CN110945343A - 并入射束成形光学器件和射束稳定性的方法和系统 - Google Patents

并入射束成形光学器件和射束稳定性的方法和系统 Download PDF

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Abstract

本公开涉及分析仪器和相关方法，所述分析仪器和相关方法并入射束成形光学器件以在广泛范围的操作条件下以改进且一致的性能区分非常亮且紧密相关的信号。

Description

并入射束成形光学器件和射束稳定性的方法和系统
技术领域
本公开的技术总体涉及用于分析和/或分选颗粒的方法和系统，并且更具体地涉及用于分析和/或分选精子的并入改进的射束成形光学器件和射束稳定性的这类方法和系统。
背景技术
诸如流式细胞仪的分析仪器可以用于基于可检测的特性而分选各种细胞或颗粒。在一种专门应用中，这类流式细胞仪已被修改来基于染色体DNA的小的变化而将染色的精子区分为一个或多个富集的亚群，诸如携带X或Y染色体的精子亚群。
使流式细胞仪适合于分析精子和/或随后基于DNA含量的小的变化而分选所述精子所需的一种修改是将射束成形光学器件适配成产生椭圆形射束点。然而，先前的修改无法在各种激光功率下或在各种通过速度下实现稳定的分辨率。事实上，在用流式细胞仪进行的商业性性别分选中采用的当前的射束成形光学器件存在先前未能识别的缺陷。
因此，需要在包括流式细胞仪的分析仪器中采用射束成形光学器件，所述射束成形光学器件实现的射束轮廓能够在各种射束功率和事件率下实现高分辨率。
发明内容
本公开的广泛的目的是提供一种在许多变化的操作条件下具有改进的性能，尤其是用于区分非常亮和紧密相关的信号的目的的分析系统。为了实现这类广泛的目的，本发明广义上涉及并入具有某些性质的射束成形光学器件的分析仪器。
某些实施方案涉及一种用于精子的分析仪器，所述分析仪器具有流动通道，所述流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，并且产生流体流的同轴流，所述同轴流具有样品流体的内部芯流和鞘液的外部流。分析仪器还包括：激光器，所述激光器产生激光束；以及射束成形光学器件，所述射束成形光学器件使激光束成形以在询问位置处具有射束宽度和射束高度。射束成形光学器件使激光束成形以在询问位置处询问待分析的至少一个精子并且将射束宽度的中心部分基本上匹配到面向激光器的内部芯流宽度。分析仪器还包括：射束路径，沿着所述射束路径，激光束穿过激光器与射束成形光学器件之间；至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于来自询问位置的电磁辐射而产生信号；以及分析器，所述分析器从至少一个检测器接收信号。
某些其它实施方案涉及一种用于精子的分析仪器，所述分析仪器具有流动通道，所述流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，并且产生流体流的同轴流，所述同轴流具有样品流体的内部芯流和鞘液的外部流。这种分析仪器还包括：激光器，所述激光器产生激光束；以及射束成形光学器件，所述射束成形光学器件使激光束成形以具有射束高度和射束宽度。已成形或修改后的激光束的射束宽度是在约130μm至约70μm的范围内并且在询问位置处具有介于7:1与3:1之间的射束宽度与射束高度比。射束成形光学器件可以被配置成使激光束成形以在询问位置处询问待分析的至少一个精子。分析仪器还包括：射束路径，沿着所述射束路径，激光束穿过激光器与射束成形光学器件之间；至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于询问位置处的电磁辐射而产生信号；以及分析器，所述分析器从至少一个检测器接收信号。
一个实施方案涉及一种产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法。这种方法可以包括产生流体流的同轴流的步骤，其中同轴流由以下项形成：样品流体的内部芯流，所述内部芯流具有横向于同轴流的不同的正交维度；以及鞘液的外部流。这种方法还可以包括以下步骤：将来自激光器的激光束修改成具有射束高度和射束宽度的激光束图案；将面向激光器的内部芯流宽度基本上匹配到射束宽度的中心部分；用激光束图案询问芯流中的精子；检测对精子的询问的响应；基于检测到的响应而产生至少一个信号；以及基于至少一个信号而对精子的性别分化特性进行分类。
另一个实施方案涉及产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体。这种方法可以包括产生流体流的同轴流的步骤，其中同轴流由样品流体的内部芯流和鞘液的外部流形成。所述方法还可以包括将激光束修改成激光束图案，所述激光束图案具有在约130μm至约70μm的范围内的射束宽度并且具有在7:1与3:1之间的射束宽度与射束高度比。这种方法还可以包括以下步骤：用激光束图案询问芯流中的精子；检测对精子的询问的响应；基于检测到的响应而产生至少一个信号；以及基于至少一个信号而对精子的性别分化特性进行分类。
另一个实施方案涉及一种多通道分析仪器。这种仪器可以包括两个或更多个流动通道，每个流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，产生流体流的同轴流，所述同轴流具有样品流体的内部芯流和鞘液的外部流。多通道分析仪器还可以包括与每个流动通道相关联的激光器以及与每个流动通道相关联的射束成形光学器件。射束成形光学器件可以从与流动通道相关联的激光器产生均匀的射束形状，并且在每个流动通道处提供均匀的射束形状并在每个流动通道处提供基本上相同的性能。分析仪器还可以包括：从每个激光器到相关联的流动通道的射束路径，其中在射束路径中不存在重叠；以及至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于对至少一个精子的询问而产生信号；以及分析器，所述分析器从至少一个检测器接收信号。
另外的实施方案涉及一种产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法。这种方法可以采用例如，流体流的第一和第二同轴流、第一和第二内部芯流、第一和第二外部流、沿着不重叠的第一和第二激光束路径产生的第一和第二激光束。在这类实施方案中，所述方法包括：修改第一激光束和第二激光束以分别具有射束高度和射束宽度；用第一修改后的射束询问第一内部芯流中的精子并用第二修改后的激光束询问第二内部芯流中的精子；检测对用第一修改后的射束对精子进行询问的响应并检测对用第二修改后的激光束对精子进行询问的响应；基于检测到的对用第一修改后的激光对精子进行询问的响应而产生至少一个第一信号并基于检测到的对用第二修改后的激光束对精子进行询问的响应而产生至少一个第二信号；以及基于至少一个第一信号而对第一内部芯流中的精子的性别分化特性进行分类并基于至少一个第二信号而对第二内部芯流中的精子的性别分化特性进行分类。
另外的实施方案涉及一种用于精子的分析仪器，所述分析仪器包括：流动通道，所述流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，并且产生流体流的同轴流，所述同轴流具有样品流体的内部芯流和鞘液的外部流；以及激光器，所述激光器产生激光束。这种实施方案还可以包括射束成形光学器件，所述射束成形光学器件使激光束成形以在询问位置处具有射束宽度和射束高度，其中射束成形光学器件在5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能。所述方法还可以包括：射束路径，沿着所述射束路径，激光束穿过激光器与射束成形光学器件之间；至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于来自询问位置的电磁辐射而产生信号；以及分析器，所述分析器从至少一个检测器接收信号。
另一个实施方案涉及一种产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法，所述方法包括产生流体流的同轴流的步骤，所述同轴流具有：样品流体的内部芯流，所述内部芯流具有横向于同轴流的不同的正交维度；以及鞘液的外部流。这种方法还可以包括将激光束修改成激光束图案的步骤，所述激光束图案在5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的精子分选分辨率，其中激光束图案具有射束宽度和射束高度。所述方法还可以包括以下步骤：用激光束图案询问芯流中的精子；检测对精子的询问的响应；基于检测到的响应而产生至少一个信号；以及基于至少一个信号而对精子的性别分化特性进行分类。
附图说明
图1示出了根据本公开的实施方案的分析仪器的部分示意图。
图2示出了根据本公开的实施方案的分析仪器的第二视图。
图3示出了询问位置处的流体流的横截面视图。
图4示出了询问位置处的激光束的横截面视图。
图5示出了在多个事件率下确定内部芯流宽度的过程中的测量的第一端点、中点和第二端点的图形表示。
图6示出了在多个事件率下测量的内部芯流宽度的图形表示。
图7示出了如流式细胞仪监测器上所显现的二元曲线图和所得的分选分辨率的对应的直方图的实例。
图8示出了70μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图9示出了70μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图10示出了80μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图11示出了80μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图12示出了80μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图13示出了80μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图14示出了90μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图15示出了90μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图16示出了90μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图17示出了90μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图18示出了100μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图19示出了100μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图20示出了100μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图21示出了100μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图22示出了110μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图23示出了110μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图24示出了110μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图25示出了110μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。
图26示出了在各种激光功率和各种射束轮廓宽度下测试连续波激光器中得到的激光束稳定性结果。
图27示出了在各种激光功率和各种射束轮廓宽度下测试连续波激光器中得到的对准容易度结果。
图28示出了在各种激光功率和各种射束轮廓宽度下测试连续波激光器中得到的不同事件率下的PVR结果。
图29示出了如110μm宽度射束轮廓和10mW连续波激光器的使用中在流式细胞仪监测器上所显现的二元曲线图和所得的分选分辨率的对应直方图的实例。
图30示出了如110μm宽度射束轮廓和10mW连续波激光器的使用中在流式细胞仪监测器上所显现的二元曲线图和所得的分选分辨率的对应直方图的实例。
图31示出了如110μm宽度射束轮廓和25mW连续波激光器的使用中在流式细胞仪监测器上所显现的二元曲线图和所得的分选分辨率的对应直方图的实例。
图32示出了如110μm宽度射束轮廓和25mW连续波激光器的使用中在流式细胞仪监测器上所显现的二元曲线图和所得的分选分辨率的对应直方图的实例。
图33示出了将在分选系统中使用Coherent Genesis连续波激光器或Vanguard脉冲激光器的过程中得到的被定向的精子的百分比进行比较的曲线图。
图34示出了将在分选系统中使用Coherent Genesis连续波激光器或Vanguard脉冲激光器的过程中得到的“X”分选区域内的精子的量进行比较的曲线图。
图35示出了将在分选系统中使用Coherent Genesis连续波激光器或Vanguard脉冲激光器的过程中得到的精子的分选率进行比较的曲线图。
图36示出了将在分选系统中使用Coherent Genesis连续波激光器或Vanguard脉冲激光器的过程中得到的PVR结果进行比较的曲线图。
图37示出了将在分选系统中使用Coherent Genesis连续波激光器或Vanguard脉冲激光器的过程中得到的分选时间进行比较的曲线图。
图38示出了将先前通过包括Coherent Genesis连续波激光器或Vanguard脉冲激光器的分选系统分选的冷冻前和冷冻后的精子的品质控制结果进行比较的表格。
图39示出了将在分选系统中使用Vanguard脉冲激光器和Coherent Genesis连续波激光器的过程中的增加的事件率下的PVR结果进行比较的表格。
图40示出了将在分选系统中使用Vanguard脉冲激光器和Coherent Genesis连续波激光器的过程中的增加的事件率下的PVR结果进行比较的条形图。
虽然本发明可以各种修改和替代形式体现，但是在附图中示出了并在本文中通过说明性实例描述了特定实施方案。应理解，附图和具体实施方式不意图将本发明的范围限于所公开的具体形式，而是意图覆盖落在权利要求的精神和范围内的所有修改、替代和等效形式。
具体实施方式
以下将参考附图描述本公开的实施方案。出于一致性考虑，各个图中的相似元件由相似附图标记表示。一般而言，本文公开的实施方案涉及用于精子分选应用中的采用射束成形光学器件和射束稳定性的设备和方法。
图1描绘了根据本公开的实施方案的分析仪器110的部分示意图。在一些实施方案中，分析仪器110有助于将精子按性别分选为携带X或Y染色体的精子的一个或多个富集的亚群，检查分选纯度或对各种染色剂或染色状况进行检查。根据一些实施方案，分析仪器110可以包括流式细胞仪100。然而，根据其它实施方案，分析仪器110可以包括微流体芯片。在图1所示的非限制性实例中，分析仪器110是小滴产生类型的流式细胞仪100。相对于所示实例描述的某些创造性特征具有适用于其它装置和系统的额外效用。
流式细胞仪100(诸如图1所示的流式细胞仪)响应于诸如由激光器12实现的激发而测量从颗粒或细胞发射或反射的光的可量化的差异。根据本文描述的实施方案，流式细胞仪100可以基于DNA含量而区分携带X和Y染色体的精子16。如全文所使用，术语“精子”可以指代如其使用情境所指示的单数情况和复数情况。
唯一进行商业实践的精子分选技术依赖于携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子的核DNA含量的差异。检测这种差异需要使用在化学计量上与精子的核DNA相关联的DNA选择性染料(例如，荧光染料，诸如Hoechst 33342)。例如，在牛科动物中，携带X染色体的精子比携带Y染色体的精子多约3.8％的核DNA。因此，通过响应于用激光器12实现的激发而检测由相关联的荧光染料在适当定向的精子中发射的荧光的量，有可能区分携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子。此外，通过检测由结合的荧光染料在激光器12询问精子时发射的荧光的量，在本公开的范围内有可能对任何数量的染色剂或染色状况进行检查。
适合于这种技术的流式细胞仪100包括能够将定向的精子单独地递送到精确位置以用激光器12激发，并且有助于所选择的精子16的物理分离的射流。流式细胞仪100包括样品流体19的颗粒源或细胞源1，所述颗粒源或细胞源1供应至少一种颗粒或至少一种细胞，诸如已用荧光染料染色以供分析和/或分选的精子。包含精子的样品流体从样品源1供应并且存放在流动通道2内。在图1中，所描绘的流动通道2还可以表征为喷嘴，但是具有密闭通道的其它系统也可以受益于本公开的某些创造性方面。鞘液3同样地从鞘液源4供应并且存放在流动通道2内。用于鞘液3和样品流体19的相应的入口(未编号)被布置为允许同轴流体流8中的两种流体的层流。流式细胞仪100的流动通道2产生流体流8的同轴流，所述同轴流包括样品流体的内部芯流17(有时在本文中仅被称为“芯流”)和鞘液3的外部流18。内部芯流17被示出为包含精子16，所述精子16具有浆状精子头和伸长的精子尾。另外，流动通道2允许精子16在内部芯流17内大部分排列成一列纵队，并且呈现适当的定向以供分析和/或分选。具体地，所示的流动通道2包括定向的喷嘴尖头34，所述定向的喷嘴尖头34在精子离开孔口5时流体动力地使精子朝向均一的定向偏置。适合于与本发明一起使用的流式细胞仪系统以及尤其是适合于分选精子的定向的喷嘴尖头的实例更详细地描述于国际专利公布WO2001/40765、WO2001/085913和WO 204/088283中。
振荡器控制装置7可以通过改变振荡器6的频率和幅度而在流动通道2内产生压力波。所述压力波传递到孔口5处离开流动通道2的流体，从而使流体流8最终规律地形成小滴9。样品流体19内的在流体流8的内部芯流17中的精子16在形成小滴时被夹带在所述小滴中。虽然小滴9，尤其是目标在于分选的小滴9可能包含单独的精子，但是可以了解到，小滴9也可能包含一个或多个精子16。在一些实施方案，诸如采用消融激光器的实施方案中，振荡器6和振荡器控制器7可能不是必要的，因为可能不需要形成小滴9。
仍然参考图1，在流体流8离开流动通道2的孔口5之后，内部芯流17内的精子16在询问位置33处受到由12产生的激光束26激发。根据一个或多个实施方案，激光器12可以是脉冲激光器，诸如Vanguard 355-350(可获自Spectra-Physics,Santa Clara,CA)、或连续波激光器，诸如较小占用面积的Genesis CX-355激光器(可获自Coherent Inc.,SantaClara CA)、或以规定的波长和功率将电磁辐射递送到生物或非生物颗粒的任何装置。如图1所示，激光器12产生呈激光束26形式的电磁辐射。虽然图1中仅示出了一个激光器12，但是与附加流动通道相关联的附加激光器与产生附加激光束的相应的附加激光器都在本公开的范围内。例如，本公开的一个或多个实施方案包括具有两个或更多个流动通道的多通道分析仪器、具有两个或更多个流动通道的两个或更多个激光器以及与每个流动通道相关联的射束成形光学器件。根据本公开的一个或多个实施方案，激光束26的波长是适于激活结合到诸如精子16的感兴趣的颗粒或细胞的核DNA的光发射材料中的荧光物质的任何波长。例如，波长可以是在约350nm与360nm之间，或在精子的情况下是处于约355nm。然而，在一些实施方案中，在330nm至365nm范围内的任何波长都在本公开的范围内。
根据本公开的一个或多个实施方案，可以采用不会损害或不利地影响精子16的生育能力的任何输出功率。在一些实施方案中，递送到精子的激光束26的功率应尽可能地低，同时在X染色体亚群与Y染色体亚群之间维持令人满意的分选分辨率。例如，在本公开的范围内的一些激光器功率范围可以包括：350mW或更少、300mW或更少、250mW或更少、200mW或更少、175mW或更少、150mW或更少、100mW或更少、90mW或更少、80mW或更少、70mW或更少、60mW或更少、50mW或更少、40mW或更少、30mW或更少、25mW或更少、20mW或更少、或10mW或更少。可以了解到，激光器自身可以甚至更高的功率操作，并且可以使用诸如滤光器、分光器、射束阑之类的光学器件来调整实际上递送到正被分选的精子的功率。
仍然参考图1，如从激光器12输出的激光束26可以具有高斯射束轮廓。如从激光器12输出的高斯射束轮廓可能大体上是圆形的并且可能在水平方向上测得0.9mm并在垂直方向上测得1.1mm。另外，经常被称为TEM00模式的高斯射束轮廓通常在中心点处最强烈并且在径向外侧上一致具有较低强度。这类圆形射束点在没有进一步修改的情况下不适合于分选精子，并且甚至略微呈椭圆形的射束点都会遭遇类似问题。也就是说，与芯流外围上以及对应地更靠近于射束边缘的精子相比较，这些射束点会将沿着射束轮廓的中心向下行进的精子暴露于更大的总激光功率通量。在内部芯流内通过的精子所经历的总激光功率的这种大变化可能会导致X染色体亚群与Y染色体亚群之间的降低的分辨率并且对于精子分选应用来说通常是不期望的。
可以使用射束成形光学器件来通过例如操纵射束点的纵横比、或垂直和水平特征而操纵射束点的形状，以解决精子所经历的显著变化的激光功率暴露和结合到多种DNA的荧光染料的同时激发的问题。国际公布号WO 01/85913和美国专利号7,371,517(以引用的方式整体并入本文)描述了采用射束成形光学器件来增加常规辐照射束图案的面积并减小所述辐照射束图案的高度的实施方案。先前的射束成形光学器件致力于用高度拉伸的射束轮廓，诸如160μm射束宽度和20μm射束高度来纠正精子分选的这种缺陷。如下文更详细地所阐述，这些射束尺寸在低事件率(例如，20,000个事件/秒以及更少)下在一些配置中能很好地发挥作用，但是随着事件率的增加或在增加的射束路径下，诸如在利用共享激光器的多通道系统中的第二流动通道处会非常敏感，变得很难对准并且通常会很快失去品质。因此，本公开的实施方案对作为激光器12的输出的激光束26进行修改以询问流体流8中的精子16。
如图1所示，流式细胞仪100或分析仪器110可以包括射束成形光学器件20。在一些实施方案中，射束成形光学器件20可以包含一对交叉的圆柱形透镜。所述透镜相对于彼此被定位成使得透镜中的一个是前透镜并且另一个是后透镜。透镜的功率结合隔开透镜的距离可以产生相对于激光束26的成形来说不同的椭圆形射束图案。根据本公开的一些实施方案，射束成形光学器件20被配置成在询问位置33处产生相对于流体流8的内部芯流17具有某些特性的射束图案。根据本公开的一些实施方案，射束成形光学器件20被配置成在询问位置33处产生具有指定绝对尺寸的射束图案。根据本公开的一些实施方案，射束成形光学器件20被配置成在询问位置33处产生射束图案，所述射束图案在流式细胞仪以各种事件率并以各种不同的内部芯流大小操作时以基本上相同的分辨率水平执行。
射束成形光学器件20可以位于流体流8附近以将询问位置33处的激光束26聚焦在流体流8上。射束路径27可以包括由激光器12自身与射束成形光学器件20之间的激光束穿越的路径。可以了解到，虽然图1描绘了直的射束路径，但是可以采用潜望镜、反光镜、双色镜、滤光器和其它光学元件来将激光束26引导到射束成形光学器件20。在一些实施方案中，射束路径27应尽可能地短。例如，射束路径27的长度可以是在2英寸与18英寸之间，在其它实施方案中，射束路径可以是在2英寸与10英寸之间。射束成形光学器件26和短射束路径27两者单独地为流式细胞仪中的精子分选应用提供改进的分选分辨率和一致性，并且在组合时可以协同地相互作用来实现甚至更大的改进。
根据本公开的一个或多个实施方案，射束成形光学器件20可以包括前透镜和后透镜，其中后透镜定位在与前透镜上的基点相距适当距离之处。在一些实施方案中，后透镜与前透镜上的基点之间的间距可以是在50mm至60mm的范围内。另外，在一些实施方案中，后透镜是100mm焦点透镜并且前透镜是40mm焦点透镜，并且可以具有以下范围内的功率：对于40mm透镜为18μm/1mm＝0.018x以及对于100mm透镜为0.12mm/1mm＝0.12x。以此方式，射束成形光学器件20可以修改激光束26的宽度和/或高度，使得所得的成形射束22在询问位置处具有所需的射束宽度和/或射束高度。本领域技术人员可以了解到，具有不同的初始射束形状的不同激光器可能需要不同的透镜强度和距离来实现所需的射束宽度。这类附加配置也在本公开的范围内。
如前所述，射束成形光学器件20可以修改激光束26的宽度。在一些实施方案中，修改后的宽度大于激光束26的高斯射束轮廓，但是小于宽度为160μm的椭圆形射束轮廓。在其它实施方案中，射束成形光学器件20使激光束26成形为在110μm或更少的范围内的宽度、在70μm至110μm的范围内的宽度、在70μm至90μm的范围内的宽度、或在90μm至110μm的范围内的宽度、或在110μm至130μm的范围内的宽度。
另外，在一些实施方案中，射束成形光学器件20可以相对于流体流8的芯流的尺寸修改激光束26。例如，根据本公开的实施方案的流式细胞仪100或分析仪器110可以被配置成使得流体流8的芯流与鞘液之间的压差可以被调整来改变流式细胞仪100的处理速度。就每秒检测到的事件的数量来说，流体流8的芯流与鞘液之间的压差与流式细胞仪100的处理速度正相关。因此，增加流体流8的芯流与鞘液之间的压差会增加流式细胞仪100的处理速度。此外，压差的这种增加还会使芯流的大小，诸如内部芯流宽度增加。也就是说，芯流的大小会随着流式细胞仪100的处理速度的增加而增加。例如，芯流在40,000至90,000个事件/秒之间的事件率下的大小明显大于芯流在10,000至20,000个事件/秒之间的事件率下的大小。
发明人已发现，常规上接受的在精子分选的商业应用中利用的射束宽度，即160μm的射束宽度会导致大量的总激光能量通量浪费在射束的椭圆形拉伸的高斯分布的外翼处。由于这种浪费的能量，内部芯流的外边界上的精子在这些较高事件率下无法被均匀地照射，因为与在激光束中间的精子相比较，所述精子在穿过激光束时暴露于更少的总激光能量。不同位置中的精子所经历的这种增加的激光功率的变化会降低分选分辨率。另外，在芯流变得更大的较高事件率下，这些损失往往会变得更加严重。这种分辨率的损失会导致生产率损失、纯度损失或两者，这取决于如何调整区域和其它分选参数。
如贯穿本公开在许多实例中所使用，尤其是在事件率与芯流尺寸变化同义时，事件率往往用作样品穿过流动通道的体积流速的代理。在若干图和实例中，精子核的浓度是200百万/ml，形成同轴流的喷嘴包括具有直径为70μm的孔口的定向的喷嘴尖头，并且样品压力被设定为约40PSI的值。本领域技术人员可以了解到，改变样品中的精子的浓度可以在不影响芯流的尺寸的情况下改变事件率，而孔口直径和样品压力的改变可能会影响事件率和样品的体积通过量两者(以及对应地芯流的尺寸)。
返回到图1，精子16在用具有适当波长的激光器12激发时会反射或发射电磁辐射23。在用荧光染料染色的精子的情况下，精子会发荧光。如本领域的人员所已知，精子头的平桨形状的表面与其包含的核DNA的量成比例地发出荧光。另外，浆状精子头的细侧部发出非常亮的荧光，这用于确定正被激发的精子是否被适当地定向。
颗粒或细胞特性用形成流式细胞仪100的一部分的颗粒或细胞感测系统10确定。在精子的情况下，细胞特性可以包括：定向、活力和性别分化特性，诸如任何X染色体或Y染色体的存在。图1示出了作为流式细胞仪100的一部分的一种这样的颗粒或细胞感测系统10。所描绘的颗粒或细胞感测系统10包括对流体流8内所含的颗粒或细胞的进行响应的至少一个检测器11。例如，染色的精子可以在询问位置33处由激光器12激发，这会使染色剂发射或反射电磁辐射23。至少一个检测器11响应于对颗粒、细胞、精子等等的询问而检测荧光，并且基于检测到的响应而产生至少一个信号。根据本公开的实施方案，分析器13从至少一个检测器11接收至少一个信号以分析下文进一步描述的任何数量的状况。分析器13可以是通用计算机、处理器或具有用于执行有关精子分选的特定功能的软件的类似物，或可以是并入有流式细胞仪的专用计算机或处理器。
仍然参考图1，在分析仪器是小滴产生型流式细胞仪的实施方案中，分析器13可以联接到小滴充填器，诸如充填销34，所述小滴充填器有区别地将鞘液18充填在喷嘴和流体流8内直到并包括新形成的小滴。以此方式，每个小滴9可以基于分析器13中确定的颗粒或细胞特性而进行充填。例如，可以基于小滴9内夹带的染色的精子16的检测到的性别分化特性而充填小滴。在这些实施方案中，偏斜元件14有助于将有区别地充填的小滴分选为一个或多个亚群，诸如活的携带X染色体的精子和/或活的携带Y染色体的精子。作为一个实例，偏斜元件14可以包括小滴产生型流式细胞仪中的一对静电偏转板，该对静电偏转板提供具有不同轨迹，诸如进入一个或多个收集容器15的有区别地充填的小滴9，从而将小滴9分离为携带X染色体的精子和Y染色体的精子的富集的亚群。以此方式，偏斜元件14产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体。
在其它实施方案中，分析器13可以连接到偏斜元件，所述偏斜元件包括用于破坏或光消融基于精子的分类而选择的精子的消融激光器。确切地说，消融激光器可以基于某些分类或特性而定时来杀死、破坏流体流8中的精子16或使所述精子失活。例如，如果期望产生具有偏斜比率的活的携带X染色体的精子的精子群体，则可以使用消融激光器来破坏或杀死流体流8中的携带Y染色体的精子。另一方面，如果期望产生具有偏斜比率的活的携带Y染色体的精子的精子群体，则可以使用消融激光器来破坏或杀死流体流8中的携带X染色体的精子。以此方式，根据本公开的一个或多个实施方案，激光消融可以用作基于颗粒或细胞特性而分开、分离、选择、分类或分选颗粒、细胞、精子等等的技术。
根据本公开的一个或多个实施方案的分析仪器可能不包括偏斜元件。在这些实施方案中，分析仪器的分析器13可以用于来相对于预先染色的精子的给定样品检查分选的纯度，对任何数量的染色剂或染色状况进行检查，或分析任何数量的状况或标准。
另外，如上所述，根据本公开的一个或多个实施方案的分析仪器可以是微流体芯片。在这些实施方案中，微流体芯片的流动通道可以包括横截面尺寸在约1.0μm与约2000μm之间的范围内的至少一个通道。另外，微流体芯片可以包括流式细胞仪毛细管系统和转向机构，所述转向机构用于用作偏斜元件以产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体。另外，以引用的方式整体并入本文的美国专利号7,311,476；美国专利号9,057,676和国际申请号PCT/US2013/031706描述了可以根据本公开的一个或多个实施方案使用的微流体芯片的实施方案。
虽然图1仅示出了单个流动通道2，但是根据本公开的一个或多个实施方案的分析仪器可以包括多通道分析仪器，所述多通道分析仪器包括多个附加流动通道。在这种多通道分析仪器中，每个附加流动通道可以产生流体流的附加同轴流，所述附加同轴流具有样品流体的附加内部芯流和鞘液的附加外部流。附加流动通道可以伴有图1和图2所描绘的元件的复制，或附加流动通道可以与所述流动通道共享部件。仅作为流动通道共享资源的一个实例，可以从单个鞘液源向流动通道和附加流动通道供应鞘液。
现转到图2，在X、Y和Z轴的指示旁边在询问位置33处描绘了流体流8与激光束26之间的相互作用的放大的三维视图。先前已相对于图1描述了流式细胞仪100的各种部件，包括流动通道2、包括在流动通道2中的喷嘴的孔口5、流体流8和激光器12。作为非限制性实例，已以引用的方式整体并入本文的国际公布号WO01/85913和美国专利号7,371,517描述了可以根据本公开的一个或多个实施方案使用的流式细胞仪的实施方案。来自其它制造商的流式细胞仪平台可以同样受益于本公开的一个或多个实施方案并且根据所述一个或多个实施方案来使用。
如图2所示，流体流8包括包含精子16的内部芯流17，以及包围内部芯流17的鞘液的外部流18。激光束26被描绘为沿着X轴行进到询问位置，其中激光束26与内部芯流17内正沿着Z轴流动的精子16相互作用。流体流8中的精子16如上所述由激光束26激发。因此，适当定向的精子将从精子头的平桨状表面沿着X轴产生呈前向荧光23a的形式的电磁辐射。定向的精子另外会从其窄侧沿着Y轴产生被称为侧向荧光23b的电磁辐射。
诸如前向荧光检测器的第一检测器11a沿着X轴放置在前向位置中以收集前向荧光23a。本领域技术人员可以了解到，诸如集光透镜或物镜的附加光学器件可以将前向荧光聚焦到第一检测器11a上。被称为侧向荧光检测器的第二检测器11b放置在相对于第一检测器11a成90度，诸如沿着Y轴的位置处。
图3示出了询问位置33处的流体流8的横截面。再次，流体流包括鞘液3的外部流18和样品流体19的内部芯流17。可以看到内部芯流17在流体流8内具有大体上为椭圆形的形状。合适的定向喷嘴，诸如国际专利公布WO2001/40765、WO2001/085913和WO 204/088283中描述的那些或其它合适的定向喷嘴产生大体上为椭圆形或带状的样品流体19流。然而，本发明的实施方案不限于特定内部芯流几何形状。适合于定向精子的其它几何形状将类似地受益于本公开的方面。如所示，内部芯流17具有与Y轴对准的长轴。长轴对应于内部芯流宽度30。内部芯流17还具有对应于内部芯流深度31的沿着X轴的短轴。
图4描绘了参考图2和图3所描绘的相同坐标系的询问位置33处的激光束26的横截面视图。所描绘的射束来源于以TEM00模式操作、或具有高斯射束轮廓的激光器，所述射束在一个方向上已被拉伸并且在另一个方向上已被压缩。可以了解到，贯穿本公开提及的射束尺寸(诸如射束高度和射束宽度)涉及射束功率为射束峰值功率的1/e2(.135)，或为高斯射束轮廓的峰值功率的13.5％所在中心射束峰值功率的任一侧上的直径上相对的点之间的距离。
如所示，激光束26沿着Y轴具有射束宽度36并且沿着Z轴具有射束高度37。射束宽度36和射束高度37的几何形状贯穿全文可以被称为激光束图案。一旦激光束26通过射束成形光学器件20成形，激光束26的那一部分可以被称为修改后的激光束。另外，激光束26在询问位置33处具有中心部分38。中心部分38可以构成射束宽度的最内侧的二分之一到射束宽度36的最内侧的四分之一。在一些实施方案中，中心部分38可以构成约射束宽度的最内侧的三分之一。
染色的精子所经历的总激光能量的小的变化会带来所产生的荧光的量的变化。考虑到分选的精子纯度的行业标准是至少85％，尤其是在高事件率，诸如40,000至90,000个事件/秒(或甚至更高)下，即使小变化也可能会开始遮蔽携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子之间的3.8％的核DNA差异。申请人出乎意料地发现，将射束宽度36的中心部分38匹配到内部芯流宽度会提供分辨率的意想不到的改进。另外，发明人发现，某些绝对尺寸在各种事件率下都会提供稳定的分选。现有技术中使用的射束成形光学器件提供了良好的分辨率，但是在诸如为了增大事件率和/或分选速度而修改内部芯流宽度的情况下，分辨率会迅速崩溃。
这种修改后的射束轮廓在诸如40,000与90,000个事件/秒之间的较高事件率下是特别有用的。事实上，所得的在携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子之间的分选分辨率在内部芯流宽度31宽于射束宽度的中心部分38的情况下会大幅降低，因为精子在内部芯流宽度30的外缘上穿过射束点。然而，现有技术射束成形光学器件也是过宽的。例如，160微米的射束宽度具有带有相对均匀的能量通量分布的大的中心部分，但是过多的功率会在感兴趣的区域(即，内部芯流17)外部浪费掉并且分选分辨率在较高事件率下会劣化。
现参考图5和图6，申请人能够通过测量中心的染色的核在这种流式细胞仪中进行分选和/或分析期间行进的距离来测量精子分选型流式细胞仪中的有效内部芯流宽度。申请人通过将测微计安装到激光束平台用具有70μm孔口的定向的喷嘴尖头在变化的事件率下产生流体流。具有带有染色的精子核的内部芯流的流体流在流式细胞仪中通过定向的喷嘴尖头来产生。从被布置为检测来自内部芯流的荧光的PMT向具有高增益的示波器馈送信号。首先，通过确定带来最高信号的激光位置来定位芯流的中心，并且将中心位置标注为“芯的中部”并将所述中心位置与测微计上的当前读数相关联。如图5中可以看到，在测微计上一致地发现“芯的中部”是处于约33.5μm处。然后扫描激光，直到发现芯流的前缘为止。通过观察测微计上在显微镜下不再存在光晕，且示波器不再记录脉冲的位置而在视觉上验证芯流的前缘，并且将测微计上的距离标注为“芯的前部”。然后将激光重置到芯流的中心，并且在相反方向上的类似扫描中发现了后缘并将所述后缘标注为“芯的后部”。如图5和图6中可以看到，在5,000个事件/秒至65,000个事件/秒的事件率下执行相同的方法。确切地说，如由测微计所指示的相对前部、后部和中部位置示出于图5中。图6示出了前缘和后缘的位置之间的差异或芯流的宽度。如图6中可以看到，在5,000与65,000个事件/秒之间，在200百万细胞/秒的浓度下，内部芯流宽度看起来存在从约24μm至40μm的线性增加。
根据本公开的一个或多个实施方案，射束成形光学器件可以将射束宽度的中心部分“基本上”匹配到内部芯流宽度30，这种内部芯流宽度面向激光器。如贯穿本公开所使用，将射束宽度的中心部分基本上匹配到内部芯流宽度可以用相对术语，或通过特定测量表述。例如，将射束宽度的中心部分匹配到内部芯流宽度可以包括将内部芯流宽度30匹配到射束宽度的最内侧的二分之一，将内部芯流宽度30匹配到射束宽度的最内侧的三分之一，将内部芯流宽度30匹配到射束宽度的最内侧的四分之一，或将内部芯流宽度30匹配到射束宽度的最内侧的四分之一与二分之一之间。仅作为基本上匹配的激光束宽度和内部芯流的几个实例，在至少40,000个事件/秒的高事件率下，射束成形光学器件可以在询问位置33处提供在90μm至130μm的范围内的射束宽度。根据本公开的附加实施方案，在10,000至25,000个事件/秒的较低事件率下的基本上匹配的激光束宽度和内部芯流包括提供在70μm至130μm的范围内的射束宽度的射束成形光学器件。在其它实施方案中，射束成形光学器件20使激光束26成形以具有在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内的射束宽度。在一些实施方案中，激光束的“基本上”匹配面向激光器的内部芯流宽度30的宽度表示在面向激光器的内部芯流宽度30约2倍至4倍范围内的激光束宽度。在其它实施方案中，激光束的“基本上”匹配面向激光器的内部芯流宽度30的宽度表示在面向激光器的内部芯流宽度30约1.5倍至4.5倍范围内的激光束宽度。通过使激光束26的宽度与面向激光器的内部芯流宽度30基本上匹配，将浪费更少的能量并且可以减少较宽芯流的边缘内的大幅下降。此外，根据本公开的实施方案的射束成形光学器件20允许流式细胞仪100或分析仪器110能够在单个机器上利用单一的射束成形光学器件设置以最小的损失从小芯流(即，较低事件率)转变为大芯流(即，较高事件率)。
根据一个或多个实施方案，射束成形光学器件20还可以调整激光束26的射束高度。例如，射束成形光学器件20将激光束26的射束高度减小到小于35μm的高斯射束轮廓的高度。在一些实施方案中，将激光束26的高斯射束轮廓减小到小于20μm的高度。在一些实施方案中，将激光束26的高斯射束轮廓减小到在18μm至20μm的范围内的高度。在其它实施方案中，将激光束26的高斯射束轮廓减小到18.5μm的高度。
通过使用射束成形光学器件20来减小激光束26的射束高度，极大地减少了在同一个测量事件期间多个精子头处在已成形的激光束26内的巧合。换句话说，减少了同时处在激光束26内的多个精子头中的所结合的光发射材料的激光激发。这带来了根据本公开的一个或多个实施方案的流式细胞仪100或分析仪器的改进的精确度，因为增大了区分携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子，或对应于不同的染色剂或染色状况的光发射事件之间的平均差。
根据本公开的一个或多个实施方案，射束成形光学器件20可以在询问位置处产生具有以下射束宽度与射束高度比的激光束：在约7:1与约3:1之间；在约6:1与约4:1之间；在约7:1与约6:1之间；在约6:1与约5:1之间；在约5:1与约4:1之间；或在约4:1与约3:1之间。
根据本公开的一个或多个实施方案，射束成形光学器件20可以在询问位置处产生表现与内芯宽度在24μm与40μm之间的流体芯流基本上相同的激光束。在另一个实施方案中，射束成形光学器件20可以在询问位置处产生在5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下表现基本上相同的激光束。在有关处于不同芯流宽度的相同流体流的背景或表现中，短语“基本上相似的表现”可以被理解为通过以下方式来确定：测得所述芯流宽度上的核的PVR在彼此的15％内、在彼此的14％内、在彼此的13％内、在彼此的12％内、在彼此的11％内、在彼此的11％内、在彼此的10％内、在彼此的9％内、在彼此的8％内、在彼此的7％内、在彼此的6％内、在彼此的5％内、在彼此的4％内、在彼此的3％内、在彼此的2％内、或甚至在彼此的1％内，同时良好对准的机器的所有PVR都保持高于85％。
根据本公开的一个或多个实施方案，射束成形光学器件20可以使激光束26成形以通过将更多能量集中在内部芯流17内来提供优异的均匀性，这能提高由内部芯流17内所有位置处的精子接收的能量通量的均匀性。另外，根据本公开的实施方案的修改后的射束轮廓提供了能够在单个机器上在低事件率与高事件率之间转变，而不会不利地影响样品的分选分辨率的灵活性。射束成形光学器件20进一步有利地允许用比流式细胞术应用中当前使用的激光器功率更低的激光器实现相当的分选分辨率结果。相关地，这类分辨率的改进可以允许缩短染色时间并减少染色剂的量，这两者对于人工授精中的分选的精子的活力来说可能都是不利的。
具体地，先前的精子分选型流式细胞仪利用分成两路、或甚至三路的单个激光器，从而将射束功率的一些部分转向到多个流动通道。这类配置往往需要到最近的流动通道的25英寸、到第二流动通道的50英寸和到第三流动通道的多达65英寸的至少一个射束路径。虽然滤光器和分光器被设计成提供为每个流动通道提供等效射束，但是实际上，最长射束路径是最敏感的并且是最难对准的。另外，分辨率和分选速度在具有最长射束路径的流动通道上通常是较差的。
因此，本公开的某些实施方案致力于尽可能地减小射束路径27并且对相似或相同的激光器12和射束成形光学器件20提供多通道仪器中的每个流体流18。以此方式，可以确保多通道仪器中的每个流体流暴露于均匀的功率和射束轮廓。与先前的多通道系统相对比，可以在每个通道中实现基本上相同的性能。一些实施方案可以并入小占用面积的连续波激光器，诸如Coherent Genesis CW-355。可以在平台上对这种小激光器进行设定并且使所述小激光器直接与询问位置对准。在一些实施方案中，诸如棱镜、反光镜、分色滤光器之类的光学元件可以被并入来以最小射束路径将激光束26引导到询问位置33。其它实施方案可以并入脉冲激光器，诸如Vanguard350-355(Spectra Physics)。Vanguard 350-355具有显著更大的占用面积，包括接近3英尺的总长度。因此，本公开的实施方案包括将平台构造成与射束成形光学器件直接对准以直接照射询问位置处的流动通道。在其它实施方案中，平台可以是在另一个平面上并且可以并入诸如潜望镜、反光镜、棱镜之类的光学器件以将激光束引导到射束成形光学器件以便照射询问位置处的流动通道。无论所实施的激光器如何，缩短的射束路径27结合为每个流动通道提供具有最小的但相同或等效的光学作用的激光提供了多通道精子分选器，诸如Genesis II或Genesis III的总性能的极大改进。可以类似地改进单个平台上并入多个喷嘴的其它多通道仪器。
返回参考图1，示出了射束路径27。如前所述，在一些实施方案中，射束路径可以是在2与18英寸之间。在其它实施方案中，射束路径可以是尽可能短的或既短又实用的。本公开的某些实施方案中描述的射束成形光学器件和缩短的射束路径两者都能单独地提供精子分选过程的显著改进，并且在结合使用时可能还会提供协同作用。举例来说，精子分选中当前使用的射束成形光学器件具有160微米的射束宽度。如将说明，这种射束宽度在精子分选的应用中是次优的。然而，较小的射束宽度可能更难对准，并且这些难题在利用较长射束路径的情况下可能会加重。
根据本公开的一个或多个实施方案，射束路径27可以是少于约18英寸的长度、少于约17英寸的长度、少于约16英寸的长度、少于约15英寸的长度、少于约14英寸的长度、少于约13英寸的长度、少于约12英寸的长度、少于约11英寸的长度、少于约10英寸的长度、少于约9英寸的长度、少于约8英寸的长度、少于约7英寸的长度、少于约6英寸的长度、少于约5英寸的长度、少于约4英寸的长度、少于约3英寸的长度、或少于约2英寸的长度。
包括短射束路径的另外的实施方案包括具有多个激光器和多个短射束的多通道系统。返回参考图3，示出了根据本公开的实施方案的射束成形光学器件20的前视图。示出了射束路径27，沿着所述射束路径27，激光束26穿过激光器12与射束成形光学器件20之间。虽然在图3中仅示出了一个射束路径，但是附加激光器与相关联的附加射束成形光学器件之间的附加射束路径也在本公开的实施方案的范围内。例如，在本公开的范围内，在两个或更多个激光器与相关联的两个或更多个射束成形光学器件之间可能存在两个或更多个射束路径。在这类实施方案中，附加射束路径从每个激光器到每个相关联的流动通道可能不会重叠或交叉。
另外，在多通道分析仪器包括多于一个射束路径的实施方案中，每个射束路径可以是相同长度。在具有两个流动通道、与两个流动通道相关联的两个激光器和从每个激光器到相关联的流动通道的射束路径的流式细胞仪的实施方案中，两个激光器的组合的射束路径长度小于36英寸，或每个射束路径可以小于18英寸。在多通道分析仪器包括三个流动通道、与三个流动通道相关联的三个激光器和从每个激光器到相关联的流动通道的射束路径的实施方案中，三个激光器的组合的射束路径长度小于54英寸，或每个射束路径可以小于18英寸。
现有的多通道精子分选型流式细胞仪系统包括单个激光器，所述单个激光器用分束器分光，从而朝向两个或三个流动通道传播两个或三个射束，这减轻了因分光部件的吸收所致的微不足道的损失。这种布置需要激光器输出端与射束成形光学器件之间存在25至50英寸之间任何大小的射束路径，所述射束成形光学器件将射束聚焦到芯流中的颗粒(例如，精子)上。实际上，其它商业精子分选型流式细胞仪系统并入分成三路的激光器，并且所述商业流式细胞仪系统上的最长射束路径需要激光器与射束成形光学器件之间高达65英寸。如可以了解，在25至50英寸下产生的稳定性问题在65英寸下会更为显著。这类不稳定问题可能会因射束在其行进时略微发生扩展的事实而加重。从25英寸射束路径进入射束成形光学器件的射束将不同于65英寸射束路径上的射束。另外，用于按性别分选精子的UV波长容易受到热漂移的影响，这意味着诸如因空调通风口或技术人员在仪器周围走动所致的气流会影响射束稳定性。另外，尤其是对于较长射束路径来说，振动或其它与流式细胞仪的微小的物理接触都可能会扰乱窄射束轮廓的相当敏感的对准。除了射束路径长度自身之外，较长射束路径还需要转向镜或其它光学元件，这引入了额外的不稳定的可能性并且在更换激光器时需要校准。
事实上，这种长射束路径长度可能会在商业流式细胞仪中带来较差的射束稳定性。通过缩短根据本公开的一个或多个实施方案的射束路径的长度，可以实现更稳定的流式细胞仪或分析仪器。因此，本公开的一个或多个实施方案包括多个射束路径，所述多个射束路径中的每一个具有以下射束路径长度：少于约18英寸的长度、少于约17英寸的长度、少于约16英寸的长度、少于约15英寸的长度、少于约14英寸的长度、少于约13英寸的长度、少于约12英寸的长度、少于约11英寸的长度、少于约10英寸的长度、少于约9英寸的长度、少于约8英寸的长度、少于约7英寸的长度、少于约6英寸的长度、少于约5英寸的长度、少于约4英寸的长度、少于约3英寸的长度、或少于约2英寸的长度。
如上所述，连续波激光器可以用作根据本公开的一个或多个实施方案的流式细胞仪或分析仪器中的激光器。一般而言，本领域的普通技术人员原先认为连续波激光器在流式细胞术应用中具有特定缺点。相对于精子，应理解，辐照可能会导致精子的较低生育能力。如所理解的，传统的连续波激光器是庞大的、高能耗的、水冷的、高故障的、低使用寿命的、需要每日对准并且提供333nm至363nm的宽带波长。这些因素导致了从传统的连续波激光器的使用移向脉冲激光器的典范转移，所述脉冲激光器是成本有效的、体型较小的、经济的、空气冷却的、具有在内部固定的对准腔并且提供单波长系统。脉冲激光器的高峰值功率允许转变为使用单个激光器以向多通道仪器供应分光的激光束。另外，单波长脉冲激光器能非常有效地用非常高的峰值功率使DNA结合染料饱和。然而，发明人已发现，射束成形光学器件可能会降低对分选精子的功率需求。
本公开涵盖一种多通道精子分选系统，所述多通道精子分选系统具有单独地与流动通道相关联的任何数量的激光器。作为一个实例，Genesis III精子分选系统(Cytonome/ST，Boston Massachusetts)可以被修改来包括用于三个流动通道中的每一个的三个激光器。在一个实施方案中，小占用面积的激光器可以被放置成到相应的射束成形光学器件具有介于2与10英寸之间的射束路径。在另一个实施方案中，Genesis III可以被修改来包括单个平台，或用于将三个较大占用面积的激光器保持在对短射束路径提供每个流动通道的位置上的三个单独的平台。较大占用面积激光器可能需要潜望镜或其它光学器件来将射束递送到射束成形光学器件。因此，较大占用面积激光器的射束路径可以是在6英寸与12英寸之间。
其它实施方案涵盖Genesis II可以类似的方式修改，使得两个激光器可以指向所述多通道系统中的两个流动通道。不管激光器的数量和射束路径的对应数量如何，本公开提供了改进的射束形状匹配和减小的射束路径，所述射束路径大大改进了每个流动通道处的分选分辨率并且额外在每个通道处提供了基本上相似的性能。相比之下，对于先前的分光式激光配置，不可能从常规的精子分选射束轮廓减小射束轮廓，因为会放大由长路径长度产生的任何不稳定性，从而引起甚至更大的不稳定性并且降低分选性能。因此，常规的并入或未并入分束器的射束成形光学器件无法足够好地表现来使用这类较低激光功率并且缺乏由短激光束路径和修改后的射束成形光学器件实现的提高的信号品质。
另外，本公开涵盖单独的脉冲激光器可以与多通道系统中的单独的通道相关联。这种系统可以独立地受益于本文描述的缩短的射束路径和如本文所述的修改后的射束成形光学器件。这类系统还可以协同地受益于本文描述的缩短的射束路径和修改后的射束成形光学器件的组合。具体地，这种仪器可以在流式细胞仪的每个通道处提供基本上相同的性能，从而证实了相对于在多个流动通道上对单个激光器进行分光并包括长达65英寸的射束路径的当前系统的重大改进。另外，下文将展示来提供射束功率和事件率的灵活性的射束成形光学器件和缩短的射束路径使每个通道同等受益，而不存在来自分束光学器件的额外的损失或对准问题。
根据本公开的一个或多个实施方案，可以使用本文描述的分析仪器或多通道分析仪器中的任一者来执行产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法。
例如，在一个或多个实施方案中，所述方法可以包括：产生流体流的同轴流，所述同轴流包括：样品流体的内部芯流，所述内部芯流具有横向于同轴流的不同的正交维度；以及鞘液的外部流；修改激光束以具有射束高度和射束宽度；使面向激光器的内部芯流宽度基本上匹配到射束宽度的中心部分；用激光束图案询问芯流中的精子；检测对精子的询问的响应；基于检测到的响应而产生至少一个信号；以及基于至少一个信号而对精子的性别分化特性进行分类。
在使用多通道分析仪器的实施方案中，前述方法可以采用，例如，流体流的第一和第二同轴流、第一和第二内部芯流、第一和第二外部流、沿着不重叠的第一和第二激光束路径产生的第一和第二激光束。在这类实施方案中，所述方法包括：修改第一激光束和第二激光束以分别具有射束高度和射束宽度；用第一修改后的射束询问第一内部芯流中的精子并用第二修改后的激光束询问第二内部芯流中的精子；检测对用第一修改后的射束对精子进行询问的响应并检测对用第二修改后的激光束对精子进行询问的响应；基于检测到的对用第一修改后的激光对精子进行询问的响应而产生至少一个第一信号并基于检测到的对用第二修改后的激光束对精子进行询问的响应而产生至少一个第二信号；以及基于至少一个第一信号而对第一内部芯流中的精子的性别分化特性进行分类并基于至少一个第二信号而对第二内部芯流中的精子的性别分化特性进行分类。在这类方法中，单独的激光器和不重叠的短射束路径的使用可以为多通道仪器中的每个流体流提供基本上相同的性能。如贯穿全文所使用，“基本上相同的性能”意指在每个流体流用由于多通道仪器中的每个射束路径上的相同或等效的射束成形光学器件而处于相同功率的相同激光询问时，修改后的激光束的形状和强度在这类流体流的询问位置处几乎是相同的并且每个射束在稳定性方面具有类似表现。相比之下，先前的仪器利用分光并引向每个通道的单个激光器。这类光学器件包括双色镜，所述双色镜被设计成反射射束能量的一部分并且传递射束能量的一部分。虽然这类反射镜被选择和配置用来在理论上为每个通道供应相同的射束轮廓，但是已发现，在沿着最长射束路径行进的射束中出现了增加的发散度。也已发现，沿着最长路径行进的射束是最不稳定的。移动或振动，以及甚至来自空调通风口的气流都会对行进通过最长射束路径的射束具有较大的影响。相对于分析系统中的多个通道，基本上相同的性能可以通过比较每个通道处的对准的容易度、稳定性、PVR或其某种组合，基于每个分选头处的分选性能根据经验来确定，假定每个分选头对准并且运行相当的样品。
图7示出了精子分选型流式细胞仪的操作期间产生的二元曲线图和对应的直方图的一般实例，并且确切地示出了分选期间如在流式细胞仪监测器上显现的分选分辨率。如前所述，根据一个或多个实施方案，分析器13分析如由第一检测器11a检测的DNA选择性光发射材料的前向荧光，以及如由第二检测器11b检测的DNA选择性光发射材料的侧向荧光。因此，图7的顶部二元曲线图示出了随峰值前向荧光和峰值侧向荧光变化的事件。根据这个曲线图，定向的精子以及死亡精子是能够容易识别的。事实上，可以在这些精子群体周围绘出区域，并且将所述区域的数量作为绝对数或作为百分比进行跟踪。基于区域内部的细胞，图7示出了在二元曲线图上绘出的两个此类区域，所述两个此类区域示出了77.42％的精子被适当地定向并且10.05％的精子已死亡。在屏幕的底部处的第二二元曲线图(峰值对积分面积)中仅绘制了定向的区域内的精子。在第二曲线图中，定向的精子的上部亚群包括携带X染色体的精子，并且定向的精子的下部亚群包括携带Y染色体的精子。根据这个第二曲线图，由操作者在感兴趣的亚群周围绘出分选区域。如图7所示，例如，分选区域“X”包括已被分选为携带X染色体的精子的精子。根据本公开的一个或多个实施方案，具有偏斜元件的流式细胞仪或分析仪器可以将落入指定分选区域中的事件分选到收集管中。
仍然参考图7，根据本公开的一个或多个实施方案的流式细胞仪或分析仪器可以包括跟踪某些数据群体的质心的群体跟踪软件包。例如，由于图7的底部二元曲线图中的两个非常靠近的亚群会随时间而漂移，群体跟踪软件会尝试将“X”分选区域保持在顶部细胞群体上。合适的软件跟踪包的非限制性实例包括Beckman Coulter’s MoFloTM流式细胞仪上的CyTrackTM软件、Cytonome/ST’s GenesisTM流式细胞仪的跟踪软件、以及国际申请号PCT/US2004/009646中的描述的软件。也可以并入基于用户输入，诸如所需纯度而产生分选区域的软件。图7表示从Cytonome/ST GenesisTM流式细胞仪产生的图像。可以看到，在分选操作期间确定峰中的事件的数量(更确切地说是两个峰的平均值)以及谷中的事件的数量并且显示正在进行的PVR。这个PVR表示假定的携带X染色体的亚群与携带Y染色体的亚群之间重叠的量。因此，贯穿本公开在度量分辨率的背景下论述了PVR。
仍然参考图7，流式细胞仪监测器的右侧示出了所得的在携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的分选分辨率的对应的直方图。再次，在直方图中仅显示落入被标记为定向的区域中的精子。确切地说，示出两个峰的直方图显示了如何很好地分辨亚群。在这个实例中，PVR为66％。出于参考目的，100％的PVR将指示分离X亚群与Y亚群的白色谷线到达基线并且将表示完美的分辨率。
实施例1
图8和图9示出了用射束成形光学器件进行的实验的结果，所述射束成形光学器件被配置成修改Genesis CX-355的射束宽度以在配备有Genesis I数字升级件(Cytonome/ST,Boston Massachusetts)的MoFlo SX(Beckman Coulter,Miami Florida)的询问位置处具有70μm的射束宽度。以200百万核/ml的浓度分选牛核。虽然许多流式细胞术应用会用各种类型的有色珠粒进行校准和/或测试，但是精子分选在许多方面是独特的并且用经过超声处理的精子或精子核执行校准。精子核提供比活精子更好的分辨率，但是不适合用于人工授精中，因为所述精子核不能够受精。另外，精子核对于测试改进的分选技术来说是优选的，因为所述精子核不存在活精子中存在的变异性和噪声中的某一种。
现参考图8，示出了70μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。确切地说，在这个实例中，连续波激光器以100mW的输出功率使用。在流式细胞仪以10,000个事件/秒的事件率(其是相对慢的)操作时获得左侧直方图。由于事件率是相对慢的，因此对应的芯流的大小是相对小的。因此，大多数精子核受到宽度为70μm的激光束的良好照射。事实上，对芯流进行良好照射，使得如这个实例的顶部左侧二元曲线图所示，84.23％的精子核被捕获在定向的区域中。另外，如左侧上的直方图所示，PVR为94％，从而指示携带X染色体的精子群体与携带Y染色体的精子群体之间对于定向的精子来说非常高的分选分辨率。出现这种有利的分选分辨率部分是因为在10,000个事件/秒的事件率下，芯流是相对小的，从而导致面向激光器的内部芯流宽度基本上匹配70μm的较小射束宽度的中心部分。例如，如申请人先前所确定，10,000个事件/秒的事件率可以对应于约26μm的内部芯流宽度。可以了解到，在70μm射束与芯流对准时，射束的刚好构成总射束宽度的三分之一以上的最内侧部分已匹配到芯流。
仍然参考图8，相对于右侧上示出的直方图，流式细胞仪以40,000个事件/秒的事件率(其是相对快的)操作。由于事件率是相对快的，与10,000个事件/秒的事件率下的内部芯流相比较，对应的内部芯流的大小是相对大的。如相对于图7所论述，申请人已将40,000个事件/秒下的内部芯流宽度确定为约34μm。对于这个相对大的内部芯流宽度来说，70μm射束宽度是不匹配的。也就是说，内部芯流宽度大于激光束轮廓的均匀中心部分。因此，更多数量的精子无法受到均匀的照射，因为所述精子落在了射束轮廓的基本上均匀的且足够强的部分之外。事实上，如这个实例的顶部左侧二元曲线图所示，仅79.53％的精子被捕获在定向的区域中。另外，如右侧上的直方图中可以看到，PVR仅为64％并且峰并不十分明确，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的较差的分选分辨率。考虑到较小百分比的核在直方图中是均匀的，可以理解，分辨率的损失在精子分选应用中会迅速加重。左侧上的直方图与右侧上的直方图之间的比较证实，在内部芯流宽度基本上匹配到射束宽度的中心部分内时，根据本公开的一个或多个实施方案，将浪费更少的能量并且实现携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的更好的分选分辨率。
图9示出了表示在与图8相似的条件下的分选分辨率的两个直方图。确切地说，直方图在相同的分析仪器中获得，但是与100mW相对比，连续波激光器向激光束供应150mW的输出功率。在左侧上的直方图中，流式细胞仪以20,000个事件/秒的事件率(其是相对慢的)操作。如前所述，慢的事件率导致相对小的内部芯流宽度。如图6所示，20,000个事件/秒的事件率下的内部芯流宽度预期为约29μm。图9左侧上的直方图示出PVR为94％，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常高的分选分辨率。可以了解到，从10,000个事件/秒转为20,000个事件/秒，不存在性能的损失。这是因为20,000个事件/秒的事件率仍然是相对慢的，使得对应的内部芯流宽度仍然基本上匹配到射束宽度的中心部分。此外，将激光束的输出功率从如图8所示的100mW增加到如图9所示的150mW潜在地对20,000个事件/秒下原本可能发生的PVR的任何小的损失进行了补偿。
仍然参考图9，相对于右侧上的所得直方图，流式细胞仪或分析仪器以40,000个事件/秒的事件率(其是相对快的)操作。由于事件率是相对快的，因此对应的芯流的大小是相对大的。确切地说，申请人认为这个事件率提供了约33μm的内部芯流宽度。看到相对较差的PVR，可以理解，70μm射束宽度对于这个相对大的内部芯流宽度来说是不匹配的。也就是说，射束宽度的均匀中心部分小于内部芯流宽度，从而导致内部芯流的边界上的精子接收与内部芯流的中心部分中的精子相比较显著不同的激光暴露。事实上，如图9右侧上的直方图所示，虽然PVR因使用具有150mW的较高输出功率(与图8的实例中使用的100mW连续波激光器相比较)的连续波激光器而略有改进，但是PVR仍然仅为70％并且峰并不十分明确，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的较差的分选分辨率。左侧上的直方图与右侧上的直方图之间的比较显示，在射束轮廓的宽度基本上匹配面向激光器的内部芯流宽度时，根据本公开的一个或多个实施方案，浪费更少的能量并且实现携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的更好的分选分辨率。
实施例2
现参考图10至图25，申请人用射束成形光学器件进行了另一项实验，所述射束成形光学器件被配置成修改Genesis CX-355(可获自Coherent)的射束宽度以在配备有Genesis I数字升级件(Cytonome/ST,Boston Massachusetts)的MoFlo SX精子分选器(Beckman Coulter,Miami Florida)的询问位置处具有80μm、90μm、100μm和110μm的射束宽度。对于每个配置和射束宽度，以100mw、150mw、200mw和250mw对激光器供电。再次，在两种事件率下测试每种状况并且以200百万核/ml的浓度分选牛核。
图10示出了在两种不同的事件率下用80μm宽度射束轮廓产生的直方图的比较。在这个实例中，连续波激光器供应输出功率为100mW的激光束。左侧上的直方图示出了流式细胞仪以20,000个事件/秒的事件率(其是相对慢的)操作。由于事件率是相对慢的，因此对应的芯流的大小是相对小的。如图6所示，20,000个事件/秒的事件率下的内部芯流宽度预期为约29μm。左侧直方图的PVR为76％，从而仅指示携带X染色体的精子群体与携带Y染色体的精子群体之间的中等分选分辨率。虽然20,000个事件/秒的事件率下的面向激光器的内部芯流宽度可以基本上匹配80μm射束宽度的中心部分，但是由图10的左侧直方图表示的结果表明，用于这个实例中的连续波激光器的100mW的输出功率可能是过低的。参考图8和图9所示的先前的实验，可以了解到，流式细胞仪的对准在越小的射束宽度下是越困难的。图10至图25说明了明显的趋势，但是可能是所述仪器在先前的实例中极为良好地对准的情况。
仍然参考图10，右侧上的直方图示出了从相同的流式细胞仪以40,000个事件/秒的事件率(其是相对快的)操作中获得的结果。由于事件率是相对快的，因此对应的芯流的大小是相对大的，并且特别地预期为约33μm。80μm射束宽度的中间部分不能基本上匹配到相对大的内部芯流宽度。也就是说，面向激光器的内部芯流宽度对于射束轮廓的均匀中心部分来说是过大的。因此，被适当地定向的精子中的一些仍然未受到良好的照射，因为所述精子落在了射束轮廓的具有足够均匀的激光能量通量的部分之外。事实上，如图10右侧上的直方图所示，PVR仅为63％(比20,000个事件/秒下的PVR小13％)并且峰并不十分明确，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的较差的分选分辨率。
现参考图11至图13，示出了80μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。确切地说，图11至图13示出了在使用80μm宽度射束轮廓时增加连续波激光器的输出功率会影响所得的分选分辨率。
图11产生的直方图响应于输出功率为150mW的连续波激光器而产生。如左侧上的直方图进一步所示，将连续波激光器的输出功率从如图10所示的100mW增加到如图11所示的150mW导致20,000个事件/秒的事件率下为84％的较高PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为65％的略高的PVR。然而，相对于图11右侧上的结果，40,000个事件/秒的相对快的事件率产生相对宽的对应芯流。面向激光器的内部芯流宽度对于射束轮廓的中心部分来说是过大的并且不能基本上匹配到所述中心部分。因此，在使用增加到150mW的功率时，PVR仅提高到65％，从而显示增加激光功率在射束轮廓宽度与芯流大小不匹配的情况下对所得的分选分辨率只有最低限度的改进。事实上，图12和图13举例说明了这一情况。
图12产生的直方图响应于输出功率为200mW的连续波激光器而产生。如进一步所示，将连续波激光器的输出功率从如图12所示的150mW增加到如图12所示的200mW导致20,000个事件/秒的事件率下为84％的相同的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为68％的略高的PVR。然而，相对于图12右侧上的结果，40,000个事件/秒的相对快的事件率产生大小相对大的对应芯流。另外再一次，面向激光器的内部芯流宽度对于射束轮廓的中心部分来说是过大的并且不能基本上匹配到所述中心部分。因此，在使用输出功率为200mW的连续波激光器时，PVR仅提高到68％，从而再次证实增加激光功率在射束宽度的中心部分不能匹配到芯流大小的情况下只可以稍微地改进分选分辨率。
图13示出了从利用输出功率为250mW的连续波激光器的流式细胞仪产生的两个直方图。如进一步所示，将连续波激光器的输出功率从如图12所示的200mW增加到如图13所示的250mW导致20,000个事件/秒的事件率下为89％的改进的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为69％的略高的PVR。然而，相对于图13右侧上的结果，40,000个事件/秒的相对快的事件率产生大小相对大的对应芯流。再次，面向激光器的内部芯流宽度对于射束轮廓的中心部分来说是过大的并且不能基本上匹配到所述中心部分，并且因此，在使用输出功率为250mW的连续波激光器时，PVR仅提高到69％。
现参考图14，示出了表示从在流式细胞仪中使用90μm宽度射束轮廓中得到的分选分辨率的直方图之间的比较。在这个实例中，使用了提供100mW的输出功率的连续波激光器。左侧上的直方图所示的结果来源于以20,000个事件/秒的事件率(其是相对慢的)操作的流式细胞仪。再次，申请人期望这类事件率对应于29μm的内部芯流宽度。如左侧上的直方图所示，PVR为91％，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的良好的分选分辨率。这个结果表明，面向激光器的内部芯流宽度在事件率为20,000个事件/秒时基本上匹配90μm射束宽度的中心部分。如也由图14左侧上的直方图所示，在射束轮廓具有90μm的宽度时，即使用较低功率的连续波激光器在20,000个事件/秒的低事件率下也可以实现高分选分辨率。
仍然参考图14，在40,000个事件/秒的事件率(其是相对快的)下产生了右侧上所描绘的直方图。由于事件率是相对快的，因此对应的芯流的大小是相对大的。再次，在这种事件率下产生的芯流可能具有33μm的内部芯流宽度。90μm射束宽度的中心部分与面向激光器的这个相对大的内部芯流宽度只是略微不匹配。如图14右侧上的直方图所示，PVR为79％，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的可接受的分选分辨率。左侧上的直方图与右侧上的直方图之间的比较显示，在射束轮廓的宽度基本上匹配面向激光器的内部芯流宽度(如左侧上的结果所指示)时，根据本公开的一个或多个实施方案，将浪费更少的能量，更多的精子可以被包括在定向的区域中并且实现携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的更好的分选分辨率。与80μm相比较，90μm的射束宽度证实了20,000个事件/秒和40,000个事件/秒下PVR的改进的收敛性。
现参考图15至图17，示出了90μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。确切地说，图15至图17示出了在使用90μm宽度射束轮廓时增加连续波激光器的输出功率会如何影响所得的分选分辨率。
图15示出了从利用输出功率为150mW的连续波激光器的流式细胞仪产生的两个直方图。如从这个图中可以理解，将连续波激光器的输出功率从100mW(如图14所示)增加到150mW(如图15所示)导致20,000个事件/秒的事件率下为91％的相同的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为82％的略高的PVR。90μm射束宽度对于40,000个事件/秒下产生的相对大的内部芯流宽度来说仅略微不匹配。因此，在使用输出功率为150mW的连续波激光器时，PVR提高到82％，从而显示增加激光功率在射束轮廓宽度的中心部分相对于内部芯流宽度来说略微不匹配的情况下对所得的分选分辨率将只有最低限度的改进。
图16描绘了从利用输出功率为200mW的连续波激光器的流式细胞仪产生的两个直方图。如从这个图中可以理解，将连续波激光器的输出功率从150mW(示出于图15)增加到200mW(示出于图16)导致20,000个事件/秒的事件率下为97％的改进的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为86％的改进的PVR。从图15中，可以看到，连续波激光器处于200mW的增加的输出功率至少部分对90μm射束宽度的中心部分与相对大的内部芯流之间的略微不匹配进行了补偿。
图17示出了从利用输出功率为250mW的连续波激光器的流式细胞仪产生的两个直方图。如从这个图中可以理解，将连续波激光器的输出功率从200mW(示出于图16)增加到250mW(示出于图17)导致20,000个事件/秒的事件率下为96％的基本上相似的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为92％的改进的PVR。再次，90μm射束宽度的中心部分与相对大的内部芯流宽度之间的任何略微不匹配在很大程度上通过连续波激光器处于250mW的增加的输出功率而得以补偿。
图18示出了表示100μm宽度射束轮廓的使用中得到的分选分辨率的直方图之间的比较。确切地说，在这个实例中，使用了输出功率为100mW的连续波激光器。左侧上的直方图示出了以20,000个事件/秒的事件率(其是相对慢的)操作的流式细胞仪的分辨率。由于事件率是相对慢的，因此对应的芯流的大小是相对小的。左侧上的直方图指示了91％的PVR，从而表明携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的良好的分选分辨率。这个结果表明，面向激光器的内部芯流宽度在事件率为20,000个事件/秒时与100μm射束宽度的中心部分基本上匹配。如也由图18左侧上的直方图所示，在射束轮廓具有100μm的宽度时，即使用较低功率的连续波激光器在20,000个事件/秒的低事件率下也可以实现高分选分辨率。
图18在右侧上示出了来源于以40,000个事件/秒的事件率(其是相对快的)操作的流式细胞仪的直方图。由于事件率是相对快的，因此对应的芯流的大小是相对大的。然而，100μm射束宽度的中心部分基本上匹配面向激光器的相对大的内部芯流宽度。事实上，如图18右侧上的直方图所示，PVR为89％，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的高分选分辨率。如图18中的直方图所示，在射束轮廓的宽度基本上匹配面向激光器的内部芯流宽度时，根据本公开的一个或多个实施方案，将浪费更少的能量，更多的精子被捕获在定向的区域中并且实现携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的更好的分选分辨率。图18还说明了在射束轮廓宽度为100μm时，在事件率从20,000个事件/秒增加到40,000个事件/秒的情况下损失了极小的PVR。另外，100的射束宽度证实了在所有功率下在20,000个事件/秒和40,000个事件/秒下PVR的显著收敛性。
现参考图19至图21，示出了100μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。确切地说，图19至图21示出了在使用100μm宽度射束轮廓时增加连续波激光器的输出功率会如何影响所得的分选分辨率。
在图19中，使用了输出功率为150mW的连续波激光器。参考图18，可以理解，将连续波激光器的输出功率从100mW(如图18所示)增加到150mW(如图19所示)导致20,000个事件/秒的事件率下为96％的较高的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为92％的略高的PVR。相对于图19右侧上的结果，40,000个事件/秒的相对快的事件率产生大小相对大的对应芯流。然而，100μm射束宽度的中心部分基本上匹配面向激光器的相对大的内部芯流宽度。在此处，在使用输出功率为150mW的连续波激光器时，PVR从89％提高到92％，从而显示增加激光功率在射束轮廓宽度基本上匹配面向激光器的内部芯流宽度的情况下可以略微改进所得的分选分辨率。
如图20所示，使用了输出功率为200mW的连续波激光器。图20证实了将连续波激光器的输出功率从150mW(如图19所示)增加到200mW(如图20所示)导致20,000个事件/秒的事件率下为94％的略小的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为91％的略小的PVR。尽管在连续波激光器的输出功率在这个实例中增加到200mW时，PVR略有降低，但是20,000个事件/秒下的94％的PVR和40,000个事件/秒下的91％的PVR各自指示了携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的高分选分辨率。虽然可能是流式细胞仪在捕获图19所在实验的部分期间略微更好地对准的情况，但是图18至图21的趋势说明了在射束宽度的中心部分很好地对准到内部芯流宽度的情况下对增加激光功率的递减的回报。另外，在射束轮廓具有100μm的宽度时，将连续波激光器的激光功率从150mW增加到200mW可能是不必要的。事实上，增加激光功率并不会改进PVR，并且将连续波激光器的输出功率设定为尽可能低的(而不会损害所得的分选分辨率)可以保持携带X染色体的精子亚群和携带Y染色体的精子亚群的健康和生育能力。而且增加了激光器的寿命，由于不会频繁地要求激光器更换，减少了时间和产品的成本。此外，允许使用较低成本、较低功率的激光器。
如图21所示，使用了输出功率为250mW的连续波激光器。如进一步所示，将连续波激光器的输出功率从200mW(如图20所示)增加到250mW(如图21所示)导致20,000个事件/秒的事件率下为93％的略小的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为91％的未改变的PVR。尽管在连续波激光器的输出功率在这个实例中增加到250mW时，PVR略有降低或不改变，但是20,000个事件/秒下的93％的PVR和40,000个事件/秒下的91％的PVR各自指示了携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的良好的分选分辨率。另外，在射束轮廓具有100μm的宽度时，将连续波激光器的激光功率从200mW(或甚至150mW)增加到250mW出于先前指示的相同原因可能是不必要的。
图22示出了比较110μm宽度射束轮廓的使用中得到的分选分辨率的两个直方图。确切地说，在这个实例中，供应到询问位置的连续波激光器输出功率为100mW。左侧上的直方图由以20,000个事件/秒的事件率操作的流式细胞仪产生，所述事件率是相对慢的，从而导致较小的内部芯流宽度。左侧上的直方图具有94％的PVR，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常高的分选分辨率。这个结果表明，110μm射束宽度的中心部分基本上匹配20,000个事件/秒的事件率下的面向激光器的内部芯流宽度。图22左侧上的直方图还显示在射束轮廓具有110μm的宽度时，即使用较低功率的连续波激光器在20,000个事件/秒的低事件率下也可以实现非常高的分选分辨率。
仍然参考图22，右侧上的所得的直方图产生于以40,000个事件/秒的事件率操作的流式细胞仪中，所述事件率是相对快的，从而导致较大的内部芯流宽度。然而，110μm射束宽度的基本上均匀的中心部分基本上匹配面向激光器的相对大的内部芯流宽度。事实上，如图22右侧上的直方图所示，PVR为86％，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常好的分选分辨率。如也由图22中的直方图所示，在射束轮廓宽度为110μm时，在事件率从20,000个事件/秒增加到40,000个事件/秒的情况下损失了很小的PVR。图22示出了射束宽度为110μm的射束轮廓为在各种射束宽度下分选精子提供了优异的选项。
现参考图22至图25，示出了110μm宽度射束轮廓的使用中的所得的分选分辨率的直方图之间的比较。图22至图25示出了在使用110μm宽度射束轮廓时增加连续波激光器的输出功率会如何影响所得的分选分辨率。
图23示出了将连续波激光器功率增加到150mW的结果。在150mW下，在20,000个事件/秒的事件率下测量到了与图22中处于100mW的情况相同的都为94％的PVR。在150mW下，在40,000个事件/秒的事件率下测量到了92％的较高的PVR。相对于图23右侧上的结果，40,000个事件/秒的相对快的事件率产生大小相对大的对应芯流。然而，110μm射束宽度的中心部分基本上匹配面向激光器的相对大的内部芯流宽度。在此处，在使用输出功率为150mW的连续波激光器时，PVR从86％提高到92％，从而显示在射束轮廓具有110μm的宽度时，增加激光功率可以实现甚至进一步改进的分选分辨率。
图24示出了将由连续波激光器递送到询问位置的功率进一步增加到200mW的结果。在20,000个事件/秒的事件率下，左侧上的直方图示出了测得的97％的PVR，这甚至高于150mW处的结果。在40,000个事件/秒的事件率下，左侧上的直方图示出了测得的95％的PVR，这相对于150mW也有一定改进。在20,000个事件/秒下和在40,000个事件/秒下测量的每个PVR各自指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常高的分选分辨率。这个实例证实了，在射束轮廓具有110μm的宽度时，将连续波激光器的激光功率从150mW增加到200mW可以实现甚至更接近的分选分辨率。
图25示出了将由连续波激光器递送到询问位置的功率进一步增加到250mW的结果。如进一步所示，将连续波激光器的输出功率从200mW(如图24所示)增加到250mW(如图25所示)导致20,000个事件/秒的事件率下为97％的未改变的PVR，以及40,000个事件/秒的事件率下为96％的略高的PVR。在20,000个事件/秒下为97％的PVR和在40,000个事件/秒下为96％的PVR各自指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常高的分选分辨率。如由这个实例进一步所示，在射束轮廓具有110μm的宽度时，将连续波激光器的激光功率从200mW增加到250mW可以实现甚至进一步改进的分选分辨率。
图22至图24证实了110μm射束宽度甚至在40,000个事件/秒的较高事件率下都提供了超常的结果。也就是说，在20,000个事件/秒和40,000个事件/秒两者的事件率下，110μm射束宽度的中心部分基本上匹配到内部芯流宽度。在事件率从20,000个事件/秒增加到40,000个事件/秒时，损失了很小的PVR。此外，一旦激光束被修改为具有110μm射束宽度，流式细胞仪或分析仪器就能容易而快速地实现适当的对准，从而带来更好的性能和稳定性。也就是说，在使用110μm射束宽度时，使用流式细胞仪或分析仪器得到的携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的分选分辨率始终是有利的。
如先前相对于图22至图25所示的结果所提及，在射束轮廓具有110μm的宽度时，增加连续波激光器的激光功率可以实现甚至更好的结果。先前，精子分选领域的人员原本没有打算使用高达200mw和更高的连续波射束功率。有关精子分选的早期工作依赖于提供宽带功率的水冷式离子管连续波激光器，并且提高所述激光器的功率显示会损害精子，从而导致较差的生育能力。另外，这些宽带激光器需要在较高的电流电平下运行来获得足够的光，以有效地分辨携带X的精子群体和携带Y的精子群体，从而导致它们具有相对短的使用寿命。与持续数万小时的最新的DPSS(二极管泵浦固态)激光器相比较，这些早期的宽带连续波激光器在需要再制造之前将只能持续数千小时。至少出于这个原因，以及出于下文进一步解释的原因，对于流式细胞术和分选应用，以及尤其是对于分选精子来说，脉冲激光器常规上原本是优选的。
尽管用于图8至图25所示的比较的流式细胞仪以10,000个事件/秒、20,000个事件/秒或40,000个事件/秒的事件率操作，但是分析仪器以以下事件率操作也在本公开的范围内：在约10,000与约20,000个事件/秒之间；在约20,000与约30,000个事件/秒之间；在约30,000与约40,000个事件/秒之间；在约40,000与约50,000个事件/秒之间；在约50,000与约60,000个事件/秒之间；在约60,000与约70,000个事件/秒之间；在约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及在约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
图26至图28提供了结合产生图8至图25的实验制得的三个表格。现参考图26，激光束稳定性结果由流式细胞仪操作者记录为从1(不稳定)至10(稳定)的数值范围。将连续波激光器的射束成形光学器件最初设定为70μm，并且将激光功率最初设定为100mW。然后，将待分选的样品放置在分选器上，并且以40,000个事件/秒处理样品。这个测试的结果记录在如所示的图表中。在此之后，将激光功率增加到150mW，然后增加到200mW并且最终增加到250mW，而连续波激光器的射束成形光学器件仍然设定在70μm处，并且将所有结果记录在图表中。然后，在连续波激光器的射束成形光学器件被设定为80μm、90μm、100μm和110μm的情况下重复这些步骤，并且同样在图表中记录了所有这些结果。
如图26中的表格所示，在70μm至110μm的范围内的任何射束宽度大小在200mW和250mW的较高的连续波激光器功率下都能具有超常的稳定性。如由所述结果进一步所显示，在100μm至110μm的范围内的射束轮廓宽度在100mW至250mW的范围内的任何连续波激光器功率下，甚至是在100mW和150mW的较低功率下都能具有超常的稳定性。如由所述结果进一步所显示，90μm的射束轮廓宽度在100mW至250mW的范围内的连续波激光器功率下具有非常好到超常的稳定性。
现参考图27，示出了在各种激光功率和各种射束轮廓宽度下测试连续波激光器中得到的对准容易度结果。熟悉对准精子分选器的操作者在这个实验期间记录了范围为1(很难对准)至10(容易对准)的数值分数。确切地说，对准容易度结果是相对于将核样品与连续波激光器对准的容易度来说的。在这个对准容易度测试中，将连续波激光器的射束成形光学器件最初设定为70μm，并且将激光功率最初设定为100mW。然后，将待分选的样品放置在分选器上，并且以40,000个事件/秒处理样品。这个测试的结果记录在如所示的图表中。在此之后，将激光功率增加到150mW，然后增加到200mW并且最终增加到250mW，而连续波激光器的射束成形光学器件仍然设定在70μm处，并且将所有结果记录在图27所示的图表中。然后，在连续波激光器的射束成形光学器件被设定为80μm、90μm、100μm和110μm的情况下重复这些步骤，并且同样在图表中记录了所有这些结果。
如由图27的结果所显示，对准容易度通常随着连续波激光器功率在70至110μm的范围内的所有射束轮廓宽度上的增加而增加。如进一步所示，在90μm至110μm的范围内的射束轮廓宽度总体上展现出了最佳对准容易度，而不管连续激光器功率如何。
现参考图28，在各种激光功率和各种射束轮廓宽度下测试连续波激光器中的以不同事件率记录在图9至图25中的每一者中的PVR结果。在这个测试中，将连续波激光器的射束成形光学器件最初设定为80μm，并且将激光功率最初设定为100mW。然后，将待分选的样品放置在分选器上，以20,000个事件/秒处理样品并且将PVR结果记录在图表中。之后，在这些连续波激光器设定下以40,000个事件/秒处理样品，并且将PVR结果记录在图表中。在此之后，将激光功率增加到150mW，然后增加到200mW并且最终增加到250mW，而连续波激光器的射束成形光学器件仍然设定在80μm处，并且将20,000个事件/秒和40,000个事件/秒的事件率下的所有PVR结果记录在图表中。然后，在连续波激光器的射束成形光学器件被设定为90μm、100μm和110μm的情况下重复这些步骤，并且将20,000个事件/秒和40,000个事件/秒的事件率下的所有PVR结果同样记录在图表中。如所示，PVR结果是数值的，其中接近100的数值指示更有利的PVR结果。
如由图28的PVR结果所显示，在90μm至110μm的范围内的射束轮廓宽度在20,000个事件/秒的较慢的事件率下通常展现出高PVR。在40,000个事件/秒的较高事件率下，在100μm至110μm的范围内的射束轮廓宽度相对于PVR表现最好。如进一步所示，除了几个异常或异常值，PVR通常随着连续波激光束功率的增加而改进。观察图28中的趋势，大体上来说，在80μm处执行的测试看起来可能未能以理想的对准执行。事实上，图27示出了操作者将80μm视为有点难以对准(对其给出了评分4)。在接近外部流的直径的射束宽度处，性能也有可能会大幅下降(使用70μm喷嘴尖头，从而意味着外部流的直径也为约70μm)。
实施例3
第三实验致力于确定在连续波激光器上可以设定多低的功率，同时在110μm的射束宽度的情况下仍能实现可接受的精子分选分辨率。再次，利用Genesis CX-355激光器来在配备有Genesis I数字升级件(Cytonome/ST,Boston Massachusetts)的MoFlo SX(Beckman Coulter,Miami Florida)的询问位置处询问精子核。以200百万核/ml的浓度将牛核供应在样品中。
现参考图29，示出了如利用110μm宽度射束轮廓和10mW连续波激光器在流式细胞仪监测器上所显现的二元曲线图和量化所得的分选分辨率的对应的直方图。如前所述，根据本公开的一个或多个实施方案，分析器13分析如由第一检测器11a检测的DNA选择性光发射材料的前向荧光，以及如由第二检测器11b检测的DNA选择性光发射材料的侧向荧光。因此，图29的顶部二元曲线图示出了10,000个事件/秒的事件率下的峰值前向荧光和峰值侧向荧光。根据这个曲线图，能够容易地识别被定向的并适合于分选的精子核。如所示，87.88％的精子核被捕获在定向的区域中。虽然示出了死亡区域，但是可以了解到，精子核并不用死亡猝灭染料染色。在屏幕的底部处的第二二元曲线图中仅绘制了定向的精子。在第二曲线图中，示出了携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子的定向的亚群。根据这个第二曲线图，由操作者在感兴趣的亚群周围绘出分选区域。然而，如图29的实例所示，在亚群中的任一者周围尚未绘出分选区域。
仍然参考图29，根据本公开的一个或多个实施方案的流式细胞仪或分析仪器可以包括跟踪某些数据群体的质心的软件包，例如像先前描述的群体跟踪软件。例如，由于图29的底部二元曲线图中的两个非常靠近的亚群会随时间而漂移，群体跟踪软件会尝试将“X”区域保持在顶部的携带X染色体的精子的亚群上。
仍然参考图29，右侧的流式细胞仪监测器图像显示了指示输出功率为10mW的连续波激光器和10,000个事件/秒的事件率的使用中的携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的分辨率的对应的直方图。在这个实例中，PVR为85％，这是携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常好的分选分辨率。
仍然参考图29，这个实例的流式细胞仪监测器中显示的结果既是令人惊奇的又是意想不到的。仅为10mW的输出功率意味着这个实例中使用的连续波激光器输出非常小的功率。另外，流式细胞仪或分析仪器以10,000个事件/秒的事件率(其是相对慢的)操作。由于事件率是相对慢的，因此对应的芯流的大小是相对小的。因此，大多数精子核受到宽度为110μm的激光束的良好照射并且能够被包括在定向的区域中。令人惊讶的是，当激光束具有110μm的宽度时，即使连续波激光器的输出功率仅为10mW，也可以实现85％的PVR，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常好的分选分辨率。虽然这个实例的所得的PVR部分归因于10,000个事件/秒的较慢事件率，但是以这种低激光输出功率电平用160μm射束轮廓宽度却无法实现这些结果。因此，这些结果显示，在低事件率下，当激光束具有110μm的宽度时，需要非常小的激光功率来实现携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的有利的分选分辨率。显著地，由于需要较小的激光功率，因此可以使用具有较小占用面积和较高使用寿命的连续波激光器，并且可以保持和/或改善携带X染色体的精子亚群和携带Y染色体的精子亚群的健康和生育能力。
图30示出了利用110μm宽度射束轮廓和10mW连续波激光器在20,000个事件/秒的事件率下在流式细胞仪监测器上产生的二元曲线图和对应的直方图。图30的顶部二元曲线图示出了峰值前向荧光和峰值侧向荧光。根据这个曲线图，能够容易地识别定向的精子。如所示，88.09％的精子被包括在定向的精子区域中。图30的这个曲线图与图29的对应的曲线图之间的比较显示，在事件率从10,000个事件/秒增加到20,000个事件/秒时，大约相同百分比的精子具有适当的定向。也就是说，增加事件率不会不利地影响被收集在定向的区域中的精子核的数量。在屏幕的底部处的第二二元曲线图中仅绘制了定向的区域中的事件。在第二曲线图中，示出了携带X染色体的精子核和携带Y染色体的精子核的亚群。根据这个第二曲线图，由操作者在感兴趣的亚群周围绘出分选区域。然而，如图30的实例所示，在亚群中的任一者周围尚未绘出分选区域。如前所述，由于图30的底部二元曲线图中的两个非常靠近的亚群会随时间而漂移，根据本公开的一个或多个实施方案可以使用群体跟踪软件包以尝试将“X”区域保持在顶部细胞群体上。
仍然参考图30，右侧的流式细胞仪监测器显示了量化110μm宽度射束轮廓和输出功率为10mW的连续波激光器在20,000个事件/秒的事件率下的使用中的携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的分选分辨率的对应的直方图。在这个实例中，PVR为79％，从而指示在事件率从如图29所示的10,000个事件/秒增加到如图30所示的20,000个事件/秒时损失了一些PVR。这些结果显示，由于事件率增加到20,000个事件/秒，因此面向激光器的内部芯流宽度基本上不与所使用的射束轮廓宽度匹配。
现参考图31，示出了利用110μm宽度射束轮廓和25mW连续波激光器在流式细胞仪监测器上产生的二元曲线图和对应的直方图。图31的顶部二元曲线图示出了10,000个事件/秒的事件率下的峰值前向荧光和峰值侧向荧光。根据这个曲线图，能够容易地识别定向的精子。如所示，87.78％的精子核被包括在定向的区域中。在屏幕的底部处的第二二元曲线图中仅绘制了包括在定向的区域中的事件。在第二二元曲线图中，携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子的亚群被示出为两个非常靠近的事件集。根据这个第二曲线图，由操作者在感兴趣的亚群周围绘出分选区域。然而，如图31的实例所示，在亚群中的任一者周围尚未绘出分选区域。如前所述，由于图31的底部二元曲线图中的两个非常靠近的亚群会随时间而漂移，根据本公开的一个或多个实施方案可以使用群体跟踪软件包以尝试将“X”亚群保持在顶部细胞群体上。
仍然参考图31，右侧的流式细胞仪监测器显示了量化110μm宽度射束轮廓和输出功率为25mW的连续波激光器在10,000个事件/秒的事件率下的使用中的携带X染色体的精子核亚群与携带Y染色体的精子核亚群之间的分选分辨率的对应的直方图。在这个实例中，PVR为89％，这是携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常好的分选分辨率。另外，功率从10mW到25mW的略微增加在10,000个事件/秒的事件率下能够轻微改进分辨率。
仍然参考图31，这个实例的流式细胞仪监测器中显示的结果既是令人惊奇的又是意想不到的。25mW远低于用于分选精子的典型的激光功率，所述典型的激光功率在160μm的射束宽度下通常使用多达约175mW的激光功率。然而，由于在10,000个事件/秒的事件率下，110μm射束宽度的中心部分基本上匹配到内部芯流宽度。令人惊讶的是，当激光束具有110μm的宽度时，即使连续波激光器的输出功率仅为25mW，也可以实现89％的PVR，从而指示携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的非常好的分选分辨率。虽然这个实例的所得的PVR部分归因于10,000个事件/秒的较慢事件率以及从如图29所示的10mW到如图31所示的25mW的略微增加的激光功率，但是以这种低激光输出功率电平用160μm射束轮廓宽度却无法实现这些结果。因此，这些结果显示，在低事件率下，当激光束具有110μm的宽度时，需要相当小的激光功率来实现携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的有利的分选分辨率。显著地，由于需要较小的激光功率，因此可以使用具有较小占用面积的连续波激光器，并且可以通过在染色期间对精子样品使用较少的染色剂来保持或实际上改善携带X染色体的精子亚群和携带Y染色体的精子亚群的健康和生育能力。
图32示出了如利用110μm宽度射束轮廓和25mW连续波激光器在流式细胞仪监测器上所显现的二元曲线图和量化分选分辨率的对应的直方图。再次，图32的顶部二元曲线图示出了以20,000个事件/秒的事件率操作的检测到的事件的峰值前向荧光和峰值侧向荧光。根据这个曲线图，能够容易地识别定向的精子。如所示，88.32％的精子核被捕获在定向的区域中。图32的这个曲线图与图31的对应的曲线图之间的比较显示，在事件率从10,000个事件/秒增加到20,000个事件/秒时，分辨率准许相同百分比的精子核被捕获在定向的区域中。也就是说，增加事件率不会不利地影响仪器分辨率。在屏幕的底部处的第二二元曲线图中仅包括第一二元曲线图的定向的区域中的精子核。在第二曲线图中，示出了携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子的亚群。根据这个第二曲线图，由操作者在感兴趣的亚群周围绘出分选区域。然而，如图32的实例所示，在亚群中的任一者周围尚未绘出分选区域。如前所述，由于图32的底部二元曲线图中的两个非常靠近的亚群会随时间而漂移，根据本公开的一个或多个实施方案可以使用群体跟踪包以尝试将“X”亚群保持在顶部细胞群体上。
仍然参考图32，右侧上的流式细胞仪监测器显示了表示使用输出功率为25mW的连续波激光器和20,000个事件/秒的事件率的流式细胞仪中的携带X染色体的精子核亚群与携带Y染色体的精子核亚群之间的分选分辨率的直方图。在这个实例中，PVR为90％，从而指示携带X染色体的精子核与携带Y染色体的精子核之间的高分选分辨率。这些结果还指示在事件率从10,000个事件/秒(如图31所示)增加到20,000个事件/秒(如图32所示)时没有损失PVR。在与图30比较时，如前所述，这些结果显示将激光输出功率从10mW略微增加到25mW在20,000个事件/秒的较快事件率下会显著改进PVR。如本领域的普通技术人员所理解，25mW的激光输出功率仍然是很低的。因此，这些结果显示，在20,000个事件/秒的事件率下，当激光束具有110μm的宽度时，需要极少量的激光功率来实现携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间的有利的分选分辨率。显著地，由于需要较小的激光功率，因此可以使用具有较小占用面积的连续波激光器，并且可以保持或实际上改善携带X染色体的精子亚群和携带Y染色体的精子亚群的健康和生育能力。
实施例4
如与常规流式细胞仪相比较，可以用减小的射束路径大大地改进射束稳定性，并且如实施例4中所例示，这种改进会带来更好的分选分辨率，以及更好的分选速度和效率。现参考图33至图37，示出了突出这些益处的各种结果。简而言之，在这个实验中，在两种精子分选系统上分选活牛精子。第一精子分选系统是用包括连续波Coherent Genesis CX-355激光器的Genesis I数字升级件(Cytonome/ST,Boston Massachusetts)修改的MoFloSX(Beckman Coulter,Miami Florida)。第二精子分选器也是用Genesis I数字升级件修改的MoFlo SX，但是用作用于比较的对照系统并且利用具有常规射束成形光学器件和35英寸的常规射束路径的Vanguard 350-355脉冲激光器。
在实验中，对来源于单只牛的精子进行染色，并且将染色的活样品分为两个等分试样。在具有Coherent Genesis CX-355连续波激光器的第一系统中分选一个等分试样。在6英寸处建立射束路径，并且在40,000个事件/秒的事件率下分选精子，直到达到具有携带X染色体的精子的90％的纯度的9千万个细胞的目标为止。如前所述，110μm的射束宽度具有的中心部分基本上匹配到以40,000个事件/秒的事件率操作的流式细胞仪的内部芯流。因此，第一系统贯穿这个实例可以被称为修改后的射束分选系统。
图33示出了将具有缩短的射束路径和连续波激光器的Coherent Genesis的使用中得到的流式细胞仪监测器的定向的区域内的精子的百分比与具有Vanguard脉冲激光器的对照物进行比较的曲线图。在四小时实验的过程中，与包括Coherent Genesis连续波激光器的修改后的分选系统相比较，包括Vanguard脉冲激光器的对照物具有其中更高百分比的精子被捕获在定向的区域中的情况以及其中更低百分比的精子被捕获在定向的区域中的情况。与具有Vanguard脉冲激光器的对照系统的结果相比较，包括Coherent Genesis连续波激光器的修改后的分选系统的使用中得到的定向的区域中的精子的百分比在四小时实验的过程中保持在更稳定的状态。事实上，定向的区域中的精子的百分比在具有Coherent Genesis连续波激光器的修改后的系统中的范围为约64.8％至约68.2％，而定向的区域中的精子的百分比在包括Vanguard脉冲激光器的对照分选系统中的范围为约63％至约69.5％。
图34示出了将具有Coherent Genesis连续波激光器的修改后的分选系统或具有Vanguard脉冲激光器的对照系统中得到的“X”分选区域内的精子的量进行比较的曲线图。在“X”分选区域内仅包括来自定向的区域的精子。相对于“X”分选区域结果，包括CoherentGenesis连续波激光器的修改后的分选系统在四小时实验的过程中保持在比包括Vanguard脉冲激光器的分选系统更稳定的状态。在分选比较早期，在对照系统数据中示出了30.02的读数，从而提供实验中的最低“X”分选区域并且进一步指示对照系统失去了对准。在四小时实验期间如此早的失准指示了具有常规射束成形光学器件和常规射束路径的对照分选系统的不稳定性。大约在两个数据组中的中间部分处，向每个流式细胞仪系统供应新的染色的样品以供分选。
现参考图35，曲线图将具有Coherent Genesis连续波激光器的修改后的精子分选系统或具有Vanguard脉冲激光器的对照系统的使用中得到的精子的分选率进行比较。如所示，相对于分选率结果，包括Coherent Genesis连续波激光器的修改后的分选系统在四小时实验的过程中保持在比包括Vanguard脉冲激光器的对照分选系统更稳定的状态。事实上，三个波谷(排除样品更换)指示了包括Vanguard脉冲激光器的修改后的分选系统失去对准并且需要操作者介入以便继续实验的时间点。这种操作者介入指示了包括常规射束成形光学器件和常规射束路径的对照分选系统的不稳定性。包括Coherent Genesis连续波激光器的修改后的分选系统具有7081个事件/秒的平均分选率，这比包括Vanguard脉冲激光器的对照分选系统的仅为6191个事件/秒的平均分选率更高且更为稳定。
图36示出了将来自修改后的分选系统与对照分选系统的PVR结果进行比较的曲线图。如所示，包括Coherent Genesis连续波激光器的修改后的分选系统在四小时实验的过程中提供比包括Vanguard脉冲激光器的对照分选系统更高且更稳定的PVR结果。也就是说，虽然PVR会不断地变动，但是修改的分选系统仍能在携带X染色体的精子亚群与携带Y染色体的精子亚群之间提供更好的分辨率。如所示，修改后的分选系统在整个实验中保持大体稳定，并且在四个小时期间不需要来自操作者的任何对准或调整。然而，相比之下，对照分选系统在机器的对准在四小时实验的过程中需要调整的四种情形下需要操作者介入。在修改后的分选系统碰上基线之处指示了四次调整。
现参考图37，示出了将修改后的分选系统与对照分选系统的使用中得到的分选时间进行比较的曲线图。如所示，修改后的分选系统的平均分选率为7081个事件/秒，并且修改后的分选系统花费了约3.5小时来分选9千万个精子。如进一步所示，对照分选系统的平均分选率为6191个事件/秒，并且对照分选系统无法在四个小时内分选9千万个精子，但是所述分选系统已接近完成。这些结果显示，在包括改进射束稳定性的短射束路径和具有一定射束宽度的射束成形光学器件的分选系统的使用中可以实现更好的性能和生产率，通过根据本公开的一个或多个实施方案实施射束成形光学器件和较短的射束路径，可以实现更稳定且更有效的分选系统。
现参考图38，示出了将先前通过包括Coherent Genesis连续波激光器或Vanguard脉冲激光器的分选系统分选的冷冻前和冷冻后的精子的品质控制结果进行比较的表格。确切地说，这些是先前通过上文相对于图33至图37描述的四小时实验分选的精子的品质控制结果。冷冻后的结果是已确定性别的精子的活力的最大指标。另外，在冷冻后存活的已确定性别的精子是最强的并且具有最高品质。如所示，包括Coherent Genesis连续波激光器的分选系统产生了冷冻后具有一定品质的与由包括Vanguard脉冲激光器的分选系统产生的那些相当的已确定性别的精子。确切地说，在精子分选应用中使用连续波激光器来取代脉冲激光器时，没有损失太多视觉运动性、活力或PIA(“主要完整顶体”，其指示精子生育的能力)(如果有的话)。这显示，根据本公开的一个或多个实施方案的包括偏斜系统和连续波激光器的分选系统能够产生良好品质的已确定性别的精子，并且与上文描述的当前学派相反，连续波激光器至少在根据本公开的实施方案使用时不会破坏精子或不利地影响精子健康和生育能力。
实施例5
图39至图40示出了从比较包括Vanguard 350-355脉冲激光器的常规类型的分选系统和包括Coherent Genesis CX-355连续波激光器的修改后的分选系统的精子分选性能的实验中获得的各种结果，包括PVR。在实验中，对来源于单只牛的精子进行染色，并且将染色的活样品分为两个等分试样。将一个等分试样放置在包括配备有Genesis I数字升级件(Cytonome/ST,Boston Massachusetts)和Vanguard 350-355脉冲激光器的MoFlo SX(Beckman Coulter,Miami Florida)的分选系统上。Vanguard的射束路径为35英寸。将另一个等分试样放置在包括Coherent Genesis CX-355连续波激光器的Genesis II分选器(Cytonome/ST,Boston Massachusetts)上，其中射束路径为8英寸。目标是为了监测和记录每个样品响应于不同激光在各种激光功率和射束宽度下经历一系列增加的事件率而所得的PVR。图39提供了在这个实验期间在两个系统中在许多事件率和功率下获得的值的表格。图40提供了在每种条件下获得的且对应于图39中的值的PVR的图形表示。特定趋势在图40中可能更为明显，尤其应理解，每个柱条群组开始于最低测试事件率并且进行到最高测试事件率。
在射束宽度被设定为160μm的情况下，最初以105mW的激光功率测试包括Vanguard脉冲激光器的分选系统。在这些设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选等分试样样品。接着，将分选系统的激光功率增加到175mW，而射束宽度保持在160μm处。在这种设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选样品。如图39至图40所示，记录了来自这些试验中的每一者的结果。
如图39至图40所示，包括Vanguard脉冲激光器的分选系统在105mW的低激光功率下并未实现可接受的PVR结果。事实上，在Vanguard脉冲激光器的功率处于105mW时，在20,000至70,000个事件/秒的所有事件率下，PVR仅处于53％至61％的范围内。然而，如进一步所示，这种分选系统在激光功率增加到175mW时在低事件率下确实表现良好，之后在事件率增加到70,000个事件/秒时性能会大幅下降。事实上，PVR在事件率为20,000个事件/秒时处于80，但是在事件率增加到70,000个事件/秒时仅处于51。
在射束宽度被设定为110.5μm的情况下以100mW的激光功率测试包括CoherentGenesis连续波激光器的分选系统。在这种设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选等分试样样品。接着，将射束宽度增加到120.4μm，而激光功率保持设定在100mW处。在这种设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选等分试样样品。接着，将射束宽度增加到130.9μm，而激光功率保持设定在100mW处。在这种设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选等分试样样品。如图39至图40所示，记录了来自这些试验中的每一者的结果。
接着，将包括Coherent Genesis连续波激光器的分选系统的激光功率增加到175mW，并且将射束宽度设定在110.5μm处。在这种设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选样品。接着，将射束宽度增加到120.4μm，而激光功率保持设定在175mW处。在这种设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选等分试样样品。接着，将射束宽度增加到130.9μm，而激光功率保持设定在175mW处。在这种设定下，在20,000个事件/秒、30,000个事件/秒、40,000个事件/秒、50,000个事件/秒、60,000个事件/秒和70,000个事件/秒的增加的事件率中的每一者下在三分钟内分选等分试样样品。如图39至图40所示，记录了来自这些试验中的每一者的结果。
如图39至图40所示，甚至是在100mW的较低激光功率电平下，包括CoherentGenesis连续波激光器的分选系统在所有射束宽度下在所有增加的事件率下通常都比包括Vanguard脉冲激光器的分选系统更为稳定。并入Genesis激光器的系统的射束成形光学器件在多个事件率下将射束宽度的中心部分更好地匹配到芯流宽度。另外，8英寸的缩短的射束路径允许更紧密地匹配的射束宽度以改进的稳定性对准并且因此改进一系列宽度上的结果。如关于包括Coherent Genesis连续波激光器的分选系统进一步所示，110.5μm的较小的射束宽度在例如20,000个事件/秒和30,000个事件/秒的较低事件率下比较大的射束宽度表现得更好。
图39至图40还示出了在175mW的激光功率电平下的包括Coherent Genesis连续波激光器的分选系统中的结果。图39至图40示出了在所有射束宽度下和在所有事件率下，改进的稳定性和特别好的分辨率在增加的功率下会进一步受益。事实上，在样品流体的芯流宽度在分选期间随着事件率的增加而增加的程度上，设定在175mW的功率电平处的包括Coherent Genesis连续波激光器的分选系统提供了在较宽的芯流宽度范围内显示改进的分辨率的PVR结果。175mW功率电平的优点相对于130.9μm或约130μm的射束宽度来说是特别明显的。如图39至图40所示，相对于130.9μm的较大的连续波激光束宽度，PVR结果在功率电平从100mW增加到175mW时在所有事件率下都出现了显著改进。
如图39至图40进一步所示，Coherent Genesis连续波激光器的120.4μm或约120μm的射束宽度在所有事件率下以及在各种激光功率电平下提供优异的分辨率。关于使用射束宽度为120.4μm且激光功率为175mW的Coherent Genesis连续波激光器的试验，在PVR结果达不到与110.5μm和130.9μm射束宽度试验相当的程度上，发明人猜想样品可能即将用尽。然而，在较宽的事件率范围内，以及对应地在较宽的芯流宽度范围内，相对于在约110μm至约130μm的范围内的射束宽度来说，这些结果支持改进的分辨率。
尽管用于产生图39至图40所示的PVR结果的分析仪器以20,000个事件/秒；30,000个事件/秒；40,000个事件/秒；50,000个事件/秒；60,000个事件/秒；或70,000个事件/秒的事件率操作，但是分析仪器以以下事件率操作也在本公开的范围内：在约10,000与约20,000个事件/秒之间；在约20,000与约30,000个事件/秒之间；在约30,000与约40,000个事件/秒之间；在约40,000与约50,000个事件/秒之间；在约50,000与约60,000个事件/秒之间；在约60,000与约70,000个事件/秒之间；在约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及在约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
参考图40，对于更大的趋势，可以看到，在标准分选配置中，处于160μm的射束宽度和175mW的射束功率的Vanguard在不同的事件率下表现截然不同。随着事件率增加，并且芯流宽度对应地增加，PVR或分选分辨率减小。在功率在Vanguard上减小到105mW时，可以看到PVR在所有事件率下都是较差的。相比之下，并入有连续波激光器且射束宽度在约110.5μm与约130.9μm之间的修改后的系统在175mW处展示了优异的稳定性。在105mW的较低功率下，修改后的分选系统展示了对以110.5μm或以120.4μm操作的常规分选系统的改进，从而显示更好地匹配到内部芯流宽度的射束宽度提供了改进的灵活性。
此外，关于所使用的每个术语，应理解，除非所述术语在本申请中的利用与这种解释不一致，否则普遍的词典定义应被理解成像Random House Webster’s UnabridgedDictionary(第二版)中包含的那样包括在对每个术语的描述中，每个定义以引用的方式在此并入本文。
此外，出于本公开的目的，术语“一”或“一个”实体指代一个或多个所述实体；例如，“流体流”指代一个或多个流体流。因此，术语“一”或“一个”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
不管是否明确指明，本文的所有数值都应假定为由术语“约”修饰。出于本发明的目的，范围可以表述为从“约”一个特定值到“约”另一个特定值。当表述这种范围时，另一个实施方案包括从一个特定值到另一个特定值。通过端点叙述的数值范围包括归入所述范围内的所有数值。一至五的数值范围包括例如数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等等。将进一步理解，范围中的每一个的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是有意义的。在通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，将理解特定值形成另一个实施方案。
本说明书中阐述的权利要求作为本发明的说明书的一部分以引用的方式在此并入本文，并且本申请人明确保留使用这类权利要求的这种并入内容的全部或一部分作为附加描述来支持任何或所有权利要求或者其任何要素或组成部分的权利，并且本申请人进一步明确保留在需要时将这类权利要求或者其任何要素或组成部分的并入内容的任何部分或全部从说明书移入权利要求(反之亦然)的权利，以限定本申请或任何后续申请或其继续申请、分割申请或部分继续申请为其寻求保护的主题，或者以获得依据任何国家或条约的专利法律、法则或法规带来的费用减少的任何益处，或者以遵从所述专利法律、法则或法规，并且以引用的方式并入的这种内容在本申请的整个未决期，包括其任何后续继续申请、分割申请、或部分继续申请或者与之有关的任何再版或扩展期间都应保持有效。
本说明书中阐述的权利要求进一步意图描述本发明的有限数量的优选实施方案的边界和界限，并且不应被视为是本发明的最宽泛的实施方案或可以要求保护的本发明的实施方案的完全列举。本申请人并不放弃基于上文阐述的说明书而开发另外的权利要求作为任何继续申请、分割申请、或部分继续申请、或类似申请的一部分的任何权利。

Claims (124)

1.一种用于精子的分析仪器，所述分析仪器包括：
流动通道，所述流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，并且产生流体流的同轴流，所述同轴流具有所述样品流体的内部芯流和所述鞘液的外部流；
激光器，所述激光器产生激光束；
射束成形光学器件，所述射束成形光学器件使所述激光束成形以在询问位置处具有射束宽度和射束高度，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形以在所述询问位置处询问所述待分析的至少一个精子并且将所述射束宽度的中心部分基本上匹配到面向所述激光器的内部芯流宽度；
射束路径，沿着所述射束路径，所述激光束穿过所述激光器与所述射束成形光学器件之间；
至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于来自所述询问位置的电磁辐射而产生信号；以及
分析器，所述分析器从所述至少一个检测器接收所述信号。
2.如权利要求1所述的分析仪器，其中所述内部芯流具有横向于所述流体流的所述同轴流的不同的正交维度，所述不同的正交维度包括所述内部芯流宽度和内部芯流深度。
3.如权利要求1或权利要求2所述的分析仪器，其中射束宽度与所述射束高度比是：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在70μm至130μm的范围内的射束宽度。
5.如权利要求1至4中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内的射束宽度。
6.如权利要求1至5中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分析仪器，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
8.如权利要求1至7中任一项所述的分析仪器，所述分析仪器还包括：
多个附加流动通道，每个附加流动通道产生流体流的附加同轴流，所述附加同轴流具有所述样品流体的附加内部芯流和所述鞘液的附加外部流；
与每个附加流动通道相关联的附加激光器，所述附加激光器产生附加激光束；
与每个附加流动通道相关联的附加射束成形光学器件，所述附加射束成形光学器件使每个附加激光束成形以具有射束宽度，所述射束宽度基本上匹配所述附加内部芯流的面向所述附加激光器的宽度，所述附加射束成形光学器件与所述附加激光器相关联；以及
在每个附加激光器与每个相关联的射束成形光学器件之间的附加射束路径，
其中每个附加射束路径具有小于18英寸的长度。
9.如权利要求1至8中任一项所述的分析仪器，其中所述激光器是发射单一波长电磁辐射的连续波激光器。
10.如权利要求1至9中任一项所述的分析仪器，其中所述流动通道包括流式细胞仪的喷嘴或微流体芯片的通道。
11.如权利要求1至10中任一项所述的分析仪器，其中所述待分析的至少一个精子是用DNA选择性光发射材料染色的精子，并且其中所述DNA选择性光发射材料响应于用所述激光束进行询问而发荧光。
12.如权利要求11所述的分析仪器，其中所述至少一个检测器还包括：
第一检测器，所述第一检测器被设置来检测所述DNA选择性光发射材料的前向荧光；以及
第二检测器，所述第二检测器相对于所述第一检测器以90°设置，所述第二检测器检测所述DNA选择性光发射材料的侧向荧光，
其中所述分析器分析来自所述第一检测器和所述第二检测器的信息以对携带X染色体的精子和/或携带Y染色体的精子进行分类。
13.如权利要求12所述的分析仪器，其中所述分析仪器还包括偏斜元件，所述偏斜元件产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体。
14.如权利要求13所述的分析仪器，其中所述偏斜元件包括小滴产生型流式细胞仪中的偏转板、微流体芯片中的转向机构或基于所选择的精子的分类而破坏所述精子的消融激光器。
15.如权利要求1至14中任一项所述的分析仪器，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的中心的二分之一到所述射束宽度的中心的四分之一。
16.如权利要求1至15中任一项所述的分析仪器，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的最内侧的二分之一、所述射束宽度的最内侧的三分之一或所述射束宽度的最内侧的四分之一。
17.如权利要求1至16中任一项所述的分析仪器，其中所述射束路径小于18英寸。
18.如权利要求1至17中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在15μm至19μm的范围内的射束高度。
19.一种用于精子的分析仪器，所述分析仪器包括：
流动通道，所述流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，并且产生流体流的同轴流，所述同轴流具有所述样品流体的内部芯流和所述鞘液的外部流；
激光器，所述激光器产生激光束；
射束成形光学器件，所述射束成形光学器件使所述激光束成形以具有射束高度和射束宽度，其中所述射束宽度在约130μm至约70μm的范围内并且在询问位置处具有介于7:1与3:1之间的射束宽度与射束高度比，
其中所述射束成形光学器件被配置成使所述激光束成形以在所述询问位置处询问所述待分析的至少一个精子；
射束路径，沿着所述射束路径，所述激光束穿过所述激光器与所述射束成形光学器件之间；
至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于所述询问位置处的电磁辐射而产生信号；以及
分析器，所述分析器从所述至少一个检测器接收所述信号。
20.如权利要求19所述的分析仪器，所述分析仪器还包括：
多个附加流动通道，每个附加流动通道产生流体流的附加同轴流，所述附加同轴流具有所述样品流体的附加内部芯流和所述鞘液的附加外部流；
与每个附加流动通道相关联的附加激光器，所述附加激光器产生附加激光束；
与每个附加流动通道相关联的附加射束成形光学器件，所述附加射束成形光学器件使每个附加激光束成形以具有射束宽度，所述射束宽度基本上匹配面向所述附加激光器的对应的内部芯流宽度，所述附加射束成形光学器件与所述附加激光器相关联；以及
在每个附加激光器与每个相关联的射束成形光学器件之间的附加射束路径，
其中每个附加射束路径具有小于18英寸的长度。
21.如权利要求19至20中任一项所述的分析仪器，其中所述激光器是以单一波长发射激光束的连续波激光器。
22.如权利要求19至21中任一项所述的分析仪器，其中所述流动通道包括流式细胞仪的喷嘴或微流体芯片的通道。
23.如权利要求19至22中任一项所述的分析仪器，
其中所述待分析的至少一个精子是用DNA选择性光发射材料染色的精子，并且
其中所述DNA选择性光发射材料响应于用所述激光束进行询问而发荧光。
24.如权利要求23所述的分析仪器，其中所述至少一个检测器还包括：
第一检测器，所述第一检测器被设置来检测所述DNA选择性光发射材料的前向荧光；以及
第二检测器，所述第二检测器相对于所述第一检测器以90°设置，所述第二检测器检测所述光发射材料的侧向荧光，
其中所述分析器分析来自所述第一检测器和所述第二检测器的信息以对携带X染色体的精子和/或携带Y染色体的精子进行分类。
25.如权利要求19至24中任一项所述的分析仪器，其中所述分析仪器还包括偏斜元件，所述偏斜元件产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体。
26.如权利要求25所述的分析仪器，其中所述偏斜元件包括小滴产生型流式细胞仪中的偏转板、微流体芯片中的转向机构或基于所选择的精子的分类而破坏所述精子的消融激光器。
27.如权利要求19至26中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述射束宽度成形到以下范围：约70μm至约90μm；约90μm至约110μm；或约110μm至约130μm。
28.如权利要求19至27中任一项所述的分析仪器，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
29.如权利要求19至28中任一项所述的分析仪器，其中所述射束宽度与射束高度比是：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
30.如权利要求19至29中任一项所述的分析仪器，其中所述射束路径小于18英寸。
31.如权利要求19至30中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形以将所述射束宽度的中心部分基本上匹配到所述内部芯流。
32.如权利要求31所述的分析仪器，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的中心的二分之一到所述射束宽度的中心的四分之一。
33.如权利要求31至32中任一项所述的分析仪器，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的最内侧的二分之一、所述射束宽度的最内侧的三分之一或所述射束宽度的最内侧的四分之一。
34.如权利要求19至33中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在15μm至19μm的范围内的射束高度。
35.如权利要求19至34中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能。
36.一种产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法，所述方法包括：
产生流体流的同轴流，所述同轴流包括：
样品流体的内部芯流，所述内部芯流具有横向于所述同轴流的不同的正交维度，所述样品流体包含精子；以及
鞘液的外部流；
将来自激光器的激光束修改成具有射束高度和射束宽度的激光束图案；
将面向所述激光器的内部芯流宽度基本上匹配到所述射束宽度的中心部分；
用所述激光束图案询问所述内部芯流中的所述精子；
检测对所述精子的询问的响应；
基于检测到的响应而产生至少一个信号；以及
基于所述至少一个信号而对所述精子的性别分化特性进行分类。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述不同的正交维度包括所述内部芯流宽度和内部芯流深度。
38.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中射束宽度与射束高度比是：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述射束宽度在70μm至130μm的范围内。
40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中所述射束宽度在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内。
41.如权利要求36至40中任一项所述的方法，其中射束成形光学器件修改所述激光束以将所述射束宽度的所述中心部分基本上匹配到所述内部芯流。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的中心的二分之一到所述射束宽度的中心的四分之一。
43.如权利要求41至42中任一项所述的方法，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的最内侧的二分之一、所述射束宽度的最内侧的三分之一或所述射束宽度的最内侧的四分之一。
44.如权利要求36至43中任一项所述的方法，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
45.如权利要求36至44中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而有区别地收集精子。
46.如权利要求36至44中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而对精子进行光消融。
47.如权利要求36至46中任一项所述的方法，其中所述激光束是以单一波长发射的连续波激光束。
48.如权利要求36至47中任一项所述的方法，其中用光发射材料对所述精子的头部内的一定体积的核DNA进行染色，并且其中所述光发射材料响应于询问步骤而发射光。
49.如权利要求48所述的方法，所述方法还包括：
检测所述光发射材料的前向荧光；
检测所述光发射材料的侧向荧光；以及
分析所述前向荧光和所述侧向荧光以确定所述精子的所述性别分化特性。
50.如权利要求36至49中任一项所述的方法，其中将面向所述激光器的内部芯流宽度基本上匹配到所述射束宽度的中心部分的步骤在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能。
51.一种产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法，所述方法包括：
产生流体流的同轴流，所述同轴流包括：
包含精子的样品流体的内部芯流；以及
鞘液的外部流；
将激光束修改成具有在约130μm至约70μm的范围内的射束宽度的激光束图案，所述激光束图案具有介于7:1与3:1之间的射束宽度与射束高度比；
用所述激光束图案询问所述芯流中的所述精子；
检测对所述精子的询问的响应；
基于检测到的响应而产生至少一个信号；以及
基于所述至少一个信号而对所述精子的性别分化特性进行分类。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述内部芯流具有横向于所述流体流的所述同轴流的不同的正交维度，所述不同的正交维度包括所述芯流的宽度和所述芯流的深度。
53.如权利要求51或权利要求52所述的方法，其中所述射束宽度与射束高度比是：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
54.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述射束宽度在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内。
55.如权利要求51至54中任一项所述的方法，其中所述射束宽度介于所述芯流宽度的长度的约1.5倍与4.5倍之间。
56.如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
57.如权利要求51至56中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而有区别地收集精子。
58.如权利要求51至56中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而对精子进行光消融。
59.如权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述激光束是以单一波长发射的连续波激光束。
60.如权利要求51至59中任一项所述的方法，其中用DNA选择性光发射材料对所述精子的头部内的一定体积的核DNA进行染色，并且其中所述DNA选择性光发射材料响应于询问步骤而发射光。
61.如权利要求60所述的方法，所述方法还包括：
检测所述DNA选择性光发射材料的前向荧光；
检测所述DNA选择性光发射材料的侧向荧光；以及
分析所述前向荧光和所述侧向荧光以确定所述精子的所述性别分化特性。
62.如权利要求51至61中任一项所述的方法，其中所述射束高度在约15μm至19μm的范围内。
63.如权利要求51至62中任一项所述的方法，其中所述激光束图案在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能。
64.一种多通道分析仪器，所述多通道分析仪器包括：
两个或更多个流动通道，每个流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，产生流体流的同轴流，所述同轴流具有所述样品流体的内部芯流和所述鞘液的外部流；
与每个流动通道相关联的激光器；
与每个流动通道相关联的射束成形光学器件，所述射束成形光学器件从与每个流动通道相关联的所述激光器产生均匀的射束形状，其中在每个流动通道处的所述均匀的射束形状在每个流动通道处提供基本上相同的性能；
从每个激光器到相关联的流动通道的射束路径，其中在所述射束路径中不存在重叠；
至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于至少一个被询问的精子而产生信号；以及
分析器，所述分析器从所述至少一个检测器接收所述信号。
65.如权利要求64所述的多通道分析仪器，其中每个射束路径基本上是相同长度。
66.如权利要求64或权利要求65所述的多通道分析仪器，其中与每个流动通道相关联的所述激光器还包括：与两个流动通道相关联的两个激光器，并且其中两个激光器的组合的射束路径长度小于36英寸。
67.如权利要求64或权利要求65所述的多通道分析仪器，其中与每个流动通道相关联的所述激光器还包括：与三个流动通道相关联的三个激光器，并且其中所述三个激光器的组合的射束路径长度小于54英寸。
68.如权利要求64至67中任一项所述的多通道分析仪器，其中与流动通道相关联的所述射束成形光学器件产生所述均匀的射束形状，所述均匀的射束形状具有射束，所述射束具有射束宽度、射束高度和以下的射束宽度与射束高度比：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
69.如权利要求68所述的多通道分析仪器，其中与每个流动通道相关联的所述射束成形光学器件使所述激光束成形以将所述射束宽度的中心部分基本上匹配到所述内部芯流。
70.如权利要求69所述的多通道分析仪器，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的中心的二分之一到所述射束宽度的中心的四分之一。
71.如权利要求69至70中任一项所述的多通道分析仪器，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的最内侧的二分之一、所述射束宽度的最内侧的三分之一或所述射束宽度的最内侧的四分之一。
72.如权利要求64至71中任一项所述的多通道分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在70μm至130μm的范围内的宽度。
73.如权利要求64至72中任一项所述的多通道分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内的宽度。
74.如权利要求64至73中任一项所述的多通道分析仪器，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
75.如权利要求64至74中任一项所述的多通道分析仪器，其中不存在从每个激光器到每个相关联的流动通道的所述射束路径的重叠或交叉。
76.如权利要求64至75中任一项所述的多通道分析仪器，其中所述射束成形光学器件在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能。
77.一种产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法，所述方法包括：
在仪器中产生流体流的第一同轴流，所述流体流的所述第一同轴流包括：
包括精子的样品流体的第一内部芯流；以及
鞘液的第一外部流；
沿着第一激光束路径产生第一激光束；
将所述第一激光束修改为第一射束图案，所述第一射束图案具有第一射束宽度和第一射束高度；
在所述仪器中产生流体流的第二同轴流，所述流体流的第二同轴流包括：
包括精子的样品流体的第二内部芯流；以及
鞘液的第二外部流；
沿着第二激光束路径产生第二激光束，其中所述第一激光束路径和所述第二激光束路径不会重叠；
将所述第二激光束修改为第二射束图案，所述第二射束图案具有第二射束宽度和第二射束高度；
用第一修改后的射束询问所述第一内部芯流中的所述精子并用第二修改后的射束询问所述第二内部芯流中的所述精子，其中与每个通道相关联的所述射束成形光学器件在第一流动通道和第二流动通道处提供均匀的射束形状和基本上相同的性能；
检测对用所述第一修改后的射束对所述精子进行所述询问的响应并检测对用所述第二修改后的射束对所述精子进行所述询问的响应；
基于检测到的对以所述第一射束图案对所述精子进行所述询问的所述响应而产生至少一个第一信号，并基于检测到的对以所述第二射束图案对所述精子进行所述询问的所述响应而产生至少一个第二信号；以及
基于所述至少一个第一信号而对所述第一内部芯流中的精子的性别分化特性进行分类，并基于所述至少一个第二信号而对所述第二内部芯流中的精子的性别分化特性进行分类。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述第一内部芯流具有横向于所述第一同轴流的不同的正交维度，所述第一内部芯流的所述不同的正交维度包括第一内部芯流宽度和第一内部芯流深度，并且其中所述第二内部芯流具有横向于所述第二同轴流的不同的正交维度，所述第二内部芯流的所述不同的正交维度包括第二内部芯流宽度和第二内部芯流深度。
79.如权利要求77或权利要求78所述的方法，其中所述第一射束图案和所述第二射束图案的射束宽度与射束高度比是：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
80.如权利要求77至79中任一项所述的方法，其中所述第一射束宽度的中心部分和所述第二射束宽度的中心部分基本上匹配到第一内部芯流宽度和第二内部芯流宽度。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的中心的二分之一到所述射束宽度的中心的四分之一。
82.如权利要求80至81中任一项所述的方法，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的最内侧的二分之一、所述射束宽度的最内侧的三分之一或所述射束宽度的最内侧的四分之一。
83.如权利要求77至82中任一项所述的方法，其中所述第一射束图案和所述第二射束图案的所述射束宽度是在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内。
84.如权利要求77至83中任一项所述的方法，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
85.如权利要求77至84中任一项所述的方法，其中射束高度在约15μm至19μm的范围内。
86.如权利要求77至85中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而从所述第一同轴流和所述第二同轴流有区别地收集精子。
87.如权利要求77至85中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而对来自所述第一同轴流和所述第二同轴流的精子进行光消融。
88.如权利要求77至87中任一项所述的方法，其中所述第一激光束和所述第二激光束是各自以单一波长发射的连续波激光束。
89.如权利要求77至88中任一项所述的方法，其中用DNA选择性光发射材料对所述第一内部芯流和所述第二内部芯流中的所述精子的头部内的一定体积的核DNA进行染色，并且其中所述DNA选择性光发射材料响应于询问步骤而发射光。
90.如权利要求89所述的方法，所述方法还包括：
从所述第一内部芯流中的精子检测所述DNA选择性光发射材料的第一前向荧光；
从所述第一内部芯流中的精子检测所述DNA选择性光发射材料的第一侧向荧光；以及
分析所述第一前向荧光和所述第一侧向荧光以确定所述精子的所述性别分化特性。
91.如权利要求77至90中任一项所述的方法，所述方法还包括将精子分离为携带X染色体的群体和携带Y染色体的群体。
92.如权利要求77至91中任一项所述的方法，其中所述射束宽度在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内。
93.如权利要求77至92中任一项所述的方法，其中所述第一射束图案和所述第二射束图案在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能。
94.一种用于精子的分析仪器，所述分析仪器包括：
流动通道，所述流动通道接收鞘液和具有待分析的至少一个精子的样品流体，并且产生流体流的同轴流，所述同轴流具有所述样品流体的内部芯流和所述鞘液的外部流；
激光器，所述激光器产生激光束；
射束成形光学器件，所述射束成形光学器件使所述激光束成形以在询问位置处具有射束宽度和射束高度，其中所述射束成形光学器件在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的性能；
射束路径，沿着所述射束路径，所述激光束穿过所述激光器与所述射束成形光学器件之间；
至少一个检测器，所述至少一个检测器响应于来自所述询问位置的电磁辐射而产生信号；以及
分析器，所述分析器从所述至少一个检测器接收所述信号。
95.如权利要求94所述的分析仪器，其中所述内部芯流具有横向于所述流体流的所述同轴流的不同的正交维度，所述不同的正交维度包括内部芯流宽度和内部芯流深度。
96.如权利要求94或权利要求95所述的分析仪器，其中射束宽度与射束高度比是：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
97.如权利要求94至96中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在70μm至130μm的范围内的射束宽度。
98.如权利要求94至96中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内的射束宽度。
99.如权利要求94至98中任一项所述的分析仪器，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
100.如权利要求99所述的分析仪器，所述分析仪器还包括：
多个附加流动通道，每个附加流动通道产生流体流的附加同轴流，所述附加同轴流具有所述样品流体的附加内部芯流和所述鞘液的附加外部流；
与每个附加流动通道相关联的附加激光器，所述附加激光器产生附加激光束；
与每个附加流动通道相关联的附加射束成形光学器件，所述附加射束成形光学器件使每个附加激光束成形以具有射束宽度，所述射束宽度基本上匹配所述附加内部芯流的面向所述附加激光器的宽度，所述附加射束成形光学器件与所述附加激光器相关联；以及
在每个附加激光器与每个相关联的射束成形光学器件之间的附加射束路径，
其中每个附加射束路径具有小于54英寸的总长度。
101.如权利要求94至100中任一项所述的分析仪器，其中所述激光器是以单一波长发射激光束的连续波激光器。
102.如权利要求94至101中任一项所述的分析仪器，其中所述流动通道包括流式细胞仪的喷嘴或微流体芯片的通道。
103.如权利要求94至102中任一项所述的分析仪器，
其中所述待分析的至少一个精子是用DNA选择性光发射材料染色的精子，并且
其中所述DNA选择性光发射材料响应于用所述激光束进行询问而发荧光。
104.如权利要求103所述的分析仪器，其中所述至少一个检测器还包括：
第一检测器，所述第一检测器被设置来检测所述DNA选择性光发射材料的前向荧光；以及
第二检测器，所述第二检测器相对于所述第一检测器以90°设置，所述第二检测器检测所述DNA选择性光发射材料的侧向荧光，
其中所述分析器分析来自所述第一检测器和所述第二检测器的信息以对携带X染色体的精子和/或携带Y染色体的精子进行分类。
105.如权利要求104所述的分析仪器，其中所述分析仪器还包括偏斜元件，所述偏斜元件产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体。
106.如权利要求105所述的分析仪器，其中所述偏斜元件包括小滴产生型流式细胞仪中的偏转板、微流体芯片中的转向机构或基于所选择的精子的分类而破坏所述精子的消融激光器。
107.如权利要求94至106中任一项所述的分析仪器，其中所述射束宽度的中心部分构成所述射束宽度的中心的二分之一到所述射束宽度的中心的四分之一。
108.如权利要求94至107中任一项所述的分析仪器，其中所述射束宽度的中心部分构成所述射束宽度的最内侧的二分之一、所述射束宽度的最内侧的三分之一或所述射束宽度的最内侧的四分之一。
109.如权利要求94至108中任一项所述的分析仪器，其中所述射束路径小于18英寸。
110.如权利要求94至109中任一项所述的分析仪器，其中所述射束成形光学器件使所述激光束成形到在15μm至19μm的范围内的射束高度。
111.一种产生具有偏斜的性别比的活精子的精子群体的方法，所述方法包括：
产生流体流的同轴流，所述同轴流包括：
样品流体的内部芯流，所述内部芯流具有横向于所述同轴流的不同的正交维度，所述样品流体包含精子；以及
鞘液的外部流；
将激光束修改成激光束图案，所述激光束图案在介于5,000个事件/秒与65,000个事件/秒之间的事件率下提供基本上相似的精子分选分辨率，所述激光束图案具有射束宽度和射束高度；
用所述激光束图案询问所述芯流中的所述精子；
检测对所述精子的询问的响应；
基于检测到的响应而产生至少一个信号；以及
基于所述至少一个信号而对所述精子的性别分化特性进行分类。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述内部芯流具有横向于所述流体流的所述同轴流的不同的正交维度，所述不同的正交维度包括内部芯流宽度和内部芯流深度。
113.如权利要求111或权利要求112所述的方法，其中所述激光束图案包括射束宽度与射束高度比，所述射束宽度与射束高度比为：介于约7:1与约3:1之间；介于约6:1与约4:1之间；介于约7:1与约6:1之间；介于约6:1与约5:1之间；介于约5:1与约4:1之间；或介于约4:1与约3:1之间。
114.如权利要求111至113中任一项所述的方法，其中所述激光束图案包括在70μm至130μm的范围内的射束宽度。
115.如权利要求111至114中任一项所述的方法，其中所述射束宽度在约70μm至约90μm、约90μm至约110μm或约110μm至约130μm的范围内。
116.如权利要求111至115中任一项所述的方法，其中所述射束宽度的中心部分基本上匹配到内部芯流宽度。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的中心的二分之一到所述射束宽度的中心的四分之一。
118.如权利要求116至117中任一项所述的方法，其中所述射束宽度的所述中心部分构成所述射束宽度的最内侧的二分之一、所述射束宽度的最内侧的三分之一或所述射束宽度的最内侧的四分之一。
119.如权利要求111至118中任一项所述的方法，其中所述分析仪器以选自由以下项组成的组的事件率操作：介于约10,000与约20,000个事件/秒之间；介于约20,000与约30,000个事件/秒之间；介于约30,000与约40,000个事件/秒之间；介于约40,000与约50,000个事件/秒之间；介于约50,000与约60,000个事件/秒之间；介于约60,000与约70,000个事件/秒之间；介于约70,000个事件/秒与约80,000个事件/秒之间；以及介于约80,000个事件/秒与约90,000个事件/秒之间。
120.如权利要求111至119中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而有区别地收集精子。
121.如权利要求111至120中任一项所述的方法，所述方法还包括：
基于所述性别分化特性而对精子进行光消融。
122.如权利要求111至121中任一项所述的方法，其中所述激光束是以单一波长发射的连续波激光束。
123.如权利要求111至122中任一项所述的方法，
其中用光发射材料对所述精子的头部内的一定体积的核DNA进行染色，并且
其中所述光发射材料响应于询问步骤而发射光。
124.如权利要求123所述的方法，所述方法还包括：
检测所述光发射材料的前向荧光；
检测所述光发射材料的侧向荧光；以及
分析所述前向荧光和所述侧向荧光以确定所述精子的所述性别分化特性。
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