JPS63502955A - 組換えｄｎａ配列類、それらを含有するベクタ−類およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡ配列類、それらを含有するベクター類およびそれらの 本発明は、組換えＤＮＡ配列類、それらを含有するベクター類およびそれらの使 用方法に間する。と（に、本発明は、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）（Ｌ−グ ルタメート：アンモニアリガーゼ［ＡＤＰ−形成性］；　ＥＣ６，３，１，２） の完全アミノ酸配列をコードする（　ｅｎｃ。

ｄｅ）組換えＤＮＡ配列およびこのようなヌクレオチド配列に使用に関する。

された、また、そうでなければ稀であるか、あるいは遺伝子の操作の完全に新規 な生成物である蛋白質を大量に得る手段をそれは提供した。哺乳動物からこのよ うな蛋白質は得ることは有利である。なぜなら、それらの蛋白質は、バクテリア 細胞中において発現される蛋白質のしばしば者しい対照をなして、一般に正しく 折り重ねられており、適当に修飾されかつ完全に慨能的であるからである。

大量の生成物が要求される場合、細胞の増殖の間ベクターの配列が保持される細 胞のクローンを同定することが必要であるにのようなベクターの維持は、ウィル スのレプリコンの使用によって、あるいはベクターの宿主細胞のＤＮＡ中への組 込みの結果として達成することができる。

ベクターが宿主細胞のＤＮＡ中に組込まれた場合、ベクターのＤＮＡのコピーの 数、および同時に発現されうる生成物の量は、ベクターの配列が宿主細胞のＤＮ Ａ中への組込み後にその中で増幅された細胞系を選択することによって増加でき るであろう。

このような選択手順を実施するための既知の方法は、既知の薬物によって感染さ れる酵素をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞を形１ｉｔ１ｉｉ： 換することである。このベクターは、また、所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配 列を含むことがで終る。あるいは、宿主細胞は所望の蛋白質をコードするＤＮＡ 配列を含む第２ベクターで同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒａ）すること ができる。

次いで、形質転換または同時形質転換された宿主細胞を、既知の薬物の濃度を増 加させて培養し、ここで薬物耐性細胞を選択する。そうでなければ毒性の薬物の 増加する濃度においで生存でかみ突然変異の細胞の出現に導く１つの普通の機構 は、薬物によって感染される酵素の過剰生産でることが発見された。最も普通に はこれはその特定の論ＲＮＡのレベルの増大から生じ、このレベルの増大はベク ターＤＮＡの増幅、それゆえ遺伝子のコピーによって頻繁に起こる。

また、阻害可能な酵素をコードするベクターＤＮＡのコピーの数の増加によって 薬物耐性が発生する場合、宿主細胞のＤＮＡ中の所望の蛋白質をコードするベク ターＤＮＡのコピーの数が同時に増加することが発見された。こうして、所望の 蛋白質の生産レベルは増加する。

このような同時増幅に最も普通に使用される系は、阻害されうる＃素として、ノ ヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を使用する。これは薬物ノトトレキセイト（Ｍ ＴＸ）によって阻害されうる。同時増幅を達成するために、ＤＨＦＲをコードす る活性遺伝子を欠く宿主細胞を、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列および所望の 蛋白質からなるベクターで形質転換するか、あるいはＤＨＦＲをコードするＤＮ Ａ配列および所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなるベクターで同時形質 転換する。形質転換または同時形質転換された宿主細胞を、増大するレベルのＭ ＴＸを含有する培地中で培養し、そして生存する細胞系を選択する。

同時増幅を生成する他の系が使用されたトだ、しかしながら、それらのいずれも ＤＨＦＲ，／ＭＴＸ糸として広く使用されてきていない。

現在利用可能な同時増幅系はある数の欠点に悩まされる１例えば、阻害されうる 酵素をコードする活性遺伝子を欠く宿主細胞を使用することが必要である。これ は、いずれかの特定の同時増＠系とともに使用できる細胞系の数を限定する傾向 がある０例えＩｆ、現在、ＤＨＦＲをコードする遺伝子を欠く既知の細胞系は１ つのみである。広範な種類の細胞系に適用万態である優性の選択可能なマーカー に基づく有効な同時増幅系を提供できたならば有利であろう。これは、種々のｍ 胞系の異なる処理および増殖の特性の利用を可能とするであろう。

他の細胞系において優性の選択可能なマーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を使用する 試みは、完全には満足すべきものではないことが証明された。

例えば、Ｍ　Ｔ　Ｘ　ｉｆｆ性突然変異のＤＨＦＲまたはＤＨＦＲ遺伝子は、非 常に強いプロモーターの制御下に、ある細胞の型において優性の選択可能なマー カーとして作用できるが、遺伝子の増幅についての選択によりて非常に高いコピ ーの数を達成することを不可能にしてきたような、高い濃度のＭＴＸを必要とす る。

追加の選択可能なマーカーを使用する同時形質転換は、また、欠点を有する０例 えば、これはプラスミドの構造の複雑さを増加することがあり、そしてＤＨＦＲ 遺伝子が活性であるクローンを区別するために形質転換された細胞の追加の時間 を消費するスクリーニングを必要とする。

既知の同時増ｍ系の他の欠点は、阻害可能な＃素をコードするＤＮＡ配列が一般 に翻訳後の制御下にないということである。したがって、増幅された系において Ｗｌ、素は、所望の蛋白質と一緒に、大量で生産される。

これは所望の蛋白質の生産のレベルの低下に導くことがあるであろう。

既知の同時増幅系の他の欠点は、既知の薬物に対する耐性が増幅以外の機構から 発生するということである１例えば、Ｄ　ＨＦ　Ｒ／Ｍ　Ｔ　Ｘ系において、Ｍ 　Ｔ　Ｘ　ｌ：対する親和性が野生型ＤＨＦＲより低い突然変異のＤＨＦＲを生 成する突然変異ＤＨＦＲ遺伝子を発生させることが可能である。このような突然 変異のＤＨＦＲが生ずる場合、それをコードする遺伝子を含有する細胞は、もと の宿主細胞よりもＭＴＸに対して耐性であり、それゆえ、増幅が起こってさえい ないが、選択されるであろう、さらに、増幅が起こっていない系統を排除するよ うに選択することが可能であるが、これは時間を消費する方法である。

遺伝子増幅のための従来の選択系の他の欠点は、毒性の＆物を必要とするという ことである。とくに、ＭＴＸは潜在的に発癌性である。

従来の増幅系の追加の欠点は、コピーの数を最大にするために、増幅の反復した 、例えば、３回以上の、時間を消費するラウンドを必要とすることである。

本発明の目的は、同時増幅のだめの先行技術の系の欠点の少なくとも一部分を党 服することである。

不発明の第１の面によれば、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）の完全アミノ酸配 列をフードする組換えＤＮＡ配列が提供される。

典型的には、組換えＤＮＡ配列は、真核生物、好ましくは哺乳動物のＧＳをコー ドする０便利には、組換えＤＮＡ配列は、ｇｍ類、例えば、マウス、ラットまた はことにハムスターのＧＳをコードする。

好ましくは、組換えＤＮＡは、第２図に示Ｔ配列のアミノ酸配列解読部分の配列 を有し、そして最も好ましくは、第２図に示す組換えＤＮＡ配列全体からなる。

本発明のこの面の紐換乏ＤＮＡ配列は、高い厳格条件下に、本発明のこの面の他 の組換えＤＮＡ配列または異なる種からのその一部とハイブリグイデージ３ンす る１つの種からの、このような配列を含む。

グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）は、ＡＴＰのＡＤＰおよびホスフェートを使用 して反応を推進させる、グルタメートおよびアンモニアの合成の原因となる万能 の増殖必須（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）　ａｔ素である。それはＴＣＡサイク ルを経るエネルギー機構を用いる窒素の代謝の統合において参加し、そしてグル タミンは細胞の型の広範な種類、多分大部分、のための主要な呼吸燃料である。

ＧＳはほとんどの高等動物のを椎細胞中に低いレベル（可溶性蛋白質の０．０１ ％〜０．１％）で存在し、そしである種の特殊化された細胞の型、例えば、肝細 胞、脂肪細胞お上びグリ子細胞中に高いレベル（全蛋白質の〉１％）で存在する 。

種々の調節シグナルは、細胞内のＧＳレベル、例えば、グルココルチコイドステ ロイド類およびｃＡＭＰＩ：影響を及ぼし、そして培地中のグルタミンはＡＤＰ リボシル化を経て翻訳後のＧＳレベルを調節するように思、われる。

すべての源からのＧＳを、種々の阻害剤、例えば、メチオニンスルホキシミン（ Ｍｓｘ）に＃、露する。この化合物は触媒プロセスの遷移状態の類似体として作 用するように思われる。広範に増幅されたＧＳ遺伝子が、Ｍｓｘ耐性について選 択された、ある哺乳動物の細胞系に変異型において得られた得られた［ウィルソ ン（Ｗｉｌｓｏｎ）　Ｒ，Ｈ，、遺伝（Ｈｅｒｅｄｉｔｙ）、土９，１８１、（ １９８２）；およびヤング　（Ｙｏｕｎｇ）　Ａ、　Ｐ、およびリンボルド（Ｒ ｉｎｇｏ！ｄ）　、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｖａ、　）、２５８．１１２６０−１１２６６．１９８３］ 、ｆｉ近、サンブース（５ａｎｄｅｒｓ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）　 ［サン　ブース（５ａｎｄｅｒｓ）　Ｐ、　Ｇ、およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏ ｎ）　Ｒ６Ｈ，、ＥＭＢＯジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ）　、３．、６５−７１ ．１９８４］は、Ｍｓｘ耐性チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓ ｔｅｒ）の卵巣（ＣＨＯ）細胞系ＫＧＩＭＳのデノムからのＧＳの遺伝情報を指 定するＤＮＡを含有する９、２ｋＦＫのＢｇｌＩＩ断片のクローニングを記載し た。しかしながら、この断片は完全ＧＳ遺伝子を含有すると思われず、そしてそ れは配列決定されながつた。

便利には、本発明のこの面の組換えＤＮＡ配列は、好ましくは逆転写によって誘 導された、ｅＤＮＡである。しかしながら、この組換えＤＮＡ配列は交互にある いは追加的にデ／ムＤＮＡの断片を含むことができる。

本発明によれば、第１の面の組換えＤＮＡ配列、またはその断片を、他の種から ＧＳ解読配列を得るためにハイプリダイデージ。ンブロープとして使用できるこ とが理解されるであろう。

その上、本発明の＃１面の組換えＤＮＡ配列は、医学および診断の方法、例えば 、被検体におけるＧＳのレベルが変更する病気の状態を検出する方法において使 用で終る。

しかしながら、本発明の第１面の組換えＤＮＡ配列の主な用途は、組換えＤＮＡ 技術において使用される同時増幅または優性の選択可能なマーカー系においてで あろうことが考えられる。

したがって、本発明の第２面によれば、本発明の第１面による組換えＤＮＡ配列 を含む組換えＤＮＡベクターが提供される。

好虫しくけ、このベクターは、形質転換体宿主細胞において、ＧＳをコードする 組換えＤＮＡ配列を発現することができる発現ベクターである。

このベクターは、さらに、ＧＳ以外の所望の蛋白質の完全アミノ酸配列をコード する組換えＤＮＡ配列を含むことができる。好ましい場合において、このベクタ ーは、形質転換体宿主細胞において、所望の蛋白質をコードする組換えＤＮＡ配 列を発現することができるであろう。

好ましくは、ＧＳをコードする組換えＤＮＡ配列はＷ！４ｗＪ可能なプロモータ ー、例えば、熱ＷＪｌｌ（ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ）プロモーターまたはメタロチ オネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーターの制御下にある。

本発明は、また、本発明の第２面に従うベクターで形質転換した宿主細胞を提供 する。

本発明の第２面に従うベクターは、選択されない遺伝子の同時増幅において使用 できる。したがって、本発明の第３面によれば、ＧＳ以外の所望の蛋白質の完全 アミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ配列を同時増幅する方法が提供され、こ の方法は、所望の蛋白質をコードする配列を含有しない本発明の第２面に従うベ クター、および前記所望の蛋白質をコードする組換えＤＮＡ配列を含む第２ベク ターで、宿主細胞を同時形質転換するか、あるいは所望の蛋白質をコードする紺 換えＤＮＡ配列を、また、含む本発明の第２面に従うベクターで、宿主細胞を形 質転換する、ことを含んでなる。

選択されない遺伝子の同時増幅において、本発明によるベクターを使用すると、 ある数の利点が得られる。

１つの利点は、ＧＳ遺伝子が、例えば、グルタミンの培地への添加により、調節 可能であるということである。したがって、ＧＳ遺伝子および非選択遺伝子を増 幅し、次いでＧＳ遺伝子を完全に調節する（　ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）す ることが可能である０次いで、宿主細胞は非常に少量の活性ＧＳを蓄積すると同 時に、なお、望むように大量の要求する生成物を生成するであろう。これは、ま た、細胞系の安定性を増加するという利点を有する。なぜなら、そうでなければ 、阻害剤を除去する場合、細胞系において増幅された配列を維持するとき、不安 定性に導（選択の圧力が低くなるであろうからである。

ＧＳ遺伝子を欠く細胞系は知られている。その上、このような細胞系を選択でき る手段が利用可能である。これらのＧＳ欠乏細胞系は、同時増幅手順において使 用できる。

しかしながら、驚くべきことにはかつ予期せざることには、内因性遺伝子増幅に よって生ずる耐性の頻度が最小であるＭｓｘのあるレベルに、耐性を付与するこ とによって、活性ＧＳ遺伝子を含有する細胞系にお％、％て有効な優性の選択可 能なマーカーとして、また、ＧＳ発現ベクターを使用できることが示された。こ のようなベクターは、高し１コピー数が達成されるように、細胞系におけるＭｓ ｘの濃度を増加することによって増幅できることが示された。これらのコピー数 は、従来の増幅系、例えば、ＤＨＦＲ／ＭＴＸを使用して達成される数より高く 、そしてわずかに２ラウンドの増幅において達成される。非常に高いコピー数を 達成する可能性は、所望の蛋白質をコードするｍＲＮＡの高いレベルを得ること を確実にするうえで有利である。

出願人はこの理論によって限定されることを欲しないが、増幅可能な優性の選択 可能なマーカーとしてのＧＳの有効性は、内因性ＧＳ遺伝子およびベクター誘導 ＧＳ遺伝子の相対的発現のレベルの結果である。

Ｍｓｘを使用する遺伝子の増幅についての選択は、はとんどもっばら、ベクター 誘導ＧＳ遺伝子が内因性遺伝子により優先的に増幅されたクローンの分離に導く 、内因性活性ＧＳ遺伝子を含有する宿主細胞を使用するとき、内因性ＧＳ活性を 減少または壊滅することにより、例えば、細胞系をクプチリルーｃＡＭＰおよび テオフィリンで処理することにより、選択を促進することが可能である。このよ うな減少および壊滅に感受性である細胞系は、３Ｔ３−Ｌ１ｍ胞系である。

その組換えＤＮＡ配列が同時増幅される所望の蛋白質は、例えば、組織プラスミ ノデン活性化因子（ｔＰＡ）であることができるが、この技術を使用して、他の 蛋白質、例えば、免疫グロブリンポリペプチド類（ＩＧ）、ヒト成長ホルモン（ ｈＧＨ）またはメタロプロイテナーゼ類の組織阻害剤（ＴＩＭＰ）をフードする 組換えＤＮＡ配列を同時増幅することができる。

好ましくは、この増幅は、ＧＳ阻害剤、最も好ましくはホスフィノトリシン（ｐ ｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）　＊たはＭｓｘの漸進的に増大するレベルに 対する耐性について選択することによって達成される。

本発明の同時増幅手順の他の利点は、Ｍｓｘは溶解度の高い安価に入手でさる生 成物であるということである。したがって、それは高い濃度で容易に使用して、 高度に増幅された配列を含有する系統の選択を可能とすることができる。

その上、Ｍｓｘの作用は選択培地へのメチオニンの添加によって増強することが できる。したがって、本発明の同時増幅手順において、選択はメチオニンを通常 のレベルより高いレベルで含有する培地中で実施されル、同様にＭｓｘの作用は 、通常のグルタメートのレベルより低いレベルによって増強することがで終る。

同時増幅に使用するベクターにおけるＧＳをコードする組換えＤＮＡ配列が調節 可能なプロモーターの制御下にある場合、ＧＳ配列の発現のためには、選択およ び増幅の間スイッチオン（ｓｗｉｔｃｈ　ｏｎ）　Ｉ、ｓ引続いて完全にｖ１４ ｇｌｉ（ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｅ）することが好ましい。

ある場合において、同時増幅後、選択した細胞系は選択手順において使用するＧ Ｓ阻害剤にある程度依存することがある。そうである場合、ＧＳ阻害剤の要求量 は培地にグルタミンを添加して減少することができ、これによってＧＳ活性は翻 訳後抑制される。

本発明の第４面に従えば、本発明の第２面に従うベクターを使用して、そのベク タで宿主細胞を形質転換し、これにより形質転換体細胞にＧＳ阻害剤に対する耐 性付与することによって、優性の選択可能なマーカーを提供することがで軽る。

本発明の第４面において使用する宿主細胞は、活性ＧＳ遺伝子を含有することが でさる。上に記載した理由で、選択は、なお、活性内因性遺伝子が存在する場合 でさえ、達成されうろことが発見された。同時増幅手順において本発明のベクタ ーを使用するとき得られる利点は、また、このベクターを優性の選択可能なマー カーとして使用するとき示される６本発明の同時増幅手順または優性マーカーの 選択に使用する宿主細胞は、哺乳動物、最も好ましくはハムスター、の細胞であ ることが好ましく、そしてチャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｗｓ ｔｅｒ）の卵巣（ＣＨＯ）−ＫＩまたはそれらの誘導体はとくに適する。

本発明の第５面に従えば、本発明の＄２面に従うベクターは、ＧＳ活性、活性Ｇ Ｓ遺伝子を完全に欠（があるいはそれが減少した宿主細胞を前記ベクターで形質 転換することによって、グルタミンを欠く培地中の生存能力を細胞系に付与する とき、使用することができる。この手順は、とくにハイブリドーマおよび骨髄Ｍ Ｎ胞およびそれらの誘導体に適用さされるが、排他的に適用されるわけではない ことが考えられる。

ある細胞、とくに骨髄腫細胞が培地中で増殖する密度は、グルタミンまたはグル タミン代謝の副生物についての要求によって限定されうろことが発見された。細 胞は直接に、あるいは追加の培地の変更の結果としてグルタミン依存性とするこ とができる場合、培地中の細胞のより大きい密度を達成することができ、これに よって細胞系によって培地にっ慇生産される蛋白質の量を増加することができる と信じられる。

したがって、ＧＳをフードする組換えＤＮＡ配列を、例えば、同時増幅、選択ま たはグルタミン依存性への形質転換のためのベクター中において使用すると、池 の同様な系、例えば、ＤＨＦＲ／ＭＴＸに基づく系よ’）ｊｌ＜はど優れている であろう、高度に柔軟なかつ有利な系が得られるであろうと信じられる。

ここで、本発明を、例示としてのみ、添付図面を参照しながら説明する： 第１図は、ｐＧＳＣ４５、λｇｓ１．１およびλｇｓ５．２１のクローンにおけ るＧＳ特異的ｃＤＮＡの制限地図を示し、ここで矢印から理解されるように、Ｇ Ｓの解読領域のヌクレオチド配列は主としてλｇｓ１．１のＭ１３サブクローン から得られ、そして種々の領域はλｇｓ５．２１およびｐＧＳＣ４５のサブクロ ーンを使用して確証された；第２図は、チャイニーズハムスターのＧＳ遺伝子に ついてのｃＤＮＡ配列（ａ：）および予測されたアミノ酸配列（ｂ：　）　、な らびにウシの脳のＧＳの刊行物に記載されたペプチド配列（Ｃ：）およびペプチ ド表示（ｄ：）を示す、配列（ｅ：）はλｇｓ１．１において使用したポリアデ ニル化部位を示す、アミノ酸配列残基はそれらの単一の文字のコードとして示さ れている；非相同のウシ残基は下の場合の文字で示されている。

塩基７より下の「△」はｐＧＳＣ４５インサートの開始を表わし、モしてｒ−− −−Ｊのしるしはは残基１１３５−１１３２に対して相補的なλｇｓｌ、ｉ中の プライミング配列を表わす、「〉」お上り「＜」の記号は、５”の非翻訳領域の ための計算した構造のステム中に含まれる塩基を表わす： 第３図は３つのＧＳ発現プラスミドの構造を示し、ここでａ）バクテリアのベク ターｐｃＴ５４中においてクローニングされた５Ｖ４０（Ｌ）の後期領域のプロ モーターの条件下に４．７５ｋｂのＧＳミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を含有 する、プラスミドｐＳＶＬＧＳ、Ｈ８，５ｋｂ）を示す、このＧＳ配列は完全解 読配列、単一のイントロンおよびポリアデニル化の推定部位の両者にまたがるほ ぼ２ｋｂの３′−７ランキングＤＮＡを含み、（ｂ）はプラスミドプラスミドｐ ＳＶ２．ＧＳ（５，５ｋｂ）を示し、これは５Ｖ４０（Ｅ）の初期領域のプロモ ーターの制御下にある１、２ｋｇのＧＳのｃＤＮＡ、ＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子 からのイントロンおよびＳＶ４０の初期領域のポリアデニル化シグナルを含有す る配列を含有し、そして（ｃ）はプラスミドｐＺＩＰＧＳ（１２，２５ｋｂ）を 示し、これはレトロウィルスのベクターρＺＰＩＰ　Ｎｅｏ　ＳＶ（Ｘ）中でク ローニングされたプラスミドｐｓｖ２．ＧＳからのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片（ＧＳＭ読配列配列びＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナ ルを含有する）を含有し、ここでラッチド（１ａｔｃｈｅｄ）ブロックは無関係 のマウスＤＮＡ配列　５１および３゛のＬＴＲをモロニー（Ｍｏ１ｏｎｙ）ねず み白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）の長い末端の反復として示し、黒（塗った（　ｆ ｉｌｌｅｄ）ブロックは、初期領域のプロモーターが、哺乳動物の細胞（ｎｅｏ ）中の６４１８に対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎＳからの遺伝子の発 現を指示するように、方向づけられた複製の起源にまたがるＳＶ４０断片を表わ し、そしてしるしを付さないブロックはＭＭＬＶからの追加のＤＮＡ配列を含有 する；第４図は、ｐＳＶＬＧＳ、１（ｔ＜＊ルＡ）！ｔたはｐｓＶ２　ＧＳ（ｔ ＜＊ルＢ）でトランス７エクシツンした細胞系のサザンプロットを示す、このプ ロットはＳＶ４０起源領域Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌ：討して特異的なＲＮＡプローブでプ ロービングする。パネルＡは２時間の露出を表わす。各レーンは次の細胞系から の２．５μｇのデノムＤＮＡを含有する。レーン１〜３は初期のトラス７エクタ ント（ｔｒａｎｓｆｅｅｔａｎｔ）からのＤＮＡを含有する：レーン１．５ＶＬ ＧＳ２；　レーン２．５ＶＬＧＳ５；　レーン３．５ＶＬＧＳ、９．レーン４〜 ６は、Ｍｓｘを使用する遺伝子の増幅についての選択の単一のラウンド後に、得 られた細胞系からのＤＮＡを含有するニレ−ＯμＭＲ）：　レーン６．５ＶＬＧ Ｓ９（５００μＭＲ）、　レーン７１ｉ、遺伝子の増幅についての選択の２ラウ ンドにかけた細胞系からのＤＮＡ。

５ＶＬＧＳ５（２ｍＭＲ）　、を含有する。パネルＢはほぼ２週間の露出である 。レーンは１〜６の各々は５μｇのデノムＤＮＡを含有し、そしてレーン７は２ ．５μｇを含有する。レーン１〜３は初期のトラス７エクタントの細胞系からの ＤＮＡを含有する：レーン１、ＳＶ２．Ｇ５２０；Ｌ／−７２、ＳＶ２．Ｇ５２ ５；　レーン３、ＳＶ２．Ｇ５３０．　レーン４〜６は、Ｍｓｘの高い濃度のに おけるに選択の単一のラウンド後の細胞系を表わす：レーン４、ＳＶ２．Ｇ５２ ０（１００μＭＲ）；　レーン、ＳＶ２．Ｇ５２５（５００μＭＲ）；　レーン ６、ＳＶ２．Ｇ５３０（５００μＭＲ）　、レーン７はｓ　Ｍｓｘ中の選択の２ ラウンド後に得られた細胞系、ＳＶ２．Ｇ５３０（１０＋ｉＭＲ）　、を表わす 。

第５図は、ｐｓＶＬＧｓ、１でトランス７エクシａンした細胞系から誘導したＲ ＮＡのプライマー発現分析を示す、推定の翻訳の「開始」におけるＲＮＡへ結合 するＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、全体のＲＮＡ調製物からＤＮＡを合 成した。示すＲＮＡ調製物は次の通りである：レーン１．５ＶＬＧＳ２；　レー ン２．５ＶＬＧＳ５：　レ−＞３．３０モルのＭｓｘに耐性のＣＨＯ−に１の誘 導体（野生型ＧＳ　ｍＲＮＡからの伸張を示すため）＋、ＭＷ、ＨｐａＩ　Ｉ分 子量マーカーで消化したｐＡＴ１５３゜ 添付図面および説明において示すヌクレオチドおよびアミノ酸の配列において、 次の略号を適切であるとき使用する。Ｕ＝ニラリジンＧ＝ニブアノシンＴ＝チミ ジン；Ａ＝７デノシン；Ｃ＝シストシン；本車京＝終止コドン；−は未知のヌク レオチド残基を意味する；Ａ＝アラニン；Ｃ＝システィン；Ｄ＝アスパラギン酸 ；Ｅ＝グルタミン酸；Ｆ＝７エ二ルアラニン；Ｇ＝ニブリシンＨ＝ヒスチジン： 　工＝インロイシン：に＝リシン；Ｌ＝ロイシン；Ｍ＝７チオニン；Ｎ＝アスパ ラギン；Ｐ＝ニブロリンＧ；グルタミン；Ｒ＝フルギニン；Ｓ＝セリン；Ｔ＝ス レオニン；Ｖ＝バリン；Ｗ＝トリプト７γン；Ｙ＝チロシン；Ｘ＝未知のアミノ 酸；ＰＢＳ＝１７酸緩衝化食塩水；　５ＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム；お上り ＥＤＴＡ＝エチェンジアミン四酢酸。

実施例 グルタミン不合培地において多工程選択手順を用い、突然変異の系統をチャイニ ーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）ＫＧＩ細胞系［それ自体はアメリカン◆タイ プ・カルチャーｔコレクシシン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、ＵＳＡ）　］　がらＣＣ Ｌ６１として得られるＣＨＯ−Ｋｌ系統がらの誘導体］から誘導した。突然変異 の細胞系、ＣＨＯ−ＫｉＭＳと表示する、は５ミリモルのＭｓｘに刈して耐性で ある。

突然変異の細胞系のサブクローン、ＫＧＩＭＳＣ４−Ｍ、を細胞のＤＮＡｍとし て使用した。サブクローンからの細胞をトリプシン処理ａＰＢＳ中で洗浄し、そ して２００Ｏｒ、ｐ、ｍ、において４分間沈殿させた。

沈殿物を１００ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０ミリモルのＥＤＴ Ａあ中に再患濁させ、モしてＳＤＳを２％に添加することによって溶菌した。Ｒ Ｎ７−ゼＡを５０μｇ／＋ｌに添加し、そしてこの溶液を３７℃で３０分間イン キュベーションした。プロテアーゼＫを５０μｇ／歇１に添加し、そしてインキ ュベージ５ンを３７℃で３０分ないし１時間続けた。この溶液を７エ／−ルで２ 回抽出し、次いで２回クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出 した。データをインプロパツールで沈殿させ、次いで２ミリモルのＥＤＴＡ、２ ０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、中に再Ｆｆ！Ｊ、濁させ、そして４ ℃で貯蔵した。

親のＫＧＩ、突然変異のＫＧＩＭＳおよびＫＧＩＭＳＣ４−Ｍ、および復帰突然 変異ＫＧＩＭＳＣ４−０からのデノムＤＮＡを、種々の制限エンドヌレ７−ゼで 消化し、アガロ−人ゲルの電気泳動にかけ、そしてニトロセルロースフィルター 上にサザンプロッテイングした。これらのプロットを、親ＫＧＩおよび突然変異 のＫＧＩＭＳＣ−４Ｍポリ（Ａ）ｍＲＮＡからつくったオリゴ（ｄＴ）−ブ２イ ムドｃＤＮＡでブロービングした。野生型ＫＧＩ　ｅＤＮＡをプローブとして使 用するとき、１系列の同一の帯がすべての細胞系からトラックＥ横切って見られ た。ＫＧＩＭＳＣ４−Ｍ突然変ｌ４ｃＤＮＡをプローブとして使用するとき、同 一の共通の帯が、突然変異ＫＧＩＭＳおよびＫＧＩＭＳＣ４−Ｍデ／ムＤＮＡに 対してｖｆ！４的な独特な帯と一緒に、すべてのトラックを横切って見られた。

すべてのデノムＤＮＡに対して共通の帝は、ＫＧＩ細胞から精製したｗｔＤＮＡ の制限＃素分析によって決定したとき、ミトコンドリア（ＩＩｔ）ＤＮＡのため であることが示された。ＧＳのための推定の解読配列の全体を含有できるであろ う、同定された最小のＤＮＡ断片は、８゜２ｋｂのＢｇｌＩＩ断片である。Ｐｓ ｔＩおよびＢｇｌＩＩで二重に消化すると、２つのＰｓｔＩ断片（２，１ｋｂお よび２．４ｋｂ）が無傷で残ることとが見られ、このことから両者のＰｓｔＩ断 片はＢｇｌＩＩ断片内に含有されることが示される。

３０ｕＢのＫ　Ｇ　Ｉ　Ｍ　Ｓ　Ｃ４ｋｉのＤＮＡをＢ［！ｌ　Ｉで完全に消化 し、そして断片を０．８％のアガロースデルの電気泳動によって分離した。増幅 された８、２ｋｂの帝は、臭化エチジウムの着色および長波の紫外線を定した。

ＤＮＡ帝はデル中にカットしたウェル（ｗｅｌｌ）中に溶離し、そしてフェノー ル抽出およびクロロホルム抽出により精製し、そしてキャリヤーｔＲＮＡを使用 してエタノール沈殿させた。精！！されたＤＮＡはＢａｎＨＩ渭化、バクテリア のアルカリ性ホスファターゼ処理したｐＵＣ９と結合した［ビエイラ（Ｖｉｅｉ ｒａ）　、Ｊ、およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、Ｊ、、遺伝子（Ｇｅｎｅ ’）　、１９．２５９−２６８．１９８２］、組換えＤＮＡを使用してＥ、　ｃ ｏｌｉをアンピシリン耐性に形質転換し、そしてＸｇａｌ上の白色クローンを分 析のために取り上げた。

１５０の組換えクローンが得られ、そしてこれらのすべてのうちの１１のＤＮＡ 分析は、それらのすべてが約８．ＯｋｂのＤＮＡインサートを有することを示し た。示差的コロニーのハイプリグイデージ９ンおよびＤＮＡスポットハイプリグ イデーシ謄ンは２つの組換えコロニーを同定し、これらは突然変異のＫＧＩＭＳ Ｃ４−ＭのｃＤＮＡプローブとの強いハイプリグイデージタンを与えたが、親の ＫＧｌ　ｃＤＮＡプローブとのシグナルを与えなかった０組換え体ｐＧｓ１およ びｐＧＳ２は、要求するＢｇｌ　Ｉ　Ｉ制限断片の挿入から期待されるｐｓｔＩ 制限パターンを生成した。ｐＧｓＩ　ＤＮＡを使用した合計の細胞質およびボ１ バＡ）ＫＧＩＭＳＣ４−Ｍ　ＲＮＡからＧＳ　ｍＲＮＡを交雑選択（ｈｙｂｒｉ ｄ　５ｅｌｅｃｔ）シた。３ｆ！択した論ＲＮＡを、ＫＧＩおよびＫＧＩＭＳＣ ４−Ｍの合計の細胞質ＲＮＡおよび［２５Ｓ］メチオニンｆｆ１Ｊポリペプチド と一緒に翻訳し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分難した。ｐＧＳ１ｉ択ｍＲＮＡの主要な 翻訳生成物は、４２　０００ｋＤ　ＭＷのポリペプチドであり、これはＫＧＩＭ ＳＣ４−Ｍｉｌｌ訳において増幅されたポリペプチドと同時に移動する。

したがって、ｐＧｓｌは、ＧＳ遺伝子の少なくとも一部を含有するデノムＣＨＯ ＤＮＡを含有する。

研究のこの部分は、サンダース（５ａｎｄｅｒｓ）およびウィルソン（Ｗｉｔｓ ｏｎ）　（ｌｏｃ、ｃｒｔ、　）に記載されているようにして笑施した。

ＫＧＩＭＳＣ４−ＭからのＧＳ遺伝子の３゛末端を含有する３、５ｋｂのＨｉｎ ｄｌ　Ｉ　Ｉ断片を、ｐＧｓｌからｐＵＣ９中にサブクローニングしてプラスミ ドｐＧｓ１１３を形成した。

ＫＧＩＭＳＣ４−Ｍの５ａｕ３Ａ部分的消化物をλＬ４７のＢａｍＨＩ部位中に 部位−ニングすることによりで、クローンのバンクを調製した。

組換え体を１）ＧＳＩへのハイプリグイデージョンについて選択した６選択した λＬ４７紐換え体からのＢａ論ＨＩ−ＥｃＲＩ断片を、ｐＵＣ９中にサブクロー ニングしてプフスミドｐＧＳ２３３５を形成した［ハイワード（Ｈａｙｗａｒｄ ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　、１４．９９９−１ ００８．１９８６］。

ｅＤＮＡのライブラリーを、標準の手順を使用して、ｐＢＲ３２２およオリゴ− ｄＴブ２イムド逆転写酵素を使用してｅＤＮＡに転化し、そしてＲＮアーゼＨ手 順を使用してｄｓＤＮＡをツ＜ッた［グプフー（Ｇｕｂｌｅｒ）、Ｕ、およびホ フマン（Ｈｏｆｆａｎｎ）　、Ｖ、、遺伝子（Ｇｅｎｅ）　、２５．２６３−２ ６９．１９８３］　、ｄｓＤＮＡはＣ残基でティリングする［ミチエルシン（Ｍ ｉｃｈｅｌｓｏｎ）　、　Ａ、　Ｍ、お上ジオ−キン（０ｒｋｉｎ）　、Ｓ。

Ｈｏ、ジャーナル・オプ・バイオロジカルΦケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｗ、）、２５７．１４７７３−１４７８２．１９８２］ｔ、、Ｇ− ティルトｐＢＲ３２２にアニーリングし、セしてＥ、　ｃｏｌｉ中に形質転換す るか、あるいはメチル化しそしてＥｃｏＲＩリンカ−に結合した。リンカード（ ｌ１ｎｋｅｒｅｄ）　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そしてセフアデツクス（５ ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　７５りｏｖトゲラフイーによりＴＮＥＳ（０，１４モル のＮＪＬＣＩ、０．０１モルのＦリス、ｐＨ７，６，０，００１モルのＥＤＴＡ 、０．１％のＳ、ＤＳ）中においでリンカ−を除去した。４＃除した体積中のり ンカードＤＮＡをエタノール沈殿により回収し、そしてＥｃｏＲＩ切［ｒλｇｔ ｌＯＤＮＡに７ニーリングした。生体外パフケーシング後、組換え体７アーノを 高い頻度の溶原性の株Ｅ、ｃｏｌｉ上に配置だ［ツイーン（Ｈｕｙｈｎ）　、　 Ｔ、Ｖ、、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）　、Ｒ，Ａ、およびディビス（Ｄａｖｉｓ）　 、Ｒ，Ｗ、　、「ＤＮＡクローニング技術（ＤＮＡｅｌｏｎｉｇ　ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ）　Ｉ　Ｉ：　実際のアプローチ（Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒ 。

ａｅｈ）　Ｊ　、グロウｔ（−（Ｇｌｏｖｅｒ）　、Ｄ、　Ｍ、　１１１ｉＩＳ Ｉ、　Ｒ，Ｌ、プレス、オックス７才一ド、１９８５］。

約５０００コロニーおよび２００００のプラークを、ＧＳデノム配列のｐＵＣサ ブクローンから誘導されたニック翻訳プローブを使用して、二シロセルロースフ ィルター上でスクリーニングした。ｐＧＳ２３３５からのｌｋｂのＥｃｏＲｒ　 −Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片を５゛プローブとして使用し、そしてｐＧｓ１１３の３． ５ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片の全体を３゛プローブとして使用した。陽性の コロニーからのプラスミドをＤＮＡの小規模の調製物の制限消化により分析し、 そして最長のクローン（ｐＧＳＣ４５）をそれ以上の分析のために選択した。

陽性のλクローンをプラーク精製し、５０００ｍｌのＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００の 液体培養物中で増殖させ、そしてプラークをＣｓＣｌの段階勾配で精製した。Ｄ ＮＡをホルムアミド抽出により調製した［ディビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｒ，Ｗ、　 、ポスティン（Ｂｏｓｔｅｉｎ）　、ｌ）、およびロス（Ｒｏｔｈ）　、Ｓ。

Ｒｏ、アドバンスト・バクチリアル・ジェネテイ７クス（ＡｄｖａｎｃｅｄＢａ ｃｔｅｒｉａ！　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、：ｌ−ルド番スプリングｅハーバ−（ Ｃｏ１ｄＳ　ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、１９８０１．１＆長のインサートを もつクローンをＥｃｏＲＩ消化によって同定し、そしてそれ以上の分析および配 列決定のために、インサートをｐＡＴ１５３およびＭ１３纏ｐＨ７ｙ−り中１こ サブクローニングした。

ＧＳ遺伝子の５°末端から誘導されたプローブで、まず、コロニーまたはプラー クを入クリーニングした。この分析からの陽性のコロニーまたはプラークを取り 上げ、そして遺伝子の３゛末端のほとんどを包含する長いプローブで再スクリー ニングした。このようにして、長いまたは多分全長のインサートをもつクローン が選択され、そして５゛末端につでの時間を消費する再スクリーニングは回１１ されるであろうことが期待された。いくつかのプラスミドのクローンお上りλ８ ｔｌＯＯ組換え体が、この手段によって誘導された。制限酵素の消化および部分 的配列決定によるプラスミドのクローンの１つ（ｐＧＳＣ４５）をさらに分析す ると、それは約２．８ｋｂのインサートおよび３１末端にポリＡ配列を有するこ とが明らかにされた。ノザンプロットによると、ＧＳについての主要なｍＲＮＡ はほぼこの大きさであり［サンブース（５ａｎｄｅｒｓ）およびウィルソン（Ｗ ｉｌｓｏｎ）　、（ｆｏｅ、ｃｒｔ、　）　］　、それゆえｐＧＳＣ４５中のイ ンサートは潜在的にこのｍＲＮＡの全長のコピーであることが示される。

２つのλクローン（λｇｓ１．ｉおよびλｇｓ５．２１）は、それぞれ、１４５ ６０ｂ、お上り１１７０ｂｐのインサートを有した。ｐＧＳＣ４５中のｃＤＮＡ のインサート、λｇｓ１．１およびλｇｓ５．２１、の制限地図および整列は第 １図に示されている。明らかなように、λクローン中のインサートは３１末端に おいてプラスミドのクローンよりもかなり短く、そしてより小さいｍＲＮＡの１ つのｃＤＮＡコピーを表わすことができる。

λｇｓ１．１中のインサートは５°末端において多少２００塩基対な延長する。

グルタミンシンセターゼの遺伝情報を指定するのヌクレオチド配列を、ｐＧＳＣ ４５のＭ１３のサブクローンおよびλＨｓｌ、１およびλｆｉｓ５゜２１のサブ クローンから得た。このヌクレオチド配列を第２図に示す。

多少確認的な配列を、また、ゲノムクローンｐＧＳ１から得た。ヌクレオチド１ ４７−１６６に対して相補的なオリゴヌクンオチドをもつＧＳ膳ＲＮＡのプライ マーの延長は、１６６のヌクレオチドの主要な延長生成物を与えた。これは、ｐ ＧＳＣ４５がｍＲＮＡの５゛末端かられずかに６または７のヌクレオチドを欠く だけであることを示す、マクサム−ギルバー）　（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ ）の配列決定によるプライマー伸張生成物のヌクレオチドの配列決定はこれを確 証するが、最初に２つの塩基は決定できなかった。

５ゝ末端においてｐＧＳＣ４５よりほぼ２００塩基だけ長い、λｇｓ１．１の５ °末端における配列は、このクローン（＾ｇｓ５，２１より３１末端において約 １５０塩基だけ短い）の３゛末端における配列に対してかなり逆位の相同性を示 した（第２図参照）、これらの追加の配列は多分クローニングアー千７７クトで あり、ＲＮアーゼＨ手順を使用したにもかかわらず、ヌクレオチド１１３２−１ １３７に対するそれらの相補的な経て、ヌクレオチド６−１プライミングＤＮＡ 合成のために、第２ｇ合成の間に発生する。複製が修飾ＧＳ遺伝子の転写から発 生し、引続いてクローニングされた修飾−ＲＮＡを生成することを排除で外ない が、プライマーの伸張の結果は、１６６ヌクレオチドより長い５′末端をもつ、 なんらかの主要ｍＲＮＡ種が存在することを示唆しなかった。

ＣＨＯグルタミンシンセターゼのための推定されたアミノ酸配列を第２図に示す 、ＮＨ，末端はウシ脳グルタミンシンセターゼとの相同性によって同定した［ノ ョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）　、Ｒ，Ｊ、およびビスキエウイズ（Ｐｉｓｋｉｅ ｗｉｃｚ）　、Ｄ、　ｓバイオヒミカ・エト・バイオフィシ力・アクタ（Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　、８２７．４３９−４４６．１９８５ １、開始ＡＵＧは真の開始コドンについて見出される精確なＣＣＡＣＣ上流コン センサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列をたどり、そしてその次にプリンがくる（ すなわち、ＣＣＡＣＣＴＧＧ）、（位１［１４における他のＡＵＧコドンは同一 の基準によって好適な関係になく、そしてその次に７レーム２１ヌクレオチドの 下流において終止コドンがくる。）ＧＳ蛋白質の予測されたアミノ酸組成は、他 の推定と一致して、４１，９６４の分子量を与える（Ｎ−末端アセチル化または 他の翻訳後の修飾を許さない）、蛋白質の塩基の性質は、アスパルテートお上び グルタメートのそれより過剰のフルギニン、ヒスチジンおよびリジンの残基にお いて反映される。

推定したアミノ酸配列は、ウシおよび他のペプチドの配列決定によって得られた ＧＳペプチドとのきわめてすぐれた相同性を示し、精確なりＮＡ配列（指示する 。（このアミノ酸配列は、臭化シアンペプチドのすべておよびウシＧＳについて 刊行物に記載されたトリブチツクペプチドの大部分のオーダーリング（ｏｒｄｅ ｒｉｎｇ）を許す）６ＣＨＯ配列は、マタ、ｇ着ニハ残基３１７−３２５、（Ｎ ＲＳＡＳＩＲＩＰ）、においで、シアノバクテリウムＡｎａｂａｅｎａからのＧ Ｓ配列と多少の相同性を示し、これらはＡｎａｂａｅｎａ残基３４２−３５０に 対する精確な合致である。さらに、関係する配列は植物から分離したグルタミン シンセターゼにおいて見出される。

チャイニーズハムスターのＧＳについての完全ｃＤＮＡクローンお上びデノムク ローンへのアクセス（ａｃｃｅｓｓ）　ｌ土、グルタミンシンセターゼのアミノ 酸配列の推定を可能としたばかりでなく、かつまた遺伝子内にイントロンの位置 およびその蛋白質の構造的領域の遺伝情報を指定するエクソンに対するそれらの 関係の詳細な分析を可能とした。

ＧＳミニ遺伝子を、ｅＤＮＡ配列（蛋白質の解読領域の大部分におよぶ）および ｒツム配列［これは解読配列の３゛末端を改造（ｒｅｃｒｅａｔｅ）する】から 構成した。ｐＧｓｌの３，４ｋｂのＥｃｏＲＩ　Ｓｓｔ　Ｉ断片は、単一のイン トロン、同定された両者のｍＲＮＡａの３°非翻訳領域のすべてをコードし、そ して約２ｋｂの３゛７ランキングＤＮＡを含有する。

このＤＮＡ断片をｐＣＴ５４のＥｃｏＲＩ部位およびＢａ匍ＨＩ部位の間でクロ ーニングして［エムティシ（ＥＩＩ＋ｔａＢｅ）　ｂ、プロシーディンゲス・オ プ・ナシタナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（ＰＮＡＳ）−ＵＳＡ、８０ ．３６７１−３６７５．１９８３］　ｐＣＴＧＳをつくった。

次いで、λｇｓ１．１（７）０．８ｋｂ＋７）ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＣＴＧＳの ＥｃｏＲ工部位に、正しい向きで挿入して、遺伝子の５“末端を改造した。ＳＶ ４０の後期プロモーターを、ＳＶ４０の３４２［）、のＰｖｕＩ　Ｉ　＝Ｈｉｎ ｄＩＩＩ断片（複製起源を含有する）を上のプラスミドのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部 位に適当な向きで挿入することによって、上流でクローニングして、第３図（、 ）に示すプラスミドｐＳＶＬＧ８．１を生成した。

哺乳動物における効率よい発現を指示するＳＶ４０からの配列の間にに、ＧＳ解 読配列のすべてを含有するｅＤＮＡを配置することによって、別のＧＳ発現構成 体をツ（ッた。λｇｓｌ、１のＮａｅＩ　ＰｖｕＩＩ断片を、ｐＳ　Ｖ　２　、 　ｄｈｆｒ中（’）ｄｈｆｒ配列［スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）　ｓ　Ｓ 、　ｓムリ〃ン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）　、Ｒ，およびベルブ（Ｂｅｒｇ）　、Ｐ 、　、モレキユラー・アンド−＋−ルフー・バイオロジー（Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、　）、１．８５４−８６４．１９８１１のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位と ＢｇｌＩＩ部位との間の位置においてクローニングして、第３図（ｂ）に示すプ ラスミドｐＳＶ２、ＧＳを形成した。

ＧＳ解読配列をモロニーネズミ白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター の制御下に配置するために、ｐＳＶ２．ＧＳからのＨｉｎｄＩＩ−Ｂａｉ＊ＨＩ 断片（第３図す参照）をｐＺＩＰ−ＮｅｏｐＳＶ（Ｘ）のＢａｍＨ工部位に導入 した［セプ：ｙ（５ｅｐｋｏ）　、Ｃ，Ｌ、、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｂ 、Ｅ、およびムリ〃ン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）　％　Ｒ，Ｃ，、細胞（Ｃｅ１ｌ） 　、３７．１０５３−１０６２．１９８４］。

ｐｔＰＡ３，１６の３．ＯｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　−Ｂａ＠ＨＩ断片［ステ ７エンス（５ｔｅｐｈｅｎｓ）　、Ｐ、　Ｅ、　、ベンディグ（Ｂｅｎｄｉｇ） 　、Ｍ、　Ｍ、およびヘンシェル（Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ）　、Ｃ，Ｃ０，１１４ 製にお（する原稿（ｍａｎｕｓｅｒｉｐｔ　ｉｎ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）　 ）は、組織プラスミ／ゲン活性化因子の遺伝情報を指定するｃＤＮＡを含有し、 この下流にはＳＶ４０の小さいｔ−イントロンおよびＳＶ４０の初期領域の転写 からのポリアデニル化シグナルが存在する。この断片を３４２ｂｐのＳＶ４０　 ＰｖｕＩ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片との３方結合によりｐＳＶＬＧＳ、１ のＢａｍＨＩ部位中に部位−ニングし、こうしてｔＰＡ遺伝子をＳＶ４０の初期 のプロモーターの制御下にした。これは２つのプラスミド、ｐｓＶＬＧｓｔＰＡ ｌ　６（ここでＧＳおよびｔＰＡ転写単位は直列に存在する）およびｐＳＶＬＧ ＳＬＰＡ１７（ここで２つの遺伝子は反対の向きである）を発生した。

ＡＴＣＣから得たＣＨＯ−ＫｌｊａＩ胞をグラスボウ（Ｇｌａｓ７ｏｗ）イーグ ル変性培地（ＧＭＥＭ）中で増殖させ、この培地はグルタミンを含之ず、そして １０％の透析胎児小生血清（ＧＩＢＣＯ）、１　ミリモルのピルビン酸ナトリウ ム、非必須アミノ酸（１００μモルのアラニン、アスパルテート、グリシンおよ びセリン、および５ｏｏμモルのアスパラギン、グルタメートおよびプロリン） およびヌクレオシド（３０μモルの７デノシン、グアノシン、シチジンおよびウ リジン、および１０μモルのチミジン）が補充されていた０選択のため、Ｌ−メ チオニンスルホキシミン［シクマ（Ｓｉｇｍ）からのＭｓｘｌを適当な濃度で添 加した。はば３×１０１細胞／１００ｍｍベトリ皿を、リン酸カルシウム同時沈 殿手順に従い、１０μｇの環状プラスミドＤＮＡでトランス７エクシＢンした［ グラハム（Ｇｒａｈａｍ）　、Ｆ、　Ｌ、およびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｆｂ、　Ａ、 Ｊ、　、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、５２．４５６−４６７．１９８３ ］、）ランス７工クシＢン後４時間に、細胞をグリセロールＷＪｇｌ（血清不合 培地中の１５％のグリセロール、２分）に暴露した１７０ス）（Ｆｒｏｓｔ）　 、Ｅおよびウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）　、Ｊ、　、ウィルス学（Ｖｉｒ ｏｌｏＨｙ）　、９１．３９−５０．１９７８］、１日後、トランスフェクショ ンした細胞に新鮮な堺択培地を供給し、そして生存するコロニーを２〜３週以内 で見ることができた。

細胞培養上澄み中のｔＰＡ活性を、比較のためＬＰＡ楳準（Ｂｉｏｐｏｏｌ）を 使用して、アイプリンーアがロース板のアッセイにより測定した。付着した細胞 を典型的には血清不合培地中で洗浄し、そして血清不合培地中で３７℃において １８〜２０時間インキュベージタンした。アッセイのための培地の試料を取り出 した後、細胞をトリプシン処理し、そして生存しうる細胞を計数した１次いで、 結果をｔＰＡ／１０＠細胞／２４時間の単位として表わした。ペトリ皿中の細胞 のコセニーを、フイプリンアがロースデルで直接覆うことによって、ｔＰＡの生 成についてアッセイした。

これらの実験において使用したグルタミン不合培地において、特異的ＧＳ阻害剤 、Ｍｓｘ、はＣＨＯ−Ｋｌ細胞に対して３μモル以上の濃度において毒性である 。ＧＳ発現プ２スミドが機能的ＧＳを生体内で合成で各るかどうかを試験するた め、各プラスミドをリン酸カルシウム仲介トランス７エクシａンによってＣＨＯ −に１細胞中に導入し、そしてＭｓｘのより高い濃度に対する耐性を付与する能 力について試験した。

しかしながら、Ｍｓｘｌ：：対する耐性は、また、内因性ＧＳ遺伝子の増幅によ り（または他の未知のｍ、構により）発生することができる。したがって、ＧＳ 発現ベクターを優性の選択可能なマーカーとして有用とするためには、それは、 自発的耐性の突然変異の頻度より大きい頻度で、Ｍｓにの特定の濃度に対する耐 性を付与しなくてはならない、自発的に耐性のクローンが検出される頻度は、選 択に使用するＭｓｘの濃度に依存する。

こうして、例えば、ＣＨＯ−に１細胞における遺伝子の増幅は１０μモルのＭｓ ｘにおいて平板培養したほば１生存コロニー／１０４細胞に導くが、この頻度は 、細胞を２５μモルのＭｓｘに対する耐性について選択する場合、１／１０７よ り低く減少する。

リン酸カルシウム共沈技術を使用するＣＨＯ細胞のトランス７エクシ１ンの頻度 は、一般に、１／１０３より低いことが報告されているので、Ｍｓｘの濃度範囲 は１０μモルを越えるように選択のために選んだ１表１の結果が示すように、３ つのＧＳ発現プラスミドのいずれかを使用するトランス７エクシタンは、１５μ モルまたは２０μモルにおいて選択したとき、偽トランス７エクシａンした（　 ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞において検出されたバラフグ２フンド の頻度よりも、よりも大きい数のＭｓｘ耐性コロニーの生存に導（。

ｐＺＩＰＧＳはバックグラウンドより上に生存するコロニーの数をわずかに増加 するだけである。したがって、このベクターは劣った選択可能なマーカーであり 、そしてそれ以上研究しなかった。しかしながら、ｐｓＶ２．ＧＳおよびｐｓＶ ＬＧｓ、１の画者は、この細胞系において有効な優性の選択可能なマーカーとし て作用するように思われる。これらの実験において、いずれかのプラスミドでト ランス７エクシ１ンした後、耐性コロニーが発生する頻度は、選択を１５〜２０ μモルのＭｓｘで実施した場合、内因性増幅による頻度の少なくとも２５倍であ る。ｐＳＶ２゜ＧＳｉ：つぃて３．８／１０’Ｈ１ｌＦｄ＊でｇよｔｌｐＳＶＬ ＧＳ、１についで２゜５／１０’細胞までの見掛けのトランスフェクションの頻 度が観測された。３つのプラスミドの間の見掛けのトランス７エクシ３ンの頻度 の差は、ＧＳｔ′＃液遺伝子が上の３つのベクターにおいて発現される効率の差 を反映しているように思われる。

トランス７エクシ１ンの効率の独立の推定はｐＺＩＰＧＳの場合において得るこ とがでトる。なぜなら、このベクターは、また、抗生物質６４１８に対する耐性 を付与するｎｅｏ遺伝子を含有するからである。Ｍｓｘの代わりに０４１８を使 用する選択は、１４〜２０μモルのＭｓｘにおける選択によって得られるより実 質的に高いトランス７工クシツン頻度を生ｅ（表１参照ン、これによってこのベ クターはａｎによって取９上げられつつあることが示され、モしてＧＳ遺伝子が このベクターにおいて比較的劣って発現されるという見解を強化する。

表１ ＣＨＯ−Ｋｌ細胞における構成体の見掛けのトランス７エクシｎンの頻度は、Ｍ ｓｘの種々の濃度における生存するコロニーの数７１０６のトランス７エクシａ ンした細胞によって、あるいは０．８ｔａｇ／ｍｌのＧ４１８に対する耐性によ って決定したＣ結果は３つのトランス７エクシ１ン、（ｉ）　、（ｉｉ）および （１ｉｉ）からのものである）。

ベクター　１５μモル　２０μモル　２５μモルｐＳＶＬＧＳ、１ （ｉ）　１３．６　９．２　５．６ （１ｉｉ）　２４．５　１０．０ ｐｓｖ２．ＧＳ （ｉ）　２６．０　１８．０　１２．０（ｉｉ）　３２．０　７．４ （１ｉｉ）　３８．０　２９．Ｏ ｐｚ　Ｉ　ＰＧＳ （ｉ）　０．７２　０．５　０ （ｉｉ）　１．１　０ （ｉ）　０．４７　０．２４　０ （ｉｉ）　０．２９　０ （ｉｉｉ）　１．０　０ ０　０　０　〇 −−−〇 Ｍｓｘ耐性コロニーの発生が、インブー／　）（１ｎｐｕｔ）　ＤＮＡのある非 特異的作用によるのではなく、トランス７エクシシンしたＧＳ遺伝子の発現によ ることを確認するために、試験できる３つの推定が存在する。第１に、Ｍｓｘ耐 性細胞はベクターＤＮＡを含有すべきである。第２に、新規なＧＳ　ｍＲＮＡは これらの細胞系において生成されるべきである。

なぜなら、使用する異質プロモーターは、長さが自然ＧＳ　ｍＲＮＡと５′末端 において異なる、ＧＳ、ｍＲＮＡの形成を指示するであろうからである。第３に 、活性なトランス７エクシミンしたＧＳ遺伝子はＭｓｘの増大した濃度にける選 択によって増＠されるべきである。したがって、これらの推定は次のようにして 試験した。

３つの細胞系をｐＳＶＬＧＳ、１によるトランス７エクシ３ン後に発生する個々 のコロニーから確立し、そして３つの細胞系をｐＳＶ２．ＧＳでトランスフェク ションしたコロニーから確立した。細胞系５ＶＬＧＳ２および３ｖＬＧＳ５は２ ０μモルのＭｓｘに対して耐性であり、そして５ＶＬＧＳ９は３０μモルのＭｓ ｘに対して耐性である。細胞ＭＳＶ２゜Ｇ５２０％ＳＶ２．Ｇ５２５おＪ：（７ ＳＶ２．Ｇ５３０ｊｉ、それｒれ、２０．２５および３０μモルのＭｓｘｌ：対 して耐性である。

ＤＮＡをこれらの細胞系の各々からＷＲ製し、そしてＤＮＡ試料のサザンプロッ トを５Ｖ４０−ＯＲＩ領域のＤＮＡに対して特異的なＰＲＮＡプローブとハイブ リグイデージＨンした。第４図に示す結果から明らかなように、Ｍｓｘ耐性細胞 系のすべてはベクターＤＮＡを含有する。各細胞中に存在するベクターのコピー の数は、同一デルに装填した、ベクターＤＮＡの標準の調製物の既知の量との比 較によって推定することができる。これから明らかなように、５ＶＬＧＳＩ！胞 系のすべては約５００コピー／Ｈ１＆までのベクターの多数のコピーを含有する （表２参照）。

ＳＶ２．ＧＳ細胞のすべては、また、ベクターＤＮＡを含有するが、すべての場 合において、ベクターＤＮＡのわずかに単一のコピー／細胞の組込みが存在した ように思われる。

ｐＳＶＬＧＳ、１を用いて得られた結果は高度に予測されないことに注意すべき である。現在まで、このように高いコピー数が単にトランス７エクシシンによっ て生成されたという報告された場合は存在しない。

このコピーの大軽い数は、宿主細胞のＤＮＡ中へ大きい数のベクターＤＮＡのコ ピーの組込みに好適なりＮＡ配列がベクター中に存在するためであると信じられ る。

組込まれたベクターのこのような大きいコピー数は、ｐＳＶ２．ＧＳを使用して ＠測されなかった。したがって、大きいコピー数のトランス７エクシ１ンの部分 的原因となるＤ　Ｎ　Ａ配列は、インドロン中に、あるいはｐＳＶＬＧＳ、１ベ クターまたは隣接するベクターの配列のゲノムＧＳ　ＤＮＡ部分の３゛領域中に 見出されると信じられる。しかしながら、コピーの数は、また、多分選択のため に使用したＭｓｘの特定のレベルに対する耐性を獲得するために擁する発現のレ ベルを反映する。

明らかなように、この大きいコピー数のトランス７工クシ磨ン配列は、ＧＳをコ ードする配列とともに、かつまた他の調製配列、例えば、選択可能なマーカーを コードするものまたは増幅可能な遺伝子とともに使用されるであろう、なぜなら 、それは、それ以上の遺伝子の増幅についての選択の効果に加えて、コピーの数 、それゆえ所望遺伝子の発現のレベルを増加する手段を提供するであろう。

したがって、本発明のそれ以上の面に従えば、ｐＳＶＬＧＳ、ｉ中に存在し、宿 主細胞中へのベクターＤＮＡの大きいコピー数のトランス７エクシａンを達成す る原因となる組換えＤＮＡ配列、あるいは同一の機能を提供するであろう他の組 換えＤＮＡ配列が提供される。

Ｍｓｘ耐性細胞系によって生成されるＧＳ　ｍＲＮＡの５゛末端を、プライマー 伸張分析によって分析した。長さが１９塩基の合成オリゴマーを合成した。これ は蛋白質解読領域の開始付近におけるｍＲＮＡの領域に対してハイブリグイデー シコンする。逆転写酵素は、このプライマーを抽出ＧＳ　輸ＲＮＡがら１４６ｂ ｐの長さに伸張し、そしてｐＳＶＬＧＳ。

１　ｒａＲＮＡの場合において転写の開始からほぼ４００ｂｐのｆｓ、さに伸張 するであろう。ｐＳＶ２．ＧＳから推定されたＤＮＡは自然謡ＲＮＡよりも短く 、それゆえプライマーの伸張反応において「ドロップ−オフ（ｄｒｏｐ−ｏｆｆ ｓ）　Ｊによってマスクされることができ、そして分析しなかった。

第５図の結果が示すように、野生型−ＲＮＡより長いＧＳ特異的−ＲＮＡｆｙｔ ＳＶＬＧＳ細胞系においで事実生成され、このことはトランス７エクシ房ンされ た遺伝子がこれらの細胞において転写されるという結論を強く支持する。逆転写 はプライマーを推定した長さに伸張せず、多分このＲＮＡの５゛非翻訳領域にお ける二次構造によって逆転写が阻害されるために、少なくとも３つの主要部位に おいてドロップオフするように思われる。

ｐＳＶＬＧＳ、１でトランスフェクシヨンした３つのＭｓｘ耐性細胞系およびｐ ＳＶ２．ＧＳでトランスフェクションした３つの細胞系を、種々の濃度のＭｓｘ において増殖して、ＧＳ遺伝子んち増幅について選択した。各細胞系について、 はぼ１０５＠胞を１００μモル、２５０ｐモル、５００ｐモルおよび１ミリモル のＭｓｘにおいて平板培養した。１２日後、各細胞系において生存するコロニー をＷｔ察できるＭｓｘの最大濃度は次の通’）　であった：　ｓｖｉ、ａｓ２． ５００ｐモル；　５ＶＬＧＳ５．２５０ｐモル；　５ＶＬＧＳ９．５００ｐモル ：　ＳＶ２．Ｇ５２０，１００ｐモル：　ＳＶ２．Ｇ５２５．５００／ｊモル； 　ｔ−ｔ！（７ＳＶ２．Ｇ５３０゜５００ｐモル。各細胞系から得られた最も高 度に耐性のコロニーをプールし、そしてこれらのＭｓｘｉｔ性プールの２つを第 ２ラウンドの増幅にがけた。５ＶＬＧＳ２（５００ｐＭＲ）　お、１−ｔ７ｓＶ ２．Ｇ５３０（５００ｐＭＲ）を１ミリモル（誼Ｍ）、５ミリモル、１０ミリモ ルおよび２０ミリモルのＭｓｘ中において平板培！！（ｐｌａｔｅ　ｏｕｔ）　 した、１５−２０日後、コロニーは５ＶＬＧＳ２（５００ｐＭＲ）を含有する平 板上に２ミリモルまでのＭｓｘにおいて出現し、モしてＳＶ２．Ｇ５３０（５０ ０ｐＭＲ）の場合において１０ミリモルまでのＭｓｘにおいて出現した。これら から、２つの高度に耐性の細胞系５ＶＬＧＳ２（２驕ＭＲ）およびＳＶ２．Ｇ５ ３０（１０ｍＭＲ）を確立した。これらの高度に耐性の細胞系の各々は、多数の 独立の増幅の事象から発生した細胞を含有した。

Ｍｓｘ耐性の細胞系のすべてから＊製したＤＮＡのサザンプロットを、ＳＶ４０ 　０ＲＩ−領域ＤＮＡに対して特異的なプローブとハイプリグイデージシンした 。この結果は第３図に示されている。プラスミドＤＮＡの標準の調製物との比較 から、コピー数を決定することができた。これらを表２に示す。

＃２ラウンドの選択後、すべての３つの５ＶＬＧＳ細胞系はベクターＤ　Ｎ　Ａ のコピー数の１０倍の増加を示す。

ムλ− 遺伝子の増幅について選択したトランス７エクシシンした遺伝のコピー 細胞系　Ｍｓｘの濃度　コピー数 （μモル） ＳＶＬＧＳ２　２０　１７０ ＳＶＬＧＳ５　２０　２５ ＳＶＬＧＳ９　３０　５００ ＳＶＬＧＳ２（５００ｐＭＲ）　５００　１２００ＳＶＬＧＳ５（５００ｐＭＲ ）　２５０　３００ＳＶＬＧＳ９（５００ｐＭＲ）　５００　４２００ＳＶＬＧ Ｓ２（２ｍＭＲ）　２０００　１５０００ＳＶ２．Ｇ５２０　２０　１ ＳＶ２．Ｇ５２５　２５　１ ＳＶ２．Ｇ５３０　３０　１ ＳＶ２．Ｇ５２０（５００ｐＭＲ）　１００　１ＳＶ２．Ｇ５２５（５００ｐＭ Ｒ）　５００　１ＳＶ２．Ｇ５３０（５００／／ＭＲ）　５００　１ＳＶ２．Ｇ ５３０（１０ｍＭＲ）　１０００　５−１０第２ラウンドの選択において、５Ｖ ＬＧＳ２は少な（ともさらに１０倍の増幅を示し、はばＩｓ、０００フピー／細 胞を達成する。

顕者に対照的には、初期のトランス７工クシタン体中に存在するｐＳＶ２．ＧＳ の単一のコピーは単一ラウンドの選択後に有意に増加せず、そしテ１０　ミリモ ルノＭｓｘｌ：：耐性のＳＶ２．Ｇ５３０（１０ｍＭＲ）ｌ；Ｌ’各細胞中にわ ずかに５〜１０フピーのみを含有する。

内因性遺伝子の増幅が、また、存在したかどうかを決定するため、プローブを除 去し、そしてＧＳデノム配列の第３イントロンから得られたニック翻訳したＢｇ ｌ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ　ＤＮＡ断片とプロ７トを再ブロービングした。した がって、このプローブは内因性ＧＳ遺伝子に対して特異的であり、そしてこのイ ントロンを欠くトランス７エクシａンした遺伝子とハイブリグイデージタンしな い、有意の内因性遺伝子の増幅は、この手段によって、５ＶＬＧＳ＠胞において 検出できなかった。小さい程度の内因性増幅はＳＶ２．Ｇ５３０（ｍＭＲ）細胞 ＤＮＡにおいて見ることができた。

こうして、ｐＳＶ２．ＧＳは、ＣＨＯ−Ｋｌ細胞において有効な優性の選択可能 なマーカーとして作用するが、増幅可能なマーカーとして適当であるために十分 なＧＳを発現するように思われる。なぜなら、わずかに増加したコピー数につい てさえ選択するために、非常に高いレベルのＭｓｘを必要とするからである。他 方において、ｐＳＶＬＧＳ、１は優性の選択可能なマーカーとして使用すること ができ、そして、また、非常に高いコピー数に増幅することができる。

選択可能なおよび増幅可能なベクターとしてのｐＳＶＬＧＳ、１の適当性を、組 織−ブフスミ／デン活性化因子（ｔＰＡ）を発現できる転写単位をその中に導入 することによって試験した。２つのプラスミドを検査し、ここでＳＶ４０の初期 の領域のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルの制御下にあるＬＰＡ　ｃ ＤＮＡをｐＳＶＬＧＳ、１の独特Ｂａ曽ＨＩ部位においてクローニングした。ｐ ＳＶＬＧＳ、ｔＰＡｌ　６において、ＧＳおよびｔＰＡの遺伝子は同−向きにあ り、そしてｐＳＶＬＧＳ。

ｔＰＡｌ７において、２つの遺伝子は反対の向きにある。

両者の構成体をＣＨＯ−Ｋｌ細胞中に導入し、そしてトランス７エクシランした 細胞を１５μモルのＭ　ｓ　ｘ　ｌ：対する耐性について選択した。

１０日後、生存するコロニーをフィブリンのオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙｓ） によってｔＰＡ活性についてスクリーニングした。生存するコロニーの多くはｔ ＰＡを分泌し、こうしてＧＳ遺伝子はトランス７エクシＢンしたコロニーを同定 するための選択可能なマーカーとして作用できることが確証された。フィブリン のデル中のｔＰＡ誘導クリアリング（ｃｌｅａｒｉｎｆＩｓ）は、ｐＳＶＬＧＳ 、ｔＰＡｌ　６でトラ：ｚＸ７ｚクシｇンした平板上で、より大きくかつより多 数であり、このことによって、２つの遺伝子が反対の向きにあるときより、ＧＳ 遺伝子としてベクター中に同−向きにあるとき、ｔＰＡ遺伝子はより効率的に発 現されることが示された。大きいｔＰＡのクリアリングを生成シタ、ｐＳＶＬＧ Ｓ、ｔＰＡｌ　６＋７））？ンス７エクシ５ンからの１０のコロニーを、９６ウ エルの平板中で増殖させた。これらのうちで、最高のレベルの他を分離する２つ の細胞系、１６−１，２０μＭＲおよび１６−２．２０μＭＲ，をそれ以上の研 究のために選択した。各々を増加する濃度のＭｓｘにおいて選択し、そして異な る段階において得られたコロニーのプールからのｔＰＡの生成を表３に示す。

に度数　ｔＰＡの分さ　Ｕ／１０’　／２４　間１６−１．２０μＭＲ２６０ １６−１，２００μＭ　２７００ １６−２．２０μＭＲ４００ １６−２，２００μＭＲ２７５０ １６−２，１０μＭＲ４０００ １６−２，１０μＭＲ，最高のレベルのｔＰＡを生成する細胞系、を希釈を限定 することによってクローニングし、そして４０００Ｕ／１０’細胞／日を分泌す るクローンを分離した。このレベルは、ＤＨＦＲ同時増幅を用いて報告されたｔ ＰＡの発現の最高レベルに匹敵する。

こうして示されたように、レトロウィルスに基づくベクターｐｚ　Ｉ　Ｐ−Ｎｅ ｏ　ｓｖ（Ｘ）中でクローニングしたＧＳ　ｃＤＮＡを使用したとき、Ｍｓｘ耐 性コロニーが発生した頻度は低く、それは多分この細胞系におけるこのベクター からの発現が比較的非効率的であったためである。他方において、ＧＳ遺伝子が ＳＶ４０プロモーターの制御下にある２つの異なる構成体は、野生型細胞より実 質的に高いレベルのＭｓｘ＋：対して耐性である細胞を発生した。試験した耐性 コロニーのすべてはベクターＤＮＡを含有し、そしてトランス７エクシシンした 遺伝子の転写と一致する新ｆｉなＧｓ　ｍＲＮＡ頚はｐＳＶＬＧＳ、Ｉ　ＤＮＡ を含有するＪｉ胞Ｍｌ：おいて検出できた。Ｍｓｘ耐性コロニーは、１／１０’ 細胞より大きい頻度において、ＳＶ４０プロモーターを使用し、両者のＧＳ発現 プラスミドを使用して同定することができ、このことにより、両者のＭＩ！成体 は、ＣＨＯ−ＫＩＪｉｉ胞中へのクローニングしたＤＮＡの導入のための優性の 選択可能なマーカーとして、有用であることができることが示された。

ＧＳミニ遺伝子を含有し、それ自体のＲＮＡ処理シグナルを利用しかつＳＶ４０ 後期プロモーターの制御下にある発現プラスミドｐＳＶＬＧＳ、１は、予期せざ ることには、ベクターの大きい数のコピーを各トランス７エクシタンした細胞中 に導入するために使用できる。

ＳＶ４０プロモーターの制御下にある両者のＧＳ遺伝子は、トランス７エクシタ ンした細胞系をＭｓｘの高い濃度において選択するとき、さらに増幅することが で慇た。ｐＳＶ２．ＧＳを発現する細胞系は、Ｍｓｘの非常に高いレベル（トラ ンス７工クシツン体を選択するために本来使用したより６５倍まで高い）に対し て耐性の変異型コロニーを生成したが、コピー数はわずかに５〜１０／細胞であ った。内因性遺伝子の検出可能な同時の増幅はほとんど存在しなかった。

ｐＳＶＬＧＳ、１は非常にいっそう適当な増幅可能なベクターである。

なぜなら、コピー数の増加はＭｓｘの濃度にほぼ比例し、そして非常に大きいコ ピー数（２ミリモルのＭｓｘに耐性の細胞において、はぼ１０，０００コピー／ ｌｓ胞）が達ｒ＆されたからである。この場合において、検出可能な内因性遺伝 子の増幅は起こらなかった。

ｐＳＶＬＧＳ、１の増幅可能なベクターを使用してｔＰＡ遺伝子をＣＨＯ−Ｋ　 １　ｍ飽中に導入し、そして遺伝子の増幅はｔＰＡの発現のより高いレベルに導 くことが示された。もとのトランス７工クシ５ン体のＭｓｘの濃度の１０倍まで に耐性の変異型コロニーは約１０倍の量のｔＰＡを分泌するが、さらにＭｓｘ耐 性の５０倍の増加はｔＰＡ分泌の２倍より低い増加を導いた。このことが示唆す るように、ｔＰＡの合成または分泌にある面はこれらの高いＭｓｘ耐性細胞にお いて飽和に近い、１６−２゜１０＋ＭＲの細胞系における４０００Ｕ／１０’細 胞７日のｔＰＡ分泌の最高レベルは、ＤＨＦＲ仲介遺伝子の増幅を使用するｄｈ ｆｒ″−ＣＨ０細胞において従来観測された発現のレベルに匹敵し、報告された 分泌の最高レベルは６０００Ｕ／１０’細胞／日である。これは、また、ｔＰＡ 分泌がこれらの細胞において現在の方法によって達成可能な最大に近いという結 論を支持する。

本発明は上において純粋に例示によって説明され、そしてその変更おより変化は 添付の請求の範囲において定′ａされた精神および範囲を逸脱しないで当業者に よってなすことがでさることは、理解されるであろう。

０）　Ｉ）ＳＶＬＧＳ、１ ｂ）ρＳＶ２．ＧＳ Ｂ。

１２３ＭＷ 国際調査報告 １ｍｌ、、、＋＊ｎａｌ　Ａｅｅ＋ｔ＊ｓ＋ｌｅ、ｅ、　ＰＣＴ／ＧＢ　８７１ ０００３９　−２−に・キミＸ　Ｔｏ　−：Ｅ　：ＮＴＥＲ）ＩＡ’：’工ＣＭ ＡＬ　５ＥＡＲ：：：　ＲＥＰＯＲＴ　Ｏ’ＪＩＮＴＥＲＮＡτｌ０ＮＡＬ　Ａ ＰＥ’ＬＺＣＡτＩｃＮＮｏ、　？ＣＴ／Ｇｅｌ　８７１０００３９　（ＳＡ　 １５９３１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルタミンシンセクーゼ（ＧＳ）の完全アミノ酸配列をコードする組換えＤ ＮＡ配列。 ２、真核生物のＧＳの完全アミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載の組 換えＤＮＡ配列。 ３、哺乳動物のＧＳの完全アミノ酸配列をコードする請求の範囲第２項記載の組 換えＤＮＡ配列。 ４、齧歯類のＧＳの完全アミノ酸配列をコードする請求の範囲第３項記載の組換 えＤＮＡ配列。 ５、ハムスターのＧＳの完全アミノ酸配列をコードする請求の範囲第４項記載の 組換えＤＮＡ配列。 ６、第２図に示す配列のアミノ酸解読部分を含む請求の範囲第５項記載の組換え ＤＮＡ配列。 ７、第２図に示す組換えＤＮＡ配列。 ８、高度の厳格な条件下に請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の組換えＤＮ Ａ配列または異なる種からのその一部とハイブリダイデーションする１つの種か らの組換えＤＮＡ配列。 ９、ｃＤＮＡである請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ配列 。 １０、ｃＤＮＡは逆転写により誘導される請求の範囲第９項記載の組換えＤＮＡ 配列。 １１、ゲノムＤＮＡの断片からなる請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の 組換えＤＮＡ配列。 １２、ハイブリダイデーションのプローブとしての請求の範囲第１〜６項のいず れかに記載の組換えＤＮＡ配列またはその断片の使用。 １３、医学的または診断の方法、例えば、被検体におけるＧＳのレベルが変更す る病気の状態を検出方法において使用するための請求の範囲第１〜１１項のいず れかに記載の組換えＤＮＡ配列。 １４、請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ配列を含んでな る組換えＤＮＡベクター。 １５、請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ配列を、形質転 換体宿主細胞中において、発現できる発現ベクターである請求の範囲第１４項記 載のベクター。 １６、ＧＳ以外の所望の蛋白質の完全アミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ配 列をさらに含む請求の範囲第１４項記載のベクター。 １７、ＧＳ以外の所望の蛋白質の完全アミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ配 列をさらに含み、また、所望の蛋白質のための粗換えＤＮＡ配列を、形質転換体 宿主細胞中において、発現できる請求の範囲第１５項記載のベクター。 １８、ＧＳをコードする組換えＤＮＡ配列が調節可能なブロモ−ターの制御下に ある請求の範囲第１５項または請求の範囲第１７項に記載のベクター。 １９、調節可能なブロモ−ターは熱衝摯ブロモ−ターまたはメクロチォネィンブ ロモ−ターである請求の範囲第１８項に記載のベクター。 ２０、ブラスミドｐＳＶＬＧＳ．１。 ２１、ブラスミドｐＳＶ２．ＧＳ。 ２２、ブラスミドｐＺＩＰＧＳ。 ２３、ブラスミドｐＳＶＬＧＳ．ｔＰＡ１６。 ２４、ブラスミドｐＳＶＬＧＳ．ｔＰＡ１７。 ２５、請求の範囲第１４〜２４項のいずれかに記載のベクターで形質転換された 宿主細胞。 ２６、ＧＳ以外の所望の蛋白質の完全アミノ酸配列をコードする祖換えＤＮＡ配 列を同時増幅する方法であって、宿主細胞を請求の範囲第１５項、請求の範囲第 １５項に従属するとき請求の範囲第１８項または請求の範囲第１９項、あるいは 請求の範囲第２０〜２２項のいずれかに記載するベクター、および前記所望の蛋 白質の組換えＤＮＡ配列を含むベクターで、同時形質転換することを含んでなる 前記方法。 ２７、ＧＳ以外の所望の蛋白質の完全アミノ酸配列をコードする祖換えＤＮＡ配 列を同時増幅する方法であって、宿主細胞を請求の範囲第１７項、請求の範囲第 １７項に従属するとき請求の範囲第１８項または請求の範囲第１９項、あるいは 請求の範囲第２３項または請求の範囲第２４項に記載するベクターで同時形質転 換することを含んでなる前記方法。 ２８、所望の蛋白質は組織のプラスミノゲン活性化因子である請求の範囲第２６ 項または請求の範囲第２７項の記載の方法。 ２９、ＧＳ阻害剤の漸進的に増加するレベルに対する耐性こついての選択によっ て増幅を達成する請求の範囲第２６〜２８項のいずれかに記載の方法。 ３０、ＧＳ阻害剤はホスフィノトリシンまたはメチオニンスルホキシミンである 請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１、増幅後、ＧＳ蓄積のレベルを培地へグルクミンの添加によって減少させる 請求の範囲第２９または３０項記載の方法。 ３２、増幅を起こすために要求されるＧＳ阻害剤の量を培地へのメチオニンの添 加によって減少させる請求の範囲第２９〜３１項のいずれかに記載の方法。 ３３、ＧＳをコードする組換えＤＮＡ配列の発現を選択お上び増幅の間にスイッ チオンし、そして引続いて完全に調節する請求の範囲第１８または１９項に従属 するとき請求の範囲第２６〜３０項のいずれかに記載の方法。 ３４、活性なＧＳ遺伝子を含有する宿主細胞を請求の範囲第１５および１７〜２ ４項のいずれかに記載のベクターで形質転換し、これによりＧＳ阻害剤に対する 耐性を形質転換体細胞に付与することによる、優性な選択可能なマーカーとして の請求の範囲第１５および１７〜２４項のいずれかに記載のベクターの使用。 ３５、ＧＳ活性を完全に欠くか、あるいはそれが減少した宿主細胞を、請求の範 囲第１５および１７〜２４項のいずれかに記載のベクターで形質転換することに よって、グルタミンを欠く培地中における生存能力を細胞系に付与すろときの請 求の範囲第１５および１７〜２４項のいずれかに記載のベクターの使用。 ３６、宿主細胞は哺乳動物の細胞である請求の範囲第２６〜３４項のいずれかに 記載の方法。 ３７、宿主細胞はＣＨＯ−ＫＩ細胞である請求の範囲第２６〜３４項のいずれか に記載の方法。 ３８、宿主細胞は骨髄腫細胞である請求の範囲第３５項記載の方法。