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
RD0 のコンストラクトは、 サイエンス （Science) , 273, 1386 (1996)； ネイチ ヤー · メデイ シン （Nature Medicine) , 4, 285 (1998)； へパ ト ロジー (Hepatology) , 25, 1462 (1997) ; ジーン 'セラピー （Gene Therapy) , 5, 1960 (1999)； ジーン 'セラピー（Gene Therapy) , 5, 1960 (1999) ; ジャーナル 'ォ ブ.モレキュラー 'メディシン （J. Mol. Med. ) , 75, 829 (1997)； プロシーディ ングス 'ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォプ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 8774 (1999)； プロシーディンダス 'ォプ 'ザ'ナショナル'ァカデ ミー'ォブ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 8768 (1999) ; ヌク レイツク 'アシッド ' リサーチ （Nuc. Acids. Res. ) , 27, 1323 (1999) ; インべ スティゲーション ·ォプ · ダーマト口ジー （Invest. Deraatol. ) , 111, 1172 (1998)；ネイチヤー ·バイオテクノロジー （Nature Biotech. )， 16, 1343 (1998) ; ネイチヤー .バイオテクノロジー （Nature Biotech. ) , 18, 43， （2000) ; ネイチ ヤー 'バイオテクノロジー （Nature Biotech. )， 18, 555， (2000) 等の記載に従 つて設計することができる。
(d) RNAi方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 RNAi (RNA interference) 法を用い、 例えば、 以下のように作製することができる。
GDP -フコース輸送蛋白質の cDNAを調製する。
調製した cDNAの塩基配列を決定する。
決定した DNA の配列に基づき、 GDP-フコース輸送蛋白質をコードする部分ある いは非翻訳領域の部分を含む適当な長さの RNAi遺伝子のコンストラクトを設計す る。
該 RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、 調製した DNAの断片、 または全長 を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷入することにより、 組換えべク ターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。
GDP-フコース輸送蛋白質の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖 蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 本発明の宿主細胞を得 ることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP - フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることがで きる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計した RNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを 含有しているものが用いられる。 具体的には、 ポリメラーゼ III により転写が行 われるタイプの発現ベクター、 後述の 3. に記載の発現ベクターがあげられる。 各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3· に記載の各種宿主細胞に適し た組換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP -フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、 ある いは、 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法と PC漏細 06 しては、 例えば、 前記 1 の （1) の （a) に記載の方法があげられる。 また、 産生 抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5. に記載の方法があげられる。
GDP-フコース輸送蛋白質の cDNA を調製する方法としては、 例えば、 前記 1 の (1) の （a) に記載された 「cDNAの調製方法」 などがあげられる。
また、 発現ベクターを用いず、 GDP-フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて 設計した RNAi遺伝子を、 直接宿主細胞に導入することで、 本発明の宿主細胞を得 ることもできる。
RNAi遺伝子は、 常法または DNA合成機を用いることにより調製することができ る。
RNAi 遺伝子のコンストラクトは、 [ネイチヤー （Nature) , 391, 806 (1998)； プ口シーデイングス'ォブ 'ザ.ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 95, 15502 (1998) ; ネイチヤー （Nature) , 395, 854 (1998)； プ口シーデイングス'オフ、、 ·ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 5049 (1999) ; セル （Cell) , 95, 1017 (1998)； プ口シーデイングス'ォブ 'ザ'ナショナル 'ァカデミ一'ォプ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 1451 (1999)； プロシーディングス 'ォブ- ザ ·ナショナル'ァカデミ · ~·ォプ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 95, 13959 (1998)； ネイチヤー 'セノレ 'パイォォロジー (Nature Cell Biol. ) , 2, 70, (2000) ] 等の記載に従って設計することができる。
本発明の RNAi法に用いられる RNAとしては、 GDP -フコース輸送蛋白質などをコ 一ドする DNAに対応する RNAがあげられる。 好ましくは GDP -フコース輸送蛋白質 が、 上記記載の GDP -フコーストランスポーターである DNAに対応する RNAがあげ られる。
本発明の RNAi法で使用される RNAとしては、 RNAおよびその相補 RNAで構成さ れ、 かつ GDP-フコーストランスポーター等の GDP-フコース輸送蛋白質の mRNA量 を減少させることが可能な 2本鎖 R Aであればいかなるものでもよいが、 RNAの 長さとしては、 好ましくは 1〜30、 より好ましくは 5〜29、 さらに好ましくは 10 〜29、 最も好ましくは 15〜29の連続した RNAがあげられる。 具体的には、
(a) 配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表される塩 基配列からなる DNAに対応する RNA； (b) 配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表される塩 基配列からなる DNAに対応する RNA；
(c) 配列番号 29で表される塩基配列中連続した 10〜30 の塩基配列で表される 塩基配列からなる DNAに対応する RNA；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表される 塩基配列からなる DNAに対応する RNA、
さらに好ましくは、
(a) 配列番号 33で表される塩基配列からなる RNA；
(b) 配列番号 33で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失また は付加された塩基配列からなり、 GDP -フコース輸送蛋白質に対して配列番号 33と 実質的に同一の RNAi活性を有する RNA
があげられる。
上述の 「配列番号 33 と実質的に同一の RNAi活性を有する RNAJ としては、 配 列番号 33で表される RNAと、 GDP-フコース輸送蛋白質に対する同様の RNAi活性 を有するものであればいかなるものでもよく、 RNA の長さなどの量的要素は異な つていてもよい。
1または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列とは、 配列番号 33の両端 の塩基が 1 または数個欠失および/または付加された塩基配列をいう。 塩基配列 としては、 好ましくは 1〜30塩基、 より好ましくは 5〜29塩基、 さらに好ましく は 10〜29塩基、 最も好ましくは 15〜29塩基の連続した RNAがあげられる。
また、 これら RNAに対応する DNAおよびその相補 DNAも本発明に包含され、 RNA に対応する DNAとして、 具体的には配列番号 16で表される塩基配列からなる DNA があげられる。 さらに、 該 DNAおよびその相捕 DNA をベクターに含む組換え体 DNAおよび該組換え体 DNA を細胞に導入して得られる形質転換体も、 本発明に包 含され、 該 2本鎖 RNAを発現させるために用いることができる。
(e) トランスポゾンを用いた方法による、 本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、 ネイチヤー 'ジヱネテイク （Nature Genet. ) , 25, 35, (2000) 等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、 GDP-フコース輸送蛋白質の 活性、 あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然 変異体を選択することで、 本発明の宿主細胞を作製することができる。 PC漏聽 06 トランスポゾンのシステムとは、 外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させ ることで突然変異を誘発させるシステムであり、 通常、 トランスポゾンに挿まれ た外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、 この遺伝子を染色体 上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞 の中に導入する。
トランスポゼースは、 用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいか なるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、 宿主細胞の DNA に変異を誘起するものであればいかなる 遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることがで きる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。 各種宿主細胞へ の遺伝子の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適した組み換えべクタ 一の導入方法を用いることができる。
GDP-フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、 ある いは、 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法と しては、 例えば、 前記 1 の （1) の （a) に記載の方法があげられる。 また、 産生 抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5. に記載の方法があげられる。
(2) GDP-フコース輸送蛋白質のドミナントネガティプ体を導入する手法
本発明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質を標的とし、 該蛋白質のドミナ ントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。 GDP-フコース輸送蛋白質としては、 具体的には、 GDP-フコーストランスポーター などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターは、 小胞体おょぴゴルジ体の膜上に おいてダイマーを形成して機能していることが知られている [ジャーナル ·ォ プ.バイオロジカル.ケミストリー （J. Biol. Chem. ) , 275, 17718 (2000) ]0 ま た、 細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を細胞内で強制発現させ ることにより、 野生型トランスポーターとヘテロダイマーを形成し、 形成したへ テロダイマーは野生型ホモダイマーに対して阻害活性を示すことが報告されてい る [ジャーナル .ォブ ·バイオ口ジカル 'ケミストリー （J. Biol. Chem. )， 275, 17718 (2000) ]。 従って、 細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を作 製し細胞内に導入することで、 ドミナントネガティブ体として機能させることが 可能である。 このような変異体の作製は、 モレキュラー ' クローユング第 2版、 カレント .プロトコールズ ·ィン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された 部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
上記方法で得られる、 GDP -フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体とし ては、 細胞内糠ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質 の N末端欠失体、 好ましくは、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体へ の輸送に関与する蛋白質の N末端 30アミノ酸が欠失した N末端欠失体があげられ る。 具体的には、 実施例 1に記載の GDP -フコース トランスポーターの N末端欠失 体があげられる。
本発明の宿主細胞は、 上述のように作製した標的蛋白質のドミナントネガティ プ体遺伝子を用い、 モレキユラ一 ·クローニング第 2版、 カレント 'プロトコール ズ 'イン'モレキュラ^ バイオロジー、 マニピュレーティング ·マウス ·ェンプリ ォ第 2版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、 例えば、 以下のように作製 することができる。
GDP-フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長 DNA をもとにして、 必要に応じ て、 該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片、 または全長 DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えべクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り、 形質転換体を得る。
GDP-フコース輸送蛋白質の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋 白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 本発明の宿主細胞を作製 することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることがで きる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 目的とするドミナントネガティブ体をコードする DNA を 転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述の 3. に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適し た組み換えべクターの導入方法を用いることができる。
GDP-フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、 ある いは、 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法と しては、 例えば、 前記 1 の （1) の （a) に記載の方法があげられる。 また、 産生 抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5. に記載の方法があげられる。
(3) GDP-フコース輸送蛋白質についての突然変異を導入する手法
本発明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子について突然変異を導 入し、 該蛋白質に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることに より作製できる。
GDP一フコース輸送蛋白質の遺伝子としては、 GDP-フコーストランスポーターな どがあげられる。
具体的には、 1) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発 生的に生じた突然変異体から、 GDP -フコース輸送蛋白質の活性を指標として所望 の細胞株を選択する方法、 2) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体ある いは自然発生的に生じた突然変異体から、 生産抗体分子の糖鎖構造を指標として 所望の細胞株を選択する方法、 3) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体 あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖 鎮構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、 親株の細胞の DNA に点突然変異、 欠失あるいはフ レームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができ る。 具体的には、 ェチルニトロソゥレア、 ニトロソグァ二ジン、 ベンゾピレン、 アタリジン色素による処理、 放射線の照射などがあげられる。 また、 種々のアル キノレ化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。 突然変異誘 発物質を細胞に作用させる方法としては、 例えば、 組織培養の技術第三版 （朝倉 書店） 日本組織培養学会編 （1996)、 ネイチヤー * ジエネテイクス （Nature Genet. ) , 24， 314, (2000) 等に記載の方法を挙げることができる。 自然発生的に生じた突然変異体としては、 特別な突然変異誘発処理を施さない で、 通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる 突然変異体を挙げることができる。
GDP-フコース輸送蛋白質の活性を測定する方法、 あるいは、 細胞膜上の糖蛋白 質の糖鎖構造を識別する方法としては、 例えば、 前記 1 の （1) の （a) に記載の 方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、 例えば、 後述の 5. に記載の方法があげられる。
(4) GDP-フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法
本発明の宿主細胞は、 GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 アンチセ ンス RNA/DNA技術 [バイォサイエンスとィンダストリ一， 50, 322 (1992)、 化学， 46, 681 (1991)、 Biotechnology, 9， 358 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、 細胞工学， 1¾ 1463 (1997) ]、 トリプノレ .ヘリ ックス技術 [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992) ] 等を用い、 標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製す ることができる。
2. 本発明の、 トランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作 製
GDP-フコース輸送蛋白質の活性が制御されるようにゲノム遺伝子が改変された トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、 GDP-フコース 輸送蛋白質の遺伝子を標的として、 1. に記載の手法を用いて作製した本発明の胚 性幹細胞、 受精卵細胞、 または植物細胞より、 公知の方法を用い作製することが できる。
具体的な方法について、 以下に記す。
トランスジエニック非ヒト動物の場合、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の胚性 幹細胞に、 1. に記載の手法を用いることにより、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性 が制御された本 明の胚性幹細胞を作製することができる。
具体例としては、 染色体上の GDP-フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を公 知の相同組換えの手法 [例えば、 Nature, 326, 6110, 295 (1987)、 Cell, 51, 3， 503 (1987) 等] により不活ィヒまたは任意の配列と置換した変異クローンなどがあ げられる。 作製した胚性幹細胞 （例えば、 該変異クローン） を用い、 動物の受精 卵の胚盤胞 （blastocyst)への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、 胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。 こ のキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、 全身の細胞で GDP -フコース輸送蛋 白質の活性が低下したトランスジエニック非ヒト動物を得ることができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A
Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ES 細胞 を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。 ターゲットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型、 ジーントラッ プ型いずれでも用いることができる。
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNA を導 入する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーショ ン法 [サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3， 133 (1990) ]、 リン酸カルシゥ ム法 (特開平 2-227075)、 リポフエクション法 [プロシーディンダス'ォブ'ザ 'ナ ショナル'アカデミー'ォプ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84,
7413 (1987) ]、 インジェクション法 （マエピュレーティング 'マウス 'ェンブリ ォ第 2版）、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813)、 DEAE-デキストラン法 レ ィォマニュアルシリーズ 4一遺伝 子導入と発現 ·解析法 （羊土社） 横田崇 *新井賢一編 （1994) ]、 ウィルスベクタ 一法 （マニピユレ一ティング'マウス 'ェンブリオ第 2版） 等をあげることがで きる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S細胞 を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガ ティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 具体的には、 hprt遺 伝子を含むターゲットベクターの場合は、 hprt遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導 入後、 胚性幹細胞をアミノプテリン、 ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地 で培養し、 アミノプテリン耐性の株を選別することにより、 hprt遺伝子を含む相 同組換え体を選別するポジティプ選択を行なうことができる。 ネオマイシン耐性 遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導入した胚性幹細胞を G418を含む培地で培養し、 G418耐性の株を選別することにより、 ネオマイシン耐 性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。 PC蘭細 06
DT遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導入した胚性幹細胞を 培養し、 生育してきた株を選別する （相同組換え以外のランダムに染色体に挿入 された組換え体は、 DT遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、 DTの毒性に より生育できない） ことにより、 DT遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネ ガティプ選択を行なうことができる。 選別した細胞株の中から目的とする相同組 換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNAに対するサザンハイブリダィゼーシ ョン法 （モレキュラー ·クロー-ング第 2版） や PCR法 [ピーシーア一ノレ ·プロ トコールズ （PCR Protocols)， Academic Press (1990) ] 等があげられる。
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8 細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。 胚性幹細胞を注入キメ ラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8細胞期から胚盤胞の発生 段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、 精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させ ることにより、 受精能を誘起された偽妊娠雌マゥスに得られた受精卵を人工的に 移植およぴ着床させる方法が好ましく、 偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得 られるが、 黄体形成ホルモン放出ホルモン （以下、 LHRH と略する） あるいはその 類縁体を投与後、 雄マウスと交配させることにより、 受精能を誘起された偽妊娠 雌マウスを得ることもできる。 LHRH の類縁体としては、 例えば [3, 5-Dil-Tyr5]- LHRH、 [Gln8]- LHRH、 [D- Ala6] - LHRH、 des- GlylO_[D- His (Bzl) 6]- LHRH ethylamide 等があげられる。
また、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウ ス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の受精卵細胞に、 1. に記載の手法を用い ることにより、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した本発明の受 精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、 マ-ピューレーティング'マウス'ェンブリオ第 2版等 に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させる ことで、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェ-ッ ク非ヒト動物を作製することもできる。
トランスジエニック植物の場合、 目的とする植物体力ルスまたは細胞に、 1. に 記載の手法を施すことで、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した 本発明の植物細胞からなる力ルスを作製することができる。 PC漏舰 06 作製したカルスを、 公知の方法 [組織培養， 20 (1994)； 組織培養， ^1 (1995)； 卜 レンドヽイ ン， ノ ィォテクノ ロジー (Trends in Biotechnology) , 15, 45 (1997) ] に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで 再分化させ、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェ 二ック植物を作製することができる。
3. 抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、 モレキユラ一'クローニング第2版、 カレント'プロ トコールズ' イン'モレキユラ1 ~· · ノ ィォロン一、 Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (以下、 アンチボディズと略す）、 Monoclonal Antibodies : principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 ( 下、 モノ ク ロ一ナノレアンチボディズと略す）、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (以 T、 ゾ ンチボディエンジニアリングと略す） 等に記載された方法を用い、 例えば、 以下 のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子の cDNAを調製する。
調製した抗体分子の全長 cDNAをもとにして、 必要に応じて、 該蛋白質をコード する部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片、 または全長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクターに適合した宿主細胞に導入することによ り、 抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞として、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とする遺伝子 を発現できるものであればいずれも用いることができるが、 好ましくは動物細胞 があげられる。
抗体分子の Fc領域に結合する N-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺 伝子工学的な手法を用いて導入した、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等の 細胞を宿主細胞として用いることもできる。
本発明の抗体組成物の製造方法に用いられる宿主細胞としては、 上記 1· で作 製した、 GDP-フコース輸送蛋白質の活性が親株細胞より欠失または低下した細胞 をあげることができる。 発現ベクターとしては、 上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色 体中への組込が可能で、 目的とする抗体分子をコードする DNA を転写できる位置 にプロモーターを含有しているものが用いられる。
cDNAは、 上記 1. の （1) の （a) に記載の 「cDNAの調製方法」 に従い、 ヒ トま たは非ヒ ト動物の組織または細胞より、 目的とする抗体分子に特異的なプローブ プライマーを用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 YEP13 (ATCC37115) , YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419) 等をあげることができる。 プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 P H 05 プロモーター、 P G Kプロモーター、 G A Pプロモーター、 A D Hプロ モーター、 gal 1 プロモーター、 gal 10 プロモーター、 ヒートショック蛋白質プ 口モーター、 プロモーター、 CUp 1 プロモーター等をあげることができる。 宿主細胞としては、 サッカロミセス属、 シゾサッカロミセス属、 クリュイべ口 ミセス属、 トリコスポロン属、 シュヮ-ォミセス属等に属する酵母、 例えば、 saccharomyces cerevisiae SchizosaccharomYces pomoe^ Kluyveromvces lactis、 Trichosporon nyllulans、 Schwann i omyces alluvius等をあげ、ること力 Sでさる。 組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNA を導入する方法であればいず れも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨン法 [メソッズ ·ェンザ ィモロジ一 （Methods. Enzymol. ) , 194, 182 (1990) ]、 スフヱ口プラスト法 [プ 口シーデイングス'ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー-ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A) , M, 1929 (1978) ]、 酢酸リチウム法 [ジャーナル ·ォ ブ 'バタテリォロジ一 （J. Bacteriology) , 153, 163 (1983) ]、 プロシーディン グス'ォブ'ザ'ナショナル'ァカデミ一 ·ォブ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A) , 75, 1929 (1978) に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 pcDNAI、 pcDM8 (ブナコシ社より市販）、 pAGE107 [特開平 3-22979；サイ トテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]、 pAS3- 3 (特開平 2 - 227075)、 pCDM8 [ネイチ ヤー（Nature) , 329, 840 (1987) ]、 pcDNAI/Amp (Invitrogen 社製）、 pREP4 (Invitrogen 社製）、 pAGE103 [ジャーナル ' ォブ ·バイオケミス トリー （J. Biochemistry) , 101, 1307 (1987) ]、 pAGE210等をあげることができる。 プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺 伝子のプロモーター、 SV40 の初期プロモーター、 レトロゥイノレスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 SR ctプロモータ 一等をあげることができる。 また、 ヒ ト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモ 一ターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒ トの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞で ある COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特開 昭 63 - 299)、 ラットミエローマ細胞、 マウスミエローマ細胞、 シリアンハムスタ 一腎臓由来細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNA を導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 [サイ トテクノ ロジー （Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]、 リン酸カルシウム法 [特開平 2 - 227075]、 リポフエクシヨン法 [プロシーディングス 'ォプ 'ザ'ナショナル'ァカデ ミー 'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ]、 ィンジェクション法 [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (以下、 マユピ ユレ一ティング .マウス 'ェンプリオ第 2版と略す）]、 パーティクルガン （遺伝 子銃） を用いる方法 （日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813)、 DEAE-デキスト ラン法 レ ィォマニュアルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 '解析法 （羊土社） 横 田崇 .新井賢一編 （1994) ]、 ウィルスベクター法 （マニピユレ一ティング 'マウ ス *ェンプリオ第 2版） 等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えば力レント ·プロトコールズ ·ィ ン · モレキュ ラー · ノ ィォロ ジ一、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 ノ づ才 / T クノロジ一 （Bio/Technology)， 6, 47 (1988) 等に記載された方法によって、 蛋 白質を発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入ベクターおよびパキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 PVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製) 等をあげることができる。 パキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである ァゥ トグラファ 'カリフォルニ力 ·ヌクレアー 'ポリへドロシス · ウィルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis virusノ等を用いること力 Sできる。 昆虫細胞としては、 Spodopterafrugiperda の卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [カレ ント ' プロ トコーノレズ · イン · モレキュラー ·バイォロジー、 Baculovirus Jixpression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992) ]、 Trichoplusia ni の卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製） 等 を用いることができる。
糸且換えゥィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ 一と上記パキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 (特開平 2-227075)、 リボフヱクシヨン法 [プロシーディングス 'ォブ 'ザ'ナショ ナル 'ァカデミ一'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ] 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 Ti プラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス (CaMV) の 35S プロモー ター、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 ァブラ ナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげることがで さる。
組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に DNA を導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム (ARrobacterium) を用 いる方法 （特開昭 59- 140885、 特開昭 60- 70080、 TO94/00977)、 エレクト口ポレー シヨン法 （特開昭 60-251887)、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （日 本特許第 2606856、 日本特許第 2517813) 等をあげることができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー 'クローユング 第 2版に記載されている方法に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等を行うこと ができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植 物細胞等により発現させた場合には、 導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が 付加された抗体分子を得ることができる。 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に抗体分子を 生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 抗体組成物を製造することが できる。 形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主細胞の培養に用いられる通常 の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を 効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糠蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール などのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモユウム、 硫酸アンモェゥム、 酢酸ァ ンモ-ゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンス チープリカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵 菌体およびその消化物等を用レ、ることができる。
無機塩類としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マン癌、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培 養温度は 15〜40°Cがよく、 培養時間は、 通常 16 時間〜 7 日間である。 培養中の pHは 3. 0〜9. 0に保持する。 pHの調製は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモユアなどを用いて行う。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換 した酵母を培養するときには、 必要に応じてインデューサーを培地に添カ卩しても よい。 例えば、 lac プロモーターを用いた組換えべクタ一で形質転換した酵母を 培養するときにはイソプロピル - J3 - D -チォガラクトピラノシド等を、 tr プロモ 一ターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはィンドー ルアクリル酸等を培地に添加してもよい。 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている RPMI1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メディ力 ノレ · ァソシェづ シヨン (The Journal of the American Medical Association; , 199， 519 (1967) ]、 Eagle の MEM培地 [サイエンス (Science) , 122, 501 (1952) ]、 ダルベッコ改変 MEM培地邊 [ヴユウロロジー (Virology) , 8, 396 (1959) ]、 199 培地 [プロシーデイング ·ォブ ·ザ · ソサイエティ · フォア ·ザ ·バイオロジカ ル · メティスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73, 1 (1950) ]、 Whitten培地 [発生工学実験マニュアル-トランスジヱニック ·マ ウスの作り方 （講談社） 勝木元也編 （1987) ]またはこれら培地に牛胎児血清等を 添加した培地等を用レ、ることができる。
培養は、 通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1〜7 日間行う。 フエドバッチ培養、 ホロファイバー培養などの培養法を用いて 1 日〜数ケ月培養 を行うこともできる。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ぺェシリン等の抗生物質を培地に 添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている T匪 - FH 培地 （Pharmingen 社製）、 Sf - 900 II SFM 培地 （Ufe Technologies社製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製）、 Grace' s Insect Medium [ネイチヤー （Nature) , 195, 788 (1962) ] 等を用いるこ とができる。
培養は、 通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の細胞 や器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地として は、 一般に使用されているムラシゲ · アンド · スターグ （MS) 培地、 ホワイト (White) 培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイトカイニン等、 植物ホルモ ンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。 上記のとおり、 抗体分子をコードする DNA を組み込んだ組換え体ベクターを保 有する酵母、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方法 に従って培養し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物より抗体組成物を採取す ることにより、 抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に 分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿 主細胞や、 生産させる抗体分子の構造を変えることにより、 該方法を選択するこ とができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソ ンらの方法 [ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカル 'ケミス トリー （J. Biol. Chera. ) , 264, 17619 (1989) ]、 ロウらの方法 [プロシーディングス'ォプ'ザ 'ナシ ョナル 'アカデミー'ォブ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 86, 8227 (1989) ; ジーン 'デベロップメント （Genes Develop. )， 4, 1288 (1990) ]、 または特開平 05-336963、 特開平 06-823021 等に記載の方法を準用することによ り、 該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 発現ベクターに、 抗体分子をコード する DNA、 および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードする DNA を 挿入し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることに より、 目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、 特開平 2 - 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素' 遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺 伝子が導入された動物個体 （トランスジエニック非ヒト動物） または植物個体 (トランスジエニック植物） を造成し、 これらの個体を用いて抗体組成物を製造す ることもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育ま たは栽培し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該抗体 組成物を採取することにより、 該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば公知の方法 [ァ メ リカン ' ジヤーナノレ 'ォブ · タリ -カル ' 二ユートリシヨン (American Journal of Clinical Nutrition) , 63, 639S (1996)； アメリカン 'ジャーナル · ォブ · ク リ ニカル ' 二ユー ト リ シヨ ン (American Journal of Clinical Nutrition) , 63. 627S (1996) ; バイオ/テクノロジー （Bio/Technology)， 9, 830 (1991) ] に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物 を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 抗体分子をコードする DNA を導入したトランスジ エニック非ヒト動物を飼育し、 抗体組成物を該動物中に生成蓄積させ、 該動物中 より抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物を製造することができる。 該 動物中の生成蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク （特開昭 63-309192)、 卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモーターとしては、 動物で 発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例えば、 乳腺細胞特異 的なプロモーターである αカゼインプロモーター、 ]3カゼインプロモーター、 β ラタトグロブリンプロモーター、 ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に 用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば抗体分子をコー ドする DNA を導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， ^ (1994)； 組織培養， ^1 (1995)； トレンド 'イン 'バイォテクノ口ジー （Trends in Biotechnology) , 15, 45 (1997) ] に準じて栽培し、 抗体組成物を該植物中に 生成蓄積させ、 該植物中より該抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物を 生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成 物は、 例えば抗体組成物が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレンチ プレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破碎し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清か ら、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) -セファロース、 DIAI0N HPA-75 (三菱化学 （株） 製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー 法、 S- Sepharose FF (Pharmacia社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ トグラフィ一法、 プチノレセファロース、 フエ-ノレセファロース等のレジンを用い た疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ-ティーク 口マトグラフィ一法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動 法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 抗体組成物の精製標品を得ること ができる。 また、 抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を 回収後破枠し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分として抗体糸且成物の不溶体 を回収する。 回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。 該可溶 化液を希釈または透析することにより、 該抗体組成物を正常な立体構造に戻した 後、 上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。 抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該抗体組成物を回収す ることができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理す ることにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製法 を用いることにより、 抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、 例えば、 抗体、 抗体の断片、 抗 体の Fc領域を有する融合蛋白質などを挙げることができる。
以下に、 抗体組成物の取得のより具体的な例として、 ヒト化抗体の組成物およ び Fc融合蛋白質の製造方法について記すが、 他の抗体組成物を上述の方法および 当該方法に準じて取得することもできる。
A. ヒ ト化抗体組成物の製造
(1) ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子 が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用発現ベクターにヒト 抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより 構築することができる。
ヒト抗体の C領域としては、 任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、 例えば、 ヒト抗体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域 （以下、 hC y 1 と表記する） およびヒ ト抗体の L鎖の/ cクラスの C領域 （以下、 hC /cと表記する） 等があげら れる。
ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子としてはェキソンとイントロンか ら成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]、 pAGE103 [ジ ヤーナル ·ォブ ·パイオケミス トリー （J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ]、 PHSG274 [ジーン （Gene) , 27, 223 (1984) ]、 pKCR [プロシーディングス ·ォプ. ザ 'ナショナル 'アカデミー♦ォプ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 78, 1527 (1981) ] 、 pSGl 13 d2-4 [サイ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 4, 173 (1990) ] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナル 'ォプ 'バイオケミストリー (J. Biochem. )， 101, 1307 (1987) ]、 モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR レィォケミカル'アンド'パイ オフィジカノレ · リサーチ · コミュ-ケーションズ (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 149, 960 (1987) ]、 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セル （Cell) , 41, 479 (1985) ] とェンハンサー [セル （Cell) , 33. 717 (1983) ] 等があげられ る。
ヒト化抗体発現用ベクターは、 抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に存在 するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ （以下、 タンデム型と表 記する） のどちらでも用いることができる力 ヒト化抗体発現ベクターの構築の 容易さ、 動物細胞への導入の容易さ、 動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現 量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方 が好ましい [ジャーナル'ォブ'ィムノロジカル'メソッズ (J. Immunol. Methods) , 167, 271 (1994) ]。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、 ヒト型キメラ抗体おょぴヒト型 CDR移 植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
(2) ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、 例えば、 マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNA は以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリ ドーマ細胞より mRNA を抽出し、 cDNA を 合成する。 合成した cDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローユン グして cDNAライブラリーを作製する。 該ライブラリーより、 既存のマウス抗体の C領域部分或いは V領域部分をプローブとして用い、 VHをコ一ドする cDNAを有す る組換えファージ或いは組換えプラスミドおよび VLをコードする cDNAを有する 糸且換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。 組換えファージ或 いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定 し、 塩基配列より VHおよび VLの全ァミノ酸配列を推定する。 ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 ハイプリ ドーマ細胞を作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。 ハイプリ ドーマ細胞から全 RNA を調製する方法としては、 チォシアン酸グァニ ジン-トリフルォ口酢酸セシゥム法 [メソッズ'イン 'ェンザィモ口ジー （Methods in Enzymol. ) , 154, 3 (1987) ]、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 オリゴ (dT)固定化セルロースカラム法 (モレキュラー'クローニング第 2版) 等が あげられる。 また、 ハイプリ ドーマ細胞から mRNA を調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製） 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） 等があげられる。
cDNAの合成おょぴ cDNAライブラリ一作製法としては、 常法 （モレキュラー'ク ローニング第 2 版；カレント ·プロトコ一ルス、 'イン 'モレキュラー ·バイオ口 ジー， Supplement 1-34]、 或いは市販のキット、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製） や ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製） を用いる方法などがあげられる。
cDNA ライブラリーの作製の際、 ハイブリ ドーマ細胞から抽出した mRNA を铸型 として合成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジー ズ （Strategies) , 5, 58 (1992) ]、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック 'ァシ ッズ ' リ サーチ（Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ]、 λ zap II (Stratagene社製）、 L gtlO、 X gtll [ディーェヌエー ·クロー-ング：了 ·プラ クティカル ·アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 L ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 pcD2 [モレキュラー 'アンド 'セルラー 'バイオロジー（Mol. Cell. Biol. ) , 3, 280 (1983) ] および PUC18 [ジーン（Gene) , 33> 103 (1985) ] 等が用いられる。
ファージ或いはプラスミ ドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、 発現おょぴ維持できるものであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XL1- Blue MRF' [ストラテジ ーズ （Strategies) , 5, 81 (1992) ]、 C600 [ジェネティックス （Genetics) , 39, 440 (1954) ]、 Y1088、 Y1090 [サイエンス (Science) , 222, 778 (1983) ]、 丽 522 [ジャーナノレ ·ォブ ·モレキュラー · ノ ィォロジ一 (J. Mol. Biol. ) , 166, 1 (1983) ]、 K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー (J. Mol. Biol. ) , 16, 118 (1966) ] および JM105 [ジーン （Gene) , 38> 275 (1985) ] 等が 用いられる。
cDNA ライブラリーからのヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VL をコードする cDNA クローンの選択法としては、 アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用 いたコロニー .ハイブリダイゼーション法或いはプラーク .ハイブリダィゼーシ ヨン法 （モレキュラー 'クローニング第 2版） により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを铸型と して、 Polymerase Chain Reaction (以下、 PCR法と表記する ； モレキユラ一'ク ローニング第 2 版；カレント ·プロ トコールズ ·イン 'モレキュラー ·バイオ口 ジー， Supplement 1-34) により VHおよび VLをコードする cDNAを調製すること もできる。
上記方法によ り選択された cDNA を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene 社製） 等のプラスミ ドにクローニングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えば、 サンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス .オフ、、 ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·オフ、、 ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. ) , 74. 5463 (1977) ] 等の反応を行い、 塩基配 列自動分析装置、 例えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 （Pharmacia社製） 等を 用いて解析することで該 cDNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、 既知の抗体の H鎖おょぴ VLの全アミノ酸配列 [シーケンシズ'ォブ'プロテインズ'ォプ'ィムノ ロジカノレ- ンタレス ト (Sequences of Proteins oi Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991 (以下、 シーケンシズ 'ォブ ·プロテ インズ'ォプ'ィムノロジカル 'インタレストと略記する）] と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なァミノ酸配 列をコードしているかを確認することができる。
(3) ヒト以外の動物の抗体の V領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、 既知の抗体の VHおよび VLの全ァミノ酸配列 （シーケンシズ'ォブ'プロティンズ' ォブ.ィムノ口ジカル'インタレスト） と比較することにより、 分泌シグナル配列 の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、 更にはそれらが属するサブグルー プを知ることができる。 また、 VHおよび VLの各 CDRのアミノ酸配列についても、 既知の抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列 （シーケンシズ'ォブ'プロティンズ 'ォ プ.ィムノロジカル ·インタレスト） と比較することによって見出すことができる。
(4) ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNA をクローエングし、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。 例えば、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、 ヒト以外の 動物の抗体 VHおよび VLの 3'末端側の塩基配列とヒト抗体の CHおよび CLの 5'末 端側の塩基配列とから成り、 かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 DNAとそれぞれ連結し、 それぞれを本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用べク ターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で 発現するようにクローニングし、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築すること ができる。
(5) ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、 以下のようにして構 築することができる。 まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR を移植するヒト抗体の VHおよび VLのフレームワーク （以下、 FRと表記する） の ァミノ酸配列を選択する。 ヒ ト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列としては、 ヒ ト抗体由来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体の VHおよび VL の FRのァミノ酸配列、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共通ァ ミノ酸配列 （シーケンシズ 'ォブ 'プロテインズ'ォブ'ィムノロジカノレ'インタレス ト） 等があげられるが、 その中でも、 十分な活性を有するヒト型 CDR移植抗体を 作製するためには、 目的のヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸 配列とできるだけ高い相同性 （少なくとも 60%以上） を有するアミノ酸配列を選 択することが望ましい。
次に、 選択したヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外 の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ酸配列を移植し、 ヒト型 CDR移植抗 体の VHおよび VLのアミノ酸配列を設計する。 設計したアミノ酸配列を抗体の遺 伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度 （シーケンシズ'ォブ'プロテインズ' ォブ'ィムノロジカル 'インタレスト） を考慮して DNA配列に変換し、 ヒト型 CDR 移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコードする DNA配列を設計する。 設計 した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長さから成る数本の合成 DNAを合成し、 それらを用レ、て PCR法を行う。 この場合、 PCRでの反応効率およぴ合成可能な DNA の長さ力 ら、 H鎖、 L鎖とも 6本の合成 DNAを設計することが好ましい。
また、 両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入す ることで、 本項 3の （1) で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクロー- ングすることができる。 PCR後、 増幅産物を pBluescript SK (-) (Stratagene社 製） 等のプラスミドにクローニングし、 本項 3の （2) に記載の方法により、 塩基 配列を決定し、 所望のヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコー ドする DNA配列を有するプラスミドを取得する。
(6) ヒト型 CDR移植抗体の V領域のァミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRの みをヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただけでは、 その抗原結合活性は元の ヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている レィォ /テク ノロジー （BI0/TECHN0L0GY)， 9, 266 (1991) ]。 この原因としては、 元のヒ ト以外 の動物の抗体の VHおよび VLでは、 CDRのみならず、 FRのいくつかのアミノ酸残 基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、 それらアミノ酸残基が CDRの移植に伴い、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの異なるアミノ酸残基へと変化 してしまうことが考えられている。 この問題を解決するため、 ヒト型 CDR移植抗 体では、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列の中で、 直接抗原との結合 に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、 抗体の立 体構造を維持し、 間接的に抗原との結合に関与しているァミノ酸残基を同定し、 それらを元のヒ ト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、 低下し た抗原結合活性を上昇させることが行われている レ ィォ /テクノロジー (BI0/TECHN0L0GY) , 9, 266 (1991) ]。
ヒト型 CDR移植抗体の作製において、 該抗体と抗原との結合活性に関わる FRの アミノ酸残基を如何に効率よく同定することが、 最も重要な点である。 抗体と抗 原との結合活性に関わる FRのアミノ酸を同定する方法としては、 X線結晶解析 [ジャーナル'ォブ ·モレキュラー'バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 112, 535 (1977) ] 或いはコンピューターモデリング [プロテイン 'エンジニアリング (Protein Engineering) , 7, 1501 (1994) ] 等の抗体の立体構造の構築及び解析方 法があげられる。 これら抗体の立体構造の情報は、 ヒト型 CDR移植抗体の作製に 多くの有益な情報をもたらした。 し力 しながら、 あらゆる抗体に適応可能なヒト 型 CDR移植抗体の作製法は未だ確立されていない。 したがって、 現状ではそれぞ れの抗体について数種の改変体を作製し、 それぞれの抗原結合活性との相関を検 討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸残基の改変は、 改変用合成 DNAを用い て本項 3の （5) に記載の PCR法により行うことができる。 PCR後の増幅産物につ いて本項 3の （2) に記載の方法により、 塩基配列を決定し、 目的の改変が施され たことを確認する。
(7) ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築
本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 本項 3の （5) および （6) で構築したヒト型 CDR移 植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクロ一-ングし、 ヒト型 CDR移植抗体 発現ベクターを構築することができる。 例えば、 本項 3 の （5) および （6) でヒ ト型 CDR移植抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる合成 DNAのうち、 両端に 位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、 本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローユングし、 ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
(8) ヒト化抗体の安定的生産
本項 3 の （4) および （7) に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞 に導入することによりヒト型キメラ抗体おょぴヒト型 C D R移植抗体 （以下、 併 せてヒト化抗体と称す） を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、 エレクト口ポレーシ ヨン法 [特開平 2 - 257891 ; サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3 , 133 (1990) ] 等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、 ヒト化抗体を生産させ ることができる動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、 チヤィユー ズハムスター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である B HK細胞、 ヒトミエロ 一マ細胞であるナマルパ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チャイニーズハ ムスター卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0細胞、 1. に記 載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、 ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418 sulfate (以下、 G418 と表 記する ； SIGMA社製） 等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。 動 物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 （日水製薬社製）、 GIT培地 （日本製薬 社製）、 EX-CELL302培地 （JRH社製）、 IMDM培地 （GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM培地 （GIBCO BRL社製）、 またはこれら培地に牛胎児血清 （以下、 FBS と表記 する） 等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得られた形質転 換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることが できる。 培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法 (以下、 ELISA法と表記する；アンチボディズ、 モノクローナ^^アンチボディズ） 等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特開平 2-257891に開示されている方 法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させること ができる。
ヒト化抗体は、 形質転換株の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製す ることができる (アンチボディズ、 モノクローナル 'アンティポディズ)。 また、 その他に通常、 蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。 例 えば、 ゲル濾過、 ィオン交換ク口マトグラフィ一および限外濾過等を組み合わせ て行い、 精製することができる。 精製したヒト化抗体の H鎖、 L鎖或いは抗体分 子全体の分子量は、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [以下、 SDS - PAGE と表記す る ；ネイチヤー （Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンプロッティング法 (アンチボディズ、 モノクローナル 'アンティボディズ） 等で測定することができ る。 B. Fc融合蛋白質の製造
(1) Fc融合蛋白質発現用ベクターの構築
Fc融合蛋白質発現用ベクターとは、 ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質と をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用 発現ベクターにヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をク ローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体の Fc領域としては、 CH2と CH3領域を含む領域のほか、 ヒンジ領域、 CH1 の一部が含まれるものも包含される。 また CH2または CH3の少なくとも 1つ のアミノ酸が欠失、 置換、 付加または挿入され、 実質的に Fe y受容体への結合活 性を有するものであればいかなるものでもよレ、。
ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはェキソン とイントロンから成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いること もできる。 それら遺伝子と Fc領域を連結する方法としては、 各遺伝子配列を鎳型 として、 PCR法 (レキユラ一'クローニング第 2版；カレント 'プロトコールズ 'ィ ン 'モレキユラ■ ~.パイォロジ一， Supplement 1-34) を行うことがあげられる。 動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー (Cytotechnology) , 3， 133 (1990) ]、 pAGE103 [ジ ヤーナル ·ォブ · バイオケミス ト リー (J. Biochera. ) , 101. 1307 (1987) ]、 PHSG274 [ジーン (Gene) , 27, 223 (1984) ]、 pKCR [プロシーディンダス ·ォブ · ザ .ナショナル ' アカデミー 'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 78, 1527 (1981)3 、 pSGl β d2 - 4 [サイ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 4, 173 (1990) ] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナル .ォブ .パイオケミストリー （J. Biochem. ) , 101. 1307 (1987) ]、 モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR レィォケミカル'アンド 'パイ オフイジ力ノレ ' リサーチ . コミュニケーショ ンズ (Biochem. Biophys. Res. Coramun. ) , 149, 960 (1987) ]、 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セル （Cell) , 41, 79 (1985) ]とェンハンサー [セル （Cell) , 33， 717 (1983) ]等があげられる。 (2) ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAの取得 ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAは以下のようにして 取得することができる。
目的の Fc と融合させる蛋白質を発現している細胞や組織より mRNAを抽出し、 cDNA を合成する。 合成した cDNA をファージ或いはプラスミド等のベクターにク ローニングして cDNAライブラリーを作製する。 該ライブラリーより、 目的の蛋白 質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、 目的の蛋白質をコードする cDNAを有 する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。 組換えファージ或いは 組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、 塩基配列より全アミ ノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 細胞や組 織を摘出することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全 RNAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン -トリ フルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ.イン'ェンザィモロジ一 (Methods in EnzyraoL ) , 154, 3 (1987) ]、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 ォ リゴ（dT)固定化セルロースカラム法 （モレキュラー 'クローニング第 2版） 等があ げられる。 また、 細胞や組織から mRNA を調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社:^)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） 等があげられる。
cDNAの合成及び cDNAライブラリ一作製法としては、 常法 （モレキュラー 'クロ 一ユング第 2版；力レント'プロ トコールズ'ィン 'モレキュラー 'バイオロジー， Supplement 1-34)、 或いは市販のキッ ト、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製） や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製） を用いる方法などがあげられる。
cDNA ライブラリーの作製の際、 細胞や組織から抽出した mRNA を錶型として合 成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであればいか なるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジーズ (Strategies) , 5, 58 (1992) ]、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック 'ァシッ ズ . リ サーチ （Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ]、 λ zapll (Stratagene社製）、 L gtl0、 L gtll [ディーェヌエー ·クローニング：ァ 'プラ クティカル'アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 ! ExCell, pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 pcD2 [モレキュラー 'アンド ·セルラー 'バイオロジー （Mol. Cell. Biol. ) , 3, 280 (1983) ] 及ぴ pUC18 [ジーン (Gene) , 33. 103 (1985) ] 等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライプラリーを導入、 発現及び維持できるものであれ ばいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XL1- Blue MRF' [ストラテジー ズ （Strategies) , 5, 81 (1992) ]、 C600 [ジェネティックス （Genetics) , 39, 440 (1954) ]、 Y1088、 Y1090 [サイエンス (Science) , 222, 778 (1983) ]、 雇 522 [ジャーナノレ 'ォブ'モレキュラー 'バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 166, 1 (1983) ]、 K802 [ジャーナノレ ·ォブ ·モレキュラー ·バイオ口ジー (J. Mol. Biol. ) , 16, 118 (1966) ]及び JM105 [ジーン (Gene) , 38, 275 (1985) ]等が用い られる。
cDNA ライブラリーからの目的の蛋白質をコードする cDNA クローンの選択法と しては、 ァイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー 'ハイブリ ダイゼーシヨン法或いはプラーク 'ハイプリダイゼーシヨン法 （モレキユラ一'ク ローニング第 2版） により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを鎵型として、 PCR法により目 的の蛋白質をコードする cDNAを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体の Fc領域と融合させる方法としては、 PCR法があげら れる。 例えば、 目的の蛋白質の遺伝子配列の 5'側と 3'側に任意の合成ォリゴ DNA (プライマ一）を設定し、 PCR法を行い PCR産物を取得する。 同様に、 融合させ るヒト抗体の Fc領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、 PCR産 物を得る。 このとき、 融合させる蛋白質の PCR産物の 3'側と Fc領域の PCR産物 の 5'側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマ 一を設定する。 この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、 その変 異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。 得られた 2種類の PCR 断片を用いてさらに PCR を行うことで、 両遺伝子を連結する。 もしくは、 同一の 制限酵素処理をした後にライゲーシヨンすることでも連結することができる。 上記方法により連結された遺伝子配列を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製） 等のプラスミドにクローユングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プ 口シーディングス 'ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] あるいは ABI PRISM 377DNA シー タエンサー （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析すること により、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列から Fc融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、 目的のァミノ 酸配列と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む Fc融合 蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
(3) Fc融合蛋白質の安定的生産
前記の （1) 項に記載の Fc融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入す ることにより Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。 動物細胞への Fc融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、 エレクトロポレー シヨン法 [特開平 2- 257891 ; サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] 等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、 Fc融合蛋白質を生産 させることができる動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、 チヤィニー ズハムスター卵巣細胞 CH0/dhfr_細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である BHK細胞、 ヒトミエロー マ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チヤィユーズハム スタ一卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエロ一マ YB2/0細胞、 前記 1項に 記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターの導入後、 Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換 株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418等の薬剤を含む動物 細胞培養用培地により選択できる。 動物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 (日水製薬社製)、 GIT培地 （日本製薬社製）、 EX-CELL302培地 （JRH社製）、 IMDM 培地 （GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM培地 （GIBCO BRL社製）、 またはこれら培 地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得られ た形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に Fc融合蛋白質を生産蓄積さ せることができる。 培養上清中の Fc 融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性は ELISA法等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特開平 2 - 257891に開示され ている方法に従い、 dhfr遺伝子増幅系等を利用して Fc融合蛋白質の生産量を上 昇させることができる。 Fc融合蛋白質は、 形質転換株の培養上清よりプロティン Aカラムやプロティン Gカラムを用いて精製することができる （アンチボディズ， Chapter 8、 モノクロ 一ナル'アンティボディズ)。 また、 その他に通常、 タンパク質の精製で用いられ る精製方法を使用することができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグ ラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、 精製することができる。 精製した Fc融合蛋白質分子全体の分子量は、 SDS- PAGE [ネイチヤー （Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンブロッテイング法 （アンチボディズ， Chapter 12、 モノク 口一ナル'アンティボディズ） 等で測定することができる。 以上、 動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、 上述したように、 酵 母、 昆虫細胞、 植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造するこ とができる。
既に、 宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有している場合には、 前記 1. に 記載の方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、 該細胞を培養し、 該培養物から目的とする抗体組成物を採取することにより、 本発明の抗体組成物 を製造することができる。
4. 抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、 抗原との結合性あるいはェフエクタ一機能を測 定する方法としては、 モノクローナルアンチボディズ、 あるいはアンチボディェ ンジ -ァリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、 抗体組成物がヒト化抗体の場合、 抗原との結合活性、 抗原陽性培養細胞株に対する結合活性は ELISA法および蛍光抗体法 [キャンサー' ィ ムノ ロジ一-ィ ムノセラ ピー (Cancer Immunol. Iramunother. ) , 36, 373 (1993) ] 等により測定できる。 抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、 CDC 活性、 ADCC活性等を測定することにより、 評価することができる [キャンサー' ィ ムノ ロジ一，ィ ムノセラ ピー (Cancer Immunol. Immunother. ) , 36, 373 (1993) ]。
また、 抗体組成物のヒトでの安全性、 治療効果は、 力二クイザル等のヒトに比 較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。 5. 抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、 通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解 析に準じて行うことができる。 例えば、 IgG分子に結合している糖鎖はガラタト ース、 マンノース、 フコースなどの中性糖、 N-ァセチルダルコサミンなどのアミ ノ糖、 シアル酸などの酸性糖から構成されており、 糖組成分析および二次元糖鎖 マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
(1) 中性糖.アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、 トリフルォロ酢酸等で、 糖鎖の酸加水分解を行 うことにより、 中性糖またはアミノ糖を遊離し、 その組成比を分析することがで きる。
具体的には、 Dionex社製糖組成分析装置 （BioLC) を用いる方法があげられる。 BioLC は HPAEC- PAD (high performance an ion-exchange chromatography - pulsed amperometric detection) 法 [ジャーナル ·ォブ ' リキッド 'クロマトグラフィ 一 (J. Liq. Chromatogr. ) , 6, 1577 (1983) ] によって糖組成を分析する装置で める。
また、 2-ァミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができ る。 具体的には、 公知の方法 [ァグリカルチュラル 'アンド 'バイオロジカル · ケミストリー （Agruc. Biol. Chem. ) , 55 (1) , 283-284 (1991) ] に従って酸加水 分解した試料を 2-ァミノピリジル化で蛍光ラベル化し、 HPLC分析して組成比を算 出することができる。
(2) 糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、 2 次元糖鎖マップ法 [アナリティカル 'バイオ ケミストリー (Anal. Biochem. ) , 171, 73 (1988)、 生物化学実験法 23-糖蛋白質 糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989年) ] により行うことができ る。 2次元糖鎖マップ法は、 例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持 時間または溶出位置を、 Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間 または溶出位置を、 それぞれプロットし、 既知糖鎖のそれらの結果と比較するこ とにより、 糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、 抗体をヒドラジン分解して、 抗体から糖鎖を遊離し、 2 -アミノビ リジン （以下、 PA と略記する） による糖鎖の蛍光標識 [ジャーナル'ォブ'バイ オケミストリー （J. Biochem. ) , 95, 197 (1984) ] を行った後、 ゲルろ過により 糖鎖を過剰の PAィ匕試薬などと分離し、 逆相クロマトグラフィーを行う。 次いで、 分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。 これらの結果 をもとに、 2次元糖鎖マップ上にプロットし、 糠鎖スタンダード （TaKaRa社製）、 文献 [アナリティカル 'パイオケミス トリー （Anal. Biochem. ) , 171, 73 (1988) ] とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖の MALDI-T0F - MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マップ法によ り推定される構造を確認することができる。
6. 本発明により得られる抗体組成物の利用
本発明により得られる抗体組成物は高い ADCC活性を有する。 高い ADCC活性を 有する抗体は、 癌、 炎症疾患、 自己免疫疾患、 アレルギーなどの免疫疾患、 循環 器疾患、 またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防およぴ 治療において有用である。
癌、 すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。 通常の抗癌剤は癌細胞の増 殖を抑制することを特徴とする。 し力、し、 高い ADCC活性を有する抗体は、 殺細胞 効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、 通常の 抗癌剤よりも治療薬として有効である。 特に癌の治療薬において、 現状では抗体 医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われてい るが [サイエンス （Science) , 280, 1197, 1998]、 本発明の抗体組成物単独での より強い抗腫瘍効果が認められれば、 化学療法に対する依存度が低くなり、 副作 用の低減にもつながる。
炎症疾患、 自己免疫疾患、 アレルギーなどの免疫疾患において、 それら疾患に おける生体内反応は、 免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起される ため、 高い ADCC活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、 ァレ ルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、 動脈硬化などがあげられる。 動脈硬化は、 現在バルーン カテーテルによる治療を行うが、 治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い ADCC 活性を有する抗体を用いて抑えることより、 循環器疾患を予防および治療するこ とができる。 ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、 高い ADCC活性を有する抗体を用 いて抑えることにより、 ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防 および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識 する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、 自己免疫疾患に関連する 抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識す る抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、 抗 GD2抗体 （Anticancer Res. , 13, 331-336, 1993)、 抗 GD3 抗体 （Cancer Immunol. Immunother. , 36, 260-266, 1993)、 抗 GM2抗体 （Cancer Res.， 54» 1511-1516， 1994)、 抗 HER2抗体 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289， 1992)、 抗 CD52 抗体 （Nature, 332, 323-327, 1988)、 抗 MAGE抗体 （British J. Cancer, 83, 493-497, 2000)、 抗 H Ml. 2 抗体 （Molecular Immunol. , 36, 387-395， 1999)、 抗副甲状腺ホルモン 関連蛋白 （PTHrP) 抗体 （Cancer, 88, 2909-2911, 2000)、 抗 FGF8 抗体 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86. 9911 - 9915, 1989) 抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、 抗 F G F 8受容体抗体 （J. Biol. Chem. , 265, 16455-16463, 1990)、 抗塩基性繊 維芽細胞増殖因子受容体抗体、 抗ィンスリン様増殖因子抗体 （J. Neurosci. Res.， 40, 647-659, 1995)、 抗ィンスリン様増殖因子受容体抗体 （J. Neurosci. Res.， 40, 647-659, 1995)、 抗 PMSA抗体 （J. Urology, 160, 2396-2401, 1998)、 抗血 管内皮細胞増殖因子抗体 （Cancer Res. , 57, 4593-4599, 1997) または抗血管内 皮細胞増殖因子受容体抗体 (Oncogene, 19, 2138-2146, 2000) などがあげられる。 アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗インター ロイキン 6抗体 （Immunol. Rev.， 127, 5-24， 1992)、 抗インターロイキン 6受容 体抗体 （Molecular Immunol. , 31, 371-381, 1994)、 抗インターロイキン 5抗体 (Immunol. Rev. , 127, 5-24， 1992)、 抗インターロイキン 5受容体抗体、 抗イン ターロイキン 4抗体 （Cytokine, 3, 562-567， 1991) , 抗インターロイキン 4受容 体抗体 （J. Immunol. Meth. , 217, 41-50， 1998)、 抗腫瘍壊死因子抗体 (Hybridoma, 13, 183-190， 1994)、 抗腫瘍壌死因子受容体抗体 （Molecular Pharmacol. , 58, 237-245, 2000)、 抗 CCR4抗体 (Nature, 400, 776-780， 1999)、 抗ケモカイン抗体 (J. Immunol. Meth. , 174, 249-257, 1994) または抗ケモカイ ン受容体抗体 （J. Exp. Med. , 186， 1373-1381, 1997) などがあげられる。 循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 GpIIbZlIIa抗体 （J. Immunol. , 152, 2968-2976， 1994)、 抗血小板由来増殖因子抗体 (Science, 253, 1129-1132， 1991)、 抗血小板由来増殖因子受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 272, 17400-17404, 1997) または抗血液凝固因子抗体 （Circulation, 101, 1158-1164, 2000) などがあげられる。
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗自己 DNA 抗体 (Immunol. Letters, 72, 61 - 68， 2000) などがあげられる。
ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 g p l20 抗体 （Structure, 8, 385-395， 2000)、 抗 CD4 抗体 (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998)、 抗 CCR4抗体または抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol. , 37, 396-399, 1999) などがあげられる。
上記抗体は、 ATCC (The American Type Culture Collection)、 理化学研究所細 胞開発銀行、 工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、 あるいは大日本製 薬株式会社、 R&D SYSTEMS社、 PharMingen社、 コスモバイオ社、 フナコシ株式会 社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、 治療薬として単独で投与 することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上 の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法によ り製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投 与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内おょぴ静脈内等の非経口投与 をあげることができ、 抗体製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることがで さる。
投与形態としては、 嘖霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセノレ剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果 糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 P-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防 腐剤、 ストロベリーフレーパー、 ペパーミント等のフレーパー類等を添加剤とし て用いて製造できる。 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトー ル等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグ ネシゥム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビュルアルコール、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の 可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。 注射剤は、 塩溶液、 プドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用 いて調製される。 または、 抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、 これに塩化ナ トリウムをカロえることによつて粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は該抗体組成物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜 を刺激せず、 かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該抗体組成物および 用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加す ることもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1日当たり lO /i g/k ^SOmg/kgである。
また、 抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、 イン ビトロ実験としては、 CDC活性測定法、 ADCC活性測定法等があげられ、 インビボ 実験としては、 マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられ る。
CDC活性、 ADCC活性、 抗腫瘍実験は、 文献 [キャンサー 'ィムノロジ fム ノセラピー （Cancer Immunology Immunotherapy) , 36, 373 (1993) ； キャンサ 一. リサーチ （Cancer Research) , 54, 1511 (1994) ] 等記載の方法に従って行う ことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発明の単な る例示を示すものにすぎず、 本発明の範囲を限定するものではない。 図面の簡単な説明
第 1 図は、 CHO/GDPf t Δ 30- CCR4株、 および CHO/pcDNA- CCR4株が生産した抗 CCR キメラ抗体と CCR4部分ペプチドとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定 した結果を示したものである。 グラフの縦軸は、 CCR4部分ペプチドとの結合活性 を波長 490nmにおける吸光度で示している。 横軸は抗 CCR4キメラ抗体の反応液中 の濃度を示している。 ▲は CHO/GDPf t Δ 30-CCR4抗体、 酾は CH0/pcDNA_CCR4抗体 の抗原結合活性を示す。
第 2 図は、 CHO/GDPf t Δ 30-CCR4株、 および CH0/pcDNA-CCR4株が生産した抗 CCR4 キメラ抗体の ADCC活性を抗体濃度を変化させて測定した結果を示したもの である。 グラフの縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗 CCR4キメラ抗体の反応液中の濃 度をそれぞれ示す。 ▲は CHO/GDPf t A 30- CCR4抗体、 ■は CHO/pcDNA- CCR4抗体の 活性をそれぞれ示す。
第 3 図は、 CHO/GDPf t Δ 30- CCR4株、 および CH0/pcDNA_CCR4株が生産した抗 CCR4キメラ抗体から調製した PA化糖鎖を、 それぞれ逆相 HPLCで分析して得た溶 離図を示したものである。 縦軸に相対蛍光強度、 横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第 4 図は、 チャイニーズハムスター GDP-フコーストランスポーターの非翻訳部 分およぴ隣接する翻訳領域の塩基配列を示した図である。 全長 cDNA取得のために 設計したプライマー部分を下線で示す。 翻訳領域の塩基配列下部に塩基配列より 推定されるアミノ酸配列を示す。
第 5図は、 プラスミド U6_pre— senseの構築工程を示す図である。
第 6図は、 プラスミド PBS_BglIIの構築工程を示す図である。
第 7図は、 プラスミド U6_pre_anti senseの構築工程を示す図である。
第 8図は、 プラスミド U6_sense_Hの構築工程を示す図である。
第 9図は、 プラスミド U6_antisense_Hの構築工程を示す図である。
第 10図は、 プラスミド U6_GFT_Hの構築工程を示す図である。
第 11図は、 プラスミド U6_GFT_H— puroの構築工程を示す図である。
第 12図は、 siR A発現による ァクチンと GDP -フコーストランスポーターの 発現量の変化を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1. GDP-フコーストランスポータードミナントネガティブ体発現細胞の作 製と産生抗体の評価
(1) ヒト GDP -フコーストランスポーター遺伝子の単離
ネイチヤー 'ジエネテイクス [Nature Genetics, 8, 73 (2001) ] に記載のヒト GDP-フコーストランスポーター mRNA配列を用いて、 ヒ ト GDP-フコーストランスポ 一ター mR A配列のオープンリーディングフレーム （以下、 0RF と表記） の全長を 増幅する為のプライマーセット [GDPfT-Fw Primer (配列番号 5) と GDPfT- Rv Primer (配列番号 6) ] を設計し、 DNAを合成した。
500 / 1容のマイクロ遠心管 （エツペンドルフ社製） 中に、 2. 5 μ 1のヒ ト胎児脳 由来 Marathon-Ready- cDNA (クロンテック社製）、 5 μ 1の 20mMデォキシリボヌク レオチド混合液 （東洋紡績社製）、 5 μ Ι の 10 XPCR バッファー （クロンテック社 製）、 4 i l の GDPfT-Fw Primer (20pmol 相当量）、 4 μ I の GDPfT- Rv Primer (20pmol相当量）、 1 μ 1 の Advantage DNA ポリメラーゼ （クロンテック社製）、 28. 5 μ 1の滅菌蒸留水 （ィンビトロジェン社製） を添カ卩し、 PCR液を調製した。 反 応液を十分に混合後、 ミネラルオイル （Sigma社製） を 30 ^ 1 重層し、 サーマル サイクラ一 480 (パーキンエルマ一社製） にて、 94°Cで 2分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 64°Cで 3分間からなる反応を 1サイクルとして、 30回反復させ、 最後に 72°Cにて 3分間反応させた。 反応液から 5 1を分取してァガロースゲル電気泳動 を行い、 全長約 1. lkbpの用いたプライマー特異的な DNAの増幅を確認した。
次に、 500 μ 1容のマイクロ遠心管 （エツペンドルフ社製） 中に、 4 1の PCR液、 1 μ 1の ΤοροΤΑ クローニングベクター (インビトロジェン社製）、 Ι μ ί の Salt Solution (インビトロジヱン社製） を混合し、 室温にて 15分間放置した。 反応後 の液から を分取して、 50 μ ΐ の大腸菌 XL- 1 Blue コンビテントセル (Stratagene社製） と混合し、 氷上にて 15分間放置後、 42°Cの温浴にて 45秒間 加熱して熱ショックによる大腸菌の形質転換を行った。 形質転換後の大腸菌は、 LB培地 （DIFC0社製） に懸濁後、 50 /i g/ml のアンピシリン （和光純薬社製） を添 加した LB寒天培地プレート上に播種した。 プレートを 37°Cにて一晩培養し、 寒 天培地上に形質転換株のシンダルコロニーを得た。 得られたシングルコロニーを 滅菌した爪楊枝で剥ぎ取り、 50 Ai g/ml のアンピシリン （和光純薬社製） を添加し た 50ml の LB培地中で、 37°C、 150rpm (往復振とう） の条件でー晚培養した。 得 られた培養液を遠心管 （ベタ トンディッキンソン社製） に分取し、 4°Cにて 06
8000rpm 15 分間の遠心分離を行い、 上清を除去し、 大腸菌の菌体を取得した。 得られた菌体に対し、 Qiaprep Midi Plasmid DNA Purification Kit (QIAGEN社 製） を用い、 キット添付のプロトコールに従ってプラスミド DNA を精製した。 精 製したプラスミ ド DNA はァガロースゲル電気泳動にて純度を確認後、 分光光度計 (島津製作所社製） を用いて波長 260nra の吸光度を測定し、 濃度を算出した。 DNA シーケンサー 377A (島津製作所社製） を用いて、 l. lkbpの組換え DNA配列を解読 し、 GDP-フコーストランスポーターの全長 0RFであることを確認した。 配列決定 したヒト GDP-フコーストランスポーター cDNAの塩基配列を配列番号 3に、 該塩基 配列に基づくヒト GDP -フコーストランスポーターのアミノ酸配列を配列番号 4に 示した。 得られたプラスミド DNAは、 pCR/hGDPfTと名付けた。
(2) ヒ ト GDP -フコーストランスポーター N末端欠失変異体とその発現ベクターの 作製
ヒ ト GDP -フコーストランスポーターの N末端側から 30残基のアミノ酸を削除 した cDNA配列を増幅する為のプライマーセット [GDPfTA30- Fw Primer (配列番 号 7) と GDPfTA30_Rv Primer (配列番号 8)] を設計し、 DNAを合成した。 なお、 GDPfTA30-Fw Primer には、 ヒ ト GDP -フコーストランスポーターの 31 番目のァ ミノ酸をコードする DNA配列の 5'末端側上流に、 動物細胞用発現プラスミ ド pcDNA3. IHyg (+) (Invitrogen社製） に組込む為の制限酵素 dlllサイト、 翻訳 効率化配列である Kozak配列 （CCGCC) および翻訳開始コドン ATGを接続した形で Ι Β Γしに。
また、 GDPfTA30- Rv Primer には、 ヒ ト GDP-フコーストランスポーターの翻訳 終止コドンをコードする DNA配列の 5'末端外側に、 動物細胞用発現プラスミ ド pcDNA3. IHyg (+) (Invitrogen社製） に組込む為の制限酵素 サイトを接続し た形で設計した。
500 1 容のマイクロ遠心管（エツペンドルフ社製）中に、 本項 （1) で作製した 10ng の pCR/hGDPfT、 5μ1 の 20mMデォキシリポヌクレオチド混合液 （東洋紡社 製）、 5μ 1 の 10XPCR バッファー （クロンテック社製）、 4μ 1 の GDPfTA30 - Fw Primer (20pmol相当量）、 4μ 1 の GDPfTA30- Rv Primer (20pmol 相当量）、 Ιμ ΐ の K0D DNAポリメラーゼ （東洋紡績社製）、 28.5 1 の滅菌蒸留水 （インビトロジ ヱン社製） を添加し、 PCR液を調製した。 反応液を十分に混合後、 ミネラルオイ ノレ （Sigma社製） を 30 il重層し、 サーマルサイクラ一 480 (パーキンエルマ一社 製） にて、 94°Cで 2分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 64°Cで 3分間からなる反応 を 1サイクルとして、 30回反復させ、 最後に 72°Cにて 3分間反応させた。 反応液 から 5 μ 1 を分取してァガロースゲル電気泳動を行い、 全長約 lkbp の用いたプラ ィマー特異的な DNAの増幅を確認した。
次に、 PCR 液をマイクロ遠心管に回収し、 Qiaquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製） を用いて DNAを精製し、 DNA溶液の 1/10容の Mバッファー （宝酒 造社製） を添加後、 各 lOunitsの制限酵素 dlllと 1 (共に宝酒造社製） を 添加して 37°Cにて 8時間処理した。 なお、 この制限酵素処理の際、 10 μ εのプラ スミド pcDNA3. lHyg (+) (Invitrogen社製） も同様に処理した。
制限酵素処理したサンプルより Qiaquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製） を用いて DNAを精製し、 N末欠失体の cDNA溶液 5 i Lと pcDNA3. lHyg (+)溶液 を混合後、 Ligation High (東洋紡績社製） を 6 ί添カ卩し、 16°Cにて 30分間ライ ゲーシヨン反応を行った。 反応液を 2 し分取し、 50 μ ΐの大腸菌 XL- 1 Blue コン ピテントセル （Stratagene社製） と混合し、 氷上にて 15分間放置後、 42°Cの温 浴にて 45秒間加熱して熱ショックによる大腸菌の形質転換を行った。 形質転換後 の大腸菌は、 LB培地 （DIFC0社製） に懸濁後、 50 i g/ml のアンピシリン (和光純 薬社製） を添加した LB寒天培地プレート上に播種した。 プレートを 37°Cにて一 晚培養し、 寒天培地上に形質転換株のシングルコロニーを得た。 得られたシング ルコ口-一を滅菌した爪楊枝で剥ぎ取り、 SO i g/ml のアンピシリン （和光純薬社 製） を添加した 50ml の LB培地中で、 37°C、 150rpm (往復振とう） の条件で一晚 培養した。
得られた培養液を遠心管 (べクトンディッキンソン社製) に分取し、 4°Cにて 8000rpm、 15分間の遠心分離を行い、 上清を除去し、 大腸菌の菌体を取得した。 得られた菌体に対し、 Qiapr印 Midi Plasmid DNA Purification Kit (QIAGEN社 製） を用い、 キット添付のプロトコールに従ってプラスミド DNA を精製した。 精 製したプラスミ ド DNA はァガロースゲル電気泳動にて純度を確認後、 分光光度計 (島津製作所社製） を用いて波長 260nm の吸光度を測定し、 濃度を算出した。 DNA シーケンサー 377A (島津製作所社製） を用いて、 lkbpの組換え DNA配列を解読し、 ヒ ト GDP -フコーストランスポーターの N末端欠失体であることを確認した。 得ら れたプラスミド DNAは、 ocDNA/hGDPf Τ Δ 30と名付けた。 (3) CH0/DG44細胞へのプラスミドの導入と形質転換体の取得
lO ^u g の pcDNA/hGDPfT Δ 30 と 10 μ g の CCR4 キメラ抗体発現プラスミ ド PKANTEX2160 (W001/64754 に記載） を、 1. 6 X 106個の CH0/DG44細胞 [G. Urlaub and L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980) ] へ、 ェ レク ト口ポレーシヨ ン法 [サイ トテクノロジー（Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] により共導入した。 また、 対照として、 lO ^u gの PcDNA3. lHyg(+) と 10 μ gの pKANTEX2160を CH0/DG44細胞に同様に共導入した。
それぞれの細胞懸濁液を 10ml の IMDM -dFBS (10) -Hyg (500) ' [透析牛胎児血清 を 10%、 ハイグロマイシン （和光純薬社製） を 500 μ §/ηι1で含む. IMDM培地] に 懸濁し、 T75 フラスコ （グライナ一社製） へ播種した。 5%C02インキュベーター 内で 37°C、 2週間培養し、 ハイグロマイシン耐性形質転換株を得た。 次に培地を IMDM -dFBS (10) - Hyg (500) に 50nM MTX を添加した培地に交換し、 2'週間培養し て 50nM MTX 耐性株を取得した。 更に、 引続き、 培地を IMDM -dFBS (10) -Hyg (500) に 200nM MTXを添加した培地に交換し、 2週間培養して 200nM MTX耐性株 を取得した。 これらの 200nM MTX耐性株は、 本実施例 （6) に記載の CCR4ぺプチ ド固相化プレートを用いた ELISA法により抗 CCR4キメラ抗体の発現を確 した。 ヒト GDP -フコーストランスポーターの N末端欠失体を導入した形質転換株を CHO/GDPft Δ 30 - CCR4株、 pcDNA3. IHyg (+)を導入した形質転換株を CHO/pcDNA - CCR4 株とそれぞれ称す。 なお、 （¾0 0? 厶
Figure imgf000077_0001
厶30の細胞名 で、 平成 14年 3月 14日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 中央第 6) に FERM BP- 7965 として寄 託されている。
(4) 抗 CCR4キメラ抗体の精製
作製した CHO/GDPft厶 30 - CCR4株、 および CHO/pcDNA - CCR4株が産生する抗 CCR4 キメラ抗体の精製は、 以下のように行った。
CHO/GDPft Δ 30-CCR4株、 および CHO/pcDNA- CCR4株をそれぞれ T182 フラスコ (グライナ一社製） に播種し、 5%C02インキュベーター内で 37°Cにてコンフルェ ントになるまで増殖させた。 細胞密度がコンフルェントに達した時点で培養上清 を除去し、 25mlの PBSバッファー （インビトロジェン社製） にて細胞を洗浄後、 35ml の EXCELL301 培地 （JRH社製） を添加した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cにて一週間培養後、 培養上清を回収し、 Prosep- Aカラム （ミリポア社製） に よる精製を添付の説明書に従い行った。 精製抗体の蛋白質濃度を BCA Protein Assay Kit (PIERCE社製） で定量した。 得られた精製抗体は、 CHO/GDPf t Δ 30 - CCR 株の生産抗体を CHO/GDPf ΐ Δ 30 - CCR4抗体と、 CHO/pcDNA - CCR4株の生産抗体 を CH0/pcDNA-CCR4抗体とそれぞれ名付けた。
(5) 精製した抗 CCR4キメラ抗体の解析
本実施例の（4)で得られた、 2種類の精製抗 CCR4キメラ抗体の各 4 μ gを公知の 方法 [ネイチヤー （Nature) , 227, 680 (1970) ] に従って SDS-PAGEし、 分子量お ょぴ精製度を解析した。 精製した抗 CCR4キメラ抗体は、 いずれも非還元条件下で は分子量が約 150Kdの単一のバンドが、 還元条件下では約 50Kdと約 25Kdの 2本 のパンドが認められた。 これらの分子量は、 抗体の H鎖および L鎖の cDNAの塩基 配列から推定される分子量 （H鎖：約 49Kd、 L鎖：約 23Kd、 分子全体：約 144Kd) とほぼ一致し、 更に、 IgG型の抗体は、 非還元条件下では分子量は約 150Kdであ り、 還元条件下では分子内の S - S結合が切断され、 約 50Kdの分子量を持つ H鎖と 約 25Kdの分子量を持つ L鎖に分解されるという報告 （アンチボディズ， Chapter 14、 モノクローナル 'アンティボディズ） と一致し、 抗 CCR4 キメラ抗体が正しい 構造の抗体分子として発現され、 かつ精製されたことが確認された。
(6) CCR4部分べプチドに対する結合活性の評価
本実施例の（4)で得られた 2種類の抗 CCR4キメラ抗体の CCR4部分べプチドに対 する結合活性は、 CCR4ぺプチド固相化プレートを用いた ELISA法に従って以下の 方法で測定した。 抗体 CCR4部分べプチドに対する結合活性 (ELISA法）
抗 CCR4キメラ抗体が反応し得るヒト CCR4細胞外領域ぺプチドとして化合物 1 (配列番号 15) を選択した。 ELISA法による活性測定に用いるため、 以下の方法で BSA (Bovine Serum Albumin) (ナカライテスタ社製） とのコンジユゲートを作製 し、 抗原として用いた。 すなわち、 10 mg の BSA を含む PBS溶液 900 mL に、 100ml の 25rag/mL SMCC [4- (N -マレイミ ドメチル） シク口へキサン- 1-カルボキシ リックァシッド N -ヒドロキシサクシンィミドエステル] (シグマ社製) -DMS0溶液 を撹拌しながら滴下し、 30 分間ゆつくりと攪拌した。 25 mL PBS で平衡化した NAP-10カラムなどのゲルろ過カラムに反応液 lmLをアプライし、 1. 5mLの PBSで 溶出させた溶出液を BSA - SMCC溶液とした （A280測定から BSA濃度を算出)。 次に、 0. 5 mgの化合物 1に 250mL PBSを加え、 次いで 250mL DMFを加えて完全に溶解さ せた後、 前述の BSA- SMCC溶液 （BSA換算 1. 25mg) を撹拌しながら添加して 3時間 ゆつくり攪拌した。 反応液を PBSに対して 4°C、 一晩透析し、 最終濃度 0. 05%と なるようにアジ化ナトリウムを添加して、 0. 22 mm フィルターでろ過した後 BSA - 化合物 1溶液とした。
96穴の EIA用プレート （グライナ一社製） に、 上述のように調製したコンジュ ゲートを 0. 05 g/mL、 50 μ ΐ/ゥエルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA-PBSを 100 μ L/ゥエルで加え、 室温で 1時間反応させて残 存する活性基をブロックした。 各ゥヱルを 0. 05%TVeen20 を含む PBS (以下、 Tween-PBS と表記する） で洗浄後、 形質転換株の培養上清を 50 μ L/ウエノレで加え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 各ゥエルを Tween-PBSで洗浄後、 1%BSA- PBS で 6000 倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ャギ抗ヒ ト IgG ( y ) 抗体溶液 (American Qualex社製） を二次抗体溶液として、 それぞれ 50 μ L/ゥヱルでカ卩え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween - PBSで洗浄後、 ABTS基質液を 50 ^ L/ゥ エルで加えて発色させ、 20分後に 5%SDS溶液を 50 17ゥヱル加えて反応を停止 した。 その後 415nmの吸光度を測定した。
その結果、 第 1図に示したように、 CH0/GDPft A 30- CCR4抗体と CHO/pcDNA- CCR4 抗体は、 ほぼ同等の CCR4ぺプチドに対する抗原結合活性を示した。
(7) ヒト CCR4高発現細胞株に対する ADCC活性の評価
本実施例の（4)で得られた 2種類の抗 CCR4キメラ抗体の、 ヒト CCR4高発現細胞 である CCR4/EL-4細胞 （W001/64754) に対する ADCC活性は、 以下に記載の方法に 従って測定した。
(a) 標的細胞溶液の調製
W001/6475 に記載のヒト CCR4を発現している CCR4/EL- 4細胞の 1. 5 X 106細胞 を調製し、 放射性物質である Na2 51Cr04を 5. 55MBq当量加えて 37°Cで 1時間 30分 間反応させ、 細胞を放射線標識した。 反応後、 培地を用いた懸濁おょぴ遠心分離 操作により 3回洗浄し、 培地に再懸濁し、 4°Cで 30分間氷中に放置して放射性物 質を自然解離させた。 遠心分離後、 培地を 15mL加え、 2 X 105細胞/ mLに調製し、 標的細胞溶液とした。 (b) ヒ トェフエクタ一細胞溶液の調製
健常人末梢血 60mLを採取し、 へパリンナトリウム （清水製薬社製） を 0. 6mLを 加え穏やかに混ぜた。 これを Lymphoprep (AXIS SHIELD社製） を用いて使用説明 書に従い、 遠心分離 （800g、 20分間） して単核球層を分離した。 培地で 3回遠心 分離 （1400rpm、 5分間） して洗浄後、 培地を用いて 5 X 106細胞/ mLの濃度で再懸 濁し、 ヒ トェフエクタ一細胞溶液とした。
(c) ADCC活性の測定
96 ゥエル U字底プレート （Falcon社製） の各ゥエルに上記 （a) で調製した標 的細胞溶液の 50 し （1 X 104細胞/ゥエル） を分注した。 次いで上記 （b) で調製 したヒトエフェクター細胞溶液を lOO ^ L (5 X 105細胞/ゥエル、 ヒトェフエクタ 一細胞と標的細胞の比は 50 : 1 となる） 添加した。 さらに、 抗 CCR4キメラ抗体を 各最終濃度 0. 0001〜10 g/raLとなるように加え、 37°Cで 4時間反応させた。 反応 後、 プレートを遠心分離し、 上清中の51 Cr量を カウンタ一にて測定した。 自然 解離 51Cr量は、 ヒトエフェクター細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地のみを用い て上記と同様の操作を行い、 上清中の 51Cr量を測定することにより求めた。 全解 離 51Cr量は、 抗体溶液とヒトェフエクタ一細胞溶液の代わりに lmol/Lの塩酸溶液 を添加し、 上記と同様の操作を行い、 上清中の slCr量を測定することにより求め た。 ADCC活性 （％) は下式 （1) により求めた。 検体上清中の5 iCr量一自然解離51 Cr量
ADCC活性 (%) = X 100 (1) 全解離51 Cr量一自然解離51 Cr量 その結果、 第 2図に示したように、 CHO/GDPf t Δ 30- CCR4抗体の ADCC活性は、 CHO/pcDNA - CCR4抗体と比較して有意に高!/、ことが明らかとなつた。
(8) 抗 CCR4キメラ抗体の糖鎖構造の解析
本実施例の（4)で得られた 2種類の抗 CCR4キメラ抗体について、 糖鎖構造の解 析を行った。 精製したそれぞれの抗体を、 ゥリ トラフリー 0. 5- 10K (ミリポア社 製） を用いて lOraM K P04に溶液を置換した。 置換倍率は 80倍以上になるように 行なった。 置換した抗体は、 UV-1600 (島津製作所製） を用いて濃度を測定した。 画襲 06 抗体のアミノ酸配列から下記式 （2) [アドバンスズ 'イン ·プロテインケミスト リー （Advances in Protein Chemistry) , 12, 303 (1962) ] を用いてモル吸光定 数を算出し、 280nmの吸光度 1. 0を 1. 38mg/ralとして濃度を決定した。 式 （2 )
Elraol/1=A X nl+B X n2+C X n3
Elmol/ml 二 ^lmol/l /丽
Figure imgf000081_0001
での吸光係数 （mg-1 ml cm—り
Elraol/ml： 280nmでのモル吸光係数 （Μ—^πΓ1)
Α:トリプトファンの 280nmでのモル吸光係数 =5550 (M^cm"1)
B:チロシンの 280mnでのモル吸光係数 = 1340 (M^cm-1)
C:シスチンの 280應でのモル吸光係数 = 200 (M^cm"1)
nl :抗体 1分子あたりのトリプ卜ファンの数
n2:抗体 1分子あたりのチロシンの数
n3 :抗体 1分子あたりのシスチンの数
MW:抗体の分子量 （g/mol)
100 gの抗体をヒドラクラブ S-204用試験管に入れ、 遠心濃縮機にて乾固した。 サンプルを乾固させた該試験管をホーネン社製ヒドラクラブを用いてヒドラジン 分解を行なった。 ヒドラジン分解はホーネン社製ヒ ドラジン分解試薬を用い、 110°C、 1 時間反応させることにより行った [メソッド ·ォブ ·ェンザィモロジ一 (Method of Enzymology) , 83, 263 (1982) ]。 反応後ヒ ドラジンを減圧留去させて、 反応容器を 30分間放置して室温に戻した。 試験管にホーネン社製ァセチル化試薬 の acetylation reagentを 250 μ 1、 無水酢酸を 25 μ 1入れてよく攪拌させ、 室温 で 30分間反応させた。 さらに acetylation reagentを 250 μ 1、 無水酢酸を 25 μ 1 加えてよく攪拌させ、 室温で 1時間反応させた。 試料を- 80°Cのフリーザーで凍結 させ、 約 17 時間凍結乾燥させた。 凍結乾燥した試料から、 TaKaRa社製セルロー スカートリッジ グリカンプレパレーションキットを用いて糖鎖を回収した。
試料糖鎖溶液を遠心濃縮機にて乾固後、 2-ァミノピリジンによる蛍光標識を行 つた [ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー (J. Biochem. ) , 95, 197 (1984) ]。 2-Tミノピリジン溶液は 2 -ァミノピリジン lgに対し HC1 760 μ 1を加え（I X PA溶 液)、 その溶液を逆浸透精製水で 10倍に希釈したものを用いた （10倍希釈 PA溶 液)。 シアン化水素化ホウ素ナトリゥム溶液は、 シアン化水素化ホウ素ナトリウム
10mgに対し 1 XPA溶液 20 μ 1、 逆浸透精製水 430 /z l を加えて調製した。 試料に 10倍希釈 PA溶液を 67 μ 1入れて 100°C、 15分間反応させ、 放冷後にシアン化水 素化ホウ素ナトリゥム溶液を 2 1入れて 90°C、 12時間反応させて試料糖鎖を蛍 光標識した。 蛍光標識した糖鎖群 （PA化糖鎖群） を、 Surperdex Peptide HR 10/30 カラム （Pharmacia社製） を用いて過剰な試薬と分離した。 溶離液は lOmM 炭酸水素アンモ-ゥム、 流速は 0. 5ml/分、 カラム温度は室温、 蛍光検出器は励 起波長 320nm、 蛍光波長 400nmで行なった。 試料添加後 20分から 30分の溶出液 を回収し、 遠心濃縮機にて乾固させ、 精製 PA化糖鎖群とした。 次に、 CLC - 0DS力 ラム （Shimadzu社製 φ 6· 0ηηιΧ 150ηιη) を用いて、 精製 ΡΑ化糖鎖群の逆相 HPLC分 析を行った。 カラム温度は 55°C、 流速は lml/ml、 蛍光検出器は励起波長 320nm、 蛍光波長 400nmで行なった。 10mM リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH3. 8)でカラムを平 後 Ϊィ匕し、 0. 5%1 -ブタノールの直線濃度勾配にて 80分間溶出した。 各 PA化糖鎖の 同定は、 分取した各 PA化糖鎖のピークのマトリックス支援レーザーィオン化飛行 時間型質量分析 （MALDI- T0F-MS分析） におけるポストソース分解 （Post Source Decay) 分析、 TaKaRa社製 PA化糖鎖スタンダードとの溶出位置の比較、 並びに各 種酵素を用いて各 PA化糖鎖を消化後、 逆相 HPLC分析により行なった。 糖鎖含量 は、 逆相 HPLC分析における各 PA化糖鎖のピーク面積より算出した。 還元末端が N-ァセチルダルコサミンでない PA化糖鎖は、 不純物由来であるか、 PA化糖鎖調 製中の副反応物であるため、 ピーク面積の算出から除外した。 HPLC の分析チヤ一 トを第 3図に示す。 緩衝液 A としてリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH3. 8)、 緩衝液 B として 0. 5%卜プタノールを含むリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH3. 8) を用い、 以下 のグラジェントで分析した。
時間 （分） 0 80 90 90. 1 120
緩衝液 B (%) 0 60 60 0 0 なお、 第 3 図で示した①〜⑧のピークは、 以下の構造 （1)〜（8) にそれぞれ対 応する。 (1)
GlcNAc )S l-2Man of 1
、6 ManiS 1 -4GlcNAcS 1 -4GlcNAc-PA
GlcNAc /Sl-2Manafl 7
(2)
Gal jS 1— 4GlcNAc β l-2Man 1
\ Man β 1 - 4GlcNAc β 1 - 4GlcNAc - PA
GlcNAc β l-2Manノ
(3)
6 Man l-4GlcNAqg l-4GlcNAc-PA
Gal^ l-4GlcNAqg l-2Manar
(4)
Gal β l-4GlcNAc β l-2Man a 1
\ '6 Man β l-4acNAc β l-4GlcNAc一 PA
Gal 1— 4GlcNAc β 1 - 2Man
Figure imgf000084_0001
(5)
GlcNAc β 1 - 2Man « 1 Fuc \
\ 6
6 Man β 1一 4GlcNAc β 1一 4QcNAc 一 PA
GlcNAc β 1一 2Man 1 '
(6)
Gal jS 1- 4GlcNAc β 1一 2Man a U Fuc a \
\, 6
6 Man 1一 4GlcNAc β 1 - 4GlcNAc 一 PA
GlcNAc β 1一 2Man a l '
(7)
GlcNAc β 1一 2Man a 1 v Fuc \
V 6
6 Man β 1一 4QcNAc β 1 - 4GlcNAc 一 PA
Gal β 1- 4GlcNAc β 1一 2Man V (8)
Gal β 1 -4GlcNAc β 1一 2Manび
Figure imgf000084_0002
GlcNAc -PA
Gal β 1 -4GlcNAc β 1 -2 an a 1
GlcNAcは N-ァセチルダルコサミン、 Gal はガラクトース、 Manはマンノース、 Fucはフコース、 PAはピリジルァミノ基を示す。 第 3図において、 al，6-フコー スを持たない糖鎖群の割合は、 ①〜⑧のうち①〜④のピークが占める面積、 ひ 1， 6-フコースが結合した糖鎖群の割合は、 ①〜⑧のうち⑤〜⑧のピークが占める 面積から算出した。 その結果を第 1表に示す。 抗体 CK I, 6-フコ -スを持たない糖鎖の割合 （％)
CHO/GDPft Δ 30-CCR4抗体 35
CHO/pcDNA- CCR4抗体 10 ピーク面積から計算すると、 CHO/GDPft Δ 30- CCR4抗体の α 1, 6-フコースのない 糖鎖含量は 35%、 a 1， 6-フコースが結合した複合型糖鎖の割合は 65%であった。 CHO/pcDNA- CCR4抗体の a 1, 6-フコースのない糖鎖含量は 10%、 a 1， 6-フコースが 結合した複合型糖鎖の割合は 90%であった。
以上の結果から、 導入した GDP -フコーストランスポーターの N末端欠失体は GDP-フコーストランスポーターのドミナントネガティブ体として働き、 産生抗体 の α 1， 6-フコースが結合した複合型糖鎖の割合を低下させることが可能であるこ とが分かった。 実施例 2. チャイニーズハムスター細胞からの GDP-フコーストランスポーター遺 伝子の単離
(1) CH0/DG44細胞由来全 R Aの抽出
CH0/DG44 細胞 [G. Urlaub and L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980) ] を、 10%ゥシ胎児血清 （l fe Technologies社製） およ び 1 倍濃度の HT supplement (Life Technologies社製） を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製） に懸濁し、 2 X 106個/ ml の密度で接着細胞培養用 T75 フラスコ （Greiner社製） に 15ml播種した。 37°Cの 5%C02インキュベーター内で 培養し、 培養 2 日目に I X 107個を回収後、 RNAeasy (QIAGEN社製）により添付の説 明書に従って全 RNAを抽出した。
(2) CH0/DG44細胞由来全一本鎖 cDNAの調製
上記 (1) で調製した全 RNAを 45 μ ΐの滅菌水に溶解し、 RQ1 RNase-Free DNase (Promega 社製） 1 μ 1 , 付属の 10 X DNase buffer 5 μ 1、 RNasin Ribonuclease inhibitor (Promega社製） 0. 5 / l をそれぞれに添カ卩して、 37°Cで 30分間反応さ せることにより、 試料中に混入したゲノム DNA を分解した。 反応後、 RNAeasy (QIAGEN社製）により全 R Aを再精製し、 50 μ 1の滅菌水に溶解した。
得られた各々の全 ΚΝΑ3 μ 1 に対し SUPERSCRIPT™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Life Technologies社製） を用いて添付の説明書に従い、 ォ リゴ (dT)をプライマーとした 20 ^ 1 の系で逆転写反応を行うことにより、 一本鎖 cDNAを合成した。 PCRクローユングには該反応液の 50倍希釈水溶液を使用した。 使用するまで- 80°Cで保管した。
(3) ヒ ト /チャイニーズハムスター卵巣細胞 （CHO) キメラ GDP -フコーストランス ポーター cDNAの取得
上記 (2) で作製した CH0/DG44由来一本鎖 cDNAに対し、 実施例 1の （1) に記 載したヒト GDP-フコーストランスポーター配列に基づいて設計したプライマーセ ット GDPfT- Fw Primerと GDPfT- Rv Primer (配列番号 5および配列番号 6) を用い てポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行ないプライマー部分がヒト GFT配列、 増幅部 分が CHO配列となるキメラ GDP-フコーストランスポーターを増幅した。 PCR は ExTaq (宝酒造社製） を用いて CH0/DG44由来一本鎖 cDNAを 1 1を含む 25 z 1の 反応液 [ExTaq buffer, 0. 2raM dNTPs、 Ο. δ μ Μ上記遺伝子特異的プライマーセッ ト]を調製し、 94°Cで 5分間の加熱の後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 1 分間からなる反応を 1サイクルとして 30サイクルの後、 さらに 72°Cで 5分間加 熱する条件で行った。 PCR終了後、 反応液を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、 特異的增幅断片約 l lOObp を GENECLEAN SPIN Kit (BIOIOI 社製） を用いて精製 (以下、 ァガロースゲルからの DNA断片の精製にはこの方法を用いた） し、 滅菌水 20 1で溶出した。 上記増幅断片 9 μ 1を Ligation High (東洋紡績社製） を用い た 20 μ 1の反応系で T7blue T- Vector 50ngとの連結反応を行ない、 該反応液 2 μ 1 を用いて大腸菌 DH5ひをコーェンらの方法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ · ナショナノレ ·アカデミー .ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A) , 69, 2110 (1972) ] (以下、 大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた） により形質 転換した。 得られた複数のアンピシリン耐性コロニーから、 公知の方法 [ヌクレ イツク 'ァシッド ' リサーチ （Nucleic Acids Research) , 7, 1513 (1979) ] (以 下、 プラスミドの単離方法にはこの方法を用いた）に従って、 プラスミド DNAを単 離した。 インサートの有無は、 ァガロースゲル電気泳動によるサイズ比較により 確認し、 塩基配列は DNAシークェンサ一 377 (Perkin Elmer社製） および Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit (Perkin Elmer社製) ¾" 使用して添付のマニュアルに従い決定した。 決定した 4つのクローンの塩基配列 を比較し、 PCR に伴う塩基の読み誤りを除いた後、 本法より決定した挿入 DNA力 S ヒト /CHO キメラ GDP-フコーストランスポーターをコードしていることを確認し た。
(4) RACE用一本鎖 cDNAの合成
上記 （1) で抽出した CH0/DG44全 RNAからの 5' RACEおよび 3' RACE用一本鎖 cDNAの作製を、 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH社製） を用いて、 添付の説明書に従って行った。 ただし PowerScript™ Reverse Transcriptase (CLONTECH社製） を逆転写酵素として用いた。 調製後の一本鎖 cDNAは各々、 キッ ト添付の Tricin- EDTA buffer で 10倍に希釈したものを PCRの铸型として用いた。
(5) RACE 法によるチャイニーズハムスター GDP-フコーストランスポーターの非翻 訳領域塩基配列の決定
上記 （3) で決定したヒト /CH0 キメラ GDP-フコーストランスポーター塩基配列 をもとにチャイニーズハムスター GDP-フコーストランスポーターに特異的な 5，RACE用プライマー CH0#GFT#GSP5' -1 (配列番号 9) および CH0#GFT#GSP5， - 2 (配 列番号 ιο)、 チャイニーズハムスター GDP -フコーストランスポーター特異的な 3' RACE 用プライマー CH0#GFT#GSP3，- 1 (配列番号 11) および CH0#GFT#GSP3， -2 (配列番号 12) を設計した。
次に Advantage2 PCR Kit (CLONTECH社製）を用いて、 本実施例 （4) で調製した CH0/DG44由来 RACE用一本鎖 cDNAを 1 1 を含む 50 μ ΐ の反応液 [Advantage2 PCR buffer (CLONTECH社製）、 0. 2mM dNTPs、 0. 2 μ mol/1 チヤイエーズハムスタ 一 GDP-フコーストランスポーター特異的 RACE用プライマー、 1倍濃度の共通プラ イマ一 （CLONTECH社製）] を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行った。 PCRは 94°Cで 5秒間、 64。Cで 10秒間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルと して 20サイクル繰り返す条件で行った。 反応終了後、 反応液より Ι μ ΐをテンプ レートとして使用し、 再度反応液を調製し、 同条件で PCR を行った。 1 回目およ び 2回目の PCRで用いたテンプレート、 プライマーの組み合わせおよび増幅され る DNA断片長を第 2表に示した。 2回目の PCR終了後、 反応液を 1%ァガロースゲ ル電気泳動に供し、 目的の特異的増幅断片を精製し、 滅菌水 20 1で溶出した。 上記、 5' RACEおよび 3' RACEにより取得した PCR産物の塩基配列は、 DNAシーク ェンサ一 377 (Parkin Elmer社製) および Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit (Perkin Elmer社製） を使用してダイレクトシークェン ス法により決定した。 方法は添付のマニュアルに従った。 チャイニーズハムスタ 一 GDP-フコーストランスポーターの ORFに隣接する 5'および 3，の非翻訳領域の塩 基配列について第 4図に示す。 チャイニーズハムスター GDP-フコーストランスポーター c DNARACEに用いた プライマーの組み合わせと PCR産物の長さ
PCR増幅産物のサイズ
5' RACE 特異的プライマー 共通プライマ一
(予測値） PGR GFT_GSP5'-1 UPM(ljnivarsaj. primer mix)
2nd PGR GFT_GSP5'-2 NUP(Nested Universal primer) 約 550bp (280bp以上）
PCR增幅産物のサイズ
3' RACE 特異的プライマー 共通プライマー
(予測値）
1st PGR GFT_GSP3'-1 UPM(Univars al rimer mix
2nd PGR GFT_GSP3'-2 NUP(Nested Univarsal primer) 約 OObp (270bp以上）
(6) チャイニーズハムスター GDP-フコース トランスポーターの全長 cDNA のクロ 一二ング
まず、 本実施例 （5) で決定した GDP-フコーストランスポーターの非翻訳領域 の塩基配列に基づいて、 チャイニーズハムスター GDP-フコース トランスポーター .特異的増幅用プライマーセット、 CH0#GFT#FW (配列番号 13) および、 CH0#GFT#RV (配列番号 14) を設計した。 次に KOD DNA ポリメラーゼ （東洋紡績社製） を用い て、 本実施例 （2) で調製した CH0/DG44由来一本鎖 cDNAを 1 i lを含む 20 /i 1の 反応液 [KOD buffer, 0. 2mM dNTPs、 1. 6mM MgCl2、 0. 5 M上記遺伝子特異的プラ イマ一 （CH0#GFT#FWおよび CH0#GFTffRV) ]を調製し、 94°Cで 5分間の加熱の後、 94°Cで 5秒間、 60°Cで 10秒間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとして 30サイクル繰り返す条件で PCRを行った。 独立した系で 4回の PCRを実施後、 そ れぞれの反応液を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、 特異的増幅断片約 1250bp を GENECLEAN SPIN Kit (BIOIOI社製） を用いて精製し、 滅菌水 20 1で溶出した。 上記増幅断片 4^ 1を Ligation High (東洋紡績社製） を用いた 20 ^ 1の系で PCR -blunt vector (invitrogen社製） 5ng との連結反応を行ない、 該反応液 2 μ 1 を 用いて DH5 "を形質転換した。 得られた複数のカナマイシン耐性コロニーからプ PC聽麵 6 ラスミド DNAを単離し、 約 lOOngを EcoRI消化後、 ァガロースゲル電気泳動に供 しインサートの存在を確認した。 クローユングした PCR増幅断片の塩基配列は DNA シークェンサ一 377 (Perkin Elmer社製） および Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit (Perkin Elmer社製） を使用して決定した。 本法より配列決定したチャイニーズハムスターの GDP-フコーストランスポーター cDNAについて配列番号 1 に示した。 さらに、 決定した全長 cDNA配列中に存在す る ORF (塩基番号 117番〜 1214番） より推定されるチャイニーズハムスターの GDP-フコーストランスポーターアミノ酸配列 （365 アミノ酸） を配列番号 2 に示 した。 実施例 3. GDP-フコーストランスポーターを標的とした siRNA発現プラスミド導 入細胞の作製と該細胞を用いた抗体組成物の生産
1 . GDP-フコース トランスポーターを標的とした siRNA 発現プラスミ ド U6_GFT_H_puroの構築
(1) RNAiの標的とする CH0由来遺伝子塩基配列の選別
配列番号 16に示した 19塩基を RNAiの標的配列とした。 該配列は実施例 2で取 得したチャイニーズハムスター由来 GDP -フコーストランスポーター cDNA (配列番 号 1) に示された塩基配列の 803番目から 821番目に相当する。 該配列を標的と したショートインターフェアリング R A (以下、 siRNA と記載する） を siRNA_GFT_H と称す。 以下に siRNA— GFT_H を動物細胞内で発現するプラスミ ド U6_GFT_H_puro の構築方法を記載する。 なお、 該発現プラスミ ドの基本構造は Miyagishi らの方法 [ネイチヤー 'バイオテクノロジー （Nat. Biotechnol. ) , 20, 5 (2002) ] に準じて設計した。
(2) プラスミド U6— Pre_senseの構築
以下の手順でプラスミド U6_pre一 senseを構築した （第 5図）。 GenBankに登録 されているヒト U6 snRNP遺伝子配列 （GenBank No. X07425および M14486) より 設計したプライマー （配列番号 17 および配列番号 18) を用いてポリメラーゼ連 鎖反応 （PCR) を行ない、 ヒ ト U6 snRNP遺伝子のプロモーター領域を増幅した。 PCRは Human Genomic DNA (クロンテック社製） を 200ng含む 50 μ Lの反応液 [1 X EX Taq Buffer (宝酒造社製）、 0. 2raMの dNTP， s、 2. 5単位の EX Taq polymerase (宝酒造社製）、 0. 5 μ Μの上記プライマー （配列番号 17および配列番号 18) ] を調 画細 06 製し、 GeneAmp PGR system 9700 (パーキンエルマ一社製） を用いて 94。Cにて 5 分間加熱した後、 94°Cにて 1分間、 68°Cにて 2分間のサイクルを 30サイクル行な つた
この PCR液をフエノール/クロ口ホルム抽出した後、 エタノール沈殿法により PCR増幅断片を回収した。 この増幅断片を 1 (宝酒造社製） で切断後、 フエノ ール /クロ口ホルム抽出を行ないエタノール沈殿法により DNA断片を回収し、 次に
BamHI (宝酒造社製） で切断した。 該反応溶液をァガロースゲル電気泳動後、 約 300bpの DNA断片を Gel Extraction Kit (キアゲン社製） を用いて精製した。 回 収した DNA断片は DNA Ligation Kit (宝酒造社製） を用いて、 あらかじめ ^§1 (宝酒造社製） および ^ ϊΗΙ (宝酒造社製） で切断した pBluescript SK (-)ベクタ 一 （STRATAGENE社製） に連結し、 得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） をコーェンらの方法 [プロシーデイングス 'ォブ ·ザ · ナショナノレ 'アカデミー 'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 69, 2110 (1972) ] (以下、 大腸菌の形質転換はこの方法を用いた） により形質転 換した。 得られた複数のアンピシリン 1"性コロニーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社製） を用いて組換えプラスミド DNAを単離した。 プラスミドに含 まれる U6 プロモーター塩基配列を、 DNA シークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキ ンエルマ一社製） を用い、 常法に従って決定した。 決定したクローンより PCR に 伴う塩基の変異が生じていないプラスミドを選択し、 U6一 pre— senseと命名した。
(3) プラスミ ド pBS_BglIIの構築
以下の手順でプラスミド pBS_BglIIを構築した （第 6図）。 配列番号 19および 配列番号 20に示す合成オリゴ DNA (5'末端をリン酸ィヒしている） を各 lOpmolず つ蒸留水に溶解し、 90°Cで 10分間熱したのち室温に戻るまで放置しァエーリング させた。 該反応液よりアニーリングした合成オリゴ 0. ¾)mol を、 DNA Ligation Kit (宝酒造社製） を用いて、 あらかじめ £l (宝酒造社製） で切断した pBluescript SK (-）ベクター （STRATAGENE社製） に連結し、 得られた組換えプラ スミド DNA を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換した。 得られた 複数のアンピシリン而ォ性コロニーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社 製） を用いて組換えプラスミド DNA を単離した。 各クローンの中から Mil (宝 酒造社製） で切断されるプラスミドを選択し、 pBS_BglIIと命名した。 (4) プラスミ ド U6— pre— anti senseの構築
以下の手順でプラスミド U6— pre— anti senseを構築した （第 7図）。 GenBankに 登録されているヒ ト U6 snRNP 遺伝子配列 （GenBank Accession No. X07425, M14486) より設計したプライマー （配列番号 21 および配列番号 22) を用いてポ リメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行ない、 ヒ ト U6 snRNP遺伝子のプロモーター領域 を增幅した。 PCRは Human Genomic DNA (クロンテック社製） を 200ng含む 50 L の反応液 [1 XEX Taq Buffer (宝酒造社製）、 0. 2mMの dNTP， s、 2. 5単位の EX Taq polymerase (宝酒造社製）、 0. 5 μ Mの上記プライマー （配列番号 21および配列番 号 22) ] を調製し、 GeneAmp PCR system 9700 (パーキンエルマ一社製） を用いて 94°Cにて 5分間加熱した後、 94°Cにて 1分間、 68°Cにて 2分間のサイクルを 30サ イクノレ行なった。
この PCR液をフエノール/クロ口ホルム抽出した後、 エタノール沈殿法により PCR増幅断片を回収した。 この増幅断片を (宝酒造社製） で切断後、 フエノ ール /クロ口ホルム抽出を行ないエタノール沈殿法により DNA断片を回収し、 次に
EcoRI (宝酒造社製） で切断した。 該反応溶液をァガロースゲル電気泳動後、 約 300bp の DNA断片を Gel Extraction Kit (キアゲン社製） を用いて精製した。 回 収した DNA断片は DNA Ligation Kit (宝酒造社製） を用いて、 あらかじめ g§ I (宝酒造社製） および i^RI (宝酒造社製） で切断したプラスミ ド pBS_BglIIに連 結し、 得られた組換えプラスミド DNA を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換した。 得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社製) を用いて組換えプラスミド DNA を単離した。 ブラ スミ ドに含まれる U6 プロモーター塩基配列を、 DNA シークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンエルマ一社製） を用い、 常法に従って決定した。 決定したクローン よ り PCR に伴う塩基の変異が生じていないプラス ミ ドを選択し、 U6— pre— antisenseと命名しに。
(5) プラスミ ド U6-sense—Hの構築
以下の手順でブラスミド U6_sense— Hを構築した （第 8図）。 配列番号 23およぴ 配列番号 24に示す合成オリゴ DNA (5'末端をリン酸ィヒしている） を各 lOpmolず つ蒸留水に溶解し、 90°Cで 10分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリング させた。 該反応液よりァニーリングした合成オリゴ 0. 2pmol を、 DNA Ligation Kit (宝酒造社製） を用いて、 あらかじめ PmaCI (宝酒造社製） および BaraHI (宝 酒造社製） で切断したプラスミド U6_pre— senseに連結し、 得られた組換えプラス ミド DNA を用いて大腸菌 DH5ひ株 （東洋紡績社製） を形質転換した。 得られた複 数のアンピシリン ¾·性コロニーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社 製） を用いて組換えプラスミド DNA を単離した。 プラスミドに含まれる合成オリ ゴ由来の塩基配列を DNA シークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンエルマ一社製） を用い、 常法に従って決定した。 決定したクローンより配列番号 23および配列番 号 24 の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、 U6— sensejl と命名し た。
(6) プラスミ ド U6_ant i sense— Hの構築
以下の手)噴でプラスミド U6— ant i sense— Hを構築した （第 9図）。 配列番号 25お よび配列番号 26に示す合成ォリゴ DNA (5'末端をリン酸ィ匕している） を各 lOpmol ずつ蒸留水に溶解し、 90°Cで 10分間熱したのち室温に戻るまで放置しァニーリン グさせた。 該反応液よりアニーリングした合成オリゴ 0. 2pmol を、 DNA Ligation Kit (宝酒造社製） を用いて、 あらかじめ E CI (宝酒造社製） および ^ RI (宝 酒造社製） で切断したプラスミド U6— pre_antisenseに連結し、 得られた組換えプ ラスミ ド DNA を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換した。 得られ た複数のアンピシリン而村生コロニーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン 社製） を用いて組換えプラスミド DNA を単離した。 プラスミドに含まれる合成ォ リゴ由来の塩基配列を DNA シークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンエルマ一社 製） を用い、 常法に従って決定した。 決定したクローンより配列番号 25およぴ配 列番号 26 の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、 U6_antisense_H と命名した。
(7) プラスミ ド U6_GFT_Hの構築
以下の手順でプラスミ ド U6_GFT_H を構築した （第 10 図）。 プラスミ ド U6— ant i sense— Hを (宝酒造社製） で切断後、 フエノール/クロ口ホルム抽出 を行ないエタノール沈殿法により DNA断片を回収し、 次に JI (宝酒造社製） で切断した。 該反応溶液をァガロースゲル電気泳動後、 約 370bp の DNA断片を Gel Extraction Kit (キアゲン社製） を用いて精製した。 回収した DNA 断片は DNA Ligation Kit (宝酒造社製） を用いて、 あらかじめ (宝酒造社製） およ び ^SHI (宝酒造社製） で切断したプラスミド U6_senSe_Hに連結し、 得られた組 換えプラスミド DNA を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換した。 得られた複数のアンピシリン耐性コロエーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キ ァゲン社製） を用いて組換えプラスミド DNA を単離した。 プラスミドに含まれる 塩基配列を DNAシークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンエルマ一社製） を用い、 常法に従って決定した。 決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミ ドを選択し、 U6_GFT— Hと命名した。
(8) プラスミ ド U6_GFT_H_puroの構築
以下の手順でプラスミド U6_GFT_H_puro を構築した （第 11 図）。 プラスミド U6_GFT_H を ΕχμΙΙ (宝酒造社製） で切断後、 該反応溶液をァガロースゲル電気泳 動に供し、 約 1150bp の DNA断片を Gel Extraction Kit (キアゲン社製） を用い て精製した。 回収した DNA断片は DNA Ligation Kit (宝酒造社製） を用いて、 あ らかじめ £Υ Π (宝酒造社製） で切断したプラスミド pPUR (クロンテック社製） に連結し、 得られた組換えプラスミド DNA を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社 製） を形質転換した。 得られた複数のアンピシリン耐性コ口-一より、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社製） を用いて組換えプラスミド DNAを単離した。 プラスミドに含まれる塩基配列を DNAシークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンェ ルマ一社製） を用い、 常法に従って決定した。 決定したクローンより目的の塩基 配列を有するプラスミドを選択し、 U6_GFT_H_puroと命名した。
(9) 直鎖化したプラスミド U6_GFT— H— puroの作製
プラスミド U6— GFTJL puroを制限酵素 £§βΙ (NEW ENGLAND BI0LABS社製） で切 断することにより直鎖化した。 切断後は反応液をァガロース電気泳動に供し、 該 プラスミドが正確に直鎖化されていることを確認した。
2. GDP-fucose transporter siRNA発現プラスミド U6_GFT— H_puro を導入した抗 体生産株の取得
(1) CH0/DG44細胞を宿主とした、 抗 CCR4キメラ抗体生産細胞の作製
抗 CCR4キメラ抗体発現べクター pKANTEX2160 (W001/64754に記載）の 4 gを 1. 6 X 106細胞の CH0/DG44細胞へェレクトロポレーション法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology) , 3， 133 (1990) ] により導入後、 10ml の IMDM- dFBS (10)— HT (1) [透析牛胎児血清 (以下、 dFBS と表記する；インビトロジェン社製）を 10%、 HT supplement (ィンビトロジェン社製）を 1倍濃度で含む IMDM培地（ィンビトロジ ェン社製）を] に懸濁し、 96ゥエル培養用プレート （旭テクノグラス社製） に 100 1/ゥエルずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°C、 24時間培養した後、 IMDM-dFBS (lO) (透析 FBSを 10%で含む IMDM培地） に培地交換し、 1〜2週間培養 した。 形質転換株のコ口ニーが出現し増殖の認められたゥヱノレより培養上清を回 収し、 上清中の抗 CCR4キメラ抗体の濃度を実施例 1. の （6) に記載の CCR4ぺプ チド固相化プレートを用いた ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥヱルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 MTXを 5 OnM 含む IMDM-dFBS (lO)培地に 1〜2 X 105細胞/ mlになるように懸濁し、 24ゥヱルプレ ート （旭テクノグラス社製） に 0. 5ml ずつ分注した。 5%C02インキュベーター内 で 37°Cで 1〜2週間培養して、 .50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 増殖 が認められたゥエルの形質転換株については、 上記と同様の方法により、 MTX 濃 度を 200nMに上昇させた。 最終的に MTXを 500nMの濃度で含む IMDM- dFBS (10)培 地で増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を発現する形質転換株を得た。 得られた形 質転換株を、 IMDM- dFBS (10)に 500nM MTXを添カ卩した培地に 0. 5細胞/ゥエルの密 度で懸濁し、 96 穴プレート （旭テクノグラス社製） に播種することにより、 限界 希釈法による単細胞分離を実施した。 37°Cで 2週間培養後、 各プレートを顕微鏡 で観察し、 シングルコロニーの増殖を確認したゥエルを拡大培養し、 抗 CCR4キメ ラ抗体を発現するクローンである、 32-05-09株を得た。
(2) 抗 CCR4キメラ抗体生産細胞への siRNA発現べクタ一 U6_GFT_H_puroの導入 本実施例第 1項で構築した siRNA発現ベクターを、 本実施例第 2項の （1) で作 製した 32-05-09株へ導入した。
siRNA発現ベクターの 32-05-09 株への導入は、 エレクトロポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で行った。 まず、 MTX を 500nMの濃度で含む IMDM_dFBS (10)培地で培養中の 32-05-09株をダルベッコ PBS (K-PBS緩衝液 [137腿 ol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5mmol/l KH2P04、 4. 0膽 ol/l MgCl2] に懸濁して 8 X 106個/ mlとし、 細胞懸濁液 200 1 (1. 8 X 106個） を本実施例第 1項で調製した線状化プラスミド lO ^u g と混和した。 細 胞- DNA混和液を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BIO- RAD社製） へ移し た後、 細胞融合装置 Gene Pulser (BIO- RAD社製） を用いてパルス電圧 0. 35KV、 電気容量 250 μ Fの条件で導入を行つた。
この細胞懸濁液を 30ml の基本培地 （10%ゥシ胎児透析血清 （Invitrogen社製） および 50 g/ml Gentamycin (ナカライテスタ社製） を添加した Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium (Invitrogen社製）） に混和し、 3枚の組織培養用 96 穴プレート （旭テクノグラス社製） に、 100 μ ΐ7ゥエルで分注した。 5%C02、 37°Cの条件下で 24 時間培養した後に培地を吸引除去し、 12 μ §/ηι1 puromycin (SIGMA社製） を添加した基本培地を 100 ゥエルで分注した。 引続き 6 日間培 養後に培地を吸引除去し、 0. 4rag/ml LCA (Lens Curinalis Aggulutinin) (Vector 社製）と 12 μ g/ml puromycin (SIGMA社製） を添加した基本培地を 100 L/ゥエル で分注した。 引続き 10日間培養することにより生き残った株を取得した。 なお、 これら生き残った株については、 実施例 1· の （6) に記載の CCR4ペプチド固相 化プレートを用いた ELISA法により、 培養上清中の抗 CCR4キメラ抗体の発現を確 n&し/し。
取得した株をトリプシン処理して培養器より剥離させ、 組織培養用 24穴プレー ト （旭テクノグラス社製） へ移植し、 12g/ml puromycin (SIGMA社製） を添加し た基本培地を用いて 5 日間培養した。 培養後、 上記プレート各ゥエル中の各株に 対し、 12 Ai g/tnl puromycin (SIGMA社製） を添加した基本培地を用いて、 組織培 養用フラスコ （旭テクノグラス社製） へ拡大培養を行いった。 このようにして取 得した、 siRNA発現ベクター U6一 GFT— H_puro導入株の一株を 32-05- 09- H12株と名 付けた。 なお、 32-05- 09- H12株は、 32- 05-09- H12株の細胞名で、 平成 15年 3月 27 日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県 つくば巿東 1丁目 1番地 中央第 6) に FERM BP- 8345として寄託されている。
3. GDP-フコーストランスポーターを標的とした siRNA_GFT_H導入株における GDP フコーストランスポーター mRNA量の測定
本実施例第 2項で得た 32- 05 - 09 - H12株を 12 ^ g/ml puromycin (Sigma社製） を 添加した基本培地に 3χ105細胞 /mlの細胞密度で懸濁し、 接着細胞用 T75フラスコ (Greiner社製） に播種して 3 日間培養した。 トリプシン処理により各細胞懸濁液 を回収し、 懸濁液に対し 1200rpm、 4°Cの条件で 5分間の遠心分離を行って上清を 除去した。 ダルベッコ PBS (Invitrogen社製） に懸濁し、 再度 1200rpm、 4°Cの条 PC漏舰 06 件で 5分間の遠心分離を行った後、 - 80°Cで凍結した。 siR A発現プラスミドを導 入していない親株 32-05-09株についても同様の操作を行い、 凍結細胞を調製した。 調製した凍結細胞を室温で融解後、 RNAeasy (QIAGEN社製） を使用し全 RNA を 抽出した。 方法は添付の説明書に従った。 全 RNAを 45 ^ 1の滅菌水に溶解し、 RQ1 RNase- Free DNase (Promega社製） 1 1、 付属の lO X DNase buffer 5 μ 1 , RNasin Ribonuclease inhibitor (Promega社製） 0. 5 μ 1 をそれぞれに添加して、 37°Cで 30分間反応させることにより、 試料中に混入したゲノム DNAを分解した。 反応後、 RNAeasy (QIAGEN社製） により全 RNAを再精製し、 40 1の滅菌水に溶解した。 得られた各々の全 RNAS w g に対し、 SUPERSCRIPT™ Preamplif ication System for First Strand cDNA Synthesis (Life Technologies社製） を用いて添付の説 明書に従い、 オリゴ (dT) をプライマーとした 20 μ 1の系で逆転写反応を行うこと により、 一本鎖 cDNAを合成した。
次に、 配列番号 1に示したチャイニーズハムスター GDP -フコーストランスポー ター cDNAの塩基番号 799番から 1108番の領域を増幅するよう設計したプライマ 一セット h_GFT— fw4 (配列番号 27) およぴ GFT_rv2 (配列番号 28) を用い、 100 倍に希釈した cDNA溶液を铸型として PCRを行なった。 すなわち、 20 しの反応液 [1 X EX Taq Buffer (宝酒造社製）、 0. 2mM の dNTP， s、 2. 5 単位の EX Taq polymerase ホットスタートバージョン （宝酒造社製）、 0. 5 ^ M の上記プライマー (配列番号 27および配列番号 28) ]を調製し、 GeneAmp PCR system 9700 (パーキ ンエルマ一社製） を用いて 94°Cにて 3分間加熱した後、 94°Cにて 1分間、 60°Cに て 1分間、 72°Cにて 2分間のサイクルを 32サイクル行なった。 PCR溶液のうち、 7ul を 1. 75%ァガロースゲル電気泳動に供した後、 ゲルを 1倍濃度の SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Molcular Probes社製） に 30分間浸漬し染色し、 フル ォロイメージヤー （Fluorlmager ; Molecular Dynamics社製） で PCRで増幅させ た DNA量を測定することで、 GDP -フコーストランスポーターの mRNA発現量を比 較した。 また、 GDP -フコーストランスポーターの raRNA量を測定した際に鎳型と して用いた一本鎖 cDNA と同量の一本鎖 cDNA を用い、 TO00/61739記載の競合的 PCR による転写量の定量方法に従い、 β -ァクチン mRNA発現量についても測定し 比較した。
上記の方法により、 32-05-09株おょぴ 32- 05- 09- H12株で発現する GDP-フコー ストランスポーターと j8 -ァクチンの mRNAを比較した結果について第 I2図に示し た。 独立した 3回の PCRにおいて、 比較した 2株の間で ]3 -ァクチンの mRNA量に 変化はなかったが、 32- 05- 09-H12株において GDP-フコーストランスポーター mRNA の発現量が有意に減少していることが示された。
4. GDP-fucose transporter を標的とした siRNA発現プラスミドを導入株が生産 する抗体組成物の取得
取得した 32- 05- 09- H12株および 32-05-09株が生産する抗 CCR4キメラ抗体の取 得を以下の手順で行つた。
32 - 05- 09- H12株を、 g/ml puromycinを添加した基本培地へ 3 X 105個/ mlの 密度で懸濁後、 30mlを接着細胞培養用 T182フラスコ （Greiner社製） へ播種し、 100%コンフルェントになるまで培養した 32-05-09株も、 puromycin未添加基本 培地を使用した以外は上記と同様に培養した。 各株の培地全量を除去して、 PBS (Invitrogen社製） を同量入れてから再度除去することで洗浄し、 EXCELL301培地 (JRH Biosciences社製） 30mlへ交換した。 さらに 7日間培養後、 各細胞懸濁液を 回収した。 懸濁液に対し 3000rPm、 4°Cの条件で 10分間の遠心分離を行って上清 を回収した後、 0. 22 ram孔径 PES Membrane (旭テクノグラス社製） を用いて濾過 した。
0. 8cm径のカラムに Mab Select (Amersham Pharmacia Biotech社製） 0. 5ml を 充填し、 精製水 3. 0ml および 0. 2mol/l ホウ酸- 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH7. 5) 3. 0mlを順次通筒した。 さらに、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 (pH3. 5) 2. 0mlおよび 0. 2raol/l ホウ酸- 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH7. 5) 1. 5mlで順次洗浄することによ つて担体の平衡化を行つた。 次に、 上記濾過処理した培養上清 30mlをカラムに通 筒した後、 0. 2mol/l ホウ酸 - 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH7. 5) 3. 0mlで洗浄した。 洗浄後、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 (pH3. 5) 1. 25ml を用いて担体に吸着した抗体 の溶出を行った。 始めに溶出する 0. 25mlの画分を廃棄し、 次に得られる溶出画分 lmlを回収して 2mol/l Tris - HC1 (pH8. 5) 0. 2 ml と混合して中和した。 このよう にして取得した抗体組成物を含む溶出液に対し、 lOmol/Ι クェン酸- 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH6. 0) を用いて 4°Cで一昼夜透析を行った。 透析後、 抗体溶液を回 収し、 0. 22職孔径 Mi Ilex GV (MILLIP0RE社製） を用いて滅菌濾過した。 PC漏舰 06
5. GDP-fucose transporter を標的とした siRNA発現プラスミド導入株が生産す る抗体組成物の単糖組成分析
本実施例第 4項で精製した抗 CCR4キメラ化抗体に対し、 公知の方法 [ジャーナ ノレ ·ォブ · リキッド ·クロマトグラフィー (Journal of Liquid Chromatography) , 6, 1577 (1983) ] に従って単糖組成分析を行った。 表 3 に各抗体の単糖組成比よ り計算される、 全複合型糖鎖に占める、 フコースを持たない複合型糖鎖の割合を 示した。 siRNA導入に供した親株 32-05-09株の生産する抗体のフコースを持たな い糖鎖の割合が 8%であったのに対し、 siRNA導入株 32- 05- 09_H12株の生産する 抗体のフコースを持たない糖鎖は. 56%となり、 フコースを有さない糖鎖の割合が 有為に上昇していることが示された。
以上の結果より、 GDP- fucose transporterを標的とした siRNAの導入により、 宿主細胞の生産する抗体における複合型糖鎖のフコース修飾を制御できることが 示された。
6. GDP-fucose transporter を標的とした siRNA発現プラスミド導入株が生産す る抗体組成物の生物活性
本実施例第 4項で精製した抗 CCR4 キメラ化抗体の生物活性を、 実施例 1. の (7) に記載の ADCC活性の測定方法おょぴ実施例 1. の （6) に記載の抗原結合活 性の測定方法に従って測定した。 その結果を第 3表に示す。 親株 32- 05- 09株の生 産する抗体と siRNA導入株 32-05-09-H12株が産生する抗体で抗原結合活性に違い は観察されなかったが、 ADCC活性は siRNA導入株 32-05-09-H12株が産生する抗 体の方が大幅に上昇していることが確認された。 第 3表 各株の産生する抗 CCR4キヌラ抗体のフコース非含有糖鎖の割合
株名 フコースを含まない糠鎖率 （％)
32-05-09 8%
32-05-09-H12 56% 産業上の利用可能性
本発明によれば、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関 与する蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞、 該細胞を用いた 抗体組成物の製造方法、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送 に関与する蛋白質の活性が低下または欠失するように、 ゲノムが改変されたトラ ンスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫、 該動物あるいは植物 から抗体組成物を製造する方法、 およぴ該抗体組成物を含有する医薬を提供する ことができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 5-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 6-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 7-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 8-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 9-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 10- -人工配列の説明 合成 DNA
酉己歹 I IJ番号 11- -人工配列の説明 合成 DNA
配列 IJ番号 12- -人工配列の説明合成 DNA
歹 I ij番号 13- -人工配列の説明 合成 DNA
配列 ¾番号 14- -人工配列の説明 合成 DNA
配歹 IIJJ番号 17- -人工配列の説明 合成 DNA
配列 (J:番号 18- -人工配列の説明合成 DNA
配列 IJ:番号 19· -人工配列の説明 合成 DNA
配列 IJ番号 20- -人工配列の説明 合成腿
配列 U番号 21- -人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 22· -人工配列の説明 合成 DNA
配列 IJ番号 23· -人工配列の説明 合成 DNA
配列 1J番号 24· -人工配列の説明 合成 DNA
配列 IJ番号 25· -人工配列の説明 合成 DNA
配列 IJ番号 26· -人工配列の説明 合成 DNA
配列 ij番号 27· -人工配列の説明 合成 DNA
配列 IJ番号 28· -人工配列の説明 合成賺
配列 IJ番号 33 -人工配列の説明 合成賺

Claims

請 求 の 範 囲
1. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞。
2. 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の活性が遺伝子工学的な手法により低下または欠失した請求の範囲 1 に記載の 細胞。
3. 遺伝子工学的な手法が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群か ら選ばれる手法である、 請求の範囲 2〜5のいずれか 1項に記載の細胞。
(a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
(b) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質のドミナントネガティブ体を導入する手法；
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質についての突然変異を導入する手法；
(d) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の転写または翻訳を抑制する手法。
4. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質のドミナントネガティブ体が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体 への輸送に関与する蛋白質の N末端欠失体である、 請求の範囲 3に記載の細胞。
5. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の N末端欠失体が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に 関与する蛋白質の N末端 30アミノ酸が欠失した N末端欠失体である、 請求の範囲 4に記載の細胞。
6. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の転写または翻訳を抑制する手法が、 RNAi (RNA interference) 法である、 請 求の範囲 3に記載の細胞。
7. RNAi 法が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれる RNAおよびその相捕 RNAで構成され、 かつ細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの ゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の mRNA量を減少させることが可能な 2本鎖 RNAを細胞内に導入または発現させる方法である、 請求の範囲 6に記載の細胞。 (a) 配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表される 塩基配列からなる DNAに対応する RNA；
(b) 配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表される 塩基配列からなる DNAに対応する RNA；
(c) 配列番号 29で表される塩基配列中連続した 10〜30 の塩基配列で表され る塩基配列からなる DNAに対応する RNA；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列中連続した 10〜30の塩基配列で表され る塩基配列からなる DNAに対応する RNA。
8. 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれる RNAおよびそ の相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAを細胞内に導入または発現させることで、 細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の mRNA 量を減少させた、 請求の範囲 6または Ίに記載の細胞。
(a) 配列番号 33で表される塩基配列からなる R A；
(b) 配列番号 33で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失ま たは付カ卩された塩基配列からなり、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ 体への輸送に関与する蛋白質に対して配列番号 33 と実質的に同一の RNAi活性を 有する RNA。
9. 2本鎖 RNAが、 請求の範囲 7または 8に記載の R Aに対応する DNAおよびその相 捕 DNAを組み込んだベクターにより細胞内へ導入される、 請求の範囲 7または 8に記 載の細胞。
10. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質が GDP -フコーストランスポーターである、 請求の範囲 1〜9のいずれか 1項に 記載の細胞。
11. GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 (c) , (d)、 （e)、 (f)、 （g) および （h)からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 請 求の範囲 10に記載の細胞。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNA；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNA； (e) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活 I1生を有する蛋白質を コードする DNA；
(f) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA とストリンジ ントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(g) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(h) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件- でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA。
12. GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （ 、 (f)、 （g)、 （h)、 （i)、 （j)、 （k) および ） からなる群から選ばれる蛋白質であ る、 請求の範囲 10に記載の細胞。
(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 31で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(d) 配列番号 32で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(e) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入おょひンまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(g) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入およびノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(h) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質； (i) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列 b a f h c d e s i jからなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(j) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(k) 配列番号 31 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(1) 配列番号 32 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
13. N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、 請求の範囲 1〜12のいずれか 1項に記載の細胞。
14. 少なくとも、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれ るレクチンの一つに耐性である、 請求の範囲 13に記載の細胞。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d) ヒィロチャワンタケレクチン。
15. 細胞が、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞おょぴ植物細胞からなる群から選ば れる細胞である、 請求の範囲 1〜14のいずれか 1項に記載の細胞。
16. 細胞が、 以下の （a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 （f )、 （g)、 （h)、 (i) および (j) からなる群から選ばれる細胞である、 請求の範囲 1〜15のいずれか 1項に記 載の細胞。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CHO細胞；
ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0-Agl 細胞；
シリアンハムスタ一腎臓組織由来 BHK細胞；
抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞；
ヒ ト白血病細胞株ナマルバ細胞；
胚性幹細胞；
受精卵細胞；
植物細胞。
17. 請求の範囲 1〜16のいずれか 1項に記載の細胞に、 抗体分子をコードす る遺伝子を導入した細胞。
18. 抗体分子が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれ る分子である、 請求の範囲 17に記載の細胞。
(a) ヒ ト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a) または （b) の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a) または （b) の Fc領域を有する融合蛋白質。
19. 抗体分子のクラスが IgGである、 請求の範囲 17または 18に記載の細胞。
20. · 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害 活性が高い抗体組成物である、 請求の範囲 17〜19のいずれか 1項に記載の細胞。
21. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 該抗体組成物中に含まれ る Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N- ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生 産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、 請求の範囲 20に記載の細胞。
22. 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複 合型糖鎖の 20%以上である請求の範囲 21に記載の細胞。
23. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 21に記載の細胞。
24. 請求の範囲 17〜23のいずれか 1項に記載の細胞を用いること特徴とする、 抗体組成物を製造する方法。
25. 請求の範囲 17〜23のいずれか 1項に記載の細胞を培地に培養し、 培養物 中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
26. 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害 活性が高い抗体組成物である、 請求の範囲 24または 25に記載の方法。
27. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 該抗体組成物中に含まれ る Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N - ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生 産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、 請求の範囲 に記載の方法。
28. 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複 合型糖鎖の 20%以上である請求の範囲 27に記載の方法。
29. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコ^"スの 1位が N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 27に記載の方法。
30. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の活性が低下または欠失するように、 ゲノムが改変されたトランスジエニック 非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
31. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の遺伝子がノックァゥトされた、 請求の範囲 30に記載のトランスジヱニック非 ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
32. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、 請求の範囲 31に記載 のトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
33. 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質が GDP-フコーストランスポーターである、 請求の範囲 30〜32のいずれか 1項 に記載のトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
34. GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 (c) , (d)、 （e)、 (f)、 (g) および （h) からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 請求の範囲 33に記載のトランスジェエック非ヒト動物あるいは植物、 またはその 子孫。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNA；
(d) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNA；
(e) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(f) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA とストリンジ ントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA； (g) 配列番号 29で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 でハイプリダイズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA；
(h) 配列番号 30で表される塩基配列からなる DNAとストリンジ工ントな条件 でハイブリダィズし、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質を コードする DNA。
35. GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a；)、 （b)、 (c) , (d)、 （e)、 (f)、 （g)、 （h)、 （i)、 （j)、 （k) および （1) からなる群から選ばれる蛋白質であ る、 請求の範囲 33に記載のトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物、 または その子孫。
(a) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 31で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(d) 配列番号 32で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(e) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付カ卩されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(g) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(h) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(i) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(j) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ 酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(k) 配列番号 31 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコーストランスポーター活性を有する蛋白質； W° 03/08 102 PC漏舰 06
(1) 配列番号 32 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
36. トランスジエニック非ヒト動物が、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 -ヮトリ、 サルおよびゥサギからなる群から選ばれる動物であ る、 請求の範囲 30〜35のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック非ヒト動物、 またはその子孫。
37. 請求の範囲 30〜36のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック非ヒト動 物あるいは植物、 またはその子孫に抗体分子をコードする遺伝子を導入した、 ト ランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
38. 抗体分子が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれ る分子である、 請求の範囲 37に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植 物、 またはその子孫。
(a) ヒ ト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a) または （b) の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a) または （b) の Fc領域を有する融合蛋白質。
39. 抗体分子のクラスが IgGである、 請求の範囲 37または 38に記載のトラ ンスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
40. 請求の範囲 37〜39のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック非ヒト動 物あるいは植物、 またはその子孫を飼育し、 飼育した動物あるいは植物から抗体 組成物を含む組織あるいは体液を取得し、 取得した組織あるいは体液から目的と する抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
41. 請求の範囲 35〜37のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック非ヒト動 物あるいは植物、 またはその子孫の抗体分子を産生する細胞を取得し、 取得した 抗体産生細胞を培地に培養し、 培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物 から抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
42. 抗体組成物がゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、 また はその子孫から得られる抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体 組成物である、 請求の範囲 40または 41に記載の方法。
43. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していな！/、糖鎖の割合が、 ゲノムが改変さ れていない非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫が産生する抗体組成物より 高いことを特徴とする、 請求の範囲 42に記載の方法。
44. 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -グリコシド結合複 合型糖鎖の 20%以上である請求の範囲 43に記載の方法。
45. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にひ結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 43に記載の方法。
46. 請求の範囲 24〜29のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体 組成物。
47. 請求の範囲 40〜45のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体 組成物。
48. 請求の範囲 46または 47に記載の抗体組成物を有効成分として含有する
49. 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 請求の範囲 48に記載の医薬。
50. 以下の （a) または （b) から選ばれる蛋白質。
(a) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポータ一活性を有する蛋白質。
51. 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA。
52. 配列番号 1に記載の全長あるいは一部 DNAを含む、 GDP-フコーストラン スポーターを標的とした相同組換えのためのターゲッ卜ベクター。
53. GDP -フコーストランスポーターの機能を阻害する蛋白質。
54. GDP-フコーストランスポーターの機能を阻害する蛋白質が、 GDP-フコー ストランスポーターのドミナントネガティブ蛋白質である、 請求の範囲 53に記載 の蛋白質。
55. GDP-フコーストランスポーターのドミナントネガティブ蛋白質が、 GDP- フコーストランスポーターの N末端欠失体である、 請求の範囲 54に記載の蛋白質。
56. GDP-フコーストランスポータ ^の N末端欠失体が、 GDP-フコーストラン スポーターの N末端 30アミノ酸が欠失した N末端欠失体である、 請求の範囲 55 に記載の蛋白質。
57. GDP-フコーストランスポーターが、 以下の （a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 (f)、 （g)、 （h)、 （i)、 （j)、 (k) および （1) からなる群から選ばれる蛋白質であ る、 請求の範囲 53〜56のいずれか 1項に記載の蛋白質。
(a) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 31で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(d) 配列番号 32で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(e) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付カ卩されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(g) 配列番号 31で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(h) 配列番号 32で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP -フコース トランスポーター活性を有する蛋白質；
(i) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(j) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(k) 配列番号 31 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
(1) 配列番号 32 で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ GDP-フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
58. 請求の範囲 53〜57のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする DNA。
59. 以下の（a)および (b)からなる群から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで 構成される 2本鎖 RNA。
(a) 配列番号 33で表される塩基配列からなる RNA ；
(b) 配列番号 33で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失ま たは付加された塩基配列からなり、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ 体への輸送に関与する蛋白質に対して配列番号 33 と実質的に同一の RNAi活性を 有する RNA。
60. 請求の範囲 59に記載の RNAに対応する DNAおよびその相補 DNA。
61. RNAに対応する DNAが配列番号 16で表される塩基配列からなる DNAである請 求の範囲 60に記載の DNA。
62. 請求の範囲 60または 61に記載の DNAおよびその相補 DNAをベクターに含む、 組換え体醒。
63. 請求の範囲 59に記載の 2本鎖 R Aを発現させるために構築されている、 請求の範囲 62に記載の組換え体 DNA。
64. 請求の範囲 62または 63に記載の組換え体 DNAを細胞に導入して得られる形 質転換体。
65. 請求の範囲 59に記載の 2本鎖 RNAを細胞内に導入または発現させること により、 N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 を作製する方法。
66. 2本鎖 R Aの細胞内への導入が、 請求の範囲 62または 63に記載の RNAの相補 DNAを組み込んだベクターの細胞内への導入である、 請求の範囲 65に記載の方法。
67. N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 が、 少なくとも、 以下の （ 、 （b)、 （c) および （d) からなる群から選ばれるレ クチンの一つに耐性を有する細胞である、 請求の範囲 65または 66に記載の方法。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d) ヒィロチャワンタケレクチン。
68. 細胞が、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ば れる細胞である、 請求の範囲 65~67のいずれか 1項に記載の方法。
69. 細胞が、 以下の （a)、 （b)、 （ 、 （d)、 （e)、 （f )、 (g) , (h)、 (i) および (j) からなる群から選ばれる細胞である、 請求の範囲 65〜68のいずれか 1項に記 載の細胞。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞；
(e) シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞；
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h) 胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞；
(j) 植物細胞。
70. 請求の範囲 48または 49に記載の医薬を製造するための、 請求の範囲 43 または 44に記載の抗体組成物の使用。
PCT/JP2003/004506 2002-04-09 2003-04-09 Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport Ceased WO2003085102A1 (en)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003582281A JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2003-04-09 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
AT03720896T ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2003-04-09 Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
DE60336548T DE60336548D1 (de) 2002-04-09 2003-04-09 Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EP03720896A EP1500698B1 (en) 2002-04-09 2003-04-09 Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
AU2003236020A AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2003-04-09 Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
CA002481656A CA2481656A1 (en) 2002-04-09 2003-04-09 Cells in which activity of the protein involved in transportation of gdp-fucose is reduced or lost

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-106952 2002-04-09
JP2002106952 2002-04-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003085102A1 true WO2003085102A1 (en) 2003-10-16

Family

ID=28786450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/004506 Ceased WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-04-09 Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7749753B2 (ja)
EP (1) EP1500698B1 (ja)
JP (1) JP4628679B2 (ja)
AT (1) ATE503829T1 (ja)
AU (1) AU2003236020B2 (ja)
CA (1) CA2481656A1 (ja)
DE (1) DE60336548D1 (ja)
ES (1) ES2362419T3 (ja)
WO (1) WO2003085102A1 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005017155A1 (ja) * 2003-06-18 2005-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーター
WO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
WO2006067913A1 (ja) * 2004-12-22 2006-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
EP1500400A4 (en) * 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
US7541029B2 (en) 2000-04-12 2009-06-02 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anti-rhesus D monoclonal antibodies
WO2012176779A1 (ja) 2011-06-20 2012-12-27 協和発酵キリン株式会社 抗ｅｒｂＢ３抗体
WO2014054804A1 (ja) 2012-10-05 2014-04-10 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
WO2020067541A1 (ja) 2018-09-28 2020-04-02 協和キリン株式会社 抗体組成物
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
WO2021201236A1 (ja) 2020-04-01 2021-10-07 協和キリン株式会社 抗体組成物
WO2025133290A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Temper Bio Protein for immune regulation
WO2025149633A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Laigo Bio B.V. Bispecific antigen binding proteins

Families Citing this family (746)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2704600C (en) * 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ATE503829T1 (de) * 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2005249566B2 (en) 2004-06-04 2010-11-11 Genentech, Inc. Method for treating multiple sclerosis
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
PL1871805T3 (pl) * 2005-02-07 2020-03-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen, które wiążą egfr, wektory kodujące te cząsteczki oraz ich zastosowania
WO2006100582A1 (en) * 2005-03-25 2006-09-28 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function
BRPI0611445A2 (pt) * 2005-05-09 2010-09-08 Glycart Biotechnology Ag molécula de ligação a antìgeno glicomanipulada, polinucleotìdeo, polipeptìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção, uso e composição farmacêutica
US20090208500A1 (en) * 2005-06-03 2009-08-20 Genentech, Inc. Method of producing antibodies with improved function
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
BRPI0619118A2 (pt) 2005-12-02 2011-09-13 Genentech Inc composições e métodos para o tratamento de doenças e desordens associadas com a sinalização de citocina
BRPI0706840A2 (pt) 2006-01-05 2011-04-05 Genentech Inc anticorpos anti- ephb4 isolado polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um anticorpo anti ephb4, método para produção de um imunoconjugado anti ephb4, método para a detecção de ephb4, método para diagnosticar um distúrbio composição, método para inibir a angiogênese, método para tratar um cáncer, tumor e/ou distúrbio da proliferação celular e uso de um anticorpo
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
EP2032606B1 (en) 2006-05-30 2013-11-27 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
NZ572177A (en) * 2006-06-06 2012-02-24 Genentech Inc Anti-dll4 antibodies and methods using same
EP2029159A2 (en) * 2006-06-06 2009-03-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
JP2009543579A (ja) 2006-07-19 2009-12-10 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 抗炎症反応のための標的としてのＷＳＸ−１／ｐ２８
AR062223A1 (es) * 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
UA94484C2 (uk) 2006-10-12 2011-05-10 Дженентек, Інк. Антитіла до лімфотоксину-альфа
BRPI0717638A2 (pt) 2006-10-27 2013-11-12 Genentech Inc Anticorpors e imunoconjugados e usos para os mesmos
JP2010517944A (ja) * 2007-01-26 2010-05-27 バイオインヴェント インターナショナル アーベー Ｄｌｌ４シグナリング阻害薬およびその使用
MX2009008430A (es) 2007-02-09 2009-10-28 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos.
AU2008247382B2 (en) 2007-05-07 2014-06-05 Medimmune, Llc Anti-ICOS antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
MX376656B (es) 2007-05-14 2025-03-07 Kyowa Kirin Co Ltd Metodos para reducir niveles de basófilos.
KR101680906B1 (ko) 2007-09-26 2016-11-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
KR101867606B1 (ko) 2007-11-07 2018-06-18 제넨테크, 인크. 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
BRPI0906261A2 (pt) * 2008-03-31 2015-07-07 Genentech Inc "métodos de diagnóstico de um subtipo de asma em uma amostra de paciente, usos de um agente terapêutico e kits de diagnóstico de um subtipo de asma em uma amostra de paciente"
WO2009135181A2 (en) 2008-05-02 2009-11-05 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
KR101054362B1 (ko) * 2008-07-03 2011-08-05 재단법인 목암생명공학연구소 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법
EP2311864A4 (en) 2008-08-13 2013-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd RECOMBINANT PROTEIN-S COMPOSITION
AR073295A1 (es) 2008-09-16 2010-10-28 Genentech Inc Metodos para tratar la esclerosis multiple progresiva. articulo de fabricacion.
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
CA2746330C (en) 2008-12-23 2017-08-29 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants with altered binding to protein a
MY152068A (en) 2009-03-20 2014-08-15 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
MA33208B1 (fr) 2009-03-25 2012-04-02 Genentech Inc Anticorps anti-fgfr3 et procédés d'utilisation de ceux-ci
NZ594343A (en) 2009-03-25 2013-10-25 Genentech Inc Novel anti-alpha5beta1 antibodies and uses thereof
SG175077A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
EP2435476A4 (en) 2009-05-27 2013-04-17 Synageva Biopharma Corp ANTIBODIES OBTAINED FROM BIRDS
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
TW201106972A (en) 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
NZ597531A (en) 2009-07-31 2014-05-30 Genentech Inc Inhibition of tumor metastasis using bv8- or g-csf-antagonists
KR101528013B1 (ko) * 2009-08-31 2015-06-16 로슈 글리카트 아게 친화성-성숙된 인간화된 항-ｃｅａ 단일클론 항체
CA2772715C (en) 2009-09-02 2019-03-26 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
RU2559533C2 (ru) 2009-10-22 2015-08-10 Дженентек, Инк. Антитела против гепсина и способы их применения
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
WO2011056494A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
CA2780221A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
EP2496601B1 (en) 2009-11-05 2017-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
WO2011071577A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Genentech, Inc. Anti-vegf-c antibodies and methods using same
EP2516465B1 (en) 2009-12-23 2016-05-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-bv8 antibodies and uses thereof
KR20130009760A (ko) 2010-02-10 2013-01-23 이뮤노젠 아이엔씨 Ｃｄ２０ 항체 및 이의 용도
US9556249B2 (en) 2010-02-18 2017-01-31 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
ES2602971T3 (es) 2010-03-02 2017-02-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Composición de anticuerpo modificado
AR080795A1 (es) 2010-03-24 2012-05-09 Genentech Inc Anticuerpos anti-lrp6 (proteina relacionada con el receptor ldl tipo 6)
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
NZ701208A (en) 2010-06-03 2016-05-27 Genentech Inc Immuno-pet imaging of antibodies and immunoconjugates and uses thereof
RU2577986C2 (ru) 2010-06-18 2016-03-20 Дженентек, Инк. Антитела против axl и способы их применения
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
WO2012006503A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Genentech, Inc. Anti-neuropilin antibodies and methods of use
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
KR20130045914A (ko) 2010-08-03 2013-05-06 에프. 호프만-라 로슈 아게 만성 림프구성 백혈병(cll) 생체지표
JP2013541937A (ja) 2010-08-05 2013-11-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｍｈｃ抗体−抗ウイルス性サイトカイン融合タンパク質
EP2603529A1 (en) 2010-08-13 2013-06-19 Roche Glycart AG Anti-tenascin-c a2 antibodies and methods of use
CA2806021C (en) 2010-08-13 2019-05-21 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
KR101603001B1 (ko) 2010-08-25 2016-03-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 Il-18r1에 대한 항체 및 그의 용도
MX2013002084A (es) 2010-08-31 2013-05-09 Genentech Inc Biomarcadores y metodos de tratamiento.
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
WO2012064836A1 (en) 2010-11-10 2012-05-18 Genentech, Inc. Methods and compositions for neural disease immunotherapy
RU2578468C2 (ru) 2010-12-16 2016-03-27 Дженентек, Инк. Способы диагностики и лечения, связанные с ингибированием th2
BR112013014527A2 (pt) 2010-12-20 2017-03-07 Genentech Inc anticorpo isolado, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso do imunoconjugado, método para tratamento de um indivíduo que tem um câncer positivo para mesotelina, para inibição de proliferação de uma célula positiva para mesotelina, para detecção de mesotelina humana em uma amostra biológica e para detectar um câncer positivo para mesotelina
CN103261230A (zh) 2010-12-22 2013-08-21 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗pcsk9抗体及使用方法
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
KR20130118941A (ko) 2011-02-10 2013-10-30 로슈 글리카트 아게 면역치료법
MX342034B (es) 2011-02-28 2016-09-12 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
AR085404A1 (es) 2011-02-28 2013-09-25 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno
PE20141017A1 (es) 2011-03-02 2014-08-25 Roche Glycart Ag Anticuerpos del cea
CA2828890A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Genentech, Inc. Anti-fgfr4 antibodies and methods of use
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US8679767B2 (en) 2011-05-12 2014-03-25 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring LC-MS/MS method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
EA030462B1 (ru) 2011-05-16 2018-08-31 Дженентек, Инк. Агонисты fgfr1 и способы их применения
US8623666B2 (en) 2011-06-15 2014-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for detecting erythropoietin (EPO) receptor using anti-human EPO receptor antibodies
FR2976811A1 (fr) 2011-06-22 2012-12-28 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom
CN103649125A (zh) 2011-06-22 2014-03-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 利用包含mhc i类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除靶细胞
AR086823A1 (es) 2011-06-30 2014-01-22 Genentech Inc Formulaciones de anticuerpo anti-c-met, metodos
MX2014001766A (es) 2011-08-17 2014-05-01 Genentech Inc Anticuerpos de neuregulina y sus usos.
KR20140068877A (ko) 2011-08-17 2014-06-09 제넨테크, 인크. 불응성 종양에서의 혈관신생의 억제
RU2014109038A (ru) 2011-08-23 2015-09-27 Рош Гликарт Аг Антитела к хондроитинсульфат протеогликану меланомы
EP2748202B1 (en) 2011-08-23 2018-07-04 Roche Glycart AG Bispecific antigen binding molecules
WO2013040433A1 (en) 2011-09-15 2013-03-21 Genentech, Inc. Methods of promoting differentiation
SG11201400724SA (en) 2011-09-19 2014-04-28 Genentech Inc Combination treatments comprising c-met antagonists and b-raf antagonists
US9663573B2 (en) 2011-10-05 2017-05-30 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using Notch2 antagonists
BR112014008862A2 (pt) 2011-10-14 2018-08-07 Genentech Inc anticorpo isolado que se liga à htra1, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos e usos
US9358250B2 (en) 2011-10-15 2016-06-07 Genentech, Inc. Methods of using SCD1 antagonists
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
WO2013059740A1 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Foundation Medicine, Inc. Novel alk and ntrk1 fusion molecules and uses thereof
MX2014004991A (es) 2011-10-28 2014-05-22 Genentech Inc Combinaciones terapeuticas y metodos para tratar el melanoma.
SG11201402485UA (en) 2011-11-21 2014-06-27 Genentech Inc Purification of anti-c-met antibodies
WO2013083497A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
SG10201900915WA (en) 2011-12-22 2019-03-28 Hoffmann La Roche Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
CN104011080B (zh) 2011-12-22 2017-10-20 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途
ES2791758T3 (es) 2011-12-22 2020-11-05 Hoffmann La Roche Organización de vectores de expresión, procedimientos de generación de células de producción novedosos y su uso para la producción recombinante de polipéptidos
AR089434A1 (es) 2011-12-23 2014-08-20 Genentech Inc Procedimiento para preparar formulaciones con alta concentracion de proteinas
WO2013101771A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Genentech, Inc. Compositions and method for treating autoimmune diseases
JP2015509091A (ja) 2012-01-09 2015-03-26 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート ヒト化抗体
CA2863224A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 The Scripps Research Institute Ultralong complementarity determining regions and uses thereof
US9200072B2 (en) 2012-01-18 2015-12-01 Genentech Inc. Anti-LRP5 antibodies and methods of use
JP2015506944A (ja) 2012-01-18 2015-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｇｆ１９修飾薬を使用する方法
KR20140119777A (ko) 2012-01-31 2014-10-10 제넨테크, 인크. 항-ig-e m1'' 항체 및 그의 사용 방법
KR102148303B1 (ko) 2012-02-11 2020-08-26 제넨테크, 인크. R-스폰딘 전위 및 그의 사용 방법
MX360352B (es) 2012-02-15 2018-10-30 Hoffmann La Roche Cromatografia de afinidad basada en receptores fc.
US20130259867A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
US9056910B2 (en) 2012-05-01 2015-06-16 Genentech, Inc. Anti-PMEL17 antibodies and immunoconjugates
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
RU2625771C2 (ru) 2012-05-23 2017-07-18 Дженентек, Инк. Способ отбора терапевтических средств
EP2861624A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
RU2684595C2 (ru) 2012-07-04 2019-04-09 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Ковалентно связанные конъюгаты антиген-антитело
DK2869837T3 (en) 2012-07-04 2016-09-26 Hoffmann La Roche Anti-theophylline antibodies and methods of use
EP2870180B1 (en) 2012-07-04 2024-08-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
US9803191B2 (en) 2012-07-05 2017-10-31 Genentech, Inc. Expression and secretion system
CN104428007B (zh) 2012-07-09 2018-03-16 基因泰克公司 包含抗cd22抗体的免疫缀合物
IN2014DN10652A (ja) 2012-07-09 2015-09-11 Genentech Inc
CN104411337A (zh) 2012-07-09 2015-03-11 基因泰克公司 包含抗cd79b抗体的免疫偶联物
AR091703A1 (es) 2012-07-09 2015-02-25 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-cd22
MY175687A (en) 2012-08-07 2020-07-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
EP2914621B1 (en) 2012-11-05 2023-06-07 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
US11230589B2 (en) 2012-11-05 2022-01-25 Foundation Medicine, Inc. Fusion molecules and uses thereof
MA38165A1 (fr) 2012-11-08 2018-07-31 Hoffmann La Roche Protéines de liaison à l'antigène her3 se liant à l'épingle à cheveux beta de her3
CN104968367B (zh) 2012-11-13 2018-04-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗血凝素抗体和使用方法
US20160185847A1 (en) 2012-12-17 2016-06-30 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Use of monoclonal antibodies for the treatment of inflammation and bacterial infections
WO2014096015A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Disulfide-linked multivalent mhc class i comprising multi-function proteins
CA3150658A1 (en) 2013-01-18 2014-07-24 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
JP2016509045A (ja) 2013-02-22 2016-03-24 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんを治療し、薬剤耐性を防止する方法
US20140242083A1 (en) 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
MX2015011428A (es) 2013-03-06 2016-02-03 Genentech Inc Metodos para tratar y prevenir la resistencia a los farmacos para el cancer.
JP2016516046A (ja) 2013-03-14 2016-06-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの治療方法及びがん薬物耐性を阻止する方法
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
MX2015010854A (es) 2013-03-14 2016-07-20 Genentech Inc Combinaciones de un compuesto inhibidor de mek con un compuesto inhibidor de her3/egfr y metodos de uso.
JP6436965B2 (ja) 2013-03-14 2018-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ４抗体及びイムノコンジュゲート
CA2905123A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
BR112015023120A2 (pt) 2013-03-15 2017-11-21 Genentech Inc método para identificar um indivíduo com uma doença ou disfunção, método para prever a responsividade de um indivíduo com uma doença ou disfunção, método para determinar a probabilidade de que um indivíduo com uma doença ou disfunção exibirá benefício do tratamento, método para selecionar uma terapia, usos de um antagonista de ligação do eixo pd-l1, ensaio para identificar um indivíduo com uma doença, kit de diagnóstico, método para avaliar uma resposta ao tratamento e método para monitorar a resposta de um indivíduo tratado
KR20150131177A (ko) 2013-03-15 2015-11-24 제넨테크, 인크. 항-CRTh2 항체 및 그의 용도
WO2014145016A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use
SG11201507427QA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Genentech Inc Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
WO2014150877A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
MX364861B (es) 2013-04-29 2019-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento de tipo insulinico humano 1 (anti-igf-1r) con abolicion de la union al fcrn y su uso en el tratamiento de enfermedades oculares vasculares.
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
WO2014177459A2 (en) 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
EP3594240B1 (en) 2013-05-20 2023-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
RU2687044C2 (ru) 2013-05-31 2019-05-06 Дженентек, Инк. Антитела против стеночной тейхоевой кислоты и их конъюгаты
MX369022B (es) 2013-05-31 2019-10-25 Genentech Inc Anticuerpos anti-ácido teicoico de la pared celular y conjugados.
WO2015017146A2 (en) 2013-07-18 2015-02-05 Fabrus, Inc. Antibodies with ultralong complementarity determining regions
CA2918370A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Fabrus, Inc. Humanized antibodies with ultralong complementarity determining regions
KR102516152B1 (ko) 2013-08-01 2023-03-31 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. 비푸코실화된 항-ｆｇｆｒ２ｉｉｉｂ 항체
SG11201601044XA (en) 2013-08-12 2016-03-30 Genentech Inc Compositions and method for treating complement-associated conditions
JP2016537399A (ja) 2013-09-17 2016-12-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｌｇｒ５抗体を使用する方法
JP2016537965A (ja) 2013-10-11 2016-12-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｓｐ４阻害剤及び使用方法
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
CN105813654B (zh) 2013-10-11 2019-05-31 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Tem8抗体及其用途
BR112016008477A2 (pt) 2013-10-18 2017-10-03 Genentech Inc Corpos, ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica e usos do anticorpo
AR098155A1 (es) 2013-10-23 2016-05-04 Genentech Inc Métodos para diagnosticar y tratar trastornos eosinofílicos
LT3071597T (lt) 2013-11-21 2020-10-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Antikūnai prieš alfa-sunukleiną ir jų naudojimo būdai
NZ720769A (en) 2013-12-09 2022-10-28 Allakos Inc Anti-siglec-8 antibodies and methods of use thereof
SG11201604784XA (en) 2013-12-13 2016-07-28 Genentech Inc Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
AU2014364593A1 (en) 2013-12-17 2016-07-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using PD-1 axis binding antagonists and an anti-CD20 antibody
JP2017507900A (ja) 2013-12-17 2017-03-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及び抗ｈｅｒ２抗体を使用してｈｅｒ２陽性がんを治療する方法
WO2015095423A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
IL263466B2 (en) 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
EP3089758B1 (en) 2014-01-03 2021-01-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
CN105899540B (zh) 2014-01-03 2020-02-07 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及它们作为血脑屏障穿梭物的应用
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
BR112016014945A2 (pt) 2014-01-03 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugado, formulação farmacêutica e uso
CA2932547C (en) 2014-01-06 2023-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent blood brain barrier shuttle modules
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
FR3016633B1 (fr) 2014-01-17 2018-04-13 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Immunoglobuline anti-toxine du charbon
EP3096797A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
ES2694857T3 (es) 2014-02-04 2018-12-27 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de uso de la misma
EP3102230B1 (en) 2014-02-08 2021-04-28 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating alzheimer's disease
CA2938466C (en) 2014-02-08 2021-11-02 Genentech, Inc. Methods of treating alzheimer's disease
EA201691610A8 (ru) 2014-02-12 2018-05-31 Дженентек, Инк. Анти-jagged1 антитела и способы применения
UA117608C2 (uk) 2014-02-21 2018-08-27 Дженентек, Інк. Спосіб лікування еозинофільного захворювання у пацієнта шляхом застосування біспецифічного анти-il-13/il-17 антитіла
DK3110446T3 (da) 2014-02-28 2022-02-28 Allakos Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af Siglec-8-associerede sygdomme
AU2015229035B2 (en) 2014-03-14 2021-08-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
CN106103478B (zh) 2014-03-21 2020-04-03 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体体内半寿期的体外预测
WO2015140591A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
RU2016141385A (ru) 2014-03-24 2018-04-28 Дженентек, Инк. Лечение рака антагонистами с-мет и их корреляция с экспрессией hgf
KR20160146747A (ko) 2014-03-31 2016-12-21 제넨테크, 인크. 항혈관신생제 및 ox40 결합 효능제를 포함하는 조합 요법
SG11201607969XA (en) 2014-03-31 2016-10-28 Genentech Inc Anti-ox40 antibodies and methods of use
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
WO2015179658A2 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Genentech, Inc. Anti-gpc3 antibodies and immunoconjugates
RU2016144405A (ru) 2014-05-23 2018-06-26 Дженентек, Инк. MiT БИОМАРКЕРЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CN106459202A (zh) 2014-06-11 2017-02-22 豪夫迈·罗氏有限公司 抗LgR5抗体及其用途
CN107073121A (zh) 2014-06-13 2017-08-18 基因泰克公司 治疗及预防癌症药物抗性的方法
BR112016029935A2 (pt) 2014-06-26 2017-10-31 Hoffmann La Roche ?anticorpos anti-brdu, complexo, formulação farmacêutica e uso de anticorpo?
RU2715038C2 (ru) 2014-07-11 2020-02-21 Дженентек, Инк. Антитела анти-pd-l1 и способы их диагностического применения
CN106488775A (zh) 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
DK4074735T3 (da) 2014-08-28 2025-07-14 Bioatla Inc Betinget aktive kimæriske antigenreceptorer til modificerede t-celler
WO2016040724A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
LT3191135T (lt) 2014-09-12 2020-11-25 Genentech, Inc. Anti-her2 antikūnai ir imunokonjugatai
MA40579A (fr) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech Inc Anticorps anti-cll-1 et immunoconjugués
MX2017003472A (es) 2014-09-17 2017-10-31 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-her2.
HUE049175T2 (hu) 2014-09-23 2020-09-28 Hoffmann La Roche Eljárás anti-CD79b immunkonjugátumok alkalmazására
JP2017536102A (ja) 2014-10-16 2017-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法
US10626176B2 (en) 2014-10-31 2020-04-21 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind B7-H4
CA2966523A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Assays for detecting t cell immune subsets and methods of use thereof
WO2016073380A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Method and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
CA2961439A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-fgfr2/3 antibodies and methods using same
DK3215528T3 (da) 2014-11-06 2019-10-07 Hoffmann La Roche Fc-regionvarianter med modificeret FcRn-binding og anvendelsesfremgangsmåder
CA2960569A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-Laroche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
US20160152720A1 (en) 2014-11-06 2016-06-02 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
CN107105632A (zh) 2014-11-10 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 肾病动物模型及其治疗剂
CR20170240A (es) 2014-11-10 2018-04-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y sus usos
WO2016077789A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
SG10201807625PA (en) 2014-11-17 2018-10-30 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
US10508151B2 (en) 2014-11-19 2019-12-17 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
WO2016081640A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
JP6859259B2 (ja) 2014-11-19 2021-04-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＢＡＣＥｌに対する抗体及び神経疾患免疫療法のためのその使用
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
RU2017118792A (ru) 2014-12-03 2019-01-09 Дженентек, Инк. Конъюгаты антитела к staphylococcus aureus с рифамицином и их применение
HK1243931A1 (zh) 2014-12-03 2018-07-27 F. Hoffmann-La Roche Ag 抗金黄色葡萄球菌抗体利福霉素缀合物及其用途
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
ES2744540T3 (es) 2014-12-05 2020-02-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-CD79b y procedimientos de uso
KR20170085595A (ko) 2014-12-10 2017-07-24 제넨테크, 인크. 혈뇌 장벽 수용체 항체 및 사용 방법
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
BR112017011235A2 (pt) 2014-12-19 2018-02-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpos anti-c5 e métodos de uso
WO2016111947A2 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
ES2818103T3 (es) 2015-01-16 2021-04-09 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para ROR1
CN113956354A (zh) 2015-01-22 2022-01-21 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
EP3253784B1 (en) 2015-02-04 2020-05-06 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
MX2017011486A (es) 2015-03-16 2018-06-15 Genentech Inc Métodos de detección y cuantificación de il-13 y sus usos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas a th2.
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
ES2789348T3 (es) 2015-03-20 2020-10-26 Us Health Anticuerpos neutralizantes para GP120 y sus usos
RS60614B1 (sr) 2015-03-23 2020-08-31 Jounce Therapeutics Inc Antitela za icos
WO2016153572A1 (en) 2015-03-25 2016-09-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific multivalent fusion proteins
WO2016161390A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
SI3280441T1 (sl) 2015-04-07 2022-01-31 Alector Llc Protitelesa anti-sortilin in metoda njihove uporabe
CN107810197B (zh) 2015-04-24 2022-10-25 豪夫迈·罗氏有限公司 鉴定包含结合多肽的细菌的方法
EP3288981A1 (en) 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
HK1248577A1 (zh) 2015-05-11 2018-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag 治疗狼疮性肾炎的组合物和方法
ES2835866T5 (es) 2015-05-12 2024-12-02 Hoffmann La Roche Procedimientos terapéuticos y de diagnóstico para el cáncer
HK1250723A1 (zh) 2015-05-29 2019-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag 人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法
ES2789500T5 (es) 2015-05-29 2023-09-20 Hoffmann La Roche Procedimientos terapéuticos y de diagnóstico para el cáncer
AR105618A1 (es) 2015-05-29 2017-10-25 Genentech Inc Metilación del promotor del ligando al receptor de muerte programada (pd-l1) en cáncer
HK1249016A1 (zh) 2015-06-02 2018-10-26 豪夫迈‧罗氏有限公司 使用抗il-34抗体治疗神经疾病的组合物和方法
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
NZ775762A (en) 2015-06-05 2025-02-28 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
JP2018521019A (ja) 2015-06-08 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体を使用して癌を治療する方法
MX2017015937A (es) 2015-06-08 2018-12-11 Genentech Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40 y antagonistas de unión al eje de pd-1.
CN108064246A (zh) 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
DK3310814T5 (da) 2015-06-16 2024-10-07 Hoffmann La Roche Humaniserede og affinitetsmodnede antistoffer mod FcRH5 og fremgangsmåder til anvendelse
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
KR102689256B1 (ko) 2015-06-17 2024-07-30 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 사용하여 국소적 진행성 또는 전이성 유방암을 치료하는 방법
CN107787331B (zh) 2015-06-17 2022-01-11 豪夫迈·罗氏有限公司 抗her2抗体和使用方法
US10774145B2 (en) 2015-06-17 2020-09-15 Allakos Inc. Methods and compositions for treating fibrotic diseases
HUE057952T2 (hu) 2015-06-24 2022-06-28 Hoffmann La Roche Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással
CN107531788B (zh) 2015-06-24 2022-06-21 豪夫迈·罗氏有限公司 对her2和血脑屏障受体特异性的三特异性抗体及使用方法
EP3313885A1 (en) 2015-06-29 2018-05-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for use in organ transplantation
EP3978525A1 (en) 2015-06-29 2022-04-06 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
FR3038517B1 (fr) 2015-07-06 2020-02-28 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
WO2018028647A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 Legend Biotech Usa Inc. Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN108026180B (zh) 2015-08-28 2022-06-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗羟腐胺赖氨酸抗体及其用途
CN105399830B (zh) * 2015-09-08 2019-11-19 北京天广实生物技术股份有限公司 抗egfr人源化单克隆抗体、其制备方法及用途
CA2999369C (en) 2015-09-22 2023-11-07 Spring Bioscience Corporation Anti-ox40 antibodies and diagnostic uses thereof
PE20181363A1 (es) 2015-09-23 2018-08-27 Genentech Inc Variantes optimizadas de anticuerpos anti-vegf
JP6955487B2 (ja) 2015-09-24 2021-10-27 アブビトロ， エルエルシー Ｈｉｖ抗体組成物および使用方法
PE20181046A1 (es) 2015-09-25 2018-07-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-tigit y metodos de uso
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
TWI873952B (zh) 2015-10-02 2025-02-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 雙特異性抗‐人類cd20/人類轉鐵蛋白受體抗體及使用方法
CR20180243A (es) 2015-10-02 2018-07-31 Genentech Inc Conjugados de anticuerpo-fármaco de pirrolobenzodiazepina y métodos de uso
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
IL293708B2 (en) 2015-10-06 2026-04-01 Genentech Inc A method for treating multiple sclerosis
CA2997809A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
AU2016342269A1 (en) 2015-10-22 2018-03-29 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
US10604577B2 (en) 2015-10-22 2020-03-31 Allakos Inc. Methods and compositions for treating systemic mastocytosis
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
WO2017072210A1 (en) 2015-10-29 2017-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-variant fc-region antibodies and methods of use
MY196448A (en) 2015-10-30 2023-04-12 Genentech Inc Anti-Htra1 Antibodies and Methods of use Thereof
US10407510B2 (en) 2015-10-30 2019-09-10 Genentech, Inc. Anti-factor D antibodies and conjugates
WO2017079479A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
CN118725134A (zh) 2015-11-08 2024-10-01 豪夫迈·罗氏有限公司 筛选多特异性抗体的方法
MX2018006181A (es) 2015-11-23 2018-09-24 Five Prime Therapeutics Inc Inhibidores de fgfr2 solos o en combinacion con agentes que estimulan el sistema inmunitario en el tratamiento contra el cancer.
IL313608A (en) 2015-12-09 2024-08-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
HUE065073T2 (hu) 2015-12-18 2024-04-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-C5 antitestek és alkalmazási eljárások
AR107078A1 (es) 2015-12-18 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo antimiostatina, polipéptidos que contienen regiones fc variantes así como métodos de uso
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
US20190016791A1 (en) 2016-01-20 2019-01-17 Genentech, Inc. High dose treatments for alzheimer's disease
EP3411396A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
JP6821693B2 (ja) 2016-02-29 2021-01-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんのための治療方法及び診断方法
US11767362B1 (en) 2016-03-15 2023-09-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-GPC3 antibodies
CN108700598A (zh) 2016-03-25 2018-10-23 豪夫迈·罗氏有限公司 多路总抗体和抗体缀合的药物量化测定法
EP3865511A1 (en) 2016-04-14 2021-08-18 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-rspo3 antibodies and methods of use
SMT202600033T1 (it) 2016-04-15 2026-03-09 Bioatla Inc Anticorpi anti-axl, frammenti di anticorpo e loro immunoconiugati e loro utilizzi
MX2018012493A (es) 2016-04-15 2019-06-06 Genentech Inc Métodos para controlar y tratar el cáncer.
KR20190003958A (ko) 2016-04-15 2019-01-10 제넨테크, 인크. 암의 치료 및 모니터링 방법
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
WO2017191101A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The contorsbody - a single chain target binder
JP7089483B2 (ja) 2016-05-11 2022-06-22 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法
PL3455261T3 (pl) 2016-05-13 2022-12-12 Bioatla, Inc. Przeciwciała anty-ror2, fragmenty przeciwciał, ich immunokoniugaty oraz ich zastosowania
CN118436801A (zh) 2016-05-20 2024-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
KR102376582B1 (ko) 2016-06-17 2022-03-18 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체 및 사용 방법
JP7133477B2 (ja) 2016-06-24 2022-09-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ポリユビキチン多重特異性抗体
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
JP7062640B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 抗ｃｄ１９抗体に対する抗イディオタイプ抗体
US20190185578A1 (en) 2016-07-29 2019-06-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody exhibiting increased alternative fviii-cofactor-function activity
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
WO2018029124A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
CN109844134B (zh) * 2016-08-16 2023-05-05 塔驰莱特Ip有限公司 闭合线性dna的生产
CA3035081A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating b cell disorders
US11168148B2 (en) 2016-09-07 2021-11-09 The Regents Of The University Of California Antibodies to oxidation-specific epitopes
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
CN109689682B (zh) 2016-09-19 2022-11-29 豪夫迈·罗氏有限公司 基于补体因子的亲和层析
PT3528838T (pt) 2016-09-23 2023-09-04 Hoffmann La Roche Utilizações de antagonistas de il-13 para tratamento de dermatite atópica
MX2019003768A (es) 2016-10-03 2019-06-24 Juno Therapeutics Inc Moleculas de enlace especificas de hpv.
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
CA3038712A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
WO2018081648A2 (en) 2016-10-29 2018-05-03 Genentech, Inc. Anti-mic antibidies and methods of use
HRP20211703T1 (hr) 2016-11-02 2022-02-04 Jounce Therapeutics, Inc. Protutijela protiv pd-1 i njihova upotreba
JP7784795B2 (ja) 2016-11-15 2025-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
JOP20190100A1 (ar) 2016-11-19 2019-05-01 Potenza Therapeutics Inc بروتينات ربط مولد ضد مضاد لـ gitr وطرق استخدامها
EP4015532A1 (en) 2016-11-21 2022-06-22 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
UA128383C2 (uk) 2016-12-07 2024-07-03 Дженентек, Інк. Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування
MX2019006330A (es) 2016-12-07 2019-09-26 Genentech Inc Anticuerpos anti-tau y metodos de uso.
EP3551663A1 (en) 2016-12-12 2019-10-16 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-pd-l1 antibodies and antiandrogens
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
US20180230218A1 (en) 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
EP3568468A4 (en) 2017-01-12 2020-12-30 Eureka Therapeutics, Inc. RECOMBINATION PRODUCTS TARGETING PEPTIDE HISTONE H3 / MHC COMPLEXES AND THEIR USES
JP6995127B2 (ja) 2017-02-10 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トリプターゼ抗体、その組成物、及びその使用
EP3580235B1 (en) 2017-02-10 2024-05-01 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
TW201837467A (zh) 2017-03-01 2018-10-16 美商建南德克公司 用於癌症之診斷及治療方法
CN113512111B (zh) * 2017-03-10 2023-08-15 北京天广实生物技术股份有限公司 抗埃博拉病毒单克隆抗体、其制备方法及用途
MA49279A (fr) 2017-03-22 2020-02-05 Hoffmann La Roche Compositions d'anticorps optimisées pour le traitement de troubles oculaires
EP3601337A1 (en) 2017-03-28 2020-02-05 Genentech, Inc. Methods of treating neurodegenerative diseases
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
MX2019011769A (es) 2017-04-03 2019-11-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a steap-1.
KR102294136B1 (ko) 2017-04-05 2021-08-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-lag3 항체
KR20200005540A (ko) 2017-04-14 2020-01-15 제넨테크, 인크. 암의 진단 및 치료 방법
EP3624820A1 (en) 2017-04-21 2020-03-25 H. Hoffnabb-La Roche Ag Use of klk5 antagonists for treatment of a disease
EP3615574A4 (en) 2017-04-26 2021-02-24 Eureka Therapeutics, Inc. SPECIFIC GLYPICAN 3 RECOGNIZING CONSTRUCTS AND THEIR USE
SG11201909395TA (en) 2017-04-27 2019-11-28 Tesaro Inc Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
EP3618868A4 (en) 2017-05-05 2021-02-24 Allakos Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING ALLERGIC EYE DISEASES
WO2018209125A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Epstein barr virus antibodies, vaccines, and uses of the same
PT3624837T (pt) 2017-05-16 2025-10-01 Five Prime Therapeutics Inc Anticorpos anti-fgfr2 em combinação com agentes quimioterapêuticos no tratamento do cancro
CA3102086A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Relinia, Inc. Single-chain tnf receptor 2 agonist fusion proteins
JP7760242B2 (ja) 2017-07-21 2025-10-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの治療法及び診断法
BR112020001653A2 (pt) 2017-07-26 2020-07-21 Forty Seven, Inc. anticorpos anti-sirp-alfa e métodos relacionados
WO2019059411A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha DOSAGE FOR POLYTHERAPY USING PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS AND GPC3 TARGETING AGENT
JP2020537515A (ja) 2017-10-03 2020-12-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｐｖ特異的結合分子
AU2018347521A1 (en) 2017-10-12 2020-05-07 Immunowake Inc. VEGFR-antibody light chain fusion protein
SG11202003501XA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
TW201923089A (zh) 2017-11-06 2019-06-16 美商建南德克公司 癌症之診斷及治療方法
EP4640703A3 (en) 2017-11-14 2026-04-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibodies and methods of use
CN111615520A (zh) 2017-12-01 2020-09-01 辉瑞大药厂 抗cxcr5抗体及其组合物和用途
MA51184A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Juno Therapeutics Inc Molécules de liaison à l'anti-cct5 et procédés d'utilisation associés
MX2020006119A (es) 2017-12-21 2020-08-24 Hoffmann La Roche Anticuerpos de union a hla-a2/wt1.
EA202091540A1 (ru) 2017-12-22 2021-03-22 Джаунс Терапьютикс, Инк. Антитела к lilrb2
US20190211098A1 (en) 2017-12-22 2019-07-11 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
CN117050184A (zh) 2017-12-28 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 针对tigit的单域抗体和其变体
EP3732203A4 (en) 2017-12-28 2021-12-15 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ANTIBODIES AND THEIR VARIANTS DIRECTED AGAINST PD-L1
EP3731864A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche SA Anti-vegf antibodies and methods of use
JP7490565B2 (ja) 2017-12-29 2024-05-27 アレクトル エルエルシー 抗ｔｍｅｍ１０６ｂ抗体及びその使用方法
EP3724223A1 (en) 2018-01-02 2020-10-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
MX2020007077A (es) 2018-01-04 2020-10-28 Iconic Therapeutics Inc Anticuerpos anti-factor tisular, conjugados anticuerpo-farmaco y metodos relacionados.
AU2019205090A1 (en) 2018-01-05 2020-08-06 Ac Immune Sa Misfolded TDP-43 binding molecules
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
CN111699200B (zh) 2018-01-15 2023-05-26 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-1的单域抗体和其变体
EP3740505A1 (en) 2018-01-16 2020-11-25 Lakepharma Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
CN112020365A (zh) 2018-01-26 2020-12-01 豪夫迈·罗氏有限公司 组合物和使用方法
CR20200327A (es) 2018-01-26 2020-11-05 Genentech Inc Proteínas de fusión fc il-22 y métodos de uso
US11472874B2 (en) 2018-01-31 2022-10-18 Alector Llc Anti-MS4A4A antibodies and methods of use thereof
US11807663B2 (en) 2018-02-01 2023-11-07 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Fully humanized anti-B cell maturation antigen (BCMA) single-chain antibody and use thereof
IL325995A (en) 2018-02-08 2026-03-01 Genentech Inc Bispecific antigen binding molecules and methods of use
KR20220098056A (ko) 2018-02-09 2022-07-08 제넨테크, 인크. 비만 세포 매개 염증성 질환에 대한 치료 및 진단 방법
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
JP7350756B2 (ja) 2018-02-14 2023-09-26 アバ セラピューティクス アーゲー 抗ヒトｐｄ－ｌ２抗体
KR20200123118A (ko) 2018-02-21 2020-10-28 제넨테크, 인크. IL-22 Fc 융합 단백질로 치료를 위한 투약
RU2020130795A (ru) 2018-02-21 2022-03-21 Дзе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эс Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз Нейтрализующие антитела к env вич-1 и их применение
CN111836831A (zh) 2018-02-26 2020-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于抗tigit拮抗剂抗体和抗pd-l1拮抗剂抗体治疗的给药
EP3765522A4 (en) 2018-03-14 2022-05-18 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. ANTI-CLAUDIN 18.2 ANTIBODIES
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
CN112119090B (zh) 2018-03-15 2023-01-13 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
JP2021519073A (ja) 2018-03-29 2021-08-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 哺乳動物細胞におけるラクトジェニック活性の制御
TW202003567A (zh) 2018-03-30 2020-01-16 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對lag-3之單一結構域抗體及其用途
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
EP3773908A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics, Inc. T cell receptors and engineered cells expressing same
WO2019222296A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
AU2019271148B9 (en) 2018-05-14 2025-05-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
JP7337099B2 (ja) 2018-05-25 2023-09-01 アレクトル エルエルシー 抗ｓｉｒｐａ抗体およびその使用法
EP3818085A4 (en) 2018-06-01 2022-03-09 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. COMPOSITIONS AND THEIR USES FOR THE TREATMENT OF DISEASES OR DISORDERS
WO2019227490A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and methods for imaging
EP3802599B1 (en) 2018-06-03 2023-12-20 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
WO2019235426A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 中外製薬株式会社 細胞質内での半減期が変化した抗原結合分子
TWI851577B (zh) 2018-06-07 2024-08-11 美商思進公司 喜樹鹼結合物
US11993661B2 (en) 2018-06-18 2024-05-28 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (PSMA) and uses thereof
MY205645A (en) 2018-06-23 2024-11-02 Genentech Inc Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
BR112020026819A2 (pt) 2018-06-29 2021-04-20 Alector Llc anticorpos isolados, ácido nucleico, vetor, células hospedeiras, método de produção de um anticorpo, composição farmacêutica, métodos para tratar o câncer e para tratar uma doença e usos de um anticorpo
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
LT3618928T (lt) 2018-07-13 2023-04-11 Alector Llc Anti-sortilino antikūnai ir jų panaudojimo būdai
WO2020018789A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
MX2021000745A (es) 2018-07-20 2021-03-26 Surface Oncology Inc Composiciones anti-cd112r y metodos.
MX2021000827A (es) 2018-08-03 2021-03-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union a antigeno que contiene dos dominios de union a antigeno que estan enlazados entre si.
MA50586A (fr) 2018-08-09 2020-09-16 Regeneron Pharma Procédés d'évaluation de l'affinité de liaison d'une variante d'anticorps au récepteur fc néonatal
KR102259473B1 (ko) 2018-08-10 2021-06-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용
CN121248772A (zh) 2018-08-17 2026-01-02 Ab工作室有限公司 催化抗体和其使用方法
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP3850013A4 (en) 2018-09-10 2022-10-05 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AGAINST CLL1 AND USES THEREOF
WO2020056170A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
AU2019342099A1 (en) 2018-09-19 2021-04-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
KR102739487B1 (ko) 2018-09-21 2024-12-10 제넨테크, 인크. 3중-음성 유방암에 대한 진단 방법
US20220002370A1 (en) 2018-09-27 2022-01-06 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
PE20211213A1 (es) 2018-10-05 2021-07-05 Five Prime Therapeutics Inc Formulaciones de anticuerpos anti-fgfr2
EP3867646A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
CN113366022B (zh) 2018-11-16 2025-11-21 纪念斯隆凯特琳癌症中心 针对粘蛋白-16的抗体及其使用方法
CN116003597A (zh) 2018-11-27 2023-04-25 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α的抗体及其用途
EP4198057A1 (en) 2018-12-05 2023-06-21 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods and compositions for cancer immunotherapy
BR112021010908A2 (pt) 2018-12-06 2021-08-31 Genentech, Inc. Método para tratamento de linfoma difuso de grandes células b, kit e imunoconjugado
JP2022513198A (ja) 2018-12-10 2022-02-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｃ含有タンパク質への部位特異的コンジュゲーションのための光架橋性ペプチド
AR117453A1 (es) 2018-12-20 2021-08-04 Genentech Inc Fc de anticuerpos modificados y métodos para utilizarlas
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
US20220089694A1 (en) 2018-12-20 2022-03-24 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
CA3120474A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
CR20210330A (es) 2018-12-21 2021-07-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS QUE SE UNEN A CD3 (Divisional 2021-0325)
EP3898671A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody that binds to vegf and il-1beta and methods of use
CA3122773A1 (en) 2018-12-26 2020-07-02 Xilio Development, Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of use thereof
EP3902830A1 (en) 2018-12-30 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-rabbit cd19 antibodies and methods of use
AU2020208193A1 (en) 2019-01-14 2021-07-29 BioNTech SE Methods of treating cancer with a PD-1 axis binding antagonist and an RNA vaccine
CN113795511B (zh) 2019-01-23 2024-07-23 大有华夏生物医药集团有限公司 抗pd-l1双抗体及其用途
WO2020153467A1 (ja) 2019-01-24 2020-07-30 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
SG11202107976SA (en) 2019-01-29 2021-08-30 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
GB2599228B (en) 2019-02-21 2024-02-07 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
WO2020176748A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-cd20 or anti-cd38 antibodies
WO2020185535A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Genentech, Inc. Methods for detecting and quantifying membrane-associated proteins on extracellular vesicles
EP3938403A1 (en) 2019-03-14 2022-01-19 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
BR112021020867A2 (pt) 2019-04-19 2022-01-04 Genentech Inc Anticorpos, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, usos do anticorpo, método de tratamento de um indivíduo com câncer e método para reduzir a depuração
CN114007643A (zh) 2019-04-19 2022-02-01 中外制药株式会社 识别抗体改变部位的嵌合受体
EP3962523A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
CN114269376A (zh) 2019-05-03 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用抗pd-l1抗体治疗癌症的方法
EP3969035A4 (en) 2019-05-14 2023-06-21 Werewolf Therapeutics, Inc. SEPARATION UNITS AND METHODS AND THEIR USE
AU2020275415B2 (en) 2019-05-14 2026-01-15 Genentech, Inc. Methods of using anti-CD79B immunoconjugates to treat follicular lymphoma
EP4696320A2 (en) 2019-05-15 2026-02-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibody
WO2020236974A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
AU2020278907A1 (en) 2019-05-23 2022-01-20 Ac Immune Sa Anti-TDP-43 binding molecules and uses thereof
EP3983441A1 (en) 2019-06-11 2022-04-20 Alector LLC Anti-sortilin antibodies for use in therapy
WO2021003297A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind egfrviii and their use
MY208387A (en) 2019-07-09 2025-05-05 Beijing Solobio Genetechnology Co Ltd Antibodies specifically recognizing pseudomonas pcrv and uses thereof
WO2021010326A1 (ja) 2019-07-12 2021-01-21 中外製薬株式会社 抗変異型ｆｇｆｒ３抗体およびその使用
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
CA3145885A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Jeonghoon Sun Anti-ms4a4a antibodies and methods of use thereof
CN114174338A (zh) 2019-07-31 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
CA3248329A1 (en) 2019-07-31 2025-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to gprc5d
JP7181438B2 (ja) 2019-08-06 2022-11-30 アプリノイア セラピューティクス リミテッド 病理学的タウ種に結合する抗体及びその使用
CN114340675A (zh) 2019-09-12 2022-04-12 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗狼疮性肾炎的组合物和方法
PH12022550646A1 (en) 2019-09-18 2023-04-03 Genentech Inc Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
CN114423454A (zh) 2019-09-20 2022-04-29 豪夫迈·罗氏有限公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
JP2022548978A (ja) 2019-09-27 2022-11-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 薬抗ｔｉｇｉｔ及び抗ｐｄ－ｌ１アンタゴニスト抗体を用いた処置のための投薬
WO2021076196A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
KR20220092580A (ko) 2019-11-06 2022-07-01 제넨테크, 인크. 혈액암의 치료를 위한 진단과 치료 방법
US20220396839A1 (en) 2019-11-12 2022-12-15 Foundation Medicine, Inc. Methods of detecting a fusion gene encoding a neoantigen
MX2022005666A (es) 2019-11-14 2022-10-07 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de citocina activables y metodos de uso de los mismos.
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
EP4069742A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
CN115916817A (zh) 2019-12-06 2023-04-04 朱诺治疗学股份有限公司 针对bcma靶向结合结构域的抗独特型抗体及相关组合物和方法
MX2022007231A (es) 2019-12-13 2022-07-12 Alector Llc Anticuerpos anti-mertk y metodos de uso de los mismos.
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
KR20220100963A (ko) 2019-12-18 2022-07-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 Hla-a2/mage-a4에 결합하는 항체
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
UA128549C2 (uk) 2019-12-27 2024-08-07 Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся Антитіло до ctla-4 та його застосування
AU2020416273A1 (en) 2020-01-03 2022-07-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021155295A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 The Cleveland Clinic Foundation Anti-müllerian hormone receptor 2 antibodies and methods of use
MX2022009391A (es) 2020-01-31 2022-09-26 Genentech Inc Metodos para inducir linfocitos t especificos para neoepitopo con un antagonista de union al eje de pd-1 y una vacuna de arn.
TWI895351B (zh) 2020-02-12 2025-09-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
TWI890283B (zh) 2020-02-14 2025-07-11 美商基利科學股份有限公司 結合ccr8之抗體及融合蛋白及其用途
WO2021168292A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
KR20220148209A (ko) 2020-02-28 2022-11-04 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항cd137 작제물 및 그 용도
KR20220145859A (ko) 2020-02-28 2022-10-31 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항cd137 작제물, 다중 특이적 항체 및 그 용도
PE20230252A1 (es) 2020-03-13 2023-02-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y sus usos de estos
CN117551194A (zh) 2020-03-19 2024-02-13 基因泰克公司 同种型选择性抗TGF-β抗体及使用方法
AU2021242249A1 (en) 2020-03-24 2022-08-18 Genentech, Inc. Tie2-binding agents and methods of use
JP2023518841A (ja) 2020-03-26 2023-05-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 宿主細胞タンパク質が減少した修飾哺乳動物細胞
CN116075525A (zh) 2020-03-31 2023-05-05 艾莱克特有限责任公司 抗mertk抗体及其使用方法
WO2021202959A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
CN115916822A (zh) 2020-04-24 2023-04-04 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物的方法
JP2023523145A (ja) 2020-04-27 2023-06-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア リポ蛋白（ａ）に対するイソ型非依存性抗体
EP4143345A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for non-small cell lung cancer immunotherapy
TW202200212A (zh) 2020-05-03 2022-01-01 中國大陸商聯寧（蘇州）生物製藥有限公司 包含抗-trop-2抗體之抗體藥物結合物
EP4157881A4 (en) 2020-05-27 2024-10-09 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY RECOGNIZE NERVE GROWTH FACTOR AND THEIR USES
WO2021243204A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 23Andme, Inc. Anti-cd200r1 antibodies and methods of use thereof
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
EP4157462A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-cd93 constructs and uses thereof
PE20240080A1 (es) 2020-06-08 2024-01-16 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso
JP2023529206A (ja) 2020-06-12 2023-07-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド がん免疫療法のための方法及び組成物
AU2021293038A1 (en) 2020-06-16 2023-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
KR20230024368A (ko) 2020-06-18 2023-02-20 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 pd-1 축 결합 길항제를 사용한 치료
WO2021255155A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cd19
PH12022553489A1 (en) 2020-06-19 2024-04-22 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3 and folr1
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
PE20230835A1 (es) 2020-06-19 2023-05-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
WO2021259880A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Almirall, S.A. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
CA3184747A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
CR20230076A (es) 2020-07-10 2023-03-13 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a células cancerosas y dirigen radionucleótidos a dichas células
JP7846667B2 (ja) 2020-07-16 2026-04-15 レジェンド バイオテック アイルランド リミテッド Ｃｄ２０結合分子及びその使用
PH12023550112A1 (en) 2020-07-17 2024-06-24 Genentech Inc Anti-notch2 antibodies and methods of use
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
US20230322935A1 (en) 2020-07-29 2023-10-12 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-cd93 constructs and uses thereof
JP2023536602A (ja) 2020-08-03 2023-08-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド リンパ腫のための診断及び治療方法
EP4192868A1 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
BR112023002123A2 (pt) 2020-08-07 2023-03-07 Genentech Inc Proteína de fusão fc, ácidos nucleicos isolados, método de produção da proteína de fusão fc, formulação farmacêutica, métodos para expandir o número de células dendríticas (dcs) em um indivíduo e para tratar um câncer, proteína fc sem efetora e anticorpo
TW202221026A (zh) 2020-08-14 2022-06-01 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途
WO2022043517A2 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Cureab Gmbh Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
CA3192344A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Genentech, Inc. Crispr/cas9 multiplex knockout of host cell proteins
EP4208201A1 (en) 2020-09-04 2023-07-12 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody that binds to vegf-a and ang2 and methods of use
IL301269A (en) 2020-09-14 2023-05-01 Ichnos Sciences S A Antibodies that bind to IL1RAP and their uses
CN118146384A (zh) 2020-09-28 2024-06-07 安济盛生物医药有限公司 抗硬骨抑素构建体及其用途
KR20230104611A (ko) 2020-09-30 2023-07-10 드렌 바이오, 인크. 항-cd94 항체 및 이의 사용 방법
CN116406291A (zh) 2020-10-05 2023-07-07 基因泰克公司 用抗fcrh5/抗cd3双特异性抗体进行治疗的给药
CA3198102A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Dren Bio, Inc. Anti-dectin-1 antibodies and methods of use thereof
WO2022084400A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof
WO2022084210A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1 axis binding antagonists and lrrk2 inhitibors
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
JP7716473B2 (ja) 2020-11-04 2025-07-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の皮下投薬
TWI874719B (zh) 2020-11-04 2025-03-01 美商建南德克公司 用抗cd20/抗cd3雙特異性抗體進行治療之給藥
AU2021374594B2 (en) 2020-11-04 2026-03-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
WO2022115865A2 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Xilio Development, Inc. Tumor-specific cleavable linkers
EP4255930A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Alector LLC Methods of use of anti-sortilin antibodies
WO2022116877A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Shanghai Henlius Biotech, Inc. ANTI-GARP/TGFβ ANTIBODIES AND METHODS OF USE
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
JP2024504931A (ja) 2021-01-12 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体
CA3204291A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
JP2024504493A (ja) 2021-01-28 2024-01-31 ヴァクスィーンヴェント ゲーエムベーハー Ｂ細胞媒介性免疫応答を調節するための方法及び手段
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
WO2022169872A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
WO2022173689A1 (en) 2021-02-09 2022-08-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
AU2022221297A1 (en) 2021-02-09 2023-08-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies targeting the spike protein of coronaviruses
KR20230146032A (ko) 2021-02-15 2023-10-18 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 Tgf-b 신호전달을 조절하기 위한 세포 치료 조성물 및 방법
EP4301467A1 (en) 2021-03-01 2024-01-10 Xilio Development, Inc. Combination of ctla4 and pd1/pdl1 antibodies for treating cancer
CA3209364A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Jennifer O'neil Combination of masked ctla4 and pd1/pdl1 antibodies for treating cancer
US20240181073A1 (en) 2021-03-03 2024-06-06 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-Drug Conjugates Comprising an Anti-BCMA Antibody
TW202302646A (zh) 2021-03-05 2023-01-16 美商當康生物科技有限公司 抗vista構築體及其用途
IL305758A (en) 2021-03-10 2023-11-01 Immunowake Inc Immunomodulatory compounds and their uses
WO2022192647A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
AU2022238526A1 (en) 2021-03-15 2023-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods of treating lupus nephritis
WO2022197947A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 Alector Llc Anti-tmem106b antibodies and methods of use thereof
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
JP2024511610A (ja) 2021-03-23 2024-03-14 アレクトル エルエルシー コロナウイルス感染の治療及び予防のための抗ｔｍｅｍ１０６ｂ抗体
EP4314049A1 (en) 2021-03-25 2024-02-07 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-igfbp7 constructs and uses thereof
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
EP4326855A1 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Genentech, Inc. Modified mammalian cells
WO2022223651A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Prevention or mitigation of nk cell engaging agent-related adverse effects
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
IL308351A (en) 2021-05-12 2024-01-01 Genentech Inc Methods for using anti-CD79B immunoconjugates to treat diffuse large B-cell lymphoma
EP4337330A1 (en) 2021-05-14 2024-03-20 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
AU2022273303A1 (en) 2021-05-14 2023-11-02 Genentech, Inc. Agonists of trem2
CN117396599A (zh) 2021-05-21 2024-01-12 基因泰克公司 用于生产目的重组产物的经修饰的细胞
TW202306994A (zh) 2021-06-04 2023-02-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ddr2抗體及其用途
CA3216220A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
EP4355786A1 (en) 2021-06-16 2024-04-24 Alector LLC Bispecific anti-mertk and anti-pdl1 antibodies and methods of use thereof
WO2022266221A1 (en) 2021-06-16 2022-12-22 Alector Llc Monovalent anti-mertk antibodies and methods of use thereof
US12227574B2 (en) 2021-06-17 2025-02-18 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-CD3 constructs and uses thereof
US20240279321A1 (en) 2021-06-18 2024-08-22 Therini Bio, Inc. ANTIBODIES WHICH BIND HUMAN FIBRIN OR FIBRINOGEN yC DOMAIN AND METHODS OF USE
TWI879694B (zh) 2021-06-25 2025-04-01 日商中外製藥股份有限公司 抗ctla-4抗體的用途
AR126220A1 (es) 2021-06-25 2023-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-ctla-4
CN118103397A (zh) 2021-07-08 2024-05-28 舒泰神(加州)生物科技有限公司 特异性识别tnfr2的抗体及其用途
US20240343817A1 (en) 2021-07-14 2024-10-17 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibody that specifically recognizes cd40 and application thereof
US12240910B2 (en) 2021-07-14 2025-03-04 Genentech, Inc. Anti-C-C motif chemokine receptor 8 (CCR8) antibodies and methods of use
EP4373859A1 (en) 2021-07-22 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Heterodimeric fc domain antibodies
WO2023004386A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Genentech, Inc. Brain targeting compositions and methods of use thereof
CN117794953A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗体及使用方法
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
CN117897409A (zh) 2021-08-13 2024-04-16 基因泰克公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
WO2023021055A1 (en) 2021-08-19 2023-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent anti-variant fc-region antibodies and methods of use
JP2024534151A (ja) 2021-08-27 2024-09-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド タウ病態の治療方法
WO2023034750A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
CA3232223A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Ying Fu Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
WO2023056403A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Genentech, Inc. Methods for treatment of hematologic cancers using anti-tigit antibodies, anti-cd38 antibodies, and pd-1 axis binding antagonists
EP4413998A4 (en) 2021-10-08 2026-02-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR PREPARING A PRE-FILLED SYRINGE FORMULATION
WO2023069919A1 (en) 2021-10-19 2023-04-27 Alector Llc Anti-cd300lb antibodies and methods of use thereof
US20250251400A1 (en) 2021-11-05 2025-08-07 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal Antibodies Against Carcinoembryonic Antigens, and Their Uses
EP4430072A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
AU2022390134A1 (en) 2021-11-16 2024-05-16 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
TW202337494A (zh) 2021-11-16 2023-10-01 美商建南德克公司 用莫蘇妥珠單抗治療全身性紅斑狼瘡（ｓｌｅ）之方法及組成物
EP4437006A1 (en) 2021-11-26 2024-10-02 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
EP4445911A4 (en) 2021-12-06 2025-10-22 Beijing Solobio Genetechnology Co Ltd BISPECIFIC ANTIBODY THAT BINDS SPECIFICALLY TO KLEBSIELLA PNEUMONIAE O1 AND O2 ANTIGENS AND COMPOSITION
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
KR20240122784A (ko) 2021-12-17 2024-08-13 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항-ox40 항체 및 사용 방법
KR20240116755A (ko) 2021-12-17 2024-07-30 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항-ox40 항체, 다중 특이적 항체 및 이의 사용 방법
UY40097A (es) 2022-01-07 2023-07-14 Johnson & Johnson Entpr Innovation Inc Materiales y métodos de proteínas de unión a il-1b
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
KR20240142563A (ko) 2022-02-10 2024-09-30 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 코로나바이러스를 광범위하게 표적으로 하는 인간 모노클로날 항체
CA3243689A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Ac Immune Sa Humanized Anti-TDP-43 Bonding Molecules and Their Uses
AU2023221861A1 (en) 2022-02-18 2024-09-05 Rakuten Medical, Inc. Anti-programmed death-ligand 1 (pd-l1) antibody molecules, encoding polynucleotides, and methods of use
EP4489790A1 (en) 2022-03-10 2025-01-15 Vivasor, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
MX2024011468A (es) 2022-03-23 2024-09-25 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto de un anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y quimioterapia.
CA3245762A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Shanghai Henlius Biologics Co., Ltd. ANTI-MSLN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US20250197482A1 (en) 2022-03-26 2025-06-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
EP4499228A1 (en) 2022-03-28 2025-02-05 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
IL315770A (en) 2022-04-01 2024-11-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-FCRH5/anti-CD3 antibodies
US20260043816A1 (en) 2022-04-08 2026-02-12 Ac Immune Sa Anti-TDP-43 Binding Molecules
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
US20250257123A1 (en) 2022-04-20 2025-08-14 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
AU2023264069A1 (en) 2022-05-03 2024-10-24 Genentech, Inc. Anti-ly6e antibodies, immunoconjugates, and uses thereof
CN119487065A (zh) 2022-05-09 2025-02-18 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别gdf15的抗体及其应用
AR129268A1 (es) 2022-05-11 2024-08-07 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a e il6 y métodos de uso
JP2025517650A (ja) 2022-05-11 2025-06-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＦｃＲＨ５／抗ＣＤ３二重特異性抗体による処置のための投与
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
KR20250022049A (ko) 2022-06-07 2025-02-14 제넨테크, 인크. 항-pd-l1 길항제 및 항-tigit 길항제 항체를 포함하는, 폐암 치료의 효율을 결정하는 방법
US20250382354A1 (en) 2022-06-08 2025-12-18 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
US12600801B2 (en) 2022-07-11 2026-04-14 Fred Hutchinson Cancer Center Single-domain antibodies that bind ROR1
AU2023305619A1 (en) 2022-07-13 2025-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
KR20250040020A (ko) 2022-07-19 2025-03-21 제넨테크, 인크. 항-fcrh5/항-cd3 이중특이성 항체로 치료하기 위한 투약법
CN120322455A (zh) 2022-07-19 2025-07-15 舒泰神(加州)生物科技有限公司 特异性识别b和t淋巴细胞衰减器(btla)的抗体及其应用
TW202417504A (zh) 2022-07-22 2024-05-01 美商建南德克公司 抗ｓｔｅａｐ１抗原結合分子及其用途
MA71628A (fr) 2022-07-29 2025-05-30 Alector Llc Anticorps anti-gpnmb et leurs méthodes d'utilisation
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
MA71684A (fr) 2022-08-05 2025-05-30 Janssen Biotech, Inc. Protéines de liaison de récepteur de transferrine pour traitement de tumeurs cérébrales
CA3263779A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. CD98 LINKAGE CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF BRAIN TUMORS
US20260053742A1 (en) 2022-08-19 2026-02-26 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Formulations comprising g-csf and uses thereof
EP4577578A1 (en) 2022-08-22 2025-07-02 Abdera Therapeutics Inc. Dll3 binding molecules and uses thereof
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
EP4581366A1 (en) 2022-09-01 2025-07-09 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
EP4584296A1 (en) 2022-09-07 2025-07-16 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
EP4596580A4 (en) 2022-09-27 2026-01-21 Staidson Beijing Biopharmaceuticals Co Ltd ANTIBODIES TO SPECIFICALLY RECOGNIZE LIGHT LIGANDS AND THEIR USE
WO2024077239A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies
WO2024086796A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Alector Llc Anti-ms4a4a antibodies with amyloid-beta therapies
CN120693395A (zh) 2022-10-20 2025-09-23 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 特异性结合TRAIL或FasL的抗体组合以及双特异性抗体
KR20250093336A (ko) 2022-10-25 2025-06-24 제넨테크, 인크. 다발성 골수종에 대한 치료 및 진단 방법
JP2025537137A (ja) 2022-11-04 2025-11-14 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド 抗ｃｃｒ８抗体、化学療法及び免疫療法の組み合わせを使用する抗がん療法
EP4615872A1 (en) 2022-11-08 2025-09-17 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
EP4615580A1 (en) 2022-11-09 2025-09-17 CIS Biopharma AG Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
EP4619045A1 (en) 2022-11-17 2025-09-24 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
JPWO2024111657A1 (ja) 2022-11-25 2024-05-30
EP4588936A1 (en) 2022-12-08 2025-07-23 Changchun Bcht Biotechnology Co. Antibodies specifically binding to rsv
WO2024137381A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies for treating sars-cov-2 infection
WO2024148232A2 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Alector Llc Anti-il18 binding protein antibodies and methods of use thereof
JP2026510546A (ja) 2023-01-18 2026-04-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体およびその使用
CN120569410A (zh) 2023-01-25 2025-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 与csf1r和cd3结合的抗体
AU2024221322A1 (en) 2023-02-17 2025-07-03 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind interleukin 4 receptor alpha and methods of use
EP4676596A1 (en) 2023-03-08 2026-01-14 AC Immune SA Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
JP2026509243A (ja) 2023-03-10 2026-03-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド プロテアーゼとの融合およびその使用
CN120936626A (zh) 2023-03-31 2025-11-11 基因泰克公司 抗αvβ8整合素抗体及使用方法
CN121969397A (zh) 2023-04-05 2026-05-01 维硕公司 抗体偶联药物及其用途
WO2024211235A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
CN121969398A (zh) 2023-04-05 2026-05-01 维硕公司 抗体偶联药物及其用途
CN121263432A (zh) 2023-04-12 2026-01-02 上海康抗生物技术有限公司 包含掩蔽型白介素12的多功能分子及使用方法
KR20260012304A (ko) 2023-04-17 2026-01-26 피크 바이오, 인크. 항체 및 항체-약물 접합체 및 사용 방법 및 합성 공정 및 중간체
AU2024270495A1 (en) 2023-05-05 2025-10-09 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
EP4709752A1 (en) 2023-05-08 2026-03-18 F. Hoffmann-La Roche AG Targeted interferon alpha fusion proteins and methods of use
EP4709484A1 (en) 2023-05-10 2026-03-18 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
AU2024273454A1 (en) 2023-05-16 2025-11-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Pd-1-regulated il-2 immunocytokine and uses thereof
WO2024243355A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that target the rh5 complex of blood-stage plasmodium falciparum
KR20260021689A (ko) 2023-06-08 2026-02-13 제넨테크, 인크. 림프종 진단 및 치료 방법을 위한 대식세포 시그니처
CN121311247A (zh) 2023-06-09 2026-01-09 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性结合masp3的抗体以及特异性结合masp3和masp2的多特异性抗体
CN121358781A (zh) 2023-06-16 2026-01-16 江苏贝捷泰生物科技有限公司 特异性识别因子XIIa的抗体及其应用
EP4731668A1 (en) 2023-06-22 2026-04-29 Genentech, Inc. Antibodies and uses thereof
EP4731255A1 (en) 2023-06-22 2026-04-29 Genentech, Inc. Treatment of multiple myeloma
AU2024309736A1 (en) 2023-06-30 2026-01-15 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd G-csf dimer for use in the treatment or prevention of chemotherapy or radiotherapy induced neutropenia
WO2025014896A1 (en) 2023-07-07 2025-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Humanized 40h3 antibody
AU2024300009A1 (en) 2023-07-21 2026-01-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies that broadly target coronaviruses
AU2024300993A1 (en) 2023-07-26 2026-01-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
WO2025034806A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Single-domain antibodies and variants thereof against fibroblast activation protein
WO2025032069A1 (en) 2023-08-09 2025-02-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Mono and multispecific anti-trem2 antibodies, methods and uses thereof
KR20260051042A (ko) 2023-08-09 2026-04-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 단일 및 다중특이성 항-trem2 항체, 그 방법 및 용도
CN121620524A (zh) 2023-08-09 2026-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 抗A-β蛋白抗体、方法及其用途
AU2024324215A1 (en) 2023-08-11 2026-02-26 Abalytics Oncology, Inc. Anti-ctla-4 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof
WO2025045251A2 (en) 2023-09-03 2025-03-06 Kira Pharmaceuticals (Us) Llc Multispecific constructs comprising anti-factor d moiety
WO2025064539A1 (en) 2023-09-19 2025-03-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Herv-e antibodies and methods of their use
AR133909A1 (es) 2023-09-25 2025-11-12 Hoffmann La Roche ANTICUERPO QUE SE UNE A C3bBb
WO2025072726A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Trex Bio, Inc. Tnf-alpha variant fusion molecules
WO2025099280A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Oxion Biologics Ab Improved anti-ox40l antibodies
WO2025099120A1 (en) 2023-11-09 2025-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies with conditional activity
WO2025106474A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for treating cancer with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2025106427A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing and protective monoclonal antibodies against respiratory syncytial virus (rsv)
WO2025111402A1 (en) 2023-11-21 2025-05-30 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Anti-amyloid beta antibodies and related compositions and methods thereof
WO2025117384A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly neutralizing influenza hemagglutinin stem-directed antibodies
WO2025125118A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease activatable fc domain binding molecules
WO2025125386A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that bind to folr1 and methods of use
TW202535949A (zh) 2023-12-20 2025-09-16 美商必治妥美雅史谷比公司 靶向IL-18受體β(IL-18RB)之抗體及相關方法
WO2025137410A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Apogee Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions of anti-il-13 antibodies with and without c-terminal lysine
WO2025132503A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to ceacam5
WO2025137523A2 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Apogee Therapeutics, Inc. Pharmaceutical formulations of antibodies that bind interleukin 13
WO2025137284A2 (en) 2023-12-21 2025-06-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly neutralizing antibodies against sars-cov-2 and sars-cov variants
WO2025133042A2 (en) 2023-12-22 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Activatable fusion proteins and methods of use
WO2025179281A1 (en) 2024-02-23 2025-08-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Treatment of cardiovascular disease with antxr1 antibodies
WO2025184416A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single-domain antibodies and bispecific antibodies against hiv-1 and their use
WO2025184421A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors and antibodies specific for delta-like ligand 3 (dll3) and related methods
WO2025181189A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
WO2025199352A2 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies specific for solute carrier family 34 member 2 (slc34a2)
WO2025196639A1 (en) 2024-03-21 2025-09-25 Seagen Inc. Cd25 antibodies, antibody-drug conjugates, and uses thereof
WO2025215060A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that specifically bind modified oligonucleotides
WO2025226808A1 (en) 2024-04-24 2025-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
WO2025238187A1 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Cis Biopharma Ag Immunoconjugates targeting l1-cam
WO2025240670A2 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Abalytics Oncology, Inc. Anti-pd-1 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof
WO2025242909A1 (en) 2024-05-24 2025-11-27 Paul Scherrer Institut CD30-targeting antibody-radioligand conjugates and their therapeutic use
WO2025250969A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Anti-cd74 antibodies, conjugates and uses thereof
WO2025255353A1 (en) 2024-06-06 2025-12-11 Apogee Therapeutics, Inc. Dosage and administration of an anti-ox40l antibody
WO2025262564A1 (en) 2024-06-17 2025-12-26 Pfizer Inc. Use of anti-cxcr5 antibodies
WO2025264972A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-4r alpha and antibodies that bind
WO2025264960A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-13 and antibodies that bind ox40l
WO2026013218A1 (en) 2024-07-10 2026-01-15 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 vectors, binding molecules and uses thereof
EP4684803A1 (en) 2024-07-25 2026-01-28 CeMM - Forschungszentrum für Molekulare Medizin GmbH Antibody conjugated chemical inducers of degradation of rbm39 and therapeutic uses thereof
WO2026030464A1 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Genentech, Inc. Dosage regimen for reducing cytokine release syndrome (crs) with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies in multiple myeloma therapy
WO2026030473A1 (en) 2024-07-31 2026-02-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services West nile virus neutralizing monoclonal antibodies
WO2026041568A1 (en) 2024-08-20 2026-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and dotam
WO2026050244A1 (en) 2024-08-26 2026-03-05 Angitia Incorporated Limited Methods of treating or preventing osteoporosis and low bone mass
WO2026072685A1 (en) 2024-09-25 2026-04-02 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
WO2026080829A1 (en) 2024-10-10 2026-04-16 Apogee Therapeutics, Inc. Methods of administering antibodies that bind interleukin 13
WO2026085415A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-13 and antibodies that bind tslp in combination with hyaluronidase or a variant thereof
WO2026085414A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind tslp and antibodies that bind interleukin 4 receptor alpha in combination with hyaluronidase or a variant thereof
WO2026085419A2 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind il-13 in combination with hyaluronidase or a variant thereof
WO2026085417A2 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Apogee Therapeutics, Inc. Antibodies that bind interleukin 4 receptor alpha in combination with hyaluronidase or a variant thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5324663A (en) 1990-02-14 1994-06-28 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
CA2704600C (en) * 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
WO2000064262A1 (en) * 1999-04-26 2000-11-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Antisense human fucosyltransferase sequences and methods of use thereof
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
CA2953239A1 (en) * 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
ATE503829T1 (de) * 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUBKE T. ET AL.: "Complementation cloning identifies CDG-IIc, a new type of congenital disorders of glycosylation, as a GDP-fucose transporter deficiency", NAT. GENET., vol. 28, no. 1, 2001, pages 73 - 76, XP002970287 *
LUHN K. ET AL.: "The gene defective in leukocyte adhesion deficiency II encodes a putative GDP-fucose transporter", NAT. GENET., vol. 28, no. 1, 2001, pages 69 - 72, XP002970288 *
PUGLIELLI L. ET AL.: "Reconstitution, identification and purification of the rat liver golgi membrane GDP-fucose transporter", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 50, 1999, pages 35596 - 35600, XP002970290 *
ROOS D. ET AL.: "Hematologically important mutations: leukocyte adhesion deficiency", BLOOD CELLS MOL. DIS., vol. 27, no. 6, 2001, pages 1000 - 1004, XP002970289 *
SHINKAWA T. ET AL.: "The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 5, 2003, pages 3466 - 3473, XP002965857 *
ZHOU Y. ET AL.: "Post-transcriptional suppression of gene expression in xenopus embryos by small interfering RNA", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 30, no. 7, 1 April 2002 (2002-04-01), pages 1664 - 1669, XP002970291 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9718889B2 (en) 2000-04-12 2017-08-01 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function
US8153124B2 (en) 2000-04-12 2012-04-10 Lfb Biotechnologies Method for treating cancer using monoclonal antibodies
US10081683B2 (en) 2000-04-12 2018-09-25 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function
US9718890B2 (en) 2000-04-12 2017-08-01 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function
US8409572B2 (en) 2000-04-12 2013-04-02 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function
US8178093B2 (en) 2000-04-12 2012-05-15 Lfb Biotechnologies Method for treating infectious disease using monoclonal antibodies
US9708409B2 (en) 2000-04-12 2017-07-18 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function
US8685725B2 (en) 2000-04-12 2014-04-01 Labortoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function
US8357370B2 (en) 2000-04-12 2013-01-22 Lfb Biotechnologies Anti-D monoclonal antibodies
US7541029B2 (en) 2000-04-12 2009-06-02 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anti-rhesus D monoclonal antibodies
US7579170B2 (en) 2000-04-12 2009-08-25 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Method for preparing monoclonal antibodies capable of activating effector cells expressing FCγRIII
US7931895B2 (en) 2000-04-12 2011-04-26 Lfb Biotechnologies Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function
US8124078B2 (en) 2000-04-12 2012-02-28 Lfb Biotechnologies Method for treating idiopathic thrombocytopenic purpura using monoclonal antibodies
EP1500400A4 (en) * 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
WO2005017155A1 (ja) * 2003-06-18 2005-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーター
JPWO2005017155A1 (ja) * 2003-06-18 2006-10-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーター
WO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
JPWO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
JPWO2006067847A1 (ja) * 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
JPWO2006067913A1 (ja) * 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
WO2006067847A1 (ja) * 2004-12-22 2006-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
WO2006067913A1 (ja) * 2004-12-22 2006-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
WO2012176779A1 (ja) 2011-06-20 2012-12-27 協和発酵キリン株式会社 抗ｅｒｂＢ３抗体
WO2014054804A1 (ja) 2012-10-05 2014-04-10 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
WO2020067541A1 (ja) 2018-09-28 2020-04-02 協和キリン株式会社 抗体組成物
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
WO2021201236A1 (ja) 2020-04-01 2021-10-07 協和キリン株式会社 抗体組成物
WO2025133290A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Temper Bio Protein for immune regulation
WO2025149633A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Laigo Bio B.V. Bispecific antigen binding proteins

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003236020A1 (en) 2003-10-20
US20100291628A1 (en) 2010-11-18
DE60336548D1 (de) 2011-05-12
ATE503829T1 (de) 2011-04-15
US20040110282A1 (en) 2004-06-10
US7749753B2 (en) 2010-07-06
EP1500698A1 (en) 2005-01-26
US8361751B2 (en) 2013-01-29
AU2003236020B2 (en) 2009-03-19
EP1500698B1 (en) 2011-03-30
JPWO2003085102A1 (ja) 2005-08-11
JP4628679B2 (ja) 2011-02-09
EP1500698A4 (en) 2006-02-15
ES2362419T3 (es) 2011-07-05
CA2481656A1 (en) 2003-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4628679B2 (ja) Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
JP5770783B2 (ja) 抗体組成物
CN1930288B (zh) 基因组被修饰的细胞
EP1705251A1 (en) PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY USING RNA INHIBITING THE FUNCTION OF a1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
US20040132140A1 (en) Production process for antibody composition
WO2003055993A1 (en) Composition of antibody specifically binding to cd20
WO2003085119A1 (en) METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcϜ RECEPTOR IIIa
JPWO2006013964A1 (ja) 糖蛋白質組成物の製造法
WO2005035741A1 (ja) ゲノムが改変された細胞
JPWO2005035740A1 (ja) 無血清馴化したゲノム改変細胞
HK1072619A (en) Cells with modified genome

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003582281

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2481656

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003236020

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003720896

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003720896

Country of ref document: EP