BR112020000896A2

BR112020000896A2 - método e sistema que incorporam os elementos ópticos de modelagem do feixe e a estabilização do feixe.

Info

Publication number: BR112020000896A2
Application number: BR112020000896-6A
Authority: BR
Inventors: Kenneth Michael Evans
Original assignee: Inguran, Llc
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2020-07-21
Also published as: RU2020107243A; AU2018302191B2; IL271178A; MX2023010116A; WO2019018609A1; AU2018302191A1; US11105744B2; NZ760907A; AU2021203880B2; CN110945343B; CA3068874A1; US20210389246A1; EP3655754A1; CN110945343A; US20190025212A1; RU2020107243A3; AR112611A1; AU2021203880A1

Abstract

Esta divulgação refere-se a instrumentos analíticos e métodos relacionados que incorporam elementos ópticos de modelagem do feixe para diferenciar sinais muito brilhantes e diretamente relacionados a uma ampla gama de condições operacionais com um desempenho aprimorado e uniforme.

Description

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RELATÓRIO DESCRITIVO Pedido de Patente de Invenção para “MÉTODO E SISTEMA QUE

INCORPORAM OS ELEMENTOS ÓPTICOS DE MODELAGEM DO FEIXE E A ESTABILIZAÇÃO DO FEIXE” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A tecnologia desta divulgação refere-se geralmente a métodos e sistemas para analisar e/ou ordenar partículas e, mais particularmente, a tais métodos e sistemas que incorporam elementos ópticos de modelagem do feixe aprimorada e estabilização do feixe para uso na análise e/ou ordenamento de espermatozoides.

FUNDAMENTOS

[002] Um instrumento analítico, tal como um citômetro de fluxo, pode ser usado para ordenar uma variedade de células ou partículas com base em características detectáveis. Em uma aplicação especializada, tais citômetros de fluxo foram modificados para diferenciar espermatozoides manchados em uma ou mais subpopulações enriquecidas, como subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X ou Y com base em pequenas variações no DNA cromossômico.

[003] Uma modificação necessária para renderizar um citômetro de fluxo adequado para analisar e/ou ordenar subsequentemente o espermatozoide com base em pequenas variações no conteúdo do DNA, é que os elementos ópticos de modelagem do feixe são adaptados para produzir um ponto de feixe elíptico. No entanto, modificações anteriores falham em obter uma resolução estável em uma variedade de potências de laser ou em uma variedade de velocidades de transferência. De fato, existem deficiências não identificadas anteriormente com os elementos ópticos de modelagem do feixe atual empregada no ordenamento comercial de sexo com citômetros de fluxo.

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[004] Por conseguinte, existe uma necessidade de empregar elementos ópticos de modelagem do feixe em instrumentos analíticos, incluindo citômetros de fluxo que atingem um perfil de feixe capaz de alcançar alta resolução em uma variedade de potências de feixe e taxas de evento.

SUMÁRIO

[005] Um objetivo amplo da presente divulgação é fornecer um sistema analítico com desempenho aprimorado em várias condições operacionais variadas, em particular com o objetivo de diferenciar sinais muito brilhantes e intimamente relacionados. A fim de atingir tais objetivos amplos, a presente invenção refere-se amplamente a instrumentos analíticos que incorporam elementos ópticos de modelagem do feixe com certas propriedades.

[006] Certas modalidades se referem a um instrumento analítico para espermatozoides com um canal de fluxo que recebe um fluido de revestimento (sheath fluid) e um fluido de amostra com pelo menos um espermatozoide a ser analisado e que cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido com uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento. O instrumento analítico também inclui um laser que produz um feixe de laser e elementos ópticos de modelagem do feixe que modelam o feixe de laser para ter uma largura de feixe e uma altura de feixe em um local de interrogação. Os elementos ópticos de modelagem do feixe modelam o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local de interrogação e combina substancialmente com a uma porção do centro da largura do feixe com uma largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser. O instrumento analítico também inclui um caminho de feixe ao longo do qual o feixe de laser atravessa o laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe, pelo menos um detector que gera um sinal em resposta à radiação

3 / 87 eletromagnética do local de interrogação e um analisador que recebe o sinal de pelo menos um detector.

[007] Certas modalidades se referem a um instrumento analítico para espermatozoides com um canal de fluxo que recebe um fluido de revestimento e um fluido de amostra com pelo menos um espermatozoide a ser analisado e que cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido com uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento. Tais instrumentos analíticos também incluem um laser que produz um feixe de laser e elementos ópticos de modelagem do feixe que modelam o feixe de laser para ter uma altura e largura de feixe. A largura do feixe de laser modelado ou modificado estando numa faixa entre cerca de 130 μm e cerca de 70 μm e possui uma razão entre a largura do feixe e a altura do feixe entre 7:1 e 3:1 em um local de interrogação. Os elementos ópticos de modelagem do feixe podem ser configurados para modelar o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local de interrogação. O instrumento analítico também inclui um caminho de feixe ao longo do qual o feixe de laser atravessa o laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe, pelo menos um detector que gera um sinal em resposta à radiação eletromagnética do local de interrogação e um analisador que recebe o sinal de pelo menos um detector.

[008] Uma modalidade refere-se a um método de geração de uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis. Tal método pode incluir a etapa de criar um fluxo coaxial de uma corrente de fluido, em que o fluxo coaxial é formado a partir de uma corrente de núcleo interna de um fluido de amostra com diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial e uma corrente externa de um fluido de revestimento. Tal método pode ainda incluir as etapas de modificação de um feixe de laser de um laser para um padrão de feixe de laser tendo uma altura e uma largura de feixe, combinando substancialmente

4 / 87 com uma largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser a uma porção do centro da largura do feixe, interrogando o espermatozoide na corrente de núcleo com o padrão de feixe de laser, detectando uma resposta à interrogação do espermatozoide, gerando pelo menos um sinal com base na resposta detectada e ordenando uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide com base em pelo menos um sinal.

[009] Outra modalidade refere-se a um método de geração de uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis. Tal método pode incluir a etapa de criar um fluxo coaxial de uma corrente de fluido, em que o fluxo coaxial é formado a partir de uma corrente de núcleo interna de um fluido de amostra e uma corrente externa de um fluido de revestimento. O método pode ainda incluir a modificação de um feixe de laser em um padrão de feixe de laser com uma largura de feixe na faixa de cerca de 130 μm a cerca de 70 μm e tendo uma razão de largura de feixe para altura do feixe entre 7:1 e 3:1. Tal método pode ainda incluir as etapas de interrogar o espermatozoide na corrente de núcleo com o padrão de feixe de laser, detectar uma resposta à interrogação do espermatozoide, gerar pelo menos um sinal com base na resposta detectada e ordenar uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide com base em pelo menos um sinal.

[010] Ainda outra modalidade se refere a um instrumento analítico multicanal. Tal instrumento pode incluir dois ou mais canais de fluxo, cada canal de fluxo recebendo um fluido de revestimento e um fluido de amostra tendo pelo menos um espermatozoide a ser analisado que cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido tendo uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento. O instrumento analítico multicanal também pode incluir um laser associado a cada canal de fluxo e elementos ópticos de modelagem do feixe associada a cada canal de fluxo. Os elementos ópticos de modelagem do feixe podem

5 / 87 produzir uma forma uniforme de feixe do laser associado ao canal de fluxo e fornecer uma forma uniforme de feixe em cada canal de fluxo e desempenho substancialmente idêntico em cada canal de fluxo. O instrumento analítico também pode incluir um caminho de feixe de cada laser para o canal de fluxo associado, onde não há sobreposição nos caminhos de feixe, bem como pelo menos um detector que gera um sinal em resposta ao pelo menos um espermatozoide e um analisador interrogados que recebe o sinal de pelo menos um detector.

[011] Modalidades adicionais referem-se a um método para gerar uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoide viável. Tal método pode empregar, por exemplo, primeiro e segundo fluxos coaxiais de uma corrente de fluido, primeira e segunda correntes de núcleo internas, primeira e segunda correntes externas, primeiro e segundo feixes de laser gerados ao longo do primeiro e segundo caminhos de feixe de laser que não se sobrepõem. Em tais modalidades, o método inclui modificar o primeiro feixe de laser e o segundo feixe de laser para que cada um tenha uma altura e largura de feixe, interrogando o espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna com o primeiro feixe modificado e interrogando o espermatozoide na segunda corrente de núcleo interna com o segundo feixe de laser modificado, detectando uma resposta à interrogação do espermatozoide com o primeiro feixe modificado e detectando uma resposta à interrogação do espermatozoide com o segundo feixe de laser modificado, gerando pelo menos um primeiro sinal com base na resposta detectada à interrogação do espermatozoide com o primeiro laser modificado e gerando pelo menos um segundo sinal com base na resposta detectada à interrogação do espermatozoide com o segundo feixe de laser modificado e classificando uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna baseada em pelo menos um primeiro sinal e ordenando uma característica de diferenciação sexual do

6 / 87 espermatozoide na segunda corrente de núcleo interna com base em pelo menos um segundo sinal.

[012] Ainda outra modalidade refere-se a um instrumento analítico para espermatozoides, incluindo um canal de fluxo que recebe um fluido de revestimento e um fluido de amostra com pelo menos um espermatozoide a ser analisado e que cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido com uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento, bem como um laser que produz um feixe de laser. Tal modalidade pode também incluir elementos ópticos de modelagem do feixe que modelam o feixe de laser para ter uma largura e altura de feixe em um local de interrogação, onde os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecem desempenho substancialmente semelhante em taxas de evento entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo. O método pode ainda incluir um caminho de feixe ao longo do qual o feixe de laser atravessa o laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe, pelo menos um detector que gera um sinal em resposta à radiação eletromagnética do local de interrogação e um analisador que recebe o sinal de pelo menos um detector.

[013] Outra modalidade refere-se a um método de gerar uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis que inclui a etapa de criar um fluxo coaxial de uma corrente de fluido com uma corrente de núcleo interna de um fluido de amostra com diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial e uma corrente externa de um fluido de revestimento. Esse método também pode incluir a etapa de modificar um feixe de laser em um padrão de feixe de laser que fornece resolução de ordenamento de espermatozoide substancialmente semelhante a taxas de evento entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo, em que o padrão de feixe laser tem uma largura de feixe e uma altura de feixe. O método pode também incluir

7 / 87 as etapas de interrogar o espermatozoide na corrente de núcleo com o padrão de feixe de laser, detectar uma resposta à interrogação do espermatozoide, gerar pelo menos um sinal com base na resposta detectada e ordenar uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide com base em pelo menos um sinal.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[014] A FIG. 1 mostra um esquema parcial de um instrumento analítico de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[015] A FIG. 2 mostra uma segunda vista de um instrumento analítico de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[016] A FIG. 3 mostra uma vista em seção transversal da corrente de fluido em um local de interrogação.

[017] A FIG. 4 mostra uma vista em seção transversal de um feixe de laser no local de interrogação.

[018] A FIG. 5 mostra uma representação gráfica de um primeiro ponto final medido, ponto médio e um segundo ponto final na determinação das larguras da corrente de núcleo interna em várias taxas de evento.

[019] A FIG. 6 mostra uma representação gráfica das larguras de corrente de núcleo interna medidas em várias taxas de evento.

[020] A FIG. 7 mostra exemplos de gráficos bivariados e um histograma correspondente de uma resolução de ordenamento resultante, conforme visualizado em um monitor de citômetro de fluxo.

[021] A FIG. 8 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 70 μm de largura.

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[022] A FIG. 9 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 70 μm de largura.

[023] A FIG. 10 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 80 μm de largura.

[024] A FIG. 11 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 80 μm de largura.

[025] A FIG. 12 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 80 μm de largura.

[026] A FIG. 13 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 80 μm de largura.

[027] A FIG. 14 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 90 μm de largura.

[028] A FIG. 15 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 90 μm de largura.

[029] A FIG. 16 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 90 μm de largura.

[030] A FIG. 17 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 90 μm de largura.

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[031] A FIG. 18 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 100 μm de largura.

[032] A FIG. 19 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 100 μm de largura.

[033] A FIG. 20 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 100 μm de largura.

[034] A FIG. 21 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 100 μm de largura.

[035] A FIG. 22 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura.

[036] A FIG. 23 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura.

[037] A FIG. 24 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura.

[038] A FIG. 25 mostra uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura.

[039] A FIG. 26 mostra os resultados de estabilidade do feixe de laser ao testar um laser de onda contínua em várias potências de laser e várias larguras de perfil de feixe.

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[040] A FIG. 27 mostra resultados de facilidade de alinhamento ao testar um laser de onda contínua em várias potências de laser e várias larguras de perfil de feixe.

[041] A FIG. 28 mostra resultados da PVR em diferentes taxas de evento, desde o teste de um laser de onda contínua em várias potências de laser e várias larguras de perfil de feixe.

[042] A FIG. 29 mostra exemplos de gráficos bivariados e histograma correspondente de uma resolução de ordenamento resultante, conforme visualizado em um monitor de citômetro de fluxo, a partir do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 10 mW.

[043] A FIG. 30 mostra exemplos de gráficos bivariados e histograma correspondente de uma resolução de ordenamento resultante, conforme visualizado em um monitor de citômetro de fluxo, a partir do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 10 mW.

[044] A FIG. 31 mostra exemplos de gráficos bivariados e histograma correspondente de uma resolução de ordenamento resultante, conforme visualizado em um monitor de citômetro de fluxo, a partir do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 25 mW.

[045] A FIG. 32 mostra exemplos de gráficos bivariados e histograma correspondente de uma resolução de ordenamento resultante, conforme visualizado em um monitor de citômetro de fluxo, a partir do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 25 mW.

[046] A FIG. 33 mostra um gráfico que compara porcentagens de espermatozoides orientados resultantes do uso de um laser de onda contínua Coherent Genesis ou um laser pulsado Vanguard em um sistema de ordenamento.

[047] A FIG. 34 mostra um gráfico que compara quantidades de espermatozoides dentro de uma região de ordenamento "X" resultante do uso

11 / 87 de um laser de onda contínua Coherent Genesis ou um laser pulsado Vanguard em um sistema de ordenamento.

[048] A FIG. 35 mostra um gráfico que compara as taxas de ordenamento de espermatozoides resultantes do uso de um laser de onda contínua Coherent Genesis ou um laser pulsado Vanguard em um sistema de ordenamento.

[049] A FIG. 36 mostra um gráfico que compara os resultados da PVR do uso de um laser de onda contínua Coherent Genesis ou um laser pulsado Vanguard em um sistema de ordenamento.

[050] A FIG. 37 mostra um gráfico que compara tempos de ordenamento resultantes do uso de um laser de onda contínua Coherent Genesis ou um laser pulsado Vanguard em um sistema de ordenamento.

[051] A FIG. 38 mostra uma tabela que compara os resultados do controle de qualidade dos espermatozoides pré e pós-congelados que foram previamente ordenados por um sistema de ordenamento, incluindo um laser de onda contínua Coherent Genesis ou um laser pulsado Vanguard.

[052] FIG. 39 mostra uma tabela que compara os resultados da PVR do uso de um laser pulsado Vanguard e um laser de onda contínua Coherent Genesis em um sistema de ordenamento através de taxas de evento crescentes.

[053] A FIG. 40 mostra um gráfico de barras que compara os resultados da PVR do uso de um laser pulsado Vanguard e um laser de onda contínua Coherent Genesis em um sistema de ordenamento através de taxas de evento crescentes.

[054] Embora a presente invenção possa ser incorporada com várias modificações e formas alternativas, modalidades específicas são ilustradas nas figuras e descritas neste documento por meio de exemplos ilustrativos. Deve ser entendido que as figuras e descrições detalhadas não se destinam a

12 / 87 limitar o escopo da invenção à forma específica divulgada, mas que todas as modificações, alternativas e equivalentes que se enquadram no espírito e no escopo das reivindicações devem ser cobertas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[055] Modalidades da presente divulgação serão descritas abaixo com referência às figuras. Elementos semelhantes nas várias figuras são indicados por números de referência iguais para consistência. Em geral, as modalidades divulgadas neste documento referem-se a aparelhos e métodos que empregam elementos ópticos de modelagem do feixe e estabilização de feixe para uso em aplicações de ordenamento de espermatozoides.

[056] A FIG 1 representa um esquema parcial de um instrumento analítico 110 de acordo com uma modalidade da presente divulgação. Em algumas modalidades, o instrumento analítico 110 facilita o espermatozoide de ordenamento sexual em uma ou mais subpopulações enriquecidas de espermatozoides portadores de cromossomo X ou Y, verificação da pureza ordenada ou verificação de uma variedade de manchas ou condições de mancha. De acordo com algumas modalidades, o instrumento analítico 110 pode compreender um citômetro de fluxo 100. De acordo com outras modalidades, no entanto, o instrumento analítico 110 pode compreender um chip microfluídico. No exemplo não limitativo mostrado na FIG. 1, o instrumento analítico 110 é um citômetro de fluxo 100 do tipo de geração de gotículas. Certas características inventivas descritas em relação ao exemplo ilustrado têm utilidade adicional aplicável a outros dispositivos e sistemas.

[057] Um citômetro de fluxo 100, como o mostrado na FIG. 1, mede diferenças quantificáveis na luz emitida ou refletida por partículas ou células em resposta a uma excitação, como por um laser 12. De acordo com modalidades descritas neste documento, o citômetro de fluxo 100 pode diferenciar espermatozoides portadores do cromossomo X e Y 16 com base

13 / 87 no conteúdo de DNA. Como usado ao longo, o termo "espermatozoide" pode se referir ao caso singular e plural, conforme determinado pelo contexto de seu uso.

[058] A única técnica de ordenamento de espermatozoides praticada comercialmente baseia-se nas diferenças no conteúdo nuclear de DNA de espermatozoides portadores de cromossomo X e espermatozoides portadores de cromossomo Y. A detecção dessa diferença requer o uso de um corante seletivo para o DNA (por exemplo, um fluorocromo como o Hoechst 33342) que se associou estequiometricamente ao DNA nuclear do espermatozoide. Nos bovídeos, por exemplo, o espermatozoide portador do cromossomo X possui cerca de 3,8% mais DNA nuclear do que o espermatozoide portador do cromossomo Y. Assim, detectando a quantidade de fluorescência emitida no espermatozoide adequadamente orientado pelo fluorocromo associado em resposta à excitação com um laser 12, é possível diferenciar entre espermatozoides portadores de cromossomo X e espermatozoides portadores de cromossomo Y. Além disso, detectando a quantidade de fluorescência emitida pelo fluorocromo ligado ao interrogar o espermatozoide pelo laser 12, é possível verificar qualquer número de manchas ou condições de mancha no escopo da presente divulgação.

[059] Um citômetro de fluxo 100 adequado para essa técnica inclui fluídicos capazes de fornecer espermatozoides orientados individualmente para um local preciso para excitação com o laser 12, bem como para facilitar a separação física de espermatozoides selecionados 16. O citômetro de fluxo 100 inclui uma fonte de partículas ou fonte de células 1 do fluido de amostra 19, que fornece pelo menos uma partícula ou pelo menos uma célula, como espermatozoide que foi corado com um fluorocromo para análise e/ou ordenamento. O fluido de amostra contendo espermatozoide é fornecido a partir da fonte de amostra 1 e depositado dentro de um canal de fluxo 2. Na FIG. 1, o canal de fluxo representado 2 também pode ser caracterizado como

14 / 87 um bico, mas outros sistemas com canais fechados também podem se beneficiar de certos aspectos inventivos da divulgação de instância. O fluido de revestimento 3 é igualmente fornecido a partir de uma fonte de fluido de revestimento 4 e depositado dentro do canal de fluxo 2. As respectivas entradas (não numeradas) para o fluido de revestimento 3 e o fluido de amostra 19 são dispostas para permitir um fluxo laminar de ambos os fluidos em uma corrente de fluido coaxial 8. O canal de fluxo 2 do citômetro de fluxo 100 cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido 8, que inclui uma corrente de núcleo interna 17 de fluido de amostra (às vezes referida neste documento como apenas uma "corrente de núcleo") e uma corrente externa 18 da fluido de revestimento 3. A corrente de núcleo interna 17 é ilustrada contendo espermatozoide 16, que tem cabeças de espermatozoide em forma de remo e caudas extensíveis. Além disso, o canal de fluxo 2 permite que o espermatozoide 16 alinhe principalmente um único arquivo dentro da corrente de núcleo interna 17 e assuma a orientação adequada para análise e/ou ordenamento. Em particular, o canal de fluxo ilustrado 2 inclui uma ponta de bico de orientação 34, que inclina hidrodinamicamente o espermatozoide em direção a uma orientação uniforme à medida que o espermatozoide sai do orifício 5. Exemplos de sistemas de citômetros de fluxo adequados para uso com a presente invenção e, em particular, pontas de bicos de orientação adequados para ordenamento de espermatozoides são descritos em mais detalhes nas Publicações de Patentes Internacionais WO2001/40765, WO2001/085913 e WO 204/088283.

[060] Um controle de oscilador 7 pode estabelecer ondas de pressão dentro do canal de fluxo 2 variando a frequência e a amplitude de um oscilador 6. Essas ondas de pressão são transmitidas aos fluidos que saem do canal de fluxo 2 no orifício 5, fazendo com que a corrente de fluido 8 eventualmente e regularmente forme gotículas 9. O espermatozoide 16 dentro do fluido de amostra 19 na corrente de núcleo interna 17 da corrente

15 / 87 de fluido 8 é arrastado para dentro das gotículas à medida que se formam. Enquanto uma gotícula 9, particularmente uma gotícula 9 direcionada para ordenamento, pode conter um espermatozoide individual, pode-se apreciar que uma gotícula 9 também pode conter um ou mais espermatozoides 16. Em algumas modalidades, como uma modalidade que emprega um laser de ablação, o oscilador 6 e o controlador do oscilador 7 podem não ser necessários, pois pode não haver necessidade de formar gotículas 9.

[061] Ainda com referência à FIG. 1, depois que a corrente de fluido 8 sai do orifício 5 do canal de fluxo 2, o espermatozoide 16 dentro da corrente de núcleo interna 17 é excitado em um local de interrogação 33 com um feixe de laser 26 produzido por um 12. De acordo com uma ou mais modalidades, o laser 12 pode ser um laser pulsado, como um Vanguard 355-350 (disponível na Spectra-Physics, Santa Clara, CA) ou um laser de onda contínua, como um laser de pegada menor Genesis CX-355 (disponível na Coherent Inc., Santa Clara CA) ou qualquer dispositivo que forneça radiação eletromagnética para partículas biológicas ou não biológicas em um comprimento de onda e potência prescritos. Como mostrado na FIG. 1, o laser 12 produz radiação eletromagnética na forma de um feixe de laser 26. Embora apenas um laser 12 seja mostrado na FIG. 1, lasers adicionais associados a canais de fluxo adicionais, com cada laser adicional produzindo um feixe de laser adicional, está dentro do escopo da presente divulgação. Por exemplo, uma ou mais modalidades da presente divulgação incluem um instrumento analítico multicanal com dois ou mais canais de fluxo, dois ou mais lasers associados aos dois ou mais canais de fluxo e elementos ópticos de modelagem do feixe associada a cada canal de fluxo. De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, o comprimento de onda do feixe de laser 26 é qualquer comprimento de onda que é apropriado para ativar a fluorescência no material de emissão de luz ligado ao DNA nuclear da partícula ou célula de interesse, como o espermatozoide 16. Por exemplo,

16 / 87 o comprimento de onda pode estar entre cerca de 350 nm e 360 nm, ou a cerca de 355 nm no caso de espermatozoide. No entanto, em algumas modalidades, qualquer comprimento de onda na faixa de 330 nm a 365 nm está dentro do escopo desta divulgação.

[062] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, qualquer potência de saída que não danifique ou afete adversamente a fertilidade do espermatozoide 16 pode ser empregada. Em algumas modalidades, a potência do feixe de laser 26 distribuído ao espermatozoide é o mais baixo possível, mantendo uma resolução de ordenamento satisfatória entre as subpopulações dos cromossomos X e Y. Por exemplo, algumas faixas de potência do laser dentro do escopo da divulgação podem incluir:350 mW ou menos, 300 mW ou menos, 250 mW ou menos, 200 mW ou menos, 175 mW ou menos, 150 mW ou menos, 100 mW ou menos, 90 mW ou menos, 80 mW ou menos, 70 mW ou menos, 60 mW ou menos, 50 mW ou menos, 40 mW ou menos, 30 mW ou menos, 25 mW ou menos, 20 mW ou menos, ou 10 mW ou menos. Pode-se perceber que os próprios lasers podem operar com potências ainda mais altas e que os elementos ópticos, como filtros, divisores, interrupções de feixe e similares, podem ser usados para ajustar a potência realmente distribuída ao espermatozoide sendo ordenado.

[063] Ainda com referência à FIG. 1, o feixe de laser 26 como saída do laser 12 pode ter um perfil de feixe gaussiano. O perfil do feixe gaussiano, como saída do laser 12, pode ser geralmente circular e pode medir 0,9 mm na direção horizontal e 1,1 mm na direção vertical. Além disso, o perfil do feixe gaussiano, geralmente chamado de TEM00 geralmente é mais intenso no ponto do centro e uniformemente menos intenso radialmente para fora. Tais pontos de feixe circular não são adequados para ordenar espermatozoides sem outras modificações e até pontos de feixe levemente elípticos sofrem de problemas semelhantes. Nomeadamente, esses pontos de

17 / 87 feixe expõem os espermatozoides que viajam pelo centro do perfil do feixe a um fluxo total de potência do laser maior em comparação com os espermatozoides na periferia da corrente de núcleo e correspondentemente mais próximos da borda do feixe. Essa grande variação na potência total do laser experimentada pelos espermatozoides que passam dentro da corrente de núcleo interna pode resultar em diminuição da resolução entre as subpopulações dos cromossomos X e Y e geralmente é indesejável para aplicação de ordenamento de espermatozoides.

[064] Os elementos ópticos de modelagem do feixe podem ser usados para manipular a forma de um ponto de feixe, manipulando, por exemplo, a razão de aspecto ou os aspectos verticais e horizontais do ponto de feixe para abordar os problemas de exposição de potência do laser bastante variada experimentada pelo espermatozoide e coincidente excitação do fluorocromo ligada a múltiplos DNAs. Publicação Internacional Nº WO 01/85913 e Patente US. Nº 7. 371. 517, que são incorporadas por referência neste documento na sua totalidade, descreve modalidades que empregam elementos ópticos de moldagem do feixe para aumentar a área e reduzir a altura de um padrão de feixe de irradiação convencional. Os elementos ópticos de modelagem do feixe anteriores procuravam corrigir essa deficiência no ordenamento de espermatozoides com um perfil de feixe altamente esticado, como largura de feixe de 160 μm e altura do feixe de 20 μm. Conforme descrito em mais detalhes abaixo, essas dimensões de feixe funcionam bem em baixas taxas de evento (por exemplo, 20.000 eventos por segundo e menos) em algumas configurações, mas são muito sensíveis, tornam-se difíceis de alinhar e geralmente perdem a qualidade muito rapidamente conforme a taxa de evento é aumentada ou em caminhos de feixe aumentados, como no segundo canal de fluxo em um sistema multicanal utilizando um laser compartilhado. Por conseguinte, modalidades

18 / 87 da presente divulgação modificam o feixe de laser 26 como saída do laser 12 para interrogar o espermatozoide 16 na corrente de fluido 8.

[065] Como mostrado na FIG. 1, o citômetro de fluxo 100 ou instrumento analítico 110 pode incluir elementos ópticos de modelagem do feixe 20. Em algumas modalidades, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 pode conter um par de lentes cilíndricas cruzadas. As lentes são posicionadas uma em relação à outra, de modo que uma das lentes é uma lente frontal e a outra é uma lente traseira. O poder das lentes em combinação com a distância que separa as lentes pode criar diferentes padrões de feixe elíptico em relação à modelagem do feixe de laser 26. De acordo com algumas modalidades desta divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 são configuradas para produzir um padrão de feixe no local de interrogação 33 tendo certas características em relação à corrente de núcleo interna 17 da corrente de fluido 8. De acordo com algumas modalidades desta divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 são configuradas para produzir um padrão de feixe no local de interrogação 33 tendo dimensões absolutas especificadas. De acordo com algumas modalidades desta divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 são configurados para produzir um padrão de feixe no local de interrogação 33 que executa substancialmente o mesmo nível de resolução quando o citômetro de fluxo está operando em uma variedade de taxas de evento e em uma variedade de tamanhos diferentes da corrente de núcleo interna.

[066] Os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 podem estar localizados perto da corrente de fluido 8 para focalizar o feixe de laser 26 no local de interrogação 33 na corrente de fluido 8. Um caminho de feixe 27 pode compreender o caminho atravessado pelo feixe de laser entre o próprio laser 12 e os elementos ópticos de modelagem do feixe 20. Pode ser apreciado que, embora a FIG. 1 represente um caminho de feixe reto,

19 / 87 periscópios, espelhos, espelhos dicroicos, filtros e outros elementos ópticos podem ser empregados para direcionar o feixe de laser 26 para os elementos ópticos de modelagem do feixe 20. Em algumas modalidades, o caminho do feixe 27 é o mais curto possível. Por exemplo, o caminho do feixe 27 pode ter entre 2 polegadas e 18 polegadas de comprimento, em outras modalidades o caminho do feixe pode ter entre 2 polegadas e 10 polegadas. Tanto os elementos ópticos de modelagem do feixe 26 como o caminho de feixe curto 27 fornecem resolução e consistência de ordenamento aprimoradas para aplicações de ordenamento de espermatozoides em um citômetro de fluxo e, quando combinadas, podem interagir sinergicamente para aprimoramentos ainda maiores.

[067] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 podem compreender uma lente frontal e uma lente traseira com a lente traseira posicionada a uma distância apropriada do ponto base na lente frontal. Em algumas modalidades, o espaçamento entre a lente traseira e o ponto base na lente frontal pode estar na faixa de 50 mm a 60 mm. Além disso, em algumas modalidades, a lente traseira é um ponto focal de 100 mm e a lente frontal é um ponto focal de 40 mm e pode ter uma potência numa faixa de 18 μm/1 mm = 0,018x para a lente de 40 mm e 0,12 mm/1 mm = 0,12x para a lente de 100 mm. Dessa maneira, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 pode modificar a largura e/ou a altura do feixe de laser 26, de modo que o feixe modelado resultante 22 tenha a largura de feixe desejada e/ou a altura do feixe no local de interrogação. Os versados na técnica podem apreciar diferentes lasers com diferentes formas de feixe inicial, podem exigir diferentes forças e distâncias da lente para atingir a largura desejada do feixe. Essas configurações adicionais estão dentro do escopo desta divulgação.

[068] Como mencionado anteriormente, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 pode modificar a largura do feixe de laser 26. Em

20 / 87 algumas modalidades, a largura modificada é maior que o perfil de feixe gaussiano do feixe de laser 26, mas menor que um perfil de feixe elíptico tendo uma largura de 160 μm. Em outras modalidades, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 moldam o feixe de laser 26 para uma largura que esteja numa faixa de 110 μm ou menos, uma largura que esteja numa faixa de 70 μm a 110 μm, uma largura que esteja numa faixa de 70 μm a 90 μm, ou uma largura que esteja numa faixa de 90 μm a 110 μm, ou uma largura que esteja numa faixa de 110 μm a 130 μm.

[069] Além disso, em algumas modalidades, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 pode modificar o feixe de laser 26 em relação a uma dimensão da corrente de núcleo da corrente de fluido 8. Por exemplo, o citômetro de fluxo 100 ou instrumento analítico 110 de acordo com modalidades da presente divulgação pode ser configurado de modo que a pressão diferencial entre a corrente de núcleo e o fluido de revestimento da corrente de fluido 8 possa ser ajustada para alterar a velocidade de processamento do citômetro de fluxo 100. A pressão diferencial entre a corrente de núcleo e o fluido de revestimento da corrente de fluido 8 está diretamente relacionada à velocidade de processamento do citômetro de fluxo 100 em termos do número de eventos que são detectados a cada segundo. Como tal, aumentar a pressão diferencial entre a corrente de núcleo e o fluido de revestimento da corrente de fluido 8 aumenta a velocidade de processamento do citômetro de fluxo 100. Além disso, esse aumento na pressão diferencial também aumenta o tamanho da corrente de núcleo, como a largura da corrente de núcleo interna. Ou seja, o tamanho da corrente de núcleo aumenta à medida que a velocidade de processamento do citômetro de fluxo 100 aumenta. Por exemplo, o tamanho da corrente de núcleo em uma taxa de evento entre 40.000 a 90.000 eventos por segundo é dramaticamente maior que o tamanho da corrente de núcleo em uma taxa de evento entre 10.000 a 20.000 eventos por segundo.

21 / 87

[070] O inventor descobriu que a largura do feixe convencionalmente aceita utilizada em aplicações comerciais de ordenamento de espermatozoides, ou seja, uma largura de feixe de 160 μm, faz com que grande parte do fluxo total de energia do laser seja desperdiçado nas asas externas da distribuição gaussiana elipticamente esticada do feixe. Devido a essa energia desperdiçada, o espermatozoide nos limites externos da corrente de núcleo interna não pode ser uniformemente iluminado nessas taxas de eventos mais altas, pois são expostos a menos energia geral do laser enquanto atravessam o feixe de laser em comparação com o espermatozoide no meio do feixe de laser. Essa variação maior na potência do laser experimentada pelos espermatozoides em diferentes posições reduz a resolução do ordenamento. Além disso, em taxas de evento mais altas em que a corrente de núcleo se torna maior, essas perdas geralmente se agravam. Essa perda na resolução resulta em perda de produtividade, perda de pureza ou ambas, dependendo de como as regiões e outros parâmetros de ordenamento são ajustados.

[071] Como usado em muitos exemplos ao longo desta divulgação, as taxas de evento costumam servir como um proxy para a taxa de fluxo volumétrica da amostra através do canal de fluxo, particularmente porque a taxa de evento é sinônimo de alterações nas dimensões da corrente de núcleo. Em várias figuras e exemplos, a concentração de núcleos de espermatozoide foi de 200 milhões por ml, o bico que formava a corrente coaxial incluiu uma ponta de bico orientador com um orifício de 70 μm de diâmetro e a pressão da amostra foi ajustada para um valor de aproximadamente 40 PSI. Os versados na técnica podem compreender que a alteração da concentração de espermatozoide na amostra pode variar a taxa de evento sem afetar as dimensões da corrente de núcleo, enquanto as alterações no diâmetro do orifício e na pressão da amostra podem afetar a taxa de evento e a taxa de

22 / 87 transferência volumétrica da amostra (e correspondentemente as dimensões da corrente de núcleo).

[072] Voltando à FIG. 1, o espermatozoide 16 refletirá ou emitirá radiação eletromagnética 23 quando excitado com um laser 12 de um comprimento de onda apropriado. No caso de espermatozoides corados com fluorocromo, os espermatozoides fluorescem. Como é sabido pelos versados no campo, a superfície plana da cabeça do espermatozoide em forma de remo emite fluorescência na proporção da quantidade de DNA nuclear que ela contém. Além disso, os lados finos da cabeça de espermatozoide em forma de remo emitem uma fluorescência muito brilhante, que é usada para determinar se o espermatozoide sendo excitado está ou não orientado adequadamente.

[073] Uma característica de partícula ou célula é determinada com um sistema de detecção de partícula ou célula 10, que forma uma porção do citômetro de fluxo 100. No caso das características das células de espermatozoides, podem incluir: orientação, viabilidade e características de diferenciação sexual, como a presença de qualquer cromossomo X ou Y. FIG. 1, ilustra um desses sistemas de detecção de partículas ou células 10 como uma porção do citômetro de fluxo 100. O sistema de detecção de partículas ou células 10 inclui pelo menos um detector 11 que responde às partículas ou células contidas na corrente de fluido 8. Por exemplo, o espermatozoide corado pode ser excitado por um laser 12 em um local de interrogação 33, o que faz com que a mancha emita ou reflita radiação eletromagnética 23. O pelo menos um detector 11 detecta a fluorescência em resposta à interrogação das partículas, células, espermatozoide ou similares e gera pelo menos um sinal com base na resposta detectada. Um analisador 13 recebe pelo menos um sinal do pelo menos um detector 11 para analisar qualquer número de condições, que são descritas adicionalmente abaixo, de acordo com modalidades da presente divulgação. O analisador 13 pode ser

23 / 87 um computador, processador ou similar de uso geral com software para executar funções específicas para o ordenamento do espermatozoide ou pode ser um computador ou processador de finalidade específica incorporado ao citômetro de fluxo.

[074] Ainda com referência à FIG. 1, nas modalidades em que o instrumento analítico é um citômetro de fluxo gerador de gotículas, o analisador 13 pode ser acoplado a um carregador de gotículas, como um pino de carga 34 que carrega diferencialmente o fluido de revestimento 18 dentro do bico e da corrente de fluido 8 até e incluindo gotículas recentemente formadas. Dessa maneira, cada gotícula 9 pode ser carregada com base nas características de partícula ou célula determinadas no analisador 13. Por exemplo, as gotículas podem ser carregadas com base em uma característica de diferenciação sexual detectada dos espermatozoides corados 16 arrastados para dentro da gotícula 9. Nestas modalidades, um elemento de assimetria 14 facilita o ordenamento das gotículas carregadas diferencialmente em uma ou mais subpopulações, como espermatozoides viáveis portadores de cromossomo X e/ou espermatozoides viáveis portadores de cromossomo Y. Como exemplo, o elemento de assimetria 14 pode incluir um par de placas de deflexão eletrostática em um citômetro de fluxo que gera gotículas que fornecem gotículas com carga diferencial 9 com trajetórias diferentes, como em um ou mais recipientes de coleta 15, separando assim as gotículas 9 em subpopulações enriquecidas de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Deste modo, o elemento de assimetria 14 gera uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoide viável.

[075] Em outras modalidades, o analisador 13 pode ser conectado a um elemento de assimetria que inclui um laser de ablação para danificar ou fotoablar espermatozoides selecionados com base em seu ordenamento. Especificamente, o laser de ablação pode ser programado para matar,

24 / 87 danificar ou desativar o espermatozoide 16 na corrente de fluido 8 com base em um determinado ordenamento ou característica. Por exemplo, se for desejado gerar uma população de espermatozoides com uma razão assimétrica de espermatozoides viáveis portadores de cromossomo X, o laser de ablação pode ser usado para danificar ou matar espermatozoides portadores de cromossomo Y na corrente de fluido 8. Por outro lado, se for desejado gerar uma população de espermatozoides com uma razão assimétrica de espermatozoides viáveis portadores de cromossomo Y, o laser de ablação pode ser usado para danificar ou matar o espermatozoide portador de cromossomo X na corrente de fluido 8. Dessa maneira, a ablação a laser pode ser usada como uma técnica para isolar, separar, selecionar, classificar ou ordenar partículas, células, espermatozoide ou similares com base nas características das partículas ou células de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação.

[076] O instrumento analítico de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação pode não incluir um elemento de assimetria. Nessas modalidades, o analisador 13 do instrumento analítico pode ser usado para verificar a pureza ordenada, verificar qualquer número de manchas ou condições de mancha ou analisar qualquer número de condições ou critérios com relação a uma determinada amostra de espermatozoides pré-manchados.

[077] Além disso, como mencionado acima, o instrumento analítico de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação pode ser um chip microfluídico. Nestas modalidades, o canal de fluxo do chip microfluídico pode incluir pelo menos um canal com dimensões de seção transversal na faixa entre cerca de 1,0 μm e cerca de 2000 μm. Além disso, o chip microfluídico pode incluir um sistema de capilares do citômetro de fluxo e um mecanismo de desvio para servir como um elemento de assimetria para gerar uma população de espermatozoides com uma razão sexual

25 / 87 assimétrica de espermatozoide viável. Além disso, a Patente US. Nº

7.311.476; Patente US. Nº 9.057.676 e o Pedido Internacional Nº PCT/US2013/031706, que são incorporados por referência neste documento na sua totalidade, descrevem modalidades de um chip microfluídico que pode ser usado de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação.

[078] Enquanto a FIG. 1 ilustra apenas um único canal de fluxo 2, o instrumento analítico de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação pode compreender um instrumento analítico multicanal que inclui uma pluralidade de canais de fluxo adicionais. Em um instrumento analítico multicanal, cada canal de fluxo adicional pode criar um fluxo coaxial adicional de uma corrente de fluido tendo uma corrente de núcleo interna adicional do fluido de amostra e uma corrente externa adicional do fluido de revestimento. Os canais de fluxo adicionais podem ser acompanhados por uma duplicação dos elementos representados na FIG. 1 e FIG. 2, ou os canais de fluxo adicionais podem compartilhar componentes com o canal de fluxo. Como apenas um exemplo de canais de fluxo que compartilham recursos, o canal de fluxo e o canal de fluxo adicional podem ser fornecidos com fluido de revestimento a partir de uma única fonte de fluido de revestimento.

[079] Voltando agora à FIG. 2, uma vista tridimensional ampliada da interação entre a corrente de fluido 8 e o feixe de laser 26 é representada no local de interrogação 33, ao lado de uma indicação de um eixo X, Y e Z. Vários componentes de um citômetro de fluxo 100, incluindo um canal de fluxo 2, um orifício 5 de um bico incluído no canal de fluxo 2, uma corrente de fluido 8 e um laser 12, que foram descritos anteriormente em relação à FIG. 1. Como exemplos não limitativos, a Publicação Internacional Nº WO 01/85913 e Patente US. Nº 7.371.517, que foi incorporada por referência neste documento na sua totalidade, descreve modalidades de um citômetro

26 / 87 de fluxo que pode ser usado de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação. As plataformas de citômetros de fluxo de outros fabricantes também podem se beneficiar e ser usadas de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação.

[080] Como mostrado na FIG. 2, a corrente de fluido 8 inclui uma corrente de núcleo interna 17, que contém o espermatozoide 16, e uma corrente externa 18 de fluido de revestimento que circunda a corrente de núcleo interna 17. O feixe de laser 26 é representado viajando ao longo do eixo X para o local de interrogação, onde o feixe de laser 26 interage com o espermatozoide 16 dentro da corrente de núcleo interna 17 sendo fluida ao longo do eixo Z. O espermatozoide 16 na corrente de fluido 8 é excitado pelo feixe de laser 26 como descrito acima. Como consequência, espermatozoides adequadamente orientados produzirão radiação eletromagnética na forma de fluorescência frontal 23a a partir da superfície plana em forma de remo da cabeça de espermatozoides ao longo do eixo X. Os espermatozoides orientados produzem adicionalmente radiação eletromagnética a partir de seus lados estreitos, conhecida como fluorescência lateral 23b ao longo do eixo Y.

[081] Um primeiro detector 11a, como um detector de fluorescência frontal, é colocado na posição direta ao longo do eixo X para coletar a fluorescência frontal 23a. Os versados na técnica podem apreciar elementos ópticos adicionais, como uma lente de coleta ou objetiva, podem focar a fluorescência frontal no primeiro detector 11a. Um segundo detector 11b é conhecido como detector de fluorescência lateral, é colocado em uma posição 90 graus em relação ao primeiro detector 11a, tal como ao longo do eixo Y.

[082] A FIG. 3 ilustra uma seção transversal da corrente de fluido 8 no local de interrogação 33. Novamente, a corrente de fluido compreende uma corrente externa 18 de revestimento 3 e uma corrente de núcleo interna

27 / 87 17 da amostra de fluido 19. A corrente de núcleo interna 17 pode ser vista tendo uma forma geralmente elíptica dentro da corrente de fluido 8. Bicos de orientação adequados, como os descritos nas Publicações Internacionais de Patentes WO2001/40765, WO2001/085913 e WO 204/088283, ou outros bicos de orientação adequados, produzem geralmente fluxos elípticos ou de fita do fluido de amostra 19. No entanto, as modalidades da presente invenção não estão limitadas a uma geometria de corrente de núcleo interna específica. Outras geometrias adequadas para orientar os espermatozoides se beneficiarão de maneira semelhante dos aspectos desta divulgação. Como representado, a corrente de núcleo interna 17 tem um eixo principal que se alinha ao eixo Y. O eixo principal corresponde à largura da corrente de núcleo interna 30. A corrente de núcleo interna 17 também tem um eixo menor ao longo do eixo X que corresponde à profundidade da corrente de núcleo interna 31.

[083] A FIG. 4 representa uma vista em seção transversal do feixe de laser 26 no local de interrogação 33 fazendo referência ao mesmo sistema de coordenadas representado nas FIGS. 2 e 3. O feixe representado se origina de um laser operando no modo TEM00 ou com um perfil de feixe gaussiano, que foi esticado em um aspecto e compactado em outro aspecto. Pode ser apreciado que as dimensões do feixe (como altura e largura do feixe) referenciadas ao longo desta divulgação se referem à distância entre os pontos diametralmente opostos em ambos os lados de um pico de potência do feixe central em que a potência do feixe é de 1/e2 (0,135) da potência de pico do feixe, ou 13,5% da potência de pico do perfil de feixe gaussiano.

[084] Como representado, o feixe de laser 26 tem uma largura de feixe 36 ao longo do eixo Y e uma altura de feixe 37 ao longo do eixo Z. A geometria da largura do feixe 36 e da altura do feixe 37 pode ser referida como um padrão de feixe de laser. Uma vez que o feixe de laser 26 é moldado pelos elementos ópticos de modelagem do feixe 20, essa porção do feixe de

28 / 87 laser 26 pode ser referida como um feixe de laser modificado. Além disso, o feixe de laser 26 tem uma porção de centro 38 no local de interrogação 33. A porção de centro 38 pode compreender entre uma metade mais interna da largura do feixe e um quarto mais interno da largura do feixe 36. Em algumas modalidades, a porção de centro 38 pode compreender cerca de um terço mais interno da largura do feixe.

[085] Pequenas variações na energia total do laser experimentada pelos espermatozoides manchados produzem variações na quantidade de fluorescência produzida. Dado que o padrão da indústria para a pureza ordenada de espermatozoides é de pelo menos 85%, mesmo uma pequena variação pode começar a obstruir a diferença de 3,8% do DNA nuclear entre os espermatozoides portadores de cromossomos X e Y, especialmente em altas taxas de evento, como 40.000 a 90.000 eventos por segundo (ou até mais alto). Os requerentes descobriram surpreendentemente que combinar a porção de centro 38 da largura do feixe 36 com a largura da corrente de núcleo interna forneceu aprimoramentos inesperados na resolução. Além disso, o inventor descobriu que certas dimensões absolutas forneciam ordenamento estável em uma variedade de taxas de evento. Os elementos ópticos de modelagem do feixe usada na técnica anterior forneceu uma boa resolução, mas essa resolução desmorona rapidamente se e quando a largura da corrente de núcleo interna é modificada, de modo a aumentar as taxas de evento e/ou as velocidades de ordenamento.

[086] Esse perfil de feixe modificado é particularmente útil em taxas de evento mais altas, como entre 40.000 e 90.000 eventos por segundo. De fato, a resolução de ordenamento resultante entre os espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y pode ser drasticamente reduzida se a largura 31 da corrente de núcleo interna for maior que a porção de centro 38 da largura do feixe, conforme o espermatozoide atravessar o ponto do feixe nas bordas externas da largura 30 da corrente de núcleo interna. No entanto,

29 / 87 os elementos ópticos de modelagem do feixe da técnica anterior também foi muito ampla. Por exemplo, uma largura de feixe de 160 mícrons possui uma grande porção de centro com uma distribuição relativamente uniforme do fluxo de energia, mas muita energia é desperdiçada fora da região de interesse (ou seja, corrente de núcleo interna 17) e a resolução de ordenamento se deteriora em taxas de evento mais altas.

[087] Com referência agora às FIGS. 5 e 6, o Requerente foi capaz de medir a largura efetiva da corrente de núcleo interna em um citômetro de fluxo de ordenamento de espermatozoide, medindo a distância do centro dos núcleos manchados percorrida durante o ordenamento e/ou análise em tal citômetro de fluxo. O requerente gerou correntes de fluido com uma ponta de bico de orientação tendo um orifício de 70 μm em taxas de evento variáveis, montando um micrômetro no estágio do feixe de laser. Uma corrente de fluido tendo uma corrente de núcleo interna com núcleos de espermatozoide manchados foi gerada em um citômetro de fluxo através de uma ponta de bico de orientação. Um osciloscópio com alto ganho foi alimentado com um sinal de um PMT disposto para detectar fluorescência da corrente de núcleo interna. Primeiro, o centro da corrente de núcleo foi localizado, determinando a posição do laser, resultando no sinal mais alto, e o local do centro foi anotado como o "Meio do Núcleo" e associado à leitura atual no micrômetro. Como pode ser visto na FIG. 5, o “Meio do Núcleo” foi consistentemente encontrado em cerca de 33,5 μm no micrômetro. O laser foi varrido até encontrar uma borda frontal da corrente de núcleo. A borda frontal da corrente de núcleo foi verificada visualmente, visualizando a posição no micrômetro na qual não havia mais um brilho sob o microscópio e na qual o osciloscópio não registrava mais pulsos e a distância no micrômetro era anotada como “Frente do Núcleo”. O laser foi então redefinido para o centro da corrente de núcleo, e a borda traseira foi encontrada com uma varredura semelhante na direção oposta e anotada como

30 / 87 “Parte Posterior do Núcleo ”. A mesma metodologia foi realizada nas taxas de evento de 5.000 eventos por segundo a 65.000 eventos por segundo, como pode ser visto nas FIGS. 5 e 6. Especificamente, as posições relativas frontal, traseira e média, conforme indicado pelo micrômetro, são mostradas na FIG.

5. FIG. 6 ilustra a diferença entre a posição das bordas frontal e traseira ou a largura da corrente de núcleo. Como pode ser visto na FIG. 6, entre 5.000 e

65.000 eventos por segundo, a uma concentração de 200 milhões de células por segundo, parece haver um aumento linear na largura da corrente de núcleo interna de 24 μm a 40 μm.

[088] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe podem "substancialmente" corresponder à porção de centro da largura do feixe com uma largura da corrente de núcleo interna 30, tal largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser. Como usado ao longo desta divulgação, combinar substancialmente a porção de centro da largura do feixe com uma largura da corrente de núcleo interna pode ser expresso em termos relativos, ou por medições específicas. Por exemplo, combinar a porção de centro da largura do feixe com uma largura da corrente de núcleo interna pode compreender combinar a largura da corrente de núcleo interna 30 com a metade mais interna da largura do feixe, combinar a largura da corrente de núcleo interna 30 com o terço mais interno da largura do feixe, combinar a largura da corrente de núcleo interna 30 com o quarto mais interno da largura do feixe, ou combinar a largura da corrente de núcleo interna 30 para entre o quarto mais interno e a metade da largura do feixe. Como apenas alguns exemplos de larguras de feixe de laser e correntes de núcleo internas substancialmente combinadas, em altas taxas de evento de pelo menos

40.000 eventos por segundo, os elementos ópticos de modelagem do feixe podem fornecer uma largura de feixe na faixa de 90 μm a 130 μm no local de interrogação 33. De acordo com modalidades adicionais da presente

31 / 87 divulgação, larguras de feixe de laser e correntes de núcleo internas substancialmente combinadas a taxas mais baixas de evento de 10.000 a

25.000 eventos por segundo, incluem elementos ópticos de modelagem do feixe que fornecem uma largura de feixe na faixa de 70 μm a 130 μm. Em outras modalidades, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 modelam o feixe de laser 26 para ter uma largura de feixe que varia de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm. Em algumas modalidades, uma largura do feixe de laser que "substancialmente" combina à largura da corrente de núcleo interna 30 voltada para o laser significa que uma largura de feixe de laser que está dentro de uma faixa de cerca de 2 a 4 vezes a largura da corrente de núcleo interna 30 voltada para o laser. Em outras modalidades, uma largura do feixe de laser que "substancialmente" combina com a largura da corrente de núcleo interna 30 voltada para o laser significa uma largura de feixe de laser que está dentro de uma faixa de cerca de 1,5 a 4,5 vezes a largura da corrente de núcleo interna 30 voltada para o laser. Ao combinar substancialmente uma largura do feixe de laser 26 com a largura da corrente de núcleo interna 30 voltada para o laser, menos energia é desperdiçada e a queda dramática dentro das bordas da corrente de núcleo mais ampla pode ser reduzida. Além disso, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20, de acordo com modalidades da presente divulgação, permite que o citômetro de fluxo 100 ou o instrumento analítico 110 se desloque de pequenas correntes de núcleo (ou seja, taxas de evento mais baixas) para grandes correntes de núcleo (ou seja, taxas de evento mais altas) com uma perda mínima de resolução em uma única máquina, utilizando uma configuração dos elementos ópticos de modelagem do feixe único.

[089] De acordo com uma ou mais modalidades, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 também pode ajustar a altura do feixe do feixe de laser 26. Por exemplo, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 reduz

32 / 87 a altura do feixe de laser 26 para uma altura inferior ao perfil de feixe gaussiano de 35 μm. Em algumas modalidades, o perfil de feixe gaussiano do feixe de laser 26 é reduzido para uma altura que é inferior a 20 μm. Em algumas modalidades, o perfil de feixe gaussiano do feixe de laser 26 é reduzido para uma altura na faixa de 18 μm a 20 μm. Ainda em outras modalidades, o perfil de feixe gaussiano do feixe de laser 26 é reduzido a uma altura de 18,5 μm.

[090] Ao usar os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 para reduzir a altura do feixe de laser 26, a coincidência de várias cabeças de espermatozoides estarem dentro do feixe de laser modelado 26 durante o mesmo evento medido é bastante reduzida. Em outras palavras, a excitação por laser do material de emissão de luz ligada em várias cabeças de espermatozoides que estão dentro do feixe de laser 26 ao mesmo tempo é reduzida. Isso resulta em uma precisão aprimorada do citômetro de fluxo 100 ou instrumento analítico de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação como uma diferença média entre eventos emissores de luz que distinguem entre espermatozoide portador do cromossomo X e espermatozoide portador do cromossomo Y ou que correspondem a manchas ou condições de mancha diferentes, é aumentada.

[091] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 pode produzir um feixe de laser no local de interrogação tendo uma razão de largura de feixe para altura de feixe que está entre cerca de 7:1 e cerca de 3:1; entre cerca de 6:1 e cerca de 4:1; entre cerca de 7:1 e cerca de 6:1; entre cerca de 6:1 e cerca de 5:1; entre cerca de 5:1 e cerca de 4:1; ou entre cerca de 4:1 e cerca de 3:1.

[092] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 pode produzir um feixe de laser no local de interrogação que executa substancialmente o

33 / 87 mesmo com a corrente de núcleo de fluido com larguras de núcleo internas entre 24 μm e 40 μm. Em outra modalidade, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 podem produzir um feixe de laser no local de interrogação que executa substancialmente o mesmo em taxas de evento entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo. No contexto ou desempenho na mesma corrente de fluido em diferentes larguras de corrente de núcleo, a frase "desempenho substancialmente semelhante" pode ser entendida como determinada medindo uma PVR de núcleos através das referidas larguras de corrente de núcleo dentro de 15% uma da outra, dentro de 14% uma da outra, dentro de 13% uma da outra, dentro de 12% uma da outra, dentro de 11% uma da outra, dentro de 11% uma da outra, dentro de 10% uma da outra, dentro de 9% uma da outra, dentro de 8% uma da outra, dentro de 7% uma da outra, dentro de 6% uma da outra, dentro de 5% uma da outra, dentro de 4% uma da outra, dentro de 3% uma da outra, dentro de 2% uma da outra, ou mesmo dentro de 1% enquanto todas as PVRs de uma máquina bem alinhada permanecem acima de 85%.

[093] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 pode modelar o feixe de laser 26 para fornecer excelente uniformidade, concentrando mais energia dentro da corrente de núcleo interna 17, o que aumenta a uniformidade do fluxo de energia recebido pelo espermatozoide em todos os locais dentro da corrente de núcleo interna 17. Além disso, o perfil de feixe modificado, de acordo com modalidades da presente divulgação, fornece a versatilidade de poder alternar entre taxas de evento baixas e altas em uma única máquina sem afetar adversamente a resolução de ordenamento da amostra. Os elementos ópticos de modelagem do feixe 20 ainda mais vantajosamente permite obter resultados de resolução de ordenamento comparáveis, com um laser de potência mais baixa do que os lasers atualmente usados em aplicações de citometria de fluxo. De modo

34 / 87 semelhante, tais melhorias na resolução podem permitir tempos de manchamento mais curtos e quantidades reduzidas de manchas, as quais podem ser prejudiciais à viabilidade de um espermatozoide ordenado na inseminação artificial.

[094] Em particular, os citômetros de fluxo anteriores ao ordenamento de espermatozoides utilizavam um único laser que foi dividido de duas maneiras, ou mesmo de três maneiras, desviando alguma porção da energia do feixe para múltiplos canais de fluxo. Tais configurações frequentemente exigiam pelo menos um caminho de feixe de 25 polegadas para o canal de fluxo mais próximo, 50 polegadas para um segundo canal de fluxo e até 65 polegadas para o terceiro canal de fluxo. Embora os filtros e divisores sejam projetados para fornecer a cada canal de fluxo um feixe equivalente, na realidade, o caminho mais longo do feixe é o mais sensível e o mais difícil de alinhar. Além disso, as velocidades de resolução e ordenamento são tipicamente piores no canal de fluxo que possui o caminho de feixe mais longo.

[095] Por conseguinte, certas modalidades da presente divulgação buscam reduzir o máximo possível o caminho do feixe 27 e fornecer laser semelhante ou igual ao laser 12 e elementos ópticos de modelagem do feixe 20 com cada corrente de fluido 18 em um instrumento multicanal. Dessa maneira, pode-se garantir que cada fluxo de fluido em um instrumento multicanal seja exposto a uma potência uniforme de potência e feixe. Ao contrário dos sistemas multicanais anteriores, é possível obter um desempenho substancialmente idêntico em cada canal. Algumas modalidades podem incorporar um laser de onda contínua de pequena pegada, como o Coherent Genesis CW-355. Um laser tão pequeno pode ser colocado em um palco e alinhado diretamente com o local de interrogação. Em algumas modalidades, elementos ópticos, como prismas, espelhos, filtros dicroicos e similares, podem ser incorporados para direcionar o feixe

35 / 87 de laser 26 para o local de interrogação 33 com um caminho de feixe mínimo. Outras modalidades podem incorporar um laser pulsado, como um Vanguard 350-355 (Spectra Physics). O Vanguard 350-355 tem uma pegada significativamente maior, incluindo um comprimento total de quase 3 pés. Como tal, modalidades da presente divulgação incluem a construção de uma plataforma em alinhamento direto com os elementos ópticos de modelagem do feixe para iluminar diretamente o canal de fluxo no local de interrogação. Em outras modalidades, a plataforma pode estar em outro plano e pode incorporar elementos ópticos, como um periscópio, espelhos, prismas e similares para direcionar o feixe de laser para os elementos ópticos de modelagem do feixe para iluminar o canal de fluxo no local de interrogação. Independentemente dos lasers implementados, o caminho de feixe encurtado 27, em combinação com o fornecimento de laser para cada canal de fluxo com elementos ópticos mínimos, mas idênticos ou equivalentes, fornece grandes melhorias no desempenho geral de um ordenador de espermatozoide multicanal, como um Genesis II ou um Genesis III. Outros instrumentos multicanais que incorporam vários bicos em uma única plataforma podem ser igualmente aprimorados.

[096] Voltando à FIG. 1, um caminho de feixe 27 é ilustrado. Como descrito anteriormente, o caminho do feixe pode estar entre 2 e 18 polegadas em algumas modalidades. Em outras modalidades, o caminho do feixe pode ser o mais curto possível ou o mais curto possível. Tanto os elementos ópticos de modelagem do feixe descritos em certas modalidades desta divulgação quanto um caminho de feixe reduzido fornecem melhorias significativas no processo de ordenamento de espermatozoide individualmente, e talvez também forneçam uma sinergia quando usados em conjunto. A título de exemplo, os elementos ópticos de modelagem do feixe atualmente usados no ordenamento de espermatozoides tem uma largura de feixe de 160 mícrons. Como será demonstrado, essa largura do feixe é

36 / 87 subótima na aplicação do ordenamento de espermatozoides. No entanto, as larguras de feixe menores podem ser mais difíceis de alinhar e essas dificuldades podem ser agravadas quando caminhos de feixe mais longos são utilizados.

[097] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, o caminho do feixe 27 pode ser inferior a cerca de 18 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 17 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 16 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 15 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 14 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 13 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 12 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 11 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 10 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 9 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 8 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 7 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 6 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 5 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 4 polegadas de comprimento, ser inferior cerca de 3 polegadas de comprimento ou ser inferior a cerca de 2 polegadas de comprimento.

[098] Modalidades adicionais, incluindo um caminho de feixe curto, incluem um sistema multicanal com vários lasers e múltiplos feixes curtos. Voltando à FIG. 3, a vista frontal dos elementos ópticos de modelagem do feixe 20 de acordo com uma modalidade da presente divulgação é mostrada. Um caminho de feixe 27 é mostrado ao longo do qual o feixe de laser 26 atravessa entre o laser 12 e os elementos ópticos de modelagem do feixe 20. Embora apenas um caminho de feixe seja mostrado na FIG. 3 caminhos de feixe adicionais entre lasers adicionais e elementos ópticos de modelagem do feixe adicionais associada estão dentro do escopo das modalidades da presente divulgação. Por exemplo, pode haver dois ou mais caminhos de feixe entre dois ou mais lasers e dois ou mais elementos ópticos de

37 / 87 modelagem do feixe associados dentro do escopo da presente divulgação. Em tais modalidades, os caminhos de feixe adicionais não podem se sobrepor ou se cruzar de cada laser para cada canal de fluxo associado.

[099] Além disso, nas modalidades em que um instrumento analítico multicanal inclui mais de um caminho de feixe, cada caminho de feixe pode ter o mesmo comprimento. Em modalidades de citômetros de fluxo com dois canais de fluxo, dois lasers associados aos dois canais de fluxo e um caminho de feixe de cada laser para o canal de fluxo associado, o comprimento combinado do caminho de feixe para os dois lasers é inferior a 36 polegadas ou cada feixe o caminho pode ser inferior a 18 polegadas. Nas modalidades em que um instrumento analítico multicanal inclui três canais de fluxo, três lasers associados aos três canais de fluxo e um caminho de feixe de cada laser para o canal de fluxo associado, o comprimento do caminho de feixe combinado para os três lasers é inferior a 54 polegadas ou cada caminho do feixe pode ser inferior a 18 polegadas.

[0100] Os sistemas de citômetros de fluxo de ordenamento de espermatozoides multicanais existentes incluem um único laser que é dividido com um divisor de feixe, propagando dois ou três feixes, menos uma quantidade insignificante de perdas por absorção do componente de divisão em direção a dois ou três canais de fluxo. Esse arranjo requer de 25 a 50 polegadas de caminho do feixe entre a saída do laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe, que focaliza o feixe nas partículas (por exemplo, espermatozoide) na corrente de núcleo. De fato, outros sistemas comerciais de citômetro de fluxo de ordenamento de espermatozoides incorporam um laser dividido de três maneiras, e o caminho mais longo do feixe nesses sistemas comerciais de citômetro de fluxo requer até 65 polegadas entre o laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe. Como pode ser apreciado, os problemas de estabilidade criados de 25 a 50 polegadas são muito mais pronunciados em 65 polegadas. Tais problemas de

38 / 87 instabilidade podem ser agravados pelo fato de que o feixe se expande levemente à medida que viaja. O feixe que entra nos elementos ópticos de modelagem do feixe a partir de um caminho de feixe de 25 polegadas variará do feixe no caminho de feixe de 65 polegadas. Além disso, o comprimento de onda UV usado para ordenar os espermatozoides por sexo é suscetível à deriva térmica, o que significa que correntes de ar, como saídas de ar condicionado ou movimentos técnicos ao redor do instrumento, podem afetar a estabilidade do feixe. Além disso, vibrações ou outro contato físico menor com o citômetro de fluxo pode prejudicar o alinhamento bastante sensível de um perfil de feixe estreito, especialmente com os caminhos de feixe mais longos. Além do próprio comprimento do caminho de feixe, os caminhos mais longos exigem espelhos de direção ou outros elementos ópticos, que introduzem oportunidades adicionais de instabilidade e exigem calibração quando os lasers são substituídos.

[0101] De fato, esses comprimentos de caminho de feixe longo podem contribuir para uma fraca estabilidade do feixe em citômetros de fluxo comerciais. Ao encurtar o comprimento do caminho do feixe de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, um citômetro de fluxo muito mais estável ou instrumento analítico pode ser alcançado. Consequentemente, uma ou mais modalidades da presente divulgação, incluem múltiplos caminhos de feixe cada um tendo um comprimento de caminho de feixe: de inferior a cerca de 18 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 17 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 16 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 15 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 14 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 13 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 12 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 11 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 10 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 9 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 8 polegadas de comprimento, inferior a

39 / 87 cerca de 7 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 6 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 5 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 4 polegadas de comprimento, inferior a cerca de 3 polegadas de comprimento ou inferior a cerca de 2 polegadas de comprimento.

[0102] Como descrito acima, um laser de onda contínua pode ser usado como laser no citômetro de fluxo ou instrumento analítico de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação. Geralmente, aqueles versados na técnica pensaram que os lasers de onda contínua têm desvantagens particulares nas aplicações de citometria de fluxo. No que diz respeito ao espermatozoide, entende-se que a irradiação pode resultar em menor fertilidade do espermatozoide. Como entendido, os lasers de onda contínua tradicional eram grandes, com muita energia, arrefecidos a água, alta falha, baixa vida útil, exigiam alinhamento diário e forneciam um comprimento de onda de banda larga de 333 nm a 363 nm. Esses fatores contribuíram para uma mudança de paradigma para deixar o uso de lasers de onda contínua tradicionais para lasers pulsados, de melhor custo-benefício, de menor tamanho, econômicos, arrefecidos a ar, tinham uma cavidade de alinhamento fixa internamente e forneciam um sistema de comprimento de onda único. A alta potência de pico do laser pulsado permitiu uma mudança no uso de um único laser para fornecer feixes de laser divididos para instrumentos multicanais. Além disso, os lasers pulsados de comprimento de onda único eram muito eficientes em saturar os corantes de ligação ao DNA com potências de pico muito altas. No entanto, o inventor descobriu os elementos ópticos de modelagem do feixe, o que pode reduzir a necessidade de energia para a ordenamento de espermatozoides.

[0103] Esta divulgação contempla um sistema de ordenamento de espermatozoide multicanal com qualquer número de lasers associados individualmente a canais de fluxo. Como um exemplo, um sistema de ordenamento de espermatozoide Genesis III (Cytonome/ST, Boston

40 / 87 Massachusetts) pode ser modificado para incluir três lasers para cada um dos três canais de fluxo. Numa modalidade, lasers de pegada pequena podem ser colocados com um caminho de feixe entre 2 e 10 polegadas para os respectivos elementos ópticos de modelagem do feixe. Em outra modalidade, o Genesis III pode ser modificado para incluir uma única plataforma ou três plataformas individuais para manter três lasers de pegada maiores em uma posição que fornece um caminho de feixe curto com cada canal de fluxo. Os lasers de pegada maior podem exigir um periscópio ou outros elementos ópticos para distribuir o feixe aos elementos ópticos de modelagem do feixe. Como tal, os caminhos do feixe para lasers de pegada maior podem estar entre 6 polegadas e 12 polegadas.

[0104] Outras modalidades contemplam um Genesis II podem ser modificadas de maneira semelhante para que dois lasers possam ser direcionados para dois canais de fluxo nesses sistemas multicanais. Independentemente do número de lasers e do número correspondente de caminhos de feixe, esta divulgação fornece correspondência de forma de feixe aprimorada e caminhos de feixe reduzidos que aprimoram enormemente a resolução de ordenamento em cada canal de fluxo e que fornecem um desempenho substancialmente semelhante em cada canal. Por outro lado, com configurações anteriores de laser dividido, não é possível diminuir o perfil do feixe dos perfis convencionais de feixe de ordenamento de espermatozoides, pois as instabilidades criadas a partir dos comprimentos do caminho longo são amplificadas, causando instabilidade ainda maior e diminuindo o desempenho do ordenamento. Como tal, os elementos ópticos de modelagem do feixe convencional, com ou sem a incorporação de um divisor de feixe, não pode ter um desempenho suficiente para usar essas potências laser mais baixas e ficar aquém da qualidade de sinal aprimorada realizada pelo caminho do feixe de laser curto e pelos elementos ópticos de modelagem do feixe modificada.

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[0105] Além disso, esta divulgação contempla que lasers pulsados individuais podem estar associados a canais individuais em um sistema multicanal. Esse sistema pode se beneficiar independentemente do caminho de feixe abreviado descrito neste documento e dos elementos ópticos de modelagem do feixe modificados, conforme estabelecido neste documento. Tais sistemas também podem se beneficiar sinergicamente da combinação do caminho de feixe abreviado e dos elementos ópticos de modelagem do feixe modificados descrita neste documento. Em particular, esse instrumento pode fornecer substancialmente o mesmo desempenho em cada canal de um citômetro de fluxo, demonstrando um aprimoramento drástica nos sistemas atuais que dividem um único laser em vários canais de fluxo e incluem caminhos de feixes de até 65 polegadas. Além disso, os elementos ópticos de modelagem do feixe e o caminho reduzido do feixe, que serão mostrados abaixo para fornecer flexibilidade na potência do feixe e na taxa de evento, beneficiam cada canal igualmente, sem perdas adicionais ou problemas de alinhamento dos elementos ópticos de divisão do feixe.

[0106] De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, um método para gerar uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis pode ser realizado usando qualquer um dos instrumentos analíticos ou instrumentos analíticos multicanais descritos neste documento.

[0107] Por exemplo, em uma ou mais modalidades, o método pode incluir a criação de um fluxo coaxial de uma corrente de fluido que inclui uma corrente de núcleo interna de um fluido de amostra com diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial e uma corrente externa de um fluido de revestimento, modificando um feixe de laser para ter uma altura de feixe e uma largura de feixe, combinando substancialmente uma largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser com uma porção de centro da largura do feixe, interrogando o espermatozoide na corrente de

42 / 87 núcleo com o padrão de feixe laser, detectando uma resposta à interrogação do espermatozoide, gerando pelo menos um sinal com base na resposta detectada e classificando uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide com base em pelo menos um sinal.

[0108] Em modalidades usando um instrumento analítico multicanal, o método mencionado acima pode empregar, por exemplo, primeiro e segundo fluxos coaxiais de uma corrente de fluido, primeira e segunda correntes de núcleo internas, primeira e segunda correntes externas, primeiro e segundo feixes de laser gerados ao longo do primeiro e segundo caminhos de feixe de laser que não se sobrepõem. Em tais modalidades, o método inclui modificar o primeiro feixe de laser e o segundo feixe de laser para que cada um tenha uma altura e largura de feixe, interrogando o espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna com o primeiro feixe modificado e interrogando o espermatozoide na segunda corrente de núcleo interna com o segundo feixe de laser modificado, detectando uma resposta à interrogação do espermatozoide com o primeiro feixe modificado e detectando uma resposta à interrogação do espermatozoide com o segundo feixe de laser modificado, gerando pelo menos um primeiro sinal com base na resposta detectada à interrogação do espermatozoide com o primeiro laser modificado e gerando pelo menos um segundo sinal com base na resposta detectada à interrogação do espermatozoide com o segundo feixe de laser modificado e classificando uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna baseada em pelo menos um primeiro sinal e ordenando uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide na segunda corrente de núcleo interna com base em pelo menos um segundo sinal. Em tais métodos, o uso de lasers individuais e caminhos de feixe curto que não se sobrepõem pode fornecer corrente de fluido em um instrumento multicanal com desempenho substancialmente idêntico. Como usado em toda parte, "desempenho substancialmente idêntico" significa que a forma e

43 / 87 a intensidade do feixe de laser modificado são quase idênticas no local de interrogação de cada corrente de fluido quando essas correntes de fluido são interrogadas com o mesmo laser na mesma potência como resultado de elementos ópticos de modelagem do feixe idênticos ou equivalentes em cada caminho de feixe em um instrumento multicanal e que cada feixe tenha o mesmo desempenho em termos de estabilidade. Em contraste, os instrumentos anteriores utilizaram um único laser que foi dividido e direcionado para cada canal. Tais elementos ópticos incluem espelhos dicroicos projetados para refletir uma porção da energia do feixe e transmitir uma porção da energia do feixe. Enquanto tais espelhos são selecionados e configurados para suprir teoricamente cada canal com perfis de feixe idênticos, verificou-se que um grau crescente de divergência ocorre no feixe que viaja ao longo do caminho do feixe mais longo. Verificou-se também que o feixe que viaja pelo caminho mais longo é o menos estável. Movimentos ou vibrações, e até correntes de ar provenientes das saídas de ar condicionado, têm um impacto muito maior no feixe que viaja pelo caminho mais longo do feixe. Um desempenho substancialmente idêntico, com relação a múltiplos canais em um sistema analítico, pode ser determinado empiricamente com base no desempenho de ordenamento em cada cabeçote de ordenamento, assumindo que cada cabeçote de seleção esteja alinhado e executando amostra comparável, comparando a facilidade de alinhamento, estabilidade, PVR ou alguma combinação dos mesmos em cada canal.

[0109] A FIG. 7 ilustra um exemplo genérico de gráficos bivariados e histogramas correspondentes produzidos durante a operação de um citômetro de fluxo de ordenamento de espermatozoide e ilustra especificamente a resolução de ordenamento conforme visualizada em um monitor de citômetro de fluxo durante o ordenamento. Como mencionado anteriormente, de acordo com uma ou mais modalidades, o analisador 13

44 / 87 analisa a fluorescência frontal do material de emissão seletiva de DNA, conforme detectado pelo primeiro detector 11a, e a fluorescência lateral do material de emissão seletiva de DNA, conforme detectado pelo segundo detector 11b. Por conseguinte, o gráfico bivariado superior da FIG. 7 ilustra eventos em função do pico de fluorescência frontal e pico de fluorescência lateral. A partir desse gráfico, o espermatozoide orientado e o espermatozoide morto são facilmente identificáveis. De fato, regiões podem ser desenhadas em torno dessas populações de espermatozoide e seus números podem ser rastreados como números absolutos ou como porcentagens. A FIG. 7 ilustra duas dessas regiões desenhadas no gráfico bivariado, mostrando que 77,42% dos espermatozoides estavam adequadamente orientados e 10,05% dos espermatozoides estavam mortos, com base nas células dentro dessas regiões. Somente espermatozoides na região orientada são plotados no segundo gráfico bivariado (pico vs. área integrada) na parte inferior da tela. No segundo gráfico, a subpopulação superior de espermatozoides orientados inclui espermatozoides portadores de cromossomo X e a subpopulação inferior de espermatozoides orientados inclui espermatozoides portadores de cromossomo Y. A partir desse segundo gráfico, uma região de ordenamento pode ser desenhada por um operador em torno da subpopulação de interesse. Como mostrado na FIG. 7, por exemplo, a região de ordenamento "X" inclui espermatozoides que foram ordenados como espermatozoides portadores de cromossomo X. De acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, o citômetro de fluxo ou instrumento analítico com um elemento assimétrico pode ordenar os eventos que caem na região de ordenamento especificada em um tubo de coleta.

[0110] Ainda com referência à FIG. 7, o citômetro de fluxo ou instrumento analítico de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação pode incluir um pacote de software de rastreamento de população que rastreia o centro de massa de certas populações de dados. Por exemplo,

45 / 87 como as duas subpopulações muito próximas no gráfico bivariado inferior da FIG. 7 derivam ao longo do tempo, o software de rastreamento de população tentaria manter a região de ordenamento “X” acima da população de células principal. Exemplos não limitativos de pacotes de rastreamento de software adequados incluem o software CyTrackTM nos citômetros de fluxo MoFloTM da Beckman Coulter ou no software de rastreamento dos citômetros de fluxo Cytonome/ST’s GenesisTM, bem como o software descrito no Número de Pedido Internacional PCT/US2004/009646. Também pode ser incorporado software que gera regiões de ordenamento com base na entrada do usuário, como uma pureza desejada. A FIG. 7 representa uma imagem gerada a partir de um citômetro de fluxo Cytonome/ST Genesis TM. Pode-se observar que o número de eventos nos picos, mais especificamente a média de dois picos, e o número de eventos no vale são determinados e uma PVR em andamento é exibida durante a operação de ordenamento. Esta PVR representa a quantidade de sobreposição entre as subpopulações presumíveis portadores dos cromossomos X e Y. Como tal, a PVR é discutida ao longo desta divulgação no contexto de uma medida de resolução.

[0111] Ainda com referência à FIG. 7, o lado direito do monitor do citômetro de fluxo mostra um histograma correspondente de uma resolução de ordenamento resultante entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Novamente, apenas o espermatozoide que cai na região rotulada como orientada é exibido no histograma. Especificamente, o histograma que ilustra dois picos mostra como as subpopulações foram resolvidas. Neste exemplo, a PVR é de 66%. Para referência, uma PVR de 100% indicaria que o vale branco que separa as subpopulações X e Y atinge a linha de base e representaria uma resolução perfeita.

EXEMPLO 1

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[0112] As FIGS. 8 e 9 ilustram os resultados de experimentos realizados com elementos ópticos de modelagem do feixe configurados para modificar a largura do feixe de um Genesis CX-355 para ter uma largura de feixe de 70 μm no local da interrogação de um MoFlo SX (Beckman Coulter, Miami, Flórida) equipado com uma atualização digital Genesis I (Cytonome/ST, Boston Massachusetts). Os núcleos bovinos foram ordenados a uma concentração de 200 milhões de núcleos por ml. Embora muitas aplicações de citometria de fluxo possam ser calibradas e/ou testadas com esferas coradas de vários tipos, o ordenamento de espermatozoide é único em vários aspectos e a calibração é realizada com espermatozoide sonicado ou núcleos de espermatozoides. Os núcleos de espermatozoides fornecem uma resolução melhor que os espermatozoides vivos, mas são inadequados para uso em inseminação artificial porque são incapazes de fertilizar. Além disso, os núcleos de espermatozoides são preferíveis para testar técnicas de ordenamento aprimoradas, porque faltam parte da variabilidade e do ruído presentes nos espermatozoides vivos.

[0113] Com referência agora à FIG. 8, é mostrada uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 70 μm de largura. Especificamente, neste exemplo, um laser de onda contínua usado com uma potência de saída de 100 mW. O histograma esquerdo foi obtido enquanto o citômetro de fluxo foi operado a uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo, o que é relativamente lento. Como a taxa de evento era relativamente lenta, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente pequeno. Como resultado, a maioria dos núcleos de espermatozoides foi bem iluminada pelo feixe de laser com uma largura de 70 μm. De fato, a corrente de núcleo foi tão bem iluminada que, como mostrado no gráfico bivariado superior esquerdo deste exemplo, 84,23% dos núcleos de espermatozoides foram capturados na região orientada. Além disso, como mostrado no histograma à esquerda, a

47 / 87 PVR foi de 94%, indicando uma resolução de ordenamento muito alta entre as populações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y para o espermatozoide orientado. Essa resolução de ordenamento favorável ocorreu em parte porque a uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo, a corrente de núcleo era relativamente pequena, resultando na largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser combinando substancialmente a uma porção de centro da largura de feixe menor de 70 μm. Por exemplo, como determinado anteriormente pelo Requerente, uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo pode corresponder a uma largura da corrente de núcleo interna de cerca de 26 μm. Pode ser apreciado que, quando o feixe de 70 μm está alinhado com a corrente de núcleo, que uma porção mais interna do feixe que compreende pouco mais de um terço da largura total do feixe é combinada com a corrente de núcleo.

[0114] Ainda com referência à FIG. 8, com relação ao histograma representado à direita, o citômetro de fluxo operava a uma taxa de evento de

40.000 eventos por segundo, o que é relativamente rápido. Como a taxa de evento era relativamente rápida, o tamanho da corrente de núcleo interna correspondente era relativamente grande, comparado à corrente de núcleo interna de 10.000 eventos por segundo. Como discutido em relação à FIG. 7, o Requerente determinou que a largura da corrente de núcleo interna em

40.000 eventos por segundo é de cerca de 34 μm. A largura do feixe de 70 μm foi incompatível com essa largura da corrente de núcleo interna relativamente grande. Ou seja, a largura da corrente de núcleo interna era maior que a porção de centro uniforme do perfil do feixe de laser. Como resultado, um número crescente de espermatozoides não era iluminado uniformemente porque ficavam fora da parte substancialmente uniforme e suficientemente poderosa do perfil do feixe. De fato, como mostrado no gráfico bivariado superior esquerdo deste exemplo, apenas 79,53% dos espermatozoides foram capturados na região orientada. Além disso, como

48 / 87 pode ser visto no histograma à direita, a PVR foi de apenas 64% e os picos não foram muito bem definidos, indicando uma baixa resolução de ordenamento entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Considerando que uma porcentagem menor de núcleos estava presente no histograma, pode-se entender que as perdas de resolução podem se agravar rapidamente na aplicação de ordenamento de espermatozoides. Uma comparação entre o histograma à esquerda e o histograma à direita demonstra que quando uma largura da corrente de núcleo interna combina substancialmente a uma porção de centro da largura do feixe, de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, menos energia é desperdiçada e é obtida uma melhor resolução de ordenamento entre subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y.

[0115] A FIG. 9 ilustra dois histogramas representativos de resoluções de ordenamento em condições semelhantes às da FIG. 8. Especificamente, os histogramas foram obtidos no mesmo instrumento analítico, mas o laser de onda contínua forneceu um feixe de laser com uma potência de saída de 150 mW, em oposição a 100 mW. No histograma à esquerda, o citômetro de fluxo operava a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo, o que é relativamente lento. Como descrito anteriormente, a taxa de evento lenta resultou em uma largura da corrente de núcleo interna, que era relativamente pequena. Como ilustrado na FIG. 6, espera-se que a largura da corrente de núcleo interna a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo seja de cerca de 29 μm. O histograma à esquerda da FIG. 9 mostra que a PVR foi de 94%, indicando uma resolução de ordenamento muito alta entre as populações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Pode ser apreciado que não houve perda de desempenho ao passar de 10.000 eventos por segundo para 20.000 eventos por segundo. Isso ocorre porque uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo ainda é relativamente lenta, de

49 / 87 modo que a largura da corrente de núcleo interna correspondente ainda era substancialmente combinada à parte de centro da largura do feixe. Além disso, aumentando a potência de saída do feixe de laser de 100 mW, como mostrado na FIG. 8 a 150 mW, como mostrado na FIG. 9 compensou potencialmente qualquer pequena perda na PVR que possa ter ocorrido em

20.000 eventos por segundo.

[0116] Ainda com referência à FIG. 9, com relação ao histograma resultante à direita, o citômetro de fluxo ou instrumento analítico operava a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo, o que é relativamente rápido. Como a taxa de evento era relativamente rápida, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente grande. Especificamente, os Requerentes acreditam que essa taxa de evento fornece uma largura da corrente de núcleo interna de cerca de 33 μm. Revendo a PVR relativamente ruim, pode-se entender que a largura do feixe de 70 μm foi incompatível com essa largura da corrente de núcleo interna relativamente grande. Ou seja, a porção de centro uniforme da largura do feixe era menor que a largura da corrente de núcleo interna, resultando em espermatozoides nos limites da corrente de núcleo interna recebendo uma exposição a laser significativamente diferente em comparação com os da porção de centro da corrente de núcleo interna. De fato, como mostrado no histograma à direita da FIG. 9, enquanto a PVR melhorou levemente com o uso do laser de onda contínua com uma potência de saída mais alta de 150 mW (em comparação com o laser de onda contínua de 100 mW usado no exemplo da FIG. 8), a PVR ainda era de apenas 70% e os picos não foram muito bem definidos, indicando uma baixa resolução de ordenamento entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Uma comparação entre o histograma à esquerda e os da direita mostra que quando a largura do perfil do feixe combina substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser, de acordo com uma ou

50 / 87 mais modalidades da presente divulgação, menos energia é desperdiçada e é obtida uma melhor resolução de ordenamento entre subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y.

EXEMPLO 2

[0117] Com referência agora às FIGS. 10-25, o Requerente realizou outra experiência com os elementos ópticos de modelagem do feixe configurada para modificar a largura do feixe de um Genesis CX-355 (disponível na Coherent) para ter larguras de feixe de 80 μm, 90 μm, 100 μm e 110 μm no local de interrogação de um espermatozoide MoFlo SX ordenado (Beckman Coulter, Miami Florida) equipado com uma atualização digital Genesis I (Cytonome/ST, Boston Massachusetts). Para cada configuração e largura do feixe, o laser era alimentado a 100 mw, 150 mw, 200 mw e 250 mw. Novamente, cada condição foi testada em duas taxas de evento e os núcleos bovinos foram ordenados em uma concentração de 200 milhões de núcleos por ml.

[0118] A FIG. 10 ilustra uma comparação de histogramas gerados em duas taxas de evento diferentes com um perfil de feixe de 80 μm de largura. Neste exemplo, o laser de onda contínua forneceu um raio laser com uma potência de saída de 100 mW. O histograma à esquerda ilustra o citômetro de fluxo operado a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo, o que é relativamente lento. Como a taxa de evento era relativamente lenta, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente pequeno. Como ilustrado na FIG. 6, espera-se que a largura da corrente de núcleo interna a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo seja de cerca de 29 μm. A PVR do histograma à esquerda foi de 76%, indicando apenas uma resolução moderada de ordenamento entre as populações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Enquanto uma largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser a uma taxa de evento de

20.000 eventos por segundo pode combinar substancialmente à porção de

51 / 87 centro de uma largura de feixe de 80 μm, os resultados representados pelo histograma à esquerda da FIG. 10 sugerem que a potência de saída de 100 mW para o laser de onda contínua usado neste exemplo pode ter sido muito baixa. Com referência ao experimento anterior ilustrado nas FIGS. 8 e 9, pode ser apreciado que o alinhamento de um citômetro de fluxo é cada vez mais difícil em larguras de feixe menores. As FIGS. 10-25 ilustram uma tendência clara, mas pode ser que o instrumento tenha sido extremamente bem alinhado no exemplo anterior.

[0119] Ainda com referência à FIG. 10, o histograma à direita ilustra os resultados obtidos no mesmo citômetro de fluxo operado a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo, o que é relativamente rápido. Como a taxa de evento era relativamente rápida, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente grande e, em particular, é esperado que seja de cerca de 33 μm. A porção do meio da largura do feixe de 80 μm não era substancialmente compatível com a largura da corrente de núcleo interna relativamente grande. Ou seja, a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser era muito grande para a porção de centro uniforme do perfil do feixe. Como resultado, alguns dos espermatozoides que estavam adequadamente orientados ainda não estavam bem iluminados porque ficavam fora da parte do perfil do feixe com um fluxo de energia a laser suficientemente uniforme. De fato, como mostrado no histograma à direita da FIG. 10, a PVR foi de apenas 63% (13% menor que a PVR em 20.000 eventos por segundo) e os picos não foram muito bem definidos, indicando uma baixa resolução de ordenamento entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y.

[0120] Com referência agora às FIGS. 11-13, é mostrada uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 80 μm de largura. Especificamente, as FIGS. 11-13 mostram que o aumento da potência de saída do laser de onda contínua

52 / 87 afeta as resoluções de ordenamento resultantes quando um perfil de feixe de 80 μm de largura é usado.

[0121] Os histogramas gerados na FIG. 11 foram produzidos em resposta a um laser de onda contínua com uma potência de saída de 150 mW. Como ainda é mostrado pelo histograma à esquerda, aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 100 mW, como mostrado na FIG. 10 a 150 mW, como mostrado na FIG. 11 resulta em uma PVR mais alta de 84% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR ligeiramente mais alta de 65% a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Com respeito aos resultados à direita da FIG. 11, no entanto, a taxa de evento relativamente rápida de 40.000 eventos por segundo produziu uma corrente de núcleo correspondente que era relativamente ampla. A largura da corrente de núcleo interna do núcleo voltada para o laser era muito grande e não correspondia substancialmente à porção de centro do perfil do feixe. Como resultado, a PVR somente aumentou para 65% quando a potência foi aumentada para 150 mW, mostrando que o aumento da potência do laser terá apenas um aprimoramento mínimo na resolução de ordenamento resultante se a largura do perfil do feixe for incompatível com o tamanho da corrente de núcleo. De fato, as FIGS. 12 e 13 exemplificam o mesmo.

[0122] Os histogramas gerados na FIG. 12 foram produzidos em resposta a um laser de onda contínua com uma potência de saída de 200 mW. Como mostrado adicionalmente, aumentando a potência de saída do laser de onda contínua de 150 mW, como mostrado na FIG. 12 a 200 mW, como mostrado na FIG. 12 resultam na mesma PVR de 84% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e em uma taxa de PVR ligeiramente mais alta de 68% a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Com respeito aos resultados à direita da FIG. 12, no entanto, a taxa de evento relativamente rápida de 40.000 eventos por segundo produziu uma corrente de núcleo correspondente que era relativamente ampla. E, novamente, a largura da

53 / 87 corrente de núcleo interna voltada para o laser era muito grande e não combinava substancialmente com a porção do centro do perfil do feixe. Como resultado, a PVR aprimorou para 68% quando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 200 mW foi usado, demonstrando novamente que o aumento da potência do laser pode aprimorar marginalmente a resolução do ordenamento se a porção do centro da largura do feixe não combinar com o tamanho da corrente de núcleo.

[0123] A FIG. 13 ilustra dois histogramas gerados a partir de um citômetro de fluxo utilizando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 250 mW. Como ainda é mostrado, aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 200 mW, como mostrado na FIG. 12 a 250 mW, como mostrado na FIG. 13 resulta em uma PVR aprimorada de 89% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR ligeiramente mais alta de 69% a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Com respeito aos resultados à direita da FIG. 13, no entanto, a taxa de evento relativamente rápida de 40.000 eventos por segundo produziu uma corrente de núcleo correspondente que era relativamente ampla. Novamente, a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser era muito grande para, e não combinava substancialmente com a porção de centro do perfil do feixe e, como resultado, a PVR só aprimorou para 69% quando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 250 mW foi utilizado.

[0124] Com referência agora à FIG. 14, é mostrada uma comparação entre histogramas representando resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 90 μm de largura em um citômetro de fluxo. Neste exemplo, um laser de onda contínua forneceu uma potência de saída de 100 mW. Os resultados ilustrados no histograma à esquerda, resultaram do citômetro de fluxo operado a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo, o que é relativamente lento. Novamente, o Requerente espera que essas taxas de evento correspondam a uma largura de corrente de núcleo

54 / 87 interna de 29 μm. Como mostrado no histograma à esquerda, a PVR foi de 91%, indicando uma boa resolução de ordenamento entre as populações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Esse resultado sugere que a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser, quando a taxa de evento é de 20.000 eventos por segundo, combina substancialmente com a porção de centro da largura do feixe de 90 μm. Como também mostrado pelo histograma à esquerda da FIG. 14, uma alta resolução de ordenamento pode ser alcançada, mesmo com um laser de onda contínua de menor potência, a baixas taxas de evento de 20.000 eventos por segundo quando o perfil do feixe tem uma largura de 90 μm.

[0125] Ainda com referência à FIG. 14, o histograma representado à direita gerou uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo, o que é relativamente rápido. Como a taxa de evento era relativamente rápida, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente grande. Novamente, espera-se que a corrente de núcleo gerada a uma taxa de evento tenha uma largura de corrente de núcleo interna de 33 μm. A porção de centro da largura do feixe de 90 μm foi apenas ligeiramente incompatível para esta largura da corrente de núcleo interna relativamente grande, voltada para o laser. Como mostrado no histograma à direita da FIG. 14, a PVR foi de 79%, indicando uma boa resolução de ordenamento entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Uma comparação entre o histograma à esquerda e o histograma à direita mostra que quando a largura do perfil do feixe combina substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser (conforme indicado pelos resultados à esquerda), de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, menos energia é desperdiçada, mais espermatozoides podem ser incluídos na região orientada e é obtida uma melhor resolução de ordenamento entre subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Em comparação com 80 μm, a largura do feixe de 90 μm demonstra uma

55 / 87 convergência aprimorada das PVRs em 20.000 eventos por segundo e 40.000 eventos por segundo.

[0126] Com referência agora às FIGS. 15-17, é mostrada uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 90 μm de largura. Especificamente, as FIGS. 15-17 mostram como o aumento da potência de saída do laser de onda contínua afeta as resoluções de ordenamento resultantes quando um perfil de feixe de 90 μm de largura é usado.

[0127] A FIG. 15 representa dois histogramas gerados a partir de um citômetro de fluxo utilizando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 150 mW. Como pode ser entendido nesta figura, aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 100 mW (como mostrado na FIG. 14) para 150 mW (como mostrado na FIG. 15) resulta na mesma PVR de 91% em uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR ligeiramente mais alta de 82% a uma taxa de evento 40.000 eventos por segundo. A largura do feixe de 90 μm foi apenas ligeiramente incompatível com a largura da corrente de núcleo interna relativamente grande produzida a 40.000 eventos por segundo. Como resultado, a PVR aprimorou para 82% quando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 150 mW foi usado, mostrando que o aprimoramento da potência do laser terá apenas um aprimoramento mínimo na resolução de ordenamento resultante se a porção de centro da largura do perfil do feixe é ligeiramente incompatível com a largura da corrente de núcleo interna.

[0128] A FIG. 16 representa dois histogramas gerados a partir de um citômetro de fluxo utilizando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 200 mW. Como pode ser entendido nesta figura, aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 150 mW (mostrado na FIG. 15) para 200 mW (mostrado na FIG. 16) resulta em uma PVR aprimorada de 97% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR

56 / 87 aprimorada de 86% a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Da FIG. 15, pode ser visto que o aprimoramento da potência de saída do laser de onda contínua a 200 mW pelo menos compensou parcialmente a pequena incompatibilidade entre a porção de centro da largura do feixe de 90 μm e a corrente de núcleo interna relativamente grande.

[0129] A FIG. 17 representa dois histogramas gerados a partir de um citômetro de fluxo utilizando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 250 mW. Como pode ser entendido nesta figura, melhorar a potência de saída do laser de onda contínua de 200 mW (mostrado na FIG. 16) para 250 mW (mostrado na FIG. 17) resulta em uma PVR substancialmente semelhante de 96% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR aprimorado de 92% a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Novamente, qualquer ligeira incompatibilidade entre a porção de centro da largura do feixe de 90 μm e a largura da corrente de núcleo interna relativamente grande é amplamente compensada pelo aumento da potência de saída do laser de onda contínua a 250 mW.

[0130] A FIG. 18, é mostrada uma comparação entre histogramas representando resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 100 μm de largura. Especificamente, neste exemplo, foi usado um laser de onda contínua com uma potência de saída de 100 mW. O histograma à esquerda, mostra a resolução de um citômetro de fluxo operado a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo, o que é relativamente lento. Como a taxa de evento era relativamente lenta, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente pequeno. O histograma à esquerda indica uma PVR de 91%, representando uma boa resolução de ordenamento entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Esse resultado sugere que a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser, quando a taxa de evento é de 20.000 eventos por segundo,

57 / 87 combina substancialmente com a porção de centro da largura do feixe de 100 μm. Como também mostrado pelo histograma à esquerda da FIG. 18, uma alta resolução de ordenamento pode ser alcançada, mesmo com um laser de onda contínua de menor potência, a baixas taxas de evento de 20.000 eventos por segundo quando o perfil do feixe tem uma largura de 100 μm.

[0131] A FIG. 18 representa um histograma à direita que resulta de um citômetro de fluxo operado a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo, o que é relativamente rápido. Como a taxa de evento era relativamente rápida, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente grande. No entanto, a porção de centro da largura do feixe de 100 μm combina substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna relativamente grande, voltada para o laser. De fato, como mostrado no histograma à direita da FIG. 18, a PVR foi de 89%, indicando uma alta resolução de ordenamento entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Como mostrado pelo histograma na FIG. 18, quando a largura do perfil do feixe combina substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser, de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, menos energia é desperdiçada, mais espermatozoides são capturados na região orientada e um melhor ordenamento é alcançado uma resolução entre subpopulações portadoras de cromossomos X e Y. FIG. 18, também ilustra que, quando o perfil de largura do feixe é de 100 μm, muito pouca PVR foi perdida quando a taxa de evento foi aumentada de 20.000 eventos por segundo para 40.000 eventos por segundo. Além disso, a largura do feixe de 100 demonstra, em todas as potências, uma convergência significativa das PVRs em 20.000 eventos por segundo e 40.000 eventos por segundo.

[0132] Com referência agora às FIGS. 19-21, é mostrada uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 100 μm de largura. Especificamente, as FIGS.

58 / 87 19-21 ilustram como o aumento da potência de saída do laser de onda contínua afeta as resoluções de ordenamento resultantes quando um perfil de feixe de 100 μm de largura é usado.

[0133] Na FIG. 19 foi utilizado um laser de onda contínua com uma potência de saída de 150 mW. Com referência à FIG. 18, pode ser entendido que aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 100 mW (como mostrado na FIG. 18) para 150 mW (como mostrado na FIG. 19) resultou em uma PVR maior de 96% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e um PVR ligeiramente superior a 92% a uma taxa de evento de

40.000 eventos por segundo. Com respeito aos resultados à direita da FIG. 19, a taxa de evento relativamente rápida de 40.000 eventos por segundo produziu uma corrente de núcleo correspondente que era relativamente grande. No entanto, a porção de centro da largura do feixe de 100 μm combina substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna relativamente grande, voltada para o laser. Aqui, a PVR aprimorou de 89% para 92% quando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 150 mW foi usado, mostrando que o aumento da potência do laser pode aprimorar um pouco a resolução de ordenamento resultante quando a largura do perfil do feixe combina substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser.

[0134] Como mostrado na FIG. 20, foi utilizado um laser de onda contínua com uma potência de saída de 200 mW. A FIG 20 demonstra que aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 150 mW (como mostrado na FIG. 19) para 200 mW (como mostrado na FIG. 20) resultou em uma PVR ligeiramente menor de 94% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR ligeiramente menor de 91% a uma taxa de evento 40.000 eventos por segundo. Embora a PVR tenha sido ligeiramente reduzido quando a potência de saída do laser de onda contínua foi aumentada para 200 mW neste exemplo, uma PVR de 94% em 20.000 eventos por

59 / 87 segundo e uma PVR de 91% em 40.000 eventos por segundo indica uma alta resolução de ordenamento entre subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Embora possa ser o caso de o citômetro de fluxo estar alinhado ligeiramente melhor durante a porção da experiência em que a FIG. 19 foi capturada, a tendência das FIGS. 18-21 ilustra retornos decrescentes ao aumentar a potência do laser quando a porção de centro da largura do feixe é bem compatível com a largura da corrente de núcleo interna. Além disso, aumentar a potência do laser de onda contínua de 150 mW para 200 mW quando o perfil do feixe tem uma largura de 100 μm pode ser desnecessário. De fato, aumentar a potência do laser não aprimorou a PVR e definir a potência de saída do laser de onda contínua o mais baixo possível (sem comprometer a resolução de ordenamento resultante) pode preservar a saúde e a fertilidade das subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Além de aumentar a vida útil do laser, diminuir o tempo de inatividade e o custo do produto, exigindo a substituição do laser com menos frequência. Além disso, permitindo um menor custo, lasers de menor potência devem ser usados.

[0135] Como mostrado na FIG. 21, foi utilizado um laser de onda contínua com uma potência de saída de 250 mW. Como mostrado adicionalmente, aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 200 mW (como mostrado na FIG. 20) para 250 mW (como mostrado na FIG. 21) resultou em uma PVR ligeiramente menor de 93% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR inalterada de 91% a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Embora a PVR tenha sido ligeiramente reduzida ou inalterada quando a potência de saída do laser de onda contínua foi aumentada para 250 mW neste exemplo, uma PVR de 93% em 20.000 eventos por segundo e uma PVR de 91% em 40.000 eventos por segundo indicam cada um uma alta resolução de ordenamento entre subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Além

60 / 87 disso, aumentar a potência do laser de onda contínua de 200 mW (ou mesmo 150 mW) para 250 mW quando o perfil do feixe tem uma largura de 100 μm pode ser desnecessário pelos mesmos motivos indicados anteriormente.

[0136] A FIG. 22 ilustra dois histogramas comparando as resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura. Especificamente, neste exemplo, uma potência de saída do laser de onda contínua fornecida ao local de interrogação era de 100 mW. O histograma à esquerda foi gerado por um citômetro de fluxo operado a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo, o que é relativamente lento, resultando em uma largura menor da corrente de núcleo interna. O histograma à esquerda tem uma PVR de 94%, indicando uma resolução de ordenamento muito alta entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Esse resultado sugere que a porção de centro da largura do feixe de 110 μm corresponde substancialmente à largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser na taxa de evento de 20.000 eventos por segundo. O histograma à esquerda da FIG. 22, também mostra que uma alta resolução de ordenamento pode ser alcançada, mesmo com um laser de onda contínua de menor potência, a baixas taxas de evento de 20.000 eventos por segundo quando o perfil do feixe tem uma largura de 110 μm.

[0137] Ainda com referência à FIG. 22, o histograma resultante à direita foi gerado em um citômetro de fluxo operado a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo, o que é relativamente rápido, resultando em uma largura maior da corrente de núcleo interna. No entanto, a porção de centro substancialmente uniforme da largura do feixe de 110 μm combina substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna relativamente grande, voltada para o laser. De fato, como mostrado no histograma à direita da FIG. 22, a PVR foi de 86%, indicando uma resolução de ordenamento muito boa entre as subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Como também mostrado pelo histograma na FIG. 22,

61 / 87 quando o perfil de largura do feixe é de 110 μm, não se perde muita PVR quando a taxa de evento é aumentada de 20.000 eventos por segundo para

40.000 eventos por segundo. FIG. 22 ilustra que um perfil de feixe com uma largura de feixe de 110 μm fornece uma excelente opção para ordenar espermatozoides em uma variedade de larguras de feixe.

[0138] Com referência agora às FIGS. 22-25, é mostrada uma comparação entre os histogramas das resoluções de ordenamento resultantes do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura. As FIGS. 22-25 demonstram como o aumento da potência de saída do laser de onda contínua afeta as resoluções de ordenamento resultantes quando um perfil de feixe de 110 μm de largura é usado.

[0139] A FIG. 23 mostra os resultados do aumento da potência do laser de onda contínua para 150 mW. A 150 mW, a mesma PVR de 94% foi medida a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo, a 100 mW na FIG. 22. A 150 mW, uma PVR maior de 92% foi medida a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Com respeito aos resultados à direita na FIG. 23, a taxa de evento relativamente rápida de 40.000 eventos por segundo produziu uma corrente de núcleo correspondente que era relativamente grande. No entanto, a porção de centro da largura do feixe de 110 μm combinou substancialmente com a largura da corrente de núcleo interna relativamente grande, voltada para o laser. Aqui, a PVR melhorou de 86% para 92% quando foi usado um laser de onda contínua com uma potência de saída de 150 mW, mostrando que o aumento da potência do laser quando o perfil do feixe tem uma largura de 110 μm pode alcançar uma resolução de ordenamento ainda mais aprimorada.

[0140] A FIG. 24 mostra os resultados de aumentar ainda mais a potência do laser de onda contínua distribuído ao local de interrogação para 200 mW. A uma taxa de evento de 20.000, o histograma à esquerda mostra a PVR medida de 97% de eventos por segundo, que é até mais alta do que os

62 / 87 resultados de 150 mW. A uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo, o histograma à esquerda mostra a PVR medida de 95%, o que também é um aprimoramento acima de 150 mW. Cada PVR medida em 20.000 eventos por segundo e em 40.000 eventos por segundo cada um indica uma resolução de ordenamento muito alta entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Este exemplo demonstra que aumentar a potência do laser de onda contínua de 150 mW para 200 mW quando o perfil do feixe tem uma largura de 110 μm pode alcançar uma resolução de ordenamento ainda mais próxima.

[0141] A FIG. 25 mostra os resultados de aumentar ainda mais a potência do laser de onda contínua distribuído ao local de interrogação para 250 mW. Como mostrado adicionalmente, aumentar a potência de saída do laser de onda contínua de 200 mW (como mostrado na FIG. 24) para 250 mW (como mostrado na FIG. 25) resultou em uma PVR inalterada de 97% a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo e uma PVR ligeiramente maior de 96% a uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo. Uma PVR de 97% em 20.000 eventos por segundo e uma PVR de 96% em 40.000 eventos por segundo indicam uma resolução de ordenamento muito alta entre subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Como mostrado ainda neste exemplo, aumentar a potência do laser de onda contínua de 200 mW para 250 mW quando o perfil do feixe tem uma largura de 110 μm pode alcançar uma resolução de ordenamento ainda mais aprimorada.

[0142] As FIGS. 22-24 demonstram que uma largura de feixe de 110 μm fornece resultados excepcionais, mesmo em taxas de eventos mais altas de 40.000 eventos por segundo. Ou seja, a porção de centro de uma largura de feixe de 110 μm é substancialmente combinada à largura da corrente de núcleo interna, como taxas de evento de 20.000 e 40.000 eventos por segundo. Muito pouca PVR é perdida quando a taxa de evento é aumentada

63 / 87 de 20.000 eventos por segundo para 40.000 eventos por segundo. Além disso, uma vez que o feixe de laser é modificado para ter uma largura de feixe de 110 μm, o citômetro de fluxo ou instrumento analítico alcança fácil e rapidamente o alinhamento adequado, resultando em melhor desempenho e estabilidade. Ou seja, quando uma largura de feixe de 110 μm é usada, as resoluções de ordenamento resultantes entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y usando o citômetro de fluxo ou o instrumento analítico são consistentemente favoráveis.

[0143] Como mencionado anteriormente em relação aos resultados mostrados nas FIGS. 22-25, aumentar a potência do laser de um laser de onda contínua quando o perfil do feixe tem uma largura de 110 μm pode obter resultados ainda melhores. Anteriormente, aqueles no campo de ordenamento de espermatozoides não teriam procurado usar potências de feixe de onda contínua de 200 mw ou mais. Os primeiros trabalhos de ordenamento de espermatozoides baseavam-se em lasers de onda contínua de tubo de íon arrefecidos a água, que forneciam energia de banda larga, e o aumento da potência desses lasers demonstrou danificar os espermatozoides, resultando em baixa fertilidade. Além disso, esses lasers de banda larga precisavam funcionar em níveis de corrente muito mais altos para obter luz suficiente para resolver efetivamente as populações de espermatozoides portadores de X e Y, causando uma vida útil relativamente curta. Esses lasers de onda contínua de banda larga anteriores durariam apenas algumas milhares de horas antes de serem remanufaturados, em comparação com os lasers DPSS (estado sólido bombeado por diodo) mais recentes, com duração nas dezenas de milhares de horas. Por pelo menos esse motivo, e por outros motivos explicados abaixo, os lasers pulsados têm sido convencionalmente preferidos para citometria de fluxo e aplicações de ordenamento, e particularmente para ordenamento de espermatozoides.

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[0144] Embora o citômetro de fluxo usado para as comparações mostradas nas Figuras 8-25 operado em taxas de evento de 10.000 eventos por segundo, 20.000 eventos por segundo; 40.000 eventos por segundo, também está dentro do escopo da presente divulgação que o instrumento analítico opere a uma taxa de evento entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de 30.000 eventos por segundo; entre cerca de 30.000 e cerca de 40.000 eventos por segundo; entre cerca de 40.000 e cerca de 50.000 eventos por segundo; entre cerca de 50.000 e cerca de 60.000 eventos por segundo; entre cerca de 60.000 e cerca de

70.000 eventos por segundo; entre cerca de 70.000 eventos por segundo e cerca de 80.000 eventos por segundo; e entre cerca de 80.000 eventos por segundo e cerca de 90.000 eventos por segundo.

[0145] As FIGS. 26-28 fornecem três tabelas preparadas em conexão com a experiência que gerou as FIGS. 8-25. Com referência agora à FIG. 26, os resultados da estabilidade do feixe de laser foram registrados pelos operadores do citômetro de fluxo como uma faixa numérica de 1 (instável) a 10 (estável). Os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua foram ajustados primeiro para 70 μm e a potência do laser foi ajustada primeiro para 100 mW. Em seguida, a amostra a ser ordenada foi colocada no ordenador e a amostra foi processada em 40.000 eventos por segundo. Os resultados deste teste foram registrados no gráfico, como mostrado. Posteriormente, a potência do laser foi aumentada para 150 mW, depois para 200 mW e, finalmente, para 250 mW, enquanto os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua permaneceu definida em 70 μm, e todos os resultados foram registrados no gráfico. Em seguida, essas etapas foram repetidas com os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua ajustado para 80 μm, 90 μm, 100 μm e 110 μm, e todos esses resultados também foram registrados no gráfico.

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[0146] Como mostrado pela tabela na FIG. 26, qualquer tamanho de largura de feixe na faixa de 70 μm a 110 μm possui estabilidade excepcional com potências de laser de onda contínua mais altas de 200 mW e 250 mW. Como mostrado pelos resultados, as larguras de perfil de feixe na faixa de 100 μm a 110 μm têm estabilidade excepcional em qualquer potência do laser de onda contínua na faixa de 100 mW a 250 mW, mesmo em potências menores de 100 mW e 150 mW. Como demonstrado pelos resultados, uma largura de perfil de feixe de 90 μm tem uma estabilidade muito boa a excepcional com potências de laser de onda contínua na faixa de 100 mW a 250 mW.

[0147] Com referência agora à FIG. 27, são mostrados resultados de facilidade de alinhamento ao testar um laser de onda contínua em várias potências de laser e várias larguras de perfil de feixe. Os operadores familiarizados com o alinhamento de ordenadores de espermatozoides registraram pontuações numéricas que variaram de 1 (alinhamento difícil) a 10 (alinhamento fácil) durante esse experimento. Especificamente, os resultados da facilidade de alinhamento dizem respeito à facilidade de alinhar uma amostra de núcleos com um laser de onda contínua. Nesse teste de facilidade de alinhamento, os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua foram ajustados primeiro para 70 μm e a potência do laser foi ajustada primeiro para 100 mW. Em seguida, a amostra a ser ordenada foi colocada no ordenador e a amostra foi processada em 40.000 eventos por segundo. Os resultados deste teste foram registrados no gráfico, como mostrado. Posteriormente, a potência do laser foi aumentada para 150 mW, depois para 200 mW e, finalmente, para 250 mW, enquanto os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua permaneceram definidos em 70 μm, e todos os resultados foram registrados no gráfico mostrado na FIG. 27. Em seguida, essas etapas foram repetidas com os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua

66 / 87 ajustado para 80 μm, 90 μm, 100 μm e 110 μm, e todos esses resultados também foram registrados no gráfico.

[0148] Como mostrado pelos resultados da FIG. 27, a facilidade de alinhamento geralmente aumenta à medida que a potência do laser de onda contínua aumenta em todas as larguras de perfil de feixe na faixa de 70 a 110 μm. Como mostrado mais adiante, as larguras de perfil de feixe na faixa de 90 μm a 110 μm exibem a melhor facilidade de alinhamento geral, independentemente da potência contínua do laser.

[0149] Com referência agora à FIG. 28, são mostrados os resultados da PVR registrados em cada uma das FIGS. 9-25 em diferentes taxas de evento, desde o teste de um laser de onda contínua em várias potências de laser e várias larguras de perfil de feixe. Nesse teste, os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua foram ajustados primeiro para 80 μm e a potência do laser foi ajustada primeiro para 100 mW. Em seguida, a amostra a ser ordenada foi colocada no ordenador, a amostra foi processada em 20.000 eventos por segundo e os resultados da PVR foram registrados no gráfico. Em seguida, a amostra foi processada em 40.000 eventos por segundo nessas configurações de laser de onda contínua e os resultados da PVR foram registrados no gráfico. Posteriormente, a potência do laser foi aumentada para 150 mW, depois para 200 mW e, finalmente, para 250 mW, enquanto os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua permaneceram definidos em 80 μm, e todos os resultados da PVR com taxas de evento de 20.000 eventos por segundo e 40.000 eventos por segundo foram registrados no gráfico. Em seguida, essas etapas foram repetidas com os elementos ópticos de modelagem do feixe do laser de onda contínua ajustados em 90 μm, 100 μm e 110 μm, e todos os resultados da PVR com taxas de evento de 20.000 eventos por segundo e 40.000 eventos por segundo foram registrados no gráfico também. Como mostrado, os

67 / 87 resultados da PVR são numéricos, com números próximos a 100 indicando um resultado mais favorável da PVR.

[0150] Como mostrado pelos resultados da PVR da FIG. 28, larguras de perfil de feixe na faixa de 90 μm a 110 μm geralmente exibem uma alta PVR a taxas de evento mais lentas de 20.000 eventos por segundo. Em taxas mais altas de evento de 40.000 eventos por segundo, as larguras de perfil de feixe na faixa de 100 μm a 110 μm tiveram o melhor desempenho em relação à PVR. Como mostrado mais adiante, com algumas exceções ou valores extremos, a PVR geralmente aprimorava à medida que a potência do feixe de laser de onda contínua era aumentada. Visualizando as tendências na FIG. 28, geralmente, parece que o teste realizado a 80 μm pode não ter sido realizado em um alinhamento ideal. De fato, a FIG 27 mostra que os operadores consideraram 80 μm como algo difícil de alinhar (com uma pontuação de 4). Também é possível que o desempenho diminua drasticamente nas larguras dos feixes que se aproximam do diâmetro da corrente externa (foram usadas pontas de bico de 70 μm, o que significa que o diâmetro da corrente externa também é de cerca de 70 μm).

EXEMPLO 3

[0151] Um terceiro experimento procurou determinar quão baixa a potência poderia ser ajustada no laser de onda contínua enquanto ainda alcançava uma resolução aceitável de ordenamento de espermatozoides com uma largura de feixe de 110 μm. Novamente, um laser Genesis CX-355 foi utilizado para interrogar núcleos de espermatozoides no local de interrogação de um MoFlo SX (Beckman Coulter, Miami Florida) equipado com uma atualização digital Genesis I (Cytonome/ST, Boston Massachusetts). Os núcleos bovinos foram fornecidos na amostra a uma concentração de 200 milhões de núcleos por ml.

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[0152] Com referência agora à FIG. 29, gráficos bivariados e um histograma correspondente quantificando a resolução de ordenamento resultante, como visualizados em um monitor de citômetro de fluxo utilizando um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 10 mW. Como mencionado anteriormente, de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, o analisador 13 analisa a fluorescência frontal do material de emissão de luz seletiva de DNA, conforme detectado pelo primeiro detector 11a, e a fluorescência lateral do material de emissão de luz seletiva de DNA, conforme detectado pelo segundo detector 11b. Por conseguinte, o gráfico bivariado superior da FIG. 29 ilustra pico de fluorescência frontal e pico de fluorescência lateral a uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo. A partir desse gráfico, os núcleos de espermatozoides orientados e adequados para ordenamento são facilmente identificáveis. Como mostrado, 87,88% dos núcleos de espermatozoides foram capturados na região orientada. Enquanto uma região morta é ilustrada, pode ser apreciado que os núcleos de espermatozoide não sejam manchados com um corante de extinção morto. Somente o espermatozoide orientado é plotado no segundo gráfico bivariado na parte inferior da tela. No segundo gráfico, são mostradas subpopulações orientadas de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. A partir desse segundo gráfico, uma região de ordenamento pode ser desenhada por um operador em torno da subpopulação de interesse. Como mostrado no exemplo da FIG. 29, no entanto, a região de ordenamento não foi desenhada em torno de nenhuma das subpopulações.

[0153] Ainda com referência à FIG. 29, o citômetro de fluxo ou instrumento analítico de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação pode incluir um pacote de software, como o software de rastreamento de população descrito anteriormente, por exemplo, que rastreia o centro de massa de determinadas populações de dados. Por exemplo, como

69 / 87 as duas subpopulações muito próximas no gráfico bivariado inferior da FIG. 29 ao longo do tempo, o software de rastreamento de população tentaria manter a região “X” acima das subpopulações principais de espermatozoides portadores de cromossomo X.

[0154] Ainda com referência à FIG. 29, o lado direito da imagem do monitor do citômetro de fluxo mostra um histograma indicando uma resolução entre subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y a partir do uso de um laser de onda contínua com uma potência de saída de 10 mW e uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo. Neste exemplo, a PVR foi de 85%, que é uma resolução de ordenamento muito boa entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y.

[0155] Ainda com referência à FIG. 29, os resultados mostrados no monitor de citômetro de fluxo deste exemplo são surpreendentes e inesperados. Uma potência de saída de apenas 10 mW significa que o laser de onda contínua usado neste exemplo estava produzindo muito pouca energia. Além disso, o citômetro de fluxo ou instrumento analítico operava a uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo, o que é relativamente lento. Como a taxa de evento era relativamente lenta, o tamanho da corrente de núcleo correspondente era relativamente pequeno. Como resultado, a maioria dos núcleos de espermatozoides foram bem iluminados pelo feixe de laser com uma largura de 110 μm e puderam ser incluídos na região orientada. O que é surpreendente é que, quando o feixe de laser tem uma largura de 110 μm, uma PVR de 85% pode ser alcançada, indicando uma resolução de ordenamento muito boa entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomo X e Y, mesmo que a potência de saída do laser de onda contínua seja de apenas 10 mW. Enquanto a PVR resultante deste exemplo foi devida em parte à taxa de evento lenta de 10.000 eventos por segundo, esses resultados não podem ser alcançados com uma

70 / 87 largura de perfil de feixe de 160 μm em um nível de potência de saída de laser tão baixo. Consequentemente, esses resultados mostram que em baixas taxas de evento, é necessária muito pouca potência do laser para obter uma resolução de ordenamento favorável entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y quando o feixe de laser tem uma largura de 110 μm. Significativamente, porque é necessária menos energia do laser, os lasers de onda contínua com uma pegada menor e vidas úteis muito maiores podem ser usados, e a saúde e a fertilidade das subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y podem ser preservadas e/ou aprimoradas.

[0156] A FIG. 30 mostra gráficos bivariados e correspondentes a um histograma gerado em um monitor de citômetro de fluxo utilizando um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 10 mW a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo. O gráfico bivariado superior da FIG. 30 ilustra pico de fluorescência frontal e pico de fluorescência lateral. A partir desse gráfico, o espermatozoide orientado é facilmente identificável. Como mostrado, 88,09% dos espermatozoides foram incluídos na região de espermatozoide orientado. Uma comparação entre este gráfico da FIG. 30 e o gráfico correspondente da FIG. 29 mostra que aproximadamente a mesma porcentagem de espermatozoides tinha a orientação adequada quando a taxa de evento aumentou de 10.000 eventos por segundo para 20.000 eventos por segundo. Ou seja, aumentar a taxa de eventos não afetou negativamente o número de núcleos de espermatozoide coletados na região orientada. Somente eventos na região orientada são plotados no segundo gráfico bivariado na parte inferior da tela. No segundo gráfico, são mostradas subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. A partir desse segundo gráfico, uma região de ordenamento pode ser desenhada por um operador em torno da subpopulação de interesse. Como mostrado no exemplo da FIG. 30, no entanto, a região de

71 / 87 ordenamento não foi desenhada em torno de nenhuma das subpopulações. Como descrito anteriormente, um pacote de software de rastreamento de população pode ser usado de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação para tentar manter a região "X" sobre a população principal de células como as duas subpopulações muito próximas no gráfico bivariado inferior de FIG. 30 deriva ao longo do tempo.

[0157] Ainda com referência à FIG. 30, o lado direito do monitor do citômetro de fluxo mostra o histograma correspondente quantificando a resolução de ordenamento entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y a partir do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua com uma potência de saída de 10 mW a uma taxa de evento de 20.000 eventos por segundo. Neste exemplo, a PVR foi de 79%, indicando que alguma PVR foi perdida quando a taxa de evento foi aumentada de 10.000 eventos por segundo, como mostrado na FIG. 29 a 20.000 eventos por segundo, como mostrado na FIG.

30. Esses resultados mostram que, como a taxa de eventos foi aumentada para 20.000 eventos por segundo, a largura da corrente de núcleo interna voltada para o laser não combinou substancialmente com a largura do perfil do feixe usada.

Com referência agora à FIG. 31, gráficos bivariados e um histograma correspondente gerado em um monitor de citômetro de fluxo utilizando um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 25 mW são mostrados.

[0158] O gráfico bivariado superior da FIG. 31 ilustra pico de fluorescência frontal e pico de fluorescência lateral a uma taxa de evento de

10.000 eventos por segundo. A partir desse gráfico, o espermatozoide orientado é facilmente identificável. Como mostrado, 87,78% dos núcleos de espermatozoides foram incluídos na região orientada. Somente eventos incluídos na região orientada são plotados no segundo gráfico bivariado na

72 / 87 parte inferior da tela. No segundo gráfico bivariado, subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y são mostrados como dois clusters muito próximos de eventos. A partir desse segundo gráfico, uma região de ordenamento pode ser desenhada por um operador em torno da subpopulação de interesse. Como mostrado no exemplo da FIG. 31, no entanto, a região de ordenamento não foi desenhada em torno de nenhuma das subpopulações. Como descrito anteriormente, um pacote de software de rastreamento de população pode ser usado de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação para tentar manter a subpopulação "X" sobre a população principal de células como as duas subpopulações muito próximas no gráfico bivariado inferior da deriva da FIG. 31 ao longo do tempo.

[0159] Ainda com referência à FIG. 31, o lado direito do monitor do citômetro de fluxo mostra o histograma correspondente que quantifica a resolução de ordenamento entre as subpopulações de núcleos de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y a partir do uso de um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua com uma potência de saída de 25 mW a uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo. Neste exemplo, a PVR foi de 89%, que é uma resolução de ordenamento muito boa entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. Além disso, um ligeiro aumento na potência de 10 mW para 25 mW foi capaz de aprimorar um pouco a resolução a uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo.

[0160] Ainda com referência à FIG. 31, os resultados mostrados no monitor de citômetro de fluxo deste exemplo são surpreendentes e inesperados. 25 mW está bem abaixo das potências típicas do laser para ordenamento de espermatozoides, que geralmente usam até 175 mW de potência a laser em uma largura de feixe de 160 μm. No entanto, porque a parte de centro da largura do feixe de 110 μm é substancialmente combinada

73 / 87 à largura da corrente de núcleo interna a uma taxa de evento de 10.000 eventos por segundo. O que é surpreendente é que, quando o feixe de laser tem uma largura de 110 μm, uma PVR de 89% pode ser alcançada, indicando uma resolução de ordenamento muito boa entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomo X e Y, mesmo que a potência de saída do laser de onda contínua seja de apenas 25 mW. Embora a PVR resultante deste exemplo se deva em parte à taxa de evento lenta de 10.000 eventos por segundo e à potência do laser ligeiramente aumentada de 10 mW, como mostrado na FIG. 29 a 25 mW, como mostrado na FIG. 31, esses resultados não podem ser alcançados com uma largura de perfil de feixe de 160 μm com um nível de potência de saída do laser tão baixo. Consequentemente, esses resultados mostram que em baixas taxas de evento, é necessária potência do laser de menor magnitude para obter uma resolução de ordenamento favorável entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y quando o feixe de laser tem uma largura de 110 μm. Significativamente, porque é necessária menos potência do laser, podem ser utilizados lasers de onda contínua com uma pegada menor, e a saúde e fertilidade das subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y podem ser preservadas ou de fato aprimoradas usando menos manchas nas amostras de espermatozoides durante o manchamento.

[0161] A FIG. 32 mostra gráficos bivariados e um histograma correspondente quantificando a resolução de ordenamento, como visualizado em um monitor de citômetro de fluxo utilizando um perfil de feixe de 110 μm de largura e um laser de onda contínua de 25 mW. Novamente, o gráfico bivariado superior da FIG. 32 ilustra o pico de fluorescência frontal e o pico de fluorescência lateral de eventos detectados operando a uma taxa de eventos de 20.000 eventos por segundo. A partir desse gráfico, o espermatozoide orientado é facilmente identificável. Como mostrado, 88,32% dos núcleos de espermatozoides foram capturados na

74 / 87 região orientada. Uma comparação entre este gráfico da FIG. 32 e o gráfico correspondente da FIG. 31 mostra que a resolução permitiu que a mesma porcentagem de núcleos de espermatozoides fosse capturada na região orientada quando a taxa de evento foi aumentada de 10.000 eventos por segundo para 20.000 eventos por segundo. Ou seja, aumentar a taxa de evento não afetou adversamente a resolução dos instrumentos. Somente núcleos de espermatozoides na região orientada do primeiro gráfico bivariado são incluídos no segundo gráfico bivariado na parte inferior da tela. No segundo gráfico, são mostradas subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y. A partir desse segundo gráfico, uma região de ordenamento pode ser desenhada por um operador em torno da subpopulação de interesse. Como mostrado no exemplo da FIG. 32, no entanto, a região de ordenamento não foi desenhada em torno de nenhuma das subpopulações. Como descrito anteriormente, um pacote de rastreamento de população pode ser usado de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação para tentar manter a subpopulação "X" sobre a população principal de células conforme as duas subpopulações muito próximas no gráfico bivariado inferior da deriva da FIG. 32 ao longo do tempo.

[0162] Ainda com referência à FIG. 32, o lado direito do monitor do citômetro de fluxo mostra um histograma representando a resolução de ordenamento entre subpopulações de núcleos de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y em um citômetro de fluxo usando um laser de onda contínua com uma potência de saída de 25 mW e uma taxa de evento de

20.000 eventos por segundo. Neste exemplo, a PVR foi de 90%, indicando uma alta resolução de ordenamento entre os núcleos de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. Esses resultados também indicam que nenhuma PVR foi perdida quando a taxa de evento foi aumentada de 10.000 eventos por segundo (como mostrado na FIG. 31) para 20.000 eventos por

75 / 87 segundo (como mostrado na FIG. 32). Quando comparado com a FIG. 30, como descrito anteriormente, esses resultados mostram que aumentar ligeiramente a potência de saída do laser de 10 mW para 25 mW melhora significativamente a PVR na taxa de evento mais rápida de 20.000 eventos por segundo. Como entendido por aqueles versados na técnica, uma potência de saída de laser de 25 mW ainda é muito baixa. Consequentemente, esses resultados mostram que em taxas de evento de 20.000 eventos por segundo, é necessária uma quantidade muito baixa de potência do laser para obter uma resolução de ordenamento favorável entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomos X e Y quando o feixe de laser tem uma largura de 110 μm. Significativamente, porque é necessária menos potência do laser, os lasers de onda contínua com uma pegada menor, e a saúde e a fertilidade das subpopulações de espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y podem ser preservadas ou de fato aprimoradas.

EXEMPLO 4

[0163] A estabilidade do feixe pode ser bastante aprimorada com um caminho de feixe reduzido em comparação com os citômetros de fluxo convencionais e, como exemplificado neste Exemplo 4, essa melhoria resulta em melhor resolução de ordenamento, bem como em melhores velocidades e eficiência de ordenamento. Com referência agora às FIGS. 33-37, são ilustrados vários resultados que destacam esses benefícios. Resumidamente, nesta experiência, o espermatozoide bovino vivo foi ordenado em dois sistemas de ordenamento de espermatozoides. O primeiro sistema de ordenamento de espermatozoides foi um MoFlo SX (Beckman Coulter, Miami, Flórida) modificado com a atualização digital Genesis I (Cytonome/ST, Boston Massachusetts) incluindo um laser Coherent Genesis CX-355 de onda contínua. O segundo ordenador de espermatozoide também foi um MoFlo SX modificado com a atualização digital Genesis I, mas serviu como um sistema de controle para comparação e utilizou um laser pulsado

76 / 87 Vanguard 350-355 com elementos ópticos de modelagem do feixe convencionais e um caminho de feixe convencional de 35 polegadas.

[0164] No experimento, os espermatozoides originários de um único touro foram corados e a amostra viva corada foi dividida em duas alíquotas. Uma alíquota ordenada no primeiro sistema com o laser de onda contínua Coherent Genesis CX-355. O caminho do feixe foi estabelecido em 6 polegadas e o espermatozoide foi ordenado em uma taxa de evento de 40.000 eventos por segundo até que um alvo de 90 milhões de células com uma pureza de 90% de espermatozoides portadores de cromossomo X fosse atingido. Conforme descrito anteriormente, a largura do feixe de 110 μm tem uma porção de centro que é substancialmente combinada a uma corrente de núcleo interna de um citômetro de fluxo operando a uma taxa de evento de

40.000 eventos por segundo. Por conseguinte, o primeiro sistema pode ser referido ao longo deste exemplo como o sistema de ordenamento de espermatozoide modificado.

[0165] A FIG. 33 mostra um gráfico comparando porcentagens de espermatozoides na região orientada do monitor do citômetro de fluxo resultante do uso de um Coherent Genesis com o caminho de feixe reduzido e o laser de onda contínua para o controle que possui o laser pulsado Vanguard. Ao longo do experimento de quatro horas, o controle, incluindo o laser pulsado Vanguard, teve casos em que uma porcentagem maior de espermatozoide foi capturada na região orientada e casos em que uma porcentagem menor de espermatozoide foi capturada na região orientada em comparação com o sistema de ordenamento modificado incluindo o laser de onda contínua Coherent Genesis. Comparado aos resultados do sistema de controle com o laser pulsado Vanguard, as porcentagens de espermatozoides na região orientada resultantes do uso do sistema de ordenamento modificado, incluindo o laser de onda contínua Coherent Genesis, permaneceram mais estáveis durante o curso das quatro horas do

77 / 87 experimento. De fato, a porcentagem de espermatozoide na região orientada variou de cerca de 64,8% a cerca de 68,2% no sistema modificado com o laser de onda contínua Coherent Genesis, enquanto a porcentagem de espermatozoide na região orientada variou de cerca de 63% a cerca de 69,5% o sistema de ordenamento de controle, incluindo o laser pulsado Vanguard.

[0166] A FIG. 34 mostra um gráfico que compara quantidades de espermatozoides dentro de uma região de ordenamento "X", resultando no sistema de ordenamento modificado com laser de onda contínua Coherent Genesis ou no sistema de controle com o laser pulsado Vanguard. Somente espermatozoides das regiões orientadas são incluídos na região de ordenamento "X". O sistema de ordenamento modificado, incluindo o laser de onda contínua Coherent Genesis, permaneceu muito mais estável durante as quatro horas do experimento do que o sistema de ordenamento, incluindo o laser pulsado Vanguard em relação aos resultados da região de ordenamento “X”. No início da comparação de ordenamento, uma leitura de 30,02 é ilustrada nos dados do sistema de controle, fornecendo a região de ordenamento "X" mais baixa do experimento e indicando ainda que o sistema de controle saiu de alinhamento. O desalinhamento tão cedo durante as quatro horas do experimento é indicativo da instabilidade do sistema de ordenamento de controle que possui elementos ópticos de modelagem do feixe convencional e um caminho de feixe convencional. Na metade dos dois conjuntos de dados, cada sistema de citômetro de fluxo foi fornecido com nova amostra manchada para ordenamento.

[0167] Com referência agora à FIG. 35, um gráfico compara taxas de ordenamento de espermatozoides resultantes do uso de um sistema de ordenamento de espermatozoide modificado com o laser de onda contínua Coherent Genesis ou o sistema de controle com o laser pulsado Vanguard. Conforme mostrado, o sistema de ordenamento modificado, incluindo o laser de onda contínua Coherent Genesis, permaneceu muito mais estável durante

78 / 87 as quatro horas do experimento do que o sistema de ordenamento, incluindo o laser pulsado Vanguard em relação aos resultados da taxa de ordenamento. De fato, as três cavidades (excluindo a alteração da amostra) indicam pontos em que o sistema de ordenamento modificado, incluindo o laser pulsado Vanguard, estava fora de alinhamento e exigia a intervenção do operador para continuar o experimento. Essa intervenção do operador é indicativa da instabilidade do sistema de ordenamento de controle, incluindo os elementos ópticos de modelagem do feixe convencional e o caminho do feixe convencional. O sistema de ordenamento modificado, incluindo o laser de onda contínua Coherent Genesis, teve uma taxa média de ordenamento de 7081 eventos por segundo, maior e mais estável do que a taxa média de ordenamento do sistema de ordenamento de controle, incluindo o laser pulsado Vanguard, que era apenas de 6191 eventos por segundo.

[0168] A FIG. 36 ilustra um gráfico que compara os resultados da PVR do sistema de ordenamento modificado com o sistema de ordenamento de controle. Conforme mostrado, o sistema de ordenamento modificado, incluindo o laser de onda contínua Coherent Genesis, forneceu resultados da PVR maiores e muito mais estáveis durante as quatro horas do experimento do que o sistema de ordenamento, incluindo o laser pulsado Vanguard. Ou seja, embora a PVR estivesse em constante movimento, o sistema de ordenamento modificado ainda fornecia uma melhor resolução entre as subpopulações de espermatozoides portadores de cromossomo X e espermatozoides portadores de cromossomo Y. Como mostrado, o sistema de ordenamento modificado permaneceu geralmente estável durante todo o experimento e não exigiu nenhum alinhamento ou ajuste por parte do operador durante as quatro horas. Em contrapartida, no entanto, o sistema de ordenamento de controle exigia a intervenção do operador em quatro instâncias, quando o alinhamento da máquina precisava de ajustes durante o

79 / 87 curso das quatro horas do experimento. Os quatro ajustes são indicados onde o sistema de ordenamento modificado atinge a linha de base.

[0169] Com referência agora à FIG. 37, é ilustrado um gráfico que compara os tempos de ordenamento resultantes do uso do sistema de ordenamento modificado com o sistema de ordenamento de controle. Como mostrado, a taxa média de ordenamento para o sistema de ordenamento modificado foi de 7081 eventos por segundo e demorou cerca de 3,5 horas para o sistema de ordenamento modificado ordenar 90 milhões de espermatozoides. Como mostrado a seguir, a taxa média de ordenamento para o sistema de ordenamento de controle foi de 6191 eventos por segundo, e o sistema de ordenamento de controle não conseguiu ordenar 90 milhões de espermatozoides em quatro horas, embora o sistema de ordenamento estivesse próximo. Estes resultados mostram que melhor desempenho e produtividade pode ser alcançado a partir do uso de um sistema de ordenamento incluindo uma via de feixe curto que melhora a estabilidade do feixe e um elemento óptico de modelagem do feixe tendo uma largura que melhora a óptica de modelagem do feixe e vias de feixe mais curtas em conformidade com uma ou mais modalidades da presente divulgação, um sistema de ordenamento mais estável e mais eficiente pode ser realizado.

[0170] Agora em referência à FIG. 38, é mostrada uma tabela que compara os resultados do controle de qualidade dos espermatozoides pré e pós-congelados que foram previamente classificados por um sistema de classificação, que inclui um laser de ondas contínuas Coherent Genesis ou um laser pulsado Vanguard .Especificamente, estes são os resultados do controle de qualidade dos espermatozoides que foram previamente classificados pelo experimento de quatro horas descrito acima em relação às Figuras 33-37.Os resultados pós-congelamento são um ótimo indicador da viabilidade do espermatozoide sexado. Além disso, os espermatozoides sexados que sobrevivem ao congelamento são os mais fortes e são da mais

80 / 87 alta qualidade. Conforme mostrado, um sistema de classificação que inclui um laser de onda contínua Coherent Genesis produz espermatozoides sexados que são de uma qualidade pós-congelamento que é comparável ao produzido por meio de um sistema de classificação que inclui um laser pulsado Vanguard.Especificamente, não há muita motilidade visual, viabilidade ou PIA ("acrossoma primário intacto", que é indicativo da capacidade do espermatozoide de fertilizar), se houver, é perdido quando um laser de onda contínua é usado em vez de um laser pulsado em aplicações de classificação de espermatozoides. Isso mostra que os sistemas de classificação de acordo com uma ou mais modalidades da presente divulgação, que incluem sistemas de distorção e lasers de ondas contínuas são capazes de produzir espermatozoides sexados de boa qualidade e, contrariamente à atual escola de pensamento descrita acima, lasers de ondas contínuas, pelo menos quando utilizados de acordo com modalidades da presente divulgação, não está destruindo o espermatozoide ou afetando adversamente a saúde e a fertilidade do espermatozoide.

EXEMPLO 5

[0171] As FIG. 39-40 ilustram vários resultados, incluindo as PVRs, obtidas de um experimento que compara o desempenho de classificação de espermatozoides de um tipo convencional de sistema de classificação, que inclui um laser pulsado Vanguard 350-355 e um sistema de classificação modificado, que inclui um laser de onda contínua Coherent Genesis CX-355 são mostrados. No experimento, os espermatozoides originários de um único touro foram corados e a amostra viva corada foi dividida em duas alíquotas. Uma alíquota foi colocada em um sistema de classificação que compreende um MoFlo SX (Beckman Coulter, Miami Florida) equipado com uma atualização digital Genesis I (Cytonome/ST, Boston Massachusetts) e um laser pulsado Vanguard 350-355.O caminho do feixe da Vanguard era de 35 polegadas. A outra alíquota foi colocada em uma triagem Genesis II

81 / 87 (Cytonome/ST, Boston Massachusetts) que incluía um laser de ondas contínuas Coherent Genesis CX-355 com um caminho de feixe de 8 polegadas. O objetivo era monitorar e registrar a PVR resultante de cada amostra em resposta aos diferentes lasers em várias potências de laser e larguras de feixe em uma gama de taxas de eventos crescentes. A FIG. 39 fornece uma tabela de valores obtidos durante este experimento em várias taxas de eventos e potências em ambos os sistemas. A FIG. 40 fornece uma representação gráfica das PVRs obtidos sob cada condição e corresponde aos valores na FIG. 39.Certas tendências podem ser mais aparentes na FIG. 40, particularmente entendendo-se que cada agrupamento de barras começa na menor taxa de eventos testados e progride até a maior taxa de eventos testados.

[0172] O sistema de classificação, incluindo o laser pulsado Vanguard, foi inicialmente testado com uma potência de 105 mW, com largura de feixe definida em 160 μm. Nessas configurações, a amostra da alíquota foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo, 40.000 eventos por segundo, 50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e

70.000 eventos por segundo. Em seguida, a potência do laser do sistema da classificação foi aumentada para 175 mW, enquanto a largura do feixe permaneceu em 160 μm. Nessa configuração, a amostra foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo, 40.000 eventos por segundo,

50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e 70.000 eventos por segundo. Os resultados de cada um desses ensaios foram registrados, conforme mostrado nas FIG. 39-40.

[0173] Conforme mostrado nas FIG. 39-40, o sistema de classificação, incluindo o laser pulsado Vanguard, não alcança resultados aceitáveis de PVR com baixa potência do laser de 105 mW. De fato, a PVR estava apenas

82 / 87 na faixa de 53 a 61% nas taxas de eventos de 20.000 a 70.000 eventos por segundo, quando a potência do laser pulsado da Vanguard estava em 105 mW. Como demonstrado em mais detalhes, esse sistema de classificação teve um bom desempenho em baixas taxas de eventos quando a potência do laser foi aumentada para 175 mW antes de cair drasticamente, pois as taxas de eventos aumentaram em até 70.000 eventos por segundo. De fato, a PVR estava em 80 quando a taxa de eventos era de 20.000 eventos por segundo, mas somente em 51 foi quando a taxa de eventos aumentou para 70.000 eventos por segundo.

[0174] O sistema de classificação, incluindo o laser de ondas contínuas Coherent Genesis, foi testado a uma potência de laser de 100 mW, com uma largura de feixe definida em 110,5 μm. Nessa configuração, a amostra de alíquota foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo,

40.000 eventos por segundo, 50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e 70.000 eventos por segundo. Em seguida, a largura do feixe foi aumentada para 120,4 μm enquanto a potência do laser permaneceu definida em 100 mW. Nessa configuração, a amostra de alíquota foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo, 40.000 eventos por segundo, 50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e

70.000 eventos por segundo. Em seguida, a largura do feixe foi aumentada para 130,9 μm, enquanto a potência do laser permaneceu definida em 100 mW. Nessa configuração, a amostra de alíquota foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo, 40.000 eventos por segundo, 50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e 70.000 eventos por segundo. Os resultados de cada um desses ensaios foram registrados, conforme mostrado nas FIG. 39-40.

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[0175] Em seguida, a potência do laser do sistema de classificação, incluindo o laser de ondas contínuas Coherent Genesis, foi aumentada para 175 mW e a largura do feixe foi definida em 110,5 μm. Nessa configuração, a amostra foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo,

40.000 eventos por segundo, 50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e 70.000 eventos por segundo. Em seguida, a largura do feixe foi aumentada para 120,4 μm enquanto a potência do laser permaneceu definida em 175 mW. Nessa configuração, a amostra de alíquota foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo, 40.000 eventos por segundo, 50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e

70.000 eventos por segundo. Em seguida, a largura do feixe foi aumentada para 130,9 μm, enquanto a potência do laser permaneceu definida em 175 mW. Nessa configuração, a amostra de alíquota foi classificada por três minutos em cada uma das taxas crescentes de eventos de 20.000 eventos por segundo, 30.000 eventos por segundo, 40.000 eventos por segundo, 50.000 eventos por segundo, 60.000 eventos por segundo e 70.000 eventos por segundo. Os resultados de cada um desses ensaios foram registrados, conforme mostrado nas FIG. 39-40.

[0176] Conforme mostrado nas FIG. 39-40, mesmo no nível mais baixo de potência do laser de 100 mW, o sistema de classificação, incluindo o laser de ondas contínuas Coherent Genesis, era geralmente mais estável do que o sistema de classificação, incluindo o laser pulsado Vanguard em todas as larguras de feixe, aumentando as taxas de eventos. Os elementos ópticos de modelagem de feixe do sistema que incorpora o laser Genesis combinava melhor a parte de centro da largura do feixe com a largura da corrente de núcleo em várias taxas de eventos. Além disso, o caminho abreviado do feixe de 8 pol permitiu que as larguras do feixe combinadas mais próximas fossem

84 / 87 alinhadas com estabilidade aprimorada e, portanto, resultados aprimorados em várias larguras. Conforme mostrado em relação ao sistema de classificação, que inclui o laser de ondas contínuas Coherent Genesis, a largura menor do feixe de 110,5 μm teve um desempenho melhor que as larguras maiores do feixe em taxas de eventos mais baixas, como, por exemplo, 20.000 eventos por segundo e 30.000 eventos por segundo.

[0177] As FIG. 39-40 também mostram os resultados no nível de potência do laser de 175 mW no sistema de classificação, incluindo o laser de ondas contínuas Coherent Genesis. As FIG. 39-40 ilustram que a estabilidade aprimorada e as resoluções particularmente boas foram adicionalmente mais beneficiadas pelo aumento da potência em todas as larguras de feixe e taxas de eventos. De fato, na medida em que a largura da corrente de núcleo do fluido da amostra aumenta, conforme a taxa de eventos aumenta durante a triagem, o sistema de classificação que inclui o laser de ondas contínuas Coherent Genesis ajustado a um nível de potência de 175 mW, forneceu resultados de PVR que mostram uma resolução aprimorada em uma faixa mais ampla de larguras de corrente de núcleo. As vantagens do nível de potência de 175 mW são particularmente evidentes em relação à largura do feixe de 130,9 μm ou cerca de 130 μm. Como mostrado nas FIG. 39-40, com relação à maior largura de feixe laser de ondas contínuas de 130,9 μm, os resultados de PVR melhoram visivelmente quando o nível de potência é aumentado de 100 mW para 175 mW em todas as taxas de eventos.

[0178] Como mostrado adicionalmente nas FIG. 39-40, a largura do feixe de 120,4 μm, ou cerca de 120 μm, do laser de ondas contínuas Coherent Genesis fornece excelente resolução em todas as taxas de eventos, bem como uma variedade de níveis de potência do laser. Em relação aos ensaios usando o laser de ondas contínuas Coherent Genesis com largura de feixe de 120,4 μm e potência de 175 mW, o inventor suspeita que a amostra possa ter ficado

85 / 87 baixa na medida em que os resultados de PVR sejam menos do que comparável aos 110,5 μm e os ensaios de largura de feixe de 130,9 μm.No entanto, esses resultados apoiam resolução aprimorada em relação às larguras de feixe em uma faixa de cerca de 110 μm a cerca de 130 μm em uma faixa mais ampla de taxas de eventos e, correspondentemente, em uma faixa mais ampla de larguras de corrente principal.

[0179] Embora o instrumento analítico usado para produzir os resultados de PVR mostrados nas FIG. 39-40 operados em taxas de eventos de 20.000 eventos por segundo; 30.000 eventos por segundo; 40.000 eventos por segundo; 50.000 eventos por segundo; 60.000 eventos por segundo; ou

70.000 eventos por segundo, também está dentro do escopo da presente divulgação que o instrumento analítico opere a uma taxa de evento entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de 30.000 eventos por segundo; entre cerca de 30.000 e cerca de

40.000 eventos por segundo; entre cerca de 40.000 e cerca de 50.000 eventos por segundo; entre cerca de 50.000 e cerca de 60.000 eventos por segundo; entre cerca de 60.000 e cerca de 70.000 eventos por segundo; entre cerca de

70.000 eventos por segundo e cerca de 80.000 eventos por segundo; e entre cerca de 80.000 eventos por segundo e cerca de 90.000 eventos por segundo.

[0180] Com referência à FIG. 40, para tendências maiores, pode-se observar que, na configuração de classificação padrão, o Vanguard em uma largura de feixe de 160 μm e uma potência de feixe de 175 mW, atua drasticamente de maneira diferente em diferentes taxas de eventos. À medida que as taxas de eventos aumentam e a largura da corrente de núcleo aumenta de maneira correspondente, as PVRs ou a resolução de classificação diminuem. Quando a energia foi reduzida no Vanguard para 105 mW, pode- se observar que as PVRs eram ruins em todas as taxas de eventos. Em contraste, o sistema modificado tendo incorporado o laser de ondas contínuas e uma largura de feixe entre cerca de 110,5 μm e cerca de 130,9 μm

86 / 87 demonstrou excelente estabilidade a 175 mW.Com uma potência mais baixa de 105 mW, o sistema de classificação modificado demonstrou melhorias em relação ao sistema de classificação convencional operado a 110,5 μm a 120,4 μm, mostrando que a largura do feixe mais adequada à largura do vapor do núcleo interno fornece maior flexibilidade.

[0181] Além disso, para cada termo usado deve ser entendido que, ao menos que sua utilização neste pedido seja inconsistente com tal interpretação, as definições comuns de dicionários devem ser entendidas como sendo incluídas na descrição de cada termo, como contidos no Random House Webster's Unabridged Dictionary, segunda edição, com cada definição aqui incorporada por referência.

[0182] Além disso, para os fins da presente divulgação, o termo "a" ou "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessas entidades; por exemplo, "uma corrente de fluido" refere-se a uma ou mais das correntes de fluido. Como tal, os termos "um" ou "uma", "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados de forma permutável neste documento.

[0183] Todos os valores numéricos neste documento são assumidos como sendo modificados pelo termo "cerca de", sendo ou não sendo explicitamente indicado. Para os fins da presente invenção, os intervalos podem ser expressos a partir de "cerca de" um valor particular até "cerca de" outro valor particular. Quando um tal intervalo é expresso, uma outra modalidade inclui do valor determinado a outro valor determinado. A recitação das faixas numéricas por pontos de extremidade inclui todos os valores numéricos incluídos dentro dessa faixa. A faixa numérica de um a cinco inclui, por exemplo, os valores numéricos 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 e assim por diante. Deverá ser compreendido ainda que os pontos finais de cada uma das faixas são significativamente em relação ao outro final e independentes do outro ponto final. Quando um valor é expresso como uma

87 / 87 aproximação através do uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor particular forma outra modalidade.

[0184] As reivindicações estabelecidas nesta especificação, se for o caso, são aqui incorporadas por referência como parte dessa descrição da invenção, e o requerente expressamente reserva o direito de usar todos ou uma parte do conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrições adicionais para apoiar qualquer ou todas as reivindicações ou elementos ou componentes dos mesmos, e o requerente ainda expressamente reserva o direito de mover qualquer porção ou todo o conteúdo incorporado para tais reivindicações ou qualquer elemento ou componente do mesmo, a partir da descrição às reivindicações, ou vice versa, conforme necessário para definir a matéria para qual a proteção é buscada por esta aplicação, ou qualquer pedido ou continuação subsequente, divisão, ou continuação parcial de um pedido do mesmo, ou para obter qualquer benefício de, a redução em taxas nos termos de, ou em conformidade com as leis, regras ou regulamentos de patentes de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo incorporado por referência deve sobreviver durante toda a pendência deste pedido, incluindo qualquer continuação, divisão ou continuação de pedido da mesma, ou qualquer reedição ou extensão nos mesmos.

[0185] As reivindicações estabelecidas nesta especificação destinam- se adicionalmente a descrever os limites e os limites de um número limitado das modalidades preferidas da invenção e não devem ser construídas como a modalidade mais ampla da invenção ou como uma lista completa das modalidades da invenção que pode ser reivindicado. O requerente não renuncia a nenhum direito de desenvolver reivindicações adicionais com base na descrição estabelecida acima como parte de qualquer solicitação de continuação, divisão ou continuação em parte ou similar.

Claims

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REIVINDICAÇÕES

1. Instrumento analítico para espermatozoide, caracterizado por compreender: um canal de fluxo que recebe um fluido de revestimento e um fluido de amostra tendo pelo menos um espermatozoide a ser analisado e que cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido que tem uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento; um laser que produz um feixe de laser; elementos ópticos de modelagem do feixe que modelam o feixe de laser para ter uma largura de feixe e uma altura de feixe em um local de interrogação, em que os elementos ópticos de modelagem do feixe modelam o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local de interrogação e corresponder substancialmente a um porção de centro da largura do feixe para uma largura de corrente de núcleo interna voltada para o laser; um caminho de feixe ao longo do qual o feixe de laser atravessa entre o laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe; pelo menos um detector que gera um sinal em resposta à radiação eletromagnética a partir do local de interrogação; e um analisador que recebe o sinal a partir de pelo menos um detector.

2. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a corrente de núcleo interna ter diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial da corrente fluida, sendo que as referidas dimensões ortogonais diferentes compreendem a largura interna da corrente de núcleo interna e uma profundidade da corrente de núcleo interna.

3. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado por uma largura com a razão da altura do

2 / 29 feixe estar: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

4. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelam o feixe de laser com uma largura de feixe que está em uma faixa de 70 μm a 130 μm.

5. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser com uma largura de feixe que está em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

6. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecerem desempenho substancialmente semelhante a taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo.

7. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o instrumento analítico operar em uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de 30.000 eventos por segundo; entre cerca de 30.000 e cerca de

8. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender ainda:

3 / 29 uma pluralidade de canais de fluxo adicionais, sendo que cada canal de fluxo adicional cria um fluxo coaxial adicional de uma corrente de fluido tendo uma corrente de núcleo interna adicional do fluido de amostra e uma corrente externa adicional do fluido de revestimento; um laser adicional associado a cada canal de fluxo adicional que produz um feixe de laser adicional; elementos ópticos de modelagem do feixe adicionais associados a cada canal de fluxo adicional que modela cada feixe de laser adicional para ter uma largura de feixe que corresponda substancialmente a uma largura da corrente de núcleo interna adicional voltada para o laser adicional com quais os elementos ópticos de modelagem do feixe adicionais estão associados; e um caminho de feixe adicional entre cada laser adicional e cada elemento óptico de modelagem do feixe associado, em que cada caminho de feixe adicional tem um comprimento total inferior a 18 polegadas.

9. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o laser ser um laser de onda contínua que emite um feixe de laser em um único comprimento de onda.

10. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o canal de fluxo compreender um bico de um citômetro de fluxo ou um canal de um chip microfluídico.

11. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por pelo menos um espermatozoide a ser analisado ser um espermatozoide corado com um material de emissão de luz seletiva de DNA e em que o material de emissão de luz seletiva de DNA se torna fluorescente em resposta à interrogação com o feixe de laser.

12. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por pelo menos um detector compreender ainda:

4 / 29 um primeiro detector disposto para detectar uma fluorescência frontal do material de emissão de luz seletiva de DNA; e um segundo detector disposto a 90° em relação ao primeiro detector que detecta a fluorescência lateral do material de emissão de luz seletiva de DNA, em que o analisador analisa informações do primeiro detector e do segundo detector para classificar o espermatozoide portador de cromossomo X e/ou o espermatozoide portador de cromossomo Y.

13. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o instrumento analítico compreender ainda um elemento assimétrico que gera uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis.

14. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o elemento assimétrico compreende placas de deflexão em um citômetro de fluxo gerador de gotículas, um mecanismo de desvio em um chip microfluídico ou um laser de ablação que danifica os espermatozoides selecionados com base em sua classificação.

15. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender entre uma metade de centro da largura do feixe e um quarto de centro da largura do feixe.

16. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender a metade mais interna da largura do feixe, o terço mais interno da largura do feixe ou o quarto mais interno da largura do feixe.

17. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por o caminho do feixe ser inferior a 18 polegadas.

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18. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser a uma largura de feixe que está em uma faixa de 15 μm a 19 μm.

19. Instrumento analítico para espermatozoide, caracterizado por compreender: um canal de fluxo que recebe um fluido de revestimento e um fluido de amostra tendo pelo menos um espermatozoide a ser analisado e que cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido que tem uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento; um laser que produz um feixe de laser; elementos ópticos de modelagem do feixe que modelam o feixe de laser para ter uma altura de feixe e uma largura de feixe, em que a largura do feixe está em uma faixa de cerca de 130 μm a cerca de 70 μm e tem uma largura de feixe para a a altura de feixe entre 7:1 e 3:1 em um local de interrogação, em que os elementos ópticos de modelagem do feixe podem ser configurados para modelar o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local de interrogação; um caminho de feixe ao longo do qual o feixe de laser atravessa entre o laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe; pelo menos um detector que gera um sinal em resposta à radiação eletromagnética no local de interrogação; e um analisador que recebe o sinal a partir de pelo menos um detector.

20. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender ainda:

6 / 29 uma pluralidade de canais de fluxo adicionais, sendo que cada canal de fluxo adicional cria um fluxo coaxial adicional de uma corrente de fluido tendo uma corrente de núcleo interna adicional do fluido de amostra e uma corrente externa adicional do fluido de revestimento; um laser adicional associado a cada canal de fluxo adicional que produz um feixe de laser adicional; elementos ópticos de modelagem do feixe adicionais associados a cada canal de fluxo adicional que modela cada feixe de laser adicional para ter uma largura de feixe que corresponde substancialmente a uma largura da corrente de centro voltada para o laser adicional com qual os elementos ópticos de modelagem do feixe adicionais estão associados; e um caminho de feixe adicional entre cada laser adicional e cada elemento óptico de modelagem do feixe associado, em que cada caminho de feixe adicional tem um comprimento total inferior a 18 polegadas.

21. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizado por o laser ser um laser de onda contínua que emite um feixe de laser em um único comprimento de onda.

22. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado por o canal de fluxo compreender um bico de um citômetro de fluxo ou um canal de um chip microfluídico.

23. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado por pelo menos um espermatozoide a ser analisado ser um espermatozoide corado com um material de emissão de luz seletiva de DNA, e em que o material de emissão de luz seletiva de DNA fica fluorescente em resposta à interrogação com o feixe de laser.

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24. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por pelo menos um detector compreender ainda: um primeiro detector disposto para detectar uma fluorescência frontal do material de emissão de luz seletiva de DNA; e um segundo detector disposto a 90° em relação ao primeiro detector que detecta a fluorescência lateral do material de emissão de luz, em que o analisador analisa informações do primeiro detector e do segundo detector para classificar o espermatozoide portador de cromossomo X e/ou o espermatozoide portador de cromossomo Y.

25. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 24, caracterizado por o instrumento analítico compreender ainda um elemento assimétrico que gera uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis.

26. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o elemento de assimetria compreender placas de deflexão em um citômetro de fluxo gerador de gotículas, um mecanismo de desvio em um chip microfluídico ou um laser de ablação que danifica os espermatozoides selecionados com base em sua classificação.

27. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 26, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem de feixe modelarem o feixe de laser para ter uma largura de feixe que está em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

28. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, caracterizado por o instrumento analítico operar em uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de 30.000 eventos por segundo; entre cerca de 30.000 e cerca de

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29. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 28, caracterizado por a largura do feixe para a razão da altura do feixe ser: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

30. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 29, caracterizado por o caminho do feixe ser inferior a 18 polegadas.

31. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 30, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe do laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local de interrogação e combina substancialmente a uma porção de centro da largura do feixe.

32. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender entre uma metade de centro da largura do feixe e um quarto de centro da largura do feixe.

33. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 32, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender a metade mais interna da largura do feixe, o terço mais interno da largura do feixe ou o quarto mais interno da largura do feixe.

34. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 33, caracterizado por os elementos ópticos de

9 / 29 modelagem do feixe modelarem o feixe de laser a uma largura de feixe que está em uma faixa de 15 μm a 19 μm.

35. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 34, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecerem desempenho substancialmente semelhante em taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo.

36. Método para gerar uma população de espermatozoides tendo uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis, caracterizado por compreender: criar um fluxo coaxial de uma corrente de fluido que compreende: uma corrente de núcleo interna de um fluido de amostra com diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial; e uma corrente externa de um fluido de revestimento; modificar um feixe de laser a partir de um laser em um padrão de feixe de laser tendo uma altura e largura de feixe; combinar substancialmente uma largura de corrente de núcleo interna voltada para o laser com uma porção de centro da largura do feixe; interrogar o espermatozoide na corrente de núcleo com o padrão do feixe de laser; detectar uma resposta à interrogação dos espermatozoides; gerar pelo menos um sinal com base na resposta detectada; e classificar uma característica de diferenciação sexual dos espermatozoides com base em pelo menos um sinal.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a corrente de núcleo interna ter diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial da corrente fluida, sendo que as referidas

10 / 29 dimensões ortogonais diferentes compreendem a largura da corrente de núcleo e uma profundidade da corrente de núcleo interna.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36 ou reivindicação 37, caracterizado por uma largura de feixe com a razão da altura do feixe estar: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado por a largura do feixe estar na faixa de 70 μm a 130 μm.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 39, caracterizado por a largura do feixe estar em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 40, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local de interrogação e combina substancialmente com uma porção de centro da largura do feixe.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender entre uma metade de centro da largura do feixe e um quarto de centro da largura do feixe.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 42, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender a metade mais interna da largura do feixe, o terço mais interno da largura do feixe ou o quarto mais interno da largura do feixe.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 43, caracterizado por o instrumento analítico operar em uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de

11 / 29

30.000 eventos por segundo; entre cerca de 30.000 e cerca de 40.000 eventos por segundo; entre cerca de 40.000 e cerca de 50.000 eventos por segundo; entre cerca de 50.000 e cerca de 60.000 eventos por segundo; entre cerca de

60.000 e cerca de 70.000 eventos por segundo; entre cerca de 70.000 eventos por segundo e cerca de 80.000 eventos por segundo; e entre cerca de 80.000 eventos por segundo e cerca de 90.000 eventos por segundo.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 44, caracterizado por compreender ainda: coletar diferencialmente os espermatozoides com base na característica de diferenciação sexual.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 44, caracterizado por compreende ainda: espermatozoides com ablação de foto com base na característica de diferenciação sexual.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 46, caracterizado por o feixe de laser ser um feixe de laser de onda contínua emitida em um único comprimento de onda.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 47, caracterizado por um volume de DNA nuclear dentro de uma cabeça do espermatozoide ser corado com um material de emissão de luz e em que o material de emissão de luz emite luz em resposta à etapa de interrogação.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por compreender, adicionalmente: detectar uma fluorescência frontal do material de emissão de luz; detectar uma fluorescência lateral do material de emissão de luz; e analisar a fluorescência frontal e a fluorescência lateral para determinar a característica de diferenciação sexual do espermatozoide.

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50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 49, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecem desempenho substancialmente semelhante em taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo.

51. Método para gerar uma população de espermatozoides tendo uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis, caracterizado por compreender: criar um fluxo coaxial de uma corrente de fluido que compreende: uma corrente de núcleo interna de um fluido de amostra; e uma corrente externa de um fluido de revestimento; modificar um feixe de laser em um padrão de feixe de laser tendo uma largura de feixe na faixa de cerca de 130 μm a cerca de 70 μm, sendo que o padrão de feixe de laser tem uma largura de feixe com a razão de altura de feixe entre 7:1 e 3:1; interrogar o espermatozoide na corrente de núcleo com o padrão do feixe de laser; detectar uma resposta à interrogação dos espermatozoides; gerar pelo menos um sinal com base na resposta detectada; e classificar uma característica de diferenciação sexual dos espermatozoides com base em pelo menos um sinal.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por a corrente de núcleo interna ter diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial da corrente fluida, sendo que as referidas dimensões ortogonais diferentes compreendem a largura da corrente de núcleo e uma profundidade interna da corrente de núcleo.

53. Método, de acordo com a reivindicação 51 ou reivindicação 52, caracterizado por a largura de feixe com a razão da altura do feixe está: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre

13 / 29 cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 53, caracterizado por a largura do feixe estar em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 54, caracterizado por a largura do feixe estar entre cerca de 1,5 e 4,5 vezes o comprimento da largura da corrente de núcleo.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 55, caracterizado por o instrumento analítico opera em uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 56, caracterizado por compreender ainda: coletar diferencialmente os espermatozoides com base na característica de diferenciação sexual.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 56, caracterizado por compreender ainda: espermatozoides com ablação de foto com base na característica de diferenciação sexual.

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59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 58, caracterizado por o feixe de laser ser um feixe de laser de onda contínua emitida em um único comprimento de onda.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 59, caracterizado por um volume de DNA nuclear dentro de uma cabeça do espermatozoide ser corada com um material de emissão de luz seletor de DNA e em que o material de emissão de luz seletor de DNA emite luz em resposta à etapa de interrogação.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por compreender ainda: detectar uma fluorescência frontal do material de emissão de luz seletiva de DNA; detectar uma fluorescência lateral do material de emissão de luz seletiva de DNA; e analisar a fluorescência frontal e a fluorescência lateral para determinar a característica de diferenciação sexual do espermatozoide.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 61, caracterizado por a altura do feixe estar em uma faixa de cerca de 15 μm a 19 μm.

63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 62, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecerem desempenho substancialmente semelhante em taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo.

64. Instrumento analítico multicanal, caracterizado por compreender: dois ou mais canais de fluxo, sendo que cada canal de fluxo recebe um fluido de revestimento e um fluido de amostra que tem pelo menos um espermatozoide a ser analisado, que cria um fluxo coaxial de uma

15 / 29 corrente de fluido que tem uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento; um laser associado a cada canal de fluxo; elementos ópticos de modelagem do feixe associados a cada canal de fluxo, sendo que os elementos ópticos de modelagem do feixe produzem uma modelagem de feixe uniforme a partir do laser associado com o canal de fluxo, em que os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecem uma modelagem do feixe uniforme em cada canal de fluxo e desempenham substancialmente idêntica em cada canal de fluxo; um caminho de feixe a partir de cada laser para o canal de fluxo associado, em que não há sobreposição nos caminhos de feixe; pelo menos um detector que gera um sinal em resposta ao pelo menos um espermatozoide interrogado; e um analisador que recebe o sinal a partir de pelo menos um detector.

65. Instrumento analítico multicanal, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por cada caminho de feixe ter substancialmente o mesmo comprimento.

66. Instrumento analítico multicanal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 ou reivindicação 65, caracterizado por o laser associado com cada canal de fluxo compreender ainda: dois lasers associados com dois canais de fluxo e em que o comprimento do caminho do feixe combinado para ambos os lasers é inferior a 36 polegadas.

67. Instrumento analítico multicanal, de acordo com a reivindicação 64 ou reivindicação 65, caracterizado por o laser associado com cada canal de fluxo compreender ainda: três lasers associados a três canais de fluxo e em que o comprimento do caminho do feixe combinado com os três lasers é inferior a 54 polegadas.

16 / 29

68. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 64 ou reivindicação 67, caracterizado por cada elemento óptico de modelagem do feixe produzir um feixe tendo uma largura do feixe, uma altura feixe e uma largura de feixe com a razão da altura de feixe que está: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

69. Instrumento analítico multicanal, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado por cada elemento óptico de modelagem do feixe modelar o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no canal de fluxo associado e corresponde substancialmente a uma porção de centro da largura do feixe.

70. Instrumento analítico multicanal, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender entre uma metade de centro da largura do feixe e um quarto de centro da largura do feixe.

71. Instrumento analítico multicanal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 70, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender a metade mais interna da largura do feixe, o terço mais interno da largura do feixe ou o quarto mais interno da largura do feixe.

72. Instrumento analítico multicanal, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 64 a 71, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelam o feixe de laser a uma largura de feixe que está em uma faixa de 70 μm a 130 μm.

73. Instrumento analítico multicanal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 72, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelam o feixe de laser a uma largura de feixe que

17 / 29 está em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

74. Instrumento analítico multicanal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 73, caracterizado por o instrumento analítico operar em uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de 30.000 eventos por segundo; entre cerca de 30.000 e cerca de 40.000 eventos por segundo; entre cerca de 40.000 e cerca de 50.000 eventos por segundo; entre cerca de 50.000 e cerca de 60.000 eventos por segundo; entre cerca de 60.000 e cerca de 70.000 eventos por segundo; entre cerca de 70.000 eventos por segundo e cerca de 80.000 eventos por segundo; e entre cerca de 80.000 eventos por segundo e cerca de 90.000 eventos por segundo.

75. Instrumento analítico multicanal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 74, caracterizado por não haver sobreposição ou interseção dos caminhos de feixe a partir de cada laser para cada canal de fluxo associado.

76. Instrumento analítico multicanal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 75, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecerem desempenho substancialmente semelhante em taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo.

77. Método para gerar uma população de espermatozoides tendo uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis, caracterizado por compreender: criar um primeiro fluxo coaxial de uma corrente de fluido em um instrumento, sendo que o primeiro fluxo coaxial da corrente de fluido compreende:

18 / 29 uma primeira corrente interna de um fluido de amostra incluindo espermatozoide; e uma primeira corrente externa de um fluido de revestimento; gerar um primeiro feixe de laser ao longo de um primeiro caminho de feixe de laser; modificar o primeiro feixe de laser para ter uma primeira largura de feixe e uma primeira altura de feixe; criar um segundo fluxo coaxial de uma corrente de fluido no instrumento, sendo que o segundo fluxo coaxial de uma corrente de fluido compreende: uma segunda corrente interna de um fluido de amostra incluindo esperma; e uma segunda corrente externa de um fluido de revestimento; gerar um segundo feixe de laser ao longo de um segundo caminho de feixe de laser, em que o primeiro caminho de feixe de laser e o segundo caminho de feixe de laser não se sobreponham; modificar o segundo feixe de laser para ter uma segunda largura de feixe e uma segunda altura de feixe; interrogar o espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna com o primeiro feixe modificado e interrogar o espermatozoide na segunda corrente de núcleo interna com o segundo feixe modificado, em que os elementos ópticos de modelagem do feixe associados a cada canal fornece uma modelagem do feixe uniforme e desempenho substancialmente idêntico no primeiro canal de fluxo e no segundo canal de fluxo; detectar uma resposta a interrogação do espermatozoide com o primeiro feixe modificado e detectar uma resposta a interrogação do espermatozoide com o segundo feixe modificado; gerar pelo menos um primeiro sinal com base na resposta detectada à interrogação do espermatozoide no primeiro padrão de feixe e

19 / 29 gerar pelo menos um segundo sinal com base na resposta detectada à interrogação do espermatozoide no segundo padrão de feixe; e classificar uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna com base em pelo menos um primeiro sinal e classificar uma característica de diferenciação sexual do espermatozoide na segunda corrente de núcleo interna com base em pelo menos um segundo sinal.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado por a primeira corrente de núcleo interna ter diferentes dimensões ortogonais transversais ao primeiro fluxo coaxial, sendo que as referidas dimensões ortogonais diferentes da primeira corrente de núcleo interna compreendem uma largura da primeira corrente de núcleo interna e uma profundidade da primeira corrente de núcleo interna, e em que a segunda corrente de núcleo interna tem dimensões ortogonais diferentes transversais ao segundo fluxo coaxial, sendo que as referidas dimensões ortogonais diferentes da segunda corrente de núcleo interna compreendem uma largura da segunda corrente de núcleo interna e uma profundidade da segunda corrente de núcleo interna.

79. Método, de acordo com a reivindicação 77 ou reivindicação 78, caracterizado por uma largura de feixe com a razão da altura do feixe para o primeiro padrão de feixe e o segundo padrão de feixe estarem: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 79, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local da interrogação e corresponde substancialmente a uma porção de centro da largura do feixe.

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81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender entre uma metade de centro da largura do feixe e um quarto de centro da largura do feixe.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 81, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender a metade mais interna da largura do feixe, o terço mais interno da largura do feixe ou o quarto mais interno da largura do feixe.

83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 82, caracterizado por a largura do feixe do primeiro padrão de feixe e do segundo padrão de feixe estarem em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 83, caracterizado por o instrumento analítico operar em uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 84, caracterizado por a altura do feixe estar em uma faixa de cerca de 15 μm a 19 μm.

86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 85, caracterizado por compreender ainda:

21 / 29 coletar diferencialmente espermatozoides do primeiro fluxo coaxial e do segundo fluxo coaxial com base na característica de diferenciação sexual.

87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 85, caracterizado por compreender ainda: espermatozoides de ablação fotográfica do primeiro fluxo coaxial e do segundo fluxo coaxial com base na característica de diferenciação sexual.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 87, caracterizado por o primeiro feixe de laser e o segundo feixe de laser serem feixes de laser de onda contínua, cada um emitido em um único comprimento de onda.

89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 88, caracterizado por um volume de DNA nuclear dentro de uma cabeça do espermatozoide ser corada com um material de emissão de luz e em que o material de emissão de luz emite luz em resposta à etapa de interrogação.

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado por compreender, adicionalmente: detectar uma primeira fluorescência frontal do material de emissão de luz seletiva de DNA do espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna; detectar uma primeira fluorescência lateral do material de emissão de luz seletiva de DNA do espermatozoide na primeira corrente de núcleo interna; e analisar a fluorescência frontal e a fluorescência lateral para determinar a característica de diferenciação sexual do espermatozoide.

91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 90, caracterizado por compreender ainda a separação de espermatozoide

22 / 29 em uma população portadora de cromossomo X e uma população portadora de cromossomo Y.

92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 91, caracterizado por a largura do feixe estar em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 92, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecerem desempenho substancialmente semelhante em taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo.

94. Instrumento analítico para espermatozoide, caracterizado por compreender: um canal de fluxo que recebe um fluido de revestimento e um fluido de amostra tendo pelo menos um espermatozoide a ser analisado e que cria um fluxo coaxial de uma corrente de fluido que tem uma corrente de núcleo interna do fluido de amostra e uma corrente externa do fluido de revestimento; um laser que produz um feixe de laser; elementos ópticos de modelagem do feixe que modelam o feixe de laser para ter uma largura e altura de feixe em um local de interrogação, onde os elementos ópticos de modelagem do feixe fornecem desempenho substancialmente semelhante em taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo; um caminho de feixe ao longo do qual o feixe de laser atravessa entre o laser e os elementos ópticos de modelagem do feixe; pelo menos um detector que gera um sinal em resposta à radiação eletromagnética a partir do local de interrogação; e um analisador que recebe o sinal a partir de pelo menos um detector.

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95. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado por a corrente de núcleo interna ter diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial da corrente fluida, sendo que as referidas dimensões ortogonais diferentes compreendem a largura interna da corrente de núcleo interna e uma profundidade corrente de núcleo interna.

96. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 94 ou reivindicação 95, caracterizado por uma largura de feixe com a razão da altura do feixe estar: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

97. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 94 a 96, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser a uma largura de feixe que está em uma faixa de 70 μm a 130 μm.

98. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 96, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser a uma largura de feixe que está em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

99. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 98, caracterizado por o instrumento analítico operar em uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de 30.000 eventos por segundo; entre cerca de 30.000 e cerca de

24 / 29

100. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado por compreender ainda: uma pluralidade de canais de fluxo adicionais, sendo que cada canal de fluxo adicional cria um fluxo coaxial adicional de uma corrente de fluido tendo uma corrente de núcleo interna adicional do fluido de amostra e uma corrente externa adicional do fluido de revestimento; um laser adicional associado a cada canal de fluxo adicional que produz um feixe de laser adicional; elementos ópticos de modelagem do feixe adicionais associados a cada canal de fluxo adicional que modela cada feixe de laser adicional para ter uma largura de feixe que corresponda substancialmente a uma largura da corrente de núcleo interna adicional voltada para o laser adicional com quais os elementos ópticos de modelagem do feixe adicionais estão associados; e um caminho de feixe adicional entre cada laser adicional e cada elemento óptico de modelagem do feixe associado, em que cada caminho de feixe adicional tem um comprimento total inferior a 54 polegadas.

101. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 100, caracterizado por o laser ser um laser de onda contínua que emite um feixe de laser em um único comprimento de onda.

102. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 101, caracterizado por o canal de fluxo compreender um bico de um citômetro de fluxo ou um canal de um chip microfluídico.

103. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 102, caracterizado por

25 / 29 pelo menos um espermatozoide a ser analisado ser um espermatozoide corado com um material de emissão de luz seletiva de DNA, e em que o material de emissão de luz seletiva de DNA fica fluorescente em resposta à interrogação com o feixe de laser.

104. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que pelo menos um detector compreende ainda: um primeiro detector disposto para detectar uma fluorescência frontal do material de emissão de luz seletiva de DNA; e um segundo detector disposto a 90° em relação ao primeiro detector que detecta a fluorescência lateral do material de emissão de luz seletiva de DNA, em que o analisador analisa informações do primeiro detector e do segundo detector para classificar o espermatozoide portador de cromossomo X e/ou o espermatozoide portador de cromossomo Y.

105. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 104, caracterizado por o instrumento analítico compreender ainda um elemento de assimetria que gera uma população de espermatozoides com uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis.

106. Instrumento analítico, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado por o elemento de assimetria compreender placas de deflexão em um citômetro de fluxo gerador de gotículas, um mecanismo de desvio em um chip microfluídico ou um laser de ablação que danifica os espermatozoides selecionados com base em sua classificação.

107. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 106, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender entre uma metade de centro da largura do feixe e um quarto de centro da largura do feixe.

108. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 107, caracterizado por a porção de centro da largura do

26 / 29 feixe compreender a metade mais interna da largura do feixe, o terço mais interno da largura do feixe ou o quarto mais interno da largura do feixe.

109. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 108, caracterizado por o caminho do feixe ser inferior a 18 polegadas.

110. Instrumento analítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 94 a 109, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser a uma largura de feixe que está em uma faixa de 15 μm a 19 μm.

111. Método para gerar uma população de espermatozoides tendo uma razão sexual assimétrica de espermatozoides viáveis, caracterizado por compreender: criar um fluxo coaxial de uma corrente de fluido que compreende: uma corrente de núcleo interna de um fluido de amostra com diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial; e uma corrente externa de um fluido de revestimento; modificar um feixe de laser em um padrão de feixe de laser que fornece resolução de classificação de espermatozoide substancialmente semelhante a taxas de eventos entre 5.000 eventos por segundo e 65.000 eventos por segundo, em que o padrão de feixe laser tem uma largura de feixe e uma altura de feixe; interrogar o espermatozoide na corrente de núcleo com o padrão do feixe de laser; detectar uma resposta à interrogação dos espermatozoides; gerar pelo menos um sinal com base na resposta detectada; e classificar uma característica de diferenciação sexual dos espermatozoides com base em pelo menos um sinal.

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112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracterizado por a corrente de núcleo interna ter diferentes dimensões ortogonais transversais ao fluxo coaxial da corrente fluida, sendo que as referidas dimensões ortogonais diferentes compreendem a largura da corrente de núcleo e uma profundidade interna da corrente de núcleo.

113. Método, de acordo com a reivindicação 111 ou reivindicação 112, caracterizado por uma largura de feixe para a razão da altura do feixe ser: entre cerca de 7: 1 e cerca de 3: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 4: 1; entre cerca de 7: 1 e cerca de 6: 1; entre cerca de 6: 1 e cerca de 5: 1; entre cerca de 5: 1 e cerca de 4: 1; ou entre cerca de 4: 1 e cerca de 3: 1.

114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 113, caracterizado por o padrão de feixe de laser compreender uma largura de feixe que está na faixa de 70 μm a 130 μm.

115. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 114, caracterizado por a largura do feixe estar em uma faixa de cerca de 70 μm a cerca de 90 μm, cerca de 90 μm a cerca de 110 μm ou cerca de 110 μm a cerca de 130 μm.

116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 115, caracterizado por os elementos ópticos de modelagem do feixe modelarem o feixe de laser para interrogar pelo menos um espermatozoide a ser analisado no local da interrogação e combina substancialmente a uma porção de centro da largura do feixe.

117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe compreender entre uma metade de centro da largura do feixe e um quarto de centro da largura do feixe.

118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 116 a 117, caracterizado por a porção de centro da largura do feixe

28 / 29 compreender a metade mais interna da largura do feixe, o terço mais interno da largura do feixe ou o quarto mais interno da largura do feixe.

119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 118, caracterizado por o instrumento analítico operar a uma taxa de eventos selecionada a partir do grupo que consiste em: entre cerca de 10.000 e cerca de 20.000 eventos por segundo; entre cerca de 20.000 e cerca de

120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 119, caracterizado por compreender ainda: coletar diferencialmente os espermatozoides com base na característica de diferenciação sexual.

121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 120, caracterizado por compreender ainda: espermatozoides com ablação de foto com base na característica de diferenciação sexual.

122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 121, caracterizado por o feixe de laser ser um feixe de laser de onda contínua emitida em um único comprimento de onda.

123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 122, caracterizado por um volume de DNA nuclear dentro de uma cabeça do espermatozoide ser corado com um material de emissão de luz, e em que o material de emissão de luz emite luz em resposta à etapa de interrogação.

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124. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por compreender ainda: detectar uma fluorescência frontal do material de emissão de luz; detectar uma fluorescência lateral do material de emissão de luz; e analisar a fluorescência frontal e a fluorescência lateral para determinar a característica de diferenciação sexual do espermatozoide.