JP2000507816A - 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫グロブリン様ドメインおよびそれらの部分（例えば、抗体Fc-ヒンジフラグメント、サブフラグメント、および延長された生物学的半減期を有する変異ドメイン）をコードする組換えベクターが開示される。宿主細胞による発現の後のこのようなドメイン、ヘテロダイマーおよび融合タンパク質の大量産生の方法もまた報告される。インタクトな抗体と同じインビボ安定性を有する抗体FcおよびFc-ヒンジドメイン；ならびにインビボで半減期を増加させるように操作されたドメインが記載されている。これらのDNA構築物およびタンパク質ドメインは、インビトロ突然変異誘発および高分解能構造研究のため；免疫およびワクチン接種のため；ならびに治療的および診断的使用のための、安定性および寿命を増加させた組換え抗体またはキメラタンパク質の産生のための鋳型として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン １．発明の分野 本発明は、一般に、FcレセプターFcRnにより媒介される、血清タンパク質およ び抗体の輸送の分野、およびさらにはpH依存様式でFcレセプターと相互作用する 因子の血清半減期に対する効果に関連する。 ２．関連技術の説明 IgGは、ヒトおよび他の哺乳動物の血清において最も優勢な免疫グロブリンク ラスを構成し、そして驚くほど一定レベルに維持される。最近の研究により、主 要組織適合遺伝子複合体(MHC)-クラスＩ関連レセプターFcRnが血清IgGのホメオ スタシスに関与していることが示される(Ghetieら、1996；JunghansおよびAnder son、1996；Israelら、1996)。このレセプターは、ほぼ間違いなくサルベージレ セプターとして作用し、そしてこのことは、新生児消化管(WallaceおよびRees、 1980；RodewaldおよびKraehenbuhl、1984)および卵黄嚢(Robertsら、1990；Isra elら、1995)または胎盤(KristoffersenおよびMatre、1996；Simisterら、1996； Leachら、1996)を横切って、インタクトな形態のIgGを経細胞輸送するその既知 の能力と一致する。マウスIgGl(mIgGl)に対するFcRnの相互作用部位は、組換えF c-ヒンジフラグメントの部位特異的変異誘発、続いてインビボおよびインビトロ の両方でのこれらのフラグメントの分析を使用してマッピングされた(Kimら、19 94b；Medesanら、1996；1997)。これらの研究から、I253(EU番号付(Edelmanら、 1969))、H310、H435、およびH436(より劣った程度で)は、この相互作用において 中心的な役割を演じる。これらのアミノ酸は、CH2-CH3ドメイン界面に位置し(De isenhofer、1981)、そしてこれらの残基への機能的部位のマッピングは、ラット Fcと複合体化したラットFcRnのＸ線結晶学的構造と一致する(Burmeisterら、199 4b)。 FcRnの相互作用部位は、一次アミノ酸配列では遠位である配列から構成される 、 空間的に接近した３つのループを包含する。この部位の構築におけるFcヒスチジ ンの中心的役割は、Fc-FcRn相互作用の顕著なpH依存性(pH6.0で結合、pH7.4で遊 離)(RodewaldおよびKraehenbuhl、1984;Raghavanら、1995；Popovら、1996)を説 明する。なぜなら、イミダゾールプロトンの１つのpKaが、このpH範囲にあるか らである。1253、H310、H435、およびH436(より劣った程度で)は、ヒトおよび齧 歯類の両方のIgGにおいて高度に保存されている(Kabatら、1991)。このことは、 FcRnのヒトホモログの単離(Storyら、1994)と考え合わせると、IgGホメオスタシ スに関与する分子メカニズムが、マウスおよびヒトの両方で共通であり、そして これは、治療における使用のためのIgGの薬物動態の調整に影響を及ぼすことを 示す。 現在まで、Fc上のFcRn相互作用部位を同定する研究において、対応するFc-ヒ ンジフラグメントの血清半減期を減少させる、Fc-ヒンジフラグメントの変異が 作成された(Medesanら、1997；Kimら、1994a)。血清半減期とFcRnの結合親和性( affinity)との間の相関は、これらの変異させたFc-ヒンジフラグメントについて 極めて良好であり(Kimら、1994b；Popovら、1996)、このことは、FcRn-Fc相互作 用の親和性が、pH依存性をなお保持しながら増大する場合、これは、延長された 血清存続性を有するFcフラグメントを生じることを示唆する。このようなフラグ メントの産生は、改善された薬物動態(例えば、循環における増大した存続性)を 有する治療用IgGを新たに作製するエンジニアリングにおける顕著な前進である 。しかし、現在、そのようなフラグメントは産生されていない。 免疫グロブリンFcドメインはまた、抗体安定化、異化作用、および免疫系のさ らなる分子との抗体の相互作用のメカニズムを研究する目的にとても重要である 。これらは、抗体のクラスに依存して、補体との相互作用、および他の細胞(マ クロファージ、好中球およびマスト細胞を含む)の特異的レセプターへの結合を 包含する。Fc領域の生物学のより詳細な知識は、免疫系の種々の分子プロセス( 例えば、食作用、抗体依存性細胞媒介細胞毒性およびアレルギー反応)を理解す る上で重要である。 FcRnへの結合が増大した、より長く生存するFcフラグメントの産生は、魅力的 である。なぜなら、このようなフラグメントは、治療試薬をタグ付けするために 使用され得るからである。この様式で産生されるキメラタンパク質は、高いイン ビボ安定性という利点を有する。この安定性は、血流中での増大した存続性を通 じて、因子がより少ない投与で治療に使用されることを可能にし、そしておそら くより低い用量の因子が使用されることを可能にする。不運にも、増大した血清 存続性を有するタンパク質(例えば、抗体フラグメント)を作製する方法論は、ま だ開発されていない。 発明の要旨 本発明は、Fcレセプター(FcRn)との相互作用により増大した血清半減期を有す る機能的なタンパク質、抗体または他の因子を提供することによって、当該分野 における欠陥を克服しようとする。これらの機能的因子には、pH依存的な様式で FcRnと結合し、その結果、結合親和性が、pH7.4での結合と比べて、約pH６〜約p H6.5で強い任意の分子が含まれる。生理学的には、このことは、因子が、より低 いpHでFcRnによりサルベージされ、そして血清の本質的に中性なpH環境中に遊離 されることを可能にする。本開示には、IgGに対して改変された血清半減期を有 するタンパク質およびペプチド組成物、公知の配列から開始するかまたはランダ ム配列をスクリーニングすることによるかのいずれかでこのようなタンパク質ま たはペプチドを作製する方法、およびpH依存性FcRn結合について未知の候補因子 をスクリーニングする方法が含まれる。さらに、改変された血清半減期を有する 因子を、FcRnとの相互作用により増大した血清半減期を有すると同定された部分 にその因子を接合させるかまたはそうでなければ結合させることによって作製す る方法が、本明細書中に開示される。このような因子には、抗体、抗体のフラグ メント、ホルモン、レセプターリガンド、イムノトキシン、任意の種類の治療薬 物、Ｔ細胞レセプター結合抗原、および本発明の増大した血清半減期部分に結合 され得る他の任意の因子が含まれるが、これらに限定されない。 タンパク質またはペプチドが、増大した血清半減期を有するように、FcRn結合 タンパク質またはペプチドのFcRn結合親和性を増大させる方法もまた、開示され る。これらの方法は、FcRnと直接相互作用するアミノ酸を同定することを包含す る。これらのアミノ酸は、それらが、広範囲の種にわたり高度に保存されている ことによって、または他の任意の方法によって同定され得る。他の方法には、例 えば、アミノ酸変異またはブロッキング、およびFcRnに対する減少した結合につ いてのスクリーニングを包含するか、または相互作用の三次元構造の研究、また は当該分野において公知の他の方法による。直接相互作用する残基が同定される 場合、その側鎖が直接的相互作用の空間的近傍にある二次アミノ酸が、同定され る。抗体の場合、これら二次アミノ酸は、しばしばループで生じ、その結果、こ れらは溶媒に曝される。この様式では、これらのアミノ酸の変異はネイティブな タンパク質構造を破壊すると期待されない。次いで、これらの同定された二次ア ミノ酸は、ランダムに変異され、次いで、この変異タンパク質またはペプチドは 、約pH６で、非変異タンパク質またはペプチドに対して、FcRnに関する増大した 結合親和性についてスクリーニングされる。この方法は、pH依存性様式でFcRnと 結合する任意のタンパク質またはペプチドに適用可能であり、そしてこのような タンパク質またはペプチドすべてが、本願発明に包含される。ランダム変異はそ れ自体は本発明を構成しないこと、および二次アミノ酸は、当該分野において公 知の任意の方法で、特異的に、変異または改変あるいは誘導体化され得、次いで FcRn結合に対する効果についてスクリーニングされ得ることもまた理解される。 特定の広い局面では、本発明は、増大したインビボまたは血清半減期を有する よう操作された、組換え抗体または抗体Fc-ヒンジドメインの設計および産生を 包含する。本発明の増大した血清半減期を有するFc-ヒンジドメイン変異体は、 一般に、Fc-ヒンジフラグメントのCH2-CH3ドメイン界面における１つ以上の天然 残基が、別のアミノ酸と交換されている変異体として定義される。このようなFc -ヒンジドメイン変異体はまた、損なわれたSpA(スタフィロコッカスタンパク質 Ａ)結合を示す変異体として機能的に定義され得る。好ましい実施態様において 、増大した半減期のFc-ヒンジ変異体は、「異化作用制御部位」を形成するかま たはこれに対して極めて近位にあることが見出されている、残基252付近と残基4 36付近との間の特定のアミノ酸に変化を有する。 さらなる実施態様において、本発明は、IgG:FcRn相互作用の親和性より必ずし も大きくなくても良い親和性を有する、FcRnと結合するペプチドまたは因子(し かし、このペプチドまたは因子は、なお、本明細書中に記載のようなpH依存性様 式でFcRnと結合しない同様なペプチドまたは因子より、測定可能に長い半減期を 有する)の単離を包含する。このようなペプチドまたは因子は、治療用因子また はタンパク質のための安定化「タグ」として有用であることが、予想される。 より具体的には、本発明は、１つ以上の下記のアミノ酸が他の残基と交換され ているドメインを有する変異Igドメインおよび抗体に関する：252位のスレオニ ン(thr)、254位のスレオニン、256位のスレオニン(ここで、アミノ酸は、Kabat ら(1991)に従って番号付けられている)。Fc-ヒンジドメインまたはインタクトな 抗体の半減期を増大させるために、上記の残基のうちの任意のものは、任意の他 のアミノ酸残基と置換され得、次いで、FcRnに関するより高い親和性を有する変 形体は、例えば、バクテリオファージディスプレイを使用して、または当業者に 公知の任意の他の方法によって選択され得る。置換は、本明細書において下記に 示すように、当業者に公知の任意の分子生物学的技術によって、または化学的改 変によってさえも、有利に達成され得る。 特定の増大した半減期の抗体またはドメインは、Kabatの番号付けシステムで の１つ以上の下記の置換、または異なる番号付けシステムでのそれらの等価物を 含むものである：スレオニン(thr)252からロイシン(leu)252、スレオニン254か らセリン(ser)254、スレオニン256からフェニルアラニン(phe)256。本明細書中 に開示される例は、以下の３つの変異を含むLSFと呼ばれる三重変異体である： スレオニン252からロイシン252、スレオニン254からセリン254、スレオニン256 からフェニルアラニン256。 より長いインビボ半減期を有するFc-ヒンジドメインの産生は、それが、Fc-ヒ ンジフラグメントの特異的領域に対するIgG1異化作用の制御部位をさらに正確に 描写する点、および実用的見地からは、いくつかの重要な適用を有する点で、有 利な進展である。これは、より長い半減期を有する抗体分子、ドメイン、または フラグメント(例えば、二価Fabフラグメント)の設計および構築を可能にする。 これらは、より緩慢な生物学的クリアランス時間が、抗体またはワクチンのより 少ない回数の投与に至り、その結果、より少ない回数の「追加免疫」ワクチン接種 で済ませられ得る点で、一般に有用である。さらに、より長い半減期を有するこ れらの分子は、他の治療分子(例えば、ワクチン分子)をタグ付けするために使用 され得る。本発明において正確に描写された異化作用部位は、ADCCおよび補体結 合部位とは異なる。このことは、完全に機能的でより長い半減期を有する抗体が 産生され得るので、重要である。他の重要な使用には、例えば、抗体ベースの全 身性薬物送達、より長い寿命を有するイムノトキシンの作製、または慢性疾患も しくは病的状態(例えば、枯草熱または他のアレルギー反応)のための抗体ベース の免疫療法、あるいは抗Ｔ細胞レセプター抗体またはＴ細胞抗原によるＴ細胞媒 介性自己免疫疾患の処置が含まれる。 Fc-ヒンジドメイン変異体はまた、臨床的投与を含むもの以外の実施態様、例 えば、IgGの異化作用に関与するレセプターの単離において用いられ得る。この 目的のために、変異体が、可能性のある異化作用レセプターに対して結合または 増大した結合を示す、スクリーニングアッセイまたはディファレンシャルスクリ ーニングアッセイが使用され得る。 抗体異化作用に関して本明細書において開示された知見はまた、ヒトまたは動 物に投与することを所望される、実質的に任意の組換えタンパク質(および特に 組換え抗体)のインビボ半減期を増大させるために有用であることを想像させる 。理想的に所望されるより迅速に身体から排除されることが見出された抗体また は組換えタンパク質は、本明細書中で同定される残基において、またはFcRnと直 接相互作用することが見出されるアミノ酸の近傍で操作され得、その結果、その インビボ半減期を増大させた。 特定の他の実施態様において、本発明は、増大したインビボ半減期を有する組 換え分子、特に抗体構築物(ワクチンおよびイムノトキシンを含む)の作製を企図 する。組換え分子の長寿はしばしば必要とされ、そしていくつかのプロトコルが 、設計した作用の発揮後、循環からより緩慢に除去される分子の設計から利益を 得る。これには、例えば、病原体、トキシン、生物学的不均衡を引き起こす物質 を取り除き、このことによりこれらが身体を傷つけるのを防ぐ目的で投与される 抗体；および免疫治療薬物およびワクチンの長期間の全身性送達を提供するよう 設計された抗体が含まれる。 より長い半減期を有するドメイン、抗体、または抗体構築物を作製するために 、「異化作用制御部位」を形成するか、またはこれに対して極めて近傍にある、Fc - ヒンジのCH2-CH3ドメイン界面の天然残基が改変される。抗体分子または抗体接 合体に容易に操作され得るいくつかの異化作用制御変異が、本明細書に記載され る。これらには、スレオニン252、スレオニン254、スレオニン256、メチオニン3 09、グルタミン311および/またはアスパラギン315(Kabatら、1991)を別の残基に 置換することを包含する。本発明はまた、異化作用制御に重要な他の残基を決定 するために有利な方法を提供する。 本発明のタンパク質またはペプチドは、組換え宿主細胞における、免疫グロブ リン様ドメイン(例えば、抗体ドメイン)または他のタンパク質もしくはペプチド の発現用に適合された組換えプラスミドまたは発現ベクターから発現され得る。 従って、組換えプラスミドは、１つ以上の免疫グロブリン様ドメインをコードす るDNAセグメントを含有し得る。従って、任意の、１つ以上の広範な種々の免疫 グロブリン様ドメインまたは他のタンパク質もしくはペプチドは、組換えベクタ ーに組み込まれ得、そして本明細書に従って宿主細胞中で発現される。これらに は、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEの可変ドメインもしくは定常ドメイン、Ｔ細胞レ セプター、MHCクラスＩもしくはMHCクラスII、およびさらにCD2、CD4、CD8、CD3 ポリペプチド、Thy-1、および干DGFレセプター、N-CAMもしくはNg-CAM由来のド メインが含まれるが、これらに限定されない。 特定の実施態様において、本発明は、抗体定常ドメインの発現および産生に関 する。抗体Fc-ヒンジ、Fc、CH2-ヒンジまたはCH3ドメインの産生が好ましく、Fc -ヒンジまたはFcドメインが、それらのより長いインビボ半減期のために特に好 ましい。他の例では、thr252、thr254またはthr256での変異を有するFc-ヒンジ ドメイン(またはこのようなドメインを組み込んでいる抗体)の産生が好ましい。 なぜなら、これらは特異的により長い半減期を有するからである。このような変 異体は、thr252からleu252、thr254からser254、およびthr256からphe256によっ て例示される。 上記の任意のドメインの種々のセグメントまたはサブフラグメント、ならびに 他の可変ドメインもしくは定常ドメインもまた、本明細書に従って用いられ得る 。これらのドメインには、例えば、免疫グロブリンドメインCH1が含まれる。上 で具体的に記載されたもの以外の免疫グロブリンドメインの変形もまた、本発明 の 範囲である。このような変形は、天然に生じる変異または遺伝子操作された変異 (例えば、点変異、１つ以上のアミノ酸に影響する欠失およびその他の改変、ま たはＮ末端もしくはＣ末端でのアミノ酸の付加)から生じ得る。 さらに、本発明は、マウスFcRnおよび免疫グロブリンフラグメントを用いて例 示されたが、同様なストラテジーは、種々の他の種(ラットのような哺乳動物を 含む)に由来する免疫グロブリン様ドメインまたは他のタンパク質もしくはペプ チド、およびより具体的にはヒト免疫グロブリン様分子に適用可能である。免疫 グロブリン様ドメインの構造的相似性、および進化を通じての免疫グロブリンス ーパーファミリーの保存の観点から、本発明の技術は、任意の種からの免疫グロ ブリン様ドメインの発現および組換え産生に直接適用可能であると考えられる。 記載される免疫グロブリン様ドメインに連結した他のDNAセグメントもまた、 含まれ得る。例えば、種々の特異性を有する１つ以上の組換え抗体可変ドメイン は、１つ以上の抗体定常ドメイン、免疫グロブリン定常ドメイン、またはさらに は他のタンパク質（例えば、バクテリオファージコートタンパク質遺伝子、ホル モン、またはＴ細胞レセプター抗原を含む抗原）に連結され得る。本発明の抗体 定常ドメインはまた、別の免疫グロブリンドメイン、またはもちろん任意の他の タンパク質と組合せられ得る。免疫グロブリン定常ドメインは、単一のドメイン （例えば、CH3ドメイン）として；または１つ、２つ、または３つ以上のドメイ ン（例えば、CH2-ヒンジドメイン、Fcドメイン、または全Fcヒンジドメイン）と 組み合わせて多様に発現され得る。特定の実施態様において、以下により詳細に 記載されるが、FcまたはFcヒンジドメインは、任意のタンパク質に連結されて増 強された生物学的安定性を有する組換え融合体を産生し得るか、または特定の変 異体が、増大した半減期を有する抗体もしくは融合タンパク質を生成するために 用いられ得る。 一旦発現されると、本明細書中の任意の産物は、放射標識もしくは蛍光標識さ れ、またはセファロースもしくは磁性ビーズもしくはリポソームのような合成二 重層を含む固体支持体に付着される。産物はまた、ウシ血清アルブミンのような キャリアタンパク質に連結され得る。Fc定常ドメイン、または他のタンパク質と 組み合わせた定常ドメインはまた、コレセプター（例えば、CD4またはCD8の細胞 外ドメイン）に合成的に連結され得る。 組換えまたはクローニングベクターは、本発明の１つの局面に含まれる。この ようなベクターおよびDNA構築物は、タンパク質発現を指向するために有用であ るばかりか、インビトロ変異誘発のためのテンプレートとしての使用に関しても 有用である。ベクターは、一般に、リーダー配列、好ましくはpelB（Betterら、 1988）を含むが、他のリーダー配列（例えば、アルカリホスファターゼ（phoA） またはompA）も用いられ得る。好ましい実施態様において、pelBリーダーセグメ ントは、単一の制限部位（例えば、Ncol）で改変され、抗体可変ドメイン遺伝子 の挿入を可能にする。このような制限部位の導入は、リーダー配列と同じリーデ ィングフレームのDNAセグメントにクローニングする便利な手段である。 リーダー配列DNAの改変は、１つ以上のヌクレオチドを、部位特異的変異誘発 を用いて変更することによって達成され得る。一般に、部位特異的変異誘発の技 術は、刊行物（Carterら、1985; Sambrookら、1989）によって例示されるように 当該分野で周知である。理解されるように、この技術は代表的には、一本鎖およ び二本鎖形態の両方において存在するファージミドベクターを用いる。あるいは 、変異体はPCR^TMを用いて生成され得る。部位特異的変異誘発に有用な代表的な ベクターには、M13ファージ（Messingら、1981）またはpUC 119のようなベクタ ーが含まれる。これらベクターは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれ らの使用は、一般に当業者に周知である。あるいは、二本鎖プラスミドまたはフ ァージミドなどを使用する部位特異的変異誘発の方法はまた、当該分野で周知で あり、そして本発明の実施においても用いられ得る。 本発明に従う部位特異的変異誘発は、まず、リーダー配列（pelBが本明細書中 で用いられる）をコードするDNA配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得る ことによって行われる。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマ ーは、一般に合成的に（例えば、Narangら、（1980）の方法によって）調製され る。プライマーは、一本鎖ベクターとアニールされ、そしてE.coliポリメラーゼ IクレノウフラグメントのようなDNAポリマー化酵素に供される。変異を有する鎖 の合成を完了するために、ヘテロニ重鎖が形成され、ここで一方の鎖が元の非変 異配列をコードし、そして第２の鎖は所望の変異を有する。ヘテロニ重鎖は、細 菌細胞（E.coliが好ましい）中に、形質転換され得る。クローンは、コロニーハ イブリダイゼーションおよび放射標識された変異原性オリゴヌクレオチドを用い てスクリーニングされ、変異プラスミドDNAを含むコロニーを同定する（Carter ら、1985）。二本鎖DNAテンプレートを用いるPCR^TM指向変異誘発は、増大した半 減期を有する変異体を生成するために特に適している。PCR^TM変異誘発は、代表 的には、１以上の増幅反応において１つ以上の代替の（alternate）またはラン ダムなアミノ酸をコードするプライマーの使用を含む。 構築物はまた、発現されたポリペプチド産物の単離および精製のために有用な 「タグ」を含む。タグは、検出、単離、および精製を容易にする機能を有する所 望のポリペプチド（例えば、ポリヒスチジン）をコードする配列にインフレーム で融合された比較的短いDNAセグメントである。例えば、親和性ぺプチドは、セ グメントによってコードされ得、特定の抗体または親和性樹脂に選択的に結合す ることによって単離を可能にする。任意の多くのタグ（c-mycタグ、(his)₆タグ 、デカペプチドタグ（Huseら、1989）、Flag^TM（Immunex）タグなどを含む）が 用いられ得る。多くのタグがまた、ウエスタンブロッティングを用いる、発現さ れたタンパク質の検出のために有用である（Wardら、1989; Towbinら、1979）。 例えば(His)₆タグは、Ni²⁺のような金属に基づいた親和性金属クロマトグラフ ィーカラム上での、分泌されたポリペプチド産物の精製のために好ましい。(his )₆ペプチドは、Ni²⁺イオンを高親和性でキレートする。ＮまたはＣ末端にこれら の残基を含むポリペプチド産物は、親和性カラムに結合し、ポリペプチド不純物 および他の汚染物が精製工程の一部として洗浄除去されることを可能にする。次 いでポリペプチド産物は、例えば250mMイミダゾールを用いて、カラムから高い 効率で溶出され得る。 ペプチドタグまたはリンカーはまた、免疫グロブリン産物中に組み込まれ得る 。一本鎖FvまたはＴ細胞レセプター（TCR）フラグメントについて、好ましいリ ンカーペプチドは、15マー（例えば、(gly₄ser)₃）、またはFilpulaおよびWhitl ow(1991)に記載されるような他のリンカーを含む。 上述のように、本発明の組換えベクターはまた、種々の他のタンパク質をコー ドするDNAセグメントを含み得る。特に、抗体FcヒンジまたはFcドメインをコー ドする組換えベクターはまた、より長い血清半減期を有する形態においてタンパ ク質を産生することを所望する場合は特に、他のタンパク質またはそのフラグメ ントをコードするDNAセグメントを含み得ると考えられる。動物またはヒトへの 投与について意図されるタンパク質またはペプチドの血清安定性は、この様式で 増大され得ることが予想される。このようなタンパク質またはペプチドの例には 、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４、γインターフェロン、イ 合成薬物が、同様にこの様式で安定化され得る。 このようなタンパク質をコードするDNAセグメントは、Fcベースのドメインと 上流下流に関わらずインフレームで、ベクターがタンパク質：Fcドメイン融合タ ンパク質（またはタンパク質：Fcヒンジ融合タンパク質）を発現し得るような位 置で組換えベクター中に作動可能に組み込まれ得る。例えば、制限エンドヌクレ アーゼを用いる遺伝子工学によりこの様式でDNAセグメントを操作するための技 術は、本開示およびSambrookら（1989）のような参考文献の両方に照らして当業 者に理解される。 本発明は、原核生物宿主細胞を用いて例示されたが、これは制限であることを 意味しない。本明細書中に記載される原核生物の特異的プロモーターおよびリー ダー配列は、真核生物の対応物によって容易に置換され得る。任意の多くの免疫 グロブリン様ドメインをコードするDNAセグメントでの宿主細胞の形質転換は、 例えば機能的IgGのような完全に機能的なタンパク質を産生する便利な手段を提 供すると認識される。cDNAおよびゲノム配列の両方は、真核生物性の発現のため に適切である。なぜなら、宿主細胞は、もちろん、タンパク質への翻訳のための 機能的mRNAを生じるためにゲノム転写物をプロセスするからである。増大した半 減期を有する変異体ドメインおよび抗体は、補体を固定しそしてADCCを媒介する 真核生物系でグリコシル化形態において産生され得る。 ほぼ任意の真核生物発現系が、本発明のタンパク質およびペプチドの発現のた めに使用され得ることが同様に考えられる。例えば、バキュロウイルスベースの 、COS細胞ベースの、ミエローマベースの系が用いられ得る。プラスミドベクタ ーは、pCMV5のようなpCMVシリーズの真核生物ベクターによって例示されるよう に、 複製起点および効率的な真核生物プロモーターを組み込む。 この様式での発現のために、コード配列をプロモーターに隣接して、そしてプ ロモーターの制御下に配置する。このようなプロモーターの制御下にコード配列 を配置するために、タンパク質の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位の5' 末端を、選択されたプロモーターの約１〜約50ヌクレオチド「下流」（すなわち 、3'側）に配置することが当該分野で理解される。 真核生物発現が意図される場合、代表的には、元のクローン化セグメント内に 含まれていなければ、適切なポリアデニル化部位（例えば、5'-AATAAA-3'）を、 転写ユニット中に組み込むこともまた所望される。代表的には、ポリＡ付加部位 を、転写終結の前の位置で、タンパク質の終結部位の約30〜2000ヌクレオチド「 下流」に配置する。 本明細書中で使用される用語「操作された」または「組換え」細胞は、免疫グ ロブリン様ドメインをコードする遺伝子のような組換え遺伝子が導入されている 細胞をいうことが意図される。それゆえ、操作された細胞は、トランスフェクシ ョンまたは形質転換技術によって導入される組換え遺伝子を含まない天然に存在 する細胞とは区別され得る。従って、操作された細胞は、人為的に導入された遺 伝子を有する細胞である。 本発明の実施において有用である適切な宿主細胞は、グラム陰性生物を含み、 そしてSerratia marcescens、Salmonella typhimurium、および類似の種を含み 得る。特に好ましい宿主細胞は、Escherichia coliおよび容易に入手可能であり そして当業者に周知のE.coliのいくつかの改変体である。 本発明の特定の局面は、免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ネイティブのも しくは変異体の抗体定常ドメイン、またはそれらのサブフラグメントもしくは融 合タンパク質）の産生のための方法である。このようなドメインまたは改変され たドメインを産生するために、グラム陰性微生物宿主細胞をまず任意の開示され た組換えベクターで形質転換し、次いで適切な細菌培養培地中で免疫グロブリン 様ドメインの発現を可能にする条件下で培養し、続いてこれを単離し得る。 培養は、代表的には、増殖および誘導を包含する。増殖は、簡便には、１％グ ルコースを含むLuriaブロス、１％グルコースを含む４×TY（二倍強度２×TY） 、 カザミノ酸および５％w/vグリセロールを含む最小培地のような培地において、2 0℃〜約37℃の範囲、好ましくは25〜30℃の間の範囲の温度で行われる。好まし い実施態様では、培地は、発現プラスミドを含む細菌細胞を選択するために、ア ンピシリンのような選択剤を0.1mg/mlの濃度で含む。当然、当業者に公知のよう に、元々使用されたプラスミド構築物と組み合わせて、特定の選択剤を選択する 。 発現の誘導は、代表的には、増殖が開始された後の時点で、通常12〜16時間後 に、30℃で行われる。この時間の長さは、誘導期で初期静止相にある細胞を生じ る。増殖培地がグルコースを含む場合、グルコースは発現の誘導を阻害するので 、細胞をペレット化し、そして洗浄し、その後イソプロピルチオガラクトピラノ シド（IPTG）のようなインデューサーを濃度0.1〜１mMで添加する。再び、種々 の他のインデューサーが、元々用いられたベクター構築物に従って、当該分野で 公知のように、用いられ得る。細胞は、誘導の前により短い期間、例えば６〜10 時間、または増殖の中期対数期まで増殖され得る。細胞は、５〜28時間誘導され る。５〜６時間の誘導は、タンパク質が周辺質から単離される場合には、好まし い誘導時間である。なぜなら、より長い誘導時間は、タンパク質の培養上清への 漏出を生じるからである。しかし、外部培地から産物を単離することが望ましく あり得、この場合はより長い誘導時間の使用が好ましい。20℃〜37℃の範囲の温 度は、増殖および誘導温度として使用され得、25℃が好ましい誘導温度である。 微生物宿主細胞によって産生されそして周辺質空間に位置するポリペプチド産 物を単離することは、代表的には、微生物を、一般には浸透圧ショック、超音波 処理、または溶解のような手段によって、しかし好ましくは浸透圧ショックによ って破壊する工程を包含する。一旦細胞が破壊されると、細胞または細胞細片は 、簡便に、例えば、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、 例えば、適切なペプチドタグがポリペプチド産物に付着されている場合、親和性 金属樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。 あるいは、誘導期間が８時間より長く（例えば、25℃で）、その結果タンパク 質が培養上清中に漏出する場合、細胞は、培養物から遠心分離によって除去され 得、そして培養上清は濾過され、そして（例えば、10〜20倍に）濃縮される。次 いで、濃縮された上清は、リン酸緩衝化生理食塩水に対して透析され、そして分 離がカラムクロマトグラフィー（例えば、親和性または吸着クロマトグラフィー ）によって達成される。一例には、適切にタグ化されたタンパク質（例えば、(h is)₆タグを保有するタグ化タンパク質）を分離するためのNi²⁺-NTA-アガロース による分離がある。これらのタグが発現ベクターの構築において用いられる場合 、ヒスチジンタグは、特に好ましい。なぜなら、それらはNi²⁺-NTAアガロースの ような金属樹脂上での単離および精製を容易にするからである。 本明細書中で使用される用語「生物学的に安定なタンパク質」は、改変された 結果、血清半減期が元のタンパク質と比較して増大したタンパク質をいうことが 意図される。この用語は、公知の組換えタンパク質およびまた組換え形態がまだ 報告されていないタンパク質の両方を含む。このように、増大した生物学的安定 性は、公知のまたは元の組換えタンパク質、あるいはネイティブのタンパク質に 比較して測定され得る。生物学的安定性は、例えば、放射標識タンパク質を用い 血清の放射活性のレベルを時間の関数として測定することによって、またはELIS Aを用いて血清中にインタクトな抗体のレベルを時間の関数としてアッセイする ことによって、種々のインビトロまたはインビボ手段によって測定され得る。こ こで、増大した生物学的安定性の特に好ましい測定は、血清半減期の増大および クリアランス速度の減少によって証明される。 目的のタンパク質が抗体Fcヒンジドメインまたは抗体Fcドメインに連結してい る生物学的に安定な組換えタンパク質を産生するためには、本明細書に従って、 まずタンパク質：Fcヒンジまたはタンパク質：Fcドメイン融合タンパク質を、本 明細書中上記のように、グラム陰性宿主において発現し得る組換えベクターを調 製し得る。次いで、組換えベクターをグラム陰性細菌に挿入し、そしてその細菌 を融合タンパク質の発現を可能にするのに効果的な条件下で培養する。この後、 次いでこのように産生された融合タンパク質を、例えば本発明の方法を用いて単 離する。 上記の方法は、改善された生物学的安定性を有する一連の治療化合物の生成に おける使用に提案される。このような化合物は、例えば、インターロイキン２、 インシュリン、インターロイキン４、およびインターフェロンγ、またはさらに を安定化することにおいて有用であることが意図され、このことは、それらの反 復投与に対する必要性を軽減する可能性がある。しかし、本発明の方法は、ヒト への投与のためのタンパク質の産生のみに限定されず、そして増大した安定性を 有する大量の任意のタンパク質を産生するために用いられ得る。例えば、免疫化 プロトコル、獣医による動物の処置、または齧歯類のインビボ治療モデルにおい て用いられ得る。 変異体Fcヒンジドメインが、本発明において生成され、そして本明細書中でネ イティブのドメインに比較して劇的に増大したインビボ半減期を有することが示 される。それゆえ、本発明は、延長された生物学的半減期を有する抗体またはタ ンパク質を産生するための方法をさらに包含する。これらの方法は、上記のよう に、まずタンパク質または抗体の可変ドメインを、本発明の増大した半減期変異 体ドメインにカップリングする工程を包含する。このような抗体またはタンパク 質を産生するために、所望の融合または変異タンパク質を発現し得る組換えベク ターを調製し、そのベクターをグラム陰性細菌中に挿入し、それを培養して発現 させ、そしてこのように産生された抗体またはタンパク質を単離する。これらの 技術は、より長い生物学的半減期を有することを所望される任意の抗体またはタ ンパク質（抗体およびイムノトキシンを含む）に適用可能である。 本発明の別の方法は、増加した血清半減期を有する抗体の生産に特に適し、代 謝制御部位においてまたはその近傍のいずれかで、与えられた抗体を、本明細書 に開示される残基の１つまたはそれ以上で単に改変することである。これは、化 学的に、またはランダムもしくは部位特異的変異誘発および任意の公知の生産方 法を用いる組換え生産により達成され得る。好適な方法は、示された残基を、残 りの19の残基のすべてで置き換え、次いでFcRnに対してより高い親和性を有する 変異体を(１つ以上の残基が同時に変異する場合ファージディスプレーを用いて) 選択することである。選択された変異体はまた、本明細書に記載されるように、 pH依存性様式でFcRnに結合し、このpHは選択ステップの間制御され得る。この選 択方法はまた、ランダムペプチドライブラリーまたは任意の他のランダムに変異 されたタンパク質に適用可能である。このように操作された抗体は、単一の抗体 、ドメイン、Fabフラグメント、またはイムノトキシンのような抗体結合物およ び 治療養生法に用いられる抗体であり得る。 本発明の範囲内に含まれるのはまた、可変または定常抗体ドメインのような組 換え免疫グロブリン様ドメイン産物；抗体、抗体構築物、抗体ドメインまたは延 長した半減期を有するイムノトキシン；あるいは、MHC分子またはCD2、CD4、CD8 、CD3、N-CAM、もしくはNg-CAMのようなシグナリング分子由来のドメイン、また はPDGFレセプタードメイン、またはそれらのフラグメントである。好適な実施態 様では、これらは、Fcヒンジ、Fc、CH2-ヒンジおよびCH3ドメインのような抗体 定常ドメイン産物；およびより長いインビボ半減期を有するように加工された、 例えば、LSF変異体のような抗体Fcヒンジドメインを含む。これらのドメインの 組成において、例えば、基礎となるDNAを変更することにより、改変または変化 がなされ得て、そしてなお同様のまたはそうでなければ所望の特性を有する分子 を得ることが認識される。それ故に、これらの免疫グロブリン様ドイメンの生物 学的機能的等価物、およびFcRnに結合するペプチドおよびその他のランダムに変 異されたタンパク質のような変異体もまた、本発明の範囲内に含まれる。 一般に、特定のアミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域またはレセプター部位 のような構造との相互作用結合能力の認識され得る損失なくして、タンパク質構 造中のその他のアミノ酸を置換し得る。そのタンパク質の生物学的機能的活性を 規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質であるので、特定のアミノ 酸配列置換は、タンパク質配列(または、勿論、その基礎となるDNAコード配列) でなされ得、そしてそれにも関わらず、同様のまたは匹敵する性質(例えば、ア ンタゴニスト的またはアゴニスト的)でさえ有するタンパク質を得る。従って、 コードされたタンパク質の生物学的有用性または活性の認識し得る損失なくして 、免疫グロブリン様ドメインのコード配列中に、種々の変化がなされ得ることが 予期される。このようなドメイン中で特定の残基を変化させ、例えば、RcRnに対 するFcの結合親和性を増加することにより、それらの生物学的有用性を増強する こと、またはそれらの相互作用能力を増大することさえ可能であり得る。 本明細書で例示されるように、形質転換された宿主細胞は、免疫グロブリン様 ドメインの特に良好な収率を提供する。得られる収率は、CH3について約２mg/L ；CH2-ヒンジについて１〜1.5mg/L；Fcについて1.5〜２mg/L；およびFcヒン ジについて0.5〜１mg/Lのオーダーである。このような値は、容易にスケールア ップされ、例えば、Ni²⁺-NTA-アガロースを用いる親和性精製のための(his)₆タ グを利用して、数日のうちに、比較的大量のこれらドメインを生産し得ることが 予期される。従って、発現系は、比較的コスト的に有効な方式で得られ得る免疫 グロブリン様ドメインタンパク質の容易な供給を提供する。 ネイティブな抗体定常ドメインのような免疫グロブリン様ドメイン、または増 大した半減期を持つFcヒンジドメインの精製は、クロマトグラフィー、密度勾配 遠心分離および電気泳動的方法を含む多くの方法で達成され得る。 本発明は、広範な種類の実施態様で利用され得るヒト供給源由来の免疫グロブ リン様ドメインを含む、免疫グロブリン様ドメインの大スケール生産を容易にす る。これらは、インビトロ変異誘発研究、およびNMRおよびＸ線結晶学のような 高分解能構造分析におけるそれらの使用を含む。FcヒンジおよびFcドメイン分析 は、抗体代謝に関与する領域の輪郭を描写することを可能にし、残基イソロイシ ン(ile)253、ヒスチジン(his)310、his435およびhis436が重要であることを示し た。組換えフラグメント、ドメイン、またはそれらのサブフラグメントでさえ、 FcRnへの結合に機能的に重要なFc残基をマッピングするために用い得る。組換え Fcフラグメントの残基は、本明細書に開示されるような可溶性タンパク質として 、またはバクテリオファージの表面上(McCaffertyら、1990)での発現の前に、改 変され得、そしてFcRnに対してより高い親和性を有する変異体結合が、FcRnでコ ートされた固体表面または溶液中のFcRnを用いてスクリーニングまたは選択され 得る。好適な方法は、溶液中のFcRnを用いることであり、次いでビーズ上のFcRn : バクテリオファージ複合体を捕捉する。 他のタンパク質または薬物に連結した免疫グロブリンFcヒンジまたはFcドメイ ンの大スケール生産もまた、免疫療法に対して可能性を有している。特定の実施 態様では、キメラ（chimaeric）タンパク質または薬物が、延長された半減期の 利点を有して生産され得、そして非グリコシル化Fcは、Fcレセプターに対する結 合親和性が非常に低いので、それらは、これらのレセプターを有する大多数の免 疫細胞に結合し得ない。これは、そのことが非特異的結合を低減するので顕著な 利点である。このような非グリコシル化Fcフラグメントはまた、補体を固定せず 、 そして重要なことには、このことは、局所炎症反応の発生をおそらく低減する。 本発明はまた、血清中のIgGレベルを調節する方法として記載され、この方法 は、上記IgGに対するFcRn結合を増大する工程を包含する。この調節は、FcRnの 発現の変更による内因性FcRnレベルを増大もしくは低減することにより、または FcRnを発現する組換え細胞の使用により達成され得る。さらに、この調節は、Ig Gに対する変更された結合親和性を有するFcRnを提供することにより達成され、 そしてそれによってIgGレベルを調節する。 さらなる実施態様で本発明は、拡張して、その他のタンパク質、ペプチド、ま たは非タンパク質リガンドを含むリガンドを包含し得、そしてこれらは本明細書 に開示された例示の抗体のそれのような高親和性およびpH依存様式でFcRnに結合 し、その結果それらの半減期が延長される。 本発明は、可変領域および定常領域の両方の免疫グロブリン様ドメイン、なら びに遺伝子操作された変異体ドメインの大量生産により例示される。元は抗体分 子由来の免疫グロブリン様ドメインの生産例もまた含まれる。特に、抗体Fcヒン ジ、Fc、CH2-ヒンジおよびCH3ドメイン；ならびに増大した血清半減期を有するF cヒンジ変異体ドメインの生産が、開示される。しかし、免疫グロブリン様スー パーファミリーおよびその改変のスペクトルをカバーするこのような広範な範囲 の例を考慮して、本発明がこれらの例のみに制限されないことが理解される。む しろ、それは、本明細書中上記のすべての免疫グロブリン様構造を包含する。 先の論議を考慮して、本発明は、IgGに対して増大した血清半減期を有する変 異体IgG分子を含む組成物として特定の広範な局面で記載され得、そしてここで 、上記変異体IgG分子は、Fcヒンジ領域中に少なくとも１つのアミノ酸置換を有 する。このIgGは、任意のIgG分子であり得、そして特定の実施態様では好ましく はヒトIgGである。 本発明はまた、特定の実施態様において、IgGの血清半減期に対して増大した 血清半減期を有する変異体IgG Fcヒンジフラグメントを含む組成物として記載さ れ、そしてここで、上記フラグメントは、FcRnに対して増大した結合親和性を有 する。従って、本発明の組成物は、CH2ドメインにおける番号252、254、256、30 9、311もしくは315、またはCH3ドメインにおける433もしくは434から選択され る１つまたはそれ以上、あるいは３つものアミノ酸におけるアミノ酸置換を有す る分子またはフラグメントを含み得、そして特定の実施態様では以下のアミノ酸 置換を有し得る：位置252におけるトレオニンに対するロイシン、位置254におけ るトレオニンに対するセリン、および位置256におけるトレオニンに対するフェ ニルアラニン。抗体、または特にIgGの場合、FcRnに対する増大した結合親和性 は、表面プラスモン共鳴分析により測定したとき、約７nMより小さい、pH6にお けるFcRnへの結合に対する解離定数を有するとして規定され得る。本発明の任意 の組成物がまた、特定の実施態様では、薬学的に受容可能な組成物として規定さ れ得ることが理解される。 特定の広範な局面では、本発明は、因子の血清半減期を増大する方法として記 載され得、上記因子を、上記のように増大した血清半減期を有する変異体IgGま たはIgG Fcヒンジフラグメントに結合させる工程を包含する。好適な因子は、治 療薬物、抗原結合性ポリペプチド、抗原もしくはレセプター結合性リガンド、ま たはＴ細胞レセプター結合性リガンドでさえ、またはＴ細胞レセプタードメイン を包含するがこれらに限定されない。 本発明はまた、増大した血清半減期を有する抗体の作成方法を含み、FcRn結合 に直接関与すると考えられるIgGヒンジ領域中の第１のアミノ酸を同定する工程 、１つまたはそれ以上の第２のアミノ酸を同定する工程であって、ここで上記第 ２のアミノ酸の各々は上記第１のアミノ酸の空間領域中にあり、そしてここでこ の第２のアミノ酸の側鎖はネイティブな抗体において溶媒に曝されている工程、 変異体抗体を作成するために、上記第２のアミノ酸の１つまたはそれ以上のラン ダムアミノ酸置換を有する抗体を作成する工程、および増大した血清半減期を有 する変異体抗体を同定する工程を包含する。この方法はさらに抗体を単離する工 程を包含し得る。この方法の実施において、第１のアミノ酸は、Fcフラグメント のアミノ酸番号253、310、435または436であり得、そして第２または２次アミノ 酸は、CH2ドメイン中のアミノ酸番号252、254、256、309、311または315、ある いはCH3ドメイン中の433または434であり得る。 特定の広範な局面では、本発明は、Fcフラグメントを含む組成物として記載さ れ、このFcフラグメントは、IgG抗体の約アミノ酸250から約アミノ酸440までの フラグメントを含み、上記IgG抗体よりFcRnに対してより高い結合親和性を有し 、１つまたはそれ以上のFcRn結合性アミノ酸残基の近傍領域に1つまたはそれ以 上のアミノ酸置換を有し、そしてpH7.4でよりもpH６でFcRnに対するより高い結 合親和性を有するとしてさらに規定され得る。 本発明の別の局面は、被験体において内因性の血清IgGを低減する方法であっ て、被験体に、増大した血清半減期を有するタンパク質またはペプチドを含む組 成物の有効量を投与する工程、そして特に増大した血清半減期を有するIgGを投 与する工程を包含する。 本発明の特定の実施態様はまた、IgGの血清半減期に対して増大した血清半減 期について、因子をスクリーニングする方法を包含し、この方法は、候補因子を 得る工程、pH7.4および約pH６においてこの因子のFcRnに対する結合親和性を測 定する工程、pH7.4においてより約pH６においてFcRnに対するより高い結合親和 性を有する候補因子を選択する工程、および同一条件下で上記選択された因子の FcRnに対する結合親和性とIgGのFcRnに対する結合親和性と比較する工程を包含 し、ここで、IgGの結合親和性と比較してFcRnに対する増大した結合親和性が、 増大した血清半減期を有する因子の指標である。特定の好適な候補因子は、ペプ チドまたはポリペプチド、あるいは抗体または抗体のフラグメントでさえあり得 る。代わりの実施態様では、このペプチドは、ランダムペプチドライブラリーか ら選択され得るか、またはランダムに変異されたタンパク質、または合成ペプチ ドでさえあり得る。 特定の実施態様では、本発明はまた、治療的因子の血清半減期を増大する方法 であり得、この治療的因子を、本明細書に開示され請求項に記載された方法によ り同定されたIgGの血清半減期に比較して増大した血清半減期を有する因子に結 合する工程を包含する。 図面の簡単な説明 図１は、大腸菌(E.coli)中の免疫グロブリン定常領域フラグメントの発現およ び分泌に用いたプラスミドの部分の概略図である。a)CH3ドメイン；b)CH2-ヒン ジ;c)Fcフラグメント、およびd)Fcヒンジフラグメント。lacZプロモーターは白 抜き丸、pelBリーダーは斜線の箱、免疫グロブリンドメイン[ヒンジ領域(H)およ びCH2、CH3ドメイン]は白抜き箱、およびhis₆ペプチドタグ(his)は黒塗りの箱に より表される。 図２Ａは、組換え[CH2-ヒンジ]₂についてのクリアランス曲線である。この曲 線は、急速なα相(血管空間の内と外との間の注入タンパク質の平衡を表す；こ のタンパク質のα相は部分的にサイズにより決定される)およびより長いβ相(血 管内空間におけるタンパク質の異化を表す)を有する２相性である。このフラグ メントのβ相の半減期は表Ｉに示され、そしてこれらはタンパク質の生物学的半 減期を表す。 図２Ｂは、グリコシル化IgG1分子についてのクリアランス曲線である。 図３Ａは、SVEC細胞に対する、¹²⁵Ｉ-標識WT Fcヒンジおよび有Q-310/HN-433 変異体の結合を示す。白抜きの棒は、洗浄後の細胞に結合した量を表し、そして 斜線の棒は、2.5mg/mlのCHAPSを用いた抽出後に細胞ペレットから抽出された量 を示す。 図３Ｂは、図３Ａに示される研究の繰り返しからのデータである。 図４Ａは、¹²⁵Ｉ-標識mIgG1、FcヒンジフラグメントおよびIgAの異化である。 閉じた三角および＋は、WT Fcヒンジを表し；閉じた四角およびXは、β2m+/+(閉 じた三角および四角)およびβ2m-/-(＋およびX)マウス中のHQ-310/HN-433変異体 を表す。 図４Ｂは、¹²⁵Ｉ-標識mIgG1、FcヒンジフラグメントおよびIgAの異化である。 白抜き三角および白抜き四角はIgAを表し、白抜き菱形はおよびX印の箱は、β2m +/+(白抜き三角および白抜き四角)およびβ2m-/-(白抜き菱形はおよびX印の箱) マウス中のmIgG1を表す。各タンパク質について、各群内から１匹のマウスにつ いての代表的な曲線が示される。これらのデータは、C57BL/6バックグラウンド のマウスについてである。 図５は、SWISSマウス中のFcヒンジフラグメントのクリアランス曲線である。 各群内から１匹の代表的なマウスについての曲線が示される。 図６Ａは、pH6.0における、野生型(WT)(黒塗り四角)およびLSF変異体(黒塗り 三角)Fcヒンジフラグメントの解離を示すSPRセンサーグラムの領域である。プロ ットは、BIAevaluation 2.1ソフトウェアを用いて描かれる。時間の関数として の応答は、応答単位(RU)で示される。 図６Ｂは、pH7.4における、WT(黒塗り四角)およびLSF変異体(黒塗り三角)Fcヒ ンジフラグメントの解離を示すSPRセンサーグラムの領域である。矢印は、緩衝 液がpH6.0から7.4に変化した点を示す。プロットは、BIAevaluation 2.1ソフト ウェアを用いて描かれる。時間の関数としての応答は、応答単位(RU)で示される 。pH7.4緩衝液がpH6.0緩衝液に対するために(後者がベースラインとして用いら れる)大きな下向きのシフトは、マイナスのRU値を生じる。 図７は、マウスIgG1分子およびIgG1由来フラグメントのクリアランス曲線であ る。 図８は、マウスIgG1、Fab、Fc-パパインおよび組換えFcフラグメントの腸移入 を示す。各試験に用いたマウスの数は、６(Fab)、12(mIgG1)、16(Fc-パパイン) 、31(WTFc)、５(HQ-310/HN-433)、５（成体マウス中のWT Fc）、および14(Fc-ハ イブリッド)である。 図９は、β相半減期と、組換えWTおよび変異体Fcフラグメントについての移入 の阻害との間の相関関係を示す。 図10は、非標識IgG1、WTおよびHQ-310/HN-433変異体Fcフラグメントによる、 単離された刷子縁に対する¹²⁵Ｉ-IgG1結合の阻害を示す。 図11は、Fc遺伝子(WTまたは変異体)を含む発現/ファージディスプレーベクタ ーである。白丸=lacZプロモーター、斜線の箱=pelBリーダー、白箱=WTFcまたはH Q-310/HN-433変異体、両斜線の箱=c-mycタグ、および斜線の箱=cpIII遺伝子。単 一の線=骨格ベクターである。 図12Ａは、組換えFcヒンジフラグメントの経細胞輸送である。括弧内の番号は 、各実験に用いたマウスの数を表す。SCIDマウス中の組換えFcヒンジフラグメン トの母胎転移を示す。 図12Ｂは、BALB/c新生児中の組換えFcヒンジフラグメントによる放射標識mIgG 1の腸伝達の阻害を示す。H433Aに対する値は、WT Fcヒンジに対する値とは有意 に異ならない(Studentの検定による。p=0.127)。 図13Ａは、組換えFcヒンジフラグメントのFcRnに対する結合を示す。mIgG1-セ ファロースへのFcRn結合の、インヒビター非存在下での結合に対する阻害パーセ ントを示す(３つの別々の試験の平均)。 図13Ｂは、組換えFcヒンジフラグメントのSpAに対する結合示す。SpA-セファ ロースへのFcヒンジフラグメント結合の、WT Fcヒンジの結合に対するパーセン テジを示す(３つの別々の試験の平均)。 好適な実施態様の詳細な説明 本発明は、宿主細胞中で、免疫グロブリン様ドメインならびに加工されたおよ び変異体ドメインの、この免疫グロブリン様産物が増大した血清存続性を有する ようなクローニングおよび発現に関する。 本明細書に開示されるのは、延長されたインビボ半減期を有する抗体Fcフラグ メントおよびサブフラグメントおよひFcヒンジドメインのような、免疫グロブリ ン様ドメインおよびその部分をコードする組換えベクターである。大量の、例え ば、インタクトな抗体と同じインビボ安定性を有する免疫グロブリンFcおよびFc ヒンジドメインを生産する方法が、増大した半減期を有する抗体およびその他の 分子を生産する方法として記載される。これらのDNA構築物およびタンパク質ド メインは、免疫治療薬またはその他の安定な組換えタンパク質の生産において、 あるいは構築物の生産においてのような、種々の用途があるように考案される。 本発明は、抗体Fcヒンジ、Fc、CH2-ヒンジおよびCH3ドメイン；ならびに、例 えば、LSFと称される変異体のような延長されたインビボ半減期を有する加工さ れたFcヒンジドメインを含む、種々の免疫グロブリン様ドメインの生産により例 示されるので；本発明の方法を利用してその他の免疫グロブリン様ドメインが発 現され得ることが理解される。 かなりの数の免疫系の鍵となる分子が相同なドメインを含むことが認められ、 その構造は、進化を通じて保存されている。このような分子は、免疫グロブリン のスーパーファミリーのメンバーであり、それは、抗体およびＴ細胞レセプター のみならず、MHCクラスＩおよびII糖タンパク質、CD2、CD4およびCD8細胞-細胞 接着タンパク質、ならびに種々のFcレセプター(そのすべては１つ以上の免疫グ ロブリン様ドメインを含む)を含む。 代表的には、これらドメインの各々は、約100アミノ酸長であり、そして通常 保存されたジスルフィド結合により安定化される２つの逆平行βシートからなる 特徴的なサンドイッチ様構造に折り畳まれていると考えられている。これら分子 の多くは、１つの鎖の免疫グロブリン相同性単位が別の鎖中の相同性単位と相互 作用するダイマーまたはそれ以上のオリゴマーである。 通常、各免疫グロブリン相同性単位は別々のエキソンによりコードされ、そし て完全なスーパー遺伝子ファミリーが、初期の細胞-細胞相互作用を媒介するこ とに関与し得る、Thy-1またはβ₂-マイクログロブリンをコードする免疫グロブ リン相同性単位に類似の単一の免疫グロブリン相同性単位をコードする遺伝子か ら進化したようである。Thy-1-様分子がヤリイカの脳から分離されたので、その ような根源的な遺伝子が、約4億年前に脊椎動物がそれらの無脊椎動物祖先から 分かれる前に生じた可能性がある。新たなファミリーメンバーは、おそらく、エ キソンおよび遺伝子重複により生じ、そして同様の重複事象が、おそらく、抗体 およびＴ細胞レセプターをコードする複数の遺伝子セグメントを生じた。 抗体およびＴ細胞レセプターの他に、免疫グロブリン様ドメインを含む最も特 徴付けられたタンパク質は、MHC分子およびCD4およびCD8糖タンパク質である。 ２つの主要なクラスのMHC(主要組織適合性複合体)分子、クラスＩおよびIIが存 在し、各々は１セットの細胞表面糖タンパク質からなる。MHC糖タンパク質の両 方のクラスは、相同な全体構造を有するヘテロダイマーであり、そのアミノ末端 ドメインは、Ｔ細胞への呈示のために抗原結合のために特殊化されていると考え られている。しかし、MHCクラスＩの相同体であるFcRnは、別の機能、即ち血清I gGレベルの調節を有している。 各クラスＩMHC遺伝子は、α鎖と呼ばれるその大部分が３つの細胞外球形ドメ インに折り畳まれる単一の膜貫通ポリペプチド鎖をコードする。各α鎖は、β₂- マイクログロブリンと呼ばれる非グリコシル化小タンパク質と非共有結合的に会 合する。膜に最も近接しているβ₂-マイクログロブリンおよびα₃ドメインは、 両方とも免疫グロブリンドメインに相同性であり、そしてそれ故両タンパク質は 、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。膜から最も遠いα鎖の ２つのアミノ末端ドメインは、Ｔ細胞により認識される多形性(可変)残基を含む 。 Ｔ細胞はまた、クラスＩ分子に結合するウイルス由来ペプチドを認識し、そして これは細胞性免疫において特に重要である。 クラスＩMHC分子と共通して、クラスIIMHC分子は、膜に近接する２つの保存さ れた免疫グロブリン様ドメインおよび膜から最も離れた２つの多形性（可変）ア ミノ末端ドメインを有するヘテロダイマーである。しかし、これらの分子では、 両鎖は膜にまたがる。両クラスのMHC分子の多形性領域が外来抗原と相互作用し 、しかもＴ細胞レセプターにより認識されるのはMHC分子と外来抗原との複合体 であるという強い証拠がある。 CD4およびCD8は、ヘルパーおよび細胞障害性Ｔ細胞の表面上でそれぞれ発現さ れる。両糖タンパク質はMHC分子の不変部分、CD4はクラスII、そしてCD8はクラ スＩMHC糖タンパク質に結合すると考えられている。 続いて、その他の分子が、免疫グロブリン様ドメインを含むことが示された。 これらは、例えば、５つの免疫グロブリン様ドメインに折り畳まれると考えられ る細胞外ドメインであるPDGFレセプターを含む。脊椎動物において細胞-細胞接 着を媒介する、増加する数の細胞表面糖タンパク質がまた、免疫グロブリンスー パーファミリーに属するとして同定された。これらは、神経細胞およびグリア細 胞の表面上で発現され、そしてCa²⁺非依存性細胞接着を媒介する大きな単回通過 膜貫通糖タンパク質であるN-CAMを含む。N-CAMポリペプチドの細胞外部分はまた 、５つの免疫グロブリン様ドメインに折り畳まれる。L1糖タンパク質（ニューロ ン-グリア細胞-接着分子、またはNg-CAMとしても知られる）もまた、免疫グロブ リンスーパーファミリーのメンバーである。 Ａ：増大した血清存続性を有するFcRnリガンドの単離 Fcフラグメント上のFcRnの相互作用部位の近傍にある領域をランダムに変異さ せ、次いで変異体のライブラリーからより高い親和性結合体について選択するこ とにより、増大した血清半減期を有する改変体Fcフラグメントが単離され得る。 これらのより高い親和性変異体は、それらの結合のpH依存性をなお維持すべきで ある。何故なら、データは、これがFcRnが働く、即ち酸性区画においてIgG類へ 結合し次いで約pH7.4で血清中に放出される方式の重要な側面であることを示す からである。従って、この方法は、特にFcRnを可溶性形態で用いてリガンドを単 離する場合、pH依存様式でFcRnに結合する任意のリガンド(タンパク質、ペプチ ド、または非タンパク質リガンドでさえ)を選択するために用いられ得る。事実 、開示された発明を用いて、合成の化学的化合物のライブラリー、ランダム化さ れた表面ループを有するペプチドライブラリーまたはタンパク質のライブラリー のいずれかからリガンドを単離し、当業者に周知の標準的な単離手法により１週 間程度で可溶性タンパク質またはペプチドを得、次いでこれらのペプチド(ルー プ)またはタンパク質を用いてACDデータベースを用いて合成リガンドを調製し、 ホモログを同定し得ることは明白である。さらに、このようなFcRnリガンドは、 IgGまたはフラグメントより有用であり得る。何故なら、それらはより小さく、 そして合成リガンドの場合、非免疫原性であると考えられ得るからである。この 観点から、FcRnに対してIgGより低い親和性を有するリガンド、および同一また はより高い親和性を有するリガンドの単離が有用であると考えられる。例えば、 mIgG1より数倍低い親和性を有するリガンドはなお、FcRnに対して検出し得る親 和性を有さない類似のリガンドより有意に長い半減期を有し得る。 薬物、タンパク質、ペプチドなどの血清半減期を増大するために用いられ得る 分子の使用は巨大である。原理的には、そのような分子は、任意の治療薬の血清 存続性を増大するために用いられ得る。従って、請求項に記載された発明は、ほ とんど無制限の数の疾患または障害の処置に対する治療用途に広く適用可能であ る。何故なら、それは、必要な治療投与量の数を低減することによりコストおよ び患者の不快感の両方を低減するために用いられ得るからである。 Ｂ：抗体定常ドメイン 高いインビボ安定性を決定する免疫グロブリン分子の特徴は、本発明の前に完 全には理解されていなかった。先の研究は、CH2ドメインが抗体の異化の制御に おいて重要な役割を果たし得ることを示し、そして最近の研究はまた、CH3ドメ イン中の配列が関与し得ることを示唆した(Ellersonら、1976；Muellerら、1990 ；Pollockら、1990、Kimら、1994a；Medesanら、1997)。CH2ドメイン上の炭水化 物残基の存在は、安定性について有意であっても重要でない影響を与えるよ うであり、そしてこの影響の範囲はイソタイプに依存する(TaoおよびMorrison、 1989)。 本発明の一部として、マウスIgG1定常領域由来の組換えCH2-ヒンジ、CH3、Fc およびFcヒンジフラグメントが宿主細胞から発現された。フラグメントは精製さ れ、放射標識され、そしてマウスにおけるクリアランス研究で用いられた。クリ アランス速度は、Fvフラグメントおよび完全グリコシル化IgG1分子のそれと比較 された。組換えFcヒンジフラグメントは、完全免疫グロブリン分子のそれに非常 に類似である安定性性質を有している。対照的に、モノマー性CH2-ヒンジおよび CH3フラグメントは、両方とも急速にそしてFvフラグメントと類似の様式で浄化 された。これは、CH2およびCH3両領域中の配列が、インビボ安定性に重要であり 、そしてさらに、グリコシル化はこのイソタイプの異化の制御において重要な役 割を果たしていないことを示す。 CH3ドメイン、FcフラグメントおよびFcヒンジフラグメントはすべて、ホモダ イマー性タンパク質であることが見いだされた。FcおよびCH3ドメインについて は、ダイマーは非共有結合的に結合し、そしておそらく非共有結合的相互作用に より安定化されている。Fcヒンジダイマーについては、このフラグメントは、ヒ ンジ領域システイン間の-S-S-架橋により共有結合で結合している。 この研究の特に重要な局面は、宿主細胞中での発現の後に精製された免疫グロ ブリンFcヒンジおよびFcフラグメントが、ネイティブな抗体分子と同じインビボ 安定性を有しているという発見である。これは、時間の関数として¹²⁵Ｉ-放射標 識免疫グロブリンフラグメントのインビボでのクリアランス速度を測定すること により決定された。これら試験からの結果は、組換え非グリコシル化Fcヒンジま たはFcフラグメントが、完全グルコシル化IgG1分子と類似のインビボ安定性を有 することを実証した。 組換え非グリコシル化Fcヒンジフラグメントは、完全グリコシル化IgG1免疫グ ロブリン分子のそれと同様のβ相を有していることが見いだされた。事実、Fcヒ ンジの除去は、わずかな半減期の減少をもたらした(Kimら、1995)。これらの結 果は、マウスIgG1イソタイプにとって、炭水化物残基の存在は、それはなおマイ ナーな役割を果たし得るが、インビボ安定性にとって必要であるには見えないこ とを示す。タンパク質化学を用いて得た先のデータは、CH2ドメインがインビボ 安定性の原因であることを示唆したが(Ellersonら、1976)、最近の研究は、CH3 ドメイン中の残基もまた、マウスIgG2aおよびIgG2bイソタイプの異化制御に関与 し得ることを示した(Pollockら、1990)。 安定性に関する本発明の発見は特に重要である。何故なら、非グリコシル化Fc フラグメントのインビボ安定性は先に評価されていなかった(Noseら、1990)から である。非グリコシル化Fcフラグメントは、(哺乳類細胞により生産された免疫 グロブリンのタンパク質分解により調製された)グリコシル化型と比較して、補 体C1qに対する結合が低下し、単球上のFcレセプターへの結合が顕著に低下する ことが公知である(Noseら、1990；Leatherbarrowら、1985；NoseおよびWigzell 、1983；TaoおよびMorrison、1989)。しかし、これら有利な性質は、非グリコシ ル化分子が不安定であることが見いだされた場合、ほとんど重要ではないであろ う。本発明者らは、インビボで安定であることが証明された非グリコシル化Fcフ ラグメントを発現し得た。 E.coli中のIgG1 FcヒンジまたはFcフラグメントの生産は、インビボの抗体安 定性および異化の制御に関与するこの領域の重要な残基が解明されることを可能 にする。これらの結果は実施例８に記載される。さらに、本発明に従って、ヒト Fcドメインが今やE.coliで生産され得、ヒトタンパク質のさらに詳細な研究を可 能にする。さらに、マウスまたはヒト起源のいずれかに関わらず、FcまたはFcヒ ンジドメイン、あるいはFcまたはFcヒンジドメイン：融合タンパク質の細菌によ る分泌が考案され、長い血清存続性を有する新規なタンパク質生産のための、便 利な、経済的に魅力的でありかつ迅速なルートを提供する。 構造分析に次いで、Fc構造のより小さな領域が、タンパク質キメラ、または融 合タンパク質に利用され、生物学的に安定な治療薬を生産し得る。これは特に、 タンパク質分解のために、哺乳類細胞のようなその他の発現系から得られること が出来ない治療薬の生産に特に有用である。それ故、本発明のFcヒンジまたはFc ドメイン、またはその部分は、治療用途のキメラタンパク質を含む組換え分子の タグ化および安定化の両方に有用なモジュールであることが提案される。 Ｃ：IgG分子の異化部位 Igクラス(IgA、IgE、IgM、IgDおよびIgG)の中で、IgG分子が最も長いインビボ 半減期を持つ(Zuckierら、1990)。異化を制御するIgG分子の領域（「異化部位」 ）は、数十年の間Fcフラグメントに在ることが知られていた。この試験は、最初 、SpiegelbergおよびWeigle(1966)により実施され、そして後に多くの他の研究 者により確認され(Zuckierら、1990に概説されている)、タンパク質分解により 生産されたFcフラグメントが完全IgG分子と同じインビボ半減期を有することが 示された。Dorringtonおよび共同研究者による研究(DorringtonおよびPainter、 1974；Ellersonら、1976；Yasmeenら、1976)は、トリプシン消化により生産され たCH2ドメインフラグメントが完全IgG分子のそれと同じ半減期を有したことを示 した。初期およびより最近の両データは、CH2ドメインがIgG異化の制御に関与し ていることを示したが、これらデータのいくつかは、CH3ドメインのさらなる関 与については一致していない(ArendおよびWebster、1977；Dimaら、1983；Muell arら、1990；Kimら、1994a；Batraら、1993)。実際、最近の研究は、CH2ドメイ ンおよびCH3ドメインの両方が、IgG分子の血清存続性を制御する配列を含むこと を示した(Kimら、1994a；Pollockら、1990、Kimら、1994c；Medesanら、1997)。 特に、部位特異的変異誘発を用いて、マウスにおいて血清IgG1レベルの維持に重 要であるCH2-CH3ドメイン界面中のアミノ酸残基が同定され(Kimら、1994a;Medes anら、1997)、そしてそれ故この研究は異化部位の正確な位置を示した。これら の残基は、ヒトおよびマウスIgGイソタイプの両方で高度に保存されており(Kim ら、1994a；表Ｉ)、ヒトおよびマウスIgGの異化部位が同じであることを示唆す る。異化および腸転移に関する、２つの二重変異体(HQ-310、His310がAlaおよび Gln311がAsnに；HN-433、His433がAlaおよびAsn434がGlnに)の影響が、これらの 位置の単一変異よりもむしろ、単一変異(Ile253がAla253に)の影響とともに特徴 付けられた(Kimら、1994a；Kimら、1994b)。より最近の研究では(Medesanら、19 97)、His310からAla310、His435からAla435、His436からAla436、His433からAla 433、Asn434からAla434またはGln434の変異の影響が分析された。 ^* mIgG1＝マウスIgG1、⁺hIgG+ヒトIgG1^** 二重変異としてのHis433およびAsn434は影響を有したが、単一変異としての、 his433からala433およびasn436からala436は、影響が観察されなかった（Medesa nら、1997）。変異しており、そしてクリアランス速度に影響することが見い出 された残基（Kimら、1994a）に下線を付する。 His435からAla435への変異は、異化作用および経細胞輸送の両方に強力な影響 を有し、一方、His436からAla436への変異は、より小さな影響を有する（Medesa nら、1997）。His310からAla310への変異のみは、His310からAla310およびGln31 1からAsn311の両方の変異と同じ影響を有する。このことは、Gln311がFc:FcRn相 互作用に関連しないことを示唆する。Hi433からAlaへ、およびAsn434からAla/Gl nへの個々の変異は、FcRn異化または経細胞輸送への結合において影響を有さず 、その一方、初期の研究（Kimら、1994a;1994c）において、His433、Asn434の二 重変異が中程度の影響を有することが留意されていた。この変動は、Fc:FcRn相 互作用における433および434の直接的な関与よりもむしろ二重変異によるHis435 のような隣接する重要な残基の摂動に起因する（その一方単一変異は摂動が少な い）。 Thr252、Thr254、Thr256、Met309およびAsn315に加えて、変異誘発のための有 用な標的であり得る他の残基は、Gln311、His433およびAsn434である。さらに、 本明細書中に開示されるデータは、His433およびAsn434の二重変異は異化に対し て影響を有するが、Gln311、His433またはAsn434が異化部位を構成すると述べる ことは妥当でないことを示す。 CH2ドメイン由来の炭水化物残基の除去は、IgGのインビボでの半減期に小さな 影響を有するか、または全く影響を有さず、そしてこの影響の程度は、イソタイ プに依存する（NoseおよびWigzell，1983; TaoおよびMorrison，1989; Wawrzync zakら、1989）。IgGの異化に関与するFcの領域（Kimら、1994a）は、FcγRI、RI IおよびRIIIレセプター（「古典的」FcR）の結合に関与する部位とは異なるよう である。なぜなら、これらの認識配列は、より低いヒンジ領域に主として位置す るからである（Duncanら、1988;Lundら、1992;Sarmayら、1992;Jefferisら、199 0;CanfieldおよMorrison，1991;Wawrzynczakら、1992）。さらに、異化部位は、 補体因子Clq結合部位（Glu318、Lys320およびLys322）とは異なる（Wawrzynczak ら、1992;DuncanおよびWinter，1988）。従って、異化部位の変異は、補体結合 にもFcγRI、RIIおよびRIIIへの結合にも影響しないはずである。 IgG2bおよび他のマウスイソタイプ マウスIgG2bは、IgG1、IgG2aおよびIgG3よりも迅速なクリアランス速度を有す ることが示されている（Pollockら、1990）。異化部位を構築することに重要で あることが示されているCH2-CH3ドメイン界面の残基に関する配列差異に関する 分析は、IgG2bにおいて、IgG1、IgG2aおよびIgG3のHis433、His435、His436は、 IgG2bにおいて、Lys433、Tyr435およびTyr436に置換されていることを示す（表 Ｉ）。これらの配列差異は、観察されているクリアランス速度および新生児転移 における差異を説明し得る（McNabbら、1976;Guyerら、1976）。この点に関して 、Scharffおよび共同研究者（Pollockら、1990）は、IgG2aおよびIgG2bのCH3ド メインにおける配列差異が、IgG2aと比較してIgG2bがより速いクリアランス速度 を担うことを示しているが、関連する残基は同定されていない。さらに、マウス IgG2bは、マウスIgG1と同じぐらい効率的には新生児の腸管を横切って転移され ない（Guyerら、1976）。マウスイソタイプのCH3領域における配列差異（表Ｉ） は、異化および経細胞輸送を制御することにおける位置433、435および436の役 割を分析するための理想的なシステムを提供する。IgG2b分子における、his433 からala433、チロシン（tyr）435からhis435、およびtyr436からhis436への変換 は、マウスIgG1と同じインビボ半減期を有する変異IgG2bを生じる。さらに、IgG 1、IgG2およびIgG4と比較したヒトIgG3のより速いクリアランス速度は、残基435 （表Ｉ）が、血清IgGレベルを調節することに関与することをさらに示す。 IgG異化の考えられる機構 全くの定常レベルでの血清IgG濃度の維持は、効果的な免疫に重要である。さ らに、異常に高い（高γグロブリン血症）または低い（低γグロブリン血症）血 清IgGレベルは、臨床的な症状を生じる。効果的であるために、血清IgGレベルの 感知および調節の両方を行う恒常性機構は、生物のＢ細胞によるIgG分子の連続 的かつ可変性の産生を扱い得なければならない。このような恒常性がどのように してもたらされるかは未だ不明であり、そしていくつかの機構が、血清中のIgG レベルの制御を説明するために提案されている（Brambellら、1964; Brambell， 1966; Ghetieら、1981）。明白に、いずれのモデルも、血清IgGレベルにおける 変化に感受性であり、かつ応答性であるフィードバックシステムを引き合いに出 さねばならない。 Brambellおよび共同研究者（Brambellら、1964;Brambell，1966）は、限られ た数の細胞性レセプター（この提案においてFcRcと称される）が、IgG分子に結 合し、そして分解からIgG分子を保護することを提案している。結合し、そして インターナライズしたIgG分子は、タンパク質分解から保護され、引き続いて血 管内プールに放出されて戻され、一方、結合レセプターを有さないインターナラ イズしたIgG分子は分解される。従って、IgG崩壊を担う細胞はまた、崩壊に対す るIgGの保護に関与することが逆説的に提案される（Brambellら、1964;Brambell ，1966）。これらのレセプターは、飽和し得、そして高γグロブリン血症の個体 におけるこのモデルで一貫し、血管内IgGは、低γグロブリン血症におけるより も多いに迅速に分解される。この濃度依存性の異化速度は、濃度-異化現象と呼 ばれる。レセプターモデルはまた、IgG1分子CH2-CH3界面の特定残基の変異が迅 速な血管内クリアランスを生じることを示す最近のデータ（Kimら、1994a）と一 致する。このことは、変異が「保護的」レセプターによる認識の損失を生じたこ と を示唆する。 免疫グロブリンクリアランスの部位 IgGが異化され、そしてプロテアーゼが関与する部位は、なおも特徴付けられ なければならない。肝臓および胃腸管は両方とも、IgGの異化に役割を果たすこ とが示されているが（Covellら、1986;Hopfら、1976;DobreおよびGhetie，1979 ）、いずれの器官も、異化の主要な部位であることが示されていない。それゆえ 、身体全体での散在性異化の可能性が、考慮されるべきである（Waldmannおよび Strober，1969）。このような散在性異化は身体全体の内皮系で生じ得る。なぜ なら、この系の細胞は血管内プールと緊密に接触し、そしてIgGは内皮細胞を絶 えず横断して、血管外スペースに進入する。最近のデータは、内皮細胞の関与の 可能性とともに散在性異化の概念を支持する。 膜を横切るIgGの転移（経細胞輸送） 新生児における腸管転移 母から若年（胎児/新生児）への受動免疫の転移に関与する機構は、Brambell （1966）によって提案され、そして最近のデータにより支持されるような異化の 制御に関与する機構と類似性を共有し得る。齧歯類において、IgGの腸管転移は 、出生後の２週間までに生じ得、そして乳児の齧歯類が母性のIgGを必要とする 主要な経路である（Morris，1978;JonesおよびWaldmann，1972にレビューされて いる）。卵黄嚢を横切るIgGの母性-胎児転移は、ヒト（ここでは母性-胎児転移 が唯一の経路である）とは対照的に、齧歯類における転移のよりマイナーな経路 である。 Fcレセプター（FcRn）は、初乳または乳から新生児ラットおよびマウスの血流 中へのIgGの転移に関係している（Brambell，1966;Rodewald，1976）。新生児に おけるその役割と一致して、レセプターFcRnは、成体齧歯類の十二指腸において 発現されない。単離したラット刷子縁の結合研究（WallaceおよびRees，1980;Ro dewaldら、1983）により、異なる親和性のFcレセプターの２つのクラスが存在す ることを示し、そしてデータは、より高い親和性のFcRが経細胞輸送に 関与することを示唆する（Hobbsら、1987;RodewaldおよびKraehenbuhl，1984） 。FcRnは、乳児ラットの十二指腸の上皮刷子縁から単離され（RodewaldおよびKr aehenbuhl，1984;SimisterおよびRees，1985）、そして対応する遺伝子がクロー ン化された（SimisterおよびMostov，1989a;SimisterおよびMostov，1989b）。 このFcレセプターは、51kDaおよび14kDaの２つのポリペプチドのヘテロダイマー を含む。興味深いことに、14kDa成分は、β2-ミクログロブリンであり、そして5 1kDa成分は、クラスＩMHCタンパク質の重鎖に相同性を有する。このタンパク質 は、組換え形態において高収量で発現され得、そして最近、Ｘ線結晶学によって 分析されている（Burmeisterら、1994a;Burmeisterら、1994b)。マウスFcRnをコ ードする遺伝子が単離され、そしてラットのそれに高度に相同的であることが示 されている（Ahouseら、1993）。興味深いことに、ラットおよびマウスFcRnの両 方はまた、最近単離された、ヒト胎盤由来のFcレセプター（これはおそらく母性 -胎児転移に関与する）と相同性を共有する（Storyら、1994）。従って、入手可 能なデータは、ラット、マウスおよびヒトにおけるIgG経細胞輸送が、類似のレ セプターによて実行され、そして結果として共通の機構を共有することを示す。 経腸管輸送の提案される機構は、腸管上皮細胞のルーメン側におけるFcRnがpH 6〜6.5（腸管ルーメンのpH）でIgGに結合し、そしてIgG-FcRn複合体が細胞を横 切って側底表面に輸送されることである（ここで開口分泌が、新生児齧歯類の血 流に生じる）。IgGのFcRnとの会合が、それが細胞を介して輸送されるとき、リ ソソームの分解からIgG分子を保護すると推論される。血漿のpH（7.4）は、循環 への結合IgGの放出を生じる。FcRnのIgG（またはFc）への結合の分析は、このモ デルで一貫したpH依存性（すなわち、pH6〜6.5での強い結合およびpH7.4での非 常に弱い（たとえ存在したとしても）結合）を示す（Rodewald，1976;Wallaceお よびRees，1980）。組換えFcフラグメントを用いて、マウスFcRnは異化制御に関 与する領域と重なり合うマウスIgG1分子の領域と相互作用し、そしてIle253、Hi s310、Gln311、His433およびAsn434を含む（Kimら、1994b）。より最近のデータ は、His435およびHis436の関与、ならびにHis433およびAsn434（個々に変異し、 そして二重変異としてではなく）が、FcRnとの相互作用において役割を果たさな いことも示している（Medesanら、1997）。さらに、His310か らAla310への単一変異は、His310からAla310およびGln311からAsn311の二重変異 と同じ効果を有する。このことは、Gln311がFcRnと相互作用しないことを示す（ Medesanら、1997）。同様の結論が、ラットFcRnにおけるＸ線結晶学的データお よびBjorkmanおよび共同研究者のインビトロ結合研究から引き出されている（Bu rmeisterら、1994a;Burmeisterら、1994b;Raghavanら、1994）。さらに、腸管転 移に関して、データは、ラットFcRnのFcへの結合の化学量論が2:1であるという 報告（Huberら、1993）と一致して、Fc当たり２つのFcRn部位が必要であること を実証している（Kimら、1994b）。FcRnとの相互作用におけるIgG1分子のHis310 、His435およびHis436の関与は、少なくとも部分的に、FcRn-Fc相互作用のpH依 存性を説明する（Kimら、1994b;Raghavanら、1993）。 マウス卵黄嚢を横切る転移（母胎転移） マウスFcRnは、新生児腸管および卵黄嚢の両方において高レベルで発現され（ Ahouseら、1993）、そしてFcRnに構造的に類似するFcRはまた、ラット卵黄嚢か ら単離されている（Robertsら、1993）。FcRnへのIg結合に関する細胞位置は、 ２つのプロセスにおいて異なるようであるが（Robertsら、1993）、これらのデ ータは、本明細書中に開示されるインビボ研究とともに、母体-胎児および腸管 輸送が、FcRnによって実行されることを強く示唆する。ラットにおいて、卵黄嚢 FcRは、尖端および側底の細胞質中の小胞に位置し、そして卵黄嚢細胞のルーメ ン表面に位置しない（Robertsら、1993）。位置の差異は必要であると考えられ る。なぜなら、卵黄嚢を取り囲むルーメンのpHは、わずかに塩基性であり（Robe rtsら、1993）、そしてFcRnのIgGへの結合の親和性このpHでは低いからであり（ Hobbsら、1987;RodewaldおよびKraehenbuhl，1984）；従って、母性IgGが、非特 異的エンドサイトーシスエ程において卵黄嚢細胞によって取り込まれ、次いでわ ずかに酸性のエンドソーム区画においてFcRnに結合することが示唆された。IgG の胎児循環への送達は、次いで、腸管の経細胞輸送の送達と類似の様式で生じる ことが提案されている（Robertsら、1993）。同様に、IgG異化の制御に関して、 IgGは、非特異的エンドサイトーシスエ程において「異化」細胞によって取り込 まれ、そして続いてエンドソーム区画においてFcRnに結合する。 IgG経細胞輸送と異化の制御との間の相互作用 データ（Kimら、1994a;Kimら、1994b）は、Brambellおよび共同研究者によっ て最初に提案されたように、異化制御、母胎転移および腸管転移に関与するFcレ セプターは、マウスIgG1の同一（同一でない場合には、緊密に関連した）部位に 結合する。この仮説の支持において、発現分析は、マウスの卵黄嚢および新生児 腸管におけるFcRnの高レベルの発現に加えて、FcRnが、マウスの心臓、肺、肝臓 、脾臓および内皮細胞株において低レベルで偏在的に発現されるが、Ｔリンパ球 でもＢリンパ球でも発現されないことを示す。 Fc:FcRn相互作用の親和性が増大し、そして血清存続性が長くなる場合に、受 動性免疫の乳児への母性転移が改善されることが予想される。治療的IgGの増強 された血清存続性および母胎転移に関して、それらのプロセスに関与するFcレセ プターへの結合に対してより高度な親和性を有するIgGを付与することが好まし い。結果として、より高度な親和性のIgGは、高濃度の内因性IgGを競合（out-co mpete）し得なければならない（マウスにおける５mg/mlおよびヒトにおける10mg /ml）。 Ｄ：延長されたインピボ半減期を有する操作された抗体ドメイン IgG分子のインビボ異化を調節することに関与する機構は、現在十分に理解さ れていないが、Fc領域は、IgGの血清存続性に重要である配列を含有していると 考えられている（SpiegelbergおよびWeigle，1965）。本明細書中およびPollock ら、(1990)に記載されるように、CH2ドメインおよびCH3ドメインは、IgGの生物 学的半減期に影響することが示されている。 StaphylococcusのプロテインA(SpA)-IgG複合体は、非複合体化IgG分子よりも 迅速に血清から取り除かれることが観察されている（Dimaら、1983）。Ｘ線結晶 学研究由来の結果は、Fc-ヒンジ領域中の残基がSpA結合に関与することを示して いる（Deisenhofer，1981）。これらの異なる系統の情報は、マウスIgG1分子由 来の（上記の）組換えFc-ヒンジフラグメントのCH2-CH3ドメイン界面の残基を変 異させること、および得られる変異体の異化を調査することを、本発明者らに促 した。 このアプローチを用いて、CH2ドメインのいくつかのアミノ酸残基、Ile-253お よびHis-310（およびHis310、Gln-311からAla310、Asn311の二重変異）、ならび にCH3ドメインのいくつかのアミノ酸残基（His-433-Asn-434の二重変異、His433 およびAsn434の単一変異、ならびにHis435およびHis436の単一変異）をインビト ロ変異誘発によって変化させた。次いで、変異タンパク質を、組換えE.coli細胞 から精製し、そして薬物動態学的なパラメーターをマウスにおいて測定した。こ のような研究からの結果は、CH2ドメイン由来のアミノ酸残基、およびCH3ドメイ ン由来のアミノ酸残基が、マウスIgG1の異化に直接的に関与することを実証する 。従って、異化を制御するIgG1分子の部位は、CH2-CH3ドメイン界面に位置し、 そしてFcレセプターへの結合に関与するより低いヒンジ領域とは異なる（Duncan ら、1988;Lundら、1991）。異化制御に関与する特定のアミノ酸残基の同定は、 レセプターを持つ細胞が血清IgGレベルを調節することに重要であり得るという 仮説を支持する（Brambellら、1964）。 本発明者らは、マウスIgG1分子の特定の残基（このイソタイプの異化の制御に 関与することを本発明者らが見出した）を「異化制御部位（catabolic controls lte）」と名付けた。この領域は、従来のFcレセプター（FcγRI、FcγRII、およ びFcγRIII）との相互作用の部位とは異なるが、SpA結合部位と重複する。それ ゆえ、これは、SpA-免疫グロブリン複合体が、複合体化されていない免疫グロブ リンより迅速に浄化されたことを示した以前のデータと一致する（Dimaら、1983 ）。このデータは異化制御におけるFcフラグメントのさらなる残基の関与を排除 しないが、それによって抗体または抗体に基づく分子または結合体の生物学的半 減期が短縮され得る明らかな手段を提供する。それはまた、それによって、所望 であれば、ile253、his310、his435、およびhis436のような残基を再挿入するこ とにより（任意のそのような残基が特定の抗体（例えば、IgG2b）において異な ることが見出された場合）、特定の抗体の寿命が増加され得る手段を提供する。 また、これらの鍵となるアミノ酸に隣接する残基のランダムな変異誘発、それに 続く選択は、増加した半減期を有するFcフラグメントを生じ得る。 IgG分子の異化に関与する機構はなお完全には解明されていないが、本明細書 中に示されるデータは、SpA様「保護的」レセプターがIgG上のCH2-CH3ドメイン 界面に結合し、そしてそれらを分解から保護するという概念を支持する。本発明 のこれらの局面を形成する加工されたFc-ヒンジフラグメントは、種々の実施態 様において有用な試薬であると想像される。例えば、それらは、推定のレセプタ ー（これはおそらくFcRnである）の単離において、そしてさらにIgG異化の部位 および機構を描写することにおいて用いられ得る。 組換えFc-ヒンジフラグメントはまた、動物におけるイムノトキシンの存続性 を調節することが所望される場合、イムノトキシンの調製および送達のために有 用であり得る。イムノトキシンは、細胞の増殖もしくは細胞分裂を抑制するかま たは死滅させる能力を有する別の因子（特に、細胞傷害性のまたはそうでなけれ ば抗細胞性の因子）に結合された抗体成分を有する因子である。イムノトキシン の調製は、一般に、当該分野において周知である（例えば、米国特許第4,340,53 5号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。 Ｅ：FcRn γグロブリン（IgG）が免疫において担う中心的な役割にもかかわらず、それ によって顕著に一定のIgGレベルが血清において維持される分子的機構および原 動力についてはほとんど知られていない。IgGホメオスタシスを分子レベルで維 持するプロセスを理解することは、IgG欠損の処置および治療用抗体の有効な送 達に関連する。新生児マウスにおける機能研究は、IgGの異化を調節するマウスI gG1（mIgGl）の同じアミノ酸（Fc残基Ile253、His310、His433、Asn434、His435 、およびHis436、ここでHis433およびAsn434は二重変異である）がまた、MHCク ラスＩホモログであるFcRnへの結合に関与することを示し、そしてこれはラット FcRn：Fc複合体のＸ線結晶構造と一致する（Burmeisterら、1994a、b）。齧歯類 FcRnは、母体から子への、主に経細胞輸送を介するIgGの受動転移に関連付けら れており（RodewaldおよびKraehenbuhl、1984；SimisterおよびRees、1985）、 そしてβ2-ミクログロブリン（β2m；SimisterおよびMostov、1989b）と会合し た45〜50kDaのα-鎖を含む。組換えFc-ヒンジフラグメントの生理学的半減期に 対する、および新生児経細胞輸送に対するIle253、His310、His433、 Asn434、His435、およびHis436の変異の効果は、密接に相関する。このことは、 FcRn、または近縁のタンパク質が、もともとBrambellおよび共同研究者らによっ て血清IgGレベルの調節に関与することが示唆された今までのところ未同定のFc レセプターであり得ることを示唆する（Brambellら、1964）。そのようなFcレセ プターは、IgGを結合しそして循環中にIgGを放出し戻すことにより、IgGホメオ スタシスを維持することが提唱され、そしてIgGがレセプターに対して飽和濃度 に達すると、過剰のIgGは分解に運命付けられる（Brambellら、1964）。 IgGの異化は、肝臓（FukumotoおよびBrandon、1979）ならびに腸（Covellら、 1986）のような特定の器官だけでなく、脾臓、皮膚、および筋肉のような網内皮 成分を含有する組織においても生じる分散的なプロセスである（MarianiおよびS trober、1990）。逆説的に、これらの細胞はまた、IgGをリサイクルする推定のF cレセプター（Brambellら、1964）を有し得る。IgGの母胎／新生児転移に関与す る細胞外でのラットFcRn（SimisterおよびMostov、1989a）およびヒトFcRnホモ ログ（Storyら、1994）の偏在性の発現は、身体中の部位においてIgGレベルを制 御することにおける役割と一致する。 実施例７に記載のように、マウス組織および細胞株におけるFcRnの発現は、逆 転写酵素（RT）-PCR^TMを使用して分析されている。FcRnα-鎖mRNAは、成体組織 ／細胞型、特に内皮細胞に富む成体組織／細胞型において偏在的に分布している 。β2m遺伝子の破壊に起因してFcRn発現を欠く遺伝子操作されたマウス（β2m-/ -マウス）におけるFc-ヒンジフラグメントの薬物動態学（Zijlstraら、1990；Ko llerら、1990）もまた分析されている。データは、IgGの異化の調節におけるFcR nの関与を支持する。 実施例７に記載の研究において、β2m-/-マウスにおけるIgG/Fcフラグメント の薬物動態学の分析は、β2m依存性タンパク質（Zijlstraら、1990）であるFcRn が、血清IgGレベルの維持に関与し得るという概念を支持する証拠を提供する。 この役割におけるFcRnの示唆された意義は、ラット（SimisterおよびMostov、19 89a）、ヒト（Storyら、1994）およびマウス（図４Ａ〜図４Ｃ）におけるFcRnま たはそのホモログの偏在性の発現、およびさらに、新生児経細胞輸送の制御、Ig G異化、および組換えFcRnへの結合に関与するIgGの領域間の密接な重複（Kim ら、1994b；Popovら、1996；Medesanら、1997）と一致する。 RT-PCR^TM分析は、FcRnが、肝臓、脾臓、および肺においては発現されるが、ク ローン性ＢおよびＴ細胞株／ハイブリドーマにおいては発現されないことを実証 する。マウスの内皮細胞株および肝細胞の両方における発現のさらなる分析は、 FcRnが、これらの細胞型においても発現されることを示した。定量的PCR^TMは、 これらの細胞における発現のレベルが、新生児刷子縁における発現のレベルより も実質的に低いことを示し、そしてこのことは、ノーザンブロッティングを使用 して以前に報告された新生児刷子縁および卵黄嚢以外の組織におけるマウスFcRn α-鎖mRNAの検出の欠如（Ahouseら、1993）を説明し得る。内皮細胞株SVECを用 いる直接的結合研究は、WT Fc-ヒンジが、HQ-310/HN-433変異体より有意に高い レベルで結合することを示す。変異体Fc-ヒンジフラグメントがバックグラウン ドレベルで単離された新生児刷子縁（Kimら、1994b）、および検出不能に組換え FcRn（Popovら、1996）に結合することを実証する以前の観察は、ディファレン シャルな結合がFcRnにより媒介されることを示唆する。ディファレンシャルな結 合がFcgRI、IIおよび／またはIIIとの相互作用に起因するという可能性は、Fc上 のこれらのレセプターの相互作用部位がCH2-CH3ドメイン界面に対して遠位であ ること（Duncanら、1988；CanfieldおよびMorrison、1991；Lundら、1991）、な らびにさらに、非グリコシル化（aglycosylated）Fcフラグメントがこれらのレ セプターへの結合において損なわれていること（TaoおよびMorrison、1989；Nos eら、1990）を実証する報告により、なさそうにされる。それゆえ、結合データ は、FcRnがSVEC細胞において機能的であり、そしてFcRnα-鎖mRNAが発現される 他の細胞型において機能的であると意図されることを示唆する。機能的なFcRnは また、SepharoseにカップリングされたマウスIgG1（mIgG1）を使用して、SVEC細 胞溶解物から単離されている。 内皮細胞および肝細胞の両方におけるFcRnの発現の機能的意義は、これらの細 胞型のいずれかまたは両方が、IgGホメオスタシスの維持に関与し得ることを示 唆する。これに関して、FcRnがラット肝細胞から免疫沈降により検出されており 、そしてIgGの胆管への輸送の媒介における役割が、近年この部位における免疫 監視に関連することが示唆されている（Blumbergら、1995）。しかし、肝細胞Fc Rn についての異なる機能は、このタンパク質が結合しているIgGを胆汁中への送達 から孤立させ、そして非結合（過剰）IgGのみが胆管における異化のために送達 されるということであり得る。これは、ヒツジにおいてIgGが肝臓細胞を介して 胆汁中へ分解のために送達されることを示すデータと一致する（Fukumotoおよび Brandon、1979）。しかし、他者の以前のデータ（MarianiおよびStrober、1990 ；Zuckierら、1989において概説される）と考え合わせると、本研究における知 見は、肝臓およびより分散して位置する内皮細胞の両方の関与を支持する。 薬物動態学データは、mIgG1またはWT Fc-ヒンジが、β2m-/-マウスにおいて異 常に短い血清半減期を有することを実証する。これらの血清半減期は、血清IgG レベルの維持におけるなんらかの普遍的な欠損に起因するのではない。なぜなら 、IgAの血清半減期はβ2m+/+マウスおよびβ2m-/-マウスの両方において同じだ からである。多くの研究が、血清IgG濃度とIgGの半減期との間に逆の相関が存在 することを示しており、そしてこれは濃度-異化現象（concentration-catabolis mphenomenon）と呼ばれている（WaldmannおよびStrober、1969；Zuckierら、198 9）。それゆえ、mIgGl/WT Fc-ヒンジの迅速な排除は、β2m-/-マウスにおける異 常に高レベルの内因性血清IgGに起因し得る。 しかし、これは明らかにその例ではない。なぜなら血清IgGレベルは両方のバ ックグラウンドのβ2m-/-マウスにおいて異常に低く、そしてこれらの低い血清I gG濃度は他者の観察と一致するからである（Spriggsら、1992；Israelら、1995 ）。対照的に、血清IgAおよびIgM濃度（これらは、IgGホメオスタシスに関与す る機構とは異なる機構により調節される）（Stroberら、1968）は正常範囲にあ る。 今日までに、β2m-/-マウスにおける低い血清IgG濃度の媒介においてIgG分解 速度が有し得る役割は研究されていない。正常マウスにおいて、母体IgGが内因 性免疫グロブリン合成を刺激し、そしてβ2m-/-マウスにおける母体転移の欠如 が低いIgGレベルを説明するということが以前に示唆されている（Israelら、199 5）。しかし、この研究におけるデータは、両方のバックグラウンドのβ2m-/-マ ウスはより低いIgG1合成速度を有するが、低い血清IgGレベルのさらなる原因は 異化速度の増加であることを示す。C57BL/6×129/Olaバックグラウンドのマ ウスについての状況は、このバックグラウンドのβ2m+/+動物についてさえ、IgG およびIgG1レベルが異常に低いという観察により、より複雑にされる。これは、 この混合バックグラウンドのβ2m-/-マウスについての合成速度よりも、予想外 に低い合成速度に起因する。従って、混合バックグラウンドのマウスにおけるIg Gの新生児転移の存在または非存在には依存せずに、IgG1合成速度は異常に低く 、そしてこの理由は未知である。このバックグラウンドのβ2m+/+マウスにおけ る低い血清IgG濃度の結果として、そして濃度-異化現象と一致して（Waldmannお よびStrober、1969；Zuckierら、1989）、IgG1およびWT Fc-ヒンジの半減期はβ 2m+/+C57BL/6マウスにおけるよりもこの系統において有意に長い。 β2m-/-マウスにおける観察は、それによって、正常マウスにおいて血清IgGレ ベルを調節するβ2m依存性Fcレセプター（すなわち、FcRn）がβ2m-/-マウスに おいて存在しないかまたは機能不全であるかのいずれかのモデルと一致する。し かし、特にβ2mの欠如が現在利用可能なデータが示すより多面発現性である場合 は、別の説明は排除され得ない。これは、β2m-/-マウスにおける見かけ上正常 なCD4+CD8-サブセットの存在（Zijlstraら、1990；Kollerら、1990）およびＢ細 胞がＴ細胞依存性抗体応答を備える能力（Spriggsら、1992；Mozesら、1993）に より、なさそうにされる。他の可能性（例えば、IgG産生前駆細胞における欠損 、または低い血清IgGレベルを生じるCD8+細胞により産生される因子／サイトカ インの非存在のいずれか）は、β2m-/-マウスが正常数のB220+/sIgM細胞を有す る（Spriggsら、1992）、およびLyt2ノックアウトマウスにおいてCD8＋細胞の欠 如は減少したIgGレベルを生じない（Fung-Leungら、1991）という観察により排 除される。さらに、FcRn自体ではなくFcRnに類似するβ2m依存性タンパク質がIg Gホメオスタシスに関与するという可能性は、マウスにおいてFcRnは近縁のホモ ログを有しないことを示すサザンブロッティングデータにより、なさそうにされ る（Kandilら、1995）。しかし、FcRnと同じ部位においてFcまたはIgGに結合す る、無関係な、今までのところ未同定の、β2m依存性タンパク質が、血清IgGレ ベルの維持において役割を担うことが考えられる。 IgGに結合し、そして新生児腸および卵黄嚢細胞を横断してのIgGの輸送を媒介 するFcRnの能力は、それによって、FcRnが、他の組織において、IgGを分解から 、 それに結合しそして血清中に再循環させることにより保護する機構を示唆する。 FcRn発現の一定のレベルは、いかにして、Ｂ細胞による変動するIgG産生にかか わらず、IgGホメオスタシスが維持されるかを説明する。なぜなら、一旦FcRnが 飽和すると、過剰のIgGはエンドサイトーシス取り込み後の分解に運命付けられ るからである（Brambellら、1964）。FcRn-IgG複合体形成の部位に関して、この 相互作用のpH依存性（RodewaldおよびKraehenbuhl、1984；SimisterおよびRees 、1985；Gastinelら、1992）は、血清IgGレベルの維持のために、細胞内、酸性 区画中への液相エンドサイトーシスによる取り込み後に、FcRnがIgGに結合する ことを示唆する。これは、新生児腸を横断しての経細胞輸送の間に空腸上皮細胞 の先端細胞表面におけるわずかに酸性の媒質において生じるFcRn-Fc相互作用と は対照的である（Rodewald、1973）。しかし、ヒト（Leachら、1990）およびラ ット（Robertsら、1990）の両方におけるIgGの母胎転移についての類似の機構を 支持するデータが報告されている。 まとめると、知見は、以前に割り当てられていた機能（RodewaldおよびKraehe nbuhl、1984；SimisterおよびRees、1985）とは異なるFcRnについての新たな役 割を示唆し、そしてこれは、IgGホメオスタシスを維持する分子的機構の理解に 対する関連を有する。齧歯類FcRnと近年同定されたヒトFcR（Storyら、1994）と の間の配列類似性は、本発明の知見がヒトにおけるIgG-関連免疫不全の治療に、 そしてまたヒト胎盤を横断しての治療用IgGの母体-胎児転移の媒介に関連を有す ることを示唆する。 Ｆ：変異誘発 本発明において、アミノ酸残基の変異誘発は、ランダムまたは部位特異的のい ずれかであり得る。タンパク質において完全にランダムな変異を作製すること、 または実施例４に記載のように特定の残基のみをランダムに変異することを選択 し得る。また、残基を任意の他のアミノ酸残基に変化させ得るが、しかし、特定 の残基が好ましくありそうである。例えば、タンパク質の三次または三次元構造 を維持するために必須である親水性残基を大きな疎水性残基に変異させることは 、おそらく所望されない。なぜなら、そのような変異は抗体を不安定化させ得、 そ して分子の半減期を延長しないかもしれないからである。さらに、露出した残基 を変異させることが好ましい。なぜならそれらはおそらくFcRnと相互作用するか らである。 部位特異的変異誘発は、基礎をなすDNAの特異的変異誘発を通しての、個々の タンパク質もしくはペプチド、または生物学的機能的に等価なタンパク質もしく はペプチドの調製において有用な技術である。この技術はさらに、DNA中に１つ 以上のヌクレオチド配列変化を導入することにより、１つ以上の上記の考慮を取 り込んで、配列改変体を調製および試験する容易な能力を提供する。部位特異的 変異誘発は、特異的オリゴヌクレオチド配列の使用を通しての変異体の産生を可 能にする。この特異的オリゴヌクレオチド配列は、所望の変異のDNA配列および 十分な数の隣接するヌクレオチドをコードして、横断される欠失連結部の両側に おいて安定な二重鎖を形成するに十分な大きさおよび配列の複雑さのプライマー 配列を提供する。代表的には、変化される配列の連結部の両側に約５〜10残基を 有する、約17〜25ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。 一般に、部位特異的変異誘発の技術は当該分野において周知である。理解され るように、この技術は代表的には、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在す るバクテリオファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発において有用な代 表的なベクターとしては、Ml3ファージのようなベクターまたはpUC119のような ファージミドベクターが挙げられる。これらのファージベクターは市販されてお り、そしてそれらの使用はおおむね当業者に周知である。二本鎖プラスミドもま た、PCR^TMを使用する部位特異的変異誘発（これは、一本鎖DNAを生成する工程を 排除する）において慣習的に用いられる。 一般に、部位特異的変異誘発は、最初に一本鎖ベクターを得るか、またはその 配列内に所望のタンパク質をコードするDNA配列を含む二本鎖ベクターの２つの 鎖を融解することにより行われる。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチ ドプライマーは合成的に調製される。次いで、このプライマーは、変異保有鎖の 合成を完了するために、一本鎖DNA調製物とアニーリングされ、そしてE．coliポ リメラーゼＩクレノウフラグメントのようなDNAポリマー化酵素に供される。こ のように、ヘテロ二重鎖が形成され、ここで１つの鎖がもとの非変異配列をコー ドし、そして第２の鎖が所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベク ターは適切な細胞（例えば、E．coli細胞）を形質転換するために使用され、そ して変異配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。 あるいは、二本鎖DNAのPCR^TM特異的変異誘発が、変異されるべき部位に重複す るオリゴヌクレオチドプライマーを設計することにより使用され得る。このよう な変異体は、例えば、核酸再生技術（例えば、米国特許第4,603,102号（本明細 書中で参考として援用される）のPCR^TM技術）の適用によってFcフラグメントを 直接合成することにより容易に調製され得る。 部位特異的変異誘発を使用する選択遺伝子の配列改変体の調製は、潜在的に有 用な種を産生する手段として提供され、そしてこれはそれに制限することを意図 しない。なぜなら、遺伝子の配列改変体が得られ得る他の方法が存在するからで ある。例えば、所望の遺伝子をコードする組換えベクターが、配列改変体を得る ために、ヒドロキシルアミンのような変異原性因子で処理され得る。 Ｇ：ワクチン 本発明は、能動免疫および受動免疫の両方の実施態様で使用するためのワクチ ンを意図する。ワクチンとしての使用が適切であることが提案される免疫原性組 成物は、最も容易に、本明細書中に開示される様式で調製される、操作された抗 体Fcフラグメント、ドメインおよび／またはペプチドから直接調製され得る。好 ましくは、抗原性物質は、十分に透析されて所望でない低分子量の分子が除去さ れる、および／または所望のビヒクル中へより容易に処方するために凍結乾燥さ れる。 有効成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製は一般に、米国特許第4,60 8,251号；同第4,601,903号；同第4,599,231号；同第4,599,230号；同第4,596,79 2号；および同第4,578,770号（これら全ては、本明細書中で参考として援用され る）に例示されるように、当該分野で良く理解されている。代表的には、このよ うなワクチンは、注射剤として調製される。液体溶液または液体懸濁液のいずれ かとして；注入前の、液体中溶液または液体中懸濁液に適切である固体形態もま た調製され得る。調製物はまた、乳化され得る。活性な免疫原性成分は、 しばしば、薬学的に受容可能でありそして有効成分と適合性である賦形剤と混合 される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロ ール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれ ば、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、またはワクチンの有効性を 増強するアジュバントのような微量の補助物質を含み得る。 ワクチンは、従来のように、非経口的に、注射（例えば、皮下または筋肉内の いずれか）により投与され得る。投与の他の態様に適切なさらなる処方物は、坐 薬および、特定の場合、経口処方物を含む。坐薬について、従来の結合剤および キャリアは、例えば、ポリアルキレン（polyalkalene）グリコールまたはトリグ リセリドを含み得る：このような坐薬は、0.5％〜10％、好ましくは１〜２％の 範囲で有効成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物は、例えば、薬学的 グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、 サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いら れる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、 徐放性処方物、または粉末の形態をとり、そして10〜95％、好ましくは25〜70％ の有効成分を含む。 タンパク質は、中性すなわち塩形態としてワクチンに処方される。薬学的に受 容可能な塩は、酸添加塩（ペプチドの遊離のアミノ基により形成される）および 無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、 酒石酸、マンデル酸など）により形成されるものを含む。遊離のカルボキシル基 により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリ ウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）および有機塩 基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノー ル、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。 ワクチンは、投与処方に適合性の様式で、および治療に有効でありかつ免疫原 性であるような量で投与される。投与されるべき量は、処置されるべき被験体に 依存し、これは、例えば、個体の免疫系の抗体を合成する能力、および所望され る防御の程度を含む。投与されることが必要である有効成分の正確な量は、医師 の判断に依存する。しかし、適切な投与範囲は、１ワクチン接種あたり数百マイ クログラムの有効成分のオーダーである。最初の投与および追加免疫の注射に適 切なレジメはまた変化し得るが、最初の投与、続く後の接種または他の投与によ り代表される。 適用の様式は、広範に変化し得る。ワクチンの投与のための任意の従来の方法 が適用され得る。これらは、固体の生理学的に受容可能な基剤でのまたは生理学 的に受容可能な分散液での経口適用、非経口、注射などを含むと考えられる。ワ クチンの投与は投与経路に依存し、そして宿主のサイズに従って変化する。 ワクチンのためのアジュバント効果を達成する種々の方法は、通常、リン酸緩 衝化生理食塩水中で0.05〜0.1パーセントの溶液として使用される水酸化アルミ ニウムまたはリン酸アルミニウム（alum）のような薬剤、0.25パーセント溶液と して使用される糖類の合成ポリマー（Carbopol）との混合物、70℃〜101℃の間 の範囲の温度で30秒〜２分間の加熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集物 のそれぞれの使用を含む。アルブミンに対するペプシン処理（Fab）抗体での再 活性化による凝集物、細菌細胞（例えば、C．parvum）またはグラム陰性細菌の エンドトキシンもしくはリポポリサッカライド成分との混合物、生理学的に受容 可能な油性ビヒクル（例えば、マンニット(mannide)モノオレイン酸（AracelA） ）中のエマルジョン、あるいはブロック置換基として使用されるパーフルオロカ ーボン（Fluosol-DA）の20パーセント溶液とのエマルジョンがまた用いられ得る 。 多くの例において、一般には６回のワクチン接種を超えない、より一般には４ 回のワクチン接種を超えない、そして好ましくは１回以上、一般には少なくとも 約３回のワクチン接種である、ワクチンの複数回の投与を有することが望まれる 。ワクチン接種は、通常、２〜12週の間隔で、より一般には３〜５週の間隔であ る。１〜５年の間隔、一般には３年の間隔での周期的な追加免疫は、抗体の防御 レべルを維持するために望まれる。免疫の過程には、上清抗原に対する抗体につ いてのアッセイが続き得る。アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光などの従来の 標識で標識することにより行われ得る。これらの技術は周知であり、そしてこれ らのタイプのアッセイを例示としての、広範な種々の特許（例えば、米国特許第 3,791,932号；同第4,174,384号；および同第3,949,064号）において見出され得 る。 以下の実施例は、本発明の実施を例示することを意図し、それらに制限される ことを意図しない。本発明は、マウス抗体のFc-ヒンジ、Fc、CH2-ヒンジおよびC H3ドメインを含む種々の免疫グロブリン様ドメイン；ならびに安定性が増加した 変異体ドメインにより示されるが、他のタンパク質またはペプチドが、本明細書 中に記載されるものと類似する構築物に適合可能であることが理解される。同様 に、種々のタグ、リンカー配列およびリーダー配列が、ポリペプチド産物を得る ために望ましい特定の精製または単離方法に依存して用いられ得る。 実施例１ 以下の実施例は、発現宿主としてE．coliを使用した、免疫グロブリンのFc-ヒ ンジまたはFcフラグメントおよびFc-ヒンジまたはFc由来サブフラグメントの、 ミリグラム量での産生を例示する。これらの結果は、この系の、組換えタンパク 質の商業的な大量生産についての適切性を示す。 プラスミド、発現および精製 PCR^TMを使用して、マウスIgGl免疫グロブリン分子9E10（Honjoら、1979；Evan ら、1985）に由来するフラグメントをコードする遺伝子を発現プラスミド（図１ ）中に連結するために単離しそして改変した。これを達成するために、全RNAを １×10⁷の9E10ハイブリドーマ細胞から本明細書中上記のように抽出した。 cDNAを、CH3ドメイン遺伝子/Fcフラグメント遺伝子またはCH2ドメイン遺伝子の いずれかをそれぞれ単離するためのオリゴヌクレオチドCH3forBstまたはCH2forB st（以下を参照のこと；Honjoら、1979）を使用してプライムした。次いで、こ の遺伝子を、PCR^TMおよび以下に示すプライマーを使用して単離した。列挙した ように、５つの異なる配列は、それぞれ、配列番号１から配列番号５で表される 。 代表的なPCR^TMは、以下を含んだ：100mlの最終容量中、３ユニットのPromegaT aqポリメラーゼ、10μl Promega緩衝液、10mlの0.2mM dNTP cDNA合成反応溶液。 サイクル条件は、Techne温度サイクリングブロックを使用し、94℃（0.5分）、5 5℃（0.5分）、72℃（１分）を30サイクルであった。各オリゴヌクレオチドは、 NcoIまたはBstEIIのいずれかの制限部位（下線が引かれ、そしてイタリックであ る配列により示される）をコードし、マウスIgG1定常領域遺伝子（Honjoら、197 9）にアニーリングするオリゴヌクレオチドの領域を示す；これはPCR^TM産物の制 限消化、続くゲル精製およびNcoI-BstEIIフラグメントとしてのVape1βHis中へ の連結を可能にする（Wardら、1992）。次いで、連結したDNAを上記のようにE． coli BMH 71-18中へ形質転換した。全てのプラスミド構築物の挿入物の配列を、 ジデオキシヌクレオチド法ならびに一本鎖DNAテンプレートのためのSequnase(US B)および二本鎖DNAテンプレートのためのFemtomoleキット （Promega）のいずれかを使用して分析した。 これらの抗体フラグメントを組換えE．coli細胞から発現させ、そして分泌さ せ得る。そしてカルボキシ末端His₆ペプチドタグはNi²⁺-NTA-アガロースを使用 する精製を可能にする。図１に示すプラスミドを保有するE．coli BMH71-18形質 転換体を、本明細書中上記のように、増殖させそして発現のために誘導した。組 換えタンパク質を、ペリプラズムから、浸透圧ショック、続くNi²⁺-NTA-アガロ ースを使用する親和性精製により単離した。組換えフラグメントを、CH3ドメイ ン、CH2-ヒンジフラグメント、FcフラグメントおよびFc-ヒンジフラグメントに ついて、それぞれ、培養物１リットルあたり２、１〜1.5、1.5〜２および0.5〜 １ミリグラムの収量で精製した。組換えタンパク質の純度を、SDSゲル電気泳動 （Laemmli）およびクーマシーブルーR-250での染色を使用して評価した。 CH2-ヒンジフラグメントはダイマーおよびモノマーの混合物として発現された 。ダイマーをSepharose-G75カラム（Pharmacia，Piscataway，NJ）を使用してモ ノマーから分離した。モノマーCH2-ヒンジフラグメントを、還元（ジチオスレイ トールを使用）、続く還元スルフヒドリル基の記載されるヨードアセトアミドで の処理（遮断）（Kimら、1994c）によりダイマーから調製した。 インビトロ分析 HPLC分析の結果は、CH3ドメイン、FcフラグメントおよびFc-ヒンジフラグメン トが全て発現され、そしてホモダイマーのタンパク質として精製されることを示 した。FcおよびCH3ドメインについては、非還元PAGEでの分析（図２Ｂ）により 示されるように、ダイマーは非共有結合されている。FcフラグメントおよびCH3 ドメインのダイマー化は、おそらく、CH3フラグメント間の非共有相互作用によ り安定化される。これらは免疫グロブリン構造において密に並置されている（Ma rquartら、1980）。Fc-ヒンジダイマーについては、フラグメントはまた、ヒン ジ領域システイン間の-S-S-架橋により共有結合されている。 対照的に、HPLCを使用したCH2-ヒンジフラグメントの分析は、タンパク質の約 10％がダイマーとして発現および精製され、そして残りはモノマーとして発現お よび精製されることを示す。免疫グロブリンの構造分析は、抗体分子のFc領域中 のCH2ドメインがわずかな相互作用を形成し、そして比較的弱いこれらの相互作 用（例えば、CH3ドメイン間の相互作用と比較して）が、おそらく、低い割合の 発現されたダイマーを生じることを示す。ダイマーは-S-S-架橋により共有結合 されている；ヒンジ領域を有さないCH2ドメインの発現および精製は、非共有結 合されているダイマーを形成する、有意な割合のこのタンパク質を生じ、さらに 、分子内-S-S-架橋により正確に折り畳まれている免疫グロブリンドメインで予 想されるように遊離のスルフヒドリル基が存在しない。これは、CH2-ヒンジフラ グメントにおいて、-S-S-架橋が、ヒンジ領域に位置するシステイン残基間で形 成されることを示唆する。 実施例２ 以下の実施例は、E．coliでの発現後に精製された、ネイティブな配列の免疫 グロブリンのFc-ヒンジおよびFcフラグメントが、ネイティブなIgG1抗体分子に 類似するインビポ安定性を有することを例示する。 免疫グロブリンフラグメントのインビボでのクリアランス速度を決定するため に、組換えタンパク質を¹²⁵Iで放射標識し、そして血清の放射標識レベルを時間 の関数としてモニターした。次いで、クリアランス速度を、インタクトなマウス IgG1（ハイブリドーマから発現および精製した）およびマウスD1.3抗体由来の細 菌で発現させたD1.3Fvフラグメント（Wardら、1989）の速度と比較した。クリア ランス曲線は、すべて二相性であることが見出された（図２Ａおよび図２Ｂ）。 α相およびβ相の半減期を表IIに示す。D1.3Fv、モノマーCH2-ヒンジおよびCH3 フラグメントについては、α相は迅速過ぎて正確に決定されなかった（図２Ａお よび図２Ｂ）。 クリアランス速度のデータから、いくつかの結論が導かれ得る。最初に、組換 え非グリコシル化Fc-ヒンジフラグメントは、完全にグリコシル化されたIgG1分 子と同じインビボでの安定性を有する。a相（血管組織と血管外組織との間の平 衡相を表す）のより短い半減期は、そのより小さなサイズのため、組換えFc-ヒ ンジフラグメントについてより短い。第２に、CH3ドメインおよびモノマーのCH2 -ヒンジフラグメントの両方は、D1.3Fvフラグメントの速度に類似する速度 で浄化される（図２Ａおよび図２Ｂ）。 組換え免疫グロブリンフラグメントを精製し、そしてBolton Hunter試薬（Ame rsham，2000Ci/mmol）またはIodogen（Amersham）のいずれかを用いて10⁵〜10⁷c pm/mgタンパク質の比活性に放射標識した。コントロールとして使用した完全なI gG1抗体を、哺乳動物細胞から、標準的方法論を用いて精製した。グリコシル化F c-ヒンジフラグメントを、パパイン消化、プロテインＡセファロース（Pierce） を用いたその後の精製により、このIgG1抗体から得た。半減期の測定のために、 ２〜４匹のBALB/cマウス（23〜28ｇ、雌）に、0.1mlの放射標識タンパク質（10⁶ 〜10⁷cpmを含む約１〜50μgのタンパク質）を尾部または眼窩後部に注射し、そ して注射後２分〜72時間の時点で眼窩後部から採血した。血液サンプル中に存在 する放射活性の量を、シンチレーションカウンターを用いて決定した。 高い比率（約90％）のCH2-ヒンジフラグメントは、ダイマー形態よりもむしろ モノマー形態で発現および精製され、従って、安定性の決定基がCH2-ヒンジダイ マー上に位置する可能性が残った。CH2-ヒンジダイマーがインビボで安定である か否かを決定するために、CH2-ヒンジフラグメントのダイマーを、サイズ排除に よりモノマーから分離し、そしてKimら（1994c）により記載されたような薬物動 態学的研究における使用のために放射標識した。CH2-ヒンジダイマーのモノマー を、還元およびアルキル化によりダイマーから生成し、そしてこれらのモノマー もまた放射標識し、そして薬物動態学的研究に使用した。このダイマーのβ相の 半減期は、優先的にはモノマーであるCH2-ヒンジドメインの半減期よりも有意に 長い。 これらのデータは、組換え非グリコシル化Fc-ヒンジフラグメントが、完全な グリコシル化IgG1免疫グロブリン分子に類似のβ相を有することを実証する。従 って、炭水化物残基は、安定性において主要な役割を果たさないようである。さ らに（Kimら，1995）、ヒンジの存在は、半減期の僅かな増加をもたらす。対照 的に、モノマーCH2-ヒンジフラグメントおよびCH3フラグメントの両方が、抗体F vフラグメントと同程度に早く異化される。このことは、CH2ドメインおよびCH3 ドメインの両方における配列の存在が、組換えFc-ヒンジまたはFcフラグメント のインビボでの安定性に必要であることを示す。しかし、CH2-ヒンジダイマーは 、CH2-ヒンジモノマーよりも長い半減期を有するが、CH3ドメインについての必 要性と一致して、CH2-ヒンジダイマーの半減期はFc-ヒンジの半減期よりも短い 。E.coliにおけるIgG1 Fc-ヒンジまたはFcフラグメントの産生は、インビボでの 免疫グロブリン分子の異化を制御することに関与する重要な残基の記載を可能に すると予想される。本研究を考慮すれば、E.coliにおけるヒトFc領域の産生およ び分析がここで可能である。この研究がまた、動物またはヒトの治療において用 いられる種々の組換え分子とともに使用するための新規なタギングおよび安定化 方法の開発をもたらすことが予想される。 実施例３ 以下の実施例は、β２-ミクログロブリン欠損マウスにおけるIgGの異常に短い 半減期を示し、そして成体の肝臓、肺、脾臓、および内皮細胞におけるFcRn α 鎖の発現を実証する。これは、血清IgGレベルの維持におけるFcRnの役割を意味 する。 細胞株 マウスＢ細胞株BCL1/3B3（Brooksら，1983）およびＴ細胞ハイブリドーマ2B4 （Chienら，1984）を、本研究に用いた。２つの内皮細胞株（マウス肺毛細血管 内皮細胞（B10、D2.PCE）およびSV40形質転換内皮細胞（Kimら，1994c）（SVEC ））は、それぞれ、B10.DBA/2マウスおよびC3H/HeJマウスの肺に由来した。B10 、D2.PCE細胞株を、A．Curtis教授から得た。マウス肝細胞ガン株Hepa 1-6を、A TCC（1830-CRL）から得た。 マウス系統 β2m-/-（Kollerら，1990; C57BL/6×129/OlaおよびC57BL/6バックグランド； 混合バックグランドについては、129/Olaマウスは少なくとも２〜３回、C57BL/6 バックグランドに戻し交配されており、そしてコロニーは同腹子交配により維持 された）およびβ2m+/+[(C57BL/6×129/Ola)F2]マウスは、Jackson Laboratorie sからであった。β2m+/+(C57BL/6)マウスは、Southwestern Medical Center Ani mal Resources Centerからであった。 RT-PCR^TM分析 肺、肝臓、肝細胞、脾臓、および卵黄嚢を、成体BALB/cマウスおよび12日齢BA LB/cマウスからの新生児刷子縁から単離した。肝細胞の単離のために、ラット肝 細胞の単離について既に記載された方法を用いた（Quistorffら，1993）。これ は、95％を越えるものが肝細胞である細胞集団をもたらした。RNAを組織／細胞 株から抽出し、そしてcDNA合成をプライマーＢでプライミングした。プライマー Ｂは、既に記載された方法（Kimら，1994a）を用いて制限部位を「付加（add-on ）」するために加えられた13塩基を有する、FcRN α鎖（Ahouseら，1993）のコ ード鎖の塩基1075〜1095に相補的である。cDNA合成物のアリコートを、プライマ ーＡ（配列番号６）およびＢまたはプライマーＢおよびＣのいずれかとともにPC R^TMに用いた。プライマーＡ（配列番号６）およびＣは、それぞれ、FcRn α鎖遺 伝子（Ahouseら，1993）のコード鎖の塩基640-656および964-996にマッチする。 プライマーＣは、制限部位を「付加」するために加えられた12塩基を有する。RT -PCR^TM産物の予想サイズは469bp（プライマーＡ（配列番号６）およびＢ）およ び157bp（プライマーＢおよびＣ）である。 RT-PCR^TMのコントロールとして、βアクチンプライマー（マウスβアクチンコ ード配列の塩基352〜368であり、そしてβアクチンコード配列の塩基781〜787に 相補的である）を、cDNA合成およびPCR^TMに用いた。サザンブロッティング（Sam brookら，1989）を、クローン化FcRn α鎖由来の³²Ｐ標識SacI-BstEIIフラグメ ント（塩基688〜1028）をプローブとして用いて行なった。 内皮細胞由来の完全なFcRn α鎖遺伝子の単離およびヌクレオチド配列決定 FcRn α鎖全体をコードする遺伝子を、２つの重複するクローンから以下の通 りに単離した。総RNAを内皮細胞株から単離し、そして細胞外ドメイン（リーダ ーペプチドを含む）をコードする遺伝子セグメントを、FcRnのコード配列（Ahou seら，1993）の塩基１〜24にマッチし、そしてその塩基841〜870に相補的である プライマーを用いてRT-PCR^TMにより単離した。D10、D2.PCE細胞由来のこの遺伝 子を用いて、昆虫細胞における可溶性FcRnの発現のためのプラスミドを構築した （Popovら，1996）。塩基640〜1095をコードするセグメント（膜貫通領域および 細胞質テールを含む）を、RT-PCR^TMならびにプライマーＡ（配列番号６）および Ｂを用いて単離した。PCR^TM産物をpGEM-T（Promega）中にクローン化し、次いで SphI-SaIIフラグメントとして両方向でpUCl18/pUCl19中に再クローン化した。ss DNAを得られたクローンから単離し、そしてジデオキシヌクレオチド法 た。各フラグメントについて、いくつかの独立したPCR^TM単離物を分析した。 定量的PCR^TM 本質的に、ScheuermannおよびBauer（ScheuermannおよびBauer，1993）の方法 論を用いた。FcRnのカルボキシ末端領域および3'非翻訳領域をコードする遺伝子 セグメント（Ahouseら，1993）を、PCR^TMならびにプライマー5’TCT GGC TCC TC C GTG CT 3’（配列番号６）（FcRnコード配列の塩基640〜656）および5’ATC ATC TAG ATT TTT TTG TTG GGG CCA AAT TTA TG 3’（配列番号７）（XbaI部位を 下線で示し、そしてポリＡテールおよび上流領域に相補的である配列を斜体で示 す）を用いて単離した。次いで、PCR^TM産物を、XbaI（プライマー中にコードさ れる）およびNcoI（FcRnコード配列中の内部部位およびFcRn非翻訳3’テール） を用いて制限処理して、NcoIフラグメント（塩基992〜1192）およびNcoI-XbaIフ ラグメント（塩基1200〜1285）を生成した。これらの２つのフラグメントを、塩 基640〜1095をコードする配列を含むpUCl19誘導体とともに用いて、FcRnコード 配列の塩基640〜1095および3’非翻訳領域（すなわち、塩基640〜1285）をコー ドする遺伝子を組立てた。この構築物を、唯一のBstEII部位（FcRnの塩基1021〜 1027）で制限処理し、そして100bpの「フィラー」フラグメントを挿入してからp SP64（Promega）へ再クローン化した。ポリＡ＋RNAを、Riboprobe system II（P romega）を用いて合成し、そしてオリゴdTセルロースを用いてポリＡ＋RNAを精 製した。このRNA（FcRnポリＡ）を、定量的PCR^TMにおける内部標準として用いた 。 総RNAを、既に記載されたように（Kimら，1994a）、またはQiagen（Chatswort h，CA）からのRNeasy総RNAキットを用いて細胞株から抽出した。cDNAを合成反応 を、0.8〜2.2μgRNA（各細胞株について一定に保持した）ならびに10⁵〜10⁸FcRn ポリＡ分子（この範囲で変化した）および上記のポリＡプライマーを用いて行な った。 cDNA合成物のアリコートを、以下のプライマーを含む二連PCR^TMにおいて使用 した： 5’ATC ACC ATG GCC GGT AGG ATG CGC AGC GGT CTG CCA GCC 3’、配列番号８（ 斜体の塩基はFcRnコード配列の塩基967〜990にマッチする）および32-P標識5’A TC AGT CGA CCT TGG AAG TGG GTG GAA AGG CAT T 3’、配列番号９（斜体の塩基 はFcRnの塩基1075〜1095に相補的である）。各PCR^TMの10分の１を、４％アガロ ースゲル上で分析した。PCR^TM産物に対応するバンドを切り出し、そしてcpmレベ ルをガンマ計測により決定した（FcRnポリＡに由来する産物は、100bpのサイズ 差により、本物のFcRn転写産物に由来する産物とは区別され得る）。 標準サンプルおよび試験サンプルの取り込まれたcpmを、添加した標準物の量 に対してプロットし、そして交差点をFcRn転写産物およびFcRnポリＡ標準物の量 の等量に対応するとした。単一の刷子縁細胞を計数することは不可能であるので 、定量を総RNA１μgあたりの転写産物の数として表した。 免疫グロブリンの放射標識 mIgG1、組換えFc-ヒンジフラグメントおよびIgAを、記載された（Kimら，1994 a）ようにIodo-Gen試薬（Amersham）を用いてヨウ素化した。 組換えFc-ヒンジフラグメントの結合研究 コンフルエントな層のSVEC細胞を、0.26または0.4mg/mlの¹²⁵Ｉ標識WT Fc-ヒ ンジまたはHQ-310/HN-433変異体とともに37℃にて一晩（16〜18時間）インキュ ベートし、培地（完全RPMI，Gibco，Grand Island，NY，＋10％ウシ胎児血清） で洗浄し、そして50mMリン酸緩衝液（pH7.5）中の５mM Na₂EDTAとの５分間のイ ンキュベーションにより剥離した。細胞を移し、そして10⁷細胞あたりの放射活 性を決定した。 次いで、細胞をペレット化し、そして0.3mg/ml PMSF、25mg/mlペプスタチン、 および0.1mg/mlアプロチニンを含有する2.5mg/ml CHAPS、0.1M Tris-HCl pH8.0 ２ml中に再懸濁し、そして室温にて30分間インキュベートした。懸濁液を、1200 0ｇで30分間遠心分離し、そしてペレットおよび上清中の放射活性の量を決定し た。上清値を用いて、10⁷細胞あたりの抽出された量を計算した。 薬物動態学的研究 ヨウ素化mIgG1、組換えFc-ヒンジフラグメント、およびIgAの薬物動態学を、 既に記載された（Kimら，1994a）ように決定した。 血清Ig濃度の決定 血清Igの濃度を、放射状免疫拡散法およびBindaridキット（The Binding site Ltd.，Birmingham，UK）を用いて決定した。沈澱環の直径を電気的に測定した。 マウスIgG1の合成速度の決定 IgG1の合成速度（SR）を、ｂ相半減期（日）および血清濃度（c（mg/ml））か ら式（MarianiおよびStrober，1990）を用いて計算した： SR（mg/日/マウス）＝（2.77ｃ）/（Ｔ_1/2） そして、2.77の定数は（100×ln2×Ｖ）/（IV）に由来する ここで、Ｖ＝血液容量（全てのマウスについて２mlとした）そしてIV＝血管内 IgG1の％（全てのマウスについて50％とした）。 FcRn α鎖mRNA発現 本明細書中に開示されたデータは、FcRnが血清IgGレベルを調節することに関 与し得ることを示唆した。IgG異化の部位は依然として明確には決定されていな い（MarianiおよびStrober，1990）ので、種々のマウス組織および細胞株におけ るFcRnα鎖の発現を、RT-PCR^TMおよびFcRn α鎖遺伝子（Ahouseら，1993）由来 のプライマーを用いて分析した。RT-PCR^TMが特異的であったことを確実にするた めにサザンハイブリダイゼーションを行なった。卵黄嚢および新生児刷子縁に加 えて、FcRn α鎖は、肺、肝臓、および脾臓において発現されるが、Ｂ細胞株BCL 1/3B3（Brooksら，1983）およびＴ細胞ハイブリドーマ2B4（Chienら，1984）に より示されたクローンリンパ球集団においては検出可能なレベルではない。PCR^{T M} 産物の同一性の確認が、ヌクレオチド配列決定により得られた。 FcRn α鎖の遍在的な発現は、それがこれらの組織内で内皮細胞において産生 され得ることを示唆した。従って、RT-PCR^TM分析を、２つのマウス内皮細胞株B1 0、D2.PCEおよびSVEC（0’ConnellおよびEdidin，1990）を用い、FcRn α鎖（Ah ouseら，1993）に特異的なプライマーを用いて行なった。両方の株について、Fc Rn α鎖mRNAの発現が観察された。他の研究者の研究（Ahouseら，1993; Kandil ら，1995）と一致して、SVEC細胞由来のFcRn α鎖の完全なコード配列の遺伝子 の単離および配列決定は、これがC3H/HeJマウス（Kandilら，1995）由来の配列 と同じ配列を有することを実証した。この配列は、元々記載されたマウス（FVB/ N株）FcRn遺伝子（Ahouseら，1993）とは、コドン26、52、212、230、244、およ び299で異なる。変化は、コドン52でのＧからＡへの変化（バリンからメチオニ ン）を除いてサイレントである。B10、D2.PCE細胞由来のFcRn α鎖遺伝子の配列 は、FVB/N株（Ahouseら，1993）の配列とは、コドン52、212、230、および244で 異なり、そしてこれらの位置でSVEC細胞の配列と同じ配列を共有する。従 って、B10、D2.PCE遺伝子は、以前に記載されていないFcRn α鎖の多型変異体を 示す。 肝臓は、IgG異化に関与することが示唆されており（FukmotoおよびBrandon，1 979; MarianiおよびStrober，1990）、従ってこの器官におけるFcRnの発現をさ らに分析した。肝細胞を成体マウスから単離し、そしてRT-PCRT^Mにより分析し、 そしてこれは予想されたサイズのPCR^TM産物を生じた。単離された肝細胞は完全 には均一ではなかった（他の細胞（例えば、Kupffer細胞）で５％未満の夾雑物 ）ので、RNAをマウス肝細胞ガン株Hepa 1-6から抽出し、そしてRT-PCR^TM分析に おいて用いた。これは、予想されたサイズの産物の単離をもたらした。内皮細胞 株（SVEC、B10、D2.PCE）およびHepa 1-6細胞株におけるFcRnの発現のレベルを 定量的PCR^TMを用いて研究し、そしてSVEC、B10、D2.PCE細胞およびHepa 1-6細胞 におけるFcRn α鎖発現レベルは新生児刷子縁における発現よりも約1000倍低い 。 結合研究 研究を、野生型（WT）およびHQ-310/HN-433変異体Fc-ヒンジフラグメントの内 皮細胞への結合を分析するために行った。HQ-310/HN-433変異体を、それが、His 310、Gln311、His433、Asn434〜Ala310、Asn311，Ala433、Gln434の変異に起因 して、単離された新生児刷子縁（Kimら，1994a）に対してはバックグランドレベ ルで結合し、そして組換え可溶性FcRn（Popovら，1996）に対しては検出不可能 なレベルで結合するものとして用いた。内皮細胞株SVECでの結合研究は、２つの 独立した研究において、WT Fc-ヒンジがHQ-310/HN-433変異体よりもずっと高い レベルで結合することを示す（図3Aおよび図3B）。さらに、WT Fc-ヒンジフラグ メントについてよりも高い比率の結合HQ-310/HN-433は、CHAPSを用いて抽出され るが、これは第１の研究についてさらに顕著であった（図3Aおよび図3B）。 β2m-/-マウスにおける薬物動態学的分析 上記のデータは、遍在的に発現されるFcRnが血清IgGレベルを調節し得るとい う概念を支持する。β2m-/-マウスは、クラスＩ MHC分子およびFcRnの発現が欠 損していることが知られており（Zijlstraら，1990; Kollerら，1990）、従って この仮説を試験するために有益な道具を提供する。BALB/cマウスを用いる以前の 研究では、HQ-310/HN-433変異体は、WT Fc-ヒンジフラグメントよりも有意に短 いβ相半減期を有することが見出された（Kimら,1994a）。従って、mIgG1に加え てこれらの２つの組換えFc-ヒンジフラグメントは放射標識され、そしてそれら の薬物動態学をβ2m-/-およびβ2m+/+マウス（C57BL16×129/OlaおよびC57BL/6 バックグランド）において比較した（図4Aおよび図4B；表III）。２つのβ2m-/- マウス株における３つのタンパク質の全てのβ相半減期は、有意には異ならず、 そして非常に短い（図4Aおよび図4B；表III）。対照的に、mIgG1およびWT Fc-ヒ ンジのβ相半減期は、HQ-310/HN-433変異体の半減期よりもβ2m+/+マウスにおい て実質的に長く、BALB/cマウスにおける以前の観察（Kimら，1994a）と一致する 。予想外に、mIgG1およびWT Fc-ヒンジの半減期は、β2m+/+（C57BL/6）マウス においてよりもβ2m+/+（C57BL/6×129/Ola）マウスにおいて有意に長く、そし てさらなる分析は、これがこれらのマウスにおける血清IgGの異常に低いレベル の原因であることを示した。 β2m-/-マウスがIgレベルの維持におけるいくつかの一般化された欠損を有さ ないことを確実にするために、マウスIgAの薬物動態学をまた、β2m-/-マウスお よびβ2m+/+マウスの両方において決定した（図4Aおよび図4B；表III）。クリア ランス速度に有意差はなく、そしてIgA β相半減期は、他のβ2m+/+マウス株で 観察された半減期の典型である（表IIIならびにWaldmnnおよびStrober，1969；V ieiraおよびRajewsky，1988）。 血清Igレベルの分析 両方のバックグランドのβ2m-/-マウスにおける血清IgGレベルの決定は、これ らが異常に低い（表IV）ことを示した。このことは、他の研究者の観察（Sprigg sら，1992; Israelら，1995）と一致する。さらに、C57BL/6×129/Olaバックグ ランドのβ2m+/+マウスについては、血清IgGレベルはC57BL/6 β2m+/+マウスの レベルよりも低い。IgAおよびIgMの濃度はまた、β2m+/+マウスおよびβ2m-/-マ ウスの両方について分析されており、そしてそれらのレベルは正常範 囲内である（Goding，1983）。薬物動態学および血清IgG1濃度に基づいて、IgG1 の合成速度もまた決定され得（表Ｖ）、そしてこれらのデータを以下でより十分 に議論する。 表Ｖ β2m-/-およびβ2m+/+マウスにおけるIgG1の合成速度 ^aC57BL/6×129/Ola バックグラウンド 実施例４ 以下の実施例は、FcRn-IgG相互作用部位に近位のアミノ酸残基のランダム変異 誘発によって生じたIgGフラグメントの増大した半減期および血清存続性を示す 。結果は、マウスの血清IgGのホメオスタシスにおけるFcRnの関与への支持を提 供し、そしてまた免疫グロブリンフラグメントの半減期を増大するための方法実 証する。相同なFcRnがヒトにおいてIgGレベルを調節するという示唆は、このア プローチが治療抗体の血清存続性増大のための意味を有することを示唆する。 Fc-ヒンジ変異体のライブラリーの構築 野生型(WT)Fcヒンジ遺伝子(Kimら、1994a)を、以下のオリゴヌクレオチドを用 いるオーバーラップ伸長(Hortonら、1989)によるスプライシングにおけるテンプ レートとして使用した：HingebakNco（Kimら、1994a）、5’ATC ACC ATG GCC GT G CCC AGG GAT TGT GGT TG 3’、配列番号３（Ncol部位を下線で示す）；252for 、5’CAA CAC ACG TGA CCT TAG CSN NCA GSN NAA TSN NGA GC 3’、配列番号10 、（N=T、C、G、またはAおよびS=A、GまたはC；Sを終止コドンの産生を最小限に するためにゆらぎ部位で相補体に挿入した）；252bak 5’GTC ACG TGT GTT G 3 ’、配列番号11；Xmafor、5’GCT CCT CCC GGG GTT GCG T 3’、配列番号12(Xma I部位を下線で示す)。PCR^TM産物をXmaIおよびNcoIで消化し、そしてpHEN1(Hooge nboomら、1991)における対応するWT Fc-ヒンジ遺伝子のセグメント（pelBリーダ ーにおいてNcoI部位およびFc-ヒンジの位置211でXmaI）を置換する ために使用した。20,000クローンの大きさのライブラリーを記載(Marksら、1991 )されたようなE．coli TG1のエレクトロポレーションにより生成した。 ライブラリーのパンニング ライブラリーストックを記載(Marksら、1991)されたように使用してファージ を生成した。ファージ（２×10¹²p.f.u/mlの100μl）を以下のように溶液パンニ ングアプローチを用いてパンニングした：ファージを２％粉ミルク、20mMMES(MM 緩衝液)pH6.0に再懸濁し、そして振動しながら室温で350ng組換え可溶性FcRn(Po povら、1996)と１時間混合した。次いで、MM緩衝液(pH6.0)中のNi²⁺-NTA-アガロ ース(Qiagen)の50％懸濁液を30マイクロリットル添加し、10分間インキュベート し、そして遠心分離によりペレット化した。ビーズを0.5ml MM緩衝液(pH6.0)で2 0回洗浄し、そしてファージを100μlリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)中で20分間 室温でインキュベートすることにより溶出した。ファージを使用して、指数関数 的に増殖するE．coli T1を記載(Marksら、1991; Ward，1994)のように再感染さ せた。パンニングを２回行った。 選択したクローンからの浸透圧ショック画分の産生 パンニングから生じたプレートからのコロニーを１ml培養物として増殖させ、 そして記載(Kimら、1994a)のようにFcヒンジ発現のために誘導した。浸透圧ショ ック画分を細胞ペレットの15μlクロロホルムへの再懸濁によって作製し(Amesら 、1984)、そして50mM MES(pH6.0)、0.01％Tween,150mM NaClへの10倍希釈した。 細胞細片を遠心分離によりペレット化し、そして上清を表面プラスモン共振(SPR )研究に使用した。浸透圧ショック画分中の各Fcヒンジフラグメントの量を測定 するために、以前に記載(Wardら、1989)されたようにこれらの画分を抗c-myc抗 体を用いる検出を使用するイムノブロッティングにより、分析した。 可溶性Fcヒンジフラグメントの発現および精製 変異されたFcヒンジフラグメントをコードする遺伝子を、ポリヒスチジンタグ をコードするコドンのすぐ5'に挿入されたインフレームNo.tI部位を有する改変 さ れた形態のVβpelBhis(Ward，1992)に、NcoI-NotIフラグメントとして再クロー ン化した。組換えクローンを増殖させ、発現のために誘導し、そしてFcヒンジフ ラグメントを以前に記載(Kimら、1994a)されたように精製した。SPR研究におい て使用する前に、Superdex-75(Pharmacia，Piscataway，NJ)カラム上での調製物 が分析的分析の55kDaに対応する移動で１つより多いのピークを示す場合、同じ カラム上でのサイズ排除によりFcヒンジフラグメントをさらに精製した。 薬物動態学的分析 タンパク質をIodo-Gen(Amersham，Arlington Heights，IL)を用いてNa¹²⁵Iで 放射標識し、そして薬物動態学的分析をSWISS(Taconic)およびBALB/c(Harlan)マ ウスにおいて以前に記載(Kimら、1994a)されたように行った。 表面プラスモン共鳴(SPR)測定 これらの研究は、BIAcore2000(BIAcore Inc.)およびFc-FcRn相互作用を分析す るために以前に記載された方法論(Popovら、1996)に類似のものを用いて行った 。浸透圧ショック画分におけるFcヒンジフラグメントの結合活性を、BIAcoreセ ンサーチップ(研究等級CM5チップ)に結合したFcRnを使用して半定量的に分析し 、そしてWT Fcヒンジよりも明らかに高い親和性（特に、pH6.0でより低い解離速 度(off-rate)を有するもの）を有するフラグメントを産生するクローンを、さら に精製タンパク質として試験した。100〜300nMの範囲の濃度での精製Fcヒンジフ ラグメントの固定化FcRnへの結合を、40μl/分の流速を用いて分析した。Fcヒン ジフラグメントをまた、コートしていないCM5チップ上に流し、そしてBIA評価2. 1ソフトウエアを用いて、これらの分析からのセンサーグラム(sensorgram)をFcR n結合チップで得られたものから差し引いた。結合および解離速度(on-and off-r ate)計算のために、同じソフトウエアを用いてデータをそれぞれ式R=R_eq(1-e^{-(K sCn+kd)(t-tO)} )およびR=R_Oe^-kd(t-tO)に適合させた。より複雑な解離モデル（例 えば、２つの平衡解離反応）へのデータの適合は、いくつかの変異体についてk_{d l} の負の値を生じ、そして従ってこのモデルは適切ではなかった。再結合によるk_d sの影響を最小限にするために、解離プロットの初期の部分（最初の10〜15秒） を分析 に使用した。WT Fcヒンジについては、この分析は、以前計算された速度(Popov ら、1996)より高い解離速度を生じ、そしてこれはこの実施例において観察され た、以前記載された親和性よりも約４倍低い親和性の主な原因である。各Fcヒン ジフラグメントについて、k_aおよびk_dの値を３〜４センサーグラムから抽出し、 そして平均値を計算した。各センサーグラムについてのK_Ds(k_d/k_a)もまた計算し 、そして平均値を決定した。 変異誘発および選択 1253に密に近接し、溶液に曝されそしてIgGにおいて高度に保存されていない( Kabatら、1991)３残基(T252、T254、およびT256)をランダムなPCR^TM指向変異誘 発のために選んだ。組換えFcヒンジフラグメントを、ベクターpHEN1(Hoogenboom ら、1991)を用いてファージディスプレイライブラリー（約20,000クローン）と して発現させた。アンバーコドンの読み取りの漏出性は、Fcヒンジ：遺伝子III コートタンパク質の混合物を生じ、そして可溶性Fcヒンジフラグメントは、ファ ージディスプレイされ、遺伝子IIIコートタンパク質に結合したFcヒンジホモダ イマーとして発現され、そして構築される。ファージ調製物と組換え可溶性FcRn （ポリヒスチジンタグ化）を溶液中でインキュベートし、続いてNi²-NTA-アガロ ースビーズを用いるファージ-FcRn複合体の捕捉によって２回のパンニングを行 った。結合したファージをpH7.4で溶出し、野生型(WT)Fcヒンジの特徴である結 合のpH依存性を保持するFcヒンジフラグメントを選択した。 パンニングから生じた10個のクローン由来の組換えFcヒンジフラグメントを、 E．coli形質転換体の浸透圧ショック画分における可溶性フラグメントとしてさ らに分析した。表面プラスモン共鳴(SPR)を用いて、固定化FcRnへの結合につい て、WT Fcヒンジフラグメントの親和性よりも類似またはより高い親和性を有す る５つが観察された。これらのFcヒンジフラグメントをコードする遺伝子をイン フレームC末端ポリヒスチジンタグを有するベクター中に再クローン化し、Ni²⁺- NTA-アガロース上での可溶性タンパク質の精製を可能にした。精製の後、WT Fc ヒンジに類似のHPLCおよびSDS-PAGEプロフィール（約55kDa、スルフヒドリル結 合および非共有結合ホモダイマーの混合物を含む）を有する３つのFcヒンジフラ グメントが見出され、そしてこれらのタンパク質を続いて分析した。 コドン位置251〜257での３つの変異のアミノ酸配列を表VIに示す。変異体を、 位置252、254、および256でのアミノ酸に従って名付けた（表VI）。対応する遺 伝子の残りの配列は、変異体ASAがコドン272でグアノシン(G)からアデノシン(A) への変化（これは、グルタミン酸からリジンへの変化を生じた）を除いて、WT F cヒンジフラグメントの配列と同じであった。このアミノ酸は、IgGのヒンジ領域 の近隣に位置し(Deisenhofer，1981)、従ってFc-FcRn相互作用には影響しないら しい。 Fcヒンジフラグメントの薬物動態学 Fcヒンジフラグメントを放射ヨウ素標識し、そしてSWISSマウスにおけるその 薬物動態学を分析した（表VII：図５）。３つの変異体において、変異体LSFはWT Fcヒンジフラグメントまたは変異体ASAもしくはVSHのいずれかよりも有意に長い β相半減期を有した。後者の３つのフラグメントの半減期はそれぞれ有意には異 ならなかった。BALB/cマウスにおいてもまた薬物動態学研究を行い、そして再び 変異体LSFはWT Fcヒンジフラグメントまたは変異体ASAもしくはVSHのいずれかよ りも有意に長いβ相半減期を有した（表VII）。BALB/cマウスにおいて、SWISSマ ウスにおけると同様に、後者３つのフラグメントの半減期は有意に異ならなかっ た。 表VII WTおよび変異体Fcヒンジフラグメントの薬物動態学*スチューデントｔ検定によりWTの値はASAおよびVSH変異体の値とは有意に異な らないが、一方LSF変異体の値は有意に異なった（SWISSおよびBALB/cマウスそれ ぞれについてｐ＜0.003およびＰ＜0.001）。 表面プラスモン共鳴(SPR)分析 ３つの変異体の各々の組換え固定化マウスFcRnとの相互作用動態学をSPRを用 いて分析した（表VIII）。全ての変異体は、WT Fcヒンジフラグメントの結合速 度と類似の結合速度(k_as)を有した。WT(7.44nM)と比較して変異体ASA(4.13nM)お よびLSF(2.16nM)の親和性(K_D)差異は、主に有意な解離速度の差異によった（ASA およびLSFは、それぞれ約２倍および約４倍低いk_dSを有する）（表VIII；図６Ａ および図６Ｂ）。これら２つの変異体の相対親和性もまた、阻害結合研究を用い て分析した。ここで、Sepharoseに結合したマウスIgG1への、放射標識した可溶 性FcRnの結合を、各Fcヒンジフラグメントが阻害する能力を定量した。SPR分析 と一致して、結合の50％阻害に必要なFcヒンジフラグメントの量はWT＞ASA＞LSF の順に減少した。 表VIII FcRnへのFcヒンジフラグメントの結合の速度論のSPR分析 重要なことに、このFcレセプターの正確な機能に必要と考えられるFc-FcRn相 互作用の特徴的なpH依存性に、変異はほとんど影響を有さなかった。WT、ASA、 およびVSH FcヒンジフラグメントのpH7.4での解離速度は、SPRによっては測定不 可能に速かった。しかし、変異体LSFはWT、ASA、またはVSHフラグメントよりpH7 .4で低い解離速度を有した（図６Ａおよび図６Ｂ）が、それでも約0.027s^-1の解 離速度はpH6.0（表VIII）におけるよりなお約25倍速い。pH依存結合の存続性は 、変異残基に隣接するループに位置するH310、H435、およびH436の、この特性の 媒介における示唆された関与に一致した(Raghavanら、1995; Medesanら、1997) 。 SPRデータは、WTに比較して変異体LSFのより長い半減期が、FcRnとの相互作用 に対して約3.5倍高い親和性により説明されることを示した（これは、主に解離 速度の減少による）。これらのデータは、FcRnが飽和可能であり(Brambell，196 4)、そしてより高い親和性のFcフラグメントは、分解されるよりもサルベージさ れそしてリサイクルされるので、内因性IgGに競合的利点を有するというコンセ プトに一致する。しかし、ASA変異体はWTよりも1.8倍高いFcRnへの親和性を有し 、そして有意に長いインビボ半減期を示さなかった。これは、観察されるべき血 清存続性への有意な影響のためには、FcRn結合への親和性の実質的な増大が必要 とされたことを示唆した。あるいは、ASA変異体における変異は、血清プロテア ーゼによる攻撃に対して、または変性に対して増大した感受性により、血清にお いて比較的低い安定性を有するFcヒンジフラグメントに生じたのであろう。 ３つの変異体の配列の分析は、多くの異なる残基がFcRn結合（変異体VSH）の 傷害にならない位置252、254および256において耐性であり得ることを示した。 そして、変異体ASAおよびLSFについては、親和性までもが改良されていた。この 点で、データは、位置252および256について、ASA変異体内のアラニンにおけるT 252およびT256の置換が親和性増加を生じたように、WT残基がFcRnで好ましい接 触をなし得ないことを示した。これは、この位置でのアラニンで置換が、親和性 の実質的減失（3000倍）を生じた（Popovら、1996）ような、高親和性Fc-FcRn相 互作用を媒介する際の1253の明白に決定的な役割とは対照をなした。他の残基が 、FcRn結合能力に変化を与えずに1253を置換し得ることは想像されるが、1253は 全ての哺乳動物IgG全体に保存されている（Kabatら、1991）。 位置252において疎水性側鎖を伴うアミノ酸についての選択が存在するようで ある。そして、WT Fcヒンジの活性に類似したFcRn結合活性におけるさらなる変 異体の配列決定は、この位置におけるPheを明らかにした。興味深いことには、 また、マウス、ラットおよびヒトの大多数の自然発生IgGに存在する位置254（Ka batら、1991）で、全ての３つの変異体は、セリンを有した。この位置でのセリ ンで変異体の明らかな選択は、FcRn結合活性の保持のために、セリンが好ましい 残基であることを示唆する。しかし、WT Fcヒンジ（IgGl）はこの位置でスレオ ニンを有する。そして、それでもなお高親和性Fc-FcRn相互作用を示し、それゆ えに、他の残基がこの位置に存在し得ること、および活性を結合しているFcRnが 保持され得ることが、想像される。 変異体の配列の分析は、活性を結合しているFcRnがアミノ酸（Ala、Hisおよび Phe）の多様なセットで、位置256で保持されることを示した。これは、この領域 がFc-FcRn相互作用の近傍にあり得ないことを示唆する。しかし、この位置での 残基は、齧歯動物およびヒトIgGにおいて、高度に保存される（分析されたIgG中 の約94％のセリンまたはスレオニン、Kabatら、1991）。これは、このアミノ酸 がまだ未確認の機能を有し得ることを示す。ASAおよびVSH変異体において、それ ぞれ、LSF変異体のF256の疎水性側鎖が、より疎水性でないアラニン残基または ヒスチジン残基によりなされ得ないFcRnとの好ましい相互作用を行う可能性もあ る。これらの二つの変異体が、目に見える分ではこの位置だけでお互いと異なっ てい るので、このような相互作用はVSHに比較してLSF変異体の増大した親和性を説明 する。 変異体LSFは、WT Fcヒンジまたは変異体ASAおよびVSHより低いFcRnからのオフ レートをpH 7.4において有したが、このオフレートは、pH 6.0において、それよ り顕著に迅速であった。このより低いオフレートは、細胞表面上のFcRnの半減期 （pH 7.4）が充分に長く、この変異体の有意な量を血清に遊離させ得ることを意 味する。この点で、pH 7.4でのFcRn-LSF変異体複合体の半減期は、約26秒である 。 これらのデータは、FcRnについてのFcヒンジフラグメントの親和性とβ位相半 減期との間の相関を拡張し、そしてさらにFcRnが、直接的にIgG恒常性に関係し ているという提案（Ghetieら、1996；JunghansおよびAnderson、1996；Israelら 、1996）を支持する。さらなる親和性の改良は、mIgGl分子（例えば、CH2ドメイ ン内のH310を含有している表面ループ構造内の分子）の他の領域を標的とするこ とによりなされ得ることが、想像される。脱グリコシル化Fcヒンジフラグメント が完全グリコシル化IgGlと同じ半減期を有するという観察（Kimら、1994a）は、 これらのデータがインタクトなIgGの血清存続性を延長することに直接の関連を 有することを示す。 さらに、変異を受けた部位が、FcγRI、FcγRII、FcγRII I（Duncanら、1988；Sarmayら、1992）と補体Clq（DuncanおよびWinter、1988） との相互作用部位から離れている。これは、より長い血清存続性を生じる変異が 、ADCCまたは補体結合のいずれにも影響を及ぼさないことを示唆する。最後に、 マウスFcRnのヒト相同染色体の同定（Storyら、1994）は、これらの研究が疾患 治療（例えばガンおよび自己免疫）のための治療抗体の薬物動態学の最適化に関 連性があることを示唆する。 実施例５ 本実施例において、pH 6で高い親和性およびpH 7.4で低親和性を有するFcRnに 結合するペプチドを単離する。単離に続いて、結合ペプチドを分析して、それら が、FcRnへの結合についてFcと競合するかどうか、すなわち、それらが同じまた は重複する部位に結合するかどうかを決定する。ペプチド（開示された方法に従 って調製される）は、他の治療のタンパク質または薬物に連結され得、そしてこ のことにより効果的にタンパク質の半減期を増大し得、そして薬物をタグ化し得 る。小さいペプチドは、全長タンパク質と比較して大量に製作するのが比較的よ り簡便である。しかし、現在まで、ペプチドは、それらの短い半減期のために治 療の使用が限定されている。 ペプチドライブラリーの生成 ファージディスプレイベクターpHENl（Hoogenboomら、1991）を、使用する。 ランダムなペプチドライブラリーを、終止コドンの生成を最小限にするために、 センス鎖において揺らぎ位置がＴまたはＧのいずれかであることを除いて、ラン ダムに挿入した塩基で各位置でセンス鎖オリゴヌクレオチドを合成することによ って、生成する。まず最初に、オリゴヌクレオチドは10および15アミノ酸をコー ドするために設計するが、この長さは変化し得る。オリゴヌクレオチドを、NcoI およびNo.tI制限部位をコードする突出部を有して作製する。オリゴヌクレオチ ド二重鎖を、PCR^TMおよび合成オリゴヌクレオチドの5’および3’末端にアニー ルするプライマーを使用して生成する。PCR^TM産物をNcoI-NotIで制限したpHEN 1 に連結し、連結混合物を、コンピテントE．coli細胞に以前に記載（Ward、1995 、Popovら、1996a）のように形質転換する。20〜30個の別々のクローンの挿入物 を配列決定し（Sambrookら、1989）、ライブラリーの多様性を分析する。 ライブラリーのパンニングおよび結合剤の選択 クローンのライブラリーを増殖させ、以前に記載されたように濃縮したファー ジ粒子を形成した（Ward、1995；Popovら、1996a）。ファージを、パンニングに おいて、高い親和性（低いオフレート）ペプチドを単離するために設計した以下 の手順で使用する。ファージを、全てのインキュベーションをpH 6で実行するこ とを除いては、Hawkinsら（1992）が記載した方法に類似の方法で、限界濃度（1 0 nM）可溶化ビオチン化FcRnとインキュベートする。１時間のインキュベーショ ンに続いて、混合液のアリコートを、過剰な非標識FcRn（20μM）で希釈し、そ してストレプトアビジンコート常磁性ビーズの添加の前に、ビオチン化FcRJl-フ ァージ複合体を捕捉するために、様々な時間でインキュベートした。あるいは、 実施例４に記載するパンニング手順を、使用する。次いで、ファージをpH 7.4の 緩衝液で溶出し、そして第2のラウンドのパンニングのための拡大の前に、E．co liを再感染するために使用する。 パンニングの２〜３ラウンドに続いて、感染により溶出したファージで生成す るE．coliクローンを増殖させ、そして96ウェルマイクロタイタープレートの上 をコートするFcRnへの結合について、押し出したファージを酵素連結免疫吸着ア ッセイ（ELISA）で分析した。結合活性を有するファージをウェルに添加する前 に可溶化FcまたはIgGをファージに加える競合結合アッセイにおいて、さらに分 析する。それらのFcRnへの結合が可溶化Fc/IgGにより阻害されるファージを産生 しているクローンを、さらに特徴づける。 FcRnに結合するペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、そして対応するペ プチドを合成する。ペプチド-FcRn相互作用の親和性を、SPRおよびBIAcore（Pha rmacia）を使用して決定する。 ペプチドを、ビオチン化形態において合成して、BIAcoreチップにストレプト アビジン（ストレプトアビジン-コートチップは、多数の供与源から市販される ）を介する直接の結合を可能にさせるために合成する。pH 6およびpH 7.4でのオ ンおよびオフ速度は、先述の方法を使用して決定する（Popovら、1996a； は最も著しいpH依存性を示すペプチドを、さらに分析する。 ペプチドのFcRn媒介性転移 ポリIgAレセプターを発現しているMadin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞単層につ いて記載された方法論（MostovおよびDietcher 1986）に類似の方法論を使用し て、FcRnの機能活性についてのインビトロアッセイを開発する。このアッセイは 、細胞単層の一方の側からもう一方までの結合リガンドのトラフィキングを媒介 する際のFcRnの機能活性の決定を可能にする。代替アッセイが、新生児マウスに おいて以前にFcフラグメントについて記載（Kimら、1994b）されたように（放射 標識した）ペプチドの転移を分析する。 インビトロおよびインビボアッセイのために、ペプチドはＮ末端チロシンを有 するように合成し、そしてIodo-Gen試薬（Amersham）を使用して放射標識する。 ペプチドが一つ以上のチロシンを内部位置で含有する場合、これは明らかに有用 なアプローチではない。このような場合、ペプチドを合成の間Ｎ末端グリシンで 延長させ、Rinkリンカー（Rink、1987）を介して樹脂に連結させて、そして次い で放射標識したスクシンイミジルヒドロキシフェニルプロピオネートにＮ末端で 直接結合させる。多様な濃度のペプチド（１μg/ml〜１mg/ml）を、トランスウ ェルの適切な側面に添加し、そして単層をまたぐペプチドの転移をガンマ計数に よって定量化する。 Fcヒンジが１分子あたり２つのFcRn相互作用部位を有するように、「反複」ペ プチド（すなわち所望の薬物動態の特徴を達成するために、１分子につき２つの 相互作用部位を有するペプチド）を調製し得る（タンパク質１分子あたり２つの 相互作用部位を有することによって成し遂げられる、改良された薬物動態学を実 証する例示的なデータについて実施例６および表Ｘにおいて言及する）。 実施例６ マウスIgG1 Fc領域の部位特異的変異誘発 組換えFcヒンジフラグメントを、異化コントロール（Kimら、1994a）に関係し ているマウスIgG分子の部位を決定するために使用した。以前の研究で、IgG複合 体化StaphylococcusのプロテインＡ（SpA）が複合体化されていないIgG分子より 迅速に排出されることを示した（Dimaら、1983）。SpAは、CH2-CH3ドメイン界面 に位置する残基に結合し（Deisenhofer、1981）、そしてこれはこの領域に位置 するアミノ酸残基がまた、IgG分子の異化の制御時に関与することを示唆した。 従って、Fc変異体を、組換え体E．coli細胞において発現し、そしてNi²⁺NTAアガ ロースを使用して精製した。 野生型（WT）および変異体Fcヒンジフラグメントを、培養物１リットルあたり 0.5ミリグラムの収率において、各々精製する。HPLCならびに還元および非還元 ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析により、WTおよび変異体Fcヒンジフ ラグメントは、正しく折り畳まれたFcヒンジフラグメントについて予測されるよ うにジスルフィド連結ホモダイマーとして発現され、そして精製されることが示 された。 WTおよび変異体Fcヒンジフラグメントの薬物動態学 WTおよび変異体FcヒンジフラグメントをIodo-Gen試薬（Frakerら、1978）を使 用して放射標識し、そしてマウスの薬物動態学の研究において使用した（Kimら 、1994a）。全てのタンパク質について、cpmの90％より大きい部分が、10％TCA によって、沈澱性であった。さらに、注射後24時間の血漿試料のHPLC（SEC-250 カラム、Bio-Rad）を使用した分析は、他の血清蛋白（Kimら、1994a）と結合し ないインタクトな分子（大きさ55kDa）として、WTおよび変異体Fcヒンジフラグ メントが血清に残留することを示した。薬物動態学的パラメーターを、表IXに示 す。 表IX WTおよび変異体Fcフラグメントの薬物動態学パラメーター CH2ドメインにおける変異（HQ-310およびI-253）が、αおよびβ相半減期につ いて、CH3ドメインにおける変異（HN-433）よりも著しい効果を有することは、 これらのデータ（表IX）から明白である。しかし、さらなる研究（実施例10を参 照のこと）からのデータは、His435およびHis436が血清存続性のために重要であ ること、そしてHis433およびAsn434の変異が個別に血清存続性に影響を及ぼさな いことを示す。さらに、HQ-310/HN-433変異体は、最も短いαおよびβ相半減期 を有する。変異体Fcフラグメントの折り畳まれた状態を分析するために、円二色 性（CD）分析を190〜260nmの範囲内で実行した（Kimら、1994a；Medesanら、199 7）。得られたスペクトルは、変異が組換えFcフラグメントの折り畳みミスを生 じないことを示す（Kimら、1994a；Medesanら、1997）。さらに、CDを使用した 変性分析は、WTおよび全ての変異体Fcフラグメントが、使用した条件（10 mMリ ン酸ナトリウム、pH7.0）下で、類似した変性温度（65℃）を有することを示す 。これらの研究のためのさらなるコントロールとして、IgGl Fcの保存されたヒ スチジン（残基285、EU計数法、Edelmanら、1969）をアラニンに転換し、そして 変異体（H-285という）を薬物動態学的に特徴づける（Kimら、1994c）。この変 異体のβ相半減期（76+/-14.6時間）は、WT Fc（表IX）の半減期からは統計学的 に識別不可能であり、このことは、CH2-CH3ドメイン界面（Deisenhoferら、1976 ）から離れたヒスチジンの変異は、Fcフラグメントの異化速度に影響を及ぼさな いことを示す。これは、さらにCH2-CH3ドメイン変異が薬物動態上の特定の効果 を有し、そしてFc構造を一般的に不安定にさせる効果による、Fcのより迅速なク リアランスを生じないというアイデアを支持する。 Fc由来フラグメントの発現 CH2ヒンジフラグメント、CH2ドメインおよびCH3ドメインをコードする遺伝子 を、設計したオリゴヌクレオチドプライマーおよびPCR^TM（Saikiら、1988）を使 用して単離し、そしてNcol-BStEIIフラグメントとしてVβpelBHis（Ward、1992 ）に連結した。CH2-ヒンジ、CH2ドメインおよびCH3フラグメントを発現し、そし て記載（Kimら、1994c）のようにNi²⁺-NTAアガロースを使用して精製し、そして 発現タンパク質の収率は、培養物１リットルあたり、１〜1.5（CH2ヒンジ）、２ （CH2ドメイン）および1.5〜２（CH3ドメイン）ミリグラムであった。これらの 研究用のコントロールとしての使用のために、抗リゾチームD 1.3Fv（Wardら、1 989）もまた発現し、そして組換えE．coli細胞から精製した。 還元および非還元SDSゲル電気泳動を使用した分析は、FcおよびCH3フラグメン トがホモダイマーとして発現されることを示す。対照的に、CH2ヒンジフラグメ ントは、モノマーと-S-S-結合ダイマーとの混合物として発現される。ダイマー を、HPLCを使用してモノマーから分離し、そして薬物動態の研究において使用し た。CH2ドメインを発現し、そしてモノマー（おそらくIgG分子内のCH2-CH2ドメ イン相互作用の相対的な弱さによる（Deisenhoferら、1976））として精製した 。 発現フラグメントの薬物動態学 インビボのIgGフラグメントのクリアランス速度を決定するために、それらをI odo-Gen試薬（FrakerおよびSpeck、1978）を使用して¹²⁵Iで放射標識した。Kim ら（1994a，1994c）が記載のように、マウスにおけるαおよびβ相半減期を決定 し、そして表Ｘに示す。CH2ヒンジダイマーおよびCH2ドメインモノマーのβ相半 減期における差違は、フラグメントあたり２つの異化部位が血清存続性のために 必要であることを示唆する。 CH2ヒンジダイマーに対するCH2ドメインのより短い半減期が後者におけるヒン ジ配列に起因したという可能性を除外するために、CH2ヒンジダイマーを、還元 およびアルカリ化によってモノマーへと変換した（Kimら，1994c）。得られたモ ノマーを薬物動態学的に分析し、そしてCH2ドメインモノマーのβ相半減期（25. 5時間）に類似する短いβ相半減期（29.1時間）を有することを見出した。これ は、１つのCH2ヒンジフラグメントにつき２つの異化部位が、１つのCH2ヒンジに つき１つの部位よりも長い血清存続性を生じることを示す。あるいは、モノマー とダイマーとのサイズの差異は、血清存続性における差異を説明し得る。この可 能性を調査するために、１つの変異体(mutant)（HQ-310/HN-433）ポリペプチド に付随する１つのWT Fcフラグメントを含む、ハイブリッドFcを作製した。この ハイブリッドを、変異体Fcをc-mycタグ（カナマイシン耐性を与えるプラスミド 中）でタグ化し、そしてWT FcをHis₆ペプチド（アンピシリン耐性を与えるプラ スミド中）でタグ化し、そして２つのポリペプチドを同一の細菌細胞において同 時に発現させることにより、単離した（Kimら，1994c）。ヘテロダイマーを、Ni²⁺ -NTA-アガロースカラムに続いて9E10-Sepharoseカラムを使用して精製した（ 後者はc-mycエピトープを認識する、Wardら，1989）。ハイブリッドタンパク質 を、薬物動態学的研究において使用した（図７および表Ｘ）。Fcハイブリッドに ついての37.9分のβ相半減期は、WTホモダイマーのβ相半減期よりも小さいが、 しかし変異体ホモダイマーのβ相半減期よりも大きい。これは、Fcにつき１つの 異化部位が、FcフラグメントにWTホモダイマーの薬物動態学的特徴を与えるのに 十分でないことを示す。Brambellの仮説（Brambellら，1964；Brambell，1966） の枠組みの中では、データは、ハイブリッドが保護レセプターへの結合について 減少したアビディティーを有し、その結果がこのWT Fcホモダイマーのより迅速 な消去であることを示唆する。しかし、Fcハイブリッドに対する変異体ホモダイ マーのより迅速な消去は、後者がホモダイマーよりも保護レセプターに対する高 い結合親和性を保持することを示唆し、そしてこのFcハイブリッドの組換えFcRn に対する結合が、最近になってSPRを使用して示されている（Popovら，1996b） 。 新生マウスにおけるFcフラグメントの腸管転移 表XIに示す変異の、新生マウスにおける組換えFcフラグメントの腸管転移に対 する影響が、以下に記載する種々のアプローチを使用して分析されている。腸管内腔から血漿へのFcフラグメントの直接転移 完全なIgG1分子（mIgG1）、WTおよび変異体（HQ310/HN-433）Fcフラグメント を放射標識し、そして10〜14日齢マウスにおけるインビボ転移アッセイにおいて 分析した（Kimら，1994b）。コントロールとして、パパイン消化によって産生さ れたFcフラグメントおよびFabフラグメントを使用した。ハイブリッドFcフラグ メントもまた分析した。 図８に示す結果は、WT FcフラグメントがFcパパインおよびmIgG1と同様に転移 することを示し、グリコシル化（またはその欠失）が転移に影響を与えないこと を示す。これはHobbsおよび共同研究者の過去のデータと矛盾しない（Hobbsら， 1992）。これらの結果は、変異体HQ-310/HN-433が転移において損なわれている ことを示し、異化部位が腸管転移に関与する部位と重複すること、およびFcハイ ブリッドが転移において損なわれていることを示唆し、Fcにつき２つの機能性部 位が必要であることを示す。これは、異化調節における２つの異化部位の必要性 に関する発見に類似する（上記データおよびKimら，1994c）。 しかし、これらのデータは新生児腸管レセプター、FcRn、および/または経細 胞転移への結合における変異体Fcフラグメントの検出を区別せず、従って、転移 の阻害を含むさらなる研究を行った。 競合転移アッセイ これらのアッセイにおいて、未標識WTおよび変異体Fcフラグメントが放射標識 マウスIgG1の転移を阻害する能力を分析した。HQ-310/HN-433変異体に加えて、 表XIに記載の変異体もまた使用した。これらの研究の結果を表XIIに示す。デー タは、変異体が、FcRnへの結合について完全なIgG1分子との競合において欠陥を 有することを明らかに示した。さらに、半減期に対する各変異の影響は、阻害能 力に対する影響との優れた相関関係を示す（図９）。 *PBSの存在下での放射標識IgG1の伝達と比較して #BSA、ウシ血清アルブミン これらの結果をさらに確認しそして拡張するために、新生児刷子縁を単離し、 そしてWT FcおよびHQ-310/HN-433変異体Fcとの結合研究において使用した。そこ では、mIgG1、WT Fc、およびHQ-310/HN-433変異体がmIgG1の単離された新生児刷 子縁への結合を阻害する能力を評価した（図10）。 結論として、これらの研究は、マウスIgG1分子の新生児マウスにおける腸管転 移の間のFcRnとの相互作用に関与する部位の同定という結果を得た。データは、 異化部位とFcRn結合部位とが密接に関連することを示す。 WTおよび変異体Fcフラグメントの母胎転移 マウスIgG1（mIgG1）、WT Fc、およびHQ-310/HN-433変異体の母胎転移を分析 するために、以下の実施例９に記載の方法論を使用して研究を行った。データは 、変異体がmIgG1およびHT Fcよりも有意に低いレベルで転移することを明らかに 示す（表XIII）。 実施例７ 実施例３および４において上記のデータは、マウスFcRnとFcRc（異化調節に関 与する推定上の「保護」レセプター）とが関連し、そして共通の配列を分かち合 い得ることを示す。従って、マウス組織および細胞株からの推定上のFcRcをコー ドする遺伝子の単離を行った。これを本実施例において記載する。 マウスClass I分子に相同ではない（SimisterおよびMostov，1989a）マウスFc Rn（Ahouseら，1993）の配列に基づくPCR^TMプライマーを、以下のように設計し た： プライマーＡ：5’CAG GAA GCT GAC CCC TGT GGG NN 3’（配列番号13） このプライマーは、マウスFcRnのセンス鎖の塩基190〜212をコードする。 プライマーＢ：TTC CGT CTC AGG CCA CTC CCC NN 3’（配列番号14） このプライマーは、FcRnのセンス鎖の塩基452〜474に相補的である。両プライマ ーについて、FcRcの配列がFcRnに正確に適合しない場合、２つの縮重塩基が各プ ライマーの3’末端において挿入されていることに留意のこと。 総RNAを、２つの内皮細胞株［SVEC（C3H/HeJマウス（0’ConnellおよびEdidin 、1990）由来）、およびMPCE（B10.DBA/2マウス肺由来）；それぞれ、Prof．P． ThorpeおよびProf．A．Curtisから入手］から単離し、そしてcDNA合成をプライ マーＢでプライムした。次いで、cDNAをプライマーＡおよびＢを用いるPCR^TMに おいて使用し、そして両方のcDNAについて、285bpのPCR^TM産物を生成した。陰性 コントロールにおいて産物は全く観察されず、これはこの結果が新生児マウス腸 管によるPCR^TM汚染に起因していないことを示す。PCR^TM産物をTAクローニングシ ステム（Promega）を使用してクローン化し、そしてジデオキシヌクレオチド法 （Sangerら，1977）を使用して配列決定した。複数の独立したクローンの配列決 定は、285bpフラグメントの配列が、１つの塩基変化（A→G）（これはコドン73 においてバリンをメチオニンに変換する）を除いて、FcRnの配列と同一であるこ とを示す。 内皮細胞株からの285bpフラグメントの単離は、膜貫通領域および原形質内末 端(cytoplasmic tail)をコードする遺伝子を増幅するための、以下のようなPCR^{T M} プライマーの設計を促した： プライマーＣ：5’TCT GGC TCC TCC GTG CT 3’（配列番号６） （FcRnのセンス鎖の塩基640〜656をコードする） プライマーＤ：5’TCA GGA AGT GGC TGG AAA GGC ATT 3’（配列番号15） （FcRnのセンス鎖の塩基1075〜1095に相補的である） ２つの内皮細胞株、マウス心臓、肝臓、肺、脾臓、卵黄嚢、新生児刷子縁、お よびプライマーＤとプライムするＴ/Ｂ細胞ハイブリドーマに由来するRNAから、 相補的DNA（cDNA）を合成した。組織についてはBALB/cマウスを使用し、そして2 B4細胞（Ｔ細胞、Chienら，1984）およびY-3P（Ｂ細胞、Janewayら，1984）ハイ ブリドーマを、それぞれ、B10.AおよびBALB/cByJ細胞から得た。PCR^TMにおける これらのcDNAのプライマーＣおよびＤとの使用は、Ｔ細胞とＢ細胞とのハイブリ ドーマ以外の全ての細胞からの、予想されたサイズの産物の単離を生じた。全て の場合において、予想されたサイズのPCR^TM産物を、βアクチン特異的プライマ ーを使用して観察した。 上記の組織/細胞から得たPCR^TM産物の量には、一貫して定量的な差異（これは 同様にmRNAの異なるレベルを示唆する）が存在する。卵黄嚢および新生児腸管（ 刷子縁）が最大量を産生し、そして他の組織における量は以下の順で減少する： 肝臓＞脾臓、肺＞心臓。定量的PCR^TMを実施して、異なる細胞型におけるmRNAレ ベルを評価する。肝臓、脾臓、新生児刷子縁、および肺からの定量的PCR^TM産物 は、領域640〜870においてクローン化および配列決定されており、そしてFcRnと 高い割合の相同性を共有することが見出されている。さらに、完全なFcRnホモロ グが、２つの内皮細胞株からプライマーＤおよびＥを使用して単離されており、 そして複数の独立した単離物が配列決定されている：全部で４つのヌクレオチド 差異が存在し、その内の３つはサイレントであり、そして１つはコドン73におけ るA→G変化（バリンをメチオニンに変換する）である。コドン233、251、および 265におけるサイレント変異はまた、肝臓、脾臓、新生児刷子縁、および肺（BAL B/cマウスに由来する）から単離されたPCR^TM産物においても観察されている。 プライマ−Ｅ：5’ATG GGG ATG CCA CTG CCC TGG 3’（配列番号16）（リーダ ー配列を含んだFcRnのセンス鎖の塩基１〜21をコードする）。 公表されたFcRn配列と単離されたFcRn配列との間の配列差異は、本発明者らお よびSimisterおよび共同研究者（FVA/Nマウス（Ahouseら，1993）を使用した） によって使用された異なるマウス株に起因する対立遺伝子差異である可能性が最 も高い。Simisterらは、マウス胎盤、成体マウス近位小腸、胸腺、脾臓、腎臓、 または肝臓への、FcRn cDNAプローブのハイブリダイゼーションを全く見出さな かったが、マウス線維芽細胞におけるタンパク質レベルでの発現を除外しなかっ た。これらの差異の理由は、使用された方法（すなわち、PCR^TM対ノーザンブロ ッティング）の感度における差異に起因し得る。データに矛盾することなく、Si misterら（Storyら，1994）は、多くの他の成体ヒト組織における広範な発現に 加えて、FcRnホモログがヒト胎盤において高レベルで発現されることを、最近に なって報告している。ラットについてもまた、成体組織由来のRNAへのFcRnプロ ーブの弱いハイブリダイゼーションが、高ストリンジェンシー洗浄の後に観察さ れている（SimisterおよびMostov，1989a；SimisterおよびMostov，1989b）。遍 在性の内皮細胞（すなわち、全ての脈管化器官）における異化の調節に関与する レセプターの低レベル発現は、一定の血清IgGレベルの維持におけるこのタンパ ク質の提案された役割と矛盾しない。これらの発現データは、上記の実施例３お よび４において提示されたデータと共に、FcRcおよびFcRnが単一かつ同一である ことを示唆する。 バキュロウイルス系の可溶形態におけるFcRnの発現 FcRnの細胞外領域（コドン１〜290、リーダーぺプチドを含む）をコードする 遺伝子は、3'His₆ペプチドコドンでタグ化され（Ward，1992）、PCR^TMを使用し てBamHI部位を改変され(tailored)、そしてバキュロウイルス系における発現の ためにpACUW51（Invitrogen）のBgIII部位に連結されている（O'Reillyら，1992 ）。β2ミクログロブリンをコードする遺伝子もまた、PCR^TMを使用してそしてBg 1II部位をタグ化して増幅し、そしてpACUW51のBamHi部位に連結した。ベクターF cRn-pACを使用して、Spodoptera frugiperda（Sf9）細胞へトランスフェクトし た組換えウイルスプラークを精製した。組換えウイルスのストックを生成して、 そしてSf9よりも高いレベルの組換えタンパク質を発現するHigh-5細胞 （Trichoplusia ni；Invitrogen）を感染させるために使用した。４日間の感染 に続いて、培養上清および溶解したペレットを、Ni²⁺-アガロース上を通過させ 、そして結合タンパク質を溶出させた。この系を使用して、１リットルにつき15 ミリグラムのFcRnをルーチン的に精製した。SDS-PAGEおよび免疫ブロッティング （抗β2ミクログロブリンを使用する）分析は、タンパク質が重鎖とβ2ミクログ ロブリンとのヘテロダイマーとして精製されることを示す。HPLC分析は、FcRn重 鎖がβ2ミクログロブリンに定量的に会合することを示す。さらに、マウスIgG1- Sepharoseへの、放射標識した可溶性FcRn（sFcRnと称する）を用いる結合研究は 、sFcRnが、pHに依存的かつ特異的な様式で、Sepharoseに結合したmIgG1へと結 合することを示す（表XIV）。 ^*500μgのmIgGIの存在下^# 標識したrFcRnの比活性は10⁶cpm/μgであった FcRnへのWTおよび変異体Fcフラグメントの結合 IgG-セファロースへの¹²⁵-I sFcRnの結合をマウスIgG1、WTまたは変異体Fcフ ラグメントによって阻害した研究は、I-253、HQ-310、HQ-310/HN-433変異体がsF cRnへの結合においてWT Fcに比較して全てを欠損していることを示す。このこと は、単離した刷子縁を用いたインビボの転移データおよびインビトロの結合研 究と一致する（表XV）。 バクテリオファージの表面上でのFcフラグメントの発現 ファージディスプレイベクターの構築 図11に示すファージミド構築物を作製した。WT FcおよびHQ-310/HN-433フラグ メント（ヒンジ領域を含む）をコードする遺伝子を、ベクターpHEN1（Hoogenboo mら、1991）へNcoI-NotIフラグメントとして連結するために、PCR^TMによって作 製した。この作業についてpHEN1を使用する利点は、以下の通りである：Fc遺伝 子を、抑制可能な停止コドン（amber）を介してフィラメント様バクテリオファ ージfdのcpIIIコートタンパク質に連結する。従って、amberサプレッサー株E．c oli TG1（Gibson、1984）のファージミドでのトランスフェクション、続くヘル パーファージでの重感染は、ファージミド粒子の排出を生じる（Hoogenboomら、 1991）。この場合、ファージミド粒子は、表面結合Fcフラグメントを有する。し かし、抑制は完全ではなく、その結果、Fcフラグメントの有意な割合が、可溶性 の非結合分子として輸送される（イムノブロットにおいて明瞭に観察される）。 従ってこれらの可溶性のFcフラグメントは、Fabフラグメント上の重鎖および軽 鎖成分について以前に記載された方法（Hoogenboomら、1991） と同様の方法で、表面結合Fcフラグメントと会合してホモダイマーを形成する。 ファージディスプレイFcフラグメントの機能的活性：sFcRnへの結合 pHEN1中にWT FcまたはHQ-310/HN-433変異体のいずれかを有するE．coli TG1形 質転換体を増殖させ、ファージを排出させ、そしてポリエチレングリコール沈殿 によって濃縮した（Marksら、1991）。ファージペレットを２％粉乳／PBS（pH６ ）、および10μg/mlの濃度で添加した精製したsFcRn中に、50μgマウスIgG1の存 在または非存在下で再懸濁した。２時間のインキュベーション後、sFcRn-ファー ジ複合体を、10μlのNi²⁺-NTA-アガロースの添加によって単離し、そしてアガロ ースビーズを0.1％ Tween/PBS（pH６）で、次いでPBS（pH６）で大規模に洗浄し た。特異的に結合したファージを、50mMのTris-HCl（pH7.5）を用いて溶出し、 そして記載されるように（Marksら、1991）、指数的に増殖しているE．coli TG1 を感染させるために使用した。感染させたTG1細胞を連続希釈し、プレーティン グし、そしてcfuを決定した（表XVI）。 これらのデータおよび実施例４から、この系が、sFcRnに特異的に結合するFc フラグメントのファージディスプレーを生じ、従って、この系が、FcRn結合につ いて高い親和性を有するFc変異体の選択のための適切な系であることが明らかで ある。 実施例８ この実施例において、血清IgGレベルおよび経細胞輸送の制御における残基His 433、His435、およびHis436の役割を、薬物動態学的研究において試験した。mIg G2b分子が、mIgG2aまたはmIgG1のいずれかより短い血清存続性を有することが以 前に注目されているが（Pollockら、1990）、これを担っている配列はマッピン グされていない。以前のデータに基づいて、本発明者らは、半減期における差異 が433、435、および436位でのCH3ドメインにおける配列の差異に起因し得ること を明記した。IgG2aおよびIgG1において、これらの位置の残基は、His433、His43 5、およびHis436であり、そしてデータは、His435およびHis436（ならびに、His 433-Asn434の二重変異の状況である場合、His433）が血清存続性の調節に関与す ることを示す（Medesanら、1997）。mIgG2bにおいて、これらの位置の残基は，L ys433、Tyr435、およびTyr436である。本発明者らは、mIgG2b中の残基433、435 、および436を、これらの変異がmIgG2b分子の半減期を増大させ得るとの予想の 下に、mIgG1中の対応する残基に変異させた。 タンパク質の調製および放射標識 組換えFcフラグメントをNi²⁺-NTA-アガロースを使用して精製し、そして以前 に記載された（Kimら、1994a）Iodo-Gen試薬（Amersham）を使用して放射性ヨウ 素標識する。 薬物動態学的研究 以前に記載された（Kimら、1994a）方法論を本質的に使用する。簡潔には、タ ンパク質を放射標識し、10⁷cpm/μgの比活性をこの方法を使用して日常的に得、 そして遊離のヨウ素を、セファロースG-25M上での２回の連続的なゲル濾過によ って除去する。放射標識したFcフラグメントを、マウスへの注射の前に浸透HPLC によってSEC-250カラム上で分析する。放射標識したタンパク質を、150μlを超 えない容量、および1〜5×10⁷cpmの放射活性負荷で尾静脈に注射する。マウスを 、注射後120時間まで一定の間隔でヘパリン化したキャピラリーチューブで採血 する。血漿中に存在する放射活性を記載される（Kimら、1994a）ように決定し、 そ して血漿のアリコートを10％トリクロロ酢酸（TCA）に添加して沈殿し得ないcpm を決定する。血漿を注射後24時間で採集し、そしてSEC-250カラム上でのHPLCに よって分析する（Kimら、1994a）。 より長い血清存続性を有するマウスIgG2b（mIgG2b）抗体の作製 意外なことに、E．coliから発現されそして精製されたmIgG2b Fc-ヒンジフラ グメントは、完全にグリコシル化されたマウスIgG2b分子よりも短い血清存続性 を有する（これは、物質を発現するE．coliが完全にグリコシル化されたIgG1と 同じ半減期を有する場合、マウスIgG1 Fc-ヒンジについて得られる結果と対照的 であることに注意）。従って、ベクターは、バキュロウイルス発現系を使用して 、完全なマウスIgG2b分子（野生型、ならびにLys433、Tyr435、およびTyr436がH is433、His435、およびHis436に変更された変異した誘導体；後者はKYY変異体と 称される）を発現するように構築されている。昆虫細胞中での発現は、哺乳動物 細胞において使用されるものと同じグリコシル化のための認識配列を使用する、 グリコシル化タンパク質を生じることが公知である。IgG2b定常領域をコードす る遺伝子を、PCR^TM、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して単 離し、そして抗リゾチーム抗体のVHドメイン遺伝子（D1.3；Amitら、1986）をコPCR^TMを使用して、重鎖および軽鎖遺伝子の両方の上流に挿入した。次いで、軽 鎖および重鎖をコードする免疫グロブリン遺伝子を、バキュロウイルス発現ベク ターpACUW51（Pharmingen）中に連結した。 ベクターを、Sf9（Spodoptera frugiperda）細胞へトランスフェクトし、組換 えウイルスのプラークを精製し、そして発現のためにHigh５（Trichoplusiani） 細胞を感染させるために使用した。感染の４日後、組換え抗体を記載されるよう に（Wardら、1989）リゾチームセファロースを使用して培養上清から精製した。 変異体mIgG2b（KYY）分子を精製し、そしてそのインビボの半減期をSWISSマウス 中で分析した。半減期を、骨髄腫（Ｂ細胞）が発現したmIgG2b（変異していない ）およびmIgG1と比較し、結果を表XVIIに示す。 明らかに、変異は、半減期において有意な延長を生じ（56.1時間から110.9時 間）、そして変異したIgG2b分子の半減期はSWISSマウス中のmIgG1の半減期と同 じである。従って、433、435、および436での残基の差異のいくつかまたは全て が、野生型mIgG2bとmIgG1との間の半減期の差異を担っている。 実施例９ 材料および方法 mIgG1由来の変異したFcヒンジフラグメントの作製 変異を、設計した変異誘発オリゴヌクレオチド、および重複伸長（Hortonら、 1989）または部位特異的変異誘発（Carterら、1985；Kunkel、1985）によるいず れかのスプライシングを使用して作製した。変異体を表XVIIIに記載し、そして 変異体1253AおよびH285Aの作製は以前に記載されている（Kimら、1994a；1994c ）。他の変異体について、部位特異的変異誘発に使用した変異誘発性オリゴヌク レオチドは以下の通りである（下線は変異させた塩基を示す）：H433A、5'-GGTG GTTGGCCAGGCCCCT-3'（配列番号17）；H435A、5'-CAGTATGGGCGTTGTGCA-3'（配列 番号18）；およびH436A、5'-CTCAGTAGCGTGGTTGTG-3'（配列番号19）。変異体H31 0A、N434A、およびN434Qを、以下の変異誘発オリゴヌクレオチドを用いる重複伸 長（Hortonら、1989）によるスプライシングを使用して作製した：H310A、5'-CC CATCATGGCCCAGGACTGG-3'（配列番号20）および5'-CCAGTCCTGGGCCATGATGGG-3'（ 配列番号21）；N434A、5'-GGCCTGCACGCGCACCATACT- 3'（配列番号22）および5'-AGTATGGTGCGCGTGCAGGCCCTC-3'（配列番号23）；なら びにN434Q、5'-AGTATGGTGTTGGTGCAG-3'（配列番号24）および5'-CTGCACCAACACCA TACT-3'（配列番号25）。すべての変異体について、対応する遺伝子を、機能的 分析の前に、ジデオキシヌクレオチド法（Sangerら、1977）およ 組換えタンパク質の発現および精製 野生型（WT）およびカルボキシ末端ヘキサヒスチジンペプチドでタグ化した変 異体Fcヒンジフラグメントを、Ni²⁺-NTA-アガロース（Qiagen、Chatsworth、CA ）を使用して以前に記載されたように（Kimら、1994a）精製した。15mMのリン酸 緩衝液／50mM NaCl（pH7.5）に対する透析後、変異体を、短期間の保存（＜10日 ）のためには４℃、または長期間の保存のためには凍結乾燥のいずれかで維持し た。組換え可溶性マウスFcRnを、以前に記載されるような（Popovら、1996b）バ キュロウイルス系を使用して発現させ、精製し、そして４℃で保存した。 ^a以前に記載された変異体（Kimら、1994a；1994c） SDS-PAGEおよび循環型ジクロイズム（CD）を使用する変異体Fcヒンジフラグメン トの分析 SDS-PAGE（Laemmli、1970）およびCD分析を、以前に記載された（Laemmli、19 70）ように行った。 タンパク質の放射標識 モノクローナルmIgG1、組換えマウスFcγ₁ヒンジフラグメント、および組換え マウスFcRn（mFcRn）（Popovら、1996b）を、以前に記載されたような（Kimら、 1994a）Iodogen試薬（FrakerおよびSpeck、1978）を使用して[¹²⁵I]Na（Amersha m、Arlington Heights、IL）で放射標識した。遊離のヨウ素をMicroSpin G-25カ ラム（Pharmacia、Piscataway、NJ）上での遠心分離によって除去した。放射標 識したタンパク質の比活性は、約5×10⁶cpm/μgであり、＜５％の遊離のヨウ素 を含んだ。放射活性タンパク質をマウスへの注射の前に１週間以内４℃で保存し た。 クロマトグラフィー分析 すべての放射標識したFcヒンジフラグメントを、浸透HPLCによってs-250カラ ム（Bio-Rad、Hercules、CA）上で分析した。放射標識したFcヒンジフラグメン トで注射したマウスから24時間にて採集した血清をプールし、そしてs-250カラ ム（Bio-Rad）上でのHPLCによって分析した。クロマトグラフィー画分の放射活 性をガンマカウンターで測定し、そして放射活性ピークの分子量および異質性を 決定した。 血清IgG濃度の決定 血清IgGの濃度を、Nanorid and Bindaridキット（The Binding Site、Birming ham、UK）を用いる放射性免疫拡散法を使用して決定した。沈降素環の直径を、 電子的に測定した。 薬物動態学的分析 放射性ヨウ素標識Fcヒンジフラグメントの薬物動態学を、６週齢のBALB/cマウ ス（Harlan Sprague-Dawley Laboratory、Indianapolis、IN）中で以前に記載さ れたように（Kimら、1994a；1994c）決定した。 母体胎児（maternofetal）伝達 以前に記載された方法論（Medesanら、1996）を、妊娠中の異系交配SCIDマウ ス（Taconic Co.、Germantown、NY）について分娩期に（15〜18日）使用した。 簡潔には、マウスに飲料水中の0.01％のNaIを給餌し、次いで、１日後に、放射 標識タンパク質（2×10⁷および5×10⁷cpm）を尾静脈に注射した。マウスを20μl のキャピラリーで注射後３分で採血し、そして24時間後、胎児を帝王切開によっ て取り出した。いくつかの胎児をプールし（胎盤を廃棄して）、生理食塩水中で 洗浄し、秤量し、液体窒素中で凍結させ、そして10容量の10％TCA中でホモジナ イズした。懸濁物を遠心分離し、そして沈澱の放射活性をガンマカウンターにお いて決定した。伝達の割合を、以下の式で計算した： ％伝達（％Ｔ）＝（R3）/［（R1−R2）×（Ｗ×0.72）/0.02］ ここで、R1は、３分での母体血液中の放射活性、R2は24時間での母体血液中の放 射活性、Ｗは、体重（グラム）、そしてR3は胎児の放射活性である。 所定の同腹子中の胎児の総重量および数は同腹子間で変化した。従って、伝達 データを、同腹子当たりに転移された量よりむしろ、胎児の単位重量当たりで示 す（％ T/g）（Medesanら、1996）。妊娠マウスの血液容量は体重の7.2％である と考えられた（Guyerら、1976）。胎児への伝達に利用可能な母体血液中の放射 活性を、放射標識タンパク質の注入の３分後に測定してから24時間後に残存する 放射活性を推定することにより計算した。 経腸転移の阻害 BALB/c新生児マウス（10〜14日齢）を、以前に記載（Kimら、1994b）のように 、約2000のFc/IgGモル比での［¹²⁵Ｉ］mIgG1およびFcヒンジフラグメントの混合 物で挿管した(intubate)。阻害パーセントを、インヒビターのない同量の［¹²⁵ Ｉ］ mIgG1の転移に対して計算した。 mIgG1-セファロースへのFcRn結合の阻害 全てのFcヒンジ誘導体を、250mM NaClおよび５mM Na₂EDTAを有する50mMリン酸 緩衝液（pH 6.0）（PB-6）中で透析し、そして１mg/mIの濃度に調整した。300μ lのFcヒンジ（WTまたは変異体）またはPB-6を、エッペンドルフチューブ中で、2 5℃で30分間回転させながら、150μlのmIgG1-セファロース（１mg/ml充填ゲル、 50％懸濁液）、50μlのPB-6(10mg/ml OVA（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO ）を含有する）、および10μlの［¹²⁵Ｉ］FcRn（0.1μg/200,000cpm）と共にイ ンキュベートした。インキュベーション後、500μlの氷冷PB-6を添加し、そして ゲルを、氷冷PB-6（＋１mg/ml OVA）を用いて12,000×ｇで３分間遠心分離する ことにより、３回洗浄した。ゲルに結合した放射活性を決定した。ゲルペレット を、1mlのPB-7.5中に再懸濁し（250mM NaCl、５mM Na₂EDTAを含有する50mMリン 酸緩衝液(1mg/ml OVAを有する)）、そして上清を遠心分離後に捨てた。ゲルに結 合した残存放射活性を決定した。mIgG1-セファロースゲルに特異的に結合した放 射活性を、結合放射活性から残存放射活性を引き算することにより計算した。Fc 誘導体によるFcRnのmIgG1-セファロースへの結合阻害を、以下の式を用いて計算 した：阻害％＝100−100A/B、ここでＡはFcヒンジフラグメントの存在下でmIgG1 セファロースに結合した特異的放射活性であり、そしてＢはFcヒンジフラグメン トの非存在下で結合した特異的放射活性である。 ブドウ球菌プロテインＡ（SpA）への結合の分析 SpA-アガロースゲル（0.5ml）をBP-7（250mM NaCl、５mM Na₂EDTAを含有する5 0mMリン酸緩衝液）および1mg/ml OVA（BP-7.5）と平衡させた。50〜100μlの各^{1 25} I標識Fcヒンジフラグメント（50μgのタンパク質を含有する）をカラム上にロ ードし、15分間インキュベートし、次いで10カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した 。結合Fcヒンジフラグメントを100mM酢酸で溶出した。素通り画分、洗浄液、お よび溶出液中の放射活性の量を決定した。結合／非結合の比を計算し、そしてWT RFcヒンジフラグメントに対する各変異体の結合の割合を決定した。 結果 マウスFcγ₁ヒンジ変異体の発現および分析 WT Fcヒンジおよび変異体をコードするプラスミド（表XVIII）を構築し、そし てタンパク質をEscherichia coliを宿主として用いて発現させ、そして精製した 。H285A変異体を除いて、変異した残基は全て、CH2-CH3ドメイン界面（Deisenho fer、1981）に非常に密接しており、そしてまた、マウスおよびヒトの両方のIgG イソタイプ（Kabatら、1991）において高度に保存されている。以前に記載のよ うに、放射標識Fcヒンジ誘導体は、本質的に、s-250カラム上で分析されたとき に55kDaに対応する保持時間を伴うシングルピークとして出現した（Kimら、1994 a）。HPLC分析と共に考慮すると、還元および非還元SDS-PAGE分析は、Fcヒンジ 誘導体が非共有結合ホモダイマーおよびスルフヒドリル結合ホモダイマーの混合 物として発現されていることを示した。さらに、Fcヒンジ誘導体のCD研究は、変 異が組換えタンパク質の構造において大規模な変化を生じないことを示した。 Fcヒンジフラグメントの薬物動態学的分析 放射標識Fcヒンジフラグメントをマウスに注入し、そして血清放射活性を注入 後の種々の時点でモニターした。各Fcヒンジ誘導体について、異なるマウスにお ける除去曲線は類似であった。 各組換えFcヒンジフラグメントについて、１つの群内のマウスから24時間の時 点で採集した血清サンプルをプールし、これをs-250カラムにおけるHPLCに供し た。全てのFcヒンジフラグメントについて、大部分の放射活性は、注入タンパク 質の分子量（55kDa）に対応する保持時間を伴うシングルピークとして溶出した 。以前の結果（Kimら、1994a）と一致して、このことは、Fcヒンジ誘導体が、ホ モダイマー分子として血清中に存続しており、タンパク質分解により消化されて おらず、他の血清タンパク質と会合していないことを示す。Fcヒンジ誘導体の薬 物動態学パラメーターを表XIXに示し、α相は、血管内隙と血管外隙との間の平 衡時間を表すが、β相は、血管内隙からの平衡化タンパク質の除去を表す。さら に、 α相の間で、組換えタンパク質調製物中に存在し得るいずれのミスフォールドタ ンパク質分子も除去される；従って、β相は、血管内隙からの正確にフォールド されたタンパク質の除去を表す。 本データは、いくらかの変異が対応するFcヒンジフラグメントのβ相半減期に 対して有意な効果を有することを、明らかに実証する。従って、CH2ドメインに おけるH310の変異は、異化速度に対して顕著な効果を有する（表XIX）。対照的 に、H285（CH2-CH3界面に遠位のCH2ドメインの外部表面上のループ中に位置する (Deisenhofer、1981)）の変異は、異化速度に対して何の効果も有さず、これは 以前の知見(Kimら、1994c)と一致する。H433およびN434の同時変異は、これらの 各位置での単一変異がWT Fcヒンジと同じ半減期を有する２つの変異体（H433Aお よびN434A）を生じたのに対し、β相半減期を77時間に減少させた（36％減少） 。N434のグルタミンでの置換もまた、WT Fcヒンジの半減期と同様の半減期を有 するFcヒンジフラグメントを生じた（表Ａ）。H433A-N434Q変異体の半減期（76. 9h）は、以前に報告された値（50.3h）（Kimら、1994a）より大きく、そしてこ れはまた、WT Fcヒンジフラグメント（119対82.9h）、H28A（106対85h）、およ びI253A（26対20h）についても観察される。これらの見かけの相違の説明は、本 研究において用いたBALB/cマウス（Harlan Laboratoriesから入手）は、1.0±0. 4mg/mlのIgG濃度（25マウスの平均）を有することであり、この値は、初期の研 究（Kimら、1994a、1994c）において用いられた動物集団からのBALB/cマウスに おけるIgG濃度（4.6±0.8mg/ml）よりかなり低い。濃度−異化関係（Marianiお よびStrober、1991）により、IgGの半減期は、より低い血清IgG濃度を有するマ ウスにおいてより長いことが推定される。そしてこのことにより、直接比較がな された上記の場合における、Fcヒンジフラグメントのより長い半減期が説明され 得る。 CH3ドメインにおけるH435の変異は、CH2ドメイン中のI253またはH310の変異に より誘導されるのとほぼ同様に顕著な効果を有する。このことは、明らかに、こ のCH3ドメイン残基がmIgG1の異化部位を構築するにおいて重要な役割を果たすこ とを示している。さらに、H436A変異体は49時間の半減期を有し、H436が、異化 の制御においてI253、H310、またはH453より微小な役割しか果たさないことが実 証される（表XIX）。 表XIX BALB/cマウスにおける組換えFcヒンジフラグメントの異化 母胎転移 Fcヒンジフラグメントの薬物動態学分析を母胎転移研究に拡張した。分娩期近 くの妊娠SCIDマウスの循環から胎児への放射標識Fcヒンジ誘導体の転移を、転移 研究のために用いられた24時間の間、母体血液中に存在する放射活性に対して１ 同腹子の胎児により採取したタンパク質結合放射活性を測定することにより分析 した。初期の研究において、wtおよび変異体の両Fcヒンジフラグメントがインタ クトな分子として胎児に転移されることが実証された（Medesanら、1996）。従 って、転移における差異は、wt分子と変異体分子とのタンパク質分解に対する感 受性における差異に起因するわけではないようである。I253A、H310A、およびH4 35A変異体の伝達は、WT FcヒンジまたはH285Aの約10〜20％でしかなかった。こ のことにより、IgGの母胎転移においてこれらの残基により果たされる中心的な 役割が実証される。従って、これらの変異は、母胎転移および異化に対して同 様の効果を有する。しかし、I253A、H310A、H433A、およびH435Aについて見出さ れたβ相半減期と母胎伝達との間の相関は、H436A変異体については観察されな かった。WT Fcヒンジに対して、この変異体は、母胎伝達において同様の活性を 有したが、より短い半減期を有する（表XIXおよび図12Ａ）。 腸管転移 組換えFcヒンジ誘導体の腸管伝達を、新生児マウスの腸管壁を横切る放射標識 mIgG1の転移を阻害するそれらの能力を測定することにより分析した（図12Ｂ） 。 結果は、I253A、H310A、およひH435A変異体の母胎伝達について得られたデータ と一致する。このことは、同じレセプターおよび伝達機構が、両方の経細胞輸送 プロセスに関与していることを示す。しかし、H436A変異体は、WT Fcヒンジとほ ぼ同じ効率でSCIDマウスの母胎障壁を横切って転移され（図12Ａ）、そしてなお 新生児腸管を横切るmIgG1の転移を有効には阻害しない。従って、この変異体に ついては、半減期および新生児転移の阻害はWT Fcヒンジに対して減少しており 、そしてなお母胎転移は影響を受けないようである。 FcRnに対する親和性 組換えFcヒンジフラグメントの組換えmFcRnへの結合についての相対的親和性 を、［¹²⁵I］FcRnのmIgG1-セファロースへの結合を阻害するそれらの能力を測定 することにより概算した（図13Ａ）。本データは、全ての場合において、短い半 減期および経細胞輸送アッセイ（母胎および新生児）における減少した活性を有 する変異体がまた、H436Aを除いて、FcRnへの結合についてより低い親和性を有 することを実証する。FcRnについてより低い相対的親和性であるにも関わらず、 この変異体は、WT Fcヒンジとほぼ同じ効率で母胎障壁を横切って転移され、そ してなお減少した血清半減期および腸管転移アッセイにおける減少した活性を有 する。 SpAへの結合 SpA結合部位および異化部位はmIgG1のCH2-CH3ドメイン界面に位置することが 以前に示されており（Kimら、1994a）、従って、FcヒンジフラグメントのSpAへ の結合に対する変異の影響を、直接結合研究において分析した（図13Ｂ）。本デ ータは、H310AおよびH435AはSpA結合を大いに損なう（WTの９〜12％）が、I253 またはH433の変異はそれほど顕著な影響を有さない（WTの30〜35％）ことを示す 。 本研究は、CH2ドメイン（1253およひH310）およびCH3ドメイン（H435および、 より少ない程度ではH436）のアミノ酸残基が経細胞輸送およびmIgG1の血清存続 性の調節に関与していることを実証する。この結論は、非グリコシル化(aglycos ylated)形態で発現された組換えFcヒンジフラグメントの分析から導かれるが、 初期の研究は、WT Fcヒンジフラグメントが、完全なグリコシル化mIgG1と同じβ 相半減期（Kimら、1994a）および経細胞輸送アッセイにおける同じ活性（Kimら 、1994b）を有することを実証した。このことは、このイソタイプについて、非 グリコシル化Fcヒンジフラグメントを用いる研究を完全IgGに拡張することが妥 当であることを示す。従って、両ドメイン中の残基は、FcRn-mIgG1相互作用を含 む２つのプロセスにおいて重要な役割を果たす。この結論は、CH2ドメインにお ける変異がCH3ドメインにおける変異よりもより顕著な効果を有するという初期 の提言（Kimら、1994a；1994c；1994b；Medesanら、1996）に矛盾するようであ り得る。しかし、これらの初期の研究では、経細胞輸送／異化におけるH433およ びN434の両方の同時変異の効果のみを分析しており、これは、これらの残基につ いて微小な役割を示した。最近の研究では、これらの２つのアミノ酸のそれぞれ の変異は、独立して、経細胞輸送および異化の両方に対して有意でない効果を有 する。H433およびN434の両変異の観察された効果についての最も妥当な説明は、 これらの２つのアミノ酸の同時変異が、隣接したヒスチジン（H435）（H433およ びN434とは対照的に、FcRn-mIgG1相互作用において本質的な役割を果たす）の方 向付けにおいて、局所的な混乱を引き起こすということである。 H310およびQ311を含む領域（以前、H310、Q311からA310、N311への同時変異の 状況で分析された）のさらなる分析は、FcRn-mIgG1相互作用におけるH310の中心 的役割を実証する。H310のアラニンへの変異は、初期に分析したH310A／Q311N変 異体について見られるのとほぼ同程度に顕著である効果を有する。この理由のた め、Q311単独の変異効果を現研究において調べなかった。1253、H310、および H435とは対照的に、H436は、血清IgGレベルおよび経細胞輸送の維持においてよ り微小な役割を果たす。1253およびH310はともに、全てのマウスおよびヒトIgG イソタイプで高度に保存されており（Kabatら、1991）、一方、H435およびH436 は、より低い程度の保存を示す（mIgG2bにおいては、Y435、Y436；mIgG2aアロタ イプにおいては、L436；ヒトIgG1、IgG2、およびIgG4においては、Y436；ヒトIg G3においては、F436；ならびにヒトIgG3アロタイプにおいては、R435）。これら の配列の差異は、他のIgGイソタイプに対するmIgG2bおよびヒトIgG3のより短い 血清半減期（WardおよびGhetie、1995）を説明し得た。今日まで、異なるヒトIg Gイソタイプ（MellbyeおよびNatvig、1973）およびマウスIgGイソタイプ（Guyer ら、1976）の相対的経細胞輸送活性に関して利用可能な一貫したデータは存在し ない。従って、母胎または新生児転移に対する435位および436位でのアミノ酸差 異の効果について、仮定することができない。IgGとは対照的に、IgM、IgE、お よびIgAは、短い血清半減期を有し、そして胎盤／卵黄嚢障壁または新生児腸を 横切って転移されない（Zuckierら、1989；Wild、1973）。これらの観察と一致 して、Fc-FcRn相互作用を媒介するのに重要であると本研究で示された残基のい ずれもが、ヒトおよびマウスの両方のIgM、IgE、およびIgAはそれぞれの分子の 他の領域ではIgGと有意な相同性を共有している（Kabatら、1991）にも関わらず 、これらの３つのIgクラスには存在しない。 1253は、哺乳動物に属する全てのIgG分子において保存されている、高度に曝 露された疎水性の残基である（Kabatら、1991）。本研究では、このイソロイシ ンのアラニンへの変異は、血清半減期および母胎障壁または新生児腸を横切る経 細胞輸送においてかなりの減少を生じた。このことは、I253がSpAへの結合（Dei senhofer、1981）以上に重要な生理的役割を満たすことを、明らかに示す。I253 に隣接するアミノ酸残基は、ヒトFcのSpAへの結合（Deisenhofer、1981）に関与 しており、そしてFcRnの結合におけるそれらの関与は排除され得ない。従って、 M252は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、およびヒトの全てのIgGイソタ イプにおいて高度に保存されており、但し、mIgG1およびラットIgG1／IgG2a（ト レオニンがメチオニンに置換されている）のようないくつかの例外を除く（Kaba tら、1991）。同様に、254位は、全てのイソタイプおよび種についてセリ ンで占められており、但し上述のマウスおよびラットイソタイプ（この位置にト レオニンを有する）を除く。252位および254位におけるこれらの変化は、他のイ ソタイプと比較した、mIgG1のより長い半減期およびより効率的な経細胞輸送と 相関し得る。 H433AおよびH436Aを除く全ての変異体について、FcRnおよびSpAへの結合は同 程度に損なわれている。H433Aは、WT Fcヒンジに比較してSpA結合を減少させた が、FcRnと相互作用するとき影響はない。逆に、H436A変異は反対の効果を有す る。従って、SpAおよびFcRn相互作用部位は重複するが、この重複は完全ではな く、mIgG1におけるSpAおよびFcRnの「フットプリント」は別個である。このこと はまた、FcRn-mIgG1およびSpA-mIgG1相互作用について観察されたpH依存性の差 異（WallaceおよびRees、1980；RodewaldおよびKrachenbuhl、1984；Eyら、1978 ）と一致する。 IgGおよびFcRn間の相互作用のpH依存性（pH６〜6.5で結合し、そしてpH７〜7. 5で遊離する）（WallaceおよびRees、1980；RodewaldおよびKraehenbuhl、1984 ）は、ヒスチジンのイミダゾール側鎖のpK値の範囲内に入る。本研究からのデー タと共に考慮すると、この情報は、IgG-FcRn相互作用の顕著なpH依存性が、CH2 およびCH3ドメインの界面に位置する310位、435位、および436位の表面に近接可 能なヒスチジン残基により決定されることを示唆し、そしてこの結論は、Bjorkm anおよびその共同研究者のデータと一致する。このことは、mIgG2aについて、6. 4〜6.9のpH範囲に３つの滴定可能な残基が存在することを示す（Raghavanら、19 95）。これらの研究（Raghavanら、1995）と一致して、H310A変異体の分析は、H 310Aが、Fc-FcRn相互作用を媒介することにおいてインビトロおよびインビボの 両方で役割を果たすことを実証する。しかし、対照的に、H433AおよびH435Aの分 析は、mIgG1について、H435のアラニンへの変異がFcRnについての親和性の損失 を生じ、一方、H433は、FcRn結合において何の役割も果たさないことを示す。さ らに、H436のアラニンへの変異は、FcRnに対して減少した親和性を有するFcヒン ジフラグメントを生じる。従って、mIgG1-FcRn相互作用の高度の親和性を媒介す ることにおいて役割を果たすヒスチジンは、H310、H435、および、より低い程度 ではH436である。これらのデータと他のデータ（Raghavanら、1995）と の間のH433およびH435における見かけの差異の理由は明らかではないが、後者の 研究では、FcRn相互作用部位およびその部位に近接した両方の残基において結果 的な配列差異を伴う異なるイソタイプ（mIgG2a、mIgG2b、およびヒトIgG4）が用 いられた。従って、周囲残基の配列における差異の状況では、H433および有435 の相対的役割は異なるイソタイプでは別個であると考えられる。 薬物動力学に対するFcヒンジフラグメントの変異の効果、新生児刷子縁／卵黄 嚢を横切る経細胞輸送、およひFcRnについての親和性の間の密接な相関（表XX） は、FcRnがこれら全てのプロセスに関与している（Ghetieら、1996；Junghansお よびAnderson、1996）という概念を支持する。これはまた、β₂m発現の喪失に起 因してFcRnを欠損するマウスにおいて、IgGが腸管伝達を減少させ（Israelら、1 995；Zijlstraら、1990）、そして異常に短い血清半減期を有する（Ghetieら、1 996；JunghansおよびAnderson、1996）ことを示す研究と一致する。異化および 経細胞輸送の制御の両方について、FcRnに結合したIgG分子のみが分解から保護 され、そして循環に再入する（異化）か、または卵黄嚢／新生児腸管を横断する （経細胞輸送）と仮定されている（Brambellら、1964）。FcRnは、最初、母親か ら胎児または新生児への抗体の伝達に関与する異なる種の組織（胎盤、卵黄嚢、 および新生児腸管の刷子縁）において機能的タンパク質として同定された（Wall aceおよびRees、1980；RodewardおよびKrachenbuhl、1984；Robertsら、1990；S imisterら、1996；KristoffersenおよびMatre、1996；Leachら、1996）。より最 近では、マウスFcRnα鎖mRNAがIgGの母体伝達に関与しない器官（例えば、肝臓 、肺、心臓、および脾臓）から単離されている（Ghetieら、1996）。FcRnのラッ トおよびヒトホモログがまた、mRNAレベルで偏在的に発現されていることが見出 されている（Storyら、1994；SimisterおよびMostov、1989b；Blumbergら、1995 ）。このことは、FcRnがそれらの器官内で内皮細胞により合成され得ることを強 く示唆する。このことと一致して、FcRnα鎖mRNA（Ghetieら、1996）および対応 するタンパク質が培養マウス内皮細胞（SVEC）から単離されており、これにより 、内皮細胞がIgG異化の部位であり得ることが示唆される。ヒトIgGにおけるI253 、H310、およびH453の高度の保存を伴う（Kabatら、1991）、成体組織において 偏在的に発現されるFcRnのヒトホモログ（Storyら、1994）が、ヒト胎盤 から単離されたこと（Simisterら、1996；KristoffersenおよびMatre、1996；Le achら、1996）は、血清IgGの母胎転移およびホメオスタシスの同じ機構がヒトIg Gにおいて作用することを示す。分子詳細においてこれらのプロセスを理解する ことは、治療的IgGの薬物動態学の調整およびIgGの母胎転移の増強（胎児の受動 免疫において価値があり得る）の両方について含蓄を有する。 表XX Pearson相関係数検定 ^aH436Aについて得た値を除く相関係数；r=0.9917；p=0.00001。 FcRn-IgG相互作用のpH依存性（WallaceおよびRees,1980; RodewaldおよびKrac henbuhl，1984）は、結合が生じるサブ細胞部位（細胞表面または細胞内区画） が、以前に議論された（Ghetieら，1996）ように、新生児経細胞輸送および母胎 転移／異化の制御について異なることを示唆する。他の未知の要素（例えば、こ れらの異なる細胞区画における再利用率）もまた、FcRnの有効濃度を決定するこ とに役割を果たし得る。関与するプロセスおよび細胞型の間のこれらの相違は、 共通のレセプターの関与にもかかわらず、H436A変異体の挙動（半減期、腸管転 移、およびFcRnへの親和性が他の変異体ほど密接に母胎伝達と相関しない）を説 明し得る。H436A変異の異常な影響についてのさらなる説明は、以下の通りであ り得る：H436のアラニンへの変異は、異化、腸管転移の阻害、およびFcRnへの結 合に、I253A、H310A、および有435Aについて観察されたほど著しい影響を有さず 、そして、他の３つのアッセイとは対照的に、母胎転移アッセイは、内因性IgG による競合の非存在下でSCIDマウスを用いて行われる。従って、この状況では、 母胎転移に対するこの変異の影響は、伝達の時間経過の分析が行われるかまたは 転移が内因性の競合するIgGの存在下で例えばBALB/cマウスにおいて分析される 場合にのみ、それ自身表れる。対照的に、競合アッセイにおいてFcRnへの結合に ついてH436Aよりも低い親和性を有する変異体（例えば、I253A、H310A、およびH 435A）については、３つ全てのインビボアッセイ（異化、母胎転移、および新生 児経細胞輸送の阻害）における低い活性は密接に相関する。 まとめると、この研究は、異化および母胎／新生児経細胞輸送の制御における mIgG1の３つの高度に保存されたヒスチジン（H310、H435、およびより低い程度 でH436）の役割の明快な同定をもたらした。従って、これらのプロセスにおける I253に関する以前のデータとひとまとめにして考えると、これらの残基は、FcRn -mIgG1相互作用に重要である。この研究はさらに、経細胞輸送および異化の両方 におけるFcRnの関与を支持する証拠を拡張し、そしてIgGのこれらの必須の機能 を調節する分子機構の理解に対する関連性を有する。 実施例10 コグネイト抗原に結合するための抗体の親和性改善のためのバクテリオファー ジディスプレーの力は、既に実証されている。本研究では、この系を用いて変異 Fcフラグメントを発現させ、そしてFcRnへの結合についてより高い親和性の変異 体を選択する。本研究のために、ミリグラム量の可溶性FcRn（sFcRn）を用い、 そしてWT Fcフラグメントを機能的に活性な形態でファージの表面上に発現させ る。 変異誘発のためのストラテジー 以前の研究は、Ile253、His310、His433、Asn434、His435、およびHis436が直 接的または間接的のいずれかで、FcRnへの結合において役割を果たすことを示し ている（Kimら，1994a; 1994b; Medesanら，1997および実施例９）。これらの重 要な残基に隣接する残基およびヒトIgGlのＸ線構造（Deisenhorfer，1981）から CH2-CH3ドメイン界面の近傍に最も曝されるようである側鎖を有する残基を、ラ ンダムな変異誘発のために選択した。さらに、これらの残基は、種内および種間 （例えば、ヒトと比較してマウスにおいて）で保存されていないはずである。こ のことは、これらが、異化の制御および経細胞輸送（またはIgGのいくつかの他 の重要な機能）に（直接的には）関与しないことを示唆する。マウスIgG1イソタ イプについてのこのような残基の例は、EU番号付け（Edelmanら，1969）で、CH2 ドメインにおけるThr252、Thr254、Thr256（分析については実施例４を参照のこ と）、Met309、Gln3ll、Asn315、ならびにCH3ドメインにおけるHis433およびAsn 434である。 ランダムな変異誘発の前に、sFcRnへのFcフラグメントの結合に対する、これ らの残基のそれぞれのアラニンへの変異の影響を分析する。これらの残基のいず れかが10倍を越えて親和性を低く変化させる場合、これらはランダムには変異さ れない。しかし、上記に列挙したこれらの残基の大部分は、高度には保存されて おらず（Kabatら，1991）、従ってこれらは、Fc:FcRn相互作用および拡大すると 、異化およびIgG経細胞輸送の制御において重要な役割を果たすようであると考 えられる。His433およびAsn434はCH3ドメインから突出しているループ上で高度 に露出されている（Deisenhofer，1981）ので、変異誘発の好ましい候補である 隣接残基はほとんど存在しない。より多数の変異が、CH3ドメインよりもCH2ドメ インで作製される。 これらの残基を、２〜６の群（例えば、Gln309/Arg315ランダム変異体を、Thr 252、Thr254、およびThr256ランダム変異体と組み合わせる）で、隣接コドンと 正確にマッチするが変異した残基に対応するコドンの位置にランダムな塩基を挿 入するオリゴヌクレオチドを用いて、ランダムに変異させる。同じFc遺伝子内で 相互に遠位である変異コドンの挿入のために、２つ以上の異なるオリゴヌクレオ チドとともに２回のPCR^TMを用いる。オリゴヌクレオチドにおけるランダムな塩 基を、コドン末端のゆらぎ位置がＡで終了するように設計し、そして特定のア ミノ酸に対する偏りを避けるために、Ｃもまたゆらぎ位置から除去され得る（Ho ogenboomおよびWinter，1992により記載されたように）。変異遺伝子を、オーバ ーラップ伸長によるスプライシング（Hortonら，1989）によるかまたは唯一の制 限部位を用いる（変異部位の近位に位置する場合）ことによるかのいずれかによ り組み立てる。変異誘発に続いて、各変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて作製 された約20クローンを、ジデオキシヌクレオチド法（Sangerら，1977）を用いて 配列決定する。約20クローンの発現レベルを、以前に記載されたように（Wardら ，1989）抗myc抗体9E10および免疫ブロッティングを用いて分析する。 FcRnへの結合に対してより高い親和性を有する変異体の選択 変異Fc遺伝子のライブラリーからのより高い変異体の選択のための２つのスト ラテジーを用いる。第１に、変異遺伝子をpHEN1（Hoogenboomら，1991）内で組 み立て、そしてE.coli TG1をトランスフェクトするために用いる。上記で示した ように、抑制の漏出は、組換え細胞から搬出される可溶性Fcおよびファージに結 合したFcフラグメントの両方をもたらし、そしてこれらはファージの表面上にホ モダイマーとして組立てられるべきである。Fcフラグメントを有するファージ（ 「Fc-ファージ」）を増殖し、ポリエチレングリコール沈澱により濃縮し、そし て以前に記載された（Marksら，1991; Ward，1977; Popovら，1995）ように、sF cRnコートDynabeads/Ni²⁺-NTA-アガロース上でパンニングする。sFcRnを、以前 に記載された（Popovら，1996）ように、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞 から精製する。パンニングとその後のファージ増殖の繰り返しは、より高い親和 性のバインダーの富化をもたらすはずである。さらに、より高い親和性の変異体 を選択するために、Winterおよび共同研究者（Hawkinsら，1992）により記載さ れた手順と類似の手順を用いる；第１に、抗原がファージよりも過剰であるが必 要とされる解離定数の濃度（7.8nM；Raghavanら，1994）よりも低い濃度である ように、ファージを少量の可溶性ビオチン化sFcRn（＜１μg）と混合する。次い で、sFcRnに結合したFc-ファージ粒子を用い、そしてNi²⁺-NTA-アガロースを添 加してsFcRnに結合したファージを分離する。第２に、より低いオフ速度を有す るFcフラグメントを選択するために、Fc-ファージ粒子をビオチン化sFcRnに予 めロードし、次いで以前に記載された（Hawkinsら，1992）ように、ストレプト アビジンでコートしたビーズの添加の前に、可変の倍数で過剰な非標識抗原中に 希釈する。あるいは、実施例４で用いられた選択方法を利用する。 全ての結合工程を、pH６で行い、そして結合したファージをpH7.4で溶出して から指数関数的に増殖したE.coli TG1細胞に感染させる。数回のパンニングの後 、宿主株を非サプレッサー株E.coli HB2151（Marksら，1991）に切り替える。Fc 変異体を、検出のために抗mycタグ抗体9E10に由来するビオチン化Fabフラグメン トを用いて、sFcRnコートプレートを用いるELISAにおいて可溶性分泌Fcフラグメ ントとして分析する（完全な9E10抗体は、これがマウスIgG1抗体であり、そして FcRnへの結合についてFcフラグメントと競合するので使用しないことに留意され たい）。このために、Fcフラグメントを、親和性精製タグとしてc-mycタグを用 いて組換えE.coli細胞から精製する（Marksら，1991; Popovら，1995）；あるい は、遺伝子を、Ni²⁺-NTA-アガロースを用いる精製のためのインフレームなポリ ヒスチジンタグとともに、VβpelBHis（Ward，1992）のベクター誘導体中にNcoI -NotIフラグメントとして再クローン化する。His₆タグ化タンパク質の検出のた めに、Fcフラグメントをビオチン化してから使用する（Amershamビオチン化キッ ト）。ELISAにおける全ての結合工程を、pH６で行う。 マウスFcフラグメントはFcRnへの結合に高い親和性を有すると期待される（ラ ットFcRn:Fc相互作用との類似性による）ので、FcRn:Fc相互作用について増加し た親和性を有する変異体を選択するのは、特に１つのFcあたり２つの機能性結合 部位が存在する（親和力が増大する）場合は、困難であるかもしれない。従って 、先のFcハイブリッドの研究（Kimら，1994c）に基づくアプローチをとる。Fcハ イブリッドは、１つの変異体（HQ-310/HN-433）と会合した１つのWT Fcポリペプ チドのヘテロダイマーを含み、そしてHQ-310/HN-433変異体はFcRnに不十分にし か結合しない（Kimら，1994b; Popovら，1996b）ので、親和力の喪失により減少 した結合親和性を有する。従って、ランダムに変異したWT FcフラグメントとHQ- 310/HN-433との同時発現は、FcRnにモノマーとして強く結合する、より高い親和 性の変異体の選択を容易にし得る。このような変異体は、続いてホモダイマーと して発現され得、そしてそれらの二価のフラグメントとしての親和性が決定され 得る。 ランダムに変異したFcフラグメント（WT Fcに由来する）を、部位特異的変異 誘発により停止コドンが除去されている改変版のpHEN1中（ZollerおよびSmith， 1982）に連結する。従って、E.coliへの形質転換に続いて、全てのランダム変異 体を、cpIII結合融合体として発現する。E.coliをまた、HQ-310/HN-433 Fc遺伝 子をpBGS19（カナマイシン耐性を与えるpUC119の誘導体；Sprattら，1986）中に 連結することにより以前に作製されたプラスミドを用いて同時形質転換する。二 重トランスフェクタントを、アンピシリン＋カナマイシンプレート上で（Kimら ，1994c; Riechmannら，1988により記載されたように）選択し、そしてファージ を増殖し、ポリエチレングリコール沈澱により濃縮し、そしてsFcRnでコートし たDynalビーズ/Ni²⁺-NTA-アガロース上で、上記のより高い親和性の変異体につ いての選択のためのアプローチを用いてパンニングする。 より高い親和性の変異体を可溶性分泌タンパク質として発現するために、遺伝 子をpHEN1中に再クローン化し、そしてE.coli HB2151を宿主として使用して発現 させる。あるいは、遺伝子をVβpelBHis（Ward，1992）誘導体中にクローン化し て上記のようなNi²⁺-NTA-アガロースを用いる精製を可能にする。ELISAもまた上 記のように行う。 より高い親和性の変異体の親和性測定 FcRnへのより高い親和性を有するFc変異体を、以前に記載された（Ward，1992 ; Marksら，1991; Popovら，1995）ように、c-mycエピトープまたはポリヒスチ ジンペプチドを親和性精製タグとして用いて、組換えE.coli細胞から精製する。 sFcRnへの結合についてのこれらのFcフラグメントの親和性を、表面プラズモン 共鳴（SPR）およびBIAcore（Karlssonら，1991）を用いて決定する。このアプロ ーチは、抗体-抗原相互作用を分析するために用いられており（Ward，1994; Bor rebaeckら，1992）、そしてBjorkmanおよび共同研究者は、SPRを用いてIgGとラ ットFcRnとの相互作用を特徴付けた（Raghavanら，1994; Popovら，1996b）。 平衡結合定数および速度解離定数（Kd＝k_off/k_on、ここでk_offおよびk_onはそ れぞれオフ速度およびオン速度である）をともに決定する研究を行う。精製した sFcRnは、標準的なアミンカップリング手順を用いてCM5チップ（Pharmacia）に 直接カップリングさせる。化学的カップリングのために、sFcRnを、10mM酢酸緩 衝液（pH5.5）中で20μg/mlでカップリングさせる。最初に、両方の型のセンサ ーチップを用い、そして結合した正確に折り畳まれたsFcRnの相対量を、マウスI gG1またはWT Fcのいずれかを用いて決定する。Fcフラグメントを、脱塩カラムま たは透析のいずれかを用いてBIAcoreランニング緩衝液（10mM HEPES、3.4mM EDT A、150mM EDTA、150mM NaCl、および0.05％P20、pH7.4）に移し、そして最初に0 .05〜0.5mg/mlの濃度範囲で使用する。これらのフラグメントをまた、凝集物を 除去するために、使用の直前にサイズ排除（HPLC）により精製する（これはアー チファクトを避けるために必須であるからである）。５〜30μl/分の流速を用い る。 代替的なアッセイ形式として、Fcフラグメントを上記のCM5チップにカップリ ングし、そしてBIAcoreランニング緩衝液中のsFcRnを最初に0.05〜0.5mg/mlの濃 度範囲で用いる。最初の研究を、sFcRnと完全なIgGl/WT Fcとの間の相互作用を 分析するために行い、次いでより高い親和性をおそらく有する変異体Fcフラグメ ントの分析に拡張する。 Fc変異体の母胎転移および腸管転移の薬物動態学 先の実施例において上述した方法を用いる。 より高い親和性変異のIgG2aへの取り込み マウスイソタイプの内、IgG2aはADCCで最も効率的であり、そしてまた補体媒 介性溶解を有効に行う（HerlynおよびKoprowski，1982; Bindonら，1988）。異 化部位の残基Ile253、His310、His435、およびHis436はまた、IgG2a中にも存在 し（表Ｉ）、そしてこれに一致して、IgG1およびIgG2aの半減期は同様である（P ollockら，1990）。従って、このイソタイプの経細胞輸送および血清存続性を改 善するために、IgG1の改善した経細胞輸送および血清存続性をもたらすことが見 出された同じ変異を、Y-3Pハイブリドーマ（IgG2a; Janewayら，1984）由来の組 換えFcフラグメントに取り込ませる。組換えFcフラグメントを、先の実施例 で記載された方法と同じ方法を用いて精製および分析する。 完全なグリコシル化IgGに対する変異の影響の分析 IgG1イソタイプ マウスIgG1抗体（抗アルソン酸）の発現のための構築物を、pRL1（Riechmann ら，1988）中への連結のための適切な制限部位とともにPCR^TMを用いて作製し、 そしてミエローマNSO細胞をトランスフェクトするために用いる。さらに、FcRn へのより高い親和性結合、増大した経細胞輸送、およびおそらく改善された血清 存続性をもたらす、Fcフラグメントの変異を、部位特異的変異誘発（Zollerおよ びSmith，1982）を用いてこの構築物のFc遺伝子に取り込ませる。全ての変異体 を、発現分析の前に配列決定（Sangerら，1977）し、第２の部位の変異が存在し ないことを確実にする。 安定なトランスフェクタントを、以前に記載された（Riechmannら，1988）よ うにNSO細胞のエレクトロポレーション、その後のミコフェノール酸を用いる選 択により、またはより好ましくは実施例８に記載されたように昆虫細胞をトラン スフェクトするためにバキュロウイルス系を用いることにより作製する。この後 者の系は、それがより早いので好ましい。NSO細胞トランスフェクションのため に、クローンを限界希釈により単離し、そして個々のクローンの発現レベルを、 細胞を35Ｓ-メチオニンでパルス標識し、その後培養上清のSDS-PAGEにより決定 する。PAGEゲルを乾燥し、そしてオートラジオグラフィーを行う。IgG1変異体を 、アルソン酸（Ars）-SepharoseまたはプロテインＡ-Sepharoseを用いて精製す る（しかし、FcRnへのより高い親和性結合をもたらす変異がプロテインＡ結合に 有害な影響を有することが考えられ得、従ってArs-Sepharoseの使用が好ましい かもしれない）。WTおよび変異体のIgG1抗体を放射標識し、そして記載された（ Kimら，1994a; Kimら，1994c）ように、薬物動態学、母胎転移、および腸管転移 の研究に用いる。 他のイソタイプ IgG1以外のマウスイソタイプ（または変異体誘導体）をコードする遺伝子を用 いて、上記の発現構築物中のIgG1定常領域を置換する。これらの構築物を用いて 、NSO細胞をトランスフェクトし、そしてArs特異的抗体を、Ars-Sepharoseまた はSpA-Sepharoseを用いて精製する。あるいは、完全なグリコシル化IgGを、マウ スIgG2bについて実施例８に記載されたバキュロウイルス系において発現する。 これらの抗体を、上記のように薬物動態学、母胎転移、および腸管転移の研究に 用いる。 CH2-CH3ドメイン界面での変異ならびに補体結合およびADCCへの影響 変異体抗体がそれら自身の機能（補体結合およびADCC）を有して治療に用いら れる場合、これらがより高い親和性でFcRnに結合し、そして結果としてより効率 的に経細胞輸送され、そしてより長い血清存続性を有するならば、これらはまた ADCCおよび補体結合に関してそれらの元の特性を保持することを確実にすること が重要である。マウスIgG2aおよび2bは、補体結合およびADCCで最も有効であり （HerlynおよびKoprowski，1982; Bindonら，1988）、従ってこれらが活性を喪 失していないことをチェックすることが特に重要である。対照的に、マウスIgG1 は、これらの２つのエフェクター機能において相対的に不活性である（Herlynお よびkoprowski，1982; Bindonら，1988）。従って以下のアッセイを行う。 補体媒介性溶解 DuncanおよびWinter（1988）により記載された方法と同様の方法を用いる。ヒ ツジ赤血球（RBC）をPBS中で洗浄し、そして10⁹細胞／mlで再懸濁する。アルソ ネートを、以前に記載された方法（HarlowおよびLane，1988）を用いて-p-アゾ ベンゼンアルソネート-L-チロシン-t-Boc-N-スクシンイミドを添加することによ り細胞にカップリングする。細胞を補体結合希釈物（CFD）中で３回洗浄し、そ して10⁸細胞/mlで再懸濁する。細胞を、Na⁵¹CrO₄（細胞１mlあたり0.2ml、比活 性１〜10mCi/ml）とともに37℃で４時間インキュベートすることにより標識する 。抗体（野生型および変異体）の系列希釈を、96ウェルプレートの平底ウエルで CFD中に作製する。50μlの1:10希釈のモルモット血清および100μl誘導体化標識 細胞を各ウェルに添加する。結果を以下の式を用いて表す： ADCC 本質的にSarmayおよび共同研究者（1992）の方法を用いる。マウスまたはニワ トリのRBCを、上記のようにアルソネートを用いて誘導体化し、そしてNa⁵¹CrO₄ を用いてパルス標識する。WTおよび変異体の抗体の系列希釈を96ウェルプレート のウェル（10⁵細胞／ウェルを含む）に添加し、そしてエフェクター細胞を0.5〜 ５（エフェクター：標的）の範囲の比率で標的細胞に添加する。エフェクター細 胞として、IFN-γで活性化したマウス腹膜マクロファージまたはP388D1細胞（Na thanら，1983）を用いる。細胞を、37℃で12時間インキュベートし、そして⁵¹Cr 比放出を上記のように決定する。 実施例11 この実施例は、FcRnに結合しないF(ab’)₂フラグメントよりもずっと長い血清 存続性を有するFabフラグメントを記載する。これらのフラグメントは、ある範 囲の親和性でFcRnに結合し、そしてより長い血清存続性を有する非Fcリガンドを 示す。 長い血清存続性を有するF(ab')₂フラグメントの単離 ニュージーランド白ウサギを、適切な抗FcRn力価が達成されるまで２週間間隔 で、その後の注射のために不完全Freundアジュバント中に乳濁化した100μgFcRn を用いて、可溶性組換えFcRn（Popovら，1996b）で皮下免疫した。次いで、ポリ クローナル血清を単離し、そしてIgGをプロテインＡ-Sepharose（Pharmacia，Pi scataway，NJ）を用いて精製した。IgGをペプシンで消化してF(ab')₂フラグメン トおよびFcフラグメントを生成し、そして精製したF(ab')₂フラグメントをFcお よび全ての未消化IgGからプロテインＡ-Sepharoseを用いて分離した。抗FcRn F( ab')₂フラグメントを、FcRn-Sepharoseを用いて精製し、次いでMHCクラ スＩ発現RMA細胞を用いて吸着し、交差反応性抗MHCクラスＩ F(ab')₂フラグメン トを取り出した。FcRn（「コントロール」F(ab')₂）に結合しないF(ab')₂フラグ メントを、IgGの精製、その後のペプシンでの消化について同じ方法を用いてウ サギの免疫前血清から得た。両方のF(ab')₂調製物を、以前に記載されたようにI odogenを用いて放射標識し、そしてSWISSマウス（１群あたり３〜４マウス）に おけるクリアランス研究において使用した。β相半減期は、コントロールF(ab')₂ については24.6±3.6時間であり、そして抗FcRn F(ab')₂については78.2±4.8 であった。明らかに、抗FcRn F(ab')₂フラグメント（または最もありそうなのは 、ポリクローナル集団内のF(ab')₂のサブセット）は、同じ系統におけるマウスI gG1またはFc-ヒンジのβ相半減期（約120時間）に近い長い血清存続性を有した 。 ＊ ＊ ＊ 本発明の組成物および方法を好ましい実施態様に関して記載してきたが、本明 細書中に記載の組成物、方法、および方法の工程または順序に、本発明の概念、 精神、および範囲から逸脱せずに変更が適用され得ることが当業者には明らかで ある。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の因子が本明 細書中に記載の因子について置換され得るが、同じまたは同様の結果が達成され ることは明らかである。当業者に明らかなこのような同様の置換および改変の全 ては、添付の請求の範囲により定義された本発明の精神、範囲、および概念内に あると判断される。請求した全ての主題は、過度の実験を伴わずに成され得る。参考文献 以下に列挙した参考文献は、本明細書中で用いた方法、技術、および／または 組成物についての背景を補充、説明、提供し、またはそれらを教示する程度に、 本明細書中に参照として援用されている。 米国特許第3,791,932号 米国特許第3,949,064号 米国特許第4,174,384号 米国特許第4,554,101号 米国特許第4,578,770号 米国特許第4,596,792号 米国特許第4,599,230号 米国特許第4,599,231号 米国特許第4,601,903号 米国特許第4,603,102号 米国特許第4,608,251号

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 33/531 33/531 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． IgGに対して増大した血清半減期を有する変異IgG分子を含む組成物であっ て、ここで該変異IgG分子がFc-ヒンジ領域において少なくとも１つのアミノ酸置 換を有する、組成物。 ２． 前記IgGがヒトIgGである、請求項１に記載の組成物。 ３． IgGの血清半減期に対して増大した血清半減期を有する変異IgG Fc-ヒンジ フラグメントを含む組成物であって、ここで該フラグメントがFcRnに対する増大 した結合親和性を有する、組成物。 ４． IgGの血清半減期に対して増大した血清半減期を有する変異IgGFc-ヒンジフ ラグメントを含む組成物であって、ここで該フラグメントがFcRnに対する結合に ついてIgGと同じまたは少し低い親和性を有する、組成物。 ５． 前記分子またはフラグメントが、CH2ドメインにおける番号252、254、256 、309、311もしくは315、またはCH3ドメインにおける番号433もしくは434から選 択される１つ以上のアミノ酸においてアミノ酸置換を有する、請求項１または請 求項３に記載の組成物。 ６． 前記分子またはフラグメントが、CH2ドメインにおけるアミノ酸番号252、2 54、256、309、311もしくは315、またはCH3ドメインにおけるアミノ酸番号433も しくは434において３つのアミノ酸置換を有する、請求項５に記載の組成物。 ７． 前記分子またはフラグメントが以下のアミノ酸置換：252位のスレオニンを ロイシン、254位のスレオニンをセリン、および256位のスレオニンをフェニルア ラニン、を有する、請求項６に記載の組成物。 ８． 前記分子またはフラグメントが、表面プラスモン共鳴分析により測定され る場合、約７nMより低いpH６でのFcRnへの結合のための解離定数を有する、請求 項１または請求項３に記載の組成物。 ９． 薬学的に受容可能な組成物としてさらに限定される、請求項１または請求 項３に記載の組成物。 １０． 前記アミノ酸置換がランダム変異誘発によって生成される、請求項５に 記載の組成物。 １１． 因子の血清半減期を増加させる方法であって、請求項１または３に記載 の増大した血清半減期を有する変異IgGまたはIgG Fcヒンジフラグメントと該因 子とを結合させる工程を包含する、方法。 １２． 前記因子が治療薬である、請求項１１に記載の方法。 １３． 前記因子が抗原結合ポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。 １４． 前記因子が抗原またはレセプター結合リガンドである、請求項１１に記 載の方法。 １５． 前記レセプター結合リガンドがT細胞リセプター結合リガンドである、請 求項１４に記載の方法。 １６． 増大した血清半減期を有する抗体の作製方法であって、以下の工程を包 含する、方法： FcRn結合に直接的に関与していると考えられるIgGヒンジ領域中の第１のアミ ノ酸を同定する工程； １つ以上の第２のアミノ酸を同定する工程であって、ここで該第２のアミノ酸 の各々が該第１のアミノ酸の空間的領域に存在し、そしてここで該第２のアミノ 酸の側鎖がネイティブな抗体において溶媒に曝される、工程； １つ以上の該第２のアミノ酸のランダムなアミノ酸置換を有する抗体を作製し て変異抗体を作製する工程；および 増大した血清半減期を有する変異抗体を同定する工程。 １７． 前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 １８． 前記第１のアミノ酸がFcフラグメントのアミノ酸番号253、310、435また は436である、請求項１６に記載の方法。 １９． 前記第２のアミノ酸が、CH2ドメインにおけるアミノ酸番号252、254、25 6、309、311もしくは315、またはCH3ドメインにおけるアミノ酸番号433もしくは 434である、請求項１６に記載の方法。 ２０． ２つ以上の前記第２のアミノ酸が、単一の変異抗体において変異されて いる、請求項１６に記載の方法。 ２１． 増大した血清半減期を有する抗体であって、該抗体が請求項１６に記載 の方法によって作製される、抗体。 ２２． IgG抗体の約アミノ酸250から約アミノ酸440までのフラグメントを含むFc フラグメントを含む組成物であって、さらに以下のように限定される、組成物： 該IgG抗体よりも高いFcRnへの結合親和性を有する； １つ以上のFcRn結合アミノ酸残基に近接する領域において１つ以上のアミノ酸 置換を有する；および pH7.4よりpH6でFcRnへの高い結合親和性を有する。 ２３． 被験体における内因性血清IgGを減少させる方法であって、請求項２２に 記載の組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。 ２４． IgGの血清半減期に対して増大した血清半減期について因子をスクリーニ ングする方法であって、以下の工程を包含する、方法： 候補因子を得る工程； pH7.4および約pH6でのFcRnへの該因子の結合親和性を測定する工程； pH7.4よりも約pH6でのFcRnへの高い結合親和性を有する候補因子を選択する工 程；および 同一条件下で該選択された因子のFcRnへの結合親和性とIgGのFcRnへの結合親 和性とを比較する工程； ここでIgGの結合親和性に対してFcRnへの増大した結合親和性は、増大した血 清半減期を有する因子の指標である。 ２５． 前記候補因子がペプチドまたはポリペプチドである、請求項２４に記載 の方法。 ２６． 前記ペプチドまたはポリペプチドが抗体または抗体のフラグメントであ る、請求項２５に記載の方法。 ２７． 前記ペプチドがランダムなペプチドライブラリーから選択される、請求 項２５に記載の方法。 ２８． 前記ポリペプチドがタンパク質である、請求項２５に記載の方法。 ２９． 前記タンパク質がランダムに変異されたタンパク質である、請求項２８ に記載の方法。 ３０． 前記ペプチドが合成ペプチドである、請求項２５に記載の方法。 ３１． 前記ペプチドが合成化学的化合物のランダムなライブラリーから単離さ れる化学的化合物である、請求項２５に記載の方法。 ３２． 抗体、または薬物、またはタンパク質、または他の治療的因子のいずれ かの、母胎転移を増加させる方法であって、請求項２２に記載の組成物の有効量 を前記被験体に投与する工程を包含する、方法。 ３３． 治療的因子の血清半減期を増大させる方法であって、以下の工程を包含 する、方法： 該治療的因子を、請求項２３に記載の方法により同定されるIgGの血清半減期 に対して増大した血清半減期を有する因子に結合させる工程。