CN102666841A - 减少精子细胞群中的dna断裂的方法和系统 - Google Patents

减少精子细胞群中的dna断裂的方法和系统 Download PDF

Info

Publication number
CN102666841A
CN102666841A CN2010800484974A CN201080048497A CN102666841A CN 102666841 A CN102666841 A CN 102666841A CN 2010800484974 A CN2010800484974 A CN 2010800484974A CN 201080048497 A CN201080048497 A CN 201080048497A CN 102666841 A CN102666841 A CN 102666841A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
colony
sample
cell
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800484974A
Other languages
English (en)
Inventor
J·莫雷诺
M·埃文斯
M·杰兰德
J·格萨维茨
C·洛佩兹·费尔南德斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Technology LLC
Inguran LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology LLC filed Critical Monsanto Technology LLC
Publication of CN102666841A publication Critical patent/CN102666841A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0612—Germ cells sorting of gametes, e.g. according to sex or motility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及根据DNA断裂的不同水平对精子样品进行分拣的方法和系统、以及采用具有低水平的DNA断裂的群体来提高辅助生殖过程的生殖力和成功率的方法，所述辅助生殖过程包括人工授精、体外受精、胞质内注射、以及其它相关的技术。

Description

减少精子细胞群中的DNA断裂的方法和系统
技术领域
本发明实施方案大体涉及减少精子群体中DNA断裂的方法和系统，具体地，涉及形成具有减少的DNA断裂的精子群体、以用于产生后代的辅助生殖过程。
背景技术
精子和性分拣的精子(精子的分拣是基于携带X或者Y染色体分类的)是辅助生殖技术和畜牧养殖业中被赋予极大兴趣的生物材料。但是，损伤的和/或死亡的精子缺乏通过人工授精(AI)、体外受精(IVF)、卵子胞质内单精子注射(ICSI)或者其它辅助生殖技术产生后代的能力。损伤的细胞可以包括膜改变的细胞、经历细胞凋亡的细胞、以及具有DNA断裂的细胞。损伤的精子，当其在辅助生殖技术中使用的有生活力的精子群体中出现时，可能能够使卵子受精，但是可能无法产生有生活力的胚胎或者产生的胚胎具有基因异常(其不会正常发育或稍后死亡)。以这种方式，具有DNA断裂的精子和有生活力的精子竞争，减少了成功妊娠的总体可能性，增加了产生畸形的后代的可能性。Simon等，Human Reproduction，Vol.25 No.7 pp.1594-1608(2010)证明了：增加精子DNA断裂的比率对采用以下辅助生殖技术(例如IVF和ICSI)的妊娠率和胚胎发育具有不利影响。同样地，卵子、卵母细胞、胚胎或者其它具有损伤的DNA或DNA断裂的生殖细胞也减少成功妊娠的可能性。因此，需要关于精子处理的方法和系统，其能减少分拣的精子亚群体中的DNA断裂水平，特别是当在辅助生殖技术中使用的分拣的亚群体(其中性别选择是最终目标)。
性分拣的精子是富含有性别的精子群体(其精子基于携带X染色体或携带Y染色体而被分类)。利用所述性分拣的精子，可以产生具有高度确定性的期望的性别的后代，从而有利于乳制品和牛肉工业。应用于精子性分拣的流式细胞分析，通常合并非毒性DNA结合荧光染料，其渗透细胞膜，以化学计量方式和每个精子的DNA相关联。与每个精子相关联的染料的量，与被包含在每个细胞中的DNA的量密切相关，激光激发使可以识别带有Y染色体和带有X染色体的精子。美国专利5,135,759、6,357,307、7,371,517和7,758,811，其每个都通过参考的方式并入，提供了适于精子分拣(基于X和Y染色体的差异)的系统和方法。
虽然所有动物的新鲜精液本身含有一定的精子DNA断裂，从各个捐助者的精液中的DNA断裂水平可以有所不同，由于不同的因素，如氧化应激、细胞凋亡、组蛋白-鱼精蛋白的无法替代、和其他与精液产生相关的环境因素。在随后的精子处理过程中，一些DNA损伤因子可以被复合。除此之外，假设精子是体外射精得到的易损的细胞、精子样品，其在大多数精子处理过程(同时准备受精样品)中能忍受额外的医源性的损伤。特别地，精子性分拣的方法学包括几个步骤，对细胞制造应激条件，其不仅是损伤，但也可以有助于和加强潜在的医源性损伤。由于所述分拣过程某些步骤中的制造的损伤，可以被复合，在整个分拣过程中通过化学或物理方式持续地进行；特别需要富集细胞群体(关于DNA断裂或者缺少DNA断裂的)。因此，需要富集考虑到DNA断裂水平的精子样品的方法和系统，来改善人工繁殖技术和使用性分拣的精子的后代健康发育的成功率。
发明概述
本发明实施方案通常涉及分拣精子和产生精子群体的流式细胞分析方法和系统，所述精子群体与所述初始精子样品相比，具有减少的DNA断裂的量。这些具有减少的DNA断裂的量的精子群体，对通过生殖技术(例如AI，ICSI，IVF和其它相关技术)例如进行的授精和/或受精是有利的。
因此，本文公开的实施方案提供用于使精子样品中的精子DNA断裂的水平相对于射精后的初始精子样品减少的方法和装置。
在一个方面中，本文公开的实施方案提供了用于减少精子群体中的DNA断裂的方法和装置。
在另一个方面中，本文公开的实施方案提供用于将精子分拣成具有不同的DNA断裂特征的精子群体的方法和系统，包括至少一种富集的精子群体(其具有减少的DNA断裂的量)。
甚至在另一个方面中，精子的分拣是基于DNA断裂的特征、或者代表精子群体具有DNA断裂的较高发生率的特征。
附图简述
图1A示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光对于侧向角荧光的代表性绘图。
图1B示出了染色质扩散试验中含有精子的一侧，其中所述精子是从特殊分类的区域收集的。
图1C示出了染色质扩散试验中含有精子的一侧，其中所述精子是从特殊分类的区域收集的。
图2A示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光对于侧向角荧光的代表性绘图。
图2B示出了流式细胞仪中精子的近门部分，绘制了前向荧光对于集成前向荧光的关系图。
图3A示出了常规的精子样品中DNA断裂随时间的推移的示意性表述。
图3B示出了性分拣的精子样品中DNA断裂随时间的推移的示意性表述。
图3C示出了在常规样品和性分拣的精子样品中平均DNA断裂随时间的推移的示意性表述。
图4示出了根据本文提出的某些实施方案的流式细胞仪。
图5示出了根据本发明的实施方案的方法的流程图。
发明详述
容易理解的，在详细地解释本方法之前，这不是对本文描述的实施方法的专门限制，其是可以以多种方式实施的。而且，所述方法和系统是以通常的方式公开的，因此一旦人们理解了通常的规律，这些方法就能运用于具体的系统中。
一个实施方案涉及分拣细胞的方法，其形成不连续的亚种群，其中一些富集的亚种群具有减少的DNA断裂水平或者没有DNA断裂，其它富集的亚种群具有增加的DNA断裂水平。这种分拣基于DNA断裂特征的存在，以减少富集的精子样品中DNA断裂的发生率。所述方法通过建立精子样品开始。所述精子样品可以从任意哺乳动物获得，所述哺乳动物没有限制，包括在Wilson，D.E.and Reeder，D.M.，Mammal Speciesof the World，Smithsonian Institute Press(1993)中列出的，该文本整体通过参考方式并入本文。在一个实施方案中，均匀的精液可以用膨胀剂稀释处理，保存精子能动性和生殖力这是现有技术公知的。在另一个实施方案中，所述精子样品的建立也可以通过融化先前冷冻保存和/或先前处理的精子(来自吸管)。在又一个实施方案，所述精子样品可以包括分别去除了它们的精子尾部的精子头部。
在某些实施方案中，所述精子样品可以用标记或者染料染色。所述标记可以是DNA选择性的或DNA结合染料，例如Hoechst 33342、Hoechst 33258、BBC、SYBR-14、SYBR Green I、双苯酰亚胺染料，或其组合(其可以是荧色物)。在某些实施方案中中，所述精子可以被第二标记染色，例如红色食品染料或者碘化丙啶。
在这些实施方案中，所述染色的精子可以单独使用流失细胞分析进行评估，或者使用其它的基于荧光或可见的显微镜法的分析技术。在流式细胞分析中，精子在液体流中输送，然后液体流被分裂成液滴，每个液滴理想地含有单一的精子，其在检查区用能量源单独地照射，例如激光。所述DNA选择性荧色物染料能吸收所述激光的能量，发射不同波长的发射光，以对这种激发作出反应。这种发射光的量可以定量，以测定所述染料的相对量(与样品中其它精子相比)。
可以检测或监测所述照射的精子的发射光，通过利用处理信号(表征来自照射的细胞的发射光的强度)的光电倍增管。发射光的强度可以提供关于每个精子的性能的信息，其每个精子与使用的不同染料之间差异性相互作用；也可以提供关于所述精子的DNA断裂特征的信息。由于具有较大量的DNA断裂的细胞可能有较少的与DNA选择性染料结合的位点，所以细胞可能产生较低强度的发射以允许评估DNA断裂特征(基于检测的发射值)。DNA断裂特征可以包括其它可识别的细胞特性，例如免疫能力下降的或改变的膜，在这种情况下，淬火剂或者第二标记可以大大减少受刺激的精子细胞荧光的量。基于对一个或多个的这些特征的评估，亚种群细胞可以被表征为相对于样品中剩余的精子群体含有较高或者较低的DNA断裂水平，或者相对于样品中剩余的精子群体较大或较小的具有这种损坏的可能性。通过选择表征为具有较小的DNA断裂的可能性的精子群体，分拣和收集了具有较低水平的DNA断裂的富集群体。
例如，在使用流式细胞分析的某些精子分拣系统中，分拣精子可以通过基于产生的信号使夹带所述精子的流体带电。分离自液体流的带电的液滴，然后保持带电荷，并通过引导所述液滴进入一个或几个容器的偏转平板而发生电磁偏转。
这种流式细胞仪系统可以设定，以将精子样品分拣成第一群体、第二群体和可能的第三群体，其中所述第一群体可以含有更大的比率的死亡的细胞或者DNA损伤的细胞，而所述第二群体和所述第三群体可以含有X/Y分拣的产物。所述精子的第一群体(具有较高的DNA断裂的发生率)，可以作为废物收集，也可以被包括在认为是非-活精子的群体中。所述剩余的第二和第三群体可以包括X/Y分离的群体(具有减少的精子损伤)。
用于分拣细胞(基于DNA断裂特征的水平)的流式细胞仪系统。可以包括基本的流失细胞仪部件，直到包括接受细胞或精子样品的入口、以及与振荡器(产生夹带精子的液滴)连接的出口。所述精子可以具有与它们的DNA相关联的DNA选择性染料。
产生电磁辐射能量的激发装置可以用来刺激与所述精子DNA相关联的染料。激光是激发装置的一个例子，但是弧光灯和其它辐射能源可以用来辐射或刺激荧色物染色的精子。
分拣精子的系统可以包括检测器，定位以检测所述标记的激发装置关联所述检查区的DNA的相互影响，产生基于照射的精子的发射光的信号。该信号然后可以和分析仪连通，以评估检测器产生的信号。所述信号可以被评估在每个样品单独的精子中DNA断裂特征的存在。DNA断裂特征可以是指示精子的亚种群具有断裂的DNA的可能性增大的特征。作为非限制性的实例，DNA断裂特征可以由发射荧光强度来代表，因为其荧光染料结合位点数量减少；和其一样，第二淬火染料(其只与具有免疫能力下降的胞膜的精子相关联)引起荧光减少。一旦通过分析仪测定，信号可以通过将样品分离成不同的群体的分离器。一个或多个群体可以被分拣成富集的精子样品，其相对于初始样品具有较高的或较低的DNA断裂水平。
所述系统可以包括收集分拣精子的第一群体的第一收集元件、和收集精子的第二群体的第二收集元件。所述系统还可以包括第三或者更多收集元件，用于收集精子的第三、或者更多的群体。这种分拣可以同时进行，或者以两步或者更多步骤顺序进行。容易理解，任意一个群体可以单独地根据DNA断裂分离，同时其它两个群体可以根据携带X染色体还是Y染色体分离。
在分拣的精子中的DNA断裂
本文提供的四个实验证明：分拣技术能将死亡的和DNA损伤的精子从有生活力的精子样品中分离出。在所述死亡的和染色的精子群体中的所述精子有较高的DNA断裂频率，同时从有生活力的亚种群分离的所述精子具有减少的精子DNA断裂水平。通过合并多种分拣技术，可以检测具有高水平的精子损伤；例如使用流式细胞分析的性分拣，其中所述精子可以分拣成死亡的亚种群，而剩余部分可以含有活亚种群，例如携带X-和/或Y-染色体的活亚种群。所述死亡的和所述活亚种群可以含有受损伤的或者经历DNA断裂的细胞，但是其在所述活亚种群细胞中的比率分布是最小的。
证明减少的DNA损伤的实验
在接下来的实验中，在3和9岁之间的年龄选择5只Jersey公牛和15只Holstein公牛，制备精子样品。每种性分拣的样品使用MoFlo SX TM (Beckman Coulter，Miami，Florida)进行分拣。精子的分拣根据有差异的荧光信号进行，其使用Hoechst 33342(Molecular Probes，Eugene，Oregon)和红色食品染料(FD&C#40，Molecular ProbesEugene，Oregon)形成。具有较高DNA含量的所述最终的荧光信号较强，即X-染色体携带群体相对于较低DNA含量的被称为Y-染色体携带群体的最终荧光信号较强。所述红色食品染料被排除在健康完整的胞膜外，同时保留在有损伤的胞膜(其淬灭这些细胞中显著量的荧光)的精子内。
在每个实验中，携带X-和携带Y-染色体、分拣的精子是根据不同的荧光信号选择的，使用16.2mM Hoechst 33342(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)，在含有20％卵黄-TRIS膨胀剂的捕捉液中稀释。常规精液制备的相同标准，以及选择用于处理的精液的标准精液特征的截止值被应用。在所有实验中，为常规的或性分拣的吸管中的精液的用于处理的公牛精液，只有符合以下标准：1)55％的最小活动力；2)900x106个精子/mL的最小浓度，使用SP1-Cassette，Reagent S100和Nucleo SP-100TM系统(ChemoMetec A/S，Gydevang 43，DK-3450
Figure BDA0000157643360000062
Denmark)测定；以及
3)15％的初级形态，15％的次级形态，和总形态不超过25％。此外，在解冻后分析中使用的样品符合下列条件的质量标准：1)精子前向运动活动力(progressive motility)在0h时至少45％，在3h时为30％；和2)包括在3h时至少50％的完整的顶体。在3小时的冻解后运动和顶体测量，所有的样品在加湿室中37℃孵育3h。对于所有精子质量评估，使用75x25mm玻璃显微载玻片(Andwin，Addison，Illinois，美国)和22x22mm#1.5盖玻片(Thomas Scientific，Swedesboro，New Jersey，USA)。所有活动力评估(motility assessment)使用明视野显微镜，后续的完整的顶体和形态评估使用微分干涉对比(DIC)显微镜(放大倍数为x400)。
本实验中使用的所有膨胀剂的配方相同，具有6.8的pH，对TRIS膨胀剂渗透压平衡在300mOsm。对于低温贮藏，分拣的和常规的精子样品使用甘油两步扩大处理。在所述实验中使用的所有冷冻-解冻的性分拣的样品含有2.1x 106精子/吸管(0.25cc)，同时常规样品的范围是25x 106至30x 106精子/吸管(0.5cc)。
来自每只单独公牛的均匀的精液被分成两等分试样。一个等分试样是性分拣的，其后所述精子被冷冻，使用自动冷冻装置IMV
Figure BDA0000157643360000071
(IMV，Cedex，France)，贮藏在液氮中进行低温冷冻。第二个等分试样被直接地冷冻保存，在解冻后进行DNA断裂水平的后续分析。所述精子DNA断裂分析在不同的亚种群(在X-和Y-染色体性别选择后)中进行，同时比较分别每只公牛的等分试样。
在每个实施例中，使用精子-Halomax试剂盒(Halotech DNA，Madrid，Spain)测定DNA断裂。每个精子样品被溶解，然后在载玻片上琼脂糖中制备。所述载玻片然后用SYBR I(Invitrogen，Molecular Probes，Eugene，Oregon)或者GELRED(Biotium，Hayward，California)染色，使染色质染色，其围绕具有DNA断裂或没有DNA断裂的被溶解的精子分散开。然后具有断裂的DNA片段的细胞和具有完整的DNA的细胞被在每个载玻片上可视化地识别。
关于图1，可见在流式细胞仪中分拣的精子的前向荧光对于侧向荧光(图1A)的图。该图上一个亚种群包含大比率的死亡或染色的精子(图1A中的R2)，其余组包含活精子(在图1A中的R1)。在商购的流式细胞仪(例如MoFlo SX或者MoFlo SX XDP(Beckman Coulter，Miami，Florida))上显示的分拣参数的区域，其示出了基于前向荧光和侧向荧光的近门精子细胞。图1B示出了在原位荧光显微镜中来自R1的精子细胞(使用精子-Halomax试剂盒)，其中细胞具有小的紧紧的环表明精子没有经历DNA断裂。在该载玻片上，可见到环绕膜的松散的染色质的单一的精子，表明该精子曾经或正在经历DNA断裂。关于图1C，示出了来自R2的精子，其中几个可见到表明DNA断裂的分散的染色质的宽宽的环。
关于图2A和2B，一个亚种群包括主要是死亡的精子(在图2A中的R2)，其余两个组主要由活精子(在图2A中的R1)亚种群组成，所述活精子亚种群含有X-染色体携带(在图2B中的R3)和Y-染色体携带(在图2B中的R4)精子，纯度约95％。所述MoFloSX XDP可以设定R3、R4、和R2中的每个进入分离的容器中，而所述MoFlo SX可以用于从R2精子中分离出R1精子。样品的性比率纯度使用STS Sexed SemenPurity Analyzer(Sexing Technologies，Navasota，TX)测定，其提供高分辨率峰的X和Y染色体携带的精子种群和和基线，每种分析对于2,000精子。分析和比较所有这些亚种群，分析和比较其DNA断裂水平相对于在分别分拣前的样品(采自在染色和孵育之后但是分拣之前)中获得的水平。在图2A中基于区域2分拣死亡的精子，所有其它的细胞落入这个区域之外。在分拣前精液样品中所述死亡的细胞的比率平均为13％，因此提供了每秒800至900死亡的精子的平均分拣速度。因此，约85％的精子(含有断裂DNA)通过此过程从初始样品中除去。
实验1-进行所述第一实验，以分析DNA断裂的量的差异(在性分拣之前和之后)。精子样品取自5只Jersey公牛，每个样品被平均分成两份试样。试样的第一组被性分拣和冷冻保存。所述试样的第二组被直接冷冻保存。表1示出了DNA断裂的相对水平(从每只分拣前和分拣后的公牛中获得)。
表1(％DNA断裂、性分拣的)
  参考   分拣前   分拣-XY
  公牛1   7.00   1.10
  公牛2   7.50   1.10
  公牛3   11.00   4.00
  公牛4   9.00   5.00
  公牛5   5.30   4.60
  平均值±SD   7.96±2.15   3.16±1.91
所述5只分拣
前公牛样品中的DNA损伤的基线水平的范围是从5.3％至11％，其平均和标准方差为7.9±2.1。所述在性分拣的精子样品中获得的精子DNA断裂的水平更低，其平均和标准方差为3.1±1.9。精子DNA断裂减少平均为63％，但是所述减少在公牛2中高达85％。
实验2-所述第二实验专门观察性分拣后的每个亚种群的DNA断裂。又有5只jersey公牛在这个实验中被使用，每只被收集和分拣产生三个精子的亚种群。所述第一精子亚种群最初由下列构成：如红色食品染料或者碘化丙啶所指示，通过常规分拣技术被认为死亡的那些精子。所述第二和第三亚种群最初由活的分拣的精子细胞组成。每个样品的一部分在分拣之前被测试，为了建立DNA断裂的基线。正如表2所示，所述DNA断裂的基线具有7.9±2.5的平均和标准方差。在分拣的携带X-染色体的亚种群中测定的所述DNA断裂的平均和标准方差是1.8±1.5，而所述携带Y-染色体的亚种群的平均和标准方差是12±0.6(平均每只公牛)。所述第三精子亚种群含有所有死亡的精子，其有累积大多数DNA断裂精子(其平均和标准方差为12±4.4)的趋势。
表2(％DNA断裂，分拣的亚种群)
  参考   分拣前   分拣-死亡的   分拣-X   分拣-Y
  平均值±SD   7.9±2.5   12±4.4   1.8±1.5   1.2±0.6
实验3-进行所述第三实验，以分析在解冻之后的100根性分拣吸管中的精子DNA断裂的分布，以比较10只公牛不同时间收集的样品的变化。每根吸管被收集和性分拣出携带X-染色体的精子。从相同的公牛不同的日期收集的吸管具有存在非常相近的DNA断裂，其可以参见表3。虽然有偶然性的离群，收集自单独公牛的大多数样品证明有相近的DNA断裂，尽管它们是收集自不同的日期。
表3(％DNA断裂，收集自不同日期的X-分拣的样品)
Figure BDA0000157643360000091
实验4-第四实验集中于定期地评估常规和分拣样品中的DNA断裂，为了测定DNA断裂在每个样品中发生过的比率。先前的实验已经示出了常规的精子，表4中再次显示，与性分拣的精子相比具有较高的DNA断裂基线。但是，在24、48和72小时对性分拣的精子进行监测之后，似乎性分拣的精子在约24和48小时之间DNA断裂有剧增的趋势，而常规的精子直到至少约72小时保持基线水平。在约48小时，常规的精子DNA断裂出现轻微的增长。表4示出了在8只公牛中常规精子在t0(C-To)的DNA断裂，以及测定的相同公牛性分拣的样品在t0(S-T0)的DNA断裂。正如所期望的，每只公牛S-T0明确地低于C-T0。但是，24小时后(S-T24)，48小时后(S-T48)和72小时后(S-T72)，所述性分拣的样品的DNA断裂大幅度地变化，而常规的精子在72小时间，倾向于保持接近它的基线水平。表4表明交叉定位时间点(CPT)，其可以用作精子DNA断裂比率的指示，例如，较低的CPT表明DNA断裂的快速增长，较高的CPT表明DNA断裂的缓慢增长。对每只公牛取平均，所述8只公牛CPT平均约33小时。平均地，在33小时后，所述性分拣样品的所述DNA断裂相对于常规样品变得更大。
表4(CPT和％DNA断裂-分拣之后的时间)
  CPT   C-T0   S-T0   S-T24   S-T48   S-T72
  公牛1   27h   5.00   0.33   1.66   10.50   70.00
  公牛2   44h   2.00   0.33   0.66   5.00   45.00
  公牛3   25h   2.66   0.33   0.66   17.00   32.00
  公牛4   33h   2.00   0.33   0.00   11.00   26.00
  公牛5   51h   4.00   0.00   0.66   2.50   66.00
  公牛6   41h   4.00   2.00   2.66   8.00   29.00
  公牛7   27h   3.33   0.00   1.00   19.66   32.00
  公牛8   19h   1.00   0.00   1.00   19.00   37.00
  r2   0.31   0.27   0.59   0.64   0.68
 Durbin-Watson   2.05   1.98   1.99   2.41   2.55
  P   0.24   0.26   0.27   0.09   0.06
图3示出了表4中的数据的生动表述。图3A示出了经历约72小时的DNA断裂的百分比。作为比较，图3B示出了分拣的精子在72小时过程的DNA断裂。将图3B与图3A作对比，可以看见，常规的精子在72小时的孵育时间里，以更加缓慢的和更加平稳的速度增长，而所述分拣的精子的精子DNA断裂在约24和48小时之间有剧增。图3C示出了常规样品的平均值和分拣样品的平均值，通过这种方式，更加清楚地证明了所述分拣的精子在初始具有较低的DNA断裂百分比。图3C也清晰地示出了在分拣的精子之间的DNA断裂剧增(相对于常规的精子)和CPT，其中平均后所述分拣的精子相对于所述分拣的精子具有更多的DNA断裂。对收集和图3C所示的的样品，所述CPT约33小时发生。
富集关于DNA断裂的精子群体
在一个实施方案中，一旦精子样品被分子标记染色，所述精子可以通过流式细胞分析检测。可以理解，可以使用测量和检测分子标记和荧光标记的其它方法，其包括但不限于，利用分光光度计、微观流体芯片、以及这些公开方法中的实施方案。可以使用在美国专利6,357,307中描述的流式细胞分析，如上述参考，以测定每个细胞中DNA的量，所述细胞可以根据这种测量方法进行分离。由于DNA断裂发生在给定的细胞内，所述DNA选择性染料的结合位点数量可以根据断裂片段位点的定位减少。这意味着：经历DNA断裂可能倾向于具有更少的结合位点，其对于以化学计量的方式结合荧光染料是可行的，例如Hoecst 33342。相似地，可以使用流式细胞分析区分损坏的或者膜改变的细胞(与有生活力的细胞相区别)，基于用第二标记的荧光测量，例如碘化丙啶或者红色食品染料。
一旦细胞被评估，它们可以以多种方式被分离。美国专利6,357,307论述了利用电磁偏转(与流式细胞分析连同使用)。但是，当前方法的实施方案也关注了利用微观流体槽来分离所述细胞。美国专利申请出版2006/0270021和美国专利7,298,478，每个其整体内容通过参考方式并入本文，提供了微管流体槽的实例，其可以用来分离精子。
现在回到图4，示出了实施某些本文描述的方法的系统。所述系统包括用于建立分析和/或分拣的一批细胞的细胞源1。所述细胞被引进喷嘴2，同时鞘液3从鞘液源4引出。所述鞘液3在细胞周围形成鞘液环境，因为两者都通过喷嘴孔口5充满喷嘴2。
液体提供给喷嘴2的压力影响流体8离开喷嘴孔口5的速度。所述液体8可以进一步被振荡器6通过振荡器控制器7控制，其在喷嘴2和所述喷嘴孔口5中产生压力波。这些压力波经过所述喷嘴4和喷嘴孔口5转换给流体8，导致在断开点形成规则的液体9。所述喷嘴孔口5的直径和振荡器6的频率被调节以产生液滴，使其足够大可以夹带分裂的细胞。
根据夹带在每个液滴9中的细胞的特征，所述夹带单独细胞的液滴9被分析和/或分拣。作为流式细胞仪的部分，可以合并细胞识别系统10以判断出这些区别。所述细胞识别系统10可以包括检测器或传感器11，以对流体8所包含的细胞作出应答。所述细胞识别系统10可以依据特征的相对存在或缺失而做出行动反应。例如，可以使用标记分子的存在、缺失或者数量来区分细胞(更有可能地经历DNA断裂和那些具有较少可能性经历精子DNA断裂的细胞)。
作为一个实例，荧色物染料可以作为分子标记与细胞内DNA结合。所述荧色物染料可以被激发装置12激发，例如激光，其发射照射光导致荧色物染料反应或发荧光。为了性分拣精子的目的，每个精子受到DNA结合荧光染料(例如Hoechst 33342)的染色。每个通过细胞的总荧光取决于每个细胞内含有的DNA的量，因此提供区分携带X染色体精子和携带Y染色体精子的方式。如本文先前所描述的，这些发射光可以提供关于单独细胞的DNA断裂的信息。
所述荧光可以被传感器11获得，并被转化电信号。所述电信号可以被输入到分析仪13，根据发射的荧光做出测定。所述分析仪13可以和液滴充电器连接，以使流体8和产生的液滴9有差异地带电(在液滴9它们被切断之前)。所述检测和充电的时间可以调节，使得所述流体的充电恰好在切断液滴(其含有被分析的细胞)之前。一旦所述液滴被切断，其保持给流体充电。
图4也示出了喷嘴2任何一边的偏转盘14，为了引导细胞进入几个可能轨道中的一个。所述偏转盘可以被相反的电场充电，例如分别地，左手盘大约+2500伏特，右手盘-2500伏特。容易理解，依据所述装置，所述盘在任一极化中可以被充电至多约4000伏特。熟悉流式细胞仪操作领域人员可以使用多种电荷配置来调定这种偏转盘为任意数量的配置。例如，流动流体速度越快，将获得更多的电压来来将液滴拉进规定的轨道。如果液滴落伍片转盘之间，它们会被引向具有相反电荷的盘，或者直线下落(加入液滴9没有带电荷)。所述收集容器15被示出，三个收集液滴的容器：没有被带上电荷的，带上正电荷的和带上负电荷的。容易理解，图4中示出的所述3个容器15的排列，可以在MoFlo SX上配置，但是所述示出的流体中的一个是多余的，或空的液滴。除了死亡的细胞流体和多余流体之外，所述MoFlow SX XDP可以配置两个流体，例如富含X染色体流体和富含Y染色体流体。该机器可以被装上门，以制造具有每种性约50/50、但是富集DNA特征的单一分拣的样品。
现在回到图5，流程图示出了建立用于分拣的液体样本的步骤(在110)。该液体样本可以包括精液、或者其它含有精子的的授精液、或者性分拣的精子、或者其它形式、或者处理的精子。一旦所述样本被建立，所述流程图进行下一步，用分子标记120标记所述样本。标记可以包括染色，分子标记可以是荧光染料、非-荧光染料、抗体、碘化丙啶、荧光团、或者让类荧光团物质，包括先前论述的染料。
一旦样本被标记，在所述样本中的所述细胞在130被评估。流式细胞分析、光谱测定或者其它方法(取决于所运用的分子标记)，可以被用来评估分子标记以测定DNA断裂特征、在细胞中存在的DNA的量、在DNA中的断裂和/或免疫能力下降的细胞膜。
一旦作出这种评估后，所述细胞在140被分离。这种分离可以在利用电磁偏转的流式细胞分析中仪和在可选择的微流体室(可以被用来分离所述生殖细胞)中完成。也可以使用其它细胞分离技术。可以根据携带X染色体或Y染色体分离所述细胞，也可以根据标记的存在或缺失分离所述细胞。或者，所述细胞可以被分拣成单一的精子群体(其同时具有除了具有较高DNA断裂发生率之外的X染色体和Y染色体)。
步骤150代表第一细胞子集，其通过步骤140分离。可以选择所述第一细胞子集，其相对于所述初始样品具有较高百分比的DNA断裂、或者细胞凋亡。在一个实施方案中，所述第一细胞子集相对于初始液体样本具有较高百分比的DNA断裂细胞。可以选择该子集，其具有低荧光发射、或者相对于所述总细胞群体相对较低。步骤160代表第二细胞子集的形成。所述第二子集可以包括分拣的X染色体的细胞、分拣的Y染色体的细胞或者任意的细胞(具有X染色体或者Y染色体)。步骤170代表任选的实施方案，其形成第三细胞子集。选择所述第三精子子集，相对于所述第二子集作为互补的性别。所述精子的第二子集和第三子集的每个可以被选择，基于独特的DNA断裂水平或者细胞特征。作为实例，所述细胞子集可以包括具有DNA断裂特征(指示有较高百分比的DNA断裂)的精子，同时所述第二子集和任选的所述第三子集可以具有DNA断裂特征(指示较少的DNA断裂水平。
通过列举非限制性的实例的方式，所述三个子集可以表示所述分离的精子，证明了在第一子集150中有较高水平的DNA断裂，在第二子集160中携带X染色体的活精子，在第三子集中携带Y染色体的活精子。所述第二和第三子集的每个选自精子，其证明有DNA断裂的最小水平。本方法的其它实施方案考虑到多于三个的子集，其可以根据一个或多个分子标记的测量值选择。例如，根据期望的纯度差异来选择所述子集。
通过列举又一非限制性的实例的方式，所述第一子集150可以含有精子的亚种群，其被测定是没有生活力的、或者其没有生活力具有较高的可能性，同时所述第二子集包括精子，其被测定是有生活力的、或者其有生活里具有较高的可能性。
步骤180表示新的测量方法/分离方法，其在所述第二子集160之后发生或者与步骤130和140的测量方法和分离方法同时发生。
通过列举非限制性的实例的方式，所述第二子集160可以是在步骤130中被测定为有生活力的精子，并且在步骤140中被分进第二子集160。该精子子集160然后可以通过流式细胞分析仪被性分拣，在步骤180被分进携带X染色体的精子组190和携带Y染色体的精子组200。
虽然本发明对关于限制数量的具体实施方案进行了描述，从本公开中受益的本领域技术人员，将理解到可以设计其它的实施方案，其并没有离开本文公开的本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围并不被所附加的权利要求限制。

Claims (27)

1.一种分拣细胞的方法，包括以下的步骤：
a.建立精子样品；
b.将分子标记运用于所述精子样品；
c.单独刺激所述精子样品中的精子；
d.监测所述受刺激的精子；
e.评估所述精子的DNA断裂特征；和
f.选择富含非-断裂精子的群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述分离所述精子的步骤进一步包括下列步骤：将所述精子样品分拣成至少第一群体、第二群体和第三群体，其中所述第一群体含有相对于所述初始精子样品的更大的具有DNA断裂的细胞比率，同时相对于所述第二群体和所述第三群体含有更大的具有DNA断裂的细胞比率。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述分离所述精子的步骤进一步包括下列步骤：将所述精子样品分拣成第一群体和第二群体，所述第一群体含有的精子具有更高的DNA断裂发生率，所述第二群体含有的精子具有较低的DNA断裂发生率。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一群体包含带有X染色体的精子和带有Y染色体的精子的约50/50的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述标记包括将所述精子样品染色的荧光染料。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述染色的精子用激光刺激。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述监视DNA断裂的精子的步骤进一步包括检测由受刺激的细胞发射的荧光。
8.如权利要求7所述的方法，其中评估所述精子DNA断裂的步骤进一步包括基于每个细胞发射的荧光来区分DNA断裂特征。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括用第二标记对所述精子样品染色的步骤。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第二标记包括红色食品染料或者碘化丙啶。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述分离所述细胞或细胞群体的步骤导致产生至少精子的第一群体和精子的第二群体，其中所述第一群体细胞与所述初始样品和所述第二群体细胞相比有更大的具有DNA断裂的细胞比率。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述精子的第一群体包含被认为是死亡的细胞的细胞，并且其中所述精子的第二群体被认为是有生活力的精子。
13.如权利要求1所述的方法，其中评估细胞或者细胞群体的DNA断裂的步骤包括下列步骤：对所述液体样本进行流式细胞分析、光谱测定或者微流体分析。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述精子样品包括哺乳动物精子。
15.如权利要求1所述的方法，其中选择的具有较少DNA断裂的精子样品提供改善的生殖力。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述改善的生殖力选自：卵裂率、囊胚率、妊娠率和出生率。
17.一种分拣细胞的流式细胞仪系统，包括：
a.用于接受精子样品的入口；
b.分子标记的一种或组合，其能够识别精子中DNA断裂的水平；
c.出口，其用于产生夹带来自所述精子样品的精子的液滴；
d.激发装置，其定位以产生经过检查区处流体的照射光；
e.检测器，其定位以检测所述标记的辐射能量关联所述检查区的精子DNA的相互影响，产生表征所述检测的相互影响的信号；
f.分析仪，其与所述检测器连接以分析所产生的信号；
g.与所述分析仪连接的分离器，其用于根据所述产生的信号将所述样品分离成明显分拣的精子群体。
18.如权利要求17所述的流式细胞仪系统，进一步包括第二标记。
19.如权利要求18所述的流式细胞仪，其中所述第二标记包括红色食品染料或者碘化丙啶。
20.如权利要求17所述的流式细胞仪系统，进一步包括：
a.用于收集分拣的精子的第一群体的第一收集元件；和
b.用于收集分拣的精子的第二群体的第二收集元件。
21.如权利要求20所述的流式细胞仪系统，进一步包括用于收集分拣的精子的第三群体的第三收集元件。
22.如权利要求20所述的流式细胞仪系统，其中所述精子的第一群体比所述样品中的精子具有较少的DNA断裂。
23.如权利要求17所述的流式细胞仪系统，其中所述标记包括选自下列的一种或多种成分：抗体、荧光染料和非-荧光染料。
24.如权利要求23所述的流式细胞仪系统，其中所述荧光染料包括荧色物或者荧光团。
25.一种改善精子样品的生殖力的方法，包括：
a.建立精子样品；
b.将分子标记运用于所述精子样品；
c.单独刺激所述精子样品中的精子；
d.监测所述受刺激的精子；
e.评估所述精子DNA断裂特征；和
f.选择富含非-断裂和具有改善的生殖力精子的群体。
26.一种辅助生殖过程的改善生殖力的方法，包括：
根据权利要求25获得具有改善的生殖力的精子样品；和
使卵子受精。
27.根据权利要求26所述的辅助生殖过程的改善生殖力的方法，其中所述辅助生殖过程选自：人工授精、体外受精和胞质内注射。
CN2010800484974A 2009-10-30 2010-10-28 减少精子细胞群中的dna断裂的方法和系统 Pending CN102666841A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25689309P 2009-10-30 2009-10-30
US61/256,893 2009-10-30
PCT/US2010/054549 WO2011053727A2 (en) 2009-10-30 2010-10-28 Methods and systems for reducing dna fragmentation in a population of sperm cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102666841A true CN102666841A (zh) 2012-09-12

Family

ID=43922985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800484974A Pending CN102666841A (zh) 2009-10-30 2010-10-28 减少精子细胞群中的dna断裂的方法和系统

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20120308998A1 (zh)
EP (1) EP2494036A4 (zh)
CN (1) CN102666841A (zh)
AU (1) AU2010313349A1 (zh)
BR (1) BR112012009939A2 (zh)
CA (1) CA2778245A1 (zh)
WO (1) WO2011053727A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020233343A1 (zh) * 2019-05-17 2020-11-26 京东方科技集团股份有限公司 微流控芯片及其制备方法和微流控装置

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9581587B2 (en) 2011-09-30 2017-02-28 Inguran, Llc Sperm staining and sorting methods

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1795382A (zh) * 2003-03-28 2006-06-28 孟山都技术公司 用于分拣颗粒和提供性别分拣的动物精子的设备、方法和程序

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4559309A (en) * 1982-09-01 1985-12-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm
US6149867A (en) * 1997-12-31 2000-11-21 Xy, Inc. Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm
CA2566749C (en) * 2003-05-15 2017-02-21 Xy, Inc. Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1795382A (zh) * 2003-03-28 2006-06-28 孟山都技术公司 用于分拣颗粒和提供性别分拣的动物精子的设备、方法和程序

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PIASECKA MET AL.: "Flow cytometry application in the assessment of sperm DNA integrity of men with asthenozoospermia", 《FOLIA HISTOCHEMICA ET CYTOBIOLOGICA增刊》 *
杜立颖 等: "《流式细胞术》", 31 July 2008, 北京大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020233343A1 (zh) * 2019-05-17 2020-11-26 京东方科技集团股份有限公司 微流控芯片及其制备方法和微流控装置

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012009939A2 (pt) 2015-09-15
WO2011053727A2 (en) 2011-05-05
CA2778245A1 (en) 2011-05-05
US20120308998A1 (en) 2012-12-06
EP2494036A2 (en) 2012-09-05
EP2494036A4 (en) 2013-08-28
AU2010313349A1 (en) 2012-05-03
WO2011053727A3 (en) 2011-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rappa et al. Sperm processing for advanced reproductive technologies: Where are we today?
Welch et al. Sex preselection: laboratory validation of the sperm sex ratio of flow sorted X-and Y-sperm by sort reanalysis for DNA
Gillan et al. Flow cytometric evaluation of sperm parameters in relation to fertility potential
EP2269617B1 (en) Process for enriching a population of sperm cells
Gosálvez et al. Sex-sorted bovine spermatozoa and DNA damage: I. Static features
Sellami et al. Assessment of chromatin maturity in human spermatozoa: useful aniline blue assay for routine diagnosis of male infertility
Niżański et al. Use of fluorescent stainings and flow cytometry for canine semen assessment
CN102812123A (zh) 减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统
ITMI20000030A1 (it) Procedimento per la produzione di embrioni non umani di sesso predeterminato ad alto valore genetico
Niżański et al. Evaluation of spermatozoal function—useful tools or just science
US8123924B2 (en) Sperm cell separation by electrophoresis
Samper et al. Commercial breeding with sexed stallion semen: reality or fiction?
CN102666841A (zh) 减少精子细胞群中的dna断裂的方法和系统
US20190310243A1 (en) Methods and compositions for determining the presence or absence of dna aberrations
WO2023012247A1 (en) Method of sperm sorting using liposomes and/or an inhibitor of slo3 potassium channel
US20200326331A1 (en) Methods and compositions for determining the presence or absence of dna aberrations
Shivahre et al. Relationship of conventional and fluorescent microscopic technique to assess in vitro semen quality status of Murrah buffalo males
KAMAL USE OF APTAMERS FOR SELECTIVE ENRICHMENT OF X AND Y CHROMOSOME BEARING SPERMATOZOA IN BUFFALO
CA3133622C (en) Method for improved sperm cell populations
EP4354139A1 (en) Non-invasive method of cell imaging
ERİMŞAH MALE INFERTILITY
WO2024079341A1 (en) Non-invasive method of cell imaging
Setti et al. A Comprehensive Guide to Sperm Optimization Prior to ART
Mir et al. Sperm sexing by flow cytometry–past improvements and future prospects: A review
CN101048496B (zh) 富集精细胞群的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120912