NL8102123A - Verbeteringen in of met betrekking tot een enzymatisch toevoegsel. - Google Patents

Description

N.0. 29-998 -1- '

J

<· -

Verbeteringen in of met betrekking tot een enzymatisch toevoegsel.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op verbeteringen in of met betrekking tot een stugheid verminderend middel voor een rei-nigingsmiddelpreparaat, een reinigingsmiddelpreparaat en een wasmethode.

5 Het is bekend, dat het wassen van katoen bevattende weefsels on der normale omstandigheden in het algemeen een uitgesproken, onaangename stugheid zal veroorzaken. In de huidige wasserijpraktijk wordt deze stugheid gewoonlijk verminderd door behandeling van de weefsels met een verzachter (spoelconditioneringsmiddel)* dat een 10 kationogeen reinigingsmiddel bevat, in een trap gescheiden van de hoofdwas. Deze behandeling echter heeft een ernstig nadeel, dat wil zeggen dat het stugheid verminderende effekt van tijdelijke aard is. Na de volgende wasbehandeling zal de stugheid terugkeren, tenzij het weefsel nog eens opnieuw behandeld wordt met een verzachter.

15 Niettegenstaande het feit, dat grote sommen zijn uitgegeven om betere wegen te vinden om de stugheid van de weefsels te verminderen, blijft het feit, dat de in de praktijk gebruikte verzachters aan de weefsels moeten worden toegevoegd in een trap gescheiden van de hoofdwastrap teneinde het volledige stugheid verminderende effekt 20 uit te oefenen en het de stugheid verminderende effekt is alleen van i tijdelijke aard.

Er zijn echter verschillende papieren voorstellen, die pogen dit probleem op te lossen. Bijvoorbeeld is in het Britse octrooi-schrift 1.568.599 een zogenaamd meer efficiënt alternatief voor het 25 verminderen van de stugheid van katoen bevattende weefsels beschreven, bestaande, uit behandeling met een cellulase. Opgemerkt dient te worden, dat de behandeling altijd wordt uitgevoerd als een gescheiden trap, bijvoorbeeld als een voorwas of voorweekbehandeling, zoals meer gedetailleerd hierna zal worden verklaard, maar in het Britse oc-50 trooischrift 1.568.599 wordt beweerd dat katoenweefsels behandeld met een cellulase· de zachtheid gedurende enkele wasbehandelingen behou- | den. Opgemerkt dient echter te worden, dat de cellulaseverzachter niet in de handel is, zelfs hoewel deze techniek reeds in 1972 bekend was (wanneer het Belgische octrooischrift 775-280, een equiva-55 lent van het Britse octrooischrift 1.568.599 werd gepubliceerd). Derhalve dient de leer van het Britse octrooischrift 1.568.599 (of het Belgische octrooischrift 775-280) behandeld te worden als een theoretische mogelijkheid eerder dan een realistische technische leer, bad ORIGINAL 81 02 123 ~ ·" · -2- . . ! V ' die de techniek had willen commercialiseren.

Opgemerkt dient te worden, dat hacteriële cellulasen gewoonlijk nogal duur zijn, omdat de opbrengst ervan gewoonlijk zeer gering is; fungusachtige cellulasen zijn de meest veelbelovende cellulasen van-5 uit commercieel gezichtspunt, omdat deze in het algemeen geproduceerd kunnen worden in vrij hoge opbrengsten. Bijvoorbeeld wordt op bladzijde 2, regels 84 - 90 van het Britse octrooischrift 1.568.599 vermeld: "vele typen cellulasen afkomstig van fungi hebben een pH-. optimum van ongeveer 5· Boven pH 7 ia hun activiteit gewoonlijk 10 sterk verminderd en daarom dienen de celluloseachtige enzymen afkomstig van fungi gebruikt te worden bij de onderhavige uitvinding in een zuur milieu". Bit betekent, dat de wasbewerking, die gewoon-j lijk wordt uitgevoerd bij een alkalische pH, niet kan worden uitge voerd in dezelfde trap als de celluiasebehandeling. Be cellulasebe-15 handeling wordt uitgevoerd in een eerste trap, als een zure voorwas-of voorweekbehandeling en daarna wordt de hoofdwas uitgevo«rd in een ! tweede trap als een alkalische wasbehandeling. Voorzover bekend is er in de techniek niets geopenbaard over een of andeife cellulase, die bestemd is om gebruikt te worden voor de uitvoering van een wasbehan-20 deling en verzachtende behandeling in een enkele trap in een praktische wasmethode.

Zoals begrepen zal worden maakt de noodzakelijkheid van uitvoering van de cellulasebehandeling bij een zure pH vóór de hoofdwas het gebruik noodzakelijk van een tussentijdse spoeling tussen de zure 25 cellulasebehandeling en de hoofdwas, tenzij een overmaat alkali voor het neutraliseren van de zuurgraad in het met cellulase behandelde wasgoed aanwezig is in het reinigingsmiddel voor de hoofdwas of daaraan wordt toegevoegd.

Wanneer tenslotte de cellulasebehandelingsvloeistof reinigings-50 middelen bevat, is het reinigend vermogen van het reinigingsmiddel gewoonlijk tamelijk laag bij de lage pH-waarden in de cellulasebehandelingsvloeistof .

Berhalve bestaat een dringende behoefte aan een hoofdwasreini-gingspreparaat, dat een relatief goedkope cellulase bevat met hoge 55 activiteit bij de pH-waarden die gewoonlijk in hoofdwasoplossingen heersen.

Be stand der techniek wijst echter niet op een of andere goedkope cellulase, die een aanvaardbare hoge cellulaseactiviteit vertoont bij de pH-waarden, die gewoonlijk heersen in hoofdwasoplossin-40 gen niettegenstaande het feit, dat een reusachtig commercieel voor- BAD ORIGINALQ ^ 02123 -3- : ·ν · j deel verwacht kan worden wanneer deze behoefte zou kunnen worden vervuld.

Thans is verrassenderwijze volgens de uitvinding gevonden, dat een bepaalde fungusachtige cellulase, dat wil zeggen de fungusachti-5 ge cellulase produceerbaar uit Humicola insolens (Humicola grisea var, thermoidea),een grote cellulase-activiteit heeft bij de pH-waarden, die gewoonlijk in hoofdwasoplossingen heersen, in tegenstelling tot hetgeen verwacht zou kunnen worden op basis van de algemene kennis in de stand der techniek, bijvoorbeeld volgens de hier-10 voor geciteerde passage uit 1.368.5:99·

Derhalve wordt volgens het eerste aspekt van de onderhavige uitvinding een stugheid verminderend middel verschaft in toevoegsel-vorm aai?Reinigingsmiddel voor een reinigingspreparaat, waarvan een essentieel bestanddeel een fungusachtige cellulase is, waarin de fun-15 gusachtige cellulase produceerbaar is door een stam van Humicola insolens (Humicola grisea var, thermoidea) en waarin het stugheid verminderende middel een stugheid verminderend middel is voor een hoofdwasreinigingspreparaat.

Op andere wijze uitgedrukt is de uitvinding het gebruik van de 20 fungusachtige cellulase produceerbaar uit Humicola insolens als een stugheid verminderend middel voor een hoofdwasreinigingspreparaat.

[ Het zal duidelijk zijn, dat de fungusachtige cellulase produ ceerbaar uit Humicola insolens geproduceerd kan worden uit gewone stammen van Humicola insolens alsmede uit mutanten en varianten van 25 Humicola insolens.

Door gebruik van het de stugheid verminderende middel voor een hoofdwasreinigingspreparaat volgens de uitvinding is het voor de eerste keer mogelijk een was- en stugheid verminderend proces op een redelijk goedkope wijze en in één bewerking uit te voeren, dat wil 30 zeggen in de hoofdwas, zonder een of andere voorweek- of andere voorbehandeling.

j' In Agric. Biol. Chem. 44 (3) (1980) 481-487 en 44 (8) (1980) 1721-1728 is beschreven, dat Humicola insolens een cellulase producerend thermofiel fungus is. Ook is beschreven, dat de optimum pH's 35 van de cellulasen geproduceerd door Humicola insolens respectievelijk i.

5,3 en 5»0 zijn en dat deze cellulase daarom tot de kategorie cellulasen1^ behoren zoals hiervoor aangegeven iri verband met het Britse octrooischrift 1.368.599» en daardoor volledig ongeschikt zou zijn om aan het doel van de onderhavige uitvinding te 40 voldoen. Yerrassenderwijze echter werd volgens de uitvinding gevon- BAD ORIGINAlg ^ Q £ 1 2 3 -4-. ! den, dat Humicola insolens een cellulase voortbrengt, die aan het | doel van de uitvinding voldoet.

Humicola insolens valt binnen de groep van thermofiele Humicola, j die Humicola insolens en Humicola var, thermoidea omvat, waarbij het 5 taxonome verschil tussen deze twee zeer dubieus is.

De normale C -cellulase-activiteit wordt bepaald krachtens het

r X

I feit, dat cellulase carboxymethylcellulose hydrolyseert tot reduce rende koolhydraten, waarvan het: reducerende vermogen colorimetrisch wordt bepaald door middel van de ferricyanide-reactie volgens Hoff-10 man, W.S., J. Biol. Chem. 120 (1937), 51.

De gaasie Cx-cellulase-activiteit wordt bepaald in verband met het substraat carboxymethylcellulose (CMC Hercules, 4 ΜβΡ).

I De standaard-omstandigheden zijn de volgende: pH 9»50? buffer 0,1 M tris(hydroxymethyl)aminomethaan ("tris"); substraat 4 S CMC/ 15 liter van de hiervoor aangegeven bufferoplossing; inkubatietempera-' tuur 50°C en inkubatietijd 20 minuten.

Eén gewone C^-cellulase-activiteitseenheid (kortheidshalve hierna aangeduid als één gewone Cx~eenheid) is de hoeveelheid cellulase die, onder de hiervoor aangegeven standaardomstandigheden, een hoe-20 veelheid reducerende suiker vormt, die equivalent is aan 1 yumol glucose per minuut.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het stugheid verminderende middel volgens de uitvinding wordt de fungusachtige cellulase i voortgebracht door middel van de Humicola-stam DSM 1800. Gevonden ; 25 werd, dat deze stam een alkalische cellulase voortbrengt met een ho ge Cx-activiteit bij alkalische pH-waarden. De nieuwe Humicola-stam is geïdentificeerd bij de Commonwealth Mycological Institute, Kew,

England, als Humicola insolens. De nieuwe stam werd gedeponeerd op 14 april 1980 bij de Duitse Collectie van Microörganismen (DSM, 50 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), Göttingen, Bondsrepubliek Duitsland, onder het DSM nr. 1800.

Het volgende is een morfologische en fysiologische beschrijving | ; van de hiervoor vermelde nieuwe Humicola-stam DSM 1800.

Bovenaan-, ^ mycelium eerst wit, later donkergrijs wordend met zicht 35 wiiie vlekken; hyphen kleurloos, glad, . septaat- diameter ongeveer ! 2,8 yum. Kleurloze waterdruppels soms aanwezig.

Achterzijde: geel, bij veroudering bruin - donkergrijs wordend. Aleuriosuoren: glad; bruin; geproduceerde enkelvoudige, eind-i standige op enkelvoudige of multicellulaire conidiosporen; gewoonlijk I 40 globose 12,6 - 16,8 y-um of soms subglobose 7 x 11,2 - 14 x 16,8 yrurn.

: bad original I 8102123 -5- .·ι

Apiculus aanwezig.

Chlamydosporen; enkelvoudig of in ketens geproduceerd; glad; bruin; 11,2 - 16,8 yum.

Phial ocorfdia: afwezig.

5 Temperatuurgrenzen: geen groei bij 26°C; goede groei van 37 - 50°C. Koloniën 8 cm in diameter bij 37°C gedurende 3 dagen.

De hiervoor vermelde waarnemingen werden gedaan na 5 dagen bij 37°C op ïPSS-agar met de hierna aangegeven samenstelling.

Gistextrakt Difco 4,0 g io k2hpo4 1,0 g

MgSO^ . 7H2o 0,5 g oplosbaar zetmeel 15,0 g gedestilleerd water 1000 ml agar 15,0 g.

15 Verrassenderwijze werd gevonden, dat het cellulaseprodukt voort gebracht door middel van de Sumicola insolens-stam DSM 1800, naast het verzachtingseffekt een sterk vuil oplossend en antiherafzettings-effekt vertoont.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het stugheid vermin-20 derende middel volgens de uitvinding wordt de fungusachtige cellu-j lase verrijkt met betrekking tot de cellulasefraktie, die zelf niet hecht aan een anionuitwisselaar bij 6,5 ^ pH 7,5·

Zoals gedetailleerd later zal worden getoond (zie voorbeeld VI) werd gevonden, dat de cellulasefraktie, die zelf niet hecht aan 25 een anionuitwisselaar bij 6,5 pH ^ 7,5 (kortheidshalve hierna aangeduid als de AC^I-fraktie) het meest betekenisvolle ·· stugheid verminderend vermogen vertoont. Eveneens werd gevonden, dat de tempera-I tuurstabiliteit van de AC^I-fraktie beter was dan de tanperatuursta biliteit van de andere frakties van de Humicola insolens-cellulase | 30 en de temperatuurstabiliteit van de zure fungusachtige cellulasen j beschreven in het Britse octrooischrift 1.368.599·

Om in staat te zijn het gehalte van de AC^I-fraktie vast te stellen kan de gemodificeerde C (cellulase) activiteit op de volgen-

Ji de wijze bepaald worden. Een fosfaatbuffer A wordt bereid uit 26,52 g 35 natriumdihydroxyfosfaatdihydraat in 1000 ml gedeloniseerd water; dus de molariteit van A is 0,17· 100 ml A worden gemengd met ongeveer j 800 ml gedeloniseerd water, de pH wordt op 7,0 ingesteld en het to tale volume van de buffer wordt ingesteld op 1000 ml buffer} | welke buffer buffer B wordt genoemd,waarvan de molariteit· 0,017:is.

40 Een kolom', wordt gevuld met 1· g van de. anionuitwisselaar BAD ORIGWAliï-Sepharose C1-6B en in evenwicht gebracht [ 8102123 " ' -6- · ' met B-. Vervolgens wordt het enzym in B opgelost en 25 ml van de aldus bereide enzymoplossing wordt door de hiervoor aangegeven, in evenwicht gebrachte kolom geleid. Be Cx~activiteit van de enzymoplossing stroomafwaarts van de kolom wordt op de hiervoor aangegeven 5 wijze voor de bepaling van de gewone C^-cellulose-activiteit bepaald.

Beze C -activiteit wordt de gemodificeerde C -activiteit genoemd en is kleiner dan de gewone C^-activiteit in het geval dat enige 0χ-activiteit geadsorbeerd wordt aan de anionuitwisselaar onder de gespecificeerde omstandigheden.

10 Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van de uitvinding vertoont de fungusachtige cellulase een verhouding (θχ gemodificeerd/Cx gewoon) van ten minste 0,6, bij voorkeur ten minste 0,8.

Gebleken is, dat een dergelijk de stugheid verminderend middel verrijkt is met betrekking tot de ACxI-fraktie in een zodanige mate, 15 dat het de stugheid verminderende vermogen buitengewoon goed is.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het - stugheid verminderende middel volgens de uitvinding wordt de fungusachtige cellulase verschaft als een niet-stuivend granulaat. Het is essentieel, dat het cellulasepreparaat een laag stuifniveau heeft. Met een hoog 20 stuifniveau kunnen complicaties ontstaan zowel in de fabrieken waar 1 het cellulasepreparaat gemengd wordt met reinigingsmiddelen als tij dens de latere behandeling van het cellulase bevattende reinigings-| middel. Een cellulasepreparaat in granulaatvorm kan bereid worden op een aantal verschillende wijzen, bijvoorbeeld door middel van een 25 ,,Marumerizer,' zoals beschreven in de Britse octrooischriften 1.362.365 en 1.361.397 of door middel van een granuleringsmachine, zoals beschreven in Aufbereitungstechnik No. 3/1970, blz. 147 - 153 en No. 5/1970, blz. 262 - 278, of het kan een gekorreld granulaat zijn zoals beschreven in het Belgische octrooischrift 760.135· In 50 alle gevallen echter dient het granulaat geringe stuifeigenschappen te bezitten. Het woord "Marumerizer" is een handelsmerk.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het stugheid verminderende middel volgens de uitvinding wordt het cellulasegranulaat bekleed met een wit makend middel, bij voorkeur TiOg, in combinatie | 55 met een stof bindend middel. Op deze wijze wordt een aantrekkelijk j uitziend cellulasegranulaat verschaft met een minimum aan stuifvermo- gen.

Volgens een andere voorkeurs-uitvoeringsvorm van het . stugheid verminderende middel volgens de uitvinding is het stugheid j 40 verminderende middel een vloeistof, waarin de fungusachtige cellula- ! BAD original 8102123

r , . I

j -7-. ‘ ! se verschaft wordt als een celluia3econcentraat gesuspendeerd in een niet-ionogeen oppervlak-actief middel. Het concentraat wordt ge-j: produceerd op "basis van de fermentatievloeistof. Zoals hiervoor ver- ! meld is het essentieel, dat het cellulosepreparaat een laag stuif- 5 niveau heeft. Omdat bij deze uitvoeringsvorm het stugheid verminderende middel volgens de uitvinding een vloeistof is, is het stuifniveau daarvan nul en de hiervoor vermelde moeilijkheden worden derhalve volledig vermeden.

Met voordeel bevat, wanneer het stugheid verminderende mid-10 del een suspensie is, het niet-ionogene oppervlak-actieve middel een verdikkingsmiddel. Daardoor kan sedimentatie van de cellulase gewoonlijk vermeden worden. Als verdikkingsmiddel kan bijvoorbeeld gerookt siliciumdioxide met een uiterst kleine deeltjesgrootte gebruikt worden. Wanneer gerookt siliciumdioxide gebruikt wordt als verdikkings-S 15 middel is de hoeveelheid daarvan gewoonlijk in het trajekt van 0,5 - 10 gew.96, bij voorkeur in het trajekt van 1-5 gew.%.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het stugheid verminde-j! rende middel volgens de uitvinding is het stugheid verminderende middel een vloeistof en wordt de fungusachtige cellulase verschaft 20 als een cellulaseconcentraat opgelost in een water bevattend milieu, | bij voorkeur bij aanwezigheid van een stabilisator. Als stabilisator t kan elk middel gebruikt worden, dat stabiliseert tegen sedimentatie en tegen verlies van enzymatische activiteit.

Volgens het tweede aspekt van de onderhavige uitvinding wordt 25 een hoofdwas-reinigingspreparaat verschaft, dat reinigende bestanddelen en een . stugheid verminderende hoeveelheid van het stug. -heid verminderende middel van het eerste aspekt van de onderhavige uitvinding bevat, waarbij de pH van een oplossing van 1 g van het hoofdwas-reinigingspreparaat in 1 liter water met een hardheid van 30 1Ö°DH voor de toevoeging van het hoofdwas-reinigingsmiddelpreparaat | in het trajekt van 7 - 10, bij voorkeur in het trajekt van 7»5 - 9>5 i is.

!: I Het is de bedoeling, dat de uitdrukking "hoofdwas-reinigings- middelpreparaat" een reinigingsmiddelpreparaat omvat, dat gewoonlijk, I 35 maar niet noodzakelijkerwijze, gebruikt wordt bij een enkele wasbe

handeling en die niet wordt voorafgegaan of gevolgd door andere behandelingen van wasserijaard. Het voordeel, dat samenhangt met het hoofdwas-reinigingsmiddelpreparaat volgens de uitvinding blijkt het meest duidelijk, wanneer het hoofdwas-reinigingsmiddelpreparaat vol-40 gens de uitvinding gebruikt wordt bij een enkele wasbehandeling, die BAD ORIGINAL

8102 123

•' * v I

-8- niet wordt voorafgegaan of gevolgd door andere behandelingen van wasserijaard.

De reinigingsmiddelbestanddelen in een hoofdwasreinigingsmiddel-preparaat volgens de onderhavige uitvinding zijn niet kritisch, de 5 enige beperking is, dat deze bestanddelen verenigbaar moeten zijn met de fungusachtige cellulase.

Derhalve kunnen de gebruikte reinigingsmiddelbestanddelen en de percentages daarvan bij wijze van voorbeeld de volgende zijn.

1) Oppervlak-actieve middelen, in het bijzonder anionogene en 10 niet-ionogene oppervlak-actieve middelen, in een totale hoeveelheid van 1-100 gew.%, gewoonlijk 5 - 45 gew.%. Gebruikelijke anionogene oppervlak-actieve middelen zijn lineaire alkylarylsulfonaten ("LAS") en α-alkeensulfonaten ("AOS")· Gebruikelijke niet-ionogene oppervlak-actieve middelen zijn alkylfenylethoxylaten en vetalcoholethoxy-15 laten.

2) Builders, in het bijzonder alkalische builders en de water-hardheid verlagende middelen, in een totale hoeveelheid van 5-80 gew.Jó, gewoonlijk 25 - 75 gew.%. Gebruikelijke builders zijn natri-umtripolyfosfaat ("STPP”), natriumaluminiumsilicaten (zeolieten), 20 natriumsilicaten en natriumcarbonaten.

3) Bleekmiddelen, in het bijzonder peroxiden in een totale hoeveelheid van 0-40 gew.%, gewoonlijk 0% of 15 - 309ó. Gebruikelijke bleekmiddelen zijn natriumperboraat en natriumpercarbonaat.

4) Andere bestanddelen, overwegend enzymen, optische bleekmid-25 delen, parfums, kleurstoffen, schuim modificerende middelen, stabilisatoren, antiherafzettingsmiddelen, bij voorkeur niet CMC, dat tot | een bepaalde mate ontleed zal worden door de cellulase, in een tota le hoeveelheid van 0-10 gew.?é, gewoonlijk 0,1 - 5%· 5) Vulstoffen, in het bijzonder natriumsulfaat, en water, in 30 een zodanige hoeveelheid dat het totaal van de reinigingsmiddelfor- mulering op 100% wordt gebruikt.

In de brochure ”Novo Enzymes” voor de reinigingsmiddelindustrie (B 157a-GB 2000, februari 1977)» worden andere algemene voorbeelden van reinigingsmiddelformuleringen, die tezamen gebruikt kunnen worden 35 met het cellulasepreparaat, vermeld, namelijk preparaten gekenmerkt door specifieke verbindingen of kategorieën van verbindingen en overeenkomstige percentages daarvan of overeenkomstige trajekten voor de percentages daarvan.

| Op bladzijde 5 van de Deense octrooiaanvrage 5691/78, ingediend 40 op 12 december 1978, worden enkele specifieke reinigingsmiddelprepa-

BAD ORIGINAL

8102123 « l -9-.

» * raten, die tezamen gebruikt kunnen worden met het cellulasepreparaat, vermeld.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het hoofdwasreinigings-middelpreparaat volgens de onderhavige uitvinding is het stug-5 heid verminderende middel aanwezig in een hoeveelheid overeenkomend I met 2,5 - 100 gewone 0χ eenheden/g van het hoofdwasreinigingsmiddel, of 1,5 - 60 gemodificeerde 0χ eenheden/g van het hoofdwasreinigingsmiddel, bij voorkeur 5-50 gewone C eenheden/g van het hoofdwas-reinigingsmiddel of 3 - 30 gemodificeerde 0χ eenheden/g van het 10 hoofdwasreinigingsmiddel. Op deze wijze kan een bevredigend stugheid verminderend effekt verkregen worden en eveneens kan een overmaat cellulase (dat het hoofdwasreinigingsmiddelpreparaat onekono-misch zou maken) vermeden worden.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het hoofdwasreinigings-15 middelpreparaat volgens de onderhavige uitvinding bevat het hoofdwasreinigingsmiddel eveneens een bacteriele proteinase, bij voorkeur een proteinase voortgebracht door middel van Bacillus lichenformis, in het bijzonder met ALCALASE. Verrassenderwijze werd gevonden, dat |! de reinigingsmiddeltoevoegsels cellulase en proteinase verenigbaar 20 zijn en dat zij beide een bevredigend effekt uitoefenen bij de pH-waarden tijdens de wasmethode, zelfs hoewel gedacht zou kunnen worden, dat het proteolytische enzym verteerd zou worden door de cellu-|ij lase. Dit gecombineerde reinigingsmiddeltoevoegsel oefent zowel een beter reinigingseffekt als een beter verzachtingseffekt uit bij toe-25 voeging aan het reinigingsmiddel. Het woord "ALCALASE" is een han-i delsmerk voor een Novo enzympreparaat, dat in de handel verkrijgbaar is. Vanneer ALCALASE en een granulaat van cellulase worden gebruikt, kan het gemengde enzymatische toevoegsel bereid worden door menging van een vooraf bereid granulaat van ALCALASE met een vooraf bereid 30 granulaat van cellulase of door mengen van een concentraat van ALCALASE met een concentraat van cellulase en vervolgens dit mengsel toe j te voeren aan een granuleringsinrichting tezamen met de gebruikelij- | ke granuleringshulpstoffen.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van het hoofdwasreinigings-35 middelpreparaat volgens de onderhavige uitvinding is perboraat één van de reinigingsmiddelbestanddelen. Onder bepaalde omstandigheden vergroot perboraat de wasdoelmatigheid en verrassenderwijze is ge-| bleken, dat perboraat en de cellulase in het hoofdwasreinigingspre- i paraat volgens de uitvinding verenigbaar zijn.

40 Volgens het derde aspekt van de onderhavige uitvinding wordt

BAD ORIGINAL

8102123 -10- ..1 een hoofdwasmethode verschaft, waarbij een hoofdwasreinigingsmiddel-preparaat volgens het tweede aspekt van de onderhavige uitvinding als het reinigingsmiddel wordt gebruikt.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van de hoofdwasmethode vol-5 gens de onderhavige uitvinding wordt de fungusachtige cellulase ge-| bruikt in een concentratie in de wasoplossing overeenkomend met 10-100

gewone C eenheden/liter wasoplossing, of 6 - 60 gemodificeerde C

X X

eeriheden/liter wasoplossing, bij voorkeur 20 - 50 gewone 0χ eenheden/liter wasoplossing of 12 - 30 gemodificeerde 0χ eenheden/liter 10 wasoplossing.

Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van de uitvinding is de pH van de oplossing tussen 7 en 10, bij voorkeur tussen 7,5 en 9»5·

Hierbij is de cellulase in staat zijn volledige activiteit uit te oefenen.

15 Bij een voorkeurs-uitvoeringsvorm van de hoofdwasmethode vol gens de onderhavige uitvinding wordt een aanzienlijk gedeelte van de hoofdwas uitgevoerd bij een temperatuur beneden 70°C, bij voorkeur beneden 60°C.

De volgende voorbeelden lichten verder de fermentatie toe, door ! 20 middel.waarvan*het stugheid verminderende middel volgens de uit vinding wordt voortgebracht (voorbeelden I, YI en VIII) en hoofdwas-! reinigingsmiddelpreparaten volgens de uitvinding en hoofdwasmetho- ! den volgens de uitvinding (voorbeelden II - VIII).

Voorbeeld I.

25 De stam DSM 1800 werd bij 37°C gekweekt op een agar-substraat met de samenstelling: gistextrakt Difco 4 g

K2HP04 1 S

MgS04 . 7 h2o 0,5 g 30 glucose 15 g gedestilleerd water 1000 g agar 15 g·

Een eerste groep schudflessen van 500 ml werd· gereed gemaakt; ml deze schudflessen bevatten 10Qvsubstraat met de samenstelling: 35 vloeistof van geweekt graan 2,4% glucose 2,4%

CaC03 0,5% sojaolie 0,5%· V<5(5r de toevoeging van CaCO^ werd de pH-waarde met 4N EaOH op 4Ï> 5)5 ingesteld en sterilisatie werd 20 minuten bij 21 °C uitgevoerd.

BAD ORIGINAL

8102 123 -11-

Na groei gedurende 7 dagen op de. schuin opgestelde agar werden de sporen overgebracht naar de schudflessen in de eerste groep schudflessen van 500 ml.

Een tweede groep schudflessen van 500 ml werd gereed gemaakt; 5 deze schudflessen bevatten elk 100 ml van een substraat met de samenstelling: NH4N05 0,25% jj kh2po4 0,56% K2HP04 0,44% 10 MgS04 . 7 H20 0,075% cellulose 2,0%

CaCO^ 0,25%

Pluronic 0,01% V<5<5r de toevoeging van CaCO^ werd de pH-waarde door middel van 4N ïïaOH op 6,8 - 7,0 ingesteld en sterilisatie werd uitgevoerd door behandeling in een autoclaaf bij 121°C gedurende 20 minuten.

Na groei gedurende 2 x 24 uren bij 57°C in de eerste groep schudflessen wordt inoculatie met 6% van de eerste groep schud-flessen op de tweede groep schudflessen uitgevoerd.

20 Na fermentatie in de tweede groep schudflessen gedurende 140 uren bij 57°C was de cellulase-activiteit 4,2 gewone C eenheden/ml t x

Ij kweekvloeistof. Vervolgens werd de kweekvloeistof op de volgende wij ze gezuiverd: de kweekvloeistof werd gefiltreerd over diatomeeënaar-I de (Hyflo-supercel), het filtraat werd door ultrafiltratie geconcen- j 25 treerd en het retentieprodukt werd door vriezen gedroogd. Set door vriezen gedroogde poeder (A) vertoonde een C^-activiteit van 745 ge-i: wone 0χ eenheden/g.

Twee experimenten werden op exakt dezelfde wijze als hiervoor beschreven uitgevoerd. Na fermentatie in de tweede groep schudfles-50 sen gedurende 140 uren was de gewone C cellulase-activiteit in deze twee experimenten respectievelijk 2,2 en 6,0 0χ eenheden/ml kweekvloeistof. Ook het door vriezen gedroogde poeder vertoonde bij deze twee experimenten een gewone Cx-activiteit van 558 (poeder B) en 518 Cx~eenheden/g (poeder C).

35 Voorbeeld II.

In dit voorbeeld werd het cellulasepreparaat poeder A van voorbeeld I gebruikt als het de stugheid verminderende middel.

Het wasexperiment werd uitgevoerd als een eentraps-wasbehande- ling met een volledig automatische trommelwasmachine van MIELE vol- 40 gens het wasprogramma genoemd "Kogevask 950Cn aangegeven in de bro-

BAD ORIGINAL

8102 123 ï.

' ^ V I

-12- chure T-52001, dat de MIELE wasmachine type 421 S beschrijft. Het woord "MIELE" is een handelsmerk. Het programma genaamd "Kogevask 95°C" heeft het volgende benaderde temperatuur-tijd-profiel: tijd (min.) 0 6 12 18 24 30 36 42 45 5 temp. (°C) 16 27 43 61 76 85 85 82 spoelen met koud water.

De wasoplossing bezat de volgende samenstelling: ongeveer 16 liter water met een hardheid van ongeveer 20° dH, die 5 g/liter van een gebruikelijk, commercieel poedervormig reinigingsmiddel bevatten 10 met de volgende hoofdbestanddelen (benaderde droge vaste stoffen-samenstelling in gew.%): 21% oppervlak-actieve middelen (7% LAS, 11% zeep en 3% nonylfenyl-ethoxylaat) 3996 builders (32% STPP, 4% natriumsilicaat en 3% natriumcarbonaat) 15 26% natriumperboraat 13% natriumsulfaat.

Aan deze wasoplossing werd het proteolytische enzympreparaat ALCALASE toegevoegd in een concentratie die overeenkomt met j 0,06 Anson-eenheden/liter oplossing. De proteolytische activiteit 20 van het enzympreparaat werd bepaald volgens de gemodificeerde Anson-methode, beschreven in Novo Analytical Method No. AP 4*3/5-GB (de oorspronkelijke Anson-methode is beschreven in J. Gen. Physiol., 22, (1939)i 79-89).

Aan deze wasoplossing werd niets of het cellulasepreparaat van 25 voorbeeld I in een concentratie overeenkomend met 40 gewone Οχ een-heden/liter oplossing toegevoegd.

De gebruikte proefmaterialen voor elk van deze twee parallelle experimenten waren: 1) 12 stukken wit Terry katoendoek met de afmetingen 42 cm x 30 60 cm en 2) 12 stukken wit katoenen interlock met dezelfde afmetingen.

Voorts werd schoon katoenen wasgoed toegevoerd met de twee soorten proefmateriaal om in totaal 3 kg wasgoed te verschaffen. Het proefmateriaal werd 20 maal gewassen voor gebruik met een perboraat 35 bevattend gebruikelijk reinigingsmiddel onder toepassing van een programma met hoge temperatuur.

Na deze 20 herhaalde wasbehandelingen, die het wassen van het proefmateriaal in de praktijk simuleren, was het proefmateriaal gereed voor het wasexperiment met of zonder cellulase.

40 Het proefmateriaal werd 6 maal gewassen met tussentijdse dro-

BAD ORIGINAL

8102123 -13- ging over een lijn gedurende de nacht. Na de laatste wasbehandeling werden alle proefstukken (12x2x3) geconditioneerd over een lijn in dezelfde ruimte.

Ne waardering werd uitgevoerd door een panel "bestaande uit 20 5 personen. Zonder kennis van de identiteit van de verschillende proefstukken werd aan elk van de eerste 10 personen in het panel gevraagd 6 waarderingen te maken (dat wil zeggen 3 voor het witte Terry-doek en 3 voor het witte katoenen interlock) op basis waarvan het mogelijk was de juiste opgave onder de volgende opgaven te kie-10 zen: 1) Het met cellulase behandelde doek is zachter dan het zonder cellulase behandelde doek, 2) het met cellulase behandelde doek heeft dezelfde mate van zachtheid als het zonder cellulase behandelde doek en 15 3) bet met cellulase behandelde doek is harder dan het zonder cellulase behandelde doek.

!| Nrie stukken proefmateriaal werden gekozen uit de 12 stukken wit Terry-doek van katoen behandeld met cellulase en drie stukken j van het proefmateriaal werden gekozen uit de 12 stukken wit Terry- * 20 doek van katoen zonder cellulase behandeld. Deze 6 stukken werden i opgesteld in 3 paren en elk van de eerste 10 leden van het panel werd gevraagd alle 3 paren gescheiden te waarderen. Soortgelijke waarderingen werden uitgevoerd met het witte katoenen interlock. De i' iv andere 10 personen in het panel werd vervolgens gevraagd het over- \ 25 blijvende proefmateriaal op dezelfde wijze te waarderen.

Alleen verwijzend naar het witte Terry-doek maakte elke persoon ij' in het panel 3 waarderingen overeenkomend met een totaal voor het gehele panel van 60 waarderingen voor dit proefmateriaal.

Het witte katoenen interlock werd op dezelfde wijze gewaardeerd, 30 waarbij het totale aantal waarderingen ook 60 in dit geval was.

Het resultaat van de hiervoor beschreven waarderingen blijkt uit de volgende tabel A. Tabel A laat tevens de pH zien van de rei- i | nigingsmiddeloplossing bij het begin van de wasbehandeling, na 10 | minuten en na 20 minuten (respectievelijk t=0, t = 10 en t = 20).

35 Voorbeeld III.

fj * | Voorbeeld II werd herhaald. De resultaten zijn in tabel A opge nomen.

Voorbeeld IV.

I In dit voorbeeld werd het cellulasepreparaat poeder B van voor- | bad OiSgINAL ^ als het de stugheid verminderende middel. Voorbeeld 810 2 12 3 * ^ ! -14- II werd herhaald, evenwel met de volgende veranderingen: de wasmachine werd gevuld met proefmateriaal zoals in voorbeeld I, vervolgens werd vuil katoenen wasgoed toegevoerd om in totaal 3 kg wasgoed te verschaffen. Het vuile wasgoed was katoenen ondergoed van een mili-5 tair kampement. De resultaten zijn in tabel A opgenomen.

Voorbeeld V.

In dit voorbeeld werd het cellulasepreparaat C van voorbeeld I gebruikt als het de stugheid verminderende middel. Het in voorbeeld II beschreven experiment werd herhaald, evenwel met de volgende ver-10 anderingen: het wasprogramma genaamd "Finvask 60°C" in de brochure T-52001 werd gebruikt. Dit programma heeft het volgende benaderde temperatuur/tijd-profie1: tijd (min.) 0 6 12 18 24 30 36 42 temp. (°C) 16 24 35 47 57 55 54 spoeling met koud 15 wat er.

De wasoplossing had een volume van ongeveer 26 liter. De pH van de wasoplossing werd enigszins met citroenzuur ingesteld. De resultaten zijn in tabel A opgenomen.

Tabel A.

20 Voorbeeld Proefmateriaal Waardering II 73%: zachter met cellulase pH bij terry-doek 2%: geen verschil t = 0: 10,0 25%: harder met cellulase t - 10. 9»8 katoenen 77%: zachter met cellulase | 25 t 20. 9»7 interlock 8%: geen verschil 15%: harder met cellulase III terry-doek 68%: zachter met cellulase pH bij 5%: geen verschil t = 0: 9»9 27%: harder met cellulase t = 10* 9 8 30 ~ * ’ katoenen 78%: zachter met cellulase t — 20· 9 6 * interlock 2%: geen verschil i 20%: harder met cellulase i IV 8lf%: zachter met cellulase pH bij terry-doek 3%: geen verschil 35 t = 0: 9>8 13%: harder met cellulase t = 10: 9 7 ’ katoenen 82%: zachter met cellulase 20. 9>6 interlock 5 %: geen verschil BADORICTDAT-'- 1*‘ haIdeI met °ellu1·^- 8102123 -15- ..1

Vervolg tabel A.

Voorbeeld Proef materiaal Waardering V 93%ί zachter met cellulase pH bij terry-doek 0 %: geen verschil t = 0: 8,9 7%: harder met cellulasa t = 10: 8,8 --—-- _ - katoenen 93%ï zachter met cellulase t = 50: 8,9 interlock 2%: geen verschil 3%: harder met cellulase

Yoorbeeld VI.

He stam DSM 1800 werd hij 37°C gekweekt op een agar-substraat I met dezelfde samenstelling als het agar-substraat in voorbeeld I.

| 500 liter van een inoculatie of voor-fermentatiesubstraat met 5 de samenstelling: vloeistof van geweekt graan 2,4% glucose 2,4%

CaCO-, 0,5% | sojaolie 0,4%,

| 10 (waarbij de pH v<5<5r toevoeging van CaCO^ door middel van 4 N NaOH

op 5>5 was ingesteld) werden 45 minuten bij 121°C gesteriliseerd.

1 Ha een groei van 14 dagen op het agar-substraat werden de spo- * ren overgebracht naar het gesteriliseerde voor-fermentatiesubstraat van 500 liter. Steriele lucht werd door de aldus bereide voor-15 fermentatievloeistof geleid gedurende 49 uren bij 37°C onder een druk van 49 kPa en met een snelheid van 300 liter per minuut.

i 350 Liter van een hoofd-fexmentatiesubstraat met de volgende ! \ samenstelling: | vloeistof van geweekt graan 10% 20 cellulose 3%

CaCOj ’ 0,25% j kh4no3 0,25% kh2po4 0,56% I; e2HP04 0,4490 25 MgSO. 0,08% ! 4

Pluronic 0,014% j (waarbij de pH-waarde v<5<5r toevoeging van CaCO^ door middel van j 4 N HaOH op 6,8 tot 7»0 was ingesteld) werd door koken gedurende i

: BAD ORIGINAL

8102123 ' · · ! 60 minuten bjj 123°C gesteriliseerd. 35 Liter van de voor-fermentatie-vloeistof werden overgebracht naar het aldus gesteriliseerde hoofdferment at ie sub straat . Steriele lucht werd door de aldus bereide hoofd-fermentatieyloeistof geleid onder een druk van 49 kPa en met 5 en snelheid van 300 liter per minuut.De pH werd beneden 7>0 gehouden door toevoeging van KHgPO^·. Le fermentatie werd 136 uren bij 37°C uitgevoerd. Na het beëindigen van de fermentatie was de activiteit 29 gewone'C eenheden/ml.

De kultuurvloeistof werd op de volgende wijze gezuiverd: 10 De kultuurvloeistof werd over diatomeeënaarde (Hyflo-supercel) i ’ gefiltreerd. Het filtraat werd door ultrafiltratie geconcentreerd en het retentieprodukt (dat kortheidshalve hierna zal worden aangeduid als retentieprodukt D) werd door vriezen gedroogd.

Het door vriezen gedroogde poeder D vertoonde een gewone C -15 activiteit van I316 0χ eenheden/g en een gemodificeerde C^-activi-teit van 953 0χ eenheden/g.

Nog twee fermentaties met daaraan volgende ultrafiltraties werden op dezelfde wijze uitgevoerd zoals hiervoor aangegeven. De overeenkomstige retentieprodukten worden aangeduid als retentieprodukt 20 E en P. Retentieprodukt P werd door vriezen gedroogd en het door vriezen gedroogde poeder P vertoonde een gewone Cx-activiteit van 743 eenheden/g en een gemodificeerde Cx~activiteit van 580 eenheden/ e·

Het door vriezen gedroogde poeder D werd gescheiden in ver-25 - schillende componenten door anionogene uitwisselingschromatografie op de volgende wijze: 100 g daarvan werden opgelost in 2000 ml gedestilleerd water bij 4°C. De pH werd op 7>5 ingesteld met 1 M "trisV De oplossing werd vervolgens gebracht op een ionenuitwisselingskolom van 4000 ml met 100 g DEAE-Sephadex A-50. Pig. 1 laat het absorbe-30 rend vermogen 0D280 zien bij 280 nm van de frakties, die uit de kolom vrijkomen. De aan de kolom gebonden proteïnen werden geëlueerd met een NaCl-gradiënt; de NaCl-concentratie werd gemeten en in fig.

1 tezamen met het absorberend vermogen van de frakties uitgezet.

! De proteïne bevattende frakties werden bijeengevoegd zoals aan- j 35 gegeven met de haakjes in fig. 1 en de bijeengevoegde frakties wer den 1-5 genummerd. De depots 1-5 werden vervolgens gescheiden aan een vriesdroogbehandeling onderworpen.

De met de vriesdroging behandelde depots werden gekenmerkt door de hoeveelheid proteïne, de samenstelling van proteïnen en de gewone 40 Cx-activiteit, zie tabel B. Het isoëlektrische punt van de proteïnen BAD ORIfóNAIbepaald met een "LEZB multiphoer"-apparaat.

8102 123 Γ .. ..] -17-

Tab el B.

Proteïne, Totaal aan- pl-trajekt Opbrengst Opbrengst g tal gewone proteïne, C , 0χ eenheden % % 5 uitgangs- 53,0 131600 3,5 - 9,0 materiaal depot 1 8,6 47400 6 - 9,0 16 36 depot 2 0,9 1000 4-6 2 1 depot 3 4,8 9500 4-5,5 9 7 10 depot 4 7,1 11000 5,5-5,5 13 8 depot 5 17,7 18600 3,5-5 33 14 totaal 73' 66 *) (=Α0χΙ fraktie).

Depot 1 bevat alle alkalische componenten, dat wil zeggea de ; 15 proteïnen, die niet gebonden zijn aan de anionogene uitwisselings- ;i] | hars bij 6,5 4 pH 7,5· Derhalve is de totale hoeveelheid gemodifi ceerde 0χ cellulase-activiteit aanwezig in depot 1, dat ook alle cellulolytische activiteiten met pi boven 6,0 bevat.

Teneinde te waarderen welke van de vijf depots de fraktie beVat-I 20 te met het grootste verzachtigingseffekt werden de volgende experi menten uitgevoerd.

Katoenen terry-doek werd 20 maal voorgewassen zoals beschreven in voorbeeld II. Na deze voorwasbehandeling werden stroken van 10 cm x 10 cm (ongeveer 4 g) uitgesneden en gemerkt.

!i 25 De cellulasebehandeling werd nu uitgevoerd in een Terg-0-Tometer laboratorium-wasmachine onder de volgende omstandigheden: reinigingsmiddel en dosering: zoals in-voorbeeld II, behalve voor I celluiasedosering ! begin-pH: ongeveer 9,5

• 30 temperatuur: 50°C

tijd: 30 minuten

; waterhardheid: 20°dH

i I volume per beker: 1200 ml ’ aantal stroken per beker: 10 ij 35 cellulasedosering: zie tabel hierna, in alle gevallen 100 mg van de j door vriesdrogen verkregen depots/liter.

8102 123

BAD ORIGINAL

·- . . ! -18-

Dosering: Depot 1 Depot 2 Depot 3 Depot 4 Depot 5 mg protelne/l 31 13 28 34 52 gewone 0χ eenheden/l 170 15 56 52 55 gemodificeerde 0χ 5 eenheden/l 170 . 0 0 0 0

De waardering werd uitgevoerd door een panel bestaande uit 10 i personen, waaraan verschillende stellen stroken werden gegeven, elk bestaande uit drie stroken en gevraagd werd de stroken binnen elk stel op te stellen volgens de zachtheid. Elk stel bestond uit twee | 10 stroken, die waren gewassen met één van de depots en één strook dien de als controle. 9 Personen van de 10 personen in het panel vonden dat de stroken gewassen met depot 1 zachter waren dan die waaraan geen depot was toegevoegd. Alle andere depots maakten niet aanzienlijk de stroken zachter.

15 Uit het voorafgaande kan geconcludeerd worden, dat depot 1 de C -activiteit bevat, die een verzachtend effekt heeft. De C -activi-x x teit in de depots 3-5 vertoonde geen van betekenis zijnd zachtma-kingseffekt bij doseringsniveau*s, die gewoonlijk een verzachtend effekt verschaffen.

20 Voorbeeld VII.

Retentieprodukt E van voorbeeld VI werd door sproeien gedroogd, waarbij een onzuiver concentraat werd gevormd.

Dit onzuivere concentraat werd door een zeef gedrukt met een openingdiameter van 0,5 mm, waardoor een gemiddelde diameter van 25 17»4 /um verkregen werd. De cellulase-activiteit van het concentraat in deze toestand was 650 gewone 0χ eenheden/g.

Een mengsel bestaande uit het hiervoor vermelde celluloseconcentraat 2,5 kg cellulosepoeder (Arbocel BC 200) 1,0 kg 30 Ti02 0,2 kg

NaCl (deeltjesgrootte kleiner dan 0,2 mm) 6,1 kg werden in een menger (Lödige FM 50/lMZ) gemengd met een rotatiesnel-heid van 120 omwentelingen per minuut en een messnelheid van 3000 omwentelingen per minuut. Aan het aldus voortgebrachte mengsel werd 35 1 kg van een 20-procents oplossing van polyvinylpyrrolidon in water (PVP K 30) toegevoegd, waarbij de hiervoor aangegeven rotatiesnel-heid en messnelheid werden gehandhaafd. De toevoeging van de waterige oplossing werd uitgevoerd door middel van een drukmondstuk en badoriginal 810 2 12 3

Γ · · . I

-19- duurde 1 minuut. Dit vochtige mengsel werd vervolgens 3 minuten behandeld in de menger bij een mengsnelheid van 200 omwentelingen per minuut en een messnelheid van 3000 omwentelingen per minuut. Tweemaal werd een verdere hoeveelheid water toegevoegd, respectievelijk 5 200 g en 100 g water, beide malen gevolgd door behandeling in het mengsel gedurende 3 minuten. Waargenomen werd, dat de temperatuur in de massa tijdens de granulering steeg van 25°Ct>t30°C. Het vochtige granulaat werd vervolgens gedroogd in een gefluldiseerd bed tot een watergehalte van 1,6%. De woorden "Lödige’' en "Arbocel" zijn handels-10 merken.

Gewone C^-activiteit van droog granulaat: berekend 164 gewone 0χ eenheden/g gevonden 136 gewone 0χ eenheden/g activiteitsverlies 17%.

15 Dit produkt was een deeltjesvormig produkt met lensvormige I deeltjes. Kortheidshalve zal het worden aangeduid als granulaat E.

Granulaat E vertoonde de volgende deeltjesgrootteverdeling:

Deeltjesgrootte, /urn % deeltjes i: >1180 15 ij 20 > 1000 . 28 > 850 43 > 707 62 >600 76 > 500 87 25 > 420 94 > 300 1,8.

Gemiddelde diameter = 790 yrum.

i: Granulaat E werd op de volgende wijze bekleed. 4,0 kg Granulaat E werd gestort in een menger (Lödige, type Μ 20E). Het mengsel werd 30 tot 65°C verwarmd en vervolgens werden 160 g gesmolten polyethyleen-glycol 4000 (molecuulgewicht 4000) toegevoegd; dit mengsel werd 1 minuut gemengd. Vervolgens werd het granulaat bepoederd met 360 g TiOg en 90 g magnesiumsilicaat. Na een mengtijd van 5 minuten werden verder 40 g polyethyleen 4000 op het mengsel gegoten en het men-35 gen werd 1 minuut voortgezet. De inhoud werd vervolgens gekoeld.

1 kg Van het aldus bereide beklede granulaat werd door blazen van stof bevrijd gedurende 1,5 minuten bij 65°C op een gefluldiseerd bed.

De activiteit.van het granulaat blijkt uit de volgende analyse: BAD ORIGINAL g ^ g ^ ƒ 2 3 -20- !

Bekleed granulaat Bekleed en door blazen van stof bevrijd granulaat activiteit, gewone 0χ eenheden/g 137 138 5 Het hiervoor aangegeven beklede granulaat, het beklede en door blazen van stof bevrijde granulaat en granulaat E zijn gebruikelijke uitvoeringsvormen van een de stugheid verminderend middel in de vorm van een toevoegsel aan een reinigingsmiddel.

Een wasexperiment met granulaat E werd uitgevoerd zoals in 10 voorbeeld VI met de volgende verandering: c ellul as e do s eri ng: ! 333» 667» 1000, 1333 en 1667 mg/liter.

De waardering werd uitgevoerd zoals in voorbeeld VI met de volgende veranderingen: 15 Elk stel stroken bestaande uit 2 stroken, namelijk één strook gewassen met reinigingsmiddeloplossing, die geïnactiveerde cellulase bevatte, en één strook gewassen met een reinigingsmiddeloplossing, die actieve cellulase bevatte. Het geïnactiveerde cellulase werd verkregen door een voorraadoplossing te bereiden met 10 g granulaat 20 E opgelost in water tot 250 ml en verwarming van deze oplossing tot | 90°C en het handhaven van deze temperatuur gedurende 10-15 minu ten. Een totaal van 5 stellen werd gewaardeerd en de resultaten van de waarderingen zijn in tabel C opgenomen.

Tabel C: zachtheidswaardering (%): 25 Stel nr. Cellulasedosering Cellulase inact. cellulase (mg/liter) --—

Waardering: strook behandeld zoals aangegeven is het zachtst zegt: j 1 333 6o% 40% | 30 2 667 70% 30% 3 1000 70% 30% 4 1333 7096 30% 5 1867 90% ” 10%

Voorbeeld VIII.

55 In dit voorbeeld werden verschillende stammen van Ηπτητcola in- solens vergeleken, dat wil zeggen CBS 14764 (identiek aan ATCC 22082), DSM.-206-9 . - en DSM 2068 . Deze stammen werden gekweekt zoals in voorbeeld I beschreven met de uitzondering, dat het substraat voor de tweede groep van schudkolven naast de bestanddelen aangege-

BAD ORIGINAL

8102123 -21- ' 1 ) ven in voorbeeld I 14% geweekte graanvloeistof bevatte. Door vriezen gedroogde poeders werden voortgebracht uit de fermentatievloeistof-fen zoals aangegeven in voorbeeld I. De door vriezen gedroogde poeders werden ontzout, opnieuw opgelost en ontzout op een Sephadex G 5 25 kolom en opnieuw door vriezen gedroogd. Deze door vriezen gedroogde poeders vertoonden respectievelijk 1096, 480 en 690 gewone 0χ eenheden/g. Ook een deel van het door vriezen gedroogde poeder F van voorbeeld VI (DSM 1800) werd in dit voorbeeld gebruikt.

Het door vriezen gedroogde depot 1 van voorbeeld VI werd ver-10 der gezuiverd door kationuitwisseling op CM-Sepharose CL 6B. Een hoeveelheid' van dit door vriesdrogen verkregen depot 1 overeenkomend met 1,7 g proteïne werd opgelost in een citroenzuurbuffer bij een pH van 5>0 en aangebracht op een kolom van 1000 ml met de kationenuit-wisselaar, waarop het proteïne was gehecht. Er werd met een NaCl-15 gradiënt geëlueerd en bij een NaCl-concentratie van 250 mmol werd het zuivere CMC actieve Α0χΙ proteïne geëlueerd. Het molecuulgewicht van dit proteïne blijkt 80.000 te zijn door middel van SDS-gel elektro-forese. Ook werd dit proteïne gebruikt voor de bereiding van antiserum (konijnen).

20 Dit antiserum werd nu gebruikt voor het kwantificeren van het gehalte van het AC^I-proteïne door middel van immunologische technieken, dat wil zeggen raket-elektroforese, zoals beschreven door B. Weeke in Scandinavian I. Immun., 2 Suppl. 1, bladz. 57 (1973)·

Het raket-immunoëlektroforesepatroon is in fig. 2 getoond. De 25 elektroforese werd één nacht uitgevoerd in een tris-maleaatbuffer i met een pH van 7 sn met een spanningsgradiënt van 1,0 volt/cm.

!;' In fig. 2 correspondeert a met het DSM 2069 . produkt (3 mg/ ml), correspondeert b met het CBS 14764-produkt (2 mg/ml/, correspondeert c met het DSM,20é8.< produkt (3 mg/ml) en correspondeert dn 50 met het DSM 1800 produkt (n mg/ml).

De hiervoor aangegeven cellulasepreparaten afkomstig van DSM 1800, CBS 14764, DSM.2068'· ' en DSM.2069 werden gebruikt bij het hierna beschreven wasexperiment: katoenen terry-doek werd 20 maal voorgewassen zoals beschreven 55 in voorbeeld II. Na deze voorwas werden stroken van 10 cm x 10 cm (ongeveer 4 g) uitgesneden en gemerkt.

De cellulasebehandeling werd nu uitgevoerd in een Terg-O-Tometer 1aborat orium-wasmachine onder de volgende omstandigheden: reinigingsmiddel en dosering: zoals in voorbeeld II, 40 behalve voor de celluiasedosering

BAD ORIGINAL

8102123

* « >. I

-22- begin-pH: ongeveer 9,5 temperatuur: 50°C tijd: 30 minuten waterhardheid: 20°dH 5 volume per beker: 1200 ml aantal stroken per beker: 10 cellulasedosering: zie tabel hierna.

Cellui as e- geen DSM CBS DSM 2068 DSM. 2069 dosering (mg/liter) 1800 14764 ! ’ 10 0 102 39 96 105 gewone 0χ eenheden/liter 76 43 66 50

Eet cellulasepreparaat afkomstig van DSM 1800 werd toegevoegd in een dosering van 76 gewone C eenheden/liter en de andere cellu- Λ 15 losepreparaten werden toegevoegd in een dosering om dezelfde Α0χΙ-proteïneconcentratie (immunologisch bepaald zoals hiervoor beschreven in dit voorbeeld) in de wasoplossing als het DSM 1800 preparaat te ontwikkelen. De cellulasebehandelingen werden 6 maal herhaald.

Na elke behandeling werden de stroken grondig in leidingwater ge-20 spoeld en aan de lucht over een lijn één nacht gedroogd.

De waardering werd uitgevoerd door een panel, bestaande uit 10 personen, waaraan vier verschillende stellen stroken werden gegeven, elk bestaande uit 3 stroken en waaraan werd gevraagd de stroken binnen elk stel volgens de zachtheid op te stellen. De zachtste strook 25 in een stel werd een "1" gegeven, de volgende een "2", enz. De samenstelling van de gewaardeerde stellen en de resultaten van de waarderingen, uitgedrukt in % (het percentage van het panel dat een bepaalde strook in een bepaalde zachtheidskategorie plaatst), zijn in tabel D hierna getoond: 30 Tabel D; zachtheidswaardering (9é)

Stel nr. Cellulase Zachtheidskategorie ii2*· iijii zachtste 1 geen 0 10 90 35 poeder C (vb. VI) 80 20 0

poeder van CBS

14764 20 70 10

BAD ORIGINAL

8102 123 -25- * 1. j

Vervolg Tabel D.

Stel nr. Cellulase Zachtheidskategorie II·] It 112" ll^t! zachtste 5 2 geen 0 50 70 poeder C (vb. VI) 70 50 0 poeder van 1 DSM. 2068 50 40 50 5 geen 0 20 80 10 poeder C (vb. VI) 50 50 20 poeder van DSM.2069. ’ 70 50 0 8102 123

BAD ORIGINAL

Claims (22)

1. Stugheid verminderend middel in de vorm van een toevoegsel aan een reinigingsmiddel voor een reinigingsmiddelpreparaat, waarvan een wezenlijke component een fungusachtige cellulase is, met 5. e t kenmerk, dat de fungusachtige cellulase produceerbaar is door een stam Humicola insolens (Humicola grisea var, thermoidea) en het stugheid verminderende middel een stugheid verminderend middel is voor een reinigingspreparaat voor de hoofdwas.

2. Stugheid verminderend middel volgens conclusie 1, met , 10 h e t kenmerk, dat de stam van Humicola insolens de stam is gedeponeerd onder DSM 1800.

3. Stugheid verminderend middel volgens conclusie 1 ea 2, met het kenmerk, dat de fungusachtige cellulase verrijkt is met betrekking tot de cellulasefraktie, die zelf niet hecht 15 aan een anionuitwisselaar bij 6,5 <· pH <· 7»5·

4. Stugheid verminderend middel volgens conclusie 3» met het kenmerk, dat de fungusachtige cellulase een verhouding (C gemodificeerd/C gewoon) vertoont van ten minste 0,6, bij voor- X X keur ten minste 0,8. 2o

5· Stugheid verminderend middel volgens conclusies 1-4, met hetkenm er k , dat het de stugheid verminderende middel een niet-stuivend granulaat is.

6. Stugheid verminderend middel volgens conclusie 5» met het kenmerk, dat het niet-stuivende granulaat bekleed is 25 met een wit makend middel in combinatie met een stof bindend middel.

7. Stugheid verminderend preparaat volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het wit makende middel TiÜ2 is.

8. Stugheid verminderend middel volgens conclusies 1 - 4> met het kenmerk, dat het stugheid verminderende mid- 50 del een vloeistof is en waarin de fungusachtige cellulase verschaft is als een cellulaseconcentraat gesuspendeerd in een niet-ionogeen oppervlak-actief middel.

9· Stugheid verminderend middel volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat tevens een verdikkingsmiddel aanwezig is.

10. Stugheid verminderend middel volgens conclusies 1-4» met het kenmerk, dat het stugheid verminderende mid del een vloeistof is en de fungusachtige cellulase verschaft is als een cellulaseconcentraat opgelost in een waterig milieu, bij voorkeur bij aanwezigheid van een stabilisator.

11. Eeinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas, g e k e n - BAD ORIGINALg <| Q £ «j 2 3 *v ' -25- merkt door reinigingsmiddelbestanddelen en een stugheid verminderend middel van het stugheid verminderende middel volgens een of meer van de conclusies 1 - 10, waarbij de pH in een oplossing van 1 g van het reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas in 1 li-5 ter water met een hardheid van 10°dH vóór de toevoeging van het reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas in het trajekt van 7-10, hij voorkeur van 7»5 - 9,5 is·

12. Reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het stugheid vermin- 10 derende middel aanwezig is in een hoeveelheid overeenkomend met 2,5 - 100 gewone 0χ eenheden/g reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas of met 1,5 - 60 gemodificeerde 0χ eenheden/g reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas.

13· Reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas volgens conclu-15 sie 12, met het kenmerk, dat het stugheid vermin derende middel aanwezig is in een hoeveelheid overeenkomend met 5 -50 gewone 0χ eenheden/g van het reinigingsmiddelpreparaat voor de ' hoofdwas of met 3 - 30 gemodificeerde 0χ eenheden/g van het reini gingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas. 20

14· Reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas volgens conclu sies 11, 12 of 13, met het kenmerk, dat tevens een bacteriële proteinase aanwezig is.

15· Reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas volgens conclusie 14» met het kenmerk, dat de bacteriële proteinase 25 een proteinase is voortgebracht door middel van Bacillus licheni-formis.

16. Reinigingsmiddelpreparaat voor de hoofdwas volgens conclusies 11-15» met het kenmerk, dat één van de reini-gingsmiddelbestanddelen een perboraat is. 30

17· Hoofdwaswerkwijze, met het kenmerk, dat het reinigingsmiddel voor de hoofdwas volgens conclusies 11 - 16 als reinigingsmiddel gebruikt wordt.

18. Hoofdwaswerkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat de fungus achtige cellulase gebruikt wordt in een 35 concentratie in de wasoplossing overeenkomend met 10 - 100 gewone 0χ eenheden/liter wasoplossing of met 6-60 gemodificeerde 0χ eenhe-den/liter wasoplossing.

19· Hoofdwaswerkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de fungusachtige cellulase gebruikt wordt in een 40 concentratie in de wasoplossing overeenkomend met 20 - 50 gewone C BAD ORIGINAL 8102 123 -as-, ' ‘ ! eenheden/liter wasoplossing of met 12-30 gemodificeerde 0χ eenhe-den/liter wasoplossing.

20. Hoofdwaswerkwijze volgens conclusies 17-19» met het kenmerk, dat de pH in de wasoplossing tussen 7 en 10, hij 5 voorkeur tussen 7»5 en 9»5 is.

21. Hoofdwaswerkwijze volgens conclusies 17 - 20, met het kenmerk , dat het voornaamste deel van de hoofdwaswerkwijze wordt uitgevoerd hij een temperatuur beneden 70°C.

22. Hoofdwaswerkwijze volgens conclusie 21, met het 10kenmerk, dat het voornaamste deel van de hoofdwashehandeling wordt uitgevoerd hij een temperatuur beneden 60°C. BAD ORIGINAg 1 0 2 12 3 -2?- B 4 «f V Tekst ter vervanging van blz. 5, regels 15 t/m 18 van de beschrijving, behorende bij de octrooiaanvrage No. 8102123, voorgesteld door aanvraagster onder datum van 9 september 1981. Verrassenderwijze werd gevonden, dat het door middel van de Humicola insolens-stam DSM 1800 verkregen cellulaseprodukt behalve het verzachtingseffect een sterk vuil losmakend en antiherafzettings-effect vertoont. Dit effect wordt op verschillende wijzen waargenomen, 5 afhankelijk van de aard van het katoen bevattende weefsel. Met wit weefsel wordt in de eerste plaats waargenomen, dat gekleurd vuil, bijvoorbeeld roetdeeltjes in olijfolie, in een aanzienlijk grotere mate wordt verwijderd, wanneer men het cellulaseprodukt gebruikt. Dit kan worden gemeten als een toeneming in de i '10 lichtreflectie ( witheid). [ Met zwart of donker gekleurd weefsel wordt in de eerste plaats waargenomen, dat de kleuren helderder blijken met een minder grijze nuance bij toepassing van het cellulaseprodukt. Dit is te danken aan een afneming in de hoeveelheid van en een verandering van de ( 15 fysische structuur van katoenpluis op het oppervlak van het materiaal. Deze vermindering van grijze nuance kan bijvoorbeeld met zwart materiaal worden gemeten als vermindering in de lichtreflectie ( witheid). : ij t Τι V. i I rTgSEPWS' \ !j: i BAD ORIGINAL 8102123