ES2564005T3

ES2564005T3 - Método para proporcionar esperma animal clasificado por sexo

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Publication number: ES2564005T3
Application number: ES10184283.9T
Authority: ES
Inventors: Gary Durack; Jeremy T. Hatcher; Lon A. Westfall; David R. Helbing; Jeffrey D. Wallace; Gary P. Vandre; Bradley Didion; Niraj V. Nayak; Muhammad Anzar; Cindy L. Ludwig; Jeffrey A. Graham; Kathleen S. Crowley
Original assignee: Inguran LLC
Current assignee: Inguran LLC
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2016-03-17
Anticipated expiration: 2024-03-29
Also published as: ES2524040T3; DK2305173T3; HUE028498T2; US8709825B2; ES2910439T3; US10100278B2; AR043956A1; DK2308420T3; US20130149736A1; EP2306173A2; EP2309244A2; WO2004088283A3; WO2004088283A2; US20130164741A1; EP2309246A2; EP1608963A2; US7799569B2; US20220106560A1; EP2308420A3; MX345105B

Abstract

Un método para analizar células espermáticas animales en una corriente de fluido que tiene una dirección de flujo, donde cada célula del esperma tiene una cabeza con un núcleo que comprende una región cromosómica localizada que contiene al menos un cromosoma y características del ADN cromosómico, donde dicho núcleo tiene una longitud en la dirección del flujo de la corriente, donde dicho método comprende: enfocar un haz de radiación electromagnética en la corriente de fluido como un punto generalmente elíptico que tiene una longitud a lo largo de un eje principal que se extiende generalmente en ángulos rectos a la dirección del flujo de la corriente y una anchura a lo largo de un eje menor que se extiende paralelo a la dirección del flujo de la corriente, donde la anchura del punto de iluminación es menor que la longitud de dicho núcleo, donde dichas células espermáticas están adaptadas para pasar a través dicho punto lo que resulta en emisiones de radiación electromagnética procedente de las células espermáticas, que incluyen emisiones procedentes de dichas regiones cromosómicas indicativas de las características del ADN cromosómico de las regiones; detectar y convertir al menos parte de dichas emisiones procedentes de las regiones cromosómicas en señales eléctricas analógicas que varían con el tiempo indicativas de dichas características del ADN cromosómico; muestrear digitalmente la señal analógica que varía con el tiempo y proporcionar un resultado que incluya la información digital correspondiente a dicha señal analógica que varía con el tiempo; analizar la información digital para extraer información indicativa de una característica derivada a partir de las señales analógicas que varían con el tiempo, donde dicha característica derivada comprende la pendiente de la señal analógica que varía con el tiempo en un punto de la señal relativo a un valor de umbral; clasificar al menos parte de las células espermáticas como células que tienen una característica del ADN cromosómico particular en función de al menos parte de dicha información extraída; y clasificar dichas células espermáticas de acuerdo con dichas características del ADN cromosómico.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para proporcionar esperma animal clasificado por sexo Antecedentes de la invencion

Esta invencion se refiere a aparatos y metodos para la recogida de semen animal, y mas particularmente a aparatos y metodos que usan diversas tecnicas, incluyendo citometna de flujo, para producir poblaciones de esperma que estan enriquecidas con celulas espermaticas que tienen poblaciones viables de celulas espermaticas clasificadas de acuerdo con las caractensticas de ADN para su uso por la industria de produccion animal para preseleccionar el sexo de la descendencia animal.

La fertilizacion de animales por inseminacion artificial (AI) y transplante de embriones despues de fertilizacion in vitro es una practica establecida. En la industria de produccion de ganado, la capacidad de influir en el resultado reproductivo hacia descendencia que tenga una o mas caractensticas deseadas tiene ventajas obvias. A modo de ejemplo, sena un beneficio economico en la industria lactea preseleccionar la descendencia en favor del sexo femenino para asegurar la produccion de vacas lecheras. Se han hecho esfuerzos hacia conseguir este objetivo usando citometna de flujo para clasificar celulas espermaticas X e Y, como se evidencia por las descripciones de las patentes de Estados Unidos N° 6.357.307 (Buchanan, et al.), 5.985.216 (Rens, et al.), y 5.135.759 (Johnson). Sin embargo, ninguno de estos esfuerzos ha provocado la introduccion de un sistema de alto rendimiento comercialmente satisfactorio capaz de producir volumenes de produccion de celulas espermaticas sexadas relativamente puras que tengan una movilidad suficiente para una fertilizacion eficaz.

En la tecnica anterior se han descrito instrumentos para clasificar celulas utilizando el barrido de ranura (vease, p. ej., Rens W, et al., CYTOMETRY, 25(2), 1996, 191-199). Sin embargo, a diferencia de la tecnica anterior, la presente invencion utiliza el procesamiento de senales digital para extraer una caractenstica de pulso conocida como diferencia de pendiente cntica, la cual muestra propiedades no lineales y la cual mejora significativamente la separacion y, por lo tanto, la resolucion de las partfculas.

Otros han intentado desarrollar tecnologfa que pueda usarse para procesar celulas espermaticas para obtener poblaciones de celulas espermaticas que esten enriquecidas con esperma que tenga un cromosoma sexual deseado. Sin embargo, la tecnologfa existente esta por debajo de las tecnologfas de la invencion descritas en este documento.

Por ejemplo, Johnson et al. (patente de Estados Unidos N° 5.135.759) describe la separacion de poblaciones de esperma que albergan el cromosoma X e Y intactos de acuerdo con el contenido de ADN usando un citometro de flujo/clasificador celular en poblaciones enriquecidas de esperma que albergan el cromosoma X e Y. Como se ha descrito, el esperma se combina con un colorante ADN selectivo a una temperatura de 30 a 39°C durante un periodo de 1 hora (39°C) a 1,5 horas (30°C). Entonces se usa un citometro de flujo para medir la cantidad de luz fluorescente emitida segun pasa el esperma a traves de un haz laser que excita el colorante. Como el esperma que alberga el cromosoma X contiene mas ADN que el esperma que alberga el cromosoma Y, teniendo la mayona de las especies de mairnferos una diferencia de aproximadamente el 3 al 5%, el esperma que alberga el cromosoma X emite mas luz fluorescente que el esperma que alberga el cromosoma Y. Para explicar el hecho de que la medicion de fluorescencia puede variar dependiendo de la orientacion rotatoria de las celulas espermaticas, se usan dos foto detectores. El primero determina si las celulas espermaticas estan orientadas apropiadamente, mientras que el segundo recoge la medicion que se usa para clasificar el esperma como que tiene el cromosoma X o Y. Se usa un oscilador que provoca que la corriente que contiene el esperma se rompa en gotitas corriente abajo del sitio donde el esperma pasa a traves del haz laser. A las gotitas que contienen esperma unico de una intensidad fluorescente predeterminada se les da una carga y se desvfan electrostaticamente en recipientes de recogida. La poblacion de esperma recogida enriquecida en genero entonces se usa para microinyeccion, fertilizacion in vitro, o inseminacion artificial.

Seidel et al. (documento WO 02/43574) tambien describe la separacion de esperma en poblaciones enriquecidas en genero de celulas que albergan el cromosoma X e Y usando citometna de flujo. Seidel et al. describe la tincion de las celulas a una temperatura entre 30°C y 40°C.

La publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2003/0157475 A1 (Schenk, 21 de agosto de 2003) describe un metodo para crioconservar celulas espermaticas que se han clasificado de acuerdo con el contenido de cromosoma X o Y. Como se indica en la misma, es deseable anadir un crioprotector a las celulas espermaticas antes de crioconservarse para proteger a las celulas espermaticas durante el proceso de crioconservacion. Por ejemplo, el glicerol es un crioprotector que se anade habitualmente a celulas espermaticas bovinas antes de la crioconservacion. Sin embargo, para obtener mejor proteccion del crioprotector, es deseable esperar a que el crioprotector se equilibre con las celulas espermaticas antes de someter a las celulas espermaticas a temperaturas por debajo de 0°C. Durante el periodo de equilibrado, el crioprotector penetra en la membrana celular para proporcionar proteccion intra-celular ademas de cualquier proteccion extra-celular proporcionada por el crioprotector. Por tanto, los metodos de crioconservacion descritos en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N°

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2003/0157475 A1 especifican que se anade un diluyente que contiene glicerol a las celulas espermaticas despues de haberse refrigerado a aproximadamente 5°C. Entonces se permite que las celulas espermaticas y el glicerol se equilibren a 5°C durante cualquier periodo entre 1 y 18 horas antes de que las celulas espermaticas se sometan a temperaturas inferiores. La descripcion recomienda un periodo de equilibrado entre tres y seis horas para obtener los mejores resultados.

Desafortunadamente, el tiempo y coste implicados en un periodo de equilibrado de 3 a 6 horas tendran un impacto negativo sobre la rentabilidad de un proceso comercial de clasificacion de esperma. Ademas, en el contexto de un proceso comercial de clasificacion de esperma, se cree que la salud del esperma se mejora de forma general reduciendo el tiempo entre la recogida del esperma y la crioconservacion (siendo equitativos otros factores). Desde este punto de vista tambien, sena deseable tener acceso a tecnologfa de crioconservacion que no requiera un largo periodo de equilibrado para obtener los beneficios optimos de un crioprotector. Ademas, se ha informado de que la tecnologfa de crioconservacion conocida tiene un impacto perjudicial sobre la motilidad del esperma, que es indicativa de fertilidad disminuida del esperma. Por tanto, existe la necesidad de tecnicas de crioconservacion que conserven la salud del esperma en comparacion con las tecnicas convencionales.

Sumario de la invencion

Esta invencion se refiere a un sistema (metodos y aparatos) mejorado para analizar, clasificar y ordenar celulas espermaticas de acuerdo con la reivindicacion 1.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama de flujo de trabajo para un proceso de clasificacion de esperma ejemplar;

la Fig. 2 es un diagrama esquematico de un sistema de clasificacion de gotitas por citometna de flujo;

la Fig. 3 es una vista lateral de un aparato de citometna de flujo para clasificacion de gotitas que muestra un ensamblaje optico de epi-iluminacion que enfoca un haz de excitacion sobre una corriente de fluido de movimiento ascendente generado por un sistema de boquilla;

la Fig. 4 es una vista final de una boquilla y porta-boquillas adecuados para el sistema de la invencion;

la Fig. 5 es una vista seccional de la boquilla y porta-boquillas de la Fig. 4 tomada a traves del plano de corte 5--5 en la Fig. 4;

la Fig. 6 es un diagrama esquematico de una celula espermatica arrastrada en una corriente de fluido que se esta examinando mediante un punto de iluminacion con forma elfptica;

la Fig. 7 es un diagrama esquematico que muestra la envoltura angular para la orientacion deseada de una celula espermatica en que el haz de luz desde el sistema optico impactara sobre una amplia cara de la celula generalmente de costado;

la Fig. 8 es una vista seccional transversal de un cuerpo de boquilla adecuado para el sistema de la invencion;

Fig. 9 es una vista lateral del cuerpo de boquilla mostrado en la Fig. 8 que muestra una serie de planos de corte (A-A a H-H y J-J a K-K) a traves del cuerpo de boquilla;

las Fig. 9A-9H y 9J-9K son vistas seccionales del cuerpo de boquilla mostrado en las Fig. 8 y 9 a lo largo de los planos correspondientes (A-A a H-H y J-J a K-K) de la Fig. 9;

la Fig. 10 es una vista en perspectiva de una seccion transversal de un sistema de boquilla que tiene un deflector de orientacion en la boquilla;

la Fig. 11 es una vista seccional transversal del sistema de boquilla mostrado en la Fig. 10;

la Fig. 12 es una vista seccional transversal parcial ampliada de una parte del sistema de boquilla mostrado en las Fig. 10 y 11;

la Fig. 13 es una vista seccional transversal parcial ampliada similar a la vista mostrada en la Fig. 12, pero tomada desde una direccion que es perpendicular a la direccion de vision en la Fig. 12;

la Fig. 14 es una vista lateral de un soporte de deflector que soporta una placa deflectora;

la Fig. 15 es una vista superior del soporte de deflector y la placa deflectora mostrados en la Fig. 14;

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a Fig. 16 es una vista superior de un soporte de deflector orientado de forma rotatoria en una boquilla de modo que as patas de la placa deflectora se crucen en una lmea que es paralela al eje principal de la elipse D en la boquilla;

a Fig. 17 es una vista superior de un soporte de deflector orientado de forma rotatoria en una boquilla de modo que as patas de la placa deflectora se crucen en una lmea que es perpendicular al eje principal de la elipse D en la boquilla;

a Fig. 18 es una vista seccional transversal lateral de un sistema de boquilla que incluye un deflector que muestra una serie de planos de corte (A-A a E-E) a traves de la boquilla y el deflector;

as Fig. 18A-18E muestran las areas de flujo seccional transversal en diversos puntos en el sistema de boquilla mostrado en la Fig. 18;

a Fig. 19 es una vista seccional transversal similar a la Fig. 12 tomada a traves de una boquilla que tiene una placa deflectora que es perpendicular al eje longitudinal de la boquilla;

a Fig. 20 es una vista seccional transversal de la boquilla mostrada en la Fig. 19 tomada a traves del plano de corte 20-20 mostrado en la Fig. 19;

a Fig. 21 es una vista seccional transversal similar a la vista seccional transversal de la Fig. 18 que muestra un sistema de boquilla que tiene un conducto de introduccion de muestra en una localizacion desplazada;

a Fig. 22 es una vista en perspectiva de un sistema de boquilla montado en una montura de boquilla;

a Fig. 23 es un diagrama esquematico de una pluralidad de celulas espermaticas alineadas que se estan orientando de forma rotatoria segun pasan a traves de un miembro con orificio calibrado hacia de localizacion de examen;

a Fig. 24 es un diagrama esquematico que muestra la localizacion de rotura de gotitas corriente abajo de la boquilla;

a Fig. 25 es un diagrama esquematico de un sistema detector de rotura;

a Fig. 26 es una elevacion frontal de un sistema de citometna de flujo;

a Fig. 27 es una vista en perspectiva ampliada de una parte del sistema mostrado en la Fig. 26 con partes del sistema retiradas por motivos de claridad;

a Fig. 28 es un diagrama esquematico de un sistema optico de epi-iluminacion;

a Fig. 29 es una vista en perspectiva de un sistema optico de epi-iluminacion;

a Fig. 30 es una vista lateral del sistema optico de epi-iluminacion mostrado en la Fig. 29;

a Fig. 31 es una vista superior del sistema optico de epi-iluminacion mostrado en las Fig. 29 y 30;

a Fig. 32 es una vista seccional del sistema optico de epi-iluminacion a lo largo del plano 32-32 de la Fig. 30;

a Fig. 33 es una vista seccional de una parte del sistema optico de epi-iluminacion a lo largo del plano 33-33 de la Fig. 31;

a Fig. 34 es una vista en perspectiva que muestra solamente elementos del sistema de filtracion optica que estan en a parte posterior del filtro dicroico del sistema optico de epi-iluminacion mostrado en la Fig. 29;

a Fig. 35 es una vista en perspectiva de otro sistema optico de epi-iluminacion que incluye ajuste de traslado de la ente cilmdrica;

a Fig. 36 es un diagrama esquematico de una localizacion de examen que muestra un haz laser enfocado sobre una corriente de fluido corriente abajo de la boquilla a un angulo oblicuo de incidencia;

a Fig. 37 es un diagrama esquematico de un sistema de calibracion de clasificacion de;

a Fig. 38 es un diagrama esquematico de un detector de epi-iluminacion para su uso con la calibracion de clasificacion mostrada en la Fig. 37;

a Fig. 39 es un diagrama de bloques de un analizador digital de celulas (DCA) y regulador del procesador; a Fig. 40 es un diagrama esquematico de un clasificador multi-canal que muestra dos canales;

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la Fig. 41 es un diagrama de flujo de trabajo de un clasificador multi-canal que muestra cuatro canales; la Fig. 42 es un diagrama de bloques de un analizador analogico de celulas (ACA);

la Fig. 43 es un grafico que ilustra una corriente de pulsos de forma de onda desde una salida de fotodetector que detecta pulsos fluorescentes de celulas que fluyen a una tasa promedio de 10.000 celulas/segundo;

la Fig. 44 es una vista detallada de la Fig. 43 que ilustra la corriente desde una salida de fotodetector que detecta tres pulsos fluorescentes de tres celulas que fluyen a una tasa promedio de 10.000 celulas/segundo; una onda cuadrada de un oscilador de gotitas de 100 MHz se ha superpuesto sobre la ilustracion para mostrar la sincronizacion entre los tres pulsos y los pulsos de onda cuadrada del oscilador de gotitas;

las Fig. 45-48 ilustran el movimiento de una celula espermatica relativo a un punto de iluminacion laser que tienen una anchura reducida;

la Fig. 49 es una ilustracion ejemplar de la informacion digital correspondiente a una salida analogica variable en el tiempo de un fotodetector que detecta un unico pulso de fluorescencia basado en 122 muestras a una tasa de muestreo continua de 105 MHz;

la Fig. 50 es un diagrama esquematico que ilustra la relacion sincronica entre pulsos de laser, emisiones de fluorescencia de una celula resultantes de los pulsos de laser y las muestras digitales de la salida del fotodetector;

la Fig. 51 es un diagrama esquematico que ilustra el modo en que las muestras digitales mostradas en la Fig. 50 forman una forma de onda del pulso;

la Fig. 52 es un diagrama esquematico de una forma de onda del pulso a partir de un celula espermatica X sincronizada con la forma de onda del pulso de una celula espermatica Y que muestra mayor intensidad de pico en la forma de onda del pulso para la celula espermatica X;

la Fig. 53 es un diagrama esquematico de una forma de onda del pulso que muestra un umbral y una ventana de integracion que pueden usarse para el analisis de pulsos;

la Fig. 54 es un histograma de una muestra que contiene celulas espermaticas X e Y que muestra la elevada resolucion que se puede obtener con tecnicas de barrido de ranura;

la Fig. 55 es un histograma de una muestra que contiene celulas espermaticas X e Y que muestra la resolucion relativamente mala obtenida con iluminacion convencional;

las Fig. 56-59 muestran histogramas de fluorescencia y diagramas de dispersion de picos frente al area para nucleos de esperma y celulas espermaticas vivas;

las Fig. 60-61 ilustran un modelo de cuatro componentes de un histograma de intensidad de fluorescencia para celulas espermaticas-la Fig. 60 muestra los datos sin procesar y la Fig. 61 muestra curvas modelo generadas mediante un algoritmo iterativo basado en los datos mostrados en la Fig. 60;

las Fig. 62-63 ilustran un modelo de tres componentes de un histograma de intensidad de fluorescencia para celulas espermaticas-la Fig. 62 muestra los datos sin procesar y la Fig. 63 muestra curvas modelo generadas mediante un algoritmo iterativo basado en los datos mostrados en la Fig. 62;

la Fig. 64 ilustra la naturaleza no lineal del elemento CSD; el panel superior muestra diagramas de M promedio para celulas espermaticas que albergan Xy que albergan Y; el panel central muestra un grafico de las primeras derivadas de estos diagramas de M promedio (es decir M') para valores de amplitud de senal menores de la altura del pico del pulso de emision de fluorescencia que alberga Y promedio; y el panel inferior muestra la diferencia entre las primeras derivadas (M'x-M'y) como una funcion de la amplitud de senal;

la Fig. 65 ilustra un sistema en que el elemento CSD es la pendiente computada de una lmea que pasa a traves de dos puntos sobre el pulso de emision de fluorescencia;

las Fig. 66-69 ilustran la discriminacion mejorada conseguida mediante el uso de la extraccion del elemento CSD;

la Fig. 70 ilustra una region de clasificacion bi-variada sobre un diagrama de dispersion de CSD frente a la dispersion del area de pulso;

la Fig. 71 ilustra re-analisis de citometna de flujo para un ensayo en que el panel de la izquierda corresponde con la estrategia de clasificacion de alta recuperacion/aceptacion coincidente (estrategia de cancelacion de ausencia de

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coincidencia) y el panel de la derecha corresponde con la estrategia de clasificacion de alta pureza/rechazo coincidente (estrategia de cancelacion de coincidencia);

a Fig. 72 es un diagrama de flujo de trabajo del procesamiento de la senal digital; a Fig. 73 es un ejemplo de una estrategia de agrupamiento de media k;

a Fig. 74 es una ilustracion conceptual y representacion grafica de la aplicacion de una regla de decision por Error M^nimo de Bayes a los datos de las caractensticas pulso;

a Fig. 75 es una representacion grafica de los resultados obtenidos usando una regla de decision por Error Mnimo de Bayes y umbralizacion de la distancia de Mahalonobis;

a Fig. 76 es una ilustracion conceptual de la estadfstica de ventana movil para proporcionar "olvido"; a Fig. 77 es una representacion grafica de la compensacion de desviacion; a Fig. 78 ilustra una corriente de fluido que contiene una distribucion ejemplar de partfculas;

a Fig. 79 es un grafico que muestra la pureza como una funcion de la tasa de suministro del fluido con una estrategia de clasificacion de aceptacion coincidente;

a Fig. 80 es un grafico que muestra el porcentaje de partfculas deseadas clasificadas satisfactoriamente en la poblacion utilizable como una funcion de la tasa de suministro del fluido con una estrategia de clasificacion de rechazo coincidente;

a Fig. 81 es un grafico que muestra la relacion inversa entre el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas para clasificacion en una poblacion de partfculas deseadas en comparacion con el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas para clasificacion en esa poblacion;

a Fig. 82 es un diagrama de flujo de decisiones que muestra el funcionamiento global de un aparato de clasificacion;

a Fig. 83 es una elevacion lateral de un citometro orientado a producir una corriente de gotitas que tienen un componente de velocidad horizontal y un sistema de recogida para recoger las gotitas;

a Fig. 84 es una vista en perspectiva ampliada del sistema de recogida mostrado en la Fig. 83 mostrado con relacion al sistema de boquilla y las placas deflectoras;

a Fig. 85 es un diagrama esquematico de una realizacion de un sistema de recogida;

a Fig. 86 es una elevacion frontal de un dispositivo de intercepcion del sistema de recogida mostrado en la Fig. 83; a Fig. 87 es una elevacion lateral de un dispositivo de intercepcion del sistema de recogida mostrado en la Fig. 83; as Fig. 88-95 muestran resultados graficos de varios experimentos de centrifugacion de esperma; as Fig. 96-98 son diagramas esquematicos que ilustran las etapas en un metodo de filtracion; a Fig. 99 es un diagrama esquematico de un sistema de filtracion usado para filtrar celulas espermaticas; a Fig. 100 es un diagrama esquematico de otro sistema de filtracion usado para filtrar celulas espermaticas; as Fig. 101 y 102 muestran resultados graficos de experimentos de filtracion de celulas espermaticas; a Fig. 103 es un diagrama de flujo de trabajo para el metodo de crioconservacion;

a Fig. 104 muestra resultados graficos para un experimento de crioconservacion de celulas espermaticas;

a Fig. 105 es un diagrama de flujo de trabajo para un metodo para procesar celulas espermaticas;

a Fig. 106 es una vista en perspectiva de un clasificador de partfculas multi-canal con partes desprendidas para mostrar elementos internos del clasificador;

a Fig. 107 es una vista en perspectiva de un sistema colector que puede usarse para el suministro de fluido en el clasificador de partfculas multi-canal de la Fig. 106;

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la Fig. 108 es una vista en perspectiva del sistema colector de la Fig. 107 que muestra conexiones fluidas internas del sistema colector;

la Fig. 109 es una vista en perspectiva del clasificador de partfculas mostrado en la Fig. 106 con elementos adicionales retirados o parcialmente retirados para mostrar mejor los elementos internos del clasificador;

la Fig. 110 es una elevacion frontal del clasificador de partfculas mostrado en la Fig. 106;

la Fig. 111 es una elevacion lateral del clasificador de partfculas mostrado en la Fig. 106 con la pared lateral de la carcasa retirada para mostrar elementos internos del clasificador;

la Fig. 112 es una elevacion lateral del clasificador de partfculas mostrado en la Fig. 106 (tomada desde el lateral opuesto al lado del que se tomo la Fig. 107) con la pared lateral retirada para mostrar elementos internos del clasificador;

la Fig. 113 es una vista en perspectiva del clasificador de partfculas mostrado en las Fig. 106 tomada desde un angulo por detras del clasificador y con la cubierta posterior retirada para mostrar elementos internos del clasificador;

la Fig. 114 es una vista en perspectiva de una parte del clasificador de partfculas mostrado en la Fig. 106 que muestra el montaje de multiples sistemas de boquilla en un travesano;

la Fig. 115 es una vista en perspectiva de una parte del clasificador de partfculas mostrado en la Fig. 106 que muestra las posiciones relativas del sistema de recogida y otras partes del clasificador de partfculas;

la Fig. 116 es un diagrama esquematico de un sistema de suministro de fluidos para un clasificador multi-canal;

las Fig. 117 y 118 son diagramas esquematicos de dos diferentes sistemas divisores del haz laser;

las Fig. 119 y 120 son vistas en perspectiva de otro sistema multi-canal;

las Fig. 121-134 muestran resultados graficos de diversos experimentos;

la Fig. 135 es un diagrama esquematico de un sistema de boquilla donde la boquilla dirige la corriente de fluido a traves de un tubo capilar;

la Fig. 136 es un diagrama esquematico de un sistema de clasificacion por foto deterioro;

la Fig. 137 es un diagrama esquematico de un sistema de clasificacion alternativo basado en conmutacion flmdica; y

la Fig. 138 es un diagrama esquematico de un sistema de clasificacion alternativo basado en una corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad que desvfa segmentos concretos seleccionados de la corriente de fluido que porta las partfculas analizadas.

Partes correspondientes se designan por numeros de referencia correspondientes en todos los dibujos. Lo siguiente es una lista de partes con los numeros de referencia asociados para cada parte. La lista de partes se proporciona con encabezamientos de seccion que corresponden en general con los encabezamientos de seccion en la memoria descriptiva para facilitar el uso de la lista de partes. Generalmente, cada seccion de la lista de partes proporciona un numero de referencia para las partes que se introducen por primera vez en la seccion correspondiente de la descripcion detallada.

Lista de partes con numeros de referencia asociados para cada parte Resumen general

39 Recogida de semen

41 Marcaje del semen

41A Adicion de tampon

43 Control de calidad

47 Lavado

48 Fluido de tincion

49 Tincion

51 Incubacion

53 Carga en el dispositivo de introduccion de muestra del citometro de flujo

54 Adicion de fluido envolvente a traves de citometna de flujo

55 Clasificacion

57 Recogida de esperma clasificado

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58A Adicion de fluido de recogida

58B Concentracion de celulas espermaticas

58C Adicion de criodiluyente

59 Carga del esperma clasificado en pajitas

61 Crioconservacion

63 Envasado en nitrogeno lfquido

65 Distribucion

67 Venta

69 Almacenamiento

71 Inseminacion artificial

Citometna de flujo

1 Sistema (global)

3 Suministro de fluido portador

7 Suministro de fluido envolvente

9 Aparato de citometna de flujo que tiene capacidades de clasificacion

15 Sistema de suministro de fluidos

17 Fluido portador

19 Fluido envolvente

21 Corriente de Fluido

23 Corriente de Partfculas

25 Haz de radiacion electromagnetica

31 Emision de radiacion electromagnetica desde las partfculas 33 Gotitas

35 Partfculas contenidas en las Gotitas

Aparato de citometria de flujo (un canal)

101 Sistema de boquilla

103 Orificio de la boquilla

105 Transductor

107 Rotura de gotitas

109 Sistema optico

115 Localizacion de examen

117 Fotodetector

119 Sistema de clasificacion

123 Primer grupo o poblacion diferente de gotitas

125 Segundo grupo o poblacion diferente de gotitas

2201 Sistema de recogida

131 Procesador

Sistema de boquilla

133 Cuerpo de flujo cilmdrico

135 Orificio longitudinal central

137 Boquilla

139 Cuerpo de boquilla con forma de embudo 141 Paso a traves del cuerpo de boquilla 145 Escariador con rosca interna

149 Proyeccion o pasador roscado

155 Sellamiento de junta torica

157 Conducto (aguja tubular)

167 Espacio anular (hueco)

173 Orificio radial en el cuerpo de flujo (fluido envolvente)

183 Segundo orificio radial (fluido envolvente adicional)

189 Nucleo central del fluido portador

191 Envoltura co-axial externa de fluido

Orientacion de las celulas

201 Celula espermatica bovina

205 Cabeza con forma de pala

207 Caras opuestas completamente planas

209 Bordes estrechos

211 Ecuador del esperma

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

213 Nucleo

215 Cola

217 Longitud del nucleo

219 Longitud de la cabeza

221 Anchura de la cabeza

223 Longitud global

225 Region localizada dentro del nucleo

227 Direccion del flujo de la corriente

229 Envoltura angular en que el haz de luz impacta una cara amplia R1 Intervalo angular

P Plano

Diseno de la boquilla

231 Interior del cuerpo de boquilla

233 Superficie interior del cuerpo de boquilla

235 Primera region axialmente ahusada

237 Segunda region axialmente ahusada

239 Tercera region axialmente ahusada

247 Eje longitudinal de la boquilla

249 Cuarta region interior de la boquilla

251 Longitud axial de la cuarta region

255 Miembro con orificio calibrado

257 Escariador en el Extremo frontal de la boquilla

259 Primera zona de torsion

261 Segunda zona de torsion

263 Superficie de la primera zona de torsion

267 Superficie de la segunda zona de torsion

271 Fuerzas de torsion

273 Longitud axial de la primera zona de torsion

275 Longitud axial de la primera region ahusada

277 Longitud axial de la segunda region ahusada

279 Longitud axial de la segunda zona de torsion

309 Superficie ascendente conica del miembro con orificio calibrado

315 Superficie descendente cilmdrica del miembro con orificio calibrado

317 Longitud axial de la superficie ascendente conica

327 Longitud axial de la superficie descendente

Deflector de orientacion

2001 Deflector de orientacion

2003 Placa deflectora

2005 Soporte de deflector

2007 Pata ascendente

2009 Pata descendente

2015 Lmea de interseccion

2017 Eje central del cuerpo de boquilla

2019 Borde curvado de la pata ascendente

2025 Distancia de la pata inferior que se extiende de forma descendente

2027 Longitud global del soporte de deflector

2029 Diametro exterior del soporte de deflector

2031 Diametro interior del soporte de deflector

2033 Distancia entre la lmea de interseccion y el centro de la boquilla

2035 Extremo corriente arriba del deflector

2037 Superficie inclinada del soporte de deflector

2039 Bordes laterales de la pata descendente

2041 Borde descendente de la pata descendente

2049 Hueco entre la placa deflectora y el soporte de deflector

2051 Superficie interna del soporte de deflector

2053 Volumen tras la placa deflectora

2055 Volumen interior de la boquilla

2057 Eje longitudinal del Soporte de deflector cilmdrico

2059 Lmea a traves del Eje principal de la elipse D

2061 Distancia entre la Aguja de inyeccion y el deflector

2067 Extremo corriente abajo del soporte de deflector

2069 Puntos de contacto entre el soporte de deflector y la boquilla

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2071 Juntas toricas

2077 Extremo corriente abajo del porta-boquillas (saliente)

2079 Diametro interior del saliente

2081 Parte de fluido envolvente entre la corriente central y la superficie de boquilla 2087 Seccion transversal corriente arriba (A)

2089 Seccion transversal en el deflector (B)

2091 Seccion transversal en el deflector (C)

2093 Seccion transversal en el deflector (D)

2094 Seccion transversal corriente abajo del deflector (E)

2097 Sistema deflector perpendicular

2095 Burbuja de aire

2099 Placa deflectora perpendicular

2101 Borde curvado de la placa deflectora perpendicular 2103 Borde recto de la placa deflectora perpendicular 2105 Junta torica

2107 Tope anular (plataforma) en la boquilla

2109 Diametro exterior de la aguja de inyeccion de muestra (conducto)

2151 Sistema de boquilla que tiene un conducto de introduccion de muestra desplazado

Montaje y ajuste de la boquilla

331 Montura de boquilla

333 Primera fase lineal

337 Segunda fase lineal

339 Eje X

341 Eje Y

343 Tercera fase de rotacion

345 Eje Z

347 Miembro de primera fase fijo (no mostrado)

349 Armazon para el Miembro de primera fase fijo

355 Miembro de primera fase movil

357 Accionador (micrometro) para la primera fase

359 Miembro de segunda fase fijo

361 Miembro de segunda fase movil

363 Accionador (micrometro) para la segunda fase

365 Miembro de tercera fase fijo

371 Miembro de tercera fase movil

373 Accionador (micrometro) para la tercera fase

375 Direccion generalmente ascendente de la corriente que contiene celulas 377 Angulo de direccion ascendente

Transductor y formacion de gotitas

379 Collarm

381 Elemento piezoelectrico (no mostrado)

383 Terminales

D Diametro de corriente

Detector de rotura

389 Detector de rotura

391 Microprocesador

393 Fuente de luz

395 Fotoserie lineal (fotodiodos)

401 Lente para el detector de rotura de gotitas

405 Circuitos op-amp de corriente a voltaje

407 Amplificadores de seguimiento/retencion

409 Generador de onda sinusoidal (senal de seguimiento/retencion)

411 Conversor A/D

412 Sistema de camara

413 Luz estroboscopica

414A Rejilla

414B Abertura con forma de ranura en la rejilla

Sistema optico de epi-iluminacion

415

417

419

425

427

429

431

435

437

439

441

443

445

447

449

455

457

459

461

463

465

467

469

471

473

475

477

479

485

487

489

491

497

498

501

503

505

507

509

511

513

515

517

519

521

523

525

527

529

531

533

535

539

541

543

545

547

549

551

553

557

559

561

563

567

571

Sistema de epi-iluminacion

Instrumento de epi-iluminacion

Eje optico longitudinal

Punto de iluminacion

Eje del haz de iluminacion enfocado

Base rectangular

Filtro reflectante

Laser o lampara de arco

Ensamblaje de lente de acondicionamiento

Abertura de entrada

Pared lateral de una camara dicroica

Camara dicroica

Arandela de retencion

Filtro de densidad neutra

Lente cilmdrica

Sosten de lente

Contratuerca

Seccion transversal elfptica del punto de iluminacion Abrazaderas para el filtro reflectante Porta-filtros

Cara angular del porta-filtros Aberturas en el porta-filtros Fase lineal para el porta-filtros Eje X

Larguero de soporte Accionador para la fase lineal Filtro dicroico

Abrazaderas para el filtro dicroico Armazon para el filtro dicroico Direccion de avance

Eje optico longitudinal del instrumento optico Ensamblaje de lente de enfoque

Forma de onda de pulso fluorescente o senal emitida por la celula

Funcion espacial de excitacion

Adaptador de microscopio

Abertura en la pared frontal de la camara dicroica

Pared frontal de la Camara dicroica

Tubo de enfoque

Tubos de montaje de lente

Lente de enfoque

Direccion de retroceso

Ajuste de enfoque telescopico

Luz emitida colimada

Sistema de filtracion

Filtro de emision

Porta-filtros de emision

Abertura en la pared posterior de la camara dicroica Pared posterior de la camara dicroica Ensamblaje de pelfcula de alineacion Deslizador de la pelfcula de alineacion Riel para los componentes del ensamblaje de filtro Porta-filtros para la pelfcula de alineacion Elemento de filtro de pelfcula

Sujeciones para fijar el elemento de filtro al porta-filtros Angulo para la pelfcula de alineacion relativo al eje optico Sujeciones para fijar el deslizador a la base Muescas paralelas en la base Lente asferica

Soporte para la lente asferica Armazon para la lente asferica Sujeciones para la lente asferica Filtro espacial Placas de apertura

Armazon para las placas de filtro espacial Ranura vertical Ranura horizontal

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

573 Apertura

575 Dimension vertical

577 Dimension horizontal

579 Volumen de recogida

583 Porta-placas

587 Sujeciones para el porta-placas

589 Miembro de refuerzo para las placas de apertura

449A Ensamblaje de montaje ajustable

449B Muescas

449C Muescas

450 Epi-iluminacion que refleja emisiones de fluorescencia

451 Filtro dicroico

Fotodetector

591 Placa de montaje para el fotodetector

595 Sujeciones para el fotodetector

Angulo de incidencia del haz

605 Distancia entre la localizacion de examen y el orificio de la boquilla 609 Eje del haz

A Angulo de incidencia

Punto de iluminacion enfocado

L1 Longitud a lo largo del eje principal

W1 Anchura a lo largo del eje menor

Sistema de clasificacion

627 Dispositivo de carga

629 Placas deflectoras cargadas

631 Elemento de carga

633 Abertura en el elemento de carga

635 Suministro de energfa para las placas deflectoras

5001 Ensamblaje de montaje ajustable

5003 Cuadro de ajuste del ensamblaje de montaje

5005 Refuerzo del ensamblaje de montaje

5007 Sujeciones

5009 Muescas

5011 Eje de traslado

5013 Eje de traslado

5015 Cuadro de ajuste del ensamblaje de montaje

5017 Sujeciones

5019 Muescas

5021 Soporte fijo

5023 Sujeciones

5025 Resorte

Calibracion de clasificacion automatizada

4201 Sistema de calibracion

4203 Detector de epi-iluminacion

4205 Cable de fibra optica

4207 Filtro dicroico

4209 Sistema de lente

4211 Emision fluorescente desde partfculas en las gotitas

4213 Fotodetector

4215 Captador de haz

Correccion de fallos del sistema de clasificacion

5047 Sistema de eliminacion de desechos para el elemento de carga

5049 Sistema de eliminacion de desechos para las placas deflectoras

5051 Soporte para el elemento de carga

5053 Conducto de vacfo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5055 Lmea de vacm

5057 Abertura adyacente al elemento de carga

5058 Conector

5059 Lmea de gas comprimido 5061 Colector

5063 Conductos de aire

5064 Aberturas

5065 Conector

5066 Lateral de la placa deflectora Proteccion de la muestra clasificada

4033 Recipiente de recogida

4041 Mecanismo de prevencion de contaminacion

4043 Accionador neumatico

4045 Brazo oscilante

4047 Extremo del brazo oscilante

Sistema de suministro de fluidos

645 Bomba de jeringa

647 Lmea de flujo desde la bomba hasta el suministro de fluido portador

649 Recipiente para contener el suministro de fluido portador 651 Lmea desde la bomba hasta la aguja de inyeccion

657 Lmea de suministro desde de la bomba de jeringa hasta la aguja

659 Motor de velocidad variable

661 Segundo recipiente para suministro de fluido envolvente

667 Lmea de suministro para conectar el fluido envolvente al orificio radial en la boquilla

669 Valvula de control en la lmea de suministro

671 Sistema de presion de gas para el fluido envolvente

675 Fuente de gas presurizado

679 Lmea de aire para el gas presurizado

681 Regulador para controlar la presion suministrada al tanque de fluido envolvente 683 Valvula de dos direcciones en la lmea de aire

Control

689 Conversor A/D

693 Intensidad relativa del haz experimentada por un punto que se mueve a traves del punto de iluminacion

695 Intensidad relativa del pulso emitido desde el esperma que cruza el punto de iluminacion

d Distancia entre la boquilla y la localizacion de rotura de gotitas

Procesamiento de la senal

701 Senal de salida desde el fotodetector

703 Senales del oscilador de generacion de gotitas

705 Procesamiento de la senal digital (Analizador digital de celulas)

707 Senal digital desde el A/D

735 Terminal de PC/ordenador

737 Reloj maestro (Senal sincronizada 128 x)

739 Adquisicion de datos(HH1')

741 Parametros de deteccion de inicializacion (HH1)

745 Parametros de discriminacion de inicializacion (HH2)

747 Deteccion de pulso digital (HH3)

749 Analisis de pulso digital - extraccion de caractensticas (HH4) 753 Area de pulso (HH5)

755 Pico de pulso (HH6)

757 Discriminacion de pulso (HH7)

759 Clasificacion (HH8)

761 Analisis de desviacion (HH9)

763 Lfmite de decision para las reglas de Bayes

769 Inicializar

771 Comprobacion del sistema

773 Interaccion del usuario

775 Reintento (hasta tres veces)

777 Descarga

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

779 Control de calidad de las gotas

781 Aspirar la muestra

783 Control de calidad de la muestra

785 Inicio de la muestra

787 Activar clasificacion

789 Muestra completa

791 Continuacion de la muestra

793 Desactivar clasificacion

795 Optimo de discriminacion X/Y

797 Establecer discriminacion X/Y

799 Discriminacion correcta

801 Optimo de velocidad

803 Establecer velocidad de jeringa

805 Velocidad correcta

807 Comprobacion del sistema

809 Reajuste del sistema

811 Sistema correcto

813 Flujo funcionamiento global ejemplar

825 Integrador

827 Comparador anchura/area

829 Calculador de umbral dinamico

831 Discriminacion de pulso

833 I/O de puerto JTAG

837 Comparador de ventana (area)

839 Anchura de pulso y circuito logico activador

841 Decision de clasificacion

843 Controladores de I/O

845 Controladores auxiliares

847 Placa del controlador de clasificacion

849 USB

851 SDRAM de placa DSP

853 Senal de clasificacion

854 Filtro de paso bajo

855 SDRAM de placa I/O

857 I/O de procesador

859 Bus I/O periferico

861 Generador de pulsos de clasificacion

863 Procesador de tratamiento de datos

865 Procesador de deteccion de pulsos

867 Procesador de extraccion de caractensticas

873 Procesador de clasificacion

875 RAM de placa DSP

OL Relacion inversa entre gotitas coincidentes en poblacion utilizable en comparacion con gotitas coincidentes en poblacion no utilizable

P1 Punto en la Lmea OL correspondiente a pureza del 85%

LL Punto en la lmea OL correspondiente a recogida del 60% de las partmulas deseadas OR Rango operativo (segmento de OL entre P1 y LL)

6000 Datos sin procesar

6001 1a Poblacion de celulas no alineadas

6003 2a Poblacion de celulas no alineadas 6005 Poblacion Y alineada

6007 Poblacion X alineada

6010 Datos sin procesar

6011 Poblacion de celulas no alineadas

6015 Poblacion Y alineada

6017 Poblacion X alineada

Sistema multi-canal

1001 Sistema multi-canal

1003 Unidades de citometna de flujo

1005 Suministro comun de partmulas

1007 Fuente comun de Radiacion electromagnetica

1009 Carcasa comun

1011 Entrada comun para control

1019 Salida comun

1021 Sistema comun de suministro de fluidos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1023 Sistema comun de control de temperatura 1025 Fuente comun de energfa 1027 Sistema comun de recuperacion de residuos 1029 Sistema comun de placa deflectora

1031 Sistema comun de limpieza

Carcasa comun

1069 Base

1071 Dos paredes laterales

1073 Par inferior de topes

1075 Panel de cubierta inferior

1077 Frontal de la carcasa

1081 Par superior de topes

1083 Panel de cubierta superior

1085 Parte posterior de la carcasa

1087 Armazon para el montaje de multiples unidades de citometna

1089 Travesano fijado a las paredes laterales de la carcasa (para fijar la montura de boquillas) 1093 Placa de montaje inclinada que se extiende entre las paredes laterales

Suministro comun de fluido

1105 Bomba para el fluido portador

1107 Suministro comun de fluido portador

1115 Sistema de presion de gas para el fluido envolvente

1117 Suministro comun de fluido envolvente

1121 Sistema colector

1123 Recipiente que contiene el suministro comun de fluido portador

1125 Soporte para el recipiente

1133 Bloque de soporte

1135 Cavidad para recibir el recipiente

1137 Segunda cavidad para material tamponante

1139 Recipiente para material tamponante

1141 Bomba de jeringa

1147 Lmea de suministro desde la bomba de jeringa hasta el colector

1149 Valvula de desvm que controla el fluido portador y tamponante

1155 Recipiente para el suministro comun de fluido envolvente

1157 Lmea de suministro desde el recipiente de fluido envolvente hasta el colector

1161 Fuente de gas presurizado

1163 Lmea de gas

1165 Reguladoren la lmea de gas

1167 Valvula de dos direcciones para la lmea de gas entre la fuente de gas y el tanque de fluido envolvente 1169 Lmea de gas para presurizar un suministro de solucion de limpieza

1173 Tanque para la solucion de limpieza

1175 Valvula de dos direcciones para la lmea de gas para la solucion de limpieza

1177 Colector

1179 Bloque laminado

1181 Conductos

1185 Circuito de flujo de fluido

1189 Entradas conectadas a la bomba de jeringa

1191 Entradas conectadas al suministro de fluido envolvente

1193 Salidas para el fluido portador y el fluido envolvente

V1-V6 Valvulas para controlar el flujo a traves de los conductos del colector

1203 Miembro de armazon (para fijar el bloque colector)

1205 Conectores roscados en bloque

1207 Deposito de muestra

V1A-V1D Valvulas de dos direcciones (para controlar el flujo de fluido de muestra hasta las boquillas)

1217 Aguja del deposito de muestra

1221 Sistema de residuos

1223 Tanque de residuos (receptaculo)

1225 Mecanismotal como bomba de vacm (para generar vacm)

1227 Lmeas de residuos (que conectan las valvulas V1A-V1D al tanque de residuos)

1233 Filtro hidrofobo (en la lmea que conecta el tanque de residuos y la bomba de vacm)

1235 Circuito fluido para el fluido envolvente

V2A-V2D Valvulas de dos direcciones (para controlar el flujo de fluido envolvente a las boquillas)

1241 Lmea de suministro de envolvente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1247 Lmeas de residuos que conectan el circuito de flujo de fluido envolvente al tanque de residuos

Suministro comun de energia y controles

1249 Suministro comun de energfa

1251 Sistemas comunes de suministro de energfa

1253 Entrada comun (GUI)

1255 Salida comun (al microprocesador)

Control comun de la temperatura

1257 Sistema de control de la temperatura

1259 Circuito de flujo de fluido (para control de la temperatura)

1263 Conductos de fluido (para el control de la temperatura en el bloque de soporte)

1265 Unidad de control

1269 Conductos de fluido (para el control de la temperatura en el colector)

V6 Valvula de retencion

Haz de luz comun y sistema divisor del haz

1270 Divisor del haz

1270A Primer haz desde el divisor del haz 1270B Segundo haz desde el divisor del haz

1271 Segundo divisor del haz

1271A Primer haz desde el segundo divisor del haz 1271B Segundo haz desde el segundo divisor del haz

1272 Tercer divisor del haz

1272A Primer haz desde el tercer divisor del haz 1272B Segundo haz desde el tercer divisor del haz

1273 Sistema de grna del haz

1279 Ensamblaje de filtro inferior

1281 Ensamblaje de espejo superior

1285 Base (para el ensamblaje de filtro inferior)

1289 Fase (para el ensamblaje de filtro inferior)

1291 Mecanismo para mover la fase (micrometro)

1293 Plataforma basculante en la fase

1295 Espejo (en la plataforma)

1297 Base (para el ensamblaje de espejo superior)

1299 Fase (para el ensamblaje de espejo superior)

1301 Plataforma basculante (para el ensamblaje de espejo superior)

1303 Espejo (para el ensamblaje de espejo superior)

1305 Mecanismo para mover la Fase superior

1309 Placas de puntena (fijadas a la pared lateral de la carcasa)

1311 Orificios alineados de forma vertical (en las placas de puntena)

1315 1er filtro reflectante

1317 2° filtro reflectante

1319 3er filtro reflectante

1321 4° filtro reflectante

Placas deflectoras comunes

1331 Dos placas deflectoras comunes

1333 Armazon (para el montaje de las placas deflectoras comunes en la carcasa) Sistema multi-canal modular

4001 Sistema multi-canal 4009 Unidad de citometna modular 4011 Alojamiento para la unidad modular 4013 Carcasa comun 4015 Laser

4017 Sistema divisor y de grna del haz

4021 Orificio para que el laser entre en el alojamiento modular

4023 Placa para cubrir el orificio de salida

4025 Sistema de recogida para el sistema

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Sistema de boquilla de tubo capilar

1335 Sistema de boquilla de tubo capilar 1337 Tubo capilar

1341 Camara llena con medio transmisor de luz Sistemas alternativos de clasificacion

1351 Sistema de clasificacion de foto deterioro

1353 Segundo laser

1355 Receptaculo de recogida

1357 Sistema de derivacion de fluido

1359 Dispositivo de derivacion de fluido

1361 Derivacion capilar hasta el primer recipiente de recogida

1365 Derivacion capilar hasta el segundo recipiente de recogida

1367 Transductor (para crear ondas de presion para controlar de forma selectiva la direccion del flujo de fluido)

1369 Tubo capilar en el extremo de la boquilla

1371 Sistema de clasificacion de corriente de interferencia de gotitas

1373 Corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad

1375 Sistema de generacion de gotitas para la corriente de gotitas de alta velocidad 1377 Sistema de boquilla de alta velocidad 1379 Corriente de fluido de alta velocidad

1381 Transductor para la generacion de corriente de interferencia de gotitas 1383 Gotitas de alta velocidad

1387 Placa deflectora electrica para la desviacion de gotitas de alta velocidad

1389 Gotitas no cargadas

1391 Gotitas cargadas

1397 Segmento desviado de la corriente de fluido

1399 Interseccion de la corriente de gotitas de alta velocidad con la corriente de fluido coaxial 1403 Capilares de recogida

Sistema de recogida

2201 Sistema de recogida

2203 Dispositivo de intercepcion

2205 Superficie de impacto 2207 Recipiente de recogida 2211 Entrada de gotitas

2213 Deposito de pipeta

2215 Pipeta

2217 Pared interior de la pipeta 2225 Tubo grna

2227 Armazon del sistema de recogida 2229 Soporte circular

2231 Tornillo fijador para la altura del dispositivo de intercepcion

2233 Placa de montaje

2235 Tornillos fijadores para el ajuste lateral

2241 Muesca lateral

2243 Bandeja para alojar los recipientes de recogida

2245 Ventana de salida

2247 Primer dispositivo de intercepcion

2249 Segundo dispositivo de intercepcion

2265 Gotitas dispersas

Fluido de recogida

2301 Fluido de recogida Filtracion

2401 Filtro

2403 Recipiente de recogida para filtracion

2405 Suspension concentrada que contiene celulas espermaticas

2409 Mecanismo de jeringa

2411 Filtro de canula

2413 Fluido de resuspension

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2419 Segundo recipiente 2421 Jeringa para experimento de filtracion 2423 Muestra para experimento de filtracion 2425 Filtro para experimento de filtracion 2427 Bomba de vacm para experimento de filtracion 2431 Jeringa para experimento de filtracion II 2433 Muestra para experimento de filtracion II 2435 Filtro para experimento de filtracion II 2437 Porta-filtros para experimento de filtracion II

Crioconservacion

2501 Ajustar la concentracion

2503 Anadir crioprotector

2505 Anadir fuente de protema

2507 Cargar en las pajitas

2509 Refrigerar hasta la temperature de mantenimiento

2511 Mantener a temperatura de mantenimiento

2513 Refrigerar hasta temperatura proxima a la zona cntica

2515 Refrigerar a traves de un intervalo de formacion de cristales de hielo

2517 Sumergir en nitrogeno lfquido

Sistema comun de recogida

2801 Sistema comun de recogida

2803 Armazon comun para dispositivos de intercepcion

2805 Cuba de residuos

2807 Bandeja para los recipientes de recogida

Sistema de laser pulsado

3001 Laser pulsado

3003 Detector de pulso de laser

3005 Pulso de laser

3007 Extincion de la vida del pulso de fluorescencia 3009 Muestra digital

Descripcion detallada de las realizaciones

La realizacion de la presente invencion se refiere a un sistema y metodo para la clasificacion de celulas espermaticas X e Y.

Resumen general

La Figura 1 es un diagrama de flujo de trabajo que proporciona una vision global de las etapas en un proceso de clasificacion de esperma ejemplar. El proceso empieza con la recogida de muestras puras de semen de uno o mas animales macho (por ejemplo, toros) en la etapa 39. Las muestras de semen se marcan para su identificacion en la etapa 41, se ponen en contacto con un tampon, en la etapa 41A y se transportan a una instalacion de procesamiento. Ademas del tampon, tambien pueden anadirse aditivos en la etapa 41A, incluyendo, por ejemplo, una fuente de energfa, una fuente de protemas, un antibiotico, y/o una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular. Puede realizarse un ensayo opcional de control de calidad en la etapa 43 para asegurar que la calidad de cada muestra (por ejemplo, motilidad del esperma) es suficiente para indicar que el producto final probablemente cumplira los criterios mmimos de calidad. Puede realizarse una etapa opcional de lavado en la etapa 47. En la etapa 47A se selecciona el protocolo de tincion que se usara para el procesamiento usando diversos protocolos de tincion para tenir almuotas de la muestra y despues analizando la capacidad de clasificacion de cada almuota para identificar un protocolo de tincion para esa muestra particular. La tincion de acuerdo con el protocolo de tincion seleccionado se realiza en la etapa 49 anadiendo un fluido de tincion 48 que contiene un colorante qmmico (por ejemplo, un colorante fluorescente ADN selectivo) a cada muestra. Ademas del fluido de tincion, tambien pueden anadirse aditivos en la etapa 48, incluyendo, por ejemplo, una fuente de energfa, una fuente de protemas, un antibiotico, y/o una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular. Las muestras se incuban en la etapa 51 para permitir la captacion del colorante por el esperma. Despues se carga una muestra en el dispositivo de introduccion de muestra de un citometro de flujo en la etapa 53. El fluido de muestra se introduce en el citometro de flujo junto con un fluido envolvente en la etapa 54. Ademas del fluido envolvente, tambien pueden anadirse aditivos en la etapa 54, incluyendo, por ejemplo, una fuente de energfa, una fuente de protemas, un antibiotico, y/o una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular. En la etapa 55 el citometro de

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flujo clasifica las celulas espermaticas de acuerdo con una caractenstica de ADN especificada, como se describira a continuacion. Segun se recogen las celulas espermaticas clasificadas por el sistema de recogida del citometro de flujo en la etapa 57, se anaden a un recipiente de recogida que contiene un fluido de recogida o criodiluyente en la etapa 58A. Ademas del fluido de recogida, tambien pueden anadirse aditivos en la etapa 58A, incluyendo, por ejemplo, una fuente de energfa, una fuente de protemas, un antibiotico, y/o una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular. En este momento las celulas espermaticas estan en una solucion que se ha diluido por los diversos fluidos anadidos durante todo el proceso. Por consiguiente, la poblacion de celulas espermaticas que tienen la caractenstica de ADN deseada se concentran en la etapa 58B para su uso en inseminacion artificial comercial. Se anade un criodiluyente a las celulas espermaticas clasificadas concentradas en la etapa 58C. Ademas del criodiluyente, tambien pueden anadirse aditivos en la etapa 58C, incluyendo, por ejemplo, una fuente de energfa, una fuente de protemas, un antibiotico, y/o una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular. Las celulas espermaticas entonces se envasan en recipiente tubulares (mencionados en la industria reproductiva como "pajitas") en la etapa 59 y se crioconservan en la etapa 61. El esperma crioconservado se envasa para su almacenamiento en nitrogeno ftquido en la etapa 63. El esperma crioconservado despues se distribuye a traves de un sistema de distribucion comercial en la etapa 65 y se vende a criadores de animales en la etapa 67. Los criadores de animales pueden almacenar el esperma crioconservado en la etapa 69 hasta que esten listos para usar el esperma para inseminar de forma artificial un animal hembra (por ejemplo, vaca) en la etapa 71.

Recogida y dilucion de muestras

Recogida de muestras

La muestra de esperma a clasificar puede ser una muestra recien recogida de un animal fuente, tal como una fuente bovina, equina, porcina, u otra fuente mairnfera, o una muestra descongelada previamente crioconservada. Ademas, la muestra puede ser un unico eyaculado, multiples eyaculados combinados del mismo mamftero, o multiples eyaculados combinados de dos o mas animales.

Se conocen diversos metodos de recogida e incluyen el metodo de la mano enguantada, el uso de una vagina artificial, y electro-eyaculacion. El esperma preferiblemente se recoge o se transfiere rapidamente en un recipiente aislado para evitar un rapido cambio de temperatura desde las temperaturas fisiologicas (tfpicamente aproximadamente de 35°C a aproximadamente 39°C). El eyaculado tfpicamente contiene de aproximadamente 0,5 a 15 billones de esperma por mililitro, dependiendo de la especie y animal particular.

Independientemente del metodo de recogida, puede extraerse una aftcuota de la muestra de esperma y evaluarse para diversas caractensticas, tales como por ejemplo, concentracion de esperma, motilidad del esperma, motilidad progresiva del esperma, pH de la muestra, integridad de la membrana del esperma, y la morfologfa del esperma. Estos datos pueden obtenerse por examen del esperma usando, por ejemplo, el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos convencionales y bien conocidos (vease, por ejemplo, Farrell et al. Theriogenology (1998) 49 (4): 871-9; y patentes de Estados Unidos N° 4.896.966 y 4.896.967).

Dilucion

La muestra de esperma puede combinarse con un tampon (en forma de un solido o solucion) para formar una suspension de esperma. Entre otras cosas, el tampon puede potenciar la viabilidad del esperma tamponando la suspension contra cambios significativos en el pH o la presion osmotica. Generalmente, un tampon es no toxico para las celulas y es compatible con el colorante usado para tenir las celulas. Tampones ejemplares incluyen fosfatos, difosfatos, citratos, acetatos, lactatos, y combinaciones de los mismos. Los tampones actualmente preferidos incluyen TCA, TEST, citrato sodico, HEPES, TL, TES, acido cftrico monohidrato, HEPEST (Gradipore, St. Louis, MO), PBS (Johnson et al., Gamete Research, 17: 203-212 (1987)), y PBS de Dulbecco (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Pueden combinarse uno o mas tampones juntos o con aditivos como se analiza a continuacion para formar una solucion tamponada, y la solucion tamponada puede combinarse con la muestra de esperma para formar una suspension de esperma. Una solucion tamponada tambien puede contener uno o mas aditivos, como se describe en mayor detalle a continuacion. Se describen soluciones tamponadas ejemplares en la Tabla I. Las soluciones tamponadas preferidas incluyen una solucion que comprende base TRIS al 3%, acido cftrico monohidrato al 2%, y fructosa al 1% (p/v) en agua a un pH de aproximadamente 7,0, una solucion denominada como TCA n° 1 en la Tabla 1, y una solucion denominada como TCA n° 2 en la Tabla I.

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TABLA I. Soluciones tamponadas

COMPONENTES: TCA n° 1 TCA n° 2 ENSAYO Citrato Na HEPES TL

Cloruro sodico (NaCl): 7,6 g 5,84 g

Cloruro potasico (KCl): 0,3 g 0,23 g

Bicarbonato sodico (NaHCO3): 2,1 g

Fosfato sodico monobasico (NaH2PO4-H2O): 0,04 g

Acido (+)-2-hidroxiproprionico (Lactato Na): 3,68 ml

Cloruro de magnesio (MgCl2): 0,1 g 0,08 g

Acido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2- etanosulfonico) (HEPeS): 2,38 g 2,38 g

Tris(hidroximetil) amimonetano (TRIS base): 30,3 g 32,02 g 10,28 g

Acido dtrico monohidrato: 15,75 g 18,68 g

Citrato Na dihidrato: 29 g

Acido 2-[(2-hidroxi-1,1-bis[hidroximetil] etil) aminoetanosulfonico (tEs): 43,25 g

Fructosa: 12,5 g 2,67 g 10 g 2,52 g

D-Glucosa: 2 g

Esteptamicina: 0,25 g

Penicilina-G: 0,15 g

Agua: 1 litro 1 litro 1 litro 1 litro 1 litro 1 litro

pH diana: 7,35 7,35 7,35 7,35 7,35 7,35

Osmolalidad diana (miliosmol/kg H2O): ~314 ~300 ~302 ~316 ~298 ~296

Como alternativa, el esperma puede combinarse con un inhibidor metabolico para formar una suspension de esperma inhibido. Los inhibidores metabolicos causan que las celulas espermaticas emulen a las celulas espermaticas del epid^dimo de un mairnfero, tal como por ejemplo un toro, simulando el entorno fluido del epid^dimo o el tracto epididimario del mamffero. Dicho inhibidor reducina o inhibina la motilidad y actividad metabolica del esperma. Los inhibidores ejemplares de esta clase incluyen inhibidores basados en carbonato, tales como por ejemplo aquellos descritos en Salisbury y Graves, J. Reprod. Fertil., 6: 351-359 (1963). Un inhibidor preferido de este tipo comprende NaHCO3, KHCO3, y C6H8O7H2O. Un inhibidor mas preferido de este tipo comprende 0,204 g de NaHCO3, 0,433 g de KHCO3, y 0,473 g de C6H8O7H2O por 25 ml de agua purificada (0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l y C6H8O7H2O en agua).

Ademas de un tampon, la suspension de esperma tambien puede contener un intervalo de aditivos para potenciar la viabilidad o motilidad del esperma. Aditivos ejemplares incluyen fuentes de energfa, fuentes de protemas, antibioticos, y composiciones que regulan las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular. Puede introducirse uno o mas de estos aditivos en el tampon o solucion tamponada antes de la formacion de la suspension de esperma o, como alternativa, pueden introducirse por separado en la suspension de esperma.

Puede anadirse una o mas fuentes de energfa para minimizar o inhibir que las celulas espermaticas oxiden los fosfolfpidos intracelulares y otros componentes celulares. Fuentes de energfa ejemplares incluyen monosacaridos, tales como fructosa, glucosa, galactosa y manosa, y disacaridos, tales como sacarosa, lactosa, maltosa, y trehalosa, asf como otros polisacaridos. Por ejemplo, la suspension de esperma resultante puede incluir de aproximadamente un 1% (p/v) a aproximadamente un 4% (p/v) de la fuente o fuentes de energfa. Si se incluye, la fuente de energfa es preferiblemente fructosa y la suspension de esperma contiene aproximadamente un 2,5% (p/v).

Para minimizar el impacto de la dilucion, proporcionar soporte a las celulas, o dispersar las celulas por toda la suspension, tambien puede incluirse una fuente de protemas en el tampon, solucion tamponada, o suspension de esperma. Las fuentes de protemas ejemplares incluyen yema de huevo, extracto de yema de huevo, leche (incluyendo homogeneizada por calory desnatada), extracto de leche, protema de soja, extracto de protema de soja, albumina serica, albumina serica bovina, suplemento sustituto de suero humano, y combinaciones de los mismos. La

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albumina, y mas particularmente la albumina serica bovina (BSA), es una fuente preferida de protemas. Por ejemplo, si se incluye, la BSA puede estar presente en la suspension de esperma en una cantidad de menos de aproximadamente el 5,0% (p/v), preferiblemente menos de aproximadamente el 2% (p/v), mas preferiblemente menos de aproximadamente el 1% (p/v), y mucho mas preferiblemente en una cantidad de aproximadamente el 0,1% (p/v).

El uso de una fuente de protemas, tal como BSA, en solitario puede iniciar el proceso de capacitacion en un porcentaje de las celulas espermaticas en la suspension. Se prefiere que este proceso tenga lugar en el tracto reproductor femenino. Por lo tanto, para inhibir el inicio de la capacitacion durante la dilucion, asf como durante la posterior tincion y clasificacion, puede incluirse una fuente alternativa de protemas o un sustituto proteico en la suspension de esperma. La fuente alternativa de protemas o sustituto proteico posee los efectos ventajosos de una fuente tfpica de protemas, tal como BSA, ademas de la capacidad de inhibir el inicio de la capacitacion en un porcentaje mayor de las celulas en la suspension de esperma. Ejemplos de fuentes alternativas de protemas incluyen suplemento sustituto de suero humano (SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y BSA potenciador de colesterol, mientras que un ejemplo de un sustituto proteico incluye un alcohol polivimlico, tal como por ejemplo, un alcohol polivimlico de viscosidad baja a media generalmente de un peso molecular de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 60.000. Generalmente, si se incluye, estas composiciones estaran presentes en las mismas cantidades analizadas anteriormente con respecto a BSA, no excediendo generalmente el contenido total de albumina del tampon o solucion tamponada de aproximadamente el 5,0% (p/v).

Puede anadirse un antibiotico a la suspension de esperma para inhibir el crecimiento bacteriano. Antibioticos ejemplares incluyen, por ejemplo, tilosina, gentamicina, lincomicina, espectinomicina, Linco-Spectin® (clorhidrato de lincomicina-espectinomicina), penicilina, estreptomicina, ticarcilina, o cualquier combinacion de los mismos. Los antibioticos pueden estar presentes en una concentracion de aproximadamente 50 |ig a aproximadamente 800 |ig por ml de semen, independientemente de si el semen esta puro, tamponado, o contiene sustancias adicionales, tales como por ejemplo, cualquiera de los aditivos mencionados en este documento. Los Certified Semen Services (CSS) y la National Association of Animal Breeders (NAAB) han aprobado directrices respecto al uso de antibioticos con respecto a la recogida y uso de esperma.

Tambien puede incluirse una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular en la suspension de esperma. Dicha composicion puede proporcionar un efecto protector a las celulas espermaticas, tal como por ejemplo manteniendo la viabilidad o la motilidad progresiva del esperma. Ejemplos de dicha composicion incluyen, por ejemplo, piruvato, vitamina K, acido lipoico, glutation, flavinas, quinonas, superoxido dismutasa (SOD), y sOd irnmicos. Si se incluye en la suspension de esperma, dicha composicion puede estar presente en una concentracion suficiente para realizar el efecto protector sin afectar de forma perjudicial a la salud del esperma. Intervalos de concentracion ejemplares incluyen de aproximadamente 10 |iM a aproximadamente 50 |iM dependiendo de factores tales como la composicion particular que se este usando o la concentracion de esperma en la suspension. Por ejemplo, puede estar presente piruvato en la suspension de esperma en una concentracion de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferiblemente de aproximadamente 2,5 mM a aproximadamente 40 mM, mas preferiblemente de aproximadamente 5 mM a 25 mM, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 10 mM a 15 mM, aun mas preferiblemente de 15 mM, y mucho mas preferiblemente de aproximadamente 10 mM. Puede estar presente vitamina K en la suspension de esperma en una concentracion de aproximadamente 1 |iM a aproximadamente 100 |iM, preferiblemente de aproximadamente 10 |iM a aproximadamente 100 |iM, y mas preferiblemente de aproximadamente 100 |iM. Puede estar presente acido lipoico en la suspension de esperma en una concentracion de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 mM, preferiblemente de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1 mM, y mas preferiblemente de aproximadamente 1 mM.

Tincion de las celulas a clasificar

Generalmente, las celulas espermaticas pueden tenirse formando una mezcla de tincion que comprende celulas espermaticas, un tampon, y un colorante. Las celulas espermaticas pueden obtenerse de una muestra de semen recien obtenida, como se ha analizado anteriormente con respecto a la recogida y dilucion de muestras, o de una muestra de semen crioconservada descongelada.

Si la muestra de semen es una muestra descongelada previamente crioconservada, el esperma se descongela preferiblemente inmediatamente antes de la tincion. Generalmente, puede colocarse una pajita u otro recipiente de crioconservacion que contenga el esperma congelado en un bano de agua, cuya temperatura esta preferiblemente en exceso de la temperatura de transicion vftrea de la membrana de las celulas espermaticas (es decir, aproximadamente 17°C), pero no tan elevada como para afectar de forma adversa a la salud del esperma. Por ejemplo, el esperma congelado puede descongelarse sumergiendo el recipiente de crioconservacion en un bano de agua mantenido a una temperatura de aproximadamente 17°C a aproximadamente 40°C durante un periodo de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 90 segundos.

Una vez obtenidas, las celulas espermaticas pueden introducirse en la mezcla de tincion en forma de semen puro o

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en forma de una suspension derivada del mismo, por ejemplo, una suspension de esperma como se ha analizado anteriormente con respecto a la recogida y dilucion de muestras.

El colorante puede estar en forma de un solido puro o una composicion Kquida. El colorante tambien puede disolverse o dispersarse en un lfquido no tamponado para formar una solucion de colorante. Como alternativa, el colorante puede estar en forma de una suspension de colorante que comprende un colorante y un tampon o solucion tamponada que es biologicamente compatible con las celulas espermaticas. Se ha analizado anteriormente un intervalo de tampones y soluciones tamponadas ejemplares con respecto a la recogida y dilucion de muestras. Por ejemplo, entre los tampones que pueden usarse esta una solucion tamponante TCA que comprende base TRIS al 3%, acido cftrico monohidrato al 2%, y fructosa al 1% en agua a un pH de aproximadamente 7,0, o una solucion inhibidora basada en carbonato que comprende 0,204 g de NaHCO3, 0,433 g de KHCO3, y 0,473 g de C6H8O7 H2O por 25 ml de agua purificada (0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l de C6H807H2O en agua). Por tanto, por ejemplo, puede formarse una mezcla de tincion combinado el semen puro con un colorante. Como alternativa, la mezcla de tincion puede formarse combinando semen puro con un tampon o solucion tamponada y un colorante. Ademas, la mezcla de tincion puede formarse combinando una suspension de esperma con un colorante.

La mezcla de tincion puede formarse usando uno o mas colorantes ADN selectivos excitables por luz UV o visible como se ha descrito previamente en la patente de Estados Unidos N° 5.135.759 y el documento WO 02/41906. Colorantes selectivos ejemplares excitables por luz UV incluyen Hoechst 33342 y Hoechst 33258, cada uno de los cuales esta disponible en el mercado en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Colorante ejemplares excitables por luz visible incluyen SYBR-14, disponible en el mercado en Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) y el conjugado bisbencimida-BODIPY® 6-{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroboril)-3,5-dimetil-1H-pirrol-2-il]metileno}-2H-pirrol-5-il)propanoil] amino}-N-[3-(metil{3-[({4-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H,3'H-2,5'-bibencimidazol-2'-il]fenoxi}acetil)amino]propil}amino) propil]hexanamida ("BBC") descrito en el documento WO 02/41906. Cada uno de estos colorantes puede usarse solo o en combinacion; como alternativa, pueden usarse otros colorantes excitable por luz UV y visible que penetran en las celulas, solos o en combinacion con los colorantes mencionados anteriormente, con la condicion de que el colorante no afecte de forma perjudicial a la viabilidad de las celulas espermaticas a un grado inaceptable cuando se usa en concentraciones que posibilitan la clasificacion como se describe en otra parte.

La concentracion preferida del colorante ADN selectivo en la mezcla de tincion es una funcion de un intervalo de variables que incluyen la permeabilidad de las celulas al colorante seleccionado, la temperatura de la mezcla de tincion, la cantidad de tiempo permitido para que suceda la tincion, y el grado de enriquecimiento deseado en la posterior etapa de clasificacion. En general, la concentracion de colorante es preferiblemente suficiente para conseguir el grado deseado de tincion en un periodo razonablemente corto de tiempo sin afectar de forma sustancialmente perjudicial a la viabilidad del esperma. Por ejemplo, la concentracion de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14, o BBC en la mezcla de tincion generalmente sera entre aproximadamente 0,1 |iM y aproximadamente 1,0 M, preferiblemente de aproximadamente 0,1 |iM a aproximadamente 700 |iM, y mas preferiblemente de aproximadamente 100 |iM a aproximadamente 200 |iM. Por consiguiente, en una serie de condiciones de tincion, la concentracion de Hoechst 33342 es preferiblemente aproximadamente 100 |iM. En otra serie de condiciones de tincion, la concentracion de Hoechst 33342 es aproximadamente 150 |iM. En otra serie mas de condiciones de tincion la concentracion es preferiblemente aproximadamente 200 |iM.

Ademas del tampon, pueden incluirse otros aditivos en la mezcla de tincion para potenciar la viabilidad o motilidad del esperma; estos aditivos pueden proporcionarse como parte de la fuente de esperma, la fuente de colorante, o por separado a la mezcla de tincion. Dichos aditivos incluyen fuentes de energfas, antibioticos, composiciones que regulan las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular, y plasma seminal, las tres primeras de las cuales se han analizado anteriormente con respecto a la recogida y dilucion de muestras, y la ultima de las cuales se analiza a continuacion con respecto a los fluidos de recogida. Dichos aditivos pueden anadirse durante las tecnicas de tincion de acuerdo con las mismas.

En particular, se ha observado que la inclusion de una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular en la mezcla de tincion puede ayudar a mantener la viabilidad del esperma a elevadas temperaturas de tincion, a elevadas concentraciones de colorante, en periodos aumentados de tincion, o cualquier combinacion de los mismos. Ejemplos de estas composiciones y el uso de las mismas se ha analizado anteriormente con respecto a tampones y diluyentes. Dichas composiciones pueden anadirse durante las tecnicas de tincion de acuerdo con las mismas.

La mezcla de tincion puede mantenerse a cualquiera entre un intervalo de temperaturas; tipicamente, este sera dentro de un intervalo de aproximadamente 4°C a aproximadamente 50°C. Por ejemplo, la mezcla de tincion puede mantenerse a una temperatura "relativamente baja", es decir, una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C. Como alternativa, la mezcla de tincion puede mantenerse dentro de un intervalo de temperatura "intermedia", es decir, una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 39°C. Ademas, la mezcla de tincion puede mantenerse dentro de un intervalo de temperatura "relativamente elevada", es decir, una temperatura de aproximadamente 40°C a aproximadamente 50°C. La seleccion de una temperatura preferida

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generalmente depende de un intervalo de variables, incluyendo por ejemplo, la permeabilidad de las celulas al colorante o colorantes que se esten usando, la concentracion del colorante o colorantes en la mezcla de tincion, la cantidad de tiempo que las celulas se mantendran en la mezcla de tincion, y el grado de enriquecimiento deseado en la etapa de clasificacion.

La captacion del colorante por las celulas espermaticas en la mezcla de tincion se deja continuar durante un periodo de tiempo suficiente para obtener el grado deseado de tincion del ADN. Ese periodo es tipicamente un periodo suficiente para que el colorante se una al ADN de las celulas espermaticas de modo que puedan clasificarse las celulas espermaticas que albergan el cromosoma X e Y en base a la intensidad de fluorescencia diferente y medible entre los dos. Generalmente, este sera de no mas de aproximadamente 160 minutos.

Fluido envolvente

Para clasificar las celulas espermaticas, las celulas tenidas se introducen como un fluido de muestra en la boquilla de un citometro de flujo como se describe a continuacion. Como parte del proceso, el fluido de muestra se rodea tfpicamente por un fluido envolvente. El fluido envolvente permite que las celulas espermaticas en el fluido de muestra se extraigan en una unica lmea en fila como se analiza a continuacion. El fluido envolvente se recoge junto con las celulas espermaticas por el sistema de recogida del citometro de flujo y por lo tanto forma parte del entorno post-clasificacion para las celulas espermaticas. Por tanto, es deseable que el fluido envolvente proporcione un efecto protector a las celulas tras el contacto de las celulas por el fluido envolvente.

El fluido envolvente generalmente comprende un tampon o solucion tamponada. Ejemplos de tampones y soluciones tamponadas y concentraciones ilustrativas de los mismos que pueden usarse en el fluido envolvente se han analizado anteriormente con respecto a la recogida y dilucion de muestras. En un ejemplo particular, el fluido envolvente comprende solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco al 0,96% (p/v), BSA al 0,1% (p/v), en agua a un pH de aproximadamente 7,0.

Opcionalmente, el fluido envolvente tambien puede contener un intervalo de aditivos que son beneficiosos para la viabilidad o motilidad del esperma. Dichos aditivos incluyen, por ejemplo, una fuente de energfa, una fuente de protemas, un antibiotico, una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de forma intracelular y/o extracelular, una fuente alternativa de protemas, y alcohol polivimlico. Cada uno de estos aditivos, y ejemplos de los mismos, se ha analizado anteriormente con respecto a la recogida y dilucion de muestras. Dichos aditivos pueden anadirse al fluido envolvente de acuerdo con los mismos.

El fluido envolvente puede filtrarse opcionalmente antes de la etapa de clasificacion. Los contaminantes que pueden estar presentes en el fluido envolvente, tales como particulados no solubles, pueden impedir la clasificacion. Por lo tanto, el fluido envolvente puede filtrarse antes de su introduccion en un citometro de flujo. Dichos filtros y metodos para usar los mismos son bien conocidos en la tecnica. Generalmente, el filtro es una membrana de aproximadamente 0,1 micrometres a aproximadamente 0,5 micrometres.

Las celulas tenidas pueden introducirse en el fluido envolvente en cualquier momento posterior a la tincion. Tfpicamente, se inyecta una corriente de las celulas tenidas en el fluido de muestra en una corriente de fluido envolvente dentro de la boquilla del citometro de flujo. Inicialmente, no existe contacto sustancial del fluido de muestra y el fluido envolvente debido al flujo laminar de los fluidos como se analiza en mayor detalle a continuacion. Es deseable que el fluido de muestra y el fluido envolvente permanezcan como corrientes de flujo sustancialmente diferentes hasta despues de que las partreulas (por ejemplo, las celulas espermaticas tenidas) en el fluido de muestra se hayan analizado. En algun punto, sin embargo, el fluido envolvente y las celulas del fluido de muestra entran en contacto entre sf. Por ejemplo en un citometro de flujo de clasificacion de gotitas (analizado a continuacion) el fluido envolvente y el fluido de muestra empiezan a contactar entre sf segun se estan formando las gotitas corriente abajo de la localizacion de examen.

En el momento de la introduccion de las celulas tenidas y el fluido envolvente, tanto las celulas tenidas como el fluido envolvente pueden estar a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 50°C. El fluido envolvente y las celulas tenidas pueden estar a la misma temperatura o a diferentes temperaturas, estando cualquiera de ellos a una temperatura mayor que el otro. Por consiguiente, en el momento de la introduccion de las celulas tenidas y el fluido envolvente, tanto las celulas como el fluido envolvente estan a la misma temperatura; por ejemplo, a una temperatura "relativamente baja", tal como por ejemplo de aproximadamente 5°C a aproximadamente 8°C; a una temperatura "intermedia", tal como por ejemplo de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C; o a una temperatura "relativamente elevada", tal como por ejemplo de aproximadamente 40°C a aproximadamente 43°C.

CITOMETRIA DE FLUJO

La presente invencion emplea tecnologfas de la invencion en citometna de flujo para la clasificacion de celulas espermaticas X e Y. Con referencia ahora a las Fig. 2 y 3, se denomina una realizacion de un sistema de citometna de flujo de la presente invencion en su totalidad por el numero de referencia 1. Como se comprobara, el sistema de

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citometna de flujo 1 es util para clasificar y ordenar partfculas, tales como celulas espermaticas, de acuerdo con caractensticas seleccionadas. En general, el sistema 1 comprende un suministro 3 de fluido portador 17 que contiene partfculas a clasificar, un suministro 7 de fluido envolvente 19, un aparato de citometna de flujo que tiene capacidades de clasificacion, generalmente denominado 9, y un sistema de suministro de fluidos 15 para suministrar los fluidos portador 17 y envolvente 19 desde los respectivos suministros 3, 7 a presion hasta el aparato de citometna de flujo 9. El aparato de citometna de flujo 9 esta adaptado para recibir los fluidos portador 17 y envolvente 19, para combinar los fluidos 17, 19 para crear una corriente de fluido presurizado 21, para dirigir la corriente 21 que porta las partfculas a traves de un haz de radiacion electromagnetica enfocado 25 (por ejemplo, luz laser UV), y para analizar la radiacion electromagnetica 31 (por ejemplo, luz fluorescente) emitida por las partfculas que pasan a traves del haz enfocado 25. El aparato 9 tambien funciona descomponiendo la corriente 21 en gotitas 33 que contienen partfculas a evaluar, y clasificando las gotitas 33 en base a las mediciones mencionadas anteriormente de acuerdo con una o mas caractensticas de las partfculas contenidas en las gotitas 33. Aunque este sistema puede usarse para analizar y preferiblemente clasificar cualquier tipo de partfcula, tiene aplicacion particular para la clasificacion de celulas de acuerdo con una o mas caractensticas deseadas de las celulas (por ejemplo, tamano, contenido de ADN, forma, densidad, secuencia genica, etc.). Este sistema es especialmente adecuado para la clasificacion de celulas espermaticas animales para uso comercial por la industria de produccion animal para inseminacion artificial in vivo o in vitro.

APARATO Y METODO DE CLASIFICACION DE UN CANAL

Aparato de citometna de flujo

El aparato de citometna de flujo 9 mostrado en la Fig. 3 comprende un sistema de boquilla, generalmente denominado 101, para suministrar una corriente de fluido 21 que contiene partfculas (por ejemplo, celulas espermaticas tenidas) a traves de un orificio de boquilla 103 a presion con las celulas sustancialmente en una fila unica y, en el caso de celulas espermaticas, con las cabezas asimetricas de las celulas espermaticas sustancialmente en una orientacion deseada que se describira. Como en sistemas convencionales de clasificacion de gotitas por citometna de flujo, se proporciona un transductor 105 opuesto al orificio de boquilla 103 para introducir energfa acustica en la corriente de fluido 21 que causa que la corriente 21 se rompa en gotitas 33 que contienen celulas individuales en una localizacion de "rotura de gotitas" 107 espaciada del orificio de boquilla 103. El sistema 1 tambien incluye un sistema optico, generalmente denominado 109, para enfocar un haz de radiacion electromagnetica 25 (por ejemplo, luz laser UV de 350-700 nm o visible) sobre la corriente de fluido 21 en una localizacion de "examen" 115 que, en el ejemplo descrito, esta entre el orificio de boquilla 103 y la localizacion de rotura de gotitas 107. Por tanto, el ejemplo descrito es un sistema de chorro-en-aire. En otros ejemplos, la localizacion de examen 107 podna estar dentro del orificio de boquilla 103 o corriente arriba del orificio 103. En cualquier caso, las celulas estan adaptadas para pasar a traves del haz de luz 25 en la localizacion de examen 107, provocando la excitacion de un colorante qmmico (u otro medio indicador) en las celulas para causar emisiones de fluorescencia 31 que tienen una longitud de onda diferente de la del haz 25 (por ejemplo, si la luz de iluminacion 25 tiene una longitud de onda de aproximadamente 350 a 370 nm, las emisiones fluorescentes 31 pueden tener una longitud de onda de aproximadamente 460 nm). Un fotodetector 117 es operativo para detectar estas emisiones 31 y para convertirlas en senales electricas que se procesan y usan para clasificar las celulas de acuerdo con caractensticas seleccionadas, tales como el contenido de cromosoma X/Y de celulas espermaticas. El aparato de citometna de flujo 9 comprende adicionalmente un sistema de clasificacion, generalmente denominado 119, para la clasificacion de las gotitas 33 en diferentes grupos o poblaciones (por ejemplo, dos poblaciones 123,125) de acuerdo con la clasificacion de las celulas contenidas en las gotitas 33 y un sistema de recogida, generalmente denominado 2201 (Fig. 2), para recoger las gotitas 33 y mantener la segregacion de las diferentes poblaciones 123,125.

El funcionamiento del sistema 1 se controla por un procesador 131, tal como un microprocesador u otro control y/o procesador digital o analogico, o combinaciones de los mismos, que controla las diversas funciones de los componentes del sistema 1 de un modo a describir. De forma significativa, el procesador 131 tambien es sensible a la informacion de analisis de las partfculas para controlar la salida del sistema 1 en base a estrategias de control y clasificacion seleccionadas que implican diferentes parametros, incluyendo la pureza deseada de una de las poblaciones clasificadas de partfculas, la cantidad aceptable (o porcentaje) de partfculas deseadas en una de las poblaciones en comparacion con la cantidad (o porcentaje) de las partfculas deseadas en una o mas de las otras poblaciones, y otros parametros, como se analizara posteriormente.

Sistema de boquilla

Con referencia a las Fig. 4 y 5, el sistema de boquilla 101 puede comprender, un cuerpo de flujo generalmente cilmdrico 133 que tiene un orificio longitudinal central 135 a traves del mismo, y una boquilla 137 sobre el cuerpo de flujo 133 que tiene un cuerpo de boquilla con forma de embudo 139. Un conducto 141 se extiende a traves del cuerpo de boquilla 139 de forma co-axial con el orificio 135 en el cuerpo de flujo 133 y termina en el orificio de boquilla 103 mencionado anteriormente en el extremo anterior de la boquilla 137. El cuerpo de boquilla 139 tiene un escariador con rosca interna 145 en su extremo posterior para recibir de forma roscada una proyeccion o pasador roscado 149 en el extremo anterior del cuerpo de flujo 133 para conectar de forma desmontable la boquilla 137 al cuerpo de flujo 133, estando la conexion sellada por un sellamiento de junta torica 155. Se entendera que la boquilla

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puede conectarse de forma desmontable al cuerpo de flujo de otros modos o, como alternativa, las partes podnan formarse de forma integral como una pieza.

Las partmulas se suministran a la boquilla 137 mediante un conducto 157 posicionado de forma co-axial en el orificio 135 del cuerpo de flujo 133. El diametro exterior del conducto 157 es menor que el diametro interior del orificio 135 de modo que se forma un espacio anular 167 alrededor del conducto 157. El conducto 157 es una aguja tubular (por ejemplo, una aguja de calibre 16 que tiene un diametro interior de 0,25 mm (0,01 pulgadas)) que tiene un extremo frontal que se extiende dentro del escariador 145 en la parte posterior de la boquilla 137. El extremo posterior del conducto 157 esta conectado al sistema de suministro de fluidos 15 para el suministro de fluido portador 17 (por ejemplo, una mezcla de tincion que contiene celulas espermaticas) hasta el conducto 157. El espacio anular 167 que rodea el conducto 157 esta conectado mediante un orificio radial 173 en el cuerpo de flujo 133 al sistema de suministro de fluidos 15 para el suministro de fluido envolvente 19 en el espacio anular 167. Como se muestra en las Fig. 3 y 5, puede proporcionarse un segundo orificio radial opcional 183 en el cuerpo de flujo 133 que conecta el espacio anular 167 a otra lmea (no mostrada) para el suministro de fluido envolvente adicional 19 a la boquilla 137.

Como en sistemas convencionales de citometna de flujo, el fluido envolvente 19 se introduce en el espacio anular 167 que rodea el conducto 157. La velocidad del fluido envolvente 19 segun fluye pasada la punta del conducto 157 es mucho mayor que la velocidad del fluido portador 17 que sale del conducto 157, de modo que el fluido portador 17 y las celulas (por ejemplo, celulas espermaticas) contenidas en el mismo se aceleran por el fluido envolvente 19 hacia el orificio 103 de la boquilla 137. Esta aceleracion funciona espaciando las celulas generalmente en una disposicion de una sola fila para su analisis separado por el sistema optico 109. El fluido envolvente 19 rodea el fluido portador 17, provocando que la corriente de fluido 21 tenga un nucleo central 189 de fluido portador 17 y una cubierta exterior co-axial 191 de fluido envolvente 19 que rodea el nucleo central 189 (vease la Fig. 6). Como entenderan los especialistas en citometna de flujo, el flujo laminar y el enfoque hidrodinamico del nucleo central 189 tiende a confinar las partmulas al nucleo 189, con poca mezcla de los fluidos envolvente 19 y portador 17 en la boquilla 137. Ademas, el nucleo central 189 permanece esencialmente intacto dentro de la cubierta 191 segun se mueve la corriente 21 a traves del sistema de boquilla 101, hasta el momento en que se forman gotitas 33 en la localizacion de rotura 107. Este tipo de flujo co-axial es particularmente adecuado para citometna de flujo, porque las partmulas a analizar estan confinadas dentro del nucleo relativamente estrecho 189 de la corriente. Como resultado, un haz de luz 25 enfocado sobre el centro o nucleo 189 de la corriente 21 iluminara las partmulas de modo que puedan analizarse sustancialmente una cada vez. Confinando el nucleo 189 dentro de un diametro suficientemente estrecho, puede obtenerse una iluminacion mas uniforme de las partmulas en el fluido central 189. Para buenos resultados analtticos, el diametro del nucleo que contiene las partmulas debe estar deseablemente dentro de un intervalo de 7 a 20 micrometros, y de forma mas deseable dentro de un intervalo de 7 a 14 micrometros. El diametro de la corriente central 189 puede aumentarse o disminuirse ajustando la tasa de suministro del portador 17 relativa a la tasa de suministro del fluido envolvente 19.

Orientacion de las celulas

Para optimizar los resultados analtticos, es deseable que las partmulas que tienen formas asimetricas esten en una orientacion deseada cuando pasan a traves del haz de luz desde el sistema optico. Como saben los especialistas en la tecnica, las emisiones de fluorescencia desde partmulas asimetricas tienden a ser anisotropicas (es decir, la intensidad de las emisiones no es uniforme en todas las direcciones). Como se usa en este documento, la expresion "orientacion deseada" significa una orientacion que permite que el sistema de procesamiento discrimine entre celulas que tienen diferentes caractensticas con una precision en un intervalo del 70% al 100%.

Para ilustrar el punto, se ilustra una celula espermatica bovina 201 en las Fig. 6 y 7. Tfpicamente, la celula tiene una cabeza con forma de pala 205 con caras opuestas relativamente planas por completo 207 y bordes estrechos 209, un nucleo 213 en la cabeza 205 que contiene la masa de ADN cromatico de la celula, y una cola 215 que se extiende desde la cabeza 205 que proporciona la motilidad necesaria para una fertilizacion eficaz. La celula espermatica bovina promedio 201 tiene una longitud de la cabeza 219 de aproximadamente 8 |im, una anchura de la cabeza 221 de aproximadamente 4 |im, y una longitud global 223 desde la parte frontal de la cabeza hasta el final de la cola de aproximadamente 100 |im. En la celula espermatica bovina promedio 201, el nucleo 213 ocupa la mayona del volumen de la cabeza y es solamente algo mas pequeno que la cabeza del esperma 205. Por tanto, la longitud del nucleo 217 es casi igual a la longitud de la cabeza 219, siendo de nuevo de aproximadamente 8 |im de longitud. Se ha observado que en bovinos los cromosomas X/Y de las celulas espermaticas 201 estan localizados en una region del nucleo 225 (Fig. 6) por debajo e inmediatamente adyacentes a la lmea media longitudinal o ecuator 211 o el centro de la cabeza 205. Mas espedficamente, esta region sub-ecuatorial 225 se extiende no mas de aproximadamente un 20% de la longitud del nucleo 217 sobre la mitad inferior (hacia la cola 215) del nucleo 213, y aun mas espedficamente no mas de aproximadamente 1,0-1,5 |im por debajo del ecuador 211 del nucleo 213.

Cuando las celulas espermaticas pasan a traves del haz de excitacion 25, es deseable que las celulas esten sustancialmente en fila unica y que la cabeza 205 de cada celula 201 este orientada de forma sustancialmente similar para reducir la variabilidad de orientacion de una celula a otra y de este modo proporcione una medicion mas uniforme de las celulas. Tambien se desea que las celulas tengan una orientacion que posibilite la discriminacion

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precisa entre celulas X e Y. De forma deseable, esta orientacion es una en que la longitud de la celula espermatica 201 esta generalmente alineada con la direccion del flujo de la corriente 227 (ya sea con la cabeza hacia delante (mostrado en la Fig. 6) o con la cabeza hacia atras) y en que la cabeza 205 de la celula espermatica 201 esta rotada sobre su eje longitudinal de modo que la cabeza 205 cae dentro de una envoltura angular 229 en que el haz de luz 25 desde el sistema optico 109 impactara sobre una cara amplia 207 de la celula 201 generalmente de costado, como se muestra esquematicamente en la Fig. 7, en lugar de un borde estrecho 209 de la celula. Preferiblemente, la envuelta 229 que define la orientacion deseada se genera por rotacion de una celula espermatica 201 a traves de un intervalo angular de R1 relativo a un plano P que es generalmente perpendicular al haz de luz entrante 25, como se ve en una seccion transversal tomada de forma transversal a traves de la corriente 21. El intervalo R1 es preferiblemente de 0 a 90 grados. La boquilla puede configurarse para conseguir esta orientacion deseada con una precision de hasta el 90% o mas.

La tolerancia para la orientacion del esperma (es decir, el tamano de la envuelta 229 definida por el intervalo angular R1) esta relacionada con la apertura numerica de la lente usada para recoger las emisiones de fluorescencia 31 desde las celulas espermaticas. En el ejemplo mostrado en la Fig. 7, por ejemplo, el sistema optico 109 tiene un volumen de deteccion 579 de emision de fluorescencia 31 definido por un angulo solido de 55 grados. Cuando la orientacion rotatoria de una cabeza de esperma 205 esta fuera de la envuelta 229 definida por R1 segun se mueve el esperma a traves del haz 25, se recogera una emision de fluorescencia 31 relativamente mas potente desde un borde 209 de la cabeza de esperma 205 por el sistema optico 109, evitando que el procesador 131 correlacione la intensidad de la emision de fluorescencia 31 con el contenido de cromosoma X/Y de la celula espermatica 201. Sin embargo, el sistema optico 109 no recoge las emisiones de fluorescencia 31 relativamente mas potentes desde el borde estrecho 209 de las cabezas de esperma 205 siembre que la orientacion rotatoria de una cabeza de esperma 205 este dentro de la envuelta 229 segun pasa a traves de la localizacion de examen 115. Por tanto, en el ejemplo mostrado en la Fig. 7, la orientacion de la celula espermatica no provoca la recogida de las emisiones de fluorescencia de los bordes relativamente mas potentes siempre que los bordes estrechos 209 de la cabeza de esperma 205 esten confinados dentro del angulo R1. El angulo solido del volumen de recogida 579 puede disminuirse usando una lente con una apertura numerica mas pequena, aumentando de este modo el angulo R1 y la tolerancia por esperma mal orientado. Sin embargo, esto tambien disminuye la cantidad de fotones que pueden recogerse por el sistema optico 109, que puede influir sobre la medicion de emisiones de fluorescencia 31 reduciendo la intensidad de las emisiones 31 detectadas por el fotodetector. Asimismo, si el sistema optico 109 recoge emisiones de fluorescencia 31 con una lente de elevada apertura numerica para obtener una intensidad mas potente de las emisiones de fluorescencia detectadas por el fotodetector, entonces disminuye la tolerancia por orientacion de esperma. Por tanto, en el diseno de un sistema, se tiene que encontrar un equilibrio entre la tolerancia por orientacion de esperma y la apertura numerica de la lente. El equilibrio optimo dependera de las capacidades de orientacion y la sensibilidad optica del sistema. Por ejemplo, se usa una lente que tiene una apertura numerica de 0,65.

Diseno de la boquilla

Como se muestra en las Fig. 8 y 9, el interior 231 del cuerpo de boquilla 139 corriente abajo del escariador 145 puede tener una superficie interior 233 que comprende una primera, segunda y tercera regiones axialmente ahusadas 235, 237, 239 para acelerar progresivamente la velocidad de la corriente de fluido 21 en una direccion corriente abajo hacia el orificio de boquilla 103. Como se ha indicado anteriormente, esta aceleracion funciona espaciando las partfculas (por ejemplo, celulas) en la corriente 21 de modo que asumen una formacion de fila generalmente unica de modo que puede analizarse sustancialmente una partfcula cada vez. Al menos dos de estas regiones, y preferiblemente las tres 235, 237, 239, tienen formas generalmente elfpticas (ovales) en las secciones transversales tomadas a angulos rectos al eje longitudinal 247 de la boquilla 137, como se muestra en las Fig. 9A- 9H y las Fig. 9J-9K. La superficie interior 233 del cuerpo de boquilla 139 tambien tiene una cuarta region 249, no ahusada, corriente abajo de las tres primeras regiones 235, 237, 239 e inmediatamente corriente arriba del orificio de boquilla 103 que puede estar formado en un miembro con orificio calibrado separado 255 fijado en un escariador 257 en la parte frontal del cuerpo de boquilla 139. Las formas de seccion transversal generalmente elfpticas de la primera 235 y segunda 237 regiones pueden orientarse en sustancialmente la misma direccion para definir una primera zona de torsion 259, y la forma de seccion transversal generalmente elfptica de la tercera region 239, que constituye una segunda zona de torsion 261, esta orientada a un angulo (por ejemplo, aproximadamente 90 grados) relativa a las formas de seccion transversal generalmente elfpticas de la primera 235 y segunda 237 regiones. La orientacion es tal que la superficie interior 233 del cuerpo de boquilla 139 aplica fuerzas de torsion a la corriente de fluido 21 y de este modo tiende a orientar las celulas espermaticas 201 en la orientacion deseada indicada anteriormente segun pasan a traves del orificio de boquilla 103. Preferiblemente, la primera zona de torsion 259 tiene una longitud axial 273 de 3,0-4,5 mm y la primera 235 y segunda 237 regiones ahusadas que componente la zona 259 tienen longitudes axiales aproximadamente iguales 275, 277 (por ejemplo, aproximadamente 1,8 mm). La segunda zona de torsion 261 tiene una longitud axial 279 de 3,5-5,0 mm. La cuarta region 249 es preferiblemente de forma generalmente cilmdrica. Cada forma generalmente elfptica de seccion transversal A-D (Fig. 8) en los lfmites de la primera 235, segunda 237 y tercera 239 regiones tiene un diametro de eje principal y un diametro de eje menor, cuyas dimensiones ejemplares se muestran en la Fig. 8 y la siguiente Tabla II.

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TABLA II

Elipse: Diametro de eje principal (mm) Diametro de eje menor (mm) Proporcion

A: 7,0 6,0 1,2

B: 6,1 5,3 1,15

C: 2,1 2,1 1

D: 0,9 0,2 1,45

Se entendera que las dimensiones anteriores son ejemplares, y que tambien pueden ser adecuadas otras dimensiones y formas. Funcionalmente, los cambios en las proporciones entre los diametros principal y menor, y las diferentes orientaciones de las formas eKpticas de las regiones, crean fuerzas laterales que actuan sobre cada celula 201 y aplican una fuerza de torsion 271 que tiende a rotar la celula 201 sobre su eje longitudinal de modo que sus caras amplias 207 se alinean con el eje menor en la primera zona de torsion 259 y segun la celula se retuerce suavemente (por ejemplo, 90 grados) se alinea con el eje menor de la segunda zona de torsion 261. Cada una de las superficies ahusadas 235, 237, 239 tambien sirve para acelerar la corriente 21 (y las celulas) que fluye a traves de la boquilla 101. La aceleracion puede aumentar mas gradualmente en la primera 235 y tercera 239 regiones y mas rapidamente en la segunda region 237. De nuevo a modo de ejemplo, el ahusamiento de la primera region 235 puede variar de aproximadamente 11-14 grados; el ahusamiento en la segunda region 237 puede variar de aproximadamente 42-48 grados; y el ahusamiento en la tercera region 239 puede variar de aproximadamente 8-12 grados. El cuerpo de boquilla 139 esta formado por un material adecuado tal como plastico moldeado (ABS) o metal.

El miembro con orificio calibrado 255 (Fig. 8) se forma preferiblemente a partir de un material duro resistente al desgaste, tal como zafiro, que es capaz de trabajarse a maquina o formarse de otro modo con dimensiones precisas. El miembro con orificio calibrado 255 en sf mismo tiene, en un ejemplo, una superficie ascendente conica 309 de seccion transversal generalmente circular que disminuye en diametro de aproximadamente 0,92 mm a aproximadamente 0,060 mm y tiene una longitud axial 317 de aproximadamente 0,54 mm y un angulo de ahusamiento de aproximadamente 39 grados. El miembro con orificio calibrado 255 tambien tiene una superficie descendente generalmente cilmdrica 315 con un diametro de aproximadamente 0,060 mm y una longitud axial 327 de aproximadamente 0,36 mm. Estas dimensiones son solamente ejemplares, y se entendera que el miembro con orificio calibrado 255 puede tener otros tamanos y formas. Por ejemplo, la forma de la superficie ascendente 309 puede ser generalmente elfptica (oval) en seccion transversal, y el diametro del orificio 103 en el extremo corriente abajo de la boquilla 137 puede variar de 40 a 100 micrometros o mas. Es deseable que el tamano del orificio 103 sea tal que las celulas que salen de la boquilla 101 esten en una formacion sustancialmente de fila unica dentro del nucleo 189 de la corriente 21 y sustancialmente en la orientacion deseada, como se ha descrito previamente. Por ejemplo, en el caso de celulas espermaticas se ha encontrado que un orificio 103 que tiene un diametro de aproximadamente 60-62 micrometros en el extremo corriente abajo es adecuado. Preferiblemente, el orificio de boquilla 103 sirve para acelerar adicionalmente la corriente 21 y para conformar y dimensionar la corriente 21 para un espaciado de las celulas, orientacion celular y formacion de gotitas 33 optimos, como se describira.

La velocidad de la celulas segun salen de la boquilla 137 dependera de diversos factores, incluyendo la presion a la que se introduce el fluido envolvente 19 en el sistema de boquilla 101. A una presion de 1,88 bar (20 psi), las celulas saldran del orificio de boquilla 103 del ejemplo anterior a una velocidad de aproximadamente 16,6 m/s como una corriente generalmente cilmdrica 21 que contiene celulas que estan orientadas de forma sustancialmente similar en el nucleo 189 de la corriente 21. A una presion de envolvente de 2,07 bar (30 psi), la velocidad de las celulas sera de aproximadamente 20,3 m/s. A diferentes presiones del fluido envolvente 19, variara la velocidad de la corriente 21.

Introduccion de la corriente central en la zona de torsion

La orientacion mejorada de las partfculas puede obtenerse alterando el flujo de la corriente de fluido 21 a traves de una boquilla de orientacion de modo que la corriente central 189 que contiene las partmulas a orientar (por ejemplo, celulas espermaticas) se dirija a lo largo de un paso de flujo, al menos una parte del cual esta desplazado del centro de la boquilla de modo que las partmulas se sometan a las fuerzas hidrodinamicas de orientacion generadas por una boquilla mientras estan en una localizacion que esta desplazada desde el centro de la boquilla. Dirigir la corriente central 189 a lo largo de un paso de flujo desplazado tambien puede mejorar la orientacion de las partmulas en una boquilla tradicional (es decir, una que no tenga ninguna zona de torsion). En muchas boquillas, se puede determinar que una posicion dada esta desplazada del centro de la boquilla porque esta desplazada desde un eje longitudinal de la boquilla. Tambien puede reconocerse que una posicion particular esta desplazada del centro de una boquilla porque esta desplazada del centro geometrico de un area de seccion transversal de la boquilla a traves de la cual fluye la corriente de fluido.

Pueden usarse varias tecnicas para dirigir la corriente central 189 a lo largo de un paso de flujo que este desplazado del centro de la boquilla. Por ejemplo, puede posicionarse un deflector de orientacion en la boquilla para desviar la

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corriente central hasta un lateral de la boquilla. Asimismo, el conducto 157 para introducir la corriente central 189 que contiene las partmulas de muestra puede reubicarse desde el centro tradicional de la boquilla hasta una localizacion desplazada. Ademas, se contempla que puede usarse un conducto de introduccion de muestra desplazado 157 en combinacion con un deflector de orientacion. A continuacion se analizan ejemplos de uso de un deflector de orientacion y de uso de un conducto de introduccion de muestra desplazado.

La orientacion mejorada de las partmulas (por ejemplo, celulas espermaticas) conseguida mediante el uso de un deflector de orientacion y/o conducto de introduccion de muestra desplazado 157 puede deberse a varios factores. Un factor es que la desviacion de la corriente central 189 y/o un cambio en el tamano y forma del area de flujo de seccion transversal provoca la aplicacion de fuerzas hidrodinamicas que tienden a orientar las partmulas asimetricas. (Kachel, et al., Histochemistry y Cytochemistry, 25 (7): 774-80 (1977)). Otro factor es que se ha descubierto que las partmulas asimetricas (en particular celulas espermaticas) tienden a orientarse segun fluyen en una corriente de fluido en cercana proximidad a una superficie solida. Por tanto, dirigiendo la corriente central 189 de modo que este en cercana proximidad a la superficie interior de una boquilla o una superficie deflectora puede obtenerse una orientacion mejorada de las partmulas. Ademas, puede usarse un deflector y/o conducto de introduccion de muestra desplazado junto con una boquilla de orientacion que aplica fuerzas adicionales de orientacion (por ejemplo, fuerzas de torsion) a las partmulas asimetricas. En ese caso, el deflector puede funcionar dirigiendo la corriente de fluido de modo que la corriente central que contiene las partmulas a orientar fluya a lo largo de un conducto que esta desplazado del centro de la boquilla mientras las partmulas se someten a las fuerzas de torsion generadas por una o mas de las zonas de torsion.

Deflector de orientacion

Las Fig. 10-13 muestran un deflector de orientacion ejemplar, generalmente denominado 2001, posicionado en la boquilla de orientacion 137 descrita anteriormente. Sin embargo, el deflector 2001 podna usarse junto con una boquilla diferente, incluyendo una boquilla no de orientacion. El deflector 2001 se posiciona en la boquilla corriente arriba del orificio 103 y corriente abajo de la aguja de inyeccion de muestra 157. Con referencia a las Fig. 14 y 15, el deflector comprende una placa deflectora 2003 que se mantiene en su sitio mediante un soporte de deflector 2005. Como se muestra, la placa deflectora 2003 tiene forma generalmente de L y se construye de un material sustancialmente ngido, duradero y resistente a la corrosion (por ejemplo, acero inoxidable). La placa con forma de L 2003 tiene una pata ascendente 2007 y una pata descendente 2009, que son de forma deseable sustancialmente perpendiculares entre sf (por ejemplo, en aproximadamente 5 grados de ser perpendiculares). Como se muestra en los dibujos, las dos patas 2007, 2009 de la placa con forma de L 2003 se cruzan en una lmea 2015 que es perpendicular al eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 (Fig. 11). Como se muestra en la Fig. 14, la lmea de interseccion 2015 tambien esta espaciada una corta distancia 2033 (por ejemplo, aproximadamente 0,3 mm) desde el eje longitudinal 2057 del soporte de deflector 2005. La pata ascendente 2007 de la placa con forma de L 2003 se extiende desde la lmea de interseccion 2015 desde el eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 toda la trayectoria hasta el borde del soporte de deflector 2005, como se muestra en la Fig. 15. Por tanto, la pata ascendente 2007 se forma con un borde curvado 2019 que coincide mtimamente con la forma del soporte de deflector 2005. Como se muestra en la Fig. 14, la pata ascendente 2007 esta inclinada a un angulo AA de aproximadamente 15-25 grados desde la perpendicular al eje longitudinal 2057 del soporte de deflector 2005. La pata descendente 2009 de la placa con forma de L 2007 se extiende de forma descendente desde la lmea de interseccion 2015 de las dos patas 2007, 2009 una distancia 2025 de aproximadamente 2,0-2,5 mm a un angulo BB que esta en el intervalo de aproximadamente 60-80 grados desde la perpendicular hasta el eje longitudinal 2057 del soporte de deflector 2005.

El soporte de deflector 2005 esta dimensionado y conformado para ajustar dentro de la boquilla 137, como se muestra en las Fig. 10-13. El soporte de deflector 2005 esta preferiblemente hecho de un material moldeable (por ejemplo, polipropileno) aunque el soporte de deflector 2005 puede construirse de otros materiales. El soporte de deflector 2005, mostrado en las Fig. 14 y 15, generalmente se conforma como un revestimiento cilmdrico hueco de aproximadamente 4,0-4,5 mm de longitud global 2027. El soporte de deflector 2005 tiene un diametro exterior 2029 de aproximadamente 5-6 mm y un diametro interior 2031 de aproximadamente 2,5-3,5 mm. Si el soporte de deflector 2005 tiene que moldearse, puede proporcionarse una conicidad menor (no mostrada) sobre las superficies del soporte 2005 (por ejemplo, para permitir que el soporte de deflector se retire facilmente de una maquina de moldeo por inyeccion). El extremo corriente arriba 2035 del soporte de deflector ejemplar 2005 tiene una superficie inclinada 2037 que esta inclinada al mismo angulo AA que la pata ascendente 2007 de la placa con forma de L 2003. La pata ascendente 2007 de la placa con forma de L 2003 empotra contra y esta soportada por la superficie inclinada 2037 del soporte de deflector 2005. Los bordes laterales 2039 (Fig. 15) de la pata descendente 2009 de la placa con forma de L 2003 estan parcialmente empotrados (por ejemplo, recibidos en muescas) en el soporte de deflector 2005 para mantener la placa deflectora 2003 en una posicion en que la pata descendente 2009 abarque generalmente desde un lateral del soporte de deflector 2005 hasta el otro. El borde descendente 2041 de la pata descendente 2009 forma una lmea recta que es generalmente perpendicular al eje longitudinal 2057 del soporte de deflector 2057. Hay un hueco 2049 (Fig. 14) entre el borde descendente 2041 de la pata descendente 2009 y la superficie cilmdrica interior 2051 del soporte de deflector 2005. El hueco 2049 proporciona comunicacion fluida entre un volumen 2053 definido por las patas 2007, 2009 de la placa con forma de L 2003 y la superficie cilmdrica interior 2051 del soporte de deflector 2003 y el resto del volumen interior 2055 de la boquilla 137.

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El soporte de deflector 2005 se posiciona de forma deseable dentro de la boquilla con el eje longitudinal 2057 del soporte de deflector 2005 generalmente alineado con el eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 de modo que mantenga la placa con forma de L 2003 en la posicion descrita anteriormente. De forma deseable, la placa deflectora ejemplar 2003 se orienta de forma rotatoria de modo que la lmea de interseccion 2015 de las dos patas 2007, 2009 de la placa 2003 sea paralela a una lmea 2059 que discurre a traves del eje principal de la elipse D, como se muestra en la Fig. 16. Sin embargo, el deflector ejemplar 2001 tambien funciona bien cuando la interseccion 2015 de las dos patas 2007, 2009 de la placa con forma de L 2003 es perpendicular a la lmea 2059 que discurre a traves del eje principal de la elipse D, como se muestra en la Fig. 17. Ademas, el deflector puede tener cualquier orientacion rotatoria. Como se muestra en la Fig. 12, la aguja de inyeccion de muestra 157 esta de forma deseable a una distancia 2061 de aproximadamente 0,25-1,0 mm corriente arriba de la parte mas superior 2035 del deflector 2001. De forma mas deseable, la aguja de inyeccion de muestra 157 esta aproximadamente 0,55-0,65 mm corriente arriba de la parte mas superior 2035 del deflector 2001.

El soporte de deflector 2005 puede mantenerse en una posicion deseada relativa a la boquilla de cualquiera de varios modos. Con referencia a la Fig. 14, el extremo corriente abajo 2067 del soporte de deflector 2005 esta escalonado de modo que ajusta mas lejos corriente abajo en la boquilla 137. El extremo escalonado corriente abajo 2067 del soporte 2005 es de forma circular y empotra contra la superficie interior de forma elfptica 233 de la boquilla 137. Por tanto, el contacto entre la superficie interior 233 de la boquilla 137 y el soporte de deflector 2005 esta generalmente limitado a dos puntos 2069, como se muestra en la Fig. 13. Se posiciona un par de juntas toricas 2071 alrededor del soporte de deflector 2005 entre la boquilla 137 y la proyeccion roscada 149 del cuerpo de flujo 133 (Fig. 11-13) y sellan el sistema de boquilla 101 frente a filtraciones. Las juntas toricas 2071 pueden estar hechas de Viton®, o cualquier otro material similar. Las dos juntas toricas 2071 se comprimen segun se enrosca la boquilla 137 en la proyeccion roscada 149 para proporcionar un sellamiento estanco a fluidos. Se usan dos Juntas toricas 2071 porque una unica junta torica no puede comprimirse dentro del espacio entre la boquilla 137 y el cuerpo de flujo 133 debido a la longitud 2027 del soporte de deflector 2005. Podna usarse cualquier cantidad de juntas toricas o un tipo diferente de sellamiento, con la condicion de que la cantidad de juntas toricas u otro tipo de sellamiento se seleccione de modo que haya un sellamiento estanco a fluidos cuando la boquilla 137 se enrosca en el cuerpo de flujo 133. Esto dependera de varios factores, incluyendo el tamano y forma de la boquilla 137, el cuerpo de flujo 133, el soporte de deflector 2005, y las juntas toricas 2071 asf como el tipo de sellamiento. Las juntas toricas 2071 tambien ayudan a mantener el soporte de deflector 2005 en la posicion deseada. Las juntas toricas 2071 ocupan el espacio alrededor del soporte de deflector 2005, restringiendo de este modo el movimiento de lado a lado del soporte de deflector 2005 dentro de la boquilla 137. Las fuerzas de friccion entre las juntas toricas 2071 y el soporte de deflector 2005 tambien resisten el movimiento de rotacion del soporte de deflector 2005.

Cuando la boquilla 137 se aprieta sobre el cuerpo de flujo 133 como se muestra en la Fig. 12, el extremo corriente abajo 2077 de la proyeccion roscada 149 del cuerpo de flujo 133, en forma de un saliente, es aproximadamente uniforme con la parte mas superior 2035 del deflector 2001. Como resultado, el soporte de deflector 2005 se mantiene axialmente cautivo entre el cuerpo de flujo 133 (en el extremo corriente arriba 2035 del soporte de deflector 2005) y la superficie interior 233 de la boquilla 137 (en el extremo corriente abajo 2067 del soporte de deflector 2005). Pueden usarse otros mecanismos de retencion. Como se muestra en los dibujos, el diametro interior del saliente 2079 (Fig. 12) en el extremo corriente abajo de la proyeccion roscada 149 es casi igual al diametro interno 2031 del soporte de deflector 2005.

Los especialistas en la tecnica reconoceran que el flujo a traves del sistema de boquilla 101 permanece laminar a pesar del deflector 2001 porque el area de pequena seccion transversal a traves de la cual deben fluir los fluidos provoca un bajo numero de Reynolds para el flujo. Como se muestra en la Fig. 11, el deflector desvfa la corriente central 189 y la corriente envolvente 191 desde el eje longitudinal central 2017 de la boquilla 137 y hacia una superficie interior 233 de la boquilla 137. La corriente central 189 tambien puede fluir muy cerca de la superficie interior 233 de la boquilla 137 segun pasa la corriente central 189 entre la transicion entre la primera 259 y la segunda 261 zonas de torsion. Sin embargo, una parte 2081 de la corriente de fluido envolvente 191 permanece entre la corriente central 189 y la superficie interior 233 de la boquilla 137 de modo que las partmulas en la corriente central 189 realmente no impactan o contactan con la superficie interior 233 de la boquilla 137. Mas lejos corriente abajo en la boquilla 137, las fuerzas hidrodinamicas empujan la corriente central 189 de vuelta hacia el centro de la boquilla 137 (por ejemplo, en alineacion con el eje longitudinal 2017 de la boquilla 137).

Con referencia a las Fig. 18A-18E, el deflector 2001 cambia la forma y reduce el tamano del area de flujo de seccion transversal en la boquilla 137. (Por motivos de claridad, las Fig. 18A-18E no muestran ninguna estructura de boquilla corriente abajo del deflector. El area de flujo en cada una de las Fig. 18A-18E se perfila en negrita por claridad.) Corriente arriba del deflector 2001 (Fig. 18A), area de flujo de seccion transversal 2087 generalmente es circular o elfptica. En el extremo corriente arriba 2035 del deflector 2001, el area de flujo comienza a cambiar de una forma circular a una forma generalmente semi-circular 2089 en la interseccion 2015 de las patas 2007, 2009 de la placa deflectora 2003 (Fig. 18B), aunque pueden ser adecuadas otras formas. Aim el area de flujo de seccion transversal 2089 es mas pequena que el area de flujo 2087 corriente arriba del deflector. La Fig. 18C ilustra el area de flujo 2091 segun fluye el fluido a traves de una parte del soporte de deflector 2005, y la Fig. 18D ilustra el area de flujo 2093 mas lejos corriente abajo en el extremo corriente abajo 2041 de la pata descendente 2009 de la placa deflectora 2003. Se observara que el area de flujo 2093 es algo mas grande que el area de flujo 2091 debido a la orientacion

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angular de la pata descendente 2009 de la placa deflectora 2003. Corriente abajo de la placa deflectora 2003 (Fig. 18E) el area de flujo 2094 a traves del deflector corresponde a la forma de la superficie interior 2051 del soporte de deflector 2005, que es circular en el dibujo ilustrado (pueden ser adecuadas otras formas). Corriente abajo del soporte de deflector 2005 las zonas de torsion 259, 261 de la boquilla 137 proporcionan de forma deseable fuerzas de torsion como se ha analizado anteriormente.

Como se muestra en la Fig. 11, se ha observado que una o mas burbujas de aire 2095 pueden quedar atrapadas en el volumen 2053 entre la pata descendente 2009 de la placa con forma de L 2003 y el soporte de deflector 2005. Ademas, una parte de una burbuja 2095 puede extenderse a traves del hueco 2049 entre el borde 2041 de la pata descendente 2009 y el soporte de deflector 2005. Por tanto, la burbuja o burbujas de aire 2095 pueden ocupar una parte del area de flujo de seccion transversal corriente abajo de la pata descendente 2009 de la placa con forma de L 2003, quiza afectando al flujo de fluido a traves de la boquilla 137. Se ha descubierto que el deflector ejemplar 2001 funciona bien tanto con como sin la burbuja o burbujas de aire 2095. Por tanto, puede usarse un deflector para orientar las celulas espermaticas sin implicacion de ninguna burbuja.

Se muestra otro deflector de orientacion ejemplar, generalmente denominado 2097, en las Fig. 19 y 20. El deflector 2097 comprende una placa deflectora semi-circular generalmente plana 2099 en la boquilla de orientacion 137 analizada anteriormente. La placa deflectora 2099 se posiciona en la boquilla 137 corriente abajo del conducto de introduccion de muestra 157 y generalmente perpendicular al eje longitudinal 2017 de la boquilla 137. La placa deflectora 2099 tiene un borde curvado 2101 que generalmente coincide con la curvatura de la superficie interior 233 de la boquilla 137 de modo que no haya huecos grandes entre el borde curvado 2101 de la placa deflectora 2099 y la superficie interior 233 de la boquilla 137. La placa deflectora 2099 tambien tiene un borde recto 2103 que se extiende una corta distancia pasado el eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 de modo que este aproximadamente alineada con el diametro exterior 2109 del conducto de introduccion de muestra 157. La placa deflectora 2099 se mantiene en posicion por la friccion resultante de la compresion de la placa deflectora 2099 entre un sellamiento de junta torica 2105, que es similar a los sellamientos de junta torica 2071 descritos en relacion con el deflector con forma de L2001 anterior, y un tope anular o plataforma 2107 formado sobre el interior de la boquilla 137. Como se muestra en la Fig. 19 el deflector de orientacion 2099 funciona desviando la corriente de fluido de modo que la corriente central 189 que contiene las partfculas a analizar este desplazada del eje longitudinal central 2017 de la boquilla 137 a lo largo de una parte de su paso de flujo. Por ejemplo, la corriente central 189 puede dirigirse a lo largo de un paso de flujo que esta desplazado del eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 segun fluye a traves de la primera zona de torsion 259, asf como al menos una parte de la segunda zona de torsion 261. Por consiguiente, las partfculas (por ejemplo, celulas espermaticas) se someten a las fuerzas de torsion generadas por las zonas de torsion 259, 261 mientras estan en una posicion que esta desplazada del eje longitudinal central 2017 de la boquilla 137.

Los especialistas en la tecnica reconoceran que pueden hacerse cambios sustanciales a los deflectores ejemplares 2001, 2097 descritos anteriormente. Todo lo que se requiere es que el deflector se configure para desviar la corriente central 189 y la corriente envolvente 191 hacia una superficie interior de la boquilla o para causar que la corriente central 189 y envolvente 191 fluyan a traves de un area de seccion transversal que cambia en tamano y/o forma. Ademas, se entiende que la estructura del deflector de orientacion puede formarse de forma integral con la boquilla o formarse de forma integral con la boquilla y el cuerpo de flujo.

Conducto de introduccion de muestra desplazado

La corriente central 189 puede dirigirse a lo largo de un paso de flujo que esta desplazado del eje longitudinal central 2017 de la boquilla 137 reposicionando el conducto de introduccion de muestra 157 desde su posicion tradicional en el centro de la boquilla 137 hasta una posicion desplazada. Por ejemplo, la Fig. 21 muestra un sistema de boquilla de introduccion de muestra desplazado ejemplar 2151 que tiene un conducto de introduccion de muestra desplazado 157. Excepto lo indicado, el sistema de boquilla 2151 es sustancialmente igual que el sistema de boquilla 101 mostrado en las Fig. 4 y 5. La diferencia significativa es que el conducto de introduccion de muestra 157 se ha movido desde el centro de la boquilla 137 de modo que ya no esta alineado con el eje longitudinal 2017 de la boquilla. Por tanto, la corriente central 189 esta dirigida a las zonas de torsion 259, 261 de la boquilla de orientacion 137 a lo largo de un paso de flujo que esta desplazado desde el eje longitudinal 2017. Aunque el sistema de boquilla ejemplar 2151 mostrado en la Fig. 21 usa la boquilla de orientacion ejemplar 137 descrita anteriormente, se contempla que el conducto de introduccion de muestra desplazado 157 podna usarse con una boquilla de orientacion diferente o una boquilla no de de orientacion para orientar partfculas en la corriente central 189.

Montaje y ajuste de boquilla

El cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137 se montan en una orientacion y posicion seleccionadas mediante una montura de boquilla, generalmente denominada 331. La montura 331 puede comprender una pluralidad de fases (Fig. 22), incluyendo la primera y segunda fases lineales 333, 337 que proporcionan ajuste lineal del cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137 a lo largo de los ejes X e Y 339, 341, respectivamente, y una tercera fase de rotacion 343 que proporciona ajuste de rotacion alrededor del eje Z 345 correspondiente al eje longitudinal 2017 del cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137. Estas fases 333, 337, 343 pueden ser de diseno convencional, estando disponibles en el

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mercado fases adecuadas, por ejemplo, en Newport Corporation de Irvine CA. En particular, la primera fase de movimiento lineal 333 comprende un miembro de primera fase fijo (no mostrado) montado sobre un armazon 349, un miembro de primera fase movil 355 deslizable sobre el miembro de primera fase fijo a lo largo del eje X 339, y un accionador 357, por ejemplo, un micrometro, para mover de forma precisa el miembro de primera fase movil 355 hasta una posicion seleccionada del eje X. La segunda fase de movimiento lineal 337 comprende un miembro de segunda fase fijo 359 montado sobre el miembro de primera fase movil 355, un miembro de segunda fase movil 361 deslizable sobre el miembro de segunda fase fijo 359 a lo largo del eje Y 341, y un accionador 363, por ejemplo, un micrometro, para mover de forma precisa el miembro de segunda fase movil 361 hasta una posicion seleccionada del eje Y. La fase de rotacion (tercera) 343 comprende un miembro de tercera fase fijo 365 montado sobre el miembro de segunda fase movil 316, un miembro de tercera fase movil 371 montado de forma rotatoria sobre el miembro de tercera fase fijo 365 para su rotacion alrededor del eje Z 345, y un accionador 373, por ejemplo, un micrometro, para rotar de forma precisa el miembro de tercera fase movil 371 hasta una posicion angular seleccionada relativa al eje Z 345. El ajuste en tres ejes proporcionado por estas fases 333, 337 343 permite que la boquilla 137 y la corriente de fluido 21 que sale del orificio de boquilla 103 se posicionen de forma precisa con relacion al sistema optico 109. La rotacion de la boquilla 137 alrededor del eje Z 345 es particularmente util porque posibilita que la corriente 21 que sale de la boquilla 137 se rote para poner las celulas (por ejemplo, celulas espermaticas) orientadas por la boquilla 137 en una posicion en que el haz de luz 25 del sistema optico 109 caera sobre las superficies deseadas de la celulas (por ejemplo, las caras planas 207 de las cabezas de esperma 205), como se ilustra esquematicamente en la Fig. 23. Pueden ser adecuadas otras monturas de boquilla. Por ejemplo, tambien puede usarse un sistema de montaje de boquilla de 4 ejes, que proporciona ajuste lineal a lo largo de los ejes X, Y y Z y ajuste rotatorio a lo largo del eje Z. Ademas, puede ser deseable usar una o mas fases que tengan un elemento de alineacion automatizado, tal como una fase de microtraslado controlada por servomotor o motor paso a paso (por ejemplo, numero de parte M-110,2DG de Polytech PI, Inc. of Auburn, Michigan).

En la Fig. 36, por ejemplo, la boquilla 137 esta orientada para dirigir una corriente 21 que contiene celulas a analizar en una direccion generalmente ascendente. El angulo 377 entre la direccion de la corriente de fluido 21 y la horizontal esta preferiblemente en el intervalo de 5 a 85 grados. Esta orientacion es ventajosa porque se elimina facilmente el aire atrapado en el sistema de boquilla 101. Ademas, la velocidad de la corriente de fluido 21 disminuye gradualmente bajo la fuerza de la gravedad antes de la recogida de las gotitas 33. Se cree que una deceleracion mas gradual de las gotitas 33 es menor estresante para las celulas que se estan analizando lo que, en el caso de celulas espermaticas, puede resultante en una mayor motilidad del esperma clasificado despues de su recogida. Por supuesto, la boquilla 101 puede posicionarse de modo que la corriente de fluido 21 tenga una velocidad sustancialmente descendente cuando sale del orificio 103 lo que es convencional para citometros de chorro en aire.

Opcionalmente, los componentes del sistema de boquilla 101 tales como el cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137 se recubren con un material no reflector, no emisor (por ejemplo, una pintura oscura mate o epoxi que no emite luz cuando se somete a luz laser UV) para reducir cualquier luz reflejada y/o emitida desde este elementos 133,137 que de lo contrario podna causal ruido de senal o tener otros efectos adversos sobre el sistema optico 109.

Transductor y formacion de gotitas

El transductor 105 para introducir energfa en la corriente de fluido 21 comprende, en un ejemplo, un collarm 379 que contiene un elemento piezoelectrico (no mostrado) fijado alrededor del cuerpo de flujo 133 del sistema de boquilla 101 (Fig. 3-5). El transductor es de diseno convencional, tal como esta disponible en Beckman Coulter, Inc. como N° de parte 6858368. El transductor tiene terminales 383 para su conexion a una fuente adecuada de energfa acustica de modo que pueda suministrarse energfa a la corriente de fluido 21 a una frecuencia que causara que se rompa en gotitas 33 en la localizacion de rotura de gotitas 107 corriente debajo de la boquilla 137 una distancia d (Fig. 24). Como entenderan los especialistas en citometna de flujo, las caractensticas de la formacion de gotitas estan gobernadas por la siguiente Ecuacion 1:

(V = fX) Ecuacion 1

Donde V es la velocidad de la corriente 21; f es la frecuencia aplicada a la corriente de fluido 21 a traves de la boquilla 137; y X es la "longitud de onda" o distancia entre las gotitas 33. Es un principio conocido de la citometna de flujo que se formaran gotitas 33 en un patron regular siendo la distancia entre gotitas 33 unas 4,54 veces el diametro de la corriente 21. Como el diametro D de la corriente 21 cerca de la boquilla 137 generalmente corresponde al diametro del orificio de boquilla 103 en su extremo corriente abajo, la frecuencia a la que debe hacerse vibrar la corriente 21 (y la boquilla 137) para formar las gotitas 33 puede calcularse facilmente usando la siguiente Ecuacion 2:

(f = V/4,54D) Ecuacion 2

El transductor 105 puede hacerse funcionar para generar el intervalo de 30.000 - 100.000 gotitas 33 por segundo. Por ejemplo, el transductor 105 puede generar 50.000 - 55.000 gotitas por segundo. Asumiendo que la frecuencia es de 55.000 ciclos por segundo (55 kHz), y asumiendo adicionalmente que la concentracion de celulas en la corriente 21 es tal que las celulas salen de la boquilla 137 a una tasa sustancialmente coincidente de 55.000 celulas por

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segundo, entonces habra, de promedio, una celula por gotita 33. (En realidad, algunas gotitas 33 no contendran celulas, algunas contendran una celula, y algunas contendran mas de una celula.) Por supuesto, cualquiera de los diversos factores puede cambiarse para variar este promedio, incluyendo un cambio en la frecuencia (f), el tamano (D) de la corriente 21 (orificio 103) y la velocidad (V) de la corriente 21. De forma ideal, estos factores deben ser tales que se reduzca la cantidad de estres conferida a las celulas durante el transcurso del proceso, especialmente en el caso de celulas espermaticas donde es importante la conservacion de la motilidad.

Detector de rotura

Con referencia a la Fig. 2, puede emplearse un detector de rotura 389 para determinar la localizacion (por ejemplo, localizacion de rotura 107) en la que la corriente 21 empieza a formar gotitas libres 33. La localizacion de rotura 107 variara dependiendo de varios factores incluyendo la viscosidad de la corriente 21, la tension superficial del fluido y la amplitud de vibracion del transductor 105. Controlando la localizacion de rotura 107, puede variarse la amplitud del transductor 105 para mantener la localizacion de rotura 107 dentro de un intervalo dado de modo que el momento en que cada gotita 33 se rompe pueda predecirse de forma mas precisa por el microprocesador 131. Esto permite que el microprocesador 131 controle de forma precisa la carga electrica de la gotita 33 que se consigue controlando de forma selectiva la carga de la corriente 21. Como la carga de la gotita 33 sera la misma que la carga de la corriente 21 inmediatamente antes de la formacion de gotitas 33, el microprocesador 131 controla la clasificacion de las gotitas 33 cargando de forma selectiva la corriente 21, como se indica a continuacion.

En general, un detector de rotura es para su uso con cualquier corriente continua de fluido que se este descomponiendo en gotitas en una localizacion de rotura. (En la Fig. 2, el detector de rotura 389 esta localizado corriente debajo de la boquilla 137 y la localizacion de examen 115.) Se muestra un detector de rotura ejemplar 389 de forma esquematica en la Fig. 25. Se posiciona una fuente de luz 393 en un lateral de la corriente 21 para iluminar la corriente 21 dentro del intervalo dado en que se mantendra la localizacion de rotura 107. Una fotoserie lineal 395 posicionada en el otro lateral de la corriente 21 esta adaptada para orientarse a lo largo de un eje sustancialmente paralelo a la corriente 21. Como resultado, la fotoserie 395 detecta la luz de la fuente de luz 393 que pasa a traves de las gotitas 33 y proporciona senales de salida correspondientes a la luz detectada.

Las senales de salida se procesan para determinar la posicion de la localizacion de rotura 107. Por ejemplo, las senales de salida pueden digitalizarse y proporcionarse al procesador 131 para su procesamiento. Como alternativa, como se muestra en la Fig. 25, la fuente de luz 393 puede ser un LED u otra fuente que genere una parte del infrarrojo cercano del espectro visible. La luz que pasa entre las gotitas 33 se aumenta por una lente 401 y se dirige hacia una serie lineal 8 por 1 de fotodiodos 395. Cada fotodiodo genera una corriente que es proporcional a la intensidad de luz que incide sobre el mismo. Esta corriente suministra a 8 circuitos op-amp de corriente a voltaje 405. El voltaje de salida de los op-amp es AC acoplada en 8 amplificadores de seguimiento/retencion 407. La senal de seguimiento/retencion 409 usada por los amplificadores se recoge desde el transductor 105. La salida desde el amplificador de seguimiento/retencion se suministra al conversor A/D 411 de una unidad de microprocesador (MPU) 391. Los valores digitales computados por la MPU 391 se proporcionaran al microprocesador de control del sistema 131. Puede usarse una tabla de consulta y/o algoritmo por el microprocesador de control del sistema 131 para convertir entre la desviacion de la localizacion de rotura 107 y el ajuste de voltaje para el transductor 105. Como alternativa, la salida de la MPU 391 puede ser una senal analogica tal como un voltaje DC que tiene una amplitud correspondiente a un cambio en la amplitud de vibracion del transductor 105. El voltaje dc puede aplicarse a la entrada del amplificador de elevado voltaje que acciona el transductor de gotitas 105 para variar la amplitud de la vibracion. Por tanto, dicho procesador 391 constituina un control para recibir la senal de salida desde la fotoserie 395 y proporcionar una senal de localizacion correspondiente a una localizacion de la localizacion de rotura 107. Dicho procesador 391 tambien constituina un control para recibir la senal de salida indicativa de la posicion de la localizacion de rotura 107 de las gotitas 33 y variar el funcionamiento del transductor 105 como una funcion de la posicion de la localizacion 107.

Como alternativa, como saben bien los especialistas en la tecnica, puede usarse una videocamara y luz estroboscopica para supervisar y controlar la localizacion de rotura de gotitas. Por tanto, como se muestra en las Fig. 26- 27, puede proporcionarse un sistema de videocamara 412 y luz estroboscopica 413 para controlar la localizacion de rotura 107. Es deseable colocar la luz estroboscopica 413 detras de una rejilla 414A (por ejemplo, una cubierta con una pequena ranura; abertura conformada 414B) para limitar la cantidad de luz producida por la luz estroboscopica 413 que entra en el sistema optico 109 (Fig. 27).

Sistema optico de epi-iluminacion

El sistema optico 109 esta adaptado para enfocar un haz de radiacion electromagnetica 25 (por ejemplo, un haz laser) sobre la corriente de fluido 21 como un punto de iluminacion, de modo que las celulas a analizar pasen a traves del punto. El haz 25 puede ser luz laser en la parte visible o ultravioleta del espectro, por ejemplo, que tiene una longitud de onda de aproximadamente 350-700 nm, aunque pueden usarse otras longitudes de onda. La longitud de onda de la luz laser puede seleccionarse de modo que sea capaz de excitar un fluorocromo particular usado para analizar partfculas. Si el sistema optico 109 se usa para analizar celulas espermaticas tenidas con Hoechst 33342, por ejemplo, la longitud de onda puede seleccionarse para que este en el intervalo de

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aproximadamente 350-370 nm. La salida de ene^a del laser puede variar entre 50 y 300 mW. Las celulas espermaticas pueden analizarse usando un laser de 200 mW, por ejemplo. Con referencia a las Fig. 28-34, el sistema 109 es un sistema de epi-iluminacion 415 que comprende un instrumento, generalmente denominado 417, que tiene un eje optico longitudinal 419. Como se usa en este documento, el termino "epi-iluminacion" significa un sistema optico donde al menos algunas de las emisiones de fluorescencia desde las celulas que pasan a traves del punto de iluminacion se dirigen de nuevo a traves del instrumento optico a lo largo del mismo eje que el haz enfocado 25, pero en el sentido opuesto. Este tipo de sistema es ventajoso porque se requiere solamente una serie de opticas, incluyendo solamente un fotodetector 117, a diferencia de los sistemas convencionales que detectan fluorescencia directa y lateral y que usan dos o mas fotodetectores. Sin embargo, se entendera que aunque se prefiere un sistema de epi-iluminacion, muchos de los aspectos pueden aplicarse independientemente del tipo de sistema optico usado.

El instrumento de epi-iluminacion 417 puede comprender una base rectangular 429 que soporta una pluralidad de elementos opticos. Estos elementos opticos se describen a continuacion, con ejemplos espedficos de las dimensiones relevantes, longitudes focales, y numeros de parte. Como entenderan los especialistas en la tecnica, esta informacion es solamente ejemplar, y pueden usarse elementos opticos alternativos.

Con referencia a las Fig. 28-34, los elementos opticos incluyen un filtro reflectante 431 que refleja un haz colimado 25 de luz desde un laser o lampara de arco 435, por ejemplo, a traves de un ensamblaje de lente de acondicionamiento 437 montado en una abertura 439 en una pared lateral 441 de una camara dicroica 443 que se extiende desde la base 429. En este ejemplo particular, el ensamblaje de lente de acondicionamiento 437 comprende una arandela de retencion 445, un filtro de densidad neutra 447, una lente cilmdrica 449, un sosten de lente 455 y una contratuerca 457. La lente cilmdrica 449 introduce una divergencia uni-dimensional en el haz 225 y lo dirige hacia los elementos opticos (descritos a continuacion) que conforman el haz para que tenga una forma de seccion transversal deseada 459, preferiblemente generalmente elfptica. A modo de ejemplo, la lente cilmdrica 449 puede ser una lente plano-convexa que tiene una longitud focal de 16 mm. Opcionalmente puede instalarse un expansor de haz (no mostrado) en el instrumento 417 que permite hacer ajustes a la forma del punto elfptico de iluminacion 459.

El filtro reflectante 431 se monta mediante abrazaderas 461 sobre la cara angular 465 de un porta-filtros 463 que tiene aberturas 467 en el mismo para permitir que el haz 25 refleje desde el filtro 431 hacia la optica del instrumento 417. El soporte 463 se sujeta a una fase lineal 469 movil a lo largo de un eje X 471 relativo a un larguero de soporte 473 fijado a la base 429 y la camara dicroica 443, siendo la fase 469 movil por medios adecuados 475 (por ejemplo, un micrometro) para localizar de forma precisa el soporte 463 y el filtro reflectante 431 para reflejar el haz 25 en el instrumento 417 en la localizacion apropiada. Un filtro dicroico 477 se sostiene por abrazaderas 479 sobre un armazon 485 montado en la camara dicroica 443 y funciona reflejando el haz conformado 25 en una direccion de avance 487 a lo largo de un eje 489 que, en este ejemplo particular, corresponde al eje optico longitudinal 419 del instrumento. El haz 25 pasa a traves de un ensamblaje de lente de enfoque 491 que enfoca el haz 25 sobre la corriente de fluido 21 como un punto de iluminacion que tiene la forma generalmente elfptica mencionada anteriormente 459 (Fig. 6) con el eje principal de la elipse extendiendose generalmente perpendicular a la direccion del flujo 227 de la corriente 21. Segun pasa cada celula a traves del punto de iluminacion 459, se activa el colorante fluorescente (u otro agente indicador) en la celula para emitir luz fluorescente 31 (Fig. 23). En el caso de celulas espermaticas tenidas con un colorante fluorescente ADN selectivo, las celulas X tienen mas ADN que las celulas Y, incluyen mas colorante fluorescente, y emiten una senal mas potente que las celulas Y (por ejemplo, un 3,8%), lo que proporciona una basis para discriminar y clasificar celulas, como se describira. El ensamblaje de lente de enfoque 491 incluye, en un ejemplo, un adaptador de microscopio 501 montado en una abertura 503 en una pared frontal 505 de la camara dicroica 443, un tubo de enfoque 507, un par de tubos de montaje de lente 509, y la propia lente 511, que puede ser una lente plano-convexa de 12,5 mm de diametro con una longitud focal de 16 mm, disponible en Oriel Corporation como numero de parte 41209, y esta recubierto con anti-reflectante para luz que tiene una longitud de onda en el intervalo de 340-550 nm. La lente 511 puede estar hecha de sflice fundida. Tambien pueden ser adecuadas otras lentes de enfoque, tal como un objetivo de microscopfa de fluorescencia de infinidad- corregida. El ensamblaje de lente de enfoque 491 tiene un ajuste convencional de enfoque telescopico 515 para enfocar el punto de iluminacion de forma elfptica 459 sobre el nucleo 189 de la corriente 21.

La luz fluorescente saliente 31 emitida por las celulas segun pasan a traves del punto de iluminacion 459 es de una longitud de onda diferente (mas larga, debido al principio de desplazamiento de Stoke) que la luz laser entrante 25. Algunas de las emisiones de fluorescencia 31 se transmiten en una direccion de retroceso 513 a lo largo del eje del haz entrante de nuevo a traves de la lente de enfoque 511 que recoge y colima la emision de fluorescencia 31. Las emisiones de fluorescencia colimadas 517 pasan en una direccion de retroceso desde la lente 511 hasta el filtro dicroico 477, que transmite la emision de fluorescencia 517. A modo de ejemplo, el filtro dicroico 477 puede ser un filtro disponible en Omega Optical como numero de parte XF2001,400DCLP.

El sistema optico 415 incluye un sistema de filtracion 519 posicionado hacia atras del filtro dicroico 477 a lo largo del eje optico 419 del instrumento 417. En un ejemplo, el sistema de filtracion 519 incluye un filtro de emision 521 en un soporte 523 montado en una abertura 525 en una pared posterior 527 de la camara dicroica 443. El filtro de emision 521 atenua cualquier dispersion de luz laser u otra radiacion electromagnetica indeseada que se transmita a traves

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del filtro dicroico 477. A modo de ejemplo y no limitacion, el filtro de emision 521 puede ser un filtro de paso largo de pelmula delgada adaptado para transmitir mas del 90% de la luz que tiene una longitud de onda mayor de 408 nm, como esta disponible en Omega Optical como numero de parte XF3097. Un ensamblaje de pelmula de alineacion 529 esta espaciado hacia atras a lo largo del eje optico 419 desde el filtro de emision. Este ensamblaje incluye un deslizador 531 movil sobre un riel 533 que se extiende de forma longitudinal de la base 429 paralelo al eje optico longitudinal 419 del instrumento 417, un porta-filtros 535 fijado al deslizador 531, un elemento de filtro de pelmula 539, y abrazaderas 541 para fijar el elemento de filtro de pelmula 539 al porta-filtros 535 en un angulo 543 relativo al eje optico 419 del instrumento 417. El elemento de filtro de pelmula 539 tiene el mismo grosor que el filtro dicroico 477 y funciona trasladando la emision de fluorescencia colimada 517 de nuevo sobre el eje optico 419 del instrumento 417. Las sujeciones 545 que se extienden a traves de las muescas paralelas 547 en la base 429 sobre lados opuestos del riel 533 fijan el deslizador 531 a la base 429 en la posicion deseada a lo largo del eje optico 419. Espaciado a la parte posterior del ensamblaje de pelmula de alineacion 529 hay una lente asferica 549 mantenida por un soporte 551 montado en un armazon 553 que tambien es deslizable sobre el riel 533 y esta fijado en una posicion seleccionada por sujeciones adecuadas 557. La lente asferica 549 enfoca la emision de fluorescencia colimada 517 sobre un filtro espacial, generalmente denominado 559, que filtra el reflejo o emision desde fuentes diferente a las celulas a analizar. La lente asferica 549 puede ser, por ejemplo, una lente asferica de 12,5 mm de diametro que tiene una longitud focal de 15 mm, que esta disponible en Oriel Corporation. La lente 549 esta preferiblemente recubierta con anti-reflectante para longitudes de ondas de emision visibles pero esta hecha de un material (por ejemplo, vidrio incoloro) que atenua adicionalmente la transmision de dispersion de luz laser.

Como se muestra en la Fig. 34, el filtro espacial 559 puede comprender, un par de placas de apertura 561 mantenidas de forma liberable por un armazon 563 montado sobre la base 429 del instrumento 417. Cada una de las placas 561 tiene una ranura 567, 571 en la misma, siendo una ranuela 567 preferiblemente generalmente vertical y la otra 571 preferiblemente generalmente horizontal, siendo la disposicion tal que las ranuras 567, 571 se crucen para formar una apertura 573. La apertura 573 puede ser generalmente de forma rectangular y puede tener una dimension vertical 575 de 100 micrometres y una dimension horizontal 577 de 500 micrometres. El tamano y forma de la apertura 573 pueden variar (o incluso ajustarse cambiando placas de apertura), siempre que funcione eliminando los reflejos y la luz de cualquier fuente diferente al volumen de recogida 579. El armazon 563 que sostiene las placas de apertura 561 preferiblemente tiene dos partes, concretamente, un porta-placas 583 deslizable sobre el riel 533 de la base 429 y fijado en posicion seleccionada por las sujeciones 587, y un miembro de refuerzo 589 para fijar las placas de apertura 461 en posicion sobre el porta-placas 583.

La dimension mas pequena (vertical) 575 de la apertura 573 en el filtro espacial 559 puede dimensionarse (o ajustarse) para posibilitar el uso de una tecnica de "barrido de ranura" para evaluar la celula. Esta tecnica se describe en mayor detalle en la seccion "punto de iluminacion enfocado" de esta memoria descriptiva.

Otro ejemplo de un sistema optico de epi-iluminacion, generalmente denominado 450, se muestra en la Fig. 35. Este sistema de epi-iluminacion es sustancialmente igual que el sistema mostrado en las Fig. 28-34, excepto lo indicado. Una diferencia significativa es que el filtro dicroico 477 se ha remplazado con un filtro dicroico diferente 451 que transmite (en lugar de reflejar) el haz de iluminacion 25 y refleja (en lugar de transmitir) las emisiones fluorescentes 31. Ademas, como las emisiones de fluorescencia 31 se reflejan por el filtro dicroico 451 en lugar de transmitirse, no existe necesidad de una pelfcula de alineacion 539 en este ejemplo de un sistema optico de epi-iluminacion 450. Por tanto, el sistema de epi-iluminacion 450 es justo un ejemplo del modo en que puede reconfigurarse el sistema optico si se desea.

Ademas, la lente cilmdrica 449 se monta sobre un ensamblaje de montaje ajustable 449A. El ensamblaje de montaje 449A permite el movimiento de traslado en dos ejes de la lente cilmdrica 449 en un plano perpendicular al haz de iluminacion 25. Sujeciones liberables (por ejemplo, tornillos (no mostrados)) se extienden a traves de orificios con forma de muesca 449B (solamente uno de los cuales es visible en la Fig. 35). La liberacion de las sujeciones permite el movimiento de traslado de la lente 449 en una primera direccion perpendicular al haz 25. Sujeciones similares (no mostradas) se extienden a traves de orificios con forma de muesca 449C, que permiten el movimiento de traslado de la lente 449 en una segunda direccion perpendicular a la primera direccion. Esto permite un ajuste secundario de las posiciones relativas de la lente cilmdrica 449 y el haz 25 de modo que la interseccion del haz 25 y la lente 449 pueda moverse a traves de la superficie de la lente 449, causando de este modo ligeros cambios en el enfoque proporcionado por la lente cilmdrica 449. Una vez la lente 449 esta en la posicion deseada, las sujeciones pueden apretarse para mantenerla atm

Fotodetector

La fluorescencia emitida que pasa a traves del filtro espacial 559 cae sobre un fotodetector 117 fijado a una placa de montaje 591 deslizable sobre el riel 533 de la base 429 en la parte posterior del instrumento de epi-iluminacion 417 y fijable en posicion fija por las sujeciones 595 (Fig. 32). El fotodetector 117 detecta las emisiones fluorescentes 31 y las convierte en senales electricas que pueden procesarse para analizar las caractensticas deseadas de las celulas, como se describira en mayor detalle posteriormente. El fotodetector 117 puede ser un dispositivo convencional, tal como un fotodetector disponible en Hammamtsu. El fotodetector 117 preferiblemente incluye un preamplificador y ganancia PMT que se optimiza para la intensidad de emision producida por el sistema de epi-iluminacion para las

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celulas tenidas particulares que se estan analizando.

En general, la ganancia PMT se optimiza cuando se aplican entre aproximadamente 200 y 2000 voltios al tubo de vado. En el caso de detectar emisiones fluorescentes a partir de Hoechst 33342, por ejemplo, la ganancia PMT se optimiza cuando se aplican entre aproximadamente 400-800 voltios al tubo de vado. Un fotodetector particularmente deseable incluye una PMT que tiene un intervalo espectral de 185-830 nm (pico de 530 nm), una corriente de anodo promedio maxima de 0,01 mA, una sensibilidad radiante de catodo de 70 mA/W tfpica, una sensibilidad luminosa de catodo de 140, |uA/lm, una sensibilidad luminosa de anodo de 300 A/lm, una corriente residual de anodo maxima de 1 nA (0,1 nA tfpico), y un tiempo de propagacion de 1,4 nanosegundos. La PMT es amplificador de corriente continua acoplada que demuestra una ganancia plana hasta > 37 MHz, que tiene un pico de salida de 1 V en una carga de 50 Q y un tiempo de recuperacion de menos de 400 nanosegundos. Tambien es deseable para el amplificador permitir un juste de alto voltaje para la compensacion de variaciones de eficacia de PMT sin disminuir la proporcion de senal a ruido hasta menos de 800 dB.

Angulo de incidencia del haz

La Fig. 36 ilustra esquematicamente una orientacion deseable de la interseccion del haz de luz y la corriente de fluido. Son de senalar varios puntos. Como se muestra, el haz de luz 25 se enfoca sobre la corriente 21 a una localizacion 115 que esta solamente a una corta distancia 605 desde el orificio de salida 103 de la boquilla 137, preferiblemente menos de 1,0 mm, o incluso dentro de la boquilla 137, de modo que las celulas pasan a traves del punto 459 mientras aun estan sustancialmente en orientacion deseada, como se ha descrito previamente. Esto es particularmente importante para celulas que son moviles en la corriente de fluido 21, incluyendo celulas espermaticas.

Otro punto a senalar es que el haz 25 de este ejemplo puede dirigirse hacia la corriente de fluido 21 a lo largo de un eje del haz 609 que cruza la corriente de fluido 21 en un angulo de incidencia A que esta sesgado (en 90 grados) relativo a un eje longitudinal de la corriente de fluido 21, como se observa desde un lateral de la corriente 21 (vease la Fig. 36). Cuando se clasifican ciertas partfculas, se ha descubierto que la mejor discriminacion de los diferentes tipos de partfculas puede obtenerse iluminando la corriente 21 a un angulo de incidencia diferente de 0°. Los nucleos del esperma, por ejemplo, se iluminan de forma deseable a un angulo de incidencia A que esta en el intervalo de 5 a 45 grados. Otras partfculas (por ejemplo, celulas espermaticas vivas) son mas faciles de examinar cuando el haz de luz 25 es generalmente perpendicular a la corriente de fluido 21 (es decir, cuando el angulo A es de aproximadamente 0°). Por tanto, se contempla que el angulo A puede ser cualquier angulo.

La seleccion apropiada del angulo A provoca una mejorada discriminacion de senal a ruido en ciertas partfculas y por tanto una discriminacion mas precisa basada en diferentes caractensticas de esas partfculas (por ejemplo, los nucleos de esperma con celulas espermaticas con cromosomas X e Y). Esta mejora puede deberse a varios factores, incluyendo la dispersion de luz laser que entra en la lente de enfoque 511. Como el punto de iluminacion enfocado 459 es preferiblemente mas ancho que la corriente 21, se crea un patron de difraccion en la interseccion 115 del haz 25 y la corriente 21. Cuando el angulo A es mayor de aproximadamente 12 grados, el patron de difraccion reflejado no cae sobre la lente 511. Otro factor puede ser que el angulo oblicuo A permite que el haz 25 se enfoque muy cerca del orificio de boquilla 103, de modo que el cuerpo de boquilla 139 no interfiere con la lente 511. De forma relacionada, las celulas se alinean de forma mas uniforme cerca de la boquilla 137, de modo que el enfoque del punto de iluminacion 459 cerca de la boquilla 137 provoca una senal mejorada. Ademas, el perfil mas "de frente" de la celula presentada a la lente 511 (haz 25) al angulo oblicuo A reduce la variacion de la intensidad de fluorescencia total causada por cualquier error de alineacion de la celulas. A este respecto, en el caso de celulas espermaticas es preferible que el haz 25 caiga sobre una de las caras amplias 207 de cada celula espermatica 201, como se ha analizado anteriormente, y que la boquilla 101 y el sistema optico 109 se posicionen para conseguir este resultado.

Aunque se cree que un angulo oblicuo de incidencia A es beneficioso en la clasificacion de algunas partfculas, se contempla que el angulo de interseccion entre el eje del haz y la corriente puede ser de 90 grados o cualquier angulo oblicuo. Tambien se espera que el angulo optimo de incidencia pueda variar ampliamente dependiendo de las propiedades de las partfculas particulares que se esten analizando.

Punto de iluminacion enfocado

Con referencia a la Fig. 6, se muestra el punto de iluminacion enfocado de un ejemplo teniendo una forma generalmente elfptica (oval) 459 con una longitud L1 a lo largo de un eje principal que se extiende generalmente a angulos rectos a la direccion del flujo de la corriente de fluido 227 y una anchura W1 a lo largo de un eje menor que

se extiende generalmente paralelo a la direccion del flujo de la corriente de fluido 227. La anchura W1 puede ser

menor que la longitud de la cabeza de la celula espermatica 219, e incluso mas preferiblemente menor que la

longitud de la region 225 que contiene la masa de ADN cromatico de la celula, que en el caso de una celula

espermatica bovina 201 tiene una longitud de menos de aproximadamente 1 |im. Para una corriente 21 que tiene una corriente envolvente 191 que es de aproximadamente 60 |im de diametro y una corriente central 189 que contiene celulas espermaticas bovina 201, una longitud L1 ejemplar es de aproximadamente 80 |im y una anchura

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W1 ejemplar es de aproximadamente 1,5 |im. Enfocando el punto de iluminacion 459 hasta una anchura W1 que es menor que la longitud de la cabeza 205 de la celula espermatica 201, o cualquier otra celula o partfcula que se este analizando, e incluso mas preferiblemente menor que el diametro de la region de ADN 225 de la cabeza 205 de la celula espermatica 201, se consigue mayor resolucion de senal, como entenderan aquellos familiarizados con las tecnicas de "barrido de ranura". Esta es una tecnica por la cual un haz 25 se estrecha hasta tener una anchura menor que la longitud de una celula (es decir, la dimension de la celula en la direccion del flujo de la corriente) de modo que segun se mueve la celula a traves del haz estrecho, las emisiones de fotones 31 de la celula se miden sobre la longitud de la celula, como se analizara posteriormente. De este modo, puede obtenerse informacion acerca de variaciones en la estructura, incluyendo material de ADN, a lo largo de la longitud de la celula. La tecnica de barrido de ranura tambien es util para identificar celulas "coincidente", es decir, celulas que estan solapando o estan muy juntas.

Como se ha mencionado previamente, el barrido de ranura tambien puede realizarse dimensionando la apertura 573 del filtro espacial 559 hasta tener una dimension vertical 575 tal que solamente una parte de la luz emitida desde una celula, correspondiente a una fraccion de la longitud de la celula en la direccion del flujo de la corriente, pase a traves de la apertura hasta el fotodetector 117. Ademas, la resolucion de la senal puede optimizarse ajustando la anchura del haz y/o el tamano de la apertura del filtro espacial para trabajar juntos para proporcionar un punto de iluminacion que este adecuadamente conformado para el barrido de ranura.

Un modo de ajustar la forma del punto de iluminacion 459 es cambiando a una lente cilmdrica diferente y/o haciendo un ajuste a un expansor de haz en el sistema optico 109. Puede contemplarse cualquier metodo adicional para conformar el haz 25 para formar un punto de iluminacion con forma elfptica 459. Tambien pueden usarse y pueden contemplarse puntos de iluminacion de otras formas y tamanos.

Sistema de clasificacion

La Fig. 2 ilustra un ejemplo del sistema de clasificacion 119. El sistema de clasificacion 119 comprende un dispositivo de carga electrostatica 627 para cargar y/o no cargar las gotitas 33 dependiendo de la clasificacion de las partfculas contenidas en las gotitas 33 (por ejemplo, el contenido de cromosoma X/Y de celulas espermaticas), y un par de placas deflectoras cargadas electrostaticas 629 para la clasificacion de las gotitas 33 en diferentes grupos 123, 125, de acuerdo con su carga. Es deseable recubrir las placas deflectoras 629 con un recubrimiento opaco de baja emision (por ejemplo, epoxi o pintura) para limitar la luz reflejada o emitida por las placas deflectoras 629. Las placas deflectoras 629 pueden cargarse mediante cualquier suministro de energfa adecuado 635. Generalmente es deseable que el potencial electrico entre las dos placas deflectoras completamente cargadas 629 este en el intervalo de 2000-4000 voltios. Sin embargo, el potencial electrico entre las placas deflectoras 629 puede estar en cualquier parte entre aproximadamente 1000 y 6000 voltios.

El dispositivo de carga 627 comprende un elemento de carga 631 que tiene una abertura 633 en el mismo a traves de la cual la corriente 21 pasa en una localizacion cerca de la localizacion de rotura de gotitas 107 (por ejemplo, en cinco longitudes de gotita o mas cerca). Es deseable montar el elemento de carga 631 con un mecanismo que facilite el ajuste de la posicion del elemento de carga 631 con respecto a la localizacion de rotura de gotitas 107. Como se muestra en las Fig. 26 y 27, por ejemplo, el elemento de carga 631 y las placas deflectoras 629 pueden unirse a un ensamblaje de montaje ajustable 5001 que permita el traslado en tres ejes y el ajuste de inclinacion del elemento de carga 631 y las placas deflectoras 629 con respecto al sistema de boquilla 101. Para el traslado a lo largo de un eje 5011 paralelo a la corriente 21, el ensamblaje de montaje 5001 incluye un cuadro 5003 fijado a un refuerzo 5005 mediante sujeciones liberables 5007 que pasan a traves de muescas 5009 en la placa 5003, estando orientadas las muescas 5009 generalmente paralelas al eje 5011. Para el traslado en un eje 5013 perpendicular a la corriente 21, se fija un segundo cuadro de ajuste 5015 al primer cuadro 5003 mediante sujeciones liberables 5017 que pasan a traves de las muescas 5019 en el segundo cuadro de ajuste 5015, estando orientadas las muescas 5019 generalmente paralelas al eje 5013. El elemento de carga 631 y las placas deflectoras 629 se fijan al segundo cuadro de ajuste 5015. Por tanto, liberando las sujeciones 5007 y/o 5017, puede ajustarse la posicion del elemento de carga 631 y las placas deflectoras relativa al sistema de boquilla 101 en un plano paralelo a la corriente de fluido 21 y despues apretar las sujeciones 5007 y/o 5017 para fijar el ensamblaje de montaje 5001.

Para el traslado a lo largo de un tercer eje perpendicular a los dos primeros ejes 5011, 5013, el refuerzo 5005 se fija a un soporte fijo 5021 mediante sujeciones ajustables 5023 (por ejemplo, pernos con rosca atornillados en orificios de rosca en el soporte fijo 5021). Cada sujecion ajustable 5023 puede pasar a traves de un resorte 5025 posicionado entre el refuerzo 5005 y el soporte fijo 5021. La cantidad de compensacion de cualquier resorte 5025 puede ajustarse apretando o aflojando la sujecion respectiva 5023. Ajustando la compresion de todos los resortes 5025 en la misma cantidad se provoca el traslado a lo largo del tercer eje. El ensamblaje de montaje 5001 puede inclinarse en casi cualquier direccion cambiando la compresion relativa de uno o mas de los resortes 5025 con respecto a uno o mas de los otros resortes 5025.

Las posiciones relativas del elemento de carga 631 y las placas deflectoras 629 permanecen fijas unas con respecto a las otras porque todo se fija al mismo cuadro de ajuste 5015. Esto evita que el ajuste del ensamblaje de montaje 5001 afecte a la alineacion del elemento de carga 631 con respecto a las placas deflectoras 629.

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El elemento de carga 631 se conecta a un circuito electrico adecuado (por ejemplo, un circuito de carga selectiva de 90 voltios) bajo el control del procesador 131 y acoplado a un suministro de energfa para aplicar una carga electrica al elemento de carga 631. El circuito se usa para cargar o no cargar la corriente 21 inmediatamente antes de la formacion de una gotita 33 en la localizacion de rotura 107 dependiendo de si la gotita 33 contiene una partfcula que tiene las caractensticas deseadas (por ejemplo, al menos una celula espermatica viva con cromosoma X). El elemento de carga 631 se posiciona de forma electrostatica cerca de la corriente 21 o cerca de las gotitas 33 formadas a partir de la corriente 21 para proporcionar una referencia electrica con respecto a la polaridad electrostatica de la corriente 21. Las gotitas 33 portan la misma carga que la corriente 21 en el instante en que la gotita 33 se rompe desde la corriente 21. Las gotitas 33 cargadas o no cargadas entonces pasan entre las placas deflectoras 629 y se clasifican por carga en recipientes de recogida 2207 del sistema de recogida 2201. Aunque la clasificacion produce dos grupos o poblaciones de gotitas 123, 125 en la Fig. 2, las partfculas pueden separarse en cualquier cantidad de poblaciones de 1 a N clasificadas colocando diferentes cargas en las gotitas 33 en grupos respectivos, suministrando la cantidad apropiada de recipientes de recogida, estando cada uno posicionado para recoger una diferente poblacion de gotitas.

Calibracion automatizada del retardo de gotitas

En el sistema de clasificacion 119 descrito anteriormente, el procesador 131 debe estimar el tiempo que le lleva a una partfcula moverse desde la localizacion de examen 115 hasta la localizacion de rotura de gotitas 107 de modo que la carga (o ausencia de carga) a aplicar a la gotita 33 que contiene esa partfcula se aplique cuando la partfcula esta en la ultima gotita adherida 33 en la localizacion de rotura 107. Si la configuracion de retardo usada por el procesador 131 es incorrecta, las gotitas 33 no se clasificaran de acuerdo con sus contenidos. Asimismo, si la aplicacion de cargas electricas a las gotitas 33 esta incluso ligeramente fuera de fase con la formacion de gotitas 33 esto puede degradar la clasificacion porque ninguna de las gotitas 33 estara completamente cargada y las gotitas 33 que se supone que tienen carga neutra portaran una pequena carga electrica positiva o negativa. Esto alterara las trayectorias de las gotitas 33 a traves del campo electrico entre las placas deflectoras 629.

El mejor modo de verificar que el procesador 131 esta usando la configuracion apropiada de retardo o para ajustar la configuracion de retardo de gotitas (es decir, calibrar la configuracion de retardo de gotitas del sistema 9), es clasificar varias gotitas 33 y examinar los resultados. Variando de forma creciente la configuracion de retardo y controlando los resultados, puede seleccionarse la configuracion optima de retardo. Tradicionalmente, esta calibracion de clasificacion se realiza manualmente. Recientemente, se han disenado sistema de calibracion automatizados para muestrear o examinar los contenidos de las gotitas en las corrientes de gotitas clasificadas y ajustar de forma automatica la configuracion de retardo sin intervencion humana. Por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 6.372.506 (Norton) y 5.643.796 (van den Engh), describen ambas sistemas automatizados de calibracion de clasificacion. Las ventajas pretendidas de estos sistemas son que son menos laboriosos y son capaces de verificar la configuracion de retardo durante todo el proceso de clasificacion en lugar de justo durante la preparacion inicial. Los inconvenientes son que son complicados y ocupan un espacio valioso innecesariamente.

(i) Detectores de epi-iluminacion

Con referencia a la Fig. 37, un sistema automatizado de calibracion continua 4201 para un sistema de citometna de clasificacion de gotitas activadas por fluorescencia comprende uno o mas detectores de epi-iluminacion 4203 posicionados para detectar los contenidos de las gotitas 33 para verificar la configuracion de retardo para la carga de las gotitas. Con referencia a la Fig. 38, cada detector de epi-iluminacion incluye una fuente de luz (no mostrada), un cable de fibra optica 4205, un filtro dicroico 4207, un sistema de lente 4209, un fotodetector 4213, y un sistema de control. El procesador 131 puede servir como sistema de control, pero podnan usarse otros procesadores o controles en su lugar.

La fuente de luz puede ser un laser en estado solido de baja potencia especializado unicamente para el sistema automatizado de calibracion 4201. Como alternativa, puede usarse un divisor del haz (no mostrado) para desviar una parte (por ejemplo, aproximadamente el 5%) de la energfa en el haz 25 usado para el examen de las partfculas en la corriente de fluido 21 hasta uno o mas detectores de epi-iluminacion 4203. Asimismo, el cable de fibra optica 4209 puede posicionarse en un captador de haz 4215 (Fig. 26) para reunir la luz del haz 25 despues de pasar a traves de la localizacion de examen 115. La luz desde la fuente de luz debe incluir luz que tenga una longitud de onda capaz de excitar moleculas fluorescentes en las partfculas que se estan clasificando, causando de este modo emisiones de fluorescencia 4211 a partir de las partfculas. Si las partfculas se tinen con Hoechst 33342, por ejemplo, la fuente de luz puede proporcionar luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 350 nm, aproximadamente 407 nm o cualquier otra longitud de onda capaz de excitar las moleculas de Hoechst 33342.

El cable de fibra optica 4205 se extiende desde la fuente de luz hasta una localizacion corriente abajo de la localizacion de examen 115. En un ejemplo, el cable de fibra optica 4205 conduce hasta una localizacion adyacente a la trayectoria de una de las corrientes de gotitas segun se mueve a traves del campo electrico entre las placas deflectoras 629. El filtro dicroico 4207 se posiciona frente al extremo del cable de fibra optica 4205. El filtro dicroico 4207 transmite luz que tiene las caractensticas espectrales de la luz conducida por el cable de fibra optica 4205,

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pero refleja luz que tiene caractensticas espectrales de las emisiones de fluorescencia 4211. Por tanto, el filtro dicroico 4207 puede tener las mismas especificaciones que el filtro dicroico 477 descrito anteriormente en relacion con el instrumento optico de epi-iluminacion 417. La longitud focal del sistema de lente 4209 se selecciona en base a la distancia esperada del detector 4203 desde las gotitas 33 so de modo que el volumen de iluminacion/deteccion de cada detector 4203 se aproximadamente igual al volumen de las gotitas 33.

Con referencia al ejemplo mostrado en la Fig. 37, se posiciona un detector de epi-iluminacion 4203 adyacente a la trayectoria de cada una de las tres corrientes de gotitas clasificadas 4225, 4227, 4229 para detectar los contenidos de gotitas 33 en una corriente respectiva. El sistema de citometro 9 incluye un soporte electricamente aislado 4221 para montar las dos placas deflectoras 629. El soporte tiene tres orificios 4223, uno adyacente a la trayectoria de cada corriente de gotitas clasificadas 4225, 4227, 4229. Se posiciona un detector de epi-iluminacion 4203 en cada orificio 4223 para observar las gotitas 33 en una de las corrientes de gotitas 4225, 4227, 4229 a traves del orificio respectivo 4223. Esta configuracion compacta ocupa relativamente poco espacio y mantiene los componentes del sistema de calibracion 4201 fuera del camino, proporcionando mejor acceso a otras partes del citometro 9.

Si una gotita que contiene una partfcula fluorescente pasa a traves del volumen de iluminacion/deteccion del detector 4203, esta provocara un centelleo de emisiones de fluorescencia 4211, algunas de las cuales se recogeran por el sistema de lente 4209 y se reflejaran desde el filtro dicroico 4207 hasta el fotodetector 4213. Las senales del fotodetector 4213 se proporcionan al procesador 131. En base a las senales recibidas desde los fotodetectores 4213, el procesador 131 puede determinar los contenidos de las gotitas 33 en cada una de las corrientes de gotitas clasificadas 4225, 4227, 4229.

Si un detector 4203 no logra detectar un centelleo de emision de fluorescencia 4211 cuando el procesador 131 espera que una gotita 33 que contiene una partfcula fluorescente pase por ese detector 4203, el procesador 131 puede usar esa informacion para ajustar la configuracion de retardo o ajustar la localizacion de la localizacion de rotura de gotitas 107. Asimismo, el procesador 131 puede hacer un ajuste si un detector 4203 detecta una emision fluorescente 4211 cuando el procesador 131 no espera que una gotita 33 que contiene una partfcula pase por el detector 4203. Ademas, el procesador puede comparar la frecuencia relativa de emisiones fluorescentes 4211 desde las corrientes clasificadas 4225, 4227, 4229 para ver si la frecuencia de las emisiones fluorescentes detectadas 4211 coincide con la frecuencia esperada. El procesador 131 tambien puede ajustar la amplitud de la carga aplicada al elemento de carga 631 para aumentar o disminuir la cantidad por la cual una corriente clasificada 4225, 4229 se desvfa para maximizar la intensidad de las emisiones de fluorescencia detectadas 4211. Esto mantendra la alineacion de la trayectoria de las corrientes de gotitas desviadas 4225, 4229 de modo que las gotitas pasen directamente a traves del volumen de recogida del detector de epi-iluminacion. Como los detectores 4203 estan posicionados para observar las corrientes 4225, 4227, 4229 segun se mueven a traves del campo electrico entre las placas deflectoras 629, el sistema de calibracion tiene un tiempo de respuesta mas corto que el que sena si observaran las corrientes 4225, 4227, 4229 en el area de cafda libre corriente debajo de las placas deflectoras.

(ii) Corriente de ensayo de gotitas vadas

Una indicacion sensible de la calidad de la calibracion puede disponerse creando y controlando una corriente de ensayo de calibracion que contiene sustancialmente solo gotitas vadas 33. Con referencia al sistema de calibracion de clasificacion 4201 mostrado en la Fig. 37, las gotitas 33 que contienen partfculas deseadas se clasifican en la corriente 4225 y las gotitas 33 que contienen cualquier otra partfcula y la mayona de las gotitas vadas 33 se clasifican en la corriente 4229 (es decir, la corriente de residuos). La corriente de ensayo 4227 se crea aplicando una carga neutra a al menos una fraccion (por ejemplo, 1 de cada 10) de las gotitas vadas 33. Muchas gotitas 33 que se consideran "vadas" para los propositos tradicionales de clasificacion son realmente gotitas 33 para las cuales existe una probabilidad baja de que la gotita 33 contenga una partfcula, en base al tiempo de llegada de las partfculas a la localizacion de examen 115 y los lfmites estimados de formacion de gotitas en la corriente de fluido 21. Estas gotitas "vadas" no deben clasificarse en la corriente de ensayo 4227 porque esto provocana de forma inevitable la deteccion de algunas partfculas en la corriente de ensayo 4227.

En su lugar, para la corriente de ensayo 4227 el procesador 131 debe seleccionar solamente gotitas 33 que el procesador 131 crea que tienen probabilidad cero de contener una partfcula con el fin de crear una corriente de ensayo sustancialmente libre de partfculas 4227. La probabilidad de que cualquier gotota 33 seleccionada aleatoriamente contenga una celula es conocida y es aproximadamente la tasa de analisis promedio de celulas dividida por la tasa de generacion de gotitas. Esto significa que controlando la tasa de clasificaciones erroneas en la corriente de ensayo 4227 es posible estimar el ajuste fraccional de la relacion de fase de la carga de gotitas necesaria para coincidir con la fase de formacion de gotitas 33. Por ejemplo el procesador 131 puede seleccionar gotitas que estima que tienen una probabilidad del 15% o inferior de contener una partfcula. El corte probabilista para una probabilidad sustancialmente cero puede seleccionarse en base a la velocidad de clasificacion, la tolerancia de impurezas, o otros parametros de clasificacion, incluyendo el corte probabilidades mayores de que una gota incluya una partfcula para clasificacion a alta velocidad o cuando hay mayor tolerancia de impurezas.

El fallo del procesador 131 en crear una corriente de ensayo sustancialmente libre de partfculas 4227 (es decir, una corriente de ensayo 4227 en que la proporcion de gotitas 33 que contienen partfculas a la cantidad total de gotitas

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33 concuerda con el corte probabilista usado para seleccionar gotitas 33 para la corriente de ensayo 4227), indicado por la deteccion de mas de una cantidad umbral de gotitas 33 que contienen partmulas en la corriente de ensayo 4227, es una indicacion definitiva de clasificacion sub-optima e incita al procesador 131 a ajustar la configuracion de retardo de gotitas. El nivel umbral se determina en relacion al corte probabilista usado para seleccionar gotitas 33 para la corriente de ensayo 4227 y la cantidad total de gotitas 33 seleccionada para la corriente de ensayo 4227. De forma ideal, algunas gotitas 33 puede seleccionarse para la corriente de ensayo 4227 a pesar de que una o mas partmulas en la corriente de fluido 21 esten relativamente cerca de un lfmite de formacion de gotitas estimado para la gotita respectiva 33 para hacer al sistema 4201 mas sensible a configuraciones de retardo de gotitas ligeramente sub-optimas.

Por supuesto, el sistema de calibracion de clasificacion podna aplicar una carga no neutra a y desviar gotitas seleccionadas para la corriente de ensayo. El orden relativo de la corrientes 4225, 4227, 4229 tambien podna reordenarse, aunque interponer la corriente de ensayo 4227 entre la corriente de residuos 4225 y la corriente de partmulas deseadas 4229 reduce el riesgo de contaminacion cruzada de la muestra clasificada por la corriente de residuos. Ademas, si las partmulas no emiten luz fluorescente, pueden usarse diferentes detectores para detectar cualquier luz dispersada causada por las partmulas en la corriente de ensayo.

(iii) Impacto del sistema de calibracion de clasificacion

El sistema automatizado de calibracion 4201 puede funcionar para determinar de forma automatica y establecer la relacion de fase entre la formacion de gotitas y la carga de gotitas en aproximadamente el 5% de la fase optima (es decir, en +/- aproximadamente 18 grados). El sistema 4201 puede funcionar para determinar de forma automatica y establecer la relacion de fase en aproximadamente el 1% de la fase optima (es decir, en +/- aproximadamente 3,6 grados). Ademas, el sistema de calibracion 4201 puede funcionar para controlar de forma continua una sistema de clasificacion de gotitas de alta velocidad y mantener de forma automatica la relacion de fase en aproximadamente el 10% de la fase optima (es decir, en +/- aproximadamente 36 grados). Ademas, el sistema 4201 puede funcionar para controlar de forma continua un sistema de clasificacion de gotitas de alta velocidad y mantener de forma automatica la relacion de fase en aproximadamente el 3% de la fase optima (es decir, en +/-10,8 grados).

Correccion de fallos del sistema de clasificacion

De vez en cuando, una gotita 33 se apartara de su trayectoria normal y golpeara el elemento de carga 631 o las placas deflectoras 629. Si una o mas gotitas 33 golpean el elemento de carga 631, el elemento de carga 631 puede no ser capaz de cargar las gotitas 33 apropiadamente. Ademas, la trayectoria normal de la gotita 33 a traves del elemento de carga 631 puede llegar a obstruirse causando que incluso mas gotitas 33 se acumulen en el elemento de carga 631. Ademas, si gotitas dispersas 33 golpean una placa deflectora 629, pueden distorsionar o alterar de otro modo las lmeas del campo electrico entre las placas deflectoras 629, cambiando de este modo la trayectoria de las corrientes de gotitas clasificadas 123, 125.

Por tanto, es deseable tener un sistema de eliminacion de desechos para retirar los desechos del elemento de carga 631 y/o las placas deflectoras 629. En un ejemplo, mostrado en las Fig. 26 y 27, el sistema 9 incluye un sistema de eliminacion de desechos 5047 para el elemento de carga 631 y un sistema de eliminacion de desechos 5049 para las placas deflectoras 629.

Con referencia a la Fig. 27, el elemento de carga 631 se mantiene en posicion mediante un soporte 5051 fijado al cuadro 5015 del ensamblaje de montaje ajustable 5001. Un conducto de vado 5053 (mostrado en sombras) se extiende a traves del soporte 5051 hasta una abertura 5057 adyacente al elemento de carga 631. El conducto de vado 5053 esta conectado a una fuente de vado adecuada (no mostrada) por una lmea de vado 5055 unida a un conector 5058 sobre el soporte 5051. Se proporcionan controles adecuados para aplicar selectivamente un vado en el conducto 5053 para vaciar cualquier material indeseado (por ejemplo, gotitas dispersas 33) del elemento de carga 631 y restaurar la funcion apropiada del elemento de carga 631.

De forma relacionada, como se muestra en la Fig. 27, un colector 5061 fijado al ensamblaje de montaje 5001 tiene una red de conductos de aire 5063 en el mismo (mostrado en sombras) conectada mediante una lmea de aire 5059 y un conector 5065 a una fuente de aire comprimido u otro gas (no mostrado). Los conductos 5063 tienen aberturas 5064 posicionadas a lo largo del lateral 5066 en cada placa deflectora 629 y las partes 5067 de los conductos 5063 que conducen a las aberturas 5065 estan orientadas de modo que el aire comprimidos soplado a traves del colector 5061 elimine cualquier gotita dispersa 33 u otros desechos de las placas deflectoras 629. Cualquier material soplado de las placas deflectoras 629 golpeara el panel de cubierta (no mostrado) y se drenara en un dispositivo de recogida de residuos adecuado (no mostrado).

Si el procesador u otro detector determina que gotitas dispersas 33 han golpeado el elemento de carga 631 o las placas deflectoras 629, indicado por el sistema de calibracion de clasificacion descrito anteriormente por ejemplo, el procesador puede iniciar automaticamente un procedimiento o modo de correccion de fallos, que puede incluir aplicar un vado al conducto 5053 para variar el material del elemento de carga 631 y/o enviar gas comprimido a traves de los conductos 5067 para soplar el material de las placas deflectoras 629.

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Proteccion de la muestra clasificada durante el modo de fallos

El sistema 9 tambien puede incluir un mecanismo de prevencion de contaminacion 4041 (Fig. 26), que puede activarse por el procesador 131 para limitar o prevenir la contaminacion de la muestra clasificada cada vez que el sistema de clasificacion este en el modo de correccion de fallos. El mecanismo de prevencion de contaminacion incluye un accionador neumatico 4043 funcional para mover selectivamente un brazo oscilante 4045 entre una posicion de proteccion (mostrada en la Fig. 26) y una posicion no de proteccion (no mostrada). En la posicion de proteccion, el extremo 4047 del brazo oscilante 4045 cubre la abertura del recipiente de recogida 4033, evitando de este modo la recogida de gotitas 33 por el recipiente de recogida 4033. En la posicion no de proteccion, el recipiente de recogida 4033 esta sin cubrir. Normalmente, el brazo oscilante 4045 esta en la posicion no de proteccion, pero el procesador 131 causa que el accionador 4043 mueva el brazo oscilante 4045 a la posicion de proteccion cada vez que el procesador 131 determina que hay riesgo de contaminacion (por ejemplo, el sistema de boquilla 101 queda obstruido, la localizacion de rotura de gotitas 107 se vuelve inestable, o gotitas dispersas 33 han golpeado el elemento de carga 631 o las placas deflectoras 629). El extremo 4047 del brazo oscilante 4045 tiene forma de cuba para drenar cualquier fluido recogido por el brazo oscilante 4045 en el recipiente de residuos 4035.

Sistema de suministro de fluidos

El sistema 1 descrito anteriormente es capaz de producir de forma eficaz cantidades de partmulas (por ejemplo, celulas espermaticas X) clasificadas por caractensticas seleccionadas. La tasa de produccion puede aumentarse o disminuirse variando las tasas a las cuales el sistema de suministro de fluidos 15 (Fig. 2) suministra el fluido portador 17 y el fluido envolvente 19 a la boquilla 137. En un ejemplo, el sistema de suministro de fluidos incluye una bomba de jeringa 645, siendo un ejemplo de dicha bomba MICROLAB® Modelo PSD/3 disponible en Hamilton Company. La bomba 645 es funcional para suministrar fluido portador 17 a la boquilla 137 a una tasa de aproximadamente 20 |il/min. En general, la bomba 645 debe ser funcional para suministrar fluido de muestra 17 a la boquilla 137 a una tasa en el intervalo de 10-50 |il/min. La bomba 645 esta conectada por la lmea de flujo 647 al suministro 3 de fluido portador 17, que puede ser un recipiente adecuado 649 que contiene un volumen de material a analizar y clasificar. Cuando la temperatura de las partmulas que se estan analizando es un factor, como en el caso de celulas espermaticas, por ejemplo, la temperatura del recipiente 649 puede controlarse por un sistema de control adecuado de la temperatura, tal como bano de calentamiento/refrigeracion (no mostrado). La bomba de jeringa 645 es movil a traves de una carrera de admision para aspirar fluido portador del recipiente de suministro y a traves de una carrera de descarga para distribuir fluido portador 17 a traves de una lmea de suministro 651 hasta la aguja de inyeccion 157 del sistema de boquilla 101. La bomba 645 se acciona preferiblemente por un motor de velocidad variable (no mostrado) bajo el control del procesador 131. A modo de ejemplo, la bomba 645 puede accionarse por un motor paso a paso que funciona a tasas selectivamente variables para bombear fluido portador 17 hasta la aguja 159 a tasas necesarias para obtener el rendimiento deseado. Pueden usarse otros tipos de dispositivos de suministro de fluidos en lugar de una bomba de jeringa. Para proporcionar solamente un ejemplo, el recipiente 649 puede presurizarse por una fuente de gas presurizado. Ademas, es deseable mantener las lmeas 647, 651 tan cortas como sea posible de forma practica porque el entorno de la lmea es no conductor para la salud de las celulas sensibles (por ejemplo, celulas espermaticas) que pueden estar en el fluido portador 17.

El suministro 7 de fluido envolvente 19 comprende un segundo recipiente 661, por ejemplo, un tanque en la Fig. 2, que aloja un volumen apropiado de fluido envolvente 19 conectado al orificio radial 173 en el cuerpo de flujo 133 del sistema de boquilla 101 mediante una lmea de suministro 667 que tiene una valvula de control 669 en la misma. En el ejemplo de la Fig. 1, el recipiente de fluido envolvente 661 esta presurizado por un sistema de presion de gas 671 que comprende una fuente 675 de gas presurizado (por ejemplo, aire u otro gas, tal como nitrogeno) que comunica con el tanque 661 mediante una lmea de aire 679 que tiene un regulador 681 en el mismo para controlar la presion suministrada al tanque 661. Una valvula de dos direcciones 683 en la lmea de aire 679 es movil entre una primera posicion que establece comunicacion entre el tanque 661 y la fuente de gas 675 y una segunda posicion que vacfa el tanque 661. El regulador de la presion de gas 681 es un regulador convencional preferiblemente bajo el control del procesador 131. Controlando la presion del tanque 661, tambien puede controlarse la presion a la cual se suministra el fluido envolvente 19 al cuerpo de flujo 133. Esta presion puede variar de 1,1 a 6,9 bar (16 a 100 psi).

En la Fig. 26 el sistema de suministro de fluidos 15, incluye un tanque de fluido envolvente (no mostrado) y una estacion de muestra 4051. La estacion de muestra incluye un recipiente de presion de dos partes 4053 adaptado para alojar un tubo de muestra 4055. La seccion inferior 4057 del recipiente de presion es movil en direccion ascendente y descendente relativa a la seccion superior 4059 del recipiente de presion 4053 entre una posicion abierta (mostrada en la Fig. 26), en que el tubo de muestra 4055 puede cargarse o descargarse, y una posicion cerrada (no mostrada) en que las dos partes 4057, 4059 del recipiente de presion 4053 quedan juntas para formar un sellamiento para contener el gas presurizado usado para bombear fluido portador 17 desde el tubo de muestra 4055 hasta el sistema de boquilla 101.

Cuando el recipiente de presion esta abierto un brazo oscilante retenido por resorte 4071 se mueve hasta una posicion por debajo de la lmea 651 que suministra fluido portador 17 al sistema de boquilla 101 (vease tambien la Fig. 119 n° 4071'). El brazo oscilante 4071 tiene forma de cuba y esta adaptado para recoger fluido retrodescargado

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a traves de la lmea 651 y para drenar el fluido retrodescargado hasta el recipiente de residuos a traves del acceso 4073. Segun se mueve el recipiente de presion 4053 desde su posicion abierta hasta su posicion cerrada, una placa de leva 4075 unida a la seccion inferior 4057 del recipiente de presion 4053 mueve el brazo oscilante 4071 contra su retencion de resorte para despejar el area entre las dos secciones 4057, 4059 y permitir que el recipiente de presion 4053 se cierre.

Control

Haciendo referencia de nuevo a la Fig. 2, el microprocesador 131 (u otro control y/o procesador digital o analogico, o combinaciones de los mismos) controla el funcionamiento del sistema 1. Como se indica a continuacion con respecto a la Fig. 39, el microprocesador puede implementarse como un procesador de control del sistema y cuatro procesadores para manipular el procesamiento de la senal. Como alternativa, algunas o todas las funciones pueden estar integradas en uno o mas procesadores. Por ejemplo, el microprocesador de control del sistema (vease la Fig. 36) puede implementarse usando uno de los cuatro procesadores de procesamiento de la senal. Ademas, como se indica a continuacion, el procesamiento de la senal puede implementarse por un circuito analogico (por ejemplo, un analizador analogico de celulas como se muestra en la Fig. 39) o una combinacion de circuitena analogica y digital.

El microprocesador 131 proporciona senales de salida para controlar el sistema de suministro de fluidos 15 (indicado a continuacion) en respuesta a senales de entrada recibidas desde el sistema de epi-iluminacion 415, proporciona senales de salida para controlar los transductores 105 en respuesta a senales de entrada recibidas desde el detector de roturas 389, y proporciona senales de salida para controlar el sistema de clasificacion 119 (indicado a continuacion) en respuesta a senales de entrada recibidas desde el sistema de epi-iluminacion 415. El microprocesador 131 puede proporcionar senales de salida a otras partes del sistema de citometna 9 como se indica en otra parte en este documento. Ademas, el microprocesador 131 puede adaptarse para procesar informacion y proporcionar senales de salida a tiempo real. En terminos generales, la expresion "tiempo real" se refiere a operaciones en que el funcionamiento del procesador 131 coincide con la percepcion humana del tiempo o aquellas en que la velocidad de funcionamiento del procesador 131 coincide con la velocidad de procesos ffsicos o externos relevantes. En un contexto, la expresion "tiempo real" puede indicar que el sistema reacciona a eventos antes de que los eventos queden obsoletos.

En general, las senales electricas del sistema de epi-iluminacion 415 se convierten en informacion digital por un conversor A/D 689 que suministra la informacion digital correspondiente al microprocesador 131. En respuesta a la informacion, el microprocesador 131 controla un sistema de clasificacion 119 y un sistema de suministro de fluidos 15, ambos descritos anteriormente.

Las senales electricas producidas desde el fotodetector 117 del sistema de epi-iluminacion 415 son senales de voltaje analogicas variables con el tiempo indicativas de la amplitud de la fluorescencia emitida 31 en cualquier instante en el tiempo generadas por cada celula cuando se ilumina por el haz laser 25. Por tanto, las senales analogicas (tambien mencionadas como salida analogica) estan en forma de pulsos de forma de onda variables con el tiempo 497 como se ilustra esquematicamente en las Fig. 52 y 53. En general un pulso de forma de onda 497 se define como una forma de onda o una parte de una forma de onda que contiene uno o mas pulsos o alguna parte de un pulso. Por tanto, la amplitud de cada pulso de forma de onda 497 en cualquier instante en el tiempo representa la velocidad relativa de la emision de fotones 31 de cada celula en ese instante en el tiempo segun la celula pasa a traves del haz laser 25. Las celulas espermaticas bovinas con cromosoma X tienen un mayor contenido de aDn que las celulas espermaticas bovinas con cromosoma Y (por ejemplo, aproximadamente el 3,8%). Como resultado, las celulas X vivas marcadas con un colorante fluorescente como se ha indicado anteriormente produciran un pulso de diferente forma de onda 497 que los pulsos de cualquier otra celula marcada. Analizando los pulsos 497 como se indica a continuacion (vease procesamiento de la senal, barrido de ranura, y diferencia de pendiente cntica), cada celula puede identificarse como una celula X o no identificarse como una celula X (-X). En general, como se usa en este documento, celulas X se refiere a celulas X vivas, celulas Y se refiere a celulas Y vivas y celulas -X se refiere a la combinacion de celulas Y vivas y celulas que por lo demas producen una emision de fluorescencia detectable 31 pero que no pueden identificarse con una probabilidad razonable como celulas X vivas.

La sincronizacion de cada pulso de forma de onda 497 indica la posicion de cada celula en la corriente 21. Como la tasa a la cual se suministra el fluido envolvente 19 a traves de la boquilla 137 permanece constante, y como la distancia d (en la Fig. 25) entre la boquilla 137 y la localizacion de rotura de gotitas 107 es conocida, la posicion de cada gotita 33 es conocida y las celulas, si las hay, dentro de cada gotita 33 son conocidas. Por tanto, el microprocesador 131 puede calcular el instante en el cual cada gotita en formacion pasa a traves del collarm de carga 631 y puede controlar la polaridad del collarm 631 y de este modo controlar si una gotita 33 se carga para su desviacion por los elementos de carga 631 del sistema de clasificacion 119. Como el microprocesador 131 conoce la tasa de formacion de gotitas e identifica las celulas dentro de una gota como X o -X, el microprocesador 131 conoce el contenido celular de cada gotita 33 y hace un seguimiento (o enumera) la cantidad de celulas en cada poblacion 123, 125. Dependiendo de la estrategia de clasificacion, vease a continuacion, el microprocesador 131 determina las gotitas 33 que estan cargadas para su desviacion y las gotitas 33 que no estan cargadas de modo que no se desvfan.

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Procesamiento de la senal

A. Introduccion de muestreo digital

Como se ha descrito previamente, la interaccion entre el haz laser 25 y la partfcula produce una emision "pulsada" de gotones 31 (por ejemplo, una emision de fluorescencia) que se captura por la lente de recogida 511 del sistema optico 109 y se suministra a un fotodetector 117. El fotodetector 117 convierte la energfa de los fotones en cualquier instante en el tiempo en una salida de voltaje analogica de amplitud variable en el tiempo. Esta salida es una serie de pulsos de forma de onda 497 (Fig. 43 y 44) que contiene muchas caractensticas que pueden usarse para discriminar entre poblaciones de partfculas. Entre estas caractensticas estan la emision total de fotones, la tasa de emision de fotones como una funcion del transito espacial de la partfcula a traves del haz laser, la tasa maxima de emision de fotones durante el transito, la tasa promedio de emision de fotones durante el transito, y el tiempo requerido para el transito. La combinacion de la geometna del haz laser 459, el tamano de partfcula, la distribucion de la fuente de emision a traves del volumen de partfcula y la velocidad de la partfcula determina el espectro de frecuencias del pulso de forma de onda 497. Por ejemplo el sistema 1 usado con semen bovino descrito previamente ha determinado que cada celula 201 produce un pulso de forma de onda 497 de entre 800 ns y 1200 ns de duracion. Tambien se ha determinado que como funcion de la frecuencia, mas del 97% de la energfa en el pulso de forma de onda 497 se libera a frecuencias por debajo de 30 MHz. Este espectro de frecuencias se analizara posteriormente relacionado con el teorema de muestreo de Nyquist. Tomados juntos estos pulsos de forma de onda 497 forman una senal de salida 701 desde el fotodetector 117 que es una senal continua variable en el tiempo que representa el transito de la corriente de partfculas a traves del aparato. Ademas de las caractensticas de los pulsos individuales que se usan para discriminar entre poblaciones, la senal variable en el tiempo proporciona un registro preciso en cuando al espaciado relativo (tiempo y posicion) entre las partfculas individuales que pasan a traves del aparato y la velocidad relativa de las partfculas que se mueven a traves del aparato. Este registro preciso de tiempo, posicion y velocidad puede sincronizarse con las senales del oscilador de generacion de gotitas 703 como se muestra en la Fig. 44 para determinar las partfculas que son miembros de una gotita particular 33 formada por el aparato de generacion de gotitas 105. Esta informacion puede usarse como base para determinar la "coincidencia" o la aparicion de una partfcula deseada e indeseada en una gotita individual 33. La capacidad de determinar de forma precisa la cantidad y clasificacion de cada partfcula en una gotita 33 permite una ordenacion precisa y eficaz.

Puede emplearse procesamiento de senales digitales 705 como se ilustra en la Fig. 72 para analizar la deteccion de pulsos de fluorescencia 31 indicada por senales de salida muestreadas de forma sincronica 701 desde el fotodetector 117. Este procesamiento se implementana en un software de analisis de pulsos que emplea instrucciones y/o algoritmos, como se indica en este documento. La senal de salida analogica variable en el tiempo 701 del fotodetector 117 se proporciona a un conversor A/D (analogico/digital) 689 que la muestrea sincronicamente. Muestrear sincronicamente significa muestrear para producir informacion digital correspondiente a la salida analogica. Muestrear sincronicamente tambien se menciona como muestrear de forma continua o adquisicion de datos continuos. Como se indica a continuacion, la tasa de muestreo depende del espectro de frecuencias de la salida analogica.

El conversor 689 proporciona una salida que incluye informacion digital 707 que se proporciona al microprocesador 131 u otro dispositivo de analisis digital que ejecuta el software de analisis de pulsos para analizar la informacion digital 707. En general, el software de analisis de pulsos incluina deteccion de pulsos digitales, extraccion de caractensticas de pulso y discriminacion de pulsos.

B. Frecuencia de muestreo y espectros de frecuencias de las senales

La senal de salida 701 de la PMT 117 se captura por un conversor analogico a digital de alta velocidad 689 (ADC) que muestrea la salida output 701 de forma continua a una frecuencia de 105 MHz. Es bien comprendido que cuando se muestrea una senal variable en el tiempo es necesario que la frecuencia de muestreo sea al menos dos veces la frecuencia maxima contenida en la senal que se esta muestreando.

Esto se conoce como el teorema de muestreo de Nyquist. Por esta razon la senal de salida 701 de la PMT 117 se envfa primero a traves de un filtro de paso bajo de 40 MHz 854 (vease la Fig. 39) para asegurar que la frecuencia maxima contenida en la senal 701 esta por debajo del lfmite de 52,5 MHz impuesto por la tasa de muestreo. Es importante indicar que los sistemas optico 109, flrndico 15 y de deteccion del aparato 1 se han sintonizado para producir una forma de onda del pulso 497 que tiene caractensticas optimas de frecuencia para el muestreo a la tasa de 105 MHz. La tasa de muestreo puede variarse entre aproximadamente 25 y 200 MHz.

C. Procesamiento de pulsos

El procesamiento de pulsos tiene lugar en cuatro (4) Procesadores de DSP TigerSharc que comparten memoria y estan conectados entre sf por puertos paralelos de alta velocidad. Como se ilustra en la Fig. 39, los cuatro procesadores son: 1) un procesador de tratamiento de datos 863 que recibe datos de un ADC de alta velocidad 689 que digitaliza las senales de salida 701 del fotodetector 117; 2) un procesador de deteccion de pulsos 865 que detecta los pulsos de forma de onda 497 representados por la informacion digital; 3) un procesador de extraccion de

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caractensticas y discriminacion 867 que extrae caractensticas de los pulsos detectados 497 y discrimina los pulsos 497 en base a las caractensticas extrafdas; y 4) un procesador de clasificacion 873 que determina una clasificacion de ordenacion para cada pulso 497 en base a las caractensticas extrafdas y la discriminacion, que determina las decisiones de clasificacion paras las celulas y gotitas correspondientes 33 y que esta sincronizada con la formacion de gotitas 105. En general un procesador 863, 865, 867, 873 completa una tarea y establece una "senal" de modo que los procesadores companeros sepan que hay datos disponibles para procesar.

Cada procesador 863, 865, 867, 873 funciona independientemente de los otros, maximizando el rendimiento global porque no se interrumpen entre st Por tanto, cualquier procesador 863, 865, 867, 873 puede ser capaz de realizar cualquier funcion y uno o mas procesadores o funciones pueden combinarse en un unico procesador o repartirse sobre una pluralidad de procesadores. Las etiquetas del procesador 863, 865, 867, 873 usadas anteriormente y esta aplicacion se usan por conveniencia unicamente y no pretenden ser limitantes de ningun modo.

Los cuatro procesadores 863, 865, 867, 873 estan vinculados a una SDRAM de placa DSP 851 para intercambiar informacion y estan vinculados a una entrada/salida (I/O) de procesador 857 para su sincronizacion y comunicacion con un bus I/O periferico 859 conectado al PC 735 y el generador de pulsos de clasificacion 861. El I/O de procesador 857 puede implementarse por dos o mas procesadores de I/O SharcFIN conectados por un enlace de comunicaciones. Las senales de clasificacion 853 se proporcionan al PC 735 mediante el bus I/O periferico 857 y se usan para controlar el generador de pulsos de clasificacion 861 que controla la carga de gotitas 33.

El I/O de procesador 857 recibe la salida 707 desde el conversor analogico/digital (ADC) 689, por ejemplo, Bitware Corp. 105MHz/2-canales, 14 bit con capacidad de 105MHz/1-canal sostenido. El ADC 689 esta conectado a la salida del fotodetector 117 para convertir sus senales analogicas variables con el tiempo de salida 701 en informacion digital 707 y tambien esta conectado a una SDRAM de placa I/O 855 para almacenar los bloques de informacion digital desde el ADC 689.

En general, las senales analogicas de salida 701 del fotodetector 117 son indicativas de la caractenstica A o caractenstica B (por ejemplo, X o ~X). El conversor A/D 689 convierte las senales analogicas de salida 701 del fotodetector 117 del sistema de citometna de flujo 1 en informacion digital correspondiente 707. Los procesadores 863, 865, 867, 873 analizan y clasifican la informacion digital 707 y proporcionan una senal de clasificacion al sistema de clasificacion 119 como una funcion de la informacion digital detectada y clasificada.

D. Adquisicion de datos

Como se ha indicado previamente, la senal de salida 701 del fotodetector 117 se captura por un conversor analogico a digital de alta velocidad (ADC) 689 que muestrea la salida de forma continua a una frecuencia de 105 MHz. Los datos (informacion digital 707) se transfieren inmediatamente en bloques de memoria de alta velocidad (SDRAM de placa I/O) 855 que sirve para acumular los datos entrantes. Estos bloques de memoria 855 se organizan de un modo que mantiene la integridad y secuencia de la corriente de datos 707. Estos bloques de memoria 855 tambien son accesibles por los procesadores de procesamiento de senales digitales (DSP) 863, 865, 867, 873 mediante acceso directo a la memoria (DMA). De este modo los procesadores 863, 865, 867, 873 pueden acceder a los datos entrantes 707 sin interrumpir el ADC 689. Esto facilita una transferencia eficaz de los datos 707 a estos procesadores 863, 865, 867, 873 para la extraccion de caractensticas, el analisis y la clasificacion de ordenacion. En todo este proceso, el procesador de tratamiento de datos 863 mantiene las muestras de pulso 707 en orden y tiempo indexados (relativos al reloj maestro 737, que es 128 veces la frecuencia de gotita 33) para conservar su referencia al "tiempo real" o el tiempo verdadero en que la celula pasa a traves del haz laser 25. El ADC 689 rebota hacia atras y hacia delante entre dos entradas, muestreando de forma continua las senales analogicas variables con el tiempo de salida 701 incluyendo los pulsos de forma de onda 497 y convirtiendolas en informacion digital 707 que se proporciona en bloques 855 a la SDRAM de placa I/O bajo el control del procesador de tratamiento de datos 863, el procesador 863 reune la informacion 707 en una corriente continua.

E. Parametros de deteccion de inicializacion

Para distinguir de forma eficaz sobre el ruido de fondo, debe proporcionarse al software de deteccion de pulso digital 747 informacion que indique la estadfstica de segundo orden del fondo de senales, es decir el conocimiento del comportamiento de la senal de voltaje de salida 701 desde el fotodetector 117 cuando no existe pulso de fluorescencia 497. Esta estadfstica puede aprenderla el software para parametros de deteccion de inicializacion 741 de un modo no supervisado durante el periodo de inicializacion inmediatamente despues del arranque del sistema 1. En general, un pulso puede definirse como 2 o 3 desviaciones tfpicas a partir del nivel de fondo.

Debido a la posibilidad de que la introduccion del fluido portador 17 en la corriente de fluido envolvente 191 pueda causar un cambio en la emision de fluorescencia de fondo, el fluido portador 17 debe estar presente para la inicializacion de los parametros de deteccion. La computacion simple de la estadfstica de segundo orden de una secuencia de tiempo de valores de senales de voltaje de salida puede sobre-estimar la desviacion tfpica del fondo (debido a la posible presencia de pulsos de fluorescencia 497 en la secuencia). Por lo tanto se prefiere un procedimiento iterativo para eliminar gradualmente este efecto. El software de deteccion de pulsos 747 consigue

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esto computando la estadfstica de la senal total 701 (fondo + pulsos), usando estos valores para aplicar la logica de deteccion de pulsos, re-computando la estad^stica de las senales sin muestras detectadas como dentro de pulsos, y repitiendo este procedimiento hasta que convergen las estimaciones estad^sticas del fondo (o se produce una cantidad maxima fija de iteraciones). Evaluando el fondo con celulas presentes, puede determinarse una indicacion mas precisa de la amplitud del pulso correcto esperado 497. La Tabla III resume el procedimiento de inicializacion de deteccion para determinar los parametros de deteccion para su uso por el software de deteccion de pulsos.

Algoritmo:: Parametros de deteccion de inicializacion

Entrada:: vector de numeros de coma flotante PMTvolts; numero de coma flotante statWindowSize, numero entero maxlterations

Salida:: numero de coma flotante bckgrndMean; numero de coma flotante bckgrndSTD

Procedimiento:

1.: Inicializar el vector de fondo bckgrnd a las ultimas muestras statWindowSize del vector PMTvolts y numerations, lastSampleMean, y lastSampleSTD a cero: bckgrnd = PMTvolts[I a statWindowSize] lastSampleMean = 0 lastSampleSTD = 0 numIterations = 0

2.: Computar la media de la muestra y la desviacion tfpica de la muestra de bckgrnd y incrementar el contador de iteracion: samoleMean= suma (bckgrnd) statWindowSize -t- sampleSTD= ([suma(bckgrnd - sampleMean)] 2))/statWindowSize numIterations= numerations + 1

3.: Comprobar la convergencia o cantidad maxima extraordinaria de iteraciones: exitFlag= ((sampleMean - lastSampleMean <eps a (sampleStd - lastSampleStd < eps v (numeration > maxIterations) Si exitFlag es cierto, se va a la etapa 6 (lo demas continua con la etapa 4).

4.: Aplicar el algoritmo de deteccion de pulsos, obteniendo vectores de muestras de pulso y nuevas estimaciones de muestras de fondo: [pulse,bckgrnd] = pulse_detect(bckgrnd, sampleMean, sampleSTD)

5.: Registrar las estimaciones estadfsticas a partir de esta iteracion y repetir lastSampleMean = sampleMean lastSampleSTD = sampleSTD Ir a la etapa 2.

6.: Establecer las estaciones estadfsticas de fondo para la estadfstica de muestras y salir: bckgrndMean = sampleMean bckgrndSTD = sampleSTD

Tabla III. Inicializacion, de parametros del algoritmo de deteccion de pulsos.

En general, el conversor A/D 689 convierte las senales analogicas de salida 701 del fotodetector 117 en la correspondiente informacion digital 707 indicativa de la caractenstica A o caractenstica B (por ejemplo, X o -X). El Procesador de senales digitales 865 determina las caractensticas de fondo de las senales variables con el tiempo de salida 701 a partir de la informacion digital 707 correspondiente a las mismas, detecta los pulsos de forma de onda 497 a partir de la informacion digital 707 como una funcion de las caractensticas de fondo determinadas, y proporciona una senal de clasificacion 853 al sistema de clasificacion 119 como una funcion de los pulsos detectados 497.

F. Parametros de discriminacion inicial

Similares a los parametros de deteccion (y posterior a su inicializacion como se muestra en la Tabla III), pueden inicializarse los parametros para su uso en un algoritmo de discriminacion de un modo no supervisado. A diferencia de los parametros del algoritmo de deteccion, sin embargo, no es necesario un procedimiento iterativo. En este caso, el software para inicializar los parametros de discriminacion 745 detecta un numero pre-establecido (por ejemplo, 100.000) de pulsos de fluorescencia 497, computa las caractensticas a usar para la discriminacion para cada pulso detectado 497, y usa un procedimiento de agrupacion (vease la Tabla IV para un resumen de los

procedimientos de agrupacion candidatos) para asignar estos pulsos 497 a poblaciones de interes (por ejemplo, X, ~X).

Nombre del algoritmo: Aproximacion del algoritmo

Media k: Minimizacion iterativa (local) de la suma de la distancia al cuadrado (Euclidiana o de Mahalanobis) entre puntos dentro de cada poblacion [1]

Media k difusa: Expectacion-maximizacion del modelo mixto (Gaussiano) [2]

Aglomerativo jerarquico: Fusion de los grupos "mas cercanos" (partiendo con cada dato puntua como su propio grupo) hasta alcanzar la cantidad deseada de grupos. Diversas medidas para la determinacion de los grupos "mas cercanos" incluyen distancia entre puntos mas proximos, distancia entre puntos mas lejanos, distancia entre medias de grupo, y distancia promedio entre puntos. [1]

Tabla IV. Resumen de las aproximaciones de agrupacion en consideracion para su uso en inicializacion de 5 parametros con algoritmo de discriminacion.

La Fig. 73 contiene un ejemplo de los resultados de aplicacion de un procedimiento de agrupacion de media k para definir la poblacion 1 y la poblacion 2 en base a la estadfstica de distribucion. La estadfstica de segundo orden de estas poblaciones entonces se usa para establecer los parametros necesarios para la discriminacion (los 10 coeficientes de una funcion de decision polinomial de 1er o 2°). La Tabla V resume el procedimiento de inicializacion de discriminacion.

Algoritmo:

Parametros de discriminacion de inicializacion

Entrada:

Matriz de numeros de coma flotante detectedPulseData, vector de numeros de coma flotante popPriorProbabilities

Salida:

Para cada poblacion de clase i: matriz de numeros de coma flotante Wi, vector de numeros de coma flotante w,, numero de coma flotante wo

Procedimiento:

1.

Computar los valores de caractensticas de los pulsos detectados (n valores por pulso donde n es la dimensionalidad de espacio de caractensticas): feature Values = feature_extract(detectedPulseData)

Agrupar los valores de caractensticas en el espacio de caractensticas para obtener miembros de la poblacion poblaciones = grupo (featureValues)

Computar la estadfstica de 2o orden de poblaciones:

(para i = 1 a m, donde m es el numero de poblaciones/clases)

(para j= 1 a n, donde n es dimensionalidad del espacio de caractensticas) popMean[j]= suma (featureValues [poblaciones,/!)

n° de muestras en poblacionesi

(para k = 1 a n, donde n es dimensionalidad del espacio de caractensticas) tmpVal[j,k]= (featureValues[poblacionesi, j] - poblaci6nMeani,j^])•

(featureValues[poblacionesi, k] -poblaci6nMean;[k])

popCovariance[,k] = suma (tmpVal[i.k])__________

n° de muestras en poblacionesi

Computar coeficientes de funcion de discriminacion polinomial:

(para i = 1 a m, donde m es el numero de poblaciones/clases)

Wi = -1/2-popCovariance-1 Wi = popCovariance-1 popMeani Wio = -1/2ln([popCovariance]) - 1/2 popMean^popCovariancef1 popMeani +

ln( popPriorProbabilities)____________________________________________________

Tabla V. Inicializacion de parametros del algoritmo de discriminacion.

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15 En general, el conversor A/D 689 convierte las senales analogicas de salida 701 del fotodetector 117 en la correspondiente informacion digital 707 indicativa de la caractenstica A o caractenstica B (por ejemplo, X o ~X). El procesador de senales digitales 867 genera parametros de discriminacion inicial correspondientes a la informacion digital 707, discrimina la informacion digital como una funcion de los parametros de discriminacion inicial, y

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proporciona una senal de clasificacion 853 al sistema de clasificacion 119 como una funcion de la informacion digital discriminada.

G. Deteccion de pulso digital

La primera etapa del procesamiento es la deteccion de pulsos que realiza el procesador de deteccion de pulsos 865 para determinar si una forma de onda particular es un pulso de forma de onda 497 correspondiente a la emision de fluorescencia 31 de una celula. El procesador 865 ejecuta un algoritmo de deteccion de pulsos que identifica conjuntos de muestras con probabilidad de representar a las partfculas buscadas para clasificarlas o a las partfculas a evitar porque son contaminantes potenciales de una poblacion. En el caso de la clasificacion de esperma bovino, se anade un colorante para inactivar la emision 31 de las celulas no viables, lo que hace que las intensidades de pulsos asociadas sean ~1/3 de la intensidad de una celula viva. Las celulas no viables no se consideran como blancos de clasificacion ni como contaminacion potencial. No se consideran como pulsos 497 detectados. Los pulsos 497 de las celulas vivas se detectan mediante el seguimiento de la intensidad de muestras para un numero sucesivo de muestras que sobresalen de los niveles de fondo. Una vez que este nivel cruza un umbral determinado estadfsticamente, el procesador 865 salta a un tiempo posterior que es aproximadamente 75% del ancho de pulso esperado 497 para una celula viva. Si el nivel esta todavfa por encima del umbral, la serie de muestras se considera como un pulso 497. Las muestras de los pulsos detectados 497 se trasfieren a un bloque de memoria usada por el procesador de extraccion de caractensticas 867.

Un enfoque de deteccion de anomalfas estadfsticas es un ejemplo que se puede emplear por el software de deteccion de pulsos digitales 747 aunque se considera que se pueden usar otros enfoques para identificar y/o aislar los pulsos digitalizados 497. Esencialmente, las muestras digitales 707 de las senales de voltaje de salida 701 del fotodetector 117 que detecta la fluorescencia que resultan estadfsticamente anomalas respecto al fondo se consideran como parte de un pulso 497. Para tener una robustez adicional (para reducir al mmimo la deteccion de ruido), se pueden incluir criterios temporales adicionales.

La deteccion de pulso procede del siguiente modo. Cuando la senal de salida de voltaje 701 del fotodetector 117 no es un pulso, se calcula la distancia de Mahalanobis respecto al fondo de las muestras entrantes 707 de la senal 701 y se compara con un umbral prefijado. Si la distancia de una muestra dada excede el umbral, se considera como el comienzo potencial de un pulso 497 y el software de deteccion de pulsos empieza a acumular las muestras entrantes. Si el siguiente numero predeterminado de muestras (por ejemplo, 25) tambien supera el umbral, se considera que ha comenzado un pulso 497 y la acumulacion continua hasta que se satisfacen los criterios de final de pulso; de otro modo, el bufer se vacfa y se reanuda la comprobacion de comienzo de un pulso. Mientras se detecta un pulso 497, si una muestra esta por debajo del umbral, se considera como el final potencial de un pulso y se registra la ubicacion del bufer (pero se continua almacenando en el bufer la informacion de la muestra). Si el siguiente numero predeterminado de muestras (por ejemplo, 25) tambien esta por debajo del umbral, se considera que el pulso 497 ha terminado y el pulso 497 consta de las muestras almacenadas en el bufer hasta la ubicacion registrada. La Tabla VI resume el algoritmo de deteccion de pulsos, y la Fig. 49 proporciona una ilustracion de los resultados de la deteccion de pulsos en un pulso de fluorescencia 497 adquirido digitalmente.

Algoritmo:: Deteccion de pulso de fluorescencia digital

Entrada: vector de numeros de coma flotante digSamples, numero de coma flotante bkgrndMean, numero de coma flotante bkgrndSigma, numero de coma flotante pulseStartThresh, numero de coma flotante pulseEndThresh, numero entero numStartSamples, numero entero numEndSamples

Salida:: vector de numeros de coma flotante pulseBuffer

Procedimiento:: Inicializar inPulseFlag = 0, pulseStartCount = 0, pulseEndCount = 0 Para cada muestra en

1.: digSamples, calcular la distancia de Mahalanobis respecto al fondo:

2.: mhDisti = (diciSamplefi] - bkorndMean) bkgrndSigma

3.: Si inPulseFlag no esta fijado, ir a la etapa4, si no ir a la etapa6.

4.: Si mhDist > pulseStartThresh, colocar la muestra en pulseBuffer, aumentar pulseStartCount, e ir a la etapa5; si no fijar pulseStartCount=0, ir a la etapa 2.

5.: Si pulseStartCount > numStartSamples, fijar inPulseFlag e ir a la etapa2.

6.: Si mhDist < pulseEndThresh, colocar la muestra en pulseBuffer, fijar lastPulseSample en la posicion actual del bufer, aumentar pulseEndCount, e ir a la etapa7; si no fijar pulseEndCount a cero e ir a la etapa2.

7.: Si pulseEndCount es mayor que numEndSamples, regresar pulseBuffer[1 a lastPulseSample] y salir.

Tabla VI. Resumen de la deteccion de pulso digital de fluorescencia.

En general, el conversor A/D 689 convierte las senales analogicas de salida 701 del fotodetector 117 en la informacion digital correspondiente 707 que indica la caractenstica A o la caractenstica B (por ejemplo, X o ~X). El

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procesador de senales digitales 865 analiza la informacion digital y el procesador 873 proporciona una senal de clasificacion 853 al sistema de clasificacion 119 en funcion de la informacion digital detectada.

H. Extraccion y discriminacion de caracteristicas

La siguiente etapa del procesamiento es la extraccion de caracteristicas realizada mediante el procesador de extraccion y discriminacion de caracteristicas 867. Este procesador responde a los indicadores establecidos por el procesador de deteccion de pulsos 865. Las muestras de los pulsos detectados se colocan en la memoria compartida con el procesador de extraccion de caracteristicas 867. Para cada pulso 497 se determinan las caracteristicas tales como el area, el ancho del pulso, la altura del pulso, el coeficiente de correlacion gaussiana y/u otras caracteristicas. En algunos casos los pulsos 497 se determinan como "dobletes" o invalidos y las caracteristicas no se extraen. Para el caso de esperma bovino 201 solo se extraen las caracteristicas para los pulsos 497 que tienen la amplitud y el ancho general de una celula viva X o Y. De manera caracteristica, la amplitud del pulso para una celula espermatica viva se encuentra entre aproximadamente 700 y 900 mV, aunque este intervalo puede ser tan amplio como de 500 a 1000 mV. Una vez que se extraen las caracteristicas, estas se comparan con los espacios de caracteristicas definidos para la poblacion o poblaciones seleccionadas para clasificacion. Si las caracteristicas coinciden con los espacios de caracteristicas identificadas para la clasificacion, entonces el procesador 867 establece una senal que indica un comando de clasificacion positiva para el procesador de clasificacion 873. En general, la clasificacion de una celula particular la hace por el procesador de discriminacion 867 y la decision de separacion la hace el procesador de clasificacion 873.

La informacion digital 707 que representa la emision de fluorescencia 31 (y por lo tanto las caracteristicas de las celulas correspondientes que las crearon) la discrimina el software 757 en base a caracteres o caracteristicas espedficas que muestran un comportamiento estadfstico marcadamente diferente en el espacio de caracteristicas (el espacio ortogonal n-dimensional formado por n caracteristicas como ejes) para las diferentes poblaciones de interes. Por lo tanto, la primera etapa al analizar la informacion digital 707 para la discriminacion es el calculo de estas caracteristicas, un proceso llamado extraccion de caracteristicas realizado por el software de analisis de pulsos 749 ejecutado por el procesador 867. La Tabla VII enumera las diversas caracteristicas posibles que el software 749 puede usar para esta aplicacion. Se seleccionaran una o mas de estas caracteristicas para formar el espacio de caracteristicas para la clasificacion. Debe senalarse que hay caracteristicas adicionales que proporcionan una mejor separacion de modo que esta lista es solo un ejemplo, no es integral. Por ejemplo, el software 749 puede emplear una subrutina 753 para determinar el area de pulso 497 y/o puede emplear una subrutina 755 para determinar el pico de pulso 497.

Nombre de la caracteristica: Descripcion de la caracteristica

Area de pulso: Aproximado por la suma (o promedio) de las muestras de pulso

Pico del pulso: Maximo valor de las muestras de pulso

Area "interna" de pulso: Suma (o promedio) de las muestras TBD internas de pulso (centrada en el promedio de pulso)

Ancho de pulso: Numero de muestras en el pulso.

"Gaussianidad" de pulso: MSE (error promedio al cuadrado) o coeficiente de correlacion de pulso con una forma gaussiana con la misma estadfstica de segundo orden.

"Pico retardado" del pulso: Valor posterior al pico (o promedio) del pulso en muestras TBD

Diferencia critica de pendiente (CSD): Pendiente de pulso en un punto a lo largo del pulso en el cual la diferencia entre la primera derivada de un pulso producido por las parriculas que tienen la caracteristica A y la primera derivada de un pulso producido por las parriculas que tienen la caracteristica B se encuentra en un maximo o proximo a este.

Tabla VII. Resumen de las caracteristicas posibles que se esta considerando usar en un analisis de pulso digital en relacion con la extraccion de caracteristicas.

I. Barrido de ranura

En general, el haz elfptico 459 proporcionado por el sistema de iluminacion 109 mide las diferencias relativas de contenido de ADN en las celulas. La resolucion puede mejorarse aun mas al analizar la fraccion del pulso 497 de la emision de fluorescencia 31 detectada por el fotodetector 117 que es mas probable que contenga las caracteristicas que se estan evaluando. Un fenomeno biologico de ciertas celulas (por ejemplo, esperma bovino) es la localizacion de los cromosomas X e Y en la region subecuatorial 225 que esta inmediatamente adyacente a la lmea media longitudinal o ecuador o centro del nucleo 213 de la celula 201 y que tiene una longitud de aproximadamente 1 |im. (Vease la Fig. 6). En realidad, los cromosomas X/Y no estan necesariamente centrados en el nucleo 213. Por lo tanto, la resolucion puede mejorarse al convertir la salida analogica variable en el tiempo 701 del fotodetector 117 en informacion digital 707 y analizar una porcion de la informacion digital correspondiente a la fraccion del pulso 497 de la emision de fluorescencia 31, por ejemplo, correspondiente a la luz emitida desde la region circumecuatorial 225 tal

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como 20-60% y en particular 20-30% del pulso de ondas centrado alrededor del pico del pulso 497.

Como se senalo anteriormente, se puede emplear el barrido de ranura para obtener la medicion de fluorescencia de una porcion de la cromatina de cada celula en lugar de obtenerla de la cromatina en su totalidad. El haz elfptico 459 proporcionado por el sistema de epi-iluminacion 415 como se menciono antes mide las diferencias relativas del contenido de aDn en las celulas en secciones espedficas de la cromatina, para mejorar la resolucion de las celulas X y las celulas ~X en relacion entre st Como se senalo anteriormente, la tecnica de medicion de barrido de ranura es un enfoque de medicion de fluorescencia que enfoca el haz de excitacion 25 de modo que la dimension del tamano del haz enfocado 459 es mucho menor que el diametro de una celula, como se muestra en la Fig. 6. De esta forma, el haz laser 25 explora la celula 201 a medida que la celula pasa a traves del haz de forma elfptica 459. El pulso de forma de onda 497 resultante producido por el fotodetector 117 en la salida 701 que detecta la emision de fluorescencia 31 que resulta de la iluminacion del barrido de ranura contiene informacion acerca de la localizacion de la fluorescencia a lo largo de la longitud de la celula 201. Segun se muestra en las Fig. 45-48, a medida que la celula 201 atraviesa el haz de forma elfptica 459, los pulsos de ondas que vanan con el tiempo 497 (lmea roja/anaranjada) son la convolucion de la intensidad relativa del haz (lmea azul) y la intensidad relativa del pulso emitido (que corresponde a la emision de fluorescencia de la tincion excitada por el haz elfptico a medida que la celula atraviesa el haz y que vana debido a que la distribucion de la fluorescencia a lo largo del eje de la celula vana).

Al iluminar solo una fraccion de la cromatina de la celula en un momento, la salida analogica resultante que vana con el tiempo 701 del fotodetector 117 contiene informacion espedfica de la localizacion de la fluorescencia dentro de la cromatina a lo largo del eje longitudinal de la celula 201. Aunque la emision de fluorescencia 31 detectada del barrido de ranura es menor que la emision 31 detectada de la exploracion realizada por un haz 25 con un ancho de haz equivalente al diametro de la celula, lo que da como resultado pulsos de onda 497 del barrido de ranura con una amplitud de pulso inferior, la mayor parte de la diferencia entre las celulas con cromosoma X y las celulas con cromosoma Y aparece en el centro del 20-30% al 20-60% del pulso de forma de onda 497. Si solo se considera el area rectangular 725 en la Fig. 53 para discriminar los celulas espermaticas X-Y, entonces se puede medir una diferencia relativa mayor entre la variacion localizada en el contenido de ADN dentro de la seccion de la cromatina que corresponde a la region rectangular 725 debido a la presencia de los cromosomas X e Y dentro de esa region comparado con el contenido total de ADN de las celulas. Por ejemplo, las celulas espermaticas bovina X e Y tienen una diferencia en contenido de ADN total de aproximadamente el 3,8%. La emision de fluorescencia 31 de los cromosomas X e Y estara contenida en la region rectangular 725. Si esta region rectangular 725 representa el 20% del pulso de forma de onda 497 total correspondiente a una emision de fluorescencia 31, entonces existira una diferencia del 14% en el contenido de ADN relativo dentro de la region. Al medir las diferencias relativas de contenido de ADN de secciones espedficas de la cromatina, se mejora la resolucion de la diferenciacion de las celula espermaticas X e Y (por ejemplo, del 3,8% al 14%). La Fig. 54 ilustra la resolucion que se puede alcanzar usando iluminacion de barrido de ranura y procesando las areas de solo el 20% central del pulso 497 (es decir, la region rectangular 725 de la Fig. 53). El histograma de la Fig. 54 permite identificar un porcentaje muy alto (por ejemplo, 98%) de esperma que alberga cromosoma X y esperma que alberga cromosoma Y con un alto grado de confianza (por ejemplo, 95%). En comparacion, el histograma de la Fig. 54, que ilustra la resolucion que se puede obtener cuando se utilizan tecnicas de iluminacion convencionales, muestra que el barrido de ranura ofrece una mejora significativa con respecto a los resultados obtenidos usando tecnicas convencionales de iluminacion.

Dos enfoques que se pueden emplear para obtener el area 725 de la porcion central del pulso de forma de onda 497 como se ilustra en la Fig. 53 son el procesamiento de las senales digitales (DSP) del fotodetector digitalizado 117 de salida analogica que vana en el tiempo 701, como se analiza en esta seccion, o la integracion analogica usando un umbral analogico desencadenante, como se indica a continuacion. Segun se observa en este documento, el procesamiento del DSP implica un muestreo continuo de la salida analogica que vana en el tiempo 701 del fotodetector 117 para obtener informacion digital 707 correspondiente a la salida 701 y aplicar algoritmos DSP a la informacion digital 707 para extraer las caractensticas, como por ejemplo el tamano del area, de la informacion digital correspondiente a la porcion central 725 del pulso de forma de onda 497 que corresponde a la diferencia en el contenido de ADN como resultado de la presencia de un cromosoma X o Y en diferentes celulas 201. Como un ejemplo sencillo, el 20% del centro del area total de cada pulso de forma de onda 497 se determinana analizando la informacion digital 707 correspondiente al mismo. El analisis se usana para generar un histograma tal como el ilustrado en la Fig. 53.

J. Barrido de laser pulsado

En un ejemplo, se contempla que, por ejemplo, el sistema 1 incluye un laser de pulsos para iluminar las celulas. En El barrido de ranura (como se ha descrito anteriormente) puede emplearse o no. Por ejemplo, se puede usar un laser de estado solido de modo cerrado, para emitir una serie de pulsos electromagneticos con un ancho de pulso (duracion) de 1 a 100 picosegundos a una frecuencia de pulso de aproximadamente 50 a 150 MHz y a una potencia de salida promedio de aproximadamente 100 a 500 milivatios. Un laser adecuado es un laser Vanguard 350 de estado solido de modo cerrado (disponible en Spectra-Physics, Mountain View, CA 94039), que puede funcionar para emitir una serie de pulsos de aproximadamente 12 picosegundos de ancho (duracion) a una frecuencia de aproximadamente 85 millones de pulsos por segundo y a una potencia promedio de aproximadamente 350 milivatios. Dado que los 350 mW de potencia se liberan en descargas sumamente cortas de solo 12 picosegundos,

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la potencia de salida maxima de dicho laser es varios cientos de veces (por ejemplo, aproximadamente 800 veces) mayor que la potencia promedio.

La salida de un laser de esas caractensticas puede describirse como una onda cuasi continua porque, para muchas aplicaciones, la velocidad de repeticion de pulso es suficientemente rapida como para aproximarse a una salida de onda continua. En efecto es posible hacer funcionar el sistema como se ha descrito anteriormente con un laser de onda cuasi continua practicamente de la misma forma que como se hana funcionar con un laser de onda continua. Esto proporciona ciertas ventajas porque los laser de estado solido habitualmente funcionan de manera mas eficaz, requieren sistemas de refrigeracion menos extensos y requieren menos mantenimiento que la mayona de los demas laser.

Un laser de estado solido de pulsos de onda cuasi continua tambien puede proporcionar relaciones senal a ruido significativamente mejores usando las tecnicas de procesamiento de senales digitales. Se puede incluir un circuito de sincronizacion y se puede hacer funcionar para producir una senal de temporizacion indicativa de la llegada de los pulsos laser a la localizacion de examen 115 (es decir, el area donde el haz laser 25 ilumina la corriente 21). Por ejemplo, el circuito de sincronizacion puede ser un detector de pulso laser 3003 como se muestra en la Fig. 40 para detectar luz correspondiente al pulso laser incluyendo la luz dispersa generada por la interaccion de cada pulso laser con la corriente de fluido 21 y/o incluyendo la luz de los pulsos laser. Alternativamente, para laser que se pueden disparar, se puede proporcionar una senal activadora al microprocesador 131 y/o al conversor A/D 689 para sincronizar cualquiera o ambos pulsos laser, como se observa a continuacion con respecto a la Fig. 50. En cualquiera de los ejemplos, la sincronizacion del pulso laser proporcionana una senal del oscilador para el sistema.

Con referencia a la Fig. 50, un diagrama de sincronizacion ilustra la relacion de sincronizacion entre los pulsos laser LP, la emision de fluorescencia FE desde una celula como resultado de la excitacion repetida por los pulsos laser LP a medida que la celula pasa a traves del haz de luz 459 y las muestras digitales DS de la salida del fotodetector 701. Segun se muestra en las figuras 45-49, a medida que una celula pasa a traves del haz laser 459, la emision de fluorescencia 31 vana segun la cantidad de iluminacion de la porcion de la celula que genera la emision de fluorescencia 31. La Fig. 50 ilustra veinte pulsos laser (20) LP1-LP20 que inciden sobre una celula a medida que la celula pasa por la zona de examen 115 de un citometro de flujo 1. Cada pulso laser LP1-LP20 corresponde a una emision de fluorescencia FE1-FE20, respectivamente, la cual decae exponencialmente despues de la excitacion practicamente instantanea por parte del pulso laser.

El microprocesador 131 puede controlar el conversor A/D 689 (vease la Fig. 40) para que el conversor 689 muestree la senal de salida 701 del fotodetector 117 en el pico o cercano a este de cada emision de fluorescencia FE1-FE20, como se indica por las muestras digitales DS1-DS20, respectivamente. En otras palabras, el circuito de sincronizacion sincroniza la velocidad de muestreo del conversor A/D 689 con la emision de fluorescencia FE1- FE20. La senal digital resultante producida por el transito de una partfcula a traves de la zona de examen 115 es el equivalente funcional de la senal digital que se habna producido por la digitalizacion de pulsos de ondas 497 de un laser de onda continua. Como se muestra en la Fig. 51, por ejemplo, considerando solamente la intensidad de fluorescencia durante las muestras digitales DS1-DS20 y sin tener en cuenta la cafda de intensidad de fluorescencia entre los pulsos laser LP1-LP20, la intensidad de fluorescencia como una funcion del tiempo es un pulso de forma de onda 497. Esto permite la extraccion de caractensticas por parte del microprocesador 131 a partir de la senal digital 707 generada por el laser de pulsos para analizar la celula que proporciona las emisiones de fluorescencia FE1-FE20. En un ejemplo, se puede usar un fotodetector mas sensible con un tiempo de respuesta relativamente rapido, de aproximadamente unos 2 nanosegundos o menos para detectar con mayor precision la emision de fluorescencia.

Por lo tanto, el laser de pulsos proporciona ventajas en un sistema de citometna de flujo 1 en que es posible usar un laser de pulsos de menor potencia para obtener sustancialmente el mismo analisis que se obtendna con un laser de onda continua que funcionara a una potencia promedio mucho mayor que la potencia promedio del laser de pulsos. Aun mas, la potencia maxima de un laser de pulsos tiende a saturar los fluoroforos de modo que la emision de fluorescencia se maximiza reduciendo asf la relacion senal a ruido de las senales de salida del fotodetector. En otras palabras, al usar un pulso laser que contiene mucha mas energfa de la que se requiere para saturar el fluoroforo, las variaciones en la salida del laser no dan como resultado variaciones en la emision de fluorescencia 31.

Los especialistas en la tecnica reconoceran que hay muchas maneras de hacer que un laser emita una serie de pulsos. Se entiende que se podnan usar otros laser de pulsos, incluyendo otros laser de modo cerrado, laser de conmutacion de Q y de vaciado de cavidad, en lugar del laser de modo cerrado abalizado anteriormente. De igual manera, seran evidentes muchas otras maneras de controlar el tiempo del muestreo digital y procesar la informacion resultante basandose en la descripcion previa. Por ejemplo, el muestreo digital se podna cronometrar para que haya un retardo diferente (o ningun retardo) entre un pulso laser y una muestra digital. Asimismo, el numero de muestras digitales por pulso o el numero de pulsos que transcurren entre el muestreo digital tambien se puede variar.

K. Estimacion de las caractensticas de la poblacion

Como se ha indicado anteriormente, la citometna de flujo se puede usar para discriminar celulas espermaticas

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bovinas que albergan X de las celulas espermaticas bovinas que albergan Y en base a su diferencia relativa del 3,8% en el contenido de ADN. La discriminacion se logra mediante el analisis de las caractensticas de la senal que vana en el tiempo 701 que se produce por el fotodetector 117 usado para registrar la emision de fluorescencia 31 a medida que las celulas tenidas pasan a traves de la localizacion de examen 115. Esta interaccion se ilustra en las Fig. 45-48. Las Fig. 45-48 ilustra el modo en que se genera un pulso de forma de onda 497 por las emisiones de fluorescencia 31 resultantes de la interaccion entre el haz laser 25 y un celula espermatica tenida 201. El pulso de emision 497 es la integral de convolucion de la funcion espacial de excitacion y la funcion espacial de emision de la celula 201. Las caractensticas del pulso de forma de onda 497 de fluorescencia se usan para clasificar una celula como X, Y o indeterminada. En un ejemplo, la discriminacion X-Y depende de dos caractensticas de pulso: la altura del pico del pulso y el area del pulso.

Estas caractensticas se ilustran en el pulso de ejemplo que aparece en las Fig. 52 y 53. Las Fig. 52 y 53 son los ejemplos de pulsos 497 de celulas espermaticas que albergan X y que albergan Y. Los pulsos 497 se generaron a partir de un modelo informatico que asumio iluminacion de excitacion con un haz laser 25 que tema un punto de iluminacion de forma elfptica 459 con una cintura de haz gaussiano W1 de 2 |im (Fig. 6) y donde la diferencia de contenido de ADN estaba distribuida uniformemente a traves del 20 por ciento central de la celula 201. Estas suposiciones son representativas de la iluminacion de barrido de ranura de las celulas espermaticas bovinas 201 con una diferencia localizada de ADN analizada en mas detalle anteriormente. La integracion de los pulsos 497 da como resultado una diferencia promedio del 3,8% entre el area del pulso 497 para un celula X y el area del pulso 497 para un celula Y.

Es posible generar graficos de dispersion e histograma del pico del pulso 497 y las caractensticas del area para las celulas y los nucleos tenidos. Las Fig. 56-59 contienen histogramas de la caractenstica del area para los nucleos y las celulas vivas tenidos, ademas de graficos de dispersion del area del pulso 497 y las caractensticas del pico para los nucleos y las celulas vivas tenidos. Algunos de los elementos que pueden limitar la discriminacion de las celulas vivas y en ultimo termino la velocidad de separacion de las celulas son evidentes en estos graficos. En particular, el histograma de celulas vivas de la Fig. 57 y en menor grado el histograma de los nucleos (Fig. 56), tienen un borde izquierdo que es caractenstico de los histogramas de intensidad de fluorescencia para celulas espermaticas de mairnfero. Se ha determinado que el borde izquierdo se genera por una o mas poblaciones de las celulas levemente desalineadas (es decir, celulas que generan emisiones de fluorescencia relativamente mas debiles debido a las desviaciones leves de la alineacion optima, pero que no estan tan lejos de la alineacion como para causar la emision de fluorescencia relativamente mas brillante 31 del borde estrecho 209 de la cabeza del esperma 205 a recoger por el sistema optico 109). Solo aproximadamente la mitad de las celulas X pueden identificarse facilmente en el histograma del area de celulas vivas. El resto se superpone con la poblacion de celulas Y y las poblaciones de celulas no alineadas. Aun cuando se anade la altura del pico del pulso, como se muestra en los graficos de dispersion en las Fig. 56-59, la clasificacion de celulas que albergan X puede estar significativamente limitada.

Las Fig. 60-61 ilustran la superposicion de las distribuciones de poblaciones X e Y. En las Fig. 60-61, se aplico un modelo informatico de cuatro componentes a los datos sin procesar 6000 (Fig. 60) para estimar la estadfstica de poblacion para dos poblaciones de celulas no alineadas (6001, 6003), celulas Y vivas y alineadas (6005) y celulas X vivas y alineadas (6007) (Fig. 61). Es aconsejable discriminar las poblaciones X e Y como una funcion del coeficiente de la variacion (CV) de las poblaciones X e Y. Por ejemplo, es aconsejable reducir al mmimo el coeficiente de variacion (CV) de las poblaciones X e Y para mejorar la discriminacion. En particular, cuando se desea una poblacion de celulas X clasificadas, es aconsejable que el CV de la poblacion de celulas X sea menor del 1,5%, de forma mas deseable de aproximadamente el 1,3% e incluso de forma mas deseable menor del 1,3%. Tradicionalmente, el CV de una distribucion de intensidad de fluorescencia de celulas espermaticas se ha considerado con respecto a las funciones de distribucion para solo dos poblaciones (X e Y). El control de calidad en lo que se refiere al Cv se ha limitado a la estimacion subjetiva sin procesar del CV de las poblaciones X e Y para decidir si vale la pena continuar con el analisis o la clasificacion.

Una funcion del microprocesador 131 es proporcionar una estimacion automatizada del CV de la poblacion X usando el modelo de cuatro componentes ilustrado en las Fig. 60-61. Para estimar los CV de las poblaciones presentes en una distribucion de caractensticas (por ejemplo, area de pulso), es necesario estimar la estadfstica de segundo orden de las distribuciones de poblacion. Esto puede lograrse aplicando un modelo de una forma conocida y buscando el mejor ajuste de ese modelo a los datos observados.

Dado que se esperan datos con una distribucion normal, se ha elegido un enfoque que consiste en una estimacion de densidad no parametrica de ventana de Parzen (utilizando una funcion de nucleo gaussiano) seguida de la aplicacion de un modelo parametrico de mezcla gaussiana. Espedficamente, el modelo de cuatro componentes ilustrado en las Fig. 60-61 constan de una suma (o mezcla) de cuatro distribuciones gaussianas de una variable y estos cuatro componentes son las distribuciones de caractensticas correspondientes a celulas X alineadas, celulas Y alineadas y una poblacion de celulas no alineadas de dos componentes. De este modo los parametros que caracterizan el modelo son las medias de poblacion (promedios) (4), desviaciones/variaciones tfpicas de poblacion (4) y las probabilidades previas (% esperado de la distribucion general) (4). Estos 12 parametros luego se pueden variar para lograr un mejor ajuste del modelo al histograma de datos observados. Con los parametros del componente modelo asf estimados, se puede determinar una estimulacion del CV de una poblacion de interes (en

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particular, celulas X) a partir de la desviacion tipica y la media de la poblacion estimadas:

CV= desviacion tipica ■ 100%

Media

Para reducir la complejidad computacional, se han establecido limitaciones en el modelo para reducir la magnitud del espacio parametrico. En particular, las desviaciones tipicas de los componentes del modelo correspondientes a las poblaciones alineadas X y las alineadas Y se han limitado para que sean iguales. Ademas, los componentes alineados X y alineados Y se han limitado para conformar el mismo porcentaje de la mezcla total, por lo tanto las poblaciones no alineadas se suponen en 50% de celulas X y 50% de celulas Y.

La estimacion de densidad no parametrica se aplica antes del ajuste del modelo para obtener una estimacion mejorada de la funcion total de densidad (siendo la suma de las densidades de los componentes) subyacente a los datos sin procesar del histograma. La tecnica espedfica aplicada se conoce como "ventana de Parzen" (Duda, Hart y Stork, 2001), que aqm utiliza una funcion de nucleo o ventana gaussiana debido a la naturaleza supuesta de suma-de-Gauss de la densidad subyacente. La desviacion tipica del nucleo gaussiano se elige para que sea un 1% del numero de clases pobladas del histograma; este valor se ha observado en forma emprnca para proporcionar un suavizado adecuado pero no excesivo del histograma. Cada punto de datos en el histograma contribuye asi con una funcion del nucleo centrada en la clase del histograma que contiene el punto de datos. El calculo de densidad se obtiene luego como la suma de las funciones del nucleo.

La metodologia elegida para la variacion de los parametros del modelo para lograr el mejor ajuste a los datos se conoce como Maximizacion de Expectativas (Vease Duda R.O., Hart, P.E., y Stork, D.G., 2001, Pattern Classification 2a Ed., John Wiley & Sons; y Moore, A., "Very Fast EM-based Mixture Model Clustering using Multiresolution kd- trees," en M. Keams y D. Cohn, Eds., Advances in Neural Information Processing Systems, paginas 543-549, 1999, Morgan Kaufman).

La implementacion algoritmica espedfica utilizada es la siguiente:

1) Se establecen las condiciones iniciales para los parametros del modelo. Los dos maximos locales superiores en el calculo de densidad de Parzen se usan como las localizaciones medias X e Y (la amplitud inicial de los maximos para ambas poblaciones X e Y que se estan estimando como la amplitud del pico derecho). Se estima la variacion inicial de la poblacion X e Y como la variacion de los datos a la derecha del mmimo local que tiene lugar entre los picos izquierdo y derecho en relacion con el sitio del pico derecho. Ademas, las probabilidades iniciales previas de la poblacion X e Y se establecen como el porcentaje de todos los puntos que caen a la derecha de este mmimo local. Las estimaciones iniciales de la densidad gaussiana de la poblacion X e Y luego se calculan usando estos parametros y se restan del calculo total de la densidad de Parzen. La media y la variacion de los restantes puntos de datos luego se calculan y se usan para inicializar el modelo de poblacion no alineado de dos componentes del siguiente modo. Las dos medias de poblacion se suponen (arbitrariamente) como que estan a una separacion de un 5% (2,5% arriba y debajo de la media no alineada general). Dada una suposicion (inicial) de previos iguales y variaciones iguales, entonces, las variaciones del componente se dan como:

It ~ rjtot~ ^ O^a -

donde o2 es la varianza y ^ es la media de la poblacion respectiva.

2) Las estimaciones actualizadas de la estadistica de poblacion del componente (medias, desviaciones tipicas y previos) se calculan usando el calculo de densidad de Parzen. La ubicacion de cada clase del histograma se pondera en los calculos estadisticos por la estimacion de densidad de Parzen en ese intervalo. Ademas, cada punto de datos contribuye a todos los calculos estadisticos de poblacion del componente ponderados por el grado al cual se considera que ese punto pertenece a una poblacion dada, basandose en los parametros de poblacion del componente actual. Este grado de pertenencia se determina como la razon de un valor dado de densidad de probabilidad (gaussiana) de poblacion del componente a la suma de todos los valores de densidad de probabilidad de poblacion del componente en el punto de datos. Por lo tanto tenemos (para todos los puntos de datos x en el histograma, las poblaciones cp e {cx,Cy,cu}, y el vector del parametro de poblacion 0p = [up, op, Pp]) pertenencias del componente de poblacion usadas en el calculo de las estimaciones de parametros actualizados dados por:

P”'

(* -ryf *4

Pertenencia

(cp k0p) =

k^n) EstimacionDensidadParzen(x)

Las medias y las variaciones actualizadas luego se calculan usando los valores de la estimacion de densidad de Parzen ponderados por estos valores de pertenencia, con los previos actualizados dados por la pertenencia

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promedio para cada poblacion del componente sobre todos los puntos de datos.

3) El procedimiento de actualizacion del parametro sigue hasta que todos los parametros alcanzan un estado estacionario (es decir, dejan de cambiar en forma significativa de una iteracion de actualizacion a la siguiente (o hasta que tiene lugar un numero maximo permitido de iteraciones)).

Como se ha mencionado anteriormente, las poblaciones X e Y alineadas estan limitadas en este procedimiento para tener la misma variacion y probabilidad previa. Esta limitacion se logra al usar el promedio de la variacion X e Y y los valores previos calculados a traves del procedimiento anterior en cada iteracion.

Alternativamente, puede aplicarse un enfoque de modelo similar a un modelo de tres componentes (Fig. 62-63) en el cual las celulas que comprenden a las dos poblaciones no alineadas 6001, 6003 en el modelo de cuatro componentes se consideran como una unica distribucion gaussiana 6011 en lugar de dos subpoblaciones diferentes. Las celulas no alineadas pueden modelarse como tercera distribucion gaussiana (mostrada en la Fig. 63) que tiene una media y desviacion tfpica determinadas por un mejor ajuste del borde izquierdo y el pico principal izquierdo de los datos sin procesar 6010 (mostrado en la Fig. 62). El modelo de tres poblaciones tambien ha estimado datos estadfsticos para la poblacion Y alineada 6015 y la poblacion X alineada 6017. Una ventaja del modelo de tres componentes es que requiere solo un espacio de parametros de 9 dimensiones (en comparacion con el espacio de parametros de 12 dimensiones necesario para el modelo de cuatro componentes). Sin embargo, se ha descubierto que el modelo de cuatro componentes da lugar tipicamente a una funcion de densidad estimada que coincide mejor con los datos sin procesar.

Los especialistas en la tecnica reconoceran que se puede usar una amplia diversidad de tecnicas estadfsticas para estimar las caractensticas de las poblaciones X alineada e Y alineada. Por lo tanto, pueden implementarse el modelo de cuatro componentes, el modelo de tres componentes u otros modelos por cualquier algoritmo informatico parametrico o no parametrico para estimar las caractensticas de las poblaciones de celulas X alineadas y/o celulas Y alineadas.

L. Seleccion de las condiciones de tincion en base al CV

Varios factores afectan a la eficacia de clasificacion de celulas tenidas de una poblacion en subpoblaciones enriquecidas de celulas. Entre estos factores se encuentra la cantidad de fluorescencia diferencial entre las diversas subpoblaciones de celulas dentro de una poblacion tenida. La fluorescencia diferencial esta afectada por la absorcion de colorante, que vana dependiendo de factores de tincion, como por ejemplo, la concentracion del colorante, la duracion del penodo de tincion, la temperatura a la que se produce la tincion, y la cantidad y concentracion de todos los aditivos que pueden estar incluidos con el colorante o agregados a la mezcla de tincion. Por consiguiente, se pueden hacer ajustes a cualquiera o a todos esos factores para aumentar la eficacia de clasificacion (la velocidad a la que las celulas se pueden separar en al menos una subpoblacion enriquecida de celulas con cierto grado de pureza y/o una perdida minima de las celulas deseadas) de la poblacion de celulas tenidas. Aun mas, se puede aumentar la eficacia de un sistema de clasificacion de multiples muestras ajustando uno o mas de esos factores para cada muestra, contrarrestando de ese modo cualquier variacion entre muestras. En el contexto de la clasificacion de esperma bovino, por ejemplo, se puede mejorar la eficacia de clasificacion ajustando uno o mas de los factores de tincion anteriores de una muestra de semen a la siguiente para contrarrestar las variaciones entre toros o las variaciones entre muestras de un mismo toro.

Una determinacion del coeficiente de variacion ("CV") para una caractenstica de emision de fluorescencia dada de una poblacion de celulas clasificarse es una manera de determinar si se pueden hacer ajustes a las condiciones de tincion para alcanzar la eficacia de clasificacion deseada. Por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones de tincion como una funcion del CV de cualquier caractenstica extrafda del pulso de onda generado por el desplazamiento de una celula a traves de la localizacion de examen, tal como cualquier caractenstica indicativa de la intensidad de fluorescencia total o la intensidad de fluorescencia maxima (incluidas la intensidad de fluorescencia total y la intensidad de fluorescencia maxima). Como se ha analizado con mas detalle anteriormente, el CV es un indicador de la homogeneidad o uniformidad de una distribucion de una propiedad o caractenstica medibles de una poblacion, como por ejemplo una caractenstica de emision de fluorescencia de una subpoblacion particular de una poblacion dada. El CV se puede determinar dividiendo la desviacion tfpica de la caractenstica medida de una muestra entre el la media de la muestra. El CV tambien se puede determinar automaticamente mediante el sistema de citometna de flujo 9, tal como mediante la implementacion del algoritmo de estimacion del CV iterativo que se ha analizado en detalle anteriormente. Cuanto menor es el CV mayor es la homogeneidad o la uniformidad de la distribucion de la caractenstica medida.

Aplicado a la tincion y separacion de celulas espermaticas, el CV de una caractenstica de emision de fluorescencia particular para una muestra de celulas espermaticas que albergan el cromosoma X e Y puede estar afectado por las condiciones de tincion. La concentracion del colorante, la duracion del penodo de tincion, la temperatura de la mezcla de tincion, y/o la cantidad y concentracion de aditivos afectan al CV de una caractenstica de emision de fluorescencia dada. Aumentar la concentracion del colorante, la duracion del penodo de tincion, y la temperatura de la mezcla de tincion y/o reducir la cantidad o la concentracion de aditivos generalmente disminuira el CV. Dichas

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condiciones se pueden alterar individualmente o combinadas. Ademas, si uno de esos factores es tal que tendiera a aumentar el CV de una caractenstica de emision de fluorescencia, tal como por ejemplo, acortar el penodo de tincion, entonces cualquiera o mas de las otras condiciones se podnan ajustar de modo que contrarresten el efecto de la primera, tal como por ejemplo, aumentar la concentracion de colorante, siendo el resultado general una disminucion en el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia a un nivel suficiente para alcanzar la eficacia de clasificacion deseada.

Por consiguiente, manipulando cualquier factor o cualquier combinacion de dichos factores de este modo, el CV de una caractenstica de emision de fluorescencia de poblaciones que albergan el cromosoma X e Y se puede disminuir hasta un valor que permita la clasificacion de la muestra de esperma en una subpoblacion de semen enriquecido por sexo, que comprenda un porcentaje de pureza deseado de celulas que albergan el cromosoma X.

Desafortunadamente, los cambios que tienden a disminuir el CV del esperma que alberga el cromosoma X pueden tener consecuencias negativas como el incremento del coste o la disminucion en la motilidad o fertilidad del esperma. Por ejemplo, en igualdad de condiciones de otros aspectos es deseable utilizar menores concentraciones de colorante y penodos de tincion mas cortos para minimizar el efecto nocivo del proceso de tincion sobre el esperma. Teniendo esto en mente, se puede predeterminar un CV al cual se pueda alcanzar una eficacia de clasificacion aceptable. A partir de entonces, una fraccion de la muestra de celulas a clasificar se tine y se somete a analisis de citometna de flujo. Se determina una caractenstica de emision de fluorescencia de la fraccion, y la fraccion se clasifica en subpoblaciones en base a esa caractenstica. Se determina el CV de la caractenstica de fluorescencia con respecto a las celulas de una de las subpoblaciones (una subpoblacion enriquecida). Si el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas de la subpoblacion enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado al cual se produce la clasificacion, entonces la muestra de celulas restante se tine de acuerdo con las condiciones segun las cuales se tino la fraccion. A partir de entonces la muestra se clasifica, por ejemplo, segun los metodos descritos en este documento. Si el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia particular de las celulas de la subpoblacion enriquecida es mayor que el CV predeterminado al cual se produce la clasificacion, entonces se analiza otra fraccion de la misma muestra de manera similar, pero en condiciones de tincion que se cree que alcanzaran un CV aun menor. En tal situacion, el CV se puede disminuir mediante, por ejemplo, el incremento de la duracion del penodo de tincion, el incremento de la concentracion del colorante, el incremento de la temperatura a la que se tine la fraccion o cualquier combinacion de los mismos. Esta serie de etapas (es decir, la eliminacion de una fraccion de la muestra a clasificar, el ajuste de las condiciones de tincion, y la determinacion del CV) se repite hasta que se determine que el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia particular de las celulas de la subpoblacion enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado. A partir de entonces, el resto de la muestra se tine consecuentemente y se puede clasificar. La muestra de celulas puede comprender una muestra de semen, y las celulas de la subpoblacion enriquecida comprenden celulas que albergan el cromosoma X.

Por consiguiente, para un ejemplo existe un proceso para evaluar una serie de condiciones para tenir una poblacion de celulas a clasificar, comprendiendo la poblacion un primer tipo de celulas y un segundo tipo de celulas. El proceso comprende (a) tenir una fraccion de la poblacion de celulas con un colorante fluorescente de acuerdo con una serie de condiciones de tincion; (b) exponer las celulas tenidas a radiacion electromagnetica a medida que las celulas tenidas se hacen pasar a traves de una localizacion de examen de un citometro de flujo a una velocidad, R; (c) determinar una caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas expuestas; (d) usar la caractenstica de emision de fluorescencia para clasificar las celulas en dos o mas subpoblaciones, siendo una de las subpoblaciones una subpoblacion enriquecida del primer tipo de celulas; (e) determinar un coeficiente de variacion para la caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas de la subpoblacion enriquecida; y (f) determinar si es necesario modificar alguna de las condiciones de tincion segun las cuales las celulas se van a tenir o la velocidad, R, a la que las celulas tenidas se hacen pasar a traves de la localizacion de examen del citometro de flujo. En otro ejemplo, se tine otra fraccion de la poblacion de celulas de acuerdo con una serie diferente de condiciones de tincion y se repiten las etapas (b) a (e) con esa fraccion. Este proceso se puede llevar a cabo en dos, tres, cuatro o cualquier numero de fracciones adicionales. En otro ejemplo mas, se extraen multiples fracciones de celulas de la muestra al mismo tiempo. Cada fraccion puede tenirse simultaneamente, o cada fraccion puede tenirse despues de que la fraccion previa haya pasado a traves del citometro de flujo. En el primer anterior, cada fraccion puede tenirse segun su propia y unica serie de condiciones de tincion y la etapa (f) puede comprende el uso de los CV respectivos para determinar una serie de condiciones de tincion a utilizarse para tenir otras celulas. En el ultimo caso, se pueden alterar las condiciones de tincion de las fracciones tenidas posteriormente de acuerdo con la determinacion de la etapa (f) con respecto a una fraccion analizada previamente. El proceso se repite hasta que se determina que el CV es aproximadamente igual a o menor que un CV espedfico (por ejemplo, 1,3 %).

Alternativamente, una vez que se ha predeterminado un CV al que se puede obtener una eficacia de clasificacion aceptable, se puede tenir toda la muestra de celulas. Una fraccion de la muestra de celulas se retira y se somete al analisis por citometna de flujo. Se determina una caractenstica de emision de fluorescencia de la fraccion y se utiliza para clasificar las celulas en dos o mas subpoblaciones. El CV de la caractenstica de fluorescencia se determina con respecto a las celulas de una subpoblacion enriquecida. Si el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas de la subpoblacion enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado al que se produce la clasificacion, entonces el resto de la muestra de celulas se clasifica despues de eso. Si el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia particular de las celulas de la subpoblacion enriquecida es mayor que el CV

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predeterminado al que se va a producir la clasificacion, entonces se analiza de manera similar una segunda fraccion de la misma muestra y se determina el CV de la caractenstica de fluorescencia. El CV de la segunda fraccion se puede disminuir, por ejemplo, incrementando la duracion del penodo de tincion, incrementando la concentracion del colorante o mediante cualquier combinacion de los mismos. Esta serie de etapas (es decir, la retirada de una fraccion de muestra a clasificar y una determinacion del CV) se repite hasta que se determine que el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia particular de las celulas de la subpoblacion enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado. Despues de eso, el resto de la muestra se puede clasificar, por ejemplo, de acuerdo con los metodos descritos en este documento. En particular, la muestra de celulas comprende una muestra de semen, y las celulas de la subpoblacion enriquecida comprenden celulas que albergan el cromosoma X.

En consecuencia, otro ejemplo es un proceso para evaluar una serie de condiciones para tenir una poblacion de celulas a clasificar; la poblacion que comprende un primer tipo de celulas y un segundo tipo de celulas. El proceso comprende (a) tenir una fraccion de la poblacion de celulas con un colorante fluorescente de acuerdo con una serie de condiciones de tincion; (b) exponer las celulas tenidas a radiacion electromagnetica a medida que las celulas tenidas se hacen pasar a traves de una localizacion de examen de un citometro de flujo a una velocidad, R; (c) determinar una caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas expuestas; (d) usar la caractenstica de emision de fluorescencia determinada para clasificar las celulas en dos o mas subpoblaciones, siendo una de las subpoblaciones una subpoblacion enriquecida del primer tipo de celulas; (e) determinar un coeficiente de variacion para la caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas de la subpoblacion enriquecida; (f) determinar si es necesario modificar alguna de las condiciones de tincion segun las cuales se va a tenir la fraccion de celulas o la velocidad, R, a la que las celulas tenidas se hacen pasar a traves de la localizacion de examen del citometro de flujo; y (g) aplicar la condicion de tincion modificada al resto de la poblacion de celulas. En otro ejemplo, se repiten las etapas (a) a (f) al menos una vez con al menos otra fraccion de la poblacion de celulas. Las etapas (a) a (f) se pueden repetir una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o una mayor cantidad de veces. En otro ejemplo, se extraen multiples fracciones de celulas de la muestra al mismo tiempo. Cada muestra puede tenirse simultaneamente, o cada una puede tenirse posteriormente a la fraccion previa que esta pasando a traves del citometro de flujo. En el ultimo caso, se puede alterar la posterior tincion de las fracciones de acuerdo con la determinacion de la etapa (f) con respecto a una fraccion analizada previamente. En otro ejemplo mas, el proceso comprende adicionalmente, antes de la etapa (g), seleccionar la condicion de tincion modificada que produzca el coeficiente de variacion mas bajo para la caractenstica de emision de fluorescencia. En otro ejemplo mas, el proceso comprende la repeticion de las etapas (a) a (e) hasta que el coeficiente de variacion de la caractenstica de emision de fluorescencia de al menos una de las fracciones sea de aproximadamente el 1,3% o menor. En otro ejemplo, el proceso comprende adicionalmente, antes de la etapa (g), seleccionar la condicion de tincion modificada que produzca un coeficiente de variacion de aproximadamente 1,3 o menor.

Ademas de realizar dicho analisis antes de clasificar la muestra entera como se ha detallado anteriormente, puede realizarse un analisis similar durante el proceso de tincion y clasificacion de la muestra en un esfuerzo por asegurar el mantenimiento de la eficacia de clasificacion. En consecuencia, en otro ejemplo, se determina el CV de una caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas de una subpoblacion enriquecida de una fraccion de una muestra que se ha tenido previamente, una porcion de la cual se esta clasificando, como se ha descrito anteriormente. Los ajustes a las condiciones de tincion segun las cuales se tineron estas muestras, se hacen de acuerdo con los metodos analizados anteriormente con respecto a los ajustes previos a la clasificacion.

La seleccion de un CV predeterminado en que se consiga una eficacia de clasificacion aceptable se basa en varios factores, incluyendo por ejemplo, el tipo de celulas que se estan clasificando, la velocidad de clasificacion y el grado de pureza deseado con respecto a la clasificacion de la poblacion en subpoblaciones enriquecidas. En general, se selecciona un CV que permita la clasificacion al porcentaje de pureza deseado de la subpoblacion enriquecida, minimizando al mismo tiempo la cantidad de tiempo necesaria para lograrlo, tal como por ejemplo, consiguiendo un grado de pureza de la subpoblacion enriquecida del 85% minimizando al mismo tiempo la duracion del penodo de tincion. Teniendo en cuenta estos factores, el CV de la caractenstica de emision de fluorescencia de las celulas de una subpoblacion enriquecida es generalmente entre aproximadamente el 2,0% y aproximadamente el 1,0%.

M. Extraccion de caracteristicas por diferencia critica de pendientes

El microprocesador 131' con procesamiento de senales digitales (DSP) ilustrado en la Fig. 40 que se emplea como parte de un clasificador de celulas permite extraer las caracteristicas del pulso de emision de fluorescencia de resolucion temporal, en particular las caracteristicas que no se pueden obtener facil o economicamente usando tecnologfa analogica. En particular, una caractenstica de pulso que presenta propiedades no lineales y que mejora significativamente la separacion y por lo tanto la resolucion de las partfculas A y B (por ejemplo, mejora la discriminacion de celulas espermaticas vivas, y celulas espermaticas X alineadas) es una caractenstica a la que se le llama diferencia cntica de pendientes (CSD). La CSD es una cuantificacion de la pendiente del pulso de emision de fluorescencia a una amplitud de senal donde la diferencia entre la primera derivada de un pulso producido por la partfcula A (por ejemplo, una celula que alberga X) y la primera derivada de un pulso producido por la partfcula B (por ejemplo, un celula que alberga Y) se acerca a un maximo.

Las funciones que describen los pulsos de emision de fluorescencia pueden expresarse en terminos de la amplitud

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de la senal como una funcion de tiempo: y = x(t). Dentro del contexto de deteccion de las caractensticas de la CSD, se puede definir una funcion que describa los pulsos de emision de fluorescencia en terminos del tiempo de duracion del pulso en funcion de la amplitud de la senal. Esta funcion puede denominarse una funcion de M. La funcion de M se obtiene al transponer la funcion de pulso de emision de fluorescencia segun se muestra a continuacion.

Funcion de pulso de emision de fluorescencia: y=x(t)

Funcion de M: t = M(y) t = duracion del pulso y = amplitud de la senal

La comparacion de las funciones M para esperma bovino X e Y tfpicos ilustra el poder de discriminacion de la caractenstica de CSD. El panel superior de la Fig. 64 muestra los graficos M promedio para celulas espermaticas que albergan X y celulas espermaticas que albergan Y. El panel central en la Fig. 64 muestra una grafica de las primeras derivadas de estos graficos M promedio (es decir M') para los valores de amplitud de senal menores que la altura de los picos del pulso de emision de fluorescencia promedio para celulas espermaticas que albergan Y. En este grafico se puede observar que a medida que la amplitud de la senal se aproxima a la altura de los picos promedio del pulso de los portadores de Y, la diferencia entre las primeras derivadas (M'y y M'x) aumenta en forma significativa. Representado graficamente en el panel inferior de la Fig. 64 se encuentra la diferencia entre las primeras derivadas (M'x - M'y) como una funcion de la amplitud de la senal; la caractenstica de CSD cuantifica la pendiente de M (M') para un pulso individual cerca de la region donde ocurre la maxima diferencia entre las primeras derivadas (o la pendiente en un punto correspondiente en la funcion del pulso de emision de fluorescencia). Para discriminar celulas espermaticas que albergan X y celulas espermaticas que albergan Y, se determina la CSD para cada pulso en el punto donde el borde principal del pulso corta el umbral de CSD, como se muestra en las Fig. 6263. En algunos ejemplos, la CSD puede depender de las caractensticas del haz de iluminacion como el ancho del haz ya sea que el haz continuo o de pulsos. A continuacion se analiza un algoritmo para determinar la CSD con respecto a la Fig. 65.

La Figura 64 ilustra que en algunos casos la caractenstica de CSD tiene una naturaleza no lineal, como en el caso de la clasificacion de poblaciones de celulas espermaticas X-Y. La diferencia entre las derivadas (M'x - M'y) aumenta a medida que el umbral de CSD se acerca al pico del pulso Y. La caractenstica no lineal de esta diferencia coloca el valor promedio de las celulas Y no alineadas y alineadas a un 45% por debajo del valor promedio de las celulas X alineadas en el espacio de caractensticas de CSD. La desviacion tfpica en el espacio de caractensticas de CSD de las celulas X alineadas en gran medida no se ve afectado (es decir similar al observado en los espacios de caractenstica del pico o area). Es esta naturaleza de alta ganancia no lineal de la caractenstica CSD la que aumenta el numero de celulas X alineadas que pueden discriminarse con exactitud.

Un metodo computacionalmente eficaz para determinar el valor de CSD para un pulso dado se ilustra en la Fig. 65. Un umbral de CSD puede determinarse como una funcion de una altura del pico de los pulsos de emision de fluorescencia. En particular, se puede determinar en base a la altura maxima promedio de los pulsos de emision de fluorescencia. El umbral de CSD se mantiene en un punto donde aproximadamente un 25% de los picos de pulso de celulas vivas alineadas cae dentro del umbral o por debajo de este. Por consiguiente, el umbral de CSD se ajusta dinamicamente durante la clasificacion en base a una distribucion en proceso de alturas de los picos (es decir, en relacion con un promedio de altura de los picos). Por ejemplo, el umbral puede basarse en un promedio en proceso ponderado de alturas de pico (donde se otorga mas peso a las mediciones mas recientes que a las mas antiguas). El valor de CSD es la pendiente de una lmea que pasa a lo largo de dos puntos en el pulso. Estos puntos son el umbral de pulso de CSD y el pico del pulso. Por lo tanto, en este ejemplo el valor de CSD es solo una aproximacion de la pendiente del pulso de forma de onda 497 en la interseccion del borde principal del pulso y el umbral de CSD. Sin embargo, otros metodos de computacion del valor de CSD para un pulso dado son facilmente evidentes, algunos de los cuales pueden proporcionar valores de CSD mas precisos si se desea.

En otro ejemplo, el umbral de CSD se ajusta dinamicamente como una funcion del CV de la extraccion de caractensticas de CSD para una subpoblacion de partfculas. En el caso de clasificacion de celulas espermaticas, por ejemplo, aumentando el umbral de CSD desde un nivel relativamente bajo (es decir, el umbral de deteccion de pulsos) el umbral de CSD alcanzara un nivel que dara como resultado un aumento importante en el CV de la CSD de las celulas Y pero que todavfa es suficientemente bajo de modo que el aumento en el CV de la CSD de las celulas X es significativamente mas bajo en comparacion con el aumento del CV en las celula Y. Este efecto se puede observar en la distribucion de la CSD como un despliegue en abanico de una subpoblacion en la distribucion general de la CSD. Se puede obtener una buena discriminacion de la caractenstica de CSD manteniendo el umbral de la CSD en este nivel.

Debe senalarse que el poder discriminatorio de la caractenstica de CSD se mejora usando el enfoque de barrido de ranura para la citometna de flujo. La forma del haz de luz 459 puede influir sobre la forma del pulso de forma de onda 497. Por ejemplo, al usar un haz de luz 459 que tiene un ancho relativamente pequeno W1, una diferencia de fluorescencia localizada en una partfcula de muestra (por ejemplo, la diferencia de intensidad de fluorescencia localizada resultante de la localizacion del cromosoma X o Y en la region central 225 de un nucleo de esperma 213) tiene una mayor influencia sobre la primera derivada del pulso de ondas. En consecuencia, pueden usarse tecnicas

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de barrido de ranura en combinacion con extraccion de caractensticas de CSD. Por el contrario, el uso de un haz laser con una cintura de haz que es demasiado grande (por ejemplo, igual o mayor que el diametro de las partfculas) puede evitar el uso eficaz de la caractenstica de CSD para discriminar las partfculas. Para el ancho de la cintura del haz, el intervalo aceptable del haz de iluminacion enfocado dependera de varios factores incluyendo el tamano y la forma de las partfculas, la distribucion del colorante dentro de las partfculas que se estan analizando y la cantidad de diferencia entre los pulsos de ondas caractensticos para las partfculas a discriminar. En el caso de celulas espermaticas, la extraccion de caractensticas CSD de los pulsos de ondas 497 generados mediante la excitacion de celulas espermaticas bovina 201 con un haz laser que presenta una cintura de haz de menos de 3 |im ha funcionado bien como se indica a continuacion. Desde luego, se considera la extraccion de caractensticas de CSD con cualquier forma de barrido de ranura como se analiza en la seccion de barrido de ranura.

El uso de la caractenstica de la CSD aumenta sustancialmente el rendimiento del sistema, en particular en el caso de la clasificacion de poblaciones de celulas espermaticas X-Y porque permite la recogida de muchas mas celulas X alineadas. Debido a la superposicion en las poblaciones definida en los espaciaos de caractensticas pico frente a area o tiempo de propagacion frente a area, no mas de aproximadamente el 70% de celulas X alineadas pueden discriminarse con una certidumbre de aproximadamente el 85% o mayor. Cuando se usa la caractenstica de la CSD, puede discriminarse el 95% o mas de las celulas X alineadas, lo que aumenta significativamente el porcentaje de celulas X vivas que se pueden recoger sin reducir la pureza de la poblacion de las celulas X recogidas por debajo de un nivel deseado de pureza.

Esto se observa graficamente en los datos de celulas vivas mostrados en las Fig. 66-69. La naturaleza no lineal de la caractenstica de CSD permite que las celulas X se afslen para la clasificacion. La seleccion bruta en CSD aplicada en el grafico de dispersion que se muestra en la Fig. 68 da como resultado un area de poblacion de celulas X un 70% pura. Cuando se aplica discriminacion de clasificacion bivariable en los espacios de caractensticas de area y CSD (Fig. 68), puede discriminarse > 95% de las celulas X alineadas para la clasificacion. Los datos en las Fig. 66-69 se obtuvieron sobre una produccion total de celulas de aproximadamente 22.000 celulas vivas por segundo en un canal de un sistema de citometna de cuatro canales (vease el analisis del sistema multi-canal mas adelante). Aun habilitando la deteccion de coincidencias (pureza alta), se recogieron mas de 6.000 celulas X por segundo a un nivel de pureza de al menos el 85% de pureza.

Las Fig. 66-69 ilustran una ventaja de la caractenstica de CSD cuando se usa para discriminar celulas espermaticas que albergan X y celulas espermaticas que albergan Y. Las Fig. 66 y 67 son histogramas de la caractenstica del area de los pulsos de emision de fluorescencia para el espacio de caractensticas definido en los graficos de dispersion que se muestran en las Fig. 68 y 69. En la Fig. 68, la caractenstica de CSD ha movido la mayona de los celulas Y alineadas y no alineadas completamente fuera de la pantalla del grafico de dispersion. Esto deja una poblacion X con una pureza del 70% en el marco del grafico de dispersion, que es lo que se muestra en el histograma del area del pulso en la Fig. 66. La discriminacion no CSD se muestra en el grafico de dispersion del area de pulso/tiempo de propagacion mostrado en la Fig. 69. Las celulas X alineadas constituyen aproximadamente el 30% del histograma del area correspondiente (Fig. 67). Mas del 95% de las celulas X alineadas pueden recogerse a una pureza > 85% usando la caractenstica de CSD para la discriminacion. En comparacion, no se puede discriminar mas del 70% de las celulas X alineadas usando el espacio de caractensticas tradicional a la derecha.

Se han completado varias clasificaciones de celulas vivas usando la tecnica de discriminacion bivariable del CSD con respecto al area de pulso. La Figura 70 es un ejemplo de como se puede usar una region de separacion fijada en este espacio bidimensional de caractensticas para excluir las celulas no alineadas y las celulas Y. La Figura 70 ilustra una region de separacion bivariable fijada en un grafico de dispersion de CSD con respecto a la dispersion del area de pulso. Observese como la region de clasificacion baja por debajo de la caractenstica del area para valores altos de CSD (CSD aumenta de izquierda a derecha y el area aumenta de abajo hacia arriba) y se mueve mas alto en la caractenstica de area mientras la CSD disminuye a valores mas bajos. La region de clasificacion bivariable establecida en el grafico anterior de dispersion de CSD con respecto al area de pulso se uso para clasificar celulas espermaticas X a una velocidad de decision de separacion > 6000 celulas X por segundo con una velocidad de entrada de celulas vivas de 26.000 celulas por segundo. La pureza basada en un reanalisis de citometna de flujo fue del 87%.

La caractenstica de CSD permite una estrategia de separacion de alto rendimiento, interrupcion en no coincidentes (es decir, aceptacion de coincidentes o alta recuperacion). En algunos ejemplos, una caractenstica de pulso podna proporcionar una separacion muy cercana a la lmea de base y por lo tanto una clasificacion exacta del 100% de las celulas espermaticas X e Y vivas. Esta condicion permitina separar las celulas a velocidades razonablemente altas sin descartar las gotitas que contienen las dos, una celula clasificada como X y una como no-X (ya sea desconocida o Y). Esta estrategia de separacion se conoce como estrategia de alta recuperacion o aceptacion de coincidentes. Se realizo un experimento para ensayar esto usando la caractenstica de CSD. Se realizaron las separaciones de aceptacion de coincidentes con una velocidad de entrada de 12.000 celulas X vivas por segundo en un canal de un citometro de flujo de cuatro canales. El 77% de las celulas X se alinearon adecuadamente, haciendo que 4.600 celulas X por segundo estuvieran potencialmente disponibles para la clasificacion. En estas condiciones, se separaron 4.300 celulas por segundo en la poblacion de celulas X. Un analisis de pureza posterior indico una pureza de esta clasificacion de > 87% sin correccion para celulas muertas y un 89% con correccion para celulas muertas.

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Inmediatamente despues se realizo una clasificacion de deteccion de pureza elevada, de rechazo de coincidentes en las mismas condiciones. Se observo una velocidad de recogida de 3200-3500 celulas por segundo. El analisis de pureza indico una pureza de un 92% sin correccion para celulas muertas y una pureza de un 94% con correccion para celulas muertas.

Los resultados del experimento anterior indican que a una velocidad de entrada de 12.000 celulas vivas por segundo, > 92% de las celulas X alineadas se pueden recoger a una pureza de > 85%. Esta es una indicacion de que la caractenstica de CSD proporciona una clasificacion con una precision del 95% de todas las celulas X alineadas. En estas circunstancias, el rendimiento del clasificador de celulas esta limitado principalmente por la alineacion correcta de las celulas.

La Figura 71 ilustra un ejemplo de un nuevo analisis de citometna de flujo para un ensayo en la cual el panel izquierdo corresponde a la estrategia de clasificacion de aceptacion de alta recuperacion/coincidencia (estrategia de interrupcion en no coincidentes) y el panel derecho corresponde a la estrategia de separacion de rechazo de pureza elevada/coincidencia (estrategia de interrupcion en coincidentes). El panel izquierdo (87% puro) es de una velocidad de salida de 4.400 celulas X por segundo de interrupcion en no coincidentes. El panel derecho es de una clasificacion completada en las mismas condiciones excepto que fueron interrumpieron las gotitas que conteman celulas contaminantes. La pureza para esta clasificacion fue de aproximadamente el 92%. Estas clasificaciones demuestran que las clasificaciones de alta recuperacion, interrupcion en no coincidentes son posibles cuando se usa la caractenstica de CSD para la discriminacion.

El uso de la caractenstica de CSD no esta limitado a la clasificacion de celulas espermaticas o a una especie particular de celulas espermaticas. Como apreciaran los especialistas en la tecnica de la descripcion anterior, la caractenstica de CSD puede adaptarse para mejorar la discriminacion entre cualquier grupo de partfculas que genere pulsos de senal que tengan caractensticas diferentes de derivadas de primer orden independientemente de la causa de la diferencia.

N. Discriminacion

Una vez las caractensticas de los pulsos se han extrafdos por el software de analisis de pulsos 749, la discriminacion (por ejemplo, clasificacion) de pulsos la realiza el software de discriminacion de pulsos 757 ejecutado por el procesador 867 empleando una aplicacion de logica como puede ser la regla de decision de Riesgo m^nimo de Bayes. Esta regla es una modificacion de una regla de decision de Error m^nimo de Bayes que permite la asignacion (y el ajuste) de costos dispares asociados con la toma de diferentes decisiones de clasificacion (por ejemplo, discriminacion) erroneas.

El Error m^nimo de Bayes calcula el Imite de decision 763 o la superficie de decision como la superficie de igual probabilidad a posteriori entre poblaciones en el espacio de caractensticas. Para el caso de las distribuciones de probabilidad gaussianas (supuestas) esta superficie es en general cuadratica, aunque en ciertas condiciones puede ser lineal (o puede aproximarse mucho por un hiperplano). La decision de clasificacion (por ejemplo, discriminacion) se lleva a cabo calculando primero las probabilidades a posteriori para un punto dado en el espacio de caractensticas (en general en las densidades de probabilidad condicional de clase y las probabilidades conocidas/supuestas de poblacion a priori usando la Regla de Bayes) y eligiendo luego la etiqueta de la clase como la de la poblacion que tiene la mayor probabilidad a posteriori.

El Riesgo m^nimo de Bayes incluye un factor para permitir el ajuste del lfmite de la decision 763 en el caso deseado para asignar diferentes costos por hacer diferentes errores de clasificacion (por ejemplo, puede ser mas costoso clasificar celulas "Y" como celulas "X" que viceversa). En esta aplicacion, esto permite una compensacion entre la pureza y la recuperacion de la muestra separada. En esta regla de decision, el "riesgo" de asignar cada etiqueta de clase posible a un punto en el espacio de caractensticas se calcula como la suma de las probabilidades a posteriori de pertenencia a cada poblacion multiplicada por el costo asociado con clasificarlas como la poblacion actual dada la pertenencia verdadera a la otra poblacion. El cuadro VIII resume el procedimiento para la clasificacion de Error m^nimo de Bayes. Se debe tener en cuenta que para las densidades gaussianas de multiples variables, la evaluacion de la regla de Bayes para obtener las probabilidades a posteriori puede reducirse a la evaluacion de la funcion cuadratica observada en la Tabla VIII, dado que los coeficientes W, w, y Wo son como los calculados en el procedimiento de inicializacion de parametros del algoritmo de discriminacion dado en la Tabla V. La Fig. 74 muestra un ejemplo grafico de la clasificacion por este procedimiento. La ilustracion de la izquierda es una ilustracion esquematica de las dos poblaciones 1 y 2 y el lfmite de decision 763 que separa las poblaciones. El histograma a la derecha muestra dos conjuntos concentricos de elipses que definen las regiones X e Y, donde el lfmite de la decision 763 es una lmea definida por la interseccion de las elipses.

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Algoritmo: Clasificacion de pulso de fluorescencia de Error Mrnimo de Bayes (discriminacion)________________

Entrada: vector de numeros de coma flotante pulseFeatures, para cada poblacion de clase i: matriz de numeros

de coma flotante W, vector de numeros de coma flotante w, numero de coma flotante wo____________________

Salida: numero entero classLabel________________________________________________________________

Procedimiento:

1. Para cada clase/poblacion i, calcular el valor de la funcion discriminante g: gi = pulseFeaturest • Wi • pulseFeatures + wrm pulseFeatures + wp

2. Para cada clase/poblacion i, calcular el valor del riesgo de la funcion risk: Inicializar riski=0,

luego para cada clase/poblacion j:

Riski = riski + costj * gj

3. Buscar j s.t. risk = min(risk) v i. Regresar classLabel=j y salir.

Tabla VIII. Resumen de la clasificacion (discriminacion) de pulso digital de fluorescencia por la regla de decision de Error m^nimo de Bayes.

Por motivos de robustez adicional, se lleva a cabo una etapa adicional en la clasificacion de pulsos digitales de fluorescencia. Se calcula la distancia de Mahalanobis de un pulso en el espacio de caractensticas de la poblacion asignada por el Error mrnimo de Bayes, y si es mayor que un umbral, el pulso se marca como "no clasificado" o alguna otra indicacion apropiada de que no es probable que sea un miembro de alguna poblacion conocida. La Fig. 75 ilustra el efecto de esta etapa adicional, usando nuevamente las caractensticas calculadas de los datos de pulso de fluorescencia adquiridos en forma digital.

En general, el conversor A/D 689 convierte las senales analogicas de salida 701 del fotodetector 117 en la informacion digital correspondiente 707 que indica la caractenstica A o la caractenstica B (por ejemplo, X o -X). El procesador de senales digitales 865 extrae caractensticas de la informacion digital y el procesador 873 proporciona una senal de clasificacion 853 al sistema de clasificacion como una funcion de las caractensticas extrafdas.

O. Clasificacion de ordenacion y sincronizacion de gotitas

El cuarto procesador de clasificacion 873 administra la clasificacion de gotitas, ejecuta la estrategia de clasificacion y suministra un pulso desencadenante de separacion 853 que esta sincronizado con la gotita seleccionada para la clasificacion. Este procesador 873 recibe informacion de clasificacion de celulas del procesador de discriminacion 867 y relaciona esa informacion al oscilador de generacion de gotitas 703 (es decir alinea la posicion de partfculas clasificadas para la ordenacion en una poblacion con la formacion de gotitas). Determina si hay coincidencia dentro de una gotita y maneja esa coincidencia basandose en estrategias de clasificacion predeterminadas. Mantiene un FIFO de todas las clasificaciones de celulas y decisiones de clasificacion de gotitas que establece el retardo correcto entre el momento en el que la partfcula se observo en tiempo real y el momento en el que la partfcula llega a la ultima gotita unida. Producira un pulso de salida adecuadamente cronometrado 853 de la polaridad y la amplitud apropiada para cada gotita seleccionada para la clasificacion.

En general, el conversor A/D 689 convierte las senales analogicas de salida 701 del fotodetector 117 en la informacion digital correspondiente 707 que indica la caractenstica A o la caractenstica B (por ejemplo, X o -X). El procesador de senales digitales 867 discrimina la informacion digital 707 que indica la caractenstica A o que indica la caractenstica B (por ejemplo, X o ~X) y proporciona una senal de clasificacion 853 al sistema de clasificacion 119 en funcion de la informacion digital discriminada.

En general, los procesadores de senales digitales 863, 865, 867, 873 incluyen instrucciones para detectar pulsos de ondas representados por la informacion digital, las instrucciones para extraer las caractensticas en los pulsos detectados y las instrucciones para discriminar los pulsos detectados como una funcion de sus caractensticas extrafdas. Ademas, los procesadores incluyen instrucciones para definir un lfmite de decision 763 que discrimina entre las caractensticas extrafdas que representan las caractensticas A y las caractensticas extrafdas que representan la caractenstica B. Aun mas, los procesadores 863, 865, 867, 873 pueden ajustar optativamente la ubicacion relativa del lfmite de decision 763 con respecto a las caractensticas extrafdas que representan la caractenstica A y con respecto a las caractensticas extrafdas que representan la caractenstica B como una funcion de al menos uno de lo siguiente: (1) la pureza de al menos una poblacion con respecto a las partfculas con la caractenstica A o a las partfculas con la caractenstica B, y (2) la cantidad de las partfculas con la caractenstica A y las partfculas con la caractenstica B en al menos una poblacion en relacion a la cantidad total de partfculas con la caractenstica A y de partfculas con la caractenstica B en la corriente. Por ejemplo, el procesador puede mover el lfmite de decision 763 para incluir menos de la poblacion 1 y mas de la poblacion 2, o viceversa, en base a la salida de una muestra particular o en base a la salida deseada (por ejemplo, como se ha indicado anteriormente en lo que se refiere a la regla de decision de Riesgo mrnimo de Bayes para ajustar el lfmite de decision para costos dispares).

P. Compensacion de la desviacion

Dado que con el transcurso del tiempo los pulsos de forma de onda correspondientes a la emision de fluorescencia pueden variar o presentar dispersion con el transcurso del tiempo (por ejemplo, debido a variaciones de tincion,

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cambios de temperatura, tiempo de muestra y/u otros factores) el sistema puede emplear optativamente el software de analisis de dispersion 761 (Fig. 72) que define umbrales dinamicos que vanan para compensar cualquier efecto de dispersion. En particular, los umbrales de deteccion de pulsos empleados por el software 747 pueden ajustarse para cualquier variacion lenta en las caractensticas de fondo de la senal, y el algoritmo de discriminacion del software 757 puede ajustar el lfmite de decision 763 (Fig. 74) para responder a cualquier dispersion en las poblaciones en el espacio de caractensticas.

En el caso del algoritmo o algoritmos empleados por el software de deteccion de pulsos 747, el software de compensacion de desviacion 761 logra la compensacion de la desviacion actualizando las estimaciones de desviacion tfpica y media de fondo en base a estimaciones estadfsticas de muestras calculadas dentro de una ventana movil de una longitud dada de muestras (por ejemplo, 10-100 muestras) finalizando con la muestra actual. Dada la tasa de dispersion lenta (supuesta) en relacion con la frecuencia de adquisicion de datos, las estadfsticas de fondo no necesitan actualizarse con cada muestra; mejor, las actualizaciones de estadfsticas de fondo pueden ocurrir periodicamente (por ejemplo, cada 6 segundos; ver el caracter de referencia 795 y la Fig. 82). Ademas, la ventana puede contener una ponderacion menor que la unidad para permitir un mdice de "olvido" para restar peso a las muestras anteriores con respecto a las muestras mas recientes en los calculos estadfsticos. La Fig. 76 ilustra el concepto del calculo estadfstico (promedio) dentro de una ventana movil sin y con un mdice de "olvido".

Similar a la compensacion de desviacion del algoritmo de deteccion, el o los algoritmos de discriminacion empleados por el software de discriminacion de pulsos 757 logran una compensacion de desviacion mediante actualizaciones periodicas de las estadfsticas de segundo orden de las poblaciones en el espacio de caractensticas. En este caso, sin embargo, solo aquellos valores de la caractenstica de los pulsos asignados a una poblacion dada se usan para actualizar las estadfsticas de esa poblacion. Nuevamente, la ponderacion no unitaria se puede usar para incluir un mdice de "olvido". La Fig. 77 muestra una ilustracion conceptual de los efectos de aplicar esta tecnica a las poblaciones en el espacio de caractensticas. La Fig. 77 ilustra un ejemplo de la compensacion de desviacion para las estadfsticas de poblacion en el espacio de caractensticas. El amarillo indica la poblacion 1 (X), el verde la poblacion 2 (Y), los rombos los calculos promedio de la clase (con una ilustracion exagerada de desviacion) y las flechas de bloque los cambios en los calculos de covarianza de la poblacion reflejados en la deformacion de las elipses de sigma constante.

En general, el procesador de senales digitales 863 emplea un umbral de deteccion para analizar la informacion digital, donde el umbral es una funcion de un calculo promedio de fondo y una desviacion tfpica de las senales muestreadas de salida que vanan con el tiempo calculadas dentro de una ventana movil de muestras que finalizan con la muestra actual.

Q. Ventaja de tecnicas completamente digitales sobre tecnicas analogicas

Una de las ventajas principales de usar un sistema totalmente digital para la clasificacion es que no hay ningun "tiempo muerto" asociado con la deteccion y el analisis de un pulso. Con sistemas analogicos siempre hay un "tiempo de conmutacion" finito requerido para que los componentes electronicos se reinicien despues de que suceda y se detecte un pulso. Este tiempo generalmente se encuentra en el orden de al menos un microsegundo. Como el sistema digital capta una corriente continua realmente no tiene ningun tiempo muerto.

Otra ventaja de un sistema digital es la capacidad de mirar hacia adelante y hacia atras en el tiempo en torno a un pulso clasificado para ordenacion. En general, el procesamiento de senales digitales requiere aproximadamente cinco (5) penodos de gotitas para el analisis. Preferiblemente, el retardo de tiempo entre la iluminacion de las gotitas 115 y la formacion de las gotitas 107 es aproximadamente de siete (7) penodos de gotitas. Esto permite al sistema clasificar una partmula espedfica basandose en la probabilidad de que contaminara a la poblacion utilizable segun se indica por las caractensticas de la partmula espedfica y basandose en la proximidad de la partmula espedfica a otra partmula clasificada. Como un ejemplo, el procesador de clasificacion 873 puede rechazar una partmula visualizada como que tiene una probabilidad del 50% de ser una celula X viva mientras que el procesador de clasificacion 873 puede aceptar una partmula visualizada como que tiene una probabilidad del 50% de ser una celula X viva cuando la partmula es coincidente con una segunda partmula visualizada como que tiene una probabilidad del 95% de ser una celula X viva.

R. Analisis analogico de celulas

Tambien se contempla que las senales de salida que vanan en el tiempo, provenientes del fotodetector, pueden procesarse por circuitos analogicos 819, como por ejemplo un conjunto de puertas programable de campo, que puede ser menos costoso que un analizador de celulas digital. La Fig. 42 es un diagrama funcional de un ejemplo de un analizador analogico de celulas que puede emplearse como parte del sistema. La Fig. 53 ilustra graficamente el analisis analogico. Se fija un umbral para producir un factor desencadenante basado en la altura del pulso. El umbral abre una ventana de integracion que controla un integrador analogico para acumular carga. La ventana permanece abierta ya sea durante un penodo fijo o hasta que la amplitud del pulso cae por debajo del umbral desencadenante. De esta forma, solo el area de la porcion del pulso dentro de la ventana de integracion se usa para las mediciones relativas de fluorescencia.

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Con referencia a la Fig. 42, la salida 701 del fotodetector 117 se suministra a un integrador 825 que integra la senal de salida 701 en sincroma con el oscilador de gotitas 703. La senal integrada se suministra a un comparador de ancho/area 827 para comparar el nivel de la senal integrada con un nivel de umbral que define un pulso (por ejemplo, un pulso puede definirse como una senal integrada con un 40% de certeza a un umbral determinado). Un calculador del umbral dinamico A 829 funciona de forma similar a la compensacion de desviacion observada anteriormente en que sigue el nivel de senal integrada y vana el nivel del umbral que utiliza el comparador de ancho/area como una funcion de las variaciones en el nivel de senal integrada promedio.

La senal discriminada por el pulso se suministra a un comparador de ventana 837 para confirmar que el area de pulso esta dentro de un intervalo aceptable. La senal discriminada por pulsos tambien se suministra a un circuito de ancho de pulso y logica desencadenante 839 para confirmar que el ancho de pulso esta dentro de un intervalo aceptable. Si el area y el ancho son aceptables, la logica proporciona una senal desencadenante a un controlador de I/O 843 que indica la decision de clasificacion 841. Por lo tanto, el comparador de ventana 837 y el ancho de pulso y logica desencadenante 839 toman la decision sobre si una celula debe clasificada como una celula X o una celula ~X.

El controlador de I/O 843 proporciona la decision de clasificacion 841 a la placa del controlador de clasificacion 847 en forma de una senal X o ~X. El controlador de I/O 843 tambien incluye una interfaz de bus universal en serie (USB) 849 para conectar al PC 735 y puede tener un puerto I/O para conectar a los controladores auxiliares 845 de los otros canales. El analizador analogico de celulas tambien incluye un puerto de grupo de acceso de ensayo conjunto (JTAG) 833 para programar el comparador de ancho/area, el comparador de ventana y el ancho de pulso y logica desencadenante.

Tambien se contempla que el analizador analogico de celulas puede emplearse simultaneamente con el analizador digital de celulas 705. Por ejemplo, el analizador analogico se puede usar para ajustar los umbrales de voltaje usados por el analizador digital. Por otro lado, el analizador digital se puede usar para identificar diversas caractensticas del pulso y esta informacion de caractensticas se puede usar para configurar el analizador analogico de celulas, en particular si se implementa con un conjunto de puertas.

Estrategias de control

En general, el microprocesador 131 se programa para implementar estrategias de control y de separacion que tienen el proposito de optimizar la eficacia del sistema 1 en cuanto a la produccion y/o la perdida de las partfculas deseadas para afrontar cualquier requisito de costo del producto separado. Esto puede incluir, por ejemplo, equilibrar la necesidad de pureza elevada de al menos una poblacion recogida y la necesidad de recuperar al menos un porcentaje mmimo de partfculas deseadas de la muestra que se esta separando. Lograr tal equilibrio es importante, en particular en el contexto de las aplicaciones comerciales donde el costo y la rentabilidad son consideraciones importantes.

Con este fin, el microprocesador 131 implementa una estrategia de control que es una serie de instrucciones y/o algoritmos que controlan las variables del sistema como por ejemplo la velocidad de suministro de fluido y/o los parametros de clasificacion. El microprocesador tambien implementa una estrategia de clasificacion que define el proceso de decision para determinar como se separa cada partfcula o grupo de partfculas. Cada estrategia de control espedfica puede emplear una o mas estrategias de clasificacion. Se pueden usar diversas estrategias de clasificacion en factores tales como la estrategia de control seleccionada, el sistema de deteccion de partfculas y/o la informacion relacionada con la distribucion de partfculas en la corriente de fluido.

Con respecto a la distribucion de partfculas, la Fig. 78 ilustra una corriente de fluido que contiene un ejemplo de distribucion de partfculas. En este ejemplo espedfico, la corriente esta formada por una boquilla similar a la boquilla descrita anteriormente y contiene una mezcla de partfculas que tienen diferentes caractensticas A y B, por ejemplo, celulas espermaticas X e Y. Segun se muestra, por lo general las celulas se ubican una detras de otra en una serie que puede considerarse como que conforman conjuntos secuenciales de partfculas. Estos conjuntos incluyen los conjuntos de primera partfcula donde cada uno esta formado por una o mas partfculas que tienen una caractenstica A (por ejemplo, indican que tienen una celula espermatica X viva), los conjuntos de segunda partfcula donde cada uno esta formado por una o mas partfculas que tienen una caractenstica B (por ejemplo, indican que tienen una celula espermatica Y o, mas en general, una celula espermatica que no es una celula X viva (-X), como por ejemplo una celula Y o una celula X o Y muerta) y los conjuntos de tercera partfcula donde cada uno esta formado por dos o mas partfculas con menos espacio entre sf donde al menos una de ellas tiene la caractenstica A y al menos una de ellas tiene la caractenstica B (por ejemplo, una o mas celulas espermaticas X y uno o mas celulas espermaticas ~X). Los conjuntos de tercera partfcula tambien se denominan de aqrn en adelante como conjuntos de partfculas "coincidentes".

Que una partfcula espedfica se considere como que conforma un conjunto en sf misma o una parte de otro conjunto dependera principalmente de su posicion espacial y/o de la separacion en relacion con las partfculas adyacentes. Por ejemplo, en un sistema de clasificacion de gotitas, los diversos conjuntos de partfculas estaran definidos por las

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partfculas en las gotitas. En un sistema de clasificacion de foto deterioro donde se usa un haz laser para destruir (matar o danar de otro modo) los conjuntos de partfculas seleccionadas con el fin de proporcionar una poblacion recogida que tenga un contenido deseado, segun lo tratado a continuacion en la seccion de "Separacion por foto deterioro", los diversos conjuntos de partfculas estaran definidos por la proximidad espacial de las partfculas, es decir, si la separacion espacial entre las partfculas es suficiente como para permitir la clasificacion precisa de las partfculas y/o la destruccion de una o mas partfculas no deseadas usando el haz laser sin destruir tambien una o mas partfculas deseadas. De igual manera, en un sistema de clasificacion por conmutacion de fluidos donde las porciones de la corriente que contienen las partfculas seleccionadas se desvfan para proporcionar una poblacion recogida con un contenido deseado, como se trata a continuacion en el sistema de "Separacion por desviacion de fluido", los diversos conjuntos de partfculas estaran definidos por la proximidad espacial de las partfculas, es decir, si la separacion espacial entre las partfculas es suficiente como para permitir la clasificacion precisa de las partfculas y/o la desviacion de las partfculas seleccionadas.

Se observara a partir de lo anterior que la decision de clasificacion aplicada a los diferentes conjuntos de partfculas puede variarse, segun el resultado o la produccion deseada del sistema. Por ejemplo, en un sistema de clasificacion de gotitas, la estrategia de clasificacion usada puede depender del tratamiento de gotitas "coincidentes", es decir, las gotitas que contienen los conjuntos de tercera partfcula. En la manipulacion de celulas espermaticas bovina en un sistema y metodo de clasificacion de gotitas por citometna de flujo como se describe en este documento, por ejemplo, para mejorar el numero de celulas espermaticas X en al menos una poblacion recogida, puede ser aconsejable usar una estrategia donde cada gotita coincidente que contenga una celula espermatica X se acepte y se separe como si contuviera solo celulas espermaticas X, aunque la gotita tambien pueda contener una celula espermatica -X (estrategia de aceptacion de coincidentes). Por otro lado, para mejorar la pureza de las celulas espermaticas X recogidas en la poblacion establecida, es posible que sea aconsejable rechazar cada gotita coincidente que contenga una celula espermatica ~X aunque la misma gotita tambien pueda contener una celula espermatica X (estrategia de rechazo de coincidentes). En general, segun se senalara a continuacion, hay muchas estrategias de control que pueden emplearse para maximizar la produccion de partfculas y hay muchas estrategias de clasificacion que pueden emplearse con cada estrategia de control en particular. Las estrategias pueden aplicarse a diversas tecnicas de clasificacion usando la citometna de flujo, como la clasificacion de gotitas, la clasificacion por foto deterioro y la clasificacion por conmutacion de fluidos. Aun mas, las estrategias anteriores se pueden usar para separar cualquier tipo de partfcula de acuerdo a cualquier caractenstica o caractensticas deseadas de la partfcula.

Segun un ejemplo, el microprocesador controla la velocidad a la cual el sistema de suministro de fluidos suministra el fluido que contiene las partfculas como una funcion de otras variables del sistema. Por ejemplo, el microprocesador puede controlar la velocidad de suministro de fluido como una funcion de un resultado de produccion deseado. Ya que el microprocesador determina la identidad de cada partfcula y determina si esta se dirige al menos a una poblacion recogida, el microprocesador puede determinar y controlar el resultado de produccion mediante la variacion de la estrategia de control y/o mediante la variacion de la estrategia de clasificacion. Un resultado deseado de produccion en general puede definirse como al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una poblacion recogida con respecto a las partfculas con la caractenstica A o a las partfculas con la caractenstica B ("alta recuperacion"), y (2) la cantidad de partfculas con la caractenstica A en la poblacion establecida en relacion con la cantidad total de partfculas con la caractenstica A en la corriente o la cantidad de partfculas con la caractenstica B en la poblacion establecida con relacion a la cantidad total de partfculas con la caractenstica B en la corriente ("pureza elevada"). Como otro ejemplo, el sistema puede emplear una velocidad de suministro de fluido sustancialmente constante y el microprocesador puede controlar los parametros de clasificacion como una funcion de un resultado deseado de produccion. En este ultimo ejemplo, el resultado deseado de produccion en general puede definirse como una combinacion de (1) la pureza de las partfculas en al menos una poblacion recogida y (2) la cantidad de partfculas deseadas disponibles en la corriente pero no incluidas en la poblacion establecida ("caudal constante").

En general, se puede asumir que cuando se separan dos poblaciones, una celula identificada podna tener una probabilidad de 50/50 de formar parte de una poblacion o de la otra. Sin embargo, tambien se contempla que una celula no identificada en realidad puede tener una probabilidad diferente a la de 50/50 de formar parte de una poblacion o de la otra. Esta otra probabilidad puede determinarse mediante un analisis empmco o por otras caractensticas con respecto a la muestra que se esta separando.

A continuacion se analizan en mas detalle varias estrategias diferentes de control.

A. Estrategia de control de alta recuperacion

Un tipo de estrategia de control puede denominarse como una estrategia de control de "alta recuperacion". El objetivo de esta estrategia es maximizar el numero de partfculas deseadas separadas en la poblacion de las partfculas deseadas siempre que la pureza de esa poblacion se encuentre en un nivel de pureza aceptable o por encima de este.

De acuerdo con esta estrategia, los conjuntos de primera partfcula descritos anteriormente se clasifican en la

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poblacion de las partfculas deseadas porque cada uno de estos conjuntos contiene una o mas partfculas que tienen una caractenstica A deseada. Los conjuntos de tercera pardcula tambien se separan en la poblacion de partfculas deseadas (aceptacion de coincidentes) porque cada uno de estos conjuntos tambien contiene a una o mas partfculas que tienen una caractenstica A deseada, aunque este acompanada de una pardcula mas que tenga la caractenstica B. Por otra parte, se rechazan los conjuntos de segunda partfcula (es decir, no separados en la poblacion de partfculas deseadas) porque no contienen una partfcula que tenga la caractenstica deseada. Para optimizar la produccion usando esta estrategia, el microprocesador aumenta la velocidad de suministro de fluido siempre que la pureza de la poblacion recogida se encuentre en un nivel aceptable o por encima de este. Dicho de otra forma, la velocidad de suministro de fluido se aumenta siempre que el nivel probable de contaminacion de la poblacion de las partfculas deseadas se encuentre en un nivel aceptable o por debajo de este.

Como un ejemplo, se puede considerar el uso de una estrategia de control de alta recuperacion para la separacion de las celulas espermaticas X e Y en la corriente de fluido de la Fig. 78. El resultado deseado puede ser separar todas las celulas X en una poblacion de celulas X siempre que la poblacion permanezca en un nivel de pureza aceptable o por encima de este, por ejemplo, siempre que X/(X+Y) sea mayor del 85% o algun otro nivel aceptable. Para obtener este resultado, los conjuntos de primera partfcula se separan en una poblacion de celulas X porque contienen solo una o mas celulas X. Los conjuntos de tercera partfcula tambien se separan en la poblacion de celulas X porque tambien contienen una o mas celulas X, aunque tambien pueden contener una celula Y (o ~X). Los conjuntos de segunda partfcula se separan en alguna otra poblacion porque no contienen una o mas celulas X. En este ejemplo, la velocidad a la cual el sistema de suministro de fluidos suministra el fluido que contiene las celulas a la boquilla seguina aumentando siempre que la pureza de la poblacion de celulas X sea mayor del 85%. Por el contrario, si la pureza de la poblacion de celulas X desciende por debajo del 85%, se reduce la velocidad de suministro de fluido.

En el contexto de un sistema de clasificacion de gotitas, se conoce que de acuerdo a la ecuacion de Poisson para cualquier velocidad dada de generacion de gotitas, el numero de gotitas de varias celulas aumentara a medida que aumente la velocidad de suministro de celulas. En otras palabras, el aumento de la velocidad de suministro de fluido que contiene las celulas aumentara el numero de gotitas de varias celulas. Por consiguiente, si se usa la estrategia de clasificacion de aceptacion de coincidentes y las gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partfcula se separan en la poblacion de las partfculas deseadas, el aumento de la velocidad de suministro de fluido dara lugar a una disminucion en la pureza de la poblacion recogida porque a velocidades mayores de suministro de fluido se generan y se recogen mas gotitas coincidentes. La Figura 79 ilustra este resultado para un fluido de 2 (dos) partfculas de modo que se captura el 100% de las partfculas deseadas. Como se muestra, a velocidades muy bajas de suministro de fluido (velocidad FDR de suministro de fluido en el eje x), la pureza (eje y) de la poblacion resultante recogida es muy alta porque se estan generando y recogiendo muy pocas gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partfcula. A medida que aumenta la velocidad de suministro de fluido (la velocidad FDR de suministro de fluido aumenta hacia la derecha en el eje x), el porcentaje de gotitas coincidentes generado aumenta dando como resultado la recogida de mas gotitas coincidentes y reduciendo la pureza de la poblacion utilizable (a lo largo del eje y). En el ejemplo espedfico ilustrado, la velocidad de suministro de fluido es de 30K pardculas/segundo a una pureza de aproximadamente el 80%.

Los resultados de usar una estrategia de alta recuperacion pueden ser notables, como se ilustra por medio de un ejemplo sencillo donde las celulas espermaticas X e Y se separan usando un proceso de clasificacion de gotitas. Supongamos, por ejemplo, que las gotitas se generan a una velocidad de 60 K/s y que las celulas espermaticas se suministran a la localizacion de examen a una velocidad de 30 K/s. Segun la ecuacion de Poisson, si todas las gotitas que contienen celulas X se separan en la poblacion de celulas X, incluyendo gotitas coincidentes que contienen celulas X e Y, se recogeran aproximadamente 15.000 celulas X cada segundo. La poblacion recogida incluira aproximadamente 2.600 celulas Y, reduciendo la pureza de la poblacion con respecto a las celulas X a aproximadamente el 85,2%. Sin embargo, el numero de celulas X recogidas (15.000) representa un aumento sustancial respecto a una estrategia donde las gotitas coincidentes no se recogen, como en la estrategia o modalidad de pureza elevada que se analiza a continuacion. En la modalidad de pureza elevada, la operacion a una frecuencia de gotitas de 40 K/segundo y a una velocidad de suministro de celulas de 40 K/segundo (10 K celulas/segundo mas que en el ejemplo anterior de la modalidad de alta recuperacion), solo se recogen aproximadamente 11.800 celulas X cada segundo o aproximadamente 3.800 celulas X menos que en la estrategia de alta recuperacion. Aun mas, cuando se usa la estrategia de pureza elevada, se pierden o se desechan aproximadamente 9.200 celulas X porque las gotitas coincidentes no se separan en la poblacion de celulas X. Por consiguiente, si es aceptable menos del 100% de pureza, quiza sea aconsejable usar la modalidad de alta recuperacion para aumentar el numero de celulas X recogidas o, dicho de otra forma, para disminuir el numero de celulas X perdidas.

En resumen, en la estrategia de control de alta recuperacion usando la estrategia de clasificacion de aceptacion de coincidentes, la velocidad de suministro de partfculas esta relacionada inversamente con la pureza de la poblacion recogida de las partfculas deseadas (denominada en ocasiones como la poblacion "utilizable").

B. Estrategia de control de pureza elevada

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Un segundo tipo de estrategia de control puede denominarse como una estrategia de control de "pureza elevada". El objetivo de esta estrategia es mantener en un alto nivel la pureza de la poblacion recogida en lo que se refiere a las partfculas que tienen una caractenstica deseada, siempre que la cantidad de partfculas deseadas en la poblacion recogida en relacion con el numero total de partfculas deseadas disponibles en la corriente se encuentre en una cantidad aceptable o por encima de esta (es decir, siempre que la cantidad de partfculas deseadas en la corriente que no se recogen permanezca por debajo de una cantidad aceptable). De acuerdo con esta estrategia, los conjuntos de primera partfcula descritos anteriormente se separan en la poblacion de las partfculas deseadas porque cada uno de estos conjuntos contiene a una o mas partfculas que tienen una caractenstica deseada A y porque estos conjuntos no contienen ninguna partfcula contaminante. Por otro lado, los conjuntos de segunda y tercera partfcula se separan en una o mas poblaciones "inutilizables" (rechazo de coincidentes) porque contienen partfculas contaminantes (es decir, partfculas con la caractenstica B). Para optimizar la produccion usando esta estrategia de "pureza elevada", el microprocesador aumenta la velocidad de suministro de fluido siempre que la cantidad de partfculas deseadas que se separan en la poblacion utilizable en relacion con el numero total de partfculas deseadas disponibles en la corriente permanezca en una cantidad aceptable o por encima de esta.

Como un ejemplo, se puede considerar el uso de una estrategia de control de pureza elevada para la separacion de las celulas espermaticas X e Y en la corriente de fluido de la Fig. 78. El resultado deseado puede ser separar todas las celulas X en una poblacion de celulas X siempre que la cantidad de celulas X recogidas de la corriente permanezca en una cantidad aceptable o por encima de esta, por ejemplo, al menos el 60%. Para obtener este resultado, los conjuntos de primera partfcula se separan en la poblacion utilizable porque contienen solo una o mas celulas X. Por otro lado, los conjuntos de segunda y tercera partfcula se separan en una o mas poblaciones inutilizables porque contienen una o mas celulas contaminantes (~X). En este ejemplo, la velocidad a la cual el sistema de suministro de fluidos suministra el fluido que contiene las celulas a la boquilla seguina aumentando siempre que la cantidad de celulas X que se recoge en la poblacion utilizable como un porcentaje de la cantidad disponible total de celulas X que se han separado permanezca en un 60% o mayor. Por el contrario, si la cantidad de celulas X que no se recogen en la poblacion utilizable aumenta por encima de un 40% del numero total de celulas X disponibles que se han separado, la velocidad de suministro de fluido disminuye.

Segun se ha observado anteriormente en el contexto de un sistema de clasificacion de gotitas, se sabe que el aumento de la velocidad de suministro de fluido aumentara el numero de gotitas con varias celulas, y por lo tanto el numero de gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partfcula. Ya que las gotitas coincidentes no se separan dentro de la poblacion de celulas X recogidas cuando se usa una estrategia de clasificacion de rechazo de coincidentes, esto significa que el aumento de la velocidad de suministro de fluido dara lugar a un aumento en la cantidad de celulas X vivas perdidas a la poblacion inutilizable.

La Figura 80 ilustra este resultado para un fluido de dos (2) partfculas para que la poblacion utilizable tenga un 100% de pureza de las partfculas deseadas. Segun se muestra, a velocidades muy bajas de suministro de fluido (FDR en el eje x), el porcentaje de partfculas deseadas en la poblacion utilizable es muy alto porque se estan generando y rechazando muy pocas gotitas coincidentes. A medida que aumenta la velocidad de suministro de fluido (la FDR aumenta a la derecha en el eje x), el porcentaje de gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partfcula aumenta y se rechazan mas conjuntos de ese tipo. Esto reduce la cantidad de partfculas deseadas que se separan en la poblacion utilizable en relacion con la cantidad total de partfculas deseadas disponibles en la corriente (es decir, el porcentaje de partfculas deseadas de la corriente que se recogen en la poblacion utilizable). En el ejemplo espedfico ilustrado, la velocidad de suministro de fluido es de aproximadamente 40 K partfculas/segundo y aproximadamente el 75% de las partfculas deseadas se separan hacia la poblacion utilizable.

En resumen, en la estrategia de control de pureza elevada que implementa la estrategia de clasificacion de rechazo de coincidentes, la velocidad de suministro de partfculas esta relacionada inversamente con el porcentaje de partfculas deseadas en la poblacion recogida (es decir, pureza elevada de partfculas deseadas en la poblacion utilizable).

C. Estrategia de control de caudal constante

Un tercer tipo de estrategia de control puede denominarse como una estrategia de control de caudal constante. En esta estrategia, el microprocesador mantiene la velocidad de suministro de fluido constante (o dentro de un intervalo constante) y vana el porcentaje de gotitas coincidentes recogidas (o rechazadas) siempre que la pureza de al menos una poblacion recogida se encuentre en un nivel aceptable o por encima de este y siempre que la cantidad de partfculas deseadas en esa poblacion se encuentre en una cantidad aceptable en relacion con una cantidad total de partfculas deseadas que se han procesado. Dicho de otro modo, la velocidad de suministro de fluido es constante y el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (o rechazadas) vana siempre que el nivel probable de contaminacion de la poblacion utilizable se encuentre en un nivel aceptable de pureza o por debajo de este y siempre que la cantidad probable de partfculas deseadas que se pierde a una poblacion diferente de la poblacion establecida (utilizable) este en una cantidad aceptable o por debajo de esta.

Como ejemplo, considerese el uso de una estrategia de control de caudal constante para la separacion de la corriente de fluido que se muestra en la Fig. 78. El resultado deseado puede ser separar las celulas espermaticas X

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en una poblacion utilizable que tenga una pureza de al menos el 85% y recoger al menos el 60% de las celulas X que se encuentran en la corriente para que no mas del 40% de las celulas X se separen en la poblacion inutilizable. En este ejemplo, se mantendna constante la velocidad a la cual el sistema de suministro de fluidos suministra las partmulas y se variana el porcentaje de recogida o rechazo de conjuntos de tercera partmula (conjuntos coincidentes) siempre que la pureza de la poblacion utilizable en lo que se refiere a las celulas X sea igual o mayor del 85% y siempre que el porcentaje de celulas X separadas en la poblacion inutilizable sea menor del 40% de modo que el porcentaje de partmulas deseadas separadas en la poblacion utilizable sea igual o mayor del 60% (estrategia de clasificacion de aceptacion de coincidentes variable). A medida que aumenta el porcentaje de los conjuntos de tercera partmula aceptados, la pureza de la poblacion utilizable disminuye, pero la cantidad de partmulas deseadas (por ejemplo, celulas X) que se separan en la poblacion inutilizable disminuye. Por el contrario, a medida que disminuye el porcentaje de los conjuntos de tercera partmula aceptados, la pureza de la poblacion utilizable aumenta, pero la cantidad de partmulas deseadas (por ejemplo, celulas X) que se separan en la poblacion inutilizable aumenta.

Como se ha indicado anteriormente, se sabe a partir de la ecuacion de Poisson que el numero de gotitas de varias celulas (y por lo tanto el numero de gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partmula) es constante para una velocidad constante de suministro de fluido (celula). Como el numero de gotitas coincidentes es constante en esta estrategia de control, el porcentaje de gotitas coincidentes clasificadas en la poblacion utilizable repercutira tanto en la pureza de la poblacion utilizable como en la cantidad de celulas X que se desechan por separarse hacia la poblacion inutilizable. Esto es porque el porcentaje de celulas Y (o ~X) no deseadas en gotitas coincidentes que se aceptan y se separan hacia la poblacion inutilizable recogida esta inversamente relacionado con el porcentaje de celulas X en gotitas coincidentes que se rechazan y por lo tanto no se separan dentro de la poblacion utilizable recogida.

La Figura 81 ilustra la estrategia de control de velocidad de suministro de fluido constante en un sistema y metodo de clasificacion de gotitas de citometna de flujo como se describe en este documento implementando una estrategia de clasificacion de rechazo de coincidentes variable para un lfquido de 2 (dos) partmulas. Como se muestra, la lmea OL ilustra la relacion inversa entre el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas (eje x) comparado con el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (eje y). Cuando hay un porcentaje muy bajo de gotitas coincidentes aceptadas, hay un porcentaje muy alto de gotitas coincidentes rechazadas. Por el contrario, cuando hay un porcentaje muy alto de gotitas coincidentes aceptadas, hay un porcentaje muy bajo de gotitas coincidentes rechazadas. La lmea OL ilustra esta relacion inversa y representa la lmea de operacion de la estrategia de clasificacion de aceptacion de coincidentes variable a una determinada velocidad constante de flujo de la partmula. En el punto P en la Fig. 81 sobre la lmea de operacion OL, la pureza de la poblacion utilizable es un porcentaje dado que depende del caudal de la partmula, por ejemplo, un 85% de pureza. A medida que aumenta el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (a la izquierda y arriba) sobre la lmea de operacion OL, el numero de partmulas no deseadas que se separan hacia la poblacion utilizable aumenta y la pureza disminuye por debajo de un 85%, que puede que sea inaceptable. A medida que disminuye el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (a la derecha y abajo) a lo largo de la lmea de operacion OL, la pureza supera el 85% y es aceptable.

En el punto LL sobre la lmea de operacion OL, se rechaza el 75% de las gotitas coincidentes (es decir, se separan hacia la poblacion inutilizable) de modo que el porcentaje de partmulas deseadas que se desecha por separarse hacia la poblacion inutilizable es un porcentaje dado basado en la velocidad de suministro de partmulas, por ejemplo, 40%. A medida que aumenta el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas (a la derecha y abajo) sobre la lmea de operacion OL, el porcentaje de partmulas deseadas que se separa hacia la poblacion utilizable disminuye (por ejemplo, a <60%), lo que puede llegar a ser inaceptable. A medida que disminuye el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas (a la izquierda y arriba) sobre la lmea de operacion OL, el porcentaje de partmulas deseadas separadas hacia la poblacion utilizable aumenta (por ejemplo, a >60%) y es aceptable. Por lo tanto, para una estrategia de control de caudal constante que implementa una estrategia de clasificacion de aceptacion de coincidentes variable, el microprocesador puede dirigir el sistema para que el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas y rechazadas vane en un intervalo operativo entre el punto P1 y LL como se indica con la flecha OR. Se debe tener en cuenta que el intervalo operativo OR puede abarcar mas, o menos de la lmea de operacion, segun el nivel de tolerancia para impurezas y la perdida de las partmulas deseadas hacia la poblacion inutilizable.

En resumen, en la estrategia de control de caudal constante usando la estrategia de clasificacion de aceptacion de coincidentes variable, el porcentaje de conjuntos de tercera partmula que se acepta esta inversamente relacionado con la pureza de la poblacion utilizable e inversamente relacionado con la cantidad de partmulas deseadas desechadas por separarse hacia una poblacion inutilizable.

D. Resumen de estrategias de control

La siguiente Tabla resume las estrategias de control indicadas anteriormente.

ESTRATEGIA DE CONTROL: ALTA RECUPERACION PUREZA ELEVADA CAUDAL CONSTANTE

Parametro controlado: Velocidad de suministro de fluido Velocidad de suministro de fluido Parametros de clasificacion

Parametro de control:: Pureza de la poblacion Cantidad de partfculas deseadas en la poblacion Pureza de la poblacion Y cantidad de partfculas deseadas en la poblacion

Estrategia de clasificacion: Aceptacion de coincidentes Rechazo de coincidentes Aceptacion de coincidentes variable

Estrategia de clasificacion X/Y: Recogida de gotitas X y gotitas de X+~X; rechazo de gotitas ~X Recogida de gotitas X; rechazo de gotitas X+~X y de gotitas ~X Recogida de gotitas X; vana el porcentaje de gotitas recogidas X+- X; rechazo de gotitas ~X

Definicion: La velocidad de suministro de fluido se aumenta siempre que la pureza de la poblacion con respecto a las partfculas X se encuentre en un nivel aceptable o por encima de este. La velocidad de suministro de fluido aumenta mientras la cantidad de partfculas deseadas en la poblacion utilizable con relacion a la cantidad total de partfculas X en la corriente se encuentre en una cantidad aceptable o por encima de esta. El porcentaje de las gotitas coincidentes en la poblacion aumenta siempre que la pureza de la poblacion con respecto a las partfculas X se encuentre en un nivel aceptable o por encima de este; para continuar la operacion, la cantidad de partfculas deseadas en la poblacion utilizable en relacion a la cantidad de partfculas X en la corriente debe ser igual a la cantidad aceptable o estar por encima de esta.

Definicion inversa: La velocidad de suministro de fluido se aumenta siempre que la probabilidad de contaminacion de la poblacion utilizable este en un nivel aceptable de pureza o por debajo de este. La velocidad de suministro de fluido se aumenta siempre que la probabilidad de perdida de la cantidad de partfculas deseadas hacia una poblacion inutilizable este en una cantidad aceptable o por debajo de esta. La velocidad de suministro de fluido se aumenta siempre que la probabilidad de contaminacion de la poblacion utilizable se encuentre en un nivel aceptable de pureza o por debajo de este Y siempre que la probabilidad de perdida de la cantidad de partfculas deseadas hacia la poblacion inutilizable este en una cantidad aceptable o por debajo de esta.

Resultado deseado: > la pureza minima aceptable; por ejemplo, >85% de pureza > la cantidad minima aceptable; por ejemplo, >60% de partfculas deseadas capturadas (<40% de partfculas deseadas perdidas) > la pureza minima aceptable y > la cantidad minima aceptable; por ejemplo, >85% de pureza y >60% de partfculas deseadas-capturadas (<40% de partfculas deseadas perdidas)

De forma relacionada, una muestra separada obtenida usando una de las estrategias de control anteriores se puede combinar con una segunda muestra para obtener una muestra final (por ejemplo, comercial) que presente las caractensticas deseadas. Por ejemplo, una muestra separada segun la estrategia de pureza elevada para producir 5 una poblacion 100% pura se puede combinar con una poblacion del mismo volumen separada a una pureza del 80% para producir una muestra final que tenga una pureza del 90%. O en el caso de celulas espermaticas separadas a una pureza elevada, una cantidad de la alfcuota de las celulas espermaticas separadas puede combinarse con una cantidad de la alfcuota de celulas espermaticas sin separar para producir una muestra final de la pureza deseada a un costo mas bajo que si se separara toda la cantidad de celulas espermaticas usando cualquiera de los metodos de 10 clasificacion anteriores.

La descripcion anterior de las estrategias de control supone la identificacion y separacion precisa de cada gotita incluyendo cada gotita coincidente. En la practica, la exactitud del 100% no es posible por diversas razones. Por consiguiente, para reducir al mmimo la contaminacion, quiza sea aconsejable rechazar las partfculas que no pueden 15 clasificarse con certidumbre como pertenecientes a la poblacion deseada. Por otro lado, si ciertas partfculas pueden identificarse y clasificarse como que pertenecen a la poblacion deseada dentro de una cierta probabilidad seleccionada (por ejemplo, mayor del 50% en el caso de celulas espermaticas), quiza sea aconsejable clasificar las partfculas como pertenecientes a la poblacion deseada para que no se pierdan hacia la poblacion inutilizable. Por lo tanto, segun se ha analizado previamente, partfculas tales como celulas espermaticas pueden aceptarse o 20 rechazarse para separarlas en una poblacion de celulas deseadas en base a la probabilidad de que tales partfculas pertenezcan a la poblacion utilizable.

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Los terminos "utilizable" e "inutilizable" como se utilizan en la tabla anterior y en esta solicitud se usan por comodidad unicamente y no pretenden ser limitantes de ninguna manera. Por lo tanto, una poblacion "utilizable" incluye cualquier "primera" poblacion, independientemente de como se utilizara o de si se utilizara y una poblacion "inutilizable" incluye cualquier "segunda" poblacion diferente de la poblacion utilizable, independientemente de como se utilizara o de si se utilizara. De igual manera, una poblacion "deseada" significa cualquier poblacion que se separa segun las caractensticas de partfcula seleccionadas.

El microprocesador y su software de procesamiento de senales constituyen un sistema para procesar las senales electricas del fotodetector para clasificar las partfculas (por ejemplo, partfculas en general y partfculas de celulas espermaticas en particular) segun las caractensticas de las partfculas y para obtener informacion relacionada con la distribucion de las partfculas como se ha descrito anteriormente con respecto a la Fig. 78. Ademas, el microprocesador constituye un sistema de control que responde al software de procesamiento de senales para variar la velocidad a la cual el sistema de suministro de fluidos suministra las partfculas al sistema de boquilla como una funcion de la informacion obtenida en relacion con la distribucion de las partfculas. Ademas, el microprocesador constituye un sistema de control de respuesta al software de procesamiento de senales para variar la estrategia de clasificacion como una funcion de la informacion obtenida en relacion con la distribucion de las partfculas.

En general, el microprocesador constituye un sistema de control que responde a la informacion recibida del aparato de citometna de flujo para controlar el sistema de clasificacion con el fin de variar su estrategia de clasificacion o para controlar el sistema de suministro de fluidos. En otras palabras, el microprocesador es capaz de operar en una primera modalidad para variar la estrategia de clasificacion, es capaz de operar en una segunda modalidad para controlar el sistema de suministro de fluidos, es capaz de operar en una tercera modalidad para variar la estrategia de clasificacion y para controlar el sistema de suministro de fluidos y puede ser capaz de operar en otras modalidades. Cuando opera en la primera o tercera modalidad, el microprocesador es capaz de variar la velocidad a la cual se suministra el fluido como una funcion de al menos una de las siguientes: (1) la pureza de al menos una poblacion con respecto a partfculas con la caractenstica A o partfculas con la caractenstica B y (2) la cantidad de partfculas con la caractenstica A o partfculas con la caractenstica B en al menos una poblacion en relacion con la cantidad total de partfculas con la caractenstica A o partfculas con la caractenstica B en la corriente.

Sistema de recogida

Se necesita un sistema de recogida para recoger las gotitas despues de que pasan entre las placas deflectoras. El sistema de recogida para un citometro convencional puede estar formado tan solo por recipientes de recogida dispuestos para atrapar las gotitas en las diferentes corrientes de gotitas despues de que pasen entre las placas deflectoras. Se pueden usar sistemas similares de recogida convencionales.

Sin embargo, es posible que sea diffcil usar un sistema de recogida convencional donde la boquilla este orientada para dirigir la corriente de fluido en un angulo ascendente, lo que da un componente horizontal a la velocidad de las gotitas. Un asunto es que las gotitas se desplazanan cierta distancia horizontal a lo largo de sus trayectorias curvas antes de comenzar el movimiento descendente que sena apropiado para llegar a un recipiente de recogida. Por ejemplo, si la boquilla esta apuntada hacia arriba entre 45° y 60° y las gotitas salen a una velocidad entre 15 m/s y 20 m/s, las gotitas estaran a una distancia horizontal de varios metros de la boquilla antes de alcanzar el apice de sus trayectorias y comenzar un movimiento descendente. Por lo tanto, las corrientes de gotitas ocupanan un gran espacio de laboratorio. Ademas, en un intervalo de varios metros tambien podna ser diffcil asegurar que las gotitas llegaran a los recipientes de recogida adecuados. Las trayectorias de las corrientes de gotitas pueden cambiar cuando cambian una o mas condiciones de funcionamiento para el citometro (por ejemplo, ajuste de la velocidad de suministro de fluido que da como resultado un cambio en la velocidad del lfquido en el orificio de la boquilla). Los cambios en las trayectorias de las corrientes de gotitas se veran magnificados por la distancia que recorren las gotitas. Por lo tanto, los cambios en las trayectorias que no provocan un cambio apreciable en la ubicacion de las gotitas en un punto relativamente proximo a la boquilla podnan provocar un cambio significativo en la ubicacion de las gotitas en un sitio que este mas lejos de la boquilla. Como se ha analizado anteriormente, algunos sistemas emplean la retroalimentacion a la formacion de gotitas y/o sistemas de suministro de fluidos de la muestra que podnan dar lugar a corrientes de gotitas que alteren constantemente sus trayectorias. Tambien es posible que se desee variar la presion a la cual el fluido envolvente se suministra a la boquilla. Las corrientes de aire, las variaciones de temperatura y las variaciones de humedad tambien podnan alterar las trayectorias de las corrientes de gotitas. Cualquier factor que pueda cambiar la trayectoria de las corrientes de gotitas tambien podna requerir la reubicacion de los recipientes de recogida para que las gotitas sean recibidas en los recipientes apropiados de recogida. Por contraste, las trayectorias de las corrientes de gotitas en un citometro convencional que tenga una boquilla que apunte hacia abajo son menos susceptibles a la variacion. Por ejemplo, el hecho de que las corrientes de gotitas tengan una velocidad inicial sustancialmente descendente significa que la variacion en la velocidad del lfquido en el orificio no da como resultado ninguna variacion significativa en las trayectorias. Ademas, los recipientes de recogida estan relativamente cerca de la boquilla lo que hace que el sistema de recogida sea mas tolerante a las variaciones de trayectorias en las corrientes de gotitas.

Las Fig. 83-85 muestran un ejemplo de un sistema de recogida, denominado de forma general 2201, que se puede usar para recoger las gotitas separadas en un sistema. El sistema de recogida es particularmente adecuado para la

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recogida de gotitas 33 cuando el sistema de boquilla del citometro 101 esta orientado a dirigir la corriente de fluido 21 en un angulo ascendente o cualquier otro angulo que tenga un componente horizontal. A medida que las gotitas pasan entre las placas deflectoras 629, se separan en corrientes de varias gotitas 123, 125 (por ejemplo, dos) que tienen diferentes trayectorias curvas. Como se muestra en las Fig. 84 y 85, la trayectoria de cada corriente de gotitas conduce a uno de dos dispositivos interceptores de gotitas 2203. Si las gotitas se separan en mas de dos corrientes de gotitas, se debera proporcionar otro dispositivo interceptor para cada corriente de gotitas adicional. Por lo tanto, el numero de dispositivos interceptores en un sistema de recogida dependera del numero de corrientes en las que se estan separando las gotitas.

Cada dispositivo interceptor 2203 en el sistema de recogida de ejemplo tiene una superficie de impacto 2205 ubicada para cubrir la trayectoria de una de las corrientes de gotitas para desviar las gotitas que avanzan por esa trayectoria hacia un recipiente de recogida 2207 colocado debajo de cada dispositivo interceptor. Las superficies de impacto estan fabricadas preferiblemente de un material flexible. Sin limitarse a una teona particular, se cree que los materiales flexibles amortiguan el impacto de las gotitas que chocan contra la superficie del dispositivo interceptor, reduciendo asf el dano a las partfculas (por ejemplo, celulas espermaticas) en las gotitas. Por ejemplo, los dispositivos interceptores pueden estar fabricados de polipropileno, polietileno u otros polfmeros similares. Con referencia a las Fig. 86 y 87, los dispositivos interceptores 2203 se han fabricado cortando una entrada para las gotitas 2211 (por ejemplo, una ventana rectangular) en un lado de la ampolla 2213 de una pipeta 2215. Por lo tanto, una porcion de la pared interior 2217 de la ampolla opuesta a la entrada de la gotita forma una superficie de impacto curva 2205 que cubre la trayectoria de la corriente de gotitas respectiva. Convenientemente, el tubo de la pipeta sirve de grna 2225 para dirigir el lfquido desde la superficie de impacto al recipiente de recogida.

Con referencia a la Fig. 84, los dispositivos interceptores estan sujetos a un marco del sistema de recogida 2227, que los mantiene en su lugar. Para tener en cuenta la variabilidad en las trayectorias de las corrientes de gotitas, es deseable permitir el ajuste de las posiciones de los dispositivos interceptores. Por ejemplo, la altura vertical de cada dispositivo interceptor puede ajustarse deslizando el tubo grna hacia arriba y hacia abajo en un orificio circular a traves de un soporte 2229. Cuando el dispositivo interceptor esta a la altura deseada, puede ajustarse un tornillo de fijacion 2231 para sostenerlo a esa altura. El soporte puede adjuntarse a una placa de montaje 2233 que esta adjuntada al marco del sistema de recogida, por ejemplo por tornillos de fijacion 2235 (por ejemplo, dos tornillos de fijacion). Los tornillos de fijacion 2235 pasan a traves de una ranura horizontal 2241 en la placa de montaje para permitir el ajuste lateral del dispositivo interceptor. Despues del ajuste, los tornillos de fijacion pueden ajustarse para mantener al soporte circular en la ubicacion deseada. Los especialistas en la tecnica reconoceran que se podna usar una variedad de otros dispositivos de sujecion para ajustar la posicion del dispositivo interceptor. Los recipientes de recogida 2207 se mantienen debajo de los dispositivos interceptores en las ranuras 2241 en una bandeja 2243 para sostener los recipientes de recogida. Por lo tanto, se puede mover cada recipiente de recogida dentro de una ranura respectiva segun sea necesario para que se mantenga en posicion debajo del dispositivo interceptor respectivo. Ademas, si se desea se puede proporcionar un bano de agua (no se muestra) alrededor del recipiente de recogida para controlar la temperatura de los contenidos del recipiente de recogida.

Con referencia a la Fig. 85, se ha cortado una ventana de salida 2245 (por ejemplo, una ventana rectangular) en la parte trasera de uno de los dispositivos interceptores 2247 para permitir que una o mas corrientes de gotitas pase a traves del dispositivo interceptor. Se coloca un segundo dispositivo interceptor 2249 detras de la ventana de salida para interceptar las gotitas que pasan por esta ventana. Por ejemplo, una ventana de entrada para el segundo dispositivo interceptor puede ser aproximadamente del mismo tamano que la ventana de la salida del ejemplo del primer dispositivo interceptor. Por razones que seran evidentes, es deseable que la ventana de salida sea significativamente mas pequena que la ventana de entrada para el primer dispositivo interceptor. Por ejemplo, un ejemplo de una ventana de entrada para el primer dispositivo interceptor es cerca de 5/8 pulg. de alto y cerca de 3/8 pulg. de ancho (1,95 cm alto y 0,952 cm ancho). Por contraste, un ejemplo de una ventana de salida puede ser de 1/8 pulg. (0,32 cm) de alto y 5/16 pulg. (0,79 cm) de ancho.

Durante el funcionamiento del citometro, el sistema de recogida funciona para interceptar las gotitas en las corrientes separadas. Las gotitas interceptadas luego bajan a traves de los tubos de grna 2225 de los dispositivos interceptores 2203 y a los recipientes de recogida 2207. En un caso en el cual un citometro tiene una boquilla de citometro ascendente que dirige las corrientes de gotitas a lo largo de las trayectorias curvas, por ejemplo, los dispositivos interceptores permiten que las gotitas sean interceptadas en un punto de su trayectoria que esta significativamente mas cercano a la boquilla en comparacion con el punto en el cual se recogenan las gotitas mediante un sistema de recogida convencional (es decir, un sistema de recogida sin dispositivos interceptores). La interceptacion de las corrientes de gotitas en un punto relativamente cercano a lo largo de sus trayectorias arqueadas (por ejemplo, mientras estan todavfa moviendose hacia arriba) reduce la cantidad de variacion en la ubicacion de las gotitas al momento en que las gotitas se encuentran por primera vez con el sistema de recogida. En consecuencia, el sistema de recogida puede tolerar mas variacion en las trayectorias de las corrientes de gotitas que las que podna tolerar un sistema de recogida convencional. De igual manera, las gotitas tienen menor probabilidad de estar sometidas a corrientes de aire gracias a sus recorridos mas breves hacia el sistema de recogida.

Se debe establecer un equilibrio entre mover los dispositivos interceptores 2203 mas cerca de la boquilla 101 para aumentar la tolerancia para las variaciones de trayectorias y mover los dispositivos interceptores mas lejos del

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orificio de la boquilla para reducir o minimizar la fuerza del impacto cuando las gotitas golpean contra los dispositivos interceptores, como por ejemplo colocar los dispositivos interceptores para que intercepten las corrientes de gotitas practicamente en el apice de sus trayectorias. En consecuencia, la mejor ubicacion para los dispositivos interceptores dependera de la durabilidad de las partfculas (por ejemplo, celulas espermaticas) a separar, las velocidades de las gotitas, y la magnitud esperada de la variacion en las trayectorias de la corriente de gotitas. En el caso de gotitas que contengan esperma bovino que tengan una velocidad en el orificio de la boquilla de cerca de 16 a 20 m/s, por ejemplo, los dispositivos interceptores pueden colocarse en el intervalo de 4-6 pulgadas (10,16-15,24 cm) del orificio de la boquilla. En el sistema en que un primer dispositivo interceptor tiene una ventana de salida y se coloca un segundo dispositivo interceptor detras del primer dispositivo interceptor, por ejemplo, el primer dispositivo interceptor puede estar en un intervalo de aproximadamente 4 y 5 pulgadas (10,2 y 12,7 cm) de la boquilla. El segundo dispositivo interceptor puede estar en el intervalo de aproximadamente 5 a 6 pulgadas (12,7 a 15,2 cm) de la boquilla. De forma mas deseable, el segundo dispositivo interceptor esta aproximadamente a 5,5 pulgadas (13,97 cm) de la boquilla.

La configuracion en la cual se coloca un dispositivo interceptor 2203 para interceptar las gotitas que pasan a traves de una ventana de salida de otro dispositivo interceptor es particularmente ventajosa cuando no es primordial la pureza de una de las poblaciones separadas (por ejemplo, celulas espermaticas portadores del cromosoma Y en el caso de celulas espermaticas separados para usar en la cna de vacas lecheras). Los especialistas en la tecnica sabran que el citometro puede producir una cantidad de gotitas dispersas 2265 (por ejemplo, una nube de gotitas dispersas) que tengan un contenido desconocido ademas de las gotitas en las corrientes separadas segun se muestra en la Fig. 85. El primer dispositivo interceptor se debe colocar de modo que la corriente de gotitas que se esta separando para la poblacion con mayor tolerancia a las impurezas, golpee la superficie de impacto 2205 del primer dispositivo interceptor, y la corriente para la cual la pureza es sumamente cntica pase a traves de la ventana de salida 2245 y golpee la segunda superficie de impacto del segundo dispositivo interceptor.

De esta manera la mayona de las gotitas dispersas se recoge en el recipiente de recogida 2207 que contiene la poblacion para la cual la pureza no es tan importante, como se muestra en la Fig. 85 y no contaminara a la poblacion para la cual la pureza es cntica. Tambien al interceptar y recoger las gotitas dispersas, se evita la necesidad de limpiar tan a menudo como en el caso de que las gotitas dispersas se salieran del sistema de recogida. En contraposicion al primer dispositivo interceptor, el segundo dispositivo interceptor solo desvfa las gotitas que pasan por la ventana mas pequena de salida. Esto facilita el mantenimiento de la pureza de la poblacion recogida por el segundo dispositivo interceptor.

Los especialistas en la tecnica reconoceran que el sistema de recogida ejemplar podna modificarse facilmente de varias maneras. Por ejemplo, sena posible construir un dispositivo interceptor de gotitas que tenga debajo de este un recipiente de recogida formado de manera integral (o unido de otro modo). De igual manera, aunque los dispositivos interceptores en el ejemplo mostrado en las Fig. 83-87 son pipetas modificadas, se comprende que los dispositivos interceptores 2203 pueden ser de una gran variedad de formas. Por ejemplo, cada dispositivo interceptor puede comprender una lamina plana o curva, una cuchara, un cuenco u otra forma similar. El unico requisito es que el dispositivo interceptor funcione correctamente para interceptar las gotitas que avanzan por una trayectoria respectiva de una corriente de gotitas y para desviar las gotitas interceptadas en un recipiente de recogida. Sin embargo, una ventaja de construir los dispositivos interceptores a partir de un producto facilmente de obtener y de un costo relativamente bajo, como por ejemplo una pipeta, es que quiza sea mas economico reemplazar y eliminar los dispositivos interceptores usados despues de pasar cada muestra, en lugar de limpiar los dispositivos interceptores cada vez que se pasa una muestra. Esto podna ayudar a reducir los costos del funcionamiento del sistema de recogida.

Fluido de recogida

Las celulas espermaticas separadas se recogen en un recipiente que contiene un fluido de recogida 2301 (Fig. 56 y 57). En general, el objetivo del fluido de recogida incluye amortiguar el impacto de las celulas espermaticas con el recipiente de recogida y proporcionar un soporte lfquido para las celulas. De acuerdo con estas consideraciones, el fluido de recogida puede contener un tampon y una fuente proteica.

Antes se dieron ejemplos de tampones que se pueden usar en el fluido de recogida con relacion a la recogida y dilucion de muestras. Habitualmente, estos tampones tendran una concentracion entre aproximadamente 0,001 M y aproximadamente 1,0 M y tendran un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 8,5; preferiblemente de aproximadamente 7,0. Por ejemplo, el fluido de recogida contiene el tampon que contiene 0,96% (p/v) de PBS de Dulbecco a un pH de aproximadamente 7,0. En otro ejemplo, la solucion tamponada contiene 0,204 g de NaHCO3; 0,433 g de KHCO3 y 0,473 g C6H8O7 H2O en 25 ml de agua purificada (0,097 moles/l de NaHCOa; 0,173 moles/l de KHCO3 y 0,090 moles/l de C6H8O7-H2O en agua).

Si se incluye, la fuente proteica puede ser cualquier fuente proteica que no interfiera con la viabilidad de las celulas espermaticas, y sea compatible con el tampon o solucion amortiguada particular que se utilice. Algunos ejemplos de fuentes proteicas comunes son la leche (incluso la homogeneizada por calor y la descremada), el extracto lacteo, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la protema de soja y el extracto de protema de soja. Dichas protemas

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se pueden encontrar en una concentracion entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 30 % (v/v), preferiblemente entre aproximadamente 10 % (v/v) y aproximadamente 20 % (v/v), y mejor si es de aproximadamente 10 % (v/v). Aunque la leche se puede usar en combinacion con un tampon o solucion amortiguada, en general se usa a falta de estos, ya que la leche misma es una solucion que se puede utilizar para los mismos fines que un tampon o solucion amortiguada. En tales casos, el fluido de recogida contendna entre aproximadamente 80 % (v/v) y aproximadamente 90 % (v/v) de leche.

Ademas o en lugar de la fuente proteica, el fluido de recogida tambien puede contener plasma seminal. El plasma seminal presenta ambos beneficios el de mejorar la viabilidad y motilidad de las celulas espermaticas y el de estabilizar la membrana de estos (evitando de esa manera la capacitacion de las celulas espermaticas durante la recogida y el almacenamiento). Maxwell et al., Reprod. Fert. Dev. (1998) 10: 433-440. Los metodos para obtener plasma seminal son bien conocidos por los especialistas en la tecnica, como queda demostrado en la publicacion de Maxwell et al. El plasma seminal puede provenir del mismo mairnfero del que se obtuvo la muestra de semen, de un marnffero diferente de la misma especie o de un mamffero de diferente especie. Habitualmente, el porcentaje de plasma seminal estara en el intervalo entre aproximadamente 0,5 % (v/v) y aproximadamente 10 % (v/v). Si se usa en combinacion con una fuente proteica, como por ejemplo yema de huevo o leche, el porcentaje total de plasma seminal y fuente proteica estara en el intervalo entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 30 % (v/v). En dichas circunstancias, el porcentaje de plasma seminal sera inversamente proporcional al porcentaje de fuente proteica. Opcionalmente, el fluido de recogida puede tambien contener una diversidad de aditivos que son beneficiosos para la viabilidad o la motilidad de las celulas espermaticas.

Ejemplos de dichos aditivos incluyen, por ejemplo, una fuente de energfa, un antibiotico y una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion de intracelular o extracelular, cada uno de los cuales se ha analizado anteriormente con relacion a la recogida y dilucion de muestras. Dichos aditivos se pueden anadir al fluido de recogida de acuerdo con eso.

Alternativamente, y en lugar de usar un fluido de recogida, las celulas separadas se pueden recoger en un recipiente que contiene o esta recubierto con un criodiluyente utilizado en las etapas posteriores de crioconservacion. Las celulas clasificadas se recogen en un criodiluyente. En otro ejemplo, las celulas recogidas se clasifican en un criodiluyente comprende agua, Triladyl® (Minitube, Verona, Wl, que comprende glicerol, tris, acido cftrico, fructosa, 5 mg/100 ml de tirosina, 25 mg/100 ml de gentamicina, 30 mg/100 ml de espectinomicina, y 15 mg/100 ml de lincomicina), yema de huevo y acido piruvico. En otro ejemplo mas, el fluido de recogida es el criodiluyente que comprende 25 g de Triladyl®, 25 g de yema de huevo y 10 mM de acido piruvico en 75 ml de agua.

Se debe entender que las concentraciones porcentuales de protema en el fluido de recogida descritas en este documento son las previas al agregado de las celulas espermaticas separadas por flujo. El agregado de las celulas separadas por flujo diluira la concentracion final del fluido de recogida en aproximadamente 1/20 de la concentracion previa al agregado de las celulas separadas por flujo. Por lo tanto, en donde, por ejemplo, el fluido de recogida contiene aproximadamente 10 % (v/v) de yema de huevo, una vez que las celulas separadas por flujo se recogen en el recipiente de recogida que contiene el fluido de recogida, la concentracion final de yema de huevo se reducira a aproximadamente 0,5 % (v/v).

Pre-tratamiento de los dispositivos interceptores y/o recipientes de recogida

A fin de minimizar el posible dano a las partfculas (p. ej., celulas espermaticas) que se pueden separar, los dispositivos interceptores 2203 y/o recipientes de recogida 2207 (Fig. 56-60) se pueden tratar antes de su uso. Dicho tratamiento previo puede consistir en, por ejemplo, poner en contacto o sumergir los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida en un bano que contenga una preparacion que sirva para minimizar el impacto entre la partfcula y el dispositivo interceptor. Despues de retirar los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida del bano, una cierta cantidad de la preparacion permanecera en los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida y servira como agente tampon para las partfculas de las gotitas. La preparacion, por lo tanto, debe tener las caractensticas adecuadas para proporcionar el efecto tampon deseado. Ademas, la preparacion tambien debe ser compatible con la partfcula o celula que se va a separar, el fluido envolvente y el fluido de recogida. De acuerdo con estas consideraciones, la preparacion usada para tratar los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida puede contener un tampon, un fluido envolvente, un fluido de recogida, un criodiluyente, cualquier componente del fluido envolvente, del fluido de recogida y del criodiluyente, o cualquier combinacion de estos. Los tampones, soluciones tamponadas, fluidos envolventes y fluidos de recogida utilizados para la tincion y separacion de las celulas espermaticas se han descrito anteriormente. Por consiguiente, en un ejemplo, los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida estan en contacto (p. ej., sumergidos o frotados con) fluido envolvente. En otro ejemplo, los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida estan en contacto con el fluido de recogida. Aun En otro ejemplo, (os dispositivos interceptores y los recipientes de recogida estan en contacto con un criodiluyente que se describe a continuacion.

El contacto o inmersion de los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida con la preparacion debe producirse durante un penodo suficiente para permitir que la preparacion se adhiera a las superficies de los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida. Tal penodo es generalmente menor de aproximadamente 90 minutos, preferiblemente menor de aproximadamente 60 minutos, mejor si es entre aproximadamente 30 y

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aproximadamente 60 minutos, y mejor aun si es de aproximadamente 60 minutos. Todav^a En otro ejemplo, los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida estan solamente en contacto con la preparacion antes de su uso.

En lugar del contacto o en combinacion con el contacto de los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida con la preparacion antes descrita, los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida tambien se pueden poner en contacto con componentes espedficos contenidos en el fluido envolvente, el fluido de recogida, y/o el criodiluyente, como por ejemplo, BSA, SSS, yema de huevo, extracto de yema de huevo, leche (incluso leche homogeneizada por calor y descremada), extracto de leche, protema de soja, y extracto de protema de soja. En consecuencia, en un ejemplo, los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida se ponen en contacto con fluido envolvente y a continuacion con 0,1 % (v/v) de albumina de suero bovino. En otro ejemplo, los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida se ponen en contacto con fluido envolvente y a continuacion con 10 % (v/v) de yema de huevo. En otro ejemplo, los dispositivos interceptores y los recipientes se sumergen en fluido de recogida y a continuacion se ponen en contacto con 0,1 % (v/v) de albumina de suero bovino. En otro ejemplo, los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida se sumergen en fluido de recogida y a continuacion se ponen en contacto con 10 % (v/v) de yema de huevo.

A pesar de que los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida reciben el mismo tratamiento previo en cada ejemplo descrito anteriormente, es posible utilizar diferentes protocolos de tratamiento previo para los dispositivos interceptores y los recipientes de recogida. Asimismo, algunos de los dispositivos interceptores o recipientes de recogida pueden recibir un tratamiento previo y otros de los dispositivos interceptores o recipientes de recogida pueden recibir un tratamiento previo diferente. Ciertas ventajas del tratamiento previo tambien pueden obtenerse mediante el tratamiento previo solo de los dispositivos interceptores o solo de los recipientes de recogida.

Concentracion

Como se ha indicado anteriormente, el esperma separado recogido por el citometro de flujo se ha diluido mediante la adicion de diversas soluciones tamponadas y diluyentes, el lfquido de tincion, el fluido envolvente y el fluido de recogida. De manera caractenstica, la concentracion de celulas espermaticas despues de la separacion mediante citometna de flujo como se ha descrito anteriormente, se encuentra dentro del intervalo de 0,7-1,4 x 106 celulas espermaticas/ml aproximadamente. Por consiguiente, es importante concentrar las celulas espermaticas separadas para reducir al mmimo el choque por la dilucion del esperma y lograr la concentracion adecuada del esperma con fines de crioconservacion e inseminacion artificial. Una practica generalizada en la industria de cna, por ejemplo, es llevar a cabo la inseminacion artificial con esperma con una concentracion de aproximadamente 20 x 106 o aproximadamente 40 x 106 celulas espermaticas/ml. Una manera de concentrar las celulas espermaticas es centrifugar el lfquido recogido por el citometro. Otra manera de concentrar el esperma es pasar el lfquido recogido por el citometro a traves de un sistema de filtracion. Estos metodos se tratan con mayor detalle a continuacion.

A. Centrifugacion

Para concentrar el esperma se puede usar cualquier centnfuga convencional. Sin embargo en una actividad comercial es preferible usar una centnfuga que tenga la capacidad de centrifugar un lote grande de celulas espermaticas de una vez. Durante la centrifugacion la mayona de las celulas espermaticas se comprimiran formando un sedimento en el fondo del tubo de centnfuga como consecuencia de la fuerza centnfuga que actua sobre ellos. La magnitud de la fuerza centnfuga se establece convencionalmente como la cantidad de veces que la fuerza centnfuga sobrepasa la fuerza gravitacional. Dado que la fuerza centnfuga es el parametro cntico y debido a que la magnitud de la fuerza centnfuga a cualquier velocidad dada (velocidad angular) variara dependiendo de la longitud del radio de curvatura, la velocidad de centrifugacion se especifica habitualmente estableciendo la magnitud de la fuerza centnfuga. Por ejemplo, una fuerza de 600 g significa que la velocidad angular de la centnfuga se selecciona para que la fuerza centnfuga resultante sea 600 veces la fuerza de gravedad. La mayona de los lfquidos y todas las celulas espermaticas que no se hayan centrifugado para formar el sedimento quedan en el sobrenadante. En general, se extrae el sobrenadante y las celulas espermaticas del sedimento se resuspenden para su procesamiento adicional segun se describe mas adelante. Es importante maximizar el porcentaje de esperma concentrado en el sedimento, reduciendo al mmimo al mismo tiempo el dano a las celulas espermaticas.

De acuerdo con un ejemplo, un tubo de centnfuga que contiene aproximadamente 10 x 106 celulas espermaticas separadas se coloca en una centnfuga. Para facilitar la concentracion, los tubos de centnfuga se pueden usar como recipientes de recogida en el sistema de recogida del citometro. Esto evita la necesidad de transferir las celulas espermaticas separadas a un tubo de centnfuga antes de la centrifugacion. El tubo se centrifuga a una velocidad determinada y por un tiempo suficiente para permitir que se forme el sedimento de celulas espermaticas concentradas en el fondo del tubo. La velocidad y la duracion de la centrifugacion se seleccionan convenientemente teniendo en cuenta diversos factores, incluyendo: el hecho de que las celulas espermaticas son fragiles y la centrifugacion a una velocidad excesiva las puede danar; el tamano del tubo de centnfuga influye en el tiempo necesario para que las celulas espermaticas se muevan hacia el fondo el tubo; y hay mayor probabilidad de que las celulas espermaticas resulten danadas al centrifugarse a una velocidad determinada cuanto mas dure la centrifugacion. Por lo tanto, en un ejemplo el tubo de centrifuga se centrifuga a 550-800 g durante un periodo de

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aproximadamente 6-10 minutos. De acuerdo con otro ejemplo, el tubo de centrifuga se centrifuga a 650-750 g durante un periodo de aproximadamente 6-10 minutos. En otro ejemplo mas, el tubo de la centrifuga se centrifuga a 700g durante un periodo de aproximadamente 6-10 minutos. En otro ejemplo mas, el tubo de centrifuga se centrifuga a 700 g durante un periodo de aproximadamente 7 minutos.

Como se demuestra en los siguientes experimentos, la velocidad de la centrifuga y la duracion de la centrifugacion pueden afectar al porcentaje de celulas espermaticas recuperados y la motilidad de los mismos. Los experimentos se llevaron a cabo sin separar las celulas espermaticas efectivamente. En cambio, se anadieron a las muestras de semen diversos lfquidos como soluciones tamponadas, diluyentes, lfquidos de recubrimiento y un lfquido de tincion para simular el proceso de separacion. Las muestras despues se centrifugaron para intentar concentrar las celulas espermaticas.

Ejemplo I de centrifugacion

En el ejemplo I de centrifugacion se recogio semen bovino y se evaluo como se ha descrito anteriormente. La muestra de semen se diluyo con una cantidad de acido cftrico - Tris ("TCA") con un pH de 7,3 para obtener una concentracion de 150 x 106 celulas espermaticas/ml. Las celulas espermaticas se tineron con Hoechst 33342 (100 |iM) a 41°C durante veinte minutos. Se habfan preparado dos tubos de 15 ml con soluciones tamponadas para la simulacion. El tubo 1 estaba parcialmente lleno con 750 |il de solucion salina amortiguada con fosfato ("PBS") con 10% de yema de huevo y 14,25 ml de PBS con 0,1% de albumina serica bovina ("BSA"). El tubo 2 estaba parcialmente lleno con 750 |il de TCA con yema de huevo al 10% y 14,25 ml de PBS con BSA al 0,1%. Cada uno de los dos tubos recibio 100 |il de la solucion que contema las celulas espermaticas tenidos, que luego se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuacion los dos tubos se dividieron en dos alfcuotas de 7 ml cada una. Se centrifugo una alfcuota de cada tubo a 2250 rpm (aproximadamente 540 g) durante 7 minutos en una centrifuga de rotor de angulo fijo. La otra alfcuota de cada uno de los dos tubos se centrifugo a 2500 rpm (aproximadamente 660 g) durante 7 minutos. Inmediatamente despues de la centrifugacion, se utilizaron pipetas de 10 ml para extraer y guardar el sobrenadante de cada alfcuota. Los sedimentos se resuspendieron en 200 |il de TCA con yema de huevos al 10% (pH 7,0). Se observo la motilidad de las celulas espermaticas previa y posteriormente a la centrifugacion con un microscopio de contraste de fase. Se anadieron cincuenta |il de un fijador (0,1% de glutaraldehfdo en citrato de sodio al 3,4%) a cada sedimento y sobrenadante para inmovilizar el esperma para determinar la concentracion con un hemocitometro. La cantidad total de celulas espermaticas se calculo sobre la base del volumen usado/recuperado multiplicado por la concentracion correspondiente de esperma determinada por el hemocitometro. La tasa de recuperacion se calculo como la cantidad total de esperma en el sedimento dividido por la suma de la cantidad total de esperma en el sedimento y la cantidad total de esperma en el sobrenadante.

Los resultados, como se muestra en las Fig. 88 y 89 demuestran que la variacion de la velocidad de la centrifuga causa pocas diferencias en la motilidad de las celulas espermaticas. Los resultados tambien indican que la motilidad fue algo mejor al usar TCA en comparacion con PBS.

Ejemplo II de centrifugacion

En el ejemplo II de centrifugacion se recogieron y evaluaron muestras de semen de tres toros como se ha descrito anteriormente. Una de las muestras se descalifico por no cumplir con las normas de control de calidad iniciales. Las otras dos muestras de semen se diluyeron con una cantidad de TCA que tema un pH de 7,3 para obtener un esperma con una concentracion de 150 x 106 celulas espermaticas/ml. Las celulas espermaticas se tineron con Hoeschst 33342 10 |iM a 41°C durante veinte minutos. A cada uno de los tubos se agrego una solucion tamponada simulada que contema 1500 |il de PBS con 10% de yema de huevo y 28,3 ml de PBS con 0,1% de BSA. A cada tubo se anadieron doscientos |il de celulas espermaticas tenidos (30 x 106 celulas espermaticas) y se incubaron a temperatura ambiente durante veinte minutos. Se tomaron tres alfcuotas de 9 ml de la mezcla de semen de cada uno de los dos tubos para la centrifugacion. Una alfcuota de cada una de las dos muestras se centrifugo durante siete minutos en un tubo de centrifuga de 15 ml a cada una de las velocidades siguientes: 550 g; 650 g; y 750 g. Durante la centrifugacion la temperatura fue de 22°C. Inmediatamente despues de la centrifugacion se extrajo el sobrenadante con una pipeta de 10 ml, dejando aproximadamente 200-300 |il del sobrenadante en el sedimento. Los sedimentos se resuspendieron con 200 |il de TCA con 10% (v/v) de yema de huevo que tema un pH de 7,0, Se observo la motilidad del esperma previa y posteriormente a la separacion con un microscopio de contraste de fase. En las muestras de uno de los dos toros posteriormente a la centrifugacion se observo un grado importante de aglutinacion del esperma. Se anadieron cincuenta |il de un fijador (0,1% de glutaraldelmdo en citrato de sodio al 3,4%) al sobrenadante y al sedimento para inmovilizar al esperma para determinar su concentracion. La tasa de recuperacion se determino de acuerdo a la formula establecida en el experimento I de centrifugacion.

Los resultados se muestran en la Fig. 90. Los resultados indican que hay una mejor tasa de recuperacion de celulas espermaticas a 650 g que a 550 g. Sin embargo, hubo poca diferencia en la tasa de recuperacion entre 650 g y 750 g. No hubo ninguna diferencia significativa en la motilidad de las celulas espermaticas causada por la variacion de la velocidad de la centrifuga.

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Ejemplo III de centrifugacion

Para el ejemplo III de centrifugacion, se repitio basicamente el procedimiento del ejemplo II de centrifugacion con los mismos tres toros, otro dfa. Los resultados se muestran en la Fig. 91. Los resultados confirman que hay poca diferencia en la tasa de recuperacion a 650 g comparada con 750 g.

Ejemplo IV de centrifugacion

Se recogio semen de dos toros diferentes en dos dfas diferentes. El semen se transporto y se evaluo de la manera descrita anteriormente.

Sobre la base de la concentracion de esperma del semen sin tratar, las celulas espermaticas se diluyeron con acido cftrico-Tris (TCA, pH 7,3) mas piruvato 10 mM, hasta una concentracion de 150x106 celulas espermaticas/ml. Las celulas espermaticas se tineron con Hoechst 33342 10 |iM a 41°C durante 20 min. Despues de la tincion, 267 |il de la solucion que contema las celulas espermaticas tenidos se diluyeron hasta alcanzar una concentracion de 1x106 celulas espermaticas/ml mediante la adicion de las siguientes soluciones tamponadas simuladas: 2 ml de PBS con 10% (v/v) de yema de huevo; y 37,733 ml de PBS con 0,1% (p/v) de albumina serica bovina (BSA). Las celulas espermaticas tenidas y las soluciones tamponadas simuladas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Se tomaron cuatro alfcuotas de 9 ml de la mezcla de celulas espermaticas tenidos obtenidos de cada toro y las soluciones tamponadas simuladas. Las cuatro alfcuotas del primer toro se centrifugaron a combinaciones variables de velocidad y tiempo de la centnfuga en la siguiente secuencia:

(1) 700 g durante 7 minutos para la primera alfcuota;

(2) 700 g durante 10 minutos para la segunda alfcuota;

(3) 650 g durante 10 minutos para la tercer alfcuota; y

(4) 650 g durante 7 minutos para la cuarta alfcuota.

Las cuatro alfcuotas del segundo toro se centrifugaron a combinaciones variables de velocidad y tiempo de la centnfuga en la siguiente secuencia:

(1) 700 g durante 10 minutos para la primera alfcuota;

(2) 700 g durante 7 minutos para la segunda alfcuota;

(3) 650 g durante 10 minutos para la tercer alfcuota; y

(4) 650 g durante 7 minutos para la cuarta alfcuota.

Toda la centrifugacion se llevo a cabo en tubos de centnfuga de 15 ml en una centnfuga de rotor basculante (Allegra 6R, Beckman Coulter Inc. Fullerton, CA) a 22°C. El intervalo de tiempo entre la recogida de semen en la granja y la centrifugacion en el laboratorio fue de 4-5 horas. Inmediatamente despues de la centrifugacion, se extrajo el sobrenadante con pipetas de 10 ml, dejando ~250 |il de sobrenadante con cada uno de los sedimentos. Los sedimentos se resuspendieron en 250 |il de PBS de Dulbecco (pH 7,0). La motilidad del esperma y la motilidad progresiva se observaron mediante un analizador de motilidad Hamilton Thom (Hamilton-Thorn Motility Analyzer) (dos portaobjetos por muestra; dos camaras por portaobjetos) despues de la tincion pero antes de la centrifugacion y nuevamente despues de la centrifugacion. La concentracion del esperma se determino mediante la medicion con un hemocitometro de una alfcuota de unos 100 |il de la mezcla sin centrifugar de celulas espermaticas tenidos y soluciones tamponadas simuladas, que se habfa colocado en el congelador y una alfcuota de 10 |il del sedimento resuspendido mezclado con 90 |il de fijador (0,1% de glutaraldetndo en citrato de sodio al 3,4%). La tasa de recuperacion se determino de la misma forma que en el ejemplo I de centrifugacion. Los resultados se muestran en las Fig. 92 y 93.

Los datos indican que >85% de las celulas espermaticas pueden recuperarse despues de la centrifugacion a 650 g o 700 g, durante 7 o 10 minutos (Fig. 92). Sin embargo, la tasa de recuperacion fue algo mejor (95%) a 700 g. La disminucion en la motilidad despues de la centrifugacion (comparada con la motilidad antes de la centrifugacion) en todos los tratamientos podna deberse a la presencia de celulas espermaticas muertas/anomalas/fragiles que podnan no resistir la agresion de la fuerza centnfuga. La motilidad del esperma descendio en un 10-14% (Fig. 93) en todos los tratamientos. La disminucion mayor en la motilidad del esperma (14%) a 650 g durante 7 minutos podna deberse a la exposicion mas larga del esperma a la solucion tamponada simulada cuando se llevo a cabo la centrifugacion a 650 g despues de 700 g. La centrifugacion no mostro ningun efecto adverso sobre la motilidad progresiva de las celulas espermaticas, mas bien hubo una mejona de alrededor de 2-3%.

Ejemplo V de centrifugacion

Se recogio el semen de un toro en dos dfas diferentes. El semen se evaluo, se diluyo y se tino con Hoechst 33342 y se diluyo posteriormente con soluciones tamponadas simuladas segun se describe en el ejemplo IV de centrifugacion. Para cada una de las muestras de semen se obtuvieron cuatro alfcuotas de 9 ml de la mezcla de celulas espermaticas tenidos y soluciones tamponadas simuladas. Las alfcuotas de la primera muestra se

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centrifugaron a una de las siguientes combinaciones de velocidad y tiempo de la centnfuga en la siguiente secuencia:

(1) 750 g durante 10 minutes para la primera alteuota;

(2) 750 g durante 7 minutes para la segunda alteuota;

(3) 700 g durante 10 minutes para la tercer alteuota; y

(4) 700 g durante 7 minutes para la cuarta alteuota.

Para las alteuotas obtenidas de la segunda muestra, las combinaciones de velocidad y tiempo de la centnfuga fueron las mismas, pero la secuencia se modifico del siguiente modo:

(1) 750 g durante 7 minutos para la primera alteuota;

(2) 750 g durante 10 minutos para la segunda alteuota;

(3) 700 g durante 7 minutos para la tercer alteuota; y

(4) 700 g durante 10 minutos para la cuarta alteuota.

La centrifugacion se llevo a cabo en un tubo de centnfuga de 15 ml en una centnfuga de rotor basculante (Allegra 6R, Beckman Coulter Inc. Fullerton, CA) a 22°C. El intervalo entre la recogida de semen en la granja y la centrifugacion en el laboratorio fue de 6,5 horas aproximadamente para la primera muestra y de 4 horas aproximadamente para la segunda muestra. El procedimiento posterior a la centrifugacion, es decir, la extraccion del sobrenadante, la resuspension del sedimento, la determinacion de la concentracion del esperma y la estimacion de la motilidad con el analizador de motilidad Hamilton-Thorn (Hamilton-Thorn Motility Analyzer), se llevo a cabo siguiendo el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo IV. Los resultados se muestran en las Fig. 94 y 95.

Los resultados muestran que >85% de la poblacion de esperma en una suspension sumamente diluida puede recuperarse con 700 g o 750 g en 7 minutos o 10 minutos (Fig. 94). Un aumento de la fuerza g a 750 g no mejoro significativamente la tasa de recuperacion. Como el caso en el ejemplo IV de centrifugacion, en todos los tratamientos se observo disminucion en la motilidad despues de la centrifugacion (en comparacion con la motilidad antes de la centrifugacion). En el experimento actual, la motilidad del esperma descendio aproximadamente 13-20% (Fig. 95), que es un porcentaje un poco mayor que el del ejemplo IV de centrifugacion. La variacion podna deberse a la variacion en la muestra de semen y al mayor intervalo de tiempo desde la recogida del semen hasta la centrifugacion (6 horas) en una muestra. Como se explico en el ejemplo IV, la disminucion en la motilidad del esperma (aproximadamente 20%) con la centrifugacion a baja velocidad (700 xg, durante 7 o 10 min.) podna deberse a la mayor exposicion del esperma a la solucion tamponada simulada cuando se centrifugo despues de la centrifugacion a 750 g. La disminucion en la motilidad progresiva fue insignificante (1-5%).

B. Centrifugacion secundaria

Para recuperar el esperma que de otro modo se podna perder en el sobrenadante, es posible centrifugar el sobrenadante despues que este se ha separado del sedimento. Sin adherirse a una teona en particular, los solicitantes creen que la interfase sedimento/sobrenadante impide el movimiento de las celulas espermaticas dentro del sedimento. La extraccion de la interfase mediante la separacion del sedimento del sobrenadante permitira que la centrifugacion adicional del sobrenadante provoque la formacion de un segundo sedimento con las celulas espermaticas que hubieran quedado en el sobrenadante. El segundo sedimento se puede resuspender y agregar al esperma resuspendido del primer sedimento.

C. Filtracion

La filtracion es un metodo de concentracion alternativo que se puede usar para evitar la perdida de celulas espermaticas en el sobrenadante. Como se muestra en la Fig. 96, de acuerdo con un ejemplo, un filtro 2415 se incorpora en un recipiente de recogida 2403. Es deseable que el tamano de los poros en el filtro este dentro del intervalo de aproximadamente 0,2 -1 micrometro. Tambien es deseable que el filtro no sea un filtro de profundidad (por ejemplo, un filtro que tenga pasajes tortuosos en los que puedan quedar atrapadas las colas de las celulas espermaticas). Mas bien es deseable que el filtro sea lo mas delgado posible. Por ejemplo, es deseable que el filtro tenga un grosor de 50 |im a 500 |im; es mas deseable que el grosor sea de 75 |im a 250 |im; y aun es mas deseable que el grosor del filtro sea de 100 |im a 150 |im. Se aplica vacte de nivel bajo 2417 para extraer los fluidos a traves del filtro cuando se recogen las gotitas 33. Es importante usar vacte de nivel bajo (menos de 20 pulgadas de mercurio (0,6906 kg/cm2), por ejemplo, 15 pulgadas de mercurio (0,5179 kg/cm2) para evitar infligir dano a las celulas espermaticas. En un ejemplo el vacte es lo bastante bajo como para que la velocidad de extraccion del lfquido sea de aproximadamente 1,0 ml/15 segundos. De acuerdo con otro ejemplo, el vacte se aplica intermitentemente para permitir que las celulas espermaticas se recuperen. En otro ejemplo, el filtro 2415 esta construido de un material que es compatible con las celulas espermaticas, si bien no tiene ninguna afinidad de union a ellos. Al finalizar la separacion, aproximadamente 80-90% de los lfquidos se habran extratelo a traves del filtro. Sin embargo, queda suficiente lfquido (aproximadamente 10-20%) para que las celulas espermaticas se acumulen en una suspension concentrada 2405, impidiendo de ese modo que las celulas espermaticas formen una torta de filtracion. La suspension concentrada se puede transferir a otro recipiente 2419, como se muestra en la Fig. 97 por

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ejemplo. Se puede usar un mecanismo de jeringa 2409 con un filtro de la punta de la canula 2411 para extraer una parte del lfquido remanente de este recipiente 2419. Sin embargo, en el recipiente quedan lfquidos suficientes para evitar que las celulas espermaticas formen una torta en el filtro 2411. Se aplican las mismas consideraciones al filtro de la punta de la canula 2411 que al filtro 2415 del recipiente de recogida. Por lo tanto, es deseable que el tamano de poro del filtro de la canula 2411 vane entre 0,2 y 1,0 micrometros aproximadamente y que el filtro de la canula sea relativamente fino para evitar que las colas de las celulas espermaticas queden atrapadas en los tortuosos pasajes del filtro. Por ejemplo, un filtro de punta de jeringa de fibra de polipropileno hueco DynaGard®, que se encuentra disponible comercialmente de los Laboratorios Spectrum, Inc. de Rancho Dominguez, CA, se puede usar para el filtro de la punta de la canula. Como se muestra en la Fig. 98, se vierte un lfquido de resuspension 2413 a traves del filtro de la punta de la canula para lavar las celulas que pueden estar adheridas a la superficie del filtro y devolverlas a la suspension. El lfquido de resuspension puede contener una cantidad del lfquido filtrado y/o un diluyente apropiado. Despues de efectuar un retrolavado a traves del filtro con una cantidad de lfquido de resuspension suficiente para extraer las celulas espermaticas del filtro, se puede agregar lfquido de resuspension adicional si se desea. La cantidad total de lfquido de resuspension se selecciona para llevar la concentracion a un valor deseado (por ejemplo, aproximadamente 20 x 106 celulas espermaticas/ml). Por lo tanto, el proceso de filtracion de este ejemplo es un proceso en tres etapas que incluye el uso de un filtro en el recipiente de recogida, la filtracion mediante un filtro de la canula y la resuspension para obtener la concentracion deseada.

En un proceso alternativo de filtracion en dos etapas, se combinan el primero y el segundo etapa del proceso en tres etapas descrito anteriormente para que la extraccion de todo el lfquido sea a traves de un filtro de la canula. En este proceso las celulas espermaticas separadas se dirigen a un recipiente de recogida que no tiene filtro. Los lfquidos se extraen por medio de vacfo de bajo nivel y/o vacfo intermitente como se ha descrito anteriormente, que se aplica a traves del filtro de la punta de la canula 2411. Cuando las celulas espermaticas estan formando parte de una suspension concentrada, se hace un retrolavado con un lfquido de resuspension, como por ejemplo un diluyente, a traves del filtro de la canula para obtener la concentracion deseada de celulas espermaticas.

Ejemplo I de filtracion

El ejemplo I de filtracion muestra la tasa de recuperacion y la motilidad de las celulas espermaticas despues de la concentracion mediante un proceso de filtracion en tres etapas. Se recogieron muestras de semen de tres toros y se evaluaron segun lo estipulado anteriormente en la seccion de preparacion de muestras. Una de las tres muestras de semen se descalifico por no satisfacer los criterios de calidad iniciales mmimos. Las dos muestras restantes se diluyeron con una cantidad de TCA (pH 7,3) adecuada para obtener una concentracion de 150 x 106 celulas espermaticas/ml. Se anadieron quinientos |il de PBS con 10% de yema de huevo y 9,5 ml de PBS con 0,1% de BSA a cada uno de dos tubos de ensayo de 15 ml. A cada tubo de ensayo se anadieron sesenta y siete |il de la muestra de semen (aproximadamente 10 x 106 celulas espermaticas) y se incubaron durante veinte minutos a temperatura ambiente. Con referencia a la Fig. 99, se uso una bomba de vacfo 2427 para aplicar presion negativa para extraer una alfcuota de cuatro ml del semen diluido 2423 a traves de un filtro 2425. El filtrado 2429 se recogio en una jeringa 2421. Despues de la filtracion las celulas espermaticas que quedaron en el filtro se retrolavaron con 1 ml de solucion tamponada TCA en un tubo de 15 ml. La motilidad del esperma se evaluo visualmente. Las muestras se mezclaron con un fijador (0,1% de glutaraldehudo en citrato de sodio al 3,4%) antes y despues de la filtracion para inmovilizar las celulas espermaticas. La concentracion del esperma se determino usando un hemocitometro. El numero total de celulas espermaticas se calculo sobre la base del volumen multiplicado por la concentracion de celulas espermaticas. La tasa de recuperacion se calculo como el numero total de celulas espermaticas en la porcion a la que se efectuo el retrolavado dividida por el numero total de celulas espermaticas en la alfcuota antes de la filtracion. El proceso se repitio con un filtro diferente. El experimento ensayo los dos filtros siguientes: (1) un filtro (jeringa) de disco de membrana de 1,0 |im de PTFE (no FTPE) (que comercializa Pall Corporation, Life Science Group, Ann Arbor, MI, Cat N° PN4226T o VWR, Batavia, IL, Cat. N° 28143-928); y (2) filtro (jeringa) de disco de membrana de 0,8 SFCA (acetato de celulosa sin surfactante) (Corning, Inc., Corning, NY, Cat. N° 431221; VWR Batavia, IL, Cat. N° 28200-028). Los resultados se muestran en la Fig. 101. Se recuperaron mas celulas espermaticas con filtros de acetato de celulosa en comparacion con el filtro de PTFE, es decir 67 frente a 33% debido a las protemas de baja afinidad de union del acetato de celulosa. La motilidad visual de las celulas espermaticas recuperados fue del 63% (PTFE) al 68% (acetato de celulosa).

Ejemplo II de filtracion

El ejemplo II de filtracion muestra la tasa de recuperacion y la motilidad de las celulas espermaticas despues de la concentracion mediante un proceso de filtracion en dos etapas. Se recogieron muestras de semen de tres toros y se evaluaron segun lo estipulado anteriormente en la seccion anterior de preparacion de muestras. Las tres muestras se diluyeron con una cantidad de TCA (pH 7,3) adecuada para obtener una concentracion de 150 x 106 celulas espermaticas/ml. A cada uno de los 50 tubos de ensayo se agrego un ml y medio de PBS con 10% de yema de huevo y 28,3 ml de PBS con 0,1% de BSA. Se anadieron doscientos |il de la muestra de semen (aproximadamente 30 x 106 celulas espermaticas) a cada tubo de ensayo y se incubaron durante treinta minutos a temperatura ambiente. Con referencia a la Fig. 100, se utilizo una jeringa 2431 para aplicar presion negativa para extraer una alfcuota de 6 ml del semen diluido 2433 de cada tubo de ensayo a traves de un filtro 2435. El filtro se coloco en un soporte del filtro 2437 (un soporte de filtro Swinnex de Millipore Corporation, Billerica, MA Cat N° SX0002500,).

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Despues de la filtracion, el soporte de filtracion 2437 se desconecto de la jeringa y el tubo, conservando intacto el soporte del filtro.

Las celulas espermaticas en el filtro se recogieron invirtiendo la parte superior del ensamblaje del filtro y retrolavando con 1 ml de solucion tamponada TCA empleando una jeringa de 3 ml que tema un trozo pequeno de tubo en la punta de un tubo de ensayo de 15 ml. La motilidad del esperma se evaluo visualmente. Las muestras se mezclaron con un fijador (0,1% de glutaraldelddo en citrato de sodio al 3,4%) antes y despues de la filtracion para inmovilizar las celulas espermaticas. La concentracion de celulas espermaticas se determino usando un hemocitometro. El numero total de celulas espermaticas y la tasa de recuperacion se calcularon como se especifica en el ejemplo I de filtracion. El proceso se repitio dos veces para ensayar filtros diferentes. El experimento ensayo los dos filtros siguientes: (1) un filtro de membrana de Teflon de 0,2 |im (disponible en el mercado en X-Partek, P.J Cobert Associates Inc. St. Louis Cat. N° 944106; y (2) un filtro de membrana de acetato de celulosa de 0,8 (Millipore Corporation, Billerica, MA Cat. N° AAWP 02500). Los resultados se muestran en la Fig. 102. La tasa de recuperacion de celulas espermaticas fue baja en ambos filtros (~25%). En el filtro de teflon fue baja como en el ejemplo I. Sin embargo, la baja tasa de recuperacion y poca motilidad visual de las celulas espermaticas a los que se les efectuo el retrolavado en el filtro de acetato de celulosa podna deberse al material usado por diferentes proveedores y/o a la capacidad de las celulas espermaticas de unirse al soporte/ montaje del filtro.

D. Concentracion de medio denso

Otro metodo alternativo para concentrar las celulas espermaticas recogidas depende de la flotacion de las celulas espermaticas en un medio de alta densidad. Segun este metodo, se anade un medio de alta densidad a las celulas espermaticas recogidas para elevar el peso espedfico de la suspension por encima de aproximadamente 1,3. Por ejemplo, para aumentar el peso espedfico de la suspension se puede usar una suspension de sflice coloidal tal como esta disponible comercialmente de las marcas registradas Percoll® e Isolate®. Las celulas espermaticas flotaran en la parte superior de la suspension, donde pueden separarse o recogerse de otro modo, debido al mayor peso espedfico de la suspension. A las celulas que se han recogido de la superficie se les agrega un lfquido de resuspension para llevar la concentracion final a aproximadamente 20 x 106 celulas espermaticas/ml. Parte del lfquido de suspension puede extraerse por uno de los metodos de filtracion descritos anteriormente antes del agregado del medio de alta densidad para reducir la cantidad de medio de alta densidad necesario para obtener el peso espedfico deseado.

Criodilucion

A. Crioproteccion

Una vez que el esperma se separo y recogio en los recipientes de recogida, se puede usar para inseminar hembras de mairnferos. Esto puede ocurrir casi de inmediato, requiriendo poco tratamiento adicional del esperma. Asimismo, el esperma tambien se puede enfriar o congelar para usar en una fecha posterior. En tales casos, puede ser beneficioso administrar un tratamiento adicional al esperma para reducir al mmimo la repercusion sobre la viabilidad o la motilidad posterior a la descongelacion como resultado de la refrigeracion y la congelacion.

En general, un criodiluyente consiste en un tampon o solucion amortiguada, una fuente proteica y un crioprotector. Antes se dieron ejemplos de tampones y soluciones amortiguadas que se pueden usar en el criodiluyente en lo que se refiere a la recogida y dilucion de las muestras. Habitualmente estos tampones tendran una concentracion de aproximadamente 0,001 M a aproximadamente 1,0 M y su pH es entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 8,5; preferiblemente de aproximadamente 7,0.

Si esta incluida, se puede agregar una fuente proteica para proporcionar sustento a las celulas y para amortiguar el contacto de las celulas con el recipiente de recogida. La fuente proteica puede ser cualquier fuente proteica que no interfiera con la viabilidad de las celulas espermaticas y sea compatible con el tampon o solucion amortiguada particular que se utilice. Algunos ejemplos de fuentes proteicas son la leche (incluso la homogeneizada por calor y la descremada), el extracto lacteo, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la protema de soja y el extracto de protema de soja. Tales protemas se pueden encontrar en una concentracion entre aproximadamente 10% (v/v) y aproximadamente 30% (v/v), preferiblemente entre aproximadamente 10 % (v/v) y aproximadamente 20 % (v/v) y mejor si es de aproximadamente 20 % (v/v). Aunque la leche se puede usar en combinacion con un tampon o solucion amortiguada, en general se usa a falta de estos, ya que la leche misma es una solucion que se puede utilizar para los mismos fines que un tampon o solucion amortiguada. En tales casos, el criodiluyente contendna entre aproximadamente 80 % (v/v) y aproximadamente 90 % (v/v) de leche.

Preferiblemente se incluye un crioprotector en el criodiluyente para reducir o evitar el choque frio y para conservar la fecundidad del esperma. En el medio se conocen numerosos crioprotectores. La seleccion de un crioprotector apropiado para usar con un diluyente determinado puede variar y depende de la especie de la que se obtuvo el esperma congelado. Algunos ejemplos de crioprotectores apropiados son, por ejemplo, el glicerol, el dimetil sulfoxido, el etilenglicol, el propilenglicol, la trehalosa, Triladyl® y combinaciones de estos. Si estan incluidos, en general, estos crioprotectores estan presentes en el criodiluyente en una cantidad de entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 15 % (v/v), preferiblemente en una cantidad entre aproximadamente 5 % (v/v) y

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aproximadamente 10 % (v/v), mejor si es entre aproximadamente 7 % (v/v), y lo mejor es que este presente en una cantidad de aproximadamente 6 % (v/v).

En un ejemplo particular, el criodiluyente comprende agua, Triladyl®, yema de huevo y acido piruvico. En otro ejemplo mas, el criodiluyente comprende 25 g Triladyl ®, 25 g de yema de huevo y acido piruvico 10 mM en 75 ml de agua.

Opcionalmente, el criodiluyente tambien puede contener una variedad de aditivos que son beneficiosos para la viabilidad o motilidad del esperma y que evitan o reducen los efectos colaterales perjudiciales de la crioconservacion. Entre dichos aditivos se encuentran, por ejemplo, una fuente de energfa, un antibiotico o una preparacion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion dentro de la celula o del medio celular, cada uno de los cuales se trata antes con relacion a la recogida y dilucion de muestras. Dichos aditivos se pueden agregar al criodiluyente de acuerdo con eso.

B. Crioconservacion de celulas espermaticas separadas

En la mayona de los casos, no es posible usar de inmediato las celulas espermaticas que se separaron como se ha descrito anteriormente para la inseminacion artificial. En el caso espedfico de una aplicacion de clasificacion de esperma para uso comercial, las celulas espermaticas separadas se deben almacenar y/o transportar antes de que se puedan usar en inseminacion artificial. Esto generalmente requiere la crioconservacion de las celulas espermaticas. El esperma separado se puede cargar en cilindros alargados (conocido como "pajitas" en la industria de cna) y se lo somete a la crioconservacion para protegerlo durante el transporte y el almacenamiento. Las celulas espermaticas sometidas a la crioconservacion se pueden almacenar durante penodos largos en nitrogeno lfquido. Para usar el esperma sometido a crioconservacion, se puede sumergir la pajita en un bano de agua caliente para descongelarlo. Luego la pajita se carga en una pistola de inseminacion artificial que se usa para inseminar a una hembra. Se deben tomar varias precauciones para proteger a las celulas espermaticas durante el proceso de crioconservacion. De otro modo las celulas espermaticas resultaran tan danados (como lo indica una tasa baja de motilidad posterior a la descongelacion, del 5-10%) que no seran adecuados para usaren inseminacion artificial.

Los metodos convencionales de crioconservacion consisten en agregar secuencialmente una fuente proteica (por ejemplo, yema de huevo), enfriar el esperma a una temperatura de aproximadamente 4-5°C, agregar un crioprotector (por ejemplo, glicerol), mantener al esperma y al crioprotector a una temperatura constante en el intervalo de 4-5°C aproximadamente durante un penodo suficiente para permitir que las celulas espermaticas se equilibren con el crioprotector y despues sobreenfriar el esperma, por ejemplo sumergiendo las celulas espermaticas en nitrogeno lfquido a -196°C para el almacenamiento. Los especialistas en la tecnica saben que la finalidad de la fuente proteica es proteger al esperma del dano cuando se lo enfna desde aproximadamente 14°C hasta aproximadamente 8° C, que es la temperatura a la que las celulas espermaticas son mas susceptibles al choque fno. En contraposicion, el crioprotector protege a las celulas espermaticas del dano a temperaturas inferiores a 0o C. Aun cuando las temperaturas que se emplean en la crioconservacion son muy inferiores a la congelacion y el termino "congelacion" a veces se emplea para describir la crioconservacion, los especialistas en la tecnica tambien saben que el esperma crioconservado no esta realmente congelado. Para ser precisos, el esperma crioconservado esta en un estado sobreenfriado. El penodo convencional durante el cual las celulas espermaticas y el crioprotector se mantienen a una temperatura constante puede durar desde 60 minutos hasta muchas horas. El tiempo total que lleva completar la crioconservacion utilizando los metodos convencionales en general supera las cuatro horas Ademas, se cree que hasta 50% de las celulas espermaticas mueren durante los procesos convencionales de crioconservacion. Aunque el esperma se crioconserva utilizando metodos convencionales de acuerdo con algunos ejemplos, otros ejemplos pueden emplea metodos mejorados de crioconservacion que permiten reducir el tiempo que requiere el proceso y/o mejorar la salud del esperma crioconservado.

La Fig. 103 muestra un diagrama de flujo de trabajo que describe las etapas de un ejemplo ejemplar de un metodo mejorado de crioconservacion de esperma. En el etapa 2501, la concentracion de una solucion que contiene celulas espermaticas separados se ajusta para quedar dentro del intervalo de 1 millon - 40 millones de celulas espermaticas/ml aproximadamente, dependiendo de la norma que use el consumidor final (por ejemplo, asociacion de cna). Por ejemplo, la concentracion de esperma puede ajustarse para quedar en el intervalo de 20 millones a 24 millones de celulas espermaticas/ml aproximadamente. El ajuste de la concentracion de esperma puede incluir la adicion de lfquido de resuspension, soluciones tamponadas y/o diluyentes al esperma concentrado, como se ha descrito anteriormente. En el etapa 2503, se anade un crioprotector (por ejemplo, glicerol) antes de que el esperma se enfne. Las celulas espermaticas comienzan a equilibrarse con el crioprotector en cuanto entran en contacto con este. En el etapa 2505 tambien se anade una fuente proteica (por ejemplo, yema de huevo) a la solucion que contiene las celulas espermaticas como se ha descrito anteriormente.

La solucion con las celulas espermaticas, la fuente proteica y el crioprotector se carga en pajitas convencionales de inseminacion artificial de 0,5 o 0,25 ml utilizando un equipo de carga convencional en el etapa 2507. Los especialistas en la tecnica conocen una cantidad de equipos y tecnicas convencionales que se pueden usar para cargar semen en las palillas. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N° 5.249.610, otorgada a Cassou, et al. expedida el 5 de octubre de 1993 e incorporada en este documento por referencia, proporciona instrucciones sobre

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el relleno de las pajitas con semen bovino utilizando una boquilla inyectora desechable. Es mas, Minitube de America, ubicada en Verana Wl comercializa el equipo para llenar las pajitas. Para cargar las celulas espermaticas separadas en las pajitas se puede utilizar cualquiera de estos metodos de carga o equipos convencionales o similares.

Despues de la carga, las celulas espermaticas se enfnan hasta una temperatura de mantenimiento en el etapa 2509. En general, la temperatura de mantenimiento se selecciona teniendo en cuenta lo siguiente: mantener a las celulas espermaticas a una temperatura demasiado alta (por ejemplo, 10°C) puede causar dano innecesario por choque fno; se cree que el equilibrado de las celulas espermaticas con un crioprotector (por ejemplo, glicerol) es mas activa a temperaturas de 4-5°C; y se cree que mantener a las celulas espermaticas a temperaturas demasiado bajas (por ejemplo, < 0°) los dana. De este modo, de acuerdo con un ejemplo, la temperatura de mantenimiento debe estar en el intervalo de 0-8°C. Es mejor si la temperatura de mantenimiento esta en el intervalo de 2-6°C. Es aun mejor si la temperatura de mantenimiento esta en el intervalo de 4-5°C. En otro ejemplo, la velocidad de refrigeracion que se usa para este etapa 2509 se selecciona para reducir al mmimo el dano a las celulas espermaticas. Por ejemplo, se puede controlar la velocidad de refrigeracion (es decir, practicamente constante) para proporcionar un refrigeracion homogeneo y evitar que el esperma sufra el choque termico. La velocidad de refrigeracion tambien debe enfriar al esperma lo suficientemente rapido para reducir su metabolismo antes de que la membrana sufra dano, pero lo suficientemente lento como para que no sufra choque termico. Se puede controlar la velocidad de refrigeracion colocando las pajitas que contienen las celulas espermaticas en un congelador programable (por ejemplo, un congelador 1810CD IceCube que esta disponible comercialmente de Minitube de America, ubicado en Verana, Wl) para enfriarlos. Segun un ejemplo, el congelador programable enfna al esperma que esta a la temperatura ambiente aproximadamente (habitualmente entre 22 y 24°C) a una velocidad de refrigeracion constante de 0,1 y 0,3°C/minuto. Es mejor si la velocidad de refrigeracion es de aproximadamente 0,15 y 0,25°C/min. Es mejor aun si la velocidad de refrigeracion es de aproximadamente 0,2°C/min. En otro ejemplo, se selecciona la velocidad de refrigeracion para enfriar el esperma de su temperatura inicial hasta la temperatura de mantenimiento en 90 minutos aproximadamente. En otro ejemplo mas, se selecciona la velocidad de refrigeracion para enfriar el esperma desde su temperatura inicial hasta la temperatura de mantenimiento a una velocidad de refrigeracion constante en aproximadamente 90 minutos. Las velocidades de refrigeracion mencionadas anteriormente se refieren en realidad a la velocidad de refrigeracion de la camara del congelador programable, pero debido a las paredes finas y a la forma larga, delgada de la pajita (es decir, aproximadamente 5,25 pulgadas (13,33 cm) de largo , menos de 3 mm de diametro y aproximadamente 0,15 mm de espesor de la pared) y a las propiedades conductoras de la pajita, la diferencia de temperatura entre las celulas espermaticas y la camara de refrigeracion no es significativa.

Despues de que las celulas espermaticas se hayan refrigerado hasta alcanzar la temperatura de mantenimiento, en el etapa 2511 se mantienen a esa temperatura o a una temperatura proxima durante un penodo para permitir completar sustancialmente su equilibrado con el crioprotector. Por ejemplo, el congelador programable descrito anteriormente se puede programar para mantener a las celulas espermaticas a una temperatura constante durante el penodo. De acuerdo con otro ejemplo, las celulas espermaticas se mantienen a la temperatura de mantenimiento durante un penodo mas corto en comparacion con los metodos convencionales porque ya se equilibraron con el crioprotector durante el proceso de refrigeracion. Por ejemplo, el penodo puede variar entre 10 y 60 minutos. Es mejor si el penodo vana entre 20 y 40 minutos. Es mejor aun si el penodo es de aproximadamente 30 minutos. En otro ejemplo el penodo es inferior a 60 minutos. En otro ejemplo mas, el penodo es inferior a 40 minutos. El penodo de mantenimiento relativamente corto ofrece varias ventajas en un proceso comercial de separacion de esperma. En primer lugar, reduce el tiempo requerido para procesar el esperma separado, que puede traducirse en el ahorro en los costos. Ademas, las celulas espermaticas todavfa llevan a cabo procesos metabolicos a temperaturas en el intervalo de 0-8°C, de modo que reducir el tiempo en que las celulas espermaticas deban mantenerse a esta temperatura puede mejorar su salud, lo que aumenta su valor para los criadores de animales, que estan interesados en los indices de acierto de la inseminacion artificial.

Despues de mantener las celulas espermaticas a la temperatura de mantenimiento durante un penodo como se describio antes, en la etapa 2513 se enfnan hasta una temperatura que se acerca a la zona de temperatura cntica de crioconservacion. Los especialistas en la tecnica saben que la zona de temperatura cntica es la zona en la que la formacion de cristales de hielo y los cambios en la presion osmotica danan a las celulas espermaticas. Esta temperatura puede variar dependiendo de la solucion que se use en la crioconservacion de las celulas espermaticas, pero la zona de temperatura cntica generalmente se encuentra en el intervalo comprendido entre -18 y -35°C. Algunas veces se informa que esta zona de temperatura cntica se encuentra en el intervalo comprendido entre -18 y -30°C aproximadamente. De este modo, de acuerdo con otro ejemplo mas, la velocidad de refrigeracion utilizada para enfriar las celulas espermaticas desde la temperatura de mantenimiento hasta una temperatura que se aproxime a -18°C (por ejemplo, -15°C) se selecciona para proteger la salud del esperma. Los factores pertinentes a considerar incluyen el hecho de que las celulas espermaticas aun se estan equilibrando con el crioprotector durante este penodo, el hecho de que aun llevan a cabo algunas funciones metabolicas y el hecho de que todavfa son un poco sensibles al cambio rapido de temperatura. Nuevamente, es deseable que la velocidad de refrigeracion sea una velocidad controlada, como una velocidad que se puede programar en el congelador programable descrito anteriormente. Es mejor si la velocidad de refrigeracion que se utiliza para enfriar el esperma desde la temperatura de mantenimiento hasta una temperatura que se aproxima a -18°C aproximadamente es una velocidad de refrigeracion constante. De este modo, de acuerdo con otro ejemplo, las celulas espermaticas se enfnan de la

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temperatura de mantenimiento hasta aproximadamente -15°C a una velocidad de refrigeracion en el intervalo de 1,0 - 5,0°C/min aproximadamente. La etapa 2515 implica refrigerar rapidamente las celulas espermaticas a traves de la zona de temperatura cntica para limitar el tiempo que las celulas espermaticas permanecen allt Por lo tanto, de acuerdo con un ejemplo, la velocidad de refrigeracion a traves de la zona de temperatura cntica (por ejemplo, -18°C hasta aproximadamente -30°C) se selecciona para que sea mucho mas rapida que la velocidad de refrigeracion utilizada para enfriar a las celulas espermaticas hasta la temperatura de mantenimiento y la velocidad de refrigeracion utilizada para enfriar a las celulas espermaticas hasta la temperatura proxima a la zona de temperatura cntica. Por lo tanto, es deseable que la velocidad de refrigeracion mas marcada se encuentre en el intervalo de aproximadamente 8-40° por minuto. Es mejor si la velocidad de refrigeracion mas marcada se encuentra en el intervalo de aproximadamente 8-12°C por minuto. Es mejor aun si la velocidad de refrigeracion mas marcada es de aproximadamente 10°C por minuto. El intervalo de temperatura en el que se usa la velocidad de refrigeracion mas marcada puede ir mas alla de la zona de temperatura cntica. De ese modo, en otro ejemplo mas, las celulas espermaticas se enfnan a una de las velocidades de refrigeracion mas marcadas descritas antes, de aproximadamente -15°C a aproximadamente -40°C. En otro ejemplo, las celulas espermaticas se enfnan a una de las velocidades de refrigeracion mas marcadas descritas antes, de aproximadamente -15°C a aproximadamente - 80°C. La etapa de refrigerar el esperma a traves de la zona de temperatura cntica a una velocidad mas marcada se puede conseguir en el congelador programable descrito anteriormente.

Despues de que las celulas espermaticas se hayan refrigerado por debajo de la zona de temperatura cntica (por ejemplo, hasta -80°C), en el etapa 2517 las pajitas que contienen las celulas espermaticas separados se sumergen en nitrogeno lfquido (-196°C) para proporcionar la maxima vida util a las celulas espermaticas separados. El uso de nitrogeno lfquido para almacenar celulas espermaticas crioconservados esta generalizado en la industria de cna de animales en el contexto de celulas espermaticas sin separar. Por lo tanto, los especialistas en la tecnica estaran familiarizados con tecnologfas que incluyen el transporte y almacenamiento de esperma en nitrogeno lfquido, por lo que no es necesario tratarlo minuciosamente en este documento. Es suficiente senalar que se dispone de recipientes convencionales para almacenar a largo plazo cantidades a granel de pajitas de inseminacion artificial en nitrogeno lfquido y que tambien se dispone de recipientes mas pequenos y portatiles para almacenar las pajitas de inseminacion artificial en nitrogeno lfquido para el transporte a los clientes y/o el transporte a un establecimiento agropecuario que tenga una o mas hembras para inseminar con esperma crioconservado.

Una ventaja de los metodos de crioconservacion descritos en este documento es que la crioconservacion se puede llevar a cabo en menos tiempo que el que se requiere segun los metodos convencionales. Quizas relacionado con esto, la disminucion de la motilidad debida a la crioconservacion es solo aproximadamente del 5-11%, como lo indica el ejemplo que se trata a continuacion. Por lo tanto, la crioconservacion conserva sanas las celulas espermaticas como lo indican los ensayos que demuestran que las celulas espermaticas crioconservados tienen una motilidad que supera el 50% (por ejemplo, aproximadamente 60%), despues que se descongelan en un bano de agua a 37°C durante aproximadamente 50 segundos. Como se trato anteriormente, se puede analizar la motilidad de las celulas espermaticas por medio de un equipo automatico (por ejemplo, el analizador de esperma IVOS de Hamilton Thorn Research) o mediante el examen visual.

Debe senalarse que los metodos de crioconservacion descritos anteriormente se consideran para el uso en un proceso de clasificacion de esperma a escala comercial. Por lo tanto, de acuerdo con un ejemplo, las etapas de los metodos originales descritos en este documento se realizan simultaneamente en un lote de celulas espermaticas separados para crioconservar rapidamente todo el lote de celulas espermaticas de una forma que los conserve sanos. Por ejemplo, utilizando el equipo de citometna de flujo multi-canal que se describe a continuacion, es posible obtener aproximadamente 840 x 106 cromosomas separados que tengan el cromosoma X en el sistema de recogida del equipo en aproximadamente 20 minutos. Es una cantidad de celulas espermaticas suficiente para llenar varias docenas de pajitas. Es mas, un lote puede incluir las celulas espermaticas combinados de dos o mas citometros de separacion diferentes. Despues de estar concentrados como se ha descrito anteriormente, las celulas espermaticas se puedan cargar en cualquier cantidad de pajitas y se pueden crioconservar como un lote. Por ejemplo, lleva aproximadamente 5 minutos agregar un diluyente (que incluye una fuente proteica y un crioprotector) a un lote de celulas espermaticas, y aproximadamente 15 minutos cargar las celulas espermaticas en las pajitas de inseminacion artificial con un equipo de carga automatico. Todas las pajitas del lote se enfnan simultaneamente en un congelador programable. Ademas, la capacidad de algunos congeladores programables permite la crioconservacion simultanea de miles de pajitas de inseminacion artificial. Por ejemplo, el congelador IceCube 1810CD mencionado anteriormente tiene la capacidad de crioconservar simultaneamente mas de 2.500 pajitas de 0,5 ml o mas de 3800 pajitas de 0,25 ml. Por lo tanto, para iniciar la etapa de refrigeracion se podna esperar a obtener lotes multiples. Alternativamente, se podnan obtener lotes multiples practicamente al mismo tiempo al operar en paralelo equipos multiples de citometna de flujo multi-canal (vease a continuacion) y enfriar simultaneamente lotes multiples obtenidos de ah juntos en un congelador programable. En un ejemplo, lleva un penodo de menos de 220 minutos enfriar las celulas espermaticas de la temperatura ambiente a un estado sobreenfriado y sumergirlos en nitrogeno lfquido (-196°C). En otro ejemplo, el penodo de sobrerefrigeracion es inferior a 190 minutos. En otro ejemplo, el penodo de sobrerefrigeracion es inferior a 150 minutos.

Los especialistas en la tecnica reconoceran que se pueden hacer modificaciones importantes a los metodos de ejemplo previos. Por ejemplo, las celulas espermaticas se pueden crioconservar en un recipiente diferente a una

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pajita de inseminacion artificial. Asimismo, los etapas del metodo que incluyen el cambio o el mantenimiento de la temperature se pueden llevar a cabo por cualquier medio apropiado, inclusive banos Mana, vapores de nitrogeno Kquido y congeladores programables o no programables convencionales, por ejemplo. Ademas, se puede usar una amplia variedad de sustancias o combinaciones de sustancias como fuente proteica y/o crioprotector. Entre estas sustancias se encuentran las sustancias y las concentraciones de las sustancias indicadas anteriormente en la parte en que se tratan las soluciones tamponadas, los diluyentes, los crioprotectores, los fluidos envolventes y los fluidos de recogida. Es mas, el orden de algunas etapas en el metodo se puede variar. Aunque la Fig. 95 indica que el crioprotector se anade despues de ajustar la concentracion del esperma separado, tambien contempla la posibilidad de agregar un crioprotector antes de ajustar la concentracion. Por ejemplo, el crioprotector se puede suministrar en el fluido de recogida o en el fluido envolvente que se utiliza con un citometro de flujo. Algunos de los beneficios tambien se pueden obtener enfriando parcialmente las celulas espermaticas y agregando despues el crioprotector. Asimismo, el orden en el que se anade la fuente proteica puede variar en tanto esta sea eficaz para proteger a las celulas espermaticas del choque fno cuando pasan por el intervalo de temperatura de aproximadamente 14 a 8°C.

Ejemplo I de crioconservacion

El semen bovino se recogio, se transporto y se evaluo como se ha descrito anteriormente. Se colocaron dos tubos de ensayo que conternan 5 ml de solucion tamponada TCA (pH 7,3) cada uno en uno de dos banos Mana durante al menos cinco minutos. Uno de los banos Mana estaba a una temperatura de 35°C y el otro a 41°C. A cada tubo se anadieron celulas espermaticas a 24°C de modo que la concentracion final en cada tubo fue de 150 x 106 celulas espermaticas/ml. Los dos tubos se dividieron en dos alfcuotas que se mantuvieron en los respectivos banos Mana. Despues de que el esperma se equilibro con la solucion tamponada TCA durante cinco minutos, se agrego solucion Hoeschst 33342 80 |iM a una de las alfcuotas a 35°C y a una de las alfcuotas a 41°C. Despues de agregar solucion Hoechst 33342, las cuatro alfcuotas se incubaron durante 20 minutos en sus respectivos banos Mana. Despues de la incubacion, los tubos de ensayo se sacaron de los banos Mana y se dejaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) durante cinco minutos. Luego los contenidos de cada tubo de ensayo se diluyeron con un diluyente TCA que conterna 20% de yema de huevo y 6% de glicerol (v/v) (pH 7,0) hasta obtener una concentracion final de 20 x 106 celulas espermaticas/ml. Los contenidos de cada tubo de ensayo se usaron despues para llenar una pajita de inseminacion artificial de 0,5 ml. Se coloco cada una de las cuatro pajitas en un congelador programable (un congelador 1810CD IceCube de Minitube de America, Wl). En el congelador programable se programo la siguiente secuencia de refrigeracion: (1) 22°C a 4oC a -0,2°C/min; (2) se mantuvo a 4oC durante 30 min; (3) 4oC a -15°C a -3,0°C/min; y (4) -15°C a -80°C a -10,0°C/min. Despues de alcanzar -80°C, las pajitas se sumergieron en nitrogeno lfquido (-196°C) durante 45 minutos. Luego las pajitas se sumergieron en un bano de agua a 37°C durante 50 segundos para descongelarlas. La motilidad del esperma se examino bajo un microscopio de contraste de fase tanto antes como despues de la crioconservacion. Los resultados se muestran en la Fig. 104. La motilidad posterior a la descongelacion estuvo en general en el orden del 60%. Esto representa una disminucion en la motilidad de solamente 5-11% aproximadamente, en comparacion con la motilidad anterior a la crioconservacion. El analisis de varianza no revelo ningun efecto significativo ni de la solucion Hoechst 33342 ni de la incubacion a 41°C en la motilidad de esperma posterior a la descongelacion.

Funcionamiento del sistema

El funcionamiento general 813 del sistema de citometna de flujo 9 se describira ahora con referencia a la Fig. 82 y en el contexto espedfico de celulas espermaticas (por ejemplo, esperma bovino), pero se comprendera que la descripcion es solamente un ejemplo y que el sistema se puede usar para procesar otros tipos de partfculas.

La primera serie de etapas que llevan al circuito cerrado de repeticion de seis segundos implica la calibracion del sistema. Despues de inicializar 769, se lleva a cabo una verificacion del sistema 771 para confirmar, entre otras cosas, que el procesador 131 o los procesadores estan en funcionamiento. Si se detecta un error despues de la falla de tres controles del sistema 775, se solicita la interaccion del usuario 773. Si la verificacion del sistema es positiva, el microprocesador dirige el sistema para enjuagar 777 el sistema de boquilla con un lfquido apropiado y luego un material de control de calidad 779, como cuentas o nucleos bovinos, se hacen pasar a traves del sistema para inicializar los parametros de deteccion (ver 739 en la Fig. 72) y confirmar que el sistema esta operando dentro de un control de calidad aceptable. Esto implica la evaluacion del material de control para ensayar la sensibilidad y la precision del sistema para confirmar que el sistema puede discriminar adecuadamente una muestra. Si el control de calidad no se confirma despues de tres intentos 775, se solicita la intervencion del usuario 773.

Si el material de control de calidad indica un nivel aceptable de control de calidad, una muestra 781 es aspirada y se verifica la calidad 783 de una porcion o alrouota de la muestra que se debe separar. La calidad de la muestra se puede determinar mediante el calculo de un factor de calidad (factor-Q) de la muestra. Por ejemplo, se puede detectar el tipo de celulas en una primera alrouota de la muestra. Durante esta deteccion, los parametros de deteccion inicializados (741) se vuelven a controlar y se generan los parametros de discriminacion iniciales (745). Si el tipo de celulas detectadas en la alfcuota indica que la muestra cumple o supera una norma preestablecida (por ejemplo, que la muestra se puede discriminar para producir determinada pureza o motilidad y, en particular, que hay suficientes celulas espermaticas X vivos disponible para el procesamiento), entonces el sistema continua con la operacion. Si la calidad de la muestra fracasa tres veces 775, se solicita la interaccion del usuario.

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La continuacion de la operacion implica la separacion 785 del resto de la muestra empleando un circuito cerrado de repeticion de seis segundos. Al comienzo del circuito, el microprocesador confirma que la separacion de la muestra no esta completa 789. Si la separacion de la muestra esta completa 789, el microprocesador procede a aspirar la muestra siguiente 781 si esta disponible o a detener la operacion de separacion 793 si no hay otra muestra disponible. Si no se completo la separacion de la muestra 789, el microprocesador verifica inicialmente la discriminacion X/Y 795 de la muestra para confirmar que esta dentro de un intervalo optimo. En otras palabras, se lleva a cabo el analisis de desplazamiento como se observo anteriormente (761 en la Fig. 72). Si se debe realizar algun cambio, tales cambios se implementan y se controla nuevamente la discriminacion 795. Si la discriminacion todavfa es inaceptable a esta altura, la separacion se desactiva 793 y se solicita la interaccion del usuario.

De lo contrario, el sistema continua para determinar sf el sistema de suministro de fluidos esta abasteciendo de lfquido y celulas a una velocidad dentro un intervalo optimo 801. Esta determinacion depende del tipo de estrategia de control que se emplee. Para la estrategia de control de alta recuperacion, la tasa optima se determinana evaluando la pureza o mediante el valor de x/x+-X de la poblacion recogida. Si la pureza determinada supera un nivel requerido de pureza, la velocidad de alimentacion de celulas se incrementa al aumentar una senal de control de la velocidad provista por la bomba de jeringa 803. Esto tiende a aumentar las celulas coincidentes y a disminuir la pureza porque se recogenan mas celulas coincidentes, incluso celulas -X con las celulas X. Si la pureza determinada es inferior a la pureza requerida, la velocidad de alimentacion de las celulas se reduce disminuyendo la senal de control de la velocidad provista por la bomba de jeringa para reducir la frecuencia de las celulas coincidentes 803. Asf, la velocidad de alimentacion de las celulas es una funcion de la pureza determinada de la poblacion recogida en comparacion con un nivel de pureza deseado, es decir, una funcion de las celulas espermaticas ~X identificadas recogidas.

Para la estrategia de control de elevada pureza, la velocidad optima se determinana mediante el calculo de las celulas X perdidas X, es decir, celulas X desechadas/celulas X desechadas + celulas X recogidas. Si la cantidad o el porcentaje de las celulas X perdidas es inferior a un nivel aceptable, la velocidad de alimentacion de las celulas se incrementa al aumentar la senal de control de velocidad provista a la bomba de jeringa 803. Esto tendena a aumentar las celulas coincidentes y a aumentar la cantidad de celulas X desechadas debido a que mas celulas, incluso celulas X, senan desechadas con las celulas Y. Si la cantidad o el porcentaje de celulas X perdidas es superior al nivel aceptable, la velocidad de alimentacion de las celulas se reduce al disminuir la senal de control de velocidad provista a la bomba de jeringa 803 para disminuir las celulas coincidentes. Por lo tanto, la velocidad de alimentacion de celulas es una funcion de las celulas X perdidas determinadas de la poblacion desechada en comparacion con la cantidad de celulas X en la poblacion recogida, es decir, una funcion de la cantidad de celulas espermaticas X no recogidas.

Si esta velocidad modificada es aceptable 805, el sistema efectua otra verificacion del sistema 807. Si la verificacion del sistema es aceptable 807, la separacion continua en el circuito de seis segundos. Si no, el sistema se reinicia 809. Si despues de reiniciado el sistema no es aceptable o si la velocidad de alimentacion modificada no es aceptable 811, se desactiva la separacion 793 y se solicita la intervencion del usuario 773.

Las corrientes de gotitas separadas se recogen mediante el sistema de recogida 2201. Las gotitas separadas en la poblacion de celulas X pasan por la ventana de salida 2245 en el primer dispositivo interceptor 2247 para interceptarse por el segundo dispositivo interceptor 2249. Desde allf, las gotitas que contienen celulas X circulan hacia un recipiente de recogida 2207. Otras gotitas se interceptan por el primer dispositivo interceptor 2247 y dirigidas hacia el canal de desechos 2805. Se entiende que las gotitas interceptadas por el primer dispositivo interceptor tambien se pueden recuperar, como se indico anteriormente. Cuando una cantidad adecuada de celulas espermaticas que tienen el cromosoma X se recogio en el recipiente de recogida, se puede interrumpir la separacion para permitir la concentracion del esperma en el recipiente de recogida 2207. Se puede colocar un nuevo recipiente de recogida debajo del primer dispositivo interceptor 2247 o el lfquido recogido se puede verter en otro recipiente y volver a colocar el recipiente de recogida. Luego se puede reanudar la separacion. Las celulas espermaticas en el lfquido recogido se concentran, se cargan en las pajitas y se congelan como se ha descrito anteriormente.

Control de la temperatura durante el funcionamiento

Se puede utilizar el control de la temperatura a lo largo del proceso para mejorar los resultados del mismo. Como ya se discutio antes, se puede controlar la temperatura del esperma durante varios etapas del proceso (p. ej., durante la tincion y la crioconservacion).

Por ejemplo, la Fig. 105 es un diagrama de flujo de trabajo de un ejemplo de un metodo de control de la temperatura. La temperatura de las muestras de semen en el momento en que se recogen se determinara en funcion de la temperatura corporal del animal del que se toman. Por ejemplo, en el etapa 2601 se recogen muestras de semen bovino a aproximadamente 37°C. En el etapa 2603 se usa un recipiente aislante para transportar las muestras de semen al laboratorio desde el sitio de recogida. El recipiente aislante demora la refrigeracion del esperma.

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Durante la evaluacion de la muestra en el etapa 2605, la temperatura se mantiene por debajo de la temperatura de recogida, pero por encima de la temperatura de transicion vftrea por debajo de la cual la membrana de las celulas espermaticas sufre dano. Por ejemplo, la temperatura se puede mantener entre aproximadamente 18 y 37°C. En otro ejemplo, la temperatura se puede mantener entre aproximadamente 24 y 37°C durante la evaluacion de la muestra. En un ejemplo en particular, las celulas espermaticas se colocan en un ambiente que tiene una temperatura entre aproximadamente 22 y 25°C durante la evaluacion de la muestra. Dependiendo de la temperatura del esperma en el momento en que llega al laboratorio, el efecto de colocarlo en un ambiente que tiene una temperatura en el intervalo entre 22 y 25°C puede ser: continuar enfriando lentamente el esperma, mantener la temperatura del esperma o aumentar ligeramente la temperatura del mismo. En un ejemplo, en el etapa 2607 la temperatura puede aumentarse (p. ej. a 40°C o mas) para la tincion, como se discutio en la seccion de tincion. En otro ejemplo, la temperatura de las celulas espermaticas durante la etapa de tincion puede estar en el intervalo entre 20 y 40°C, como se ha analizado anteriormente.

En el etapa 2609, la mezcla de semen tenida se mantiene en un bano de agua hasta el momento en que la mezcla se introduce en un citometro de flujo. La temperatura del bano de agua puede ser semejante a la utilizada en la etapa de tincion. En un ejemplo la temperatura del bano de agua se encuentra en el intervalo entre 40 y 47°C. En otro ejemplo la temperatura del bano de agua se encuentra en el intervalo entre 20 y 37°C. Aun En otro ejemplo la temperatura del bano de agua se encuentra en el intervalo entre 20 y 25°C. Despues de mantener las celulas espermaticas tenidos en el bano de agua entre un minuto y dos horas, se los separa por citometna de flujo como se ha analizado anteriormente en el etapa 2611 En el etapa 2613 se concentran las celulas espermaticas recogidos. La concentracion se puede llevar a cabo en un ambiente que tenga una temperatura que no modificara mucho la temperatura de las celulas espermaticas. Por ejemplo, en un ejemplo, la concentracion se puede llevar a cabo en un ambiente que tenga una temperatura en el intervalo entre aproximadamente 20 y 25°C. En el etapa 2615 al esperma concentrado se le agregan un diluyente, una fuente proteica y un crioprotector. Luego, en el etapa 2617 las celulas espermaticas se cargan en las pajitas de inseminacion artificial. En un ejemplo, la etapa de carga se realiza en un ambiente que tiene una temperatura que no cambiara mucho la temperatura de las celulas espermaticas. Finalmente, en el etapa 2619 la temperatura del esperma se controla durante la crioconservacion como se ha analizado anteriormente.

Las celulas espermaticas pueden tenirse a temperaturas aun menores. Por ejemplo, puede ser deseable separar las celulas espermaticas en un citometro de flujo a una temperatura relativamente baja (p. ej. aproximadamente entre 0° C y 8o C). Esto puede requerir la modificacion del control total de temperatura. Antes que nada, cuando se enfnan las celulas espermaticas antes de su introduccion en un citometro de flujo, en general no se deben usar yema de huevo ni otras fuentes proteicas que protegen a las celulas espermaticas del choque fno a temperaturas inferiores a la temperatura de transicion vftrea, puesto que este tipo de sustancias proteicas tienden a estropear u obstruir la flrndica del citometro de flujo. De este modo, es deseable enfriar las celulas espermaticas antes de llevar a cabo la etapa de tincion a fin de aprovechar los protectores naturales contra el choque fno del semen puro, como por ejemplo el ftquido seminal. Cualquier intento de tenir las celulas espermaticas antes de enfriarlos requerira el agregado de soluciones tamponadas para proteger al esperma, que diluiran al semen puro y reduciran la proteccion natural contra el choque fno.

Por consiguiente, para clasificar las celulas espermaticas a una temperatura entre aproximadamente 0°C y 8oC incluye la colocacion de dichos celulas espermaticas en un ambiente con una temperatura inferior a 8oC para enfriarlos hasta una temperatura entre aproximadamente 0°C y 8°C antes de la tincion. Se puede utilizar cualquier metodo para enfriar a las celulas espermaticas, pero es deseable utilizar un metodo que los proteja contra sus rapidas fluctuaciones de temperatura durante el proceso de refrigeracion. Por ejemplo, en un ejemplo, un recipiente que contiene las celulas espermaticas se coloca en un bano de agua a temperatura ambiente, el que a su vez se coloca en un ambiente con una temperatura por debajo de aproximadamente 8o C. En otro ejemplo, se controla la temperatura de las celulas espermaticas y se anade hielo al bano de agua para enfriar aun mas dichas celulas. La etapa de tincion se puede llevar a cabo como se describio antes excepto en que la mezcla de tincion se somete a una temperatura entre aproximadamente 0oC y 8oC. Debido a la menor temperatura, el penodo de incubacion requerido para tenir las celulas es considerablemente mayor. Una vez que las celulas espermaticas se han enfriado hasta 8o C o por debajo, es preferible evitar calentarlos. Por tanto, puede ser posible manejar el citometro de flujo en un ambiente con una temperatura en el intervalo entre 0o C y 8o C. De manera similar, tambien puede ser posible recoger las celulas espermaticas separadas en un recipiente de recogida que esta rodeado por un entorno con una temperatura entre aproximadamente 0oC y 8oC. Ademas, pueden anadirse diluyentes, crioprotectores, tampones, fuentes proteicas, antibioticos, antioxidantes u otros aditivos a una temperatura entre aproximadamente 0oC y 8oC. Con respecto al agregado del crioprotector, puede ser aconsejable agregar un poco mas del que se anadina despues de separar a las celulas espermaticas, a una temperatura en el intervalo entre 0°C y 8°C. De este modo, en un ejemplo en particular, se anade un crioprotector que contiene 7 % de glicerol (v/v) a las celulas espermaticas despues de que se han separado, a una temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 8°C.

Generalmente, se produce una sobrerefrigeracion de las celulas espermaticas en el intervalo de temperatura entre 0o C y 8o C como se describe antes en la seccion de crioconservacion. Sin embargo, las celulas espermaticas deberan mantenerse a una temperatura entre aproximadamente 0o C y 8o C por un penodo despues del agregado del crioprotector antes del sobrerefrigeracion, para dar tiempo a que dichos celulas espermaticas se equilibren con el

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crioprotector. Asf, de acuerdo con un ejemplo, se deja que las celulas espermaticas se equilibren con el crioprotector durante un penodo de aproximadamente 30 minutos a 3 horas. En otro ejemplo, se deja que las celulas espermaticas se equilibren con el crioprotector durante un penodo de 1 a 2 horas. En otro ejemplo en particular, las celulas espermaticas se dejan equilibrar con el crioprotector durante un penodo de aproximadamente 90 minutos.

Se pueden usar los metodos y equipos convencionales de control de temperatura (p. ej., banos de agua, estufas de incubacion, refrigeradores y congeladores) para calentar o enfriar la muestra a fin de que alcance o mantenga las temperaturas especificadas en los ejemplos anteriores. Se entiende que colocar una muestra en un ambiente con una temperatura diferente a la de la muestra, hara que la temperatura de la muestra cambie con el tiempo. Puede incluso haber variaciones de temperatura dentro de la muestra. Como se ha mencionado, es deseable cambiar la temperatura de la muestra gradualmente para ayudar a mantener la salud del esperma. El cambio gradual de temperatura tambien sirve para reducir la variacion de la temperatura dentro de la muestra. Como bien saben los especialistas en la tecnica, la velocidad de cambio de la temperatura de la muestra estara influida por muchos factores, incluidos el volumen de la muestra, el tamano y la forma del recipiente que la contiene y la magnitud de la diferencia de temperatura entre la muestra y el ambiente. Sin embargo, los especialistas en la tecnica podran facilmente elegir un metodo y un equipo adecuados para alcanzar el control de la temperatura deseado despues de considerar todos los factores relevantes.

El tiempo durante el cual las celulas espermaticas permanecen a cualquier temperatura tambien puede afectar a la salud del esperma. Por tanto, en el procesamiento la temperatura puede controlarse a lo largo de todo el proceso y se completa de forma deseable dentro de un cronograma analizado a continuacion.

Cronograma para el funcionamiento

En general, puede ser deseable completar el proceso de clasificacion del esperma en el menor tiempo posible para reducir el dano al mismo. El metodo de tincion mejorado descrito puede reducir el tiempo necesario para la tincion a aproximadamente 10 minutos. Asimismo, el nuevo citometro descrito anteriormente se puede usar para separar celulas espermaticas en menos tiempo que el requerido con un citometro convencional. Por ejemplo, un citometro de flujo que use la tecnologfa analizada anteriormente puede recoger entre 2.000 y 10.000 celulas espermaticas con las caractensticas de ADN deseadas por segundo. Ademas, el proceso de crioconservacion se puede usar para reducir el tiempo necesario para completar la crioconservacion de las celulas espermaticas procesadas en comparacion con los metodos tradicionales de crioconservacion. Por consiguiente, un ejemplo implica el procesamiento del esperma de conformidad con un metodo general para aprovechar una o mas innovaciones que ahorran tiempo, para reducir el tiempo requerido para completar todo el proceso. Por ejemplo, se recoge un lote de celulas espermaticas (p. ej. una eyaculacion) de un mairnfero macho (p. ej. un toro), se efectua un control de calidad, se tine, se clasifica de acuerdo con las caractensticas especificas de ADN, se carga en uno o mas recipientes (p. ej. pajitas) y se crioconserva en un penodo de aproximadamente 12 horas desde el momento de su recogida, que es inferior a aproximadamente 8 horas, inferior a aproximadamente 6 horas, inferior a aproximadamente 3 horas, inferior a aproximadamente 2 horas o inferior a aproximadamente 1 hora.

APARATO DE CLASIFICACION MULTI-CANAL Y METODO

Para separar mas esperma en menos tiempo, es posible usar mas de una unidad de citometna en paralelo para separar la misma muestra de esperma. Una manera de hacer esto es sencillamente dividir las celulas espermaticas tenidos en alfcuotas multiples y procesar cada alfcuota en un citometro diferente. Sin embargo, segun se tratara a continuacion, se pueden obtener ciertas ventajas al disenar un equipo que consta de varias unidades de citometna en una unica unidad de citometna multi-canal integrada.

Sistema multi-canal que comparte una plataforma integrada

Las Fig. 106-116 muestran un ejemplo que comprende un sistema de citometna multi-canal, designado en general 1001, en el que multiples unidades de citometna de flujo monocanal, designadas 1003, estan agrupadas formando un sistema integrado para dar el producto separado. En este ejemplo en particular se ilustran cuatro de tales unidades, pero el numero puede variar. Las unidades pueden integrarse de diversas maneras, por ejemplo compartiendo una plataforma integrada que comprende uno o mas de los siguientes elementos (1) un suministro comun de partfculas 1005; (2) una fuente comun de radiacion electromagnetica 1007; (3) una carcasa comun 1009; (4) una entrada comun para la operacion de control de las unidades 1011; (5) una salida comun 1019 que permite la evaluacion de la operacion de una unidad en relacion con otra unidad; (6) un sistema de suministro de fluidos comun 1021; (7) un sistema comun de control de temperatura 1023; (7) una fuente comun de energfa 1025; (8) un sistema comun de recuperacion de desechos 1027; (9) un sistema comun de placa deflectora 1029; y (9) un sistema comun de limpieza 1031. En un ejemplo, el sistema incluye todos estos elementos, pero se entendera que un sistema multicanal de esta invencion puede incluir cualquier combinacion de elementos. El uso de elementos comunes es beneficioso porque le permite al sistema hacerse funcionar de manera mas eficaz y rentable, logra resultados mas uniformes entre los canales al reducir el numero de variables, facilita cualquier localizacion de problemas que pueda ser necesaria y es economico. El enfoque multi-canal tambien hace al sistema de clasificacion mas susceptible de ampliar o reducir a escala.

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Cada una de las unidades de citometna 1003 tiene componentes similares a ciertos componentes del equipo de citometna de flujo 9 del ejemplo previo y, por conveniencia, las correspondientes partes se designan con los mismos numeros de referencia con el agregado de un numero primo ('). En general, cada unidad comprende un sistema de boquilla 101', un soporte para montar el sistema de boquilla 331', un transductor 105', y un instrumento optico de epi- iluminacion 417' para centrar el haz de luz 25' en la corriente de fluido 21' que sale por el orificio de la boquilla 103', todo como se describio previamente. Cada unidad consta ademas de un fotodetector 117' que se puede operar como en el primer ejemplo para detectar las emisiones de fluorescencia 31' de las partmulas en la corriente 21' y convertir las emisiones 31' en senales electricas 701' que se procesan para clasificar las partmulas por una caractenstica espedfica de ADN. Cada unidad 1003 esta tambien equipada para separar las gotitas 33' en diferentes grupos o poblaciones 123', 125' segun la clasificacion de las partmulas contenidas en las gotitas 35'. Las poblaciones de gotitas separadas por las unidades se recogen por el sistema de recogida 2201.

A. Carcasa comun y disposicion en modulos

Las unidades de citometna de flujo estan montadas en una disposicion modular en una carcasa comun 1009. En el ejemplo mostrado en las Fig. 106 y 109-113, la cubierta tiene una base 1069 y dos paredes laterales 1071 que se extienden hacia arriba desde la base. Las paredes laterales tienen un par de salientes 1073 para sostener un panel de la cubierta inferior 1075 del frontal de la carcasa 1077 y un par de salientes superiores 1081. Un panel de la cubierta inferior 1075 en el frontal de la carcasa 1077 esta montado entre las salientes inferiores 1073. Las salientes superiores 1081 sostienen un panel de la cubierta superior 1083 en la parte posterior de la cubierta 1085. Las partes delantera y trasera de la cubierta 1077,1085 estan practicamente abiertas para permitir el acceso al equipo que esta en su interior. Se comprendera que la carcasa 1009 puede tener otras configuraciones. Aun mas, se entendera que las diversas unidades pueden estar instaladas en carcasas separadas.

Las unidades de citometna de flujo 1003 estan montadas una al lado de la otra como modulos en un marco apropiado 1087 en la carcasa 1009. Espedficamente, los soportes de la boquilla 331' para colocar las boquillas 101' estan unidos libremente a una barra en forma de cruz 1089 (Fig. 106) fijados a las paredes laterales 1071 de la cubierta y las bases 429' de los instrumentos de epi-iluminacion 417' estan sujetas libremente a una placa de montaje en angulo 1093 que se extiende entre las paredes laterales 1071 de la cubierta hacia la parte trasera de esta 1085 (Fig. 109), esta disposicion es tal que una unidad particular puede instalarse o retirarse como un modulo. Esta disposicion en modulos facilita la instalacion, el retiro para mantenimiento y/o reemplazo, y permite agregar facilmente cualquier cantidad de unidades de citometna de flujo 1003 segun sea necesario para aumentar la capacidad de produccion del sistema.

B. Sistemas comunes de suministro y reparto de fluidos

El sistema de suministro de fluidos 1021 de este ejemplo esta equipado para proporcionar lfquidos apropiados a cada una de las unidades de citometna 1003. Como se ilustra esquematicamente en la Fig. 108, generalmente el sistema consta de una bomba 1105 para transferir el fluido portador 17' a presion desde un suministro comun del fluido portador 1107, un sistema de gas a presion 1115 para transferir el lfquido a presion desde un suministro comun 1117 del fluido envolvente 19' y un sistema de distribucion 1121 para recibir los lfquidos desde los respectivos suministros y dispensar los lfquidos a presion a las diversas unidades de citometna 1003, segun sea necesario. En el ejemplo espedfico de la Fig. 116, el suministro del fluido portador comprende un recipiente 1123 que contiene un volumen adecuado de dicho lfquido (por ejemplo, 5 ml). El recipiente se sostiene mediante un soporte 1125, que puede ser un bloque 1133 que tiene una cavidad 1135 clasificado por tamano para recibir el recipiente 1123. El bloque tambien tiene una segunda cavidad 1137 para sostener un recipiente 1139 que contiene una solucion tamponada adecuada para el acondicionamiento del sistema durante el uso, como se describira mas adelante.

Es deseable (pero no imprescindible) que la bomba 1105 para dispensar el fluido portador del recipiente sea una bomba de jeringa 1141 como la que se describio antes. El embolo de la bomba se puede desplazar por el recorrido de admision para aspirar el volumen elegido de fluido portador 17' del recipiente 1139 y por el recorrido de descarga para dispensar el fluido portador a traves de una lmea de suministro 1147 al colector 1177 y de allf a las diversas boquillas 101' del sistema. La bomba de jeringa tambien se puede operar para aspirar lfquido del recipiente 1139 que contiene solucion tamponada y bombear esta a traves del sistema de una manera que se describira. Una valvula de tres vfas 1149 controla el flujo de fluido portador y de solucion tamponada desde y hacia la bomba 1141. La bomba es accionada por un motor de velocidad variable controlada por el procesador 131'. A modo de ejemplo, la bomba puede accionarse por un motor paso a paso que funciona a velocidades selectivamente variables para bombear el fluido portador al sistema distribuidor 1121 a las velocidades necesarias para obtener la produccion deseada de las unidades 1003. Se pueden usar bombas de jeringa multiples u otros tipos de dispositivos dispensadores de lfquido en vez de una unica bomba de jeringa.

El suministro 1117 del fluido envolvente comprende un recipiente 1155, es decir, un tanque conectado al colector 1177 por medio de una lmea de suministro 1157. El sistema de gas a presion 1115 se puede operar para presurizar el tanque y comprende una fuente de gas presurizado 1161 (por ejemplo, aire o nitrogeno) que comunica con el

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tanque mediante una lmea de gas 1163 que tiene incorporado un regulador 1165 para controlar la presion provista al tanque y una valvula de dos vfas 1167 que, en una primera posicion, establece comunicacion entre el tanque y la fuente de gas, y en una segunda posicion, se puede operar para ventilar el tanque. El regulador de la presion del gas 1165 es un regulador convencional ajustable para controlar la presion provista desde la fuente de aire. El sistema de gas a presion 1115 tambien incluye una lmea de gas 1169 para presurizar un abastecimiento 1173 de la solucion de limpieza (por ejemplo, agua desionizada de un tanque) que puede usarse para enjuagar el sistema de circuitos de lfquido de una manera que se describira mas adelante. El flujo a traves de la lmea de gas es controlado por una valvula de dos vfas 1167 que se puede operar de la misma manera que la valvula 1167.

El colector 1177 comprende un bloque laminado 1179 (Fig. 112) de un material en el que se forman conductos 1181 para delimitar un circuito de flujo de fluido 1185 como el que se muestra en forma de diagrama en la Fig. 116. (Los conductos se pueden formar labrando ranuras en las caras de las laminas antes de ensamblarlas para formar el bloque.) El circuito de lfquido incluye entradas 1189, 1191 conectadas a la bomba de jeringa 1141 y al suministro 1117 del fluido envolvente y conjuntos de salidas 1193, para proporcionar dichos lfquidos a las unidades de citometna de flujo 1003, cada uno de tales conjuntos incluye una salida de fluido portador y una salida de fluido envolvente. El flujo a traves de los diversos conductos de flujo 1181 es controlado por valvulas V1-V6 que, en un ejemplo, son valvulas accionadas por solenoide en alojamientos unidos al bloque del distribuidor 1179. Es preferible que el bloque sea de material practicamente transparente (por ejemplo, plastico acnlico) para facilitar el monitoreo del sistema 1121 y la localizacion de problemas. El colector 1177 esta sujeto a una pieza del marco 1203 y se extiende entre las paredes laterales 1071 de la carcasa 1009 adyacente al fondo de la cubierta debajo de los sistemas de boquilla 101'. Las entradas y las salidas 1193, del colector 1177 pueden tener conexiones 1205 roscadas en el bloque, como la tuerca sin pestana y accesorios de casquillos de Upchurch Scientific, una division de Scivex. Se entendera que el diseno y la construccion del circuito de lfquido 1185 en general y del colector 1177 en particular, pueden variar.

Haciendo referencia a la Fig. 116, el circuito de distribucion de lfquido 1185 para el fluido portador 17' incluye un deposito de muestra 1207 para mantener un suministro limitado del fluido portador (por ejemplo, 1,0 ml). Si el fluido portador contiene celulas espermaticas, por ejemplo, disponer de un deposito de este tipo cerca de las boquillas 101' es beneficioso para la viabilidad y la motilidad de las celulas espermaticas, ya que el almacenamiento de tales celulas, aun durante penodos cortos, en espacios pequenos puede perjudicar la motilidad. El flujo del fluido portador desde el deposito de muestra 1207 a las boquillas 101' es controlado por una serie de valvulas de dos vfas V1A- V1D, una para cada boquilla. Cada una de las valvulas V1A-V1D tiene una primera posicion que establece la comunicacion de lfquido entre la aguja 1217 del deposito de muestra y la aguja 157' de la boquilla respectiva para la dispensacion del fluido portador 17' a la aguja sometida a la presion generada por la bomba de jeringa 1141 y una segunda posicion que establece comunicacion de lfquido entre la aguja 1217 y un sistema de desechos, generalmente designado 1221, que es comun a todas las unidades de citometna de flujo 1003. En el ejemplo mostrado, el sistema de desechos 1221 comprende un tanque de desechos 1223 para mantener material de desecho, un mecanismo 1225 como una bomba de vacfo para generar un vacfo en el tanque de desechos, y lmeas de desecho 1227 que conectan las valvulas V1A-V1D y el tanque de desechos. Se proporciona una valvula V3 en la corriente arriba de la lmea de desechos del tanque de desechos para la apertura y cierre de la lmea de desechos, segun sea necesario. Se proporciona un filtro hidrofobo apropiado 1233 en la lmea que conecta el tanque de desechos 1223 y la bomba de vacm 1225.

El circuito distribuidor de lfquido 1185 para el fluido envolvente 19' incluye una pluralidad de valvulas V2A-V2D. Cada valvula tiene una primera posicion que establece comunicacion de lfquido con el suministro 1117 del fluido envolvente del tanque para dispensar el fluido envolvente 19' a un cuerpo de flujo respectivo 133' a traves de una lmea de suministro de fluido envolvente 1241, y una segunda posicion que establece comunicacion de lfquido entre el cuerpo de flujo y el tanque de desechos mediante una lmea de desechos 1247. La presion a la cual el fluido envolvente se dispensa a los cuerpos de flujo 133' dependera de la presion del tanque de fluido envolvente (controlado por el regulador 1165) que puede variar de 1 a 100 psi (0,0703 a 7,03 kg/cm2), mejor si es de 10 a 50 psi (0,703 a 3,515 kg/cm2), mejor aun si es de 15 a 40 psi (1,0545 a 2,812 kg/cm2) y todavfa mejor aun si es de aproximadamente 20 a 30 psi (1,406 a 2,109 kg/cm2).

Aunque el uso de un suministro comun para todas las unidades tiene diversas ventajas, se considera que al menos algunas de las unidades de citometna de flujo podnan abastecerse con material de muestra de fuentes independientes.

C. Fuente de energia comun y controles de entrada y salida

Las unidades de citometna de flujo 1003 tambien comparten una fuente comun de energfa 1025, sistemas comunes de suministro de energfa, una entrada comun (GUI) 715' para el control del funcionamiento de los canales por el microprocesador 131' y una salida comun provista al microprocesador que permite evaluar el funcionamiento de un canal en relacion con el de otro canal. Por ejemplo, la salida comun incluye proporcionar las senales digitalizadas de cada sistema de epi-iluminacion al microprocesador para indicar la intensidad de fluorescencia medida por cada canal, para indicar la velocidad a la cual cada canal esta separando las partmulas, para indicar las variaciones de tincion (que puede indicarse por la diferencia de intensidad de los pulsos de fluorescencia de las celulas X e Y) y

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para indicar los Ifmites de la decision 763 usados por cada canal para discriminar entre partmulas. Como otro ejemplo, la salida comun incluye proporcionar las senales de salida de los detectores de rotura 389' al microprocesador para indicar el sitio de division de la gotita 107' de cada canal.

D. Control comun de temperatura

Opcionalmente, se proporciona un sistema de control de temperatura, en general designado 1257, para regular la temperatura de los contenidos de los recipientes 1123 en el bloque de soporte 1133 y la temperatura del colector 1177. Dicho control de temperatura reduce la variabilidad del sistema, proporcionando asf mediciones mas uniformes entre los canales y, para ciertos tipos de celulas (por ejemplo, celulas espermaticas), ayudando a mantener su viabilidad.

El sistema de control de temperatura 1257 puede comprender un circuito de flujo de fluido 1259 que consta de conductos para lfquido 1263 en el bloque de soporte 1133 y conductos para lfquido 1269 en el bloque del distribuidor 1179 y una unidad de control 1265 para hacer circular un lfquido termico (por ejemplo, agua) por el circuito a una temperatura seleccionada. Es deseable que la temperatura sea tal que mantenga el lfquido, especialmente el fluido portador, a una temperatura optima para maximizar la viabilidad de las celulas y, si se trata de celulas espermaticas, la motilidad de los mismos. Se coloca una valvula de cierre V6 en el circuito para controlar el flujo por el circuito. La unidad de control de la temperatura se puede usar para mantener las celulas espermaticas a la temperatura deseada antes de separarlos como se trato anteriormente.

Todas las valvulas del sistema de suministro de fluidos 1021 se accionan por medios convencionales, como solenoides, bajo el control de un operador o de una programacion adecuada. Es deseable que las diversas lmeas de flujo de lfquido que conectan los componentes del sistema fuera del bloque del distribuidor 1179 sean de tubena plastica practicamente transparente para poder observar cualquier bloqueo. Por ejemplo, la tubena puede ser de 0,0625 pulg. (0,158cm) de diametro externo de polfmero de FEP (etilenpropileno fluorado). Es deseable que las lmeas de flujo del sistema de control de temperatura 1257 sean algo mas grandes (por ejemplo, 0,125 pulg. (0,317 cm) de diametro externo) para proporcionar mayor capacidad de flujo.

E. Haz de luz y sistema divisor del haz comunes

Como se ha indicado previamente, el sistema multi-canal comparte una fuente comun de radiacion electromagnetica o haz de luz 1007. A modo de ejemplo (y no de manera excluyente), la fuente puede ser un haz de luz laser de un laser con emision multilmea en el ultravioleta principalmente a longitudes de onda de 351,1 nm y 363,8 nm. Alternativamente, puede ser deseable usar un laser de pulsos (por ejemplo, un laser de modo cerrado), en particular para sincronizar el muestreo digital con un laser de pulsos (como se trato en la seccion laser de pulso) para aumentar la potencia efectiva suministrada a cada unidad de citometna, aumentando de ese modo el numero de unidades de citometna que pueden operarse con un unico laser.

La potencia necesaria para generar el haz de luz laser variara segun los requisitos de cada unidad de citometna de flujo y del numero de unidades. Por ejemplo, si hay N unidades y cada unidad necesita un haz de luz que tenga una potencia efectiva de W vatios, entonces sera necesario generar un haz de luz que tenga una potencia de (W x N) + L, donde L equivale a la perdida de potencia del sistema entre los elementos opticos de este. El uso de un unico laser para abastecer a todas las unidades de citometna de flujo es economico en comparacion con un sistema que usa multiples laser. Tambien es eficaz y proporciona mediciones mas uniformes de un canal al siguiente, porque no hay ninguna variabilidad debida a diferentes caractensticas del haz de luz (por ejemplo, intensidad del haz de luz, polaridad de la luz, divergencia del haz) o ruido electrico resultante del uso de multiples laser.

De acuerdo con un ejemplo, se usa un sistema de division y orientacion del haz para dividir un unico haz de luz laser en tres o mas haces independientes. Como se muestra en la Fig. 117, por ejemplo, un divisor del haz 50/50 1270 (es decir, un divisor del haz que se puede operar para dividir un unico haz en dos haces independientes que tengan aproximadamente la misma intensidad) se puede usar para dividir un unico haz 25' en dos haces 1270A, 1270B. Al usar un segundo divisor del haz 50/50 1271 para dividir uno de los dos haces 1270B en dos haces adicionales 1271A, 1271B, se puede generar un total de tres haces 1270A, 1271A, 1271B de un unico haz 25'. Cada haz puede dirigirse al sistema optico de un citometro de flujo, por ejemplo un sistema optico de epi-iluminacion 415' como se muestra en la Fig. 117. Tambien se podnan usar mas divisores del haz 50/50 para dividir el unico haz de luz laser en cualquier cantidad de haces separados independientes. Segun se muestra esquematicamente en la Fig. 118, se puede agregar, por ejemplo, un tercer divisor del haz 1272 al sistema de division del haz de 3 vfas (Fig. 117) de modo que los tres divisores del haz 50/50 1270, 1271, 1272 se puedan usar para dividir un unico haz 25' en cuatro haces independientes 1271 A, 1271B, 1272A, 1272B. De esto se puede apreciar facilmente que el haz unico puede dividirse en cualquier cantidad de haces independientes. Se pueden utilizar otras disposiciones divisoras del haz para dividir el haz entrante de la fuente en multiples haces de luz para las diversas unidades.

Se muestra un sistema de division del haz en las Fig. 106 y 109. Se proporciona un sistema de orientacion del haz 1273 para guiar al haz comun 1007 a los instrumentos opticos 417' de las diversas unidades de citometna de flujo 1003. En las Fig. 106 y 111, el sistema de orientacion 1273 incluye un conjunto de espejo inferior 1279 montado en

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una pared lateral 1071 de la carcasa 1009, un conjunto de espejo superior 1281 montado en la pared lateral 1071 encima del conjunto del espejo inferior y una serie de filtros reflectores 1283, uno asociado a cada instrumento de optica 417'. El conjunto del espejo inferior se puede operar para reflejar un haz 1007 de una fuente apropiada ascendentemente hacia el conjunto del espejo superior, y el conjunto del espejo superior se puede operar para reflejar el haz a traves de una abertura en la pared lateral 1071 hacia los filtros reflectores 431' de los diversos instrumentos 417'.

El conjunto del espejo inferior incluye una base 1285 sujeta a la pared lateral 1071 de la carcasa 1009, una plataforma 1289 que se desplaza verticalmente sobre la base mediante un mecanismo adecuado 1291, como un micrometro, una placa basculante 1293 en la plataforma (por ejemplo, una montura optica cinematica modelo P100- P de Newport) y un espejo 1295 sobre la placa, la posicion del espejo se puede regular moviendo la plataforma y la placa del espejo a las posiciones apropiadas. El conjunto del espejo superior es similar al conjunto del espejo inferior, comprende una base 1297, una plataforma que se puede desplazar verticalmente 1299, una placa basculante en la plataforma 1301, y un espejo 1303 sobre la placa. Un par de placas de puntena 1309 se fijan a la pared lateral de la carcasa 1009 entre los conjuntos del espejo superior e inferior. Las placas de puntena 1309 alinearon verticalmente los orificios 1311 allf para facilitar el ajuste de los espejos superior e inferior de modo que un haz entrante 1007 sea reflejado con exactitud hacia los filtros reflectores 431' de los instrumentos 417', cuyos filtros estan todos alineados con el haz entrante.

Cada uno de los tres primeros filtros reflectores 1315, 1317, 1319 funciona como un divisor del haz, es decir, funciona para reflejar un porcentaje espedfico del haz y para pasar el porcentaje restante. Por ejemplo, en el caso de los cuatro instrumentos de epi-iluminacion, cada uno de los filtros reflectores 431' de los tres primeros instrumentos refleja un porcentaje de la luz laser 1007, para que cada una de las tres primeras unidades de la serie reciba 25% de la radiacion electromagnetica del haz original 1007. Por ejemplo, los filtros reflectores de la primera, segunda y tercera unidades pueden reflejar un 25 %, un 33 % y un 50 % de la luz incidente, respectivamente. Es deseable que el ultimo filtro reflector 1321 de la serie refleje toda la luz restante (aproximadamente 25% del haz original) al ultimo instrumento de la serie. Como resultado, cada uno de los cuatro instrumentos debe recibir la misma intensidad de radiacion (luz) para interrogar las celulas en las corrientes respectivas.

Dependiendo de los dispositivos de division del haz usados en el sistema anterior 1273, puede ser aconsejable que el haz laser tenga una determinada polarizacion. La relacion transmitancia a reflectancia de los filtros dielectricos puede variar dependiendo de la polarizacion de la luz. Aun mas, cuando se trata con luz linealmente polarizada, los filtros dielectricos (que se fabrican para usar a un angulo espedfico de incidencia) pueden ser demasiado sensibles a las variaciones en el angulo de incidencia. La luz polarizada circular o elfpticamente soluciona este problema hasta cierto punto porque el vector de polarizacion de la luz esta en una diversidad de orientaciones diferentes con respecto a los ejes opticos de un filtro dielectrico cuando la luz interactua con el filtro. Por lo tanto, la luz polarizada elfpticamente o circularmente simula la luz polarizada aleatoriamente, que es mas tolerante a las variaciones en el angulo de incidencia en un filtro dielectrico. En consecuencia, si el laser descrito anteriormente genera un haz de luz que tiene una polarizacion vertical, por ejemplo, puede ser ventajoso convertir la luz en luz polarizada circularmente antes de dividirla. Como comprenderan los especialistas en la tecnica, esto puede llevarse a cabo pasando el haz traves de una placa de retardo de 1/4-onda (filtro) de material polarizante que tiene sus ejes opticos rotados 45 grados en relacion con el plano de polarizacion del laser. El haz transmitido por la lamina de onda tendra polarizacion aproximadamente circular y puede dividirse mas facilmente para proporcionar haces multiples a los sistemas opticos de las unidades de citometna de flujo respectivas.

Es mas, al hacer rotar la placa de retardo de ondas para alterar el angulo entre la polarizacion del laser y los ejes opticos del material usado para hacer la lamina de onda, se puede introducir excentricidad en la polarizacion aproximadamente circular del haz (es decir, la polarizacion se puede hacer mas elfptica). Cambiando la excentricidad de la polarizacion elfptica del haz se puede cambiar la relacion transmitancia a reflectancia de los filtros dielectricos al hacer que el vector de polarizacion para un mayor porcentaje de luz tenga un angulo particular con respecto al eje optico del filtro dielectrico. En consecuencia, si el equilibrio de luz entre las multiples unidades de citometna esta fuera del intervalo deseado, se puede hacer rotar la lamina de onda para aumentar o reducir la excentricidad de la luz elfpticamente polarizada, alterando de ese modo las relaciones transmitancia a reflectancia de los diversos filtros hasta que se logre un mejor equilibrio. De igual manera, si la lamina de onda esta transmitiendo luz polarizada elfpticamente, se puede influir la relacion transmitancia a reflectancia de uno de los filtros al rotar ese filtro.

Independientemente del metodo usado para dividir el unico haz en multiples haces independientes. Se puede lograr el equilibrio de la energfa entregada a cada unidad de citometna bloqueando selectivamente un porcentaje de la luz para reducir a todas las unidades de citometna al mismo nivel de energfa. Por ejemplo, se puede seleccionar el filtro de densidad neutral 447' de cada sistema de epi-iluminacion 415' para bloquear mas o menos luz de modo de equilibrar la energfa de iluminacion entregada por el divisor del haz y el sistema de orientacion a cada unidad de citometna. Si un canal de una unidad multi-canal recibe significativamente mas iluminacion del sistema de division y orientacion del haz, se puede usar un filtro de densidad neutral 467' que transmita menos luz en el sistema de epi- iluminacion 415' de ese canal para llevar la energfa de iluminacion de ese canal mas en lmea con los otros canales. Es deseable, aunque no esencial, que las variaciones en la energfa de iluminacion canal a canal sean inferiores al

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10 % aproximadamente. Es aun mas deseable que las variaciones canal a canal sean inferiores a aproximadamente el 5%.

Tambien se apreciara que el barrido con laser de pulsos, como se ha descrito anteriormente, puede ser aconsejable para la citometna de flujo multi-canal. Por ejemplo, se puede reemplazar el laser con emision multilmea en el UV por un laser de pulsos de modo cerrado que opere a aproximadamente 85 MHz para permitir a mas canales de citometna de flujo accionarse por un unico laser. Por ejemplo, la maxima energfa proporcionada en cada pulso de un laser de modo cerrado que emite pulsos con un ancho (duracion) de cerca de 12 pico segundos a una frecuencia de aproximadamente 85 MHz es aproximadamente 800 veces la energfa promedio de salida del laser. Por lo tanto, un laser de modo cerrado (por ejemplo, un Vanguard 350 de Spectra-Physics) puede proporcionar suficiente energfa de iluminacion para operar unas pocas docenas de unidades de citometna (por ejemplo, 32 unidades de citometna) mientras opere solo a aproximadamente 350 milivatios.

Tambien se considera el uso de los sistemas de fibra optica para suministrar luz a las unidades. Pueden usarse fibras para dirigir la luz desde el laser hasta las respectivas unidades, eliminando asf la necesidad de contar con el sistema de orientacion descrito anteriormente.

F. Placas deflectoras comunes

En las Fig. 106 y 108-116, el sistema de clasificacion 119' de cada unidad de citometna de flujo 1003 es practicamente identico al sistema de clasificacion 119 excepto en que las unidades comparten preferiblemente dos placas deflectoras comunes 1331 que se extienden a traves del ancho de la carcasa 1009 en el frente de la misma. Utilizar un conjunto comun de placas deflectoras tiene sus ventajas, entre ellas una carga uniforme de un canal al siguiente, el uso de una fuente comun de energfa, un area de placa mayor que proporciona un campo electrico mas estable y una deflexion de gotitas mas uniforme y un angulo de deflexion mas constante para la recogida de las muestras separadas. Las placas deflectoras 1331 estan montadas en un marco 1333 sujeto a la carcasa 1009. Alternativamente, se podnan proporcionar placas independientes a cada unidad.

G. Sistema comun de recogida

En las Fig. 107 y 116, un sistema comun de recogida 2801 incluye dos dispositivos interceptores para cada unidad de citometna como se ha descrito anteriormente conectados con el sistema de recogida 2201 para la unidad unica. Sin embargo, se proporciona un marco comun 2803 para sostener a los ocho dispositivos interceptores. Incluso, uno de los dos dispositivos interceptores para cada unidad de citometna dirige el lfquido a un canal comun de desechos 2805 en lugar de a un recipiente de recogida. El canal de desechos facilita el desecho de las gotitas separadas que contienen partfculas de escaso valor (por ejemplo, celulas espermaticas que tienen el cromosoma Y para la cna de vacas lecheras). Si es deseable retener todas las gotitas separadas, se puede quitar el canal de desechos y colocar recipientes de recogida debajo de cada dispositivo interceptor. Los cuatro recipientes de recogida del ejemplo mostrado en la Fig. 107 y 116 descansan en las aperturas de la superficie de una bandeja de recogida 2807. Se puede proporcionar un bano de agua comun (no se muestra) bajo la superficie de la bandeja de recogida para controlar la temperatura del contenido de los recipientes de recogida.

H. Control multi-canal

Las diversas unidades de citometna de flujo se controlan por el microprocesador 131', (u otro sistema adecuado de procesamiento) que es deseable que tenga una entrada y una salida comunes como se trato anteriormente.

De forma deseable, los parametros operativos de cada unidad de citometna de flujo 1003 se pueden fijar independientemente de las otras unidades para que tales parametros puedan variarse como entre unidades. Estos parametros pueden incluir, por ejemplo, la frecuencia de formacion de gotitas, las estrategias de control y separacion utilizadas por una unidad particular, los criterios usados por cada unidad para clasificar y separar las partfculas en el lfquido suministrado a la unidad y otros parametros. Por ejemplo, en ciertas situaciones puede ser deseable proporcionar a una o mas unidades con fluido portador 17' a una primera caudal y a otras unidades a una segunda (diferente) caudal. De manera semejante, puede ser aconsejable usar una estrategia de clasificacion de control (por ejemplo, una estrategia "de alta eficacia") para una o mas unidades mientras que se usa una diferente estrategia (por ejemplo, una estrategia de "perdida baja") para otras unidades. Mediante la variacion controlada de estos parametros entre las unidades, basada en los antecedentes y los datos recopilados en tiempo real, se puede administrar la produccion de las unidades y los resultados del sistema optimizado. La capacidad de funcionar independientemente tambien permite operar a unidades seleccionadas, en el caso de que no se necesiten o no esten disponibles todas las unidades.

I. Funcionamiento del sistema multi-canal

El funcionamiento del sistema multi-canal puede ser similar al descrito anteriormente, excepto en que las multiples unidades de citometna de flujo se adaptan para realizar operaciones de citometna de flujo en paralelo (es decir, durante el mismo penodo o penodos superpuestos) para una mayor produccion.

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Antes del comienzo de un proceso, el sistema de suministro de fluidos 1021 se enjuaga, si fuera necesario, con solucion de limpieza del tanque 1173 moviendo la valvula V5 a su posicion de limpieza. El sistema se acondiciona a continuacion con solucion tamponada usando la bomba de jeringa 1141. Durante este procedimiento, las valvulas V1A-V1D y V2A-V2D se mueven para establecer comunicacion con el receptaculo de desechos 1223 que esta al vado. Como resultado, la solucion de limpieza y/o la solucion tamponada fluyen a traves del sistema hacia los desechos. Este proceso limpia el sistema 1021, ceba la bomba de jeringa 1141 y extrae las burbujas de aire del sistema.

Con la valvula de tres vfas 1149 adecuadamente colocada, la bomba de jeringa 1141 se desplaza por un recorrido de admision para aspirar una cantidad de fluido portador 17' que contiene partmulas, por ejemplo, celulas espermaticas, despues de lo cual la valvula 1149 se mueve para establecer comunicacion con el colector 1177 y la bomba de jeringa se desplaza por un recorrido de descarga para bombear un volumen de fluido portador al deposito 1207 para llenarlo. La temperatura del fluido portador 17' es controlada por el sistema de control de temperatura 1257 para mantener las celulas del fluido portador a la temperatura deseada. Con las valvulas V1A-V1D en la posicion que establece comunicacion con el deposito de muestra 1207, un nuevo accionamiento de la bomba de jeringa 1141 fuerza al fluido portador, a traves de las lmeas, a las agujas de los respectivos conjuntos de boquillas para que fluya a traves de las boquillas 101', como se ha descrito anteriormente. Al mismo tiempo, y con las valvulas V2A-V2D en la posicion que establece comunicacion con el tanque del fluido envolvente 1155, el fluido envolvente 19' es forzado a traves de las lmeas de suministro a los cuerpos de flujo respectivos y a traves de las boquillas, tambien como se ha descrito anteriormente. Este proceso continua durante un penodo adecuado y suficiente para bombear un volumen apropiado de lfquido a traves del sistema 1001. La duracion de un proceso particular variara segun la cantidad de fluido portador del recipiente de suministro, la velocidad a la cual el fluido portador se bombea a traves del sistema, y el numero de canales del sistema. Por ejemplo, un proceso puede continuar solo durante un penodo limitado (por ejemplo, 15 minutos durante los cuales se dispensa un ml de fluido portador a cada boquilla) o puede continuar indefinidamente, con el suministro de fluido renovandose segun sea necesario.

Cuando una aguja 157' se obstruye, la valvula apropiada V1 se mueve para establecer comunicacion con el receptaculo de desechos 1223. El fluido envolvente 19' que se introduce en el cuerpo de flujo 133' fluira luego forzado por el vacfo 1225 nuevamente a traves de la aguja 157' a los desechos, enjuagando y limpiando de este modo a la aguja. Si hay necesidad de cerrar el flujo a una boquilla en particular, sencillamente se cambian las valvulas V1 y V2 a sus posiciones de desecho.

Aunque el sistema descrito en este documento en lo que se refiere a las configuraciones tanto monocanal como multi-canal se ha descrito con respecto a la separacion de partmulas, como la separacion de celulas X e Y, se contempla que dichas partmulas incluyan cualquier partmula que tenga caractensticas diferentes que pueden arbitrariamente indicarse como caractenstica A y caractenstica B. Aun mas, se comprendera que En algunos ejemplos, la funcion de separacion se puede eliminar por completo, para que el equipo de citometna de flujo (monocanal o multi-canal) opere solo clasificando las partmulas y no separandolas.

Si bien el sistema multi-canal se ha descrito anteriormente en el contexto de la operacion de las unidades de citometna de flujo en paralelo, se comprendera que las unidades tambien podnan operarse en serie. Por ejemplo, se contempla que las partmulas de una corriente podnan separarse por una unidad en multiples poblaciones, y que una o mas de las poblaciones separadas podna luego pasar a traves de una o mas de las otras unidades en serie para llevar a cabo operaciones adicionales de separacion con el fin de separar partmulas diferentes, usando la misma estrategia de clasificacion o una diferente.

J. Sistema multi-canal vertical

Las Fig. 119 y 120 muestran un sistema de citometna de flujo multi-canal. Este sistema que se designa en general 4001 consta de cuatro unidades de citometna de flujo 4009 agrupadas. El sistema de boquilla 101', el sistema optico de epi-iluminacion 450', las placas deflectoras 629', la estacion de muestra 4051, el mecanismo de prevencion de contaminacion 4031 y otros componentes de cada unidad 4009 estan montados en una tabla de montaje vertical compartida 4011. Con referencia a la Fig. 120, un unico laser 4013 y un sistema de division y orientacion del haz 4015, que es sustancialmente similar al sistema de division y orientacion del haz 1273 descrito anteriormente, proporciona iluminacion para cada sistema de epi-iluminacion 450'. El laser 4013 pasa a traves de un orificio 4019 (Fig. 119) en una cubierta comun 4021 que contiene el sistema de division y orientacion del haz 4115. El sistema de division y orientacion del haz 4115 y el sistema de epi-iluminacion 450' estan en un lado de la tabla 4011. El conjunto de la lente de enfoque 491' de cada sistema de epi-iluminacion 450' se extiende a traves de la tabla 4011 hasta el otro lado (similarmente a la configuracion mostrada en el sistema monocanal mostrado (Fig. 26 y 27), en el que estan montados los restantes componentes de las unidades 4009.

Las unidades 4009 estan todas orientadas de modo que sus sistemas de boquilla 101' dirijan las corrientes de lfquido 21' corriente abajo. Cada unidad 4009 tambien tiene un sistema de recogida 4031, que incluye un recipiente de recogida 4033 para recoger gotitas 33 que contienen una poblacion deseada de partmulas y un recipientes de desechos 4035 para recoger otras gotitas 33. Se puede usar un bano de agua (no se muestra) u otro control de

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temperatura para controlar la temperatura recipiente de recogida 4033.

Las multiples unidades de citometna de flujo 4009 tambien pueden compartir una fuente de energfa comun (no mostrada), una entrada comun para controlar el funcionamiento de las unidades (no mostrada), y una salida comun (no mostrada) que permita la evaluacion comparativa del funcionamiento de las unidades 4009 unas con relacion de las otras. Como se demuestra por la comparacion de dos ejemplos multi-canal ejemplares 1001, 4001, la naturaleza de la plataforma integrada y el compartir elementos entre multiples unidades de citometna de flujo en un sistema multi-canal puede variarse extensivamente.

Repercusion del procesamiento multi-canal en el proceso general

El proceso general descrito anteriormente se puede llevar a cabo con separacion multi-canal de esperma para disminuir el tiempo requerido para separar las celulas espermaticas. Con pocas excepciones, el metodo no cambia. Un cambio menor es que las celulas espermaticas separadas se recogeran en multiples recipientes de recogida. Si se desea, el contenido de los multiples recipientes de recogida se puede combinar para su concentracion. Alternativamente, el contenido de cada recipiente de recogida se puede concentrar por separado. Se apreciara que el tiempo necesario para separar un lote de celulas espermaticas (por ejemplo, una eyaculacion) desde la recogida hasta que se completa el etapa de crioconservacion, se puede reducir significativamente usando multiples unidades de citometna para procesar el lote. Por ejemplo, si cuatro unidades de citometna operan en paralelo para procesar el lote de celulas espermaticas, el tiempo necesario para completar la separacion se reduce a aproximadamente un cuarto del tiempo necesario para separar el lote usando una unica unidad de citometna. Por lo tanto, al sustituir la etapa de separacion de las celulas espermaticas con una unica unidad de citometna por la etapa de separacion de las celulas espermaticas con cuatro unidades de citometna que operan en paralelo, se puede reducir el ejemplo de cronograma para la realizacion completa del metodo desde la recogida hasta la finalizacion de la etapa de congelacion. El tiempo se puede reducir aun mas, aumentando la cantidad de citometros que funcionan en paralelo para separar las celulas espermaticas de la muestra, sujeto a las limitaciones practicas que implica el funcionamiento de un sistema en paralelo que tiene mas de cuatro de dichas unidades. De este modo, la etapa de clasificacion en el proceso general descrito anteriormente se realiza separando las celulas espermaticas segun una caractenstica espedfica de ADN en un equipo de citometna de flujo multi-canal. Por ejemplo el metodo de procesamiento de celulas espermaticas puede comprender la etapa de separacion de las celulas espermaticas segun una caractenstica espedfica de ADN en un equipo de citometna de flujo multi-canal en el que cada canal recoge aproximadamente de 2000 a 10000 celulas espermaticas con la caractenstica deseada de ADN por segundo.

Ejemplo I de clasificacion multi-canal

Se recogio semen de toro de un toro sexualmente maduro usando una vagina artificial y la muestra se transporto a una instalacion de tincion cercana en un envase de temperatura controlada a 37°C. Al llegar, se analizo la concentracion del semen, la motilidad visual, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton-Thorn Motility Analyzer (IVOS), segun los procedimientos estandar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)).

Se prepararon seis tubos de 1 ml de suspension de esperma de 150 X 106 celulas espermaticas/ml suspendiendo una alfcuota de semen a 41°C en solucion tamponada TCA N° 2 que contema piruvato 10 mM llevando el pH general a 7,35. Luego se anadieron a las muestras de esperma distintas cantidades de solucion acuosa de Hoechst 33342 10 mM para obtener las siguientes concentraciones finales de solucion de colorante Hoechst 33342: 200, 300, 400, 500, 600 y 700 |iM. Cada una de las seis muestras se incubo a 41°C durante 30 minutos aproximadamente. Las muestras fueron analizadas por citometna de flujo y el % de CV de la poblacion de celulas X se estimo por un algoritmo de computadora iterativo para las muestras de Hoechst 33342, 200, 300 y 400 |iM. Se determino que los % de CV para las soluciones de Hoechst 33342 300 y 200 |iM se encontraban en el intervalo aceptable proximo a 1,3 % de CV. En consecuencia, se determino que se usana una concentracion de solucion de Hoechst 33342 250 |iM para tenir un lote de celulas espermaticas para el procesamiento posterior.

Se prepararon dos tubos que conteman 2 ml cada uno de suspension de esperma de 150 X 106 celulas espermaticas/ml suspendiendo una alfcuota de semen a 41°C en solucion tamponada TCA N° 2 que contema piruvato 10 mM (llevando nuevamente el pH general a 7,35). Luego se agrego solucion acuosa de Hoechst 33342 10 mM a cada una de las dos suspensiones de esperma para obtener una concentracion final de solucion de colorante Hoechst 33342 250 |iM. Las suspensiones de esperma se mantuvieron en un bano de agua a 41°C durante 30 min. Despues de 30 minutos, las suspensiones de esperma se retiraron del bano de agua a 41°C y se anadieron 4 |il de solucion de FD&C N° 40 de 25 mg/ml a una de las suspensiones. La otra muestra se almaceno a temperatura ambiente para proporcionar muestras de comparacion para los ensayos de evaluacion.

La suspension de esperma tenida y enfriada se cargo sobre el puerto de muestra de un canal de un citometro de flujo de clasificacion de gotitas de cuatro canales. Como fluido envolvente se uso PBS de Dulbecco. El citometro se equipo con una boquilla orientadora como se ha descrito anteriormente y que tiene un orificio de 60 micrometros. Se instalo una placa deflectora semicircular perpendicular al eje longitudinal de la boquilla como se ha descrito

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anteriormente. El transductor se opero a 54 kHz y el sitio de division de la gotita se controlo manualmente. Un sistema optico de epi-iluminacion como se ha descrito anteriormente se uso para dirigir aproximadamente 25% del haz de una onda laser continua para que cruzara la corriente de fluido en un angulo perpendicular. Las lentes de enfoque y recogida teman una apertura numerica de 0,65. El haz se enfoco a una mancha luminosa que tema un ancho inferior a 3 |im para el barrido de ranura de las celulas espermaticas. Se utilizo el procesamiento de senales digitales para extraer la diferencia en la pendiente cntica y el area del pulso para cada pulso de onda detectado. Los parametros de clasificacion para la clasificacion de las celulas X, las celulas Y y las celulas indeterminadas en CSD bidimensional y el espacio caractenstico del area del pulso se ingresaron manualmente en el sistema de procesamiento para clasificar a las celulas espermaticas segun el contenido cromosomico.

El esperma se separo segun el contenido de cromosomas X e Y usando una estrategia de clasificacion de aceptacion de coincidencia para la recogida de celulas X, asignando un 50/50 de probabilidad de que cada celula espermatica sin clasificar fuera una celula X o una celula Y. Se ajusto manualmente la tasa de lfquido de la muestra para mantener la pureza de la poblacion de celulas X recogidas (segun se indica por el GUI) en un 85 % o mejor y para mantener la tasa de recogida de celulas X por encima de una tasa minima. Despues de que se recogieron en un tubo aproximadamente quince millones de celulas espermaticas X que habfan estado en remojo en el fluido envolvente durante al menos una hora y luego se habfan recubierto con 0,5 ml de solucion tamponada TCA N° 2 con 10 % de yema de huevo de pH 7,0, el tubo se retiro y se reemplazo con un tubo adicional que se habfa preparado de manera similar.

Inmediatamente despues de quitar un tubo de recogida del citometro de flujo, se preparo una muestra de comparacion de suspension de esperma tenido pero no separado. Las muestras separadas y de comparacion se centrifugaron durante 7 min a 750 g en un tubo de 15 ml. Se extrajeron los sobrenadantes usando una pipeta de transferencia para obtener una concentracion de aproximadamente 40 millones de celulas espermaticas/ml. Se agrego solucion tamponada TCA N° 2 de pH 7,0 a las suspensiones de esperma para obtener una concentracion final de aproximadamente 20 millones de celulas espermaticas/ml. Este proceso continuo hasta que el citometro de flujo produjo cuatro tubos de recogida (A2-A5). Las muestras separadas y las muestras de comparacion "no separadas" se evaluaron con el analizador IVOS. La muestra separada A3 y su muestra de comparacion no separada se evaluaron con respecto al % de acrosomas intactos mediante microscopfa de contraste de interferencia diferencial. Todas las muestras separadas se contaron con hemocitometro para determinar la tasa de produccion de esperma separado por hora. El % de esperma que tema cromosomas X se confirmo al volverlo a analizar con citometro de flujo. Se proporcionan los resultados de la evaluacion con el analizador IVOS de las muestras separadas y las muestras de comparacion "no separadas" en las Fig. 121 (motilidad) y 122 (motilidad progresiva). El numero total de esperma separado en cada tubo de recogida se muestra en la Fig. 123. La tasa de esperma separado por hora en cada penodo de recogida se muestra en la Fig. 124. El porcentaje de esperma que contiene cromosomas X para cada muestra separada se indica en la Fig. 125. Los resultados de la evaluacion de la integridad de los acrosomas fueron 72% de acrosomas intactos para la muestra separada y 78% para la muestra de comparacion no separada.

Los resultados demuestran la capacidad tecnica para producir mas de 5000 celulas X separadas por segundo con una pureza superior al 85 % por canal del sistema de citometna de flujo multi-canal durante penodos prolongados. Los resultados tambien muestran la capacidad tecnica para producir mas de 7000 celulas X por segundo con pureza superior al 85% durante penodos prolongados en condiciones ideales. Aun mas, los resultados indican que las muestras de celulas espermaticas separadas obtenidas mediante dicha separacion por citometna de flujo a gran velocidad solo sufriran leves disminuciones en la motilidad, lo que indica que el esperma separado tendra buena fecundidad.

Ejemplo II de clasificacion multi-canal

Se recogio semen de toro de un toro sexualmente maduro utilizando una vagina artificial. La eyaculacion se dividio en dos alfcuotas. La primera alfcuota de 250 |il de semen se suspendio en 5 ml de Triladyl® a 37°C. La segunda alfcuota, compuesta por el resto de la eyaculacion, se suspendio en dos partes de tampon de carbonato (pH 6,1-6,2) a 37°C. Ambas alfcuotas se transportaron a 37°C en un recipiente de temperatura controlada a una instalacion de procesamiento. En la instalacion de procesamiento, la primera alfcuota se hizo flotar en -120 ml de agua a 37°C en un vaso de precipitados de 200 ml y se coloco en una habitacion fna para enfriarla lentamente hasta 5° C. A la segunda alfcuota se le analizo la concentracion, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton- Thorn Motility Analyzer (IVOS), segun los procedimientos estandar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Marzo de 1998)).

Se prepararon tres tubos de 1 ml de una suspension de esperma de 150 X 106 celulas espermaticas/ml transfiriendo subalfcuotas que conteman 150 millones de celulas espermaticas de la segunda alfcuota a tubos vacfos, centrifugando a 500 g durante 5 min, retirando los sobrenadantes y resuspendiendo los sedimentos de esperma en 1 ml de tampon TCA N° 2 que contema piruvato 10 mM, de pH 7,35 a 28°C. Se agrego solucion de Hoechst 33342 10 mM en agua a cada uno de los tres tubos en diferentes cantidades para obtener concentraciones finales de colorante de 100, 150 y 200 |iM de Hoechst 33342. Cada uno de los tres tubos se mantuvo a 28°C durante aproximadamente 60 minutos. El esperma de cada uno de los tres tubos se analizo mediante citometna de flujo y se

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determino el CV de la intensidad de fluorescencia total de la poblacion X para las condiciones de tincion con 100, 150 y 200 |iM de Hoechst 33342 utilizando un algoritmo computacional interactivo. Los CV para 150 y 200 |i.M de Hoechst 33342 estuvieron ambos dentro del intervalo aceptable proximo al 1,3 %. De este modo, se determino usar las condiciones de tincion que inclman la concentracion 150 |iM de Hoechst 33342 para la clasificacion.

Se preparo un tubo que contema 5 ml de una suspension de esperma de 150 X 106 celulas espermaticas/ml transfiriendo subalfcuotas que conteman 750 millones de celulas espermaticas de la segunda alfcuota, centrifugando a 500 g durante 5 min, retirando los sobrenadantes y resuspendiendo los sedimentos de esperma en tampon TCA N° 2 que contema piruvato 10 mM, de pH 7,35 a 28°C. Se agrego solucion de 33342 diez mM en agua al tubo en una cantidad que dio una concentracion final de colorante de 150 |iM de Hoechst 33342. El tubo se mantuvo en bano de agua a 28°C durante 60 min. Despues de 60 minutos, el tubo se retiro del bano de agua a 28°C y se anadieron 10 |il de FD&C N° 40 de 25 mg/ml.

La suspension de esperma ahora tenida y enfriado se cargo en el puerto de muestra de un canal de un citometro de flujo multi-canal de clasificacion de gotitas. La suspension de esperma se mantuvo a 28°C. Utilizando practicamente las mismas regulaciones del instrumento que se establecieron en el Ejemplo I de Separacion multi-canal, se separaron las celulas espermaticas con cromosomas X e Y mediante un sistema de citometro de flujo utilizando una estrategia de interrupcion de coincidentes durante un penodo necesario para colocar una poblacion enriquecida en celulas X de aproximadamente dieciocho millones de celulas espermaticas en un tubo de recogida que se habfa preparado sumergiendolo en fluido envolvente durante al menos una hora y luego agregando 0,5 ml de medio de crioconservacion Triladyl® que contema piruvato 10 mM de pH 6,6. Las celulas espermaticas se introdujeron en el sistema de citometna de flujo a una velocidad entre aproximadamente 25000 y 30000 celulas/segundo. Se recogio una poblacion enriquecida de celulas X a una velocidad que vario entre 4500 celulas por segundo y 6000 celulas por segundo. Una vez que se separaron aproximadamente dieciocho millones de celulas espermaticas en un tubo de recogida, el tubo se retiro y se remplazo por otro tubo que se habfa preparado de manera similar. Inmediatamente despues de retirar el tubo de recogida del citometro de flujo, la suspension de esperma separado se centrifugo a 700 g durante 7 minutos. Se extrajo el sobrenadante usando una pipeta de transferencia para obtener una concentracion de aproximadamente 100 millones de celulas espermaticas/ml. Se agrego solucion de crioconservacion Triladyl® que contema piruvato 10 mM (pH 6,6) a las suspensiones de esperma para obtener una concentracion final de aproximadamente 50 millones de celulas espermaticas/ml. Este proceso continuo hasta que el citometro de flujo produjo tres tubos de recogida (D1-D3). Aproximadamente 52 millones de celulas espermaticas fueron separados en 259 min obteniendose una velocidad de recogida general de aproximadamente 12 millones de celulas espermaticas X por hora de separacion. Los tubos de muestra separada y resuspendida se hicieron flotar en ~120 ml de agua a 28°C en un vaso de precipitados de 200 ml y se colocaron en una habitacion fna a 5° C para enfriarlos lentamente.

Despues que las muestras separadas alcanzaron los 5°C, los tres tubos de esperma separado se combinaron en un tubo. La mezcla de muestras se analizo con el analizador IVOS para determinar el % de motilidad, el % de motilidad progresiva y la concentracion. Se agrego mas medio de crioconservacion Triladyl® que contema piruvato 10 mM pH 6,6 a la muestra para obtener una concentracion final de aproximadamente 50 millones de celulas espermaticas/ml. El % de celulas espermaticas que conteman cromosomas X en la mezcla de muestras fue del 87 % como se determino mediante repeticion del analisis con citometro de flujo. Un resumen de la evaluacion del analizador IVOS en comparacion con la muestra no separada de la misma eyaculacion se ilustra en la Fig. 126.

La muestra clasificada combinada y la primera alfcuota se cargaron en una pajita estandar de 0,25 ce en una habitacion fna a 5o C. Las pajitas cargadas se transfirieron a un congelador programable y se congelaron segun el programa siguiente: 5 min a 5oC, enfriar desde 5oC hasta -12°C a 4oC/min, enfriar desde -12°C hasta -100°C a 40°C/min, enfriar desde -100°C hasta -140°C a 20°C/min, mantener a -140°C. Despues que las pajitas alcanzaron los -140°C, se retiraron rapidamente del congelador y se sumergieron en nitrogeno lfquido.

Las pajitas descongeladas se analizaron con el analizador IVOS para el % de motilidad y el % de motilidad progresiva despues de la incubacion a 37°C durante 30 y 120 minutos. Los resultados de un conjunto de dos pajitas separadas y no separadas se resumen en la Fig. 127 y la Fig. 128.

Ejemplo III de clasificacion multi-canal

Se recogio semen de un toro maduro sexualmente utilizando una vagina artificial y la eyaculacion se dividio en dos alfcuotas. Una primera alfcuota de 250 |il de semen se suspendio en 5 ml de Triladyl® a 37°C. Una segunda alfcuota, compuesta por el resto de la eyaculacion, se suspendio en dos partes de tampon de carbonato (dos partes 0,097 moles/l de NaHCOa, 0,173 moles/l de KHCO3) 0,090 moles/l de C6H8O7H2O en agua) (pH 6,1-6,2) a 37°C. Ambas alfcuotas se transportaron a 37°C en un recipiente de temperatura controlada a la instalacion de procesamiento. En la instalacion de procesamiento, la primera alfcuota se hizo flotar en ~120 ml de agua a 37°C en un vaso de precipitados de 200 ml y se coloco en una habitacion fna para enfriarla lentamente hasta 5o C. A la segunda alfcuota se le analizo la concentracion, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton- Thorn Motility Analyzer (IVOS), segun los procedimientos estandar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4); 871-9 (Mar 1998)).

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Se prepararon dos tubos con la suspension de esperma que contema 150 X 106 celulas espermaticas/ml transfiriendo a cada uno de los dos tubos vados una fraccion que contema 900 millones de celulas espermaticas de la segunda alfcuota, centrifugando cada tubo a 500 X g durante 5 minutos, retirando el sobrenadante de cada tubo y resuspendiendo cada uno de los sedimentos de esperma en 6 ml de tampon TCA N° 2 que contema piruvato 10 mM de (pH 7,35) a 28°C. A cada uno de los tubos se agrego solucion Hoechst 33342 10 mM para obtener concentraciones finales del colorante de 200 |iM de Hoechst 33342 en un tubo y 400 |iM de Hoechst 33342 en el otro tubo. Cada uno de los tubos se mantuvo a 28°C durante aproximadamente 120 minutos. El esperma de cada uno de los tubos se analizo mediante citometna de flujo y se determino el CV de la intensidad de fluorescencia total de la poblacion X para las condiciones de tincion con 200 |iM y 400 |iM de Hoechst 33342 utilizando un algoritmo computacional interactivo. Los CV para Hoeschst 33342 para 200 |iM y 400 |iM estuvieron ambos dentro del intervalo aceptable proximo al 1,3 %. La suspension de esperma tenido con una concentracion de 200 ptM de Hoechst 33342 se eligio para la separacion. Se anadieron 10 |il de FD&C N° 40 de 25 mg/ml a este tubo de suspension de esperma tenido inmediatamente antes de la separacion.

La suspension de esperma tenido se cargo en el puerto de muestra de un canal de un citometro de flujo multi-canal de clasificacion de gotitas. La suspension de esperma se mantuvo a 28°C. Utilizando practicamente las mismas regulaciones del instrumento que se establecieron en el Ejemplo I de Separacion multi-canal, utilizando una estrategia de interrupcion de coincidentes durante se separaron las celulas espermaticas con cromosomas X e Y mediante el sistema de citometna de flujo durante un penodo necesario para colocar una poblacion de celulas enriquecida en cromosomas X de aproximadamente dieciocho millones de celulas espermaticas en un tubo de recogida que se habfa preparado sumergiendolo en tampon envolvente durante al menos una hora y luego agregando 0,5 ml de medio de crioconservacion Triladyl® de pH 6,6. Las celulas espermaticas se introdujeron en el sistema de citometna de flujo a una velocidad entre aproximadamente 25000 y 30000 celulas/segundo. Se recogio una poblacion enriquecida de celulas con el cromosoma X a una velocidad que vario entre 4500 celulas por segundo y 6000 celulas por segundo. Una vez que se separaron aproximadamente dieciocho millones de celulas espermaticas en un tubo de recogida, el tubo se retiro y se remplazo por otro tubo que se habfa preparado de manera similar. Inmediatamente despues de retirar un tubo de recogida del citometro de flujo, la suspension de esperma separado se centrifugo durante 7 min a 700 X g. El sobrenadante se extrajo con una pipeta de transferencia para obtener una concentracion de aproximadamente 100 millones de celulas espermaticas/ml. Se agrego medio de crioconservacion Triladyl® (pH 6,6) a las suspensiones de esperma para obtener una concentracion final de aproximadamente 50 millones de celulas espermaticas/ml. Este proceso continuo hasta que el citometro de flujo produjo dos tubos de recogida (C1-C3). Aproximadamente 35 millones de celulas espermaticas fueron separados en 193 minutos obteniendose una velocidad de recogida general de 11 millones de celulas espermaticas con el cromosoma X por hora de separacion. Los tubos de muestra separada y resuspendida se hicieron flotar en ~120 ml de agua a 28°C en un vaso de precipitados de 200 ml y se colocaron en una habitacion fna a 5° C para enfriarlos lentamente.

Despues que las muestras separadas alcanzaron los 5o C, los tres tubos de esperma separado se combinaron en un tubo. La mezcla de muestras se analizo con el analizador IVOS para determinar el % de motilidad, el % de motilidad progresiva y la concentracion. Se agrego mas medio de crioconservacion Triladyl® (pH 6,6) a la muestra para obtener una concentracion final de aproximadamente 50 millones de celulas espermaticas/ml. El % de celulas espermaticas que conteman cromosomas X en la mezcla de muestras fue del 88% como se determino mediante repeticion del analisis con citometro de flujo. Un resumen de la evaluacion del analizador IVOS en comparacion con la muestra no separada de la misma eyaculacion se ilustra en la Fig. 129.

La muestra combinada clasificada y no clasificada (es decir, la primera alfcuota antes mencionada) se cargaron en pajitas estandar de 0,25 cc en una habitacion fna a 5o C. Las pajitas cargadas se transfirieron a un congelador programable y se congelaron segun el programa siguiente: 5 min a 5oC, enfriar desde 5oC hasta -12°C a 4oC/min, enfriar desde -12°C hasta -100°C a 40°C/min, enfriar desde -100°C hasta -140°C a 20°C/min, mantener a -140°C. Despues que las pajitas alcanzaron los -140°C, se retiraron rapidamente del congelador y se sumergieron en nitrogeno lfquido.

Las pajitas descongeladas se analizaron con el analizador IVOS para el % de motilidad y el % de motilidad progresiva despues de la incubacion a 37°C durante 30 y 120 minutos. Los resultados de un conjunto de pajitas separadas y no separadas se resumen en las Fig. 130 y 131.

Ejemplo IV de clasificacion multi-canal

Se recogio semen de toro de un toro sexualmente maduro utilizando una vagina artificial y la eyaculacion se dividio en dos alfcuotas. La primera alfcuota de 250 |il de semen se suspendio en 5 ml de Triladyl® a 37°C. La segunda alfcuota, compuesta por el resto de la eyaculacion, se suspendio en dos partes de tampon de carbonato a 37°C (dos partes 0,097 moles/l de NaHCOa; 0,173 moles/l de KHCO3; 0,090 moles/l de C6H8O7-H2O en agua) (pH 6,1-6,2) y se mantuvo bajo CO2. Ambas alfcuotas se transportaron a 37°C en un recipiente de temperatura controlada a la instalacion de procesamiento. En la instalacion de procesamiento, la primera alfcuota se hizo flotar en ~120 ml de

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agua a 37°C en un vaso de precipitados de 200 ml y se coloco en la habitacion fna para enfriarla lentamente hasta 5° C. A la segunda aKcuota se le analizo la concentracion, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton-Thorn Motility Analyzer (IVOS), segun los procedimientos estandar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Marzo de 1998)).

Se preparo un tubo de 5 ml de suspension de esperma de 150 X 106 celulas espermaticas/ml transfiriendo una fraccion que contema 750 millones de celulas espermaticas de la segunda alfcuota (pH 6,1-6,2) a un tubo vado y agregando tampon de carbonato a 28°C (pH 7,35) hasta un volumen final de 5 ml. A esta suspension de esperma, se le agrego solucion de Hoechst 33342 10 mM en agua para obtener una concentracion final 150 |iM de colorante Hoechst 33342. La suspension se mantuvo a 41°C bajo CO2 durante aproximadamente 40 minutos y luego se coloco a 28°C para su separacion. Se anadieron diez |il de FD&C N° 40 de 25 mg/ml al tubo de la suspension de esperma tenido justo antes de la separacion.

La suspension de esperma tenido se cargo en el puerto de muestra de un canal de un citometro de flujo multi-canal de clasificacion de gotitas. La suspension de esperma se mantuvo a 28°C. Se separaron las celulas espermaticas con cromosomas X e Y mediante un sistema de citometro de flujo utilizando una estrategia de interrupcion de coincidentes durante un penodo necesario para colocar una poblacion de celulas enriquecida en cromosomas X de aproximadamente dieciocho millones de celulas espermaticas en un tubo de recogida que se habfa preparado sumergiendolo en tampon envolvente durante al menos una hora y despues agregandole 0,5 ml de medio de crioconservacion Triladyl® (pH 6,6). Las celulas espermaticas se introdujeron en el sistema de citometna de flujo a una velocidad entre aproximadamente 25000 y 30000 celulas/segundo. Se recogio una poblacion enriquecida de celulas con cromosomas X a una velocidad que vario entre 4500 celulas por segundo y 6000 celulas por segundo. Una vez que se separaron aproximadamente 18 millones de celulas espermaticas en un tubo de recogida, el tubo se retiro y se remplazo por otro tubo que se habfa preparado de manera similar. Inmediatamente despues de retirar el tubo de recogida del citometro de flujo, la suspension de esperma separado se centrifugo a 700 X g durante 7 minutos. Se extrajo el sobrenadante usando una pipeta de transferencia para obtener una concentracion de aproximadamente 100 millones de celulas espermaticas/ml. Se agrego medio de crioconservacion Triladyl® y piruvato (pH 6,6) a las suspensiones de esperma para obtener una concentracion final de aproximadamente 50 millones de celulas espermaticas/ml. Este proceso continuo hasta que el citometro de flujo produjo dos tubos de recogida (C2-C3). Los tubos de muestra separada y resuspendida se hicieron flotar en ~120 ml de agua a 28°C en un vaso de precipitados de 200 ml y se colocaron en una habitacion fna a 5o C para enfriarlos lentamente.

Despues que las muestras separadas alcanzaron los 5o C, los dos tubos de esperma separado se combinaron en un tubo. La mezcla de muestras se analizo con el analizador IVOS para determinar el % de motilidad, el % de motilidad progresiva y la concentracion. Se agrego mas medio de crioconservacion Triladyl® y piruvato (pH 6,6) a la muestra para obtener una concentracion final de aproximadamente 50 millones de celulas espermaticas por ml. Un resumen de la evaluacion del analizador IVOS en comparacion con la muestra no separada de la misma eyaculacion se ilustra en la Fig. 132.

La muestra combinada clasificada y la muestra sin clasificar (es decir, la primera alfcuota antes mencionada) se cargaron en pajitas estandar de 0,25 cc en la habitacion fna a 5oC. Las pajitas cargadas se transfirieron a un congelador programable y se congelaron segun el programa siguiente: 5 min a 5oC, enfriar desde 5oC hasta -12°C a 4oC/min, enfriar desde -12°C hasta -100°C a 40°C/min, enfriar desde -100°C hasta -140°C a 20°C/min, mantener a - 140°C. Despues que las pajitas alcanzaron los -140°C, se retiraron rapidamente del congelador y se sumergieron en nitrogeno lfquido.

Las pajitas descongeladas se analizaron con el analizador IVOS para el % de motilidad y el % de motilidad progresiva inmediatamente despues de descongelarlas y despues de la incubacion a 37°C durante 30 minutos. Los resultados de un conjunto de dos pajitas separadas y no separadas se resumen en las Fig. 133 y 134.

SISTEMA DE BOQUILLA DE TUBO CAPILAR

La Fig. 135 ilustra un sistema alternativo de boquilla, generalmente designado 1335, similar al que se describio anteriormente excepto en que un tubo capilar 1337(de cuarzo o sflice fundido, por ejemplo) esta conectado a la boquilla 137 para que el lfquido que esta saliendo del orificio de la boquilla 103 se dirija hacia el interior y a traves del tubo. El sistema optico 109 del citometro de flujo esta acoplado opticamente al lado del tubo de manera apropiada, como mediante una camara 1341 llena con un medio que transmite luz como aceite o gel que tienen un mdice de refraccion conocido. El uso de un tubo capilar, en comparacion con la salida en chorro de la corriente de fluido a traves del espacio abierto, tiene el beneficio de reducir la estratificacion lenticular de la corriente 21 debido a la energfa acustica provista por el transductor 105 y permitir que la lente de enfoque 1343 se coloque de inmediato adyacente a la corriente de fluido para aumentar la resolucion de las senales de emision.

Una vez que se haya interrogado y clasificado a las partfculas, se las puede separar usando cualquier tecnica convencional conocida por los especialistas en la tecnica, como por ejemplo mediante el uso de un dispositivo de desviacion del lfquido que se muestra en la Fig. 137 u otros dispositivos apropiados como los sistemas de foto deterioro o los sistemas de clasificacion de gotitas.

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TECNICAS DE CLASIFICACION DIFERENTES DE LA TECNICA DE CLASIFICACION DE GOTITAS

Clasificacion por foto deterioro

Las mejoras en la citometna de flujo son aplicables no solo a la clasificacion de celulas en gotitas como se ha descrito anteriormente, sino tambien a otras tecnicas de clasificacion, como la clasificacion por foto deterioro (ablacion con laser). La clasificacion por foto deterioro se trata en la patente de los Estados Unidos N° 4.395.397. La Fig. 136 ilustra esquematicamente un ejemplo de un sistema de foto deterioro de citometna de flujo monocanal, generalmente designado con su numero de referencia.

Como se muestra en la Fig. 136, el sistema de clasificacion por foto deterioro 1351 es similar al sistema de clasificacion de gotitas de la Fig. 2 y las partes correspondientes se designan con los numeros de referencia correspondientes con el agregado de numero primo doble ("). En general, el sistema comprende los mismos componentes que el sistema de la Fig. 2, excepto en que se eliminan los componentes de clasificacion de gotitas (por ejemplo, el transductor 105, el dispositivo de carga 627, las placas deflectoras 629 y las fuentes de energfa asociadas 635). En cambio estos componentes se remplazan por un laser 1353 o un dispositivo similar que responde a las instrucciones recibidas del microprocesador 131" para extirpar las partfculas no deseadas de la corriente de fluido 21". Como resultado, la corriente recogida en un receptaculo de recogida 1355 contiene una poblacion deseada de partfculas. Por ejemplo, si las partfculas a analizar son celulas espermaticas y el resultado buscado es recoger celulas espermaticas con una caractenstica A (por ejemplo, un contenido del cromosoma deseado), entonces el microprocesador recibe senales del sistema de epi-iluminacion 415" que identifica las celulas que no tienen la caractenstico A y activa selectivamente el laser para extirpar dichas celulas o de otro modo las vuelve ineficaces.

Se pueden emplear diferentes estrategias de clasificacion de control en un sistema de foto deterioro, incluso las estrategias de clasificacion de "alta recuperacion" y de "pureza elevada" analizadas anteriormente en el contexto de un clasificador de gotitas. En un sistema de foto deterioro, las partfculas contenidas en la corriente de fluido estan espaciadas a diversos intervalos a lo largo de la corriente y en general estan una despues de la otra en fila india. Las partfculas tienen diferentes caractensticas, algunas tienen una caractenstica A, por ejemplo y otras tienen una caractenstica B. La secuencia de las partfculas es aleatoria, asf que vista como una procesion continua, las partfculas se pueden dividir en diferentes series de partfculas, una atras de la otra, incluida una primera serie de partfculas que consta solo de una o mas partfculas que tienen la caractenstica A, una segunda serie de partfculas que consta solo de una o mas partfculas que tienen la caractenstica B y una tercera serie de partfculas que consta de dos o mas partfculas muy juntas al menos una de las cuales tiene la caractenstica A y al menos una de las cuales tiene la caractenstica B. El ultimo (tercer) grupo corresponde en general a las partfculas muy juntas en una gotita "coincidente" tratada anteriormente, al menos a los efectos de la estrategia de clasificacion. Por lo tanto, dos o mas partfculas del tercer grupo pueden estar muy juntas en el sentido de que la separacion entre las partfculas es insuficiente para permitir una discriminacion o clasificacion exacta de las partfculas, o porque tal separacion es insuficiente para permitir a una partfcula de la serie extirparse por el laser sin danar a la(s) otra(s) partfcula (s) de la misma serie. De todas maneras, las partfculas muy juntas en cada (o al menos en alguna) tercera serie de partfculas se pueden extirpar o no extirpar, segun la estrategia de clasificacion empleada. Debe senalarse que multiples partfculas en una primera serie o multiples partfculas en una segunda serie podnan estar "muy juntas", pero puesto que las partfculas en cualquiera de dichas series tienen la misma caractenstica (A o B), se las trata como a una serie de partfcula unica, al menos a efectos de la estrategia de clasificacion.

El sistema de foto deterioro puede ser un sistema monocanal o un sistema multi-canal, como se ha descrito anteriormente.

Clasificacion por conmutacion de fluidos

Se considera que los principios de esta invencion pueden tambien aplicarse a los sistemas de citometna de flujo que usan tecnicas de conmutacion de fluidos, como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos N° 6.432.246 (Adair), 4.756.427 (Gohde et al.), y 3.791.517 (Friedman). La Fig. 137 es una vista parcial de un sistema de ese tipo, generalmente designado 1357. Es practicamente identico al sistema que se muestra en la Fig. 2 excepto en que el sistema de boquilla 101" incluye un tubo capilar 1369 (por ejemplo, vease la Fig. 135) y el sistema de clasificacion comprende un dispositivo de conmutacion de fluidos 1359 acoplado al tubo capilar 1369 mas alla de la localizacion de examen 115'. La construccion y el funcionamiento del dispositivo de conmutacion de fluidos pueden incorporar cualquier tecnologfa de conmutacion de fluidos convencional como se describe en las patentes referenciadas anteriormente. En general, el dispositivo funciona separando las partfculas deseadas de las partfculas no deseadas en respuesta a las instrucciones recibidas del procesador, al desviar intermitentemente las porciones de la corriente de fluido que contienen las partfculas deseadas o no deseadas a lo largo de pasos de flujo independientes 1361 y 1365 para la recogida en recipientes o similares. La conmutacion se logra habitualmente accionando selectivamente un transductor 1367 en uno de los pasos de flujo.

Las diversas estrategias de clasificacion descritas anteriormente respecto a la clasificacion de gotitas y la

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clasificacion por foto deterioro tambien se pueden emplear en un sistema de conmutacion de fluidos. En el sistema de conmutacion de fluidos, las partfculas contenidas en la corriente de fluido tambien estan espaciadas a diversos intervalos a lo largo de la corriente y en general una detras de la otra en fila india. Las partfculas tienen diferentes caractensticas, algunas tienen una caractenstica A, por ejemplo y otras tienen una caractenstica B y la secuencia de partfculas es aleatoria. Por consiguiente, como se ha analizado anteriormente con respecto al sistema de foto deterioro, la procesion de partfculas se puede dividir en diferentes series de partfculas, una detras de la otra, incluida una primera serie de partfculas que consta de una o mas partfculas que tienen la caractenstica A, una segunda serie de partfculas que consta de una o mas partfculas que tienen la caractenstica B y una tercera serie de partfculas que consta de dos o mas partfculas muy juntas al menos una de las cuales tiene la caractenstica A y al menos una de las cuales tiene la caractenstica B. El ultimo (tercer) grupo corresponde en general a las partfculas muy juntas en una gotita "coincidente" tratada anteriormente, al menos a los efectos de la estrategia de clasificacion. Por lo tanto, dos o mas partfculas del tercer grupo pueden estar muy juntas en el sentido de que la separacion entre las partfculas es insuficiente para permitir una discriminacion o clasificacion exacta de las partfculas, o porque tal separacion es insuficiente para permitir a una partfcula de la serie desviarse por el dispositivo de conmutacion de fluidos separada de otra partfcula de la misma serie. De todas maneras, las partfculas muy juntas en cada (o al menos en alguna) tercera serie de partfculas se pueden desviar a un sitio de recogida o a otro, segun la estrategia de clasificacion empleada. Segun se explico antes con respecto a la clasificacion por foto deterioro, multiples partfculas de una primera serie o multiples partfculas de una segunda serie podnan estar "muy juntas", pero puesto que las partfculas de cualquiera de dichas series tienen la misma caractenstica (A o B), se tratan como una serie de partfcula unica a los efectos de la estrategia de clasificacion.

El sistema de conmutacion de fluidos puede ser un sistema monocanal o multi-canal, como se ha descrito anteriormente.

Separacion por interferencia de gotitas

Puede usarse un sistema de clasificacion por interferencia de gotitas de alta velocidad 1371, que se muestra esquematicamente en la Fig. 138, para clasificar las partfculas al desviar los segmentos seleccionados de la corriente coaxial de fluido portador y fluido envolvente.

En contraposicion a algunas otras tecnicas de clasificacion, la tecnica de separacion por interferencia de gotitas no necesita que la corriente coaxial de fluido portador y de fluido envolvente forme gotitas. Por lo tanto, no hay ninguna necesidad de acoplar al sistema de boquilla 101"' usado para dispensar el fluido portador y el fluido envolvente con un sistema generador de gotitas. Unicamente a modo de ejemplo, pasar los fluidos portador y envolvente a traves de un sistema de boquilla a 60 psi (413,57 kPa) para crear una corriente de 50 micrometros de diametro es una disposicion adecuada para la formacion de una corriente coaxial laminar de fluido para la suministrar partfculas al sistema de clasificacion por interferencia de gotitas. Las partfculas de la corriente coaxial de fluido se analizan y clasifican mediante el sistema optico 109'" y el procesador 131'" a medida que se mueven a traves de la localizacion de examen 115"', segun se ha descrito anteriormente para los otros sistemas de clasificacion. La clasificacion se produce mas alla de la localizacion de examen, en un lugar donde la corriente coaxial de fluido cruza una corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad 1373.

La corriente de interferencia de gotitas 1373 se genera por un sistema de generacion de gotitas 1375 similar al sistema de generacion de gotitas usado para la clasificacion de gotitas. Una corriente de fluido de alta velocidad 1379 pasa a traves de un sistema de boquilla de gran velocidad 1377 que esta acoplado a un transductor piezoelectrico 1381 u otra fuente de energfa acustica para hacer que la corriente de fluido de alta velocidad se rompa en gotitas 1383 mas alla de la boquilla de alta velocidad. Por ejemplo, un lfquido sin partfculas a 1500 psi (10,34 MPa) puede pasar a traves de una boquilla de alta velocidad para formar un chorro de fluido de 70 micrometros de diametro de alta velocidad. La boquilla de alta velocidad puede hacerse oscilar a 400 kHz para formar gotitas de alta velocidad. Las gotitas de alta velocidad 1383 pasan por un campo electrico generado por una o mas placas deflectoras electricas 1387 de modo que el recorrido de las gotitas de alta velocidad pueda controlarse al aplicar selectivamente una carga electrica a las gotitas, como se hizo para controlar el recorrido de las gotitas en el sistema de clasificacion de gotitas. La corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad se dirige de modo que algunas gotitas de alta velocidad crucen la corriente coaxial de lfquido en un sitio 1399 mas alla de la localizacion de examen. Por ejemplo, las gotitas sin cargar 1389 se pueden dirigir para que choquen con la corriente de fluido en tanto que las gotitas cargadas 1391 se desvfan lejos de la corriente coaxial de fluido. Cuando una gotita de alta velocidad choca con la corriente coaxial de fluido, un segmento 1397 de la corriente de fluido y todas las partfculas contenidas en ella se desvfan del camino que de otro modo habnan tomado. La aplicacion de una carga o de ninguna carga a una gotita de alta velocidad se sincroniza para que la llegada de esa gotita a la interseccion 1399 con la corriente coaxial de lfquido coincida con la llegada de un segmento particular de la corriente coaxial de fluido. Por lo tanto, al cargar selectivamente las gotitas de alta velocidad dependiendo de la clasificacion de las partfculas contenidas en los segmentos de la corriente coaxial, se pueden separar las partfculas al desviar todos los segmentos de la corriente coaxial de fluido que contienen una o mas partfculas seleccionadas y no desviando otros segmentos de la corriente coaxial o viceversa. Se pueden usar capilares de recogida 1403 que tienen un vacfo leve para recoger tanto el segmento desviado 1397 como el no desviado de la corriente coaxial. Se puede fijar el sistema de clasificacion por interferencia de gotitas para que las gotitas de alta velocidad se fusionen con segmentos

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desviados de la corriente coaxial o para que las gotitas de alta velocidad permanezcan separadas de los segmentos desviados de la corriente despues de la colision con los segmentos de la corriente coaxial.

Dado que no hay partfculas ni celulas en la corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad 1373, es posible usar presiones muy altas y frecuencias de gotitas muy altas sin danar a las partfculas ni a las celulas que se van a clasificar. Esto permite la clasificacion de segmentos de la corriente cada uno de los cuales tiene menos volumen (por ejemplo, cuatro veces menos volumen) que el volumen de una gotita en el sistema de clasificacion de gotitas. Esto aumenta en gran medida la maxima produccion del sistema a la vez que reduce el factor de dilucion de las partfculas separadas. Es mas, debido a que se usa un lfquido finamente filtrado sin celulas ni partfculas para formar la corriente de interferencia de gotitas, es posible la formacion mas uniforme de gotitas porque la boquilla de formacion de gotitas tiene menor probabilidad de obstruirse o sufrir acumulacion proteica que el sistema de boquilla usado en el sistema de clasificacion de gotitas. Otra ventaja es que la distancia entre el analisis de partfculas en el localizacion de examen y el sitio de separacion 1399 se puede reducir (por ejemplo, a la cuarta parte), permitiendo predecir de manera mas exacta el tiempo de llegada de una partfcula particular al punto de clasificacion. Ademas, el sistema de interferencia de gotitas permite una mayor flexibilidad en el ajuste del tamano o la presion de la boquilla para la corriente coaxial de fluido. Si se desea, el sistema de clasificacion por interferencia de gotitas se puede combinar con el sistema de boquilla de tubo capilar. Un sistema multi-canal de separacion por interferencia de gotitas puede usar una bomba flmdica de alta presion para suministrar lfquido de una fuente comun de suministro a multiples boquillas generadoras de una corriente de interferencia de gotitas.

Cuando se introducen elementos del ejemplo o ejemplos de la misma, los artfculos "un", "una", "el", "la" y "dicho" o "dicha" pretenden indicar que hay uno o mas de los elementos. Las expresiones "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pretender ser inclusivos y quieren decir que puede haber elementos adicionales diferentes a los elementos enumerados. El termino "o" pretende incluir "y/o" y quiere decir "uno u otro o ambos". Por lo tanto, una indicacion de "ABC o DEF" significa (1) ABC, o (2) DEF, o (3) tanto ABC como DEF. El termino "y/o" pretende indicar lo mismo que "o" como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, el termino "y/o" pretende incluir "o" y quiere decir "uno u otro o ambos". Por ejemplo, una indicacion de "ABC y/o DEF" significa (1) ABC, o (2) DEF, o (3) tanto ABC como DEF.

En vista de lo anterior, se observara que se consiguen los varios objetivos de la invencion y se obtienen otros resultados beneficiosos.

Como podnan hacerse diversos cambios en las construcciones, productos y metodos anteriores sin alejarse del alcance de la invencion, se pretende que toda la materia contenida en la descripcion anterior y mostrada en los dibujos adjuntos se interprete como ilustrativa y no en un sentido limitante.

La presente invencion se refiere a la siguiente materia espedfica.

A. CSD y barrido de ranura de acuerdo con la presente invencion

a. Celulas espermaticas

A1. Un metodo para analizar las caractensticas del ADN cromosomico de celulas espermaticas animales en una corriente de fluido que tiene una direccion de flujo, donde cada celula del esperma tiene una cabeza con un nucleo que comprende una region cromosomica localizada que contiene al menos un cromosoma, donde dicho nucleo tiene una longitud en la direccion del flujo de la corriente, donde dicho metodo comprende:

enfocar un haz de radiacion electromagnetica en la corriente de fluido como un punto generalmente elfptico que tiene una longitud a lo largo de un eje principal que se extiende generalmente en angulos rectos a la direccion del flujo de la corriente y una anchura a lo largo de un eje menor que se extiende generalmente paralelo a la direccion del flujo de la corriente, donde la anchura del punto de iluminacion es menor que la longitud de dicho nucleo, donde dichas celulas espermaticas estan adaptadas para pasar a traves de dicho punto lo que resulta en emisiones de radiacion electromagnetica procedente de las celulas espermaticas, que incluyen emisiones procedentes de dichas regiones cromosomicas indicativas de las caractensticas del ADN cromosomico de las regiones;

detectar y convertir al menos parte de dichas emisiones procedentes de las regiones cromosomicas en senales electricas analogicas que vanan con el tiempo indicativas de dichas caractensticas del ADN cromosomico;

muestrear digitalmente la senal analogica que vana con el tiempo y proporcionar un resultado que incluya la informacion digital correspondiente a dicha senal analogica que vana con el tiempo;

analizar la informacion digital para extraer informacion indicativa de una caractenstica derivada a partir de las senales analogicas que vanan con el tiempo; y

clasificar al menos parte de las celulas espermaticas como celulas que tienen una caractenstica del ADN cromosomico particular en funcion de al menos parte de dicha informacion extrafda

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A2. El metodo de A1 donde dichas caractensticas del ADN cromosomico son indicativas del sexo de las celulas espermaticas.

A3. El metodo de A2 donde dichas celulas espermaticas son celulas espermaticas bovinas.

A4. El metodo de A3 donde dicha region cromosomica se ubica dentro de un area del nucleo que se extiende no mas de aproximadamente un 20% de la longitud del nucleo en cualquiera de los lados de un centro longitudinal del nucleo.

A5. El aparato de A3 donde dicha region cromosomica se ubica dentro de un area del nucleo que se extiende no mas de aproximadamente un 10%-15% de la longitud del nucleo en cualquiera de los lados de un centro longitudinal del nucleo.

A6. El metodo de A1, donde el paso de muestrear digitalmente comprende muestrear sincronicamente el resultado analogico que vana con el tiempo.

A7. El metodo de A1 donde dicha anchura del punto es menor que aproximadamente 3.0 pm.

A8. El metodo de A7 donde dicha longitud del punto es mayor que aproximadamente 100 pm.

A9. El metodo de A1 que ademas comprende ejercer una fuerza sobre las celulas espermaticas en la corriente que tienda a colocarlas en la orientacion deseada antes de que la corriente pase a traves de dicho haz.

A10. El metodo de A1 que ademas comprende la clasificacion de gotitas de gotitas de dichas celulas espermaticas de acuerdo con dichas caractensticas del ADN cromosomico.

A11. El metodo de A1 que ademas comprende la clasificacion por foto deterioro de dichas celulas espermaticas de acuerdo con dichas caractensticas del aDn cromosomico.

A12. El metodo de A1 que ademas comprende la clasificacion por conmutacion de fluidos de dichas celulas espermaticas de acuerdo con dichas caractensticas del ADN cromosomico.

A13. El metodo de la reivindicacion A1 donde dicha caractenstica derivada comprende la pendiente de la senal analogica que vana con el tiempo en un punto de la senal relativo a un valor de umbral.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para analizar celulas espermaticas animales en una corriente de fluido que tiene una direccion de flujo, donde cada celula del esperma tiene una cabeza con un nucleo que comprende una region cromosomica localizada que contiene al menos un cromosoma y caractensticas del ADN cromosomico, donde dicho nucleo tiene una longitud en la direccion del flujo de la corriente, donde dicho metodo comprende:

enfocar un haz de radiacion electromagnetica en la corriente de fluido como un punto generalmente elfptico que tiene una longitud a lo largo de un eje principal que se extiende generalmente en angulos rectos a la direccion del flujo de la corriente y una anchura a lo largo de un eje menor que se extiende paralelo a la direccion del flujo de la corriente, donde la anchura del punto de iluminacion es menor que la longitud de dicho nucleo, donde dichas celulas espermaticas estan adaptadas para pasar a traves dicho punto lo que resulta en emisiones de radiacion electromagnetica procedente de las celulas espermaticas, que incluyen emisiones procedentes de dichas regiones cromosomicas indicativas de las caractensticas del ADN cromosomico de las regiones;

detectar y convertir al menos parte de dichas emisiones procedentes de las regiones cromosomicas en senales electricas analogicas que vanan con el tiempo indicativas de dichas caractensticas del ADN cromosomico;

muestrear digitalmente la senal analogica que vana con el tiempo y proporcionar un resultado que incluya la informacion digital correspondiente a dicha senal analogica que vana con el tiempo;

analizar la informacion digital para extraer informacion indicativa de una caractenstica derivada a partir de las senales analogicas que vanan con el tiempo, donde dicha caractenstica derivada comprende la pendiente de la senal analogica que vana con el tiempo en un punto de la senal relativo a un valor de umbral;

clasificar al menos parte de las celulas espermaticas como celulas que tienen una caractenstica del ADN

cromosomico particular en funcion de al menos parte de dicha informacion extrafda; y

clasificar dichas celulas espermaticas de acuerdo con dichas caractensticas del ADN cromosomico.
2. El metodo de la reivindicacion 1, donde dichas caractensticas del ADN cromosomico son indicativas del sexo de las celulas espermaticas.
3. El metodo de la reivindicacion 2, donde dichas celulas espermaticas son celulas espermaticas bovinas.
4. El metodo de la reivindicacion 3, donde dicha region cromosomica se ubica dentro de un area del nucleo que se extiende no mas de un 20% de la longitud del nucleo en cualquiera de los lados de un centro longitudinal del nucleo.
5. El metodo de la reivindicacion 3, donde dicha region cromosomica se ubica dentro de un area del nucleo que se extiende no mas de un 10%-15% de la longitud del nucleo en cualquiera de los lados de un centro longitudinal del nucleo.
6. El metodo de la reivindicacion 1, donde el paso de muestrear digitalmente comprende muestrear sincronicamente el resultado analogico que vana con el tiempo.
7. El metodo de la reivindicacion I, donde dicha anchura del punto es menor que 3.0 pm.
8. El metodo de la reivindicacion 7, donde dicha longitud del punto es mayor que 100 pm.
9. El metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende ejercer una fuerza sobre las celulas espermaticas en la corriente que tienda a colocarlas en la orientacion deseada antes de que la corriente pase a traves de dicho haz.
10. El metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende la clasificacion de gotitas de dichas celulas espermaticas de acuerdo con dichas caractensticas del ADN cromosomico.
11. El metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende la clasificacion por foto deterioro de dichas celulas espermaticas de acuerdo con dichas caractensticas del ADN cromosomico.
12. El metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende la clasificacion por conmutacion de fluidos de dichas celulas espermaticas de acuerdo con dichas caractensticas del ADN cromosomico.
13. El metodo de la reivindicacion 1, donde dicha caractenstica derivada comprende el area de un pulso con forma de onda que representa la senal analogica que vana con el tiempo.