NL192043C

NL192043C - Stugheid verminderend middel en wasmiddelpreparaten die dit middel bevatten.

Info

Publication number: NL192043C
Application number: NL8102123A
Authority: NL
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1980-04-30
Filing date: 1981-04-29
Publication date: 1997-01-07
Also published as: US4435307A; GB2075028B; IT8121432A0; CH663511GA3; JPS6116316B2; NL192043B; FR2481712B1; DK187280A; AT384442B; ATA191581A; ES501738A0; GB2075028A; MX158929A; DE3117250C2; HU196450B; ES8306789A1; BE888632A; BR8102643A; NL8102123A; DE3117250A1

Description

3 192043 aanwezig.

Chlamydosporen: enkelvoudig of in ketens geproduceerd; glad; bruin; 11,2-11,6 pm.

Phialocondia: afwezig.

Temperatuurgrenzen: geen groei bij 26°C; goede groei van 37-50°C. Koloniën 8 cm in diameter na 5 5 dagen bij 37°C.

De hiervoor vermelde waarnemingen werden gedaan na 5 dagen bij 37°C op YPSS-agar met de hierna aangegeven samenstelling.

Gistextract Difco 4,0 g K2HP04 1,0 g 10 MgS04 · 7H20 0,5 g oplosbaar zetmeel 15,0 g gedestilleerd water 1000 ml agar 15,0 g.

Van de cellulasefractie die zelf niet hecht aan een anionuitwisselaar bij 6,5 s£ pH ^ 7,5 kan het gehalte 15 worden vastgesteld door bepaling van de gemodificeerde Cx (cellulase) activiteit op de volgende wijze. Een fosfaatbuffer A wordt bereid uit 26,52 g natriumdiwaterstoffosfaat dihydraat in 1000 ml gedeïoniseerd water; de molariteit daarvan (A) is 0,17. 100 ml A wordt gemengd met ongeveer 800 ml gedeïoniseerd water, de pH wordt op 7,0 ingesteld en het totale volume van de buffer wordt gebracht op 1000 ml buffer, welke buffer B wordt genoemd, waarvan de molariteit 0,017 is. Een kolom wordt gevuld met 1 g van de anionenuitwissel-20 aar DEAE-Sepharose CI-6B® en in evenwicht gebracht met B. Vervolgens wordt het enzym in B opgelost en 25 ml van de aldus bereide enzymoplossing wordt door de hiervoor aangegeven, in evenwicht gebrachte kolom geleid. De Cx-activiteit van de enzymoplossing stroomafwaarts van de kolom wordt op de hiervoor aangegeven wijze voor de bepaling van de gewone Cx-cellulose-activiteit bepaald. Deze Cx-activiteit wordt de gemodificeerde Cx-activiteit genoemd en is kleiner dan de gewone Cx-activiteit in het geval dat enige 25 Cx-activiteit geadsorbeerd wordt aan de anionuitwisselaar onder de gespecificeerde omstandigheden.

Gebleken is dat bij een verhouding (Cx-gemodificeerd/Cx-gewoon) van ten minste 0,8, het stugheid verminderende middel verrijkt is met betrekking tot de ACxl-fractie in een zodanige mate, dat het de stugheid verminderende vermogen buitengewoon goed is.

Bij voorkeur wordt de fungusachtige cellulase verschaft als een niet-stuivend granulaat. Het is essentieel, 30 dat het cellulasepreparaat een laag stuifniveau heeft. Met een hoog stuifniveau kunnen complicaties ontstaan zowel in de fabrieken waar het cellulasepreparaat gemengd wordt met reinigingsmiddelen als tijdens de latere behandeling van het cellulase bevattende reinigingsmiddel. Een cellulasepreparaat in granulaatvorm kan bereid worden op een aantal verschillende wijzen, bijvoorbeeld door middel van een ’’Marumerizer" zoals beschreven in de Britse octrooischriften 1.362.365 en 1.361.387 of door middel van een 35 granuleringsmachine, zoals beschreven in Aufbereitungstechnik No. 3/1970, blz. 147-153 en No. 5/1970, blz. 262-278, of het kan een gekorreld granulaat zijn zoals beschreven in het Belgische octrooischrift 760.135. In alle gevallen echter dient het granulaat geringe stuifeigenschappen te bezitten. Het woord ’’Marumerizer'’ is een handelsmerk.

Bij voorkeur wordt het cellulasegranulaat bekleed met een wit makend middel, zoals Ti02, in combinatie 40 met een stof bindend middel. Op deze wijze wordt een aantrekkelijk uitziend cellulasegranulaat verschaft met een minimum aan stuifvermogen.

Verder is het stugheid verminderende middel bij voorkeur een vloeistof, waarin de schimmel-cellulase verschaft wordt als een cellulaseconcentraat, gesuspendeerd in een niet-ionogeen oppervlak-actief middel. Het concentraat wordt geproduceerd op basis van de fermentatievevloeistof. Zoals hiervoor vermeld is het 45 essentieel, dat het cellulosepreparaat een laag stuifniveau heeft. Omdat bij deze uitvoeringsvorm het stugheid verminderende middel volgens de uitvinding een vloeistof is, is het stuifniveau daarvan nul en de hiervoor vernielde moeilijkheden worden derhalve volledig vermeden.

Met voordeel bevat, wanneer het stugheid verminderende middel een suspensie is, het niet-ionogene oppervlak-actieve middel een verdikkingsmiddel. Daardoor kan sedimentatie van de cellulase gewoonlijk 50 vermeden worden. Als verdikkingsmiddel kan bijvoorbeeld siliciumdioxyde met een uiterst kleine deeltjesgrootte gebruikt worden. Wanneer siliciumdioxyde gebruikt wordt als verdikkingsmiddel is de hoeveelheid daarvan in het traject van 0,5-10 gew.%, bij voorkeur in het trajekt van 1-5 gew.%.

Bij voorkeur is het stugheid verminderende middel een vloeistof en wordt de schimmel-cellulase verschaft als een cellulaseconcentraat opgelost in een water bevattend milieu, bij voorkeur bij aanwezigheid van een 55 stabilisator. Als stabilisator kan elk middel gebruikt worden, dat stabiliseert tegen sedimentatie en tegen verlies van enzymatische activiteit.

Volgens het tweede aspect van de onderhavige uitvinding wordt, zoals reeds vermeld, een wasmiddel- 192043 4 preparaat voor de hoofdwas verschaft, dat reinigende bestanddelen en een stugheid verminderende hoeveelheid van het stugheid verminderende middel zoals hierboven omschreven bevat, waarbij de pH van het hoofdwasmiddel in het traject van 7-10, bij voorkeur in het traject van 7,5-9,5 ligt.

Met de uitdrukking "wasmiddelpreparaat voor de hoofdwas” wordt een wasmiddelpreparaat bedoeld, dat 5 gewoonlijk, maar niet noodzakelijkerwijze, gebruikt wordt bij een enkele wasbehandeling, die niet wordt voorafgegaan of gevolgd door andere wasbehandelingen. Het voordeel dat samenhangt met het hoofdwas-middelpreparaat volgens de uitvinding blijkt het meest duidelijk wanneer het hoofdwasmiddel wordt gebruikt bij een enkele wasbehandeling, die niet wordt voorafgegaan of gevolgd door andere behandelingen.

De wasmiddelbestanddelen in een hoofdwasmiddelpreparaat volgens de onderhavige uitvinding zijn niet 10 kritisch, de enige beperking is, dat deze bestanddelen verenigbaar moeten zijn met de schimmel-cellulase.

De gebruikte reinigingsmiddelbestanddelen en de percentages daarvan zijn bij wijze van voorbeeld de volgende.

1. Oppervlak-actieve middelen, in het bijzonder anionogene en niet-ionogene oppervlak-actieve middelen, in een totale hoeveelheid van gewoonlijk 5-45 gew.%. Gebruikelijke anionogene oppervlak-actieve middelen.

15 zijn lineaire alkylarylsulfonaten (”LAS”) en α-alkeensulfonaten C’AOS”). Gebruikelijke niet-ionogene oppervlak-actieve middelen zijn alkylfenylethoxylaten en vetalcoholethoxylaten.

2. Builders, in het bijzonder alkalische builders en de waterhardheid verlagende middelen, in een totale hoeveelheid van gewoonlijk 25-75 gew.%. Gebruikelijke builders zijn natriumtripolyfosfaat (”NTP”), natriumaluminiumsilicaten (zeolieten), natriumsilicaten en natriumcarbonaten.

20 3. Bleekmiddelen, in het bijzonder peroxyden in een totale hoeveelheid van gewoonlijk 0% of 15-30%. Gebruikelijke bleekmiddelen zijn natriumperboraat en natriumpercarbonaat.

4. Andere bestanddelen, overwegend enzymen, optische bleekmiddelen, parfums, kleurstoffen, schuim modificerende middelen, stabilisatoren, antiherafzettingsmiddelen, bij voorkeur niet CMC, dat tot een bepaalde mate ontleed zal worden door de cellulase, in een totale hoeveelheid van gewoonlijk 0,1-5%.

25 5. Vulstoffen, in het bijzonder natriumsulfaat, en water, in een zodanige hoeveelheid dat het totaal van de reinigingsmiddelformulering op 100% wordt gebruikt.

Bij voorkeur is het stugheid verminderende middel aanwezig in een hoeveelheid overeenkomend met 2,5-100 gewone Cx eenheden/g van het hoofdwasreinigingsmiddel, of 1,5-60 gemodificeerde Cx eenheden/g van het hoofdwasreinigingsmiddel, meer bij voorkeur 5-50 gewone Cx eenheden/g van het 30 hoofdwasreinigingsmiddel of 3-30 gemodificeerde Cx eenheden/g van het hoofdwasreinigingsmiddel. Op deze wijze kan een bevredigend stugheid verminderend effect verkregen worden en eveneens kan een overmaat cellulase (die het hoofdwasreinigingsmiddelpreparaat oneconomisch zou maken) vermeden worden.

Bij voorkeur bevat het hoofdwasreinigingsmiddel eveneens een bacteriële proteinase, en wel een 35 proteinase voortgebracht door middel van Badllus licheniformis, in het bijzonder met ALCALASE. Gevonden werd, dat de wasmiddeltoevoegsels cellulase en proteinase verenigbaar zijn en dat zij beide een bevredigend effect uitoefenen bij de pH-waarden tijdens de wasmethode, hoewel gedacht zou kunnen worden, dat het proteolytische enzym verteerd zou worden door de cellulase. Dit gecombineerde reinigingsmiddel-toevoegsel oefent zowel een beter reinigingseffect als een beter verzachtingseffect uit bij toevoeging aan 40 het reinigingsmiddel. Het woord ’’ALCALASE” is een handelsmerk voor een Novo enzympreparaat, dat in de handel verkrijgbaar is. Wanneer ALCALASE en een granulaat van cellulase worden gebruikt, kan het gemengde enzymatische toevoegsel bereid worden door menging van een vooraf bereid granulaat van ALCALASE met een vooraf bereid granulaat van cellulase of door mengen van een concentraat van ALCALASE met een concentraat van cellulase en vervolgens dit mengsel toe te voeren aan een granule-45 ringsinrichting te zamen met de gebruikelijke granuleringshulpstoffen.

Bij voorkeur is perboraat één van de reinigingsmiddelbestanddelen. Onder bepaalde omstandigheden vergroot perboraat de wasdoelmatigheid en verrassenderwijze is gebleken, dat perboraat en de cellulase in het hoofdwasreinigingspreparaat volgens de uitvinding verenigbaar zijn. Het hoofdwasmiddelpreparaat volgens de uitvinding kan als wasmiddel worden gebruikt in een weikwijze voor het wassen van textiel.

50 Bij voorkeur wordt in die waswerkwijze de schimmel-cellulose gebruikt in een concentratie in de wasoplossing overeenkomend met 10-100 gewone Cx eenheden/liter wasoplossing, of 6-60 gemodificeerde Cx eenheden/liter wasoplossing, bij voorkeur 20-50 gewone Cx eenheden/liter wasoplossing of 12-30 gemodificeerde Cx eenheden/liter wasoplossing.

Bij voorkeur is de pH van de oplossing tussen 7 en 10, met meer voorkeur tussen 7,5 en 9,5. Hierbij is 55 de cellulase in staat zijn volledige activiteit uit te oefenen.

Bij voorkeur wordt een aanzienlijk gedeelte van de hoofdwas uitgevoerd bij een temperatuur beneden 70°C, bij voorkeur beneden 60°C.

5 192043

De volgende voorbeelden lichten de fermentatie toe, door middel waarvan het stugheid verminderende middel volgens de uitvinding wordt verkregen (Voorbeelden I, VI en VIII) en illustreren hoofdwasmiddel-preparaten volgens de uitvinding en de toepassing daarvan (Voorbeelden ll-VIII).

5 Vooibeeld I

De stam DSM 1800 werd bij 37°C gekweekt op een agar-substraat met de samenstelling: gistextract Difco 4 g K2HP04 1 g

MgS04 ♦ 7 H20 0,5 g 10 glucose 15 g gedestilleerd water 1000 g agar 15 g.

Een eerste groep schudflessen van 500 ml werd gereed gemaakt; deze schudflessen bevatten 100 ml substraat met de samenstelling: 15 vloeistof van geweekt graan 2,4% glucose 2,4%

CaC03 0,5% sojaolie 0,5%.

Vóór de toevoeging van CaC03 werd de pH-waarde met 4N NaOH op 5,5 ingesteld en sterilisatie werd 20 20 minuten bij 121°C uitgevoerd.

Na groei gedurende 7 dagen op de schuin opgestelde agar werden de sporen overgebracht naar de schudflessen in de eerste groep schudflessen van 500 ml.

Een tweede groep schudflessen van 500 ml werd gereed gemaakt. Deze schudflessen bevatten elk 100 ml van een substraat met de samenstelling: 25 NH4NO3 0,25% KH2P04 0,56% K2HP04 0,44%

MgSo4 · 7 H20 0,075% cellulose 2,0% 30 CaC03 0,25%

Pluronic 0,01% Vóór de toevoeging van CaC03 werd de pH-waarde door middel van 4N NaOH op 6,8-7,0 ingesteld en sterilisatie werd uitgevoerd door behandeling in een autoclaaf bij 121 °C gedurende 20 minuten.

Na groei gedurende 2 x 24 uren bij 37°C in de eerste groep schudflessen wordt inoculatie met 6% van 35 de eerste groep schudflessen op de tweede groep schudflessen uitgevoerd.

Na fermentatie in de tweede groep schudflessen gedurende 140 uren bij 37°C was de cellulase-activiteit 4,2 gewone Cx eenheden/ml kweekvloeistof. Vervolgens werd de kweekvloeistof op de volgende wijze gezuiverd: de kweekvloeistof werd gefiltreerd over diatomeeënaarde (Hyflo-supercel), het filtraat werd door ultrafiltratie geconcentreerd en het retentieprodukt werd gevriesdroogd. Het gevriesdroogde poeder (A) 40 vertoonde een Cx-activiteit van 745 gewone Cx eenheden/g.

Twee experimenten werden op exact dezelfde wijze als hiervoor beschreven uitgevoerd. Na fermentatie in de tweede groep schudflessen gedurende 140 uren was de gewone Cx cellulase-activiteit in deze twee experimenten respectievelijk 2,2 en 6,0 Cx eenheden/ml kweekvloeistof. Ook het gevriesdroogde poeder vertoonde bij deze twee experimenten een gewone Cx-activiteit van 558 (poeder B) en 518 Cx-eenheden/g 45 (poeder C).

Voorbeeld II

In dit voorbeeld werd het cellulasepreparaat poeder A van voorbeeld I gebruikt als het stugheid verminderende middel.

50 Het wasexperiment werd uitgevoerd als een eentraps-wasbehandeling met een volledig automatische trommelwasmachine van MIELE volgens het wasprogramma ’’Kookwas 95°C" aangegeven in de brochure die de MIELE wasmachine type 421 S beschrijft. Het woord ’’MIELE” is een handelsmerk. Het programma ’’Kookwas 95°C” heeft het volgende benaderde temperatuur-tijd-profiel: 192043 6 tijd (min.) 0 6 12 18 24 30 36 42 45 temp. (°C) 16 27 43 61 76 85 85 82 spoelen met koud 5 water.

De wasoplossing bezat de volgende samenstelling: 16 liter water met een hardheid van 20° dH, die 5 g/liter van een gebruikelijk, commercieel poedervormig wasmiddel bevatte met de volgende hoofdbestanddelen (benaderde droge vaste stoffensamenstelling in gew.%): 21% oppervlak-actieve middelen (7% LAS, 11% zeep en 3% nonylfenylethoxylaat) 10 39% builders (32% NTP, 4% natrium silicaat en 3% natriumcarbonaat) 26% natriumperboraat 13% natriumsulfaat.

Aan deze wasoplossing werd het proteolytische enzympreparaat ALCALASE toegevoegd in een concentratie die overeenkomt met 0,06 Anson-eenheden/liter oplossing. De proteolytische activiteit van het 15 enzympreparaat werd bepaald volgens de gemodificeerde Ansonmethode, beschreven in Novo Analytical Method No. AF 4.3/5-GB (de oorspronkelijke Anson-methode is beschreven in J. Gen. Physiol., 22, (1939), 79-89).

Aan deze wasoplossing werd niets, of het cellulasepreparaat van voorbeeld I in een concentratie overeenkomend met 40 gewone Cx eenheden/liter oplossing toegevoegd.

20 De gebruikte proefmaterialen voor elk van deze twee parallelle experimenten waren: 1.12 stukken wit Terry katoendoek met de afmetingen 42 cm x 60 cm en 2. 12 stukken wit katoenen interlock met dezelfde afmetingen.

Voorts werd schoon katoenen wasgoed bij de twee soorten proefmateriaal gevoegd tot in totaal 3 kg wasgoed. Het proefmateriaal werd 20 maal gewassen vóór gebiuik met een perboraat bevattend gebruikelijk 25 wasmiddel onder toepassing van een programma met hoge temperatuur.

Na deze 20 wasbehandelingen, die het wassen van het proefmateriaal in de praktijk simuleren, was het proefmateriaal gereed voor het wasexperiment met of zonder cellulase.

Het proefmateriaal werd 6 maal gewassen met tussentijdse droging aan een lijn gedurende de nacht. Na de laatste wasbehandeling werden alle proefstukken (12 x 2 x 3) in dezelfde ruimte aan een lijn geconditio-30 neerd.

De waardering werd uitgevoerd door een panel bestaande uit 20 personen. Zonder kennis van de identiteit van de verschillende proefstukken werd aan elk van de eerste 10 personen in het panel gevraagd 6 waarderingen te maken (dat wil zeggen 3 voor het witte Terry-doek en 3 voor het witte katoenen interlock) op basis waarvan het mogelijk was de juiste uitspraken uit de volgende uitspraken te kiezen: 35 1. Het met cellulase behandelde doek is zachter dan het zonder cellulase behandelde doek, 2. het met cellulase behandelde doek heeft dezelfde mate van zachtheid als het zonder cellulase behandelde doek en 3. het met cellulase behandelde doek is harder dan het zonder cellulase behandelde doek.

Drie stukken proefmateriaal werden gekozen uit de 12 stukken wit Terry-doek van katoen die werden 40 behandeld met cellulase en drie stukken van het proefmateriaal werden gekozen uit de 12 stukken wit Terry-doek van katoen die zonder cellulase waren behandeld. Deze 6 stukken werden opgesteld in 3 paren en elk van de eerste 10 leden van het panel werd gevraagd alle 3 paren gescheiden te waarderen. Soortgelijke waarderingen werden uitgevoerd met het witte katoenen interlock. De andere 10 personen in het panel werd vervolgens gevraagd het overblijvende proefmateriaal op dezelfde wijze te waarderen.

45 Alleen voor het witte Terry-doek maakte elke persoon in het panel 3 waarderingen overeenkomend met een totaal voor het gehele panel van 60 waarderingen voor dit proefmateriaal.

Het witte katoenen interlock werd op dezelfde wijze gewaardeerd, waarbij het totale aantal waarderingen ook 60 was.

Het resultaat van de hiervoor beschreven waarderingen blijkt uit de volgende tabel A. Tabel A laat tevens 50 de pH zien van de wasmiddeloplossing bij het begin van de wasbehandeling, na 10 minuten en na 20 minuten (respectievelijk t = 0, t = 10 en t = 20).

Voorbeeld III

Voorbeeld II werd herhaald. De resultaten zijn in tabel A opgenomen.

7 192043

Voorbeeld IV

In dit voorbeeld werd het cellulasepreparaat poeder B van voorbeeld I gebruikt als het stugheid verminderende middel. Voorbeeld II werd herhaald, evenwel met de volgende veranderingen: de wasmachine werd gevuld met proefmateriaal zoals in voorbeeld I, vervolgens werd vuil katoenen wasgoed toegevoerd tot een 5 totaal van 3 kg wasgoed.

Het vuile wasgoed was katoenen ondergoed van een militaire kazerne. De resultaten zijn in tabel A opgenomen.

Voorbeeld V

10 In dit voorbeeld werd het cellulasepreparaat C van voorbeeld I gebruikt als het stugheid verminderende middel. Het in voorbeeld II beschreven experiment werd herhaald, evenwel met de volgende veranderingen: het wasprogramma genaamd ’’Fijne was 60°C” werd gebruikt. Dit programma heeft het volgende benaderde temperatuur/tijd-profiel: tijd (min.) 0 6 12 18 24 30 36 42 15 temp. (°C) 16 24 35 47 57 55 54 spoeling met koud water.

De wasoplossing had een volume van ongeveer 26 liter. De pH van de wasoplossing werd met citroen-20 zuur enigszins bijgesteld. De resultaten zijn in tabel A opgenomen.

TABEL A

Voorbeeld Proefmateriaal Waardering 25 - ",,... terry-doek 73%: zachter met ?H* cellulase t = 0:10,0 ... ...

χ ’ 2%: geen verschil ” ' ’ 25%: harder met 30 '= 20: 9·7 cellulase katoenen 77%: zachter met interlock cellulase 8%: geen verschil 15%: harder met cellulase "!, ... terry-doek 68%: zachter met 40 f™' cellulase t = 0:9,9 _ ...

. .Λ ’ 5%: geen verschil t = 10: 9,8 a. .

. ’ 27%: harder met t = 20: 9,6 ’ cellulase 45 katoenen 78%: zachter met interlock cellulase 2%: geen verschil 20%: harder met cellulase 50 -

IV

.,... terry-doek 84%: zachter met ,P=0 98 «"ase t - 10-97 3%: geen verschit „ .Ion! q’« 13%: harder met 55 '-20·9'6 cellulase 192043 8 TABEL A (vervolg)

Voorbeeld Proefmateriaal Waardering 5 katoenen . 82%: zachter met interlock cellulase 5%: geen verschil 13%: harder met cellulase 10 -

V

p|—I by terry-doek 93%: zachter met t = 0: 8,9 cellulase t = 10: 8,8 0%; geen verschil 15 t = 30: 8,9 7%: harder met cellulase katoenen 93%: zachter met interlock cellulase 2%: geen verschil 20 3%: harder met cellulase

Voorbeeld VI

De stam DSM 1800 werd bij 37°C gekweekt op een agar-substraat met dezelfde samenstelling als het 25 agar-substraat in voorbeeld I.

300 liter van een inoculatie of voor-fermentatiesubstraat met de samenstelling: vloeistof van geweekt graan 2,4% glucose 2,4%

CaC03 0,5% 30 sojaolie 0,4%, (waarbij de pH vóór toevoeging van CaC03 door middel van 4 N NaOH op 5,5 was ingesteld) werd 45 minuten bij 121°C gesteriliseerd.

Na een groei van 14 dagen op het agar-substraat werden de sporen overgebracht naar het gesteriliseerde voor-fermentatiesubstraat van 300 liter. Gedurende 49 uur werd steriele lucht bij 37°C onder een 35 druk van 49 kPa en met een snelheid van 300 liter per minuut door de aldus bereide voorfermentatie-vloeistof geleid.

350 Liter van een hoofd-fermentatiesubstraat met de volgende samenstelling: vloeistof van geweekt graan 10% cellulose 3% 40 CaC03 0,25% NH4N03 0,25% KH2P04 0,56% K2HP04 0,44%

MgS04 0,08% 45 Pluronic 0,014% (waarbij de pH-waarde vóór toevoeging van CaC03 door middel van 4 N NaOH op 6,8 tot 7,0 was ingesteld) werd door koken gedurende 60 minuten bij 123°C gesteriliseerd. 35 Liter van de voor-fermentatievloeistof weid overgebracht naar het aldus gesteriliseerde hoofdfermentatiesubstraat. Steriele lucht werd door de aldus bereide hoofd-fermentatievloeistof geleid onder een druk van 49 kPa en met een 50 snelheid van 300 liter per minuut. De pH werd beneden 7,0 gehouden door toevoeging van KH2P04. De fermentatie werd 136 uren bij 37°C uitgevoerd. Na het beëindigen van de fermentatie was de activiteit 29 gewone Cx eenheden/ml.

De cultuurvloeistof werd op de volgende wijze gezuiverd: De cultuurvloeistof werd over diatomeeënaarde (Hyflo-supercel) gefiltreerd. Het filtraat werd door ultrafiltratie geconcentreerd en het retentieprodukt (dat 55 kortheidshalve hierna zal worden aangeduid als retentieprodukt D) werd gevriesdroogd.

Het gevriesdroogde poeder D vertoonde een gewone Cx-activiteit van 1316 Cx-eenheden/g en een gemodificeerde Cx-activiteit van 953 Cx-eenheden/g.

9 192043

Nog twee fermentaties met daaraan volgende ultrafiltraties werden op dezelfde wijze uitgevoerd zoals hiervoor aangegeven. De overeenkomstige retentieprodukten worden aangeduid als retentieprodukt E en F. Retentieprodukt F werd door vriezen gedroogd en het door vriezen gedroogde poeder F vertoonde een gewone Cx-activiteit van 743 eenheden/g en een gemodificeerde Cx-activiteit van 530 eenheden/g.

5 Het gevriesdroogde poeder D werd gescheiden in verschillende componenten door anionogene uitwisselingschromatografie op de volgende wijze: 100 g daarvan werden opgelost in 2000 ml gedestilleerd water bij 4°C. De pH werd op 7,5 ingesteld met 1 M ’Iris”. De oplossing werd vervolgens gebracht op een ionenuitwisselingskolom van 4000 ml met 100 g DEAE-Sephadex A-50. Figuur 1 laat het absorberend vermogen OD280 zien bij 280 nm van de fracties, die uit de kolom vrijkomen. De aan de kolom gebonden 10 proteïnen werden geëlueerd met een NaCI-gradiënt; de NaCI-concentratie werd gemeten en in figuur 1 te zamen met het absorberend veimogen van de fracties uitgezet.

De proteïne bevattende fracties werden bijeengevoegd zoals aangegeven met de haakjes in figuur 1 en de bijeengevoegde fracties werden 1-5 genummerd. De depots 1-5 werden vervolgens gescheiden aan een vriesdroogbehandeling onderworpen.

15 De met de vriesdroging behandelde depots werden gekenmerkt door de hoeveelheid proteïne, de samenstelling van proteïnen en de gewone Cx-activiteit, zie tabel B. Het isoëlektrische punt van de proteïnen werd bepaald met een ”LKB multiphoer"-apparaat.

TABEL B

20 -—

Proteïne, Totaal aantal pl-traject Opbrengst Opbrengst g gewone proteïne, Cx, %

Cx-eenheden % 25 Uitgangs- 53,0 131600 3,5-9,0 materiaal depot 1’ 8,6 47400 6-9,0 16 36 depot 2 0,9 1000 4-6 2 1 depot 3 4,8 9500 4-5,5 9 7 30 depot 4 7,1 11000 3,5-5,5 13 8 depot 5 17,7 18600 3,5-5 33 14 totaal 73 66 ‘) (=ACXI fractie).

35 Depot 1 bevat alle basische componenten, dat wil zeggen de proteïnen, die niet gebonden zijn aan de anionogene uitwisselingshars bij 6,5 $ pH ^ 7,5. Derhalve is de totale hoeveelheid gemodificeerde Cx-cellulase-activiteit aanwezig in depot 1, dat ook alle cellulolytische activiteiten met pl boven 6,0 bevat.

Ten einde te bepalen welke van de vijf depots de fractie bevatte met het grootste verzachtingseffect werden de volgende experimenten uitgevoerd.

40 Katoenen terry-doek werd 20 maal voorgewassen zoals beschreven in voorbeeld II. Na deze voorwas-behandeling werden stroken van 10 cm x 10 cm (ongeveer 4 g) uitgesneden en gemerkt.

De cellulasebehandeling werd nu uitgevoerd in een Terg-O-Tometer laboratorium-wasmachine onder de volgende omstandigheden: wasmiddel en dosering: zoals in voorbeeld II, behalve voor cellulasedosering 45 begin-pH: ongeveer 9,5 temperatuur: 50°C tijd: 30 minuten waterhardheid: 20°dH volume per beker: 1200 ml 50 aantal stroken per beker: 10 cellulasedosering: zie tabel hierna, in alle gevallen 100 mg van de door vriesdrogen verkregen depots/liter.

192043 10

Dosering: Depot 1 Depot 2 Depot 3 Depot 4 Depot 5 5 mg proteïne/l 31 13 28 34 52 gewone Cx eenheden/l 170 15 56 52 55 gemodificeerde Cx 170 0 0 0 0 eenheden/l 10

De waardering werd uitgevoerd door een panel bestaande uit 10 personen, waaraan verschillende stellen stroken werden gegeven, elk bestaande uit drie stroken, en gevraagd werd de stroken binnen elk stel te rangschikken volgens de zachtheid. Elk stel bestond uit twee stroken, die waren gewassen met één van de depots en één strook diende als controle. 9 Personen van de 10 personen in het panel vonden dat de 15 stroken gewassen met depot 1 zachter waren dan die waaraan geen depot was toegevoegd. Alle andere depots maakten de stroken niet noemenswaardig zachter.

Uit het voorafgaande kan geconcludeerd worden, dat depot 1 de Cx-activiteit bevat, die een verzachtend effect heeft. De Cx-activiteit in de depots 3-5 vertoonde geen noemenswaardig zachtmakingseffect bij doseringsniveaus, die gewoonlijk een verzachtend effect verschaffen.

20

Voorbeeld VII

Retentieprodukt E van voorbeeld VI werd door sproeien gedroogd, waarbij een onzuiver concentraat werd gevormd.

Dit onzuivere concentraat werd door een zeef gedrukt met een openingdiameter van 0,5 mm, waardoor 25 een gemiddelde diameter van 17,4 pm verkregen werd. De cellulase-activiteit van het concentraat in deze toestand was 650 gewone Cx eenheden/g.

Een mengsel bestaande uit het hiervoor vermelde celluloseconcentraat 2,5 kg cellulosepoeder (Arbocel BC 200) 1,0 kg 30 Ti02 0,2 kg

NaCI (deeltjesgrootte kleiner dan 0,2 mm) 6,1 kg werd in een menger (Lödige FM 50/1MZ) gemengd met een rotatiesnelheid van 120 omwentelingen per minuut en een messnelheid van 3000 omwentelingen per minuut. Aan het aldus voortgebrachte mengsel werd 1 kg van een 20-procents oplossing van polyvinylpyrrolidon in water (PVP K 30) toegevoegd, waarbij 35 de hiervoor aangegeven rotatiesnelheid en messnelheid werden gehandhaafd. De toevoeging van de waterige oplossing werd uitgevoerd door middel van een drukmondstuk en duurde 1 minuut. Dit vochtige mengsel werd vervolgens 3 minuten behandeld in de menger bij een mengsnelheid van 200 omwentelingen per minuut en een messnelheid van 3000 omwentelingen per minuut. Tweemaal werd een verdere hoeveelheid water toegevoegd, respectievelijk 200 g en 100 g water, beide malen gevolgd door behandeling 40 in het mengsel gedurende 3 minuten. Waargenomen werd, dat de temperatuur in de massa tijdens de granulering steeg van 25°C tot 30°C. Het vochtige granulaat werd vervolgens gedroogd in een gefluïdiseerd bed tot een watergehalte van 1,6%. De woorden ’’Lödige” en "Arbocel” zijn handelsmerken.

Gewone Cx-activiteit van droog granulaat: berekend 164 gewone Cxeenheden/g 45 gevonden 136 gewone Cxeenheden/g activiteitsverlies 17%.

Dit produkt was een deeltjesvormig produkt met lensvormige deeltjes. Kortheidshalve zal het worden aangeduid als granulaat E.

Granulaat E vertoonde de volgende deeltjesgrootteverdeling: 50

Deeltjesgrootte, pm % deeltjes >1180 15 >1000 28 > 850 43 55 > 707 62 >600 76 > 500 87 11 192043 >420 94 > 300 1,8.

Gemiddelde diameter = 790 pm.

5 Granulaat E werd op de volgende wijze bekleed. 4,0 kg Granulaat E werd gestort in een menger (Lödige, type Μ 20E). Het mengsel werd tot 65°C verwarmd en vervolgens werd 160 g gesmolten polyethyleenglycol 4000 (moleculegewicht 4000) toegevoegd; dit mengsel werd 1 minuut gemengd. Vervolgens werd het granulaat verpoederd met 360 g Ti02 en 90 g magnesiumsilicaat. Na een mengtijd van 5 minuten werd nog eens 40 g polyethyleen 4000 op het mengsel gegoten en het mengen werd 1 minuut voortgezet. De inhoud 10 werd vervolgens gekoeld. 1 kg van het aldus bereide beklede granulaat werd door blazen van stof bevrijd gedurende 1,5 minuten bij 65°C op een gefluïdiseerd bed.

De activiteit van het granulaat blijkt uit de volgende analyse: 15 Bekleed granulaat Bekleed en door blazen van stof bevrijd granulaat activiteit, 137 138 20 gewone Cx eenheden/g

Het hiervoor aangegeven beklede granulaat, het beklede en door blazen van stof bevrijde granulaat en granulaat E zijn gebruikelijke uitvoeringsvormen van een stugheid verminderend middel in de vorm van een 25 toevoegsel aan een reinigingsmiddel.

Een wasexperiment met granulaat E werd uitgevoerd zoals in voorbeeld VI met de volgende verandering: cellulasedosering: 333, 667, 1000, 1333 en 1667 mg/liter.

De waardering werd uitgevoerd zoals in voorbeeld VI met de volgende veranderingen: 30 Elk stel stroken bestaande uit 2 stroken, namelijk één strook gewassen met wasmiddeloplossing, die geïnactiveerde cellulase bevatte, en één strook gewassen met een wasmiddeloplossing, die actieve cellulase bevatte. Het geïnactiveerde cellulase werd verkregen door een voorraadoplossing te bereiden met 10 g granulaat E opgelost in water tot 250 ml en verwarming van deze oplossing tot 90°C en handhaven van deze temperatuur gedurende 10-15 minuten. Een totaal van 5 stellen werd gewaardeerd en de 35 resultaten van de waarderingen zijn in tabel C opgenomen.

TABEL C: zachtheidswaardering (%):

Stel nr. Cellulasedose- Cellulase ina ct. cellulase 40 ring (mg/liter)

Waardering: strook behandeld zoals aangegeven is het zachtst zegt: 45 - 1 333 60% 40% 2 667 70% 30% 3 1000 70% 30% 4 1333 70% 30% 50 5 667 90% 10%

Voorbeeld VIII

In dit voorbeeld werden verschillende stammen van Humicola insolens vergeleken, dat wil zeggen CBS 55 14764 (identiek aan ATCC 22082), DSM 2069 en DSM 2068. Deze stammen werden gekweekt zoals in voorbeeld I beschreven met de uitzondering, dat het substraat voor de tweede groep van schudkolven naast de bestanddelen aangegeven in voorbeeld I 14% geweekte graanvloeistof bevatte. Door vriezen gedroogde 192043 12 poeders werden voortgebracht uit de fermentatievloeistoffen zoals aangegeven in voorbeeld I. De gevriesdroogde poeders werden ontzout, opnieuw opgelost en ontzout op een Sephadex G 25 kolom en opnieuw gevriesdroogd. Deze gevriesdroogde poeders vertoonden respectievelijk 1096, 480 en 690 gewone Cx eenheden/g. Ook een deel van het gevriesdroogde poeder F van voorbeeld VI (DSM 1800) werd in dit 5 voorbeeld gebruikt.

Het gevriesdroogde depot 1 van voorbeeld VI werd verder gezuiverd door kationuitwisseling op CM-Sepharose CL 6B. Een hoeveelheid van dit gevriesdroogde depot 1 overeenkomend met 1,7 g proteïne werd opgelost in een dtroenzuurbuffer bij een pH van 5,0 en aangebracht op een kolom van 1000 ml met de kationenuitwisselaar, waarop het proteïne was gehecht. Er werd met een NaCI-gradiënt geëlueerd en bij 10 een NaCI-concentratie van 250 mmol werd het zuivere CMC actieve ACXI proteïne geëlueerd. Het moleculegewicht van dit proteïne blijkt 80.000 te zijn op basis van SDS-gelelektroforese. Ook werd dit proteïne gebruikt voor de bereiding van antiserum (konijnen).

Dit antiserum werd nu gebruikt voor het kwantificeren van het gehalte van het ACxl-proteïne door middel van immunologische technieken, dat wil zeggen raket-elektroforese, zoals beschreven door B. Weeke in 15 Scandinavian I. Immun., 2 Suppl. 1, bladz. 37 (1973).

Het raket-immunoëlektroforesepatroon is in figuur 2 getoond. De elektroforese werd één nacht uitgevoerd in een tris-maleaatbuffer met een pH van 7 en met een spanningsgradiënt van 1,0 volt/cm.

In figuur 2 correspondeert a met het DSM 2069 produkt (3 mg/ml), correspondeert b met het CBS 14764-produkt (2 mg/ml, correspondeert c met het DSM 2068 produkt (3 mg/ml) en correspondeert dn met 20 het DSM 1800 produkt (n mg/ml).

De hiervoor aangegeven cellulasepreparaten afkomstig van DSM 1800, CBS 14764, DSM 2068 en DSM 2069 werden gebruikt bij het hierna beschreven wasexperiment: katoenen terry-doek werd 20 maal voorgewassen zoals beschreven in voorbeeld II. Na deze voorwas werden stroken van 10 cm x 10 cm (ongeveer 4 g) uitgesneden en gemerkt.

25 De cellulasebehandeling werd nu uitgevoerd in een Terg-O-Tometer laboratorium-wasmachine onder de volgende omstandigheden: wasmiddel en dosering: zoals in voorbeeld II, behalve voor de cellulasedosering begin-pH: ongeveer 9,5 temperatuur: 50°C 30 tijd: 30 minuten waterhardheid: 20°dH volume per beker: 1200 ml aantal stroken per beker: 10 cellulasedosering: zie tabel hierna.

35

Cellulasedosering (mg/liter) geen DSM 1800 CBS 14764 DSM 2068 DSM 2069 0 102 39 96 105 40 - gewone Cx eenheden/liter 76 43 66 50

Het cellulasepreparaat afkomstig van DSM 1800 werd toegevoegd in een dosering van 76 gewone Cx 45 eenheden/liter en de andere cellulosepreparaten werden toegevoegd in een dosering om dezelfde ACxl-proteïneconcentratie (immunologisch bepaald zoals hiervoor beschreven in dit voorbeeld) in de wasoplossing als het DSM 1800 preparaat te ontwikkelen. De cellulasebehandelingen werden 6 maal herhaald.

Na elke behandeling werden de stroken grondig in leidingwater gespoeld en aan de lucht over een lijn 50 één nacht gedroogd.

De beoordeling werd uitgevoerd door een panel, bestaande uit 10 personen, waaraan vier verschillende stellen stroken werden gegeven, elk bestaande uit 3 stroken en waaraan werd gevraagd de stroken binnen elk stel volgens de zachtheid te rangschikken. De zachtste strook in een stel werd een ”1” gegeven, de volgende een ”2”, enz. De samenstelling van de beoordeelde stellen en de resultaten van de waarderingen, 55 uitgedrukt in % (het percentage van het panel dat een bepaalde strook in een bepaalde zachtheidscategorie plaatst), zijn in tabel D hierna getoond:

Claims

13 192043 TABEL D: zachtheidswaardering (%) Stel nr. Cellulase Zachtheidscategorie 5 ’Ί” **2h »3» zachtste 1 geen 0 10 90 poederC 10 ((vb. VI) 80 20 0 poeder van CBS 14764 20 70 10 15. geen 0 30 70 poederC (vb. VI) 70 30 0 poeder van DSM 2068 30 40 30 20 - 3 geen 0 20 80 poeder C (vb. VI) 30 50 20 poeder van 25 DSM 2069 70 30 0 30

1. Stugheid verminderend middel voor een wasmiddel, waarvan een wezenlijke component een schimmel-cellulase is, met het kenmerk, dat de schimmel-cellulase produceerbaar is door een stam van Humicola insolens (Humicola grisea var. thermoidea).

2. Stugheid verminderend middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de stam van Humicola 35 insolens de stam is, die is gedeponeerd onder DSM 1800.

3. Stugheid verminderend middel volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de schimmel-cellulase verrijkt is met betrekking tot de cellulasefractie, die zich bij 6,5 $ pH $ 7,5 niet aan een anionuitwisselaar hecht.

4. Stugheid verminderend middel volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de schimmel-cellulase een 40 verhouding (Cxgemodificeerd/Cxgewoon) vertoont van ten minste 0,8.

5. Wasmiddelpreparaat voor de hoofdwas dat wasmiddelbestanddelen en een stugheid verminderend middel bevat, met het kenmerk, dat het stugheid verminderende middel een middel volgens één van de conclusies 1-4 is, waarbij de pH van een oplossing van 1 g van het wasmiddelpreparaat in 1 liter water dat vóór de toevoeging van het wasmiddelpreparaat een hardheid van 10° dH heeft, tussen 7 en 10 ligt.

6. Wasmiddelpreparaat volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het stugheid verminderende middel aanwezig is in een hoeveelheid overeenkomend met 2,5-100 gewone Cx eenheden/g wasmiddelpreparaat of met 1,5-60 gemodificeerde Cx eenheden/g wasmiddelpreparaat.

7. Wasmiddelpreparaat volgens conclusie 5 of 6, met het kenmerk, dat het tevens een bacteriële proteinase, afkomstig van Bacillus licheniformis bevat. Hierbij 2 bladen tekening