JPH11502701A - 新規なエンドグルカナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 セルロース分解活性を有し、そして配列Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｘ３ Ｘ４ ＡｓｐＣｙｓ Ｃｙｓ Ｘ８ Ｘ１０ Ｃｙｓ Ｘ１２ Ｔｒｐ Ｘ１４（式中Ｘ３およびＸ４は独立してＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅである；Ｘ８はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである；Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３の各々は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものである）を有する１４残基の第１アミノ酸配列と、配列Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｃｙｓ ＸＸ４ Ｃｙｓ（式中ＸＸ４は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものである）を有する５残基の第２アミノ酸配列とを含んでなり、ただし、第１アミノ酸配列において、（ｉ）Ｘ１２がＳｅｒであるとき、Ｘ１４はＳｅｒではなく、そして（ｉｉ）Ｘ１２がＧｌｙであるとき、Ｘ１４がＡｌａではない、酵素から本質的に成る酵素調製物は、洗剤、洗濯、繊維材料および製紙用パルプの応用においてきわめてすぐれた性能を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なエンドグルカナーゼ 本発明は、工業的応用、例えば、洗濯組成物において、新しく製作された繊維 材料のバイオポリッシング（ｂｉｏｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、セルロースの布帛お よび被服の粗い外観の形成、および紙パルプの処理のために、非常にすぐれた性 能を有する、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素を含んでなる新規な酵素調製物 に関する。さらに、本発明は、このような酵素をコードするＤＮＡ構築物、この ような酵素をコードする遺伝子を提供する方法、酵素を生産する方法、このよう な酵素を含有する酵素調製物、および多数の工業的応用のためのこれらの酵素の 使用に関する。 発明の背景 セルラーゼ、すなわち、セルロース分解酵素は、セルロースの加水分解に関係 する酵素である。天然セルロースの加水分解において、関係するセルラーゼ酵素 の少なくとも３つの主要なタイプ、すなわち、セロバイオヒドロラーゼ（１，４ −β−Ｄ−グルカンセロバイオヒドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１）、エン ド−β−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカ ノヒロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）およびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ ３． ２．１．２１）が存在することが知られている。 セルラーゼは、真菌、アクチノミセス類、粘液細菌、および真の細菌を包含す る多数の微生物により合成されるが、また、植物により合成される。特に、広範 な種類の特異性を有するエンドグルカナーゼが同定されてきている。 セルロース分解酵素の非常に重要な工業的使用は、例えば、洗剤組成物または 布帛柔軟化組成物中の成分として、セルロースの繊維材料または布帛の処理、新 しい布帛のバイオ−ポリッシング（被服の仕上げ）、およびセルロース含有布帛 、特にデニムの「ストーン−ウォッシド（ｓｔｏｎｅ−ｗａｓｈｅｄ）」外観の 発生のための使用であり、そしてこのような処理のいくつかの方法は、例えば、 下記の特許出願において示唆された：英国特許出願（ＧＢ−Ａ）第１，３６８， ５９９号、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第０，３０７，５６４号および欧州特許出 願（ＥＰ−Ａ）第０，４３５，８７６号、ＷＯ第９１／１７２４３号、ＷＯ第９ １／１０７３２号、ＷＯ９１／１７２４４号、ＰＣＴ／ＤＫ９５／０００１０８ 号およびＰＣＴ／ＤＫ９５／０００１３２号。 セルロース分解酵素の他の重要な工業的使用は、紙パルプの処理、例えば、排 水の改良またはリサイクル紙の脱インクのための使用である。 特に、エンドグルカナーゼ（ＥＣ Ｎｏ．３．２．１．４）は、前述の工業的 に使用されるヒドロラーゼの興味あるグループである。エンドグルカナーゼは、 セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒ ドロキシエチルセルロース）、リケニンにおける１，４−β−Ｄ−グルコシド結 合、混合β−１，３−グルカン、例えば、穀物のβ−Ｄ−グルカンまたはキシロ グルカンおよびセルロース部分を含有する他の植物材料におけるβ−１，４結合 のエンド加水分解を触媒する。公認された名称はエンド−１，４−β−Ｄ０グル カン４−グルカノヒドロラーゼであるが、略された用語のエンドグルカナーゼを この明細書において使用する。下記の参考文献を参照することができる：Ｔ．− Ｍ．Ｅｎｖｅｒｉ、″Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ″ｉｎ Ｗ． Ｍ．Ｆｏｇａｒｔｙ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ 、ｐ．１８３−２２４（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ、（１９８８）、Ｖｏｌ．１６０、ｐ．２００−３９１（Ｗｏｏｄ、Ｗ．Ａ ．およびＫｅｌｌｏｇｇ、Ｓ．Ｔ．編）；Ｂｅｇｕｉｎ、Ｐ．、″Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ″、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９０）、Ｖｏｌ．４４、ｐ ｐ．２１９−２４８；Ｂｅｇｕｉｎ、Ｐ．およびＡｕｂｅｒｔ、Ｊ−Ｐ．、″Ｔ ｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏ ｓｅ″、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（１９９ ４）、ｐ．２５−５８；Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ、Ｂ．、″Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ″、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（１９９４）、Ｖｏｌ．１、ｐｐ．１６９−１９６。 真菌のエンドグルカナーゼ、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉ ｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギアキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、ネオカリマスチクス・パトリシア ラム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）のような種か ら、および、例えば、ピロミセス（Ｐｙｒｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ（Ｈｕｍｉ ｃｏｌａ）、ミセリオウトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ゲオトリクム （Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、イルペク ス（Ｉｒｐｅ ｘ）、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属の種から誘導されたものは多数の刊行 物に記載されてきている。 例えば、真菌のエンドグルカナーゼは、下記の文献に記載された：Ｓｈｅｐｐ ａｒｄ、Ｐ．Ｏ．、ｅｔ ａｌ．、″Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓ ｔｏ ｃｌｏｎｅ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｃＤＮＡｓ ｆｒｏｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｇｅｎｅ、（１９９４） 、Ｖｏｌ．１５、ｐｐ．１６３−１６７、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ、Ａ．、ｅｔ ａ ｌ．、″Ａ ｎｏｖｅｌ，ｓｍａｌｌ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ，ｅｇＩ５、ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｉｓｏｌａｔ ｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ″、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４）、Ｖｏｌ．１３（２）、ｐｐ．２１ ９−２２８；ｖａｎ Ａｒｓｄｅｌｌ、Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．、（１９８７）、 Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｏｆ ｅ ｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓ ｅｉ ，Ｂｉｏ ．ｅｔ ａｌ．、（１９８６）、″Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌ ｌｕｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ：ｃ ｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅ ｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｉ ｇｅｎｅ″、Ｇｅｎｅ ４５：２５３−２６３ ；Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、（１９８８）、″ＥＧＩＩＩ、ａ ｎｅｗ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ：ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ″、Ｇｅｎｅ ６３：１１−２１； Ｇｏｎｚａｌｅｓ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．、″Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｇｌｌ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａ ｃｈｉａｔｕｍ ″，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、 （１９９２）、Ｖｏｌ．３８、ｐｐ．３７０−３７５；Ｏｏｉ、Ｔ．ｅｔ ａｌ ．、″Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（ＦＩ−ＣＭＣａｓｅ） ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ″、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、 （１９９０）、Ｖｏｌ．１８、ｐｐ．２１７−２２２；Ｏｏｉ、Ｔ．ｅｔ ａｌ ．、″Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔ ｕｓ （ＦＩ−ＣＭＣａｓｅ）″、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ、（１９９０）、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．１９、ｐ．５８８４；Ｘｕｅ、Ｇ．ｅ ｔ ａｌ．、″Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ ｏｆ ｍｕｌｔ ｉｐｌｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃＤＮＡｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏ ｂｉｃ ｒｕｍｅｎ ｆｕｎｇｕｓ Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ｐａｔｒ ｉｃｉａｒｕｍ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ″、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、 （１９９２）、Ｖｏｌ．１３８、ｐｐ．１４１３−１４２０；Ｘｕｅ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．、″Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａ ｓｅ ｃＤＮＡ（ｃｅｌＤ） ｆｒｏｍ Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ｐａ ｔｒｉｃｉａｒｕｍ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌ ｄｏｍａｉｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，ｃｅｌｌｏ ｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｎｄ ｘｙｌａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ″、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１９９２）、Ｖｏｌ．１３８、ｐｐ ．２３９７−２４０３；Ｚｈｏｕ、Ｌ．ｅｔ ａｌ．、″Ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ ｃｅｌＢ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｎｅｏｃ ａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍｏｄ ｕｌａｒ ｆａｍｉｌｙ Ａ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ″、Ｂｉｏｃｈｅｍ ．Ｊ．、（１９９４）、Ｖｏｌ．２９７、ｐｐ．３５９−３６４；Ｄａｌｂｏｇ ｅ、Ｈ．およびＨｅｌｄｔ−Ｈａｎｓｅｎ、Ｈ．Ｐ．、″Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅ ｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎ ｇ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｇｅｎｅｓ″、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ ｎｅｔ．、（１９９４）、Ｖｏｌ．２４３、ｐｐ．２５３−２６０；Ａｌｉ、Ｂ ．Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、″Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ａｎｄ ｈｅｍｉｃｅｌｌ ｕｌａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｐｉｒｏｍ ｙｃｅｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ａ ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ ｃｅｌｌｕ ｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ａｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ″，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ．Ｌｅｔｔ．、（１９９５）、Ｖｏｌ．１２５、Ｎｏ．１、ｐｐ．１５−２ １。さらに、日本のＤＮＡデータバンク（インターネットで公衆に利用可能なＤ ＤＢＪデータベース）は、エンドグルカナーゼをコードするペニシリウム・ジャ ンチネルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｉｎｅｌｌｕｍ）からクローニ ングされた２つのＤＮＡ配列（それぞれ 、Ａ．ＫｏｃｈおよびＧ．Ｍｅｒｎｉｔｚによりクローニングされた）と、エン ドグルカナーゼをコードするフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓ ｅａ）ｖａｒ．テルモイデア（ｔｈｅｒｍｏｉｄｅｓ）からクローニングされた ＤＮＡ配列（Ｔ．Ｕｏｚｕｍｉによりクローニングされた）とを含んでなる。マ クロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ ）からの２つのエンドグルカナーゼがクローニングされ、そして配列決定された 、下記の文献を参照のこと：Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｙ．およびＪｏｎｅｓ、Ｒ．Ｗ．： ″Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉ ｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ− ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ″ｉｎ Ｇｅｎｅ，１５８：１２５−１２８、１９９５、およびＷａｎｇ，Ｈ．Ｙ．お よびＪｏｎｅｓ、Ｒ．Ｗ．：″Ａ ｕｎｉｑｕｅ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ −ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅ ｏｌｉｎａ ″ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６１：２００４−２００６、１９９５。これらのエン ドグルカナーゼの一方は真菌トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）からのｅｇ１３エンドグルカナーゼに対して高い相同性を示し 、他方は微生物の植物病原体シュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）からのｅｇｌｌに対する相同性を示し、 双方のエンドグルカナーゼがグリコシルヒドロラーゼの族５に属することが示さ れる（Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９−３１６（１９９１））。二形性真菌ウスチラゴ ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）におけるセルラーゼ遺伝子のフ ィラメント特異的発現は、Ｓｃｈａｕｗｅｃｋｅｒ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．、（１９ ９５）に開示されている。 ＷＯ９１／１７２４３号明細書（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）には、 フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ＤＳＭ １ ８００から誘導された、高度に精製された４３ｋＤａのエンドグルカナーゼに対 して発生した抗体と免疫学的に反応性の均質エンドグルカナーゼ成分から成るセ ルラーゼ調製物が開示されている；ＷＯ９１／１７２４４号明細書（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）には、新規な（ヘミ）セルロース分解酵素、例えば、 エンドグルカナーゼ、セロバイオヒドロラーゼまたはβ−グルコシダーゼが開示 されており、これらはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）およびファネロ ケテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）以外の真菌から誘導することができる；Ｗ Ｏ９３／２０１９３号明細書には、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）から誘導可能なエンドグルカナーゼが開示 されている；ＷＯ９４／２１８０１号明細書（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）は 、エンドグルカナーゼ活性を示すトリコデルマ・ロンギアキアツム（Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）から単離されたセルラーゼ系 に関する；ＷＯ９４／２６８８０号明細書（Ｇｉｓｔ Ｂｒｏｃａｄｅｓ Ｎ． Ｖ．）には、セルロース分解酵素の単離された混合物が開示されており、これら の酵素は好ましくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはジスポロトリクム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃ ｈｕｍ）から得られ、エンドグルカナーゼ、セロバイオヒドロラーゼ、およびキ シログルカナ ーゼ活性を含んでなる；そしてＷＯ９５／０２０４３号明細書（Ｎｏｖｏ Ｎｏ ｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）には、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ ｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）から誘導されたエンドグルカナーゼ活性を有する酵 素が記載されており、これは、例えば、植物細胞壁の分解または変性を包含する 多数の目的に使用することができる。 また、セルラーゼはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）をもつか、またはもた ないことができることが知られている。ＣＢＤはセルロース含有繊維への酵素の 結合を増強し、そして酵素の触媒活性部分の効能を増加する。 セルラーゼ、好ましくはエンドグルカナーゼの活性が望まれる用途に使用でき る、新規なセルラーゼ酵素調製物を提供することが常に要求されている。 本発明の目的は、酸性、中性またはアルカリ性の条件において、実質的なセル ロース分解活性を有しかつ紙パルプの処理、繊維材料の処理、洗濯プロセスにお いて、または動物飼料において、改良された性能を有する新規な酵素調製物；好 ましくは、組換え技術により生産可能なまたは生産されることが考えられる、新 規なエンドグルカナーゼ、より好ましくはすぐれた性能を有するエンドグルカナ ーゼを提供することである。 発明の要約 驚くべきことには、ある種の独特の特性を有する１グループのエンドグルカナ ーゼは、エンドグルカナーゼが好都合に使用される工業的用途において非常にす ぐれた性能を有することが発見された。これらの独特の特性は、酵素タンパク質 のアミノ酸配列の保存された領域により記載することができ、そしてある種の保 存された領域 を有するセルロース分解酵素、すなわち、セルロース分解活性を示す酵素が、例 えば、洗濯物の処理、新しく製作された繊維材料の処理、製紙用パルプの処理に おいて、非常に有効であることを本発明者らは発見した。 したがって、本発明は、その第１の面において、セルロース分解活性を有し、 そして下記の配列 を有する１４アミノ酸残基から成る第１アミノ酸配列と、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２アミノ酸配列とを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、１２および１４において、そして第２配 列の位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のも のであり、ただし、第１アミノ酸配列において、（ｉ）位置１２におけるアミノ 残基がＳｅｒであるとき、位置１４におけるアミノ酸残基はＳｅｒではなく、そ して（ｉｉ） 位置１２におけるアミノ残基がＧｌｙであるとき、位置１４におけるアミノ酸残 基はＡｌａではない、酵素から本質的に成る酵素調製物に関する。 すぐれた性能を有するエンドグルカナーゼ酵素内に見出される、むしろ顕著な 変動にかかわらず、明瞭に認識可能な保存された領域のこの驚くべき発見は、有 意なセルロース分解活性、特にエンドグルカナーゼ活性を有する酵素の特定のア ミノ酸配列をコードする多数の真菌のＤＮＡ配列の研究の結果である。 この発見に基づいて、本発明の酵素をコードすることによって特徴づけられる ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡについて特別にスクリーニングするように調整され た、新規な分子的方法が開発された。したがって、本発明は、その第２の面にお いて、前述の保存された領域を有するセルロース分解酵素をコードする遺伝子を 提供する方法に関する。 この方法、すなわち、ゲノムＤＮＡのＰＣＲスクリーニングのためのプライマ ーの組、を使用することによって、驚くべきことには、前記酵素をコードするＤ ＮＡを広い範囲の真菌から見出すことができることが見出された。前記真菌は分 類学的に非常に異なる生物に属し、そして生態学的に非常に異なる生態学的地位 に存在する。 さらに、この方法を使用することによって、結合したセルロース結合ドメイン （ＣＢＤ）をもたない前記酵素のコア領域（触媒的に活性な領域またはドメイン ）をコードするＤＮＡ配列を見出すことが可能であった。従来の性能に基づくス クリーニングのアプローチを使用することによっては、酵素の前記コア領域は選 択されなかったであろう。本発明のコア領域の酵素（酵素の触媒的に活性な領域 またはドメインを含んでなる）へのＣＢＤ領域の結合は、多ドメイン酵素の有意 に改良された性能、例えば、５０倍より高い性能を生 ずることを、本発明者らは実験的に証明した。 したがって、本発明は、工業的用途において改良された性能を有する、自然の 形態であるか、または相同的または異種的に産生された、新規なセルラーゼ、特 にエンドグルカナーゼを提供する。 他の面において、本発明は、分類学的に特異的なフィリ（ｐｈｙｌｉ）、クラ ス、目、族、属、および種、例えば、バシジオミコタス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃ ｏｔｏｕｓ）、菌じん網（Ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ジゴミコタ（Ｚｙｇ ｏｍｙｃｏｔａ）、キトリジオミコタ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）から ；またはジスコミセテス（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ロクロアスコミセテス （Ｌｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プレクトミセテス（Ｐｌｅｃｔｏｍ ｙｃｅｔｅｓ）、アルケアスコミセテス（Ａｒｃｈａｅａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ ）、ヘミアスコミセテス（Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）クラスから；また はジアポルターレス（Ｄｉａｐｏｒｔａｌｅｓ）、キシラリアーレス（Ｘｙｌａ ｒｉａｌｅｓ）、トリコアフェリアーレス（Ｔｒｉｃｈｏａｐｈａｅｒｉａｌｅ ｓ）、フィラコラーレス（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｌｅｓ）目から；またはネク トリアセエ（Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ）、ソルダリアセエ（Ｓｏｒｄａｒｉａｃ ｅａｅ）、ケトミアセエ（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）、セラトストマセエ（ Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍａｃｅａｅ）、ラシオスフェリアセエ（Ｌａｓｉｏｓｐｈ ａｅｒｉａｃｅａｅ）族から；またはシリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃ ａｒｐｏｎ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、ボルテラ（Ｖｏ ｌｕｔｅｌｌａ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、アクレモニウム （Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属から；フザリウム・リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・パシフロラ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐａｓｉｆｌ ｏｒａ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウ ム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、フザリウ ム・ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、フミコラ・ニグレセンス（Ｈｕｍ ｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）種から誘導可能である、新規なセルロース分解酵素調製物、特 に配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる酵素から本質的に成り、こ こで、位置４において、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位 置１および７において、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のも のである酵素調製物に関する。 さらに詳しくは、本発明の酵素調製物は、好ましくは、下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、エンドグルカナーゼをすべてが産生する、前述の分類学的に特異的なフィ リ、クラス、目、族、属、および種から得ることができる。 なお他の面において、本発明は、セルロース分解活性を示す酵素をコードする ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築物を提供し、前記ＤＮＡ配列は、それぞれ、 配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、および１９に示すＤＮＡ配 列、またはそれらの類似体を含んでなる。 本発明は、また、本発明のＤＮＡ構築物を含んでなる組換え発現ベクター；本 発明のＤＮＡ構築物または組換え発現ベクターを含んでなる細胞；本発明の酵素 、例えば、組換え酵素を生産する方法；本発明の酵素を使用することによって洗 濯物を色清浄化する方法；本発明の酵素を含んでなる洗濯組成物；植物材料、例 えば、細胞壁の分解または変性、布帛、繊維材料または被服の処理、紙パルプの 処理のための、本発明の酵素の使用；および本発明の酵素に富んだ 酵素調製物に関する。 図面 第１図は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．（Ｉ）、ボルテラ ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄ ｅｓ）、クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．（ＩＩ）、ミセリオフトラ ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、 チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、 マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎ ａ）の推定されたコード化アミノ酸配列の整列である。堆積プログラム（Ｆｅｎ ｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｅ、１９８７）（ＧＣＧパッケージ、バージョン８．０ ）を使用して、最良の整列をつくった。少なくとも４つの配列中の同一残基（ボ ックス）が、対応するアミノ酸の回りに示されている。 第２図 第２Ａ図、第２Ｂ図および第２Ｃ図は、本発明の前記酵素調製物および酵素を 生産できるように、本明細書において開示するすべての微生物の真菌界内の分類 学的分類を示す。 本明細書おいて使用される分類学的分類は、世界的なウェブ：（ｈｔｔｐ：／ ／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ／ｅｆ／ｅｎｔｒ ｅｚＴＡＸ）上で入手可能な：ＮＩＨデータベース（Ｅｎｔｒｅｚ、ｖｅｒｓｉ ｏｎ ｓｐｒｉｎｇ １９９６）において使用されたシステムを主として参考し て作られている。Ｅｎｔｒｅｚデータベースの中に含まれていない生物の分類に 関して、下記の一般に入手可能な、世界的に受け入れられている参 考書を使用した： アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）について：Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、Ｏ ．Ｅ．およびＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ、Ｄ．Ｌ．：Ｓｙｓｔｅｍａ Ａｓｃｏｍｙ ｃｅｔｕｍ ｖｏｌ １２（１９９３）。 バシジオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）について： ｉｏｍｙｃｅｔｅｓ，Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ ８５、４ ８５ｐｐ（１９８１）。 ジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）について：Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｋ ．：Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｒｇｉａ、ＵＳ。２５７ｐｐ（１９７９）。 一般的な菌学の参考書： Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ、Ｄ．Ｌ．、Ｋｉｒｋ、Ｐ．Ｍ．、Ｓｕｔｔｏｎ、Ｂ． Ｃ．およびＰｅｇｌｅｒ、Ｄ．Ｎ．：Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆ ｕｎｇｉ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉ ｔｕｔｅ、６１６ｐｐ（１９９５）； Ｖｏｎ Ａｒｘ，Ｊ．Ａ．：Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｆｕｎｇｉ ｓｐ ｏｒｕｔｉｎｇ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ、４２４ｐｐ（１９８１）。 フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属の分類学的配置は、最近まで不明瞭のままで あった。しかしながら、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）の広い選択 の１８ＳＲＮＡの研究は、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）目に対す るフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）を参照する強い指示を与えた（Ｔａｙｌｏｒ、 Ｃｌａｕｓｅ ｎおよびＯｘｅｎｂo ｌｌ、未発表）。さらに、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ） がシタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）と一緒に、ソルダリアセエ（Ｓｏｒ ｄａｒｉａｃｅａｅ）、ケトミアセエ（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）、セラト ストマタセエ（Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍａｔａｃｅａｅ）、およびラシオスフェリ アセエ（Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）族に対してむしろ遠い関係にあ るだけであることを、これらのデータは示唆している。前述の事実に従い、フミ コラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）およびシタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）は、 ここで未分類の族とともに、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）目内に 配置された。 第３図は、実施例５に記載する４６の微生物のうちで２６の選択から誘導され た、推定された部分的アミノ酸配列の整列である。 発明の詳細な説明 本発明の関係において、用語「２０の天然に存在するアミノ酸残基」は、通常 タンパク質において見出され、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（Ｖａｌか 、またはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ） 、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、トリプ トファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、グリシン（Ｇｌ ｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、シ ステイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（Ａ ｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アスパラギン酸（Ａｓｐまた はＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギ ニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）として普通に知 られている２０のアミノ酸残基を意味する。 本発明によれば、保存されたアミノ酸配列領域、特に下記の配列 を有する１４アミノ酸残基から成る第１アミノ酸配列と、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２アミノ酸配列とを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、１２および１４において、そして第２配 列の位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のも のであり、ただし、第１アミノ酸配列において、（ｉ）位置１２におけるアミノ 残基がＳｅｒであるとき、位置１４におけるアミノ酸残基はＳｅｒではなく、そ して（ｉｉ）位置１２におけるアミノ残基がＧｌｙであるとき、位置１４におけ るアミノ酸残基はＡｌａではない、新規なすぐれた性能を有するエンドグルカナ ーゼが提供される。 好ましくは、本発明の酵素は微生物由来である、すなわち、微生物、例えば、 真菌から得ることができる。 好ましい態様において、第１配列の位置９におけるアミノ酸残基はプロリン、 スレオニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、 グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオ ニンおよびトリプトファンから成る群より選択され、好ましくはプロリンおよび スレオニンから成る群より選択される。 他の好ましい態様において、第１配列の位置１０におけるアミノ酸残基はプロ リン、スレオニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラ ニン、グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、 メチオニンおよびトリプトファン、好ましくはセリンから成る群より選択される 。 なお他の好ましい態様において、第１配列の位置１２におけるアミノ酸残基は プロリン、スレオニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニル アラニン、グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリ ン、メチオニンおよびトリプトファンから成る群より選択され、好ましくはアラ ニンおよびグリシンから成る群より選択される。 なお他の好ましい態様において、第１配列の位置１４におけるアミノ酸残基は プロリン、スレオニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニル アラニン、グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリ ン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン酸およびアスパラギン酸から成る 群より選択され、好ましくはプロリン、スレオニン、セリン、アラニン、グルタ ミン酸およびアスパラギン酸から成る群より選択される。 好ましくは、第２配列の位置４におけるアミノ酸残基はプロリン、スレオニン 、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、 システイン、アスパラギン、グルタミン 、チロシン、セリン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン酸およびアスパ ラギン酸から成る群より選択され、好ましくはアラニン、グリシンおよびグルタ ミンから成る群より選択される。 より好ましい態様の例は、第１配列において、位置３におけるアミノ酸残基が チロシンであるか、または位置４におけるアミノ酸残基がトリプトファンである か、または位置８におけるアミノ酸残基がリジンであるのようなものである。 特に好ましい態様において、本発明の酵素は、アミノ酸配列 アミノ酸配列 アミノ酸配列 を含んでなる第１配列を有する。 第２の面において、本発明は、このような酵素をコードする前記酵素を見出し かつクローニングする方法を提供し、この方法は、第１図に示す、保存された領 域のいずれかから誘導されたオリゴヌクレオチドを使用する標準的条件下におけ るハイブリダイゼーション 、例えば、ＰＣＲ増幅を含んでなる。 有用なオリゴヌクレオチドは、 ａ． 位置３または４におけるアミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅである；位置８ におけるアミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである；それぞれ、位置９、１ ０、１２および１４におけるアミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任 意のものである；および ｂ． 位置４におけるアミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものであ る；および ｃ． 位置１におけるアミノ酸はＭｅｔまたはＩｌｅである；それぞれ、位置６および ８におけるアミノ酸はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌである；および ｄ． 位置３におけるアミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものであ る；それぞれ、位置４および６におけるアミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅ である；そして位置９におけるアミノ酸はＰｈｅまたはＭｅｔである； から成る群より選択されるペプチドにおいて構成された少なくともペンタペプチ ドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。 有用なオリゴヌクレオチドは、また、前述の配列に対して相補的なヌクレオチ ド配列を含んでなる。 本発明の方法の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライ マー センス： ５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＩ^A／_CＧＩＴＡ^C／_TＴＧＧＧＡ^C／_TＴＧ^C／_TＴ Ｇ^C／_TＡＡ^A／_G ^A／_CＣ−３’； アンチセンス１： ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡ^A／_GＣＡＩＧＣ^A／_GＣＡ^A／_GＣＡＣＣ−３’； アンチセンス２： ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＩＡ^A／_G／^TＩＣＣＩＡ_A／^C／^GＩＣＣＩＣＣＩＣＣＩ ＧＧ−３’；および アンチセンス３： ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＩＡＡＣＣＡ^A／_GＴＣＡ^A／_G ^A／_TＡＩＣ^G／_TＡＩＣ^G ／_TＣＣ−３’； から成る群より選択されるＰＣＲプライマーに相当する。 第３の面において、本発明は、セルロース分解活性を有し、そして本発明者ら により見出された保存された領域を有する酵素から本 質的に成る酵素調製物、すなわち、下記の配列 および から成る群より選択される７アミノ酸残基から成るペプチドを含んでなり、ここ で位置４において、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１ および７において、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、酵素調製物を提供する。 この酵素は、バシジオミコタス・ヒメノミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔ ｏｕｓ Ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）（第２図参照）に属する、より好ましく はアガリカーレス（Ａａｇａｒｉｃａｌｅｓ）、アウリクラリアーレス（Ａｕｒ ｉｃｕｌａｒｉａｌｅｓ）、およびアフィロホラーレス（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏ ｒａｌｅｓ）目から成る群に属する、なおより好ましくはエクシジアセエ（Ｅｘ ｉｄｉａｃｅａｅ）、トリコロマタセエ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａｅ） 、コプリナセエ（Ｃｏｒｐｉｎａｃｅａｅ）、シゾフィラセエ（Ｓｃｈｉｚｏｐ ｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ブジェルカンデラセエ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａｃｅａ ｅ）およびポリポラセエ（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ）族、特にエキシジア（Ｅ ｘｉｄｉａ）、クリニペリス（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ）、フォメス（Ｆｏｍｅ ｓ）、パネオルス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、 シゾフィルム（Ｓｃｈｚｏｐｈｙｌｕｍ）、およびス ポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）属から成る群に属する菌株から得る ことができる。 特定の例は、エキシジア・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄｕｌｏｓ ａ）、クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ） 、フォメス・フォメンタリウス（Ｆｏｍｅｓ ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、およ びスポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）ｓｐ．種から成る群に属する菌 株から得ることができるエンドグルカナーゼであり、より特定の例はエキシジア ・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）、ＣＢＳ ２７７．９ ６、クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）、 ＣＢＳ ２８０．９６、フォメス・フォメンタリウス（Ｆｏｍｅｓ ｆｏｍｅｎ ｔａｒｉｕｓ）、ＣＢＳ ２７６．９６、およびスポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉ ｐｅｌｌｉｓ）ｓｐ．、ＣＢＳ ２８３．９６である。 エキシジア・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）は、セン トラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアーズ、オーステルスタート１ 、ポストブス ２７３、ＮＬ−３７４０ ＡＧ バールン、オランダ国において 、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２７７．９６で受託され、クリニ ペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）は、セントラ アルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアーズにおいて、１９９６年３月１ ２日に、受託番号ＣＢＳ ２８０．９６で受託され、フォメス・フォメンタリウ ス（Ｆｏｍｅｓ ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）は、セントラアルビューロウ・ボー ル・シンメルカルチュアーズにおいて、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢ Ｓ ２７６．９６で受託され、スポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）ｓ ｐ．は、セントラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアー ズにおいて、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２８３．９６で受託さ れた；すべてはブダベスト条約の規定に従い寄託された。 本発明の酵素調製物は、また、キトリジオミコタ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃ ｏｔａ）に属する菌株、好ましくはキトリジオミセテス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍ ｙｃｅｔｅｓ）のクラスに属する、より好ましくはスピゼロミセターレス（Ｓｐ ｉｚｅｌｌｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目から成る群に属する、なおより好ましくは スピゼロミセタセエ（Ｓｐｉｚｅｌｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）族、特にリゾフ リクチス（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ）属に属する菌株から得ることができる 。特定の例は、リゾフリクチス・ロセア（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ ｒｏｓ ｅａ）種、より特にリゾフリクチス・ロセア（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ ｒ ｏｓｅａ）、ＣＢＳ ２８２．９６種に属する菌株である。 リゾフリクチス・ロセア（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ ｒｏｓｅａ）は、ブ ダベスト条約の規定に従いセントラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュ アーズにおいて、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２７２．９６で受 託された。 本発明の酵素調製物は、また、ジゴミコタ（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、好まし くはジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）のクラス、より好ましくはムコラ ーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目、なおより好ましくはムコラセエ（Ｍｕｃｏｒ ａｃｅａｅ）およびタムニジアセエ（Ｔｈａｍｎｉｄｉａｃｅａｅ）から成る群 、特にリゾムコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、フィコミセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃ ｅｓ）およびケトスチルム（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕｍ）属から成る群に属する 菌株から得ることができる。特定の例は、リゾムコル・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍ ｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、フィコ ミセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）、およびケトスチル ム・フレセニイ（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ）属、より特に リゾムコル・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ＩＦＯ ４５７８、フィコミセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）、 ＩＦＯ ４８１４、およびケトスチルム・フレセニイ（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕ ｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ）、ＮＲＲＬ ２３０５に属する菌株から得ることができ る。 さらに、本発明の酵素調製物は、また、アルケアスコミセテス（Ａｒｃｈａｅ ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ジスコミセテス（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ヘ ミアスコミセテス（Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ロクロアスコミセテス （Ｌｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、およびプレクトミセテス（Ｐｌｅｃ ｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）から成る群に属する、好ましくはペジザーレス（Ｐｅｚｉ ｚａｌｅｓ）、フィチスマターレス（Ｐｈｙｔｉｓｍａｔａｌｅｓ）、ドチデア ーレス（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ）、およびエウロチアーレス（Ｅｕｒｏｔｉａ ｌｅｓ）目から成る群に属する菌株から得ることができる。特に、酵素はククル ビタリアセエ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｒｉａｃｅａｅ）、アスコボラセエ（Ａｓｃ ｏｂｏｌａｃｅａｅ）、リチスマタセエ（Ｒｈｙｔｉｓｍａｔａｃｅａｅ）、お よびトリココマセエ（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ）族から成る群に属し、好 ましくはジプロジア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏ ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）、ウロスポラ（Ｕｌｏｓｐｏｒａ）、マクロフォミナ （Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）、アスコボルス（Ａｓｃｏｂｏｌｕｓ）、サッコ ボルス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、 およびテロモミセス（Ｔｈｅｒｏｍｏｍｙｃｅｓ）属から成る群に 属する菌株から得ることができる。特定の例は、ジプロジア・ゴッシピナ（Ｄｉ ｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐ ｈａｅｒｏｐｓｉｓ）ｓｐ．、ウロスポラ・ビルグラミイ（Ｕｌｏｓｐｏｒａ ｂｉｌｇｒａｍｉｉ）、マクロフォミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉ ｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、アスコボラス・スチクトイデス（Ａｓｃｏｂｏ ｌｕｓ ｓｔｉｃｔｏｉｄｅｓ）、サッコボラス・ジルテルス（Ｓａｃｃｏｂｏ ｌｕｓ ｄｉｌｕｔｅｌｌｕｓ）、ペジザ（Ｐｅｚｉｚａ）、ペニシリウム・ベ ルクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリ ウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、お よびテロモミセス・ベルクロスス（Ｔｈｅｒｏｍｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｏ ｓｕｓ）種、より詳しくはジプロジア・ゴッシピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓ ｓｙｐｉｎａ）、ＣＢＳ ２８４．９６、ウロスポラ・ビルグラミイ（Ｕｌｏｓ ｐｏｒａ ｂｉｌｇｒａｍｉｉ）、ＮＫＢＣ １４４４、マクロフォミナ・ファ セオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、ＣＢＳ ２８ １．９６、サッコボルス・ジルテルス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ ｄｉｌｕｔｅｌ ｌｕｓ）、ＣＢＳ ２７５．９６、ペニシリウム・ベルクロスム（Ｐｅｎｉｃｉ ｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、ＡＴＣＣ ６２３９６、ペニシリウ ム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ＡＴ ＣＣ ９４８０、およびテロモミセス・ベルクロスス（Ｔｈｅｒｏｍｏｍｙｃｅ ｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、ＣＢＳ ２８５．９６から成る群に属する菌株か ら得ることができる。 ジプロジア・ゴッシピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）は、セン トラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアー ズにおいて、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２８４．９６で受託さ れ、マクロフォミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏ ｌｉｎａ）は、セントラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアーズにお いて、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２８１．９６で受託され、サ ッコボラス・ジルテルス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ ｄｉｌｕｔｅｌｌｕｓ）は、 セントラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアーズにおいて、１９９６ 年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２８５．９６で受託され、テロモミセス・ベ ルクロスス（Ｔｈｅｒｏｍｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）は、セントラ アルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアーズにおいて、１９９６年３月１ ２日に、受託番号ＣＢＳ ２８５．９６で受託された；すべてはブダベスト条約 の規定に従い寄託された。 なおさらに、酵素は、ジアポルターレス（Ｄｉａｐｏｒｔａｌｅｓ）、キシラ リアーレス（Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ）、トリコアフェリアーレス（Ｔｒｉｃｈｏ ａｐｈａｅｒｉａｌｅｓ）およびフィラコラーレス（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｌ ｅｓ）目から成る群に属する菌株から、好ましくはキシラリアセエ（Ｘｙｌａｒ ｉａｃｅａｅ）、バルサセエ（Ｖａｌｓａｃｅａｅ）、およびフィラコラセエ（ Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａｅ）から成る群に属する、より好ましくはジアポ ルテ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ）、コレトトリクム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ）、ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）、キシラリア（Ｘｙｌａｒｉａ）、 ノヅリスポルム（Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｕｍ）およびポロニア（Ｐｏｒｏｎｉａ ）属から成る群に属する菌株から得ることができる。特定の例は、ジアポルテ・ シンゲネシア（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｙｎｇｅｎｅｓｉａ）・コレトトリクム ・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌ ａｇｅｎａｒｉｕｍ）、キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏ ｘｙｌｏｎ）、ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ．、ノヅリスポルム （Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｕｍ）ｓｐ．およびポロニア・プンクタタ（Ｐｏｒｏｎ ｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）種、より詳しくはジアポルテ・シンゲネシア（Ｄｉａ ｐｏｒｔｈｅ ｓｙｎｇｅｎｅｓｉａ）、ＣＢＳ ２７８．９６、コレトトリク ム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、 ＡＴＣＣ ５２６０９、ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ．、ＣＢＳ ２７２．９６、キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌ ｏｎ）、ＣＢＳ ２８４．９６である。 ジアポルテ・シンゲネシア（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｙｎｇｅｎｅｓｉａ）は 、セントラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアーズにおいて、１９９ ６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２７８．９６で受託され、ニグロスポラ（ Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ．は、セントラアルビューロウ・ボール・シンメル カルチュアーズにおいて、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２７２． ９６で受託され、キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌ ｏｎ）は、セントラアルビューロウ・ボール・シンメルカルチュアーズにおいて 、１９９６年３月１２日に、受託番号ＣＢＳ ２８４．９６で受託された；すべ てはブダベスト条約の規定に従い寄託された。 酵素は、また、未同定の真菌の栄養胞子の、コレオミセタス（ｃｏｌｅｏｍｙ ｃｅｏｕｓ）（これは、ブダベスト条約の規定に従い、セントラアルビューロウ ・ボール・シンメルカルチュアーズにおいて、１９９６年３月１２日に、それぞ れ、受託番号ＣＢＳ ２８０．９６、ＣＢＳ ２８１．９６およびＣＢＳ ２８ ３．９６で受 託された）から得ることができる。 酵素は、また、シリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）、グリ オクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ボ ルテラ（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ）、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）、シタリジウ ム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、チエラヴィア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、シスパ ストスポラ（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ）、クラドリヌム（Ｃｌａｄｏｒｒｈ ｉｎｕｍ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅ ｌｉｏｐｈｔｈｒａ）、およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属から 成る群に属する菌株から、特にシリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐ ｏｎ）ｓｐ．、ネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）、ボルテラ ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄ ｅｓ）、ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）、ソ ルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラ ヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チエラ ヴィア・テルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、シス パストスポラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ ｂｏｎｉｎｅｎｓ ｉｓ）、クラドリヌム・フェクンジシムム（Ｃｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍ ｆｏｅ ｃｕｎｄｉｓｓｉｍｕｍ）、ケトミウム・ヴィレスンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ケトミウム・ブラシリエンシス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕ ｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ケトミウム・クニコロルム（Ｃｈａｅｔｏｍ ｉｕｍ ｃｕｎｉｃｏｌｏｒｕｍ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅ ｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、グリオクラジウム・カテヌ ラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａ ｔｕｍ）、シタリジウム・テルモフィラ（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍ ｏｐｈｉｌａ）、およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．種から 成る群に属する菌株から、より詳しくはネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）、ＣＢＳ ２７９．９６、ボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌ ｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、ＣＢＳ ４００．５８ 、ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）、ＡＴＣＣ ５２６４４、ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐ ｏｒａ）、ＡＴＣＣ ６０２５５、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａ ｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ＮＲＲＬ ８１２６、チエラヴィア・テルモ フィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ＣＣＢＳ １７４． ７０、ケトミウム・ムロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｍｕｒｏｒｕｍ）、ＣＢ Ｓ １６３．５２、ケトミウム・ヴィレスンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｖｉｒ ｅｓｃｅｎｓ）、ＣＢＳ ５４７．７５、ケトミウム・ブラシリエンシス（Ｃｈ ａｅｔｏｍｉｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ＣＢＳ １２２．６５、ケト ミウム・クニコロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｃｕｎｉｃｏｌｏｒｕｍ）、Ｃ ＢＳ ７９９．８３、シスパストスポラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐ ｏｒａ ｂｏｎｉｎｅｎｓｉｓ）、ＮＫＢＣ １５１５、クラドリヌム・フェク ンジシムム（Ｃｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍ ｆｏｅｃｕｎｄｉｓｓｉｍｕｍ）、Ａ ＴＣＣ ６２３７３、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈ ｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ＣＢＳ １１７．６５、シタリジウム・テ ルモフィラ（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ＡＴＣＣ ２８０８５、グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａ ｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ＡＴＣＣ １０ ５２３、およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．、ＣＢＳ ４７ ８．９４から得ることができる． ネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）は、セントラアルビュー ロウ・ボール・シンメルカルチュアーズにおいて、１９９６年３月１２日に、受 託番号ＣＢＳ ２７９．９６で受託され、そしてアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏ ｎｉｕｍ）ｓｐ．は、１９９４年９月２８日に、受託番号ＣＢＳ ４７８．９４ で受託された；双方はブダベスト条約の規定に従い寄託された。 酵素は、また、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フ ザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、フ ザリウム・ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、フザリウム・オキシスポラ ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｓｓｐ．リコペルシシ（ｌｙｃｏ ｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓ ｐｏｒｕｍ）ｓｓｐ．パシフロラ（ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、フミコラ・ニグレ センス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）およびフミコラ・グリセア （Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）種、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｓｓｐリコペルシシ（ｌｙｃｏｐｅｒｓ ｉｃｉ）、ＣＢＳ ６４５．７８、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉ ｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｓｓｐパシフロラ（ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、ＣＢ Ｓ ７４４．７９、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、 ＩＭＩ １０７．５１１、フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、ＩＦＯ ４４６７、フザリウム・ポアエ（Ｆｕｓａｒ ｉｕｍ ｐｏａｅ）、ＡＴＣＣ ６０８８３、フミコラ・ニグレセンス（Ｈｕｍ ｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、ＣＢＳ ８１９．７３、お よびフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、ＡＴＣＣ ２２ ７２６から成る群に属する菌株から得ることができる。フミコラ・グリセア（Ｈ ｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）は、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）ｖａｒ．テルモイデア（ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）と異なることに 注意すべきである。 好ましい態様において、本発明の酵素調製物は、開示したクラス、目、族、属 および種から誘導され、そして下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸配列から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、酵素から本質的に成る。 好ましくは、第１配列の位置９におけるアミノ酸残基はプロリン 、スレオニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン 、グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチ オニンおよびトリプトファンから成る群より選択され、より好ましくはプロリン およびスレオニンから成る群より選択される；第１配列の位置１０におけるアミ ノ酸残基はブロリン、スレオニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン 、フェニルアラニン、グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロ シン、セリン、メチオニンおよびトリプトファン、好ましくはセリンから成る群 より選択される；第１配列の位置１２におけるアミノ酸残基はプロリン、スレオ ニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシ ン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニンお よびトリプトファンから成る群より選択され、好ましくはアラニンおよびグリシ ンから成る群より選択される；第２配列の位置４におけるアミノ酸残基はプロリ ン、スレオニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ ン、グリシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メ チオニン、トリプトファン、グルタミン酸およびアスパラギン酸から成る群より 選択され、より好ましくはアラニン、グリシンおよびグルタミンから成る群より 選択される。 他の面において、本発明は、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードする ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築物を提供し、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または１９ に示すＤＮＡ配列、または、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １０ ０８２、ＤＳＭ １００８ ０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳ Ｍ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、ＤＳＭ １０５７ ６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列、または ｂ）それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または１９ に示すＤＮＡ配列または、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００ ８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５ ７１、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列の類 似体、前記類似体は、 ｉ） それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または １９に示すＤＮＡ配列、または、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配 列と相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４ 、６、８、１０、１２、１６、または１９に示すＤＮＡ配列、または、それぞれ 、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ１００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ 配列と同一のヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または １９に示すＤＮＡ配列、または、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配 列を含んでなるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと相同性であるポリ ペプチドをコードする、 ｉｖ） それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または １９に示すか、または、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８ ２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７ １、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列により コードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して発生した抗体と免疫学的に 反応性であるポリペプチドをコードする、 を含んでなる。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５１ ２は、ブダベスト条約の規定に従い、１９９６年２月２日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔ ｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎ ｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５１１は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年２月２日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓ ａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌ ｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３ ８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５７１は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年３月６日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓ ａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌ ｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３ ８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５７６は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年３月１２日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ− ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５８３は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年３月１３日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ Ｇｍ ｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓ ｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５８４は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年３月１３日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ− ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５８５は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年３月１３日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ− ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５８６は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年３月１３日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ− ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５８７は、ブダベ スト条約の規定に従い、１９９６年３月１３日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ− ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５８ ８は、ブダベスト条約の規定に従い、１９９６年３月１３日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕ ｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕ ｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された 。 サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０は、ブダベスト条約の規定に従い、１９９５年２月２ ４日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏ ｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃ ｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、 ドイツ国）に寄託された。 サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）ＤＳＭ １００８２は、ブダベスト条約の規定に従い、１９９５年６月 ３０日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓ ｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ 、ドイツ国）に寄託された。 サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）ＤＳＭ １００８０は、ブダベスト条約の規定に従い、１９９５年６月 ３０日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓ ｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ 、ドイツ国）に寄託された。 サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８１は、ブダベスト条約の規定に従い、１ ９９５年６月３０日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ Ｇｍ ｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓ ｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された。 配列識別Ｎｏ．１に関する本発明のＤＮＡ構築物は、ミセリオフトラ（Ｍｙｃ ｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の菌株、特にミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔ ｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ことにミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌａ）、ＣＢＳ １１７．６５の菌株のＤＮＡライブラリーから単離 するか、または前記ＤＮＡライブラリーに基づいて生産することができる。 配列識別Ｎｏ．４および６に関する本発明のＤＮＡ構築物は、アクレモニウム （Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）の菌株、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓ ｐ．ＣＢＳ ４７８．９４の菌株のＤＮＡライブラリーから単離するか、または 前記ＤＮＡライブラリーに基づいて生産することができる。 配列識別Ｎｏ．８に関する本発明のＤＮＡ構築物は、チエラヴィア（Ｔｈｉｅ ｌａｖｉａ）の菌株、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅ ｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ことにチエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ＮＲＲＬ ８１２６の菌株のＤＮＡライブラリーか ら単離するか、または前記ＤＮＡライブラリーに基づいて生産することができる 。 配列識別Ｎｏ．１０に関する本発明のＤＮＡ構築物は、マクロホミナ（Ｍａｃ ｒｏｐｈｏｍｉｎａ）、特にマクロホミナ・ファセオリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌ ｉｎａ）、ことにマクロホミナ・ファセ オリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）、ＣＢＳ ２８１．９６の菌株からの ＤＮＡライブラリーから単離するか、または前記ＤＮＡライブラリーに基づいて 生産することができる。 配列識別Ｎｏ．１２に関する本発明のＤＮＡ構築物は、クリニペリス（Ｃｒｉ ｎｉｐｅｌｌｉｓ）、特にクリニペリス・スカベラ（Ｃ．ｓｃａｂｅｌｌａ）属 、ことにクリニペリス・スカベラ（Ｃ．ｓｃａｂｅｌｌａ）、ＣＢＳ ２８０． ９６の菌株からのＤＮＡライブラリーから単離するか、または前記ＤＮＡライブ ラリーに基づいて生産することができる。 配列識別Ｎｏ．１９に関する本発明のＤＮＡ構築物は、ソルダリア（Ｓｏｒｄ ａｒｉａ）、特にソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌ ａ）の菌株からのＤＮＡライブラリーから単離するか、または前記ＤＮＡライブ ラリーに基づいて生産することができる。 本発明の関係において、それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１ ２、１６、または１９に示すＤＮＡ配列の「類似体」は、性質ｉ）〜ｉｖ）の任 意またはすべての性質を有する、エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードす る任意のＤＮＡ配列を示すことを意図する。 類似のＤＮＡ配列は、 ａ）それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または１ ９に示すＤＮＡ配列に基づくエンドグルカナーゼ活性を有する酵素を産生する他 のまたは関係する（例えば、同一の）生物から、例えば、本明細書において記載 する手順を使用して、単離することができる；相同体は本明細書において示すＤ ＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列のアレレ変異型、すなわち、突然変異により生 ずる遺伝子の別の形態であることができる；突然変異はサイレント （コード化酵素において変化なし）であることができるか、または変更されたア ミノ酸配列を有する酵素をコードすることができる；本発明のＤＮＡ配列の相同 体は、また、属または種の相同体、すなわち、他の種から誘導される同様な活性 を有する酵素をコードする相同体であることができる、 ｂ）それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または１ ９に示すＤＮＡ配列に基づいて、例えば、ヌクレオチド置換（前記置換は前記Ｄ ＮＡ配列によりコードされるエンドグルカナーゼの他のアミノ酸配列を生ずるこ とがないが、前記酵素の産生に意図されるコドンの使用に相当する）によるか、 または異なるアミノ酸配列を生ずるヌクレオチド置換により構築することができ る。しかしながら、後者の場合において、アミノ酸の変化は好ましくは小さい特 質を有する、すなわち、タンパク質のフォルディングまたは活性に有意に影響を 与えない保存的アミノ酸置換、小さい欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸の欠 失；小さいアミノ−またはカルボキシル−末端のエクステンション、例えば、ア ミノ−末端のメチオニン残基、約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド 、または精製を促進する小さいエクステンション、例えば、ポリ−ヒスチジンの トラクト、抗原性エピトープまたは結合ドメインを有する。参照、一般に、Ｆｏ ｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７、１９９１。保存的置換の例は、塩基性 アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば 、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミンお よびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリ ン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン ）および小さいアミノ酸（ 例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）のグループ内 である。 このような置換は分子の機能に対して決定的である領域の外側において行うこ とができ、そしてなお活性ポリペプチドを生ずることは当業者にとって明らかで あろう。本発明のＤＮＡ構築物によりコードされるポリペプチドの活性に対して 必須であり、したがって、好ましくは置換されないアミノ酸は、この分野におい て知られている手法、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然 変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４、 １０８１−１０８５、１９８９）に従い同定することができる。後者の技術にお いて、突然変異は分子のすべての残基において導入可能であり、そして生ずる突 然変異の分子を生物学的（エンドグルカナーゼ）活性について試験して、分子の 活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定する。基質−酵素の相互作用の部 位は、また、核磁気共鳴、結晶学または光学的親和性標識のような技術により決 定されるように、結晶構造の解析により決定することができる。参照、例えば、 ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２、１９ ９２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９− ９０４、１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９ ：５９−６４、１９９２。 本発明のＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列によりコードされるエンドグルカナーゼは 、コード化酵素の一体的部分として存在するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ） を含んでなるか、または他の由来からのＣＢＤをエンドグルカナーゼ酵素の中に 導入し、こうして酵素ハイブリッドをつくることができる。これに関して、用語 「セルロース結合ドメイン」は、下記の文献において定義されているように理解 することを意図する：Ｐｅｔｅｒ Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．、″Ｃｅｌｌｕｌ ｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａ ｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ″ｉｎ ″Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ″、Ｊｏｈｎ Ｎ．Ｓａｄｄｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈ．Ｐｅｎｎｅｒ（編）、Ａ ＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．６１８、１９９６。この定義 は１２０より多いセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を１０の族（Ｉ〜Ｘ）に分 類し、そしてＣＢＤが種々の酵素、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナ ナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼおよびキチナーゼの中 に見出されることを証明する。ＣＢＤは、また、藻類、例えば、赤藻類Ｐｏｒｐ ｈｙｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ の中に非加水分解性多糖結合タンパク質として存在 する。参考文献として、Ｐｅｔｅｒ Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．、前掲、を参照 のこと。しかしながら、ＣＢＤの大部分はセルラーゼおよびキシラナーゼからの ものである。ＣＢＤはタンパク質のＮまたはＣ末端に見出されるか、または内部 に存在する。酵素ハイブリッドはこの分野において知られており、参照、例えば 、ＷＯ９０／００６０９号およびＷＯ９５／１６７８２号、そして問題の酵素を コードするＤＮＡ配列に、リンカーの存在または非存在下に、結合したセルロー ス結合ドメインをコードするＤＮＡの断片を少なくとも含んでなるＤＮＡ構築物 を宿主細胞の中に形質転換し、そしてこの宿主細胞を増殖させて融合遺伝子を発 現させることによって調製することができる。酵素ハイブリッドは下記式により 記載することができる： ＣＢＤ−ＭＲ−Ｘ 式中ＣＢＤは少なくともセルロース結合ドメインに対応するアミノ 酸配列のＮ−末端またはＣ−末端である；ＭＲは中央領域（リンカー）であり、 そして結合であるか、または好ましくは約２〜約１００個の炭素原子、より好ま しくは約２〜４０個の炭素原子の短い結合基であるか、または好ましくは約２〜 約１００アミノ酸、より好ましくは約２〜４０アミノ酸である；そしてＸは本発 明のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端であ る。 上記ｉ）において言及した相同体は、第２配列からの第１配列の誘導を示す２ つの配列の間の同一性の程度として決定される。相同体は、この分野において知 られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージに おいて提供されるＧＡＰにより適当に決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａ ｎ、Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、４８：４４３−４５３、１９７０）。ＤＮＡ配列 の比較のために下記の設定：５．０のＧＡＰ発生ペナルティーおよび０．３のＧ ＡＰエクステンションペナルティーとともにＧＡＰを使用すると、ＤＮＡ配列の コーディング領域は、それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、 １６、または１９に示すＤＮＡ配列、または、それぞれ、サッカロミセス・セレ ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７ ７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５ １１、ＤＳＭ １０５７１、またはＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得る ことができるＤＮＡ配列のコーディング領域と、好ましくは少なくとも６０％、 より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、なおより 好ましくは少なくとも８０％、ことに少なくとも９０ ％の同一性の程度を示す。 上記ｉｉ）において言及したハイブリダイゼーションは、下記の材料および方 法の節において詳細に記載されている、ある種の特定の条件下に、類似のＤＮＡ 配列がエンドグルカナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列と同一のプローブにハイ ブリダイゼーションすることを示すことを意図する。使用すべきオリゴヌクレオ チドのプローブは、それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１ ６、または１９に示すＤＮＡ配列、または、それぞれ、サッカロミセス・セレビ シエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７７ ０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１ １、ＤＳＭ １０５７１、またはＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得るこ とができるＤＮＡ配列のエンドグルカナーゼをコードする部分に相当するＤＮＡ 配列である。 上記ｉｉｉ）において言及した相同体は、第２配列からの第１配列の誘導を示 す２つの配列の間の同一性の程度として決定される。相同体は、この分野におい て知られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケー ジにおいて提供されるＧＡＰにより適当に決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅ ｍａｎ、Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、４８：４４３−４５３、１９７０）。ポリペ プチド配列の比較のために下記の設定：３．０のＧＡＰ発生ペナルティーおよび ０．１のＧＡＰエクステンションペナルティーとともにＧＡＰを使用すると、類 似のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは、それぞれ、配列識別Ｎｏ． １、４、６、８、１０、１２、１６、または１９に示すＤＮＡ配列、または、そ れぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０ 、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、またはＤＳＭ １０ ５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築 物によりコードされる酵素と、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少 なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、なおより好ましくは少なく とも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、ことに少なくとも９０％の同一 性の程度を示す。 上記の性質ｉｖ）に関して、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、またはＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤ ＮＡ配列によりコードされ、そして前記ＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物に おいて産生されたエンドグルカナーゼ、または、それぞれ、ミセリオフトラ・テ ルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アク レモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．、チエラヴィア・テレストリス（Ｔ ｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍ ａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、クリニペリス・スカベラ（ Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）、ボルテラ・コレトトリコイデス （Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、またはソルダ リア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）により天然に産生さ れる、対応す るエンドグルカナーゼを示すことを意図する。免疫学的反応性は、下記の材料お よび方法の節に記載する方法により決定することができる。 他の面において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を収容する発現ベクター、 ＤＮＡ構築物または発現ベクターを含んでなる細胞、およびエンドグルカナーゼ 活性を示す酵素を生産する方法に関し、前記方法は酵素の産生を可能とする条件 下に前記細胞を培養し、そして酵素を培養物から回収することを含んでなる。 なお他の面において、本発明は、 ａ）本発明のＤＮＡ構築物によりコードされる、 ｂ）本発明の方法により生産される、および／または ｃ）それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、または１６に示 すＤＮＡ配列によりコードされるか、または、それぞれ、サッカロミセス・セレ ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７ ７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５ １１、ＤＳＭ １０５７１、またはＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得る ことができるＤＮＡ配列によりコードされる、精製されたエンドグルカナーゼに 対して発生した抗体と免疫学的に反応性である、 エンドグルカナーゼ活性を示す酵素に関する。 上記ｃ）において述べるエンドグルカナーゼは、それぞれ、サッカロミセス・ セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大 腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １ ０５１１、Ｄ ＳＭ １０５７１、またはＤＳＭ １０５７６の菌株から単離されたＤＮＡ配列 によりコードされ、そして前記ＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物において産 生されることができるか、または、それぞれ、ミセリオフトラ・テルモフィラ（ Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アクレモニウム（ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖ ｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈ ｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐ ｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）、ボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔ ｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、またはソルダリア・フィミ コラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）により天然に産生される、対応す るエンドグルカナーゼであることができる。 一般に、用語「酵素」は、成熟タンパク質またはその前駆体の形態、ならびに 全長の酵素の活性を本質的に有するその機能的断片を包含すると理解される。さ らに、用語「酵素」は前記酵素の相同体を包含することを意図する。 本発明の酵素の相同体は、１または２以上のアミノ酸の置換、欠失または付加 を有することができる。これらの変化は、好ましくは、小さい特質を有する、す なわち、タンパク質のフォルディングまたは活性に有意に影響を与えない保存的 アミノ酸置換、小さい欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸の欠失；小さいアミ ノ−またはカルボキシル−末端のエクステンション、例えば、アミノ−末端のメ チオニン残基、約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド、または精製を 促進する小さいエクステンション、例えば、ポリーヒスチジンのトラクト、抗原 性エピトープまたは結合ドメインを有する。参照、一般に、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａ ｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７、 １９９１。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、 ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、 極性アミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例 えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニル アラニン、トリプトファン、チロシン）および小さいアミノ酸（例えば、グリシ ン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）のグループ内である。 このような置換は分子の機能に対して決定的である領域の外側において行うこ とができ、そしてなお活性ポリペプチドを生ずることは当業者にとって明らかで あろう。本発明の酵素の活性に対して必須であり、したがって、好ましくは置換 されないアミノ酸は、この分野において知られている手法、例えば、部位特異的 突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、１９８ ９）に従い同定することができる。後者の技術において、突然変異は分子のすべ ての残基において導入可能であり、そして生ずる突然変異の分子をセルロース分 解活性について試験して、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定 する。リガンド−レセプターの相互作用の部位は、また、核磁気共鳴、結晶学ま たは光学的親和性標識のような技術により決定されるように、結晶構造の解析に より決定することができる。参照、例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．、１９ ９２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ． 、、１９９２。 相同体はアレレ変異型、すなわち、突然変異により生ずる遺伝子の別の形態、 または突然変異した遺伝子によりコードされるが、本発明の酵素と実質的に同一 の活性を有する、変更された酵素である ことができる。それゆえ、突然変異はサイレント（コード化酵素において変化な し）であることができるか、または変更されたアミノ酸配列を有する酵素をコー ドすることができる。 本発明の酵素の相同体は、また、属または種の相同体、すなわち、他の種から 誘導される同様な活性を有する酵素であることができる。 酵素の相同体は、本明細書において記載する手法を使用して単離することがで きる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により分子スクリーニングおよびクローニング 本発明のＤＮＡ配列について分子スクリーニングは、適当な源、例えば、本明 細書において記載する生物から単離されたゲノムＤＮＡまたは二本鎖ｃＤＮＡ、 および本明細書において開示するＤＮＡ配列またはアミノ酸配列に基づいて調製 された合成オリゴヌクレオチドのプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）により実施することができる。例えば、適当なオリゴヌクレオチドの プライマーは下記の材料および方法の節に記載するプライマーであることができ る。 よく知られた手順に従い、分子スクリーニングにおいて発生したＰＣＲ断片を 単離し、適当なベクターの中にサブクローニングすることができる。ＰＣＲ断片 は、例えば、コロニーまたはプラークハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡラ イブラリーのスクリーニングに使用できる。酵母における発現クローニング エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードする本発明の酵素は、下記のもの を包含する一般的方法により単離することができる： −適当なベクター中で、適当な源、例えば、本明細書において記載 する生物からのＤＮＡライブラリーをクローニングする、 −適当な酵母宿主細胞を前記ベクターで形質転換する、 −前記宿主細胞を適当な条件下に培養して、ＤＮＡライブラリー中のクローンに よりコードされる問題の酵素を発現させる、 −このようなクローンにより産生される酵素のエンドグルカナーゼ活性を測定す ることによって、陽性のクローンについてスクリーニングする、そして −このようなクローンからＤＮＡをコードする酵素を単離する。 一般的方法はＷＯ９４／１４９５３号明細書にさらに開示されており、その内 容を引用することによって本明細書の一部とする。スクリーニング法のより詳述 な記載は、下記の実施例１に記載されている。 酵素をコードするＤＮＡ配列は、例えば、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａ ｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、クリニペリス・スカベラ（Ｃ ｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）、ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒ ｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）またはボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌ ｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）のｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングし、そして適当な酵素活性（すなわち、エンドグルカナーゼ活 性）を発現するクローンについて選択することによって単離することができるか 、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５１２［ブ ダベスト条約の規定に従い、１９９６年２月２日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅ ｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ −３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国）に寄託された］から、ま たは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５１１［ブダベスト条約の規定に従い、１９９６年２月 ２日に、ＤＳＭに寄託された］から、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５７６［ブダベスト条約の規定に従い、１９９６年３月 １２日に、ＤＳＭに寄託された］から、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５７１は、ブダベスト条約の規定に従い、１９９６年 ３月６日に、ＤＳＭに寄託された］から単離することができるか、またはミセリ フトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ）、ＣＢＳ １１７．６５、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．、 ＣＢＳ ４７８．９４、またはチエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉ ａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ＮＲＲＬ ８１２６のｃＤＮＡライブラリーをス クリーニングし、そして適当な酵素活性（すなわち、エンドグルカナーゼ活性） を発現するクローンについて選択することによって単離することができるか、ま たはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０［ブダベスト条約の規定に従い、１９９５年２月２ ４日に、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏ ｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃ ｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １６、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、 ドイツ国）に寄託された］から、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８２［ブダベスト 条約の規定に従い、１９９５年６月３０日に、ＤＳＭに寄託された］から、また はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）ＤＳＭ １００８０［ブダベスト条約の規定に従い、１９９５年６月３ ０日に、ＤＳＭに寄託された］またはサ ッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）ＤＳＭ １００８１［ブダベスト条約の規定に従い、１９９５年６月３０日 に、ＤＳＭに寄託された］から単離することができる。次いで、適当なＤＮＡ配 列をクローンから標準的手順、例えば、実施例１に記載されている手順により単 離することができる。核酸構築物 本明細書おいて使用するとき、用語「核酸構築物」はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ 、合成ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の任意の核酸分子を示すことを意図する。用語「 構築物」は、一本鎖または二本鎖であることができ、かつ問題の酵素をコードす る完全なまたは部分的な天然に存在するヌクレオチド配列に基づくことができる 、核酸セグメントを示すことを意図する。構築物は必要に応じて他の核酸セグメ ントを含有することができる。 本発明の酵素をコードする核酸構築物は、適当にゲノムまたはｃＤＮＡ由来で あり、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして標準的技術 に従いオリゴヌクレオチドのプローブを使用するハイブリダイゼーションにより 、酵素のすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングする ことによって、得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、 １９８９）。 酵素をコードする核酸構築物は、また、確立された標準的方法、例えば、Ｂｅ ａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、（１９８１）が記載するホスホルアミ ダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．、（１９８４）が記載する方法 により、合成的に製造することができる。ホスホルアミダイト法に従い、オリゴ ヌクレオチトを、例えば、自動ＤＮＡ合成装置において、合成し、精製し、アニ ールし、結合し、そして適当なベクター中でクローニングする。 さらに、核酸構築物は、混合した合成的およびゲノム、混合した合成的および ｃＤＮＡ、または標準的技術に従い、混合した合成的およびｃＤＮＡ由来（適当 な）の断片、全体の核酸構築物の種々の部分に対応する断片を結合することによ って製造された混合したゲノムおよびｃＤＮＡ由来であることができる。 核酸構築物は、また、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書または Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．、（１９８８）に記載されているように、特定のプラ イマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により製造することができる。 核酸構築物は、好ましくは、ＤＮＡ構築物であり、この用語はこの明細書およ び請求の範囲において独占的に使用されるであろう。組換えベクター 本発明の酵素をコードするＤＮＡ構築物を含んでなる組換えベクターは、組換 えＤＮＡ手法に好都合に付すことができる任意のベクターであることができ、そ してベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞にしばしば依存する。こうして 、ベクターは自動的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実在物として存 在し、その複製が染色体の複製に対して独立であるベクター、例えば、プラスミ ドであることができる。また、ベクターは、宿主細胞の中に導入したとき、宿主 細胞のゲノムの中に組込まれ、そしてそれが組込まれた１または２以上の染色体 と一緒に複製するベクターであることができる。 ベクターは好ましくは発現ベクターであり、ここにおいて本発明の酵素をコー ドするＤＮＡ配列はＤＮＡの転写に要求される追加のセグメントに作用可能に連 鎖されている。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘 導されたるか、または双方 を含有することができる。「作用可能に連鎖された」は、セグメントがそれらの 意図する目的と協調して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて 開始し、そして酵素をコードするＤＮＡ配列を通して進行するように、セグメン トが配置されていることを示す。 プロモーターは選択した宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり 、そして宿主細胞に対して相同または非相同であるタンパク質をコードする遺伝 子から誘導することができる。 酵母宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は、酵母の解糖 遺伝子からのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． 、２５５（１９８０）、１２０７３−１２０８０；Ａｌｂｅｒおよび Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１：（１９８２）、４１ ９−４３４）またはアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ ｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ ．、編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）、またはＴＰＩｌ （米国特許第４，５９９，３１１号）またはＡＤＨ２−４ｃ（Ｒｕｓｓ ｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３０４（１９８３）、６５２−６５４） のプロモーターを包含する。 糸状真菌の宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は、例え ば、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ ＥＭＢ Ｏ Ｊ． ４（１９８５）、２０９３−２０９９）またはｔｐｉＡプロモーター である。他の有用なプロモーターの例は、下記のものをコードする遺伝子から誘 導されたものである：アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡア ミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アス パラギン酸プロテイナーゼ、アスペギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α− アミラーゼ、アスペギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ 、アスペギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペギルス・アワモリ（Ａ ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒ ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙ ｚａｅ）リン酸トリオースイソメラーゼまたはアスペルギルス・ニヅランス（Ａ ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ。ＴＡＫＡ−アミラーゼおよびｇ１ｕＡ のプロモーターは好ましい。 細菌宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は下記の通りで ある：ベクターがバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニック（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ）アミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃ ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリクファシエ ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＡＮアミラ ーゼ遺伝子、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アル カリ性ホスファターゼ遺伝子、またはバシラス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはファージラムダ Ｐ_RまたはＰ_Lのプロモーター、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐま たはｔａｃのプロモーター。 また、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を、必要に応じて、適当なターミ ネーターに作用可能に接続することができる。 本発明の組換えベクターは、さらに、ベクターを問題の宿主細胞中で発現可能 とするＤＮＡ配列を含むことができる。 ベクターは、また、選択可能なマーカー、例えば、その産物が宿主細胞中の欠 陥を補足する遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコード する遺伝子またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌ、Ｇｅｎｅ ４ ０、１９８５、ｐｐ．１２５−１３０に記載されている）を含んでなることがで きる。フィラメント状真菌について、選択可能なマーカーは、ａｍｄＳ、ｐｙｒ Ｇ 、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、ｓＣを包含する。 本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分泌シグナル配列（ また、リーダー配列、プレプロ配列または前配列として知られている）を組換え ベクターの中に含めることができる。分泌シグナル配列は、酵素をコードするＤ ＮＡ配列に正しいリーディングフレームにおいて接合される。分泌シグナル配列 は、通常、酵素をコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置する。分泌シグナル 配列は通常酵素に関連するものであるか、または他の分泌された製造をコードす る遺伝子からのものであることができる。 酵母細胞からの分泌のために、分泌シグナル配列は、発現された酵素の細胞分 泌経路の中への十分な方向づけを保証する、任意のシグナルペプチドをコードで きる。シグナルペプチドは天然に存在するシグナルペプチドまたはその機能的部 分であるか、または合成ペプチドであることができる。適当なシグナルペプチド はα−因子のシグナルペプチド（参照、米国特許第４，８７０，００８号）、マ ウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（参照、Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２８９、１９８１、ｐｐ．６４３−６４６）、修 飾されたカルボキシペプチダーゼ（参照 、Ｌ．Ａ．Ｖａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ４８、１９８７、ｐｐ．８８ ７−８９７）、酵母ＢＡＲｌシグナルペプチド（参照、ＷＯ８７／０２６７０） 、または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（参 照、Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｓｔ ６、１９９０、 ｐｐ．１２７−１３７）であることができる。 酵母中の分泌を効率よくするために、リーダーペプチドをコードする配列をシ グナル配列の下流にかつ酵素をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入することもで きる。リーダーペプチドの機能は、発現された酵素を小包体からゴルジ装置に、 さらに培地の中への分泌のために分泌小胞に向けさせることである（すなわち、 細胞壁を横切るか、または少なくとも細胞膜を通した、酵母細胞の周辺質空間の 中への酵素の輸送）。リーダーペプチドは酵母のα−因子のリーダーであること ができる（その使用は、例えば、米国特許第４，５４６，０８２号、欧州特許（ ＥＰ）第１６，２０１号、欧州特許（ＥＰ）第１２３，２９４号、欧州特許（Ｅ Ｐ）第１２３，５４４号および欧州特許（ＥＰ）第１６３，５２９号明細書に記 載されている）。また、リーダーペプチドは合成リーダーペプチド、すなわち、 天然に見出されないリーダーペプチドであることができる。リーダーペプチドは 、例えば、ＷＯ８９／０２４６３号またはＷＯ９２／１１３７８号明細書に記載 されているように構築することができる。 糸状真菌中で使用するために、シグナルペプチドは好都合にはアスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｓｐ．のアミラーゼまたはグルコアミラーゼをコー ドする遺伝子、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ） のリパーゼまたはプロテアーゼ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌ ａｎｕｇｉｎ ｏｓａ）のリパーゼをコードする遺伝子から誘導することができる。シグナルペ プチドは好ましくはアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミ ラーゼ、アスペギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ、アスペギル ス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性アミラーゼ、またはアスペギルス・ニガ ー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼから誘導される。 それぞれ、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよび必要に 応じておよび／または分泌シグナル配列を結合し、そして複製に必要な情報を含 有する適当なベクターの中にそれらを挿入するために使用される手法は、当業者 によく知られている（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲） 。宿主細胞 宿主細胞の中に導入される本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、問題の宿 主に対して相同または非相同であることができる。宿主細胞に対して相同である 、すなわち、自然に宿主細胞により産生される場合、それは典型的には他のプロ モーター配列または、適当ならば、その自然の環境におけるより、他の分泌シグ ナル配列および／またはターミネーター配列に作用可能に接続されるであろう。 用語「相同」は、問題の宿主生物に本来の酵素をコードするＤＮＡ配列を包含す ることを意図する。用語「非相同」は、自然に宿主細胞により発現されないＤＮ Ａ配列を包含することを意図する。したがって、ＤＮＡ配列は他の生物からのも のであるか、または合成配列であることができる。 本発明のＤＮＡ構築物または組換えベクターが導入される宿主細胞は本発明の 酵素を産生できる任意の細胞であることができ、そして細菌、酵母、真菌および より高等の真核生物の細胞を包含する。 培養すると、本発明の酵素を産生することができる細菌の宿主細 胞の例は、グラム陽性細菌、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株、例 えば、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リヘニフォル ミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔ ｕｓ）、バシラス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、ベクターがバシラス・ステ アロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ベクター がバシラス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ アミロリクファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラ ス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・サーキュランス（ Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バシラ ス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）またはバシラス・スリンジエン シス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の菌株、またはストレプトマイセス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ ｉｖｉｄａｎｓ）またはストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ） の菌株、またはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ ｏｌｉ）である。細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換によるか、また はそれ自体知られている方法においてコンピテント細胞を使用することによって 実施することができる（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲 ）。 酵素を細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させるとき、酵素は細 胞質中で、典型的には不溶性顆粒（封入体として知られている）として保持され るか、または細菌の分泌配列により周辺質空間に向けられることがある。前者の 場合において、細胞を溶解し、顆粒を回収し、変性した後、変性剤を希釈するこ とによって、酵素をリフォルディングする。後者の場合において、細胞を、例え ば、超音波処理または浸透圧ショックにより、崩壊させて、周辺質空間の内容物 を解放させ、酵素を回収することによって、酵素を周辺質空間から回収すること ができる。 適当な酵母細胞の例は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種 またはシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、 特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）の菌株を包含する。酵母細胞を異種ＤＮＡで形質転換し、 そしてそそれから異種酵素を生産する方法は、例えば、米国特許第４，５９９， ３１１号、米国特許第４，９３１，３７３号、米国特許第４，８７０，００８号 、米国特許第５，０３７，７４３号、および米国特許第４，８４５，０７５号明 細書に記載されている（それらのすべては引用することによって本明細書の一部 とされる）。選択可能なマーカー、例えば、普通に薬物耐性または特定の栄養、 例えば、ロイシンの非存在において増殖する可能により決定された表現型により 、形質転換された細胞を選択する。酵母において使用するために好ましいベクタ ーは、米国特許第４，９３１，３７３号開示されているＰＯＴｌベクターである 。本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列の前に、例えば、前述したように、シグ ナル配列および必要に応じてリーダー配列が存在することができる。適当な酵母 細胞の他の例は、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば 、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓ ｅｎｕｌａ）、例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ）、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓ ｔｏｒｉｓ）の菌株である（参照、Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅ ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２、１９８６、ｐｐ．３４５９−３４６５；米 国特許第４，８８２，２７９号）。 他の真菌細胞の例は、糸状真菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、フザリウム（Ｆｕｓ ａｒｉｕｍ）種またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、特にアスペル ギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニヅランス（Ａ．ｎｉ ｄｕｌａｎｓ）、アスペギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはフザリウム・ グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の菌株の細胞で ある。タンパク質の発現のためのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種 の使用は、欧州特許（ＥＰ）第２７２，２７７号、欧州特許（ＥＰ）第２３０， ０２３号明細書に記載されている。フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓ ｐｏｒｕｍ）の形質転換は、例えば、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９ ８９、Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６に記載されているように実施することが できる。 糸状真菌を宿主細胞として使用するとき、それは本発明のＤＮＡ構築物で、好 都合にはＤＮＡ構築物を宿主染色体の中に組込んで組換え宿主細胞を得ることに よって、形質転換することができる。ＤＮＡ配列は細胞の中で安定に維持される ように思われるので、この組込みは一般に有利であると考えられる。宿主染色体 の中へのＤＮＡ構築物の組込みは、慣用法に従い、例えば、相同または非相同の 組換えにより、実施することができる。 次いで、本発明の酵素の発現を可能とする条件下に、前述の形質転換されたま たはトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、その後、得られる酵素を培 養物から回収する。細胞の培養に使用する培地は、宿主細胞の増殖に適当な慣用 の任意の培地、例えば、適 当な最小または複合培地であることができる。適当な培地は商業的供給業者から 入手可能であるか、または発表された処方（例えば、アメリカン・タイプ・カル チャー・コレクションのカタログにおいて）に従い調製できる。次いで、細胞に より生産される酵素は慣用手法により培地から回収できる。このような慣用手法 は、問題の酵素のタイプに依存して、遠心または濾過による培地からの宿主細胞 の分離、塩、例えば、硫酸アンモニウムによる上清または濾液のタンパク質成分 の沈降、種々のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー 、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはそ の他による精製を包含する。 なお他の面において、本発明は本発明による酵素を生産する方法に関し、ここ において酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適当な宿主細胞を酵素の 産生を可能とする条件下に培養し、そして生ずる酵素を培養物から回収する。分類学ならびに生態学により推進される酵素のスクリーニング 興味ある酵素の前記タイプを検出しかつ選択するように設計された、本明細書 において開示する分子スクリーニングのような強力なツールは、まだそれ自体有 効であることができない。興味ある発見をなす機会を最大とするために、分子ス クリーニングのアプローチをこの研究においてスクリーニングするための真菌の 注意した選択と組み合わせた。分類学的分類および病原的関係において、真菌の 同定における完全な洞察を通して、選択を実施した。 また、生態学的アプローチが含められる場合、セルロース分解酵素の生産のた めの分類学的ホットスポットをさらに初めて完全に探査することができる。聡明 なスクリーニングを設計し、かつ研究すべき菌株および生態学的地位の成功した 選択を管理するために、種 々の基質に対する適合（ことに植物材料の腐敗物向性（ｓａｐｒｏｔｒｏｐｈｉ ｃ）、壊死物向性（ｎｅｃｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）または生物向性（ｂｉｏｔｒｏ ｐｈｉｃ）分解）についての完全な知識は前提条件である。 本明細書において開示する分類学および生態学的アプローチの双方は、分子ス クリーニングプログラムにおける前記酵素の発見を最大とすることを目的とする 。しかしながら、本明細書において報告されたセルロース分解酵素の前記タイプ の５３ヒットを検出するために、なお数百（またはすべての予備的研究を含める 場合）数千の真菌を培養した。 下記の材料および方法を使用して、スクリーニングおよびクローニングを実施 することができる： 材料および方法 生物のリスト シャトルベクターｐＹＥＳ２．０の中に、本発明のエンドグルカナーゼをコー ドする、全長のＤＮＡ配列を含んでなるプラスミドを含有する、それぞれ、サッ カロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）、ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １ ００８１、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０ ５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、ＤＳＭ １０５７６。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １０５８３、１０５８ ４、１０５８５、１０５８６、１０５８７、および１０５８８。 ジプロジア・シピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）Ｃｏｏｋｅ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７４．９６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ロクロアスコミセテス（Ｌｏｃ ｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ドシデアーレス（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ） 、ククルビタリアセエ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｒｉａｃｅａｅ） ウロスポラ・ビルグラミイ（Ｕｌｏｓｐｏｒａ ｂｉｌｇｒａｍｉｉ）（Ｈａ ｗｋｓｗ． ｅｔ ａｌ．）Ｈａｗｋｓｗ． ｅｔ ａｌ． 菌株の受け入れ番号：ＮＫＢＣ １４４４、日本大学（ツバキ教授のコレクショ ン） 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ロクロアスコミセテス（Ｌｏｃ ｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ドシデアーレス（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ） 、（未分類の族） ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）種単離源：カメ リア・ジャポニカ（Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｊａｐｏｎｉｃａ）の葉（Ｔｈｅａｃｅ ａｅ、Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｌｅｓ）、クミング・ボタニカル・ガーデン（Ｋｕｎ ｍｉｎｇ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ ｇａｒｄｅｎ、Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｅｎ ｃｅ、中国）分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ロクロアスコミセ テス（Ｌｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ドシデアーレス（Ｄｏｔｈｉｄ ｅａｌｅｓ）、（未分類の族） マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉ ｎａ）（Ｔａｓｓｉ）Ｇｏｉｄａｎｎｉｃｈ Ｓｙｎ：リゾクトニア・バタチコラ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｂａｔａｔｉｃ ｏｌａ） 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２８１．９６ 単離源：グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｌｅｇ ｕｍｉｎｏｓａ）、ｃｖ ＣＭＭ ６０の種子、タイ国において成長した、１９ ９０ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ジスコミセテス（Ｄｉｓｃｏｍ ｙｃｅｔｅｓ）、リチスマターレス（Ｒｈｙｔｉｓｍａｔａｌｅｓ）、リチスマ タセエ（Ｒｈｙｔｉｓｍａｔａｃｅａｅ） アスコブルス・スチクトイデウス（Ａｓｃｏｂｏｌｕｓ ｓｔｉｃｔｏｉｄｅ ｕｓ）Ｓｐｅｇ 単離源：ガンの糞、ノルウェー国スバルバード 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ジスコミセテス（Ｄｉｓｃｏｍ ｙｃｅｔｅｓ）、ペジザーレス（Ｐｅｚｉｚａｌｅｓ）、アスコボラセエ（Ａｓ ｃｏｂｏｌａｃｅａｅ） サッコボラス・ジルテラス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ ｄｉｌｕｔｅｌｌｕｓ） （Ｆｕｃｋ．）Ｓａｃｃ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７５．９６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ジスコミセテス（Ｄｉｓｃｏｍ ｙｃｅｔｅｓ）、ペジザーレス（Ｐｅｚｉｚａｌｅｓ）、アスコボラセエ（Ａｓ ｃｏｂｏｌａｃｅａｅ） ペニシリウム・ベルクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏ ｓｕｍ）Ｐｅｙｒｏｎｅｌ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６２３９６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、プレクトミセテス（Ｐｌｅｃｔ ｏｍｙｃｅｔｅｓ）、エウロチアーレス（Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓ）、トリココマ セエ（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ） ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ ｕｍ）Ｔｈｏｍ 菌株の受け入れ番号：ＡＴＣＣ ９４８０ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、プレクトミセテス（Ｐｌｅｃｔ ｏｍｙｃｅｔｅｓ）、エウロチアーレス（Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓ）、トリココマ セエ（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ） セルモマイセス・ベルコサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕ ｓ）Ｐｕｇｈ ｅｔ ａｌ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ２８５．９６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、プレクトミセテス（Ｐｌｅｃｔ ｏｍｙｃｅｔｅｓ）、エウロチアーレス（Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓ）、（未分類の 族：１８Ｓ ＲＮＡ、配列決定および相同性に基づく関係） キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ）Ｌ．ｅｘ Ｇｒｅｙｉｌｌｅ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２８４．９６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、キシラリアーレス（Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ）、キシラリアセ エ（Ｘｙｌａｒｉａｃｅａｅ） ポロニア・プンクタタ（Ｐｏｒｏｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）（Ｆｒ．ｅｘ Ｌ．）Ｆｒ． 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、キシラリアーレス（Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ）、キシラリアセ エ（Ｘｙｌａｒｉａｃｅａｅ） ノズリスポラム（Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｕｍ）種 単離源：カメリア・レチクラタ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）の 葉（Ｔｈｅａｃｅａｅ、Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｌｅｓ）、クミング・ボタニカル・ ガーデン（Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ ｇａｒｄｅｎ、Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｅｎｃｅ、Ｃｈｉｎａ） 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、キシラリアーレス（Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ）、キシラリアセ エ（Ｘｙｌａｒｉａｃｅａｅ） シリンドロカプポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）種 単離源：海洋の試料、バハマ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）（未分類） アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ４７８．９４ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、ヒポクレ アセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ） フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ） Ｓｈｅｒｂａｋｏｆｆ 菌株の受け入れ番号：ＩＦＯ ４４６７ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、ヒポクレ アセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ） フザリウム・ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）（Ｐｅｃｋ）Ｗｒ． 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６０８８３ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、ヒポクレ アセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ） フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）（Ｍａｒｔ．）Ｓａ ｃｃ．ｅｍｎｄ．Ｓｎｙｄ ＆ Ｈａｎｓ． 菌株の受け入れ番号：ＩＭＩ １０７．５１１ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、ヒポクレ アセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ） フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｓｓ ｐリコペルシシ（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）（Ｓａｃｃ．）Ｓｎｙｄ ＆ Ｈａ ｎｓ． 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ６４５．７８ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、ヒポクレ アセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ） フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｓｓ ｐパシフロラ（ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ） 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ７４４．７９ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、ヒポクレ アセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ） グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌ ａｔｕｍ）Ｇｉｌｌｍａｎ ＆ Ａｂｂｏｔｔ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ２２７．４８ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、ヒポクレ アセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ） ネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）Ｄｉｎｇｌｅｙ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７９．９６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（ Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ ）、ネクトリアセエ（Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ） ボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉ ｃｈｏｉｄｅｓ） 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ４００．５８ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポクレアーレス（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）（未分類） ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）Ａｕ ｅｒｓｗａｌｄ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６０２５５ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ソルダリアセ エ（Ｓｏｒｄａｒｉａｃｅａｅ） ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）（Ｒｏｂｅ ｒｇｅ）Ｃｅｓａｔｉ ｅｔ Ｄｅ Ｎｏｔａｒｉｓ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ５２６４４ 単離源：糞、Ｈ．Ｄｉｓｓｉｎｇによる、ＩＳＰ、ＫＵ、デンマーク国 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ソルダリアセ エ（Ｓｏｒｄａｒｉａｃｅａｅ） フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）Ｔｒａｅｅｎ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ２２７２６ 源：ハチフィールド・ポリテクニク（Ｈａｔｆｉｅｌｄ Ｐｏｌｙ ｔｅｃｈｎｉｃ） 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、（族、未分類 ） フミコラ・ニグレセンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）Ｏｍｖ ｉｋ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ８１９．７３ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、（族、未分類 ） シタリジウム・テルモフィリウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐ ｈｉｌｉｕｍ）（Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ Ｅｍｅｒｓｏｎ）Ａｕｓｔｗｉｃｋ 菌株の受け入れ番号：ＡＴＣＣ ２８０８５ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、（族、未分類 ） チエラヴィア・テルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ）Ｆｅｒｇｕｓ ｅｔ Ｓｉｎｄｅｎ（ｓｙｎ Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ ｔｈｅ ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ １７４．７０、ＩＭＩ １４５．１３６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ケトミアセエ （Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ） 単離源：マッシュルーム・コンポスト（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｃｏｍｐｏｓｔ） チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ） （Ａｐｐｉｎｉｓ）Ｍａｌｌｏｃｈ ｅｔ Ｃａｉｎ 菌株の受け入れ番号：ＮＲＲＬ ８１２６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ケトミアセエ （Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ） クラドリヌム・フェクンジシムム（Ｃｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍｆｏｅｃｕｎｄ ｉｓｓｉｍｕｍ）Ｓａｃｃａｒｄ ｅｔ Ｍａｒｃｈａｌ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６２３７３ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ラシオスフェ リアセエ（Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ） 単離源：セランジン（Ｓｅｌａｎｄｉｎ）種（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｃｅａｅ、Ａ ｓｔｅｒａｌｅｓ）の葉、ダラス山、ジャマイカ シスパストスポラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ ｂｏｎｉｎ ｅｎｓｉｓ） 菌株の受け入れ番号：ＮＫＢＣ １５１５（日本大学、ツバキ教授のコレクショ ン） 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、セラトストマ タセエ（Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍａｔａｃｅａｅ） ケトミウム・クニコロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｃｕｎｉｃｏｌｏｒｕｍ ）Ｆｕｃｋｅｌ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ７９９．８３ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ケトミアセエ （Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ） ケトミウム・ブラシリエンセ（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓ ｅ）Ｂａｔｉｓｔａ ｅｔ Ｐｏｔｕａｌ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ １２２．６５ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ケトミアセエ （Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ） ケトミウム・ムロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｍｕｒｏｒｕｍ）Ｃｏｒｄａ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ １６３．５２ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ケトミアセエ （Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ） ケトミウム・ヴィレスンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（ ｖｏｎ Ａｒｘ）Ｕｄａｇａｗａ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ５４７．７５ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ケトミアセエ （Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ） ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍ ｏｐｈｉｌａ）（Ａｐｉｎｉｓ）Ｏｏｒｓｃｈｏｔ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ １１７．６５ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ソルダリアレス（Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、ケトミアセエ （Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ） ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７２．９６ 単離源：アルトカルプス・アルチリス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ａｌｔｉｌｉｓ ）の葉、Ｍｏｒａｃｅａｅ、クリスチアナ、ジャマイカにおいて成長したウルチ カレス（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ） 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、トリコスファリアーレス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｈａｒｉａｌｅ ｓ）、（未分類の族） ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ． 単離源：ピナス・ユアンアネンシス（Ｐｉｎｕｓ ｙｕａｎｎａｎｅｎｓｉｓ） の葉、植物園、クニング、ユンナン 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、トリコスファリアーレス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｈａｒｉａｌｅ ｓ）、アビエタセエ（Ａｂｉｅｔａｃｅａｅ）、ピナレス（Ｐｉｎａｌｅｓ） ジアポルテ・シンゲネシア（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｙｎｇｅｎｅｓｉａ） 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７８．９６ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、ジアポルターレス（Ｄｉａｐｏｒｔｈａｌｅｓ）、バルサセ エ（Ｖａｌｓａｃｅａｅ） コレトトリクム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎ ａｒｉｕｍ）（Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ）Ｅｌｌｉｓ ｅｔ Ｈａｌｓｔｅｄ ｓｙ ｎ Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ ｖａｒ ｏｒｂｉｃｕｌａｒ ｅ Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ Ｗｉｎｓｔｅａｄ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ５２６０９ 分類：アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ピレノミセテス（Ｐｙｒｅｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）、フイラコラーレス（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｌｅｓ） エキシジア・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）Ｆｒ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７７．９６ 分類：バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ヒメノミセテス（Ｈｙ ｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アウリクラリアーレス（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｌ ｅｓ）、エキシジアセエ（Ｅｘｉｄｉａｃｅａｅ） クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）（Ａ ｌｂ．＆Ｓｃｈｗ．：Ｆｒ．）Ｍｕｒｒ 菌株の受託：受け入れ番号：ＣＢＳ ２８０．９６ 分類：バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ヒメノミセテス（Ｈｙ ｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アガリカーレス（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ） パネオラス・レチルギス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｒｅｔｉｒｕｇｉｓ）（Ｆｒ ．）Ｇｉｌｌ． 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ２７５．４７ 分類：バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ヒメノミセテス（Ｈｙ ｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アガリカーレス（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）、コプリ ナセエ（Ｃｏｐｒｉｎａｃｅａｅ） フォメス・フォメンタリウス（Ｆｏｍｅｓ ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）（Ｌ． ）Ｆｒ． 菌株の受託：受け入れ番号：ＣＢＳ ２７６．９６ 分類：バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ヒメノミセテス（Ｈｙ ｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アフイロフォラーレス（ Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）、フォミタセエ（Ｆｏｍｉｔａｃｅａｅ） スポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）ｓｐ． 菌株の受託：受け入れ番号：ＣＢＳ ２８３．９６ 分類：バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ヒメノミセテス（Ｈｙ ｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アフィロフォラーレス（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａ ｌｅｓ）、ブジェルカンデラセエ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａｃｅａｅ）（同定さ れ、１８Ｓ配列および相同性により分類学的に関係づけられた） トラメテス・サングイネア（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｓａｎｇｕｉｎｅａ）（Ｆｒ ．）Ｌｌｏｙｄ ｓｙｎ：Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ；Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（Ｌ．：Ｆｒ．）Ｍｕｒｒｉｌｌ 菌株の受け入れ番号：ＡＫＵ ５０６０（京都大学培養コレクション） 分類：バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、アフィロフォラーレス （Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）、ポリポラセエ（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａ ｅ） シゾフィラム・コンムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）Ｆ ｒ 菌株の受け入れ番号：ＡＴＣＣ ３８５４８ 分類：バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、アフィロフォラーレス （Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）、シゾフィラセエ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌ ｌａｃｅａｅ） リゾフィリクチス・ロセア（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ ｒｏｓｅａ）（ｄ ｅ Ｂａｒｙ ＆ Ｗｏｒ）Ｆｉｓｃｈｅｒ 菌株の受託：受け入れ番号：ＣＢＳ ２８２．９６ 分類：チトリジオミコタ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、チトリジオミセ テス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、スピゼロミセターレス（Ｓｐｉｚ ｅｌｌｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、スピゼロミセタセエ（Ｓｐｉｚｅｌｌｏｍｙｃ ｅｔａｃｅａｅ） リゾムコル・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）（Ｌｉｎ ｄｔ）Ｓｃｈｉｐｐｅｒ ｓｙｎ：Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ 菌株の受け入れ番号：ＩＦＯ ４５７８ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ４６８８３ 分類：ジゴミコタ（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅ ｔｅｓ）、ムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）、ムコラセエ（Ｍｕｃｏｒａｃ ｅａｅ） フィコミセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）（Ｋｕｎｚ ｅ）ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ ＆ Ｌｅ Ｍｏｎｎｉｅｒ 菌株の受け入れ番号：ＩＦＯ ４８１４ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ １６３２７ 分類：ジゴミコタ（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅ ｔｅｓ）、ムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）、ムコラセエ（Ｍｕｃｏｒａｃ ｅａｅ） ケトスチラム・フレセニイ（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ） ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍｕ ＆ Ｌｅ Ｍｏｎｎｉｅｒ ｓｙｎ．Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ 菌株の受け入れ番号：ＮＲＲＬ ２３０５ 分類：ジゴミコタ（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ジゴミセテス（Ｚｙ ｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）、タムニジアセエ （Ｔｈａｍｎｉｄｉａｃｅａｅ） 未分類： トリコテシウム・ロセウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ） 受け入れ番号：ＩＦＯ ５３７２ コニオセシウム（Ｃｏｎｉｏｔｈｅｃｉｕｍ）ｓｐ エンドフィテ（Ｅｎｄｐｈｙｔｅ）、中国、ヤンナン、クミングにおいて生育す る未同定の高等植物の葉から単離された。 未分類および未同定： 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７１．９６ 単離源：ジャマイカ、クリスチアナにおいて生育するアルトカルプス・アルチリ ス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ａｌｔｉｌｉｓ）（Ｍｏｒａｃｅａｅ、Ｕｒｔｉｃ ａｌｅｓ）の葉 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７３．９６ 単離源：ジャマイカ、ダラス山において生育するピメンタ・ジオイカ（Ｐｉｍｅ ｎｔａ ｄｉｏｉｃａ）（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ）の葉 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７０．９６ 単離源：ジャマイカ、ダラス山において生育するシュードカリンマ・アリアセウ ム（Ｐｓｅｕｄｏｃａｌｙｍｍａ ａｌｌｉａｃｅｕｍ（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅ ａｅ、Ｓｏｌａｎａｌｅｓの葉 他の菌株： 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１およびＤＨ１０Ｂ 酵母菌株：使用したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はＷ３１２４（ＭＡＴα； ｕｒａ ３−５２；ｌｅｕ ２−３、１１２；ｈｉｓ ３−Ｄ２００；ｐｅｐ ４−１１３７；ｐｒｃｌ：：ＨＩＳ３；ｐｒｂｌ：：ＬＥＵ２；ｃｉｒ＋）であ った。 プラスミド： アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現ベクターｐＨＤ４１４はプラス ミドｐ７７５（欧州特許（ＥＰ）第２３８，０２３号明細書に記載されている） の誘導体である。ｐＨＤ４１４の構築はＷＯ９３／１１２４９号にさらに記載さ れている。 ｐＹＥＳ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｐＡ２Ｃ４７７、ｐＡ２Ｃ１９３、ｐＡ２Ｃ３５７、ｐＡ２Ｃ３７１、ｐＡ２Ｃ ３８５、ｐＡ２Ｃ４７５、ｐＡ２Ｃ４８８、ｐＡ２Ｃ５０２（参照、実施例１、 ２、３および４）それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または１９に示 すＤＮＡ配列の単離： それぞれ、配列識別Ｎｏ．１、４、６、８、１０、１２、１６、または１９に 示すｃＤＮＡ配列を含んでなり、本発明のエンドグルカナーゼをコードする、全 長のＤＮＡ配列は、受託された生物、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７７０、ＤＳＭ １００８２、ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５ １２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１またはＤＳＭ １０５７６から 、この分野において知られている方法によりプラスミドＤＮＡを抽出することに よって得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ、ＮＹ）。本発明のセルラーゼの分子スクリーニング用ＰＣＲプライマー ４つの縮重デオキシイノシン含有オリゴヌクレオチドのプライマー（センス； ｓおよびアンチセンス；ａｓ１、ａｓ２およびａｓ３）は、チエラヴィア・テレ ストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）セルラーゼ、ミセリオ フトラ・テルモフィララム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｌｌｕｍ）セルラーゼ、およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ． からの２つのセルラーゼの推定されたアミノ酸配列の中に見出される４つの高度 に保存されたアミノ酸領域に相当する。残基はミセリオフトラ・テルモフィラム （Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）配列に従い番号 を付されている。デオキシイノシンはプライマー配列においてＩで描写され、そ して制限部位は下線が引かれている。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による分子スクリーニング：ゲノムＤＮＡおよび二本鎖ｃＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅 方向性をもつ二本鎖ｃＤＮＡを、後述するように、５μｇのポリ（Ａ）^-ＲＮ Ａから合成した。ゲノムＤＮＡをＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．に従い単離した。 ２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１００ｐｍｏｌの３つの組み合わせの各縮重プ ライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、 ５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン ）中で、ほぼ１０〜２０ｎｇの二本鎖セルラーゼ誘導ｃＤＮＡまたは１００〜２ ００ｎｇの真菌菌株の選択からのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した： １） センス、 ５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＩ^A／_CＧＩＴＡ^C／_TＴＧＧＧＡ^C／_TＴＧ^C／_TＴ Ｇ^C／_TＡＡ^A／_G ^A／_CＣ−３’； アンチセンス１、 ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡ^A／_GＣＡＩＧＣ^A／_GＣＡ^A／_GＣＡＣＣ−３’； または ２） センス、 ５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＩ^A／_CＧＩＴＡ^C／_TＴＧＧＧＡ^C／_TＴＧ^C／_TＴ Ｇ^C／_TＡＡ^A／_G ^A／_CＣ−３’； アンチセンス２、 ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＩＡ^A／_G／^TＩＣＣＩＡ^A／^C／^GＩＣＣＩＣＣＩＣＣＩ ＧＧ−３’；または ３） センス、 ５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＩ^A／_CＧＩＴＡ^C／_TＴＧＧＧＡ^C／_TＴＧ^C／_TＴ Ｇ^C／_TＡＡ^A／_G ^A／_CＣ−３’； アンチセンス３、 ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＩＡＡＣＣＡ^A／_GＴＣＡ^A／_G ^A／_TＡＩＣ^G／_TＣＣ− ３’； ＤＮＡサーマルサークラー（Ｌａｎｄｇｒａｆ、ドイツ国）および２．５単位 のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃｅｔｕｓ、米国）。下記 のサイクルプロフィルを使用して、３０サイクルのＰＣＲを実施した：変性、９ ４℃、１分；アニーリング、６４℃、２分；およびエクステンション、７２℃、 ３分。大きさマーカーとしてＨａｅＩＩＩ消化φＸ１７４ＲＦ ＤＮＡを使用す る３％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ、ＦＭＣ）中で電気泳動により、増幅生 成物の１０μｌのアリコートを分析した。 ＰＣＲ生成物の直接配列決定。製造業者の使用説明書に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を使用して、ＰＣＲ生成物の８０μ ｌのアリコートを精製した。５０〜１５０ｎｇの鋳型、Ｔａｑデオキシ−末端の サイクル配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、米国）、蛍光標識化ター ミネーターおよび５ｐｍｏｌのセンスプライマー：５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴ ＡＣＩ^A／_CＧＩＴＡ^C／_TＴＧＧＧＡ^C／_TＴＧ^C／_TＴＧ^C／_TＡＡ^A／_G ^A／_CＣ−３’ を使用して、ジデオキシ連鎖停止法により、精製されたＰＣＲ生成物について、 増幅されたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を直接決定した。配列のデータの分析 をＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．に従い実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるクローニング ：ＰＣＲ断片のサブクローニング 前述したように発生させたＰＣＲ生成物の２５μｌのアリコート を、０．８％の低いゲル化温度のアガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧ、Ｆ ＭＣ）ゲル中で電気泳動させ、関係する断片をゲルから切除し、０．１体積の１ ０×アガラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および２単 位／１００μｌの溶融アガロースを試料に添加し、次いで４５℃において１．５ 時間インキュベートすることによって、アガラーゼ処理により回収した。試料を フェノールおよびクロロホルム抽出し、２体積の９６％のＥｔＯＨおよび０．１ 体積の３ＭのＮａＡｃ、ｐＨ５．２の添加により沈降させた。ＰＣＲ断片を遠心 により回収し、７０％のＥｔＯＨ中で洗浄し、乾燥し、そして２０μｌの制限酵 素の緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭの ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁させた。断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ ｂａＩで消化し、フェノールおよびクロロホルム抽出し、２体積の９６％のＥｔ ＯＨおよび０．１体積の３ＭのＮａＡｃ、ｐＨ５．２で沈降させることによって 回収し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断ｐＹＥＳ２．０ベクター中にサブ クローニングした。 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよび陽性クローンの特性決定。プロ ーブとして対応するランダムプライムド（ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓ ｔｅｉｎ）³²Ｐ標識化（＞１×１０⁹ｃｐｍ／μｇ）ＰＣＲ生成物を使用して、 コロニーハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）により、後述 するように構築された、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング した。ハイブリダイゼーションを２×ＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）、 ５×デンハルト溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）、０．５％（ｗ／ｖ）のＳ ＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡ中で６５℃において２０時 間実施し、５ ×ＳＳＣ中で２５℃において（２×１５分）、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ中 で６５℃において（３０分）、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ中で６５℃に おいて（３０分）そして５×ＳＳＣ（２×１５分）中で２５℃において洗浄した 。ｃＤＮＡインサートの末端をｐＹＥＳ２．０ポリリンカープライマー（Ｉｎｖ ｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で配列決定し、そして蛍光標識化ターミネーターを使用 してジデオキシ連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）により双方の鎖から 最長のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することによって、陽性ｃＤＮＡクロ ーンを特性決定した。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオシステム ス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ自動配列決定装置を使用 して、Ｔａｑデオキシ末端サイクル配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ 、米国）およびｐＹＥＳ２．０ポリリンカープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 、米国）または合成オリゴヌクレオチドのプライマーで、キアゲン（Ｑｉａｇｅ ｎ）精製プラスミドＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を配列決定した。配列データ の分析をＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．に従い実施した。 全体のＲＮＡの抽出をチオシアン酸グアニジニウムおよび引き続いて５．７Ｍ のＣｓＣｌクッションを通す超遠心により実施し、そしてポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの 単離 をＷＯ９４／１４９５３号明細書に記載されている手順を使用するオリゴ（ ｄＴ）−セルロースアフィニティークロマトグラフィーにより実施した。 ｃＤＮＡ合成：５μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから、ＲＮアーゼＨ法（Ｇｕｂｌ ｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９、（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ ｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ ｌ ａｂ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）により、Ｆ．Ｓ．Ｈａ ｇｅｎ（ｐｅｒｓ．ｃｏｍｍ．）が開発したヘアーピン変性を使用して、二本鎖 ｃＤＮＡを合成した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（５μｌのＤＥＰＣ処理した水中の５ μｇ）を前シリコン化ＲＮアーゼ不含エッペンドルフ管中で７０℃に８分間加熱 し、氷上で急冷し、５０μｌの最終体積において、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ およびｄｔｔｐおよび０．５ｍＭの５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）、４０単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（ＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏ ｍｅｇａ）、１．４５μｇのオリゴ（ｄＴ）₁₈−Ｎｏｔ Ｉプライマー（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）および１０００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮアー ゼＨ逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅ ｓ）を含有する逆転写酵素緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．３、７ ５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＤＴＴ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）と一緒にした。反応混合物を４５ ℃において１時間インキュベートすることによって、第１鎖ｃＤＮＡを合成した 。合成後、ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド混合物を製造業者の使用説明書に従 いミクロスピン（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ）Ｓ−４００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 回転カラムに通してゲル濾過した。 ゲル濾過後、ハイブリッドを２５０μｌの第２鎖緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ −Ｃｌ、ｐＨ７．４、９０ｍＭのＫＣｌ、４．６ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭの （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１６ｍＭのβＮＡＤ＋）［２００μＭの各ｄＮＴＰ、６ ０単位の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 、５．２５単位のＲＮアーゼＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１５単位の大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ）を含有する］中で希釈した。反応管を１６℃において２時間インキュ ベートし、２５℃においてさらに１５分間インキュベートすることによって、第 ２鎖のｃＤＮＡの合成を実施した。ＥＤＴＡを２０ｍＭの最終濃度に添加するこ とによって反応を停止させ、次いでフェノールおよびクロロホルム抽出した。 ヤエナリヌクレアーゼ処理：二本鎖ｃＤＮＡを−２０℃において１２時間２体 積の９６％ＥｔＯＨ、０．２体積の１０ＭのＮＨ₄Ａｃの添加により沈降させ、 遠心により回収し、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥し、３０μｌのヤエナリヌク レアーゼ緩衝液（３０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．６、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ ｍＭのＺｎＳＯ₄、０．３５ｍＭのＤＴＴ、２％のグリセロール）［２５単位の ヤエナリヌクレアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有する］中に再懸濁させた。 反応混合物を３０℃において３０分間インキュベートすることによって、一本鎖 ヘアーピンＤＮＡを切り取り、次いで７０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐ Ｈ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡを添加し、フェノール抽出し、氷上で２体積の９６ ％のＥｔＯＨおよび０．１体積の３ＭのＮａＡｃ、ｐＨ５．２で３０分間沈降さ せた。 Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用する平滑末端の形成：二本鎖ｃＤＮＡを遠心に より回収し、そして３０μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（２０ｍＭのＴｒ ｉｓ−アセテート、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＡｃ、５０ｍＭのＫＡｃ、１ｍ ＭのＤＴＴ）［０．５ｍＭの各ｄＮＴＰおよび５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する］中で反応混合物を１ ６℃において１時間インキュベートすることによって平滑末端を形成した。ＥＤ ＴＡを２０ｍＭの最終濃度に添加することによって反応を停止させ、次いでフェ ノールおよびクロロホルム抽出し、そし て−２０℃において２体積の９６％のＥｔＯＨおよび０．１体積の３ＭのＮａＡ ｃ、ｐＨ５．２の添加により１２時間沈降させた。 アダプターの結合、ＮｏｔＩ消化および大きさの選択：充填反応後、ｃＤＮＡ を遠心により回収し、７０％のＥｔＯＨ中で洗浄し、乾燥した。ｃＤＮＡのペレ ットを２５μｌの結合緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．８、１０ｍ ＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）［２．５μｇの非パ リンドロームＢｓｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および３０単位の Ｔ４リガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する］中に再懸濁させ、そして１６℃に おいて１２時間インキュベートした。６５℃に２０分間加熱することによって、 反応を停止させ、次いで氷上で５分間冷却した。アダプター結合ｃＤＮＡを２０ μｌの水、５μｌの１０×制限酵素緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ ａｂｓ）および５０単位のＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）の添加によりＮｏｔＩ制限酵素で消化し、次いで３７℃において２．５時間イ ンキュベートした。６５℃に１０分間加熱することによって、反応を停止させた 。ｃＤＮＡを１×ＴＢＥ中で０．８％のシープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）Ｇ ＴＧ低融点アガロースゲル（ＦＭＣ）上の電気泳動により大きさ分画して、非結 合ａｄｐｒおよび小さいｃＤＮＡを分離した。ｃＤＮＡを０．７ｋｂのカットオ フで大きさ選択し、製造業者の使用説明書に従いβ−アガラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の使用によりゲルからレスキューし、そして−２ ０℃において２体積の９６％のＥｔＯＨおよび０．１体積の３ＭのＮａＡｃ、ｐ Ｈ５．２の添加により沈降させた。 ライブラリーの構築：方向性をもつ、大きさ選択したｃＤＮＡを遠心により回 収し、７０％のＥｔＯＨ中で洗浄し、そして３０μｌ の１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁させた 。ｃＤＮＡを製造業者の使用説明書に従いミクロスピン（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ） Ｓ−３００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）回転カラムを通すゲル濾過により脱塩し た。３回の試験的結合を１０μｌの結合緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐ Ｈ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）［ ５μｌの二本鎖ｃＤＮＡ（反応管＃１および＃２）、１５単位のＴ４リガーゼ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）および３０ｎｇ（管＃１）、４０ｎｇ（管＃２）および４０ｎ ｇ（管＃３、ベクターのバックグラウンドの対照）のＢｓｔＸＩ−ＮｏｔＩ切断 ｐＹＥＳ２．０ベクターを含有する］中で実施した。結合反応を１６℃における １２時間のインキュベーションにより実施し、７０℃に２０分間加熱し、そして 各管に１０μｌの水を添加した。１μｌの各結合混合物を下記の文献に記載され ているように４０μｌのエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１ ０Ｂ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）の中に エレクトロポレーションした：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ。最適な条件を使用して、プールから成るライブラリーを 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で確立した。形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） をＬＢ＋アンピシリン寒天プレート上に広げて、３７℃において２４時間インキ ュベーションした後、１５．０００〜３０．０００コロニー／プレートを与える ことによって、各をプールを作った。２０ｍｌのＬＢ＋アンピシリンをプレート に添加し、そして細胞をここにおいて懸濁させた。細胞懸濁液を５０ｍｌの管中 で３７℃において１時間震盪した。プラ スミドＤＮＡを製造業者の使用説明書に従いＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを使 用して細胞から単離し、そして−２０℃において貯蔵した。 個々のプールから精製されたプラスミドＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）の１μｌ のアリコートをエレクトロポレーション（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒａｎｔｅ （１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２−１８７）によ りサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３１２４の中に 形質転換し、形質転換体を２％のグルコースを含有するＳＣ寒天上でプレートし 、そして３０℃においてインキュベートした。 陽性コロニーの同定：３〜５日間の増殖後、０．１％のＡＺＣＬ ＨＥセルロ ースを含有する１組のＳＣ＋ガラクトース−ウラシルプレート上に、寒天プレー トをレプリカプレートした。これらのプレートを３０℃において３〜７日間イン キュベートした。エンドグルカナーゼ陽性コロニーは、青色ハローにより取り囲 まれたコロニーとして同定された。 酵素陽性コロニーからの細胞を単一コロニーの単離について寒天上に広げ、そ して同定されたエンドグルカナーゼ産生コロニーの各々について、酵素を産生す る単一コロニーを選択した。 陽性コロニーの特性決定：陽性コロニーが単一コロニーとして得られ、ビオチ ニル化ポリリンカーのプライマーを使用して、ｃＤＮＡインサートを酵母コロニ ーから直接増幅し、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ Ｍ−２８０、Ｄｙｎａｌ） システムにより精製し、鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３−５４６７ ）およびセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）システム（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａ ｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して、各ｃＤ ＮＡクローンの５’末端を配列決定することによって、個々に特性決定した。 蛍光標識化ターミネーターを使用してジデオキシ連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）により、双方の鎖から最長のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定 した。後述するように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中への形質転換によりプラス ミドＤＮＡをレスキューした。製造業者の使用説明書に従いアプライド・バイオ システムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ自動配列決定装 置を使用して、Ｔａｑデオキシ末端サイクル配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ ｌｍｅｒ、米国）およびｐＹＥＳ２．０ポリリンカープライマー（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ、米国）または合成オリゴヌクレオチドのプライマーで、キアゲン（Ｑ ｉａｇｅｎ）精製プラスミドＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を配列決定した。配 列データの分析をＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．に従い実施した。 アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中の発現のためのｃＤＮＡ遺伝子 の単離 ：エンドグルカナーゼ産生酵母コロニーを、５０ｍｌのガラス試験管中の ２０ｍｌのＹＰＤブロスの中に接種した。試験管を３０℃において２日間震盪し た。細胞を３０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心することによって収獲した。 ＤＮＡをＷＯ９４／１４９５３号に従い単離し、５０μｌの水中に溶解した。 ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に標準的手順により形質転換した。プラス ミドＤＮＡを標準的手順により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離し、制限酵素分 析により精製した。ｃＤＮＡインサートを適当な制限酵素で切除し、アスペルギ ルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現ベクターの中に結合した。アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアス ペギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇ ｅｒ）の形質転換 プロトプラストは、ＷＯ９５／０２０４３号明細書、第１６ページ、第２１行 〜第１７ページ、第１２行（これは引用することによって本明細書の一部とされ る）に記載されている手順により調製することができる。 １００μｇのプロトプラスト懸濁液を、１０μｌのＳＴＣ（１．２Ｍのソルビ トール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ₂） 中の５〜２５μｇの適当なＤＮＡと混合する。プロトプラストをｐ３ＳＲ２（ア スペルギルス・ニヅランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子を有するプ ラスミド）と混合する。この混合物を室温において２５分間放置した。０．２ｍ ｌの６０％のＰＥＧ４０００（ＢＤＨ ２９５７６）、１０ｍＭのＣａＣｌ₂お よび１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加し、注意して混合（２回） し、最後に０．８５ｍｌの同一溶液を添加し、注意して混合する。この混合物を 室温において２５分間放置し、２５００ｇにおいて１５分間回転し、そしてペレ ットを２ｍｌの１．２Ｍのソルビトール中に再懸濁させる。さらに１つの沈降後 、プロトプラストを最小プレート（Ｃｏｖｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ．Ａｃｔａ １１３（１９６６）５１−５６）（１．０Ｍのスクロース、ｐＨ７ ．０、窒素源として１０ｍＭのアセトアミドおよび２０ｍＭのＣｓＣｌを含有す る）上に広げてバックグラウンドの増殖を阻害する。３７℃において４〜７日間 インキュベートした後、胞子を取り上げ、単一コロニーのために広げる。この手 順を反復し、そして第２再単離後の単一コロニーの胞子を規定した形質転換体と して貯蔵する。アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）形質転換体の試験 形質転換体の各々を１０ｍｌのＹＰＭの中に接種し、増殖させた 。３７℃において２〜５日間インキュベートした後、１０ｍｌの上清を取り出し た。エンドグルカナーゼ活性を前述したようにＡＺＣＬ ＨＥセルロースにより 同定した。ハイブリダイゼーションの条件 （本発明のＤＮＡ構築物の性質ｉｉ）の評価にお いて使用すべき）： ヌクレオチドのプローブと相同ＤＮＡまたはＲＮＡ配列との間のハイブリダイ ゼーションを決定するために適当な条件は、ＤＮＡ断片またはＲＮＡを含有する フィルターを１０分間５×ＳＳＣ（標準的生理食塩水クエン酸塩）中で前ソーキ ングしてハイブリダイゼーションさせ、フィルターを５×ＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、５×デンハルト溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅ ｔ ａｌ．、１９８９）、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性し超 音波処理したサケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）の 溶液中の前ハイブリダイゼーションし、次いでランダムプライムド（Ｆｅｉｎｂ ｅｒｇ、Ａ．Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ｂ．（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３）、³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識化（比活性＞１×１０⁹ ｃｐｍ／μｇ）プローブを含有する同一溶液中で抗体４５℃において１２時間 ハイブリダイゼーションすることを包含する。次いでフィルターを２×ＳＳＣ、 ０．５％のＳＤＳ中で好ましくは５０℃以下、より好ましくは５５℃以下、より 好ましくは６０℃以下、より好ましくは６５℃以下、なおより好ましくは７０℃ 以下、ことに７５℃以下において２回３０分間洗浄する。ハイブリダイゼーショ ンにおいて使用すべきヌクレオチドのプローブは、それぞれ、配列識別Ｎｏ．１ 、４、６、８、１０、１２、または１６ＤＮＡ配列、および／または、それぞれ 、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＤＳＭ ９７７ ０、ＤＳＭ １００８２、 ＤＳＭ １００８０、ＤＳＭ １００８１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２、ＤＳＭ １０５１１、ＤＳＭ １０５７１、またはＤＳＭ １０５ ７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列のエンドグルカナーゼをコ ードする部分に対応するＤＮＡ配列である。 免疫学的交差反応性：免疫学的交差反応性を決定するとき使用する抗体は、精 製されたセルラーゼを使用して調製することができる。さらに詳しくは、下記の 文献に記載されている手順に従い、ウサギ（または他の齧歯類）を免疫化するこ とによって、本発明のセルラーゼに対する抗血清を発生させることができる：Ｎ ．Ａｘｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａ ｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ 、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７３、Ｃｈａｐｔｅ ｒ ２３、またはＡ．ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＲ．Ｔｈｏｒｐｅ、Ｉｍｍｕｎ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８２（さらに詳しくは、ｐｐ ．２７−３１）。精製された免疫グロブリンは、抗血清から、例えば、塩沈降（ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）、次いで透析およびイオン交換クロマトグラフィー、例えば 、ＤＥＡＥ−セファデックスのクロマトグラフィーにより得ることができる。タ ンパク質の免疫化学的特性決定は、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙの二重拡散分析（Ｏ ．Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ）編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９６７、ｐｐ．６５５−７ ０６）により、交差免疫電気泳動（Ｎ．Ａｘｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、前掲、 Ｃｈａｐｔｅｒ ３およ び４）により、またはロケット免疫電気泳動（Ｎ．Ａｘｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ ．、前掲、Ｃｈａｐｔｅｒ ２）により実施することができる。 培地 ＹＰＤ：１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン、９００ｍｌとする量のＨ₂ Ｏ。オートクレーブ処理し、１００ｍｌの２０％のグルコース（滅菌濾過した） を添加した。 ＹＰＭ：１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン、９００ｍｌとする量のＨ₂ Ｏ。オートクレーブ処理し、１００ｍｌの２０％のマルトデキストリン（滅菌濾 過した）を添加した。 １０×基礎塩：７５ｇの酵母窒素塩基、１１３ｇのコハク酸、６８ｇのＮａＯ Ｈ、１０００ｍｌとする量のＨ₂Ｏ、滅菌濾過した。 ＳＣ−ＵＲＡ：１００ｍｌの１０×基礎塩、２８ｍｌの２０％のカサアミノ酸 酸（ビタミンを含まない）、１０ｍｌの１％のトリプトファン、９００ｍｌとす る量のＨ₂Ｏ、オートクレーブ処理し、３．６ｍｌの５％のスレオニンおよび１ ００ｍｌの２０％のグルコースまたは２０％のガラクトースを添加した。 ＦＣ−ＵＲＡ寒天：ＳＣ−ＵＲＡ、２０ｇ／ｌの寒天を添加した。 ＦＤ寒天：３９ｇのジャガイモデキストロース寒天、ＤＩＦＣＯ ００１３； 脱イオン水を１００ｍｌに添加する；オートクレーブ処理（１２１℃、１５〜２ ０分間）。 ＰＣ寒天：ジャガイモおよびニンジン（粉砕、２０ｇの各々）および水（１０ ００ｍｌに添加した）を１時間沸騰させる；寒天（２０ｇ／ｌのＭｅｒｃｋ １ ６１４）；オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）。 ＰＣ液状ブロス：ＰＣ寒天に類似するが、寒天を含まない。 ＰＤ液状ブロス：２４ｇのジャガイモデキストロースブロス、Ｄｉｆｃｏ ０ ５４９、脱イオン水を１０００ｍｌに添加する；オートクレーブ処理（１２１℃ 、１５〜２０分間）。 ＰＣおよびＰＤ液状ブロス、セルロースを含む：３０ｇのソルカフロク（Ｓｏ ｌｃａｆｌｏｃ）（Ｄｉｃａｌｉｔｅ−Ｅｕｒｏｐｅ−Ｎｏｒｄ、９０００ Ｇ ｅｎｔ、ベルキー国、から入手可能なＤｉｃａｃｅｌ）／１０００ｍｌ。 ＰＢ−９液状ブロス：１２ｇのロフェク（Ｒｏｆｅｃ）（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ １０１−０４４１）および２４ｇのグルコースを１０００ｍｌの水に添加する； ｐＨを５．５に調節する；５ｍｌの鉱油および５ｇのＣａＣＯ₃を添加する／１ ０００ｍｌ。オートクレーブ処理（１２１℃、４０分）。 ＹＰＧ液状ブロス：４ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ ０１２７）、１ｇのＫＨ₂ ＰＯ₄（Ｍｅｒｃｋ ４８７３）、０．５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（Ｍｅｒｃｋ ５８８６）、１５ｇのデキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ １０１−０４４１ ）、０．１ｍｌのプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（１０１−３０８８）；１ ０００ｍｌまでの脱イオン水；オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）。 希薄塩溶液（ＤＳ）：２つの貯蔵液を調製する： Ｐ−貯蔵液：１３．６１ｇのＫＨ₂ＰＯ₄；１３．２１ｇの（ＮＨ₄）₂ＰＯ₄、１ ７．２４ｇのＫＨ₂ＰＯ₄；１００ｍｌまでの脱イオン水。 Ｃａ／Ｍｇ貯蔵液：７．３５ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、１０．１７ｇのＭｇＣｌ₂ ・６Ｈ₂Ｏ、１００ｍｌまでの脱イオン水；ｐＨを７．０に調節した；オートク レーブ処理（１２１℃、２０分）。０．５ｍｌのＰ−貯蔵液を０．１ｍｌのＣａ ／Ｍｇ貯蔵液と混合する、１０００ｍｌまで脱イオン水を添加する。 ＡＺＣＬ ＨＥセルロース（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、オースラリア国） 使用 洗濯および摩耗の間に、染色された布帛または被服からの染料は通常布帛から ブリードし、次いで布帛は退色および摩耗して見える。布帛から表面繊維が除去 されると、布帛はそのもとの色および外観を部分的に回復する。用語「色清浄化 （ｃｏｌｏｕｒ ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とは、本明細書において使用す るとき、多数回の洗濯サイクルを通して布帛または被服の初期の色を部分的に回 復すること意味する。 用語「デピリング（ｄｅ−ｐｉｌｌｉｎｇ）」は、布帛表面からのピル（毛玉 ）の除去を意味する。 用語「ソーキング液」は、慣用の洗濯プロセスに付す前に、洗濯物を浸漬でき る水性液体を意味する。ソーキング液は、洗濯または洗濯プロセスにおいて普通 に使用される１種または２種以上の成分を含有することができる。 用語「洗濯液」は、洗濯物を洗濯プロセス、すなわち、通常手によるか、また は洗濯機における組み合わされた化学的または機械的作用に付すために使用する 水性液体を意味する。通常、洗濯液は粉末状または液状の洗剤組成物の水溶液で ある。 用語「すすぎ液」は、通常洗濯プロセスに付した直後に、洗濯物を浸漬および 処理して、洗濯物をすすぐ、すなわち、洗濯物から洗剤溶液を本質的に除去する ために使用する水性液を意味する。すすぎ液は布帛のコンディショニング組成物 または柔軟組成物を含有することができる。 本発明の方法に付される洗濯物は、普通の洗濯可能な洗濯物であることができ る。好ましくは、洗濯物の主要な部分は縫製または未 縫製の布帛であり、綿、綿ブレンドまたは天然または人造セルロース（例えば、 キシラン含有セルロース繊維、例えば、木材パルプから由来する）またはそれら のブレンドから作られた編物、織物、デニム、糸、およびタオルを包含する。ブ レンドの例は、綿またはレーヨン／ビスコースと１種または２種以上のコンパニ オン材料、例えば、羊毛、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、 ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化 ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）、およびセ ルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻／リネン、ジ ュート、セルロースアセテート繊維、リオセル（ｌｙｏｃｅｌｌ））とのブレン ドである。 洗剤組成物 本発明の１つの面によれば、本発明のエンドグルカナーゼは典型的には洗剤組 成物の成分であることができる。それら自体、エンドグルカナーゼは非ダスチン グ粒子、安定化された液体、または保護された酵素の形態で洗剤組成物の中に含 めることができる。非ダスチング粒子は、例えば、米国特許第４，１０６，９９ １号および米国特許第４，６６１，４５２号明細書（双方共、Ｎｏｖｏ Ｉｎｄ ｕｓｔｒｉｅｓ Ａ／Ｓ）に開示されているように製造することができ、そして 必要に応じてこの分野において知られている方法によりコーティングすることが できる。ワックス状コーティング材料の例は下記の通りである：ポリ（エチレン オキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、平均分子量１０００〜２ ００００；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノ ール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有しかつ１５〜８０エチレンオ キシド単位が存在する、エトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂 肪酸；および脂肪酸のモノ−およびジ− およびトリグリセリド。流動床技術により用途に適するフィルム形成コーティン グ材料の例は、英国特許第１，４８３，５９１号明細書に記載されている。液状 酵素調製物は、例えば、ポリオール、例えば、プロピレングリコール、糖または 糖アルコール、乳酸またはホウ酸を確立された方法に従い添加することによって 安定化することができる。保護された酵素は、欧州特許（ＥＰ）第２３８，２１ ６号明細書に開示されている方法に従い製造することができる。 本発明の洗剤組成物は、任意の慣用の形態、例えば、粉末、粒子、ペーストま たは液体であることができる。液状洗剤は水性であり、典型的には７０％までの 水および０〜３０％の溶媒を含有するか、または非水性であることができる。 洗剤組成物は１種または２種以上の界面活性剤を含んでなり、界面活性剤の各 々はアニオン、非イオン、カチオン、および双性イオンの界面活性剤であること ができる。洗剤は通常０〜５０％のアニオン界面活性剤、例えば、線状アルキル ベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、アルファ−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ ）、アルキルサルフェート（脂肪族アルコールサルフェート）（ＡＳ）、アルコ ールエトキシサルフェート（ＡＥＯＳまたはＡＥＳ）、第二級アルカンスルホネ ート（ＳＡＳ）、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−またはア ルケニルコハク酸、またはセッケンを含有するであろう。それは、また、０〜４ ０％の非イオン界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート（ＡＥＯまたは ＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシ レート、アルキルポリグルコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ ル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒ ドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、ＷＯ９２／０６１５４号明細書に記載 されているような）を含有 することができる。 洗剤組成物は、さらに、１種または２種以上の酵素、例えば、アミラーゼ、リ パーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、およびオキシダーゼ、 例えば、ラッカーゼを含んでなることができる。 洗剤は、１〜６５％の洗浄ビルダーまたは錯化剤、例えば、ゼオライト、ジホ スフェート、トリホスフェート、ホスホネート、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ 酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル−またはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩ま たは層状ケイ酸塩（例えば、ＳＫＳ−６、Ｈｏｅｃｈｓｔ）を含有することがで きる。洗剤は、また、アンビルトである、すなわち、洗浄ビルダーを本質的に含 まないことができる。 洗剤は１種または２種以上のポリマーを含むことができる。例はカルボキシメ チルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレ ングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキ レート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよび ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。 洗剤は漂白系を含有することができ、漂白系はＨ₂Ｏ₂源、例えば、過ホウ酸塩 または過炭酸塩を含んでなることができ、これらは過酸生成漂白活性化剤、例え ば、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）またはノナノイルオキシベン ゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）と組み合わせることができる。また、漂白系は、 例えば、アミド、イミド、またはスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる 。 本発明の洗剤組成物の酵素は、慣用安定剤、例えば、ポリオール 、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、 乳酸またはホウ酸、またはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸塩エステルを使 用して安定化することができ、そして組成物は、例えば、ＷＯ９２／１９７０９ 号およびＷＯ９２／１９７０８号明細書に記載されているように配合することが できる。 洗剤は、また、他の慣用の洗剤成分、例えば、布帛コンディショナー、例えば 、粘土、泡増強剤、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、染 料、殺菌剤、蛍光増白剤、または香料を含有することができる。 ｐＨ（水溶液中で使用濃度において測定する）は、通常、中性またはアルカリ 性、例えば、７〜１１の範囲であろう。 本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態は、下記のものを包含する： １）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する粒子と して配合された洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） ７〜１２％ アルコールエトキシサルフェート（例えば、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈ アルコール、１〜２ＥＯ）またはアルキルサルフェート （例えば、Ｃ_16-18） １〜４％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_14-15 アルコール、７ＥＯ） ５〜９％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） １４〜２０％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） ２〜６％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） １５〜２２％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ０〜６％ クエン酸ナトリウム／クエン酸 （Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃Ｏ₇／Ｃ₆Ｈ₈Ｏ₇として） ０〜１５％ 過ホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ₃・Ｈ₂Ｏとして） １１〜１８％ ＴＡＥＤ ２〜６％ カルボキシメチルセルロース ０〜２％ ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸 コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ） ０〜３％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、 光漂白剤） ０〜５％ ２）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する粒子と して配合された洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） ６〜１１％ アルコールエトキシサルフェート（例えば、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈ アルコール、１〜２ＥＯ）またはアルキルサルフェート （例えば、Ｃ_16-18） １〜３％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_14-15 アルコール、７ＥＯ） ５〜９％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） １５〜２１％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） １〜４％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） ２４〜３４％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ４〜１０％ クエン酸ナトリウム／クエン酸 （Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃Ｏ₇／Ｃ₆Ｈ₈Ｏ₇として） ０〜１５％ カルボキシメチルセルロース ０〜２％ ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸 コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ） １〜６％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、泡抑制剤、香料） ０〜５％ ３）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する粒子と して配合された洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） ５〜９％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_12-15 アルコール、７ＥＯ） ７〜１４％ 脂肪酸としてセッケン（例えば、Ｃ_16-22脂肪酸） １〜３％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） １０〜１７％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） ３〜９％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） ２３〜３３％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ０〜４％ 過ホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ₃・Ｈ₂Ｏとして） ８〜１６％ ＴＡＥＤ ２〜８％ ホスホン酸塩（例えば、ＥＤＴＭＰＡ） ０〜１％ カルボキシメチルセルロース ０〜２％ ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸 コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ） ０〜３％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤） ０〜５％ ４）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する粒子と して配合された洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） ８〜１２％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_12-15 アルコール、７ＥＯ） １０〜２５％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） １４〜２２％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） １〜５％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） ２５〜３５％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ０〜１０％ カルボキシメチルセルロース ０〜２％ ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸 コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ） ０〜３％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、泡抑制剤、香料） ０〜５％ ５）下記の成分を含んでなる液状洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） １５〜２１％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_12-15 アルコール、７ＥＯまたはＣ_12-15アルコール、５ＥＯ） １２〜１８％ 脂肪酸としてセッケン（例えば、オレイン酸） ３〜１３％ アルケニルコハク酸（Ｃ_12-14） ０〜１３％ アミノフェノール ８〜１８％ クエン酸 ２〜８％ ホスホン酸塩 ０〜３％ ポリマー（例えば、ＰＶＰ）ＰＥＧ） ０〜３％ ホウ酸塩（Ｂ₄Ｏ₇として） ０〜２％ エタノール ０〜３％ ポリエチレングリコール ８〜１４％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、 蛍光増白剤） ０〜５％ ６）下記の成分を含んでなる構造化液状洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） １５〜２１％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_12-15 アルコール、７ＥＯまたはＣ_12-15アルコール、５ＥＯ） ３〜９％ 脂肪酸としてセッケン（例えば、オレイン酸） ３〜１０％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） １４〜２２％ クエン酸カリウム ９〜１８％ ホウ酸塩（Ｂ₄Ｏ₇として） ０〜２％ カルボキシメチルセルロース ０〜２％ ポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ） ０〜３％ 定着ポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／ アクリル酸コポリマー；モル比２５：１； 分子量３８００ ０〜３％ グリセロール ０〜５％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、 蛍光増白剤） ０〜５％ ７）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する粒子と して配合された洗剤組成物： 脂肪族アルコールサルフェート ５〜１０％ エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド ３〜９％ 脂肪酸としてセッケン ０〜３％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） ５〜１０％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） １〜４％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） ２０〜４０％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ２〜８％ 過ホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ₃・Ｈ₂Ｏ） １２〜１８％ ＴＡＥＤ ２〜７％ ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸 コポリマー、ＰＥＧ） １〜５％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、蛍光増白剤、泡抑制剤、香料） ０〜５％ ８）下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） ８〜１４％ エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド ５〜１１％ 脂肪酸としてセッケン ０〜３％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） ４〜１０％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ、２ＳｉＯ₂） １〜４％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） ３０〜５０％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ３〜１１％ クエン酸ナトリウム（Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃Ｏ₇として） ５〜１２％ ポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸 コポリマー、ＰＥＧ） １〜５％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、泡抑制剤、香料） ０〜５％ ９）下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） ６〜１２％ 非イオン界面活性剤 １〜４％ 脂肪酸としてセッケン ２〜６％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） １４〜２２％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） １８〜３２％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ５〜２０％ クエン酸ナトリウム（Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃Ｏ₇として） ３〜８％ 過ホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ₃・Ｈ₂Ｏとして） ４〜９％ 漂白活性化剤（例えば、ＮＯＢＳまたはＴＡＥＤ） １〜５％ カルボキシメチルセルロース ０〜２％ ポリマー（例えば、ポリカルボキレートまたはＰＥＧ） １〜５％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、蛍光増白剤、香料） ０〜５％ １０）下記の成分を含んでなる液状洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） １５〜２３％ アルコールエトキシサルフェート（例えば、Ｃ_12-15 アルコール、２〜３ＥＯ） ８〜１５％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_12-15 アルコール、７ＥＯまたはＣ_12-15アルコール、５ＥＯ） ３〜９％ 脂肪酸としてセッケン（例えば、ラウリン酸） ０〜３％ アミノエタノール １〜５％ クエン酸ナトリウム ５〜１０％ ハイドロトロープ（例えば、ナトリウムトルエン スルホン酸） ２〜６％ ホウ酸塩（Ｂ₄Ｏ₇として） ０〜２％ カルボキシメチルセルロース ０〜１％ エタノール １〜３％ ポリプロピレングリコール ２〜５％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、ポリマー、分散剤、香料、 蛍光増白剤） ０〜５％ １１）下記の成分を含んでなる液状洗剤組成物： 線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算） ２０〜３２％ アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ_12-15 アルコール、７ＥＯまたはＣ_12-15アルコール、５ＥＯ） ６〜１２％ アミノエタノール ２〜６％ クエン酸 ８〜１４％ ホウ酸塩（Ｂ₄Ｏ₇として） １〜３％ ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸 コポリマー、定着ポリマー、例えば、ラウリル メタクリレート／アクリル酸コポリマー ０〜３％ グリセロール ３〜８％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、ハイドロトロープ、分散剤、香料、 蛍光増白剤） ０〜５％ １２）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する粒子 として配合された洗剤組成物： アニオン界面活性剤（脂肪族アルコールサルフェート、 アルキルサルフェート、α−オレフィンスルホネート、 α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカン スルホネート、セッケン） ２５〜４０％ 非イオン界面活性剤（例えば、アルコール エトキシレート） １〜１０％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） ８〜２５％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） ５〜１５％ 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄として） ０〜５％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） １５〜２８％ 過ホウ酸ナトリウム（ＮａＢＯ₃・４Ｈ₂Ｏ） ０〜２０％ 漂白活性化剤（ＴＡＥＤまたはＮＯＢＳ） ０〜５％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、香料、蛍光増白剤） ０〜３％ １３）線状アルキルベンゼンスルホネートのすべてまたは一部分が（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈ ）アルキルサルフェートで置換されている、１）〜１２）に記載するような洗 剤配合物。 １４）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する粒子 として配合された洗剤組成物： （Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）アルキルサルフェート ９〜１５％ アルコールエトキシレート ３〜６％ ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド １〜５％ ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ₄として） １０〜２０％ 層状ジシリケート（例えば、ＳＫ５６、 Ｈｏｅｃｈｓｔ） １０〜２０％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） ３〜１２％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） ０〜６％ クエン酸ナトリウム ４〜８％ 過炭酸ナトリウム １３〜２２％ ＴＡＥＤ ３〜８％ ポリマー（例えば、ポリカルボキレートおよび ＰＶＰ＝ ０〜５％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、蛍光増白剤、光漂白剤、 香料、泡抑制剤） ０〜５％ １５）下記の成分を含んでなる少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度 を有する粒子として配合された洗剤組成物： （Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）アルキルサルフェート ４〜８％ アルコールエトキシレート １１〜１５％ セッケン １〜４％ ゼオライトＭＡＰまたはゼオライトＡ ３５〜４５％ 炭酸ナトリウム（Ｎａ₂ＣＯ₃として） ２〜８％ 可溶性ケイ酸塩（Ｎａ₂Ｏ・２ＳｉＯ₂として） ０〜４％ 過炭酸ナトリウム １３〜２２％ ＴＡＥＤ １〜８％ カルボキシメチルセルロース ０〜３％ ポリマー（例えば、ポリカルボキレートおよび ＰＶＰ） ０〜３％ 酵素（純粋な酵素タンパク質として計算） ０．０００１ 〜０．１％ 少量成分（例えば、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、 香料） ０〜３％ １６）追加の成分として、または既に特定した漂白系の代替物として、安定化 またはカプセル封入された過酸を含有する、１）〜１５）に記載するような洗剤 配合物。 １７）過ホウ酸塩が過炭酸塩と置換されている、１）、３）、７）、９）およ び１２）に記載するような洗剤配合物。 １８）さらにマンガン触媒を含有する、１）、３）、７）、９）、１２）、１ ４）および１５）に記載するような洗剤配合物。マンガン触媒は、例えば、″Ｅ ｆｆｉｃｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ− ｔｅｍｐａｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ″、Ｎａｔｕｒｅ ３６９、１９ ９４、ｐｐ．６３７−６３９、に記載されている化合物の１つであることができ る。 １９）液状非イオン界面活性剤、例えば、線状アルコキシル化第一級アルコー ル、ビルダー系（例えば、リン酸塩）、酵素およびアルカリを含んでなる非水性 検出液状組成物として配合された洗剤組成物。洗剤は、また、アニオン界面活性 剤および／または漂白系を含むことができる。 エンドグルカナーゼは、洗剤において通常使用されている濃度で混入すること ができる。現在、本発明の洗濯組成物において、セルラーゼは洗濯液の１リット ル当たり０．０００１〜１０ｍｇ（純粋な酵素タンパク質として計算する）のセ ルラーゼに相当する量で添加することができることが考えられる。 本発明のなお他の面によれば、エンドグルカナーゼはコンディショニングまた は柔軟剤組成物の典型的には１成分であることができる。慣用の柔軟剤組成物の 例は、例えば、欧州特許（ＥＰ）第０，２３３，９１０号に開示されている。 繊維材料の用途 他の態様において、本発明はバイオポリッシング法における本発明のエンドグ ルカナーゼの使用に関する。バイオポリッシングは、布帛の湿潤性を損失しない で風合いおよび外観に関する布帛の品質を改良する特定の処理である。バイオポ リッシングの最も重要な効果は、少ない毛羽およびピル、増加した光沢／輝き、 改良された布帛の風合い、増加した耐久柔軟性および変更された水吸収性により 特徴づけることができる。バイオポリッシングは、通常編成および織製布帛の製 作の湿式プロセシングにおいて行われる。湿式プロセシングは、例えば、糊抜き 、精練、漂白、洗濯、乾燥／捺染および仕上げのような工程を含んでなる。これ らの工程の各々の間において、布帛は多少機械的作用にさらされる。一般に、繊 維材料が編成 または織製された後、布帛は糊抜き段階、次いで精練段階などに進行する。糊抜 きは繊維材料から糊剤を除去する作用である。機械的織機による織製前に、たて 糸は、それらの引張強さを増加するために、糊剤の澱粉または澱粉誘導体でしば しばコーティングされる。織製後、糊剤のコーティングを除去した後、布帛をさ らに処理して均質かつ洗濯防水の結果を保証しなくてはならない。バイオポリッ シングの効果を達成するためには、セルロース分解および機械的作用の組み合わ せが要求されることは知られている。また、セルラーゼによる処理を柔軟剤によ る慣用処理と組み合わせとき、「超柔軟性」を達成できることが知られている。 セルロースの布帛のバイオポリッシングのために本発明のエンドグルカナーゼを 使用することは有利である、例えば、いっそう完全なポリッシングを達成できる ことが考えられる。バイオポリッシングは、例えば、ＷＯ９３／２０２７８号明 細書に記載されている方法を適用することによって、得ることができる。 ストーン−ウォッシング 染色された布帛、特にデニム布帛またはジーンズにおいて、このような布帛か ら作られたデニムまたはジーンズを軽石の存在において洗濯して所望の布帛の局 存化された浅色化を達成するか、または布帛を酵素的に処理する、特にセルロー ス分解酵素で処理ことによって、「ストーン−ウォッシングされた」外観（色の 局存化された摩耗）を提供することは知られている。本発明のエンドグルカナー ゼによる処理は、米国特許第４，８３２，８６４号明細書に開示されているよう に単独で、伝統的方法において要求されるより少量の軽石とともに、またはＷＯ ９５／０９２２５号に開示されているように、パーライトとともに、実施するこ とができる。 パルプおよび紙の用途 製紙用パルプ工業において、本発明のエンドグルカナーゼは、例えば、下記の ように有利に適用することができる： − デバーキングのために：エンドグルカナーゼを使用する前処理は機械的ド ラムにおいてデバーキングの前に形成組織層を分解して、エネルギーを有利に節 約することができる。 − デフィブレイションのために：精製または叩解の前に、セルロース繊維を 含有する材料をエンドグルカナーゼで処理すると、繊維間の表面に対するセルラ ーゼの加水分解作用のために、エネルギー消費を減少できる。エンドグルカナー ゼの使用は既知の酵素の使用に比較してエネルギー節約を改良することができる 。なぜなら、本発明の酵素組成物は繊維壁に浸透する高い能力を有することがで きると考えられるからである。 − 繊維の変性、すなわち、繊維壁を横切る部分的加水分解を必要とする繊維 の性質を改良するために：これは酵素がより深く浸透することを必要とする（例 えば、粗い繊維をいっそう柔軟性とするために）。高い収率のパルプ、例えば、 砕木パルプまたは再循環パルプの混合物について、繊維の深い処理はこれまで不 可能であった。これは、繊維壁の孔マトリックスの物理的制限のために、酵素分 子の通過を妨害する繊維の壁構造に起因する。本発明のエンドグルカナーゼは繊 維壁の中に浸透することができると考えられる。 − 排水を改良するために：加水分解性酵素、例えば、セルラーゼで処理する ことによって、製紙用パルプの排水を改良できる。 リグノセルロースパルプの処理は、例えば、ＷＯ９１／１４８１９号、ＷＯ９ １／１４８２２号、ＷＯ９１／１７５４３号およびＷＯ９２／１８６８８号明細 書に記載されているように、実施可能である。 植物材料の分解 なお別の態様において、本発明は植物材料、例えば、細胞壁の分解のために本 発明のエンドグルカナーゼおよび／または酵素調製物を使用することに関する。 本発明の新規なエンドグルカナーゼおよび／または酵素調製物は、ワイン、フ 果物または野菜のジュースの調製において収量を増加するために有用である。本 発明によるエンドグルカナーゼは、また、種々の植物の細胞壁誘導材料または廃 棄材料、例えば、農業上の残留物、例えば、麦藁、トウモロコシの穂軸、トウモ ロコシ植物全体、植物の殻、豆の殻、使用済み穀物、テンサイのパルプ、および その他の酵素的加水分解に適用することができる。植物材料を分解して、異なる 種類のプロセシングを改良し、他の成分の精製または抽出、例えば、穀物からの ベータ−グルカンまたはベータ−グルカンオリゴマーの精製を促進し、飼料の価 値を改良し、水結合容量を減少し、廃水プラントの分解性を改良し、例えば、草 およびトウモロコシの貯蔵生牧草およびその他への変換を改良することができる 。 下記の実施例により、本発明を例示する。 実施例１ アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）内の２つの目の下の３つの族に属 する４つの真菌からのセルロース分解酵素を、発現クローニングにより検出した ；対応するＤＮＡ配列を決定した；酵素を異種的に発現させ、そして液体発酵に より生産し、特性決定し、そして色清浄化アッセイにおいてすぐれた性能を与え ることが証明された。 ＣＢＳ １１７．６５、ＣＢＳ ４７８．９４、ＮＲＲＬ ８１２６、および ＡＴＣＣ １０５２３の分離株を、震盪フラスコの培 養においてセルロースに富んだジャガイモデキストロースブロス上で増殖させ、 ２６℃において５日間インキュベートした（震盪条件、１５０ｒｐｍ）。Ａ．ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．、およびチ エラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）およ びボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉ ｃｈｏｉｄｅｓ）からのエンドグルカナーゼのクローニングおよび発現 十分なエアレーションを保証するために撹拌しながら、セルロース含有発酵培 地中で増殖させた、それぞれ、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏ ｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎ ｉｕｍ）ｓｐ．、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒ ｅｓｔｒｉｓ）およびボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃ ｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）から、ｍＲＮＡを単離した。菌糸体を３〜 ５日の増殖後に収獲し、液体窒素中で直ちに凍結させ、−８０℃において貯蔵し た。それぞれ、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ． 、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ） およびボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔ ｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）からのライブラリーの各々は、ほぼ１０⁶の個々のクロー ンから成り、これらを記載するように１％のベクターのバックグラウンドで大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において構築した。 各ライブラリーからのプールのいくつかからのプラスミドＤＮＡ を酵母の中に形質転換し、そして２５０〜４００の酵母コロニーを含有する５０ 〜１００のプレートが各プールから得られた。 エンドグルカナーゼ陽性コロニーを同定し、そしてＡＺＣＬ ＨＥセルロース アッセイによりＳＣ−寒天平板上で単離した。ｃＤＮＡインサートを酵母コロニ ーから直接増幅し、そして上記の材料および方法の節に記載したように特性決定 した。 ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍ ｏｐｈｉｌａ）からのエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を 配列識別Ｎｏ．１に示し、そして対応するアミノ酸配列を、また、配列識別Ｎｏ ．１に示す。ｃＤＮＡはＤＳＭ ９７７０中のプラスミドから得ることができる 。 アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．からのエンドグルカナーゼを コードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列識別Ｎｏ．４に示し、そして対応するア ミノ酸配列を、また、配列識別Ｎｏ．５に示す。ｃＤＮＡはＤＳＭ １００８２ 中のプラスミドから得ることができる。 チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ） からのエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列識別Ｎｏ． ８に示し、そして対応するアミノ酸配列を、また、配列識別Ｎｏ．９に示す。ｃ ＤＮＡはＤＳＭ １００８１中のプラスミドから得ることができる。 ボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉ ｃｈｏｉｄｅｓ）からのエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列 を配列識別Ｎｏ．１７に示し、そして対応するアミノ酸配列を、また、配列識別 Ｎｏ．１６に示す。ｃＤＮＡはＤＳＭ １０５７１中のプラスミドから得ること ができる。 全体のＤＮＡを酵母コロニーから単離し、そしてプラスミドＤＮ Ａを前述したように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換によりレスキューした。 アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中でエンドグルカナーゼを発現させ るために、ＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、ゲル上で大きさ分画し、そして、 それぞれ、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔ ｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．、チ エラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）およ びボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉ ｃｈｏｉｄｅｓ）からのライブラリーからの遺伝子に相当する断片を精製した。 遺伝子を引き続いてｐＨＤ４１４に結合し、適当な制限酵素で消化し、それぞれ 、プラスミドｐＡ２Ｃ１９３、ｐＡ２Ｃ３５７、ｐＡ２Ｃ３８５およびｐＡ２Ｃ ４８８を得た。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＤＮＡを増幅した後、プラスミドを前述したよう にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の中に形 質転換した。 アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）形質転換体の試験 形質転換体の各々を前述したようにエンドグルカナーゼ活性について試験した 。形質転換体のいくつかは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のバックグラウンドより有意に大きいエンドグルカナーゼ活性 を有した。これはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ ａｅ）におけるエンドグルカナーゼの効率よい発現を証明する。最高のエンドグ ルカナーゼ活性を有する形質転換体を選択し、そしてＹＰＭ培地を含む５００ｍ ｌの震盪フラスコの中に接種した。すぐれたエアレーションを保証するために十 分に撹拌しながら３〜５日間発酵した後、培養ブロスを２０００ｇにおいて１０ 分間遠心し、上清を回収し た。Ｂ．エンドグルカナーゼ活性の決定 エンドグルカナーゼのセルロース分解活性を分析標準に関して決定し、そして 単位Ｓ−ＣＥＶＵで表すことができる。 セルロース分解酵素はＣＭＣ加水分解し、これによりインキュベーション混合 物の粘度を減少させる。生ずる粘度の減少を振動粘度計（例えば、ＭＩＶＩ ３ ０００、Ｓｏｆｒａｓｅｒ、フランス国）により決定することができる。 Ｓ−ＣＥＶＵにより測定された、セルロース分解活性の決定は、要求に応じて 出願人から入手可能である分析法ＡＦ３０１．１に従い決定することができる。 Ｓ−ＣＥＶＵアッセイは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の溶液の粘 度を減少する試料の能力を測定することによって、試料の中に存在するセルロー ス分解活性の量を定量する。このアッセイは、４０℃、ｐＨ７．５において、Ｃ ＭＣ基質の粘度を減少する相対的酵素標準を使用して実施される。 リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を使用するＳＡＶＩ単位によりエンドグル カナーゼ活性の決定のアッセイ： 定義： ＩＳＡＶＩ−Ｕは１μｍｏｌのグルコース／分に等しい量の還元性炭水化物を 生成する酵素の量である。 アッセイ条件： 酵素の溶液：０．５ｍｌ ０．１Ｍの緩衝液中の４ｇ／ｌのＰＡＳＣ：２．０ｍｌ ２０分、４０℃ 感度： 最大０．１ＳＡＶＩＵ／ｍｌ＝約１Ｓ−ＣＥＶＵ／ｍｌ（ＣＭＣ粘 度） 最小０．０１ＳＡＶＩＵ／ｍｌ＝約０．１Ｓ−ＣＥＶＵ／ｍｌ 還元糖の生成の決定： 還元性基のアッセイは、Ｌｅｖｅｒ、Ｍ．Ａ ｎｅｗ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆ ｏｒ ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂ ｏｈｙｄｒａｔｅｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７２、Ｖｏｌ．４７（２ ７３−２７９）に従い実施した。１００ｍｌの２％水酸化ナトリウム中で１．５ ｇのｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラシド（ｈｙｄｒａｃｉｄｅ）（ＰＨＢＡＨ） を５ｇの酒石酸ナトリウムと混合することによって、試薬混合物を調製した。 基質： 下記の方法に従い氷冷アセトンおよびリン酸を使用して、ＰＡＳＣ貯蔵液を調 製した。５ｇのセルロース（Ａｖｉｃｅｌ^R）を水で湿潤させ、そして１５０ｍ ｌの氷冷８５％オルト−リン酸を添加した。この混合物をゆっくり撹拌しながら 氷浴の中に１時間入れた。次いで、１００ｍｌの氷冷アセトンを撹拌しながら添 加した。このスラリーをパイレックス焼結ディスクＮｏ．２を有するブフナー漏 斗に移し、次いで３回１００ｍｌの氷冷アセトンで洗浄し、各洗浄後できるだけ 乾燥した状態吸引した。最後に、フィルターケーキを２回５００ｍｌの水で洗浄 し、各洗浄後できるだけ乾燥した状態に吸引した。ＰＡＳＣを脱イオン水と３０ ０ｍｌの合計体積に混合し、均質にブレンドし（Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｈ ｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）そして冷蔵庫中に貯蔵した（１カ月まで）。 緩衝液との基質の平衡化：２０ｇのリン酸膨潤セルロースＰＡＳＣ貯蔵液を、 ５０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心し、上清を注ぎ出した；沈降物を３０ｍｌ の緩衝液中に再懸濁させ、５０００ｒｐ ｍにおいて２０分間遠心し、上清を注ぎ出し、沈降物を５ｇのセルロース／ｌの 基質濃度に相当する合計６０ｇに緩衝液中に再懸濁させた。 ｐＨ８．５の決定のための緩衝液：０．１Ｍのバルビタール。 ｐＨ１０の決定のための緩衝液：０．１Ｍのグリシン。 手順： １．酵素試料の希釈 酵素溶液を基質と同一緩衝液中で希釈する。 ２．酵素反応 基質溶液中の基質を４０℃において５分間予備加熱する（２ｍｌ）。次いで酵 素溶液（０．２〜１Ｓ−ＣＥＶＵ／ｍｌに希釈した）０．５ｍｌを添加し、５秒 間混合する。酵素溶液の前に停止試薬を添加することによって、酵素のブランク が得られる。４０℃において２０分間インキュベートする。０．５ｍｌの２％Ｎ ａＯＨ溶液を添加し、そして５秒間混合することによって、反応を停止させる。 試料を５０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心し、１ｍｌの上清を０．５ｍｌの ＰＨＢＡＨ試薬と混合し、１０分間沸騰させる。試験管を氷水浴中で冷却する。 ３．還元性末端基の決定 ４１０ｎｍにおける吸収を分光光度計で測定する。酵素溶液の添加前に水酸化 ナトリウムを添加することによって、ブランクを調製する。同一緩衝液中の５、 １０、１５および２５ｍｇ／ｌのグルコース濃度を使用し、そして沸騰前にＰＨ ＢＡＨ試薬を添加することによって、標準的グルコース曲線を得た。この標準的 曲線を使用して、還元性グルコース当量の解放を計算する。 ４．触媒活性の計算： ４１０ｎｍにおける吸収の測定 １）標準曲線 （グルコース）−（Ｈ₂Ｏ）／グルコース濃度 ２）酵素試料 （試料）−（ブランク） 標準曲線に従いグルコース濃度を計算する 活性（ＳＡＶＩＵ／ｍｌ）： Ｃ．ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からのエン ドグルカナーゼの精製および特性決定 ｐＡ２Ｃ１９３で形質転換されたアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をＹＰＭ培地上で４日間増殖させた。次いで液体を遠心 し、滅菌濾過した。 ２０ｋＤのカットオフのＤＯＷ膜ＧＲ６１ＰＰを使用してＡＭＩＣＯＮセル上 の限外濾過により、試料を濃縮した。限外濾過の濃縮物をＳ−ＣＥＶＵ／ｍｌお よびＳａｖｉＵ／ｍｌについて分析して、下記の結果が得られた： 精製： ２ｍｌの限外濾過の濃縮物を低いイオン強度に５倍に希釈し、０．２２μｍの ディスクフィルターを通して濾過した。この試料をＭｏｎｏＱ^RＨＲ５／５（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用し、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５（緩衝液Ａ）および１ｍｌ／分の流れと平衡化した。基線まで緩衝液Ａで 洗浄した後、カラムを１ＭのＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．５（緩衝液Ｂ）で溶離し、溶離勾配は１時間において０〜５０ ％の緩衝液Ｂであった。 ３６分後、ピークのコンプレックスが示され、１ｍｌの画分を取り上げ、最初 の１０画分はＣＭＣ／アガロース／コンゴーレッドプレート上でセルラーゼ活性 を示した。 これらの画分をプールし、２０ｋＤのカットオフのＤＯＷ膜ＧＲ６１ＰＰを使 用してＡＭＩＣＯＮセル上の限外濾過により、３ｍｌに濃縮した。 この試料をＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５^TMプレプ等級 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用し、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、 ｐＨ６．３５、および１ｍｌ／分の流れと平衡化した。 ８２分後、ピークのコンプレックスが示され、１ｍｌの画分を取り上げ、最初 の１０画分はＣＭＣ／アガロース／コンゴ−レッドプレート上でセルラーゼ活性 を示した。 これらの画分をプールし、下記の結果が得られた： Ａ₂₈₀＝０．１５ Ａ₂₈₀／Ａ₂₆₀＝１．６２ 分子量（ＳＤＳ）＝２２ｋＤ ｐＩ＝３．５〜５ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の精製＝１００％ Ｓ−ＣＥＶＵ／ｍｌ＝２８．５ Ｓ−ＣＥＶＵ／Ａ₂₈₀＝１８８ Ｓ−ＣＥＶＵ／ｍｇ＝４３６ 吸光係数＝５４８８０（計算） 分子量（計算）＝２２ｋＤ 吸光係数は、添付した配列識別Ｎｏ．１（アミノ酸配列）の配列から計算され たチロシン、トリプトファンおよびシステインの含量 に基づく。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＯＶＥＸ Ｐｒｅ−Ｃａｓｔ Ｇｅｌｓ ４ −２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ １．０ｍｍ×１０Ｗｅｌｌ上で 調製した。 ＩＥＦは、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＰＡＧプレートｐＨ３．５〜 ９．５上で実施し、活性をＣＭＣ−コンゴレッドのオーバーレイにより可視化し た。 Ｋ_M＆Ｋ_catの決定： Ｋ_MおよびＫ_catを、ＳＡＶＩ単位の決定と同一方法により、ｐＨ８．５におい て８ｇ／ｌまでの基質濃度で決定した。 下記の結果が得られた： Ｋ_cat ３８／秒、 Ｋ_M ５ｇ／ｌ、 リン酸膨潤セルロース、ｐＨ８．５。 ＣＭＣに対するｐＨ７．５における比活性： ４３６のＳ−ＣＥＶＵ／ｍｇタンパク質。Ｄ．ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からのエン ドグルカナーゼのｐＨおよび温度のプロフィルの決定 ｐＨプロフィルを下記の条件において決定した： ０．１ＭのＴｒｉ−リン酸ナトリウムを０．１Ｍのクエン酸と混合することに よって、２．５〜１０．０のｐＨ値の緩衝液を調製した。精製したエンドグルカ ナーゼを希釈して、アッセイの応答がアッセイの直線の範囲内にあるようにした 。基質は、０．２％のＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロースの最終基質濃度にクエン酸塩 ／リン酸塩緩衝液と１：１に混合したＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース（ＭｅｇａＺ ｙｍｅ）の０．４％懸濁液であった。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ^R） １．５ｍｌポリプロピレン管中の１ｍｌの基質に、１０μｌの酵素溶液を添加し 、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ^R ）温度制御サーモミキサー中で１５分間インキュベートし、次いで別のサーモ ミキサー中で９５℃において２０分間不活性化した。管を遠心し、２００μｌの 各上清を９６ウェルのマイクロタイタープレート中のウェルに移し、そしてＯＤ を６２０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｙｌｔｉ ｓｋａｎ^RＭＣＣ／３４０）で測定した。 最適なｐＨ条件について、インキュベーションを３０℃において実施した。各 ｐＨ値について、３本の管に酵素を添加し、インキュベートし、次いで加熱不活 性化したが、１本の管（ブランク）に酵素を添加し、直ちに加熱不活性化した。 ３つのインキュベートした試料の平均値を計算し、そしてブランク値を減じた。 下記のｐＨプロフィルが決定された： エンドグルカナーゼはｐＨ４．０〜８．０の間で６０％より大きい活性を有し 、そしてｐＨ５．６〜６．０において最適な活性を有することが理解される。 温度のプロフィル： 最適な温度を同一方法においてｐＨ５．５において決定した。温度は３０℃〜 ８０℃の範囲であった。各温度について、３回のインキュベーションを実施し、 平均を計算した。３つのブランクを酵素の直ちの加熱不活性化により調製し、平 均をインキュベートした試料の値から減じた。 エンドグルカナーゼは最適な活性を５０〜７０℃において有することが理解さ れた。 温度安定性を同一方法においてｐＨ５．５および３０℃において決定し、そし て、さらに、酵素溶液を実際の温度において１時間インキュベートし、氷上で冷 却した。予備加熱しない酵素の試料の活性（％）で残留活性を下に示す。 Ｅ．セルロース繊維を含有する繊維材料の糸から突起する表面のフィブリルおよ び繊維の除去として測定したミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ） セルラーゼ（配列識別Ｎｏ．１）の色清浄化 装置 ： ターグ−ｏ−トメーター（Ｔｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ） 液体積 ： １００ｍｌ 撹拌機 ： １５０回の動き／分、垂直 すすぎ時間 ： 水道水中、５分 洗濯温度 ： ４０° 洗濯液 ： ０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液 ｐＨ ： ７．０ 洗濯時間 ： ３０分 反復 ： ２ 酵素 ： ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ）配列識別Ｎｏ．１Ｂ） 投与量 ： ５００および２５００ Ｓ−ＣＥＶＵ／ｌ 繊維材料 ： 老化した黒色１００％綿５×６ｃｍ（０．９ｇ） の２スワッチ 乾燥 ： タンブル乾燥 評価 ： データカラー・エルレフォ・レミッション（Ｄａ ｔａｃｏｌｏｒ Ｅｌｒｅｐｈｏ Ｒｅｍｍｉ ｓｉｏｎ）分光光度計により、光の規約反射率 を測定する。規約反射率はデルタＬ（ハンター （Ｈｕｎｔｅｒ）Ｌａｂ値）として計算する。 糸から突起する表面のフィブリルおよび繊維が セルラーゼにより除去されるとき、黒色布帛の 表面はより黒色に見え、そしてより低いＬ値が 得られる。 試料をブラインド試料、すなわち、酵素なしで洗濯した試料と比較する： ブラインド試料と比較したデルタＬ値。 データが示すように、ＣＢＤを含まないミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈ ｔｈｏｒａ）セルラーゼは試験した条件下にすぐれた色清浄化を与える。Ｆ．ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌａ）からのエンドグルカナーゼとフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍ ｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの４３ｋＤのエンドグルカナーゼとの間の 遺伝子融合物の構築 ２つの構築物の目的は、フミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）か らの４３ｋＤのエンドグルカナーゼ（ＷＯ９１／１７２４３号明細書に開示され ている）からのリンカーおよびＣＢＤを有するミセリオフトラ・テルモフィラ（ Ｍ．ｔｈｃｒｍｏｐｈｉｌａ）からのエンドグルカナーゼの誘導体を作ることで あった。ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からの 自然エンドグルカナーゼは、リンカーおよび／またはセルロース結合ドメイン（ ＣＢＤ）をもたない。 ＣＭ１：構築物１はミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌａ）からのエンドグルカナーゼ（２２５アミノ酸）と、フミコラ・インソレン ス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の４３ｋＤのエンドグルカナーゼからの７２Ｃ−末 端のアミノ酸とから成る。 ＣＭ２：構築物２はミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌａ）からのエンドグルカナーゼ（２２５アミノ酸）と、フミコラ・インソレン ス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の４３ｋＤのエンドグルカナーゼからの８３Ｃ−末 端のアミノ酸とから成る。 フミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの４３ｋＤのエンドグ ルカナーゼｃＤＮＡを、エンドグルカナーゼ遺伝子がＴａｋａ−プロモーターか ら転写されるような方法において、ｐＨ Ｄ４１４の中にクローニングした。生ずるプラスミドをｐＣａＨｊ４１８と命名 した。 同様な方法において、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌａ）からのエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡをｐＨＤ４１４の中に クローニングし、生ずるプラスミドをｐＡ２Ｃ１９３と命名した。 プライマー： プライマー１： ５’−ＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴＣ ＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＧＧ−３’ プライマー２： ５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＧＧＧＡＧＣ ＡＧＣＣＧＣＴＣＴＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧ−３’ プライマー３： ５’−ＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴＡ ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧ−３’ プライマー４： ５’−ＣＧＧＣＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＡＣＧＧＧＡＧＣ ＡＧＣＣＧＣＴＣＴＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧ−３’ Ｔａｋａ−ｐｒｏ．プライマー： ５’ＣＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴＣＣ−３’ ＡＭＧ−ｔｅｒｍ．プライマー： ５’ＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＴＡＴＡＧＣＧ−３’ Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．１９８８に記載されているように、ＰＣＲオー バーラップ−エクステンション法により、エンドグルカナーゼ融合物を構築した 。 構築物１： 反応Ａ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、プライマー１とＡＭＧ −ｔｅｒｍ．プライマーとの間のｐＣａＨｊ４１８の断片を増幅した（フミコラ ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの４３ｋＤのエンドグルカナーゼ からのリンカーおよびＣＢＤ）。 反応Ｂ：ｐＡ２Ｃ１９３、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏ ｐｈｉｌａ）からのエンドグルカナーゼ遺伝子、におけるＴａｋａ−ｐｒｏ．プ ライマーとプライマー２との間の断片のＰＣＲ増幅。 反応Ｃ：全体の領域をフランクするプライマー、すなわち、Ｔａｋａ−ｐｒｏ ．プライマーおよびＡＭＧ−ｔｅｒｍ．プライマー、の存在において、第３ＰＣ Ｒにおいて、２つの精製された断片を使用した。 構築物２： 同一手順を使用し、ここでプライマー３およびプライマー４をそれぞれのプラ イマー１および２の代わりに使用した。 反応Ｃにおいて増幅された断片を精製し、制限酵素ＸｂａＩおよびＢｓｓｔＥ ＩＩで消化した。精製された消化断片をｐＡ２Ｃ１９３に結合し、制限酵素Ｘｂ ａＩおよびＢｓｓｔＥＩＩで消化した。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＦ’（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ ｂｓ）からのコンピテント細胞を結合プラスミドで形質転換し、そして遺伝子融 合物を含有するコロニーを単離した。クローニングした部分の配列をＤＮＡ配列 決定により確認した。 ２つの構築物における遺伝子の配列は、配列識別Ｎｏ．２Ａおよび配列識別Ｎ ｏ．３Ａに示されている。 ポリメラーゼ連鎖反応を、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ） により推奨されているように、標準的条件下に実施した。 反応ＡおよびＢを９４℃において２分で開始し、次いで（９４℃において３０ 秒、５０℃において３０秒および７２℃において１分）の２０サイクルを実施し 、最後に７２℃において４分を実施した。 反応Ｃを（９４℃において２分、５２℃において１分および７２℃において２ 分）で開始し、次いで（９４℃において３０秒、５２℃において３０秒および７ ２℃において９０秒）の１５サイクルを実施し、最後に７２℃において４分を実 施した。 ２つの構築物を前述したようにアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の中に形質転換した。Ｇ．セルロース結合ドメインを有するクローニングされたセルラーゼの精製およ び特性決定 ： 産生生物から細胞外流体を分離することによって、クローニングされた産物を 回収する。 次いで、アフィニティークロマトグラフィーにより、２０ｍＭのリン酸ナトリ ウムｐＨ７．５とのスラリー中の１５０ｇのアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）を使用し て、約１ｇのセルラーゼを高度に精製した。 合計約１ｇのセルラーゼを含有する粗製の発酵ブロスとアビセルを混合する。 ４℃において２０分間混合した後、アビセル酵素を寸法５０×２００ｍｍ、合計 約４００ｍｌのカラムの中に充填する。 カラムを２００ｍｌの緩衝液で洗浄し、次いでタンパク質がそれ 以上溶離されなくなるまで、同一緩衝液中の０．５ＭのＮａＣｌでで洗浄した。 次いで、５００ｍｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５で洗浄した。最後に、純 粋な全長の酵素を１％のトリエチルアミンｐＨ１１．８で溶離する。 溶離された酵素をｐＨ８に調節し、そして膜ＤＯＷ ＧＲ６１ＰＰ（２０ｋＤ のカットオフのポリプロピレン）を有するアミコン・セル・ユニットを使用して 、５ｍｇ／ｍｌ以上のタンパク質に濃縮する。 精製されたセルラーゼは下記のように特徴づけられた： 精製されたセルラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量について分析し、そし てファーマシアからの標準的ＬＷＭタンパク質マーカーキットを使用して、分子 量をセルラーゼについて計算した。分子量はコーディングアミノ酸組成の分子量 より明らかに高く、そしてリンカー領域がＯ−グリコシル化されているという事 実のために、このより高い分子量を生ずる。ファーマシア・アンフォリン（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ＰＡＧプレートｐＨ３．５〜９．５を使 用し、そして再び既知のｐＩのタンパク質を含むファーマシア・キットを使用し て、ｐＩを決定した。 トリプトファン、チロシンおよびシステインの既知の吸収を使用して、アミノ 酸組成に基づいて、モル吸光係数を計算した。 ＣＭＣ基質を使用し、４０℃において０．５のｐＨ間隔で２０分間インキュベ ートし、還元糖の生成を測定することによって、ｐＨ活性プロフィルを得る。異 なるｐＨにおける相対活性を計算し、そして５０％より大きい相対活性を有する 間隔を含有するテーブル（ｔａｂｌｅ）を測定した。 アプライド・バイオシステムス４７３Ａ型配列決定装置を使用して、精製され たセルラーゼについてＮ−末端を決定した。製造業者の使用説明書に従い、タン パク質配列決定装置を運転した。 セルラーゼのうちの２つがブロックされた、すなわち、検出できないピログル タメートを形成し、そしてそれ以上の配列決定をブロックするＮ−末端のグルタ ミンのためにブロックされた。マイクロカルク・インコーポレーテッドのＭＣ熱 量計を使用して、一定走査速度において、温度を２０から９０°まで９０°／時 間の速度で上昇させて、ＤＣＳ差動走査熱量測定を中性のｐＨ（７．０）におい て実施した。 抗体の発生。ウサギにおいて抗体の発生させるために、ミセリオ フトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉ ｕｍ）およびチエラヴィア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）からのセルラーゼを使用した 。注射直前に、０．９％のＮａＣｌ溶液中の０．１ｍｇの精製されたセルラーゼ をフロインドアジュバントと混合した。ウサギを１週の間隔で１０回免疫化した 。免疫グロブリンＧ画分（ＩｇＧ）を硫酸アンモニウム沈降（２５％飽和）によ り精製し、沈降物を水中に可溶化し、次いで脱イオン水と交互する酢酸ナトリウ ム緩衝液（ｐＨ５．０、５０ｍＭ）に対して広範に透析した。濾過後、ＩｇＧ画 分をアジ化ナトリウム（０．０１％）で安定化した。 寒天平板中の免疫拡散を使用して、すべての３つのセルラーゼはその相同抗血 清と単一の免疫沈降物を形成し、そして３つのクローニングされたセルラーゼと 他の２つのセルラーゼ対して発生させた血清との間で沈降は見られなかった。Ｈ−Ｉ．セルロース繊維を含有する繊維材料の糸から突起する表面のフィブリル および繊維の除去として緩衝液中で測定した構築物１のエンドグルカナーゼ（配 列識別Ｎｏ．２）の性能 装置 ： ターグ−ｏ−トメーター 液体積 ： １００ｍｌ 撹拌 ： １５０回の動き／分（ｒｐｍ） すすぎ時間 ： 水道水中、５分 洗濯温度 ： ４０° 水硬度 ： １ｍＭのＣａＣｌ₂ 洗濯液 ： ０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液 ｐＨ ： ７．０ 洗濯時間 ： ３０分 反復 ： ２ 繊維材料 ： 老化した黒色の１００％綿５×６ｃｍの２スワ ッチ 乾燥 ： タンブル乾燥 評価： マクベス・カラー・アイ（Ｍａｃｂｅｔｈ Ｃｏｌｏｒ Ｅｙｅ）７０００規 約反射率の分光光度計により、光の規約反射率を測定した。規約反射率をデルタ Ｌ（ハンターＬａｂ値）として計算する。糸から突起する表面のフィブリルおよ び繊維がセルラーゼにより除去されるとき、表面はより輝いて見え、そしてより 低いＬ値が得られる。 結果： データが示すように、本発明の酵素は試験した条件下に非常にすぐれた色清浄 化を与える。Ｈ−ＩＩ．セルロース繊維を含有する繊維材料の糸から突起する表面のフィブリ ルおよび繊維の除去として緩衝液中で測定したチエラヴィア・テレストリス（Ｔ ｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）からのクリーニングされたエンドグ ルカナーゼ（配列識別Ｎｏ．９）の性能 装置 ： ターグ−ｏ−トメーター 液体積 ： １００ｍｌ 撹拌 ： １５０回の動き／分、垂直型撹拌機 すすぎ時間 ： 水道水中、１０分 洗濯温度 ： ４０° 洗濯液 ： ０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液 ｐＨ ： ７．０ 洗濯時間 ： ３０分 反復 ： ２ 繊維材料 ： 老化した黒色の１００％綿５×６ｃｍ（ほぼ１ ５０ｇ／ｍ²）の２スワッチ 乾燥 ： タンブル乾燥 評価： データカラー・エルレフォ・レミッション分光光度計により、光の規約反射率 を測定した。規約反射率をデルタＬ（ハンターＬａｂ値）として計算する。糸か ら突起する表面のフィブリルおよび繊維がセルラーゼにより除去されるとき、表 面はより黒くかつ感じよく見え、そしてより低いＬ値が得られる。 結果： データが示すように、本発明の酵素は試験した条件下に非常にすぐれた色清浄 化を与える。Ｈ−ＩＩＩ．セルロース繊維を含有する繊維材料の糸から突起する表面のフィブ リルおよび繊維の除去として緩衝液中で測定したボルテラ・コレトトリコイデス （Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）のエンドグルカ ナーゼ（配列識別Ｎｏ．１７）の性能 装置 ： ターグ−ｏ−トメーター 液体積 ： １００ｍｌ 撹拌 ： １５０回の動き／分、垂直型撹拌機 すすぎ時間 ： 水道水中、５分 洗濯温度 ： ４０° 洗濯液 ： ０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液 ｐＨ ： ７．０ 洗濯時間 ： ３０分 反復 ： ２ 投与量 ： ２．５Ｓ−ＣＥＶＵ／ｍｌ 繊維材料 ： 老化した黒色の１００％綿５×６ｃｍ（０．９ ｇ）の２スワッチ 乾燥 ： タンブル乾燥 評価： データカラー・エルレフォ・レミッション分光光度計により、光の規約反射率 を測定した。規約反射率をデルタＬ（ハンターＬａｂ値）として計算する。糸か ら突起する表面のフィブリルおよび繊維がセルラーゼにより除去されるとき、表 面はより黒く見え、そしてより低いＬ値が得られる。 試料をブラインド試料、すなわち、酵素なしで洗濯した試料と比較する： セルラーゼなし セルラーゼを含む ０．００ −０．５７ ブラインド試料と比較したデルタＬ値。 データが示すように、ボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）セルラーゼは試験した条件下にすぐれた 色清浄化を与える。Ｈ−ＩＶ．セルロース繊維を含有する繊維材料の糸から突起する表面のフィブリ ルおよび繊維の除去として測定した高いｐＨの強力洗剤中のチエラヴィア・テレ ストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｓ）およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．ＣＢＳ ４７８．９４からのクリーニングされたセルラーゼの性能 装置 ： ターグ−ｏ−トメーター 液体積 ： １５０ｍｌ 撹拌 ： １５０回の動き／分、垂直型撹拌機 すすぎ時間 ： 水道水中、５分 洗濯温度 ： ３５℃ 洗濯液 ： １．０ｇ／ｌの米国型ＨＤＧ（ゼオライト／ソ ーダのビルト、アニオン／非イオンの重量比＞ ２．５） ｐＨ ： １０．０ 水硬度 ： １．０ｍＭのＣａＣｌ₂ ０．３４ｍＭのＭｇＣｌ₂ 洗濯時間 ： １２分 反復 ： ６ 繊維材料 ： 老化した黒色の綿５×６ｃｍ（ほぼ１５０ｇ／ ｍ²）の２スワッチ 高度に編成された綿５×６ｃｍ（ほぼ６００ｇ ／ｍ²）の２スワッチ 乾燥 ： タンブル乾燥 評価： データカラー・エルレフォ・レミッションの分光光度計により、光の規約反射 率を測定する。規約反射率をデルタＬ（ハンターＬａｂ値）として計算する。糸 から突起する表面のフィブリルおよび繊維がセルラーゼにより除去されるとき、 表面はより暗くかつ感じよく見え、そしてより低いＬ値が得られる。異なる投与 量の、それぞ れ、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ ）（配列識別Ｎｏ．９）およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ． ＣＢＳ ４７８．９４（配列識別Ｎｏ．５）からのクリーニングされたセルラー ゼ（それぞれ、ＡおよびＢと表示する）を試験した。 結果： データが示すように、双方のセルラーゼは試験した条件下に非常にすぐれた色 清浄化を与える。Ｈ−Ｖ．セルロース繊維を含有する繊維材料の糸から突起する表面のフィブリル および繊維の除去として測定したチエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖ ｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ） ｓｐ．ＣＢＳ ４７８．９４からクリーニングされたセルラーゼ、および構築物 １（配列識別Ｎｏ．２）の性能 装置 ： ターグ−ｏ−トメーター 液体積 ： １５０ｍｌ 撹拌 ： １５０回の動き／分、垂直型撹拌機 すすぎ時間 ： 水道水中、１０分 洗濯温度 ： ３５℃ 水硬度 ： １．０ｍＭのＣａＣｌ₂ ０．３４ｍＭのＭｇＣｌ₂ 洗濯液 ： ２．０ｇ／ｌのＨＤＬ（中性、クエン酸塩のビ ルト、アニオン／非イオンの重量比＞０．５） ｐＨ ： ７．５ 洗濯時間 ： ３０分 反復 ： ２ 繊維材料 ： 老化した黒色の綿５×６ｃｍ（ほぼ１５０ｇ／ ｍ²）の２スワッチ 高度に編成された綿４×７ｃｍ（ほぼ６００ｇ ／ｍ²）の２スワッチ 乾燥 ： タンブル乾燥 評価： データカラー・エルレフォ・レミッションの分光光度計により、光の規約反射 率を測定する。規約反射率をデルタＬ（ＣＩＥ Ｌａｂ値）として計算する。糸 から突起する表面のフィブリルおよび繊維がセルラーゼにより除去されるとき、 表面はより暗くかつ感じよく見え、そしてより低いＬ値が得られる。３つの異な る投与量の、それぞれ、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔ ｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（配列識別Ｎｏ．９）およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍ ｏｎｉｕｍ）ｓｐ．ＣＢＳ ４７８．９４（配列識別Ｎｏ．５）からのクリーニ ングされたセルラーゼおよび構築物１（配列識別Ｎｏ．２）（それぞれ、Ａおよ びＢおよびＣと表示する）を試験した。 結果： データが示すように、双方のセルラーゼは試験した条件下に非常にすぐれた色 清浄化を与える。Ｉ．デニムの仕上げにおけるチエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．か らのエンドグルカナーゼおよび構築物１（配列識別Ｎｏ．２）の適用 実験 装置 ： 洗濯機ワスケイター（Ｗａｓｃａｔｏｒ）ＦＬ１２ ０ 液体積 ： ２０リットル 布帛 ： １．１ｋｇのデニム布帛、１４．５オンスの１００ ％綿 糊抜き ： １０分、５５℃、ｐＨ７ ５０ｍｌのアクアザイム（Ａｑｕａｚｙｍｅ）１２ ０Ｌ ２．５ｇ／ｌのリン酸塩緩衝液 摩耗 ： ２時間； ｐＨおよび温度を下記表に従い変化させた： 不活性化：１５分、８０℃、１ｇ／ｌの炭酸ナトリウム すすぎ：冷水道水中の５分の３回のすすぎサイクル 評価： 摩耗：布帛からの規約反射率を、摩耗レベルの測度としてテクスフラッシュ（ Ｔｅｘｆｌａｓｈ）２０００を使用して４２０ｎｍにおいて決定した。 本発明の異なるエンドグルカナーゼでデニム布帛を処理して得られた結果を下 記表に示す： すべての試験したセルラーゼはデニムの仕上げにおいてすぐれた性能を示すが 、各酵素はそれ自体の方法において独特である。配列識別Ｎｏ．２に相当する酵 素をデニムの仕上げに適用するとき、強度の損失を最小にして高い摩耗レベルに 到達することができる。配列識別Ｎｏ．９に相当する酵素でデニムを処理すると き、非常に高い洗濯作用を達成することができ、これはほとんど漂白された外観 を有する布帛を残す。配列識別Ｎｏ．５に相当する酵素でデニムを仕上げると、 低い最適温度において高い摩耗レベルが得られ、これによりプロセシング温度を 減少させかつエネルギーを節約することができる。Ｊ．リオセル（ｌｙｏｃｅｌｌ）繊維をバイオポリッシングするためのアクレモ ニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．およびチエラヴィア・テレストリス（Ｔ ｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）からのクリーニングしたセルラーゼ の使用 テンセル（Ｔｅｎｃｅｌ）の商品名で販売されているリオセル繊 維は、通常のビスコース製造の場合よりいっそう環境に優しい水性溶媒中で、木 材パルプセルロースから紡糸される。しかしながら、リオセル繊維を繊維材料に 加工するとき、これらは表面上に見られ、「毛羽」と呼ばれるフィブリルを形成 する傾向がある。セルラーゼを使用することによって、露出した毛羽立った繊維 を恒久的に除去し、仕上げられた布帛の外観を改良することができ、これは一般 にバイオポリッシングとして知られている処理である。本発明のエンドグルカナ ーゼはリオセル表面繊維の除去に特に適する。 方法および材料 繊維材料の支持体は１００％の織物であるか、または異なる種類のジャージー 編成された暗い青色のテンセルである。暗い色のジャージー編物は、評価を簡素 化した視的作用を増強するために好ましかった。また、織製７０／３０テンセル ／レーヨンブレンドが少ない程度に使用された。 ラウンダー−ｏ−メーター（Ｌａｕｎｄｅｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ）を使用して２ ００ｍｌの規模で、またはワスケイター（Ｗａｓｃａｔｏｒ）を使用して２０リ ットルの規模で、アッセイを実施した。処理時間はワスケイター中で５５℃にお いて６０分であり、そしてラウンダー−ｏ−メーター（ＬＯＭ）中で６０〜９０ 分であった。緩衝液は酢酸でｐＨ５に調節した２ｇ／ｌの酢酸ナトリウムであっ た。布帛／液比は１：１０であったが、ラウンダー−ｏ−メーターにおいて直径 １４ｍｍ（各々１１ｇ）の２０個の球を使用して十分な機械的摩耗を得た。バイ オポリッシングを実施し、直ちに８０℃において１５分間２ｇ／ｌの炭酸ナトリ ウムで不活性化し、次いで冷水中ですすいだ。 毛羽記録目盛り１〜５を使用して、結果を評価した。ここで１は出発材料のフ ィブリル化した外観であり、そして５は表面上にフィ ブリルが見えない、高い品質の外観である。エンドセルラーゼの性能は表面処理 に対して特異的であるので、重量損失は２％以下であり、したがって評価に含め ない。２つのセルラーゼを評価した：アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ） ｓｐ．（配列識別Ｎｏ．５）およびチエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａ ｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（配列識別Ｎｏ．９）からクリーニングされた セルラーゼ。 ２つのセルラーゼはテンセル布帛およびテンセルブレンド布帛の双方を脱フィ ブリル化（ｄｅｆｉｂｒａｔｅ）することができる。本発明のエンドグルカナー ゼを使用することによって、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からの酸 性セルラーゼ混合物を使用する場合におけるように、全繊維よりむしろ小さいフ ィブリルのみが除去される。したがって、本発明のエンドグルカナーゼ使用する とき、処理された布帛の強度の損失は最小に保持される。 下記の投与量はよりすぐれたデフィブレイション、すなわち、毛羽記録４また はそれ以上を与える： １５Ｓ−ＣＥＶＵ／ｇ布帛のアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ． からのセルラーゼ（配列識別Ｎｏ．５）；および １０Ｓ−ＣＥＶＵ／ｇ布帛のチエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉ ａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）からのセルラーゼ（配列識別Ｎｏ．９）。 実施例２ 新規なセルロース分解酵素は、大豆の種子から単離されかつマクロホミナ・ファ セオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）として同定され た植物病原体により産生されることが、発現クローニングならびにＰＣＲクロー ニングにより検出された ＰＣＲおよび発現クローニング手順のためのバイオマスの産生： 分離株ＣＢＳ ２８１．９６を震盪フラスコの培養においてセルロースに富ん だジャガイモデキストロースブロス上で増殖させ、２６℃において５日間インキ ュベートした（震盪条件：１５０ｒｐｍ）。Ａ．マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌ ｉｎａ）からのエンドグルカナーゼのクローニングおよび発現 ｍＲＮＡをマクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａ ｓｅｏｌｉｎａ）から単離し、十分なエアレーションを保証するために撹拌しな がらセルロース含有発酵培地中で増殖させた。菌糸体を３〜５日間の増殖後に収 獲し、直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃において貯蔵した。ほぼ１０⁶の個 々のクローンから成る、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎ ａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）からのライブラリーを、１％のベクターで記載され ているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で構築した。 プールのいくつかからのプラスミドＤＮＡを酵母の中に形質転換し、そして２ ５０〜４００の酵母のコロニーを含有する５０〜１００プレートを各プールから 得られた。 ＡＺＣＬ ＨＥセルロースアッセイでＳＣ−寒天平板上で、エンドグルカナー ゼ陽性コロニーを同定し、単離した。上記の材料および方法の節に記載されてい るように、ｃＤＮＡインサートを酵母コロニーから直接増幅し、特性決定した。 エンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列識別Ｎｏ．１０に 示し、そして対応するアミノ酸配列を配列識別Ｎｏ．１１に示す。 ｃＤＮＡはＤＳＭ １０５１２中のプラスミドから得ることができる。 全体のＤＮＡを酵母コロニーから単離し、そして前述したように 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換によりレスキューした。アスペルギルス（Ａ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中でエンドグルカナーゼを発現させるために、ＤＮＡを 適当な制限酵素で消化し、ゲル上で大きさ分画し、そしてエンドグルカナーゼ遺 伝子に相当する断片を精製した。遺伝子を引き続いてｐＨＤ４１４に結合し、適 当な制限酵素で消化し、ｐＡ２Ｃ４７７を得た。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＤＮＡを増幅した後、プラスミドを前述したよう にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の中に形 質転換した。 ハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよび 陽性クローンの特性決定 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のマクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏ ｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーからのほぼ６０００コ ロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）を、プローブとしてマクロホミナ・ファセオリ ナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）からのランダムプライムド³²Ｐ標識化ＰＣＲ生 成物を使用して、コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。 材料および方法の節に記載されているように、ＰＣＲ生成物を発生させた。ｃＤ ＮＡインサートの末端を配列決定し、そして双方の鎖からの最長のｃＤＮＡのヌ クレオチド配列を決定することによって、陽性ｃＤＮＡクローンを特性決定した 。エンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列識別Ｎｏ．１０ に示し、そして対応するアミノ酸配列を配列識別Ｎｏ．１１に示す。Ｂ．マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌ ｉｎａ）からのエンドグルカナーゼとフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌ ａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの４３ｋＤのエンドグルカナーゼとの間の遺伝子融 合物の構築 マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）からのエンドグル カナーゼの誘導体と、フミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの ４３ｋＤのエンドグルカナーゼ（ＷＯ９１／１７２４３号明細書に開示されてい る）からのリンカーおよびＣＢＤとから、１つの構築物を調製した。マクロホミ ナ・ファセオリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）からの自然エンドグルカナーゼ は、リンカーおよび／またはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）をもたない。 構築物はマクロホミナ・ファセオリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）からのエ ンドグルカナーゼ（２２３アミノ酸）と、フミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓ ｏｌｅｎｓ）の４３ｋＤのエンドグルカナーゼからの７２Ｃ−末端のアミノ酸と から成る。 フミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの４３ｋＤのエンドグ ルカナーゼｃＤＮＡを、エンドグルカナーゼ遺伝子がＴａｋａ−プロモーターか ら転写されるような方法において、ｐＨＤ４１４の中にクローニングした。生ず るプラスミドをｐＣａＨｊ４１８と命名する。 マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）からのエンドグル カナーゼをコードするｃＤＮＡをＢｓｔＸＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＹＥＳ２． ０の中にクローニングし、そして生ずるプラスミドをｐＣ１Ｃ４７７と命名する 。 プライマー： プライマー１： ５’−ＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＧＴＡＣＣＣＣＣＴＣ ＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＧＧ−３’ プライマー２： ５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧ ＴＡＣＧＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ−３’ ｐＹＥＳ２．０ Ｆ．ＨＴプライマー： ５’ＣＧＧＡＣＴＡＣＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＣＧ−３’ ＡＭＧ−ｔｅｒｍ．プライマー： ５’ＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＴＡＴＡＧＣＧ−３’ Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．１９８８に記載されているように、ＰＣＲオー バーラップ−エクステンション法により、エンドグルカナーゼ融合物を構築した 。 反応Ａ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、プライマー１とＡＭＧ −ｔｅｒｍ．プライマーとの間のｐＣａＨｊ４１８の断片を増幅する（フミコラ ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの４３ｋＤのエンドグルカナーゼ からのリンカーおよびＣＢＤ）。 反応Ｂ：ｐＣｌＣ４７７、マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌ ｉｎａ）からのエンドグルカナーゼ遺伝子、におけるｐＹＥＳ２．０ Ｆ．ＨＴ プライマーとプライマー２との間の断片のＰＣＲ増幅。 反応Ｃ：全体の領域をフランクするプライマー、すなわち、ｐＹＥＳ２．０ Ｆ．ＨＴプライマーおよびＡＭＧ−ｔｅｒｍ．プライマー、の存在において、第 ３ＰＣＲにおいて、２つの精製された断片を使用した。 反応Ｃにおいて増幅された断片を精製し、制限酵素、例えば、ＸｂａＩおよび ＢａｍＨＩで消化した。精製された消化断片をｐＨＤ４１４中に結合し、制限酵 素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＦ’（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ ｂｓ）からのコンピテント細胞を結合プラスミドで形 質転換し、そして遺伝子融合物を含有するコロニーを単離した。クローニングし た部分の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。 ポリメラーゼ連鎖反応を、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ） により推奨されているように、標準的条件下に実施した。 反応ＡおよびＢを９４℃において２分で開始し、次いで（９４℃において３０ 秒、５２℃において３０秒および７２℃において１分）の２０サイクルを実施し 、最後に７２℃において４分を実施した。 反応Ｃを（９４℃において２分、５２℃において１分および７２℃において２ 分）で開始し、次いで（９４℃において３０秒、５２℃において３０秒および７ ２℃において９０秒）の２０サイクルを実施し、最後に７２℃において４分を実 施した。 構築物を前述したようにアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の中に形質転換することができる。 実施例３ アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．およびソルダリア・フィミコラ （Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）からのエンドグルカナーゼのクローニ ングおよび発現 クローニング手順のためのバイオマスの産生： それぞれ、分離株ＣＢＳ ４７８．９４およびＡＴＣＣ ５２６４４を震盪フ ラスコの培養においてセルロースに富んだジャガイモデキストロースブロス上で 増殖させ、２６℃において５日間インキュベートした（震盪条件：１５０ｒｐｍ ）。 ｍＲＮＡを、それぞれ、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．、Ｃ ＢＳ ４７８．９４、およびソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉ ｍｉｃｏｌａ）、ＡＴＣＣ ５２６４４ から単離し、十分なエアレーションを保証するために撹拌しながらセルロース含 有発酵培地中で増殖させた。菌糸体を３〜５日間の増殖後に収獲し、直ちに液体 窒素中で凍結し、−８０℃において貯蔵した。各々がほぼ１０⁶の個々のクロー ンから成る、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．およびソルダリア ・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）からのライブラリーを、 １％のベクターで記載されているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で構築した。 各ライブラリーからのプールのいくつかからのプラスミドＤＮＡを酵母の中に 形質転換し、そして２５０〜４００の酵母のコロニーを含有する５０〜１００プ レートを各プールから得られた。 ＡＺＣＬ ＨＥセルロースアッセイでＳＣ−寒天平板上で、エンドグルカナー ゼ陽性コロニーを同定し、単離した。上記の材料および方法の節に記載されてい るように、ｃＤＮＡインサートを酵母コロニーから直接増幅し、特性決定した。 エンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列識別Ｎｏ．６に 示し、そして対応するアミノ酸配列を配列識別Ｎｏ．７に示す。ｃＤＮＡはＤＳ Ｍ １００８０中のプラスミドから得ることができる。 ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）からのエン ドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡの部分的ＤＮＡ配列を配列識別Ｎｏ．１９ （ｃＤＮＡの５’末端のヌクレオチド配列）そして対応するアミノ酸配列を配列 識別Ｎｏ．２０に示す。ｃＤＮＡはＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得る ことができる。 全体のＤＮＡを酵母コロニーから単離し、そして前述したように大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の形質転換によりプラスミドＤＮＡをレス キューした。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中でエンドグルカナー ゼを発現させるために、ＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、ゲル上で大きさ分画 し、そして、それぞれ、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．および ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）からのエンド グルカナーゼ遺伝子に相当する断片を精製した。遺伝子を引き続いてｐＨＤ４１ ４に結合し、適当な制限酵素で消化し、それぞれ、プラスミドｐＡ２Ｃ３７１お よびｐＡ２Ｃ５０２を得た。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＤＮＡを増幅した後、プラスミドを前述したよう にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の中に形 質転換した。 実施例４ Ａ．クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）、 ＣＢＳ ２８０．９６からのエンドグルカナーゼのＰＣＲによるクローニング 分離株ＣＢＳ ２８０．９６をコムギぬか培地（フラスコ当たり：３００ｇの コムギぬかを４５０ｍｌの塩溶液に添加した）を保持する静止フラスコの培養に おいて増殖させ、２６℃において６日間インキュベートした。インキュベーショ ン後、コムギぬかを蒸留水（３００ｍｌ／フラスコ）で抽出し、１％アガロース （Ｌｉｔｅｘアガロース、Ｍｅｄｉｎｏｖａ）中でエンドグルカナーゼ活性（０ ．１％ＡＺＣＬ−ＨＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（メガザイム）について試験した。 活性をｐＨ３．０、７．０および９．５のプレート上で観察した。 ｍＲＮＡを、前述したように、クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌ ｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）から単離した。菌糸体を３〜５日間の増殖後に収獲し 、直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃ において貯蔵した。各々がほぼ１０⁶の個々のクローンから成る、クリニペリス ・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）からのライブラリー を、１％のベクターで記載されているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で構築し た。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のクリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉ ｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）ｃＤＮＡライブラリーからのほぼ１０，０００コロニー 形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）を、プローブとしてランダムプライムド³²Ｐ標識化Ｐ ＣＲ生成物を使用してコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングし た。材料および方法の節に記載されているように、ＰＣＲ生成物を発生させた。 ｃＤＮＡインサートの末端を配列決定し、そして双方の鎖から最長のｃＤＮＡの ヌクレオチド配列を決定することによって、陽性ｃＤＮＡクローンを特性決定し た。 エンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列識別Ｎｏ．１２ に示し、そして対応するアミノ酸配列を配列識別Ｎｏ．１３に示す。 ｃＤＮＡはＤＳＭ １０５１１中のプラスミドから得ることができる。 全体のＤＮＡを酵母コロニーから単離し、そして前述したように大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の形質転換によりプラスミドＤＮＡをレスキューした。アスペルギル ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中でエンドグルカナーゼを発現させるために、Ｄ ＮＡを適当な制限酵素で消化し、ゲル上で大きさ分画し、そしてエンドグルカナ ーゼ遺伝子に相当する断片を精製した。遺伝子を引き続いてｐＨＤ４１４に結合 し、適当な制限酵素で消化し、プラスミドｐＡ２Ｃ４７５を得た。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＤＮＡを増幅した後、プラスミドを前述したよう にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の中に形質転換した。クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）からの エンドグルカナーゼとフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌ ｅｎｓ）からの４３ｋＤのエンドグルカナーゼのリンカー／ＣＢＤ領域との間の 遺伝子融合物の構築 クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）から の自然エンドグルカナーゼはリンカーをもたず、またセルロース結合ドメイン（ ＣＢＤ）をもたない。さらに、全長のｃＤＮＡはオープンリーディングフレーム （ＯＲＦ）をコードするエンドグルカナーゼから上流のＡＴＧ開始コドンを含有 し、例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびフィラメント状真菌アスペルギルス・オリゼ（Ａ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）におけるように、ｃＤＮＡの異種発現の ときに、多分スクランブル転写開始を生ずる。したがって、クリニペリス・スカ ベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）からのエンドグルカナーゼ と、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの４ ３ｋＤのエンドグルカナーゼ（ＷＯ９１／１７２４３号明細書に開示されている ）からのリンカー／ＣＢＤとから２つの遺伝子融合物を、オーバーラップエクス テンションによるスプライシング（ＳＯＥ）（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、１ ９８９）により構築した。 構築物１はフミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の４３ｋＤのエ ンドグルカナーゼのＣＯＯＨ末端においてリンカーおよびＣＢＤ領域をコードす るフミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の３’末端ｃＤＮＡ（７２ アミノ酸）と、ＰＣＲにより融合したクリニペリス・スカベラ（Ｃ．ｓｃａｂｅ ｌｌａ）からの２２６残基のエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮＡから成る 。 第２ハイブリッドは前述の遺伝子融合物と同一であるが、ただし推定上のシグ ナルペプチドからの最初の５残基はＰＣＲにより欠失されて、第２インフレーム ＡＴＧ開始コドンで開始する、より短いシグナルを生ずる。 プラスミド構築物 プラスミドｐＣｌＣ４７５は、ＢｓｔＸＩ／ＮｏｔＩ切断酵母発現ベクターｐ ＹＥＳ２．０の中にクローニングされた、クリニペリス・スカベラ（Ｃ．ｓｃａ ｂｅｌｌａ）からの全長のｃＤＮＡを含有し、プラスミドｐＣｌＣ１４４はｐＹ ＥＳ２．０のＢｓｔＸＩの中にクローニングされた、フミコラ・インソレンス（ Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの全長のｃＤＮＡを含有する。 オーバーラップ発現によるスプライシング ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ 、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１％のゼラチン；２００μＭの各ｄＮＴＰを 含有する）中で、鋳型として５０〜１００ｎｇのｐＣｌＣ４７５、および２５０ ｐｍｏｌの逆プライマー（５’−ＧＡＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴ ＧＧＡＧＧＧＴＴＴＡＣＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＧ−３ ’）と２つの３００〜３５０ｐｍｏｌの各前方プライマー（前方ｎｏ．１ ５’ −ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＡＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣ−３ ’、前方ｎｏ．２ ５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣ ＴＴＡＡＡＡＣＧＣＴＣＧ−３’）との組み合わせ、ＤＮＡサーマルサイクラー （Ｌａｎｄｇｒａｆ、ドイツ国）、および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐ ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｃｅｔｕｓ、米国）を使用して、クリニペリス・スカ ベラ（Ｃ．ｓｃａｂｅｌｌａ）からのエンドグルカナ ーゼのコア領域をコードする２つのＰＣＲ断片を発生させた。下記のサイクルプ ロフィルを使用して、ＰＣＲの３０サイクルを実施した：９４℃において１分間 の変性、５５℃において２分間のアニーリング、および７２℃において３分間の エクステンション。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、 ５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１％のゼラチン；２００μ Ｍの各ｄＮＴＰを含有する）中で、１００ｎｇのｐＣｌＣ１４４鋳型、２５０ｐ ｍｏｌの前方プライマー（５’−ＣＡＣＴＡＡＴＡＴＣＴＣＧＧＧＣＴＧＴＧＴ ＴＣＧＴＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡ−ＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣ− ３’）、２５０ｐｍｏｌのｐＹＥＳ２．０逆プライマー（５’−ＧＧＧＣＧＴＧ ＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡ−３’）ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｌａ ｎｄｇｒａｆ、ドイツ国）および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉ ｎ Ｅｌｍｅｒ、米国）を使用して、フミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌ ｅｎｓ）のエンドグルカナーゼのリンカーおよびＣＢＤをコードするＰＣＲ断片 を発生させた。ＰＣＲの３０サイクルを前述したように実施した。ＰＣＲ生成物 を０．７％の低いゲル化温度のアガロースゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ、ＦＭＣ） 中で電気泳動させ、問題の断片をゲルから切除し、製造業者の使用説明書に従い アガラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）で処理して回収 し、次いでフェノール抽出し、−２０℃において２体積の９６％ＥｔＯＨおよび ０．１体積の３ＭのＮａＡｃの添加により１２時間エタノール沈降させた。 クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）から のエンドグルカナーゼと、フミコラ・インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）か らの４３ｋＤのエンドグルカナーゼのリンカー／ＣＢＤ領域との間の組換えハイ ブリッド遺伝子を、前述の ものからのオーバーラッピングＰＣＲ断片（約５０ｎｇの各鋳型）を２つの組み 合わせにおいてＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１％のゼラチン；２００μＭの 各ｄＮＴＰを含有する）中で組み合わせることによって発生させた。ＳＯＥ反応 をＤＮＡサーマルサイクラー（Ｌａｎｄｇｒａｆ、ドイツ国）および２．５単位 のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｃｅｔｕｓ、米国）を使用 して実施した。下記のサイクルプロフィルを使用して、ＰＣＲの２サイクルを実 施した：９４℃において１分間の変性、５５℃において２分間のアニーリング、 および７２℃において３分間のエクステンション。反応を停止させ、２５０ｐｍ ｏｌの各末端プライマー（前方ｎｏ．１ ５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴ ＴＧＧＡＡＣＣＡＡＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣ−３’、前方ｎｏ．２ ５’−ＣＣＣ ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＴＴＡＡＡＡＣＧＣＴＣＧ−３’ 、逆プライマー ５’−ＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡ− ３’）を反応混合物に添加し、下記のサイクルプロフィルを使用して、ＰＣＲの ３０サイクルを実施した：９４℃において１分間の変性、５５℃において２分間 のアニーリング、および７２℃において３分間のエクステンション。 アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）における 異種発現のための発現カセットの構築 ＰＣＲ発生した組換え断片を０．７％の低いゲル化温度のアガロースゲル（Ｓ ｅａＰｌａｑｕｅ、ＦＭＣ）中で電気泳動させ、問題の断片をゲルから切除し、 製造業者の使用説明書に従いアガラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ ｂｓ、米国）で処理して回収し、次いでフェノール抽出し、−２０℃において１ ２時間エタノ ール沈降させた。ＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで完全に消化し、 ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断ｐＨＤ４１４ベクター中に結合し、次いで製造業 者の使用説明書に従い（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ中に構築物をエレクトロポレートした。 生ずる遺伝子融合物のヌクレオチド配列を、材料および方法の節に記載されて いる双方の鎖、配列識別Ｎｏ．１４Ａおよび１５Ａから決定した。構築物をアス ペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の中に記載されているように形質転換 することができる。 実施例５ 真の真菌の４つのグループ：アスコミセタス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）、バ シジオミセタス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）、キトリジオミセタス（Ｃ ｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）およびジゴミセタス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔ ｏｕｓ）の真菌のすべてをカバーする、７クラスの１５目に属する、２３族から の、３２属を表す４６のフィラメント状および一動原体の真菌からのセルロース 分解酵素の前記型の検出をＰＣＲは促進した ５．１ 材料 １．ジプロジア・シピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）Ｃｏｏｋｅ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７４．９６ ２．ウロスポラ・ビルグラミイ（Ｕｌｏｓｐｏｒａ ｂｉｌｇｒａｍｉｉ）（Ｈ ａｗｋｓｗ． ｅｔ ａｌ．）Ｈａｗｋｓｗ． ｅｔ ａｌ． 菌株の受け入れ番号：ＮＫＢＣ １４４４ ３．ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）ｓｐ ４．アスコブルス・スチクトイデウス（Ａｓｃｏｂｏｌｕｓ ｓｔｉｃｔｏｉｄ ｅｕｓ）Ｓｐｅｇ． 菌株の受け入れ番号：Ｑ０２６（Ｎｏｖｏ Ｎｒｄｉｓｋコレクション） 単離源：ガンの糞、ノールウェイ国ソバルバード ５．サッコボラス・ジルテラス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ ｄｉｌｕｔｅｌｌｕｓ ）（Ｆｕｃｋ）Ｓａｃｃ． 菌株の受託：受け入れ番号：ＣＢＳ ２７５．９６ ６．ペニシリウム・ベルクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｕｌ ｏｓｕｍ）Ｐｅｙｒｏｎｅｌ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６２３９６ ７．ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅ ｎｕｍ）Ｔｈｏｍ 菌株の受け入れ番号：ＡＴＣＣ ９４８０ ８．セルモマィセス・ベルコサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓ ｕｓ）Ｐｕｇｈ ｅｔ ａｌ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２８５．９６ ９．キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ）Ｌ．ｅ ｘ Ｇｒｅｖｉｌｌｅ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２８４．９６ １０．ポロニア・プンクタタ（Ｐｏｒｏｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）（Ｆｒ．ｅ ｘ Ｌ．）Ｆｒ． Ｒｅｆ：Ａ．Ｍｕｎｋ：Ｄａｎｉｓｈ Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｄａｎｓ ｋ Ｂｏｔａｎｉｓｋ、Ａｒｋｉｖ、Ｖｏｌ１７、１ １９５７ １１．ノヅリスポルム（Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｕｍ）ｓｐ． 単離源：カメリア・レチクラタタ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｒｅｔｉｃ 、 クンミング植物園、中国、ヤンナン省 １２．シリンドロカプポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）種単離源：海洋サ ンプル、バハマ １３．フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅ ｓ）Ｓｈｅｒｂａｋｏｆｆ 菌株の受け入れ番号：ＩＦＯ ４４６７ １４．フザリウム・ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）（Ｐｅｃｋ）Ｗｒ． 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６０８８３ １５．フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）（Ｍａｒｔ．） Ｓａｃｃ．ｅｍｎｄ．Ｓｈｙｄ ＆ Ｈａｎｓ． 菌株の受け入れ番号：ＩＭＩ １０７．５１１ １６．フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ） ｓｓｐリコペルシシ（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）（Ｓａｃｃ．）Ｓｈｙｄ ＆ Ｈａｎｓ． 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ６４５．７８ １７．フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ） ｓｓｐパシフロラ（ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ） 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ７４４．７９ １８．グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎ ｕｌａｔｕｍ）Ｇｉｌｌｍａｎ ＆ Ａｂｂｏｔｔ 菌株の受け入れ番号：ＡＴＣＣ １０５２３ １９．ネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）Ｄｉｎｇｌｅｙ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７９．９６ ２０．ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ） Ａｕｅｒｓｗａｌｄ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６０２５５ ２１．フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）Ｔｒａｅｅｎ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ２２７２６ ２２．フミコラ・ニグレセンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）Ｏ ｍｖｉｋ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ８１９．７３ ２３．シタリジウム・テルモフィラ（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐ ｈｉｌａ）（Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ Ｅｍｅｒｓｏｎ）Ａｕｓｔｗｉｃｋ 菌株の受け入れ番号：ＡＴＣＣ ２８０８５ ２４．チエラヴィア・テルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌａ）Ｆｅｒｇｕｓ ｅｔ Ｓｉｎｄｅｎ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ １７４．７０、ＩＭＩ １４５．１３６ ２５．クラドリヌム・フェクンジシムム（Ｃｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍ ｆｏｅｃ ｕｎｄｉｓｓｉｍｕｍ）Ｓａｃｃａｒｄｏ ｅｔ Ｍａｒｃｈａｌ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ６２３７３ ２６．シスパストスポラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ ｂｏｎ ｉｎｅｎｓｉｓ） 菌株の受け入れ番号：ＮＫＢＣ １５１５（日本大学、ツバキ教授のコレクショ ン） ２７．ケトミウム・クニコロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｃｕｎｉｃｏｌｏｒ ｕｍ）Ｆｕｃｋｅｌ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ７９９．８３ ２８．ケトミウム・ブラシリエンシス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｂｒａｓｉｌｉ ｅｎｓｉｓ）Ｂａｔｉｓｔａ ｅｔ Ｐｏｔｕａｌ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ １２２．６５ ２９．ケトミウム・ムロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｍｕｒｏｒｕｍ）Ｃｏｒ ｄａ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ １６３．５２、 ３０．ケトミウム・ヴィレスンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ ）（ｖｏｎ Ａｒｘ）Ｕｄａｇａｗａ 菌株の受け入れ番号：ＣＢＳ ５４７．７５ ３１．ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７２．９６ ３２．ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ． 単離源： ３３．ジアポルテ・シンゲネシア（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｙｎｇｅｎｅｓｉａ ） 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７８．９６ ３４．コレトトリクム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇ ｅｎａｒｉｕｍ）（Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ）Ｅｌｌｉｓ ｅｔ Ｈａｌｓｔｅｄ ｓｙｎ Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ ｖａｒ ｏｒｂｉｃｕｌ ａｒｅ Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ Ｗｉｎｓｔｅａｄ 種の受け入れ番号について検査：ＡＴＣＣ ５２６０９ ３５．エキシジア・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）Ｆｒ ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７７．９６ ３６．フォメス・フォメンタリウス（Ｆｏｍｅｓ ｆｏｍｅｎｔａ ｒｉｕｓ）（Ｌ．）Ｆｒ． 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７６．９６ ３７．スポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）（？） 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２８３．９６ ３８．リゾフィリクチス・ロセア（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ ｒｏｓｅａ） （ｄｅ Ｂａｒｙ ＆ Ｗｏｒ）Ｆｉｓｃｈｅｒ 菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２８２．９６ ３９．リゾムコル・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）（Ｌ ｉｎｄｔ）Ｓｃｈｉｐｐｅｒ ｓｙｎ：Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ 菌株の受け入れ番号：ＩＦＯ ４５７８ ４０．フィコミセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）（Ｋｕ ｎｚｅ）ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ ＆ Ｌｅ Ｍｏｎｎｉｅｒ 菌株の受け入れ番号：ＩＦＯ ４８１４ ４１．ケトスチラム・フレセニイ（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉ ｉ）ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ ＆ Ｌｅ Ｍｏｎｎｉｅｒ ｓｙｎ．Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ 菌株の受け入れ番号：ＮＲＲＬ ２３０５ ４２．トリコテシウム・ロセウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ） 菌株の受け入れ番号：ＩＦＯ ５３７２ ４３．コニオセシウム（Ｃｏｎｉｏｔｈｅｃｉｕｍ）ｓｐ Ｅｎｄｏｈｔｅ、単離源：顕花植物の葉、クンミング植物園、中国、ヤンナン ４４．菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７１．９６ Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅ、単離源：アルトカルプス・アルチリス（Ａｒｔｏｃａ ｒｐｕｓ ａｌｔｉｌｉｓ）（Ｍａｒａｃｅａｅ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）の葉、 ジャマイカ、クリスチアナ ４５．菌株の受託、受け入れ番号：ＣＢＳ ２７３．９６ Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅ、単離源：ピメンタ・ジオイカ（Ｐｉｍｅｎｔａ ｄｉ ｏｉｃａ）（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ）の葉、ジャマイカ、ダラ ス山 ４６．菌株の受託：ＣＢＳ ２７０．９６ Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅ、単離源：シュードカリマ・アリアセウム（Ｐｓｅｕｄ ｏｃａｌｙｍｍａ ａｌｌｉａｃｅｕｍ）（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｅ、Ｓｏｌ ａｎａｌｅｓ）の葉、ジャマイカ、ダラス山において生育する ５．２ 手順 菌株の維持およびバイオマスの生産： 菌株をペトリ皿（９ｃｍ）中の寒天上で、または斜面（参照：培地のリスト： ＰＣＡおよびＰＤＡ）上で維持した。４４の菌株を下記の増殖条件下に震盪フラ スコ中で増殖させた：一般的真菌培地、例えば、ＰＣ、ＰＤおよびＰＢ９または ＹＰＧ（参照、培地のリスト）；３〜９日のインキュベーション時間；温度２６ ℃；ｒｐｍｌ５０〜１７５。菌株Ｎｏ．１４（Ｆ．ｐｏａｅ）をコムギぬか上で １５日間増殖させた（２６℃；静止）。菌株Ｎｏ．３８を希薄塩溶液（ＤＳ／２ ）中で増殖させ、オートクレーブ処理した濾紙の１ｃｍ²片を添加した。 活性試験： １％アガロース（ＨＳＢ、Ｌｉｔｅｘ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｍｅｄｉｎｏｖａ） 中で構成した、０．１％ＡＺＣＬ−ＨＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｍｅｇａｚｙｍ ｅ）プレート上で、活性を試験した。す ベての試験は三重反復実験において実施した、すなわち、ＡＺＣＬ−ＨＥ−Ｃｅ ｌｌｕｌｏｓｅを３つの緩衝液中に溶解し、ｐＨ３、７または９．５に調節した （種々の比率の下記の２つの成分を使用した：クエン酸一水和物（Ｍｅｒｃｋ ａｒｔ、Ｎｏ．１００２４４（２１．０ｇ）、水中に溶解して、合計の体積を１ ０００ｍｌとした；０．１Ｍのトリ−ナトリウムドデカボロハイドレート（Ｍｅ ｒｃｋ ａｒｔ、Ｎｏ．６５７８（３８ｇ）、水中に溶解して、合計の体積を１ ０００ｍｌとした）。混合を使用直前に実施する。 バイオマスの収獲： バイオマスを濾過により収獲した（メッシュを真菌の増殖に調節する、高度に 胞子形成する菌糸体を有する真菌、例えば、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種 に使用される最適なもの）。葉酸塩上のバイオマスを無菌のプラスチックバッグ の中にこすり取って入れ、直ちに凍結させた（液体窒素の中に沈めることによっ て）。 ５．３ 結果 Ｉ．材料および方法において記載されているＰＣＲスクリーニングおよび増幅 技術を使用して、下記の部分的ｃＤＮＡ配列を得た： サッコボラス・ジルテラス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ ｄｉｌｕｔｅｌｌｕｓ） （Ｆｕｃｋ）Ｓａｃｃ．、ＣＢＳ ２７５．９６：配列識別Ｎｏ．２１（および 配列識別Ｎｏ．２２における推定されたアミノ酸配列）； セルモマイセス・ベルコサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕ ｓ）、ＣＢＳ ２８５．９６：配列識別Ｎｏ．２３（および配列識別Ｎｏ．２４ における推定されたアミノ酸配列）； キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ）、ＣＢＳ ２７４．９６：配列識別Ｎｏ．２５（および配列識別Ｎｏ．２６における推定 されたアミノ酸配列）； フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｓｓｐ リコペルシシ（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ＣＢＳ ６４５．７８：配列識別Ｎ ｏ．２７（および配列識別Ｎｏ．２８における推定されたアミノ酸配列）； ネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）、ＣＢＳ ２７９．９６ ：配列識別Ｎｏ．２９（および配列識別Ｎｏ．３０における推定されたアミノ酸 配列）； フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、ＡＴＣＣ ２２７ ２６：配列識別Ｎｏ．３１（および配列識別Ｎｏ．３２における推定されたアミ ノ酸配列）； フミコラ・ニグレセンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、ＣＢ Ｓ ８１９．７３：配列識別Ｎｏ．３３（および配列識別Ｎｏ．３４における推 定されたアミノ酸配列）； クラドリヌム・フェクンジシムム（Ｃｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍ ｆｏｅｃｕｎ ｄｉｓｓｉｍｕｍ）、ＡＴＣＣ ６２３７３：配列識別Ｎｏ．３５（および配列 識別Ｎｏ．３６における推定されたアミノ酸配列）； シスパストスポラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ ｂｏｎｉｎ ｅｎｓｉｓ）、ＮＫＢＣ １５１５：配列識別Ｎｏ．３７（および配列識別Ｎｏ ．３８における推定されたアミノ酸配列）； ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ．、ＣＢＳ ２７２．９６：配列 識別Ｎｏ．３９（および配列識別Ｎｏ．４０における推定されたアミノ酸配列） ； ケトスチラム・フレセニイ（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ） ：配列識別Ｎｏ．４１（および配列識別Ｎｏ．４２における推定されたアミノ酸 配列）； エキシジア・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）、ＣＢＳ ２７７．９６：配列識別Ｎｏ．４３（および配列識別Ｎｏ．４４における推定 されたアミノ酸配列）； コニオセシウム（Ｃｏｎｉｏｔｈｅｃｉｕｍ）ｓｐ：配列識別Ｎｏ．４５（お よび配列識別Ｎｏ．４６における推定されたアミノ酸配列）； 受託Ｎｏ．ＣＢＳ ２７１．９６：配列識別Ｎｏ．４７（および配列識別Ｎｏ ．４８における推定されたアミノ酸配列）； 受託Ｎｏ．ＣＢＳ ２７０．９６：配列識別Ｎｏ．４９（および配列識別Ｎｏ ．５０における推定されたアミノ酸配列）； ジプロジア・シピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）、ＣＢＳ ２ ７４．９６：配列識別Ｎｏ．５１（および配列識別Ｎｏ．５２における推定され たアミノ酸配列）； ウロスポラ・ビルグラミイ（Ｕｌｏｓｐｏｒａ ｂｉｌｇｒａｍｉｉ）、ＮＫ ＢＣ １４４４：配列識別Ｎｏ．５３（および配列識別Ｎｏ．５４における推定 されたアミノ酸配列）； ペニシリウム・ベルクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏ ｓｕｍ）、ＡＴＣＣ ６２３９６：配列識別Ｎｏ．５５（および配列識別Ｎｏ． ５６における推定されたアミノ酸配列）； ポロニア・プンクタタ（Ｐｏｒｏｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）：配列識別Ｎｏ ．５７（および配列識別Ｎｏ．５８における推定されたアミノ酸配列）； フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ） 、ＩＦＯ ４４６７：：配列識別Ｎｏ．５９（および配列識別Ｎｏ．６０におけ る推定されたアミノ酸配列）； チエラヴィア・テルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｈｅｒｍ ｏｐｈｉｌａ）、ＣＣＢＳ １７４．７０：配列識別Ｎｏ．６１（および配列識 別Ｎｏ．６２における推定されたアミノ酸配列）； ケトミウム・クニコロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｃｕｎｉｃｏｌｏｒｕｍ ）、ＣＢＳ ７９９．８３：配列識別Ｎｏ．６３（および配列識別Ｎｏ．６４に おける推定されたアミノ酸配列）； ケトミウム・ヴイレスンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）： 配列識別Ｎｏ．６５（および配列識別Ｎｏ．６６における推定されたアミノ酸配 列）； コレトトリクム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎ ａｒｉｕｍ）：配列識別Ｎｏ．６７（および配列識別Ｎｏ．６８における推定さ れたアミノ酸配列）； フィコミセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）：配列識別 Ｎｏ．６９（および配列識別Ｎｏ．７０における推定されたアミノ酸配列）；お よび トリコテシウム・ロセウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）： 配列識別Ｎｏ．７１（および配列識別Ｎｏ．７２における推定されたアミノ酸配 列）； ＩＩ．材料および方法に記載されているＰＣＲスクリーニングおよび増幅技術 を使用して、本発明の酵素を部分的にコードする部分的ｃＤＮＡを生産し、そし てプラスミドをブダベスト条約の規定に従い寄託した： 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５８３、１９９６ 年３月１３日に受託された； トリコテシウム・ロセウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）から のｃＤＮＡ； 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５８４、１９９６ 年３月１３日に受託された； シスパストスポラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ ｂｏｎｉｎｅ ｎｓｉｓ）からのｃＤＮＡ； 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５８５、１９９６ 年３月１３日に受託された； ケトミウム・ムロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｍｕｒｏｒｕｍ）からのｃＤＮ Ａ； 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５８７、１９９６ 年３月１３日に受託された； ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）からのｃＤＮ Ａ； 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５８８、１９９６ 年３月１３日に受託された； 未同定の菌株ＣＢＳ ２７３．９６からのｃＤＮＡ； 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５８６、１９９６ 年３月１３日に受託された； スポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）ｓｐ．からのｃＤＮＡ。 粗製の上清の色清浄化 通常の洗濯の間に、布帛はしばしば退色する。しかしながら、色清浄化を与え るセルラーゼで布帛を洗濯する場合、布帛の外観は改良され、そしてもとの色は 非常によく保存および維持される。色清浄化は、セルロース繊維を含有する繊維 材料の糸から突起するフィブリルおよび繊維の除去として測定される。 装置 ： ターグ−ｏ−トメーター 液体積 ： １００ｍｌ 撹拌 ： １５０回の動き／分、垂直型撹拌機 すすぎ時間 ： 水道水中、５分 洗濯温度 ： ４０° 洗濯液 ： ０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液 ｐＨ ： ７．０ 洗濯時間 ： ３０分 反復 ： ２ 酵素 ： 下記に示す菌株からの粗製上清 投与量 ： ２００、５００、１０００または２５００Ｓ− ＣＥＶＵ／ｌからの２つの投与量 繊維材料 ： 老化した黒色の１００％綿５×６ｃｍ（０．９ ｇ）の２スワッチ 乾燥 ： タンブル乾燥 評価： データカラー・エルレフォ・レミッション分光光度計により、光の規約反射率 を測定した。規約反射率をデルタＬ（ハンターＬａｂ値）として計算する。糸か ら突起する表面のフィブリルおよび繊維がセルラーゼにより除去されるとき、表 面はより黒く見え、そしてより低いＬ値が得られる。 試料をブラインド試料、すなわち、酵素を使用しないで洗濯した試料と比較す る。ブラインド試料と比較したデルタＬ規約反射率値を下記に示す。 データが示すように、すべての菌株は試験した条件下にすぐれた色清浄化を与 える（ｎ．ｔ．＝この投与量において試験しなかった）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｓ 11/00 Ｃ１２Ｓ 11/00 Ｄ０６Ｍ 13/46 Ｄ０６Ｍ 13/46 16/00 16/00 Ｄ２１Ｈ 11/20 Ｄ２１Ｈ 5/14 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:80） (31)優先権主張番号 ０８８６／９５ (32)優先日 1995年８月８日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ０８８７／９５ (32)優先日 1995年８月８日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ０８８８／９５ (32)優先日 1995年８月８日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ０１３７／９６ (32)優先日 1996年２月12日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラッセン，ソーレン フレンステド デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 カウピネン，マルクス サカリ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ランゲ，レーヌ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ニールセン，ルビュ イルム デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 井原 美智子 千葉市中瀬１−３ 幕張テクノガーデンＣ Ｂ−６ ノボ ノルディスクバイオインダ ストリー株式会社 (72)発明者 高木 忍 千葉市中瀬１−３ 幕張テクノガーデンＣ Ｂ−６ ノボ ノルディスクバイオインダ ストリー株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．セルロース分解活性を有し、そして下記の配列 を有する１４アミノ酸残基から成る第１アミノ酸配列と、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２アミノ酸配列とを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、１２および１４において、そして第２配 列の位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のも のであり、ただし、第１アミノ酸配列において、（ｉ）位置１２におけるアミノ 残基がＳｅｒであるとき、位置１４におけるアミノ酸残基はＳｅｒではなく、そ して（ｉｉ）位置１２におけるアミノ残基がＧｌｙであるとき、位置１４におけ るアミノ酸残基はＡｌａではない、酵素から本質的に成る酵素調製物。 ２．第１配列の位置９におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バリン 、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、システイ ン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニンおよびトリプト ファンから成る群より選択され、好ましくはプロリンおよびスレオニンから成る 群より選択される、請求項１に記載の酵素調製物。 ３．第１配列の位置１０におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バリ ン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、システ イン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニンおよびトリプ トファン、好ましくはセリンから成る群より選択される、請求項１または２に記 載の酵素調製物。 ４．第１配列の位置１２におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バリ ン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、システ イン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニンおよびトリプ トファンから成る群より選択され、好ましくはアラニンおよびグリシンから成る 群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ５．第１配列の位置１４におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バリ ン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、システ イン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニン、トリプトフ ァン、グルタミン酸およびアスパラギン酸から成る群より選択され、好ましくは プロリン、スレオニン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびアスパラギン酸 から成る群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ６．第２配列の位置４におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオ ニン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシ ン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニン、 トリプトファン、グルタミン酸およびアスパラギン酸から成る群より選択され、 好ましくはアラニン、グリシンおよびグルタミンから成る群より選択される、請 求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ７．第１配列において、位置３におけるアミノ酸残基がチロシンであるか、ま たは位置４におけるアミノ酸残基がトリプトファンであるか、または位置８にお けるアミノ酸残基がリジンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素調 製物。 ８．第１配列が配列 から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜７のいずれか 一項に記載の酵素調製物。 ９．微生物由来、好ましくは真菌由来である、請求項１〜８のいずれか一項に 記載の酵素調製物。 １０．請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素調製物をコードするＤＮＡ構 築物。 １１．セルロース分解活性を有し、そして菌じん網（Ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔ ｅｓ）（バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ））に属する菌株から得 ることができる酵素から本質的に成る酵素調製物であって、前記酵素は配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、位置４において 、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１および７において 、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものである、酵素調製物 。 １２．位置７におけるアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）である、請求項１ １に記載の酵素調製物。 １３．位置１におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン （Ｔｈｒ）およびアラニン（Ａｌａ）から成る群より選択される、請求項１１に 記載の酵素調製物。 １４．前記酵素が下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の酵素調製物。 １５．前記酵素がアガリカーレス（Ａａｇａｒｉｃａｌｅｓ）、アフィロホラ ーレス（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）、およびアウリクラリアーレス（Ａ ｕｒｉｃｕｌａｒｉａｌｅｓ）目から成る群より選択される菌株から得ることが できる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の酵素調製物。 １６．前記酵素がエクシジアセエ（Ｅｘｉｄｉａｃｅａｅ）、トリコロマタセ エ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａｅ）、コプリナセエ（Ｃｏｐｒｉｎａｃｅ ａｅ）、シゾフィラセエ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ブジェルカン デラセエ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａｃｅａｅ）およびポリポラセエ（Ｐｏｌｙｐ ｏｒａｃｅａｅ）族、エキシジア（Ｅｘｉｄｉａ）、クリニペリス（Ｃｒｉｎｉ ｐｅｌｌｉｓ）、フォメス（Ｆｏｍｅｓ）、パネオルス（Ｐａｎａ ｅｏｌｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏ ｐｈｙｌｕｍ）、およびスポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）属から成 る群に属する菌株から得ることができる、請求項１５に記載の酵素調製物。 １７．前記酵素がエキシジア・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄｕｌ ｏｓａ）、クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌ ａ）、フォメス・フォメンタリウス（Ｆｏｍｅｓ ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、 およびスポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）ｓｐ．種から成る群に属す る菌株から、好ましくはエキシジア・グランヅロサ（Ｅｘｉｄｉａ ｇｌａｎｄ ｕｌｏｓａ）、ＣＢＳ ２７７．９６、クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐ ｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）、ＣＢＳ ２８０．９６、フォメス・フォメン タリウス（Ｆｏｍｅｓ ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、ＣＢＳ ２７６．９６、お よびスポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）ｓｐ．、ＣＢＳ ２８３．９ ６から成る群に属する菌株から得ることができる、請求項１６に記載の酵素調製 物。 １８．セルロース分解活性を有し、そしてキトリジオミコタ（Ｃｈｙｔｒｉｄ ｉｏｍｙｃｏｔａ）に属する菌株から得ることができる酵素から本質的に成る酵 素調製物であって、前記酵素は配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、位置４において 、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１および７において 、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものである、酵素調製物 。 １９．位置７におけるアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）である、請求項１ ８に記載の酵素調製物。 ２０．位置１におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン （Ｔｈｒ）およびアラニン（Ａｌａ）から成る群より選択される、請求項１８に 記載の酵素調製物。 ２１．前記酵素が下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するア ミノ酸残基の任意のものである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の酵素 調製物。 ２２．前記酵素がキトリジオミセテス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ） のクラスに属する、好ましくはキトリジアーレス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉａｌｅｓ） 、スピゼロミセターレス（Ｓｐｉｚｅｌｌｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、ハルポキト リアーレス（Ｈａｒｐｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）、およびブラストクラジアーレ ス（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉａｌｅｓ）目に属する菌株から得ることができる、 請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ２３．前記酵素がスピゼロミセタセエ（Ｓｐｉｚｅｌｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａ ｅ）族に属する、好ましくはリゾフリクチス（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ）属 に属する、好ましくはリゾフリクチス・ロセア（Ｒｈｉｚｏｐｈｌｙｃｔｉｓ ｒｏｓｅａ）種、特にリゾフリクチス・ロセア（Ｒ．ｒｏｓｅａ）、ＣＢＳ ２ ８２．９６種に属する菌株から得ることができる、請求項２２に記載の酵素調製 物。 ２４．セルロース分解活性を有し、そしてジゴミコタ（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ ）に属する菌株から得ることができる酵素から本質的に成る酵素調製物であって 、前記酵素は配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、 位置４において、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１お よび７において、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものであ る、酵素調製物。 ２５．位置７におけるアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）である、請求項２ ４に記載の酵素調製物。 ２６．位置１におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン （Ｔｈｒ）およびアラニン（Ａｌａ）から成る群より選択される、請求項２４に 記載の酵素調製物。 ２７．前記酵素が下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、請求項２４〜２６のいずれか一項 に記載の酵素調製物。 ２８．前記酵素がジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）のクラスに属する 、好ましくはムコラーレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目に属する菌株から得ること ができる、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ２９．前記酵素がムコラセア（Ｍｕｃｏｒａｃｅａ）およびタムニジアセエ（ Ｔｈａｍｎｉｄｉａｃｅａｅ）から成る群に属する、好ましくはリゾムコル（Ｒ ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、フィコミセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）およびケトスチ ルム（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕｍ）属から成る群に属する菌株から得ることがで きる、請求項２８に記載の酵素調製物。 ３０．前記酵素がリゾムコル・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌ ｌｕｓ）、フィコミセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｅｎｓ）、 ケトスチルム・フレセニイ（Ｃｈａｅｔｏｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ）種 、好ましくはリゾムコル・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ ）、ＩＦＯ４５７８、フィコミセス・ニテンス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔ ｅｎｓ）、ＩＦＯ ４８１４、およびケトスチルム・フレセニイ（Ｃｈａｅｔｏ ｓｔｙｌｕｍ ｆｒｅｓｅｎｉｉ）、ＮＲＲＬ ２３０５から成る群に属する菌 株から得ることができる、請求項２９に記載の酵素調製物。 ３１．セルロース分解活性を有し、そしてアルケアスコミセテス（Ａｒｃｈａ ｅａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ジスコミセテス（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、 ヘルミアスコミセテス（Ｈｅｒｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ロクロアスコミ セテス（Ｌｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、およびプレクトミセテス（Ｐ ｌｅｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）から成る群に属する菌株から得ることができる酵素 から本質的に成る酵素調製物であって、前記酵素は配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、位置４において 、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１および７において 、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものである、酵素調製物 。 ３２．位置７におけるアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）である、請求項３ １に記載の酵素調製物。 ３３．位置１におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン （Ｔｈｒ）およびアラニン（Ａｌａ）から成る群より選択される、請求項３１に 記載の酵素調製物。 ３４．前記酵素が下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ３５．前記酵素がペジザーレス（Ｐｅｚｉｚａｌｅｓ）、フィチスマターレス （Ｐｈｙｔｉｓｍａｔａｌｅｓ）、ドチデアーレス（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ） 、およびエウロチアーレス（Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓ）目から成る群に属する菌株 から得ることができる、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ３６．前記酵素がククルビタリアセエ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｒｉａｃｅａｅ） 、リチスマタセエ（Ｒｈｙｔｉｓｍａｔａｃｅａｅ）、アスコボラセエ（Ａｓｃ ｏｂｏｌｃｅａｅ）、およびトリココマセエ（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ） 族から成る群に属する、好ましくはジプロジア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、ミクロス フェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）、ウロスポラ（Ｕｌｏｓｐ ｏｒａ）、マクロフォミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）、アスコボルス（Ａｓ ｃｏｂｏｌｕｓ）、サッコボルス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐ ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、およびテロモミセス（Ｔｈｅｒｏｍｏｍｙｃｅｓ）属 から成る群に属する菌株から得ることができる、請求項３５に記載の酵素調製物 。 ３７．前記酵素がジプロジア・ゴッシピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓ ｉｓ）ｓｐ．、ウロスポラ・ビルグラミイ（Ｕｌｏｓｐｏｒａ ｂｉｌｇｒａｍ ｉｉ）、マクロフォミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓ ｅｏｌｉｎａ）、アスコボラス・スチクトイデス（Ａｓｃｏｂｏｌｕｓ ｓｔｉ ｃｔｏｉｄｅｓ）、サッコボラス・ジルテラス（Ｓａｃｃｏｂｏｌｕｓ ｄｉｌ ｕｔｅｌｌｕｓ）、ペニシリウム・ベルクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖ ｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、およびテロモミセス・ベルクロスス（Ｔｈｅ ｒｏｍｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｓ）種、好ましくはジプロジア・ゴッ シピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）、ＣＢＳ ２７４．９６、ウ ロスポラ・ビルグラミイ（Ｕｌｏｓｐｏｒａ ｂｉｌｇｒａｍｉｉ）、ＮＫＢＣ １４４４、マクロフォミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈ ａｓｅｏｌｉｎａ）、ＣＢＳ ２８１．９６、サッコボルス・ジルテルス（Ｓａ ｃｃｏｂｏｌｕｓ ｄｉｌｕｔｅｌｌｕｓ）、ＣＢＳ ２７５．９６、ペニシリ ウム・ベルクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、 ＡＴＣＣ ６２３９６、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ＡＴＣＣ ９４８０、およびテロモミセス・ベル クロスス（Ｔｈｅｒｏｍｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｓ）、ＣＢＳ ２８ ５．９６から成る群に属する菌株から得ることができる、請求項３６に記載の酵 素調製物。 ３８．セルロース分解活性を有し、そしてジアポルターレス（Ｄｉａｐｏｒｔ ａｌｅｓ）、キシラリアーレス（Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ）、トリコアフェリアー レス（Ｔｒｉｃｈｏａｐｈａｅｒｉａｌｅｓ）およびフィラコラーレス（Ｐｈｙ ｌｌａｃｈｏｒａｌｅｓ） 目から成る群に属する菌株から得ることができる酵素から本質的に成る酵素調製 物であって、前記酵素は配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、位置４において 、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１および７において 、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものである、酵素調製物 。 ３９．位置７におけるアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）である、請求項３ ８に記載の酵素調製物。 ４０．位置１におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン （Ｔｈｒ）およびアラニン（Ａｌａ）から成る群より選択される、請求項３８に 記載の酵素調製物。 ４１．前記酵素が下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、こ こで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ４２．前記酵素がキシラリアセエ（Ｘｙｌａｒｉａｃｅａｅ）、バルサセエ（ Ｖａｌｓａｃｅａｅ）、およびフィラコラセエ（Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｃｅａ ｅ）から成る群に属する、好ましくはジアポルテ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ）、コレ トトリクム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐ ｏｒａ）、キシラリア（Ｘｙｌａｒｉａ）、ノヅリスポルム（Ｎｏｄｕｌｉｓｐ ｏｒｕｍ）およびポロニア（Ｐｏｒｏｎｉａ）属から成る群に属する菌株から得 ることができる、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ４３．前記酵素がジアポルテ・シンゲネシア（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｙｎｇ ｅｎｅｓｉａ）、コレトトリクム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕ ｍ ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）ｓｐ．、 キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ）、ノヅリス ポルム（Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｕｍ）ｓｐ．およびポロニア・プンクタタ（Ｐｏ ｒｏｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）種、好ましくはジアポルテ・シン ゲネシア（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｙｎｇｅｎｅｓｉａ）、ＣＢＳ ２７８．９ ６、コレトトリクム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅ ｎａｒｉｕｍ）、ＡＴＣＣ ５２６０９、ニグロスポラ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ ）ｓｐ．、ＣＢＳ ２７２．９６、キシラリア・ヒポキシロン（Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ）、ＣＢＳ ２８４．９６から成る群に属する菌株から得 ることができる、請求項４２に記載の酵素調製物。 ４４．セルロース分解活性を有し、そしてネクトリアセエ（Ｎｅｃｔｒｉａｃ ｅａｅ）、ソルダリアセエ（Ｓｏｒｄａｒｉａｃｅａｅ）、ケトミアセエ（Ｃｈ ａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）、セラトストマセエ（Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍａｃｅａ ｅ）、ラシオスフェリアセエ（Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）族および アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａ ｄｉｕｍ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、シリンドロカルポン（ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）およびボルテラ（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ）属から 成る群に属する菌株から得ることができる酵素から本質的に成る酵素調製物であ って、前記酵素は配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、位置４において 、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１および７において 、Ｘａａは２０の天然に存在するアミ ノ酸残基の任意のものである、酵素調製物。 ４５．位置７におけるアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）である、請求項４ ４に記載の酵素調製物。 ４６．位置１におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン （Ｔｈｒ）およびアラニン（Ａｌａ）から成る群より選択される、請求項４４に 記載の酵素調製物。 ４７．前記酵素が下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ４８．前記酵素がシリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒ ｐｏｎ）、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ボルテラ（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ）、 ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）、チエラヴィア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、シパ ストスポラ（Ｓｙｐａｓｔｏｓｐｏｒａ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｒａ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔ ａｌｉｄｉｕｍ）、クラドリヌム（Ｃｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍ）、グリオクラジ ウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属 から成る群に属する菌株から得ることができる、請求項４４〜４７のいずれか一 項に記載の酵素調製物。 ４９．前記酵素がシリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）ｓｐ ．、ネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）、ボルテラ・コレトト リコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、ソ ルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）、ソルダリア・ マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラヴィア・テ レストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チエラヴィア・テ ルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、シスパストスポ ラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ ｂｏｎｉｎｅｎｓｉｓ）、ク ラドリヌム・フェクンジシムム（Ｃｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍ ｆｏｅｃｕｎｄｉ ｓｓｉｍｕｍ）、ケトミウム・ムロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｍｕｒｏｒｕ ｍ）、ケトミウム・ヴィレスンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ ）、ケトミウム・ブラシリエンシス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅ ｎｓｉｓ）、ケトミウム・クニコロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｃｕｎｉｃｏ ｌｏｒｕｍ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、グリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌｉｏｃｌ ａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、シタリジウム・テルモフィラ（Ｓｃｙ ｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、およびアクレモニウム（Ａｃｒ ｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．種、好ましくはグリオクラジウム・カテヌラツム（Ｇｌ ｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ＡＴＣＣ １０５２３および ＣＢＳ ２２７．４８、ネクトリア・ピネア（Ｎｅｃｔｒｉａ ｐｉｎｅａ）、 ＣＢＳ ２７９．９６、ボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、ＣＢＳ ４００．５８、ソルダリア・ フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）、ＡＴＣＣ ５２６４４、 ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、ＡＴ ＣＣ ６０２５５、チエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｓ）、ＮＲＲＬ ８１２６、チエラヴィア・テルモフィラ（Ｔｈｉ ｅｌａｖｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ＣＣＢＳ １７４．７０、ケトミウ ム・ムロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｍｕｒｏｒｕｍ）、ＣＢＳ １６３．５ ２、ケトミウム・ヴィレスンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ） 、ＣＢＳ ５４７．７５、ケトミウム・ブラシリエンシス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕ ｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ＣＢＳ １２２．６５、ケトミウム・クニコ ロルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｃｕｎｉｃｏｌｏｒｕｍ）、ＣＢＳ ７９９． ８３、シスパストスポラ・ボニネンシス（Ｓｙｓｐａｓｔｏｓｐｏｒａ ｂｏｎ ｉｎｅｎｓｉｓ）、ＮＫＢＣ １５１５、クラドリヌム・フェクンジシムム（Ｃ ｌａｄｏｒｒｈｉｎｕｍ ｆｏｅｃｕｎｄｉｓｓｉｍｕｍ）、ＡＴＣＣ ６２３ ７３、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅ ｒｍｏｐｈｉｌａ）、ＣＢＳ １１７．６５、シタリジウム・テルモフィラ（Ｓ ｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐ ｈｉｌａ）、ＡＴＣＣ ２８０８５、およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉ ｕｍ）ｓｐ．、ＣＢＳ ４７８．９４から成る群に属する菌株から得ることがで きる、請求項４８に記載の酵素調製物。 ５０．セルロース分解活性を有し、そしてフザリウム・リコペルシシ（Ｆｕｓ ａｒｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・パシフロラ（Ｆｕｓａｒ ｉｕｍ ｐａｓｉｆｌｏｒａ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏ ｌａｎｉ）、フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏ ｉｄｅｓ）、フザリウム・ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、フミコラ・ ニグレセンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）およびフミコラ・グ リセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）種から成る群に属する菌株から得る ことができる酵素から本質的に成る酵素調製物であって、前記酵素は配列 および から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、位置４において 、ＸａａはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、そして位置１および７において 、Ｘａａは２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものである、酵素調製物 。 ５１．位置７におけるアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）である、請求項５ ０に記載の酵素調製物。 ５２．位置１におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ａｓｐ） 、スレオニン（Ｔｈｒ）およびアラニン（Ａｌａ）から成る群より選択される、 請求項５０に記載の酵素調製物。 ５３．前記酵素が下記の配列 を有する１３アミノ酸残基から成る第１ペプチドと、下記の配列 を有する５アミノ酸残基から成る第２ペプチドとを含んでなり、ここで、 第１配列の３位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の４位置において、アミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、 第１配列の８位置において、アミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、 第１配列の、それぞれ、位置９、１０、および１２において、そして第２配列の 位置４において、アミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のもので ある、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ５４．前記酵素がフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓ ｐｏｒｕｍ）ｓｓｐリコペルシシ（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ＣＢＳ ６４５ ．７８、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ）ｓｓｐパシフロラ（ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、ＣＢＳ ７４４．７９、フザリ ウム・ソラニ （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、ＩＭＩ １０７．５１１、フザリウム・ アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、ＩＦＯ ４４ ６７、フザリウム・ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ）、ＡＴＣＣ ６０８ ８３、フミコラ・ニグレセンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、 ＣＢＳ ８１９．７３、およびフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉ ｓｅａ）、ＡＴＣＣ ２２７２６菌株から成る群に属する菌株から得ることがで きる、請求項５３に記載の酵素調製物。 ５５．第１配列の位置９におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バリ ン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、システ イン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニンおよびトリプ トファンから成る群より選択され、好ましくはプロリンおよびスレオニンから成 る群より選択される、請求項１４〜１７、２１〜２３、２７〜３０、３４〜３７ 、４１〜４３、４７〜４９、５３および５４のいずれか一項に記載の酵素調製物 。 ５６．第１配列の位置１０におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バ リン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、シス テイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニンおよびトリ プトファン、好ましくはセリンから成る群より選択される、請求項１４〜１７、 ２１〜２３、２７〜３０、３４〜３７、４１〜４３、４７〜４９、５３および５ ４のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ５７．第１配列の位置１２におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バ リン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、シス テイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニンおよびトリ プトファンから成る群より 選択され、好ましくはアラニンおよびグリシンから成る群より選択される、請求 項１４〜１７、２１〜２３、２７〜３０、３４〜３７、４１〜４３、４７〜４９ 、５３および５４のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ５８．第２配列の位置４におけるアミノ酸残基がプロリン、スレオニン、バリ ン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、システ イン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニン、トリプトフ ァン、グルタミン酸およびアスパラギン酸から成る群より選択され、好ましくは アラニン、グリシンおよびグルタミンから成る群より選択される、請求項１４〜 １７、２１〜２３、２７〜３０、３４〜３７、４１〜４３、４７〜４９、５３お よび５４のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ５９．第１配列において、位置３におけるアミノ酸残基がチロシンであるか、 または位置４におけるアミノ酸残基がトリプトファンであるか、または位置８に おけるアミノ酸残基がリジンである、請求項１４〜１７、２１〜２３、２７〜３ ０、３４〜３７、４１〜４３、４７〜４９、５３および５４のいずれか一項に記 載の酵素調製物。 ６０．請求項１１〜５９のいずれか一項に記載の酵素をコードするＤＮＡ構築 物。 ６１．第１配列が配列 から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４〜１７、２１ 〜２３、２７〜３０、３４〜３７、４１〜４３、４７〜４９、５３および５４の いずれか一項に記載の酵素調製物。 ６２．第１図に示す保存された領域のいずれかから誘導されたオリゴヌクレオ チドを使用する標準的条件下におけるハイブリダイゼーション、例えば、ＰＣＲ 増幅を含んでなる、請求項１〜９、１１〜５９および６１のいずれか一項に記載 の酵素調製物の中に存在する酵素をコードする遺伝子を含んでなる微生物株を生 産する方法。 ６３．オリゴヌクレオチドが、 ａ． 位置３または４におけるアミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅである；位置８ におけるアミノ酸はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである；それぞれ、位置９、１ ０、１２および１４におけるアミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任 意のものである；および ｂ． 位置４におけるアミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものであ る；および ｃ． 位置１におけるアミノ酸はＭｅｔまたはＩｌｅである；それぞれ、位置６および ８におけるアミノ酸はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌである；および ｄ． 位置３におけるアミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸残基の任意のものであ る；それぞれ、位置４および６におけるアミノ酸はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅ である；そして位置９におけるアミノ酸はＰｈｅまたはＭｅｔである； から成る群より選択されるペプチドにおいて構成された少なくともペンタペプチ ドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項６２に記載の方法。 ６４．オリゴヌクレオチドが請求項６３に記載の配列に対して相補的なヌクレ オチド配列を含んでなる、請求項６２に記載の方法。 ６５．オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲプライマー センス、 ５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＩ^A／_CＧＩＴＡ^C／_TＴＧＧＧ Ａ^C／_TＴＧ^C／_TＴＧ^C／_TＡＡ^A／_G ^A／_CＣ−３’； アンチセンス１、 ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡ^A／_GＣＡＩＧＣ^A／_GＣＡ^A／_GＣＡＣＣ−３’； アンチセンス２、 ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＩＡ^A／_G／^TＩＣＣＩＡ^A／^C／^GＩＣＣＩＣＣＩ ＣＣＩＧＧ−３’；および アンチセンス３、 ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＩＡＡＣＣＡ^A／_GＴＣＡ^A／_G ^A／_TＡＩＣ^G／_TＣＣ− ３’； から成る群より選択されるＰＣＲプライマーに相当する、請求項６３に記載の方 法。 ６６．セルロース分解活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤ ＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．１に示すＤＮＡ配列、および／またはサッカロミセス・セレ ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７ ０中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．１に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０中のプラ スミドから得ることができるＤＮＡ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．１に示すＤＮＡ配列および／またはサッカロミセス・セ レビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７ ７０中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と相同性である、好ましく は少なくとも７０％相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．１に示すＤＮＡ配 列および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０中のプラスミドから得ることができる ＤＮＡ配列と同一のヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．１に示すＤＮＡ配列および／またはサッカロミセス・セ レビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７ ７０中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列に よりコードされるポリペプチドと相同性である、好ましくは少なくとも６５％相 同性であるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．１に示すか、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ ９７７０中のプラス ミドから得ることができるＤＮＡ配列によりコードされる精製されたエンドグル カナーゼに対して発生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコード する、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ６７．前記ＤＮＡ配列がケトミアセエ（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）族に属 する、好ましくはミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属する 菌株、特にミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、こ とにミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ＣＢＳ １１７．６５の菌株のＤＮＡライブラリーから単離されるか、または前記ＤＮＡ ライブラリーに基づいて生産される、請求項６６に記載のＤＮＡ構 築物。 ６８．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでな るＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．４に示すＤＮＡ配列、および／またはサッカロミセス・セレ ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００ ８２中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．４に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８２中のプ ラスミドから得ることができるＤＮＡ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．４に示すＤＮＡ配列および／またはサッカロミセス・セ レビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １０ ０８２中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と相同性である、好まし くは少なくとも７０％相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．４に示すＤＮＡ配 列および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８２中のプラスミドから得ることができ ＤＮＡ配列と同一のヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．４に示すＤＮＡ配列および／またはサッカロミセス・セ レビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １０ ０８５中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列 によりコードされるポリペプチドと相同性である、好まし くは少なくとも６０％相同性であるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．４に示すか、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８２中のプラ スミドから得ることができるＤＮＡ配列によりコードされる精製されたエンドグ ルカナーゼに対して発生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコー ドする、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ６９．前記ＤＮＡ配列がヒポクレアセエ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ）族に属 する、好ましくはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する菌株、特 にアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．ＣＢＳ ４７８．９４に属す る菌株のＤＮＡライブラリーから単離されるか、または前記ＤＮＡライブラリー に基づいて生産される、請求項６８に記載のＤＮＡ構築物。 ７０．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでな るＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．６に示すＤＮΛ配列、またはサッカロミセス・セレビシエ（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８０中の プラスミドから得ることができるＤＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．６に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８０中のプ ラスミドから得ることができるＤＮＡ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．６に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８０中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配 列と相同性である、好ましくは少なくとも６５％相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．６に示すＤＮＡ配 列またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８０中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ 配列と同一のヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．６に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８０中 のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列によりコ ードされるポリペプチドと相同性である、好ましくは少なくとも７０％相同性で あるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．６に示すか、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８０中のプラ スミドから得ることができるＤＮＡ配列によりコードされる精製されたエンドグ ルカナーゼに対して発生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコー ドする、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ７１．前記ＤＮＡ配列がケトミアセエ（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）族に属 する、好ましくはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、特にアクレモニ ウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ｓｐ．ＣＢＳ ４７８．９４に属する菌株のＤＮ Ａライブラリーから単離されるか、または前記ＤＮＡライブラリーに基づいて生 産される、請 求項７０に記載のＤＮＡ構築物。 ７２．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでな るＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．８に示すＤＮＡ配列、またはサッカロミセス・セレビシエ（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８１中の プラスミドから得ることができるＤＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．８に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８１中のプ ラスミドから得ることができるＤＮＡ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．８に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８１中 のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と相同性である、好ましくは少な くとも７５％相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．８に示すＤＮＡ配 列またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８１中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ 配列と同一のヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．８に示すＤＮＡ配列またはサッカロミセス・セレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８１中 のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列によりコ ードされるポリペプチドと相同性である、好ましくは少な くとも７０％相同性であるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．８に示すか、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ １００８１中のプラ スミドから得ることができるＤＮＡ配列によりコードされる精製されたエンドグ ルカナーゼに対して発生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコー ドする、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ７３．前記ＤＮＡ配列がケトミアセエ（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）族に属 する、好ましくはチエラヴィア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属に属する菌株、特にチ エラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、こ とにチエラヴィア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ ）、ＮＲＲＬ ８１２６の菌株のＤＮＡライブラリーから単離されるか、または 前記ＤＮＡライブラリーに基づいて生産される、請求項７２に記載のＤＮＡ構築 物。 ７４．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでな るＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．１０に示すＤＮＡ配列、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２中のプラスミドから得ることができるＤ ＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．１０に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２中のプラスミドから得ることができるＤＮ Ａ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．１０に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２中のプラスミドから得ることができる ＤＮＡ配列と相同性で ある、好ましくは少なくとも６５％相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．１０に示すＤＮＡ 配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２ 中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と同一のヌクレオチドプローブ とハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．１０に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２中のプラスミドから得ることができる ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと相同性で ある、好ましくは少なくとも５５％相同性であるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．１０に示すか、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１２中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ 配列によりコードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して発生した抗体と 免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードする、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ７５．前記ＤＮＡ配列がリチスマタセエ（Ｒｈｙｔｉｓｍａｔａｃｅａｅ）族 、好ましくはマクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属、特にマクロホミナ ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、ことに マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍ．ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）、ＣＢＳ ２８ １．９６に属する菌株からのＤＮＡライブラリーから単離されるか、または前記 ＤＮＡライブラリーに基づいて生産される、請求項７４に記載のＤＮＡ構築物。 ７６．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配 列を含んでなるＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．１２に示すＤＮＡ配列、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１１中のプラスミドから得ることができるＤ ＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．１２に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１１中のプラスミドから得ることができるＤＮ Ａ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．１２に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１１中のプラスミドから得ることができる ＤＮＡ配列と相同性である、好ましくは少なくとも６０％相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．１２に示すＤＮＡ 配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１１中 のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と同一のヌクレオチドプローブと ハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．１２に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１１中のプラスミドから得ることができる ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと相同性で ある、好ましくは少なくとも６０％相同性であるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．１２に示すか、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５１１中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ 配列によりコードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して発生した抗体と 免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードする、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ７７．前記ＤＮＡ配列がトリコロマタセエ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａ ｅ）族、好ましくはクリニペリス（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ）属、特にクリニペ リス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ ｓｃａｂｅｌｌａ）属、ことにクリ ニペリス・スカベラ（Ｃ．ｓｃａｂｅｌｌａ）、ＣＢＳ ２８０．９６に属する 菌株からのＤＮＡライブラリーから単離されるか、または前記ＤＮＡライブラリ ーに基づいて生産される、請求項７６に記載のＤＮＡ構築物。 ７８．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでな るＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．１６に示すＤＮＡ配列、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７１中のプラスミドから得ることができるＤ ＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．１６に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７１中のプラスミドから得ることができるＤＮ Ａ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．１６に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７１中のプラスミドから得ることができる ＤＮＡ配列と相同性である、好ましくは少なくとも６０％相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．１６に示すＤＮＡ 配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７１ 中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と同一のヌクレオチドプローブ とハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．１６に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７１中 のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列によりコ ードされるポリペプチドと相同性である、好ましくは少なくとも６０％相同性で あるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．１６に示すか、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７１中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ 配列によりコードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して発生した抗体と 免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードする、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ７９．前記ＤＮＡ配列がボルテラ（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ）、特にボルテラ・コ レトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｄｅ ｓ）、ことにボルテラ・コレトトリコイデス（Ｖ．ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｏ ｉｄｅｓ）、ＣＢＳ ４００．５８に属する菌株からのＤＮＡライブラリーから 単離されるか、または前記ＤＮＡライブラリーに基づいて生産される、請求項７ ８に記載のＤＮＡ構築物。 ８０．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでな るＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列は、 ａ）配列識別Ｎｏ．１９に示すＤＮＡ配列、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤ ＮＡ配列、または ｂ）配列識別Ｎｏ．１９に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮ Ａ配列の類似体、前記類似体は、 ｉ） 配列識別Ｎｏ．１９に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７６中 のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と相同性である、 ｉｉ） 本明細書において記載する条件下に、配列識別Ｎｏ．１９に示すＤＮＡ 配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７６ 中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列と同一のヌクレオチドプローブ とハイブリダイゼーションする、 ｉｉｉ）配列識別Ｎｏ．１９に示すＤＮＡ配列または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができる ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと相同性で あるポリペプチドをコードする、 ｉｖ） 配列識別Ｎｏ．１９に示すか、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ １０５７６中のプラスミドから得ることができるＤＮＡ 配列によりコードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して発生した抗体と 免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードする、 を含んでなる、ＤＮＡ構築物。 ８１．前記ＤＮＡ配列がソルダリアセエ（Ｓｏｒｄａｒｉａｃｅａｅ）族、好 ましくはソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属、特にソルダリア・フィミコラ（Ｓ ｏｒｄａｒｉａ ｆｉｍｉｃｏｌａ）、ことにソルダリア・フィミコラ（Ｓ．ｆ ｉｍｉｃｏｌａ）、ＡＴＣＣ ５２６４４に属する菌株からのＤＮＡライブラリ ーから単離されるか、または前記ＤＮＡライブラリーに基づいて生産される、請 求項８０に記載のＤＮＡ構築物。 ８２．セルロース結合ドメインをコードするＤＮＡ配列をさらに含んでなる、 請求項６６〜８１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築 物。 ８３．セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）をコードするＤＮＡ配列をさらに含 んでなり、前記セルロース結合ドメインおよび前記ＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列に よりコードされる前記酵素の酵素コア（触媒的に活性なドメイン）は作用可能に 連鎖されている、請求項８２に記載のＤＮＡ構築物。 ８４．請求項６２〜８３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる組 換え発現ベクター。 ８５．請求項６２〜８３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または請求項８ ４に記載の組換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ８６．真核細胞、特に真菌細胞、例えば、酵母細胞またはフィラメント状真菌 細胞、または遺伝子が由来する内因性細胞である、請求項８５に記載の細胞。 ８７．前記細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株、 特にフザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ）、アスペギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアス ペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の菌株に属する 、請求項８６に記載の細胞。 ８８．請求項８５〜８７のいずれか一項に記載の細胞を酵素の産生を可能とす る条件下に培養し、そして酵素を培養物から回収することを含んでなる、エンド グルカナーゼ活性を示す酵素を生産する方法。 ８９．ａ）請求項６６〜８３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によりコー ドされる、ｂ）請求項８８に記載の方法により生産されるか、またはｃ）配列の リストの配列識別Ｎｏ．１、４、６、８ 、１０、１２、１６、１９のいずれかに示すＤＮＡ配列によりコードされる精製 されたエンドグルカナーゼに対して発生した抗体と免疫学的に反応性である、エ ンドグルカナーゼ活性を示す酵素。 ９０．請求項１〜９、１１〜６１および８９のいずれか一項に記載の酵素調製 物を含んでなるソーキング、洗濯またはすすぎ液で洗濯物を処理することを含ん でなる、洗濯物を色清浄化する方法。 ９１．前記洗濯物を洗濯機中で処理する、請求項９０に記載の方法。 ９２．前記エンドグルカナーゼが前記ソーキング、洗濯またはすすぎ液中に、 機械サイクル使用状態の間に、前記液の１リットル当たり１〜１０００Ｓ−ＣＥ ＶＵ、好ましくは５〜２００Ｓ−ＣＥＶＵの有効量で存在する、請求項９０また は９１に記載の方法。 ９３．前記ソーキング、洗濯またはすすぎ液のｐＨが４〜１１、好ましくは６ 〜１０．５である、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。 ９４．温度が１５℃〜６０℃である、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載 の方法。 ９５．前記ソーキング、洗濯またはすすぎ液がプロテアーゼ、セルラーゼ、キ シラナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼおよびラッカーゼから成 る群より選択される１またはそれ以上の酵素をさらに含んでなる、請求項９０〜 ９４のいずれか一項に記載の方法。 ９６．請求項１〜９、１１〜６１および８９のいずれか一項に記載の酵素調製 物と、界面活性剤、ビルダー合物、および布帛柔軟剤から成る群より選択される 化合物とを含んでなる洗濯組成物。 ９７．プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペ ルオキシダーゼおよびラッカーゼから成る群より選択 される１またはそれ以上の酵素をさらに含んでなる、請求項９６に記載の洗濯組 成物。 ９８．前記界面活性剤が非イオン、アニオン、カチオン、双性イオン、両性（ ａｍｐｈｏｌｙｔｉｃ）または両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）界面活性剤である 、請求項９７に記載の組成物。 ９９．前記布帛柔軟剤がカチオンまたは非イオン柔軟剤、好ましくは第四級ア ンモニウム化合物であり、そして必要に応じて界面活性剤、電解質、緩衝剤、酸 化防止剤および液体担体をさらに含んでなる、請求項９８に記載の組成物。 １００．植物材料、例えば、細胞壁を分解または変性するための請求項１〜９ 、１１〜６１および８９のいずれか一項に記載の酵素の使用。 １０１．布帛または繊維材料を処理するための、逆汚染を防止するための、バ イオ−ポリッシング（ｂｉｏ−ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）のための、またはセルロー ス布帛を「ストーン−ウォッシング（ｓｔｏｎｅ−ｗａｓｈｉｎｇ）」するため の請求項１〜９、１１〜６１および８９のいずれか一項に記載の酵素の使用。 １０２．紙パルプ処理のための、好ましくはデバーキング（ｄｅｂａｒｋｉｎ ｇ）、デフィブレイション（ｄｅｆｉｂｒａｔｉｏｎ）、繊維変性、酵素的デイ ンキング（ｄｅ−ｉｎｋｉｎｇ）または排水の改良のための請求項１〜９、１１ 〜６１および８９のいずれか一項に記載の酵素の使用。 １０３．請求項１〜９、１１〜６１および８９のいずれか一項に記載のセルロ ース分解活性を示す酵素に富んだ酵素調製物。 １０４．ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、ペクチンアセチル エステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリア ーゼ、ペクテートリアーゼ、エンドクル カナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ 、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セルロバイオヒドロラーゼおよ びトランスグルタミナーゼから成る群より選択される１またはそれ以上の酵素を さらに含んでなる、請求項１０３に記載の洗濯組成物。