CN113260848A - 亚群识别的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于识别和区分粒子混合物内的亚群的系统和方法。所述系统和方法实现了混合物中粒子分类的连续校准，以提供操作的一致性并减少批间和批内处理的变化。所述系统和方法生产有利的分选粒子产物。

Description

亚群识别的系统和方法
背景技术
通常这种应用与流式细胞仪有关。特别地，这个应用涉及到系统和技术来确定一个特定的细胞活动是包含在一个亚群或一个门，还是被排除在一个亚群或一个门。
流式细胞仪可以利用光检测来评估通过流式细胞仪的粒子(如细胞)的特性。在某些应用中，细胞仪可以检测细胞发出的光，包括荧光、DNA插入染料发出的光。评估和分类粒子的能力是细胞仪的基本操作。
细胞仪测量粒子的特征，并提供有关测量特征的信息。通常，此信息以直方图或散点图的图形形式表示，尽管通常也以计算机可读形式收集和存储此信息。与这些测量有关的信息可用于识别粒子的初始集合内的亚群，或定义所测特征的主观或客观值。这通常是通过使用图形表示定义一个门来完成的。一般来说，在种群周围绘制门的过程是手动完成的：操作人员在分析混合物时对粒子混合物的图形表示进行视觉检查，并手动设置用于区分种群或混合物子集的点。一旦通过门的绘制定义了子集，所有后续事件都可以被定义为落在门内(即属于所定义的子集)或落在门外(即不属于所定义的子集和/或属于另一个子集)。这对许多应用具有重要意义，包括定量流式细胞分析和诸如荧光激活细胞分选(FACS)之类的细胞识别。
其中一个应用就是确定一个精子细胞是否有X染色体(可以产生一个雌性受精卵)或Y染色体(可以产生一个雄性受精卵)。一个有两条X染色体的精子可能比一个有一条X染色体和一条Y染色体的精子多大约3％的DNA。通过鉴定精子细胞的染色体含量，就有可能产生一个相对高纯度的带有X染色体或Y染色体的精细胞群体。例如，可以通过保留想要的性别和杀死不希望的性别(或通过隔离两种性别)来产生这样的种群。大量高纯度的种群可能被用于对雌性动物(如牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、骆驼、大象、公牛、水牛或类似动物)进行授精，以获得所需的雄性或雌性后代，其概率相对较高。
染色体的特征可以通过用荧光染料(例如，DNA插入染料)对精子细胞的DNA进行染色来识别。染色的精子细胞可能被迫在狭窄的流或带中流动，并通过激发或辐照源，例如激光束。当被染色的精子细胞(多个粒子)被照射时，多个粒子中的荧光素会发出响应性荧光。荧光灯的数量可以至少部分地根据多个粒子中每个粒子中至少一个粒子分化特征的相对数量(例如，指示X或Y染色体的存在的DNA的相对数量)而变化。荧光可以被一个或多个光学元件接收，该光学元件最终将接收到的光聚焦到检测部件上，例如光电倍增管(“PMT”)或雪崩光电二极管(APD)。检测部件可以响应于接收到的光而产生电模拟信号。模拟信号可以根据接收到的光量而变化。然后可以对该信号进行处理(例如，通过处理器进行数字化和分析)，以评估精子细胞的染色体含量，可以将其以图形方式表示为直方图(例如，将数据表示为峰值电压值的矢量，指数调整是仓宽的函数)或散点图(例如，将峰值电压值和区域电压值映射成矢量，用于频谱图的形式显示最新数据)。这些图形表示可以为定义子种群和/或绘制门提供基础。这通常是由用户利用她的最佳判断来选择建立门或阈值边界的点来完成的。
目前可用来设定界限或阈值来定义亚群的系统存在几个重大缺陷。首先，定义标准的选择(即设置门限或阈值点的值)由单独的操作人员执行。这从根本上是主观的，并且在运算符之间，甚至在同一运算符运行的样本之间，或者同一运算符运行的同一样本之间，都是可变的。这最终导致流式细胞仪系统操作的可变性。在性别分选细胞仪的情况下，这会导致性精细胞产品的产量(即收集到的活细胞数量)或纯度(即收集到的具有X或Y染色体的细胞比例)的显著差异。
此外，当前的亚群定义和区分方法导致操作中的区分基准基本上是静态的——门或阈值在操作过程中保持不变。在实践中，这意味着操作员必须在运行过程中监视亚群的运行，和/或由于多种因素(例如变化)，门或阈值与亚群的关系可能会在操作过程中发生变化。例如温度或压力，或信号丢失。
本发明所描述的系统和技术克服了这些和其他缺点，并提供了显著的好处，这将受到该领域的技术人员的赞赏
概要
根据发明实施例，本发明提供了一种用于识别粒子混合物中的亚群的系统。根据具体实施方式，该系统包括样品输送装置，细胞仪，控制装置和分选装置。控制装置被配置为实现自校准识别或鉴别技术。自校准识别或鉴别技术利用从混合物中的粒子获得的信息来定义混合物中的亚群。然后系统在此基础上对混合物中的粒子进行亚群分类。通过对混合物中附加粒子所获得的附加信息进行整合，不断细化亚群的定义。上述控制装备还被配置为以与样品中检测到的粒子相对应的值的形式从细胞仪接收事件数据，区分样品中每个亚群的测量特征值，基于区分的亚群为每个样品分配临界值范围，基于区分第二组粒子中亚群的实测特征值来更新值的临界范围，并基于更新的临界值范围对混合物中的粒子进行亚群分类。
根据某些发明实施方式，控制装置可以进一步被配置为从分布中识别用于第一特征的至少一个临界值；获得与第二特征的临界值相关的第二特征的值；生成第二个特征的值的分布；从第二特征的值的分布中识别出至少一个第二特征的临界值；在特征空间中共同定位第一特征和第二特征的临界值；并从共同位于特征空间的临界值中确定至少一个判别值。
根据某些发明技术，一种方法包括：识别粒子混合物内的亚群，包括：测量具有两个或更多个亚群的粒子混合物中的第一组粒子的特征，通过特征区分每个亚群；区分混合物中每个亚群的测量特征值；根据区别，为每个亚群分配一个临界值范围；在分配临界值范围之后，测量粒子混合物中第二组粒子的特征；在测量粒子混合物中的第二组粒子的特征之后，区分第二组粒子中每个亚群的测量特征值；基于对第二组粒子中每个亚群的测量特征值的区分，更新值的临界范围；并根据更新后的临界值范围为混合物中的粒子分配亚群分类。
根据某些发明技术，所述方法还包括基于更新后的临界值范围，根据分配给所述粒子的分类对所述粒子进行分类。根据某些发明技术，该方法进一步包括破坏或丧失分配给该分类的亚群的能力。根据某些发明技术，所述粒子是精子细胞。根据某些发明技术，精子细胞是牛精子细胞。根据某些发明技术，精子细胞的特征是具有X染色体或Y染色体。根据某些发明技术，精子细胞被荧光DNA结合染料标记。
根据某些发明技术，一种方法包括在粒子组的混合物中识别多组粒子，每个亚群具有与其他亚群不同的特征，包括：提供粒子的混合物；检测混合物中的第一组多个粒子的特征以产生指示该第一组粒子的特征的信号；为信号产生事件数据，该信号指示所述第一组粒子的特性；编译第一组粒子的事件数据；为第一组粒子生成事件数据的分布；根据第一组粒子的事件数据的分布，计算至少一个定义粒子亚群的判别值；根据定义亚群的判别值对粒子进行分类。根据某些发明技术，该方法还包括基于分类指示分类装置包括或排除事件。根据某些发明技术，该方法还包括破坏或使分配了该分类的亚群丧失能力。根据某些发明技术，所述粒子是精子细胞。根据某些发明技术，精细胞是牛精细胞。根据某些发明技术，所述精子细胞的特征是具有X染色体或Y染色体。根据某些发明技术，精子细胞被荧光DNA结合染料标记。
根据某些发明技术，计算至少一个判别值包括至少定义与检测到的特征有关的临界值。根据某些发明技术，计算至少一个判别值还包括：从第一组粒子的事件数据的分布中识别出用于第一特征的至少一个临界值；获得与第一特征的临界值相关的第二特征的值；产生第二特征值的分布；从第二特征的值的分布中识别出第二特征的至少一个临界值；在特征空间中共同定位第一和第二特征的临界值；从特征空间中共处一处的临界值中确定至少一个判别值。根据某些发明技术，至少一个辨别值的计算还包括调整临界值以包括来自第二组粒子的事件数据。根据某些发明技术，临界值包括用于第一亚群的一个或多个峰值特征值，以及用于第二亚群的一个或多个峰值特征值。根据某些发明技术，峰特征值包括峰荧光强度和峰总荧光。根据某些发明技术，临界值还包括在第一和第二亚群的峰值特征值之间的谷值。根据某些发明技术，鉴别值包括门。
根据某些发明技术，通过前述权利要求中任一项的方法中的任一种来生产有性精子细胞样品。
当结合附图阅读时，将更好地理解前述概述以及本申请的某些技术和系统的以下详细描述。为了说明的目的，在附图中示出了某些系统和技术。然而应当理解，权利要求不限于附图中所示的布置和手段。
发明内容
本文讨论的某些发明性系统和技术涉及一种细胞仪，该细胞仪包括一种机制，该机制使用混合物中粒子的特征频率或量子关系中的已知关系来识别，定义或区分混合物中的亚群。有利的系统和技术优化通量(产率和/或纯度)，减少可变性和增加操作一致性，以及减少人工用户输入和与之相关的可变性。这些有利的系统和技术提供了可靠地区分具有不同特征的粒子的决策方案，从而提供了不同的分类。
本发明的系统和方法可以用于鉴别混合物中粒子的一个或多个亚群。这可以通过检测或评估粒子的单个特征或多个特征来实现。可以使用不同的鉴定手段来评估特征，所述鉴定手段包括例如荧光标记物(例如，荧光染料或与一种或多种靶标特异性分子偶联的荧光标记物，例如抗体或抗体片段或其他分子标记物)。在另一方面，本发明的方法和系统包括通过区分DNA含量的差异来分选细胞，例如精子细胞。通过将精子细胞与染料混合，然后电穿孔，将细胞用DNA特异性染料染色。可以将精子细胞维持在提高精子细胞活力的温度下，通常等于或低于39℃。然后使精子细胞通过激发光源，使染色的DNA发出荧光，然后通过检测荧光和荧光的工具和用于细胞分选的装置，其中通过DNA含量分选细胞，并收集分选的精子细胞。该方法和设备适用于哺乳动物精子细胞的分选，例如来自牛、猪、兔、羊驼、马、狗、猫、雪貂、大鼠、小鼠和水牛的精子细胞。透膜染料和非透膜染料均可使用。有用的染料包括SYTOX蓝色，橙色和绿色系列的染料，花青二聚体和单体，POPO-1，BOBO-1，YOYO-1，TOTO-1，JOJO-1，POPO-3，LOLO-1，BOBO-3，YOYO-3，TOTO-3，PO-PRO-1，BO-PRO-1，YO-PRO-1，TO-PRO-1，JO-PRO-1，PO-PRO-3，LO-PRO-1，BO-PRO-3，YO-PRO-3，TO-PRO-3，TO-PRO-5，吖啶同型二聚体，7-氨基放线菌素D，溴化乙锭，同二聚乙锭-1，同二聚乙锭-2，壬叠氮化乙锭(ethidium nonazide)，核黄，碘化丙啶。其他有用的染料包括来自SYTO 40的蓝色，绿色，橙色和红色荧光染料，Hoechst染料和二氢乙啶。为了增强信号，可以引入纳米粒子，例如量子点和金属纳米粒子。这些粒子可以被标记为靶向分子。分选效率可以大于90％，而精子细胞存活率则可以大于30％，通常大于90％。另外，染料通过渗透梯度引入细胞，而不是电穿孔细胞。首先在高渗条件下孵育细胞，然后转移至低渗条件下；可以将DNA染色染料添加到高渗和低渗溶液中的一种或两种中。将细胞染色后，即可对其进行分类或进一步处理。在其他方面，本发明的系统和方法可涉及在不使用DNA染色剂的情况下检测DNA含量的差异，例如，美国专利号8,502,148,9,835,552；和9,683,922。在另一方面，本发明的系统和方法可涉及使用其他分析手段来检测粒子的特征，所述其他分析手段包括例如光的侧向散射，前向散射或向后散射，或活/死色斑(例如碘化丙啶或其他活性染色)。
在另一方面，本发明的系统和方法可以涉及建立或修改阈值或门。阈值通常是指一个值，通常与特定的特征相关，可用于对单个事件进行分类。例如，可以将强度阈值设置为允许区分荧光的值，该荧光指示活细胞(例如，高于阈值)或死细胞(低于阈值)。类似地，门指的是在检测到的特征的二维图形表示中界定区域的一组点或顶点。例如，门可能是指四个或更多点的集合，这些点被连接以围绕子种群形成多边形。门可以用来定义或区分特定的亚群。构成门的单个点或顶点可以是根据事件数据计算得出的判别值。在散点图中，门的每个点或顶点都有X和Y坐标。这些坐标的值可以通过根据编译后的事件数据进行计算和/或通过参数集中包含的值来确定。然后，可以使用门来对各个事件进行分类，以区分事件属于门内还是门外。例如，可以根据与两个细胞表面标记结合的荧光标记的存在，可以将门确定为包括特定的细胞类型；具有两个标记的细胞将落在门内，而缺少一个或两个标记的细胞将落在门外。
分选系统
一方面，提供了一种用于优化的粒子识别和分类的系统。一方面，该系统包括样品输送装置。通过样品输送系统将粒子的混合物输送至细胞仪系统。如本领域技术人员理解的，可以使用包括注射泵，蠕动泵和/或增加样品与系统之间的压差来完成样品输送。通常，样品输送系统能够离散地或连续地采样液体悬浮液中的粒子混合物，并将粒子混合物移至细胞仪。在一些应用中，样品输送系统还可以包括将粒子的混合物与另一种流体混合，和/或输送缓冲液或鞘液。待分选的精子样品可以是从动物来源(例如牛，马，猪或其他哺乳动物来源)中新鲜收集的样品，或者是解冻的，先前冷冻保存的样品。此外，样品可以来自同一哺乳动物的单次精液、多次的精液或来自两个或多个动物的多次合并的精液。
各种收集方法是已知的，包括戴手套的方法，使用人工阴道和电射精。将精子完美地收集或快速转移到隔热容器中，以避免温度从生理温度(通常为约35℃至约39℃)快速变化。根据物种和特定动物的不同，通常每毫升精子包含约0.5至150亿精子。
无论采用何种收集方法，均可以从精子样品中提取等分试样并评估各种特征，例如精子浓度、精子活力、精子进行性活力、样品pH、精子膜完整性和精子形态。这些数据可以根据标准和众所周知的程序，通过精子检查获得，例如，使用汉密尔顿-索恩运动分析仪(IVOS)(参见，Farrell et al.Theriogenology(1998)49(4):871-9；and U.S.PatentNos.4,896,966and 4,896,967)。
在另一方面，本发明的系统包括细胞仪。细胞仪将粒子的特征检测为事件，并将与事件相对应的信号提供给处理器。根据某些方面，一种流式细胞仪设备包括：流动室，被配置为引导包括样本粒子的流体流穿过粒子询问位置；以及激光器，被配置为沿着光束路径向粒子询问位置发射电磁辐射；检测器，被配置为接收来自询问位置的电磁辐射；输出指示接收到的电磁辐射强度的时变模拟信号；至少一个放大器，其配置为放大时变模拟信号；模数转换器，被配置为接收放大的时变模拟信号并产生相应的数字化输出信号。进一步地，检测器可以是光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)。该细胞仪还进一步包括温度传感器，该温度传感器被配置为感测温度并生成相应温度信号编码温度数据，其中电压调整电路进一步被配置为至少部分地基于温度数据和在滤波器和雪崩光电二极管之间测得的电压来调整反馈回路的电压。电压调节电路可以进一步被配置为至少部分地基于雪崩光电二极管的至少一个特性，温度数据以及在滤波器和雪崩光电二极管之间测量的电压来调节反馈回路上的电压。电压调节电路可以进一步被配置为至少部分地基于雪崩光电二极管的至少一个温度数据特性以及在滤波器和雪崩光电二极管之间测量的电压来调节反馈回路上的电压。电压调节电路还可以包括：模数转换器，被配置为将在滤波器和雪崩光电二极管之间测得的电压转换为对测得的电压数据进行编码的数字测量信号；以及处理器，被配置为至少处理所测量的电压数据以生成数字调整信号；数模转换器，被配置为将数字调整信号转换为调整电压，其中，调整电压影响反馈回路上的电压。处理器可被配置为至少处理温度数据和测量的电压数据以产生数字调整信号。处理器可被配置成处理至少一个温度数据、与雪崩光电二极管的至少一个特征相对应的数据以及所测量的电压数据以产生数字调整信号。雪崩光电二极管的至少一个特征可以包括对应于预定光学增益的击穿电压和反向偏置电压中的至少一个。所述细胞仪还可以包括：第一放大器，其被配置成放大雪崩光电二极管的阳极处的电压以形成第一放大电压；以及第二放大器，其被配置成放大第一放大电压以产生第二放大电压。电源可以包括DC/DC电源。雪崩光电二极管可以是：布置成接收由多个粒子中的每一个所发射的荧光量；所接收的荧光量可至少部分地基于存在于所述多个粒子中的每一个粒子中的至少一个粒子分化特性的相对量而变化；雪崩光电二极管可被配置成将所接收的荧光光量转换成至少一个基于所接收的荧光光量而变化的信号。
一束粒子流可以通过流动室，使得它们可以在某些关键位置形成单列。流动室可引导包括粒子混合物的流体流过粒子询问位置。粒子的混合物可能先前已被染料染色，例如DNA嵌入染料。当这种染料响应于暴露于光源(或电磁辐射)而产生响应光时，它可以发出荧光(或引起荧光)。当粒子一个接一个地通过时，它们可以暴露于由激光产生的电磁辐射束(例如，给定波长的光)中，并且沿着光束路径(和可选地相关光学器件)发射到粒子询问位置。这种相关联的光学器件可以包括透镜、滤光片等。粒子(包括被染料染色的粒子)暴露于电磁辐射可引起响应事件，包括被染色粒子发射的光散射、吸收和/或荧光。在某些方面，荧光产生的光的量可以根据可检测的程度而变化，这取决于精子粒子是带有X染色体还是Y染色体。
荧光产生的光可以由光学器件(例如，透镜、滤光片等)接收，并且可以聚焦到光电探测器的有源区域上。根据某些发明技术，光电探测器可包括APD或PMT。光电探测器可产生与其从询问位置接收的电磁辐射量(例如，给定波长的光)相对应(线性或非线性变化)的输出信号。光电探测器输出信号可以包括指示接收到的电磁辐射强度的时变模拟信号。该光电探测器输出信号可最终被传送到处理器(其可包括一个或多个处理器，其控制流式细胞仪或分选装置的部分操作或整个操作)。光电探测器输出信号在被传送到处理器之前可被至少一个放大器(或串联的两个或多个放大器)放大。此外，光电探测器输出信号(例如，放大的信号)可以在被传送到处理器之前被数字化。
在另一方面中，该系统可包括接收信号并生成事件数据的处理器。处理器可以进一步将事件数据编译成一个或多个数据集。处理器还可以将事件数据分布在数据集中，进行判别值计算；根据判别值对事件进行分类并做出排序决策；和/或向分选设备提供指示。处理器可以包括单个组件或者可以包括多个组件。处理器被配置成分析从流式细胞仪接收的数字化输出信号。一般来说，来自细胞仪检测器(即PMT或APD)的电信号通过A/D转换器转换为数字信息，A/D转换器向微处理器提供相应的数字信息。作为对信息的响应，微处理器控制分选系统。
从细胞仪系统的光电探测器输出的电信号是时变的模拟电压信号，指示每个粒子在激光束照射下在任何时刻发出的荧光的振幅。因此，模拟信号(也称为模拟输出)呈时变波形脉冲的形状。通常，波形脉冲被定义为包含一个或多个脉冲或脉冲的某一部分的波形或波形的一部分。因此，每个波形脉冲在任何时刻的振幅表示当细胞通过激光束时每个细胞在该时刻的光子发射的相对速率。在一个实施方案中，X染色体牛精子细胞具有比Y染色体牛精子细胞更高的DNA含量(例如，约3.8％)。结果，如上所述用荧光染色标记的活X细胞将产生与任何其他标记细胞不同的波形脉冲497。通过如下所述分析脉冲(参见信号处理、狭缝扫描和临界斜率差)，每个细胞可以被识别为X细胞或不被识别为X细胞(～X)。一般而言，如本文所用，X细胞指活X细胞，Y细胞指活Y细胞，并且～X细胞是指活的Y细胞和以其他方式产生可检测荧光发射但不能以合理的概率确定为活X细胞的细胞的组合。
每个波形脉冲的计时表明流中每个细胞的位置。由于通过流式细胞仪输送粒子的速率保持不变，并且由于检测器和分选设备之间的距离已知，因此每个粒子的位置已知。因此，微处理器可以计算分选事件发生的瞬间(即烧蚀激光器发射时)。由于微处理器接收每个粒子的事件数据，包括粒子的特征，微处理器可以跟踪(或枚举)每个亚群中被分类的粒子的数量。根据控制装置的参数设置和分类策略(见下文)，微处理器决定如何对粒子混合物进行分类。
在另一方面，该系统包括控制，以微处理器(或其它数字或模拟控制和/或处理器或其组合)形式，控制细胞混合物中粒子的辨别。在进一步方面，该控制装置从细胞仪装置接收信息，包括粒子混合物中粒子的测量特征数据。控制还包括参数集存在的信息。使用这些信息源，控制装置能够区分一组粒子中亚群的测量特征值；基于所测量的特征的可分辨值将临界值范围分配给两个或多个亚群；测量所述粒子混合物中的第二组粒子，并区分所述第二组粒子中的亚群的所测量特征的值；使用为第二组粒子区分的亚群的测量特征的值来更新为亚群所赋值的临界范围；并利用更新的临界值范围，根据亚群分类对混合物中的粒子进行分类。控制器提供输出信号，以根据分类控制分拣系统。控制可以在单个微处理器内实现。另外，可以将一些或所有功能集成到一个或多个处理器中。此外，处理可以由模拟电路或模拟和数字电路的组合来实现。
控制装置可向细胞仪系统的其它部分提供输出信号。此外，所述控制可适用于处理信息并实时提供输出信号。广义地说，术语“实时”是指控制装置的操作与人类对时间的感知相匹配的操作，或者包括控制的一个或多个处理器的操作速率与相关物理或外部过程的速率相匹配的操作。在一定场合下，术语“实时”可以表示系统在事件过时之前对事件作出反应。
在另一方面，本发明的系统包括分选装置。所述分选装置根据从所述控制装置接收到的指令，对粒子混合物中的粒子进行分选操作。分选设备可以是本领域技术人员已知的任何类型的分选机，包括例如液滴分选机、机械分选机、激光烧蚀(“zapper”)系统，或者使用本领域技术人员已知的任何其他技术。在一个实施方案中，如美国专利US9588100所述，分选系统包括聚焦能量装置。聚焦能量装置用于向粒子提供聚焦能量脉冲。聚焦能量装置可以是热能、电学、光学或电磁装置，其将具有所需要的波长，并且将以非常高的重复率(或脉冲频率)向目标粒子传递高峰值功率。在一个实施方案中，所述聚焦能量装置在控制器激活后的预定时间(即毫秒)被触发(根据粒子通过通道的移动速度设定时间)，并且向所选择的或目标的(即不需要的)粒子发出脉冲。
脉冲激光器例如包括锁模、Q开关，以及那些同时使用锁模和Q开关技术的激光器。例如，诸如Avia 355-5-100(由Coherent,Inc.,Santa Clara,Calif.制造)或SpectraPhysics公司的Explorer XP lasers Q-开关激光器之类的聚焦能量装置能够在脉冲按需模式下工作，并且能够以每秒超过1000个脉冲的速率向目标物体提供15ns或更少的能量脉冲。在一个实施方案中，脉冲能量水平为0.5-8.0μJ，在一个优选实施方案中，脉冲按需模式的Q开关激光器递送平均脉冲能量为1.8μJ，单个脉冲的范围为1.3μJ至2.3μJ。在一个实施方案中，脉冲宽度在3ns到1ms的范围内，优选地，在5ns到9ns的范围内。然而，本领域的普通技术人员将知道，为了实现期望的目标精度和/或效果，现在存在的或以后开发的具有适当的高能脉冲和脉冲频率的任何高功率激光器将适用于本发明。
在一个实施方案中，为了将脉冲能量从聚焦能量装置传送到目标粒子或其周围区域，需要一个紧密作用区域，这对于最小化将能量传递到目标粒子或区域之外、以其他方式未选择或非目标粒子的潜在影响是重要的。例如，像Explorer XP 355-1调Q激光器这样的聚焦能量装置能够提供<4％的rms，当以规则的均匀间隔发射时提供高的脉冲间稳定性。然而，对于粒子或细胞以非均匀间隔进入作用区域的流式细胞术分析和作用系统，采用额外的措施来传递均匀的脉冲能量以仅撞击目标粒子或细胞或其周围区域。此类措施包括匹配激光性能参数，例如脉冲长度和峰值功率水平，以使本发明的系统能够实现期望的目标精度(即，在一个实施方案中，目标粒子上95％或更高命中率的光损伤或杀伤率)。此外，进一步调整激光器的按需脉冲操作和性能，以在非均匀间隔发射时提供极高的脉冲间稳定性，大大降低了受脉冲影响区域的空间变异性。因此，通过减少聚焦能量装置中的脉冲间变异性，大大减少对非目标粒子或细胞的非预期动作、损伤或破坏，实现例如85％或更高的活性、非目标粒子或细胞的存活率。
所述聚焦能量装置可被设置成用脉冲来损伤、改变、禁用、杀死或破坏所述样品流体中的目标或不想要的粒子或细胞，或激活所述粒子或细胞中的若干机制中的一个，从而导致细胞损伤或死亡。然而，取决于所期望的设置，目标或所选择的粒子可以是想要的对象，在这种情况下聚焦能量装置不被激活或触发，或者目标或所选择的粒子可以是不想要的粒子，其中聚焦能量装置被激活作用于粒子，例如损害、改变、禁用，杀死或销毁选定的、不需要的粒子。然而，这些并不是唯一的实施方案，下面将进一步讨论各种实施方案。
在一个实施方案中，当所选粒子或细胞被聚焦能量装置损坏、改变、禁用、杀死或破坏时，所述粒子或细胞继续流过所述通道并与任何非目标粒子或细胞一起流入容器。任何鞘层或缓冲液也在层流中通过输出通道。
因此，在一个实施方案中，本方法和系统能够产生容器中粒子或细胞的鉴别产品，包括非目标或想要的粒子或细胞的高存活率，以及高百分比的光损伤、改变、禁用、破坏或死亡的目标粒子或细胞。
分选方法
在另一方面，提供了一种用于识别粒子混合物中的亚群的方法。粒子的混合物可能包含两个或多个亚群。这些亚群可以通过一个特征或多个特征彼此区分。该方法包括测量粒子混合物中第一组粒子的特征。该方法还包括区分该组粒子集合中亚群的测量特征值。一方面，可针对粒子集合中的两个或多个亚群来区分所测量特征的值。在另一方面，可针对粒子集合中的每个亚群来区分所测量特征的值。该方法还包括基于所测量的特征的可分辨值将临界值范围分配给两个或多个亚群。临界范围的分配可以通过根据被比较的每个亚群的测量特征的可分辨值来识别(或分类)与其他亚群相关的亚群。在分配临界值范围之后，该方法还包括测量粒子混合物中的第二组粒子，并区分第二组粒子中的亚群的测量特征值。然后使用为第二组粒子区分的子粒子群的测量特征值来更新分配给子粒子群的值的临界范围。该方法还包括使用更新的临界值范围，根据亚群分类对混合物中的粒子进行分类。
在一个方面中，本发明的方法在粒子的混合物上进行，以便识别、辨别、区分或分类混合物中的粒子。粒子的混合物可以包含两个或更多的亚群。这些亚群可以通过一个特征或多个特征彼此区分。这些粒子可能是细胞。这些细胞可以是单一类型的，也可以是多种细胞类型的混合物，例如来源于组织或存在于血液或血液部分的细胞的混合物。优选地，所述细胞可以是精子细胞。精子细胞可能来自任何种类的动物。更优选地，精子细胞来自非人类哺乳动物。进一步优选地，精子细胞来自家畜。家畜包括但不限于家禽、有蹄类动物、反刍动物。进一步更优选地，精子细胞是绵羊、山羊、马、猪或牛。牛精子细胞可以包括家养牛、野牛、非洲水牛、水牛或牦牛的精子细胞。
在另一方面，检测和测量粒子或粒子组的特性。特征可以是可以检测到的粒子的任何方面。特征可包括大小、形状、渗透性、完整性、含量、活力、死亡率、代谢状态和表面标记等方面。在另一方面，所述特征可包括DNA含量。DNA含量，特别是在单倍体细胞，如精子细胞或卵子中，是存在两条性染色体之一的指标。X染色体比Y染色体大，因此含有X染色体的单倍体细胞比含有Y染色体的配子含有更多的总DNA。可以使用本领域技术人员已知的各种方法来检测特征，包括光散射、干扰、吸收率或荧光检测。例如，可以通过用DNA结合荧光染料染色细胞并检测染料的荧光来检测细胞DNA含量的特征。在某些方面，粒子的特性是用流式细胞仪测量的。流式细胞仪用于检测和测量特性的用途在本领域是已知的，但是一般来说，流式细胞仪通过将带有检测器的光子入射转换成电信号来操作。因此，当暴露于电磁辐射源时，来自探测器的电信号对应于来自粒子的电磁辐射(以粒子发射或散射的光子的形式)。通常，荧光分子被用于对粒子的特定方面进行特异性标记，并且细胞仪检测粒子响应于粒子暴露在特定电磁辐射而发射的特定波长的光子。来自粒子的指示特性的电磁辐射由细胞仪装置内的检测器检测。探测器通常是光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(PMT)，如美国专利US 10，069，027所述。探测器将光子转换成电信号，该电信号可传输至细胞仪的处理部件，从而将值分配给所检测的特征。根据从细胞仪得出的评估来区分所测量特征的值，可进一步涉及对粒子或粒子组的值进行分类和比较，以阐明粒子混合物中的亚群的特征。例如，可以通过确定图形方式表示的值是否形成群或峰来实现。然后，可以根据所阐明的任何群或峰的关系来确定亚群的身份。在某些方面，可以通过基于所测量的一个或多个特征来找到离散事件分组来进行区分。测量的特征可以在特征空间中表示。例如，特征空间可以是粒子的一个或多个测量特征的图形表示。在一个示例性的实施方案中，特征空间可以是荧光强度的直方图，或者荧光强度和总荧光的散点图，其中荧光指示细胞中存在的DNA的量。在某些方面，区别可以是两个亚群之间的区别，也可以是几个亚群之间的单个亚群体的区别，或者连续体内的一个亚群的区别。
在进一步方面，通过流式细胞仪生成粒子的事件数据。事件数据通常根据暴露于电磁辐射源时粒子发射或散射的所产生的电磁辐射来检测。电磁辐射被探测器(通常是PMT或APD)转换成电信号。然后，电信号由细胞仪的处理器组件转换成数据。在某些实施方案中，事件数据可以是荧光强度(即对应于单个粒子的单个事件的最高荧光值)和/或总荧光(即对应于单个粒子的整个事件的综合荧光值)。
在某些方面，本发明的方法涉及对特定粒子组进行的离散作用。例如，可以在来自粒子混合物的第一组粒子上进行测量粒子混合物中粒子的特征并区分测量特征的值，随后，可以对来自同一粒子混合物的第二组粒子执行测量粒子混合物中粒子的特征并区分所测量特征的值。
在另一方面，所述方法涉及根据所测量的特征的先前区分的值为每个亚群分配一个临界值范围。在某些方面，临界范围的分配用于确定粒子混合物中的特定亚群。例如，可以为一组粒子指定一个临界范围，以根据图形表示的这些粒子的值所形成的峰值与其他粒子值的峰值之间的关系来识别这组粒子。临界值范围的赋值可包括判别值的计算。判别值可以是阈值判别值(单个值或两个值)或门阈值(例如，三个或更多值)。计算可以使用参数集的一个或多个值。在某些实施方案中，判别值的计算涉及从第一组粒子的事件数据的分布中识别第一特征的至少一个临界值；获得与第一特征的临界值相关联的第二特征的值；产生用于第二特征的值的分布；从第二特征的值的分布中识别第二特征的至少一个临界值；在特征空间中共同定位第一和第二特征的临界值；以及从共同位于特征空间中的临界值确定至少一个判别值。在进一步方面，判别值的计算可进一步涉及调整临界值以包括来自第二组粒子的事件数据。在进一步方面中，临界值包括第一亚群的一个或多个峰值特征值，以及第二亚群的一个或多个峰值特征值。峰值特征值包括峰值荧光强度和峰值总荧光。在进一步方面中，临界值还可以是第一和第二亚群的峰值特征值之间的谷值。
在另一方面，所述方法可包括测量所述粒子混合物中第二组粒子中的每个亚群的特征并区分所测量的特征的值，其发生在为所述第一组粒子分配临界值范围之后。对第二组粒子进行测量和区分，以确定分配给亚群的临界值范围是否准确，如果不准确，则更新用于分配的值。在某些方面，基于对第二组粒子中每个亚群的测量特征值的区分，将第二组粒子的值与第一组粒子的值进行比较，并且如果它们没有不同，则使用基于第一组粒子分配的值的临界范围。如果第一组粒子和第二组粒子的值存在差异，则使用第二组粒子的值更新临界值范围。通常，一定数量的粒子，或在一定时间内可以测量的粒子数量，决定了每组粒子的组成，从而决定了临界值范围的更新频率。由集合和/；或时间值组成的粒子数是参数集的一部分。
在另一方面，基于指定的临界值范围，为粒子混合物中的单个粒子指定分类。这可以基于一个临界值范围，该临界值范围由于测量的一组新粒子而更新或不更新。粒子的这种分类源于各亚群之间的关系。根据这个临界值的分配，混合物中的单个粒子可以被分类为属于一个亚群，同时这些被分类的粒子是用于更新临界值范围的第二组粒子的一部分。
在另一方面，本发明的方法通过定义用于区分混合物中的一个或多个粒子亚群的门来提供用于识别粒子混合物中的亚群的方法。当混合物中的粒子通过流式细胞仪进行处理时，这些粒子通过流式细胞仪的检测装置进行检测，从而产生检测事件。每个检测器事件可以是值的集合，包括例如信号的强度和面积的值。用计算机来处理事件数据。累积事件数据，直到编译了足够数量的事件数据，以允许计算一个或多个判别值。在计算任何判别值之前，会提供一个参数集，即影响所有判别值计算的某些细节的一组值。当编译了足够的事件数据时，将计算判别值，并用一组新的事件数据重复该过程。每组事件数据是前一组事件数据，以确定随后一组事件数据计算的判别值是否与从前一组事件数据计算的判别值存在显著性差异。如果差异不显著，可以将前一次识别值计算得到的可用数据取平均值，以提高连续计算的识别值之间位置和形状的一致性。如果判别值显著不同，则丢弃先前计算的判别值的数据。
在所述方法的某些方面中，提供粒子的混合物。混合物的成分可根据应用而变化。混合物可包括粒子和介质。在某些实施方案中，粒子的混合物是精子样品。精子细胞可能含有原射精成分、其他介质和/或增稠剂。粒子混合物被输送到流式细胞仪系统。
在某些方面中，提供了参数集。参数集提供给处理器，用于计算一个或多个判别值。参数集包括一组值，这些值影响所有判别值计算的某些细节。在某些方面，参数集包括用于计算阈值的值。在其他方面，参数集包括用于计算门的一个或多个点或顶点的值。在进一步方面中，参数集包括发生判别值计算的频率和/或触发判别值计算的事件数据量。
在某些方面，检测混合物中粒子的特征。所述检测由细胞仪执行。细胞仪通过检测单个粒子的各个方面来检测其特征。单个细胞特征的检测被认为是一个单个事件。在某些情况下，粒子可能以粒子束的形式到达探测器，因此，对于聚集的细胞，探测将作为单个事件进行。这些方面可包括粒子的大小和形状(例如通过检测光散射)和粒子组成(例如通过检测粒子表面上或粒子内荧光标记的存在)。在某些方面，被检测的粒子方面可以是荧光染料。在进一步方面，所述粒子可以是细胞，并且所述染料可以是荧光DNA染料。每个粒子可以被检测到一个或多个特征，并且单个事件可以包括一个或多个检测到的特征。细胞仪的检测器产生与每个事件的检测特征相对应的信号，并将该信号提供给处理器(例如CPU)。
在步骤306，分发编译的事件数据，数据分布的发生可能取决于参数集的一个或多个值-事件的频率或数量。在某些方面，分布可以是按事件区域对事件进行排序。在其他方面，分布可以是按强度对事件进行排序。在进一步的方面，分布可以是按强度和面积的分类对事件进行排序。
在另一方面中，事件的分类被提供给实现排序/不排序决策的排序装置。
将为一组已编译事件计算的判别值与为前一组事件计算的判别值进行比较。[重复步骤303、307，根据新编译的事件数据集生成新的判别值]。[如果不同，则丢弃先前的；如果没有差异，则是平均事件数据]。[这可通过直接比较计算出的判别值来实现，或通过比较两个已编译数据集中的数据来实现]。
在另一方面中，本发明的方法可以按下列方式进行：
1.获取参数集。
2.从参数集中获取门计算的频率。
3.从参数集中获取其数据将直接用于门计算的最大事件数(注：每个事件都有一个是最大瞬时荧光的量度的“强度”，一个是事件持续时间内强度的积分的“面积”。)
4.当探测器生成事件时，将每个事件添加到用于计算门的事件数据集中。如果已经存在最大数量的事件，则添加新事件，并在随后的门确定中忽略最早的事件。
5.根据步骤2，周期性地确定是否已经累积了足够的事件来尝试计算一个门，如果是，继续执行步骤6。
6.按区域对累积事件排序。保存此数据集中事件区域的中值。
7.将累积的事件按强度排序，然后按面积进行排序。保存此数据集中事件强度的中值。
8.通过将强度和面积的中值与上次计算数据集中的对应中值进行比较，确定自上次计算以来事件数据的特征是否发生了显著变化。(如果之前没有可用的中值，则继续操作，如同没有显著变化一样。)
9.如果事件数据的特征发生了显著的变化(从步骤8开始)，首先保存，然后清除与以前的门相关的数据，这样它就不会影响当前数据集产生的门。例如，“忘记”可能在步骤32、57和所有其他类似步骤中与当前数据平均的旧数据。
10.创建所有事件的强度值的直方图。放置在直方图容器中的值的范围是0到65535，它们被分类到512个大小相等的容器中，这些容器共同覆盖了整个范围。
11.从直方图左边缘计算25％，从直方图右边缘计算15％。对于512个直条(bin)，这些数字对应128和435。
12.在由步骤11中确定的限制限定的直方图区域中找到三个最高峰值。直方图中的峰值是指计数数量大于任一侧直条中的计数。
13.按直条高度(每个直条中的事件数)降序排列步骤12中直方图峰值的直条号。
14.检查在步骤11中确定的限制之外的直方图区域内的所有峰。如果其中任何一个高于步骤13中确定的第二高的峰，则标记门计算错误并等待设置为新的事件数据可用。
15.雄性和雌性峰之间会有一些符合预期的物种依赖的强度差异范围。称其为所需的强度差。从步骤13中确定三个最高峰之间的强度差，取两个峰为一对。共有三对：峰1和2、峰1和3以及峰2和3。
16.如果没有一对峰值显示出所需的强度差，则标记计算错误并等待新可用的事件数据集。
17.如果步骤15中仅有一对之间的差异是所需的强度差异，则该对直方图峰值表示雄性峰值和雌峰值。如果不在该对中的第三个峰值是步骤12的三个峰值中最高的，则标记计算错误并等待新的可用事件数据集。
18.如果第17步没有确定雄性和雌性直方图峰值，则确定两对最高峰值是否都显示出所需的强度差。如果有两对是，那么按照直条号排列的所有三个峰都是等距分布的(情况A)，或者两个最高的峰非常接近(一个是尖峰，两个都代表相同的雄性峰或雌性峰)，第三个代表异性的峰(情况B)。检查间距以确定情况A或B是否正确。
19.如果遇到步骤18中的情况A，则中心峰是雄性峰或雌性峰。在左右峰中，其中一峰的高度必须小于另一峰高度的三分之二。如果不是这样，则标记一个计算错误并等待新的可用事件数据集。如果这是正确的，左峰和右峰中的较高者是异性峰；中心峰和两个外峰中较高的是雄峰和雌峰。左边的峰可能是雄性峰，也可能是雌性峰，这取决于样品源的种类。
20.如果遇到步骤18中的情况B，则选择在表现出所需强度差的两对峰值中的直方图峰值作为相关(雄性或雌性)直方图峰值之一，并且将另外两个直方图峰值视为另一相关峰值，进一步处理以确定哪个是峰的峰值，哪个是主峰(参见步骤21)。
21.如果遇到步骤18中的情况B，则找到表示剩余关注峰值和该峰的峰值的两个直方图峰值的宽度。通过找到它们之间最低点(槽)的直条来计算宽度，然后从槽向外移动，找到两个方向上的第一个高度比槽低的直条。从槽仓到第一个较低仓的仓数是该方向上峰值的宽度。以两个峰中较窄的一个为尖峰，较宽的一个为第二个兴趣峰(雄峰或雌峰)。
22.如果标识为雄性和雌性的两个峰值不是两个最高峰值，则标记计算错误并等待新的可用事件数据集。如果是，则将两个峰中最右边的峰指定为雌性强度峰，最左边的峰指定为雄性强度峰，反之亦然，具体取决于样品来源的种类。
23.将所识别的雄峰和雌峰之间的最低直方图的直条识别为谷底。
24.将峰谷比(P2T比值)计算为((P1+P2)/2)/T，其中P1和P2分别是雄性和雌性强度直方图峰仓中的计数，T是槽仓中的计数。此外，从参数集中检索峰谷阈值(P2T阈值)。另外，将峰值优势值计算为(P2-T)/(P1-T)，并从参数集中检索最小峰值优势值。
25.将步骤24中计算的P2T比率与P2T阈值进行比较。如果峰谷比小于阈值，则标记错误并等待新的可用数据集。同时，比较峰值优势值和最小峰值优势值。如果峰值优势值小于最小峰值优势值，则标记错误并等待新的可用数据集。
26.对于雄峰和雌峰，计算从谷底到直方图峰值的直条数。
27.对于雄性和雌性直方图峰值，计算直条中的峰值宽度，为步骤26中发现的相应值的两倍，再加上1。
28.对于雄性和雌性直方图峰值，计算直方图直条的数据使用点(x，y＝binnumber，count)拟合曲线。将其作为步骤27中的峰值宽度进行计算，除非峰值宽度大于9，否则将存储直条数设置为9。
29.对于雄性和雌性直方图峰值，通过对峰值周围的直条应用多项式最佳拟合算法，找到更精确的雄性和雌性峰值位置，使用步骤28中计算的直条数作为曲线拟合的点数；然后应用Newton-Raphson算法求出拟合多项式中零斜率位置对应的强度。这个更精确的峰值估计值是一个带小数点的非整数直条数。
30.从步骤23开始，对以槽仓为中心的五个仓应用多项式最佳拟合算法。然后应用Newton-Raphson算法求出拟合多项式中零斜率位置对应的强度。这个更精确的谷底估计是一个带小数点的非整数bin数。
31.如果步骤30中的槽仓估计值与步骤23中最初发现所在槽仓数量之间的差值大于1.0，根据步骤30中的精确估计值是否大于或小于步骤23中的槽仓值，将精确估计值调整为步骤23中的槽仓值加上或减去1.0。
32.计算在最后五个事件数据集中获得的步骤31的槽仓值和步骤31的槽仓值的平均值。使用此平均值作为从此数据集获得的低谷值。
33.将强度值范围的宽度(65536)乘以0.003。乘积为196.608。
34.通过将精确的直条编号乘以直条宽度，将雄性和雌性直方图峰值位置(作为直条编号)转换为强度值。例如，如果步骤29中的雌性直方图峰值位置是257.358，并且0到65535范围内有512个直方图单元，则单元宽度是128，并且通过乘以257.358×128＝32942.6获得0到65535范围内的强度峰值。
35.使用步骤33中的计算结果和从步骤34转换为强度值的雄性和雌性直方图峰值位置的乘积，找出强度值在步骤33中的乘积给出的峰值距离内的事件子集。对雄性峰和雌性峰分别这样做。例如，如果雌性强度峰值为32942.6，则在事件数据集中找到强度在[32942.6–196.608，32942.6+196.608]范围内的事件子集，即强度在32746和33139之间的事件。对一组强度接近雄性直方图峰值的事件做同样的处理。
36.对雄性峰和雌性峰分别执行以下步骤37至54，以在(强度、面积)平面中找到要绘制门的峰的“面积”坐标。这些步骤仅使用步骤35中选择的事件中的事件数据。
37.在步骤35中选择的事件中创建面积值数组。按升序排序。
38.计算等于步骤37中数组中面积值数量75％的数字。在本过程描述中，将其称为numValuesIn75Pct。
39.计算等于步骤37中数组中面积值数量99％的数字。在本过程描述中，将其称为largestRetainedIndex。
40.在后续步骤中，忽略大于第99百分位值的所有面积值，即数组索引大于largestRetainedIndex(步骤39中计算的索引)的数组中的所有值。
41.使用步骤38中的numValuesIn75pct，找到标记面积值第75百分位的面积值。在本过程描述中，将该值称为“lowest75pctMax”。
42.从步骤37中找出数组中的最小面积值。在本过程描述中，将该值称为“lowest75pctMin”。
43.计算lowest75pctMax–lowest75pctMin，它表示不被忽略的面积值范围，如步骤40所述。在本过程描述中，将此差异称为“areaRange”。
44.计算“区域”直方图直条的可变宽度为：areaBinWidth＝areaRange/512。
45.计算值(largestRetainedArea/areaBinWidth)+1，在本过程描述中，将其称为“numberOfAreaBins”。
46.在步骤37中查找数组索引“largestRetainedIndex”处的值。在本过程描述中，将该值称为“largestRetainedArea”。
47.如果要查看的选定事件很少，那么：
largestRetainedIndex<(6x numberOfAreaBins from step 45)
then recalculate areaBinWidth according to:
numberOfAreaBins＝(largestRetainedIndex/6)+1
If(numberOfAreaBins<4)
numberOfAreaBins＝4；
areaBinWidth＝largestRetainedArea/(numberOfAreaBins–1)
48.创建步骤37的数组中面积值的直方图，忽略数组索引大于步骤40中提到的最大保留索引的数组中的所有值。
49.使用相同数量的直条创建另一个面积值直方图，通过将步骤48中每个直条中的值计数与两侧七个直条(步骤48中)中的值计数求平均来平滑，即将15个值相加求平均值。
50.在步骤49中的平滑区域直方图中找到计数最多的直条。
51.将步骤50中直条中的计数乘以0.2。
52.从计数最多的直条向左移动(较小的数组索引)，找到第一个计数少于步骤51中计算的乘积的直条。
53.从计数最多的直条向右移动(较大的数组索引)，找到第一个计数少于步骤51中计算的乘积的直条。
54.使用最小二乘多项式曲线拟合算法找到一个十次多项式，该多项式近似于步骤52和53中找到的直条之间的平滑直方图区域。利用Newton-Raphson算法，找到多项式斜率为零的位置，并以此位置作为峰的面积值。
55.已知雄性峰和雌性峰的(强度，面积)位置后，计算(强度，面积)坐标空间中点的位置，该点位于穿过雄性峰和雌性峰的直线上，并且具有在步骤32中计算的槽的强度坐标。该点是(强度、面积)坐标空间中的槽仓位置。
56.如果雄性峰的面积坐标高于雌性峰的面积坐标，或低于雌峰的面积坐标，则根据样本源的种类，标记错误并等待下一个事件数据集。
57.针对最近三十个事件数据集中的每个雌性峰值强度坐标，计算步骤29中的雌性峰值强度坐标值，该值已针对自处理事件数据集以来发生的电子设备中的漂移进行了调整。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。在本过程描述中，将平均值称为“平均雌性峰值强度”(计算漂移调整坐标的过程用一组步骤来描述，这些步骤用字母而不是数字来枚举。)
58.计算为步骤29中的雄性强度坐标的值，该值已针对自处理事件数据集以来发生的电子设备中的漂移进行了调整，用于最近三十个事件数据集中的每个雄性峰强度坐标。用处理此事件数据集的步骤29中的雄性强度坐标平均漂移调整后的雄性强度峰值坐标。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。在本过程描述中，将平均值称为“平均雄性峰值强度”(计算漂移调整坐标的过程用一组步骤来描述，这些步骤用字母而不是数字来枚举。)
59.计算步骤32中的槽仓强度坐标值，该值已针对自处理事件数据集以来发生的电子设备中的漂移进行了调整，用于最后三十个事件数据集的每个波谷强度坐标。将漂移调整后的槽仓强度坐标与处理此数据集的步骤32中的槽仓强度坐标求平均值。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。在本过程描述中，将平均值称为“平均波谷强度”(计算漂移调整坐标的过程用一组步骤来描述，这些步骤用字母而不是数字来枚举。)
60.计算步骤32中的槽仓强度与步骤29中绘制门的峰值强度之间的差值。将此距离称为峰谷强度距离。
61.将步骤60的峰谷强度距离与步骤60中发现的最近30个事件数据集的峰谷强度距离求平均值。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。在本过程描述中，将平均值称为“平均峰谷强度距离”。
62.在(强度、面积)坐标平面中，根据感兴趣的顶点的位置创建多边形形状的门，该门有八个顶点。通过从参数集中获取encroachmentPct值来启动该过程的此阶段。除以100.0，然后从1.0中减去结果，得到后续步骤中使用的“侵占乘数”。
63.将平均峰谷强度距离乘以步骤62中的侵蚀乘数。在本过程描述中，将产品称为“侵占调整”。
64.计算一个称为“侵占强度”的值，用于本过程描述。两个顶点位于通过侵蚀强度绘制的垂直线上。如果门是相对于雄性峰创建的，则侵蚀强度是平均雄性峰强度加上侵蚀调整。对于雄性峰，侵蚀强度是(强度，面积)平面中强度轴最右边的一个或多个门顶点的强度坐标。如果门是相对于雌性峰创建的，则侵蚀强度为平均雌性峰强度减去侵蚀调整。对于雌性峰，侵蚀强度是(强度，面积)平面中强度轴上最左侧的一个或多个门顶点的强度坐标。
65.从参数集中检索peakFalloffPct值。这是一个0.0到100.0范围内的十进制值。目前使用的是65.0，但最终可能会确定其他一些值为最佳值。将peakFalloffPct除以100.0，然后将其乘以强度直方图中相关峰值的最高直条高度(步骤10)。相关峰值是雄性强度峰值或雌性强度峰值，取决于相对于哪个峰值计算门。在本过程描述中，将乘法的乘积称为“falloffValue”。
66.从相关峰值中的最高强度直方图直条开始，远离步骤23的槽仓，直到当前检查的直条高度小于或等于falloffValue。计算对应于该直条中心的强度值为[直条指数+0.5]×[直条宽度]。在本过程描述中，将此值称为“衰减强度”。
67.将步骤66中的衰减强度与最后三十个事件数据集的衰减强度求平均值。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。在本过程描述中，将平均值称为“平均衰减强度”。
68.取平均衰减强度作为两个门顶点(强度、面积)平面中强度坐标的初始值，这两个门顶点在相对于雌性峰绘制的门中最右侧，或在相对于雄性峰绘制的门中最左侧。
69.从参数集中检索“octExtension”值。octExtension是大于0.0的十进制值。目前使用值0.6，但将来可能会更改。将octExtension乘以步骤61的平均峰谷强度距离。在本过程描述中，将该值称为“延伸距离”。
70.如果相对于雄性峰绘制门，则从步骤68中计算的初始值减去步骤69中的延伸距离。如果相对于雌性峰绘制，则将延伸距离添加到初始值。使用结果作为两个门顶点(强度、面积)平面中强度坐标的最终值，这两个门顶点在相对于雌性峰绘制的门中最右侧，或在相对于雄性峰绘制的门中最左侧。
71.计算相对于雌性峰绘制的门的平均侵入强度和平均雌性峰强度，或相对于雄性峰绘制的门的平均雄性峰强度。
72.从参数集中检索“horizadjmultipler1”值。将其乘以步骤61的平均峰谷强度距离。将乘积与步骤71中计算的值相加。对于相对于雌性峰的门，结果用作(强度，面积)平面中位于侵占强度右侧的垂直线上两个顶点的强度坐标。对于相对于雄性峰的门，该线位于侵蚀强度的左侧。0.0的值当前用于horizadjmultipler1，但可能会更改。
73.计算相对于雌性峰绘制的门的平均衰减强度和平均雌性峰强度的平均值，或相对于雄性峰绘制的门的平均雄性峰强度。
74.从参数集中检索“horizadjmultipler2”值。将其乘以步骤61的平均峰谷强度距离。将乘积与步骤73中计算的值相加。对于相对于雌性峰的门，结果用作垂直线上两个顶点的(强度，面积)平面中的强度坐标，该垂直线上位于步骤72中计算的线的右侧和通过衰减强度绘制的线的左侧。对于相对于雄性峰的栅极，该线在步骤72中计算的线的左侧和通过衰减强度绘制的线的右侧。0.0的值当前用于horizadjmultipler2，但可能会更改。
75.计算第55步中的槽“面积”坐标与第29步中绘制门的峰的峰面积坐标之间的差值。将此距离称为峰谷面积距离。
76.将步骤75中的峰谷面积距离与步骤75中发现的最近30个事件数据集的峰谷面积距离求平均值。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。在本过程描述中，将平均值称为“平均峰谷面积距离”。
77.考虑一条穿过(强度、面积)雄性峰和雌性峰的“轴线”。两个门顶点位于步骤72中计算强度的线上，一个在轴上方，一个在轴下方。计算第72步的轴和垂直线相交处的交点(强度、面积)。然后通过从参数集中检索“AreaAboverMultiplier”的值并将其乘以第76步的平均峰谷面积距离，并将结果添加到交点的面积坐标，计算垂直线上和轴上方顶点的“面积”坐标。
78.通过从参数集中检索“areaBelowMultiplier”的值并将其乘以步骤76的平均峰谷面积距离，然后从交点的面积坐标中减去结果，计算步骤72中轴线下方的顶点的“面积”坐标。
79.两个顶点位于通过侵占点绘制的垂直线上，一个在轴线上方，一个在轴线下方。计算侵蚀强度处的垂线与轴线相交的点；在本过程描述中，将该点称为“侵占点”。通过从参数集中检索AboverHeightPctLeft的值，将其除以100.0，然后将其乘以从步骤77中计算的顶点到轴线的垂直线段长度，计算具有侵蚀强度的顶点和轴线上方的“面积”坐标；然后将该值添加到侵占点的“面积”坐标中。
80.从侵蚀强度处的垂直线与轴线相交的点(在步骤79中计算)开始，通过从参数集中检索belowHeightPctLeft的值，计算步骤79的顶点，该顶点位于侵蚀强度处的垂直线上，但在轴线下方，除以100.0，再乘以从步骤78计算的顶点到轴线的垂直线段长度；然后从侵占点的面积值中减去该值。这是点的“面积”坐标。
81.两个顶点位于具有在步骤74中计算的强度的垂直线上。计算第74步的轴和垂直线相交处的交点(强度、面积)。然后，通过从参数集中检索“AreaAboverMultiplier”的值并将其乘以第76步的平均峰谷面积距离，然后将结果添加到交点的面积坐标，来计算轴线上顶点的“面积”坐标。
82.通过从参数集中检索“areaBelowMultiplier”的值并将其乘以步骤76的平均峰谷面积距离，然后从步骤81中计算的交点的面积坐标中减去结果，计算步骤74中位于轴下方的线上顶点的“面积”坐标。
83.两个顶点位于通过衰减强度绘制的垂直线上，一个在轴线上方，一个在轴线下方。计算衰减强度处的垂直线与轴线相交的点；在本流程描述中，将该点称为“衰减点”。通过从参数集中检索AboverHeightPCTright的值，将其除以100.0，并将其乘以从步骤81中计算的顶点到轴线的垂直线段长度，计算具有衰减强度且在轴线上方的顶点的“面积”坐标；然后将该值添加到衰减点的“面积”坐标。
84.从步骤83的衰减点开始，通过从参数集中检索belowheightptright的值，计算步骤83的顶点，该顶点位于衰减强度处的垂直线上，但低于轴线，除以100.0，再乘以从步骤82计算的顶点到轴线的垂直线段长度；然后从衰减点的面积值中减去该值。即轴下方点的“面积”坐标。
85.现在已经从事件数据集计算了八个门顶点，除非在过程的中途标记了错误。从参数集中检索扰动跳过的值。如果自上一次在步骤9中注意到数据的重大变化以来处理的事件数据集的数量小于或等于扰动跳过(包括当前数据集)，则不要创建门。相反，使用“无门”并对流经流式细胞仪系统的所有细胞应用相同的操作，直到通过处理后续数据集创建新的门。但是，如果自上次显著更改以来处理的事件数据集的数量大于扰动跳过，则应用此过程从事件数据集计算的门。
86.对于需要在流程的后续迭代中用类似值平均的每个值，保存处理此数据集所产生的值。
在另一方面，该过程还包括用于寻找漂移校正强度的发明技术[上述步骤57-59的展开]
A.创建一个事件数据集计数器变量并将其初始化为零。
B.每次处理新的事件数据集时，递增计数器。递增计数器，以确定是否在处理数据时标记了错误，以及是否在步骤8中检测到事件数据的字符变化。
C.当在步骤86中保存要与来自后续数据集的类似值平均的值以供将来使用时，保存与产生该值的数据集相关联的数据集计数器的值。
D.通过从X的最新值中减去X的最早可用保存值，计算变量X在处理多个数据集所跨越的时间段内的平均漂移率，得到DELTA_X，以及从与最近存储的值相关联的计数器的值中减去与最早值相关联的数据集计数器的值，以获得DELTA_T；然后计算DELTA_X/DELTA_T作为平均漂移。
E.要计算某个变量的特定记录实例的总漂移调整，请将从步骤D中获得的变量的平均漂移率乘以自记录该值以来经过的时间段数(即，已呈现的事件数据集数)。乘法的乘积表示漂移调整。将漂移调整值与先前记录的值相加，得到漂移校正值。
在某些方面中，本发明提供由本文所述的系统和方法产生的分选粒子产品。这些分类产品可能具有更高和/或更一致的质量。在某些方面，本发明的分选粒子产物是经性别鉴定的精子细胞样品。经性别鉴定的精子样本可能主要是带有X染色体的精子，也可能主要是带有Y染色体的精子。经性别鉴定的精液样本可为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％(或60-100％范围内的任何百分比)带有X染色体或Y染色体的精子细胞。经性别鉴定的精子细胞样品可包含盐基培养基配方，任选地包括任何数量的有益成分，包括但不限于冷冻保存剂(例如甘油)、抗氧化剂、填充剂、蛋白质、维生素和糖。经性别鉴定的精子样本可能适用于受精，包括人工授精(AI)或体外受精(IVF)。
实施例
用程序优化门控系统鉴别携带Y染色体的精子细胞
对于精液性别鉴定的某些方法来说，原始射精中存在的细胞混合物(连同任何死细胞和细胞团)被富集为携带活X染色体的精子细胞或携带Y染色体的精子细胞。对于乳制品的应用，携带X染色体的精子细胞更倾向于怀孕，将产生雌性后代。浓缩通常通过液滴分选或激光烧蚀进行。在激光消融应用中，“杀死”激光试图杀死所有不具备所需特征的细胞(即不携带活X染色体的精子细胞的任何细胞)。在目前的系统中，细胞被DNA插入荧光染料标记，每个细胞发出的荧光被检测为DNA总含量的量度。每个细胞(或细胞团)产生的荧光信号由雪崩光电二极管检测并记录为事件。牛携带X染色体的精子细胞比携带Y染色体的精子细胞拥有大约3.8％的DNA，这意味着携带X染色体的精子细胞会发出更多的荧光。与带有Y染色体的精子细胞相比，与带有X染色体的精子细胞相对应的荧光强度(峰值)更大。每个事件的荧光信号面积也被确定。荧光信号区域是在检测到该事件的时间量内来自该事件的所有荧光的积分(即总和)。每个事件都可以在强度(峰值)和面积图上用图形表示，当许多事件的图被编辑时，细胞的亚群就可以被识别出来。例如，一个带有X染色体的精子细胞亚群相对于带有Y染色体的精子细胞亚群具有较高的密度，并且作为一个基于面积的单个细胞(一个双染色体的细胞将具有更高的密度和/或更大的面积)。当事件数据产生的结果超出图形上的某个区域(即，包含携带X染色体的精子细胞的区域)时，杀伤激光被触发，以激发任何事件。图上这个区域的边界是门。在以前的系统迭代中，软件操作员通过单击峰值强度图中的位置来创建门。描述门的多边形是通过依次选择顶点创建的，直到多边形完成。如果多边形被成功描述(即它至少包含三个顶点)，闸门顶点的坐标被发送到GPP，并从GPP发送到DSP，以控制杀伤激光，从而使杀伤激光被检测到落在门外的偶数触发。
据观察，不同的操作人员以不同的方式绘制闸门，导致特定期望结果中未知量的变化，无论是增加纯度还是增加性别精液样本的产量。此外，先前的工作已经证明，在运行开始时归属于子种群的门可能不会在运行结束时归属于相同的种群，这可能是由于几个因素造成的。因此，在以前的系统中有三个问题需要解决：缺乏对门产生的形状和位置的控制，导致产品不一致和收集条件不理想；由于事件属性在收集过程中漂移，门围绕母峰的中心不充分；以及操作员的参与，以建立和保持门与携带X染色体的精子细胞群的匹配。
为了解决这些问题，根据已知的X染色体精子群与Y染色体精子群的关系，提出了一种通过设置门顶点来绘制门的算法。具体来说，在编译事件时，通过使用执行以下操作的算法，根据事件的分布确定门的顶点。在算法的性能上，系统使用了一个参数集，包括：门计算的频率和将直接用于门计算的最大事件数；峰值到低谷(P2T)阈值，以及用于计算门顶点的配置设置。算法执行如下：
1.累积事件–通过调用静态函数，从外部源(流式细胞仪)一次添加一个事件到寄存器中，静态函数反过来调用公共成员函数。从参数集合中获得了门计算的频率和可以直接用于门计算的最大事件数。
a.事件存储在一个数组中。如果调用函数时数组中的事件数少于设置的默认值，则返回错误。
b.累积事件的数组是一个循环缓冲区。缓冲区中当前的事件数(从索引0开始)初始化为零，并在每次注册事件时递增。一旦事件数达到缓冲区的大小，它就不再递增，添加的新事件将覆盖最早的事件。提供的第二个变量是要写入下一个事件的索引。它也被初始化为零。
c.确定是否已累积足够的事件来尝试计算门。一旦积累了足够的事件，继续计算门。
d.累积的事件被复制到一个单独的数组中，然后按峰值和面积值升序排序。排序是通过创建指向事件的指针数组来实现的。保存此数据集中事件区域的中值。
e.还可以通过提供事件数组同时添加多个事件。但是，这不是一个静态函数，调用者需要调用它。调用者决定是单独添加它们还是在多个事件的缓冲区中添加它们。
f.通过将强度和面积的中值与上次计算数据集中的相应中值进行比较，确定自上次计算以来事件数据的特征是否发生了显著变化。如果事件数据的特征发生了显著变化，则首先保存，然后清除与以前的门相关的数据，使其不会影响当前数据集产生的门。
2.通过调用calculategate函数来计算门。此函数中出现以下情况：
a.创建事件峰值的直方图。放置在直方图直条中的值的范围是0到65535，它们被分类到512个大小相等的直条中，这些直条共同覆盖整个范围。直条数量为512个，每个直条的宽度为128个。
b.找出直方图中的最高峰值，如果有的话，并确定哪一个符合雄性和雌性峰值的标准。找到三个最高的峰并按高度排序。确定了三个而不是两个，以说明两个最高明显峰实际上不是一个峰，而是雌雄峰或者雄性峰侧面的峰的情况。
1.计算允许进入最左侧和最右侧峰值位置直方图的指数。这些指标是25％的直方图左边缘和15％的直方图右边缘。
2.根据直条编号确定允许区域内的三个最高峰值。“峰值”是一个柱状图直条，左侧和右侧的直条的值都较低。如果两个或多个相邻的直条具有相同的值，并且两侧的直条都较低，则当前还不能其标识为峰值，应将其视为错误。
3.按直条高度(每个直条中的事件数)降序排列上一步中直方图峰值的直条号。
4.检查直方图中超出最左侧和最右侧允许峰值位置允许范围的部分的峰值。如果在允许范围外发现的任何峰值高于在允许范围内发现的三个最高峰值中的第二个最高峰值，则返回错误，因为要求雄性峰和雌性峰必须是两个最高峰值，并且必须在左侧和右侧的截止限值内。
5.如果正确地识别出雄性峰和雌性峰，则它们之间的间隔总是在2.8％到4.8％之间。该算法利用这些信息来处理三个最高峰值，如果有的话，并确定哪一个是雄性峰值和雌性峰值。如果在允许的范围内只发现两个峰值，则它们之间的距离必须正确，否则将标记计算错误并等待新的可用事件数据集。
6.如果在允许的范围内发现三个峰，则通过找到两个近峰之间的最低点，然后从两个方向上的最低点移开，找到两个近峰的另一侧与槽仓高度相同的位置，来确定两个近峰中的哪一个是另一个的尖峰。宽的一侧是“真实”峰，窄的一侧是“尖峰”。
7.如果三个最高峰中正好有两个相距2.8％到4.8％，那么这两个峰就是雄峰和雌峰的候选峰。检查第三个峰值，看它是否是另外两个峰值中的一个峰值，因为它非常接近其中一个峰值。如果它是一个尖峰，则忽略。如果它不是尖峰并且高于其他两个峰值中的任何一个，则标记计算错误并等待新的可用事件数据集。
8.如果这三个峰的间距是相等的且约为3.8％，那么
i.如果最左边的峰小于最右边峰高的2/3，则最中间和最右边的峰是雄性峰和雌性峰的候选峰；或
ii.如果最右边的峰小于最左边峰高度的2/3，则最中间和最左边的峰是雄性峰和雌性峰的候选峰。
iii.如果(i)或(ii)都不满足，则返回错误。
9.如果三个最高峰值之间的距离都不在3.8％左右，则标记一个计算错误，并等待新的可用事件数据集。
10.在通过上述方法中的任何一种来选择雄性峰和雌性峰的候选峰之后，对它们进行双重检查以确认它们是两个最高峰，或者另一个，最高峰是另外两个峰中的一个的峰值。如果不是这样，则生成错误。否则，候选峰被认为是雄性峰和雌性峰。
c.确定峰值的x坐标(强度)值。对已识别的雄性和雌性直方图峰值计算出确切的x坐标峰值，以比它们的直条标识符更准确
1.应用最小二乘多边形拟合算法确定每个峰值中心的精确直方图单元。柱状图中的峰值非常尖锐。只有几个直条被用来计算峰值的中心。要使用的最左侧和最右侧直条是通过计算两个峰值之间从峰值到谷底的距离(直方图直条的数量)来确定的，并使用两个方向上从峰值中心的距离来确定输入曲线拟合算法的直方图峰值直条的限值。
2.用于拟合的多项式次数被设置为输入算法的直条数。拟合多项式后，应用Newton-Raphson算法在估计峰值附近找到多项式斜率为零的“x”值，精度至少在1/65536以内。将牛顿-拉夫逊(Newton-Raphson)算法的结果作为峰值的中心。
3.如果在进行多项式曲线拟合时，浮点处理器中出现NaN(非数字)，则返回错误，但继续执行。如果牛顿-拉夫逊算法无法在1000次迭代中确定峰值的中心(通常只需要大约10次迭代)，则会返回一个错误，但会继续执行。
4.每个峰值的x坐标峰值计算为多项式拟合算法提供的每个峰值中心的精确直方图直条乘以直方图直条宽度。
5.雌性峰被认为是两个确定的峰中最右边的，即是具有较大事件峰“x”坐标的峰。
d.确定包含槽的直条。此时计算峰谷比(P2T)，并与P2T阈值进行比较，否则设置为默认值1.2。如果直方图中的P2T比率过低，则会产生错误。
1.计算P2T比值为((P1+P2)/2)/T，其中P1和P2分别是雄性和雌性强度直方图峰值仓中的计数，T是槽仓中的计数。
2.计算峰值优势值为(P2-T)/(P1-T)，并从参数集中检索峰值优势阈值。
3.将计算的P2T比率与P2T阈值进行比较。如果峰谷比小于阈值，则标记错误并等待新的可用数据集。
4.将计算的峰值优势值与显性峰值优势阈值进行比较。如果计算的峰值优势值小于阈值，则标记错误并等待新的可用数据集。
e.将槽仓高度确定为直方图中两个峰值之间最低点的直方图高度。
f.分别针对雄性和雌性峰值，创建事件区域值的直方图，并在该“区域”直方图中找到最高峰值，并使用该直方图确定雄性或雌性峰值的y坐标值。
1.通过仅使用事件峰值接近计算的“x”值的事件，即事件峰值在65536(事件峰值范围)的0.3％以内的事件，可以找到事件最频繁处的雄性和雌性峰值点的y坐标。用事件面积值来求峰值y坐标的事件峰值范围为:
峰值x-(65536*峰值宽度×0.01)至
峰值x+(65536*峰值宽度×0.01)。
2.接近雄性峰值的事件和接近雌性峰值的事件的事件区域值被放置到单独的数组中。这两个“区域”值数组都按升序排序。
3.分别为雄性峰和雌性峰创建面积值的直方图。
i.使用以下步骤计算而不是预定义此直方图的直条宽度：
·计算等于峰面积值数量的75％的数量(numValuesIn75pct)；
·计算等于峰面积值数量的99％的数量(largestRetainedIndex)；
·忽略其值大于所有面积值的第99个百分位数的面积值，该值由最大保留索引确定；
·确定位于第99个百分位数(最大保留面积)的面积值；
·使用numValuesIn75pct(lowest75pctMax)找出标记面积值第75个百分位数的面积值；
·从峰附近的事件(lowest75pctMin)中找到排序面积值数组中的最小面积值；
·计算面积值的最低75％中面积值的范围(areaRange；＝lowest75pctMax–minimum75pctMin)；
·计算直条宽度为areaRange/512(areaBinWidth)；
·将直条的数量计算为(largestRetainedArea/areaBinWidth)+1(numberOfAreaBins)；
·如果要分为直条的面积值数量小于刚计算的所分直条数量的6倍，则numberOfAreaBins＝(largestRetainedIndex/6)+1；如果(numberOfAreaBins<4),numberOfAreaBins＝4；areaBinWidth＝maximumRetainedArea/(numberOfAreaBins–1)
ii.在根据计算的直条数和直条宽创建了面积值的直方图之后，使用以每个平滑的直条值为中心的15个直条范围对直方图值进行平滑处理。
iii.在面积直方图中找到最大值。
iv.确定面积范围，提交最小二乘曲线拟合算法。
·计算最大面积直条数的20％的面积(“峰值”面积的20％)直条数
·从直方图最大峰值向左移动到较小区域的直条，找到计数小于最大直条计数20％的第一个直条。这标志着提交给曲线拟合算法的最左边的直条。
·同样是从直方图最大值向右移动，以找到提交给曲线拟合算法的最右边的直条
v.将面积直方图提交给最小二乘多项式曲线拟合算法和牛顿-拉夫逊算法，以获得更精确的面积值，该值用于与事件面积相同单位的每个峰值的y坐标
·如果在查找y坐标值时产生错误，请不要退回到最高点。数据太稀疏，甚至平滑直方图也太不准确，无法依赖最高的“面积”直条作为峰值。如果无法从最小二乘多项式曲线拟合中生成良好的“y”，则会生成错误并中止门计算
g.计算从最近三十个事件数据集处理事件数据集以来发生的电子设备漂移调整后的雌性峰和雄性峰强度坐标值和槽仓强度值。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。
1.创建一个事件数据集计数器变量并将其初始化为零。
2.每次处理新的事件数据集时，递增计数器。无论确定是否在处理数据时标记了错误，以及是否在步骤8中检测到事件数据的字符变化，都递增计数器。
3.当保存将与后续数据集中的类似值进行平均的值以供将来使用时，保存与产生该值的数据集相关的数据集计数器的值。
4.通过从X的最新值中减去X的最早可用保存值，计算变量X在处理多个数据集所跨越的时间段内的平均漂移率，得到DELTA_X，以及从与最近存储的值相关联的计数器的值中减去与最早值相关联的数据集计数器的值，以获得DELTA_T；然后计算DELTA_X/DELTA_T作为平均漂移。
5.计算某个变量的特定记录实例的总漂移调整，将从步骤d中获得的变量的平均漂移率乘以自记录该值以来经过的时间段数(即，已呈现的事件数据集数)。乘法的乘积表示漂移调整。将漂移调整添加到先前记录的值中，以获得漂移校正值。
6.通过查找槽仓强度和绘制门的峰值的峰值强度之间的差值，计算峰谷强度距离。
7.通过平均上一步的峰谷强度距离和最近30个事件数据集的峰谷强度距离，生成“平均峰谷强度距离”。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。
h.从直条计算槽x坐标。计算槽y坐标，使槽点位于通过雄性峰和雌性峰(x，y)绘制的线上。确定了雄性峰和雌性峰的(x，y)坐标，并确定了它们之间槽仓的“x”坐标，槽仓点的“y”坐标计算为在穿过雄性峰和雌性峰点的线上。这条线是门的轴线
i.使用雄性峰、雌性峰坐标和谷坐标，计算门顶点。门沿雄性坐标和雌性坐标之间绘制的轴线定向。
1.从参数集获取InvocementPCT值。将其除以100.0，然后从1.0中减去结果，得到后续步骤中使用的“侵占乘数”(encroachmentMultiplier)。
2.通过将平均峰谷强度距离乘以侵占乘数生成侵占调整(encroachmentAdjustment)。
3.计算侵占强度。两个顶点位于通过侵占强度绘制的垂直线上。
i.如果门是相对于雄性峰创建的，则侵蚀强度是平均雄性峰强度加上侵蚀调整。对于雄性峰，侵蚀强度是(强度，面积)平面中强度轴最右边的一个或多个门顶点的强度坐标。
ii.如果门是相对于雌性峰创建的，则侵占强度为平均雌性峰强度减去侵占调整。对于雌性峰，侵占强度是(强度，面积)平面中强度轴上最左侧的一个或多个门顶点的强度坐标。
4.从参数集中检索peakFalloffPct值。这是一个0.0到100.0范围内的十进制值。目前使用的是65.0，但最终可能会确定其他一些值为最佳值。将peakFalloffPct除以100.0，然后将其乘以强度直方图中相关峰值的最高直条高度(步骤10)。相关峰值是雄性强度峰值或雌性强度峰值，取决于相对于哪个峰值计算门。在本过程描述中，将乘法的乘积称为“falloffValue”。
5.计算衰减强度：从相关峰值中的最高强度直方图直条开始，从第23步的槽仓移开，直到当前检查的直条高度小于或等于衰减值。计算对应于该直条中心的强度值为[直条指数+0.5]x[直条宽度]。
6.通过平均上一步的衰减强度和上三十个事件数据集的衰减强度来计算平均衰减强度。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。
7.取平均衰减强度作为两个选通顶点(强度、面积)平面中强度坐标的初始值，这两个选通顶点在相对于雌性峰绘制的选通中最右侧，或在相对于雄性峰绘制的选通中最左侧。
8.通过从参数集中检索“octExtension”值并乘以平均峰谷强度距离来计算延伸距离。octExtension是大于0.0的十进制值。使用默认值0.6，但可以根据需要进行更改。
i.如果相对于凸峰绘制栅极，则从计算的初始平均衰减强度值中减去延伸距离。将结果用作相对于凸峰绘制的门中最左侧的两个门顶点的(强度，面积)平面中强度坐标的最终值。
ii.如果相对于母峰绘制门，请将延伸距离添加到初始值。使用该结果作为相对于母峰绘制的门中最右侧的两个门顶点的(强度，面积)平面中强度坐标的最终值。
9.计算相对于雌性峰绘制的门的平均侵入强度和平均雌性峰强度，或相对于雄性峰绘制的门的平均雄性峰强度。
10.从参数集中检索“horizadjmultipler1”值，并将其乘以平均峰谷强度距离。将乘积与上一步计算的侵占强度值的平均值相加。
i.对于相对于雌性峰的门，结果用作(强度，面积)平面中位于侵占强度右侧的垂直线上两个顶点的强度坐标。
ii.对于相对于雄性峰的门，该线位于侵蚀强度的左侧。0.0的值当前用于horizadjmultipler1，但可能会更改。
11.计算相对于雌性峰绘制的门的平均衰减强度和平均雌性峰强度的平均值，或相对于雄性峰绘制的门的平均雄性峰强度。
12.从参数集中检索“horizadjmultipler2”值。乘以平均峰谷强度距离。将乘积与上一步计算的值相加。
i.对于相对于雌性峰的门，结果用作垂直线上两个顶点的(强度，面积)平面中的强度坐标，该垂直线上位于步骤10中计算的线的右侧和通过衰减强度绘制的线的左侧。
ii.对于相对于雄性峰的选通电路，该线位于步骤10中计算的线的左侧和通过衰减强度绘制的线的右侧。0.0的值当前用于horizadjmultipler2，但可能会更改。
13.计算峰谷面积距离，将其作为绘制门的峰谷“面积”坐标与峰谷峰面积坐标之间的差值。
14.通过平均上一步的峰谷面积距离和最近30个事件数据集的峰谷面积距离，计算平均峰谷面积距离。如果以前可用的值少于30个，则仅对可用的值求平均值。
15.计算第10步的轴和垂直线相交的相交点(强度、面积)，并找到落在这条线上的轴的上下顶点。
i.通过从参数集中检索“AreaAboverMultiplier”的值并将其乘以步骤14的平均峰谷面积距离，然后将结果添加到交点的面积坐标，计算垂直线上和轴上方顶点的“面积”坐标。
ii.通过从参数集中检索“areaBelowMultiplier”的值并将其乘以第14步的平均峰谷面积距离，然后从交点的面积坐标中减去结果，计算步骤10中轴线下方的顶点的“面积”坐标。
16.将两个顶点定位在通过侵占点绘制的垂直线上，一个在轴线上方，一个在轴线下方。计算侵蚀强度处的垂线与轴线相交的点；在本过程描述中，将该点称为“侵占点”。
i.通过从参数集中检索AboverHeightPctLeft的值，将其除以100.0，然后将其乘以从步骤15中计算的顶点到轴线的垂直线段长度，计算具有侵蚀强度的顶点和轴线上方的“面积”坐标；然后将该值添加到侵占点的“面积”坐标中。
ii.从侵蚀强度处的垂直线与轴线相交的点开始，通过从参数集中检索BelowEightPctLeft的值，计算侵蚀强度处垂直线上但低于轴线的顶点，除以100.0，再乘以从第15步计算的顶点到轴线的垂直线段长度；然后从侵占点的面积值中减去该值。这是点的“面积”坐标。
17.定位位于垂直线上的两个顶点，该垂直线上的强度在步骤12中计算。计算第12步中轴线和垂直线相交处的交点(强度、面积)。
i.通过从参数集中检索“AreaAboverMultiplier”的值并将其乘以第14步的平均峰谷面积距离，然后将结果添加到交点的面积坐标，计算轴线上顶点的“面积”坐标。
ii.通过从参数集中检索“areaBelowMultiplier”的值并将其乘以步骤14的平均峰谷面积距离，计算步骤12的线上轴下方顶点的“面积”坐标，以及从为轴线上的顶点计算的交点的面积坐标中减去结果。
18.定位两个顶点位于通过衰减强度绘制的垂直线上，一个在轴线上方，一个在轴线下方。将衰减点计算为衰减强度处的垂直线与轴线相交的点。
i.通过从参数集中检索AboverHeightPcTright的值，将其除以100.0，并将其乘以从步骤17中计算的顶点到轴线的垂直线段长度，计算具有衰减强度且在轴线上方的顶点的“面积”坐标；然后将该值添加到衰减点的“面积”坐标。
ii.从具有衰减强度且在轴上方的衰减点开始，通过从参数集中检索BelowEightPCTright的值，计算其顶点位于衰减强度处的垂直线上但在轴线下方，除以100.0，再乘以从第17步计算的顶点到轴线的垂直线段长度；然后从衰减点的面积值中减去该值。即轴下方点的“面积”坐标。
利用程序优化门控系统对牛精子细胞进行性别鉴定
采用激光消融精液性别鉴定细胞仪来实现上述示例中所述的优化分类策略。从一头2岁的荷斯坦公牛身上收集精液，并按照标准程序制备。简单地说，对收集的精液进行运动能力和是否存在异常的评估，以发现符合处理标准。然后测定精细胞浓度，并在在34℃下用Hoechst 33342染色45分钟，然后进行性别鉴定。性别鉴定仪包括一个流量控制器，用于将染色的精子细胞和鞘液输送到微流控芯片。精子细胞检测使用TM锁模355激光器
Figure BDA0003117537120000322
)进行，用雪崩光电二极管检测荧光。用explorerxp激光Q开关激光
Figure BDA0003117537120000321
)烧蚀不需要的携带Y染色体的精子细胞。染色的烫发细胞经过大约9小时的处理。
使用根据本发明实施例的优化门控策略来执行携带X-和Y-染色体的精子细胞的辨别，如上述示例中所详述。经过分类，采集的样本产生了约5146万个精子细胞。在操作过程中，监控各门参数的数值，观察门系统的运行情况。在单个样本运行期间，从相隔十分钟的两个时间点的事件生成的强度值直方图的提取部分进行比较。曲线被拟合至高峰和低谷；对拟合曲线的数学分析得出了每个图上方显示的更精确的峰值和谷值。精确的峰值和谷值乘以直条大小(128)被转换成实际的强度值。因此，例如，左侧直方图中的雄性峰值强度为223.06×128.0＝28551.68。
比较两个不同时间点的峰值强度值表明，雌性峰值强度在10分钟内从29625显著变化到29386(239个强度单位，约0.81％)。槽仓同样从29101移动到28832(269个强度单位)。为了保持与雌性峰位置的正确关系，门必须移动类似的量。
由于门是围绕雌性峰构建的，因此对于强度接近母峰强度的所有事件的“面积”值，以编程方式构建类似的直方图。这些直方图只显示了一个峰值。“面积”值的分析直方图显示，雌性峰面积在第一个时间点的峰值为4972333，在第二个时间点的峰值为4952019。
门的所有强度坐标在十分钟内的两个时间点之间左移(更低)。门顶点在第一时间点的强度坐标平均为29735.28。第二个时间点(10分钟后)的相应平均值为29465.78。这相当于平均向下移动269.5个强度单位。与239个强度单位的雌性峰强度下移和269个强度单位的低谷强度下移相比，这是有利的。门向左移动，以维持与雌性峰的关系。
雌性峰的面积坐标在10分钟内也向下移动。顶点的所有门的区域坐标都以类似的方式向下移动。
瞬时峰值坐标与门顶点坐标的精确位移量之间的差异主要是由于在计算顶点时使用了槽-雌性峰距离。由于波谷和雌性峰是独立的统计实体，尽管顶点坐标和峰值坐标随时间的平均偏移是相等的，但顶点坐标在两个时间点之间的偏移量可能与雌峰略有不同。
本领域技术人员将理解，在不偏离本申请中公开的新技术的范围的情况下，可以做出各种变化和替代等效技术。此外，可作出许多修改以使特定情形或材料适应新技术的教导而不偏离其范围。因此，新技术不限于所公开的特定技术，而是包括落入所附权利要求书范围内的所有技术。

Claims (24)

1.一种用于识别粒子混合物中的亚群的方法，包括：
测量具有两个或更多个亚群的粒子混合物中的第一组粒子的特征，每个亚群可以通过该特征来区分；
区分混合物中每个亚群的测量特征值；
根据区别，为每个亚群分配一个临界值范围；
在分配临界值范围之后，测量粒子混合物中第二组粒子的特征；
在测量粒子混合物中的第二组粒子的特征之后，区分第二组粒子中每个亚群的测量特征值；
基于对第二组粒子中每个亚群的测量特征值的区分，更新值的临界范围；乙基
根据更新的临界值范围，为混合物中的粒子分配亚群分类。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：基于更新后的临界值范围，根据分配给所述粒子的分类对所述粒子进行分类。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括：破坏或使分配了所述分类的亚群丧失能力。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中，所述粒子是精子细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述精子细胞是牛精子细胞。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述精子细胞的特征是具有X染色体或Y染色体。
7.根据权利要求4～6任一项所述的方法，其中所述精子细胞被荧光DNA结合染料标记。
8.一种用于在多组粒子的混合物中识别多组粒子的方法，每个亚群具有与其他亚群不同的特征，包括：
提供粒子的混合物；
检测混合物中的第一组多个粒子的特征以产生指示该第一组粒子的特征的信号；
为指示所述第一组粒子的特征的信号生成事件数据；
编译第一组粒子的事件数据；
为第一组粒子生成事件数据的分布；
根据第一组粒子的事件数据的分布，计算至少一个定义粒子亚群的判别值；
根据定义亚群的判别值对粒子进行分类。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括基于所述分类指示分类装置以包括或排除事件。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括破坏或使分配了所述分类的亚群丧失能力。
11.根据权利要求8-10所述的方法，其特征在于，粒子是精子细胞。
12.根据权利要求8-11所述的方法，其特征在于，所述精子细胞是牛精子细胞。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述精子细胞的特征是具有X染色体或Y染色体。
14.根据权利要求11-13所述的方法，其特征在于，所述精子细胞用荧光DNA结合染料标记。
15.根据权利要求7-14所述的方法，其特征在于，所述计算至少一个判别值包括：定义至少与所检测的特征相关的临界值。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述计算至少一个鉴别值还包括：
从第一组粒子的事件数据的分布中识别第一特征的至少一个临界值；
获得与第一特征临界值相关的第二特征的值；
产生第二特征值的分布；
从第二特征的值的分布中识别出第二特征的至少一个临界值；
在特征空间中共同定位第一和第二特征的临界值；以及
从共同位于特征空间的临界值中确定至少一个判别值。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，对至少一个判别值的所述计算还包括：调整所述临界值以包括来自第二组粒子的事件数据。
18.根据权利要求8-17所述的方法，其特征在于，所述临界值包括用于第一亚群的一个或多个峰值特征值，以及用于第二亚群的一个或多个峰值特征值。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述峰值特征值包括峰值荧光强度和峰值总荧光。
20.根据权利要求18和19所述的方法，其特征在于，所述临界值还包括在所述第一亚群和第二亚群的峰值特征值之间的谷值。
21.根据权利要求7至20所述的方法，其特征在于，所述判别值包括门。
22.通过前述权利要求中任一项所述的方法产生的有性精子细胞样品。
23.一种用于产生有性精子样品的系统，其包括：
用于递送精子细胞混合物的样品递送装置；
流式细胞仪
控件配置为：
区分精子细胞混合物中每个亚群的测量特征值，
根据区别，为每个亚群分配一个临界值范围，
基于对第二组粒子中亚群的测量特性值的区分，更新值的临界范围，以及
根据更新的临界值范围，为混合物中的粒子分配亚群分类；和
分拣装置。
24.根据权利要求20所述的系统，其特征在于，所述分拣装置包括激光杀灭装置。
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