BR112021012000A2 - Sistema e métodos para identificação sub-populacional - Google Patents

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Abstract

sistema e métodos para identificação sub-populacional. sistemas e métodos são providos para identificação e discriminação de subpopulações dentro de uma mistura de partículas. os sistemas e métodos implementam a calibração contínua da classificação de partículas dentro da mistura para prover consistência na operação e reduzir a variação de processamento entre e intra-lotes. os sistemas e métodos produzem produtos de partículas classificadas de forma vantajosa.

Description

SISTEMA E MÉTODOS PARA IDENTIFICAÇÃO SUB-POPULACIONAL
FUNDAMENTOS De forma geral, esta invenção se relaciona com a citometria de fluxo. Em particular, esta invenção se relaciona com sistemas e técnicas para determinar se um determinado evento citométrico está incluído dentro de um subconjunto ou uma porta ou é excluído de um subconjunto ou de uma porta. A citometria de fluxo pode utilizar a detecção de luz para avaliar características de partículas, como células, fluindo através do citômetro. Em certas aplicações, um citômetro pode detectar luz emitida por células, incluindo luz emitida por corante fluorescente e intercalante de DNA. A capacidade de avaliar e classificar partículas é uma operação fundamental dos citômetros. Os citômetros medem características das partículas e provem informações sobre as características medidas. Normalmente, essas informações são representadas graficamente na forma de um histograma ou um gráfico de dispersão, embora essas informações geralmente também sejam coletadas e armazenadas de uma forma legível por computador. As informações relativas a essas medidas podem ser utilizadas para identificar subpopulações dentro do conjunto inicial de partículas, ou para definir valores subjetivos ou objetivos para as características medidas. Isso é muitas vezes realizado definindo uma porta usando a representação gráfica. Geralmente, o procedimento para desenhar uma porta em torno de uma população é feito manualmente: um operador faz uma inspeção visual da representação gráfica da mistura de partículas como é analisada, e define manualmente os pontos utilizados para diferenciar populações ou subconjuntos da mistura entre si. Uma vez definidos subconjuntos pelo desenho das portas, todos os eventos subsequentes podem ser definidos como caindo dentro de uma porta (ou seja, como pertencentes ao subconjunto definido) ou como caindo fora de uma porta (ou seja, não pertencentes ao subconjunto definido, e/ou pertencentes a um subconjunto diferente). Isso tem significado para uma série de aplicações, incluindo ensaios citométricos de fluxo quantitativo, e discriminação celular, como a triagem celular ativada por fluorescência (FACS).
Uma dessas aplicações é a determinação de se uma célula de esperma tem um cromossomo X (que produzirá um zigoto feminino) ou, alternativamente, um cromossomo Y (que produzirá um zigoto masculino). Uma célula de esperma com dois cromossomos X pode ter aproximadamente 3% mais DNA do que uma célula de esperma com um cromossomo X e um cromossomo Y.
Ao identificar o conteúdo cromossômico de uma célula de esperma, pode ser possível criar uma população relativamente alta de pureza de células de espermatozoides cromossomo-X ou cromossomo Y.
Tal população pode ser gerada, por exemplo, mantendo o gênero desejado e matando o indesejado (ou segregando os dois gêneros). A população substancialmente de alta pureza pode ser usada para inseminar um animal fêmea (como bovídeos, equídeos, ovídeos, cabras, suínos, cães, gatos, camelos, elefantes, touros, búfalos ou afins) para obter uma prole desejada do macho ou da fêmea, com probabilidade relativamente alta.
As características dos cromossomos podem ser identificadas pela coloração do DNA das células de espermatozoides com um fluorocromo (por exemplo, um corante intercalante de DNA). As células de esperma manchadas podem ser forçadas a fluir em um fluxo estreito ou banda e passar por uma fonte de excitação ou irradiação, como um raio laser.
À medida que as células de esperma manchadas (uma pluralidade de partículas) são irradiadas, o fluorocromo na pluralidade de partículas emite uma luz fluorescente responsiva.
A quantidade de luz fluorescente pode variar pelo menos em parte em uma quantidade relativa de pelo menos uma característica de diferenciação de partículas (por exemplo, a quantidade relativa de DNA indicativo da presença de um cromossomo X ou Y) presente em cada uma das pluralidades de partículas.
A luz fluorescente pode ser recebida por um ou mais elementos ópticos que, em última análise, concentram a luz recebida em um componente de detecção, como um tubo fotomultiplicador ("PMT") ou um fotodiodo de avalanche (APD). O componente de detecção pode gerar um sinal elétrico e analógico em resposta à luz recebida.
O sinal analógico pode variar em correspondência com a quantidade de luz recebida.
Este sinal pode então ser processado (por exemplo, digitalizado e analisado por um processador) para avaliar o conteúdo cromossômico da célula espermatozoide, que pode ser representado graficamente como um histograma (por exemplo, dados como um vetor de valores de tensão de pico, com o ajuste do índice sendo uma função de largura de compartimento) ou uma dispersão (por exemplo, dados como um mapeamento de valores de tensão de pico e valores de tensão de área em um vetor que é usado para exibir os dados mais atuais como um espectrograma). Essas representações gráficas podem então prover a base para definir subpopulações e/ou desenhar portas. Isso é normalmente feito por um usuário, usando seu melhor julgamento para escolher pontos estabelecendo o limite de uma porta ou um limiar. Atualmente, os sistemas disponíveis para a definição de portas ou limiares para definição de subpopulações sofrem de várias deficiências significativas. Primeiro, a seleção dos critérios de definição (ou seja, os valores em que os pontos de porta ou limiar são definidos) é realizada por operadores individuais. Isso é fundamentalmente subjetivo e variável entre os operadores, e mesmo entre amostras executadas pelo mesmo operador, ou entre execuções da mesma amostra pelo mesmo operador. Isso, em última análise, leva à variabilidade na operação dos sistemas citométricos de fluxo. No caso de citômetros de classificação sexual, isso pode resultar em diferenças significativas no rendimento (ou seja, no número de células vivas coletadas) ou pureza (ou seja, a proporção de células coletadas com um cromossomo X ou Y) do produto celular sexual. Além disso, abordagens atuais para definição e discriminação de subpopulação resultam em operação onde as bases para a discriminação são essencialmente estáticas — as portas ou limiares permanecem inalterados durante a operação. Na prática, isso significa que um operador deve monitorar as subpopulações ao longo da execução, e/ou a relação das portas ou limiares com uma subpopulação pode mudar durante o curso da operação, devido a uma série de fatores, como alterações de temperatura ou pressão, ou perda de sinal. Os sistemas e técnicas aqui descritos superam essas e outras deficiências e proporcionam benefícios significativos, como será apreciado pelos versados na técnica.
SUMÁRIO De acordo com certas implementações inventivas, a presente invenção prove um sistema de identificação de subpopulações dentro de uma mistura de partículas.
De acordo com certas implementações, o sistema inclui um aparelho de entrega de amostras, um citômetro, um aparelho de controle e um aparelho de triagem.
O controle é configurado para implementar uma técnica de identificação ou discriminação auto- calibrante.
A técnica de identificação ou discriminação auto-calibrante utiliza as informações obtidas para partículas na mistura para definir subpopulações dentro da mistura.
Em seguida, o sistema atribui uma classificação de subpopulação a partículas na mistura com base nessa definição.
A definição de subpopulações é continuamente refinada apesar da integração de informações adicionais obtidas para partículas adicionais na mistura.
O controle é configurado para receber dados de eventos do citômetro na forma de valores correspondentes às partículas detectadas em uma amostra, distinguir os valores das características medidas para cada subpopulação na amostra, atribuir uma faixa crítica de valores a cada uma das subpopulações com base na distinção, atualizando a faixa crítica de valores com base na distinção dos valores das características medidas para subpopulações em um segundo conjunto de partículas, e atribui uma classificação de subpopulação a partículas na mistura com base na faixa crítica atualizada de valores.
De acordo com certas implementações inventivas, o controle pode ser configurado para identificar pelo menos um valor crítico para uma primeira característica da distribuição; obtenção dos valores para uma segunda característica associada ao valor crítico para a primeira característica; produzir uma distribuição dos valores para a segunda característica; identificar pelo menos um valor crítico para a segunda característica a partir da distribuição de valores para a segunda característica; colocalizar os valores críticos para a primeira e segunda características em um espaço de características; e determinar os valores de pelo menos uma discriminação a partir dos valores críticos colocalizados no espaço de características.
De acordo com certas técnicas inventivas, um método inclui: identificar subpopulações dentro de uma mistura de partículas, compreendendo: medir uma característica de um primeiro conjunto de partículas em uma mistura de partículas com duas ou mais subpopulações, cada subpopulação distinguindo-se pela característica; distinguindo os valores das características medidas para cada uma das subpopulações na mistura; atribuindo uma faixa crítica de valores a cada uma das subpopulações com base na distinção; posteriormente à atribuição de uma faixa crítica de valores, medindo as características de um segundo conjunto de partículas na mistura de partículas; posteriormente à medição das características de um segundo conjunto de partículas na mistura de partículas, distinguindo os valores das características medidas para cada uma das subpopulações no segundo conjunto de partículas; atualização da faixa crítica de valores com base na distinção dos valores das características medidas para cada uma das subpopulações no segundo conjunto de partículas; e atribuindo uma classificação de subpopulação a partículas na mistura com base na faixa crítica atualizada de valores.
De acordo com certas técnicas inventivas, os métodos incluem ainda mais a classificação dessas partículas de acordo com a classificação atribuída às partículas com base na faixa crítica atualizada de valores.
De acordo com certas técnicas inventivas, os métodos que compreendem destruir ou incapacitar a subpopulação atribuíram a classificação.
De acordo com certas técnicas inventivas, as partículas são células de espermatozoides.
De acordo com certas técnicas inventivas, as células de espermatozoides são células de esperma bovino.
De acordo com certas técnicas inventivas, a característica das células de espermatozoides é a presença de um cromossomo X ou um cromossomo Y.
De acordo com certas técnicas inventivas, as células de espermatozoides foram manchadas com um corante fluorescente de ligação de DNA.
De acordo com certas técnicas inventivas, um método inclui identificar múltiplos conjuntos de partículas dentro de uma mistura de conjuntos de partículas, cada subpopulação com uma característica diferente de outras subpopulações, compreendendo: prover a mistura de partículas; detectar uma característica de um primeiro conjunto de partículas múltiplas dentro da mistura para produzir um sinal indicativo da característica para o primeiro conjunto de partículas; gerar dados de eventos para o sinal indicativo da característica para o referido primeiro conjunto de partículas; compilar os dados do evento para o primeiro conjunto de partículas; gerar dados de eventos para o primeiro conjunto de partículas; calcular pelo menos um valor de discriminação que define uma subpopulação de partículas com base na distribuição de dados de eventos para o primeiro conjunto de partículas; classificar partículas com base no valor de discriminação que define a subpopulação.
De acordo com certas técnicas inventivas, o método ainda compreende instruir um aparelho de classificação para incluir ou excluir eventos com base na classificação.
De acordo com certas técnicas inventivas, o método compreende ainda destruir ou incapacitar a subpopulação atribuída à classificação.
De acordo com certas técnicas inventivas, as partículas são células de espermatozoides.
De acordo com certas técnicas inventivas, as células de espermatozoides são células de esperma bovino.
De acordo com certas técnicas inventivas, a característica dessas células de espermatozoides é a presença de um cromossomo X ou um cromossomo Y.
De acordo com certas técnicas inventivas, as células de espermatozoides são rotuladas com um corante fluorescente de ligação de DNA.
De acordo com certas técnicas inventivas, calcular pelo menos um valor de discriminação compreende a definição de pelo menos um valor crítico relacionado a uma característica detectada.
De acordo com certas técnicas inventivas, calcular pelo menos um valor discriminativo ainda compreende: identificar pelo menos um valor crítico para uma primeira característica a partir da distribuição de dados de eventos para o primeiro conjunto de partículas; obtenção dos valores para uma segunda característica associada ao valor crítico para a primeira característica; produção de distribuição dos valores para a segunda característica; identificação de pelo menos um valor crítico para a segunda característica a partir da distribuição de valores para a segunda característica; colocalização dos valores críticos para a primeira e segunda características em um espaço de características; e determinação dos valores de discriminação de pelo menos um dos valores críticos colocalizados no espaço de características.
De acordo com certas técnicas inventivas, o cálculo de pelo menos um valor de discriminação compreende ainda o ajuste dos valores críticos para incluir dados de eventos de um segundo conjunto de partículas.
De acordo com certas técnicas inventivas, os valores críticos compreendem um ou mais valores característicos de pico para uma primeira subpopulação, e um ou mais valores característicos de pico para uma segunda subpopulação.
De acordo com certas técnicas inventivas, os valores característicos de pico compreendem intensidade de fluorescência máxima e pico de fluorescência total. De acordo com certas técnicas inventivas, os valores críticos compreendem ainda um valor mínimo entre os valores característicos do pico para a primeira e segunda subpopulações. De acordo com certas técnicas inventivas, o valor da discriminação compreende uma porta. De acordo com certas técnicas inventivas, uma amostra de células de esperma sexual é produzida por qualquer um dos métodos descritos. O sumário anterior, bem como a seguinte descrição detalhada de certas técnicas e sistemas da presente invenção, serão melhor compreendidos quando lidos em conjunto com os desenhos anexados. Para efeitos de ilustração, certos sistemas e técnicas são mostrados nos desenhos. Deve-se entender, no entanto, que as reivindicações não se limitam aos arranjos e à instrumentalidade mostrados nos desenhos anexados.
DESCRIÇÃO DETALHADA Certos sistemas e técnicas inventivas aqui discutidos se relacionam com um citômetro que inclui um mecanismo para usar relações conhecidas em frequência ou quantidade de características de partículas em uma mistura para identificar, definir ou distinguir subpopulações dentro da mistura. Os sistemas e técnicas vantajosos permitem a otimização do produto (rendimento e/ou pureza), redução da variabilidade e aumento da consistência operacional e redução da entrada e variabilidade do usuário humano associada a este. Esses sistemas e técnicas vantajosas proporcionam decisões que discriminam de forma confiável entre partículas com características diferentes, proporcionando assim classificação diferencial. Os sistemas e métodos da presente invenção podem ser usados para discriminação de uma ou mais subpopulações de partículas em uma mistura. Isso pode ser feito detectando ou avaliando uma única característica, ou múltiplas características das partículas. As características podem ser avaliadas utilizando diferentes meios de identificação, incluindo, por exemplo, marcadores fluorescentes (por exemplo, corantes fluorescentes ou marcadores fluorescentes acoplados a uma ou mais moléculas específicas de alvo, como anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou outros marcadores moleculares). Em outro aspecto, os métodos e sistemas da presente invenção envolvem a classificação de células, como o esperma, distinguindo diferenças no conteúdo do DNA.
As células são manchadas com um corante específico do DNA misturando o esperma com o corante e depois pela eletroporação destes.
O esperma pode ser mantido a temperaturas que aumentam a viabilidade do esperma, tipicamente igual ou inferior a 39° C.
O esperma é então passado diante de uma fonte de luz de excitação fazendo com que o DNA manchado fluoresça, e então passe por meios para detectar a fluorescência e um meio de classificação celular, onde as células são classificadas pelo conteúdo de DNA, e o esperma classificado coletado.
Os métodos e aparelhos são apropriados para a triagem de espermatozoides de mamíferos, como os de bovinos, suínos, coelhos, alpaca, cavalo, cão, gato, furão, rato, camundongo e búfalo.
Podem ser utilizados corantes permeáveis de membrana e impermeáveis.
Corantes úteis incluem aqueles de séries azul, laranja e verde SYTOX, dímeros e monômeros de cianeto, POPO-1, BOBO-1, YOYO-1, TOTO-1, JOJO-1, POPO-3, LOLO-1, BOBO-3, YOYO-3, TOTO-3, PO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1, JO-PRO-1, PO-PRO-3, LO-PRO-1, BO-PRO-3, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, homodímero de acridina, 7-amino actinomicina D, brometo de etídio, homodímero de etídio-1, homodímero de etídio-2, nonazida de etídio, amarelo nuclear, iodeto de propídio.
Outros corantes úteis incluem os de corantes fluorescentes azul, verde, laranja e vermelho SYTO 40, corantes Hoechst e dihidroetídio.
Para melhorar o sinal, nanopartículas, como pontos quânticos e nanopartículas metálicas, podem ser introduzidas.
As partículas podem ser marcadas com moléculas de alvo.
A eficiência de classificação pode ser superior a 90%, enquanto as taxas de viabilidade do esperma são maiores que 30%, normalmente superiores a 90%. Alternativamente, em vez de eletroporação das células, o corante é introduzido nas células por gradientes osmóticos.
As células são primeiro incubadas em condições hipertônicas e, em seguida, transferidas para condições hipotônicas; o corante de coloração de DNA pode ser adicionado a soluções hipertônicas e hipotônicas.
Depois de aplicar corante às células, elas estão prontas para serem classificadas ou processadas.
Em outros aspectos, os sistemas e métodos da invenção podem envolver a detecção de diferenças no conteúdo de DNA sem o uso de manchas de DNA, por exemplo, pela patentes US nº 8502148, 9835552; e 9683922. Em outro aspecto, os sistemas e métodos da invenção podem envolver a detecção de características de partículas usando outros meios de análise, incluindo, por exemplo, dispersão lateral, dispersão dianteira ou dispersão traseira de luz, ou uma mancha viva/morta (como iodeto de propídio ou outras manchas de viabilidade). Em outro aspecto, os sistemas e métodos da presente invenção podem envolver estabelecer ou modificar um limiar ou porta.
Um limiar geralmente se refere a um valor, tipicamente relacionado a uma característica particular, que pode ser usado para classificar eventos individuais.
Por exemplo, um limiar de intensidade pode ser definido a um valor que permitirá a discriminação da fluorescência como indicativo de células vivas (por exemplo, acima do valor limite) ou células mortas (abaixo do valor limite). Da mesma forma, uma porta refere-se a um conjunto de pontos ou vértices que ligam uma região em uma representação gráfica bidimensional de características detectadas.
Por exemplo, uma porta pode se referir a um conjunto de quatro ou mais pontos que estão conectados para formar um polígono em torno de uma subpopulação.
Uma porta pode ser usada para definir ou discriminar uma subpopulação específica.
Os pontos individuais ou vértices que compõem uma porta podem ser valores de discriminação, calculados a partir de dados de eventos.
Em um gráfico de dispersão, cada ponto ou vértice de uma porta tem uma coordenada X e um Y.
O valor dessas coordenadas pode ser determinado por cálculo com base nos dados de eventos cumpridos e/ou por valores contidos no conjunto de parâmetros.
A porta pode então ser usado para classificar eventos individuais sobre se eles caem dentro ou fora da porta.
Por exemplo, a porta pode ser estabelecida para ser inclusiva de um tipo de célula específica, com base na presença de marcadores fluorescentes ligados a dois marcadores de superfície celular; as células que têm ambos os marcadores cairão dentro da porta, enquanto todas as células que não possuem um ou ambos os marcadores cairão fora da porta.
Sistema de classificação Em um aspecto, é provido um sistema de discriminação e classificação otimizada de partículas.
Em um aspecto, o sistema inclui um aparelho de entrega de amostras.
Uma mistura de partículas é entregue ao sistema citométrico por um sistema de entrega de amostras.
Como será apreciado por uma pessoa versada na técnica, a entrega de amostra pode ser realizada usando bombas, incluindo bombas de seringa, bombas peristálticas e ou um aumento do diferencial de pressão entre a amostra e o sistema.
Geralmente, os sistemas de entrega de amostras são capazes de amostragem discreta ou contínua de uma mistura de partículas em suspensão líquida, e mover a mistura de partículas para o aparelho citométrico.
Em algumas aplicações, o sistema de entrega de amostras também pode envolver a mistura de partículas com outro fluido, e/ou a entrega de um tampão ou fluido de baia.
A amostra de esperma a ser classificada pode ser uma amostra recém-coletada de um animal de origem, como bovino, equino, suíno ou outra fonte de mamíferos, ou uma amostra descongelada, previamente criopreservada.
Além disso, a amostra pode ser uma única ejaculação, ejaculações múltiplas do mesmo mamífero, ou ejaculações múltiplas de dois ou mais animais.
Vários métodos de coleta são conhecidos e incluem o método de mão enluvada, uso de uma vagina artificial e eletro-ejaculação.
Os espermatozoides são preferencialmente coletados ou rapidamente transferidos para um recipiente isolado para evitar uma rápida mudança de temperatura das temperaturas fisiológicas (tipicamente cerca de 35°C para cerca de 39°C). A ejaculação normalmente contém cerca de 0,5 a 15 bilhões de espermatozoides por mililitro, dependendo da espécie e de um animal particular.
Independentemente do método de coleta, uma alíquota pode ser extraída da amostra de espermatozoides e avaliada para várias características, como, por exemplo, concentração de espermatozoides, motilidade de espermatozoide, pH da amostra, integridade da membrana do esperma e morfologia do esperma.
Esses dados podem ser obtidos por meio de exame do esperma utilizando, por exemplo, o Hamilton-Thorn Motility Analyzer (IVOS), de acordo com procedimentos padrão e bem conhecidos (ver, por exemplo, Farrell et al.
Theriogenology (1998) 49 (4): 871-9; e patentes US nº 4896966 e 4896967). Em outro aspecto, os sistemas da presente invenção incluem um aparelho de citometria.
O aparelho de citometria detecta características das partículas como eventos, e prove sinais correspondentes aos eventos a um processador.
De acordo com certos aspectos, um aparelho de citometria de fluxo inclui: uma câmara de fluxo configurada para direcionar um fluxo de fluidos, incluindo partículas de amostra através de um local de interrogatório de partículas; um laser configurado para emitir radiação eletromagnética ao longo de um caminho de feixe até o local de interrogatório de partículas; um detector configurado para receber radiação eletromagnética do local do interrogatório; e emissão de um sinal analógico de variação temporal indicativo de uma intensidade da radiação eletromagnética recebida; pelo menos um amplificador configurado para amplificar o sinal analógico que varia o tempo; um conversor analógico- digital configurado para receber o sinal analógico amplificado e produzir um sinal de saída digitalizado correspondente.
Em outros aspectos, o detector pode ser um tubo fotomultiplicador (PMT) ou um fotodiodo de avalanche (APD). O citômetro pode incluir ainda um sensor de temperatura configurado para sentir uma temperatura e gerar um sinal de temperatura correspondente codificando dados de temperatura, onde o circuito de ajuste de tensão é configurado para ajustar a tensão no loop de feedback baseado pelo menos em parte nos dados de temperatura e na tensão medida entre o filtro e o fotodiodo de avalanche.
O circuito de ajuste de tensão pode ser configurado para ajustar a tensão no loop de feedback baseado, pelo menos em parte, em pelo menos uma característica do fotodiodo de avalanche, dos dados de temperatura e da tensão medida entre o filtro e o fotodiodo de avalanche.
O circuito de ajuste de tensão pode ser configurado para ajustar a tensão no loop de feedback baseado, pelo menos em parte, em pelo menos uma característica do fotodiodo de avalanche e da tensão medida entre o filtro e o fotodiodo de avalanche.
O circuito de ajuste de tensão pode incluir: um conversor analógico-digital configurado para converter a tensão medida entre o filtro e o fotodiodo de avalanche em um sinal medido digital que codifica dados de tensão medida; um processador configurado para processar pelo menos os dados de tensão medidos para gerar um sinal de ajuste digital; e um conversor digital-analógico configurado para converter o sinal de ajuste digital em uma tensão de ajuste, em que a tensão de ajuste influencia a tensão no loop de feedback.
O processador pode ser configurado para processar pelo menos dados de temperatura e os dados de tensão medidos para gerar o sinal de ajuste digital.
O processador pode ser configurado para processar pelo menos dados de temperatura, dados correspondentes a pelo menos uma característica do fotodiodo de avalanche, e os dados de tensão medidos para gerar o sinal de ajuste digital.
A pelo menos uma característica do fotodiodo de avalanche pode incluir pelo menos uma tensão de decomposição e uma tensão de viés reverso correspondente a um ganho óptico predeterminado.
O citômetro pode incluir ainda: um primeiro amplificador configurado para amplificar uma tensão em um ânodo do fotodiodo de avalanche para formar uma primeira tensão amplificada; e um segundo amplificador configurado para amplificar a primeira tensão amplificada para gerar uma segunda tensão amplificada.
A fonte de alimentação pode incluir uma fonte de alimentação DC/DC.
O fotodiodo de avalanche pode ser: disposto a receber uma quantidade de luz fluorescente emitida por cada uma das partículas; a quantidade de luz fluorescente recebida pode variar pelo menos em parte em uma quantidade relativa de pelo menos uma característica de diferenciação de partículas presente em cada uma das partículas; e o fotodiodo de avalanche pode ser configurado para converter a quantidade de luz fluorescente recebida em pelo menos um sinal que varia de acordo com a quantidade de luz fluorescente recebida.
Um fluxo de partículas pode passar por uma câmara de fluxo, de tal forma que elas possam ser de arquivo único em determinados locais estratégicos.
A câmara de fluxo pode direcionar um fluxo de fluidos, incluindo a mistura de partículas através de um local de interrogatório de partículas.
A mistura de partículas pode ter sido previamente manchada com um corante, como um corante intercalante de DNA.
Tal corante pode fluorescer (ou causar fluorescência) pois gera luz responsiva em resposta a ser exposto a uma fonte de luz (ou radiação eletromagnética). À medida que as partículas passam uma por uma, elas podem ser expostas a um feixe de radiação eletromagnética (por exemplo, luz de um determinado comprimento de onda) gerada por um laser e emitida ao longo de um caminho de feixe (e opcionalmente associada à óptica) ao local de interrogatório de partículas.
Tais ópticas associadas podem incluir lentes, filtros ou afins.
A exposição das partículas (incluindo partículas manchadas com um corante) à radiação eletromagnética pode causar um evento responsivo, incluindo dispersão de luz, absorção e/ou fluorescência emitidas por partículas manchadas.
Em alguns aspectos, a quantidade de luz gerada fluorescente pode variar em um grau detectável, dependendo se as partículas de células de espermatozoides possuem um cromossomo X ou cromossomo Y.
A luz gerada fluorescente pode ser recebida por óptica (por exemplo, lentes, filtros ou afins), e pode ser focada em uma área ativa de um fotodetector.
De acordo com certas técnicas inventivas, o fotodetector pode incluir um APD ou PMT.
O fotodetector pode gerar um sinal de saída que corresponde (varia linearmente ou não linearmente) à quantidade de radiação eletromagnética (por exemplo, luz de um determinado comprimento de onda) que recebe do local de interrogatório.
O sinal de saída de fotodetector pode incluir um sinal analógico de variação temporal indicativo de uma intensidade da radiação eletromagnética recebida.
Este sinal de saída de fotodetector pode, em última análise, ser comunicado a um processador (que pode incluir um processador ou uma pluralidade de processadores que controlam uma parte da operação ou toda a operação do citômetro de fluxo ou do aparelho de classificação). O sinal de saída de fotodetector pode ser amplificado por pelo menos um amplificador (ou dois ou mais amplificadores em série) antes de ser comunicado ao processador.
Além disso, o sinal de saída de fotodetector (por exemplo, como amplificado) pode ser digitalizado antes de ser comunicado ao processador.
Em outro aspecto, o sistema pode incluir um processador que recebe um sinal, e gera até dados.
O processador pode compilar ainda mais dados de eventos em um ou mais conjuntos de dados.
O processador pode distribuir ainda mais dados de eventos no conjunto de dados, fazer o cálculo do valor da discriminação; classificar eventos com base no valor da discriminação e tomar uma decisão de classificação; e/ou prover instruções para classificar aparelhos.
O processador pode ser composto por um único componente ou pode ser composto por vários componentes.
O processador está configurado para analisar o sinal de saída digitalizado recebido do aparelho de citometria de fluxo.
Em geral, os sinais elétricos do detector de citômetros (ou seja, PMT ou APD) são convertidos em informações digitais por um conversor A/D que prove as informações digitais correspondentes ao microprocessador.
Em resposta às informações, o microprocessador controla um sistema de triagem.
Os sinais elétricos de saída do fotodetector do sistema de citometria são sinais de tensão analógico de variação de tempo indicativos da amplitude da fluorescência emitida a qualquer instante de tempo gerado por cada partícula à medida que é iluminado pelo feixe laser.
Assim, os sinais analógicos (também chamados de saída analógica) estão na forma de pulsos de forma de onda que variam com o tempo.
Em geral, um pulso de forma de onda é definido como uma forma de onda ou uma porção de uma forma de onda contendo um ou mais pulsos ou alguma porção de pulso.
Assim, a amplitude de cada pulso de forma de onda a qualquer instante no tempo representa a taxa relativa de emissão de fótons de cada célula naquele instante no momento em que a célula passa pelo raio laser.
Em uma modalidade, as células de esperma bovino do cromossomo X têm um teor de DNA maior do que as células de esperma bovino do cromossomo Y (por exemplo, cerca de 3,8%). Como resultado, as células X vivas rotuladas com uma mancha fluorescente como observado acima produzirão um pulso de forma de onda 497 diferente dos pulsos de qualquer outra célula rotulada.
Analisando os pulsos conforme observado abaixo (ver Processamento de Sinal, Varredura de Fenda e Diferença de Inclinação Crítica), cada célula pode ser identificada como uma célula X ou não identificada como uma célula X (∼X). Em geral, como usado aqui, as células X referem-se a células X vivas, as células Y referem-se a células Y vivas e células ∼X referem-se à combinação de células Y vivas e células que de outra forma produzem uma emissão de fluorescência detectável, mas que não pode ser identificada com uma probabilidade razoável como sendo células X vivas.
O tempo de cada pulso de forma de onda indica a posição de cada célula no fluxo.
Uma vez que a taxa em que as partículas estão sendo entregues através do citômetro permanece constante, e como a distância entre o detector e o aparelho de triagem é conhecida, a posição de cada partícula é conhecida.
Assim, o microprocessador pode calcular o instante em que ocorre um evento de triagem (ou seja, quando o laser de ablação é disparado). Uma vez que o microprocessador recebe dados de eventos para cada partícula, incluindo as características da partícula, o microprocessador pode acompanhar (ou enumerar) o número de partículas que podem ser classificadas em cada subpopulação.
Dependendo do conjunto de parâmetros e da estratégia de classificação implementada pelo aparelho de controle, veja abaixo, o microprocessador determina como as partículas da mistura de partículas são classificadas.
Em outro aspecto, o sistema inclui um controle, na forma de um microprocessador (ou outro controle digital ou analógico e/ou processador, ou combinações dele) que controla a discriminação de partículas dentro da mistura de células.
Em outro aspecto, este aparelho de controle recebe informações do aparelho do citômetro, incluindo dados característicos medidos para partículas na mistura de partículas.
O controle inclui ainda as informações presentes no conjunto de parâmetros.
O controle é capaz, utilizando essas fontes de informação, de distinguir os valores das características medidas para subpopulações em um conjunto de partículas; atribuindo uma faixa crítica de valores a duas ou mais subpopulações com base nos valores distintos da característica medida; medir um segundo conjunto de partículas na mistura de partículas, e distinguir os valores das características medidas para subpopulações no segundo conjunto de partículas; atualizar a faixa crítica de valores atribuídos às subpopulações utilizando os valores da característica medida para as subpopulações distinguidas para o segundo conjunto de partículas; e classificar partículas na mistura de acordo com uma classificação de subpopulação, utilizando a faixa crítica atualizada de valores.
O controle prove sinais de saída para controlar o sistema de seleção com base na classificação.
O controle pode ser implementado dentro de um único microprocessador.
Alternativamente, algumas ou todas as funções podem ser integradas em um ou mais processadores.
Além disso, o processamento pode ser implementado por um circuito analógico ou uma combinação de circuitos analógicos e digitais.
O controle pode prover sinais de saída para outras partes do sistema de citometria.
Além disso, o controle pode ser adaptado para processar informações e prover sinais de saída em tempo real.
Em linhas gerais, o termo "tempo real" refere-se a operações em que o funcionamento do aparelho de controle corresponde à percepção humana do tempo ou àqueles em que a taxa de operação do processador ou dos processadores que compõem o controle corresponde à taxa de processos físicos ou externos relevantes.
Em um contexto, o termo "tempo real" pode indicar que o sistema reage a eventos antes que os eventos se tornem obsoletos.
Em outro aspecto, os sistemas da presente invenção incluem um aparelho de triagem.
O aparelho de triagem realiza uma operação de triagem nas partículas na mistura de partículas, de acordo com as instruções recebidas do aparelho de controle.
O aparelho de classificação pode ser qualquer tipo de classificador conhecido por uma pessoa versada na técnica, incluindo, por exemplo, um classificador de gotícula, um classificador mecânico, um sistema de ablação a laser ("zapper") ou usando qualquer outra técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica.
Em uma modalidade, o sistema de triagem compreende um aparelho energético focado, como descrito na patente US nº 9588100. Um aparelho de energia focado é usado para prover pulsos de energia focal focados nas partículas.
O aparelho de energia focado pode ser um dispositivo térmico, elétrico, óptico ou eletromagnético, que teria um comprimento de onda desejado, e proveria alta potência máxima com uma taxa de repetição muito alta (ou frequência de pulso), para as partículas alvo.
Em uma modalidade, o aparelho de energia focado é acionado um tempo predeterminado (ou seja, milissegundos) após a ativação pelo controlador (o tempo que está sendo definido com base na velocidade de viagem das partículas através do canal) e emite um pulso para a partícula selecionada ou direcionada (ou seja, indesejada). Exemplos de lasers pulsados incluem o modo bloqueado, Q-switch, bem como os lasers usando ambas as técnicas de bloqueio de modo e Q-switch.
Por exemplo, um dispositivo de energia focado como um Avia 355-5-100 (feito por Coherent, Inc., Santa Clara, Calif.), ou o laser Explorer XP lasers Q-switch laser da Spectra-Physics Inc., é capaz de operar em um modo de pulso sob demanda, e pode prover pulsos de energia de 15 ns ou menos, a uma taxa de mais de 1000 pulsos por segundo, para o alvo dos objetos.
Em uma modalidade, são utilizados níveis de energia de pulso de 0,5-8,0 μJ, e em uma modalidade preferível, um laser de Q-switch no modo pulso-sob-demanda é usado para prover uma energia média de pulso de 1,8 μJ com uma faixa para pulsos individuais de 1,3 μJ a 2,3 μJ.
Em uma modalidade, a largura do pulso varia de 3 nanossegundos a 1 microssegundo, e de preferência, está em uma faixa de 5-9 nanossegundos.
No entanto, alguém versado na técnica saberia que qualquer laser de alta potência existente agora, ou posteriormente desenvolvido, com os pulsos de alta energia apropriados e frequência de pulso, seria adequado para a invenção atual, a fim de alcançar a precisão e/ou efeito alvo desejado.
Em uma modalidade, a necessidade de uma região de ação apertada, a fim de prover a energia pulsada do aparelho energético focado para atingir partículas ou uma região circundante, é importante minimizar o impacto potencial de prover a energia fora das partículas ou região alvo, para partículas não eleitas ou não-direcionadas.
Por exemplo, um aparelho de energia focado, como o explorer XP 355-1 Q-switch laser, é capaz de prover <4% rms, proporcionando alta estabilidade pulso-pulso quando disparado em intervalos uniformes regulares.
No entanto, para a análise citométrica de fluxo e sistemas de ação onde partículas ou células entram na região de ação em intervalos não uniformes, medidas adicionais são empregadas para prover energia de pulso uniforme para afetar apenas as partículas ou células alvo, ou a sua região circundante.
Tais medidas incluem parâmetros de desempenho do laser correspondentes, como comprimento de pulso e níveis máximos de potência, para permitir que o sistema da invenção atual atinja uma precisão de alvo desejada (ou seja, em uma modalidade, fotodano ou taxa de morte de 95% ou maior taxa de acerto em partículas-alvo). Além disso, afinar ainda mais a operação de pulso sob demanda e o desempenho do laser para prover estabilidade pulso-pulso extremamente alto quando disparado em intervalos não uniformes, reduz consideravelmente a variabilidade espacial na área impactada pelo pulso.
Assim, ao reduzir a variabilidade pulso-pulso no dispositivo de energia focado, a ação não intencional, dano ou destruição a partículas ou células não-alvo, é muito reduzida, alcançando, por exemplo, uma taxa de viabilidade de 85% ou mais para partículas ou células vivas e não-alvos.
O aparelho de energia focado pode ser configurado para danificar, alterar, desativar, matar ou destruir a partícula ou célula alvo ou indesejada no fluido amostral com pulso, ou para ativar um dos vários mecanismos na partícula ou célula, de tal forma que o dano celular ou a morte se segue.
No entanto, dependendo do arranjo desejado, a partícula direcionada ou selecionada pode ser objetos desejados, nesse caso o aparelho de energia focado não é ativado ou acionado, ou as partículas direcionadas ou selecionadas podem ser partículas indesejadas, onde o aparelho de energia focado é ativado agir sobre as partículas, como danificar, alterar, desativar, matar ou destruir os selecionados, partículas indesejadas.
No entanto, estas não são as únicas modalidades, e as várias modalidades são discutidas mais abaixo.
Em uma modalidade, quando a partícula ou célula selecionada é danificada, alterada, desativada, morta ou destruída pelo dispositivo de energia focado, a partícula ou célula continua a fluir através do canal, e para o recipiente, juntamente com quaisquer partículas ou células não-alvo.
Qualquer baia ou fluidos tampão também procedem no fluxo laminar através de canais de saída.
Assim, em uma modalidade, os métodos e sistemas atuais são capazes de produzir um produto discriminado de partículas ou células em um recipiente, incluindo uma alta viabilidade de partículas ou células não-alvo ou desejadas, e uma alta porcentagem de partículas ou células de alvos ou células fotodanificadas, alteradas, desativadas, destruídas ou mortas.
Métodos de classificação Em outro aspecto, é provido um método para identificar subpopulações dentro de uma mistura de partículas.
A mistura de partículas pode conter duas ou mais subpopulações.
As subpopulações podem ser distinguíveis umas das outras por uma característica, ou mais de uma característica.
O método compreende medir uma característica de um primeiro conjunto de partículas na mistura de partículas.
O método compreende ainda distinguir os valores das características medidas para subpopulações no conjunto de partículas.
Em um aspecto, os valores das características medidas podem ser distinguidos para duas ou mais subpopulações no conjunto de partículas.
Em outro aspecto, os valores das características medidas podem ser distinguidos para cada uma das subpopulações no conjunto de partículas.
O método compreende ainda a atribuição de uma faixa crítica de valores a duas ou mais subpopulações com base nos valores distintos da característica medida.
A atribuição de uma faixa crítica pode ser identificando (ou fazendo uma classificação de) uma subpopulação em relação a outras subpopulações com base nos valores distintos da característica medida para cada uma das subpopulações que estão sendo comparadas.
Após a atribuição de uma faixa crítica de valores, o método compreende ainda medir um segundo conjunto de partículas na mistura de partículas, e distinguir os valores das características medidas para subpopulações no segundo conjunto de partículas.
A faixa crítica de valores atribuídos para as subpopulações é então atualizada utilizando os valores da característica medida para as subpopulações distinguidas para o segundo conjunto de partículas.
O método compreende ainda classificar partículas na mistura de acordo com uma classificação subpopulação, utilizando a faixa crítica atualizada de valores.
Em um aspecto, os métodos da presente invenção são realizados em uma mistura de partículas, a fim de identificar, discriminar, distinguir ou classificar as partículas dentro da mistura.
A mistura de partículas pode conter duas ou mais subpopulações.
As subpopulações podem ser distinguíveis umas das outras por uma característica, ou mais de uma característica.
As partículas podem ser células.
As células podem ser de um único tipo, ou podem ser uma mistura de múltiplos tipos de células, como uma mistura de células derivadas de um tecido, ou presentes em partes sanguíneas ou sanguíneas.
Em outro aspecto, as células podem ser células de espermatozoides.
As células de espermatozoides podem ser de qualquer tipo de animal.
Em outro aspecto, as células de espermatozoides são de mamíferos não humanos.
Em outro aspecto, as células de espermatozoides são de animais de criação.
Animais de criação podem incluir, mas não se limitam a aves, ungulados, ruminantes.
Em outro aspecto, as células de espermatozoides são de ovinos, caprino, equino, suíno ou bovino.
Células de esperma bovino podem incluir células de esperma de bovinos domésticos, bisões, búfalos africanos, búfalos ou iaques.
Em outro aspecto, características de partículas ou conjuntos de partículas são detectadas e medidas.
Característica pode ser qualquer aspecto de uma partícula que pode ser detectada.
As características podem incluir aspectos como tamanho, forma, permeabilidade, integridade, conteúdo, vitalidade, mortalidade, estado metabólico e marcadores de superfície.
Em outro aspecto, as características podem incluir conteúdo de DNA.
O conteúdo de DNA, particularmente em células haploides, como células de espermatozoides ou óvulos, é um indicador da presença de um dos dois cromossomos sexuais.
O cromossomo X é maior que o cromossomo Y, e, portanto, uma célula haploide que contém um cromossomo X conterá mais DNA total do que um gameta que contém um cromossomo Y.
A característica pode ser detectada usando uma variedade de métodos que uma pessoa versada na técnica conhece, incluindo dispersão de luz, interferência, absorção ou detecção de fluorescência.
Por exemplo, a característica do conteúdo de DNA de uma célula pode ser detectada colorindo a célula com um corante fluorescente de ligação de DNA, e detectando a fluorescência do corante.
Em certos aspectos, as características das partículas são medidas usando um citômetro de fluxo.
O uso de citômetros de fluxo para detecção e medição de características é conhecido na técnica, mas em geral os citômetros operam convertendo a incidência de um fóton com um detector em um sinal elétrico.
O sinal elétrico do detector corresponde, portanto, à radiação eletromagnética de uma partícula (na forma de fótons emitidos ou espalhados da partícula) mediante a exposição a uma fonte de radiação eletromagnética.
Frequentemente, moléculas fluorescentes são utilizadas para rotular especificamente um aspecto específico da partícula, e o citômetro detecta fótons de um comprimento de onda específico emitido pela partícula em resposta à exposição da partícula a determinada radiação eletromagnética.
A radiação eletromagnética da partícula, indicativa de uma característica, é detectada por um detector dentro do aparelho do citômetro.
O detector geralmente é um tubo fotomultiplicador (PMT) ou um fotodiodo de avalanche (PMT) como descrito na patente US nº 10069027. O detector converte fótons em um sinal elétrico que pode ser transmitido para os componentes de processamento do citômetro, resultando na atribuição de valores à característica detectada.
A distinção de valores das características medidas, baseada na avaliação derivada do citômetro, pode envolver ainda mais a classificação e a comparação de valores para partículas ou conjuntos de partículas para elucidar as características das subpopulações dentro da mistura de partículas.
Isso pode ser alcançado, por exemplo, determinando se os valores, quando representados graficamente, formam grupos ou picos.
A identidade das subpopulações pode então ser verificada com base na relação de quaisquer grupos ou picos que são assim elucidados.
Em alguns aspectos, o diferencial pode ser através da localização de agrupamentos discretos de eventos baseados na característica ou características medidas.
As características medidas podem ser representadas em um espaço de características.
Um espaço de características, por exemplo, pode ser uma representação gráfica de ou características mais medidas das partículas.
Em uma modalidade exemplar, o espaço de característica pode ser um histograma de intensidades fluorescentes, ou um gráfico de dispersão de intensidades fluorescentes e fluorescência total, em que a fluorescência é indicativo da quantidade de DNA presente em uma célula.
Em alguns aspectos, a distinção pode ser discriminação entre duas subpopulações, discriminação de uma única subpopulação entre várias, ou discriminação de uma subpopulação dentro de um contínuo.
Em outros aspectos, os dados de eventos são gerados para partículas pelo aparelho do citômetro.
Os dados do evento são tipicamente gerados com base na detecção de radiação eletromagnética emitida por, ou espalhadas a partir de partículas após exposição a uma fonte de radiação eletromagnética.
A radiação eletromagnética é convertida em sinais elétricos por um detector (geralmente um PMT ou / e APD). O sinal elétrico é então convertido em dados pelos componentes do processador do citômetro.
Em determinadas modalidades, os dados do evento podem ser intensidade de fluorescência (ou seja, o maior valor de fluorescência para um evento individual correspondente a uma única partícula) e/ou a fluorescência total (ou seja, os valores integrados de fluorescência para todo o evento correspondentes a uma única partícula). Em certos aspectos, os métodos da presente invenção envolvem ações discretas realizadas em determinados conjuntos de partículas.
Por exemplo, a medição de uma característica de partículas em uma mistura de partículas e distinção de valores das características medidas pode ser realizada em um primeiro conjunto de partículas a partir de uma mistura de partículas, e posteriormente medir uma característica de partículas em uma mistura de partículas e distinguir valores das características medidas pode ser realizada em um segundo conjunto de partículas da mesma mistura de partículas.
Em outro aspecto, os métodos envolvem a atribuição de uma faixa crítica de valores a cada uma das subpopulações com base nos valores anteriormente distintos das características medidas.
Em certos aspectos, a atribuição de faixas críticas é usada para identificar subpopulações específicas dentro da mistura de partículas.
Por exemplo, uma faixa crítica pode ser atribuída a um conjunto de partículas para identificar esse conjunto de partículas, com base na relação do pico formado pelos valores para as partículas representadas graficamente, em relação ao pico de valores para outras partículas.
A atribuição de uma faixa crítica de valores pode incluir o cálculo de um valor de discriminação.
O valor da discriminação pode ser um valor de discriminação limiar (valor único ou dois valores) ou valores de limite de porta (por exemplo, três ou mais valores). O cálculo pode usar um ou mais valores do conjunto de parâmetros.
Em certas modalidades, o cálculo de um valor de discriminação envolve identificar pelo menos um valor crítico para uma primeira característica a partir da distribuição de dados de eventos para o primeiro conjunto de partículas; obtenção dos valores para uma segunda característica associada ao valor crítico para a primeira característica; produzir uma distribuição dos valores para a segunda característica; identificar pelo menos um valor crítico para a segunda característica a partir da distribuição de valores para a segunda característica; colocalização dos valores críticos para a primeira e segunda características em um espaço de características; e determinação dos valores de pelo menos uma discriminação a partir dos valores críticos colocalizados no espaço de características.
Em outros aspectos, o cálculo de um valor de discriminação pode envolver ainda mais o ajuste dos valores críticos para incluir dados de eventos de um segundo conjunto de partículas.
Em outros aspectos, os valores críticos compreendem um ou mais valores característicos de pico para uma primeira subpopulação, e um ou mais valores característicos de pico para uma segunda subpopulação.
Os valores característicos de pico compreendem a intensidade de fluorescência máxima e o pico de fluorescência total.
Em outros aspectos, os valores críticos também podem ser um valor mínimo entre os valores característicos do pico para a primeira e segunda subpopulações.
Em outro aspecto, os métodos podem incluir medir as características e distinguir os valores das características medidas para cada uma das subpopulações no segundo conjunto de partículas na mistura de partículas, o que ocorre após a atribuição de uma faixa crítica de valores para o primeiro conjunto de partículas.
Esta medição e distinção no segundo conjunto de partículas é realizada a fim de determinar se a atribuição da faixa crítica de valores para as subpopulações é precisa, e se não, para atualizar os valores usados para fazer essa atribuição.
Em algum aspecto, os valores para o segundo conjunto de partículas são comparados aos do primeiro conjunto de partículas, e se não forem diferentes, a faixa crítica de valores atribuídos com base no primeiro conjunto de partículas é usada.
Se houver diferença nos valores para o primeiro conjunto de partículas e o segundo conjunto de partículas, a faixa crítica de valores é atualizada usando os valores para o segundo conjunto de partículas com base na distinção dos valores das características medidas para cada uma das subpopulações no segundo conjunto de partículas.
Normalmente, um certo número de partículas, ou o número de partículas que podem ser medidas em uma quantidade definida de tempo, dita a composição de cada conjunto de partículas e, portanto, com que frequência a faixa crítica de valores é atualizada.
O número de partículas que compreende um conjunto e / ou valor de tempo faz parte do conjunto de parâmetros.
Em outro aspecto, partículas individuais na mistura de partículas são atribuídas uma classificação baseada na faixa crítica atribuída de valores.
Isso pode ser baseado em uma faixa crítica de valores que é ou não atualizada como resultado de um novo conjunto de partículas sendo medidas.
Esta classificação de partículas é derivada da relação das subpopulações entre si.
Partículas individuais na mistura podem ser classificadas como pertencentes a uma subpopulação de acordo com esta atribuição de valores críticos, enquanto ao mesmo tempo essas mesmas partículas classificadas fazem parte de um segundo conjunto de partículas usadas para atualizar a faixa crítica de valores.
Em outro aspecto, os métodos da presente invenção preveem a identificação de subpopulações dentro de uma mistura de partículas, definindo portas para discriminar uma ou mais subpopulações de partículas dentro de uma mistura.
Como as partículas dentro da mistura são processadas por citometria de fluxo, as partículas são detectadas pelo aparelho detector do citômetro de fluxo, gerando um evento detector.
Cada evento detector pode ser uma agregação de valores, incluindo, por exemplo, valores para intensidade e área de um sinal.
Um computador é usado para processar os dados do evento.
Os dados do evento são acumulados até que os dados de um número suficiente de eventos foram compilados para permitir o cálculo de um ou mais valores de discriminação.
Um conjunto de parâmetros, que é um conjunto de valores que afetam certos detalhes de todos os cálculos de valor de discriminação, são providos antes que quaisquer valores de discriminação sejam calculados.
Quando dados de eventos suficientes são compilados, um valor de discriminação é calculado, e o processo é repetido com um novo conjunto de dados de eventos.
Cada conjunto de dados de eventos é o conjunto anterior de dados do evento para determinar se o valor de discriminação calculado para o conjunto subsequente de dados do evento é significativamente diferente do valor de discriminação anterior calculado do conjunto anterior de dados do evento.
Se não for significativamente diferente, os dados resultantes do cálculo do valor de discriminação anterior, se disponíveis, podem ser mediados com dados do valor de discriminação subsequente para melhorar a consistência da localização e forma entre valores de discriminação calculados consecutivamente.
Se o valor da discriminação for significativamente diferente, os dados para o valor de discriminação previamente calculado são descartados.
Em certos aspectos dos métodos, uma mistura de partículas é provida.
A composição da mistura pode variar de acordo com a aplicação.
A mistura pode incluir partículas e meio.
Em certas modalidades, a mistura de partículas é uma amostra de espermatozoides.
A célula do esperma pode estar presente com componentes de ejaculação bruta, com outros meios de comunicação e/ou extensor.
A mistura de partículas é entregue a um sistema de citometria de fluxo.
Em certos aspectos, um conjunto de parâmetros é provido.
O conjunto de parâmetros é provido ao processador para cálculo de um ou mais valores de discriminação.
O conjunto de parâmetros inclui um conjunto de valores que afetam certos detalhes de todos os cálculos de valor de discriminação.
Em alguns aspectos, o conjunto de parâmetros inclui valores que são usados para calcular um valor limiar.
Em outros aspectos, o conjunto de parâmetros inclui valores que são usados para calcular um ou mais pontos ou vértices da porta.
Em outros aspectos, o conjunto de parâmetros inclui a frequência com que o cálculo de um valor de discriminação deve ocorrer e / ou a quantidade de dados de eventos que desencadeia o cálculo de um valor de discriminação.
Em certos aspectos, as características das partículas na mistura são detectadas.
Esta detecção é realizada pelo aparelho de citometria.
O citômetro detecta características detectando aspectos de partículas individuais.
A detecção de características de uma célula individual é considerada um único evento.
Em alguns casos, as partículas podem chegar ao detector como aglomerados de partículas, e assim a detecção prosseguirá para as células agrupadas como um único evento.
Esses aspectos podem incluir o tamanho e a forma da partícula, por exemplo, detectando dispersão de luz e composição de partículas, por exemplo, detectando a presença de um marcador fluorescente na superfície da partícula ou dentro da partícula.
Em certos aspectos, o aspecto da partícula que está sendo detectado pode ser um corante fluorescente.
Em outros aspectos, a partícula pode ser uma célula, e o corante pode ser um corante de DNA fluorescente.
Uma ou mais características podem ser detectadas para cada partícula, e um único evento pode incluir uma ou mais características detectadas.
O detector do aparelho de citometria gera um sinal que corresponde à característica ou características detectadas para cada evento e provê esse sinal para um processador (por exemplo, uma CPU). Na etapa 306, os dados do evento compilados são distribuídos. [A ocorrência de distribuição de dados pode depender de um ou mais valores do conjunto de parâmetros – frequência ou número de eventos]. Em alguns aspectos, a distribuição pode ser uma classificação de eventos por área de eventos.
Em outros aspectos, a distribuição pode ser a classificação de eventos por intensidade.
Em outros aspectos, a distribuição pode ser a classificação de eventos por intensidade e área.
Em outro aspecto, a classificação dos eventos é provida ao aparelho de classificação, que implementa a decisão de classificação / não-classificação.
O valor de discriminação calculado para um conjunto de eventos compilados é comparado ao valor de discriminação calculado para o conjunto anterior de eventos. [repetir etapas 303-307 para gerar um novo valor de discriminação com base em um novo conjunto compilado de dados de eventos] [se diferente, descarte anteriormente; se não for diferente, dados médios de eventos] [pode ser feito comparando diretamente os valores de discriminação calculados ou comparando os dados nos dois conjuntos de dados compilados] Em outro aspecto, os métodos da presente invenção podem ser realizados da seguinte forma:
1. Obter o conjunto de parâmetros.
2. Obter a frequência do cálculo da porta a partir do conjunto de parâmetros.
3. Obter o número máximo de eventos cujos dados serão usados diretamente para um cálculo de porta a partir do conjunto de parâmetros. (Nota – cada evento tem uma 'intensidade' que é uma medida da fluorescência instantânea máxima e uma 'área' que é a parte integrante da intensidade durante a duração do evento.)
4. À medida que os eventos são gerados pelo detector, adicionar cada evento ao conjunto de dados do evento usado para calcular a porta. Se o número máximo de eventos já estiver presente, adicionar o novo evento e ignorar os eventos mais antigos na determinação subsequente da porta.
5. Periodicamente de acordo com a etapa 2, determinar se eventos suficientes foram acumulados para tentar calcular uma porta, e se sim, continuar com a etapa 6.
6. Classificar eventos acumulados por área. Salvar o valor médio das áreas de eventos deste conjunto de dados.
7. Classificar eventos acumulados por intensidade, em seguida, secundariamente por área. Salvar o valor médio das intensidades de eventos deste conjunto de dados.
8. Determinar se o caráter dos dados do evento mudou significativamente desde o último cálculo, comparando os valores medianos de intensidade e área com os valores medianos correspondentes do conjunto de dados para o último cálculo. (Se não houver valores medianos anteriores, prosseguir como se não houvesse uma mudança significativa.)
9. Se o caráter dos dados do evento mudou significativamente (a partir da etapa 8), primeiro salvar e, em seguida, limpar os dados relacionados às portas anteriores para que não afete a porta resultante do conjunto de dados atual. Por exemplo, "esquecer"
os dados antigos que podem ser mediados com os dados atuais nas etapas 32, 57 e todas as outras etapas semelhantes.
10. Criar um histograma dos valores de intensidade de todos os eventos. A faixa de valores que são colocados em caixas de histograma é de 0 a 65535, e eles são classificados em 512 caixas de tamanho igual que cobrem coletivamente toda a faixa.
11. Calcular os números do compartimento correspondentes a 25% da borda esquerda do histograma e 15% da borda direita do histograma. Com 512 caixas, esses números correspondem a 128 e 435.
12. Encontrar os três picos mais altos na área do histograma limitados pelos limites determinados na etapa 11. Um pico no histograma é um compartimento cujo número de contagens é maior do que a contagem em compartimentos de ambos os lados.
13. Classificar os números de compartimento dos picos de histograma a partir do passo 12 em ordem descendente por altura de compartimento (número de eventos em cada compartimento).
14. Examinar todos os picos dentro da área do histograma que está fora dos limites determinados na etapa 11. Se algum deles for maior do que o segundo pico mais alto identificado na etapa 13, sinalizar um erro de cálculo da porta e esperar que um novo conjunto de dados de eventos esteja disponível.
15. Haverá algumas diferenças de intensidade dependentes de espécies entre picos masculinos e femininos que estão em conformidade com as expectativas. Chamar isso de diferença de intensidade necessária. Determinar as diferenças de intensidade entre os três picos mais altos do passo 13, tomando os picos em pares. Há três pares: picos 1 e 2, picos 1 e 3, e picos 2 e 3.
16. Se nenhum par de picos apresentar a diferença de intensidade necessária, sinalizar um erro de cálculo e esperar por um novo conjunto de dados de eventos para estar disponível.
17. Se a diferença entre apenas um dos pares na etapa 15 é a diferença de intensidade necessária, então esse par de picos de histograma representa os picos masculino e feminino. Se o terceiro pico que não está nesse par for o mais alto dos três picos da etapa 12, sinalizar um erro de cálculo e esperar que um novo conjunto de dados de eventos esteja disponível.
18. Se a etapa 17 não identificou os picos do histograma masculino e feminino, então determinar se dois pares dos picos mais altos apresentam a diferença de intensidade necessária. Se dois pares o fizerem, então todos os três picos em ordem por número de compartimento são igualmente espaçados (caso A), ou dois dos picos mais altos são muito próximos (um é um pico e ambos representam o mesmo pico masculino ou feminino) e o terceiro representa o pico para o outro sexo (caso B). Examinar o espaçamento para determinar se o caso A ou B é verdadeiro.
19. Se o caso A na etapa 18 for encontrado, então o pico central é o pico masculino ou feminino. Dos picos esquerdo e direito, um deles deve ter menos de dois terços da altura do outro. Se isso não for verdade, marcar um erro de cálculo e aguardar que um novo conjunto de dados de eventos esteja disponível. Se for verdade, o mais alto dos picos esquerdo e direito é o pico do outro sexo; o pico central e o mais alto dos dois picos externos são os picos masculino e feminino. O pico à esquerda será o pico masculino ou o pico feminino, dependendo da espécie da fonte amostral.
20. Se o caso B na etapa 18 for encontrado, selecionar o pico do histograma que está em ambos os pares de picos exibindo a diferença de intensidade necessária como um dos picos de histograma relevante (masculino ou feminino) e considerar os outros dois picos de histograma como o outro pico relevante, a ser processado ainda mais para determinar qual é um pico do pico e qual é o pico principal (ver passo 21).
21. Se o caso B na etapa 18 for encontrado, então encontrar as larguras dos dois picos de histograma que representam o pico restante de interesse e um pico desse pico. Calcular as larguras encontrando o compartimento do ponto mais baixo (o vale) entre eles, e, movendo-se para fora do vale, encontrar o primeiro compartimento em ambas as direções que é de altura mais baixa do que o vale. O número de compartimentos do compartimento de vale até o primeiro compartimento é a largura do pico nessa direção. Tomar o mais estreito dos dois picos como o pico, e o mais largo como o segundo pico de interesse (o pico masculino ou feminino).
22. Se os dois picos identificados como picos masculinos e femininos não forem os dois picos mais altos, sinalizar um erro de cálculo e esperar por um novo conjunto de dados de eventos para estar disponível. Se forem, atribuir a maioria dos dois picos à direita para ser o pico de intensidade feminina, e o mais à esquerda ser o pico de intensidade masculina, ou vice-versa, dependendo da espécie da fonte da qual a amostra foi obtida.
23. Identificar o compartimento de histograma mais baixa entre os picos masculino e feminino identificados como o vale.
24. Calcular a razão pico-vale (razão P2T) como ((P1 + P2) / 2) / T, onde P1 e P2 são as contagens nos compartimentos de pico de histograma de intensidade masculina e feminina, respectivamente, e T é a contagem no compartimento de vale. Além disso, recuperar o valor do limiar de pico para vale (limiar P2T) do conjunto de parâmetros. Além disso, calcular o valor de dominância de pico como (P2-T) / (P1-T), e recuperar o valor de minPeakDominance a partir do conjunto de parâmetros.
25. Compare a razão P2T calculada na etapa 24 com o valor do limiar P2T. Se a relação pico- vale for menor que o valor do limiar, sinalizar um erro e aguardar um novo conjunto de dados para estar disponível. Além disso, comparar o valor de dominância máxima com o valor minPeakDominance. Se o valor de dominância de pico for menor que o valor minPeakDominance, marcar um erro e aguardar que um novo conjunto de dados esteja disponível.
26. Para os picos masculino e feminino, calcular o número de compartimentos do vale até o pico do histograma.
27. Para picos de histograma masculino e feminino, calcular as larguras máximas nos compartimentos como o dobro dos respectivos valores encontrados na etapa 26, mais
1.
28. Para picos de histograma masculino e feminino, calcular o número de compartimentos de histograma para usar como pontos (x, y = número de compartimento, contagem) para encaixar uma curva para. Calcular como a largura máxima do passo 27, exceto se a largura de pico for maior que nove, defina o número de compartimentos para nove.
29. Para os picos do histograma masculino e feminino, encontrar uma estimativa mais precisa dos locais de pico masculino e feminino, aplicando um algoritmo polinomial mais adequado aos compartimentos ao redor do pico, usando o número de compartimentos calculados na etapa 28 como o número de pontos para se encaixar na curva; em seguida, aplicar o algoritmo Newton-Raphson para encontrar a intensidade correspondente à localização de inclinação zero no polinomial instalado. Esta estimativa mais precisa do pico é um número de compartimento não integral com casas decimais.
30. Aplicar um algoritmo polinomial de melhor ajuste nas cinco caixas centradas no compartimento de vale a partir da etapa 23. Em seguida, aplicar o algoritmo Newton- Raphson para encontrar a intensidade correspondente à localização de inclinação zero no polinomial ajustado. Esta estimativa mais precisa do vale é um número de compartimento não integral com casas decimais.
31. Se a diferença entre a estimativa do vale da etapa 30 e o número do compartimento onde o vale é inicialmente encontrado na etapa 23 for maior que 1,0, ajustar a estimativa precisa para ser o compartimento de vale da etapa 23 mais ou menos 1,0, dependendo se a estimativa precisa da etapa 30 é maior ou menor que o compartimento de vale da etapa 23.
32. Calcular a média do valor do vale a partir da etapa 31 e os valores do vale da etapa 31 que foram obtidos nos últimos cinco conjuntos de dados de eventos. Use este valor médio como o valor do vale obtido a partir deste conjunto de dados.
33. Multiplicar a largura da faixa de valores de intensidade (65536) por 0,003. O produto é
196.608.
34. Converter os locais de pico do histograma masculino e feminino, como números de compartimento, em valores de intensidade multiplicando o número preciso do compartimento pela largura do compartimento. Por exemplo, se a localização máxima do histograma feminino a partir da etapa 29 é 257.358, e há 512 compartimentos de histograma para a faixa 0 a 65535, então a largura do compartimento é 128, e obter o pico de intensidade na faixa de 0 a 65535 multiplicando 257.358 x 128 = 32942,6.
35. Utilizando o produto do cálculo na etapa 33 e os locais de pico do histograma masculino e feminino convertidos em valores de intensidade a partir da etapa 34, encontrar o subconjunto de eventos cujos valores de intensidade estão dentro da distância do pico dado pelo produto a partir da etapa 33. Fazer isso separadamente para os picos masculino e feminino. Por exemplo, se o pico de intensidade feminina for 32942,6, encontrar o subconjunto de eventos no conjunto de dados de eventos que têm intensidades na faixa [32942.6 – 196.608, 32942.6 + 196.608], ou seja, eventos com intensidades entre 32746 e 33139. Fazer o mesmo para um conjunto de eventos com intensidades perto do pico do histograma masculino.
36. Realizar os seguintes passos 37 a 54 separadamente para picos masculinos e femininos, para encontrar as coordenadas da 'área' dos picos no plano (intensidade, área) em que a porta deve ser desenhada. Essas etapas utilizam apenas dados de eventos de eventos selecionados na etapa 35.
37. Criar uma matriz dos valores da área nos eventos selecionados na etapa 35. Classificá- la em ordem ascendente.
38. Calcular o número igual a 75% do número de valores de área na matriz na etapa 37. Chamá-lo de numValuesIn75Pct para fins desta descrição do processo.
39. Calcular o número igual a 99% do número de valores de área na matriz na etapa 37. Chamá-lo de largestRetainedIndex para fins desta descrição do processo.
40. Em etapas subsequentes, ignorar todos os valores de área superiores ao valor no 99º percentil, ou seja, todos os valores da matriz com índices de matriz maiores que os largestRetainedIndex (o índice calculado na etapa 39).
41. Encontrar o valor da área que marca o 75º percentil de valores da área, usando numValuesIn75pct a partir da etapa 38. Chamar esse valor de 'lower75pctMax' para fins desta descrição do processo.
42. Encontrar o menor valor de área na matriz a partir da etapa 37. Chamar esse valor de 'lower75pctMin' para fins desta descrição do processo.
43. Calcular o lower75pctMax – lower75pctMin, que representa a faixa de valores de área que não são ignorados como mencionado na etapa 40. Chamar essa diferença de 'areaRange' para fins desta descrição do processo.
44. Calcular a largura variável dos compartimentos de histograma 'área' como: areaBinWidth = areaRange / 512
45. Calcular o valor (largestRetainedArea / areaBinWidth) + 1, e chamá-lo de 'numberOfAreaBins' para fins desta descrição do processo.
46. Encontrar o valor na matriz a partir da etapa 37 que está no índice de matriz 'largestRetainedIndex'. Chamar esse valor de "largestRetainedArea" para fins desta descrição do processo.
47. Se há muito poucos eventos selecionados para olhar, de tal forma que largestRetainedIndex < (6 x numberOfAreaBins a partir da etapa 45) em seguida, recalcular areaBinWidth de acordo com: numberOfAreaBins = (largestRetainedIndex / 6) + 1 Se (numberOfAreaBins < 4) numberOfAreaBins = 4; areaBinWidth = largestRetainedArea / (numberOfAreaBins – 1)
48. Criar um histograma dos valores de área na matriz a partir da etapa 37, ignorando todos os valores da matriz com índices de matriz maiores do que os largestRetainedIndex, conforme mencionado na etapa 40.
49. Criar outro histograma de valores de área usando o mesmo número de compartimentos, que é suavizada pela média da contagem de valores em cada compartimento a partir da etapa 48 com as contagens nos sete compartimentos (a partir da etapa 48) de ambos os lados, ou seja, obter a média de 15 valores juntos.
50. Encontrar o compartimento no histograma de área suavizada a partir da etapa 49 que tem mais contagens.
51. Multiplicar o número de contagens no compartimento da etapa 50 por 0,2.
52. Mover para a esquerda (índices de matriz menor) a partir do compartimento com mais contagens, encontrar o primeiro compartimento com menos contagens do que o produto calculado na etapa 51.
53. Mover para a direita (índices de matriz maior) a partir do compartimento com mais contagens, encontrar o primeiro compartimento com menos contagens do que o produto calculado na etapa 51.
54. Usar um algoritmo de ajuste de curva polinomial de menor quadrado para encontrar um polinômio de décimo grau que se aproxime da região do histograma suavizada entre os compartimentos encontrados nas etapas 52 e 53. Usando o algoritmo Newton- Raphson, encontrar o local onde a inclinação do polinomial é zero e use este local como o valor da área do pico.
55. Com os locais (intensidade, área) dos picos masculino e feminino agora conhecidos, calcular a localização do ponto no espaço coordenado (intensidade, área) que está em uma linha que passa pelos picos masculino e feminino, e que tem a coordenada de intensidade do vale calculada na etapa 32. Este ponto é o local do vale no espaço de coordenadas (intensidade, área).
56. Se as coordenadas da área para o macho estiverem acima da coordenada de área para o pico feminino – ou abaixo dele, dependendo da espécie da fonte da amostra – sinalizar um erro e aguardar o próximo conjunto de dados do evento.
57. Calcular um valor para a coordenada de intensidade de pico feminina a partir da etapa 29 que foi ajustada para derivação na eletrônica que ocorreu desde que o conjunto de dados do evento foi processado, para cada uma das coordenadas de intensidade de pico feminino dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar a média apenas dos valores disponíveis. Chamar o valor médio de "intensidade média do pico feminino" para fins desta descrição do processo. (O processo de cálculo das coordenadas ajustadas à deriva está descrito no conjunto de etapas enumeradas com letras em vez de números.)
58. Calcular um valor para a coordenada de intensidade de pico masculino a partir da etapa 29 que foi ajustada para derivação na eletrônica que ocorreu desde que o conjunto de dados do evento foi processado, para cada uma das coordenadas de intensidade de pico masculino dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. A média das coordenadas de intensidade de pico masculino ajustada à derivação com a coordenada de intensidade masculina a partir da etapa 29 do processamento deste conjunto de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar a média apenas dos valores disponíveis. Chamar o valor médio de "intensidade média de pico masculino" para fins desta descrição do processo. (O processo de cálculo das coordenadas ajustadas à derivação está descrito no conjunto de etapas enumeradas com letras em vez de números.)
59. Calcular um valor para a coordenada de intensidade do vale a partir da etapa 32 que foi ajustada para derivação na eletrônica que ocorreu desde que o conjunto de dados do evento foi processado, para cada uma das coordenadas de intensidade do vale dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Tirar a média das coordenadas de intensidade de vale ajustada à derivação com a coordenada de intensidade do vale a partir da etapa 32 do processamento deste conjunto de dados. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar média apenas dos valores disponíveis. Chamar o valor médio de "intensidade média do vale" para fins desta descrição do processo. (O processo de cálculo das coordenadas ajustadas à deriva está descrito no conjunto de etapas enumeradas com letras em vez de números.)
60. Calcular a diferença entre a intensidade do vale a partir do passo 32 e a intensidade máxima do pico em relação ao qual a porta é retirada a partir da etapa 29. Chamar essa distância da distância de intensidade de pico para vale.
61. Média da distância de intensidade de pico para vale a partir da etapa 60 com as distâncias de intensidade de pico para vale encontradas na etapa 60 dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, em média apenas os valores disponíveis. Chamar o valor médio da "distância média de intensidade de pico para vale" para fins desta descrição do processo.
62. Criar uma porta na forma de um polígono no plano de coordenadas (intensidade, área) com base na localização do pico de interesse, que tem oito vértices. Iniciar esta etapa do processo obtendo o valor de encroachmentPct do conjunto de parâmetros. Dividir este por 100,0 e subtrair o resultado de 1.0 para obter o 'encroachmentMultiplier' usado nas etapas subsequentes.
63. Multiplicar a distância média de intensidade de pico para vale pelo encroachmentMultiplier da etapa 62. Chamar o produto de ‘encroachmentAdjustment’ para fins desta descrição do processo.
64. Calcular um valor chamado "intensidade de invasão" para fins desta descrição do processo. Dois vértices estão em uma linha vertical desenhada através da intensidade da invasão. Se a porta está sendo criada em relação ao pico masculino, a intensidade da invasão é a intensidade média do pico masculino mais a encroachmentAdjustment. Para o pico masculino, a intensidade da invasão é a coordenada de intensidade do vértice ou vértices da porta que são mais distantes à direita no eixo de intensidade no plano (intensidade, área). Se a porta está sendo criada em relação ao pico feminino, a intensidade da invasão é a intensidade média do pico feminino menos a encroachmentAdjustment. Para o pico feminino, a intensidade da invasão é a coordenada de intensidade do vértice ou vértices da porta que são mais distantes à esquerda no eixo de intensidade no plano (intensidade, área).
65. Recuperar o valor peakFalloffPct do conjunto de parâmetros. Este é um valor decimal na faixa 0.0 a 100.0. Atualmente 65.0 é usado, mas algum outro valor pode eventualmente ser determinado para ser melhor. Dividir o peakFalloffPct por 100,0, em seguida, multiplicá-lo pela altura do compartimento mais alta no pico relevante no histograma de intensidade (passo 10). O pico relevante é o pico de intensidade masculina ou o pico de intensidade feminina, dependendo do pico que a porta está sendo calculada em relação a. Chamar o produto da multiplicação de 'falloffValue' para fins desta descrição do processo.
66. Começar com o compartimento de histograma de maior intensidade no pico relevante, afastar do compartimento de vale da etapa 23 até que a altura do compartimento atualmente examinada seja menor ou igual falloffValue. Calcular o valor de intensidade correspondente ao centro deste compartimento como [índice de compartimento + 0,5] x [largura do compartimento]. Chamar esse valor de "intensidade de queda" para fins desta descrição do processo.
67. Tirar a média da intensidade de queda da etapa 66 com as intensidades de queda dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar a média apenas dos valores disponíveis. Chamar o valor médio de "intensidade média de queda" para fins desta descrição do processo.
68. Tomar a intensidade média de queda como o valor inicial para a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) dos dois vértices de porta que estão mais distantes à direita em uma porta desenhada em relação ao pico feminino, ou mais à esquerda em uma porta desenhada em relação ao pico masculino.
69. Recuperar o valor 'octExtension' do conjunto de parâmetros. O valor octExtension é um valor decimal maior que 0,0. Atualmente o valor 0.6 é usado, mas isso pode ser alterado no futuro. Multiplicar octExtension pela distância média de intensidade de pico para vale a partir da etapa 61. Chamar o valor de "distância de extensão" para fins desta descrição do processo.
70. Se a porta estiver sendo desenhada em relação ao pico masculino, subtrair a distância de extensão da etapa 69 do valor inicial calculado na etapa 68. Se estiver sendo desenhada em relação ao pico feminino, adicionar a distância de extensão ao valor inicial. Usar o resultado como o valor final para a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) dos dois vértices de porta que estão mais distantes à direita em uma porta desenhada em relação ao pico feminino, ou mais à esquerda em uma porta desenhada em relação ao pico masculino.
71. Calcular a média da intensidade da invasão e a intensidade média do pico feminino, para uma porta desenhada em relação ao pico feminino, ou a intensidade média do pico masculino, para uma porta desenhada em relação ao pico masculino.
72. Recuperar o valor 'horizAdjMultiplier1' do conjunto de parâmetros. Multiplicá-lo pela distância média de intensidade de pico para vale a partir da etapa 61. Adicionar o produto ao valor calculado na etapa 71. Para uma porta relativa ao pico feminino, o resultado é usado como a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) para dois vértices em uma linha vertical que é à direita da intensidade de invasão. Para uma porta em relação ao pico masculino, a linha é à esquerda da intensidade da invasão. O valor de 0,0 é atualmente usado para horizAdjMultiplier1, mas isso pode ser alterado.
73. Calcular a média da intensidade média de queda e a intensidade média do pico feminino, para uma porta desenhada em relação ao pico feminino, ou a intensidade média do pico masculino, para uma porta desenhada em relação ao pico masculino.
74. Recuperar o valor 'horizAdjMultiplier2' do conjunto de parâmetros. Multiplicá-lo pela distância média de intensidade de pico para vale a partir da etapa 61. Adicionar o produto ao valor calculado na etapa 73. Para uma porta relativa ao pico feminino, o resultado é usado como a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) para dois vértices em uma linha vertical que é à direita da linha calculada na etapa 72 e à esquerda de uma linha desenhada através da intensidade de queda. Para uma porta relativo ao pico masculino, a linha é à esquerda da linha calculada na etapa 72 e à direita de uma linha desenhada através da intensidade de queda. O valor de 0,0 é atualmente usado para horizAdjMultiplier2, mas isso pode ser alterado.
75. Calcular a diferença entre a coordenada 'área' do vale a partir da etapa 55 e a coordenada da área de pico do pico em relação ao qual a porta é desenhada a partir da etapa 29. Chamar essa distância da distância de área de pico para vale.
76. Tirar a média da distância de área de pico para vale a partir da etapa 75 com as distâncias de área de pico para vale encontradas na etapa 75 dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar média apenas dos valores disponíveis. Chamar o valor médio da "distância média da área de pico para vale" para fins desta descrição do processo.
77. Considerar uma "linha de eixo" traçada através dos picos masculino e feminino (intensidade, área). Dois dos vértices da porta estão na linha com intensidade calculada na etapa 72, uma acima do eixo e outra abaixo do eixo. Calcular o ponto de intersecção (intensidade, área) onde o eixo e a linha vertical da etapa 72 se cruzam. Em seguida,
calcular a coordenada "área" do vértice na linha vertical e acima do eixo, recuperar o valor de "areaAboveMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicá-lo pela distância média de área de pico para vale da etapa 76, e adicionar o resultado à coordenada de área do ponto de intersecção.
78. Calcular a coordenada "área" do vértice na linha da etapa 72 que está abaixo do eixo, recuperando o valor de "areaBelowMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicá- la pela distância média de área de pico para vale da etapa 76, e subtrair o resultado da coordenada de área do ponto de intersecção.
79. Dois vértices estão em uma linha vertical desenhada através do ponto de invasão, um acima da linha do eixo e outro abaixo dele. Calcular o ponto onde a linha vertical na intensidade da invasão e a linha do eixo se cruzam; chamar esse ponto de "ponto de invasão" para fins desta descrição do processo. Calcular a coordenada 'área' do vértice com a intensidade de invasão e acima da linha do eixo, recuperando o valor do conjunto de parâmetros de aboveHeightPctLeft do conjunto de parâmetros, dividindo-o por 100,0, e multiplicando-o pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 77 até a linha do eixo; em seguida, adicionar esse valor à coordenada "área" do ponto de invasão.
80. Partir do ponto em que a linha vertical na intensidade de invasão e a linha de eixo se cruzam (computada na etapa 79), computar o vértice da etapa 79 que está na linha vertical na intensidade de invasão, mas abaixo da linha do eixo, recuperando o valor de belowHeightPctLeft do conjunto de parâmetros, dividindo-o por 100,0 e multiplicando- o pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 78 para cima para a linha do eixo; em seguida, subtrair esse valor do valor da área do ponto de invasão. Essa é a coordenada "área" do ponto.
81. Dois vértices estão na linha vertical que tem a intensidade calculada na etapa 74. Calcular o ponto de intersecção (intensidade, área) onde o eixo e a linha vertical da etapa 74 se cruzam. Em seguida, calcular a coordenada "área" do vértice na linha e acima do eixo, recuperando o valor de "areaAboveMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicar pela distância média de área de pico para vale da etapa 76, e adicionar o resultado à coordenada de área do ponto de intersecção.
82. Calcular a coordenada "área" do vértice na linha da etapa 74, que está abaixo do eixo, recuperando o valor da "areaBelowMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicar pela distância média de área de pico para vale da etapa 76, e subtrair o resultado da coordenada de área do ponto de intersecção computada na etapa 81.
83. Dois vértices estão em uma linha vertical desenhada através da intensidade de queda, um acima da linha do eixo e outro abaixo dela. Calcular o ponto onde a linha vertical na intensidade de queda e a linha do eixo se cruzam; chamar esse ponto de "ponto de queda" para fins desta descrição do processo. Calcular a coordenada 'área' do vértice com a intensidade de queda e acima da linha do eixo recuperando o valor do conjunto de parâmetros acima, dividindo-o por 100,0, e multiplicando-o pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 81 até a linha do eixo; em seguida, adicionar esse valor à coordenada 'área' do ponto de queda.
84. A partir do ponto de queda a partir da etapa 83, calcular o vértice da etapa 83 que está na linha vertical na intensidade de queda, mas abaixo da linha do eixo, recuperando o valor de belowHeightPctRight do conjunto de parâmetros, dividindo-o por 100,0 e multiplicando-o pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 82 até a linha do eixo; em seguida, subtrair esse valor do valor da área do ponto de queda. Essa é a coordenada "área" do ponto abaixo do eixo.
85. Oito pontos de vértice de porta foram agora calculados a partir do conjunto de dados do evento, a menos que um erro tenha sido sinalizado no meio do processo. Recuperar o valor de perturbationSkips do conjunto de parâmetros. Se o número de conjuntos de dados de eventos processados desde a última vez que uma mudança significativa nos dados foi notada na etapa 9 é menor ou igual à perturbationSkips, incluindo o conjunto de dados atual, não criará uma porta. Em vez disso, usar "no gate" e aplicar a mesma operação a todas as células que fluem através do sistema de citometria de fluxo até que um nova porta seja criada a partir do processamento de um conjunto de dados subsequente. No entanto, se o número de conjuntos de dados de eventos processados desde a última alteração significativa for maior do que a perturbationSkips, aplicar a porta que foi calculada a partir dos dados do evento definidos por esse processo.
86. Para cada valor que precisa ser mediado com valores análogos em iterações subsequentes do processo, salvar o valor resultante do processamento desse conjunto de dados. Em outro aspecto, o processo compreende ainda técnicas inventivas para encontrar uma intensidade corrigida à derivação [expansão das etapas 57-59 acima] A. Criar uma variável de contador de dados de eventos e inicializar em zero. B. Cada vez que um novo conjunto de dados de eventos é processado, incrementar o contador. Incrementar o contador se um erro é sinalizado enquanto os dados estão sendo processados ou não, e se uma alteração no caráter dos dados do evento é detectada na etapa 8 ou não. C. Quando um valor a ser mediado com valores análogos a partir dos conjuntos de dados subsequentes é salvo na etapa 86 para uso futuro, salvar o valor do contador de dados associado ao conjunto de dados que resultou na produção do valor. D. Calcular uma taxa média de derivação na variável X durante o período de tempo abrangido pelo processamento de vários conjuntos de dados subtraindo o valor economizado mais antigo disponível de X do valor mais recente de X para obter DELTA_X, e subtrair o valor do contador de dados associado ao valor mais antigo do contador associado ao valor mais recentemente armazenado para obter DELTA_T; e, em seguida, calcular DELTA_X / DELTA_T como a derivação média. E. Para calcular o ajuste total de derivação para uma instância específica registrada de uma variável, multiplicar a taxa média de derivação para a variável obtida da etapa D pelo número de períodos de tempo (ou seja, o número de conjuntos de dados de eventos apresentados) que se passaram desde que o valor foi registrado. O produto da multiplicação representa o ajuste de derivação. Adicionar o ajuste de derivação ao valor registrado anteriormente para obter um valor corrigido por derivação.
Em certos aspectos, a presente invenção prove produtos de partículas classificados produzidos pelos sistemas e métodos aqui descritos. Estes produtos classificados podem ser de qualidade maior e/ou mais consistente. Em certos aspectos, os produtos de partículas classificados da presente invenção são amostras de células de esperma sexuadas. As amostras de células de esperma sexuadas podem ser predominantemente células de esperma com cromossomo X, ou predominantemente células de espermatozoides portadoras de cromossomo Y. As amostras de sêmen sexuado podem ser células de esperma contendo cromossomo X ou cromossomo Y a pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% (ou qualquer percentual dentro da faixa de 60-100%). As amostras de células sexuadas de esperma podem incluir uma formulação de meio à base de sal, incluindo opcionalmente qualquer número de ingredientes benéficos, incluindo, mas não se limitando a, agentes criopreservadores (como glicerol), antioxidantes, extensores, proteínas, vitaminas e açúcares. As amostras de células sexuadas de esperma podem ser adequadas para fertilização, inclusive por inseminação artificial (IA) ou fertilização in vitro (FIV).
EXEMPLOS Discriminação de células de espermatozoides portadores de cromossomo Y usando sistema de portas otimizado programado Para certas implementações de sexagem de sêmen, a mistura de células presentes na ejaculação crua (juntamente com quaisquer células mortas e aglomerados de células) é enriquecida para células de esperma com portadores de cromossomo X vivos ou células de esperma portadoras de cromossomo Y. Para aplicações leiteiras, as células de espermatozoides portadoras de cromossomo X são preferidas para produzir gestações que resultarão em descendentes fêmeas. O enriquecimento é geralmente realizado usando classificação de gotículas ou por ablação a laser. Em aplicações de ablação a laser, um laser "matador" tenta matar todas as células que não têm a característica desejada (ou seja, qualquer célula que não seja um cromossomo X vivo com célula de esperma). No sistema atual, as células são rotuladas com um corante fluorescente intercalante de DNA, e a fluorescência emitida por cada célula é detectada como uma medida do conteúdo total do DNA.
O sinal fluorescente produzido por cada célula (ou aglomerado de células) é detectado por um fotodiodo de avalanche e registrado como um evento.
Células de espermatozoides com cromossomo X em gado possuem aproximadamente 3,8% mais DNA total do que células de espermatozoides portadoras de cromossomo Y, o que se traduz em mais fluorescência emitida por uma célula de espermatozoide portadora de cromossomo X.
Isso é detectado como uma maior intensidade de fluorescência (pico) para um evento correspondente a uma célula de esperma portadora de cromossomo X, em comparação com um evento correspondente a uma célula de esperma portadora de cromossomo Y.
A área do sinal de fluorescência para cada evento também é determinada.
A área de sinal de fluorescência é uma integração (ou seja, a soma ou total) de toda a fluorescência de um evento ao longo do tempo ao longo do qual esse evento é detectado.
Cada evento pode ser representado graficamente em um gráfico de intensidade (pico) e área, e quando os lotes de muitos eventos são compilados, a subpopulação das células pode ser identificada.
Por exemplo, uma subpopulação de células de espermatozoides portadoras de cromossomo X são identificáveis em relação à subpopulação de células de espermatozoides portadoras de cromossomo Y por sua intensidade relativamente maior, e como células individuais baseadas na área (uma dupla de células terá uma intensidade maior e/ou uma área maior). O laser matador é acionado para disparar em qualquer evento para o qual os dados do evento produzem um resultado que caia fora de uma determinada região no gráfico (ou seja, a região que contém as células de esperma portadoras de cromossomo X). Os limites desta região no gráfico são a porta.
Em iterações anteriores do sistema, um operador de software criou um portal clicando em locais no gráfico de alta intensidade.
O polígono descrevendo a porta foi criado por vértices sequencialmente selecionados até que o polígono fosse concluído.
Se o polígono foi descrito com sucesso (ou seja, compreendeu pelo menos três vértices) as coordenadas dos vértices da porta foram enviadas para a GPP e de lá para o DSP, para controlar o laser matador de tal forma que o laser matador foi acionado por um evento que foi detectado como caindo fora da porta.
Observou-se que diferentes operadores desenharam portas de diferentes formas, resultando em uma quantidade desconhecida de variabilidade em resultados específicos desejados, seja aumento da pureza ou aumento da produção de amostras de sêmen sexual. Além disso, trabalhos anteriores demonstraram que uma porta que atribui uma subpopulação no início de uma corrida pode não atribuir a mesma população no final da corrida, potencialmente devido a vários fatores. Assim, havia três questões nos sistemas anteriores que precisavam ser resolvidas: falta de controle sobre a forma e localização da criação de porta, levando à inconsistência do produto e condições de coleta sub-ótima; centralização inadequada da porta ao redor do pico feminino como derivação de atributos de evento durante a coleta; e atendimento por um operador para estabelecer e manter o ajuste da porta para a população de células de espermatozoides portadoras de cromossomo x. Para resolver esses problemas, um algoritmo foi desenvolvido para definir os vértices da porta para desenhar a porta com base na relação conhecida entre a relação conhecida entre a população de células de espermatozoides portadoras de cromossomo x e a população de células de esperma do cromossomo Y. Especificamente, ao compilar os eventos, os vértices da porta foram determinados a partir da distribuição dos eventos pelo uso de um algoritmo para realizar a operação seguinte. No desempenho do algoritmo, o sistema utiliza um conjunto de parâmetros que inclui: a frequência do cálculo da porta e o número máximo de eventos cujos dados serão usados diretamente para um cálculo de porta; o limiar de pico para vale (P2T) e as configurações para calcular os vértices da porta. O algoritmo é realizado da seguinte forma:
1. Acumular eventos – adicionado ao registro um de cada vez a partir de uma fonte externa (o citômetro), chamando função estática, que por sua vez chama função de membro público. A frequência do cálculo da porta e o número máximo de eventos cujos dados serão usados diretamente para um cálculo de porta são obtidos a partir do conjunto de parâmetros.
a. Os eventos são armazenados em uma matriz. Se houver menos de um número padrão definido de eventos na matriz quando a função é chamada e o erro for retornado. b. A matriz de eventos acumulados é um buffer circular. O número de eventos atualmente no buffer, começando no índice zero, é inicializado em zero e incrementado a cada vez que um evento é registrado. Uma vez que o número de eventos atinge o tamanho do buffer, ele é incrementado mais longo, e novos eventos que são adicionados sobrepunham os eventos mais antigos. Uma segunda variável provida é o índice no qual o próximo evento será escrito. Também é inicializado em zero. c. Determinar se foram acumulados eventos suficientes para tentar calcular uma porta. Uma vez que eventos suficientes tenham sido acumulados, prosseguir com a porta de cálculo. d. Os eventos acumulados são copiados para uma matriz separada, e classificados em ordem ascendente por valores de pico, em seguida, por valores de área. A classificação ocorre criando uma matriz de ponteiros para os eventos. Salvar o valor médio das áreas de eventos a partir deste conjunto de dados. e. Há também a opção de adicionar vários eventos ao mesmo tempo, provendo uma variedade de Eventos. No entanto, essa não é uma função estática e o chamador precisaria chamá-la. O chamador determina se deve adicioná-los separadamente ou em buffers de vários eventos. f. Determinar se o caráter dos dados do evento mudou significativamente desde o último cálculo, comparando os valores medianos de intensidade e área com os valores medianos correspondentes do conjunto de dados para o último cálculo. Se o caráter dos dados do evento mudou significativamente, primeiro salvar, então limpar os dados relacionados às portas anteriores para que não afete a porta resultante do conjunto de dados atual.
2. Calcular a porta chamando o cálculo de função da porta. Os seguintes ocorrem nesta função:
a. Criar um histograma de valores de pico de eventos. A faixa de valores que são colocados em compartimentos de histograma é de 0 a 65535, e eles são classificados em 512 compartimentos de tamanho igual que cobrem coletivamente toda a faixa. O número de compartimentos é 512, com largura de cada compartimento sendo 128. b. Encontrar os picos mais altos do histograma e determinar quais, se houver, atendem ao critério por serem os picos masculino e feminino. Os três picos mais altos são encontrados e classificados em ordem por altura. Três, não dois, são identificados, para explicar uma situação em que um dos dois picos mais altos aparentes não é de fato um pico, mas sim um pico no lado dos picos feminino ou masculino.
1. Os índices no histograma dos locais de pico mais permitidos à esquerda e à direita são calculados. Esses índices são 25% da borda esquerda do histograma e 15% da borda direita do histograma.
2. Localizar os três picos mais altos dentro da região permitida pelo número do compartimento. Um "pico" é um compartimento de histograma para o qual os compartimentos tanto para a esquerda quanto para a direita têm um valor mais baixo. Se dois ou mais compartimentos adjacentes têm o mesmo valor e os compartimentos de ambos os lados são mais baixos, isso não é identificado atualmente como um pico e deve ser considerado um bug.
3. Classificar os números de compartimento dos picos de histograma localizados na etapa anterior, em ordem descendente por altura de compartimento (número de eventos em cada compartimento).
4. As porções do histograma que estão fora dos limites permitidos dos locais de pico mais permitidos à esquerda e à direita são verificadas para picos. Se algum pico for identificado fora dos limites permitidos, que é maior do que o segundo maior dos três picos mais altos encontrados dentro da faixa permitida, um erro é retornado, devido à exigência de que os picos masculino e feminino devem ser os dois picos mais altos, e devem estar dentro dos limites de corte nos lados esquerdo e direito.
5. Os picos masculino e feminino, se corretamente identificados, estarão sempre entre 2,8% e 4,8% de diferença. O algoritmo usa essas informações para processar os três picos mais altos e identificar quais são os picos masculino e feminino, se houver. Se apenas dois picos foram encontrados dentro do intervalo permitido, eles devem ser a distância correta à distância, caso contrário, sinalizar um erro de cálculo e esperar que um novo conjunto de dados de eventos esteja disponível.
6. Se três picos foram encontrados dentro da faixa permitida, a identificação de qual de dois picos próximos é um pico do outro é feita encontrando o ponto mais baixo entre eles, e então, afastando-se do ponto mais baixo em ambas as direções, encontrar o lugar do outro lado de cada um dos dois picos próximos que está na mesma altura que o vale. O lado que é mais largo é o pico "real", e o lado que é mais estreito é a "crista".
7. Se exatamente dois dos três picos mais altos são de 2,8% a 4,8% de diferença, esses dois são candidatos para os picos masculino e feminino. O terceiro pico é verificado para ver se é um pico de um dos outros dois em virtude de estar muito perto de um deles. Se é um pico, é ignorado. Se não for um pico e for maior do que qualquer um dos outros dois, marcar um erro de cálculo e aguardar que um novo conjunto de dados de eventos esteja disponível.
8. Se os três picos são igualmente espaçados e cerca de 3,8% de diferença, então i. Os picos de centro e direita são candidatos a picos masculinos e femininos, se o pico mais à esquerda for inferior a 2/3 a altura do pico mais à direita; ou ii. os picos de centro e esquerda são candidatos a picos masculinos e femininos, se o pico mais à direita for inferior a 2/3 a altura do pico mais à esquerda.
iii. Se nenhum (i) ou (ii) estiver satisfeito, um erro será retornado.
9. Se nenhum dos três picos mais altos estiver a cerca de 3,8% de distância, sinalizar um erro de cálculo e esperar que um novo conjunto de dados de eventos esteja disponível.
10. Depois que os candidatos para picos masculinos e femininos são escolhidos por qualquer um dos meios acima, eles são verificados duas vezes para confirmar que ou eles são os dois picos mais altos, ou o outro, pico mais alto é um pico de um dos outros dois. Se isso não for verdade, um erro é gerado. Caso contrário, o candidato atinge os picos masculino e feminino. c. Determinar os valores da coordenada x (intensidade) para os picos. Os valores exatos de pico de coordenada x são calculados para os picos de histograma masculino e feminino que foram identificados, para ser mais preciso do que seus identificadores de lixo.
1. O compartimento de histograma exato para o centro de cada pico é determinado aplicando um algoritmo de montagem de polígono de menor quadrado. Os picos no histograma são bastante afiados. Apenas alguns compartimentos são usados para calcular o centro do pico. Os compartimentos mais à esquerda e à direita para usar são determinados calculando a distância do pico até o vale entre os dois picos (em número de compartimentos de histograma) e usando essa distância do centro do pico em ambas as direções para determinar os limites dos compartimentos de pico de histograma alimentados no algoritmo de ajuste de curvas.
2. O grau de polinomial usado para o ajuste é definido como o número de compartimentos alimentadas no algoritmo. Após a instalação do polinomial, o algoritmo Newton-Raphson é aplicado para encontrar o valor "x" no qual a inclinação do polinomial é zero, nas proximidades do pico estimado, a uma precisão de pelo menos dentro de 1/65536. O resultado do algoritmo Newton-Raphson é usado como o centro do pico.
3. Se um NaN (não-um-número) ocorrer no processador de ponto flutuante enquanto faz o ajuste da curva polinomial, um erro é retornado, mas a execução prossegue. Se o algoritmo Newton-Raphson não identificar o centro do pico dentro de 1000 iterações (geralmente leva apenas cerca de dez iterações), um erro é retornado, mas a execução prossegue.
4. O valor máximo da coordenada x de cada pico é calculado como o compartimento de histograma exata para o centro de cada pico provido pelo algoritmo de encaixe polinomial multiplicado pela largura do compartimento de histograma.
5. O pico feminino é considerado o mais certo dos dois picos identificados, ou seja, é o pico com a maior coordenada x de pico de evento. d. Determinar o compartimento que contém o vale. A relação pico-para-vale (P2T) é calculada neste ponto, e comparada a um limiar P2T, de outra forma definido em um valor padrão de 1,2. Se a razão P2T no histograma for muito baixa, um erro será gerado.
1. Calcular a razão P2T como ((P1 + P2) / 2) / T, onde P1 e P2 são as contagens nos compartimentos de pico de histograma de intensidade masculina e feminina, respectivamente, e T é a contagem no compartimento.
2. Calcular o valor de dominância de pico como (P2-T) / (P1-T) e recuperar o valor do limiar de dominância máxima a partir do conjunto do parâmetro.
3. Comparar a razão P2T calculada com o valor do limiar P2T. Se a relação pico- vale for menor que o valor do limiar, sinalizar um erro e aguardar um novo conjunto de dados para estar disponível.
4. Compare o valor de dominância de pico calculado com o valor do limiar de dominância máxima. Se o valor de dominância de pico calculado for menor que o valor limite, marcar um erro e aguardar que um novo conjunto de dados esteja disponível. e. Determinar a altura do vale como a altura do histograma no ponto mais baixo entre os dois picos no histograma.
f. Para os picos masculino e feminino separadamente, criar um histograma de valores da área de eventos e encontrar o pico mais alto neste histograma de "área", e usá-lo para determinar os valores de coordenada y para o pico masculino ou feminino.
1. As coordenadas y dos pontos de pico masculino e feminino – onde os eventos são mais frequentes – são encontradas utilizando-se apenas os eventos cujos valores de pico do evento estão próximos dos valores calculados 'x', ou seja, eventos cujos valores máximos de eventos estão dentro de 0,3% de 65536 (a faixa de valores de pico do evento). A faixa de valores de pico de eventos cujos valores de área de evento são usados para encontrar a coordenada y do pico é de: peak_x - (65536*PEAK_WIDTH_PCT*0,01) para peak_x + (65536*PEAK_WIDTH_PCT*0,01).
2. Os valores da área do evento para eventos próximos ao pico masculino e para eventos próximos ao pico feminino são colocados em matrizes separadas. Ambas as matrizes de valores de "área" são classificadas em ordem ascendente.
3. Criar histogramas dos valores da área para picos masculinos e femininos separadamente. i. A largura do compartimento para este histograma é calculada, não predefinida, usando as seguintes etapas: • calcular o número igual a 75% do número de valores de área para o pico (numValuesIn75pct); • calcular o número igual a 99% do número de valores de área para o pico (largestRetainedIndex); • ignorar valores de área cujo valor é maior do que o 99º percentil de todos os valores da área, que é determinado a partir do largestRetainedIndex; • identificar o valor da área que está no 99º percentil (largestRetainedArea); • encontrar o valor da área que marca o 75º percentil dos valores da área, utilizando numValuesIn75pct (lowest75pctMax);
• encontrar o menor valor de área na matriz de valores de área ordenados a partir de eventos próximos ao pico (lowest75pctMin); • calcular a faixa de valores de área nos 75% mais baixos dos valores de área (areaRange; = lowest75pctMax – lowest75pctMin); • calcular a largura do compartimento como areaRange /512 (areaBinWidth); • calcular o número de compartimentos como (largestRetainedArea / areaBinWidth) + 1 (numberOfAreaBins); • Se o número de valores de área sendo compartimentados for inferior a 6 vezes o número de compartimentos recém calculado, numberOfAreaBins = (largestRetainedIndex / 6) + 1; se (numberOfAreaBins < 4), numberOfAreaBins = 4; areaBinWidth = largestRetainedArea / (numberOfAreaBins – 1) ii.
Depois que os histogramas dos valores de área foram criados com o número calculado de compartimentos e largura do compartimento, os valores do histograma são suavizados usando uma faixa de 15 compartimentos centrados em torno de cada valor de compartimento suavizado. iii.
Encontrar o maior valor no histograma de área. iv.
Determinar a faixa de compartimentos de área para submeter-se ao algoritmo de ajuste de curvas de menor quadrado. • A contagem de compartimentos de área que é de 20% da contagem máxima de compartimentos de área (20% da área de "pico") é calculada • Movendo-se para a esquerda do pico máximo de histograma em direção a compartimentos de áreas menores, o primeiro compartimento cuja contagem é inferior a 20% da contagem máxima de compartimento é encontrado.
Isso marca o compartimento mais à esquerda submetido ao algoritmo de ajuste de curvas. • O mesmo é feito movendo-se para a direita a partir do máximo do histograma, para encontrar o compartimento mais direito submetido ao algoritmo de ajuste de curva v. Os histogramas da área são submetidos ao algoritmo de ajuste de curvas polinomial de menor quadrado e, em seguida, o algoritmo Newton-Raphson para obter um valor de área mais preciso que é usado para a coordenada 'y' de cada pico nas mesmas unidades da área de eventos • Se um erro for gerado ao encontrar o valor da coordenada 'y', não cair de volta ao ponto mais alto. Os dados são muito escassos e até mesmo o histograma suavizado é muito impreciso para poder contar com o compartimento de "área" mais alto como o pico. Se nenhum 'y' bom pode ser gerado a partir do ajuste de curva polinomial de menor quadrado, um erro é gerado e o cálculo da porta é abortado. g. Calcular os valores para as coordenadas de intensidade de pico feminino e masculino e a intensidade do vale que foram ajustadas para derivação na eletrônica ocorrida desde que o conjunto de dados do evento foi processado a partir dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar média apenas dos valores disponíveis.
1. Criar uma variável de contador de dados de eventos e inicializar em zero.
2. Cada vez que um novo conjunto de dados de eventos é processado, incrementar o contador. Incrementar o contador se um erro é sinalizado enquanto os dados estão sendo processados ou não, e se uma alteração no caráter dos dados do evento é detectada na etapa 8 ou não.
3. Quando um valor a ser mediado com valores análogos dos conjuntos de dados subsequentes é salvo para uso futuro, salvar o valor do contador de dados associado ao conjunto de dados que resultou na produção do valor.
4. Calcular uma taxa média de derivação na variável X durante o período de tempo abrangido pelo processamento de vários conjuntos de dados subtraindo o valor economizado mais antigo disponível de X do valor mais recente de X para obter DELTA_X, e subtrair o valor do contador de dados associado ao valor mais antigo do contador associado ao valor mais recentemente armazenado para obter DELTA_T; e, em seguida, calcular DELTA_X / DELTA_T como a derivação média.
5. Para calcular o ajuste total de derivação para uma instância específica registrada de uma variável, multiplicar a taxa média de derivação para a variável obtida da etapa D pelo número de períodos de tempo (ou seja, o número de conjuntos de dados de eventos apresentados) que se passaram desde que o valor foi registrado. O produto da multiplicação representa o ajuste de derivação. Adicionar o ajuste de derivação ao valor registrado anteriormente para obter um valor corrigido por derivação.
6. Calcular a distância de intensidade de pico para vale, encontrando a diferença entre a intensidade do vale e a intensidade máxima do pico em relação ao qual a porta é desenhada.
7. Gerar uma distância média de intensidade de pico para vale, com uma média da distância de intensidade de pico para vale da etapa anterior, com as distâncias de intensidade de pico para vale dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar média apenas dos valores disponíveis. h. Calcular a coordenada x de vale do compartimento. Calcule a coordenada do vale para que o ponto de vale esteja em uma linha desenhada através dos picos masculino e feminino (x, y). Com as coordenadas (x, y) dos picos masculino e feminino identificados, e com a coordenada 'x' do vale entre eles identificada, a coordenada 'y' do ponto de vale é calculada como estando em uma linha que passa por pontos de pico masculino e feminino. Esta linha é o eixo para a porta. i. Usar coordenadas de pico masculino e feminino e coordenadas do vale, calcular os vértices da porta. A porta é orientada ao longo da linha do eixo traçada entre coordenadas masculinas e femininas.
1. Obter o valor de encroachmentPct a partir do conjunto de parâmetros. Dividir por 100,0 e subtrair o resultado de 1,0 para obter o 'encroachmentMultiplier' usado nas etapas subsequentes.
2. Gerar encroachmentAdjustment multiplicando a distância média de intensidade de pico para vale pelo encroachmentMultiplier.
3. Calcular a intensidade da invasão. Dois vértices estão em uma linha vertical desenhada através da intensidade da invasão. i. Se a porta está sendo criada em relação ao pico masculino, a intensidade da invasão é a intensidade média do pico masculino mais o encroachmentAdjustment. Para o pico masculino, a intensidade da invasão é a coordenada de intensidade do vértice ou vértices da porta que são mais distantes à direita no eixo de intensidade no plano (intensidade, área). ii. Se a porta está sendo criada em relação ao pico feminino, a intensidade da invasão é a intensidade média do pico feminino menos o encroachmentAdjustment. Para o pico feminino, a intensidade da invasão é a coordenada de intensidade do vértice ou vértices da porta que são mais distantes à esquerda no eixo de intensidade no plano (intensidade, área).
4. Recuperar o valor peakFalloffPct do conjunto de parâmetros. Este é um valor decimal na faixa 0,0 a 100,0. Atualmente 65,0 é usado, mas algum outro valor pode eventualmente ser determinado para ser melhor. Dividir o peakFalloffPct por 100,0, em seguida, multiplicar pela altura do compartimento mais alto no pico relevante no histograma de intensidade (etapa 10). O pico relevante é o pico de intensidade masculina ou o pico de intensidade feminina, dependendo do pico que a porta está sendo calculada em relação a. Chamar o produto da multiplicação de 'falloffValue' para fins desta descrição do processo.
5. Calcular a intensidade de queda: Começar com o compartimento de histograma de maior intensidade no pico relevante, afastar do compartimento de vale da etapa 23 até que a altura do compartimento atualmente examinada seja menor ou igual a falloffValue. Calcular o valor de intensidade correspondente ao centro deste compartimento como [índice de compartimento + 0,5] x [largura do compartimento].
6. Calcular a intensidade média de queda, com a média da intensidade de queda da etapa anterior com as intensidades de queda dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar média apenas dos valores disponíveis.
7. Tomar a intensidade média de queda como o valor inicial para a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) dos dois vértices de porta que estão mais distantes à direita em uma porta desenhada em relação ao pico feminino, ou mais à esquerda em uma porta desenhada em relação ao pico masculino.
8. Calcular a distância de extensão recuperando o valor 'octExtension' do conjunto de parâmetros e multiplicar pela distância média de intensidade de pico para vale. O valor octExtension é um valor decimal maior que 0,0. Um valor padrão 0,6 é usado, mas isso pode ser alterado conforme necessário. i. Se a porta estiver sendo desenhada em relação ao pico masculino, subtrair a distância de extensão do valor de intensidade de queda mediano calculado. Usar o resultado como o valor final para a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) dos dois vértices de porta que estão mais distantes à esquerda em uma porta desenhada em relação ao pico masculino. ii. Se a porta estiver sendo desenhada em relação ao pico feminino, adicionar a distância de extensão ao valor inicial. Usar o resultado como o valor final para a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) dos dois vértices de porta que estão mais distantes à direita em uma porta desenhada em relação ao pico feminino.
9. Calcular a média da intensidade da invasão e a intensidade média do pico feminino, para uma porta desenhada em relação ao pico feminino, ou a intensidade média do pico masculino, para uma porta desenhada em relação ao pico masculino.
10. Recuperar o valor 'horizAdjMultiplier1' do conjunto de parâmetros e multiplicar pela distância média de intensidade de pico para vale. Adicionar o produto à média do valor de intensidade de invasão calculado na etapa anterior.
i. Para uma porta relativo ao pico feminino, o resultado é usado como a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) para dois vértices em uma linha vertical que é à direita da intensidade de invasão. ii. Para uma porta em relação ao pico masculino, a linha é à esquerda da intensidade da invasão. O valor de 0,0 é atualmente usado para horizAdjMultiplier1, mas isso pode ser alterado.
11. Calcular a média da intensidade média de queda e a intensidade média do pico feminino, para uma porta desenhada em relação ao pico feminino, ou a intensidade média do pico masculino, para uma porta desenhada em relação ao pico masculino.
12. Recuperar o valor 'horizAdjMultiplier2' do conjunto de parâmetros. Multiplicar pela média da intensidade de pico para vale. Adicionar o produto ao valor calculado na etapa anterior. i. Para uma porta relativa ao pico feminino, o resultado é usado como a coordenada de intensidade no plano (intensidade, área) para dois vértices em uma linha vertical que é à direita da linha calculada na etapa 10 e à esquerda de uma linha desenhada através da intensidade de queda. ii. Para uma porta relativa ao pico masculino, a linha é à esquerda da linha calculada na etapa 10 e à direita de uma linha desenhada através da intensidade de queda. O valor de 0,0 é atualmente usado para horizAdjMultiplier2, mas isso pode ser alterado.
13. Calcular a distância da área de pico para vale como a diferença entre a coordenada do vale 'área' e a coordenada da área de pico do pico em relação ao qual a porta é desenhada.
14. Calcular a distância média da área de pico para vale, com uma média da distância de área de pico para vale da etapa anterior com as distâncias de área de pico para vale dos últimos trinta conjuntos de dados de eventos. Se houver menos de trinta valores anteriores disponíveis, tirar média apenas dos valores disponíveis.
15. Calcular o ponto de intersecção (intensidade, área) onde o eixo e a linha vertical da etapa 10 se cruzam e encontram os vértices acima e abaixo do eixo que caem nesta linha. i. Calcular a coordenada "área" do vértice na linha vertical e acima do eixo, recuperando o valor de "areaAboveMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicar pela distância média de área de pico para vale da etapa 14, e adicionar o resultado à coordenada de área do ponto de intersecção. ii. Calcular a coordenada "área" do vértice na linha da etapa 10, que está abaixo do eixo, recuperando o valor da "areaBelowMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicar pela distância média de área de pico para vale da etapa 14, e subtrair o resultado da coordenada de área do ponto de intersecção.
16. Localizar os dois vértices em uma linha vertical desenhada através do ponto de invasão, um acima da linha do eixo e outro abaixo dele. Calcular o ponto onde a linha vertical na intensidade da invasão e a linha do eixo se cruzam; chamar esse ponto de "ponto de invasão" para fins desta descrição do processo. i. Calcular a coordenada 'área' do vértice com a intensidade de invasão e acima da linha do eixo, recuperando o valor do conjunto de parâmetros de aboveHeightPctLeft do conjunto de parâmetros, dividir por 100,0, e multiplicar o pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 15 até a linha do eixo; em seguida, adicionar esse valor à coordenada "área" do ponto de invasão. ii. A partir do ponto em que a linha vertical na intensidade de invasão e a linha de eixo se cruzam, computar o vértice que está na linha vertical na intensidade de invasão, mas abaixo da linha do eixo, recuperar o valor do conjunto de parâmetros de belowHeightPctLeft do conjunto de parâmetros, dividir por 100,0 e multiplicar pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 15 até a linha do eixo; em seguida, subtrair esse valor do valor da área do ponto de invasão. Essa é a coordenada "área" do ponto.
17. Localizar os dois vértices que estão na linha vertical que tem a intensidade computada na etapa 12. Calcular o ponto de intersecção (intensidade, área) onde o eixo e a linha vertical da etapa 12 se cruzam. i. Calcular a coordenada "área" do vértice na linha e acima do eixo, recuperar o valor de "areaAboveMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicar pela distância média de área de pico para vale da etapa 14, e adicionar o resultado à coordenada de área do ponto de intersecção. ii. Calcular a coordenada de "área" do vértice na linha da etapa 12, que está abaixo do eixo, recuperando o valor da "areaBelowMultiplier" do conjunto de parâmetros e multiplicando pela distância média de área de pico para vale da etapa 14, e subtraindo o resultado da coordenada de área do ponto de intersecção computada para o vértice na linha e acima do eixo.
18. Localizar os dois vértices estão em uma linha vertical desenhada através da intensidade de queda, uma acima da linha do eixo e outra abaixo dela. Calcular o ponto de queda como o ponto onde a linha vertical na intensidade de queda e a linha de eixo se cruzam. i. Computar a coordenada 'área' do vértice com a intensidade de queda e acima da linha do eixo recuperando o valor de aboveHeightPCTRight do conjunto de parâmetros acima, dividindo por 100,0, e multiplicando pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 17 até a linha do eixo; em seguida, adicionar esse valor à coordenada 'área' do ponto de queda. ii. Partindo do ponto de queda com a intensidade de queda e acima do eixo, computar o vértice do qual está na linha vertical na intensidade de queda, mas abaixo da linha do eixo, recuperando o valor de belowHeightPctRight do conjunto de parâmetros, dividindo por 100,0 e multiplicando pelo comprimento do segmento de linha vertical do vértice computado na etapa 17 até a linha do eixo; em seguida, subtrair esse valor do valor da área do ponto de queda. Essa é a coordenada "área" do ponto abaixo do eixo.
A sexagem de células de esperma bovino usando sistema de porta otimizado programado Um citômetro de sexagem de sêmen de ablação a laser foi adaptado para implementar a estratégia de classificação otimizada estabelecida no exemplo acima.
Sêmen de um touro Holstein de 2 anos de idade foi coletado e preparado de acordo com o procedimento padrão.
Resumidamente, o sêmen coletado foi avaliado para motilidade e presença de anormalidades, e verificado para atender aos padrões de processamento.
A concentração celular foi então determinada, e a amostra foi manchada com Hoechst 33342 a 34°C por 45 minutos antes da sexagem.
O instrumento de sexagem inclui um controlador de fluxo para a entrega das células de esperma manchadas e fluido de baia em um chip de microfluido.
A detecção de células de esperma é realizada usando um laser Vanguard™ 355 (Spectra-Physics®), e a fluorescência é detectada usando um fotodiodo de avalanche.
Células de esperma portadoras de cromossomo Y indesejados são abladas usando um laser Explorer XP lasers Q-switch laser (Spectra-Physics®). Células de sêmen manchadas foram processadas durante aproximadamente 9 horas.
A discriminação das células de espermatozoides portadoras de X e Y foi realizada utilizando-se uma estratégia otimizada de porta de acordo com uma modalidade da presente invenção, conforme detalhado no exemplo acima.
Após a triagem, a amostra coletada produziu aproximadamente 51,46 milhões de células de espermatozoides.
Durante a operação, os valores dos diversos parâmetros de porta foram monitorados para observar o funcionamento do sistema de porta.
Foram comparadas porções extraídas dos histogramas de valores de intensidade gerados a partir de eventos em dois pontos de tempo com dez minutos de intervalo durante uma única amostra.
Curvas foram montadas para os picos, bem como para o vale; a análise matemática das curvas instaladas produz os valores de compartimento de pico e vale mais precisos mostrados acima de cada gráfico.
Os valores precisos de pico e vale foram convertidos em valores de intensidade reais multiplicando-se pelo tamanho do compartimento, que é de 128. Assim, por exemplo, a intensidade de pico masculino no histograma à esquerda é de 223,06 x 128,0 = 28551,68.
A comparação dos valores de intensidade para os picos nos dois pontos de tempo diferentes mostra uma mudança significativa na intensidade do pico feminino de 29625 a 29386 (239 unidades de intensidade, ou cerca de 0,81%) por dez minutos.
O vale também muda de 29101 para 28832 (269 unidades de intensidade). A porta deve deslocar uma quantidade semelhante para manter a relação correta com a localização do pico feminino.
Uma vez que uma porta deve ser construída em torno do pico feminino, histogramas semelhantes são construídos programaticamente para os valores de "área" de todos os eventos cujas intensidades estão próximas das intensidades de pico feminino.
Esses histogramas só mostram um pico.
Os histogramas analisados dos valores da 'área' colocaram os picos da área feminina em 4972333 no primeiro ponto e em 4952019 no segundo ponto de tempo.
Todas as coordenadas de intensidade da porta desviam para a esquerda (inferior) ao longo dos dez minutos entre os dois pontos de tempo.
As coordenadas de intensidade dos vértices da porta no primeiro ponto de tempo têm a média de 29735,28. A média correspondente no segundo ponto de tempo (10 minutos depois) é de 29465,78. Isso corresponde a uma mudança média para baixo de 269,5 unidades de intensidade.
Isso se compara favoravelmente com a mudança para baixo da intensidade do pico feminino de 239 unidades de intensidade, e da intensidade no deslocamento do vale para baixo de 269 unidades de intensidade.
A porta mudou para a esquerda para manter a relação com o pico feminino.
A coordenada da área do pico feminino também muda para baixo durante os dez minutos.
Todas as coordenadas da área da porta para os vértices se deslocam para baixo da mesma forma.
As diferenças entre as quantidades precisas de mudanças nas coordenadas de pico instantâneo versus coordenadas do vértice da porta são principalmente devido ao uso da distância de vale-para-pico-feminino no cálculo dos vértices.
Uma vez que o pico do vale e feminino são entidades estatísticas independentes, as coordenadas do vértice podem mostrar uma mudança ligeiramente diferente entre dois pontos de tempo do que o pico feminino, embora as mudanças médias de coordenadas de vértices e coordenadas de pico ao longo do tempo sejam iguais.
Será entendido pelos versados na técnica que diversas mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem se afastar do escopo das novas técnicas divulgadas nesta invenção.
Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma determinada situação ou material aos ensinamentos das novas técnicas sem se afastar de seu escopo.
Portanto, pretende-se que as novas técnicas não se limitem às técnicas particulares divulgadas, mas que incluam todas as técnicas que se enquadram no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para identificar subpopulações dentro de uma mistura de partículas, compreendendo: medir uma característica de um primeiro conjunto de partículas em uma mistura de partículas com duas ou mais subpopulações, cada subpopulação sendo distinguida pela característica; distinguir os valores das características medidas para cada uma das subpopulações na mistura; atribuir uma faixa crítica de valores a cada uma das subpopulações com base na distinção; subsequente à atribuição de uma faixa crítica de valores, medir as características de um segundo conjunto de partículas na mistura de partículas; subsequente à medição das características de um segundo conjunto de partículas na mistura de partículas, distinguir os valores das características medidas para cada uma das subpopulações no segundo conjunto de partículas; atualizar a faixa crítica de valores com base na distinção dos valores das características medidas para cada uma das subpopulações no segundo conjunto de partículas; e atribuir uma classificação de subpopulação a partículas na mistura com base na faixa crítica atualizada de valores.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda a triagem dessas partículas de acordo com a classificação atribuída às partículas com base na faixa crítica atualizada de valores.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda destruir ou incapacitar a subpopulação atribuída à classificação.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que as partículas são células de espermatozoides.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que as células de espermatozoides são células de esperma bovino.
6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que a característica das células de espermatozoides é a presença de um cromossomo X ou um cromossomo Y.
7. Método de acordo com as reivindicações 4 a 6, em que as células de esperma foram manchadas com um corante fluorescente de ligação de DNA.
8. Método para identificar múltiplos conjuntos de partículas dentro de uma mistura de conjuntos de partículas, cada subpopulação com uma característica diferente de outras subpopulações, que compreende: prover a mistura de partículas; detectar uma característica de um primeiro conjunto de partículas múltiplas dentro da mistura para produzir um sinal indicativo da característica para o primeiro conjunto de partículas; gerar dados de eventos para o sinal indicativo da característica para o referido primeiro conjunto de partículas; compilar os dados do evento para o primeiro conjunto de partículas; gerar uma distribuição de dados de eventos para o primeiro conjunto de partículas; calcular pelo menos um valor de discriminação que define uma subpopulação de partículas com base na distribuição de dados de eventos para o primeiro conjunto de partículas; classificar partículas com base no valor de discriminação que define a subpopulação.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, que compreende ainda instruir um aparelho de triagem para incluir ou excluir eventos com base na classificação.
10. Método de acordo com a reivindicação 8, que compreende ainda destruir ou incapacitar a subpopulação atribuída à classificação.
11. Método de acordo com as reivindicações 8 a 10, em que partículas são células de espermatozoides.
12. Método de acordo com as reivindicações 8 a 11, em que as células de espermatozoides são células de esperma bovino.
13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que a característica das referidas células de espermatozoides é a presença de um cromossomo X ou um cromossomo Y.
14. Método de acordo com as reivindicações 11 a 13, em que as células de esperma são rotuladas com um corante fluorescente de ligação de DNA.
15. Método de acordo com as reivindicações 7 a 14, em que o cálculo de pelo menos um valor de discriminação compreende a definição de pelo menos um valor crítico relacionado a uma característica detectada.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o cálculo de pelo menos um valor de discriminação compreende ainda: identificar pelo menos um valor crítico para uma primeira característica a partir da distribuição de dados de eventos para o primeiro conjunto de partículas; obter os valores para uma segunda característica associada ao valor crítico para a primeira característica; produzir uma distribuição dos valores para a segunda característica; identificar pelo menos um valor crítico para a segunda característica a partir da distribuição de valores para a segunda característica; colocalizar os valores críticos para a primeira e segunda características em um espaço de características; e determinar os valores de discriminação de pelo menos um dos valores críticos colocalizados no espaço de características.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o cálculo de pelo menos um valor de discriminação compreende ainda o ajuste dos valores críticos para incluir dados de eventos de um segundo conjunto de partículas.
18. Método de acordo com as reivindicações 8 a 17, em que os valores críticos compreendem um ou mais valores característicos de pico para uma primeira subpopulação, e um ou mais valores característicos de pico para uma segunda subpopulação.
19. Método de acordo com a reivindicação 18 em que os valores característicos de pico compreendem a intensidade de fluorescência máxima e o pico de fluorescência total.
20. Método de acordo com as reivindicações 18 e 19, em que os valores críticos, segundo os valores críticos, compreendem ainda um valor de vale entre os valores característicos do pico para a primeira e segunda subpopulações.
21. Método de acordo com as reivindicações 7 a 20, em que o valor da discriminação compreende uma porta.
22. Amostra de células sexuadas de esperma produzida por qualquer um dos métodos conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
23. Sistema para a produção de uma amostra de espermatozoides sexuados, que compreende: um aparelho de entrega de amostras para a entrega de uma mistura de células de espermatozoides; um aparelho de citometria de fluxo, um controle configurado para: distinguir os valores das características medidas para cada subpopulação na mistura de células de espermatozoides, atribuir uma faixa crítica de valores a cada uma das subpopulações com base na distinção, atualizar a faixa crítica de valores com base na distinção dos valores das características medidas para subpopulações em um segundo conjunto de partículas, e atribuir uma classificação de subpopulação a partículas na mistura com base na faixa crítica atualizada de valores; e um aparelho de classificação.
24. Sistema de acordo com a reivindicação 20, em que o aparelho de triagem compreende um aparelho de matar a laser.
BR112021012000-9A 2018-12-21 Método para identificar subpopulações e múltiplos conjuntos de partículas dentro de uma mistura de partículas, amostra de células sexuadas de esperma e sistema para a produção de uma amostra de espermatozoides sexuados BR112021012000B1 (pt)

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