NO175716B

NO175716B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive, totale og partielle hyaluronsyre-estere

Info

Publication number: NO175716B
Application number: NO862734A
Authority: NO
Inventors: Francesco Della Valle; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1985-07-08
Filing date: 1986-07-07
Publication date: 1994-08-15
Also published as: FI892711A; EP0696598B1; HUT42512A; NO910295D0; DK323686D0; FI862878A0; EP0216453B1; FI912618A0; NO862734D0; SG90006A1; FI94766C; FI892710A0; ES2001512A6; DE3650501T2; FI912619A0; KR870001901B1; NO175716C; EP0216453A3; IN165582B; IE861813L

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive totale og partielle estere av hyaluronsyre som kan anvendes på det farmasøytiske område.

Uttrykket "hyaluronsyre" (også referert til som "HY" heretter) anvendes i litteraturen for å betegne et surt polysakkarid med forskjellige molekylvekter, bestående av rester av D-glukuronsyre og N-acetyl-D-glukosamin, som forekommer naturlig i celleoverflater, de ekstracellulære grunn-substansene i bindevevene hos hvirveldyr, i synovialvæsken i ledd, i øyets glasslegeme, i vevet i navlestrengen hos mennesker og i hanekammer.

Hyaluronsyre spiller en viktig rolle i den biologiske organismen, for det første som en mekanisk bærer for cellene i mange vev, som for eksempel huden, senene, musklene og brusken, og er derfor hovedbestanddelen i den intracellulære matriksen. Men hyaluronsyre har også andre funksjoner i de biologiske prosessene, som for eksempel hydratisering av vevene, smøring, cellemigrering, cellefunksjon og -differen-siering. (Se for eksempel A. Balazs et al., Cosmetics & Toiletries, nr. 5/84, sider 8-17). Hyaluronsyre kan ekstraheres fra de ovennevnte, naturlige vevene, som for eksempel hanekammer eller også fra visse bakterier. Idag kan hyaluronsyre også fremstilles ved hjelp av mikrobiologiske metoder. Molekylvekten til hel hyaluronsyre oppnådd ved ekstraksjon ligger i området på 8-13 millioner. Polysakkaridets molekyl-kjede kan imidlertid nedbrytes ganske lett under innvirkning av forskjellige fysikalske og kjemiske faktorer, som for eksempel mekanisk innvirkning eller under innvirkning av stråling, hydrolysering, oksydering eller enzymatiske midler. Av denne grunn oppnås det ofte nedbrutte fraksjoner med en lavere molekylvekt ved de vanlige rensemetodene av original-ekstrakter. (Se Balazs et al., sitert ovenfor). Hyaluronsyre, dens molekylfraksjoner og de respektive saltene er brukt som medikamenter og deres anvendelse er også foreslått i kosmetika (se for eksempel den ovenfor nevnte artikkel av Balazs et al. og det franske patent nr. 2478468).

Som et terapeutisk middel er hyaluronsyre og dens salter brukt spesielt i terapi for artropatier, som for eksempel i veterinærmedisinen for helbredelse av artritt hos hester [Acta Vet. Scand., 167, 379 (1976)]. Som et hjelpemiddel og erstat-tende, terapeutisk middel for naturlige vev og organer er hyaluronsyre og dens molekylfraksjoner og deres salter brukt i oftalmisk kirurgi (se for eksempel Balazs et al., Modem Problems in Ophthalmology, vol. 10, 1970, s. 3 - E.B. Strieff, S. Karger utg., Basel; Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, Paper presented at the International Congress and First Film Festival on Intraocular Implantation, Cannes, 1979; US-patent nr. 4.328.803 med en oppsummering av litteraturen om bruk av HY i oftalmologi og US-patent nr. 4.141.973.

I EP patentpublikasjon 0138572 er det beskrevet en molekylfraksjon av hyaluronsyre som eksempelvis kan anvendes som natriumsalt, for intraokulære og intra-artikulære injeksjoner egnet for erstatning av henholdsvis indre væsker i øyet og i artropati-terapier.

Selv om uttrykket "hyaluronsyre" vanligvis anvendes på en uriktig måte, idet den betyr, slik det kan sees fra det ovenstående, en hel serie polysakkarider med veksling av rester av D-glukuronsyre og N-acetyl-D-glukosamin med varierende molekylvekter og til og med nedbrutte fraksjoner av disse, og selv om flertallsformen "hyaluronsyrer" kan synes å være mere passende, skal diskusjonen her fortsette å anvende entalls-formen for å referere til hyaluronsyre i sine forskjellige former inkludert dens molekylfraksjoner, og forkortelsen "HY" vil også ofte brukes for å beskrive dette kollektive uttrykket.

Når det gjelder esterne av hyaluronsyre, er det en beskrivelse i litteraturen av metylesteren av en hyaluronsyre med en høy molekylvekt oppnådd ved ekstraksjon fra navlestrenger fra mennesker [Jeanloz et al., J. Biol. Chem., 186

(1950), 495-511 og Jager et al., J. Bacteriology 1065-1067

(1979)]. Denne esteren ble oppnådd ved behandling av den frie hyaluronsyren med diazometan i eterløsning og i denne viste i det vesentlige alle karboksylgruppene seg å være forestret. Videre er det også beskrevet metylestere av oligomerer av HY med mellom ca. 5 og 15 disakkaridenheter [se Biochem. J.

(1977), 167, 711-716]. Det er også beskrevet en metylester av hyaluronsyre som er foretret med metylalkohol i en del av hydroksylalkoholgruppene [Jeanloz et al., J. Biol. Chem., 194,

(1952), 141-150 og Jeanloz et al., Helvetica Chimica Acta 35

(1952), 262-271]. Det er ikke rapportert om noen biologisk aktivitet og derfor ingen farmasøytisk anvendelse av disse esterne.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive, totale og partielle hyaluronsyre-estere, hvor forestringskomponenten er avledet fra en aktiv alkohol og er

en <C>2-18-alkylgruppe;

en Cj-^-alkoksy-karbonyl-C^-alkylgruppe ;

en fenyl-C^-alkyl- eller f enyl-C2-A-alkenyl-gruppe;

en benzyl-gruppe eller benzyl substituert med en C^-alkylgruppe eller 1 til 3 metyl- eller metoksy-gruppe(r), eller halogenatomer; eller

en rest av en steroid-alkohol;

f.eks. hvor forestringskomponenten er avledet fra en terapeutisk aktiv alkohol valgt fra gruppen bestående av kortison, hydrokortison, fluorkortison og desoksy-korticosteron; og salter derav.

Fremgangsmåten karakteriseres ved at et lavere tetraalkyl- ammoniumsalt av hyaluronsyre, fortrinnsvis tetrabutylammonium- hyaluronat, omsettes med et forestringsmiddel, såsom et alkyl- halogenid, fortrinnsvis i et aprotisk, organisk oppløsningsmiddel, hvorved karboksylgrupper i nevnte hyaluronsyre forestres, og frie karboksyl-grupper i nevnte partialestere eventuelt saltdannes med en uorganisk eller organisk base, f.eks. av et alkali- eller jordalkalimetall, særlig med en eller flere farmakologisk aktive baser, og de saltdannede partialestere som er saltdannet med et alkali- eller jordalkalimetall, eventuelt omsettes med et terapeutisk aktivt eller inaktivt amin.

En første gruppe av estere fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som er anvendbare i terapien, er representert av de i hvilke kvalitetene til hyaluronsyren selv dominerer og kan utnyttes. Slike estere som oppnås fra alkoholer i den ovenfor nevnte serien, som ikke i seg selv har en merkbar farmakologisk virkning, som for eksempel de mettede alkoholene i den alifatiske serien. En andre gruppe av estere som er anvendbare i terapien er på den annen side representert av de estere i hvilke de farmakologiske kvalitetene til alkohol-bestanddelen dominerer. Det vil si estere av HY med farmakologisk aktive alkoholer, som for eksempel steroidalkoholer, som for eksempel de av kortisontypen med en antiinflammatorisk virkning. Disse forbindelser har egenskaper som er kvalitativt lik dem hos alkoholen, men med et mere differensiert aksjons-område, sammenlignet også med allerede kjente estere, sikrer en bedre balansert, konstant og regulær farmakologisk virkning og oppnår vanligvis en markert forsinket effekt.

En tredje gruppe av estere av HY fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, og som representerer et spesielt origi-nalt og anvendbart aspekt, gjelder esterne med en mer blandet karakter sammenlignet med de to foregående gruppene. Det vil si estere i hvilke en del av karboksylgruppene av HY er forestret med en farmakologisk aktiv alkohol og en annen del med en farmakologisk indifferent alkohol, eller en hvis aktivitet er neglisjerbar. Ved dosering av passende prosenter av de to typer av alkoholer som forestrende bestanddel, er det mulig å oppnå estere med den samme farmakologiske aktiviteten som den farmakologisk aktive alkoholen, uten den spesifikke aktiviteten til hyaluronsyre, men med de ovenfor nevnte kvaliteter som bedre stabilitet og biotilgjengelighet, når det gjelder den ønskede aktiviteten og egenskapen til den farmakologisk aktive alkoholen og på grunn av estergruppene av den farmakologisk inerte alkoholen.

En fjerde gruppe estere av HY fremstilt ifølge oppfinnelsen er representert ved de av en blandet karakter i hvilke estergruppene oppnås fra to forskjellige terapeutisk aktive substanser. I dette tilfelle kan også esterne være partielle eller totale, det vil si bare noen karboksylgrupper er forestret med to forskjellige, terapeutisk aktive alkoholer, for eksempel med et kortikosteroid og med et antibiotikum eller med et fenotiazin, mens karboksylgruppene kan være frie eller saltdannede, for eksempel med alkalimetaller, spesielt med natrium, eller alle karboksylgruppene er forestret med de ovenfor nevnte alkoholene. Det er imidlertid også mulig å fremstille estere med tre eller flere alkoholbestanddeler, som for eksempel estere i hvilke en del av karboksylgruppene er forestret med en terapeutisk aktiv alkohol, en annen del med en annen terapeutisk aktiv alkohol, en tredje del med en terapeutisk inaktiv alkohol og en fjerde del er muligens saltdannet med et metall og med en terapeutisk aktiv eller inaktiv base eller omfatter karboksylgrupper i fri form.

I de ovenfor nevnte estere i hvilke noen av karboksylgruppene forblir frie, kan disse saltdannes med metaller eller organiske baser, som for eksempel med alkali- eller jordalkalimetaller eller med ammoniakk eller nitrogenholdige, organiske baser.

De fleste av estrene av HY, til forskjell fra HY selv, har en viss grad av løselighet i organiske løsningsmidler. Denne løseligheten avhenger av prosentinnholdet av forestrede karboksylgrupper og av typen av alkylgruppe som er forbundet med karboksylen. Derfor har en HY-forbindelse med alle sine karboksylgrupper forestret en god løselighet ved romtem-peratur, for eksempel i dimetylsulfoksyd (benzylesteren av HY oppløses i DMSO i en mengde på 2 00 mg/ml). De fleste av totalesterne av HY har også, til forskjell fra HY og spesielt dens salter, dårlig løselighet i vann.

De foran nevnte løselighetsegenskaper, sammen med spesielle og bemerkelsesverdige, viskoelastiske egenskaper, gjør det mulig å bruke HY-estere for å oppnå sanitær- og medisinske preparater, som er uløselige i saltløsning og som har den spesielle, ønskede form. Disse materialene oppnås ved å fremstille en løsning av en HY-ester i et organisk løsnings-middel, forme den meget viskøse løsningen til den form som den ønskede artikkelen skal ha og ekstrahere det organiske

løsningsmidlet med et annet løsningsmiddel som blander seg med

det første, men i hvilket HY-esteren er uløselig.

Esterne av hyaluronsyre fremstilt ifølge oppfinnelsen er alle nye, bortsett fra den foran nevnte metylesteren av hyaluronsyre som er ekstrahert fra navlestrenger hos mennesker og metylesterne av de ovenfor nevnte oligomerene av HY. Partialesterne av hyaluronsyre med metylalkohol og deres salter med metall- eller organiske baser er derfor også nye. De biologiske og farmakologiske aktivitetene til de ovenfor nevnte metylesterne som er beskrevet i litteraturen, var ukjent, som også deres utmerkede, bioplastiske kvaliteter og høye stabilitet.

Alkoholer av den alifatiske serien som kan anvendes som forestringsbestanddeler for karboksylgruppene i hyaluronsyre ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er eksempelvis de med et maksimum på 18 karbonatomer, som kan være mettede eller umettede og som eventuelt også kan være substituert med andre frie, funksjonelle eller funksjonelt modifiserte grupper, som for eksempel karboksylgrupper eller med grupper oppnådd fra disse, som for eksempel hydro-karbylgrupper (fra nu av skal uttrykket "hydrokarbyl" brukes for å referere til ikke bare enverdige radikaler av hydrokarboner, som for eksempel CnH2n+1-typen men også toverdige eller treverdige radikaler, som for eksempel "alkylener" C^ flzn eller "alkylidener" CnH2n) , eller estergrupper og forestrede karboksylgrupper.

Av de ovenfor nevnte grupper som inneholder hydrokarbyl-radikaler foretrekkes det at disse er lavere, alifatiske radikaler, som for eksempel alkylradikaler, med et maksimum på 4 karbonatomer.

Alkoholer av den ovenfor nevnte gruppen som fortrinnsvis anvendes innenfor grensene av foreliggende oppfinnelse, er de med et maksimum på 12, og spesielt 6 karbonatomer, og i hvilke hydrokarbylatomene i de ovenfor nevnte estergruppene representerer alkylgrupper med et maksimum på 4 karbonatomer. Av disse alkoholene skal de spesielt nevnes som er mettet og ikke substituert, som for eksempel metyl-, etyl-, propyl- og isopropylalkoholen, normal butylalkohol, isobutylalkohol, tertiær butylalkohol, amyl-, pentyl-, heksyl-, oktyl-, nonyl-og dodecylalkohol og, fremfor alt, de med en lineær kjede, som for eksempel normal oktyl- og dodecylalkohol. Av de arali-fatiske alkoholene skal spesielt nevnes de med bare én benzen-rest og i hvilke den alifatiske kjeden har et maksimum på 4 karbonatomer, i hvilke benzenresten kan være substituert med mellom 1 og 3 metyl- eller hydroksylgrupper eller med halogenatomer, spesielt med klor, brom og jod. Av disse alkoholer skal spesiell oppmerksomhet vies benzylalkohol.

Alkoholene av den cykloalifatiske eller alifatisk-cykloalifatiske serien kan oppnås fra mono- eller polycykliske hydrokarboner, kan fortrinnsvis ha et maksimum på 18 karbonatomer, kan være usubstituert og kan inneholde én eller flere substituenter, som for eksempel de som er nevnt ovenfor for de alifatiske alkoholene.

Alifatisk-cykloalifatiske, polycykliske alkoholer som kan anvendes for esterne ifølge foreliggende oppfinnelse er steroler, chol-syrer og steroider, som for eksempel seksualhormoner og deres syntetiske analoger, spesielt kortikosteroider og deres derivater. Det er derfor mulig å bruke: kortison, hydrokortison, fluorkortison og deoksykortikosteron.

I noen tilfeller kan hyaluronsyre-estere som diskutert ovenfor, være av interesse der estergruppene oppnås fra to eller flere, terapeutisk aktive hydroksylsubstanser. Spesielt interessante er de substanser i hvilke to typer av forskjellige estergrupper som oppnås fra medisiner med hydroksyl-karakter er tilstede og i hvilke de gjenværende karboksylgruppene er frie, saltdanr>°de med metaller eller med én eller forskjellige baser som er oppført senere, eventuelt også baser som i seg selv er terapeutisk aktive, for eksempel med den samme eller lignende aktivitet som forestringsbestanddelen har. Spesielt er det mulig med hyaluronsyre-estere som på den ene side oppnås fra et antiinflammatorisk steroid, som for eksempel et av de som er nevnt foran, og på den annen side fra et vitamin, fra et alkaloid eller fra et antibiotikum. Forestringsgraden av hyaluronsyre med de ovenfor nevnte alkoholer avhenger fremst av de spesielle egenskapene som skal oppnås på de forskjellige anvendelsesområdene, for eksempel en større eller mindre lipofili eller hydrofili i forhold til visse vev, som for eksempel huden.

Normalt øker en høy forestringsgrad opp til total forestring av hyaluronsyre dens lipofile karakter og minsker derfor dens løselighet i vann. For terapeutisk anvendelse av de nye esterne fremstilt ifølge oppfinnelsen, er det for eksempel spesielt viktig å regulere forestringsgraden for å sikre, på tross av et godt og øket lipofilt nivå sammenlignet med hyaluronsyre eller dens natriumsalt, tilstrekkelig hydroløselighet, for eksempel en løselighet på 10 mg/ml. Naturligvis er det nødvendig å ta i betraktning innvirkningen av molekylstørrelsen til den samme forestringsbestanddelen, som vanligvis påvirker hydroløseligheten på omvendt propo-sjonal måte. Som det allerede er nevnt, kan forestringen av karboksylgruppene i hyaluronsyren spille forskjellige roller, som kan være nyttige på forskjellige områder, for eksempel i medisin ved bruk av esterne som terapeutiske midler eller i kirurgien for å anvende dem som plastiske artikler. For bruk i terapien er det allerede nevnt at det er mulig å foreta forestring av en alkohol som i seg selv er terapeutisk aktiv, som for eksempel et antiinflammatorisk kortikosteroid, med hyaluronsyre som en måte å forbedre dens terapeutiske effektivitet på.

Når det gjelder alkoholer som på samme måte er terapeutisk aktive, opptrer hyaluronsyre derfor som et spesielt effektivt vehikkel som er helt forenelig med den biologiske omgivelse. I den ovenstående liste av alkoholer som kan anvendes for forestring ifølge foreliggende oppfinnelse, foreligger det flere av disse farmakologisk aktive alkoholene og derfor er de mulige anvendelsene av de tilsvarende estere klare da indikasjonene er de samme som for de frie alkoholene. Som det allerede er nevnt, er det i partialestere med terapeutisk aktive alkoholer igjen mulig å forestre en del av eller alle de gjenværende karboksylgruppene i hyaluronsyrebestanddelen med farmakologisk inerte alkoholer, som for eksempel de mettede, lavere, alifatiske alkoholene, som for eksempel etyl-eller isopropylalkohol.

En spesielt interessant side ved foreliggende oppfinnelse er muligheten av å fremstille mere stabile medisiner enn de som er tilgjengelige for tiden. Det er derfor på den ene siden mulig å fremstille estere av hyaluronsyre med terapeutisk inaktive alkoholer for bruk i typiske indikasjoner for selve hyaluronsyren, som for eksempel for intra-artikulære injeksjoner, hvor esteren opptrer som et smøremiddel. PÅ grunn av den forbedrede stabiliteten til esterne i forhold til hyaluronidase sammenlignet med den frie syren, er det mulig å oppnå en ganske betydelig forlenget virkning. PÅ den annen side er det mulig å oppnå medisiner med en "forsinket" virkning for de ovenfor nevnte estere av HY med terapeutisk aktive alkoholer, muligens også saltdannet med terapeutisk aktive baser. Frigjøringen av de aktive alkoholene på grunn av esterase og av de saltdannede gruppene på grunn av hydrolytisk virkning er meget langsom.

Av spesiell interesse er de partialestere i hvilke minst 5% og høyst 90% av alle karboksylgruppene i HY er forestret, og spesielt de med et prosentinnhold av forestrede grupper på mellom 50 og 80%.

Forholdet mellom antallet forskjellige typer av estergrupper kan tydeligvis også variere i de blandede partialesterne. For eksempel varierer forholdet i tilfelle av to typer av slike grupper mellom 0,1:1 og 1:0,1, og det samme gjelder for totalestere. For de estere som skal anvendes terapeutisk, varierer forholdet fortrinnsvis mellom 0,5:1 og 1:0,5. Sli^.e forhold gjelder også fortrinnsvis for totalestere og, i partialestere, foretrekkes de med referanse til de prosentinnhold som er nevnt ovenfor angående det inklusive antall forestrede grupper.

I partialesterne fremstilt ifølge oppfinnelsen kan de ikke-forestrede karboksylgruppene holdes frie eller kan saltdannes. For fremstillingen av slike salter velges basene ifølge det kriterium av disse for hvilket produktet er tenkt. Det er mulig å danne uorganiske salter oppnådd fra alkalimetaller, som for eksempel kalium og spesielt natrium og ammonium, eller oppnådd fra jordalkalimetaller, som for eksempel kalsium eller magnesium eller aluminiumsalter.

Spesielt interessante er saltene med organiske baser, spesielt nitrogenholdige baser og derfor alifatiske, aryl-alifatiske, cykloalifatiske eller heterocykliske aminer.

Disse ammoniakk-salter kan oppnås fra terapeutisk akseptable, men inaktive aminer, eller fra aminer med terapeutisk virkning. Av de førstnevnte kommer fremfor alt de alifatiske aminene på tale, som for eksempel mono-, di- og tri-alkyl-aminer med alkyigrupper som har et maksimum på 18 karbonatomer eller arylalkylaminer med det samme antall karbonatomer i den alifatiske delen og hvor aryl betyr en benzengruppe som kan være substituert med 1 og 3 metylgrupper eller halogenatomer eller hydroksylgrupper. De biologisk inaktive basene for dannelsen av salter kan også være cykliske som for eksempel monocykliske alkylenaminer med ringer på mellom 4 og 6 karbonatomer, eventuelt avbrutt i ringen med heteroatomer valgt fra gruppen bestående av nitrogen, oksygen og svovel, som for eksempel piperidin eller morfolin, og kan være substituert for eksempel med amin- eller hydroksyl-funksjoner, som for eksempel aminoetanol, etylendiamin, efedrin eller cholin.

Det er også mulig å danne de kvaternære ammoniumsaltene av partialesterne, for eksempel saltene av tetraalkylammonium med det ovenfor nevnte antall karbonatomer og fortrinnsvis salter av en slik type i hvilken den fjerde alkylgruppen har mellom 1 og 4 karbonatomer, for eksempel en metylgruppe.

De nye hyaluronsyre-esterne og deres salter fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes som et utmerket vehikkel for terapeutisk aktive substanser. For dette formål er det mulig å anvende totalesterne eller partialesterne av de saltdannede partialesterne i de gjenværende karboksylgruppene, for eksempel med en av de ovenfor nevnte substanser som. er terapeutisk akseptable men ikke biologisk aktive, fremfor alt med alkalimetaller, for eksempel natrium. Egnede medikamenter kan fremstilles av en forbindelse inneholdende de to bestanddelene: Bestanddel (1) - en farmakologisk aktiv substans eller en forbindelse av to eller flere aktive substanser og

Bestanddel (2) - et bærevehikkel omfattende en partial-eller totalester av hyaluronsyre med en alkohol, eller saltene av slike partialestere med en organisk eller uorganisk base, eventuelt med tilsetning av hyaluronsyre eller et salt derav med en uorganisk eller organisk base.

De hyaluronsyre-esterne som kan anvendes i disse medikamentene er fremfor alt de hvor den forestrende alkoholen ikke selv er farmakologisk aktiv, for eksempel en enkel, alifatisk alkohol, som beskrevet ovenfor.

Bruken av hyaluronsyre-estere som et vehikkel for medisiner som skal påføres lokalt er spesielt nyttig i oftalmologien der en spesiell forenlighet kan observeres for de nye produktene fremstilt ifølge oppfinnelsen med hornhinne-epitelet, og de har derfor utmerket tolererbarhet, uten noen sensibiliserende virkninger. Når medikamentene administreres i form av konsentrerte løsninger med elastisk-viskøse egenskaper eller i fast form, er det videre mulig å oppnå homogene og stabile filmer som er helt gjennomsiktige og kleber seg til hornhinne-epitelet, og garanterer forlenget biotilgjengelighet for medisinen og derfor representerer utmerkede preparater med en forlenget effekt.

Slike oftalmiske medikamenter er spesielt verdifulle på veterinærområdet, tatt i betraktning eksempelvis at det for tiden ikke er noen veterinærspesialiteter for øyemedisinsk bruk inneholdende kjemoterapeutiske midler. Det anvendes i steden preparater som er ment for humant bruk, og disse garanterer ikke alltid et spesielt virkeområde eller de tar ikke hensyn til de spesielle betingelser der behandlingen må finne sted. Dette er eksempelvis tilfelle i terapien for smittsom keratokonjunktivitt, "pink eye" eller IBK, en infeksjon som vanligvis angriper kveg, sauer og geiter. For disse tre artene er det sannsynligvis spesifikke, etiologiske faktorer og mere spesielt: hos kveg synes hovedmikroorganismen som er involvert å være Moraxella bovis (selv om andre midler av virus-opprinnelse ikke skal utelukkes, som for eksempel Rinotracheitis-virus, hos sauer Micoplasma, Rickettsiae og Clamidiae, og hos geiter Rickettsiae). Sykdommen manifesterer seg i akutt form og har en tendens til å spre seg raskt: i de første stadiene er symptomatologien karakterisert ved blefarospasme og stor tåreutvikling, fulgt av purulent eksudat, konjunktivitt og keratitt, ofte fulgt av feber, appetitt-tap og minsket melkeproduksjon. Særlig alvorlig er hornhinneskadene som i sluttstadiene til og med kan forårsake perforering av selve hornhinnen. Sykdommens kliniske utvikling varierer fra noen få dager til flere uker.

Et stort utvalg av kjemoterapeutiske midler anvendes for behandling, administrert både lokalt (ofte i forbindelse med steroide, antiinflammatoriske midler), og systemisk, omfattende: tetracykliner, som for eksempel oksytetracyklin, penicilliner, som for eksempel cloxacillin og benzyl-penicillin, sulfonamider, polymyxin B (forbundet med miconazol og prednisolon), kloramfenikol, tylosin og kloromycetin. Lokalbehandling av sykdommen, på tross av dens tilsynelatende enkelhet, er fortsatt et uløst problem, siden det med de øyepreparatene som er anvendt hittil, ikke har vært mulig av en eller annen grunn å oppnå terapeutisk effektive konsen-trasjoner av antibiotika eller sulfonamider i tåresekresjonen. Dette er ganske forståelig når det gjelder løsninger, tatt i betraktning den i det vesentlige hellende stillingen til disse dyrenes hoder, men det samme er også tilfelle når det gjelder halvfaste medikamenter, da de vanlig brukte bindemidlene ikke har de nødvendige kvaliteter når det gjelder klebing til hornhinneoverflaten, siden de vanligvis ikke har en høy nok konsentrasjon av aktiv substans og ikke kan oppnå perfekt fordeling av denne (det vil si det foreligger en fordelings-gradient). Disse mangler ved konvensjonelle "collirium" i oftalmisk bruk er eksempelvis beskrevet av Slatter et al., Austr. Vet. J., 1982, 59 (3), sider 69-72).

Med esterne fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan disse vanskelighetene overvinnes. Nærværet av hyaluronsyre-esteren som et vehikkel for oftalmiske medisiner muliggjør faktisk sammensetning av utmerkede preparater uten konsen-trasjonsgradienter av den aktive substansen og de er derfor helt homogene, med perfekt gjennomsiktighet og utmerket klebeevne til hornhinne-epitelet, uten noen sensibili-ser ingsef fekter , den aktive substansen oppebæres utmerket og det har eventuelt en forlenget virkning.

De ovenfor nevnte egenskapene hos de fremstilte medikamentene kan naturligvis utnyttes også på andre områder enn oftalmologien. De kan anvendes i dermatologien og i sykdommer i slimhinnene, for eksempel i munnen. Videre kan de anvendes for å oppnå en systemisk effekt på grunn av virkningen av transkutan absorbsjon, som for eksempel i suppositorier. Alle disse anvendelsene er mulige både i human-og veterinærmedisinen. I humanmedisinen er medikamentene spesielt egnede for bruk i pediatrien.

For korthets skyld skal det fra nu av når den aktive substansen eller bestanddel (1) fremstilt ifølge oppfinnelsen nevnes, forstås at det også skal omfatte forbindelsen av én eller flere aktive substanser. Bestanddel (1) beskrevet ovenfor kan fremfor alt defineres med hensyn på dens bruk i de forskjellige terapiområdene, idet det startes med distink-sjonen mellom human- og veterinærmedisinen, og så spesifisering av de forskjellige anvendelsessektorene når det gjelder organer eller vev som skal behandles, som for eksempel med referanse til lokal bruk, oftalmologi, dermatologi, otorhinolaryngologi, gynekologi, angiologi, nevrologi eller en hvilken som helst type av patologi i de indre organene som kan behandles med lokale anbringelser, for eksempel med rektale anbringelser.

Bærestoffvirkningen til hyaluronsyre-esterne fremstilt ifølge oppfinnelsen gjelder også assosierte medikamenter av den type som er nevnt ovenfor, hvori den aktive substansen ikke bare virker lokalt eller ved nasal eller rektal absorbsjon, for eksempel ved nesespray eller preparater for inhalering for munnhulen eller svelget, men også ved den orale eller parenterale ruten, for eksempel ved intramuskulær, subkutan eller intravenøs injeksjon, da det begunstiger absorbsjon av medisinen inn i anbringelsesstedet. Medikamentene kan derfor anvendes, bortsett fra på de områdene som allerede er nevnt, i praktisk talt alle sektorer i medisinen, som for eksempel indremedisinen, for eksempel i pato-logier i hjerte-karsystemet, i infeksjoner av ånde-drettssystemet, fordøyelsessystemet, nyresystemet, i sykdommer av en endokrinologisk natur, i onkologi, i psykiatri osv., og kan derfor også klassifiseres ifølge deres spesielle virkning, som kanskje kan være anestetika, analgetika, antiinflammatoriske midler, sårhelbredende midler, antimikrobielle midler, adrenenrgiske agonister og antagonister, cytostatika, antireumatika, antihypertensiver, diuretika, seksualhormoner, immunostimulanter og immunoundertrykkere, for eksempel en av medisinene med den aktiviteten som allerede er beskreyet for de terapeutisk aktive alkoholene som anvendes som forestrende bestanddel i analogifremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, eller for de terapeutisk aktive basene som anvendes for saltdannelse av de frie karboksylgruppene.

Bestanddel (1) i de ovenfor nevnte medikamentene kan også være en forbindelse mellom to eller flere aktive substanser, slike som inneholdes i mange kjente medikamenter.

Når det gjelder oftalmologiområdet, kan indikasjonene eksempelvis være: de miotiske, antiinflammatoriske, sårhelbredende og antimikrobielle effektene.

Eksempler på farmakologisk aktive substanser som kan anvendes i oftalmiske medikamenter er: basiske og ikke-basiske antibiotika som for eksempel aminoglykosider, makrolider, tetracykliner og peptider, som for eksempel gentamycin, neomycin, streptomycin, dihydrostreptomycin, kanamycin, amikacin, tobramycin, spektinomycin, erytromycin, oleandomycin, karbomycin, spiramycin, oksytetracyklin, rolitetracyklin, bacitracin, polymyxin B, gramicidin, colistin, kloramfenikol, lincomycin, vancomycin, novobiocin, ristocetin, clindamycin, amfotericin B, griseofulvin, nystatin, og eventuelt deres salter som for eksempel sulfater eller nitrater, eller forbindelser mellom disse stoffene eller med andre aktive ingredienser, slik som de som nevnes nedenfor.

Andre oftalmiske medisiner som med fordel kan anvendes er: andre antiinfeksjonsmidler som for eksempel dietyl-karbamazin, mebendazol, sulfamider, som for eksempel sulfacetamid, sulfadiazin, sulfisoksazol, antivirale midler og antitumor midler, som for eksempel jododeoksyuridin, adenin-arabinosid, trifluorotymidin, acyklovir, etyldeoksyuridin, bromvinyldeoksyuridin, 5-j od-5'-amino-2',5'-dideoksyuridin, antiinflammatoriske steroider, som for eksempel dexametason, hydrokortison, prednisolon, fluorometolon, medryson og eventuelt deres estere, for eksempel med fosforsyre, antiinflammatoriske midler som ikke er steroider, som for eksempel indometacin, oksyfenbutazon, flurbiprofen, sårhelbredende midler, som for eksempel epidermal vekstfaktor, EGF, lokal-anestetika, som for eksempel benoksinat, proparacain og eventuelt deres salter, cholinergiske agonister som for eksempel pilocarpin, metcholin, karbomylcholin, aceklidin, fysostigmin , neostigmin, demecarium og eventuelt deres salter, cholinergiske antagonistmedisiner, som for eksempel atropin og dens salter, adrenergiske agonistmedisiner, som for eksempel nordrenalin, adrenalin, nafazolin, metoksamin og eventuelt deres salter, adrenergiske antagonistmedisiner, som for eksempel propanolol, timolol, pindolol, bupranolol, atenolol, metprolol, oksoprenolol, praktolol, butoksamin, sotalol, butatrin, labetolol og eventuelt deres salter.

Eksempler på de aktive substansene som skal brukes alene eller i forbindelse med hverandre eller med andre aktive stoffer i dermatologien er: terapeutiske midler, som for eksempel antiinfeksjonsmidler, antibiotika, antimikrobielle midler, antiinflammatoriske midler, cytostatika, cytotoksika, antivirale midler, anestetiske midler og profylaktiske midler, som for eksempel solfiltere, deodoranter, antiseptika og desinfiseringsmidler. Av de spesielt viktige antibiotika er: erytromycin, bacitracin, gentamycin, neoomycin, aureomycin, gramicidin og deres forbindelser, av de antibakterielle midlene og desinfiseringsmidlene: nitroflurzon, mafenid, klorheksidin og derivater av 81-hydroksykinolin og eventuelt deres salter, av de antiinflammatoriske midlene fremfor alt kortikosteroidene som for eksempel prednisolon, deksametason, flumetason, klobetasol, triamcinolon-acetonid, betametason og deres estere, som for eksempel valeriater, benzoater, dipropionater, av den cytotoksiske gruppen: fluorouracil, metotreksat, pdofyllin, av de anestetiske midlene, dibucain, lidocain, benzocain.

Som kombinasjoner av medisiner som kan anvendes i dermatologien, skal de forskjellige antibiotika nevnes, som for eksempel erytromycin, gentamycin, neomycin, gramicidin, polymyxin B, med hverandre, eller kombinasjoner av disse antibiotika med antiinflammatoriske midler, for eksempel kortikosteroider, for eksempel hydrokortison + neomycin, hydrokortison + neomycin + polymyxin B + gramicidin, deksametason + neomycin , fluorometolon + neomycin, prednisolon + neomycin, triamcinolon + neomycin + gramicidin + nystatin, eller en hvilken som helst annen kombinasjon som anvendes i konvensjonelle preparater i dermatologien.

Kombinasjonene av forskjellige, aktive substanser er naturligvis ikke begrenset til dette området, men i hver av de ovenfor nevnte sektorer av medisinen er det mulig å anvende kombinasjoner som er lik de som allerede er i bruk for kjente farmasøytiske preparater på fagområdet.

I det ovenstående tilfelle med bruk av en bestanddel (1) med en basisk karakter kan de saltene som dannes med en partial hyaluronsyre-ester (siden den sistnevnte brukes i overskudd) være av forskjellige typer, det vil si alle de gjenværende karboksylgruppene kan være saltdannet eller bare en alikvot del, hvorved det produseres estere - sure salter, eller estere - nøytrale salter. Antallet syregrupper som skal holdes frie kan være av betydning for fremstillingen av medikamenter med et spesielt pH. Omvendt er det mulig å anvende et overskudd av en basisk bestanddel (1), i hvilket tilfelle alle de tilgjengelige karboksylgruppene i hyaluronsyre-esteren er saltdannet med basen.

Bestanddel (1) fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også være forbindelser eller blandinger av to eller flere slike medisiner og eventuelt også med andre bestanddeler. I oftalmologien kan eksempelvis en medisin være forbundet med et antibiotikum eller en antiflogistisk substans og en vaso-konstriktor eller med flere antibiotika, én eller flere anti-flogistiske substanser eller med ett eller flere antibiotika, et mydiatisk eller et miotisk middel eller et sårhelbredende eller antiallergisk middel, osv. For eksempel kan de følgende forbindelser av oftalmiske medisiner anvendes: kanamycin + fenylefrin + deksametasonfosfat, kanamycin + betametasonfosfat + fenylefrin, eller lignende forbindelser med andre antibiotika som anvendes i oftalmologien, som for eksempel rolitetracyklin, neomycin, gentamicin, tetracyklin.

Dersom det i steden for bare én aktiv substansbestanddel (1) anvendes forbindelser av aktive substanser, som for eksempel de som er nevnt ovenfor, kan saltene av de basiske, aktive substansene og partialesteren av hyaluronsyre være blandede salter av én eller flere slike basiske substanser eller eventuelt blandede salter av denne typen med et visst antall andre syregrupper av de polysakkarider som er saltdannet med metaller eller baser som er nevnt ovenfor. For eksempel er det mulig å frem-stille salter av en partialester av hyaluronsyre eller av en av molekylfraksjonene Hyalastin eller Hyalektin med en farmakologisk inaktiv alkohol, for eksempel en lavere alkanol og med et visst prosentinnhold av saltdannende syregrupper med antibiotikumet kanamycin, et annet prosentinnhold av karboksylgrupper saltdannet med vaso-konstriktoren fenylefrin og et gjenværende prosentinnhold av sure grupper kan eksempelvis være frie eller saltdannet med natrium eller et av de andre ovenfor nevnte metallene. Det er også mulig å blande denne type av blandet salt med fri hyaluronsyre eller dens fraksjoner eller deres metallsalter, slik det indikeres ovenfor for de medikamenter som inneholder salter av en enkelt, aktiv substans med de foran nevnte poly-sakkaridesterne.

Av de eksempler som er diskutert for oftalmologi og dermatologi er det mulig ved analogi å forstå hvilke medikamenter som kan anvendes i de ovenfor nevnte felter av medisinen, som for eksempel i otorhinolaryngologi, odontologi eller i indremedisin, for eksempel i endokrinologi. Slike preparater kan derfor eksempelvis være antiinflammatoriske midler, vasokonstriktorer eller vasokompressorer som for eksempel de som allerede er nevnt for oftalmologi, vitaminer, antibiotika, som for eksempel de som er nevnt ovenfor, hormoner, kjemoterapeutika, antibakterielle midler, osv. også som nevnt ovenfor for anvendelse i dermatologi.

De blandede medikamentene av hyaluronsyre-ester og farmakologisk aktive substanser kan inneholde andre farmasøytiske vehikler, som for eksempel de som er nevnt nedenfor for de farmasøytiske preparater som bare inneholder hyaluronsyre-estere, og kan forekomme i form av salver, kremer, pastiller, gelatinkapsler, kapsler, vandige eller oljeløsninger, sprayer, suppositorier, osv.

Av esterne fremstilt ifølge oppfinnelsen er de følgende spesielt viktige, ifølge hvert tilfelle, de med en surhetsgrad som er egnet for omgivelsen som det skal anvendes i, det vil si med et fysiologisk tolererbart pH. Justeringen av pH, for eksempel i de ovenfor nevnte saltene av partialesteren av hyaluronsyre med en basisk, aktiv substans, kan utføres ved passende å regulere mengdene av polysakkarid, av dets salter og av selve den basiske substansen. Dersom eksempelvis surheten av et salt av partialesteren av hyaluronsyre med en basisk substans således er for høy, kan overskuddet av frie syregrupper nøytraliseres med de ovenfor nevnte, uorganiske basene, for eksempel med hydratet av natrium eller kalium eller ammonium.

Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen for fremstilling av HY- estere Hyaluronsyre-esterne kan ifølge foreliggende oppfinnelse med fordel fremstilles ifølge en metode som generelt kan anv endes for fremstilling av karboksylsyre-estere av sure polysakkarider med karboksylgrupper. Denne fremgangsmåten består i behandling av et kvaternært ammoniumsalt av et surt polysakkarid inneholdende karboksylgrupper med et foretrings-middel, fortrinnsvis i et aprotisk, organisk løsningsmiddel. Som sure utgangspolysakkarider er det mulig, bortsett fra hyaluronsyre, eksempelvis å anvende andre sure polysakkarider av animalsk eller vegetabilsk opprinnelse og syntetisk modifiserte derivater av disse, som for eksempel sur hemi-cellulose, som kan oppnås fra de alkaliske ekstraktene av visse planter og etter utfelling av xylaner, hvis disakkarid-bestanddeler utgjøres av D-glukuronsyre og D-xylopyranose, (se "The Carbohydrates" av W. Pigman, sider 668-669 - R. L. Whistler, W. H. Corbett), pektinene og sure polysakkarider som kan oppnås fra de samme, det vil si galakturonan, sure polysakkarider som kan oppnås fra plantegummi (eksudater), som for eksempel gummi arabikum, tragant og endelig sure polysakkaridet oppnådd fra alger som for eksempel agar og karra-gener. Som startmateriale er det naturligvis mulig også å bruke molekylfraksjonene som oppnås ved nedbrytning av alle de ovenfor nevnte polysakkarider.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles de ønskede hyaluronsyre-estere ved at et lavere tetraalkyl- ammoniumsalt av hyaluronsyre, fortrinnsvis tetrabutylammonium- hyaluronat, omsettes med et forestringsmiddel, såsom et alkyl- halogenid, fortrinnsvis i et aprotisk, organisk oppløsningsmiddel, hvorved karboksylgrupper i nevnte hyaluronsyre forestres, og frie karboksyl-grupper i nevnte partialestere eventuelt saltdannes med en uorganisk eller organisk base, f.eks. av et alkali-eller jordalkalimetall, særlig med en eller flere farmakologisk aktive baser, og de saltdannede partialestere som er saltdannet med et alkali- eller jordalkalimetall, eventuelt omsettes med et terapeutisk aktivt eller inaktivt amin.

Som organiske løsningsmidler foretrekkes det å bruke aprotiske løsningsmidler, som for eksempel dialkylsulfoksyder, dialkylkarboksamider, som for eksempel spesielt lavere alkyl-dialkylsulfoksyder, spesielt dimetylsulfoksyd, og lavere alkyldialkylamider av lavere alifatiske syrer, som for eksempel dimetyl- eller dietylformamid eller dimetyl- eller dietylacetamid.

Det kan imidlertid også anvendes andre løsningsmidler som ikke alltid er aprotiske, som for eksempel alkoholer, etere, ketoner, estere, spesielt alifatiske eller heterocykliske alkoholer og ketoner med et lavt kokepunkt, som for eksempel heksafluorisopropanol, trifluoretanol og N-metylpyrrolidon.

Reaksjonen gjennomføres fortrinnsvis i et temperatur-område på mellom 0 og 100°C, spesielt mellom 25 og 75°C, for eksempel ved ca. 30°C.

Forestringen utføres fortrinnsvis ved å tilsette for-estringsmidlet gradvis til det ovenfor nevnte ammoniumsaltet i et av de ovenfor nevnte løsningsmidler, for eksempel dimetylsulfoksyd.

Som alkyleringsmiddel er det mulig å bruke de som er nevnt ovenfor, spesielt hydrokarbylhalogenene, for eksempel alkylhalogener. Som utgangsmaterialer når det gjelder kvaternære ammoniumsalter, foretrekkes det å bruke de lavere ammoniumtetraalkylatene, hvor alkylgruppene fortrinnsvis har mellom 1 og 6 karbonatomer. For det meste anvendes hyaluronatet av tetrabutylammonium. Det er mulig å fremstille disse kvaternære ammoniumsaltene ved å omsette et metallsalt av et surt polysakkarid, fortrinnsvis et av de som er nevnt ovenfor, spesielt natrium- eller kaliumsaltet, i vandig løsning med en saltdannet, sulfonisk harpiks med en kvaternær ammoniumbase.

Tetraalkylammoniumsaltet av det sure polysakkaridet kan oppnås ved frysetørking av eluatet. Tetraalkylammoniumsaltene av sure polysakkarider som anvendes som startforbindelser i den nye fremgangsmåten og er oppnådd fra lavere alkylgrupper, spesielt alkylgrupper med mellom 1 og 6 karbonatomer, er nye og danner en annen gjenstand ifølge foreliggende oppfinnelse. Overraskende er det funnet at disse saltene er løselige i de ovenfor nevnte, organiske løsningsmidlene, og av denne grunn er forestringen av sure polysakkarider ifølge den ovenfor nevnte fremgangsmåten B spesielt lett og gir gode utbytter. Det er derfor bare ved bruk av denne type fremgangsmåte at man eksakt kan dosere antallet karboksylgrupper i det sure polysakkaridet som skal forestres.

Fremgangsmåten er meget egnet spesielt for fremstilling ifølge foreliggende oppfinnelse av hyaluronsyre-estere. Spesielt anvendes derfor som startforbindelser ved fremgangsmåten, de kvaternære ammoniumsaltene av hyaluronsyre, spesielt de som oppnås fra lavere alkylgrupper, og spesielt fra alkylgrupper med mellom 1 og 6 karbonatomer.

For fremstilling ifølge oppfinnelsen av esterne er det mulig å bruke hyaluronsyre av en hvilken som helst opprinnelse, som for eksempel de syrer som er ekstrahert fra de ovenfor nevnte, naturlige startmaterialene, for eksempel hanekammer. Fremstillingen av slike syrer er beskrevet i litteraturen: fortrinnsvis anvendes rensede hyaluronsyrer. Ifølge oppfinnelsen anvendes det spesielt hyaluronsyrer som omfatter molekylfraksjoner av de integrerte syrene som oppnås direkte ved ekstraksjon av de organiske materialene med molekylvekter som varierer innenfor et bredt område, for eksempel fra 90% til 80% (Mv = 11,7 - 10,4 millioner) til 0,2%

(Mv = 30.000) av molekylvekten av den integrerte syren med en molekylvekt på 13 millioner, fortrinnsvis mellom 5% og 0,2%. Slike fraksjoner kan oppnås ved hjelp av forskjellige frem-gangsmåter som er beskrevet i litteraturen, som for eksempel hydrolyse-, oksyderings-, enzymatiske eller fysiske fremgangs-måter, som for eksempel mekaniske eller bestrålingsfremgangs-måter. De opprinnelige ekstraktene dannes derfor ofte under disse samme rensefremgangsmåtene (se for eksempel artikkelen av Balazs et al., som er sitert ovenfor i "Cosmetics & Toiletries"). Separasjonen og rensingen av de oppnådde molekylfraksjoner gjennomføres ved hjelp av kjente teknikker, for eksempel ved molekylfiltrering.

En fraksjon av renset HY som er egnet for bruk ifølge oppfinnelsen er for eksempel den som er kjent som "ikke-inflammatorisk-NIF-NaHA-natrium hyaluronat" beskrevet av Balazs i boken "Healon" - A guide to its use in Ophtalmic Surgery D. Miller & R. Stegmann, utg. John Wiley & Sons N. Y. 81983: s. 5.

Spesielt viktige som startmaterialer for esterne som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse er to rensede fraksjoner som kan oppnås fra hyaluronsyre, for eksempel de som ekstraheres fra hanekammer, kjent som "Hyalastin" og "Hyalektin". Fraksjonen Hyalastin har en gjennomsnittlig molekylvekt på 50.000 til 100.000, mens fraksjonen Hyalektin har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 500.000 og 730.000. En kombinert fraksjon av disse to fraksjonene er også isolert og karakterisert ved å ha en gjennomsnittlig molekylvekt på 250.000 til ca. 350.000. Denne kombinerte fraksjonen kan oppnås med et utbytte på 80% av total hyaluronsyre som er tilgjengelig i det spesielle startmateriale, mens fraksjonen Hyalektin kan oppnås med et utbytte på 30% og fraksjonen Hyalastin med et utbytte på 50% av start-HY. Fremstillingen av disse fraksjonene er beskrevet i Eksemplene A-C.

Saltdannelsen av HY med de ovenstående metaller for fremstilling av startsaltene for den spesielle analogifremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som er beskrevet ovenfor, utføres på en i og for seg kjent måte, for eksempel ved å omsette HY med den beregnede mengde base, for eksempel med alkalihydrater eller med basiske salter av slike metaller, som for eksempel karbonater eller bikarbonater.

I partialesterne som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse er det mulig å saltdanne alle de gjenværende karboksylgruppene eller bare en del av dem, idet basemengdene doseres slik at det oppnås den ønskede støkiometriske saltdannelsesgraden. Med den korrekte saltdannelsesgraden er det mulig å oppnå estere med et bredt område av forskjellige dissosiasjonskonstanter og som derfor gir det ønskede pH, i løsning eller "in situ" ved tiden for den terapeutiske anven-delsen.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av følgende eksempler.

Fremstillingseksempler

Følgende eksempler A-C beskriver fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen for fremstilling av de foretrukne hyaluronsyre-fraksjonene.

Eksempel A - Fremgangsmåte for oppnåelse av en blanding av Hyalastin- og Hyalectinfraksioner uten inflammatorisk aktivitet

Ferske eller frosne hanekammer (300 g) males i en kjøtt-kvern og homogeniseres så omsorgsfullt i en mekanisk homogen-isator. Den således oppnådde pasta anbringes i en beholder av rustfritt stål AISI 316 eller i glass og behandles med 10 volumer vannfritt aceton. Det hele omrøres i 6 timer med en hastighet på 50 omdreininger pr. minutt. Den får stå og separere i 12 timer og acetonet fjernes ved hjelp av hevert. Acetonekstraksjonen gjentas inntil det aceton som kastes har nådd den riktige fuktighetsgraden (Karl-Fischer-metoden). Det hele sentrifugeres så og vakuumtørkes ved en passende temperatur i 5-8 timer. På denne måten oppnås 500-600 g tørr-pulveriserte hanekammer.

300 g tørt pulver fordøyes enzymatisk med papain (0,2 g) i vandige betingelser, buffret med fosfatbuffer i nærvær av en passende mengde cystein-hydroklorid. Det resulterende omrøres i 24 timer ved 60 omdreininger pr. minutt ved en temperatur som holdes konstant ved 60-65°C. Det avkjøles så til 25°C og Celite<R> (60 g) tilsettes idet omrøringen fortsettes i ytterligere 1 time. Den resulterende blandingen filtreres inntil det oppnås en klar væske. Den klare væsken underkastes så molekyl-ultrafiltrering ved bruk av membraner med en molekyl-utelukkelsesgrense på 30.000 for å tilbakeholde molekyler med en molekylvekt over 30.000 på membranen.

Produktet ultrafiltreres fra 5 til 6 ganger av originalvolumet idet det tilsettes destillert vann kontinuerlig til produktet under ultrafiltreringen. Tilsetningen av vann stanses og ultrafiltreringen fortsettes inntil volumet er redusert til 1/3 av originalvolumet.

Restvæsken gjøres 0,1M ved tilsetning av natriumklorid og temperaturen bringes til 50°C. Under omrøring ved 60 omdreininger pr. minutt tilsettes 4 5 g cetylpyridiniumklorid. Den omrøres i 60 minutter og så tilsettes 50 g Celite<R>. Under omrøring bringes temperaturen for det hele til 25°C og det dannede bunnfallet oppsamles ved sentrifugering. Det oppnådde bunnfallet suspenderes i en 0,01M løsning i natriumklorid (5 liter) inneholdende 0,05% cetylpyridiniumklorid. Den resulterende suspensjonen omrøres i 60 minutter ved 50°C. Temperaturen bringes så til 25°C og bunnfallet sentrifugeres. Vaske-operasjonen gjentas 3 ganger, hvoretter bunnfallet samles i en beholder som inneholder 3 liter av en 0,05M løsning av natriumklorid inneholdende 0,05% cetylpyridiniumklorid. Blandingen omrøres ved 60 omdreininger pr. minutt i 60 minutter og temperaturen holdes konstant på 25°C i 2 timer. Det overstående elimineres ved sentrifugering. Fremgangsmåten gjentas flere ganger med løsninger på 0,1M natriumklorid inneholdende 0,05% cetylpyridiniumklorid. Blandingen sentrifugeres og supernatanten kastes. Bunnfallet dispergeres i en løsning av 0,3OM natriumklorid inneholdende 0,05% cetylpyridiniumklorid (3 liter). Blandingen omrøres og både bunnfallet og den klare væsken samles. Ekstraksjonen gjentas tre ganger til av bunnfallet, hver gang brukes det 0,5 liter av den samme, vandige løsningen.

Tilslutt elimineres bunnfallresten og de klare væskene anbringes sammen i en enkelt beholder. Temperaturen i væsken bringes til 50°C under konstant omrøring. Væsken bringes så til 0,23M med natriumklorid. 1 g cetylpyridiniumklorid tilsettes og den holdes i omrøring i 12 timer.

Blandingen avkjøles til 25°C og filtreres så først gjennom en Celite<R->pakke og så gjennom et filter. Den underkastes igjen molekylultrafiltrering på en membran med en molekylute-lukkelsesgrense på 30.000 idet det ultrafiltreres tre opprinnelige volumer med tilsetning av en løsning av 0,33M natrium-klorid. Tilsetningen av natriumkloridløsning avbrytes og volumet reduseres til 1/4 av det opprinnelige volumet. Løsningen som er konsentrert på denne måten utfelles under omrøring (60 omdr.) ved 25°C med 3 volumer etanol (95°C) . Bunnfallet samles ved sentrifugering og den overstående væske kastes. Bunnfallet oppløses i 1 liter 0,01M løsning av natriumklorid og utfellingen gjentas med 3 volumer 95% etanol.

Bunnfallet samles og vaskes først med 75% etanol (3 ganger), så med absolutt etanol (3 ganger) og tilslutt med

absolutt aceton (3 ganger).

Det produkt som oppnås på denne måten (HYALASTIN + HYALEKTIN-fraksjoner) har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 250.000 og 350.000.

Utbyttet av HY er 0,6% av det opprinnelige friske vevet.

Eksempel B - Fremgangsmåte for oppnåelse av fraksjonen Hyalastin fra blandingen oppnådd ved den metoden som er beskrevet i Eksempel A.

Den blandingen som er oppnådd ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet i Eksempel A oppløses i to ganger destillert, apyrogenetisk vann med en mengde på 10 mg produkt for hver ml vann. Den oppnådde løsningen eksponeres for molekylfiltrering gjennom filtermembraner med en molekyl-utelukkelsesgrense på 200.000, fulgt av en konsentrasjons-teknikk på membranen uten tilsetning av vann. Under ultra-filtreringsprosessen gjennom membranene med en molekyl-utelukkelsesgrense på 200.000 går molekylene med en molkylvekt på mer enn 200.000 ikke gjennom, mens de mindre molekylene går gjennom membranen sammen med vannet. Under filtrerings-prosedyren tilsettes intet vann, slik at volumet avtar, og det er derfor en økning i konsentrasjonen av molekyler med en molekylvekt på mer enn 200.000. Produktet ultrafiltreres inntil volumet på membranen er redusert til 10% av det opprinnelige volumet. To volumer apyrogenetisk, to ganger destillert vann tilsettes og det ultrafiltreres igjen inntil volumet er redusert til 1/3. Operasjonen gjentas to ganger til. Den løsning som gikk gjennom membranen bringes til 0,1M med natriumklorid og utfelles så med 4 volumer 95% etanol. Bunnfallet vaskes tre ganger med 75% etanol og vakuumtørkes så.

Det således oppnådde produktet (Hyalastin-fraksjon) har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 50.000 og 100.000. Utbyttet av HY er lik 0,4% av det opprinnelige, friske vevet.

Eksempel C - Fremgangsmåte for å oppnå fraksjonen Hyalektin.

Den konsentrerte løsningen som er oppsamlet i beholderen oppå ultrafiltreringsmembranen med en molekylutelukkelse på 200.000 som i Eksempel B, fortynnes med vann inntil det oppnås en løsning inneholdende 5 mg/ml hyaluronsyre, slik det bestemmes ved kvantitativ analyse basert på mengden glukuronsyre.

Løsningen bringes til 0,1M natriumklorid og utfelles så med 4 volumer 95% etanol. Bunnfallet vaskes tre ganger med 75% etanol og vakuumtørkes så.

Det således oppnådde produkt (Hyalektin-fraksjon) har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 500.000 og 730.000. Dette tilsvarer en spesifikk fraksjon av hyaluronsyre med en definert molekylkjedelengde på ca. 2500 til 3500 sakkarid-enheter med en høy renhetsgrad. Utbyttet av HY er lik 0,2% av det opprinnelige, friske vevet.

Eksempel D - Fremstilling av tetrabutylammoniumsaltet av hyaluronsyre ( HY).

4,02 g HY-natriumsalt (10 mekv.) solubiliseres i 400 ml destillert H20. Løsningen elueres så i en termostatisk kolonne ved 4°C som inneholder 15 ml sulfonisk harpiks ("Dowex" 50 x 8) i tetrabutylammoniumform. Eluatet, som er fritt for natrium, fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 6,18 g.

Eksempel 1 - Fremstilling av ( partial)- propylesteren av hyaluronsyre ( HY)

- 50% forestrede karboksylgrupper

- 50% saltdannede karboksylgrupper (Na)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 170.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 1,8 g (10,6 mekv.) propyl-jodid tilsettes og den resulterende løsningen holdes ved en temperatur på 30°C i 12 timer.

En løsning inneholdende 62 ml vann og 9 g natriumklorid tilsettes og den resulterende blandingen helles langsomt i 3500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som frafiltreres og vaskes tre ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8

timer ved 3 0°C.

Produktet oppløses så i 550 ml vann som inneholder 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 3000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 500 ml aceton/vann (5:1) og tre ganger med 500 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. 7,9 g av tittelforbindelsen oppnås. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33. 1028-1030, (1961)].

Eksempel 2 - Fremstilling av ( partial)- isopropylesteren av hyaluronsyre ( HY) - 50% forestrede karboksylgrupper - 50% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 160.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetyl sul f oksyd ved 25°C, 1,8 g (10,6 mekv.) iso-propyljodid tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 12 timer ved 3 0°C.

En løsning inneholdende 62 ml vann og 9 g natriumklorid tilsettes og den resulterende blandingen helles langsomt i 3500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 3 0°C.

Produktet oppløses så i 550 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 3000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 500 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. 7,8 g av tittelforbindelsen oppnås. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Eksempel 3 - Fremstilling av ( partial)- etvlesteren av hyaluronsyre ( HY) - 75% av forestrede karboksylgrupper - 25% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på

250.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 2,5 g (15,9 mekv.) etyljodid tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 12 timer ved 3 0°C.

En løsning inneholdende 62 ml vann og 9 g natriumklorid tilsettes og den resulterende blandingen helles langsomt i 3500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 30°C.

Produktet oppløses så i 550 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 3000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 500 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. 7,9 g av tittelforbindelsen oppnås. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Eksempel 4 - Fremstilling av ( partial)- metvlesteren av hyaluronsyre ( HY) - 75% forestrede karboksyl<g>rupper - 25% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 80.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 2,26 g (15,9 mekv.) metyljodid tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 12 timer ved 30°C.

Produktet oppløses så i 550 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 3 000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 500 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. Det oppnås 7,8 g av tittelforbindelsen. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)]

Eksempel 5 - Fremstilling av metylesteren av hyaluronsyre

( HY) .

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 120.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 3 g (21,2 mekv.) metyljodid tilsettes og løsningen holdes i 12 timer ved 30°C.

Den resulterende blandingen helles langsomt i 3500 ml etylacetat under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes fire ganger med 500 ml etylacetat og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C.

Det oppnås 8 g av tittelproduktet. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33. 1028-1030, (1961)].

Eksempel 6 - Fremstillin<g> av etylesteren av hyaluronsyre ( HY)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 85.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 3,3 g (21,2 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes i 12 timer ved 30°C.

Det oppnås 8 g av etylester-tittelproduktet. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030,

(1961)].

Eksempel 7 - Fremstilling av propylesteren av hyaluronsyre

( HY)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 170.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres

i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 3,6 g (21,2 mekv.) propyl-jodid tilsettes og løsningen holdes i 12 timer ved 30°C. Den resulterende blandingen helles langsomt i 3500 ml etylacetat under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes fire ganger med 500 ml etylacetat og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C.

Det oppnås 8,3 g av propylester-tittelproduktet. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Eksempel 8 - Fremstilling av ( partial)- butylesteren av hyaluronsyre ( HY) - 50% forestrede karboksylgru<pp>er - 50% saltdannede karboks<y>l<g>rupper ( Nå).

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 620.000. tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 1,95 g (10,6 mekv.) n-butyljodid tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 12 timer ved 30°C. En løsning inneholdende 62 ml vann og 9 g natriumklorid tilsettes og den resulterende blandingen helles langsomt i 3500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuum-tørkes i 8 timer ved 30°C.

Produktet oppløses så i 550 ml vann inneholdende 1% natrium-klorid og løsningen helles langsomt i 3000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 500 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. Det oppnås 8 g av partial-butylester-tittelproduktet. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Eksempel 9 - Fremstilling av ( partial)- etoksvkarbonyl- metylesteren av hyaluronsyre ( HY) - 75% forestrede karboksyl<g>rupper

- 25% saltdannede karboksylgrupper ( Na).

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 180.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 2 g tetrabutylammoniumjodid og 1,84 g (15 mekv.) etylkloracetat tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

Produktet oppløses så i 550 ml vann inneholdende 1% natrium-klorid og løsningen helles langsomt i 3000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 500 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. 10 g av partial etoksykarbonylmetylesterforbindelsen i tittelen oppnås. Kvantitativ bestemmelse av etoksylester-gruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P.

C. Markunas [Anal. Chem. 33. 1028-1030, (1961)].

Eksempel 10 - Fremstilling av ( partial) kortisonesteren ( C?1) av hyaluronsyre ( HY) - 20% forestrede karboksylgrupper - 80% saltdannede karboksyl<g>rupper ( Na)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 105.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,850 g (2 mekv.) 21-brom-4-pregnen-17a-ol-3,11,20-trion tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

En løsning inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid tilsettes og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer

ved 30°C.

Produktet oppløses så i 3 00 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 1500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. Det oppnås 4,5 g av partial kortisonesterforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av kortison, etter mild alkalisk hydrolyse med en hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980, s. 127.

Eksempel 11 - Fremstilling av ( partial)- hvdrokortisonesteren ( C21) av h<y>alurons<y>re ( HY) - 20% forestrede karboksylgrupper - 80% saltdannede karboksylgrupper ( Na).

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 80,000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,850 g (2 mekv.) 21-brom-4-pregnen-ll/3,17a-diol-3 ,20-dion tilsettes og den resulterende løsning holdes i 24 timer ved 30°c.

En løsning tilsettes så inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 30°C.

Produktet oppløses så i 3 00 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles så langsomt i 1500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. Det oppnås 4,4 g av partial-hydrokortisonesterforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av hydrokortison, etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980, s. 224.

Eksempel 12 - Fremstilling av den ( partiale) fluorkortisonesteren ( C-,) av h<y>alurons<y>re ( HY) - 20% forestrede karboks<y>l-grupper - 80% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 80.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres 1 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,89 g (2 mekv.) 9-fluor-21-brom-4-pregnen-ll/3,-17a-diol-3,20-dion tilsettes og den resulterende løsning holdes i 12 timer ved 30°C.

En løsning tilsettes så som inneholder 62 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2 000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 30°C.

Produktet oppløses så i 300 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 1500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. 4,6 g av tittelforbindelsen oppnås. Kvantitativ bestemmelse av fluorkortison, etter mild alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980, s. 196.

Eksempel 13 - Fremstilling av ( partial)- desoksykortikosteronesteren ( C?1) av h<y>aluronsyre ( HY) - 20% forestrede karboks<y>l-grupper - 80% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

6,21 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 105.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres 1 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,661 g (2 mekv.) 21-brom-4-pregnen-3,2 0-dion tilsettes og den resulterende løsning holdes i 24 timer ved 30°C.

En løsning tilsettes så inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2 000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer

ved 30°C.

Produktet oppløses så i 300 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 1500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 3 0°C. 4,5 g av tittelforbindelsen oppnås. Kvantitativ bestemmelse av desoksykortikosteron, etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980, s. 137.

Eksempel 14 - Fremstilling av den ( blandede) etanol- og kortisonesteren ( C21) av h<y>alurons<y>re ( HY) - 80% av karboksylgruppene er forestret med etanol - 20% av karboksylgruppene er forestret med kortison ( C21)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 70.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 1,25 g (8 mekv.) etyljodid tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 12 timer ved 30°C.

0,85 g (2 mekv.) 21-brom-4-pregnen-17a-ol-3,11,20-trion tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

En løsning tilsettes så inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som så filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 30°C.

4,6 g av den blandede etanol- og kortisonesterforbindelsen i tittelen oppnås. Kvantitativ bestemmelse av kortison, etter mild alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

Kvantitativ bestemmelse av etoksylgruppene utføres ifølge R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030,

(1961)]. -

Eksempel 15 - Fremstilling av den ( blandede) etanol- og hydrokortisonesteren ( C?1) av hyaluronsyre ( HY) - 80% karboksyl-grupper forestret med etanol - 20% karboksylgrupper forestret med hvdrokortison ( C?-,)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 125.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 1,25 g (8 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes ved 30°C i 12 timer.

0,85 g (2 mekv.) 21-brom-4-pregnen-ll/3,17a-diol-3 ,20-dion

tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

Det tilsettes så en løsning som inneholder 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuum-tørkes i 8 timer ved 30°C.

Det oppnås 4,6 g av den blandede etanol- og hydrokortisonesterforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av hydrokortison etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

Kvantitativ bestemmelse av etoksylgruppene utføres ifølge R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Eksempel 16 - Fremstilling av den ( blandede) etanol- og fluorkortisonesteren ( C21) av hyalurons<y>re ( HY) - 80% karboksyl-grupper forestret med etanol - 20% karboksylgrupper forestret med fluorkortison ( C?1)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 70.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 1,25 g (8 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

0,89 g (2 mekv.) tilsettes 9a-fluor-21-brom-4-pregnen-11)3, 17a-diol-3,20-dion tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 3 0°C.

Det tilsettes så en løsning inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuum-tørkes i 8 timer ved 30°C.

Det oppnås 4,6 g av den blandede etanol- og fluor-kortisonesterforbindelsen som er angitt i tittelen.

Kvantitativ bestemmelse av fluorkortison, etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med klorform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

(1961)].

Eksempel 17 - Fremstilling av den ( blandede) etanol- og desoks<y>kortikosteronesteren ( d) av h<y>aluronsyre ( HY) - 80% karboksylgrupper forestret med etanol - 20% karboksylgrupper forestret med desoksvkortikosteron ( C21)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 70.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 1,25 g (8 mekv.) etyljodid tilsettes og den resulterende løsning holdes i 12 timer ved 3 0°C.

0,661 g (2 mekv.) 2l-brom-4-pregnen-3,20-dion tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 3 0°C. Det tilsettes så en løsning inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 3 0°C.

Det oppnås 4,6 g av d-;n blandede etanol- og desoksykortikosteron-esterforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av desoksykortikosteron, etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

Kvantitativ bestemmelse av etoksylgruppene utføres ifølge

R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030,

(1961)].

Eksempel 18 - Fremstilling av ( partial og den blandede) etanol- og desoksykortikosteronesteren av h<y>aluronsyre ( HY) - 40% karboksylgrupper forestret med desoksykortikosteron ( C21) - 40% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 125.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,62 g (4 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

0,85 g (2 mekv.) 2l-brom-4-pregnen-3,20-dion tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C. Det tilsettes så en løsning inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 30°C.

Det oppnås 4,5 g av partial og den blandede etanol- og desoksykortikosteronesterforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av desoksykortikosteron, etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

(1961)].

Eksempel 19 - Fremstilling av ( partial og den blandede) etanol- og kortisonesteren av h<y>aluronsyre ( HY) - 4 0% karboksylgrupper forestret med etanol - 20% karboksylgrupper forestret med kortison ( C71) - 4 0% saltdannede karboksylgrupper

( Na)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 125.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,62 g (4 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 3 0°C.

0,85 g (2 mekv.) 21-brom-4-pregnen-17a-ol-3,11,20-trion

tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

En løsning tilsettes så inneholdende 100 ml vann og 5 g natriumklorid og den resulterende blanding helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100.ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 30°C.

Det oppnås 4,5 g av partial og den blandede etanol- og kortisonforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av kortison, etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

Kvantitativ bestemmelse av etoksylgruppene utføres ifølge R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal^ Chem. 33, 1028-1030,

(1961)].

Eksempel 20 - Fremstilling av ( partial og den blandede) etanol- og hydrokortisonesteren ( LC21) av hyaluronsyre ( HY) - 40% karboksylgrupper forestret med etanol - 20% karboks<y>l-grupper forestret med hydrokortison ( C21) - 40% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 70.000 tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,62 g (4 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

0,85 g (2 mekv.) 2 l-brom-4-pregnen-ll/3,-17a-diol-3 ,2 0-dion tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

Det tilsettes så en løsning inneholdende 200 ml vann og

5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuum-tørkes i 8 timer ved 3 0°C.

Det oppnås 4,5 g av partial og den blandede etanol- og hydrokortisonesterforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av hydrokortison, etter mild, alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

(1961)].

Eksempel 21 - Fremstilling av ( partial- og de blandede) etanol- og fluorkortisonesterne ( C21) av hyaluronsyre ( HY) - 4 0% av karboks<y>l<g>ruppene forestret med etanol - 20% karboksyl-grupper forestret med fluorkortison ( C?1) - 40% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

6,2 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 65.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 310 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 0,62 g (4 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

0,89 g (2 mekv.) 9a-f luor-21-brom-4-pregnen-ll/3, -17a-diol-3,20-dion tilsettes og løsningen holdes i 24 timer ved 30°C.

Det tilsettes så en løsning inneholdende 100 ml vann og

5 g natriumklorid og den resulterende blandingen helles langsomt i 2000 ml aceton under konstant omrøring. Et bunnfall dannes som filtreres og vaskes tre ganger med 100 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 100 ml aceton og tilslutt vakuum-tørkes i 8 timer ved 3 0°C.

Det oppnås 4,6 g av partial og den blandede etanol- og fluorkortisonesteren i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av fluorkortison, etter mild alkalisk hydrolyse med hydroalkoholisk løsning av Na2C03 og ekstraksjon med kloroform, utføres ifølge British Pharmacopea, 1980.

(1961)].

Eksempel 2 2 - Fremstilling av n- pentylesteren av hyaluronsyre

( HY)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 620.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 3,8 g (25 mekv.) n-pentyl-bromid og 0,2 g tetrabutylammoniumjodid tilsettes, og

løsningen holdes i 12 timer ved 30°C.

Det oppnås 8,7 g av n-pentylesterproduktet i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av den metoden som er beskrevet på sidene 169-172 hos Siggia S. og Hanna J. G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4.de utgave John Wiley and Sons.

Eksempel 23 - Fremstillin<g> av isopentylesteren av hyaluronsyre

( HY)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på

170.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 3,8 g (25 mekv.) isopentyl-bromid dg 0,2 g tetrabutylammoniumjodid tilsettes og løsningen holdes i 12 timer ved 30°C.

Det oppnås 8,6 g av isopentylesterproduktet som angis i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av den metoden som er beskrevet på sidene 169-172 hos Siggia S. og Hanna J. G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4.de utgave John Wiley and Sons.

Eksempel 24 - Fremstilling av benzylestéren av hyaluronsyre

( HY)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 170.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 4,5 g (25 mekv.) benzylbromid og 0,2 g tetrabutylammoniumjodid tilsettes og løsningen holdes i 12 timer ved 3 0°C.

Den resulterende blandingen helles langsomt i 3 500 ml etylacetat under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes fire ganger med 500 ml etylacetat og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C.

Det oppnås 9 g av benzylesterproduktet i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av den metoden som er beskrevet på sidene 169-172 hos Siggia S. og Hanna J. G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4.de utgave John Wiley and Sons.

Eksempel 25 - Fremstilling av B - f envletyl- esteren av hyaluronsyre ( HY)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 125.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 4,6 g (25 mekv.) 2-brom-etylbenzen og 185 g tetrabutylammoniumjodid tilsettes og løsningen holdes i 12 timer ved 3 0°C.

Den resulterende blandingen helles langsomt i 3500 ml etylacetat under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som så filtreres og vaskes fire ganger med 500 ml etylacetat og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C.

Det oppnås 9,1 g av /?-fenyletylesteren i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av den metoden som er beskrevet på sidene 168-172 hos Siggia S. og Hanna J. G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4.de utgave John Wiley and Sons.

Eksempel 26 - Fremstilling av benzylesteren av h<y>alurons<y>re

( HY)

3 g av kaliumsaltet av HY med en molekylvekt på 162.000 suspenderes i 200 ml dimetylsulfoksyd og det tilsettes 120 mg tetrabutylammoniumjodid og 2,4 g benzylbromid.

Suspensjonen holdes i omrøring i 48 timer ved 3 0°C. Den resulterende blandingen helles langsomt i 1000 ml etylacetat under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes fire ganger med 150 ml etylacetat og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 3 0°C.

Det oppnås 3,1 g av benzylesterproduktet i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av den metoden som er beskrevet på sidene 169-172 hos Siggia S. og Hanna J. G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4.de utgave John wiley and Sons.

Eksempel 27 - Fremstilling av streptomvcinsalt av hyaluronsyre ( HY) som er delvis forestret med etanol - 75% av karboksylgrupper er forestret med etanol - 25% av karboksylgruppene er saltdannet med streptomycin.

243 mg streptomycin-sulfat (1 mekv.) solubiliseres i 20 ml vann. Løsningen elueres i en termostatisk kolonne ved 5°C inneholdende 2 ml av kvaternær ammoniumharpiks ("Dowex" 1x8) i 0H""<f>orm.

Det sulfat-frie eluatet samles i en termostatisk beholder ved en temperatur på 5°C.

1,6 g av en 75%ig etylester av HY og 25%ig natriumsalt (tilsvarende 1 mekv. av en monomer-enhet i forhold til det ikke-forestrede karboksyl), solubiliseres i 400 ml vann. Løsningen elueres i en termostatisk kolonne ved 20°C og som inneholder 2 ml sulfonharpiks ("Dowex" 50 x 8) i H+<->form.

Det natrium-frie eluatet samles under omrøring i løsningen av streptomycinbase. Den resulterende løsningen fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 1,7 g.

Mikrobiologisk bestemmelse på B. subtilis ATCC 6633 sammenlignet med streptomycinstandard, viser et innhold på 10,9 vektprosent av streptomycinbase, tilsvarende det teoretisk beregnede innhold.

Eksempel 28 - Fremstillin<g> av ervtromycinsaltet av hyaluronsyre ( HY) delvis forestret med etanol - 75% karboksylgrupper forestret med etanol - 25% karboksylgrupper saltdannet med erytromycin

1,6 g av 75% etylester av HY og 25% natriumsalt (tilsvarende mekv. av en monomer-enhet i forhold til den ikke-forestrede karboksyl), solubiliseres i 400 ml vann. Løsningen elueres i en termostatisk kolonne ved 20°C inneholdende 2 ml sulfonharpiks ("Dowex" 50 x 8) i H+<->form.

Til det natrium-frie eluatet tilsettes 734 mg erytromycinbase (1 mekv.)* Den resulterende løsningen fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 2,1 g.

Mikrobiologisk bestemmelse på St. aureus ATCC 6538 sammenlignet med standard erytromycin, viser et innhold på 31,7 vektprosent erytromycinbase, tilsvarende den teoretisk beregnede vekt.

Eksempel 29 - Fremstilling; av neomvcinsaltet av h<y>aluronsyre ( HY) som er delvis forestret med etanol - 75% karboksylgrupper forestret med etanol - 25% karboksylgrupper saltdannet med neomycin

152 mg neomycin-sulfat (1 mekv.) solubiliseres i 20 ml vann. Løsningen elueres i en termostatisk kolonne ved 5°C inneholdende 2 ml kvaternær ammoniumharpiks ("Dowex" 1x8) i 0H""<f>orm.

Det sulfat-frie eluatet samles i en termostatbeholder ved en temperatur på 5°C.

1,6 g av 75% etylester av HY og 25% natriumsalt (tilsvarende 1 mekv. av monomer-enhet i forhold til den ikke-forestrede karboksylgruppe), solubiliseres i 400 ml vann. Løsningen elueres i en termostatisk kolonne ved 20°C og inneholdende 2 ml sulfonharpiks ("Dowex" 50 x 8) i h^-form.

Det natrium-frie eluatet samles under omrøring i løs-ningen av neomycinbase. Den resulterende løsningen fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 1,65 g.

Mikrobiologisk bestemmelse utført på St. aureus ATCC 6538 sammenlignet med standard neomycin, viser et innhold på 6,1 vektprosent neomycinbase, tilsvarende den teoretisk beregnede verdi.

Eksempel 30 - Fremstilling av gentamicinsaltet av hyaluronsyre ( HY) som ^ r delvis forestret med etanol - 75% karboksylgrupper forestret med etanol - 25% karboksylgrupper saltdannet med gentamicin

145 mg gentamicinsulfat solubiliseres i 10 ml vann. Løsningen elueres i en termostatisk kolonne ved 5°C inneholdende 2 ml kvaternær ammoniumharpiks ("Dowex" 1x8) i OH~"

form.

1,6 g av 75% etylester av HY og 25% natriumsalt (tilsvarende 1 mekv. av en monomer-enhet i forhold til den ikke-forestrede karboksylgruppen), solubiliseres i 400 ml vann. Løsningen elueres i en termostatisk kolonne ved 20°C og inneholdende 2 ml sulf onharpiks ("Dowex" 50 x 8) i H+<->form.

Det natrium-frie eluatet samles under omrøring i løs-ningen av gentamicinbase. Den resulterende løsningen fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 1,7 g.

Mikrobiologisk bestemmelse utført på S. epidermidus ATCC 12228 sammenlignet med standard gentamicin, viser et innhold på 6,5 vektprosent gentamicinbase, tilsvarende den teoretisk beregnede verdien.

Eksempel 31 - Fremstillin<g> av amikacinsaltet av hyaluronsyre ( HY) delvis forestret med etanol - 75% karboksylgrupper forestret med etanol - 2 5% karboksylgrupper saltdannet med amikacin

147 mg (1 mekv.) amikacin solubiliseres i 20 ml vann.

Det natrium-frie eluatet samles under omrøring i løs-ningen av amikacinbase. Den resulterende løsningen fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 1,7 g.

Mikrobiologisk bestemmelse utført på St. aureus ATCC 29737 sammenlignet med standard amikacin, viser et innhold på 8,5 vektprosent amikacinbase, tilsvarende den teoretisk beregnede verdi.

Eksempel 32 - Fremstilling av kanamycinsaltet av hyaluronsyre ( HY) delvis forestret med etanol - 75% karboksylgrupper forestret med etanol - 2 5% karboksylgrupper saltdannet med kanamycin.

146 mg kanamycinsulfat (1 mekv.) solubiliseres i 20 ml vann. Løsningen elueres i en termostatkolonne ved 5°C inneholdende 2 ml kvaternær ammoniumharpiks ("Dowex" 1 x 8) i 0H"~ form.

Det sulfat-frie eluatet oppsamles i en termostatbeholder ved en temperatur på 5°C.

1,6 g av 75% etylester av HY og 25% natriumsalt (tilsvarende 1 mekv. av en monomer-enhet i forhold til den ikke-forestrede karboksylgruppen), solubiliseres i 400 ml vann. Løsningen elueres i en termostatkolonne ved 20°C og inneholdende 2 ml sulf onharpiks ("Dowex" 50 x 8) i H+<->form.

Det natrium-frie eluatet samles under omrøring i løs-ningen av kanamycinbase. Den resulterende løsningen fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 1,5 g.

Mikrobiologisk bestemmelse utført på B. subtilis ATCC 6633 sammenlignet med standard kanamycin, viser et innhold på 7 vektprosent kanamycinbase, tilsvarende den teoretisk beregnede verdi.

Eksempel 33 - Fremstillin<g> av pilocarpinsaltet av hyaluronsyre ( HY) delvis forestret med etanol - 75% karboksylgrupper forestret med etanol - 25% karboksylgrupper saltdannet med pilocarpin

245 mg pilocarpin-hydroklorid (1 mekv.) solubiliseres i 2 0 ml vann. Løsningen elueres i en termostatkolonne ved 5°C inneholdende 2 ml kvaternær ammoniumharpiks ("Dowex" 1 x 8) i OH"<f>orm.

Det klorid-frie eluatet samles i en termostatbeholder ved 5°C.

1,6 g av 75% etylester av HY og 25% natriumsalt (tilsvarende 1 mekv. av en monomer-enhet i forhold til den ikke-forestrede karboksylgruppen), solubiliseres i 400 ml vann. Løsningen elueres i en termostatkolonne ved 2 0°C og inne-

holdende 2 ml sulf onharpiks ("Dowex" 50 x 8) i IT^-form.

Det natrium-frie eluatet samles under omrøring i løs-ningen av pilocarpinbase. Den resulterende løsningen fryses øyeblikkelig og frysetørkes. Utbytte: 1,89 g.

Eksempel 34 - Fremstilling av ( partial propyl)- esteren av h<y>alurons<y>re ( HY) - 85% forestrede karboksylgrupper - 15% saltdannede karboksylgrupper ( Na)

12,4 g HY-tetrabutylammoniumsalt med en molekylvekt på 165.000 tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet solubiliseres i 620 ml dimetylsulfoksyd ved 25°C, 2,9 g (17 mekv.) propyl-jodid tilsettes og den resulterende løsningen holdes i 12 timer ved 30°C.

En løsning tilsettes så inneholdende 62 ml vann og 9 g natriumklorid og den resulterende blanding helles langsomt i 3500 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes tre ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med aceton og tilslutt vakuumtørkes i 8 timer ved 3 0°C.

Produktet oppløses så i 550 ml vann inneholdende 1% natriumklorid og løsningen helles langsomt i 3000 ml aceton under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes to ganger med 500 ml aceton/vann 5:1 og tre ganger med 500 ml aceton og tilslutt vakuumtørkes i 24 timer ved 30°C. Det oppnås 8 g av partial propylesterforbindelsen i tittelen. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved bruk av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Eksempel 35 - Fremstillin<g> av pilocarpinsaltet av hyaluronsyre ( HY) delvis forestret med n- propanol - 85% karboksylgrupper forestret med n- propanol - 15% karboksylgrupper saltdannet med pilocarpin

245 mg pilocarpin-hydroklorid (1 mekv.) solubiliseres i 10 ml vann. Løsningen elueres i en termostatkolonne ved 5°C inneholdende 2 ml kvaternær ammoniumharpiks ("Dowex" 1x8) i 0H"<f>orm.

Det klorid-frie eluatet samles i en termostatbeholder ved 5°C.

4,1 g av propylesteren av HY 85% og tetrabutylammoniumsalt 15% (tilsvarende 1 mekv. av en monomer-enhet i forhold til den ikke-forestrede karboksylgruppen) solubiliseres i 100 ml dimetylsulfoksyd. Løsningen elueres i en termostatkolonne ved 20°C inneholdende 2 ml fuktig sulfonharpiks ("Dowex" 50 x 8) i H+<->form.

Eluatet oppsamles under omrøring i løsningen av pilocarpinbase. Den resulterende løsningen utfelles med etylacetat (600 ml).

Bunnfallet filtreres og vaskes fire ganger med 200 ml etylacetat og vakuumtørkes tilslutt i 24 timer ved 30°C. 3,5 g av tittelforbindelsen oppnås.

Eksempel 36 - Fremstilling av et<y>lesteren av et surt polysakkarid produsert av Rhinocladiella eliator.

Det sure polysakkaridet fremstilt fra Rhinocladiella eliator Mangenot NRRL YB-4613 anvendes (P. R. Watson, P. A.

Sandford, K. A. Burton, M. C. Cadmus og A. Jeanes - Carbohydr. Res. 46. 259-265 (1976), L. Kenne, B. Lindberg, K. Peterson og P. Unger, Carbohydr. Res. 84, 184-186 (1980). Det er dannet av enheter av 2-acetamido-2-deoksy-D-glukuronsyre sammenbundet

med bindingene 1-+4.

5,2 g av kaliumsaltet av dette sure polysakkaridet, tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet,. suspenderes i 250 ml dimetylsulfoksyd. Mens blandingen holdes i omrøring tilsettes

200 mg tetrabutylammoniumjodid ved 35°C og så langsomt 3,5 g metyljodid. Blandingen holdes i omrøring i 48 timer ved 35°C, hvoretter den langsomt helles i 800 ml etylacetat, som holdes under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes fire ganger med 150 ml etylacetat og tilslutt

vakuumtørkes. 4 g av etylesterproduktet i tittelen oppnås således, i hvilket alle karboksylgruppene er forestret. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved hjelp av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Eksempel 37 - Fremstillin<g> av etvlesteren av det sure polysakkaridet som produseres av Rhinocladiella eliator

10,0 g av tetrabutylammoniumsaltet av det sure polysakkaridet som ble brukt som startsubstans i Eksempel 36, tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet, behandles med 800 ml dimetylsulfoksyd ved 30°C. 3,3 g (21,2 mekv.) etyljodid tilsettes og løsningen holdes under omrøring i 48 timer ved 30°C. Den resulterende blandingen helles langsomt i 4000 ml etylacetat under konstant omrøring. Det dannes et bunnfall som filtreres og vaskes fire ganger med 500 ml etylacetat og tilslutt vakuumtørkes. 3 g av etylesterproduktet i tittelen oppnås, i hvilket alle karboksylgruppene er forestret.

Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ved hjelp av metoden til R. H. Cundiff og P. C. Markunas [Anal. Chem. 33^ 1028-1030, (1961)].

Eksempel 38 - Fremstillin<g> av etylesteren av det sure polysakkaridet som er fremstilt av Rhinocladiella Mansoni

Surt polysakkarid fremstilt av Rhinocladiella Mansoni NRRL Y-46272 [(A. Jeanes, K. A. Burton, M. C. Cadmus, C. A. Knutson, G. L. Rowin og P. A. Sandford - Nature (London) 233, 259-260 (1971), P. A. Sandford, P. A. Watson og A. P. Jeanes - Carbohydr. Res. 29, 153-166 (1973)] anvendes. Det er sammensatt av enheter som er dannet av ett molekyl 2-acetamido-2-deoksy-D-glukuronsyre og to molekyler N-acetyl-D-glukosamin sammenbundet med bindingene i- >3.

18,2 g tetrabutylammoniumsalt av dette sure polysakkaridet, tilsvarende 20 mekv. av en monomer-enhet, behandles med 1000 ml dimetylsulfoksyd ved 30°C. Under omrøring tilsettes 3,3 g (21,2 mekv.) etyljodid og løsningen holdes ved 30°C i 24 timer, hvoretter den langsomt helles i 4000 ml etylacetat under konstant omrøring. Et bunnfall dannes som filtreres og vaskes fire ganger med 500 ml etylacetat og tilslutt vakuumtørkes.

Det oppnås 11 g av tittelproduktet, i hvilket alle karboksylgruppene er forestret. Kvantitativ bestemmelse av estergruppene utføres ifølge metoden til R. H. Cundiff og P.

C. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028-1030, (1961)].

Undersøkelser av biologisk aktivitet

1) Undersøkelser av antiinflammatorisk aktivitet

Virkningen av esterne fremstilt ifølge oppfinnelsen kan påvises eksempelvis ved å godtgjøre den antiinflammatoriske aktiviteten til noen partialestere av hyaluronsyre med anti-flogistiske kortikosteroider, målt i modellen med eksudativ flogose indusert av dekstran i kaninøye.

Materialer

9 hyaluronsyre-estere av kortison, hydrokortison og fluorkortison (9 - fluorhydrokortison) identifisert ved kodenavnene HYCI - HYC9 ble testet. Tabell 1 beskriver disse

forbindelsene og angir prosentene for antallet karboksyl-grupper av HY som er forestret med de ovenstående kortikosteroidene, og der de kan anvendes, prosenten som er forestret med enkle, alifatiske alkoholer og de som er saltdannet med alkalimetaller (Na): Aktiviteten til forbindelsene i Tabell 1 ble sammenlignet med de tilsvarende kortisonene.

Alle derivatene, bortsett fra HYC4, HYC5 og HYC6 (oppløst i DMSO) ble oppløst i saltløsning (2 mg/ml).

Metode

Aseptisk (eksudativ) flogose ble indusert hos 48 kaniner ved intraokulær injeksjon av dekstran (1% i saltløsning,

0,1 ml). De forskjellige produktene ble administrert ved inndrypping i det høyre øyet (RE) hos kaninene, mens det i det venstre øyet (LE) bare ble inndryppet vehikkel.

Behandlingen (3 dråper i hver 6. time) ble begynt like etter injeksjonen av dekstran og ble fortsatt i 16 dager.

Oftalmisk undersøkelse

Begge øynene hos hver kanin ble observert gjennom en spaltelampe. Spesielt det følgende ble undersøkt: tilstanden til øyets bindehinne og hornhinne-epitelet, det fremre kammer (tilstedeværelse av Tyndall-effekt), regnbuehinnens tilstand og tilstanden til øyets bakre segment. Med en Goldmann-linse ble tilstanden til øyets bakre del undersøkt. Tilstedeværende tegn på inflammasjon (hyperemi, eksudat, uklare væsker, osv.) ble nedtegnet. Prosent av øyne som ikke oppviste noen tegn på flogise ble så beregnet.

Resultater

Slik det kan observeres fra de resultatene som er oppført i Tabell 2, hadde alle HYC-derivatene betydelig, anti-inf lammatorisk aktivitet som hele tiden var bedre enn de tilsvarende kortisoner som ble parallelltestet, og de reduserte ikke bare prosentsatsen øyne med flogose på hver observasjonsdag, men reduserte også inflammasjonens varighet. Det mest effektive av disse derivatene synes å være HYC4, HYC5 og HYC6, sannsynligvis fordi de er mere lipofile.

Verdiene er uttrykt som prosenter (antall øyne uten tegn på flogose av totalantallet behandlede øyne). I parentes angis antallet behandlede øyne. 2) Undersøkelser av absorbsjon og biotilgjengelighet

Virkningen av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan vises ved en undersøkelse av absorbsjonen og av biotilgjengeligheten for noen derivater av hydrokortison med hyaluronsyre. De derivater som ble brukt er de som er beskrevet ovenfor og identifisert som HYC2, HYC5 og HYC8.

Materialer og metoder

Dyr

Sprague-Dawley-hannrotter med en kroppsvekt på 250-350 g ble brukt, oppnådd fra Charles-River-Calco (Como), foret ad libitum med vann på et sammensatt pelletfor, med kodenavnet 4RF 21, fremstilt av "Italiana Mangimi", på lisens fra Charles River.

Behandling

Hydrokortison ble administrert i form av natrium hemi-succinatsaltet i en dose på 1,34 mg/kg (tilsvarende 1 mg/kg hydrokprtisonbase) generelt ved intravenøs tilførsel og i en dose på 1,34 mg/kg og 2,68 mg/kg (tilsvarende 2 mg/kg hydrokortisonbase) ved subkutan tilførsel (den intravenøse til-førselen ble brukt for å bestemme de farmakokinetiske parametere som tjener som en sammenligning for vurderingen av absorbsjon ved hjelp av en hvilken som helst annen administrasjonsmåte).

De tre HYC-derivatene ble administrert subkutant i en dose på 6,5 og 13 mg/kg (dosene tilsvarte ca. 1 og 2 mg/kg hydrokortisonbase). Alle de forskjellige produktene ble oppløst i steril saltløsning, bortsett fra for HYC5, som var uløselig i helt vandige løsninger, og derfor først ble solu-bilisert ved tilsetning av den minimale mengde som var nød-vendig av dimetylsulfoksyd, og så bragt til det riktige volumet med saltløsning. Alle forbindelser ble injisert med ét konstant volum på 1 mg/kg.

Samling av plasmaprøvene

Etter administrasjon ble 0,3 ml blod uttatt fra hvert dyr ved hjertepunktur i nærvær av antikoaguleringsmiddel (natrium-heparin).

Blodtagningstider var som følger: *15 min., 30 min., 60 min., 120 min., 180 min., 300 min., 360 min., 420 min., 480 min. (* begrenset til den intravenøse tilførselen).

Dosering av hydrokortison

Hydrokortisonet ble dosert ved hjelp av radioimmunoprøve-metoden (Cortisolo Kit, Biodata, kod. 10394) ved bruk av jodat-"tracing". Presisjonen og nøyaktigheten til metoden, bestemt med seks gjentagelser (dobbelt) av et kontrollserum med en kjent kontrollprøve, viste seg å være henholdsvis 3,03% og 0,021%. Lineariteten til metoden ligger mellom 1 og 1000 ng/ml. Observasjonsgrensen er 1 ng/ml.

Doseringen av cortisolemien hos rotten influeres hverken av basisnivåene eller circadian-rytmene til dette hormonet, da det metaboliske mønsteret til de endogene glukokortikoid-hormonene hos rotten, fører til produksjon av kortikosteron og ikke kortisol (se E. L. Green: Biology of the laboratory mouse).

Forhåndsprøver har vist at doseringsmetoden er spesifikk bare for fri kortisol. Antikortisol antistoffet oppviser ingen form for konkurranse overfor noen av de tre HYC-derivatene.

Resultater

I Tabell 3 er resultatene av de gjennomsnittlige plasmanivåene av hydrokortison, etter intravenøs og subkutan injeksjon (1 og 2 mg/kg) angitt. Det skal understrekes at, etter subkutan injeksjon er det en ganske rask absorbsjon av produktet (Tmax vurdert ved ca. 30 minutter, Cmax er det samme som nivåene etter intravenøs injeksjon ved samme dose). I Tabell 4 angis de farmakokinetiske parametere for kortisol beregnet grafisk fra plasmanedgangskurvene. I Tabell 3 angis gjennomsnittsnivåene for kortisol etter subkutan administrasjon av de tre HYC-derivatene i doser på 6,5 og 13 mg/kg (tilsvarende ca. 1 og 2 mg/kg hydro-

kortisonbase). I Tabell 4 angis de farmakokinetiske parametere i forhold til kortisol beregnet grafisk med metoden av restene fra plasma-absorbsjonskurven for de tre HYC-produktene.

Det skal bemerkes at kinetikken for hydrokortison fri-gjort fra de tre derivatene med hyaluronsyre ikke er lineær. Det vil si at det ikke eksisterer noe direkte forhold mellom de dose-avhengige parametere slik som arealet nedenfor plasma-nedgangskurven og plasmanivåene. Siden kinetikken for kortisol i seg selv er lineær og det oppnås en førstegradens modell, kan det utledes at metningsprosessen når det gjelder HYC-derivater er hydrolysen av esterbindingen mellom hyaluronsyre og cortisolo. Denne fasen (en tendens mot kinetikk av nulte graden) er ikke selv forbundet med absorbsjonen av.det aktive stoffet og kinetikken til de tre HYC ble likeledes løst ifølge en førstegradens modell.

Konklusjoner

Biotilgjengeligheten sammenlignet med hydrokortison for de tre undersøkte produktene, viser seg å være fullstendig og til og med bedre enn for det raskt frigjorte preparatet. Når det gjelder dette er imidlertid absorbsjonen langsommere (maksimumtid ca. 2 timer) og maksimumkonsentrasjoner som er like med de for subkutant administrert kortisol oppnås ikke. Den plasmatiske kortisolemien viser seg imidlertid gjennomsnittlig å være høyere flere timer etter administrasjon. Forestring med hyaluronsyre gir derfor langsommere frigjøring av hydrokortison, og dette er det ønskede mål.

3) Undersøkelse av hud- hydratisering

Hydrolyse av esterbindingen, slik det allerede er nevnt, er en metningsprosess. Det vil si den tenderer mot null graders kinetikk. Dette er en meget ønskelig faktor for en form med forsinket avgivelse, siden et preparat med regulert frigjøring etter definisjonen er "et preparat som bestemmer frigjøringen av en konstant alikvot av aktivt stoff på en gitt tid" og dette er den tilstand som nås ved null graders kinetikk.

PÅ grunn av den komplekse naturen når det gjelder hudens fysiologiske funksjoner, kan den ikke anses som bare et passivt dekningsorgan, men heller som et dynamisk, flerverdig organ. Den fullstendige, funksjonelle kapasiteten til huden garanteres fundamentalt ved nærvær av en intakt, hydrolipidisk bedekning og dette krever et korrekt fuktighetsinnhold i hornskiktet, hvilket varierer en stor del avhengig av dets lagringskapasitet (verdier varierer mellom 10% og 60% vann-innhold) . Hudens fuktighet avhenger av en serie endogene og eksogene faktorer.

Hudens fuktighet innvirker fundamentalt på dannelsen av hudens spesiikke, hydrolipidiske film som modifiserer og lagrer substanser den eliminerer, og danner således basis for gjennomføringen av dens beskyttende funksjoner.

Forsvarsmidlene som er brukt så langt for å gjenopprette maksimal hydratiseringsgrad for huden omfatter bruken av meget hygroskopiske substanser, som for eksempel glycerol, natrium-laktat og propylenglykol. Disse substansene har imidlertid den ulempe, under tørre betingelser, at de trekker fuktighet fra huden selv i steden for fra den ytre omgivelse, og således gjør huden enda tørrere.

Av denne grunn foretrekkes for tiden biologiske substanser hvis opprinnelse ligger, når det gjelder deres spesielle egenskaper, i de naturlige hydratiseringsfaktorer som er nevnt foran. I denne sammenheng kan også omfattes den betydelige interesse for bruken av hyaluronsyre.

Hydratiseringen av huden og dens næringstilførsel synes nær forbundet med HY-innholdet i hudvevet. Det er faktisk påvist at den eksogene medvirkningen av HY medvirker merkbart til hydratiseringstUstanden for hudvevet.

Disse spesielle egenskapene til hyaluronsyre finnes også, og i en enda større grad, hos de forestrede derivatene av HY fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, og av denne grunn kan de i stor grad anvendes på kosmetikkområdet.

For å etablere en sammenligning mellom hyaluronsyre og dens derivater fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble det utført noen forsøk for etter lokal påføring avgjørende å bestemme hydratiseringsegenskapene til de forbindelsene som undersøkes.

Materialer

Som hyaluronsyrederivater fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble følgende estere anvendt.

HYAFFZ hyaluronsyre forestret 75% med metanol

HYAFF7 hyaluronsyre forestret 75% med etanol

HYAFF8 hyaluronsyre forestret 50% med isopropanol

HYAFF9 hyaluronsyre forestret 50% med n-propanol

HYAFF10 hyaluronsyre forestret 50% med n-butanol Hyaluronsyre-natriumsalt (Hyalastin-fraksjon)

Alle forbindelsene ble innført med en konsentrasjon på 0,2% i en salve hvis sammensetning var som følger:

Polyetylenglykol-monostearat 400, 10.000 g.

Cetiol V, 5.000 g.

Lanette SX, 2.000 g.

Metylparaoksybenzoat, 0,075 g.

Propylparaoksybenzoat, 0,050 g.

Natriumdehydroacetat, 0,100 g.

Glycerol F.U., 1.000 g.

Sorbitol 70, 1.500 g.

Testkrem, 0,050 g.

Vann for injiserbare preparater, q.b.a. 100.000 g. Placebopreparatet inneholdt bare vehikkel.

Metode

Prøveundersøkelse

Undersøkelsen ble utført på 10 friske frivillige (seks kvinner og fire menn som ikke led av noen form av hudsykdom) med alder mellom 20 og 60 år.

Behandling

Hver frivillig ble behandlet (enkel administrasjon) med alle blandinger som skal undersøkes, som ble påført (1 g/salve) på den indre overflaten av hver underarm, idet påføringssonen (ca. 25 cm<2>) for hvert produkt ble adskilt med en dermografisk blyant og prosedyren ble standardisert så mye som mulig. PÅ den høyre underarmen ble de forbindelsene som er kjent som HYAFF2, HYAFF7, HYAFF8, HYAFF9 påført, mens det på den venstre underarmen ble påført HYAFF10, placebo og hyaluronsyre.

Vurderingsparametere

Ved de fastslåtte tidene (0, 3, 6 og 24 timer etter behandlingen) ble hydratiseringsgraden av hornsjiktet i hver påføringssone målt med et "corneometer".

Mere spesielt ble den dielektiske styrken i vannet målt (på 0,8 sekund), etter påføring av sensoren (kondensator) på hudoverflaten. Den således oppnådde verdi, hvis måle-enhet tilsvarer 0,07 mg vann (normalverdier ligger mellom 90 og 100 enheter), ble avlest på instrumentets skive.

Registreringene ble utført under betingelser med konstant fuktighet.

Resultater

Som det kan sees av resultatene som er angitt i Tabell 5, induserte behandling med forbindelsene av HYAFF-serien i alle tilfeller en merkbar økning i hydratiseringsgraden av hornsjiktet, hvilket var spesielt tydelig ikke bare i timene som fulgte like etter påføringen, men også av de siste registreringene. Denne effekten viste seg å være bedre enn både den til placebopreparatet og det preparatet som inneholdt hyaluronsyre-natriumsalt. Av de testede forbindelsene viste derivatene HYAFF2 og HYAFF9 seg særlig interessante.

Konklusjoner

På basis av de oppnådde resultatene var det mulig å konkludere med at de forestrede HYAFF-derivatene fremmer en

merkbar og forlenget hydratiseringseffekt på hudnivået, som er bedre enn den som observeres med det preparatet som inneholder hyaluronsyre, og således garanterer integriteten og den fysiologiske effektiviteten til den hydrolipidiske filmen. Disse

tilfredsstillende resultater danner derfor en gyldig basis for bruken av disse forbindelsene ved hindring (eller behandling) av sprukken hud, behandlingen av brannsår og skolding og bibehold av fysiologisk ernæring og elastisitet hos huden.

4) Undersøkelser av enzymstabilitet og oksygen-permeabilitet

Materialer

De verdifulle egenskapene til de nye esterne fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, som allerede er delvis beskrevet, og som utgjør deres tekniske fordel fremfor de allerede kjente produktene på de respektive områdene illustreres ytterligere av de følgende resultatene når det gjelder stabiliteten av enzymene og permeabiliteten for oksygen av de filmene som oppnås med følgende forbindelser: HYAFF2 hyaluronsyre forestret 100% med metanol

HYAFF7 hyaluronsyre forestret 100% med etanol

HYAFF8 hyaluronsyre forestret 100% med isopropanol

HYAFFg hyaluronsyre forestret 100% med n-propanol

HYAFFn hyaluronsyre forestret 100% med benzylalkohol HYAFF20 hyaluronsyre forestret 100% med /3-fenyletyl-alkohol HYAFF22 hyaluronsyre forestret 100% med isopentyl-alkohol Filmene kan fremstilles ifølge den metoden som er beskrevet i Eksempel 39.

HYAFF- filmenes stabilitet overfor enzymer

Stabilitet overfor serumesterase

Hver film (veide ca. 20 mg) ble anbrakt i en polyetylen-kapsel sammen med 5 ml kaninserum og holdt ved en konstant temperatur (37°C) .

Vurderingsparameteren var den tid det tok (i timer) for at filmen skulle løse seg opp. Resultatene gjengis i Tabell 6.

Stabilitet overfor hyaluronidase

Hver film (vekt ca. 20 mg) ble anbrakt i en polyetylen-kapsel sammen med pH 5-buffer (acetat 0,1M, NaCl 0,15M) eller pH 7,2 (fosfat 0,1M, NaCl 0,15M) inneholdende 100 U enzym (testikkel-hyaluronidase fra Miles sats 8062, aktivitet 342 turbidometriske enheter/mg) i hver ml og holdt ved en konstant temperatur (37°C) . Vurderingsparameteren var den tid det tok (i timer) fra filmen skulle oppløses. Resultatene er angitt i Tabell 6.

Permeabilitet for oksygen for filmene i HYAFF- serien

Hver film ble anbrkt i en beholder med to avdelinger som

er skilt ved selve membranen. En avdeling (volum =1,2 cc) ble fylt med delvis avgasset vann (P02 = 45 mm Hg ved 23°C) , i den andre ble det innført en strøm av 02 og C02 (henholdsvis 95% og 5%), som holdes konstant (1 boble/sekund) over tid. Hele

systemet ble isolert i nitrogen.

Ved de fastsatte tidene (15, 30, 60, 90, 120, 240 minutter) ble en passende alikvot vann trukket ut (1,1 cc) og bestemmelse av partialtrykket av 02 ble gjennomført ved hjelp av en Gas System analysator 13 02 fra Instrumentation Labora-tories. Metningstrykket ( 5^ 0 mg Hg) ble brukt som referanse-verdi og beregnet, under de tidligere beskrevne forsøks-betingelsene, ved innblåsning av 02-atmosfæren.

Testene ble utført som en sammenligning med en ugjennom-trengelig membran og "silastic" (Lepetit kat. nr. 500-1). Resultatene er oppført i Tabell 7.

Farmasøytiske preparater

Farmasøytiske preparater kan inneholde én eller flere av de ovennevnte estere av hyaluronsyre og salter derav, eller ett eller flere medikamenter som oppnås ved forbindelse av én av disse esterne med en farmakologisk aktiv substans for lokal anvendelse, som beskrevet ovenfor. Det vil si medikamenter i hvilke hyaluronsyre-esteren virker som en bærer for den aktive substansen.

De farmasøytiske preparatene som inneholder hyaluronsyre-esterne som et aktivt stoff, både når det gjelder estere med terapeutisk inaktive alkoholer bestemt for samme anvendelser som hyaluronsyren selv, og estere med terapeutisk aktive alkoholer som er ment for de vanlige anvendelsene av slike alkoholer, inneholder de vanlige bindemidlene og kan anvendes for oral, rektal, parenteral, subkutan, lokal eller intradermal bruk. De anvendes derfor i fast eller halvfast form, for eksempel som pastiller, tabletter, gelatinkapsler, kapsler, supppositorier eller myke gelatinkapsler. For parenteral og subkutan bruk er det mulig å bruke former som er ment for intramuskulær eller intradermal administrasjon, eller passende for infusjoner eller intravenøse injeksjoner. Det er derfor mulig å tilveiebringe løsninger av de aktive forbindelsene eller frysetørkede pulvere av de aktive forbindelsene som skal tilsettes til ett eller flere, farmasøytisk godt-agbare bindemidler eller fortynningsmidler, hensiktsmessig for de ovenfor nevnte anvendelser og med osmolaritet som er forenelig med de fysiologiske væskene. For lokal bruk kan det. anvendes preparater i sprayform, for eksempel nesesprayer, kremer eller salver for lokal bruk eller spesielt fremstilte, klebeplastere for intradermal administrasjon. Løseligheten av hyaluronsyre-esterne i organiske løsningsmidler med lave kokepunkter gjør dem spesielt egnede for fremstillingen av "sprayer".

Preparatene kan administreres til mennesker eller dyr. De inneholder fortrinnsvis mellom 0,01% og 10% av den aktive bestanddel for løsninger, sprayer, salver og kremer og mellom 1% og 100%, fortrinnsvis mellom 5% og 50%, aktiv forbindelse for preparater i fast form. Den dose som skal administreres vil avhenge av individuelle behov, av den ønskede effekt og av den valgte administrasjonsmåte. Den daglige dose av slike preparater kan avgjøres ifølge samme bruk for de tilsvarende, kjente preparatene både for hyaluronsyre for tilsvarende behandlinger, for eksempel for behandling av artritt, for eksempel hos mennesker eller hester, og for den terapeutisk aktive alkoholen, avhengig av den virkning den skal brukes for. Doseringen av en hyaluronsyre-ester med kortison kan således oppnås fra dens innhold av dette steroidet og fra dens vanlige dosering i kjente, farmasøytiske preparater.

En spesiell form av farmasøytiske preparater representeres av de ovenfor nevnte medikamenter inneholdende forbindelsen av en hyaluronsyre og av én eller flere aktive substanser. Disse kan også foreligge i fast form, for eksempel som frysetørkede pulvere som inneholder bare de to bestanddelene (1) og (2), sammen eller separat. Denne galeniske formen er spesielt egnet for lokal bruk. Disse faste medikamentene danner faktisk, ved kontakt med de overflater som skal behandles, mer eller mindre konsentrerte løsninger ifølge naturen av det spesielle epitelet, med de samme egenskapene for løsningene som tidligere er fremstilt in vitro og som representerer et annet spesielt viktig aspekt ved foreliggende oppfinnelse. Slike løsninger lages spesielt med destillert vann eller steril saltløsning og inneholder fortrinnsvis ingen annen farmasøytisk bærer bortsett fra hyaluronsyre-esteren eller en av dens salter. Konsentrasjonene av slike løsninger kan også variere innenfor vide grenser, for eksempel mellom 0,01% og 75% både for hver av de to bestanddelene brukt separat, og for deres blandinger eller salter. Løsninger med en uttalt elastisk-viskøs karakter, for eksempel med et innhold av 10% til 9 0% av medikamentet eller av hver av dens bestanddeler foretrekkes spesielt.

Spesielt viktige er de medikamenter av denne typen, både i vannfri form (frysetørket pulver) eller som løsninger, konsentrerte eller fortynnede i vann eller saltløsning, eventuelt med tilsetning av additiv eller hjelpesubstanser, som for eksempel spesielt desinfiserende substanser eller mineral-salter som virker som buffere eller andre, for oftalmisk bruk.

Av medikamentene er de særlig viktige, som har en surhetsgrad som passer for den omgivelsen som de skal anvendes i, det vil si med en fysiologisk tolererbar pH-verdi. Justering av pH, for eksempel i de ovenfor nevnte salter av esterne av hyaluronsyre med en basisk, aktiv substans, kan gjennomføres ved passende regulering av mengdene av polysakkarid, av saltene eller selve den basiske substansen. Dersom eksempelvis surheten av et salt av en hyaluronsyre-ester med en basisk substans således er for høy, nøytraliseres overskudd av frie syregrupper med de ovenfor nevnte, uorganiske basene, for eksempel med natrium-, kalium- eller ammoniumhydrat.

Fremstillingen ifølge oppfinnelsen av saltene kan gjennomføres på i og for seg kjent måte ved å bringe i kontakt løsninger, vandige løsninger eller organiske løsninger, av de to bestanddelene (1) og (2), og eventuelt baser eller basiske salter av de ovenfor nevnte alkali- eller jordalkalimetallene eller magnesium eller aluminium i de riktige mengder og isolere saltene i en amorf, vannfri form ifølge kjente teknikker. Det er eksempelvis mulig først å fremstille vandige løsninger av de to bestanddelene (1) og (2) , frigjøre disse bestanddelene fra vandige løsninger av deres salter med passende ionevekslere og blande de to løsningene ved lav temperatur, for eksempel mellom 0°C og 2 0°C. Dersom det således oppnådde saltet er lett løselig i vann, kan det frysetørkes, mens de salter som er vanskelige å oppløse, kan separeres ved sentrifugering, filtrering eller dekantering og deretter eventuelt tørkes.

For disse kombinerte medikamentene er dosen også basert på de mengder aktive stoffer som er brukt enkeltvis og kan derfor lett bestemmes av fagmannen, idet han tar i betraktning de doser som er anbefalt for de tilsvarende, kjente medisinene.

I de kosmetiske artiklene blandes hyaluronsyre-esterne og deres salter med de bindemidler som vanligvis brukes på fagområdet og er eksempelvis de som allerede er oppført for de farmasøytiske preparatene. Mest brukt er kremer, salver og væsker for lokal bruk eller et av dens salter kan representere det kosmetiske, aktive stoffet eventuelt med tilsetning av andre, kosmetisk aktive stoffer, som for eksempel steroider, for eksempel pregnenolon, eller et av de stoffer som er nevnte ovenfor. I slike preparater er hyaluronsyre-esteren fortrinnsvis en ester med en alkohol uten kosmetisk virkning, som for eksempel en lavere, alifatisk alkohol, som for eksempel en av de som allerede er nevnt. Effekten forårsakes av poly-sakkaridbestanddelens indre, kosmetiske egenskaper, som for eksempel når det gjelder fri hyaluronsyre eller dens salter.

De kosmetiske artiklene kan imidlertid baseres på substanser med spesifikke virkninger som er forskjellige fra hyaluronsyrens, for eksempel desinfiserende substanser, solbeskyttere, vannsikrende eller regenererende eller antirynkesubstanser eller odoranter, spesielt parfymer. I dette tilfelle kan hyaluronsyre-esteren selv være den aktive ingrediensen og er oppnådd fra alkoholer med samme egenskaper, for eksempel fra høyere, alifatiske alkoholer eller terpen-alkoholer når det gjelder parfymer eller virker fremfor alt som bærer for substanser med de egenskaper som er forbundet med dem.

Særlig viktige er derfor kosmetiske preparater som er lik de medikamenter som er beskrevet ovenfor hvor den farmasøytisk aktive bestanddelen (1) er erstattet med en kosmetisk faktor, og de relative saltene.

Bruken av de ovenfor nevnte estere fra alkoholer som anvendes i parfymeindustrien representerer et viktig trinn fremover i teknologien, siden de tillater en langsom, konstant og forlenget frigjøring av luktingrediensene.

En annen anvendelse av esterne fremstilt ifølge oppfinnelsen, som drar nytte av deres bionedbrytbarhet på grunn av esterasen som er tilstede i organismen, representeres av fremstillingen av kapsler for subkutan implantasjon av medikamenter eller av mikrokapsler for injeksjon, for eksempel ved subkutan eller intramuskulær injeksjon. For anvendelse av subkutane medikamenter for oppnåelse av en langsom frigjøring og derfor en "forsinket" virkning, har kapsler fremstilt av silikonmaterialer vært mest brukt opp til nå, med den ulempe at kapselen har en tilbøyelighet til å bevege seg inne i organismen og det er ikke mulig å gjenvinne den. Det er klart at denne faren ikke lenger eksisterer med disse hyaluronsyre-esterne.

Av stor betydning er også fremstillingen av mikrokapsler ved hjelp av hyaluronsyre-estere, hvilket eliminerer problemene når det gjelder ders bruk, som opp til nå har vært begrenset, av de samme grunner som de som er nevnt ovenfor og som åpner et stort anvendelsesområde hvor en "forsinket" effekt søkes ved injeksjon.

Det følgende er spesielle eksempler på farmasøytiske preparater inneholdende hyaluronsyre-esterene fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Sammensetning 1 - Collirium inneholdende kortison hvori 100 ml inneholder: partialester av hyaluronsyre med kortison (Eks. 10),

0,200 g

etyl-p-hydroksybenzoat, 0,010 g

- metyl-p-hydroksybenzoat, 0,050 g

natriumklorid, 0,900 g

- vann for injiserbare preparater/q.b.a., 100 ml. Sammensetnin<g> 2 - Injiserbar løsning inneholdende hydrokortison av hvilken 100 ml inneholder: partialester av hyaluronsyre med hydrokortison (Eks.

11), 0,1 g

natriumklorid, 0,9 g

- vann for injiserbare preparater/q.b.a., 100 ml. Sammensetning 3 - Krem inneholdende en partialester av hyaluronsyre med etylalkohol (Eks. 3), av hvilken 100 g inneholder: partialester av hyaluronsyre med etylalkohol, 0,2 g

- polyetylenglykol-monostearat 400, 10 g Cetiol V, 5,000 g

Lanette SX, 2,000 g

Metylparaoksybenzoat, 0,075 g Propylparaoksybenzoat, 0,050 g Natriumdihydroacetat, 0,100 g Glycerol F.U., 1,500 g

Sorbitol 70, 1,500 g

Testkrem, 0,050 g

Vann for injiserbare preparater/q.b.a., 100 g.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive, totale og partielle hyaluronsyre-estere, hvor forestringskomponenten er avledet fra en aktiv alkohol og er en C2.18-alkylgruppe ; en C^-alkoks<y>-karbon<y>l-Cj./.-alkylgruppe ; en fenyl-C^-alkyl- eller fenyl-C2-4-alkenyl-gruppe; en benzyl-gruppe eller benzyl substituert med en Cx.4-alkylgruppe eller 1 til 3 metyl- eller metoksy-gruppe(r), eller halogenatomer; eller en rest av en steroid-alkohol; f.eks. hvor forestringskomponenten er avledet fra en terapeutisk aktiv alkohol valgt fra gruppen bestående av kortison, hydrokortison, fluorkortison og desoksy-korticosteron; og salter derav, karakterisert ved at et lavere tetraalkyl-ammoniumsalt av hyaluronsyre, fortrinnsvis tetrabutylammonium-hyaluronat, omsettes med et forestringsmiddel, såsom et alkyl-halogenid, fortrinnsvis i et aprotisk, organisk oppløsnings-middel, hvorved karboksylgrupper i nevnte hyaluronsyre forestres, og frie karboksyl-grupper i nevnte partialestere eventuelt saltdannes med en uorganisk eller organisk base, f.eks. av et alkali- eller jordalkalimetall, særlig med en eller flere farmakologisk aktive baser, og de saltdannede partialestere som er saltdannet med et alkali- eller jordalkalimetall, eventuelt omsettes med et terapeutisk aktivt eller inaktivt amin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 5% og høyst 95% av alle karboksylgruppene i hyaluronsyre forestres.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at mellom 50 og 80% av alle karboksylgruppene i hyaluronsyre forestres.

4. Fremgangsmåte ett av kravene 1-3, karakterisert ved at det som utgangs-materiale anvendes en hyaluronsyre-molekylfraksjon med en gjennomsnittlig molekylvekt mellom 50.000 og 100.000, en gjennomsnittlig molekylvekt mellom 500.000 og 730.000 eller en gjennomsnittlig molekylvekt mellom 250.000 og 350.000.