BR122020025720B1 - Uso de um anticorpo biespecífico para a produção de uma composição farmacêutica para ativar a atividade citotóxica - Google Patents

Uso de um anticorpo biespecífico para a produção de uma composição farmacêutica para ativar a atividade citotóxica Download PDF

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Atsushi Narita
Takahiro Ishiguro
Mika Sakurai
Hirotake Shiraiwa
Naoka Hironiwa
Tomoyuki Igawa
Yumiko Kawai
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Abstract

A presente invenção refere-se a novas moléculas multiespecíficas de ligação a antígeno que mantêm excelente citotoxicidade celular e alta estabilidade, as quais compreendem um domínio que contém uma re-gião variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 e um domínio que contém uma região variável de anticorpo que tem ati-vidade de ligação ao complexo receptor de células T. Uma vez que as moléculas da presente invenção mostram uma forte citotoxicidade con-tra células e tecidos que expressam glipicana 3, é possível produzir novas composições farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de vários cânceres.

Description

[0001] Dividido do BR112017006061-2, depositado em 25.09.2015
Campo Técnico
[0002] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a an- tígeno multiespecíficas, seus usos e assim por diante.
Técnica Antecedente
[0003] Os anticorpos estão chamando a atenção como fármacos em virtude de sua elevada estabilidade no plasma e poucas reações adversas (Documentos Não Patente 1 e 2). Sabe-se que os anticorpos induzem não apenas a uma ação de ligação a antígeno, uma ação ago- nista e uma ação antagonista, mas também atividades citotóxicas mediadas por efetores (também designadas por funções efetoras), tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpos (Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity), fagocitose celular dependente de anticorpos (Antibody Dependent Cell Mediated Phagocytosis) e citotoxicidade dependente de complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity - CDC), e exibem efeitos antitumor contra células cancerosas (Documento Não Patente 3). ADCC é uma citotoxicidade exibida por células efetoras contra células cancerosas alvo ligadas a anticorpos através de ligação da região Fc do anticorpo a um receptor de Fc presente em células efeto- ras, tais como células NK e macrófagos. Um complexo de complemento se liga ao sítio de ligação do complemento presente em uma estrutura de anticorpo. CDC é a lesão celular que resulta da destruição celular onde um influxo de água e íons em células é promovido pela formação de poros na membrana celular das células ligadas ao anticorpo por componentes do complemento presentes no complexo. Diversos anticorpos terapêuticos que exibem excelentes efeitos antitumor foram desenvolvidos como fármacos para o tratamento de câncer (Documento Não Patente 4); e, embora os anticorpos terapêuticos existentes tenham demonstrado excelentes ações, o resultado terapêutico conseguido pela administração destes anticorpos ainda não é satisfatório.
[0004] Para que um anticorpo expresse ADCC, ADCP e CDC, é ne cessário que a região Fc do anticorpo, o receptor de anticorpo (FcyR) presente em células efetoras, tais como células NK e macrófagos, e vários componentes do complemento se liguem. Em seres humanos, as isoformas FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e FcyRIIIb foram ditas como a família de proteínas FcyR e os respectivos alotipos também foram reportados (Documento Não Patente 5). Dentre estas isoformas, FcyRIa, FcyRIIa e FcyRIIIa trazem um domínio denominado Motivo Ati- vador com Base em Tirosina de Imunorreceptor (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif - ITAM) no domínio intracelular e transmitem sinais de ativação. Por outro lado, apenas FcyRIIb traz um domínio denominado Motivo Inibidor com Base em Tirosina de Imunorreceptor (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif - ITIM) no domínio intracelular e transmite sinais inibidores. Sabe-se que cada um de FcyR transmite sinais via ligação cruzada por complexos imunes e assim por diante (Documento Não Patente 6). Quando os anticorpos exercem efetivamente uma função efetora nas células cancerosas, os FcyRs na membrana de células efetoras formam aglomerados nas regiões Fc de vários anticorpos ligados à membrana da célula cancerosa e os sinais de ativação são transmitidos por células efetoras. Um efeito citocida é exercido como um resultado porém, uma vez que os FcyRs são ligados de forma cruzada apenas em células efetoras presentes próximo de células cancerosas desta vez, é mostrado que a ativação de imunidade ocorre localmente em células cancerosas (Documento Não Patente 7).
[0005] As imunoglobulinas de ocorrência natural se ligam a antíge-nos em suas regiões variáveis e se ligam a receptores, tais como FcyR, FcRn, FcαR e FcεR, e se complementam em suas regiões constantes. FcRn é uma das moléculas de ligação que interagem na região Fc de IgG e, uma vez que cada uma das cadeias pesadas de anticorpo se liga a uma molécula de FcRn, descobriu-se que duas moléculas de FcRn se ligam a uma molécula de anticorpo do tipo IgG. No entanto, ao contrário de FcRn e assim por diante, o FcyR interage na região de do-bradiça do anticorpo e no domínio CH2, e apenas uma molécula de FcyR se liga a uma molécula de anticorpo do tipo IgG (Documento Não Patente 8). Além disso, um anticorpo de tipo IgG comum de ocorrência natural reconhece e se liga a um único epítopo através de sua região variável (Fab); portanto, ele pode se ligar a apenas um antígeno. Por outro lado, sabe-se que muitos tipos de proteínas estão envolvidos em câncer e inflamação, e pode haver interação cruzada entre as proteínas. Por exemplo, sabe-se que várias citocinas inflamatórias (TNF, IL1 e IL6) estão envolvidas em doenças imunológicas (Documento Não Patente 9). Além disso, a ativação de outros receptores é conhecida como um dos mecanismos do câncer na aquisição de resistência a fármacos (Documento Não Patente 10). Em tais casos, anticorpos comuns que reconhecem um único epítopo seriam incapazes de inibir múltiplas pro-teínas.
[0006] Anticorpos (anticorpos biespecíficos) que se ligam a dois ou mais tipos de antígenos com uma molécula estão sendo estudados como moléculas que inibem múltiplos alvos. É possível conferir atividades de ligação a dois antígenos diferentes (um primeiro antígeno e um segundo antígeno) através da modificação de anticorpos de tipo IgG de ocorrência natural (Documento Não Patente 11). Consequentemente, haverá não apenas a neutralização de dois ou mais tipos de antígenos por uma única molécula, mas também o aumento da atividade antitumor em virtude de ligações cruzadas entre células com atividade citotóxica e células cancerosas. Como formas moleculares de um anticorpo biespecífico, uma molécula que compreende um sítio de ligação a antí- geno foi adicionada ao N- ou C-término de um anticorpo (DVD-Ig e scFv- IgG), uma molécula que tem sequências diferentes para as duas regiões Fab de um anticorpo (anticorpo biespecífico com cadeia L em comum e um hibridoma híbrido), uma molécula na qual uma região Fab reconhece dois antígenos (IgG dois-em-um) e uma molécula que tem um sítio de alça da região CH3 como um novo sítio de ligação a antígeno (Fcab) foram reportados até o momento (Documentos Não Patente 12 e 13). Uma vez que todos os anticorpos biespecíficos interagem em suas regiões Fc com FcyR, as funções efetoras do anticorpo são preservadas. Assim, o anticorpo biespecífico se liga a qualquer antígeno que reconhece e, ao mesmo tempo, se liga ao FcyR e exibe uma atividade de ADCC contra células que expressam o antígeno.
[0007] Se todos os antígenos reconhecidos pelo anticorpo biespe- cífico são antígenos especificamente expressos em câncer, o anticorpo biespecífico exibe atividade citotóxica para células cancerosas quando ele se liga a qualquer dos antígenos. Portanto, em comparação com um fármaco de anticorpo convencional que reconhece um antígeno, pode- se esperar um efeito antitumor mais eficiente deste anticorpo. No entanto, no caso em que qualquer um dos antígenos reconhecidos pelo anticorpo biespecífico é expresso em tecidos ou células normais expressos em imunócitos, ocorrem danos nos tecidos normais ou liberação de citocinas em virtude da ligação cruzada com FcyR (Documento Não Patente 14). Como um resultado, são induzidas fortes reações adversas.
[0008] Um anticorpo redirecionador de células T que emprega células T mobilizadoras de citotoxicidade como células efetoras como o me-canismo para seu efeito antitumor é conhecido desde os anos 1980 como um anticorpo biespecífico (Documentos Não Patente 15, 16 e 17). Ao contrário dos anticorpos que empregam células NK mobilizadoras de ADC ou macrófagos como células efetoras como o mecanismo para seus efeitos antitumor, um anticorpo redirecionador de células T é um anticorpo contra qualquer uma das subunidades que constituem o complexo receptor de células T (TCR) em células T e é especificamente um anticorpo biespecífico que compreende um anticorpo que se liga à cadeia épsilon de CD3 e um anticorpo que se liga a um antígeno na célula cancerosa alvo. As células T se aproximam de células cancerosas através da ligação simultânea da cadeia épsilon de CD3 e um antí- geno canceroso por um anticorpo redirecionador de células T. Como um resultado, os efeitos antitumor contra as células cancerosas são considerados como sendo exercidos através da atividade citotóxica possuída pelas células T.
[0009] O catumaxomabe, o qual é conhecido como um anticorpo de redirecionamento de células T, se liga a dois Fab, cada um a um antí- geno canceroso (EpCAM) e a uma cadeia de CD3ε (CD3 épsilon) expressa em células T. O catumaxomabe induz à atividade citotóxica mediada pelas células T através de ligação ao antígeno canceroso e CD3ε ao mesmo tempo, e induz à atividade citotóxica mediada por células apresentadoras de antígenos, tais como células NK e macrófagos, através de ligação ao antígeno canceroso e FCYR ao mesmo tempo. Com o uso destas duas atividades citotóxicas, o catumaxomabe exibe um elevado efeito terapêutico em ascite maligna por meio de administração intraperitoneal e foi, deste modo, aprovado na Europa (Documento Não Patente 18). Além disso, há casos onde a administração de catuma- xomabe produz, segundo informações, anticorpos reativos às células cancerosas, o que mostra claramente que a imunidade adquirida é induzida (Documento Não Patente 19). A partir deste resultado, anticorpos que têm tanto atividade citotóxica mediada por células T quanto ações mediadas por FcyR pelas células, tais como células NK ou ma- crófagos (estes anticorpos são particularmente ditos como anticorpos trifuncionais) têm recebido atenção, pois um efeito antitumor e forte indução de imunidade adquirida podem ser esperados.
[0010] Os anticorpos trifuncionais, no entanto, se ligam à CD3ε e FcyR ao mesmo tempo mesmo na ausência de um antígeno canceroso e, portanto, ligam de forma cruzada a células T que expressam CD3ε com células que expressam FcyR mesmo em um ambiente que carece de células cancerosas, levando à produção de várias citocinas em grandes quantidades. Tal indução independente de antígeno canceroso da produção de várias citocinas restringe a administração atual dos anticorpos trifuncionais à via intraperitoneal (Documento Não Patente 20). Os anticorpos trifuncionais são muito difíceis de administrar siste- micamente em virtude de reações adversas de tipo "surto" graves às citocinas. Na verdade, no ensaio clínico de Fase I de administração sistêmica de catumaxomabe a pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas, uma dose muito baixa de 5 mg/corpo é a dose máxima admissível e a administração de uma dose maior causou várias reações adversas graves (Documento Não Patente 21).
[0011] Como tal, os anticorpos biespecíficos por técnicas convencionais podem se ligar a ambos os antígenos, o primeiro antígeno sendo o antígeno canceroso (EpCAM) e o segundo antígeno CD3ε, ao mesmo tempo quando eles se ligam ao FcyR; e portanto, levando em conta sua estrutura molecular, é impossível evitar reações adversas provocadas pela ligação simultânea ao FcyR e ao segundo antígeno CD3ε.
[0012] Entretanto, diferente do catumaxomabe, o BiTE não tem sítio de ligação a receptor Fcy e, portanto, não tem ligação cruzada com receptores expressos sobre células T e células tais como células NK e macrófagos de maneira dependente de antígeno canceroso. Assim, foi demonstrado que o BiTE não causa indução de citocinas independente de antígeno canceroso, o qual é observado quando o catumaxomabe é administrado. No entanto, uma vez que o BiTE é uma molécula de anticorpo de baixo peso molecular modificada sem uma região Fc, o problema é que sua meia-vida sérica após administração a um paciente é significativamente menor do que aquela de anticorpos do tipo IgG con-vencionalmente usados como anticorpos terapêuticos. Na verdade, a meia-vida sérica do BiTE administrado in vivo foi avaliada como sendo cerca de várias horas (Documentos Não Patente 22 e 23). Nos ensaios clínicos de blinatumomabe, ele é administrado por meio de infusão intravenosa contínua usando uma minibomba. Este método de administração não só é extremamente inconveniente para os pacientes, mas também tem o risco potencial de acidentes médicos em virtude de mau funcionamento do dispositivo ou similar. Assim, não se pode dizer que tal método de administração é desejável.
[0013] Nos últimos anos, o uso de uma região Fc com atividade re duzida de ligação ao FcyR permitiu a manutenção da forte atividade antitumor possuída pelo BiTE e a excelente propriedade de segurança de não induzir a uma "explosão" de citocinas de uma forma dependente de antígeno canceroso e forneceu novos conjuntos de polipeptídeos que têm meia-vida longa no sangue (Documento de Patente 1).
[0014] Por outro lado, ao expressar um anticorpo biespecífico por meio de técnicas convencionais, uma vez que são expressos dois tipos de cadeias H e dois tipos de cadeias L, dez combinações são concebíveis. Dentre elas, apenas uma das combinações produzidas tem a especificidade de ligação de interesse. Portanto, para obter o anticorpo bi- específico de interesse, o único anticorpo de interesse deve ser purificado a partir dos dez tipos de anticorpos, o que é muito ineficiente e difícil.
[0015] Foi descrito um método de secreção preferencial de IgGs com uma combinação heterodimérica de cadeias H, por exemplo, uma combinação de uma cadeia H contra o antígeno A e uma cadeia H contra o antígeno B, através da introdução de substituições de aminoácidos na região CH3 da cadeia H da IgG como um método para resolver este problema (Documentos de Patente 2, 3, 4, 5, 6, 7 e Documentos Não Patente 24 e 25). Um método que usa alterações físicas, isto é, "knob" e "hole", e um método que usa repulsão de carga elétrica foram reportados como tais métodos.
[0016] Para obter a molécula de interesse com melhor eficiência, foram descritos processos que usam cadeias L que podem se ligar a dois antígenos diferentes, embora as cadeias L tenham a mesma sequência de aminoácidos (Documentos de Patente 8 e 9). Contudo, a afinidade do antígeno pode diminuir grandemente com o uso de cadeias L comuns e é difícil encontrar cadeias L comuns que mantenham a afinidade antigênica.
Lista de Citações [Documentos de Patente]
[0017] [Documento de Patente 1] WO2012/073985
[0018] [Documento de Patente 2] WO96/27011
[0019] [Documento de Patente 3] WO2006/106905
[0020] [Documento de Patente 4] WO2007/147901
[0021] [Documento de Patente 5] WO2009/089004
[0022] [Documento de Patente 6] WO2010/129304
[0023] [Documento de Patente 7] WO2013/065708
[0024] [Documento de Patente 8] WO98/050431
[0025] [Documento de Patente 9] WO2006/109592
[Documentos Não Patente]
[0026] [Documento Não Patente 1] Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
[0027] [Documento Não Patente 2] Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
[0028] [Documento Não Patente 3] Drug Des Devel Ther (2009) 3, 7-16
[0029] [Documento Não Patente 4] Clin Cancer Res. (2010) 16 (1), 11-20
[0030] [Documento Não Patente 5] Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65
[0031] [Documento Não Patente 6] Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34 47
[0032] [Documento Não Patente 7] Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81
[0033] [Documento Não Patente 8] J. Bio. Chem., (20001) 276, 16469-16477
[0034] [Documento Não Patente 9] Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10
[0035] [Documento Não Patente 10] Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51
[0036] [Documento Não Patente 11] mAbs. (2012) Mar 1, 4 (2)
[0037] [Documento Não Patente 12] Nat. Rev. (2010) 10, 301-316
[0038] [Documento Não Patente 13] Peds (2010), 23 (4), 289-297
[0039] [Documento Não Patente 14] J. Immunol. (1999) 1 de Agosto, 163 (3), 1246-52
[0040] [Documento Não Patente 15] Nature (1985) 314 (6012), 628 31
[0041] [Documento Não Patente 16] Int J Cancer (1988) 41 (4), 609 15.
[0042] [Documento Não Patente 17] Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83 (5), 1453-7
[0043] [Documento Não Patente 18] Cancer Treat Rev. (2010) Out 36 (6), 458-67
[0044] [Documento Não Patente 19] Future Oncol. (2012) Jan 8 (1), 73-85
[0045] [Documento Não Patente 20] Cancer Immunol Immu- nother. (2007) 56 (9), 1397-406
[0046] [Documento Não Patente 21] Cancer Immunol Immu- nother. (2007) 56 (10), 1637-44 Patente 22] Cancer Immunol Immu- Patente 23] Cancer Immunol Immu- nother. (2009) 58 (1), 95-109
[0047] [Documento Não Patente 22] Cancer Immunol Immunother. (2006) 55 (5), 503-14
[0048] [Documento Não Patente 23] Cancer Immunol Immunother. (2009) 58 (1), 95-109
[0049] [Documento Não Patente 24] Protein Engineering. (1996) vol.9, p.617-621
[0050] [Documento Não Patente 25] Nature Biotechnology. (1998) vol.16, páginas 677-681.
Sumário da Invenção [Problemas a Serem Resolvidos Pela Invenção]
[0051] A presente invenção foi conseguida tendo em vista as circunstâncias acima. Um objetivo da presente invenção é fornecer molé-culas de ligação a antígeno multiespecíficas que mantêm as células T próximas das células cancerosas alvo e podem tratar o câncer através da atividade citotóxica de células T contra tecidos cancerosos alvo que contêm células que expressam glipicana 3 e são formas moleculares que podem ser produzidas com alta eficiência; métodos para a produção das moléculas de ligação a antígeno; e composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de ligação a antígeno como ingrediente ativo.
[Meios para Resolver os Problemas]
[0052] Os presentes inventores descobriram uma cadeia L em comum a um domínio que compreende uma região variável de anticorpo de ligação à glipicana 3 e um domínio que compreende uma região variável de anticorpo de ligação ao complexo receptor de células T, em que a cadeia L em comum é capaz de melhorar a afinidade por ambos os antígenos. Isto permite a preparação de formas moleculares que podem ser produzidas com alta eficiência e a descoberta adicional de novas moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas que mantêm a forte atividade antitumor possuída por anticorpos redirecionadores de células T, tal como BiTE e a excelente propriedade de segurança de não induzir a uma "explosão" de citocinas de uma maneira dependente de antígeno canceroso e também têm meia-vida longa no sangue. Além disso, os presentes inventores descobriram que as moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas que compreendem cadeias L em comum di-rigem células cancerosas que expressam glipicana 3 e causam lesão celular. Com base nesta descoberta, os presentes inventores elucidaram que as moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção causam lesões em tecidos cancerosos que contêm células cancerosas que expressam glipicana 3.
[0053] Mais especificamente, a presente invenção fornece o se guinte:
[0054] [1] uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que compreende:
[0055] (1) um domínio que compreende uma região variável de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3,
[0056] (2) um domínio que compreende uma região variável de an ticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T, e
[0057] (3) um domínio que compreende uma região Fc que tem ati vidade de ligação reduzida a um receptor Fcy,
[0058] em que as regiões variáveis de cadeia L compreendidas na região variável de (1) e a região variável de (2) têm uma sequência de aminoácidos em comum; em que a molécula de ligação a antígeno mul- tiespecífica tem uma atividade citotóxica equivalente ou maior do que aquela do anticorpo biespecífico GPC3_ERY22_rCE115 que compreende um domínio de ligação à glipicana 3 que compreende SEQ ID NOs: 47 e 48 e um domínio de ligação ao complexo receptor de células T que compreende SEQ ID NOs: 49 e 50.
[0059] [2] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [1], em que a atividade citotóxica é atividade citotóxica dependente de células T.
[0060] [3] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [1] ou [2], em que a atividade de ligação ao complexo receptor de células T é atividade de ligação a um receptor de células T.
[0061] [4] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qual quer um de [1] a [3], em que a atividade de ligação ao complexo receptor de células T é atividade de ligação a uma cadeia de CD3ε.
[0062] [5] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qual quer um de [1] a [4], em que a região variável de anticorpo de (1) em [1] é uma região variável de anticorpo que compreende qualquer uma das combinações de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia H selecionadas a partir de (a1) a (a5) abaixo ou uma região variável de anticorpo funcionalmente equivalente às mesmas:
[0063] (a1) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 40;
[0064] (a2) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 197;
[0065] (a3) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206;
[0066] (a4) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 211; e
[0067] (a5) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 215.
[0068] [6] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [4], em que a região variável de anticorpo de (2) em [1] é uma região variável de anticorpo que compreende qualquer uma das combinações de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia H selecionadas a partir de (b1) a (b15) abaixo ou uma região variável de anticorpo funcionalmente equivalente às mesmas:
[0069] (b1) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 52;
[0070] (b2) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 103;
[0071] (b3) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 122;
[0072] (b4) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 128;
[0073] (b5) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 129;
[0074] (b6) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 132;
[0075] (b7) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 142;
[0076] (b8) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 144;
[0077] (b9) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 164;
[0078] (b10) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 168;
[0079] (b11) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 421;
[0080] (b12) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 424;
[0081] (b13) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 426;
[0082] (b14) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 429; e
[0083] (b15) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 430.
[0084] [7] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qual quer um de [1] a [4], em que as regiões variáveis de anticorpo de (1) e (2) em [1] são regiões variáveis de anticorpo que compreendem qualquer uma das combinações de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia H selecionadas de (c1) a (c19) abaixo ou regiões variáveis de anticorpo funcionalmente equivalentes às mesmas:
[0085] (c1) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 40; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 52;
[0086] (c2) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 40; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 421;
[0087] (c3) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 40; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 426;
[0088] (c4) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 40; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 429;
[0089] (c5) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 40; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 430;
[0090] (c6) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 197; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 128;
[0091] (c7) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 142;
[0092] (c8) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 144;
[0093] (c9) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 164;
[0094] (c10) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 168;
[0095] (c11) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 211; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 142;
[0096] (c12) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 211; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 144;
[0097] (c13) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 211; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 164;
[0098] (c14) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 211; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 168;
[0099] (c15) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 215; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 103;
[0100] (c16) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 215; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 122;
[0101] (c17) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 215; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 129;
[0102] (c18) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 215; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 132; e
[0103] (c19) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel de anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 215; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 424.
[0104] [8] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qual quer um de [5] a [7], em que CDR1, CDR2 e CDR3 são regiões CDR1, CDR2 e CDR3 com base na numeração de Kabat.
[0105] [9] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qual quer um de [1] a [4], em que a região variável de anticorpo de (1) em [1] é uma região variável de anticorpo que compreende qualquer uma das regiões variáveis de cadeia H selecionadas a partir de (a1) a (a5) abaixo ou uma região variável de anticorpo funcionalmente equivalente às mes-mas:
[0106] (a1) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;
[0107] (a2) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197;
[0108] (a3) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206;
[0109] (a4) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211; e
[0110] (a5) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215.
[0111] [10] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [4], em que a região variável de anticorpo de (2) em [1] é uma região variável de anticorpo que compreende qualquer uma das regiões variáveis de cadeia H selecionadas a partir de (b1) a (b15) abaixo ou uma região variável de anticorpo funcionalmente equivalente às mesmas:
[0112] (b1) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52;
[0113] (b2) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103;
[0114] (b3) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122;
[0115] (b4) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128;
[0116] (b5) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129;
[0117] (b6) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132;
[0118] (b7) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142;
[0119] (b8) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144;
[0120] (b9) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164;
[0121] (b10) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168;
[0122] (b11) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 421;
[0123] (b12) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 424;
[0124] (b13) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 426;
[0125] (b14) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 429; e
[0126] (b15) uma região variável de cadeia H que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 430.
[0127] [11] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [4], em que as regiões variáveis do anticorpo de (1) e (2) em [1] são as regiões variáveis de anticorpo que compreende qualquer uma das combinações de regiões variáveis de cadeia H sele-cionados a partir de (c1) a (c19) abaixo ou as regiões variáveis de anti-corpos funcionalmente equivalentes às mesmas:
[0128] (c1) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião icorpo de (1) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; e uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52;
[0129] (c2) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 40; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 421;
[0130] (c3) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 40; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 426;
[0131] (c4) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 40; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 429;
[0132] (c5) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 40; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 430;
[0133] (c6) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 197; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128;
[0134] (c7) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 206; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142;
[0135] (c8) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 206; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144;
[0136] (c9) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 206; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164;
[0137] (c10) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 206; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168;
[0138] (c11) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 211; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142;
[0139] (c12) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 211; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144;
[0140] (c13) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 211; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164;
[0141] (c14) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 211; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168;
[0142] (c15) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103;
[0143] (c16) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122;
[0144] (c17) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129;
[0145] (c18) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132; e
[0146] (c19) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215; e uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 424.
[0147] [12] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [11], em que a cadeia L em comum de [1] é uma cadeia L em comum que compreende qualquer uma das combinações de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir de (d1) a (d11) abaixo ou uma cadeia L em comum funcionalmente equivalente às mesmas:
[0148] (d1) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 53;
[0149] (d2) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0150] (d3) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 299;
[0151] (d4) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 301;
[0152] (d5) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 302;
[0153] (d6) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 304;
[0154] (d7) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 306;
[0155] (d8) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 307;
[0156] (d9) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 309;
[0157] (d10) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami-noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO:310; e
[0158] (d11) CDR1, CDR2 e CDR3 idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 319.
[0159] [13] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [11], em que a região variável de cadeia L de [1] é uma região variável de qualquer uma das sequências de aminoácidos de cadeia L selecionada a partir de (d1) a (d11) abaixo:
[0160] (d1) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 53;
[0161] (d2) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 223;
[0162] (d3) de uma cadeia L que compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 299;
[0163] (d4) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 301;
[0164] (d5) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 302;
[0165] (d6) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 304;
[0166] (d7) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 306;
[0167] (d8) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 307;
[0168] (d9) uma cadeia L que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 309;
[0169] (d10) uma cadeia L que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 310; e
[0170] (d11) uma cadeia L que compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 319.
[0171] [14] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [4], em que as regiões variáveis do anticorpo de (1) e (2) de [1] e a região variável da cadeia L em comum são regiões variáveis de anticorpo que compreendem qualquer uma das combinações de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia H e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia e L selecionadas a partir de (e1) a (e25) abaixo ou regiões variáveis de anticorpos funcionalmente equivalentes às mesmas:
[0172] (e1) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 128; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 53;
[0173] (e2) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 128; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 299;
[0174] (e3) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 128; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 310;
[0175] (e4) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 197; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 128; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 319;
[0176] (e5) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 142; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0177] (e6) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 144; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0178] (e7) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 164; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0179] (e8) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 206; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 168; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0180] (e9) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 142; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0181] (e10) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 142; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 299;
[0182] (e11) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 144; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0183] (e12) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 164; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0184] (e13) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 211; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 168; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 223;
[0185] (e14) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 53;
[0186] (e15) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 299;
[0187] (e16) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 301;
[0188] (e17) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 302;
[0189] (e18) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 304;
[0190] (e19) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 306;
[0191] (e20) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 307;
[0192] (e21) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 103; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 309;
[0193] (e22) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 122; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 53;
[0194] (e23) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 129; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 53;
[0195] (e24) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variá vel do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 132; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 53; e
[0196] (e25) CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 215; CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 424; e CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável de anticorpo de cadeia L em comum e idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas em SEQ ID NO: 53.
[0197] [15] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [4], em que as regiões variáveis do anticorpo de (1) e (2) de [1] e a região variável da cadeia L em comum são regiões variáveis de anticorpo que compreendem qualquer uma das combinações de regiões variáveis selecionadas a partir de (f1) a (f26) abaixo ou regiões variáveis de anticorpos funcionalmente equivalentes às mesmos:
[0198] (f1) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 197; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região va-riável contida em SEQ ID NO: 53;
[0199] (f2) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 197; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região va-riável contida em SEQ ID NO: 299;
[0200] (f3) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 197; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região va-riável contida em SEQ ID NO: 310;
[0201] (f4) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 197; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região va-riável contida em SEQ ID NO: 319;
[0202] (f5) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 206; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142; e uma região variável de anticorpo de cadeia L e comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 223;
[0203] (f6) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 206; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região va-riável contida em SEQ ID NO: 223;
[0204] (f7) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 206; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164; e uma região variável de anticorpo de cadeia L e comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 223;
[0205] (f8) uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 206; uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região va-riável contida em SEQ ID NO: 223;
[0206] (f9) de uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 211; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 223;
[0207] (f10) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 211; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 299;
[0208] (f11) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 211; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 223;
[0209] (f12) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 211; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 223;
[0210] (f13) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 211; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 223;
[0211] (f14) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 53;
[0212] (f15) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 299;
[0213] (f16) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 301;
[0214] (f17) de uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 302;
[0215] (f18) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H com-preendida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 304;
[0216] (f19) de uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 306;
[0217] (f20) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 307;
[0218] (f21) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 309;
[0219] (f22) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; e uma região variável de anticorpo de cadeia L em comum idêntica à sequência de aminoáci- dos da região variável contida em SEQ ID NO: 53;
[0220] (f23) de uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L e comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 53;
[0221] (f24) uma região variável de cadeia H compreendida na re gião variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L e comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 53;
[0222] (f25) de uma região variável de cadeia H compreendida na região variável do anticorpo de (1) em [1] e idêntica à sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215; uma região variável de cadeia H compre-endida na região variável do anticorpo de (2) em [1] e idêntica à sequên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 424; e uma região variável de anti-corpo de cadeia L e comum idêntica à sequência de aminoácidos da região variável contida em SEQ ID NO: 53; e
[0223] (f26) uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que se liga a um epítopo que se sobrepõe a cada um dos epítopos de glipi- cana 3 e o complexo receptor de células T ligados pela molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de (f1) a (f25) e que tem uma cadeia L em comum.
[0224] [16] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [15], em que a região Fc de (3) em [1] é uma região Fc com uma mutação de aminoácidos em qualquer um dos aminoácidos que constituem a região Fc de SEQ ID NOs: 23 a 26 (IgG1 a IgG4).
[0225] [17] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [16], em que a região Fc de (3) em [1] é uma região Fc com a mutação de pelo menos um aminoácido selecionado a partir das posições na sequência de aminoácidos especificadas pela numeração EU:
[0226] posição 220, posição 226, posição 229, posição 231, posição 232, posição 233, posição 234, posição 235, posição 236, posição 237, posição 238, posição 239, posição 240, posição 264, posição 265, posição 266, posição 267, posição 269, posição 270, posição 295, posição 296, posição 297, posição 298, posição 299, posição 300, posição 325, posição 327, posição 328, posição 329, posição 330, posição 331 e posição 332.
[0227] [18] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [16], em que a região Fc de (3) em [1] é uma região Fc que compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos a seguir especificados pela numeração EU:
[0228] Arg na posição de aminoácido 234, Ala ou Arg na posição de aminoácido 235, Lys na posição de aminoácido 239 e Ala na posição de aminoácido 297.
[0229] [19] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [16] a [18], em que a região Fc de (3) em [1] compreende ainda uma mutação de aminoácidos para promoção da formação de uma região Fc heterodimérica.
[0230] [20] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [19], em que a região Fc heterodimérica é a combinação da sequência de aminoácidos (g1) ou (g2) abaixo:
[0231] (g1) uma combinação de uma sequência de aminoácidos idêntica à região Fc de uma região constante que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e uma sequência de ami- noácidos idêntica à região Fc de uma região constante que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; e
[0232] (g2) uma combinação de uma sequência de aminoácidos idêntica à região Fc de uma região constante que compreende a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62 e uma sequência de aminoácidos idêntica à região Fc de uma região constante que compre-ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.
[0233] [21] A molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [20], em que a molécula de ligação a antígeno multiespecífica é um anticorpo biespecífico.
[0234] [22] Um anticorpo biespecífico de qualquer um de (h1) a (h25) abaixo:
[0235] (h1) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 424 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53;
[0236] (h2) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53;
[0237] (h3) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 299;
[0238] (h4) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 301;
[0239] (h5) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 302;
[0240] (h6) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 304;
[0241] (h7) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 306;
[0242] (h8) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 307;
[0243] (h9) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de an ticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 que compreende uma re-gião variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 309;
[0244] (h10) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53;
[0245] (h11) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 53;
[0246] (h12) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 53;
[0247] (h13) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 299;
[0248] (h14) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 310;
[0249] (h15) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 319;
[0250] (h16) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 53;
[0251] (h17) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 299;
[0252] (h18) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223;
[0253] (h19) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 223;
[0254] (h20) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 223;
[0255] (h21) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 223;
[0256] (h22) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 223;
[0257] (h23) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 223;
[0258] (h24) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L em comum de anticorpo que tem a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 223; e
[0259] (h25) um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de 3 de ligação à glipicana que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; uma cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região variável de cadeia H de anticorpo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 e uma região constante que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 ou 62; e uma cadeia L do anticorpo comum que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.
[0260] [23] Um ácido nucleico que codifica a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [20] ou o anticorpo biespecífico de [21] ou [22].
[0261] [24] Um vetor no qual o ácido nucleico de [23] é introduzido.
[0262] [25] Uma célula que compreende o ácido nucleico de [23] ou o vetor de [24].
[0263] [26] Um método para a produção da molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [20] ou o anticorpo biespecífico de [21] ou [22] através de cultura da célula de [25].
[0264] [27] Uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica ou um anticorpo biespecífico produzidos por meio do método de [26].
[0265] [28] Uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [20] ou o anticorpo biespecífico de [21] ou [22] e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
[0266] [29] A composição farmacêutica de [28] que induz à citotoxi- cidade.
[0267] [30] A composição farmacêutica de [29], em que a citotoxici- dade é citotoxicidade dependente de células T.
[0268] [31] A composição farmacêutica de [28], a qual é para admi nistração a um paciente que precisa da molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [20] ou do anticorpo biespecífico de [21] ou [22].
[0269] Além disso, a presente invenção refere-se a um kit a ser usado em um método da presente invenção, em que o kit compreende uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica produzida por meio do método de produção da presente invenção. A presente invenção refere-se também ao uso de uma molécula de ligação a antí- geno multiespecífica da presente invenção ou ao uso de uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica produzida por meio do método de produção da presente invenção na fabricação de uma composição far-macêutica para ativação de atividade citotóxica. A presente invenção refere-se, adicionalmente, a uma molécula de ligação a antígeno multi- específica da presente invenção, ou uma molécula de ligação a antí- geno multiespecífica produzida por meio do método de produção da presente invenção, a ser usada em um método da presente invenção. Aqui, as moléculas de ligação a antígeno multiespecíficos incluem anticorpos biespecíficos da presente invenção.
[0270] Além disso, a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que compreende os seguintes do-mínios:
[0271] (1) um domínio que compreende uma região variável de an ticorpo que tem uma atividade de ligação à glipicana 3;
[0272] (2) um domínio que compreende uma região variável de an ticorpo que tem a atividade de ligação ao complexo receptor de células T;
[0273] em que as regiões variáveis das cadeias L contidas nas re giões variáveis de (1) e (2) têm uma sequência de aminoácidos compar-tilhada. A presente invenção refere-se também ao domínio de (1) o qual é, mais especificamente, um domínio que compreende regiões variáveis de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de anticorpos que têm atividade de ligação à glipicana 3 e o qual está compreendido na molécula de ligação a antígeno multiespecífica. A presente invenção refere-se, adicionalmente, ao domínio de (2) o qual é, mais especificamente, um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação ao complexo receptor de células T e que está compreendido na molécula de ligação a antígeno multiespecífica. Os detalhes dos domínios de (1) e (2) podem incluir aqueles descritos em [1] a [22] mencionados acima. A molécula de ligação a antígeno multiespecí- fica pode ser um anticorpo biespecífico. Além disso, a molécula de ligação a antígeno multiespecífica pode ainda compreender um domínio que compreende uma região Fc e a região Fc pode ter uma atividade de ligação ao receptor Fcy reduzida. Detalhes do domínio que compreende uma região Fc podem incluir aqueles descritos em [1] a [22] mencionados acima. A presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica a molécula de ligação a antígeno multiespecífica ou os domínios, um vetor introduzido com o ácido nucleico, uma célula que compreende o ácido nucleico ou o vetor, um método para a produção da molécula de ligação a antígeno multiespecífica por meio de cultura das células e uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica ou domínios que compreendem uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à glipicana 3 ou atividade de ligação ao complexo receptor de células T produzidos pelo método. Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação a antígeno multiespecífica e um veículo farmaceu- ticamente aceitável. A composição farmacêutica pode induzir à lesão celular, a lesão celular pode ser citotoxicidade celular dependente de células T e a composição pode ser para administração a um paciente que precisa da molécula de ligação a antígeno multiespecífica.
[0274] A presente invenção também fornece uma molécula de liga ção a antígeno multiespecífica que se liga a epítopos que se sobrepõem e/ou competem com epítopos em cada um da glipicana 3 e do complexo receptor de células T ligados pela molécula de ligação a antígeno mul- tiespecífica de qualquer um de (e1) a (e25) de [14] mencionados acima e uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que se liga a epí- topos que se sobrepõem e/ou competem com epítopos em cada um de glipicana 3 e complexo receptor de células T ligados pela molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de (f1) a (f25) de [15].
[0275] Em relação a (g1) e (g2) de [20] mencionados acima, dasduas regiões Fc, a primeira região Fc pode ser incluída na cadeia H de anticorpo com atividade de ligação à glipicana 3 e a última região Fc pode ser incluída na cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T; ou a primeira região Fc pode ser incluída na cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T e a última região Fc pode ser incluída na cadeia H de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3.
[Efeitos da Invenção]
[0276] A presente invenção fornece novas moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas com formas moleculares que podem ser pro-duzidas com elevada eficiência, as quais mantêm a forte atividade anti-tumor possuída pelo BiTE e a excelente propriedade de segurança de não causar indução independente de antígeno canceroso de uma "ex-plosão" de citocinas e assim por diante e têm meias-vidas longas no sangue. As composições farmacêuticas que ativam a atividade citotó- xica, as quais compreendem uma molécula de ligação a antígeno mul- tiespecífica da presente invenção como ingrediente ativo, têm como alvo tecidos cancerosos que contêm células cancerosas que expressam gli- picana 3 para causar lesão celular e podem tratar ou prevenir vários cânceres. A invenção permite um tratamento desejável o qual tem não apenas um elevado nível de segurança, mas também carga física redu-zida e é altamente conveniente para os pacientes.
Breve Descrição dos Desenhos
[0277] A Figura 1 mostra diagramas esquemáticos de a: ERY22 e b: ERY27.
[0278] A Figura 2 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas de GPC3_ERY22_rCE115 e GPC3_ERY27_hCE115 quando NCI-H446 é usada como a célula alvo. O losango cheio (♦) e o triângulo cheio (▲) indicam a atividade citotóxica de GPC3_ERY22_rCE115 e GPC3_ERY27_hCE115, respectivamente.
[0279] A Figura 3 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas de GPC3_ERY22_rCE115 e GPC3_ERY27_hCE115 quando PC-10 é usada como a célula alvo. O losango cheio (♦) e o triângulo cheio (▲) indicam a atividade citotóxica de GPC3_ERY22_rCE115 e GPC3_ERY27_hCE115, respectivamente.
[0280] A Figura 4 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas dos anticorpos otimizados quando NCI-H446 é usada como a célula alvo.
[0281] A Figura 5 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas dos anticorpos otimizados quando NCI-H446 é usada como a célula alvo.
[0282] A Figura 6 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas dos anticorpos otimizados quando NCI-H446 é usada como a célula alvo.
[0283] A Figura 7 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas dos anticorpos otimizados quando NCI-H446 é usada como a célula alvo.
[0284] A Figura 8 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas dos anticorpos otimizados quando NCI-H446 é usada como a célula alvo.
[0285] A Figura 9 é um gráfico que mostra as atividades citotóxicas dos anticorpos otimizados quando NCI-H446 é usada como a célula alvo.
[0286] A Figura 10 mostra os efeitos antitumor in vivo dos anticor pos otimizados quando PC-10 é usada como a célula alvo.
[0287] A Figura 11 mostra os efeitos antitumor in vivo dos anticor pos otimizados quando NCI-H446 é usada como a célula alvo.
[0288] A Figura 12 mostra a relação entre os resíduos de aminoáci- dos que constituem as regiões Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e o sis-tema de numeração de Kabat UE (aqui, também referido como o índice de UE).
[0289] A Figura 13-1 mostra as sequências da região variável de cadeia pesada e sua numeração de acordo com Kabat et al.
[0290] A Figura 13-2 mostra as sequências da região variável de cadeia pesada e sua numeração de acordo com Kabat et al.
[0291] A Figura 14 mostra as sequências de região variável de ca deia leve e a sua numeração de acordo com Kabat et al.
Modo de Realização da Invenção
[0292] As definições abaixo são fornecidas para auxiliar na compre ensão da presente invenção ilustrada aqui.
Anticorpo
[0293] Aqui, "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina natural ou uma imunoglobulina produzida por meio de síntese parcial ou completa. Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais, tais como plasma ou soro que ocorre naturalmente ou sobrenadantes de cultura de hibri- domas que produzem anticorpos. Alternativamente, anticorpos podem ser parcial ou totalmente sintetizados usando técnicas tal como recom- binação genética. Anticorpos preferidos incluem, por exemplo, anticorpos de um isotipo de imunoglobulina ou subclasse pertencente aos mesmos. Imunoglobulinas humanas conhecidas incluem anticorpos das nove classes (isotipos) a seguir: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM. Destes isotipos, anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
[0294] Métodos para produção de um anticorpo com atividade de ligação desejada são conhecidos por aqueles versados no campo. Abaixo está um exemplo que descreve um método para produção de um anticorpo (anticorpo anti-GPC3) que se liga à Glipicana-3 (daqui em diante também dita como GPC3), o qual pertence à família dos receptores GPI- ancorados (Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65). Anticorpos que se ligam a um complexo receptor de células T também podem ser produzidos de acordo com o exemplo descrito abaixo.
[0295] Anticorpos anti-GPC3 podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando métodos conhecidos. Os anticorpos anti-GPC3 produzidos são, de preferência, anticorpos monoclonais de-rivados de mamíferos. Tais anticorpos monoclonais derivados de mamí-feros incluem anticorpos produzidos por hibridomas ou células hospe-deiras transformadas com um vetor de expressão que traz um gene de anticorpo por meio de técnicas de engenharia genética.
[0296] Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais po dem ser produzidos usando técnicas conhecidas, por exemplo, conforme descrito abaixo. Especificamente, mamíferos são imunizados através de métodos convencionais de imunização usando uma proteína GPC3 como um antígeno de sensibilização. Células imunes resultantes são fundidas com células parentais conhecidas por meio de métodos de fusão celular convencionais. Então, hibridomas que produzem um anti-corpo anti-GPC3 podem ser selecionados por meio de triagem de células que produzem anticorpos monoclonais usando métodos de triagem convencionais.
[0297] Especificamente, anticorpos monoclonais são preparados conforme indicado abaixo. Primeiro, o gene GPC3, cuja sequência de nucleotídeos é descrita em RefSeq número de acesso NM_001164617.1 (SEQ ID NO: 1), pode ser expresso para produzir uma proteína GPC3 descrita em RefSeq número de acesso NP_001158089.1 (SEQ ID NO: 2), a qual será usada como um antígeno de sensibilização para preparo de anticorpo. Isto é, uma sequência gê- nica que codifica GPC3 é inserida em um vetor de expressão conhecido e células hospedeiras adequadas são transformadas com este vetor. A proteína GPC3 humana desejada é purificada a partir das células hospedeiras ou seus sobrenadantes de cultura por meio de métodos conhecidos. Por exemplo, para preparar GPC3 solúvel a partir de sobre- nadantes de cultura, aminoácidos nas posições 564 a 580 que formam a região hidrofóbica correspondendo à sequência GPI-ancorada usada para ancorar GPC3 sobre a membrana celular são deletados da sequência polipeptídica de do GPC3 de SEQ ID NO: 2 e, então, a proteína resultante é expressa em vez da proteína GPC3 de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, é possível usar uma proteína GPC3 natural purificada como um antígeno de sensibilização.
[0298] A proteína GPC3 purificada pode ser usada como um antí- geno de sensibilização para uso na imunização de mamíferos. Peptí- deos parciais de GPC3 também podem ser usados como antígenos sen- sibilizantes. Neste caso, os peptídeos parciais também podem ser obtidos por meio de síntese química a partir da sequência de aminoáci- dos de GPC3 humana. Além disso, eles também podem ser obtidos através da incorporação de uma porção do gene de GPC3 em um vetor de expressão e expressão do mesmo. Além disso, eles também podem ser obtidos através de degradação da proteína GPC3 usando proteases, mas a região e o tamanho do peptídeo de GPC3 usado como o peptídeo parcial não estão particularmente limitados a uma modalidade especial. Como a região preferida, qualquer sequência a partir da sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos nas posições 524 a 563 ou, mais preferivelmente, qualquer sequência a partir da sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos nas posições 537 a 563 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 pode ser selecionada. De preferência, qualquer sequência pode ser selecionada a partir da sequência de aminoácidos da região não que contêm a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos nas posições 550 a 663 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. De preferência, qualquer sequência pode ser selecionada a partir da sequência de aminoá- cidos que corresponde às posições 544 a 553 e, mais preferivelmente, qualquer sequência pode ser selecionada a partir da sequência de ami- noácidos que corresponde às posições 546 a 551 da sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 2. O número de aminoácidos que constituem um peptídeo a ser usado como o antígeno sensibilizante é pelo menos cinco ou mais ou, de preferência, por exemplo, seis ou mais ou sete ou mais. Mais especificamente, peptídeos que consistem em 8 a 50 resíduos ou, de preferência, 10 a 30 resíduos podem ser usados como o antígeno sensibilizante.
[0299] A proteína GPC3 purificada pode ser usada como um antí- geno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptídeo parcial de GPC3 pode também ser usado como um antígeno de sensi-bilização. Neste caso, um peptídeo parcial pode ser preparado por meio de síntese química com base na sequência de aminoácidos de GPC3 humana ou mediante inserção de um gene parcial de GPC3 em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um peptídeo parcial pode ser produzido através de degradação de uma proteína GPC3 com uma protease. O comprimento e região do peptídeo parcial de GPC3 não estão limitados à modalidades particulares. Uma região preferida pode ser arbitrariamente selecionada da sequência de aminoácido nas posições de aminoácidos 564 a 580 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. O número de aminoácidos que formam um peptídeo a ser usado como um antígeno de sensibilização é, de preferência, pelo menos, cinco ou mais, seis ou mais ou sete ou mais. Mais especificamente, um peptídeo de 8 a 50 resíduos, mais preferivelmente de 10 a 30 resíduos pode ser usado como um antígeno de sensibilização.
[0300] Para o antígeno de sensibilização, alternativamente, é pos sível usar uma proteína de fusão preparada por meio de fusão de um polipeptídeo ou peptídeo parcial da proteína GPC3 desejado com um polipeptídeo diferente. Por exemplo, fragmentos de anticorpo Fc e tags peptídicas são, de preferência, usados para produção de proteínas de fusão para serem usados como antígenos de sensibilização. Vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por meio de fusão em genes in-frame que codificam dois ou mais fragmentos polipeptídicos desejados e inserindo o gene de fusão em um vetor de expressão, conforme descrito acima. Métodos para produção de proteínas de fusão são descritos em Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al. Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Métodos para preparo de GPC3 a ser usado como um antígeno de sensibilização e métodos de imunização usando GPC3 são especificamente descritos nos documentos WO 2003/000883, WO 2004/022754 e WO 2006/006693.
[0301] Não há limitação particular sobre os mamíferos a serem imunizados com o antígeno de sensibilização. No entanto, é preferível selecionar os mamíferos considerando sua compatibilidade com as cé-lulas parentais a serem usadas para fusão celular. Em geral, roedores, tais como camundongos, ratos e hamsters, coelhos e macacos são, de preferência, usados.
[0302] Os animais acima são imunizados com um antígeno de sen sibilização por meio de métodos conhecidos. Em geral, métodos de imu-nização realizados incluem, por exemplo, injeção intraperitoneal ou sub-cutânea de um antígeno de sensibilização em mamíferos. Especifica-mente, um antígeno de sensibilização é apropriadamente diluído com PBS (Phosphate-Buffered Saline - Solução Salina Tamponada com Fosfato), solução salina fisiológica ou similar. Se desejado, um adjuvante convencional, tal como adjuvante completo de Freund, é misturado com o antígeno e a mistura é emulsificada. Então, o antígeno de sensibilização é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias. Veículos apropriados podem ser usados em imunização com o antígeno de sensibilização. Em particular, quando um peptídeo parcial de baixo peso molecular é usado como o antígeno de sensibilização, algumas vezes é desejável acoplar o peptídeo antígeno de sensibilização a uma proteína veículo, tal como albumina ou hemocianina para imunização.
[0303] Alternativamente, hibridomas que produzem um anticorpo desejado podem ser preparados usando imunização com DNA conforme mencionado abaixo. Imunização com DNA é um método de imunização que confere imunoestimulação por meio de expressão de um antígeno de sensibilização em um animal imunizado como um resultado de administração de um vetor de DNA construído para permitir expressão de um gene que codifica proteína antigênica no animal. Quando comparado com métodos convencionais de imunização nos quais um antígeno de proteína é administrado aos animais a serem imunizados, espera-se que imunização com DNA seja superior pelo fato de que: - imunoestimulação pode ser conferida, ao mesmo tempo em que retém a estrutura de uma proteína da membrana, tal como GPC3; e - não há necessidade de purificar o antígeno para imunização.
[0304] A fim de preparar um anticorpo monoclonal da presente invenção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA que expressa uma proteína GPC3 é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA que codifica GPC3 pode ser sintetizado por meio de métodos conhecidos, tal como PCR. O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão apropriado e, então, este é administrado a um animal a ser imunizado. Vetores de expressão preferivelmente usados incluem, por exemplo, vetores de expressão comercialmente disponíveis, tal como pcDNA3.1. Vetores podem ser administrados a um organismo usando métodos convencionais. Por exemplo, imunização com DNA é realizada usando uma pistola gênica para introduzir partículas de ouro revestidas com vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imunizado. Anticorpos que reconhecem GPC3 podem também ser produzidos por meio dos métodos descritos no documento WO 2003/104453.
[0305] Após imunização de um mamífero conforme descrito acima, um aumento na titulação de anticorpo ligado à GPC3 é confirmado no soro. Então, células imunes são coletadas do mamífero e, então, sub-metidas à fusão celular. Em particular, esplenócitos são, de preferência, usados como células imunes.
[0306] Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com o imunócito mencionado acima. As células de mieloma compreendem, de preferência, um marcador de seleção ade-quado para triagem. Um marcador de seleção confere características às células para sua sobrevivência (ou morte) sob uma condição de cultura específica. Deficiência de fosforribosiltransferase de hipoxantina-gua- nina (daqui em diante abreviada como deficiência de HGPRT) e defici-ência de quinase de timidina (daqui em diante abreviada como deficiência de TK) são conhecidas como marcadores de seleção. Células com deficiência de HGPRT ou TK têm sensibilidade à hipoxantina-aminopte- rina-timidina (daqui em diante abreviada como sensibilidade À HAT). Células sensíveis à HAT não podem sintetizar DNA em um meio de se-leção com HAT e, assim, são mortas. No entanto, quando as células são fundidas com células normais, elas podem continuar a síntese de DNA usando a via de salvamento das células normais e, portanto, elas podem crescer mesmo no meio de seleção com HAT.
[0307] As células deficientes em HGPRT e deficientes em TK po dem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina, 8-azagua- nina (daqui em diante abreviada como 8AG) ou 5'-bromodesoxiuridina, respectivamente. Células normais são mortas porque elas incorporam estes análogos de pirimidina em seu DNA. Enquanto isso, células que são deficientes nestas enzimas podem sobreviver no meio de seleção, uma vez que elas não podem incorporar estes análogos de pirimidina. Além disso, um marcador de seleção referido como resistência a G418 fornecido pelo gene resistente à neomicina confere resistência a anti-bióticos de 2-deóxi-estreptamina (análogos de gentamicina). Vários tipos de células de mieloma são adequados para fusão celular são conhecidos.
[0308] Por exemplo, células de mieloma incluem as células a seguir que podem ser preferencialmente usadas: P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunol-ogy (1978)81, 1-7); NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.
[0309] Fusão de células entre os imunócitos e células de myeloma são realizadas essencialmente usando métodos conhecidos, por exemplo, um método de Kohler e Milstein et al. (Methods Enzymol (1981) 73: 3-46).
[0310] Mais especificamente, a fusão celular pode ser realizada, por exemplo, em um meio de cultura convencional na presença de um agente de promoção de fusão celular. Os agentes de promoção de fusão incluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, também é adicionada uma substância auxiliar, tal como sulfóxido de dimetila, para melhorar a eficiência de fusão.
[0311] A proporção de imunócitos para células de mieloma pode ser determinada pelo próprio critério, de preferência, por exemplo, uma célula de mieloma para cada um a dez imunócitos. Meios de cultura a serem usados para fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequados para o crescimento de linhagens de células de mieloma, tais como meio RPMI1640 e meio MEM e outros meios de cultura convenci-onais usados para este tipo de cultura de células. Além disso, suple-mentos séricos, tais como soro fetal de vitelo (Fetal Calf Serum - FCS) podem, de preferência, ser adicionados ao meio de cultura.
[0312] Para fusão celular, quantidades predeterminadas das células imunes acima e das células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura acima. Então, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio é cerca de 1.000 a 6.000) previamente aquecida para cerca de 37 °C, é adicionada ao mesmo em uma concentração, em geral, de 30% a 60% (peso/v). Esta é misturada suavemente para produzir células de fusão desejadas (hibridomas). Então, um meio de cultura adequado mencionado acima é gradualmente adicionado às células e estas são centrifugadas várias vezes para remover o sobrenadante. As-sim, agentes de fusão celular e similares, os quais são desfavoráveis ao crescimento de hibridomas, podem ser removidos.
[0313] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados para cultura usando um meio seletivo convencional, por exemplo, meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). Ou-tras células que não os hibridomas desejados (células não fundidas) po-dem ser mortas continuando a cultura no meio HAT acima durante um período de tempo suficiente. Tipicamente, o período é de vários dias a várias semanas. Então, hibridomas que produzem o anticorpo desejado sofrem triagem e são clonados separadamente por meio de métodos convencionais de diluição limitativa.
[0314] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados usando um meio de seleção com base no marcador de seleção possuído pelo mieloma usado para fusão celular. Por exemplo, células deficientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas por meio de cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminop- terina e timidina). Especificamente, quando células de mieloma sensíveis à HAT são usadas para fusão celular, células fundidas com êxito à células normais podem proliferar seletivamente no meio HAT. Outras células que não os hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas continuando a cultura no meio HAT acima durante um período de tempo suficiente. Especificamente, os hibridomas desejados podem ser selecionados por meio de cultura geralmente durante vários dias a várias semanas. Então, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado sofrem triagem e são clonados separadamente por meio de métodos convencionais de diluição limitativa.
[0315] Os anticorpos desejados podem, de preferência, ser seleci onados e individualmente clonados por meio de métodos de triagem com base em reação de antígeno/anticorpo conhecida. Por exemplo, um anticorpo monoclonal que se liga à GPC3 pode se ligar à GPC3 expressa sobre a superfície celular. Tal anticorpo monoclonal pode sofrer triagem por meio de seleção de células ativada por fluorescência (Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS). FACS é um sistema que avalia a ligação de um anticorpo à superfície celular analisando células contatadas com um anticorpo fluorescente usando um feixe de laser e medindo a fluorescência emitida a partir de células individuais.
[0316] Para triagem de hibridomas que produzem um anticorpo mo noclonal da presente invenção por meio de FACS, células que expressam GPC3 são primeiro preparadas. Células usadas para a triagem são, de preferência, células de mamíferos nas quais GPC3 é forçadamente expressa. Como controle, a atividade de um anticorpo de se ligar à GPC3 na superfície celular pode ser detectada seletivamente usando células de mamíferos não transformadas como células hospedeiras. Es-pecificamente, hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal anti- GPC3 podem ser isolados por meio de seleção de hibridomas que pro-duzem um anticorpo o qual se liga às células que expressam GPC3 for- çadamente, mas não às células hospedeiras.
[0317] Alternativamente, a atividade de um anticorpo de se ligar à células imobilizadas que expressam GPC3 pode ser avaliada com base no princípio de ELISA. Por exemplo, células que expressam GPC3 são imobilizadas às cavidades de uma placa para ELISA. Sobrenadantes de cultura de hibridomas são contatados com células imobilizadas nas ca-vidades e anticorpos que se ligam às células imobilizadas são detecta-dos. Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, os anticorpos ligados às células podem ser detectados usando um anti-corpo anti-imunoglobulina de camundongo. Os hibridomas que produzem um anticorpo desejado tendo a capacidade de ligação a antígeno são selecionados pela triagem acima e eles podem ser clonados por meio do método de diluição limitativa ou similar.
[0318] Hibridomas que produzem anticorpos monoclonais assim preparados podem ser passados em um meio de cultura convencional e armazenados em nitrogênio líquido durante um longo período.
[0319] Os hibridomas acima são cultivados por meio de um método convencional e anticorpos monoclonais desejados podem ser preparados a partir dos sobrenadantes de cultura. Alternativamente, os hibrido- mas são administrados e crescidos em mamíferos compatíveis e anticorpos monoclonais são preparados a partir de ascite. O primeiro método é adequado para o preparo de anticorpos com alta pureza.
[0320] Anticorpos codificados por genes de anticorpos que são clo- nados a partir de células que produzem anticorpos, tais como os hibri- domas acima, podem também ser preferivelmente usados. Um gene de anticorpo clonado é inserido em um vetor apropriado e este é introduzido em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo gene. Métodos para isolamento de genes de anticorpos, inserção dos genes em vetores e transformação de células hospedeiras foram já estabelecidos, por exemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). Métodos para produção de anticorpos recombinantes são também conhecidos, conforme descrito abaixo.
[0321] Por exemplo, um cDNA que codifica a região variável (região V) de um anticorpo anti-GPC3 é preparado a partir de células de hibri- doma que expressam o anticorpo anti-GPC3. Para esta finalidade, RNA total é primeiro extraído de hibridomas. Métodos usados para extração de mRNA a partir de células incluem, por exemplo: - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299), e - o método AGPC (Anal. Biochem (1987) 162 (1), 156-159).
[0322] mRNAs extraídos podem ser purificados usando o Kit mRNA Purification (GE Healthcare Bioscience) ou similar. Alternativamente, kits para extração de mRNA total diretamente a partir de células, tal como o kit QuickPrep mRNA Purification (GE Healthcare Bioscience), também estão disponíveis comercialmente. mRNA pode ser preparado a partir de hibridomas usando tais kits. cDNAs que codificam a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs preparados usando uma transcriptase reversa. cDNA pode ser sintetizado usando o kit AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis (Seikagaku Co.) ou similar. Além disso, o kit SMART RACE cDNA Amplification (Clontech) e o método 5'-RACE com base em PCR (Proc. Natl Acad Sci USA (1988) 85 (23), 8998-9002; Nucleic Acids Res (1989), 17 (8), 29192932) podem ser adequadamente usados para sintetizar e amplificar o cDNA. Em um tal processo de síntese de cDNA, sítios de enzimas de restrição apropriados descritos abaixo podem ser introduzidos em ambas as extremidades de um cDNA.
[0323] O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do produto de PCR resultante e, então, este é ligado a um vetor de DNA. Um vetor recombinante é, assim, construído e introduzido em E. coli ou similar. Após seleção de colônias, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir da E. coli que forma colônias. Então, se o vetor recombinante tem a sequência de nucleotídeos de cDNA de interesse é testado por meio de um método conhecido, tal como o método de término de cadeia de nucleotídeo dideóxi.
[0324] O método 5'-RACE, o qual usa iniciadores para amplificar o gene de região variável é, convenientemente, usado para isolamento do gene que codifica a região variável. Primeiro, uma biblioteca de cDNA para 5'-RACE é construída por meio de síntese de cDNA usando RNA extraído de células de hibridoma como um modelo. Um kit comercial-mente disponível, tal como o kit SMART RACE cDNA Amplification, é adequadamente usado para sintetizar a biblioteca de cDNA para 5'- RACE.
[0325] O gene do anticorpo é amplificado por meio de PCR usando a biblioteca de cDNA para 5'-RACE preparada como um modelo. Os iniciadores para amplificação do gene de anticorpo de camundongo po-dem ser concebidos com base em sequências de genes de anticorpos conhecidas. As sequências de nucleotídeo dos iniciadores variam de-pendendo da subclasse de imunoglobulina. Portanto, é preferível que a subclasse seja determinada antecipadamente usando um kit comercial-mente disponível, tal como o kit Iso Strip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping (Roche Diagnostics).
[0326] Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem am plificação de genes que codificam as cadeias pesadas y 1, y2a, y2b e y3 e cadeias leves K e À são usados para isolar genes que codificam IgG de camundongo. Em geral, um iniciador que se hibridiza a um sítio de região constante próximo da região variável é usado como um iniciador no lado 3' para amplificar um gene de região variável de IgG. Enquanto isso, um iniciador ligado a um kit para construção de biblioteca de cDNA para 5' RACE é usado como um iniciador no lado 5'.
[0327] Produtos de PCR assim amplificados são usados para remo delar imunoglobulinas compostas de uma combinação de cadeias pe-sadas e leves. Um anticorpo desejado pode ser selecionado usando a atividade de ligação à GPC3 de uma imunoglobulina remodelada como um indicador. Por exemplo, quando o objetivo é isolar um anticorpo contra GPC3, é mais preferido que a ligação do anticorpo à GPC3 seja es-pecífica. Um anticorpo que se liga à GPC3 pode sofrer triagem, por exemplo, por meio das etapas a seguir: (1) contato de uma célula que expressa GPC3 com um anti-corpo que compreende a região V codificada por um cDNA isolado de um hibridoma; (2) detecção da ligação do anticorpo à célula que expressa GPC3; e (3) seleção de um anticorpo que se liga à célula que expressa GPC3.
[0328] Métodos para detecção da ligação de um anticorpo à células que expressam GPC3 são conhecidos. Especificamente, a ligação de um anticorpo às células que expressam GPC3 pode ser detectada por meio das técnicas descritas acima, tal como FACS. Amostras imobilizadas de células que expressam GPC3 são apropriadamente usadas para avaliar a atividade de ligação de um anticorpo.
[0329] Métodos de triagem de anticorpo preferidos que usam a ati vidade de ligação como um indicador também incluem métodos de "pan-ning" usando vetores de fago. Métodos de triagem usando vetores de fago são vantajosos quando os genes do anticorpo são isolados de bi-bliotecas de subclasses de cadeia pesada e cadeia leve a partir de uma população de células que expressam anticorpo policlonal. Genes que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem ser ligados, através de uma sequência ligante apropriada, para formar um Fv de cadeia única (scFv). Fagos que apresentam scFv sobre sua superfície podem ser produzidos mediante inserção de um gene que codifica scFv em um vetor de fago. Os fagos são contatados com um antígeno de interesse. Então, o DNA que codifica um scFv tendo a atividade de ligação de interesse pode ser isolado coletando fagos ligados ao antígeno. Este processo pode ser repetido, conforme necessário, para enriquecimento de scFv tendo a atividade de ligação desejada.
[0330] Após isolamento do cDNA que codifica a região V do anti corpo anti-GPC3 de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de res-trição que reconhecem os sítios de restrição introduzidos em ambas as extremidades do cDNA. Enzimas de restrição preferidas reconhecem e clivam uma sequência de nucleotídeos que ocorre na sequência de nu- cleotídeos do gene de anticorpo em uma baixa frequência. Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que produz uma extremidade aderente é, de preferência, introduzido em um vetor para inserir um fra-gmento digerido em cópia única na orientação correta. O cDNA que co-difica a região V do anticorpo anti-GPC3 é digerido conforme descrito acima e este é inserido em um vetor de expressão adequado para cons-truir um vetor de expressão de anticorpo. Neste caso, se um gene que codifica a região constante de anticorpo (região C) e um gene que codi-fica a região V acima são fundidos in-frame, um anticorpo quimérico é obtido. Aqui, "anticorpo quimérico" significa que a origem da região constante é diferente daquela da região variável. Assim, além de anti-corpos heteroquiméricos de camundongo/ser humano, anticorpos alo- quiméricos de ser humano/ser humano estão incluídos nos anticorpos quiméricos da presente invenção. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico pode ser construído mediante inserção do gene da região V acima em um vetor de expressão que já tem a região constante. Espe-cificamente, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que excisa o gene da região V acima pode ser ade-quadamente colocada sobre o lado 5' de um vetor de expressão trazendo um DNA que codifica uma região constante (região C) de anticorpo desejada. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico é construído fundindo in-frame os dois genes digeridos com a mesma combinação de enzimas de restrição.
[0331] Para produzir um anticorpo monoclonal anti-GPC3, os genes de anticorpo são inseridos em um vetor de expressão de modo que os genes são expressos sob o controle de uma região reguladora de ex-pressão. A região reguladora de expressão para expressão de anticorpo inclui, por exemplo, promotores e intensificadores. Além disso, uma se-quência sinalizadora adequada pode ser ligada ao amino término, de modo que o anticorpo expresso seja secretado para fora das células. Nos exemplos descritos abaixo, um peptídeo tendo a sequência de ami- noácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3) é usado como uma sequência sinalizadora. Enquanto isso, outras sequências sinaliza-doras apropriadas podem ser presas. O polipeptídeo expresso é clivado no carbóxi término da sequência acima e o polipeptídeo resultante é secretado para fora das células como um polipeptídeo maduro. Então, células hospedeiras adequadas são transformadas com o vetor de ex-pressão e células recombinantes que expressam o DNA que codifica o anticorpo anti-GPC3 são obtidas.
[0332] DNAs que codificam a cadeia pesada (cadeia H) e cadeia leve (cadeia L) de anticorpo são inseridos separadamente em diferentes vetores de expressão para expressar o gene de anticorpo. Uma molécula de anticorpo tendo as cadeias H e L pode ser expressa por meio de co-transfecção da mesma célula hospedeira com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L, respectivamente, estão inseridos. Alternativamente, células hospedeiras podem ser transformadas com um único vetor de expressão no qual DNA que codifica as cadeias H e L está inserido (vide documento WO 94/11523).
[0333] Há várias combinações de células hospedeiras/vetores de expressão conhecidas para o preparo de anticorpos mediante introdução de genes de anticorpos isolados em hospedeiros apropriados. Todos estes sistemas de expressão são aplicáveis ao isolamento de domínios, incluindo regiões variáveis de anticorpo da presente invenção. Células eucariotas adequadas usadas como células hospedeiras incluem células de animais, células de planta e células fúngicas. Especificamente, as células de animais incluem, por exemplo, as células a seguir: (1) células de mamíferos: CHO, COS, mieloma, rim de hams-ter bebê (Baby Hamster Kidney - BHK), HeLa, Vero ou similar; (2) células de anfíbios: ovócitos de Xenopus ou similar; e (3) células de inseto: Sf9, sf21, Tn5 ou similar.
[0334] Além disso, como uma célula de planta, um sistema de expressão de gene de anticorpo que usa células derivadas do gênero Nicotiana, tal como Nicotiana tabacum, é conhecido. Células de caule cultivadas podem ser adequadamente usadas para transformar células de planta.
[0335] Além disso, as células a seguir podem ser usadas como cé lulas fúngicas: leveduras: o gênero Saccharomyces, tal como Saccha- romyces cerevisiae e o gênero Pichia, tal como Pichia pastoris; e fungos filamentosos: o gênero Aspergillus, tal como Asper-gillus niger.
[0336] Além disso, sistemas de expressão de genes de anticorpos que utilizam células procariotas são também conhecidos. Por exemplo, quando de uso de células bacterianas, células de E. coli, células de Ba-cillus subtilis e similares podem ser adequadamente usadas na presente invenção. Vetores de expressão que trazem os genes de anticorpo de interesse são introduzidos nestas células por meio de transfecção. As células transfectadas são cultivadas in vitro e o anticorpo desejado pode ser preparado a partir da cultura de células transformadas.
[0337] Além das células hospedeiras descritas acima, animais transgênicos podem também ser usados para produzir um anticorpo re- combinante. Isto é, o anticorpo pode ser obtido a partir de um animal no qual o gene que codifica o anticorpo de interesse é introduzido. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construído como um gene de fusão mediante inserção in-frame em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente no leite. β-caseina de cabra ou similar pode ser usada, por exemplo, como a proteína secretada no leite. Fragmentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene de anticorpo são injetados em um embrião de cabra e, então, este embrião é introduzido em uma cabra fêmea. Anticorpos desejados podem ser obtidos como uma proteína de fusão com a proteína do leite a partir de leite produzido pela cabra transgênica nascida a partir da cabra receptora do embrião (ou sua prole). Além disso, para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica conforme ne-cessário (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).
[0338] Quando uma molécula de ligação a antígeno descrita aqui é administrada ao ser humano, um domínio derivado de um anticorpo ge-neticamente recombinante que tenha sido modificado artificialmente para reduzir a antigenicidade heteróloga contra o ser humano e similar pode ser adequadamente usado como o domínio da molécula de ligação a antígeno, incluindo uma região variável de anticorpo. Tais anticorpos geneticamente recombinantes incluem, por exemplo, anticorpos huma-nizados. Estes anticorpos modificados são, adequadamente, produzidos por meio de métodos conhecidos.
[0339] Uma região variável de anticorpo usada para produzir o domínio de uma molécula de ligação a antígeno, incluindo uma região va-riável de anticorpo, descrita aqui é geralmente formada por três regiões de determinação de complementaridade (Complementarity Determining Regions - CDRs) que são separadas por quatro regiões de framework (FR). CDR é uma região que determina substancialmente a especificidade de ligação de um anticorpo. As sequências de aminoácidos das CDRs são altamente diversificadas. Por outro lado, as sequências de aminoácidos que formam a FR frequentemente têm alta identidade, mesmo entre anticorpos com diferentes especificidades de ligação. Por-tanto, em geral, a especificidade de ligação de um determinado anticorpo pode ser introduzida em outro anticorpo por meio de enxertia de CDR.
[0340] Um anticorpo humanizado é também denominado anticorpo humano remodelado. Especificamente, anticorpos humanizados prepa-rados por meio de enxertia de CDR de um anticorpo de animal não humano, tal como um anticorpo de camundongo, a um anticorpo humano e similares são conhecidos. Técnicas de engenharia genética comuns para obtenção de anticorpos humanizados são também conhecidas. Especificamente, por exemplo, PCR de extensão por sobreposição é conhecida como um método de enxertia de CDR de uma CDR de an-ticorpo de camundongo a uma FR humana. Em PCR de extensão por sobreposição, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada a iniciadores para sintetizar uma FR de anticorpo humano. Iniciadores são preparados para cada uma das quatro FRs. Em geral, considerando-se que, quando de enxertia de uma CDR de camundongo em uma FR humana, seleção de uma FR humana que tem alta identidade por uma FR de camundongo é vantajoso para manutenção de função da CDR. Ou seja, em geral, é preferível usar uma FR humana compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem alta identidade com a sequência de aminoácidos da FR adjacente à CDR de camundongo a ser enxertada.
[0341] Sequências de nucleotídeo a serem ligadas são concebidas de modo a que elas serão conectadas umas às outras in-frame. FRs humanas são sintetizadas individualmente usando os respectivos inici-adores. Como um resultado, produtos nos quais o DNA que codifica a CDR de camundongo está ligado aos DNAs que codificam FR individuais são obtidos. Sequências de nucleotídeos que codificam a CDR de camundongo de cada produto são concebidas de modo que elas se so-breponham umas às outras. Então, reação de síntese de fita comple-mentar é conduzida para emparelhar as regiões CDR sobrepostas dos produtos sintetizados usando um gene de anticorpo humano como mo-delo. FR humanas são ligadas através de sequências de CDR de ca-mundongo por meio desta reação.
[0342] O gene de região V de comprimento total, na qual três CDRs e quatro FRs são finalmente ligadas, é amplificado usando iniciadores que se ligam à suas extremidades 5' ou 3', as quais são adicionadas com sequências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas. Um vetor de expressão para o anticorpo humanizado pode ser produzido mediante inserção do DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C do anticorpo humano em um vetor de expressão, de modo a que eles se ligarão in-frame. Após o vetor recom- binante ser transfectado em um hospedeiro para estabelecer células re- combinantes, as células recombinantes são cultivadas e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura de células (vide Publicação de Patente Europeia N° EP 239400 e Publicação de Patente Internacional N° WO 1996/002576).
[0343] Medindo e avaliando qualitativa ou quantitativamente a ativi dade de ligação a antígeno do anticorpo humanizado produzido conforme descrito acima, pode-se selecionar adequadamente FRs de anticorpo humano que permitem que as CDRs formem um sítio de ligação a antígeno favorável quando ligadas através das CDRs. Resíduos de aminoácido em FRs podem ser substituídos, se necessário, de modo a que as CDRs de um anticorpo humano remodelado formem um sítio de ligação a antígeno adequado. Por exemplo, mutações na sequência de aminoácidos podem ser introduzidas em FRs aplicando o método de PCR usado para enxertia de CDR de camundongo em uma FR humana. Mais especificamente, mutações de sequências de nucleotídeo parciais podem ser introduzidas em iniciadores que se ligam à FR. Mutações de sequências de nucleotídeo são introduzidas nas FRs sintetizadas usando tais iniciadores. Sequências de FR mutantes com as características desejadas podem ser selecionadas medindo e avaliando a atividade do anticorpo mutante com aminoácido substituído de se ligar ao antígeno por meio do método mencionado acima (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-856).
[0344] Alternativamente, anticorpos humanos desejados podem ser obtidos por meio de imunização de animais transgênicos tendo todo o repertório de genes de anticorpos humanos (vide documentos WO 1993/012227, WO 1992/003918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096, WO 1996/033735) através de imunização com DNA.
[0345] Além disso, são também conhecidas as técnicas para o preparo de anticorpos humanos por meio de "panning" usando bibliotecas de anticorpos humanos. Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo de cadeia única (scFv) sobre a superfície do fago através do método de phage display. Fagos que expressam um scFv que se liga ao antígeno podem ser selecionados. A sequência de DNA que codifica a região V de anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada por meio de análise dos genes de fagos selecionados. A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada. Um vetor de expressão é preparado fundindo a sequência da região V in-frame com a sequência da região C de um anticorpo humano desejado e inserindo a mesma em um vetor de expressão apropriado. O vetor de expressão é introduzido em células adequadas para expressão, tais como aquelas descritas acima. O anticorpo humano pode ser produzido por meio de expressão do gene que codifica o anticorpo humano nas células. Estes métodos já são conhecidos (vide documentos WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).
[0346] Um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade ligação à glipicana 3 (GPC3)
[0347] Aqui, a frase "um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade ligação à glipicana 3 (GPC3)" refere- se a uma porção de anticorpo que compreende uma região que se liga especificamente à proteína GPC3 mencionada acima ou à totalidade ou uma porção de um peptídeo parcial da proteína GPC3 e também é com-plementar à mesma. Domínios que compreendem uma região variável de anticorpo podem ser fornecidos a partir de domínios variáveis de um ou uma pluralidade de anticorpos. De preferência, os domínios que com-preendem uma região variável de anticorpo compreendem as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada (VL e VH) de anticorpos. Exemplos adequados de tais domínios que compreendem as regiões variáveis de anticorpos incluem "Fv com uma única cadeia (scFv)", "an-ticorpo com uma única aceia", "Fv", "Fv uma única cadeia 2 (scFv2)", "Fab", "F(ab')2", etc.
[0348] Um domínio que compreende uma região variável de anti corpo que tem a atividade de ligação ao complexo receptor de células T
[0349] Aqui, a frase "um domínio que compreende uma região vari ável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T" refere-se a uma porção de anticorpo de ligação ao complexo receptor de células T que compreende uma região que se liga especifi-camente à totalidade ou uma porção de um complexo receptor de células T e também é complementar à mesma. O complexo receptor de células T pode ser um receptor de células T em si ou uma molécula adaptadora que constitui um complexo receptor de células T, juntamente com um receptor de células T. CD3 é adequado como uma molécula adaptadora.
[0350] Um domínio que compreende uma região variável de anti corpo que tem uma atividade de ligação ao receptor de células T
[0351] Aqui, a frase "um domínio que compreende uma região vari ável de anticorpo que tem uma atividade de ligação ao receptor de células T" refere-se a uma porção de anticorpo de ligação ao receptor de células T produzido pela inclusão de uma região que se liga especificamente à totalidade ou uma porção de um receptor de células T e também é complementar à mesma.
[0352] A porção de um receptor de células T ao qual o domínio da presente invenção se liga pode ser uma região variável ou uma região constante, mas um epítopo presente na região constante é preferido. Exemplos da sequência de região constante incluem a cadeia α do receptor de células T de RefSeq N° de Acesso CAA26636.1 (SEQ ID NO: 4), a cadeia β do receptor de células T de RefSeq N° de Acesso C25777 (SEQ ID NO: 5), a cadeia y1 do receptor de células T de RefSeq N° de acesso A26659 (SEQ ID NO: 6), a cadeia y2 do receptor de células T de RefSeq N° de Acesso AAB63312.1 (SEQ ID NO: 7) e a cadeia δ do receptor da célula T de RefSeq N° de Acesso AAA61033.1 (SEQ ID NO: 8).
[0353] Um domínio que compreende uma região variável de anti corpo que tem uma atividade de ligação à CD3
[0354] Aqui, a frase "um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à CD3" refere-se a uma porção de anticorpo de ligação à CD3 produzida pela inclusão de uma região que se liga especificamente à totalidade ou uma porção de CD3 e também é complementar à mesma. De preferência, o domínio compreende as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada (VL e VH) de um anticorpo anti-CD3. Exemplos adequados de tal domínio incluem "Fv com uma única cadeia (scFv)", "anticorpo com uma única aceia", "Fv", "Fv uma única cadeia 2 (scFv2)", "Fab", "F(ab')2", etc.
[0355] O domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à CD3 da presente invenção pode ser qualquer domínio de ligação a epítopo, contanto que o epítopo exista na sequência da cadeia y, cadeia δ ou cadeia ε que constitui a CD3 humana. Na presente invenção, de preferência, um domínio que compreende uma região variável de cadeia leve variável (VL) e uma região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo anti-CD3 que se liga a um epítopo presente na região extracelular da cadeia ε do complexo de CD3 humana é adequadamente usado. Além da região variável de cadeia leve variável (VL) e uma região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo anti-CD3 (VH) descrito nos Exemplos, vários domínios de ligação à CD3 conhecidos que contêm uma região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo de ligação à CD3 e uma região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo de ligação à CD3, e aqueles do anticorpo OKT3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4914-4917) são adequadamente usados como tais domínios. Pode-se usar apropriadamente um domínio que contêm a região variável de anticorpo derivada do anticorpo anti- CD3 que tem as propriedades desejadas, o qual é obtido através da imunização de um animal pretendido por meio do método mencionado acima usando a cadeia y, de cadeia δ ou de cadeia ε que constituem a CD3 humana. Os anticorpos humanos e anticorpos adequadamente humanizados conforme descrito acima podem ser adequadamente usados como o anticorpo anti-CD3 para dar origem ao domínio que contêm a região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à CD3. Em relação à estrutura da cadeia y, cadeia δ ou cadeia ε que constitui a CD3, suas sequências de polinucleotídeos são mostradas em SEQ ID NOs: 9 (NM_000073.2), 10 (NM_000732.4) e 11 (NM_000733.3) e suas sequências polipeptídicas são mostradas em SEQ ID NOs: 12 (NP_000064.1), 13 (NP_000723.1) e 14 (NP_000724.1) (o número de acesso RefSeq é mostrado entre parênteses).
[0356] Domínios que contêm regiões variáveis de anticorpo em mo léculas de ligação a antígeno da presente invenção podem se ligar ao mesmo epítopo. Aqui, o mesmo epítopo pode estar presente em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 14. Alternativamente, os domínios que contêm regiões variáveis de anticorpo em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção po-dem se ligar a epítopos diferentes, respectivamente. Aqui, os diferentes epítopos podem estar presentes em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 14.
Específico
[0357] O termo "específico" significa que uma das moléculas envol vidas na ligação específica não mostra nenhuma ligação significativa a outras moléculas que não uma única ou uma série de moléculas parceiras de ligação. Além disso, o termo também é usado quando um domínio que contém uma região variável de anticorpo é específico para um epítopo particular dentre vários epítopos no antígeno. Quando um epí- topo ligado por um domínio que contém uma região variável de anticorpo está incluído em uma série de diferentes antígenos, as moléculas de ligação a antígeno que compreendem o domínio que contém a região variável de anticorpo podem se ligar a diversos antígenos que têm o epítopo.
Epítopo
[0358] "Epítopo" significa um determinante antigênico em um antí- geno e refere-se a um sítio um domínio de uma molécula de ligação a antígeno, incluindo uma região variável de anticorpo, descrita aqui se liga. Assim, por exemplo, o epítopo pode ser definido de acordo com sua estrutura. Alternativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno que reconhece o epítopo. Quando o antígeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo pode ser especificado pelos resíduos de ami- noácido que formam o epítopo. Alternativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser especificado por sua estrutura de cadeia de açúcar específica.
[0359] Um epítopo linear é um epítopo que contém um determinante antigênico cuja sequência de aminoácidos primária é reconhecida. Tal epítopo linear contém, tipicamente, pelo menos três e, mais comumente, pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a 10 ou 6 a 20 aminoácidos em sua sequência específica.
[0360] Em contraste com o epítopo linear, "epítopo conformacional" é um epítopo em que a sequência de aminoácidos primária que contém o epítopo não é o único fator determinante do epítopo reconhecido (por exemplo, a sequência de aminoácidos primária de um epítopo confor- macional não é necessariamente reconhecida por um anticorpo que define epítopo). Epítopos conformacionais podem conter um maior número de aminoácidos comparado com epítopos lineares. Um anticorpo que reconhece epítopo conformacional reconhece a estrutura tridimensional de um peptídeo ou proteína. Por exemplo, quando uma molécula de proteína se dobra e forma uma estrutura tridimensional, as principais cadeias de aminoácidos e/ou polipeptídeos que formam um epítopo conformacional ficam alinhadas e o epítopo se torna reconhecível pelo anticorpo. Métodos para determinar as conformações de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação de orbital sítio-específica e ressonância paramagnética eletrônica, mas não se limitam aos mesmos. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology (1996), vol. 66, Morris (ed.).
[0361] Um método para confirmar a ligação a um epítopo por uma molécula de ligação a antígeno de teste que compreende um domínio que contém uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à GPC3 é exemplificado abaixo e um método para confirmação da ligação a um epítopo de uma molécula de ligação a antígeno de teste que compreende um domínio que contém uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação ao complexo receptor de células T também pode ser realizado convenientemente de acordo com os exemplos abaixo.
[0362] Por exemplo, o reconhecimento de um epítopo linear pre sente na molécula de GPC3 por uma molécula de ligação a antígeno de teste que compreende um domínio que contém uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à GPC3 pode ser confirmado abaixo. Um peptídeo linear que compreende a sequência de ami- noácidos que constitui o domínio extracelular de GPC3 é sintetizado para o objetivo mencionado acima. O peptídeo pode ser quimicamente sintetizado. Alternativamente, ele pode ser obtido por meio de métodos de engenharia genética usando uma região do cDNA de GPC3 que codifica uma sequência de aminoácidos que corresponde ao domínio ex- tracelular. Em seguida, a atividade de ligação entre um peptídeo linear que compreende a sequência de aminoácidos que constitui o domínio extracelular e a molécula de ligação a antígeno de teste que compreende um domínio que contém uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à GPC3 é avaliada. Por exemplo, ELISA o qual usa um peptídeo linear imobilizado como o antígeno pode permitir a avaliação da atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno ao peptídeo. Alternativamente, a atividade de ligação para o peptídeo linear pode ser elucidada com base no nível de inibição causada pelo peptídeo linear na ligação da molécula de ligação a antígeno a células que expressam GPC3. Estes ensaios podem elucidar a atividade de ligação das moléculas de ligação a antígeno em relação ao peptídeo linear.
[0363] Além disso, o reconhecimento da estrutura tridimensional do epítopo por uma molécula de ligação a antígeno de teste que compreende um domínio que contém uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à GPC3 pode ser confirmado abaixo. Células que expressam GPC3 são preparadas para o objetivo mencionado acima. Por exemplo, quando a molécula de ensaio de ligação a antígeno que compreende um domínio que contém uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à GPC3 contata células que expressam GPC3, ela se liga fortemente às células mas, por outro lado, há casos nos quais a molécula de ligação à antígeno não se liga substancialmente ao peptídeo linear imobilizado que compreende a sequência de aminoácidos que constitui o domínio extracelular de GPC3. Nestes casos, "não se liga substancialmente" refere-se a uma atividade de liga-ção de 80% ou menos, geralmente 50% ou menos, de preferência 30% ou menos e, particularmente de preferência, 15% ou menos em relação à atividade de ligação para células que expressam GPC3 humana.
[0364] Métodos para ensaiar a atividade de ligação de uma molé cula de ligação a antígeno de teste que contém um domínio de ligação a antígeno GPC3 à células que expressam GPC3 incluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Especifi-camente, a avaliação pode ser realizada com base no princípio de ELISA ou separação de células ativada por fluorescência (Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS) usando células que expressam GPC3 como antígeno.
[0365] No formato ELISA, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste que contém um domínio de ligação a antígeno GPC3 à células que expressam GPC3 pode ser avaliada quan-titativamente comparando os níveis de sinal gerado pela reação enzi- mática. Especificamente, uma molécula de ligação a antígeno de teste é adicionada a uma placa de ELISA, na qual células que expressam GPC3 são imobilizadas. Então, a molécula de ligação a antígeno de teste ligada às células é detectada usando um anticorpo enzimatica- mente marcado que reconhece a molécula de ligação a antígeno de teste. Alternativamente, quando é usado FACS, uma série de diluições de uma molécula de ligação a antígeno de teste são preparadas e a titulação de ligação de anticorpos à células que expressam GPC3 pode ser determinada para comparar a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno de teste à células que expressam GPC3.
[0366] A ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspensas em tampão ou similar pode ser detectada usando um citômetro de fluxo. Citômetros de fluxo conhecidos incluem, por exemplo, os dispositivos a seguir: FACSCantoTM II FACSAriaTM FACSArrayTM FACSVantageTM SE FACSCaliburTM (todos são marcas comerciais da BD Biosciences) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são marcas co-merciais da Beckman Coulter)
[0367] Métodos preferíveis para ensaiar a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste que contém um domínio de ligação a antígeno GPC3 a um antígeno incluem, por exemplo, o método a seguir. Primeiro, células que expressam GPC3 são reagidas com uma molécula de ligação a antígeno de teste e, então, são coradas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece a molécula de ligação a antígeno. A molécula de ligação a antígeno de teste é apropriadamente diluída com um tampão adequado para preparar o complexo em uma concentração desejada. Por exemplo, o complexo pode ser usado em uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. Então, a intensidade de fluorescência e número de células são determinados usando FACSCalibur (BD). A intensidade de fluorescência obtida por meio de análise usando o software CELL QUEST (BD), ou seja, o valor da Média Geométrica, reflete a quantidade de anticorpo ligado às células. Isto é, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste, a qual é representada pela quantidade da molécula de ligação a antígeno de teste ligada, pode ser determinada medindo-se o valor da Média Geométrica.
[0368] Se uma molécula de ligação a antígeno de teste que contém um domínio de ligação a antígeno GPC3 compartilha um epítopo em comum com outra molécula de ligação a antígeno pode ser avaliado com base na competição entre os dois complexos pelo mesmo epítopo. A competição entre as moléculas de ligação a antígeno pode ser detectada através de um ensaio de bloqueio cruzado ou similar. Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de bloqueio cruzado preferido.
[0369] Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, a proteína GPC3 imobilizada às cavidades de uma placa de microtitulação é pré- incubada na presença ou ausência de uma molécula de ligação a antí- geno competidor candidato e, então, uma molécula de ligação a antí- geno de teste é adicionada às mesmas. A quantidade de molécula de ligação a antígeno de teste ligada à proteína GPC3 nas cavidades está indiretamente relacionada com a capacidade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno competidora candidata que compete pela ligação ao mesmo epítopo. Isto é, quanto maior a afinidade da molécula de ligação a antígeno competidor pelo mesmo epítopo, menor é a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno de teste às cavidades revestidas de proteína GPC3.
[0370] A quantidade da molécula de ligação a antígeno de teste li gada às cavidades via a proteína GPC3 pode ser facilmente determinada através de marcação da molécula de ligação a antígeno antecipadamente. Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno marcada com biotina é medida usando um conjugado de avidina/peroxidase e substrato apropriado. Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores enzimáticos, tal como peroxidase, é denominado "ensaio ELISA competitivo". A molécula de ligação a antígeno também pode ser marcada com outras substâncias de marcação que permitem detecção ou medição. Especificamente, marcadores radioativos, mar-cadores fluorescentes e similares são conhecidos.
[0371] Quando a molécula de ligação a antígeno competidora can didata pode bloquear a ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste que contém um domínio de ligação a antígeno GPC3 em pelo menos 20%, de preferência pelo menos 20 a 50% e, mais preferivelmente, pelo menos 50% comparado com a atividade de ligação em um experimento de controle realizado na ausência da molécula de ligação a antígeno competidora, a molécula de ligação a antígeno de teste é determinada como se ligando substancialmente ao mesmo epítopo ligado pela molécula de ligação a antígeno competidora ou compete pela ligação ao mesmo epítopo.
[0372] Quando a estrutura de um epítopo ligado por uma molécula de ligação a antígeno de teste que contém um domínio de ligação a antígeno GPC3 foi já identificada, se as moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle compartilham um epítopo em comum pode ser avaliado comparando as atividades de ligação das duas moléculas de ligação a antígeno com um peptídeo preparado mediante introdução de mutações de aminoácidos no peptídeo que forma o epítopo.
[0373] Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as atividades de ligação de moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle em um peptídeo linear no qual uma mutação é introduzida são comparadas no formato ELISA acima. Além dos métodos ELISA, a ati-vidade de ligação ao peptídeo mutante ligado a uma coluna pode ser determinada fluindo as moléculas de ligação a antígeno de teste e con-trole na coluna e, então, quantificando a molécula de ligação a antígeno eluída na solução de eluição. Métodos para adsorção de um peptídeo mutante a uma coluna, por exemplo, na forma de um peptídeo de fusão GST, são conhecidos.
[0374] Alternativamente, quando o epítopo identificado é um epítopo conformacional, se moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle compartilham um epítopo em comum pode ser avaliado por meio do método a seguir. Primeiro, células que expressam GPC3 e células que expressam GPC3 com uma mutação introduzida no epítopo são preparadas. As moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle são adicionadas a uma suspensão de células preparadas suspendendo estas células em um tampão apropriado, tal como PBS. Então, as suspensões de células são adequadamente lavadas com um tampão e um anticorpo marcado com FITC que reconhece as moléculas de ligação a antígeno teste e de controle é adicionado às mesmas. A intensidade de fluorescência e o número de células coradas com o anticorpo marcado são determinados usando FACSCalibur (BD). As moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle são apropriadamente diluídas usando um tampão adequado e usadas em concentrações desejadas. Por exemplo, elas podem ser usadas em uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. A intensidade de fluorescência, determinada por meio de análise usando o software CELL QUEST (BD), isto é, o valor da média geométrica, reflete a quantidade de anticorpo marcado ligado às células. Ou seja, as atividades de ligação das moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle, as quais são representadas pela quantidade de anticorpo marcado ligado, podem ser determinadas medindo-se o valor da Média Geométrica.
[0375] No método de cima, se uma molécula de ligação a antigen que "não se liga substancialmente às células que expressam GPC3 mu-tante" pode ser avaliada, por exemplo, por meio do método a seguir. Primeiro, as moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle li-gadas às células que expressam GPC3 mutantes são coradas com um anticorpo marcado. Então, a intensidade de fluorescência das células é determinada. Quando FACSCalibur é usado para detecção de fluores-cência através de citometria de fluxo, a intensidade de fluorescência determinada pode ser analisada usando o software CELL QUEST. A partir dos valores da Média Geométrica na presença e na ausência da molécula de ligação a antígeno, o valor de comparação (Δ Média Geométrica) pode ser calculado de acordo com a fórmula a seguir para determinar a proporção de aumento na intensidade de fluorescência como um resultado da ligação pela molécula de ligação a antígeno.Δ Média Geométrica = Média Geométrica (na presença da molécula de ligação a antígeno)/Média Geométrica (na ausência da mo-lécula de ligação a antígeno)
[0376] O valor de comparação da Média Geométrica (valor de Δ Mé dia Geométrica para a molécula GPC3 mutante) determinado por meio da análise acima, a qual reflete a quantidade de uma molécula de ligação a antígeno de teste ligada à células que expressam GPC3 mutante, é comparado com o valor de comparação de Δ Média Geométrica que reflete a quantidade da molécula de ligação a antígeno de teste ligada à células que expressam GPC3. Neste caso, as concentrações da molécula de ligação a antígeno de teste usadas para determinar os valores de comparação de Δ Média Geométrica à células que expressam GPC3 e células que expressam GPC3 mutante são, particularmente de prefe-rência, ajustadas para serem iguais ou sensivelmente iguais. Uma mo-lécula de ligação a antígeno que foi confirmada como reconhecendo um epítopo em GPC3 é usada como uma molécula de ligação a antígeno de controle.
[0377] Se o valor de comparação de Δ Média Geométrica de uma molécula de ligação a antígeno de teste para células que expressam GPC3 mutante é menor do que o valor de comparação de Δ Média Ge-ométrica da molécula de ligação a antígeno de teste para células que expressam GPC3 em pelo menos 80%, de preferência 50%, mais pre-ferivelmente 30% e, especialmente de preferência, 15%, então, a molé-cula de ligação a antígeno de teste "não se liga substancialmente às células que expressam GPC3 mutante". A fórmula para determinar o valor de Geo-Média (Média Geométrica) é descrito no CELL QUEST Software User’s Guide (BD Biosciences). Quando a comparação mostra que os valores de comparação são substancialmente equivalentes, o epítopo para as moléculas de ligação a antígeno de teste e de controle pode ser determinado como sendo o mesmo.
Fragmento Variável (Fv)
[0378] Aqui, o termo "fragmento variável (Fv)" refere-se à unidade mínima de um domínio de ligação a antígeno derivado de anticorpo que é composto de um par da região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e a região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo. Em 1988, Skerra e Pluckthun descobriram que anticorpos homogêneos e ativos podem ser preparados a partir da fração periplásmica de E. coli por meio de inserção de um gene de anticorpo a jusante de uma sequência sinalizadora bacteriana e indução de expressão do gene em E. coli (Science (1988) 240 (4855), 1038-1041). No Fv preparado a partir da fração pe- riplásmica, VH se associa com VL de uma maneira a se ligar a um antí- geno.
[0379] Aqui, Fv inclui, de preferência, por exemplo, um par de Fv, o qual é uma molécula de ligação a antígeno ou similar que compreende: (1) um domínio de ligação a antígeno bivalente o qual é um scFv bivalente, em que um scFv monovalente do scFv bivalente está ligado a um polipeptídeo que forma um domínio Fc através de um fragmento Fv de cadeia pesada que forma um domínio de ligação a CD3 e o outro scFv monovalente está ligado ao outro polipeptídeo que forma um domínio Fc através de um fragmento Fv de cadeia leve que forma um domínio de ligação a CD3; (2) um domínio que compreende um domínio Fc que não tem nenhuma atividade de ligação a receptor Fcy e que é derivado de ami- noácidos que formam o domínio Fc de IgG1, IgG2a, IgG3 ou IgG4; e (3) pelo menos um domínio de ligação a CD3 monovalente,
[0380] em que os fragmentos Fv de cadeia leve e de cadeia pesada se associam para formar um domínio de ligação a CD3 de modo que ele possa se ligar ao antígeno CD3.
scFv, anticorpo com uma única cadeia e sc(Fv)2
[0381] Aqui, os termos "scFv", "anticorpo com uma única cadeia" e "sc(Fv)2" referem-se todos a um fragmento de anticorpo de uma única cadeia polipeptídica que contém regiões variáveis derivadas das cadeias pesada e leve, mas não a região constante. Em geral, um anticorpo com uma única cadeia também contém um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL, o qual permite a formação de uma estrutura desejada acredita-se permitir a ligação a antígeno. O anticorpo como uma única cadeia é discutido em detalhes por Pluckthun em " The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)". Vide também a Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 1988/001649, Patentes US Nos 4.946.778 e 5.260.203. Em uma modalidade particular, o anticorpo com uma única cadeia pode ser biespecífico e/ou humanizado.
[0382] scFv é um domínio de ligação a antígeno no qual VH e VL que formam Fv são ligadas juntas por um ligante peptídico (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (16), 5879-5883). VH e VL podem ser mantidas em estreita proximidade pelo ligante peptídico.
[0383] sc(Fv)2 é um anticorpo com uma única cadeia no qual quarto regiões variáveis de duas VL e duas VH são ligadas por ligantes, tais como ligantes peptídicos, de modo a formar uma única cadeia (J Immu-nol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189). As duas VH e duas VL podem ser derivadas de diferentes anticorpos monoclonais. Tal sc(Fv)2 inclui, de preferência, por exemplo, um sc(Fv)2 biespecífico que reconhece dois epítopos presentes em um antígeno, conforme descrito em Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374. sc(Fv)2 pode ser produzido por meio dos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, sc(Fv)2 pode ser produzido por meio de ligação de scFv através de um ligante, tal como um ligante peptídico.
[0384] Aqui, a forma de um domínio de ligação a antígeno que forma um sc(Fv)2 inclui um anticorpo no qual as duas unidades VH e duas unidades VL estão dispostas na ordem dVH, VL, VH e VL ([VH]-ligante- [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VL]) começando a partir do N-término de um polipeptídeo com uma única cadeia. A ordem das duas unidades VH e duas unidades VL não está limitada à forma acima e elas podem estar dispostas em qualquer ordem. Ordens exemplificativas da forma são lis-tadas abaixo. [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL] [VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH] [VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL] [VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH] [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VH]
[0385] A forma molecular de sc(Fv)2 é também descrita em deta lhes no documento WO 2006/132352. De acordo com estas descrições, aqueles versados na técnica podem preparar adequadamente o sc(Fv)2 desejado para produzir as moléculas de ligação a antígeno descritos aqui.
[0386] Além disso, as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção podem ser conjugadas a polímero veículo, tal como PEG, ou um composto orgânico, tal como um agente anti-câncer. Alternativamente, uma sequência de adição de cadeia de açúcar é, de preferência, inserida nas moléculas de ligação a antígeno, de modo que a cadeia de açúcar produza um efeito desejado.
[0387] Os ligantes a serem usados para ligação das regiões variá veis de um anticorpo compreendem ligantes peptídicos arbitrários que podem ser introduzidos por meio de engenharia genética, ligantes sintéticos e ligantes descritos, por exemplo, em Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996. No entanto, ligantes peptídicos são preferidos na presente invenção. O comprimento dos ligantes peptídeos não está par-ticularmente limitado e pode ser adequadamente selecionado pelos aqueles versados na técnica de acordo com a finalidade. O comprimento é, de preferência, cinco ou mais aminoácidos (sem limitação particular, o limite máximo é, em geral, de 30 aminoácidos ou menos, de preferência de 20 aminoácidos ou menos) e, particularmente de preferência, 15 aminoácidos. Quando sc(Fv)2 contém três ligantes peptídi- cos, seu comprimento pode, em geral, ser o mesmo ou diferente.
[0388] Por exemplo, tais ligantes peptídicos incluem: Ser Gly-Ser Gly-Gly-Ser Ser-Gly-Gly Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 15) Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 16) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 17) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 18) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 19) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 20) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 21) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 22) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 17))n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 18))n
[0389] onde n é um número inteiro 1 ou maior. O comprimento ou sequências de ligantes peptídicos podem ser selecionados de acordo com aqueles versados na técnica, dependendo da finalidade.
[0390] Ligantes sintéticos (agentes de ligação cruzada químicos) são rotineiramente usados para ligação cruzada de peptídeos e, por exemplo: N-hidróxi-succinimida (NHS), suberato de di-succinimidila (DSS), suberato de bis(sulfo-succinimidila) (BS3), ditiobis(propionato de succinimidila) (DSP) ditiobis(propionato de sulfosuccinimidila) (DTSSP), etileno glicol-bis(succinato de succinimidila) (EGS), etileno glicol-bis(succinato de sulfosuccinimidila) (sulfo- EGS), tartrato de di-succinimidila (DST), tartrato de di-sulfo-succinimidila (sulfo-DST), bis-[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) e bis-[2-(sulfo-succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo- BSOCOES).
[0391] Estes agentes de reticulação estão comercialmente disponí veis.
[0392] Em geral, três ligantes são necessários para ligar quatro re giões variáveis de anticorpo juntas. Os ligantes a serem usados podem ser do mesmo tipo ou de tipos diferentes.
[0393] Fab, F(ab')2 e Fab'
[0394] "Fab" consiste em uma única cadeia leve e um domínio CH1 e a região variável de uma única cadeia pesada. A cadeia pesada da molécula de Fab não pode formar ligações de dissulfeto com outra mo-lécula de cadeia pesada.
[0395] "F(ab')2" ou "Fab" é produzido por meio de tratamento de uma imunoglobulina (anticorpo monoclonal) com uma protease, tal como pepsina e papaína, e refere-se a um fragmento de anticorpo gerado por meio de digestão de uma imunoglobulina (anticorpo monoclonal) próximo das ligações de dissulfeto presentes entre as regiões de dobradiça em cada uma das duas cadeias H. Por exemplo, a papaína cliva a IgG a montante das ligações de dissulfeto presentes entre as regiões de dobradiça em cada uma das duas cadeias H para gerar dois fragmentos de anticorpo homólogos, nos quais uma cadeia L compre-endendo VL (região variável de cadeia L) e CL (região constante de ca-deia L) está ligada a um fragmento de cadeia H compreendendo VH (região variável de cadeia H) e CHy1 (região y1 em uma região constante de cadeia H) via uma ligação de dissulfeto em suas regiões C- terminais. Cada um destes dois fragmentos de anticorpo homólogos é denominado Fab '.
[0396] "F(ab')2" consiste em duas cadeias leves e duas cadeias pe sadas compreendendo a região constante de um domínio CH1 e uma porção dos domínios CH2, de modo que ligações de dissulfeto sejam formadas entre as duas cadeias pesadas. O F(ab')2 que forma uma mo-lécula de ligação a antígeno descrito aqui pode, de preferência, ser pro-duzido como segue. Um anticorpo monoclonal inteiro ou similar compre-endendo um domínio de ligação a antígeno desejado é parcialmente digerido com uma protease, tal como pepsina; e fragmentos Fc são re-movidos por meio de adsorção sobre uma coluna de proteína A. A pro-tease não está particularmente limitada, contanto que ela possa clivar o anticorpo inteiro de uma maneira seletiva para produzir F(ab')2 sob uma condição de reação enzimática de configuração adequada, tal como pH. Tais proteases incluem, por exemplo, pepsina e ficina.
Domínio Fc
[0397] Um domínio Fc que forma uma molécula de ligação a antí- geno descrito aqui pode, de preferência, ser produzido da maneira a seguir. Um anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal, é parcialmente digerido com uma protease, tal como pepsina. Então, o fragmento re-sultante é adsorvido sobre uma coluna de Proteína A ou Proteína G e eluído com um tampão de eluição adequado. A protease não está par-ticularmente limitada, contanto que ela possa clivar anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, sob uma condição de reação enzimática de configuração adequada, tal como pH. Tais proteases incluem, por exemplo, pepsina e ficina.
[0398] As moléculas de ligação a antígeno descritos aqui compre endem um domínio Fc com atividade de ligação a receptor Fcy reduzida, o qual inclui aminoácidos que formam o domínio Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0399] O isotipo do anticorpo é determinado de acordo com a estru tura da região constante. Regiões constantes dos isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 são denominadas Cy1, Cy2, Cy3 e Cy4, respectivamente. As sequências de aminoácidos de polipeptídeos de domínio Fc que formam Cy1, Cy2, Cy3 e Cy4 humanas são exemplificadas em SEQ ID NOs: 23, 24, 25 e 26, respectivamente. A relação entre resíduos de ami- noácido que formam cada sequência de aminoácidos e a numeração EU de Kabat (aqui também referida como ÍNDICE EU) são mostradas na FIG. 18.
[0400] O domínio Fc refere-se à região além do F(ab')2 a qual com preende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma por-ção da região constante que compreende um domínio CH1 e a região entre os domínios CH1 e CH2, de modo que ligações de dissulfeto sejam formadas entre as duas cadeias pesadas. O domínio Fc que forma uma molécula de ligação a antígeno descrito aqui pode ser produzido, de preferência, como segue. Um anticorpo monoclonal de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 ou similar é parcialmente digerido com uma protease, tal como pepsina, seguido por eluição da fração adsorvida sobre uma coluna de Proteína A. A protease não está particularmente limitada, contanto que ela possa clivar o anticorpo inteiro de uma maneira seletiva para produzir F(ab')2 em uma condição de reação enzimática de configuração adequada, tal como pH. Tais proteases incluem, por exemplo, pepsina e ficina.
Receptor Fcy
[0401] Receptor Fcy refere-se a um receptor capaz de ligação ao domínio Fc de anticorpos monoclonais de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 e inclui todos os membros que pertencem à família de proteínas substan-cialmente codificadas por um gene de receptor Fcy. Em seres humanos, a família inclui FcyRI (CD64), incluindo isoformas FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc; FcyRII (CD32), incluindo isoformas FcyRIIA (incluindo alotipo H131 e R131), FcyRIIB (incluindo FcyRIIB-1 e FcyRIIB-2) e FcyRIIC e FcyRIII (CD16), incluindo isoforma FcyRIIIa (incluindo alotipo V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alotipo FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2), bem como todos os Fcy humanos não identificados, isoformas de Fcy e alo- tipos do mesmo. No entanto, o receptor Fcy não está limitado a estes exemplos. Sem pretender ser exaustivo, FcyR inclui aqueles derivados de seres humanos, camundongo, ratos, coelhos e macacos. FcyR pode ser derivado de qualquer organismo. FcyR de camundongo inclui, porém sem limitações, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) e FcyRIII- 2 (CD16-2), bem como todos os FcyRs de camundongo não identificados, isoformas de Fcy e alotipos dos mesmos. Tais receptores Fcy preferidos incluem, por exemplo, FcyRI humano (CD64), FcyRIIA (CD32), FcyRIIB (CD32), FcyRIIIA (CD16) e/ou FcyRIIIB (CD16). A sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácidos de FcyRI são mostradas em SEQ ID NOs: 27 (NM_000566.3) e 28 (NP_000557.1), respectiva-mente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácidos de FcyRIIA são mostradas em SEQ ID NOs: 29 (BC020823.1) e 30 (AAH20823.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a se-quência de aminoácidos de FcyRIIB são mostradas em SEQ ID NOs: 31 (BC146678.1) e 32 (AAI46679.1), respectivamente; a sequência de po- linucleotídeo e a sequência de aminoácidos de FcyRIIIA são mostradas em SEQ ID NOs: 33 (BC033678.1) e 34 (AAH33678.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de ami- noácidos de FcyRIIIB são mostradas em SEQ ID NOs: 35 (BC128562.1) e 36 (AAI28563.1), respectivamente (número de acesso RefSeq é mostrado em cada parênteses). Se um receptor FcRy tem atividade de ligação ao domínio Fc de um anticorpo monoclonal de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 pode ser avaliado por meio da triagem ALPHA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), o método BIACORE com base em ressonância de plasmon em superfície (Surface Plasmon Resonance - SPR) e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010), além de FACS descrito acima e formatos de ELISA.
[0402] Enquanto isso, "ligante de Fc" ou "ligante efetuador" refere- se a uma molécula e, de preferência, um polipeptídeo, que se liga a um domínio Fc de anticorpo, formando um complexo ligante Fc/Fc. A molé-cula pode ser derivada de qualquer organismo. A ligação de um ligante de Fc ao Fc induz, de preferência, a uma ou mais funções efetuadoras. Tais ligantes de Fc incluem, porém sem limitações, receptores de Fc, FcyR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q e C3, lectina de ligação à manana, receptor de manose, proteína A de Staphylococcus, proteína G de Staphylococcus e FcyRs virais. Os ligantes de Fc incluem também homólogos de receptores Fc (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136), os quais são uma família de receptores Fc homólogos ao FcyR. Os ligantes de Fc também incluem moléculas não identificadas que se ligam ao Fc.
Atividade de Ligação a Receptores Fcy
[0403] A atividade de ligação prejudicada do domínio Fc a qualquer um dos receptores Fcy, Fcy I, FcyIIA, FcyIIB, FcyIIIA e/ou FcyIIIB pode ser avaliada usando FACS descrito acima e formatos de ELISA, bem como triagem ALPHA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) e o método BIACORE com base em ressonância de plasmon em superfície (Surface Plasmon Resonance - SPR) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
[0404] Triagem ALPHA é realizada pela tecnologia ALPHA com base no princípio descrito abaixo usando dois tipos de glóbulos: glóbulos doador e aceitador. Um sinal luminescente é detectado apenas quando as moléculas ligadas aos glóbulos doadores interagem biologicamente com moléculas ligadas aos glóbulos aceitadoras e quando os dois glóbulos estão localizados em estreita proximidade. Excitado pelo feixe de laser, o fotossensibilizador em um glóbulo doador converte oxigênio em torno do glóbulo em oxigênio singlet. Quando o oxigênio singlet se difunde em torno dos glóbulos doadores e atinge os glóbulos aceitadores localizados em estreita proximidade, uma reação quimiolu- minescente dentro dos glóbulos aceitadores é induzida. Esta reação resulta em emissão de luz. Se as moléculas ligadas aos glóbulos doadores não interagem com moléculas ligadas aos glóbulos aceitadores, o oxigênio singlet produzido pelos glóbulos doadores não atingem os glóbulos aceitadores e a reação quimioluminescente não ocorre.
[0405] Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno marcada com biotina é imobilizada aos glóbulos doadores e receptor Fcy marcado com glutationa-S-transferase (GST) é imobilizado aos glóbulos aceita-dores. Na ausência de uma molécula de ligação a antígeno que com-preende um domínio Fc mutante competitivo, o receptor Fcy interage com uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio Fc do tipo silvestre, induzindo a um sinal de 520 a 620 nm como um resultado. A molécula de ligação a antígeno que tem um domínio Fc mutante não marcado compete com a molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio Fc do tipo silvestre pela interação com o receptor Fcy. A afinidade de ligação relativa pode ser determinada quantificando a redução de fluorescência como um resultado da competição. Métodos para biotinilação das moléculas de ligação a antígeno, tais como anticorpos, usando Sulfo-NHS-biotina ou similares são conhecidos. Métodos adequados para adição de uma tag GST a um receptor Fcy incluem métodos que envolvem fusão de polipeptídeos que codificam Fcy e GST in-frame, expressão do gene fundido usando células introduzidas com um vetor que traz o gene e, então, purificação usando uma coluna de glutationa. O sinal induzido pode, de preferência, ser analisado, por exemplo, por meio de adaptação a um modelo de competição em um sítio com base em análise de regressão não linear usando um software tal como o GraphPad Prism (GraphPad, San Diego).
[0406] Uma das substâncias cuja interação deve ser observada é imobilizada como um ligante sobre a fina camada de ouro de um Sensor Chip. Quando a luz é espalhada sobre a superfície traseira do Sensor Chip, de modo que reflexão total ocorra na interface entre a camada fina de ouro e o vidro, a intensidade de luz refletida é parcialmente reduzida em um determinado local (sinal SPR). A outra substância a observar sua interação é injetada como um analito sobre a superfície do Sensor Chip. A massa de molécula ligante imobilizada aumenta quando o analito se liga ao ligante. Isto altera o índice de refração do solvente na superfície do Sensor Chip. A alteração no índice de refração causa um desvio po- sicional do sinal de SPR (inversamente, a dissociação desvia o sinal de volta para a posição original). No sistema Biacore, a quantidade de desvio descrito acima (isto é, a variação de massa sobre a superfície do Sensor Chip) é representada no eixo vertical e, assim, a variação de massa ao longo do tempo é mostrada como dados medidos (sen- sorgrama). Parâmetros cinéticos (constante de taxa de associação (ka) e constante de taxa de dissociação (kd)) são determinados a partir da curva de sensorgrama e a afinidade (KD) é determinada a partir da relação entre estas duas constantes. Ensaio de inibição é, de preferência, usado nos métodos BIACORE. Exemplos deste tipo de ensaio de inibição são descritos em Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010.
[0407] Aqui, "atividade de ligação ao receptor Fcy é reduzida" signi fica que, por exemplo, com base no método de análise descrito acima, a atividade competitiva de uma molécula de ligação a antígeno de teste é de 50% ou menos, de preferência 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos ou 15% ou menos e, especialmente de preferência, 10% ou menos, 9% ou menos ou 8% ou menos, 7% ou menos, 6% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos ou 1% ou menos do que a atividade competitiva de uma molécula de ligação a antígeno de controle.
[0408] Moléculas de ligação a antígeno que compreendem o domí nio Fc de um anticorpo monoclonal de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 podem ser adequadamente usados como moléculas de ligação a antígeno de controle. As estruturas do domínio Fc são mostradas em SEQ ID NOs: 37 (A é adicionada ao N-término de RefSeq número de acesso AAC82527.1), 38 (A é adicionada ao N-término de RefSeq número de acesso AAB59393.1), 25 (A é adicionada ao N-término de RefSeq número de acesso CAA27268.1) e 39 (A é adicionada ao N-término de RefSeq número de acesso AAB59394.1). Além disso, quando uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio Fc mutante de um anticorpo de um determinado isotipo é usado como uma substância de teste, o efeito da mutação do mutante sobre a atividade de ligação a receptor Fcy é avaliado usando, como um controle, uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio Fc com o mesmo isotipo. Conforme descrito acima, moléculas de ligação a antí- geno que compreendem um domínio Fc mutante cuja atividade de ligação a receptor Fcy tenha sido julgada como sendo reduzida são adequadamente preparadas.
[0409] Tais mutantes conhecidos incluem, por exemplo, mutantes que têm uma eliminação de aminoácidos 231A-238S (numeração EU) (documento WO 2009/011941), bem como mutantes C226S C229S, P238S, (C220S) (J. Rheumatol (2007) 34, 11); C226S e C229S (Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1 (1), 47-54); C226S, C229S, E233P,L234V e L235A (Blood (2007) 109, 1185-1192).
[0410] Especificamente, as moléculas de ligação a antígeno prefe ridas incluem aquelas que compreendem um domínio Fc com uma subs-tituição de aminoácido na posição 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331 ou 332 (numeração EU) nos aminoácidos que formam o domínio Fc de um anticorpo de um isotipo em particular. O isotipo de anticorpo a partir do qual o domínio Fc se origina não está particularmente limitado e é possível usar um domínio Fc apropriado derivado de um anticorpo monoclonal de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. É preferível usar domínios Fc derivados de anticorpos IgG1.
[0411] As moléculas de ligação a antígeno preferidas incluem, por exemplo, aquelas que compreendem um domínio Fc o qual tem qualquer uma das substituições mostradas abaixo, cujas posições são es-pecificadas de acordo com a numeração EU (cada número representa a posição de um resíduo de aminoácido na numeração EU; e o símbolo de aminoácido em uma letra antes do número representa o resíduo de aminoácido antes de substituição, enquanto que o símbolo de aminoá- cido em uma letra após o número representa o resíduo de aminoácido após a substituição) nos aminoácidos que formam o domínio Fc de an-ticorpo IgG1: (a), L234F, L235E, P331S; (b) C226S, C229S, P238S; (c) C226S, C229S; (d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A; (e) L234A, L235A ou L235R, N297A; (f) L235A ou L235R, S239K, N297A bem como aquelas que têm um domínio Fc o qual tem uma eliminação da sequência de aminoácidos nas posições 231-238.
[0412] Além disso, moléculas de ligação a antígeno preferidas também incluem aquelas que compreendem um domínio Fc o qual tem qualquer uma das substituições mostradas abaixo, cujas posições são especificadas de acordo com a numeração EU nos aminoácidos que formam o domínio Fc de um anticorpo IgG2: (g) H268Q, V309L, A330S, e P331S; (h) V234A (i) G237A (j) V234A e G237 (k) A235E e G237A; (l) V234A, A235E, e G237A. Cada número representa a po-sição de um resíduo de aminoácido na numeração EU e o símbolo de aminoácido em uma letra antes do número representa o resíduo de ami- noácido antes de substituição, enquanto que o símbolo de aminoácido em uma letra após o número representa o resíduo de aminoácido após a substituição.
[0413] Além disso, moléculas de ligação a antígeno preferidas tam bém incluem aquelas que compreendem um domínio Fc o qual tem qualquer uma das substituições mostradas abaixo, cujas posições são especificadas de acordo com a numeração EU nos aminoácidos que formam o domínio Fc de um anticorpo IgG3: (m) F241A; (n) D265A; (o) V264A.
[0414] Cada número representa a posição de um resíduo de amino-ácido na numeração EU e o símbolo de aminoácido em uma letra antes do número representa o resíduo de aminoácido antes de substituição, enquanto que o símbolo de aminoácido em uma letra após o número representa o resíduo de aminoácido após a substituição.
[0415] Além disso, moléculas de ligação a antígeno preferidas tam bém incluem aquelas que compreendem um domínio Fc o qual tem qualquer uma das substituições mostradas abaixo, cujas posições são especificadas de acordo com a numeração EU nos aminoácidos que formam o domínio Fc de um anticorpo IgG4: (p) L235A, G237A, e E318A; (q) L235E; (r) F234A e L235A.
[0416] Cada número representa a posição de um resíduo de amino- ácido na numeração EU e o símbolo de aminoácido em uma letra antes do número representa o resíduo de aminoácido antes de substituição, enquanto que o símbolo de aminoácido em uma letra após o número representa o resíduo de aminoácido após a substituição.
[0417] As outras moléculas de ligação a antígeno preferidas in cluem, por exemplo, aquelas que compreendem um domínio Fc no qual qualquer aminoácido na posição 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330 ou 331 (numeração EU) nos aminoácidos que formam o domínio Fc de um anticorpo IgG1 é substituído por um aminoácido da posição correspon-dente na numeração EU na IgG2 ou IgG4 correspondente.
[0418] As moléculas de ligação a antígeno preferidas também in cluem, por exemplo, aquelas que compreendem um domínio Fc no qual qualquer um ou mais dos aminoácidos nas posições 234, 235 e 297 (numeração EU) nos aminoácidos que formam o domínio Fc de um an-ticorpo IgG1 são substituídos por outros aminoácidos. O tipo de amino- ácido após a substituição não está particularmente limitado; no entanto, as moléculas de ligação a antígeno que compreendem um domínio Fc no qual qualquer um ou mais dos aminoácidos nas posições 234, 235 e 297 são substituídos por alanina são particularmente preferidas.
[0419] As moléculas de ligação a antígeno preferidas também in cluem, por exemplo, aquelas que compreendem um domínio Fc no qual um aminoácido na posição 265 (numeração EU) nos aminoácidos que formam o domínio Fc de um anticorpo IgG1 é substituído por outro ami- noácido. O tipo de aminoácido após a substituição não está particular-mente limitado; no entanto, as moléculas de ligação a antígeno que compreendem um domínio Fc no qual um aminoácido na posição 265 é substituído por alanina são particularmente preferidas.
Molécula de Ligação a Antígeno Multiespecífica
[0420] Exemplos de uma modalidade preferida da "molécula de li gação a antígeno multiespecífica" da presente invenção incluem anti-corpos multiespecíficos. Quando uma região Fc que tem atividade de ligação reduzida ao receptor Fcy é usada como a região Fc de um anti-corpo multiespecífico, uma região Fc derivada do anticorpo multiespe- cífico pode ser adequadamente usada. Anticorpos biespecíficos são particularmente preferidos como os anticorpos multiespecíficos da pre-sente invenção. Neste caso, um anticorpo biespecífico é um anticorpo que tem duas especificidades diferentes. Os anticorpos biespecíficos do tipo IgG podem ser secretados a partir de um hibridoma híbrido (qua-droma) produzido por meio de fusão de dois tipos de hibridomas que produzem anticorpos IgG (Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540).
[0421] Além disso, os anticorpos biespecíficos do tipo IgG são se-cretados através da introdução de genes de cadeias L e de cadeias H que constituem os dois tipos de IgG de interesse, ou seja, um total de quatro genes, em células e coexpressão dos mesmos. No entanto, o número de combinações de cadeias H e L de IgG que podem ser produzidas por estes métodos é teoricamente dez combinações. Portanto, é difícil purificar uma IgG que compreende a combinação desejada de cadeias H e L a partir de dez tipos de IgG. Além disso, teoricamente, a quantidade de secreção de IgG que tem a combinação desejada diminuirá notavelmente e, portanto, cultura em larga escala será neces-sária e os custos de produção aumentarão ainda mais.
[0422] Portanto, técnicas para promover a associação entre as cadeias H e cadeias L com as combinações desejadas podem ser aplicadas às moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção.
[0423] Por exemplo, técnicas para supressão de associação inde-sejada da cadeia H através de introdução de repulsão eletrostática na interface da segunda região constante ou da terceira região constante da cadeia H de anticorpo (CH2 ou CH3) podem ser aplicadas à associação de anticorpos multiespecíficos (documento WO2006/106905).
[0424] Na técnica de supressão de associação indesejada da ca deia H através da introdução de repulsão eletrostática na interface de CH2 ou CH3, exemplos de resíduos de aminoácidos em contato na interface da região constante da cadeia H incluem regiões que correspondem aos resíduos nas posições 356, 439, 357, 370, 399 e 409 pela numeração EU na região CH3.
[0425] Mais especificamente, exemplos incluem um anticorpo que compreende dois tipos de regiões CH3 de cadeia H, em que um a três pares de resíduos de aminoácidos na região CH3 da primeira cadeia H, selecionados a partir de pares de resíduos de aminoácidos indicados em (1) a (3) abaixo, têm o mesmo tipo de carga: (1) resíduos de amino- ácidos compreendidos na região CH3 da cadeia H nas posições 356 e 439 pela numeração EU; (2) resíduos de aminoácidos compreendidos na região CH3 da cadeia H nas posições 357 e 370 pela numeração EU; e (3) resíduos de aminoácidos compreendidos na região CH3 da cadeia H nas posições 399 e 409 pela numeração EU.
[0426] Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo no qual pares dos resíduos de aminoácidos na região CH3 da segunda cadeia H, a qual é diferente da primeira região CH3 de cadeia H mencionada acima, são selecionados a partir dos pares de resíduos de aminoácidos (1) a (3) mencionados acima, em que um a três pares de resíduos de amino- ácidos que correspondem aos pares de resíduos de aminoácidos de (1) a (3) que trazem o mesmo tipo de cargas na primeira região CH3 de cadeia H mencionada acima trazem cargas opostas aos resíduos de aminoácidos correspondentes na primeira região CH3 da cadeia H mencionada acima.
[0427] Cada um dos resíduos de aminoácidos indicados em (1) a (3) acima se aproximam uns aos outros durante associação. Aqueles versados na técnica podem encontrar posições que correspondem aos resíduos de aminoácidos (1) a (3) mencionados acima em uma região CH3 de cadeia H ou região constante de cadeia H desejada através de modelação por homologia e assim por diante usando software comerci-almente disponível e os resíduos de aminoácidos destas posições podem ser adequadamente submetidos à modificação.
[0428] Nos anticorpos mencionados acima, resíduos de aminoáci- dos "carregados" são, de preferência, selecionados a partir de, por exemplo, resíduos de aminoácidos incluídos em qualquer um dos se-guintes grupos: (a) ácido glutâmico (E) e ácido aspártico (D); e (b) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).
[0429] Nos anticorpos mencionados acima, a frase "trazem a mesma carga" significa, por exemplo, que todos os dois ou mais resíduos de aminoácidos são selecionados a partir dos resíduos de amino- ácidos incluídos em qualquer um dos grupos (a) e (b) mencionados acima. A frase "trazem cargas opostas" significa, por exemplo, que quando pelo menos um dos resíduos de aminoácidos entre dois ou mais resíduos de aminoácido é selecionado a partir dos resíduos de aminoá- cidos incluídos em qualquer um dos grupos (a) e (b) mencionados acima, os resíduos de aminoácidos restantes são selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos incluídos no outro grupo.
[0430] Em uma modalidade preferida, os anticorpos mencionados acima podem ter a primeira região CH3 de cadeia H e a segunda região CH3 de cadeia H ligada através de ligações de dissulfureto.
[0431] Na presente invenção, os resíduos de aminoácidos sujeitos à modificação não estão limitados aos resíduos de aminoácidos menci-onados acima das regiões variáveis de anticorpo ou regiões constantes de anticorpo. Aqueles versados na técnica podem identificar resíduos de aminoácidos que formam uma interface em polipeptídeos mutantes ou heteromultímeros através de modelamento por homologia e assim por diante usando um software comercialmente disponível; e resíduos de aminoácidos destas posições podem, então, ser submetidos a modi-ficações, de modo a regular a associação.
[0432] Outras técnicas conhecidas também podem ser usadas para associação de anticorpos multiespecíficos da presente invenção. Poli- peptídeos que contêm região Fc que compreende aminoácidos diferentes podem ser eficientemente associados uns aos outros através da substituição de uma cadeia lateral de aminoácido presente em uma das regiões Fc da cadeia H do anticorpo por uma cadeia lateral maior ("knob") e substituição de um aminoácido da cadeia lateral presente na região Fc correspondente da outra cadeia H por uma cadeia lateral menor ("hole") para permitir a colocação do "knob" no interior do "hole" (documento WO1996/027011; Ridgway J.B. et al., Protein Engineering (1996) 9, 617- 621; Merchant A.M. et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681; e documento US20130336973).
[0433] Além disso, outras técnicas conhecidas também podem ser usadas para a formação de anticorpos multiespecíficos da presente in-venção. A associação de polipeptídeos que têm diferentes sequências pode ser induzida de forma eficiente por meio de associação comple-mentar de CH3 usando um domínio CH3 modificado por permuta de fitas produzido trocando parte de uma das CH3S da cadeia H de um anticorpo por uma sequência correspondente derivada de IgA e introdu-zindo uma sequência derivada de IgA correspondente na parte comple-mentar da outra CH3 de cadeia H (Protein Engineering Design & Selec-tion, 23; 195-202, 2010). Esta técnica conhecida também pode ser usada para formar eficientemente anticorpos multiespecíficos de interesse.
[0434] Além disso, tecnologias para a produção de anticorpos usando associação de CH1 e CL de anticorpo e associação de VH e VL, conforme descrito nos documentos WO 2011/028952, WO2014/018572 e Nat. Biotechnol. Fevereiro de 2014; 32 (2): 191-8; tecnologias para a produção de anticorpos biespecíficos usando anticorpos monoclonais preparados separadamente em combinação (Permuta de Braço de Fab), conforme descrito nos documentos WO2008/119353 e WO2011/131746; tecnologias para regular a associação entre CH3s de cadeia pesada de anticorpos conforme descrito nos documentos WO2012/058768 e WO2013/063702; tecnologias para a produção de anticorpos biespecíficos compostos de dois tipos de cadeias leves e um tipo de cadeia pesada, conforme descrito no documento WO2012/023053; tecnologias para a produção de anticorpos biespecí- ficos usando dois tipos de células bacterianas que expressam individualmente uma das cadeias de um anticorpo que compreende uma única cadeia H e uma cadeia L, conforme descrito por Christoph et al. (Nature Biotechnology Vol. 31, páginas 753-758 (2013)); e assim por diante podem ser usadas para formação de anticorpos multiespecíficos.
[0435] Alternativamente, mesmo quando um anticorpo multiespecí- fico de interesse não pode ser formado de forma eficiente, um anticorpo multiespecífico da presente invenção pode ser obtido por meio de sepa-ração e purificação do anticorpo multiespecífico de interesse a partir dos anticorpos produzidos. Por exemplo, um método para permitir a purificação de dois tipos de formas homoméricas e heteromérica do an-ticorpo de interesse por meio de cromatografia de permuta iônica por conferir uma diferença nos pontos isoelétricos através da introdução de substituições de aminoácidos nas regiões variáveis dos dois tipos de cadeias H foi reportado (documento WO2007114325). Até o momento, como um método para purificar anticorpos heteroméricos, métodos que usam Proteína A para purificar um anticorpo heterodimérico que com-preende uma cadeia H de IgG2a de camundongo que se liga à Proteína A e uma cadeia H de IgG2b de camundongo que não se liga à Proteína A foram reportados (documentos WO98050431 e WO95033844). Além disso, um anticorpo heterodimérico pode ser purificado de forma eficiente em si usando cadeias H que compreendem a substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 pela numeração EU, os quais são um sítio de ligação em uma proteína IgG, por Tyr, His ou similar que são aminoácidos que produzem uma afinidade por Proteína A diferente ou usando cadeias H com afinidade por Proteína A diferente obtidas de acordo com o método do Exemplo de Referência 5, para alterar a interação de cada uma das cadeias H com a proteína A e, em seguida, usando uma coluna de proteína A.
[0436] Alternativamente, uma cadeia L em comum que pode confe rir a capacidade de ligação a uma pluralidade de diferentes cadeias de H pode ser obtida e usada como a cadeia L em comum de um anticorpo multiespecífico. A expressão eficiente de uma IgG multiespecífica pode ser alcançada através da introdução de genes de tal cadeia L em comum e uma pluralidade de diferentes cadeias H em células para expressar a IgG (Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681). Um método para a seleção de uma cadeia L em comum que mostra uma forte capacidade de ligação a qualquer uma das diferentes cadeias H também pode ser usado quando se seleciona uma cadeia H em comum (documento WO 2004/065611).
[0437] Além disso, uma região Fc cuja heterogeneidade da região Fc do C-término foi aprimorada pode ser apropriadamente usada como uma região Fc da presente invenção. Mais especificamente, a presente invenção fornece regiões Fc produzidas por meio de exclusão de glicina na posição 446 e lisina na posição 447, conforme especificado pela nu-meração EU a partir das sequências de aminoácidos de dois polipeptí- deos que constituem uma região Fc derivada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0438] Uma pluralidade, tal como duas ou mais, destas tecnologias pode ser usada em combinação. Além disso, estas tecnologias podem ser aplicadas separadamente e de forma adequada às duas cadeias H a serem associadas. Além disso, estas técnicas podem ser usadas em combinação com a região Fc mencionada acima que tem atividade de ligação reduzida a um receptor Fcy. Além disso, uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode ser uma molécula produzida separadamente, de modo que ela tenha a mesma sequência de amino- ácidos com base na molécula de ligação a antígeno submetida às mo-dificações descritas acima.
[0439] Uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica apropri ada da presente invenção compreende: (1) um domínio que compreende uma região variável de an-ticorpo que tem uma atividade de ligação à glipicana 3; (2) um domínio que compreende uma região variável de an-ticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T; e (3) um domínio que compreende uma região Fc que tem ati-vidade de ligação reduzida ao receptor Fcy mencionado acima, sem li-mitação quanto à sua estrutura.
[0440] Na presente invenção, cada um dos domínios mencionados acima pode ser diretamente ligado através de ligações peptídicas. Por exemplo, quando se usa F(ab')2 como o domínio que compreende uma região variável de anticorpo de (1) e (2) e estas regiões Fc como o do-mínio que compreende uma região Fc que tem atividade de ligação re-duzida ao receptor Fcy de (3), os polipeptídeos formados pela ligação do anticorpo que contêm domínios de regiões variáveis de (1) e (2) e o domínio que contém a região Fc de (3) através de ligações peptídicas formarão uma estrutura de anticorpo. Tais anticorpos podem ser produ-zidos por meio de purificação a partir do meio de cultura de hibridoma mencionada acima e também através de purificação de anticorpos a partir do meio de cultura de células hospedeiras desejadas que trazem de forma estável os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que constituem o anticorpo.
[0441] Exemplos de uma região variável de cadeia H de anticorpo preferida da presente invenção contida na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 compreende as regiões vari-áveis de um anticorpo de cadeia H da Tabela 1 ou as regiões variáveis de cadeia H de anticorpo que possuem sequências de CDR cuja CDR1, CDR2 e CDR3 são as mesmas que as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas nas regiões variáveis de cadeia H da Tabela 1 ou regiões variáveis de cadeia H de anticorpo que sejam fun-cionalmente equivalentes às regiões variáveis mencionadas acima.Tabela 1
[0442] Exemplos de uma região variável de anticorpo preferida que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T da presente invenção incluem regiões variáveis de anticorpos que têm atividade de ligação ao receptor de células T. Dos receptores de células T, CD3 é preferida e CD3ε é particularmente preferida. Exemplos de uma região variável de cadeia H de anticorpo contida em tais regiões variáveis de anticorpo incluem as regiões variáveis de um anticorpo de cadeia H da Tabela 2, regiões variáveis de anticorpo de cadeia H com sequências de CDR cujas sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 são idênticas às sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 con-tidas nas regiões variáveis de cadeia H de um anticorpo da Tabela 2 e regiões variáveis de cadeia H de um anticorpo que são funcionalmente equivalentes às regiões variáveis mencionadas acima.Tabela 2
[0443] A relação entre as regiões de CDR dos resíduos de aminoá-cidos que constituem a sequência de aminoácidos de cadeia H de anti-corpo e a numeração de Kabat é conforme mostrado na Figura 13.
[0444] Para as regiões variáveis de cadeia L de um anticorpo conti das na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipi- cana 3 e da região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T da presente invenção, é preferível obter uma cadeia L em comum que possa fornecer uma atividade de ligação à cadeia H que tem atividade de ligação à glipicana 3 e uma cadeia H que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T e usar a mesma como a região variável de cadeia L em comum da molécula de ligação a antígeno multiespecífica.
[0445] Exemplos da região variável de cadeia L de comum a ser usada na presente invenção incluem as regiões variáveis de cadeia L da Tabela 3, regiões variáveis de cadeia L de anticorpo com sequências de CDR cujas sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 são as mesmas conforme as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 contidas nas regiões variáveis de cadeia L de anticorpo da Tabela 3 e regiões variáveis de cadeia L de anticorpo que sejam funcionalmente equivalentes às regiões variáveis mencionadas acima.Tabela 3
[0446] A relação entre as regiões de CDR dos resíduos de aminoá-cidos que constituem a sequência de aminoácidos de cadeia L do anti-corpo e a numeração de Kabat é conforme mostrado na Figura 14.
[0447] Na presente invenção, a expressão "funcionalmente equivalente" significa que as afinidades de ligação por um antígeno são equi-valentes, ou alternativamente, significa que as atividades citotóxicas contra células que expressam glipicana 3 ou tecidos que contêm tais células são equivalentes quando ela é usada como um molécula de li-gação a antígeno multiespecífica. A atividade citotóxica e a afinidade de ligação podem ser medidas com base na descrição contida aqui. As cé-lulas usadas para medição da atividade citotóxica podem ser células que expressam GPC3 desejadas ou um tecido desejado que contém estas células e, por exemplo, PC-10 ou NCI-H446, as quais são linhagens de células cancerosas humanas que expressam GPC3, podem ser usadas. Em relação às regiões constantes do anticorpo, a expressão pode significar que as diminuições na atividade de ligação ao receptor Fcy são equivalentes.
[0448] Por exemplo, uma região variável de cadeia H de anticorpo funcionalmente equivalente à região variável de cadeia H de anticorpo descrita aqui (isto é, a região variável de cadeia H original) significa que esta região tem a mesma afinidade de ligação quando ela é combinada com a região variável de cadeia L de anticorpo descrita aqui a qual forma um par com a cadeia H original ou, alternativamente, que a região tem a mesma atividade citotóxica por células que expressam glipicana 3 ou um tecido que contêm tais células quando usada para uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica. Além disso, uma região variável de cadeia L de anticorpo funcionalmente equivalente à região variável de cadeia L de anticorpo descrita aqui (isto é, a região variável de cadeia L original) significa que esta região tem a mesma afinidade de ligação quando ela é combinada com a região variável de cadeia H de anticorpo descrita aqui a qual forma um par com a cadeia L original ou, alternati-vamente, que a região tem a mesma atividade citotóxica por células que expressam glipicana 3 ou um tecido que contêm tais células quando usada para uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica.
[0449] O termo "equivalente" não precisa ter necessariamente o mesmo grau de atividade e a atividade pode ser aumentada. Especifi-camente, para a afinidade de ligação a antígeno, exemplos incluem o caso no qual o valor (valor de Kd/valor de Kd parental) obtido por meio de comparação com a afinidade de ligação da região variável do anticorpo que serve como controle (valor de Kd parental) é de 1,5 ou menos. O valor de Kd/valor de Kd parental é, de preferência, 1,3 ou menos, mais preferivelmente 1,2 ou menos, 1,1 ou menos, 1,0 ou menos, 0,9 ou me-nos, 0,8 ou menos, 0,7 ou menos, 0,6 ou menos ou 0,5 ou menos. Embora não haja nenhum limite mínimo, exemplos incluem 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ou 10-6. Mais especificamente, na presente invenção, o valor de Kd/valor de Kd parental é, de preferência, a partir de 10 -6 a 1,5 x 103 , mais preferivelmente a partir de 10-6 a 10-1 , ainda mais preferivelmente a partir de 10-6 a 10-2 e, mais preferivelmente, 10-6 a 10-3. Para a atividade citotóxica, exemplos incluem o caso no qual o valor de (taxa de inibição de crescimento celular/taxa de inibição de crescimento celular parental) obtido por meio de comparação com a taxa de inibição de crescimento celular da molécula de ligação a antígeno multiespecífica que serve como controle (taxa de inibição de crescimento celular parental) é de 0,7 ou mais. A concentração da molécula de ligação a antígeno multiespecífica adicionada pode ser determinada de forma apropriada mas é, de preferência, por exemplo, a partir de 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM ou 1 nM e, de preferência, as medições são realizadas a 0,05 nM ou 0,1 nM. O valor para a taxa de inibição de crescimento ce- lular/ taxa de inibição de crescimento celular parental é, de preferência, de 0,8 ou maior, mais preferivelmente 0,9 ou maior, 1,0 ou maior, 1,2 ou maior, 1,5 ou maior, 2 ou maior, 3 ou maior, 5 ou maior, 10 ou maior ou 20 ou maior. Embora não haja um limite máximo, o valor pode ser de 10, 102, 103, 104, 105 ou 106.
[0450] Por outro lado, quanto à atividade citotóxica, exemplos in cluem o caso nos quais o valor de (concentração para inibição de 50% de crescimento celular/concentração para inibição de 50% de crescimento celular parental) obtido por meio de comparação com a concentração da molécula de ligação a antígeno multiespecífica para inibição de 50% de crescimento celular parental (concentração para inibição de 50% de crescimento celular parental) é de 1,5 ou menos. A concentração para inibição de 50% de crescimento celular refere-se à concentração da molécula de ligação a antígeno multiespecífica necessária para reduzir a taxa de proliferação celular pela metade em comparação com quando a molécula de ligação a antígeno multiespecífica não é adicionada. O valor de "concentração para inibição de 50% de crescimento celular/concentração para inibição de 50% de crescimento celular pa-rental" é, de preferência, 1,3 ou menos, mais preferivelmente 1,2 ou me-nos, 1,1 ou menos, 1,0 ou menos, 0.9 ou menos, 0,8 ou menos, 0,7 ou menos, 0,6 ou menos ou 0,5 ou menos. Embora não haja nenhum limite mínimo, o valor pode ser, por exemplo, 10-1, 10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5 ou 106. Especificamente, o valor é, de preferência, a partir de 10-6 a 1,5 x 100 , mais preferivelmente a partir de 10-6 a 10-1 , ainda mais preferivelmente a partir de 10-6 a 10-2 e, mais preferivelmente, a partir de 10-6 a 10-3
[0451] Em relação ao domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à GPC3, o valor de Kd para a GPC3 (por exemplo, GPC3 humana) pode ser, por exemplo, 5 x 10-9 M ou menos, de preferência 4 x 10-9 M ou menos, tal como 3 x 10-9 M ou menos, 2 x 10-9 M ou menos, 1 x 10-9 M ou menos, 8 x 10-10 M ou menos, 5 x 10-10 M ou menos, 4 x 10-10 M ou menos, 3 x 10-10 M ou menos, 2 x 10-10 M ou menos, 1 x 10-10 M ou menos, 8 x 10-11 M ou menos, 5 x 10-11 M ou menos, 4 x 10-11 M ou menos, 3 x 10-11 M ou menos, 2 x 10-11 M ou menos, 1 x 10-11 M ou menos, 8 x 10-12 M ou menos, 5 x 10-12 M ou menos, 4 x 10-12 M ou menos, 3 x 10-12 M ou menos, 2 x 10-12 M ou menos, 1 x 10-12 M ou menos, 8 x 10-13 M ou menos, 5 x 10-13 M ou menos, 4 x 10-13 M ou menos, 3 x 10-13 M ou menos, 2 x 10-13 M ou menos ou 1 x 10-13 M ou menos.
[0452] Em relação ao domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem a atividade de ligação ao complexo receptor de células T, o valor de Kd para um complexo receptor de células T huma-nas, tal como um receptor de células T humana ou, mais especificamente, por exemplo, CD3ε humana pode ser, por exemplo, 1,5 x 10-7 M ou menos, tal como 1,4 x 10-7 M ou menos, 1,3 x 10-7 M ou menos, 1,2 x 10-7 M ou menos, 1 x 10-7 M ou menos, 3 x 10-8 M ou menos, 2 x 10-8 M ou menos, 1 x 10-8 M ou menos, 8 x 10-9 M ou menos, 5 x 10-9 M ou menos, 4 x 10-9 M ou menos, 3 x 10-9 M ou menos, 2 x 10-9 M ou menos, 1 x 10-9 M ou menos, 8 x 10-10 M ou menos, 5 x 10-10 M ou menos, 4 x 10-10 M ou menos, 3 x 10-10 M ou menos, 2 x 10-10 M ou menos, 1 x 1010 M ou menos, 8 x 10-11 M ou menos, 5 x 10-11 M ou menos, 4 x 10-11 M ou menos, 3 x 10-11 M ou menos, 2 x 10-11 M ou menos, 1 x 10-11 M ou menos, 8 x 10-12 M ou menos, 5 x 10-12 M ou menos, 4 x 10-12 M ou menos, 3 x 10-12 M ou menos, 2 x 10-12 M ou menos ou 1 x 10-12 M ou menos.
[0453] As moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da pre sente invenção têm, de preferência, valores de Kd para a GPC3 humana e o complexo receptor de células T humanas (por exemplo, cadeia CD3ε humana) que são de 5 x 10-9 M ou menos a 2 x 10-7 M ou menos, res-pectivamente e, mais preferivelmente, de 1 x 10-9 M ou menos e 5 x 108 M ou menos, respectivamente.
[0454] Na presente invenção, as regiões variáveis de anticorpos que são "funcionalmente equivalente" não estão particularmente limitadas, contanto que elas sejam regiões variáveis de cadeia H e/ou de cadeia L de anticorpo que satisfaçam as condições descritas acima. Exemplos de tais regiões variáveis de anticorpos incluem regiões produzidos através da introdução de substituição, eliminação, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 10 aminoáci- dos) para o aminoácido sequências das regiões variáveis das Tabelas 1 a 3 acima referidos. Um método bem conhecido dos peritos na arte para a introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos, dele- ções, adições, e/ou inserções em uma sequência de aminoácidos é um método para a introdução de mutações em proteínas. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem preparar regiões variáveis que são funcionalmente equivalentes às regiões variáveis de anticorpo com as funções mencionadas acima através da introdução de mutações em se-quências de aminoácidos usando métodos talcomo mutagênese sítio di-rigida (Hashimoto-Gotoh, T., Mizuno, T., Ogasahara, Y. e Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site- directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, M.J. e Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W., Drutsa, V., Jansen, H.W., Kramer, B., Pflugfelder, M. e Fritz, H.J. (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. e Fritz, H.J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA. Methods Enzymol. 154, 350-367; e Kunkel, T.A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad. Sci. U S A. 82, 488-492).
[0455] Quando um resíduo de aminoácido é alterado, de preferên cia, o aminoácido sofre mutação para um aminoácido diferente que conserva as propriedades do aminoácido de cadeia lateral. Exemplos de propriedades de cadeia lateral de aminoácido são: aminoácidos hi- drofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), os aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S e T), os aminoácidos que contêm cadeias alifáticas laterais (G, A, V, L, I e P), aminoácidos que contêm cadeias laterais que contêm um grupo hidroxilo (S, T e Y) , aminoácidos que contêm cadeias que contêm enxofre, átomo laterais (C e M), que contêm aminoácidos função ácido carboxílico e cadeias laterais que contêm amida (D, N, E e Q), aminoácidos que contêm cadeias laterais básicas (R, K e H) e aminoácidos que contêm cadeias laterais aromáticas (H, F, Y e W) (os aminoácidos estão representados pelo código de uma letra em parên- teses).As substituições de aminoácidos dentro de cada um destes grupos são chamadas substituições conservadoras. Sabe-se que um poli- peptídeo que contêm uma sequência de aminoácidos modificada, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos são eliminados, adicionados e/ou substituídos por outros aminoácidos, podem reter a atividade biológica inicial (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81: 5662-6; Zoller, M. J. e Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409-13). As regiões variáveis da presente invenção que contêm tais modificações de aminoácidos tem uma identidade de se-quência de aminoácidos de pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%,ainda mais preferivelmente, pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 95%, com a sequência de aminoácidos das sequências de CDR, as sequências FR ou regiões va-riáveis inteiras de a região variável antes da modificação. Aqui, de iden-tidade de sequência é definida como a percentagem de resíduos idênticos aos da sequência de aminoácidos original da região variável da região variável de cadeia H ou da cadeia L determinada após as se-quências são alinhadas e lacunas são apropriadamente introduzidos para maximizar a identidade de sequência como necessário. A identidade de sequências de aminoácidos pode ser determinada por meio do método descrito abaixo.
[0456] Além disso, pode ser obtido um "funcionalmente equivalente região variável de anticorpo", por exemplo, a partir de ácidos nucleicos que hibridam sob condições rigorosas com os ácidos nucleicos que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma região variável nas Tabelas 1 a 3 citada acima. Condições de hibridização rigorosas para isolar um ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas com um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de ami- noácidos de uma região variável incluem, por exemplo, as condições de ureia 6 M, SDS a 0,4%, 0,5x SSC e 37 °C ou condições de hibridização com um rigor equivalente ao mesmo. Isolamento de ácidos nucleicos com uma homologia muito maior pode ser esperado com condições mais rigorosas, por exemplo, as condições de ureia 6 M, 0,4% de SDS, 0,1 x SSC e 42 °C. As condições de lavagem após a hibridização são, por exemplo, lavagem usando 0,5x SSC (1x SSC é NaCl a 0,15 M e citrato de sódio a 0,015 M em um pH de 7,0) e SDS a 0,1% a 60 °C, mais preferivelmente de lavagem usando 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 60 °C, ainda mais preferivelmente de lavagem usando SSC 0,2x e SDS a 0,1% a 62 °C, ainda mais preferivelmente de lavagem usando SSC 0,2x e SDS a 0,1% a 65 °C e ainda mais preferivelmente de lavagem usando 0,1 x SSC e SDS a 0,1% a 65 °C. As sequências dos ácidos nucleicos isolados podem ser determinadas pelos métodos conhecidos descritos abaixo. A homologia de sequência total de nucleotídeos do ácido nu- cleico isolado que é pelo menos 50% ou maior, de preferência 70% ou maior e, mais preferivelmente, 90% ou maior (por exemplo, 95%, 96%,97%, 98%, 99% ou maior) de identidade de sequência.
[0457] Os ácidos nucleicos que hibridam sob condições rigorosas com um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotí- deos que codifica a sequência de aminoácidos de uma região variável pode também ser isolado usando, em vez dos métodos acima descritos, usando técnicas de hibridização, métodos de amplificação de genes, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR), que usa iniciadores sintetizados com base na informação da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável.
[0458] A identidade de sequência de um nucleotídeo ou sequência de aminoácidos para o outro pode ser determinada usando o algoritmo BLAST, por Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873-7). Programas chamados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base neste algoritmo (Altschul et al., J. Mol Biol (1990) 215: 403-10). Para analisar as sequências de nucleotídeos de acordo com BLASTN com base no BLAST, os parâmetros são ajustados, por exemplo, como pontuação = 100 e comprimento de palavra = 12. Por outro lado, os parâmetros usados para a análise de sequências de aminoáci- dos com base em por BLASTX BLAST incluem, por exemplo, pontuação = 50 e comprimento de palavra = 3. os parâmetros predefinidos para cada programa são usados quando se usa o os programas BLAST e intervalos. Métodos específicos para tais análises são conhecidos na técnica (vide o website do National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
[0459] A combinação da região variável de anticorpo que tem ativi dade 3 de ligação à glipicana e o anticorpo da região variável que tem atividade de ligação do complexo receptor de células T como compre-endida na molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção não é particularmente limitado, desde que ele tem que precede atividades. No entanto, na presente invenção, a atividade citotóxica da molécula de ligação a antígeno multiespecífica é preferivelmente equi-valente a ou maior do que a dos anticorpos biespecíficos GPC3_ERY22_rCE115 descritos no Exemplo 3. Aqui, o termo "equiva-lente" não tem necessariamente o mesmo significado grau de atividade, tal como descrito acima e a atividade pode ser aumentada. Sendo equi-valente a GPC3_ERY22_rCE115 é, por exemplo, quando o valor de (taxa de inibição do crescimento celular/taxa de inibição do crescimento celular (GPC3_ERY22_rCE115)) em relação à taxa de inibição do crescimento de células de GPC3_ERY22_rCE115 (taxa de inibição do crescimento celular (GPC3_ERY22_rCE115)) é de 0,7 ou maior, de preferência 0,8 ou maior, 0,9 ou maior, 1,0 ou maior, 1,2 ou maior, 1,5 ou maior, 2 ou maior, 3 ou maior, 5 ou maior, 10 ou maior ou 20 ou maior. Embora não haja um limite máximo, o valor pode ser, por exemplo, 10, 102, 103, 104, 105 ou 106. A concentração da molécula de ligação a an- tígeno multiespecífica a ser adicionada pode ser determinada de forma apropriada mas, de preferência é, por exemplo, 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM ou; e, de preferência, as medições são realizadas a 0,05 nM ou 0,1 nM.
[0460] Além disso, exemplos incluem o caso no qual o valor (con centração para 50% de inibição de crescimento celular/concentração para inibição de 50% de crescimento celular (GPC3_ERY22_rCE115)) obtido ao comparar a concentração para inibição de crescimento % de GPC3_ERY22_rCE115 células (concentração de 50 para 50 % de inibição do crescimento celular (GPC3_ERY22_rCE115)) é de 1,5 ou menos. O valor para "concentração para inibição de 50% do crescimento celular/concentração para inibição de 50% do crescimento celular (GPC3_ERY22_rCE115)" é de preferência 1,3 ou menos, mais preferi-velmente 1,2 ou menos, de 1,1 ou menos, de 1,0 ou menos, de 0,9 ou menos, 0,8 ou menos, de 0,7 ou menos, de 0,6 ou menos ou de 0,5 ou menos. Embora não haja nenhum limite inferior, o valor pode ser, por exemplo, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ou 10-6. Especificamente, o valor é, de preferência, 10-6 a 1,5 x 10-0 , de preferência mais de 10-6 a 10-1, ainda mais preferivelmente de 10-6 a 10-2 e, mais preferivelmente, 10-6 a 10-3.
[0461] Os valores de KD específicos preferidos para GPC3 humana e o complexo receptor de células T humanas (por exemplo, cadeia CD3ε humana) também são conforme indicado acima. Células desejadas que mostram expressão de GPC3 ou tecidos desejados que contêm tais cé-lulas podem ser usados para as células e, por exemplo, PC-10 ou NCI- H446, as quais são linhagens de células cancerosas humanas que ex-pressam GPC3, podem ser usadas.
[0462] Exemplos de tal combinação de região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à glipicana 3 e da região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T incluem as combinações de regiões variáveis de cadeia H de um an-ticorpo mostradas na Tabela 4, as combinações de regiões variáveis de cadeia H de um anticorpo que têm sequências de CDR cujas sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 são as mesmas que as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 trazidas pelas re-giões variáveis de cadeia H de um anticorpo da Tabela 4 e combinações de regiões variáveis de cadeia H de anticorpo funcionalmente equiva-lentes a estas regiões variáveis. Aqui, "funcionalmente equivalente" tem o mesmo significado conforme descrito acima.Tabela 4
[0463] Uma cadeia L em comum preferida para tais combinações de uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à gli- picana 3 e uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T inclui, por exemplo, L0000, L0011, L0201, L0203, L0204, L0206, L0208, L0209, L0211, L0212, L0222 e uma cadeia L em comum que tem sequências de CDR (sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3) idênticas às sequências de ami- noácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia L em comum acima. Com-binações específicas incluem, por exemplo, as combinações de regiões variáveis de cadeia H de um anticorpo e uma cadeia L em comum mos-tradas na Tabela 5, as combinações de regiões variáveis de anticorpos com sequências de CDR (sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3) idênticas às sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 trazidas pelas regiões variáveis de anticorpo e uma cadeia L em comum da Tabela 5 e combinações de regiões variáveis de cadeia H de um anticorpo e uma cadeia L em comum funcionalmente equivalentes a estas regiões variáveis. Aqui, "funcionalmente equivalente" tem o mesmo significado conforme descrito acima.Tabela 5
[0464] A região Fc compreendida na molécula de ligação a antigen multiespecífica da presente invenção não está particularmente limitada, contanto que ela seja uma região Fc que tem atividade de ligação redu-zida ao receptor Fcy, mas exemplos de uma região Fc preferida da pre-sente invenção incluem uma combinação da porção de região Fc de E22Hh e da porção de região Fc de E22Hk, uma combinação da porção de região Fc de E2702GsKsc e da porção de região Fc de E2704sEpsc e uma combinação da porção de região Fc de E2702sKsc e da porção de região Fc de E2704sEpsc.
[0465] Exemplos de uma molécula de ligação a antígeno multiespe- cífica preferida da presente invenção incluem anticorpos biespecíficos que compreendem uma região variável de anticorpo que tem uma ativi-dade de ligação à glipicana 3 e uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à CD3ε. Mais preferivelmente, a atividade citotóxica é a mesma ou maior do que aquela do anticorpo biespecífico GPC3_ERY22_rCE115. Exemplos de tais anticorpos biespecíficos in-cluem anticorpos biespecíficos que compreendem as cadeias H e L des-critas na Tabela 13 e anticorpos biespecíficos que se ligam a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado pelos anticorpos anteriores e que contêm uma região Fc que tem atividade de ligação reduzida ao receptor Fcy.
[0466] Se um anticorpo reconhece um epítopo que se sobrepõe a um epítopo reconhecido por outro anticorpo pode ser confirmado por meio de competição entre os dois anticorpos contra o epítopo. A competição entre os anticorpos podem ser avaliada através de ensaios de ligação competitiva usando meios tais como ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), o método de transferência de energia de fluorescência (FRET) e a tecnologia de ensaio fluorimétrico em microvolume (FMAT (marca registrada)). A quantidade de um anticorpo ligado a um antígeno se correlaciona indiretamente com a capacidade de ligação de um anticorpo competidor candidato (um anticorpo de teste) que se liga competitivamente ao epítopo de sobreposição. Em outras palavras, à medida que a quantidade ou afinidade de um anticorpo de teste contra o epítopo em sobreposição aumenta, a quantidade de anticorpo ligado a antígeno diminui e a quantidade de anticorpo de teste ligado a antígeno aumenta. Especificamente, o anticorpo adequadamente marcado e o anticorpo a ser avaliado são adicionados simultaneamente ao antígeno e o anticorpo ligado como um resultado é detectado usando o marcador. A quantidade de anticorpo ligado a antígeno pode ser facilmente determinada por meio de marcação do anticorpo antecipadamente. Este marcador não está particularmente limitado e o processo de marcação é selecionado de acordo com a técnica de ensaio usada. Especificamente, o método de marcação inclui marcação fluorescente, marcação radioativa, marcação enzimática e assim por diante.
[0467] Por exemplo, o anticorpo marcado por fluorescência e o an ticorpo ou o anticorpo de teste não marcado são adicionados simultane-amente a esferas imobilizadas com GPC3 ou CD3ε e o anticorpo marcado é detectado pela tecnologia de ensaio fluorimétrico em microvolume.
[0468] Aqui, o "anticorpo que se liga ao epítopo de sobreposição" refere-se a um anticorpo de teste que pode reduzir a quantidade de an-ticorpo marcado ligado em pelo menos 50% para uma concentração que geralmente é 100 vezes maior, de preferência 80 vezes maior, mais pre-ferivelmente 50 vezes maior, ainda mais preferivelmente 30 vezes maior e, mais preferivelmente, 10 vezes maior do que a concentração na qual o anticorpo não marcado reduz em 50% a quantidade de anticorpo marcado ligado (IC50).
[0469] As moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas, as quais possuem sítios de ligação a antígeno de anticorpos que se ligam a epítopos que se sobrepõem aos epítopos ligados pelos anticorpos mencionados acima, podem produzir uma excelente atividade citotó- xica.
[0470] As moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da pre sente invenção são produzidas por meio da mesma técnica que o método para produção de anticorpos recombinantes mencionado acima.
[0471] A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos que codificam as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção e eles podem ser inseridos em vetores de expressão discricionários. Hospedeiros adequados podem ser transformados com os vetores de expressão para a produção de células que expressam as moléculas de ligação a antígeno. As moléculas de ligação a antígeno codificadas pelos polinucleotídeos podem ser obtidas através de cultura de células que expressam as moléculas de ligação a antígeno e coleta dos produtos de expressão a partir de sobrenadantes de cultura. Isto é, a presente in-venção refere-se a vetores que compreendem um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção, células que contêm tal vetor e métodos para a produção de moléculas de ligação a antígeno os quais compreendem cultura das células e coleta das moléculas de ligação a antígeno a partir de sobrenadantes de cultura. Estas podem ser obtidas através de técnicas similares àquelas para anticorpos recombinantes mencionadas acima.
Composições Farmacêuticas
[0472] De um outro ponto de vista, a presente invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem, como ingrediente ativo, uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que compreende: (1) um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3, (2) um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T e (3) um domínio que compreende uma região Fc que tem atividade de ligação reduzida a um receptor Fcy. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que induzem à lesão celular as quais compreendem a molécula de ligação a antígeno como um ingrediente ativo. As composições farmacêuticas da presente invenção as quais induzem à lesão celular, de preferência citotoxicidade celular dependente de células T descritas são, de prefe-rência, administradas a um indivíduo que está sofrendo de uma doença para a qual as atividades são necessárias para prevenção ou tratamento ou um indivíduo onde é possível uma recaída da doença.
[0473] Além disso, na presente invenção, agentes indutores de ci- totoxicidade e agentes de inibição de crescimento celular que compre-endem, como o ingrediente ativo, uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que compreende: (1) um domínio que compreende uma região variável de an-ticorpo que tem uma atividade de ligação à glipicana 3, (2) um domínio que compreende uma região variável de an-ticorpo que tem a atividade de ligação ao complexo receptor de células T, e (3) um domínio que compreende uma região Fc com atividade reduzida de ligação a um receptor Fcy
[0474] pode ser apresentada como um método para induzir à lesão celular compreendendo a etapa de administração da molécula de ligação a antígeno a um indivíduo ou pode ser apresentada como o uso da molécula de ligação a antígeno na produção de um agente indutor de citotoxicidade e um agente inibidor de crescimento celular.
[0475] Na presente invenção "que compreende como ingredient ativo uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que compre-ende (1) um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3, (2) um domínio que compre-ende uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T e (3) um domínio que compreende uma região Fc que tem atividade de ligação reduzida a um receptor Fcy" sig-nifica compreendendo a molécula de ligação a antígeno como um com-ponente ativo importante, sem limitação quanto à proporção do teor da molécula de ligação a antígeno.
[0476] Se necessário, as moléculas de ligação a antígeno multies- pecíficas da presente invenção podem ser encapsuladas em microcáp- sulas (por exemplo, aquelas feitas de hidroximetil celulose, gelatina e poli(metilmetacrilato)) ou incorporadas como componentes de um sistema de distribuição de fármacos coloidal (por exemplo, lipossomas, mi- croesferas de albumina, uma microemulsão, nanopartículas e nanocáp- sulas) (vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 16a edição, Oslo Ed. (1980)). Métodos para preparar agentes farmacêuticos como agentes farmacêuticos de liberação controlada também são bem conhecidos e tais métodos podem ser aplicados às moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção (J. Biomed Mater Res (1981) 15: 267-. 277; Chemtech (1982) 12: 98-105; Patente dos Estados Unidos N° 3.773.719; Publicações de Pedido de Patente Europeia nos EP 58481 e EP 133988; Biopolymers (1983) 22: 547-556).
[0477] As composições farmacêuticas da presente invenção ou agentes indutores de citotoxicidade e agentes de inibição de crescimento celular podem ser administrados aos pacientes por meio de administração oral ou parentérica e administração parentérica é preferida. Exemplos específicos do método de administração incluem administração por injeção, administração transnasal, administração transpulmonar e administração transdérmica. Exemplos de administração por injeção incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e injeção subcutânea. Uma composição farmacêutica da presente invenção ou um agente indutor de citotoxicidade e um agente inibidor de crescimento celular podem ser administrados sistêmica ou localmente, por exemplo, através de administração por injeção. O método de administração pode ser apropriadamente selecionado de acordo com a idade e os sintomas do paciente. A dose pode ser selecionada na faixa a partir de 0,0001 mg a 1000 mg por quilograma de peso corporal para uma administração única. Alternativamente, por exemplo, a dose pode ser selecionada na faixa a partir de 0,001 mg/corpo a 100.000 mg/corpo por paciente. No entanto, as composições farmacêuticas da presente invenção ou um agente inibidor de crescimento celular e agente indutor de citotoxicidade não estão limitadas a estas doses.
[0478] As composições farmacêuticas da presente invenção ou agentes indutores de citotoxicidade e agentes de inibição de crescimento celular podem ser formulados de acordo com métodos convencionais (por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, EUA) e também podem conter veículos e aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos incluem, porém sem limitações, tensoativos, excipientes, agentes colorantes, perfumes, conservantes, estabilizantes, tampões, agentes de suspensão, agentes de isotonização, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes de promoção de fluidez e flavorizantes; e outros veículos comumente usados podem ser adequadamente usados. Exemplos específicos de veículos incluem ácido silícico anidro leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, croscarmelose de cálcio, croscarmelose de sódio, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, dietilaminoace- tato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeo de ácido graxo, óleo de rícino endurecido com polioxietileno 60, sacarose, carbo- ximetil celulose, amido de milho, sal inorgânico e assim por diante.
[0479] A presente invenção também fornece métodos para danificar células que expressam o antígeno glipicana 3 ou tecidos tumorais que contêm células que expressam o antígeno ou métodos para suprimir o crescimento destas células ou tecidos tumorais por meio de contato das células que expressam o antígeno glipicana 3 com uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção. A molécula de ligação a antígeno multiespecífica que se liga ao antígeno é, conforme descrito acima, uma molécula de ligação de antígeno da presente in-venção que se liga ao antígeno a qual é composta dos agentes indutores de citotoxicidade e agentes de inibição de crescimento celular da presente invenção. As células ligadas por uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção que se liga a antígeno não estão particularmente limitadas, contanto que elas sejam células que expressam o antígeno.
[0480] Na presente invenção, o "contato" é realizado, por exemplo, mediante adição de uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção ao meio de cultura de células que expressam o antígeno GPC3 em cultura in vitro. Neste caso, um líquido ou um sólido obtido por meio de secagem por congelamento ou similar pode ser ade-quadamente usado como a forma da molécula de ligação a antígeno adicionada. Quando adicionada como uma solução aquosa, ela pode ser uma solução aquosa que contêm simplesmente apenas uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção ou uma solução que contém também os tensoativos, excipientes, agentes colo- rantes, perfumes, conservantes, estabilizantes, tampões, agentes de suspensão, agentes de isotonização, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes de fluidez, agentes flavorizantes mencionados acima e assim por diante. A concentração na qual a adição é realizada não está particularmente limitada, mas uma concentração final adequada na solução de cultura está, de preferência, na faixa de 1 pg/ml a 1 g/mL, mais preferivelmente a partir de 1 ng/ml a 1 mg/ml e, ainda mais preferivelmente, a partir de 1 μg/mL a 1 mg/mL.
[0481] Além disso, em uma outra modalidade, o "contato" da pre sente invenção também é realizado através da administração de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção a animais não hu-manos com células que expressam o antígeno GPC3 transplantadas para o corpo e animais portadores de células que expressam intrinsecamente o antígeno. O método de administração pode ser oral ou pa- rentérico e a administração parentérico é particularmente preferida. Exemplos específicos do método de administração incluem administração por injeção, administração transnasal, administração transpulmonar e administração transdérmica. Exemplos de administração por injeção incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e injeção subcutânea. Uma composição farmacêutica da presente invenção ou um agente de indução de citotoxicidade celular e um agente inibidor de crescimento podem ser administrados sistêmica ou local-mente, por exemplo, através de administração por injeção. O método de administração pode ser apropriadamente selecionado de acordo com a idade e os sintomas do animal de teste. Quando administrada como uma solução aquosa, uma solução aquosa que contêm simplesmente apenas uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção pode ser usada ou uma solução que contém também os ten- soativos, excipientes, agentes colorantes, perfumes, conservantes, es- tabilizantes, tampões, agentes de suspensão, agentes de isotonização, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes de fluidez, agentes flavorizantes mencionados acima e assim por diante pode ser usada. A dose pode ser selecionada a partir da faixa de 0.0001 mg a 1000 mg por quilograma de peso corporal para uma administração única.
[0482] Alternativamente, por exemplo, a dose pode ser selecionada na faixa a partir de 0,001 mg/corpo a 100.000 mg/corpo por paciente. No entanto, a quantidade da molécula de ligação a antígeno multiespe- cífica da presente invenção administrada não está limitada a estas doses.
[0483] O método a seguir é adequadamente usado como um método para avaliação ou medição da lesão celular induzida em células que expressam o antígeno glipicana 3 que está ligado por um domínio que leva a uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 a qual constitui a molécula de ligação a antígeno como um resultado de contato das células com uma molécula de ligação a antí- geno multiespecífica da presente invenção. Exemplos de um método para avaliação ou medição da atividade citotóxica in vitro incluem métodos para medir a atividade de células T citotóxicas e assim por diante. Se uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção tem ou não citotoxicidade para células T pode ser medido através de métodos conhecidos (por exemplo, Current Protocols in Immunology, Capítulo 7, Immunologic Studies In Humans, Editor John E. Co- ligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)) e assim por diante). Para medições da atividade, uma molécula de ligação a antígeno que se liga a um antígeno diferente de glipicana 3, o qual é um antígeno não expresso nas células usadas para análise, pode ser usada como um controle do mesmo modo que uma molécula de ligação a antígeno multies- pecífica da presente invenção e a atividade pode ser determinada como estando presente quando a molécula de ligação a antígeno multiespe- cífica da presente invenção mostra uma atividade citotóxica maior do que quando a molécula de ligação a antígeno é usada como um controle.
[0484] Para avaliar ou medir a atividade citotóxica in vivo, por exem plo, células que expressam o antígeno glipicana 3 são intradérmica ou subcutaneamente transplantadas para um animal de teste não humano e, em seguida, uma molécula de ligação a antígeno de teste é intravenosa ou intraperitonealmente administrada diariamente ou com um intervalo de alguns dias, a partir do dia do transplante ou no dia seguinte. A atividade citotóxica pode ser determinada pela medição diária do tamanho do tumor e pela observação de diferenças na alteração do tamanho do tumor. De um modo similar à avaliação in vitro, a atividade citotóxica de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode ser determinada como estando presente quando a administração de uma molécula de ligação a antígeno de controle mostra que o tamanho do tumor no grupo submetido à administração de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é significativamente menor do que o tamanho do tumor no grupo submetido à administração da molécula de ligação a antígeno de controle.
[0485] Como um método para avaliação ou medição do efeito inibi dor sobre a proliferação de células que expressam um antígeno glipi- cana 3, um método de medição da incorporação de timidina marcada com isótopo em células ou o método de MTT pode ser adequadamente usado. Como um método para avaliação ou medição da atividade de supressão de proliferação celular in vivo, o mesmo método descrito acima para avaliação ou medição da atividade citotóxica in vivo pode ser adequadamente usado.
[0486] A presente invenção também fornece kits para uso nos métodos da presente invenção os quais compreendem uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica produzida por meio de um método de produção da presente invenção. Além disso, o kit pode incluir, em sua embalagem, um veículo farmaceuticamente aceitável, um solvente e instruções que descrevem o método de uso.
[0487] A presente invenção refere-se também a uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica produzida por meio de um método de produção da presente invenção para uso em um método da presente invenção.
[0488] A presente invenção refere-se também a moléculas que têm atividade de ligação à GPC3, as quais contêm um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação à GPC3 da molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção. Além disso, a presente invenção refere-se a uma molécula que tem atividade de ligação à GPC3 a qual compreende as regiões variáveis de cadeias H e L de anticorpo que compreendem, res-pectivamente, as três CDRs de cadeia H e L (total de seis CDRs) conti-das na molécula. A presente invenção refere-se também a moléculas que têm atividade de ligação ao complexo receptor de células T as quais contêm um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T da mo-lécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção. Além disso, a presente invenção refere-se a uma molécula que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que compreende as regiões variáveis de cadeias H e L de anticorpo que compreendem, respec-tivamente, as três CDRs das cadeias H e L (total de seis CDRs) contidas na molécula. Tais moléculas podem ser anticorpos ou polipeptídeos que compreendem fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo. A pre-sente invenção refere-se também a anticorpos que se ligam a epítopos que se sobrepõem ou que competem com estas moléculas ou polipep- tídeos que contêm os fragmentos de ligação a antígeno. Exemplos ade-quados de tais polipeptídeos que compreendem fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo incluem scFv, anticorpos com uma única cadeia, fragmentos Fv, Fv 2 com uma única cadeia (scFv2), Fab e F(ab')2. Além disso, estas moléculas não têm de ser multiespecíficas (biespecíficas) e podem se ligar apenas à GPC3 ou ao complexo receptor de células T (por exemplo, a cadeia CD3ε).
[0489] Estas moléculas incluem uma molécula que compreende um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem uma atividade de ligação a GPC da molécula de ligação a antígeno multies- pecífica exemplificada em detalhes nos Exemplos aqui (a qual compreende as regiões variáveis de cadeia H que têm atividade de li-gação à GPC3 e a região variável de cadeia L em comum), uma molécula que compreende um domínio que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T da molécula de ligação a antígeno multiespecífica exemplificada nos exemplos aqui (a qual compreende as regiões variáveis de cadeia H com atividade de ligação ao complexo receptor de células T e a região variável de cadeia L em comum) e também uma molécula que tem uma atividade de ligação à mesma proteína antigênica (GPC3 ou complexo receptor de células T) que compreende as três CDRs de cada uma das cadeias H e L (total de seis CDRs) contidas na molécula acima.
[0490] Estas moléculas têm CDRs que são em comum com aquelas de uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente in-venção e, portanto, espera-se que se liguem a um epítopo de sobrepo-sição com um epítopo para a molécula de ligação a antígeno multiespe- cífica da presente invenção. Portanto, estas moléculas podem competir com as moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção pelo fato de que elas coexistem com as moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção. Portanto, estas mo-léculas podem ser usadas, por exemplo, como agentes reguladores para suprimir atividades (tais como atividade de ligação a antígeno, atividade citotóxica e atividade antitumor) das moléculas de ligação a an- tígeno multiespecíficas da presente invenção. Além disso, tal molécula pode ser ligada a uma proteína alvo (GPC3 ou complexo receptor de células T) antecipadamente e, quando uma molécula de ligação a antí- geno multiespecífica da presente invenção é adicionada, as moléculas que se dissociam através de competição podem ser detectadas. Desta forma, a molécula é útil como um agente para detecção de ligação de uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção a uma proteína alvo. Aqui, tais moléculas podem ser marcadas de forma adequada com substâncias fluorescentes ou similar. Alternativa-mente, estas moléculas são úteis para o rastreio de novos anticorpos que se ligam a epítopos que se sobrepõem com os epítopos ligados pelas moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção. Conforme descrito acima, tal molécula pode ser ligada a uma proteína alvo (GPC3 ou complexo receptor de células T) antecipadamente e, quando é adicionada um anticorpo de teste, se as moléculas ligadas dissociam, então, o anticorpo de teste é um candidato a um anticorpo que se liga a um epítopo de sobreposição com o epítopo ligado pela molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção. Isto permitirá um rastreio eficiente de novas moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas.
[0491] As combinações apresentadas como exemplos aqui como combinações de cada CDR das moléculas de ligação a antígeno multi- específicos da presente invenção podem ser usada diretamente como combinações específicas de CDR das regiões variáveis de cadeia H e cadeia L nestas moléculas. A afinidade pelo antígeno destas moléculas (valores de Kd) é, de preferência, um valor exemplificado aqui como o valor de Kd de uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção, mas não está limitada aos mesmos.
[0492] A presente invenção também se refere a ácidos nucleicos que codificam estas moléculas, vectores que compreendem os ácidos nucleicos, células que compreendem os ácidos nucleicos ou os vecto- res, métodos para a produção das moléculas através da cultura das cé-lulas e as moléculas produzidas por estes métodos.
[0493] Todas as referências do estado da técnica citados aqui são incorporadas por referência à presente descrição.
Exemplos
[0494] Aqui abaixo, a presente invenção será descrita especifica mente com referência aos Exemplos, mas não deve ser interpretada como estando limitada aos mesmos.
[Exemplo 1] Produção de GPC3_ERY22_rCE115 e Medição de Atividade Citotó- xica (1-1) Produção de GPC3_ERY22_rCE115
[0495] Uma molécula na qual um dos Fabs foi substituído por um domínio de ligação de CD3 épsilon foi produzida usando IgG contra um antígeno canceroso (GPC3) como a estrutura de base. Neste caso, a Fc de IgG usada como a estrutura de base era uma Fc silenciosa com afinidade atenuada pelo FcyR (um receptor de Fcy (Fc gama)). Um an-ticorpo anti-GPC3, H0000 (SEQ ID NO: 40)/GL4 (SEQ ID NO: 41), foi usado como o domínio de ligação à GPC3. Um anticorpo anti-CD3, rCE115H/rCE115L (SEQ ID NO: 42/SEQ ID NO: 43), foi usado como o domínio de ligação à CD3.
[0496] G1d produzida removendo Gly e Lys do C-término de IgG1 foi usado como a região constante de cadeia H de um anticorpo e esta foi usada em combinação com H0000/GL4 e rCE115H/rCE115L. Quando a região constante de cadeia H de um anticorpo foi denominada H1, a sequência que corresponde àquela da cadeia H de anticorpo trazendo H0000 na região variável foi mostrada como H0000-H1. Aqui, uma alteração de aminoácidos foi mostrada, por exemplo, como D356K. A primeira letra (correspondendo a D em D356K) é a representação do código de uma letra para o resíduo de aminoácido antes da modificação, o número que segue (correspondendo a 356 em D356K) é a posição de modificação indicada pela numeração EU e a letra final (correspondendo a K em D356K) é a representação do código de uma letra para o resíduo de aminoácido após a modificação. G1dh (SEQ ID NO:44), produzida por meio de remoção de Gly e Lys no C-término de IgG1, ERY22_Hk (SEQ ID NO: 45) produzida através da introdução de mutações L234A/L235A/Y349C/T366W em G1dh e ERY22_Hh (SEQ ID NO: 46) produzida através da introdução de mutações L234A/L235A/D356C/T366S/L368A/Y407V em G1dh foram preparadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Mutações L234A e L235A foram introduzidas nas respectivas cadeias H para atenuar a afinidade pelo FcyR (um receptor de Fcy) e as mutações Y349C/T366W e D356C/T366S/L368A/Y407V foram introduzidas para formar eficien-temente heterômeros de cada cadeia H ao produzir anticorpos hetero- diméricos que compreendem dois tipos de cadeias H.
[0497] O anticorpo heterodimérico, GPC3_ERY22_rCE115, produ zido por meio de substituição com os domínios VH e VL do Fab contra GPC3, foi preparado de acordo com o Exemplo de Referência 1 (Figura 1a).
[0498] Uma série de vetores de expressão inseridos com um poli- nucleotídeo que codifica cada um de GL4-ERY22_Hk (SEQ ID NO: 47), H0000-ERY22_L (SEQ ID NO: 48), rCE115H-ERY22_Hh (SEQ ID NO: 49) e rCE115L-K0 ( SEQ ID NO: 50) foram produzidos por meio de métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como métodos de PCR usando os iniciadores adicionados com uma sequência apropriada similar àquelas do método descrito acima.
[0499] A seguinte combinação de vetores de expressão foi introdu zida nas células FreeStyle 293-F para expressão transitória de cada mo-lécula alvo.
[0500] Molécula alvo: GPC3_ERY22_rCE115
[0501] Polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos inseridos nos vetores de expressão: GL4-ERY22_Hk, H0000-ERY22_L,rCE115H-ERY22_Hh, rCE115L-k0
(1-2) Purificação de GPC3_ERY22_rCE115
[0502] O sobrenadante de cultura obtido foi adicionado a uma co luna anti-FLAG M2 (Sigma) e, em seguida, a coluna foi lavada, seguido de eluição usando 0,1 mg/mL de um peptídeo FLAG (Sigma). As frações que contêm a molécula de interesse foram adicionadas a uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare) e, em seguida, a coluna foi lavada, seguido de eluição usando um gradiente de concentração de imidazol. As frações que contêm a molécula de interesse foram concentradas usando uma membrana de ultrafiltração, então, as frações foram adicionadas a uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) e cada uma das moléculas de interesse purificadas foi obtida coletando apenas as frações mono- méricas da solução eluída.
(1-3) Medição de atividade citotóxica de GPC3_ERY22_rCE115 usando células mononucleares de sangue periférico humanas
[0503] A atividade citotóxica in vitro de GPC3_ERY22_rCE115 foi avaliada.
(1-3-1) Preparação de uma solução de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs)
[0504] Usando uma seringa pré-carregada com 100 μL de solução de 1.000 unidades/mL de heparina (Novo Heparin para injeção, 5000 unidades, Novo Nordisk), 50 mL de sangue periférico foram coletados de cada voluntário saudável (indivíduo adulto). Este sangue periférico foi diluído duas vezes em PBS(-), dividido em quatro alíquotas e adicionado a um tubo Leucosep para separação de linfócitos (Cat. N° 227290, Greiner Bio-One) que tinha sido carregado com 15 mL de Ficoll Paque PLUS e submetido à centrifugação antecipadamente. Este tubo de separação foi centrifugado (2150 rpm, durante dez minutos em temperatura ambiente) e, então, a fração de células mononucleares foi coletada. As células da fração de células mononucleares foram lavadas uma vez com Meio de Eagle Modificado por Dulbecco que contêm FBS a 10% (fabricado pela Sigma, daqui em diante dito como FBS a 10%/D-MEM) e, então, preparadas para ter uma densidade celular de 4 x 106 célu- las/mL usando FBS a 10%/D-MEM. A suspensão de células preparada desta maneira foi usada como a solução de PBMCs humanas no experimento abaixo.
(1-3-2) Medição de atividade citotóxica
[0505] A atividade citotóxica foi avaliada pela taxa de inibição de crescimento celular usando o xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (Roche Diagnostics). A linhagem de células cancerosa humana NCI- H446 ou a linhagem de células cancerosas humana PC-10, a qual ex-pressa GPC3 humano, foi usada como a célula alvo. NCI-H446 ou PC- 10 foi liberada da placa, então, as células foram colocadas em placas de E-Plate com 96 cavidades (Roche Diagnostics) em alíquotas de 100 μL/cavidade, ajustando as células para 1 x 104 células/cavidade e a me-dição de células vivas foi iniciada usando o xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. No dia seguinte, a placa foi removida do xCELLigence RealTime Cell Analyzer e 50 μL dos respectivos anticorpos preparados em cada concentração (0,004, 0,04, 0,4, 4 ou 40 nM) foram adicionadas à placa. Após 15 minutos de reação em temperatura ambiente,50 μL da solução de PBMCs humanas preparada em (1-2) foram adicionados (2 x 105 células/cavidade) e a medição de células vivas foi iniciada colocando a placa no xCELLigence Real-Time Cell Analyzer novamente. A reação foi realizada sob as condições de 5% de gás de dióxido de carbono a 37 °C e a partir do valor índice obtido 72 horas após a adição de PBMC humano, a taxa de inibição do crescimento celular (%) foi determinada usando a equação abaixo. O valor de Índice de Células usado no cálculo era um valor normalizado, onde o valor do Índice de Células imediatamente antes da adição de anticorpo foi definido como 1.taxa de inibição de crescimento celular (%) = (A-B) x 100/(A-1)
[0506] A representa o valor médio dos valores de índice de células em cavidades sem adição de anticorpo (contendo apenas as células alvo e PBMCs humanas) e B representa o valor médio dos valores de índice de células em cada cavidade. Os experimentos foram realizados em triplicata.
[0507] Quando as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) preparadas a partir de sangue humano foram usadas como células efetoras para medir a citotoxicidade de GPC3_ERY22_rCE115, uma atividade muito forte foi observada (Figura 2).
[Exemplo 2] Humanização da cadeia H de anticorpo anti-CD3, rCE115 e compar-tilhamento de uma cadeia L em comum (2-1) Concepção de hCE115HA, a região variável de cadeia H hu-manizada de rCE115
[0508] A região variável de cadeia H do anticorpo anti-CD3 rCE115 (SEQ ID NO: 42) foi humanizada. As CDR e FR foram determinadas conforme definido por Kabat (numeração de Kabat).
[0509] Primeiro, uma sequência de FR humana foi selecionada ao comparar as sequências da região variável de anticorpo humano em uma banco de dados com a sequência da região variável de rCE115 de rato. O banco de dados IMGT (http://www.imgt.org/) e NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) foram usados para o banco de dados. A sequência da região variável de cadeia H humanizada foi con-cebida por meio de ligação da sequência de CDR da região variável de cadeia H de rCE115 com a sequência de FR humana selecionada. Isto produziu uma sequência de região variável de cadeia H humanizada, hCE115HL (SEQ ID NO: 51).
[0510] O resíduo de aminoácido na posição 93 indicada pela nume ração de Kabat é Ala na sequência de FR3 da cadeia H humana seleci-onada, mas é Arg na sequência da região variável de rCE115. Usando o banco de dados de sequências de rato e de linhagem germinativa humana (banco de dados IMGT (http://www.imgt.org/)), descobriu-se que apenas poucas sequências contêm Arg neste local. É reportado que o resíduo de aminoácido na posição 94 indicada pela numeração de Ka- bat contribui para a estabilização da estrutura do anticorpo por meio de formação de núcleo superior (Ewert et al. Methods, Outubro de 2004; 34 (2): 184-99). Com base nesta informação, uma sequência de região variável de cadeia H humanizada, na qual os resíduos de aminoácido nas posições 93 e 94 de Kabat na FR3 de cadeia H foram substituídos por aqueles resíduos presentes na sequência da região variável de rCE115, foi recentemente concebida. Esta foi a sequência da região variável de cadeia H humanizada, hCE115HA (SEQ ID NO: 52).
(2-2) Concepção da cadeia L em comum, L0000, para o anticorpo anti-CD3 rCE115 e o anticorpo anti-GPC3
[0511] Embaralhamento de FR/CDR da região variável de cadeia L de rCE115L (SEQ ID NO: 43) do anticorpo rCE115 e anti-CD3 e da região variável de cadeia L de GL4 (SEQ ID NO: 41) do anticorpo anti- GPC3 foi realizado.
[0512] A sequência de FR de GL4 foi selecionada como a sequên cia de FR da cadeia L. A cadeia L-CDR2 foi a mesma para rCE115L e GL4. A CDR1 de cadeia L foi selecionada dentre as sequências de CDR de GL4 e a CDR3 de cadeia L foi selecionada dentre as sequências de CDR de rCE115L, respectivamente. Além disso, a CDR3 de cadeia L produzida por meio de substituição do resíduo de aminoácido Asp na posição 94 de Kabat da CDR3 de cadeia L selecionada com o resíduo Val presente em GL4 foi recentemente concebida.
[0513] Uma sequência da região variável de cadeia L humanizada foi concebida ligando as FR e CDR selecionadas acima. Isto produziu uma sequência de região variável de cadeia L humanizada, L0000 (SEQ ID NO: 53).
(2-3) Avaliação da afinidade pela GPC3 humana
[0514] A atividade de ligação à GPC3 humana quando se usa GL4 (SEQ ID NO: 41) e L0000 (SEQ ID NO: 53) como as regiões variáveis de cadeia L foi avaliada. Isto foi realizado usando a forma molecular de um anticorpo com um único braço que tem um único Fab na região Fc de uma IgG1 humana heterodimerizado pela técnica de "knobs-into- hole". H0000 (SEQ ID NO: 40) foi usada para a região variável de cadeia H de anticorpo anti-GPC3.
[0515] As constantes de taxa de afinidade e ligação de um anticorpo anti-GPC3 por um antígeno foram medidas por meio do método da ci-nética em ciclos múltiplos de um ensaio de ressonância de plasmônico em superfície usando BiacoreTM -T200 (GE Healthcare Japão). HBS- EP+ (GE Healthcare Japão) foi usado para o tampão contínuo e um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare Japão) foi usado para ligar covalentemente Proteína A/G ao chip CM5 (chip revestido com carboxi- metil dextrana). Cada anticorpo anti-GPC3 foi preparado de modo que cerca de 100 RU sejam capturados pela Proteína A/G. GPC3 humana usada como o analito foi preparada a 8, 16, 32, 64 e 128 nm usando HBS-EP+. As medições foram realizadas primeiro permitindo que a Proteína A/G capture a solução anticorpo e, em seguida, injetando a solução de GPC3 humana em uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante três minutos para permitir que a reação ocorra. Então, a solução foi transferida para HBS-EP+ e a fase de dissociação foi medida durante 15 minutos. Após conclusão de medição da fase de dissociação, o chip sensor foi regenerado por meio de lavagem com Gly-HCl a 10 mM em um pH de 1,5. Medição da concentração a 0 minuto foi similarmente realizada ao permitir que a Proteína A/G capture a solução de anticorpo, realizando uma injeção de três minutos de HBS-EP+ para permitir que a reação ocorra e, em seguida, trocando para HBS-EP+ para medir a fase de dissociação durante 15 minutos. Após conclusão de medição da fase de dissociação, o chip sensor foi regenerado por meio de lavagem com Gly-HCl a 10 mM em um pH de 1,5. Um software de análise de dados exclusivamente para Biacore, T200 Biacore Evaluation Software Versão 1.0, foi usado para realizar análises de cinética para calcular a constante de taxa de ligação (ka), constante de taxa de dissociação (kd)e a proporção de constante de taxa a partir dos sensorgramas obtidos. Os resultados são mostrados na Tabela 6.Tabela 6
(2-4) Avaliação da afinidade por CD3 humana
[0516] A atividade de ligação à CD3 humana quando se usa hCE115HA (SEQ ID NO: 52) como a região variável de cadeia H e L0000 (SEQ ID NO: 53) como a região variável de cadeia L foi avaliada. Isto foi realizado usando a forma molecular de um anticorpo com um único braço que tem um único Fab na região Fc de uma IgG1 humana heterodimerizada pela técnica de "knobs-into-hole".
[0517] As constantes de taxa de afinidade e ligação de um anticorpo anti-CD3 para um antígeno foram medidas por meio do método de cinética de um único ciclo de um ensaio de ressonância de plasmônico em superfície usando BiacoreTM -T200 (GE Healthcare Japão). HBS-EP+ (GE Healthcare Japão) foi usado para o tampão contínuo e um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare Japão) foi usado para ligar co- valentemente a CD3 humana ao chip CM4 (chip revestido de carboxi- metil dextrana). O anticorpo anti-CD3 usado como o analito foi preparado a 5 e 20 μg/ml usando HBS-EP+. As medições foram realizadas injetando primeiro cada uma das soluções de anticorpo anti-CD3 a 5 e 20 μg/ml durante três minutos continuamente em uma taxa de fluxo de 20 μL/min para permitir que a reação ocorresse. Em seguida, a solução foi transferida para HBS-EP+ e a fase de dissociação foi medida durante 3 minutos. Após conclusão de medição da fase de dissociação, o chip sensor foi regenerado por meio de lavagem com Gly-HCl a 10 mM em um pH de 1,5. Medição da concentração de 0 minuto foi feita através da realização de cada uma das três injeções de HBS-EP+ duas vezes su-cessivamente para permitir que a reação ocorresse e, em seguida tro-cando para HBS-EP+ para medir a fase de dissociação durante 3 minutos. Após conclusão de medição da fase de dissociação, o chip sensor foi regenerado por meio de lavagem com Gly-HCl a 10 mM em um pH de 1,5. Um software de análise de dados exclusivamente para Biacore, T200 Biacore Evaluation Software Versão 1.0, foi usado para realizar análises de cinética para calcular a constante de taxa de ligação (ka), constante de taxa de dissociação (kd) e a proporção de constante de taxa a partir dos sensorgramas obtidos. Os resultados são mostrados na Tabela 7.Tabela 7
(2-5) Preparação de GPC3_ERY27_hCE115
[0518] A IgG4 contra um antígeno canceroso (GPC3) foi usada como a estrutura de base para produzir a molécula ERY27 (Figura 1b), em que a região variável de cadeia H de um dos Fabs foi substituída por um domínio de ligação à CD3 épsilon e a cadeia L é comum a ambos os Fabs. Neste caso, a Fc de IgG4 usada como a estrutura de base era uma Fc silenciosa com afinidade atenuada por FcyR (um receptor Fcy). H0000 (SEQ ID NO: 40) foi usada como a região variável de cadeia H do domínio de ligação à GPC3 e hCE115HA (SEQ ID NO: 52) foi usada como a região variável de cadeia H do domínio de ligação à CD3. L0000 (SEQ ID NO: 53) foi usada como a região variável de cadeia L. As mutações D356K e K439E introduzidas nas respectivas cadeias H foram introduzidas para formação eficiente de heterômero de cada cadeia H quando da produção de anticorpos heterodiméricos que compreendem dois tipos de cadeias H (documento WO2006/106905). H435R é uma modificação que interrompe a ligação à Proteína A e foi introduzida para separação eficiente do heterômero e homômero (documento WO/2011/078332).
[0519] Uma série de vetores de expressão inseridos com um poli- nucleotídeo que codifica cada um de H0000-ERY27_HK (SEQ ID NO: 54), hCE115HA-ERY27_HE (SEQ ID NO: 55) e L0000-K0 (SEQ ID NO: 56) foram produzidos por meio de métodos bem conhecidos.
[0520] A seguinte combinação de vetores de expressão foi introdu zida em células FreeStyle 293-F para expressão transitória de cada mo-lécula alvo.
[0521] Molécula alvo: GPC3_ERY27_hCE115
[0522] Polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos inseridos nos vetores de expressão: H0000-ERY27_HK, hCE115HA-ERY27_HE e L0000-K0
(2-6) Purificação de GPC3_ERY27_hCE115
[0523] Cada molécula de interesse foi purificada por meio do mé todo descrito no Exemplo 1-2.
(2-7) Medição da atividade citotóxica usando células mononuclea- res de sangue periférico humanas (2-7-1) Preparação de uma solução de célula mononuclear do sangue periférico humana (PBMC)
[0524] A solução foi preparada por meio do método descrito no Exemplo 1-3-1.
(2-7-2) Medição da atividade citotóxica
[0525] A atividade citotóxica foi medida por meio do método descrito no Exemplo 1-3-2. Quando PBMCs preparadas a partir de sangue humano foram usadas como células efetoras para medir a citotoxicidade de GPC3_ERY27_hCE115, redução da atividade foi observada como um resultado da humanização da cadeia H de rCE115 e compartilhamento de uma cadeia L em comum (Figura 2).
[Exemplo 3] Produção e Avaliação de Variantes de Anticorpos Biespecíficos Humanizados Para Aprimoramento de Várias Propriedades
[0526] A atividade citotóxica dependente de células T do anticorpo anti-cadeia CD3ε humana (CD3 épsilon) e anti-GPC3 humana humanizado biespecífico, obtido no Exemplo 2, GPC3_ERY27_hCE115 (SEQ ID NOs: 54, 55 e 56), foi menor do que a atividade citotóxica dependente de células T de GPC3_ERY22_rCE115 (SEQ ID NOs: 47, 48, 49 e 50). Isto pode ser em virtude de atenuação de afinidade pela GPC3 e cadeia CD3ε como um resultado de humanização e compartilhamento de uma cadeia L em comum. Em relação aos antígenos GPC3 e cadeia CD3ε que têm sequências independentes, não houve nenhum relato até o momento de que anticorpos biespecíficos humanizados cujas atividade ci- totóxica dependente de células T foi aumentada e cuja afinidade por ambos os antígenos foi aprimorada através do uso de uma cadeia L em comum de anticorpo G. Assim sendo, tem sido considerado difícil obter anticorpos humanizados com especificidade dupla que mostrem uma eficácia medicamentosa equivalente ou maior do que aquela de GPC3_ERY22_rCE115.
[0527] Sob tais circunstâncias, os requerentes produziram anticor pos biespecíficos humanizados modificados com afinidade modificada pela GPC3 humana e a cadeia CD3ε humana por meio de métodos co-nhecidos por aqueles versados na técnica, os quais envolvem de forma abrangente a substituição de resíduos de aminoácidos codificados pelo gene do anticorpo para produzir variantes de anticorpos para ambos os antígenos GPC3 humana e cadeia CD3ε humana e realizando diversas avaliações por meio de triagem. Além disso, métodos similares foram usados para produzir anticorpos biespecíficos humanizados modificados com propriedades físico-químicas modificadas. Além disso, através da combinação de substituições de resíduos de aminoácidos eficazes para modificar a afinidade e propriedades físico-químicas, anticorpos bi- específicos otimizados com uma atividade de TDCC equivalente ou maior do que a citotoxicidade celular dependente de células T de GPC3_ERY22_rCE115 antes de humanização foram produzidos.
[0528] A introdução de mutações pontuais, expressão e purificação de anticorpos, medições de afinidade pelo antígeno e determinação de citotoxicidade celular dependente de células T na otimização de anticor-pos biespecíficos humanizados foram realizadas através de métodos si-milares àqueles descritos nos Exemplos 1 e 2. CDR e FR foram deter-minadas de acordo com a definição de Kabat (numeração de Kabat).
[0529] Dependendo do objetivo, foram usadas como as regiões constantes de cadeia H do anticorpo (os números indicam a numeração EU): E22Hh (SEQ ID NO: 57) produzida através da introdução de mu-tações de eliminação L234A/L235A/N297A/D356C/T366S/L368A/Y407V/G446/K447 em IgG1 humana; E22Hk (SEQ ID NO: 58) produzida através da introdução de mutações de eliminação L234A/L235A/N297A/Y349C/T366W/G446/K447 e uma mutação de in-serção Ser-Ser imediatamente antes da posição 118 para IgG1 humana; G1dh produzida mediante a introdução de mutações de eliminação D356C/T366S/L368A/Y407V/G446/K447 em IgG1 humana; none-Hi- Kn010G3 produzida através da introdução de mutações de deleção 118-215 e C220S/Y349C/T366W/H435R em IgG1 humana; E2702GsKsc (SEQ ID NO: 60) produzida através da introdução de mutações de eliminação L235R/S239K/N297A/E356K/R409K/H435R/L445P/G446/K447 em IgG4 humana; E2704sEpsc (SEQ ID NO:61) produzida através da intro-dução de mutações de eliminação K196Q/L235R/S239K/N297A/R409K/K439E/L445P/G446/K447 em IgG4 humana; e E2702sKsc (SEQ ID NO: 62) produzida através da in-trodução de mutações de eliminação L235R/S239K/N297A/E356K/R409K/L445P/G446/K447 para IgG4 humana. Além disso, a cadeia K (kapa) humana k0 (SEQ ID NO: 63) e E22L (SEQ ID NO: 432) produzida através da introdução de mutações R108A/T109S na cadeia k humana foram usadas como as regiões constantes de cadeia L do anticorpo.
[0530] A mutação que substitui Cys por Asp na posição de numeração EU 356, a mutação que substitui Ser por Thy na posição de nume-ração EU 366, a mutação que substitui Ala por Leu na posição de nu-meração EU 368, a mutação que substitui Val por Tyr na posição de numeração EU 407, a mutação que substitui Cys por Tyr na posição de numeração EU 349, a mutação que substitui Trp por Tre na posição de numeração EU 366 e a mutação que insere Ser-Ser imediatamente antes da posição 118 são mutações para uma formação eficiente de moléculas heterodiméricas para cada cadeia H quando da produção de anticorpos heteroméricos. Similarmente, a mutação que substitui Lys por Glu na posição de numeração UE 356 e a mutação que substitui Glu por Lys na posição de numeração EU 439 também são mutações para uma formação eficiente de moléculas heterodiméricas para cada cadeia H quando de produção de anticorpos heteroméricos. Espera-se que elas melhorem a eficiência da produção de anticorpos biespecíficos.
[0531] A mutação que substitui Ala por Leu na posição de numeração EU 234, a mutação que substitui Ala ou Arg por Leu na posição de numeração EU 235, a mutação que substitui Lys por Ser na posição de numeração EU 239 e a mutação que substitui Ala por Asn na posição de numeração EU 297 são mutações para atenuação de afinidade para um receptor Fcy e complemento (C1q). Espera-se que elas suprimam a ligação de Fab à CD3 e a ligação cruzada mediada por Fc de um receptor Fcyou um complemento do mesmo e evitem a síndrome de liberação de citocinas que acompanha o aumento de funções efetoras não espe-cíficas.
[0532] A cadeia H introduzida com mutações de eliminação nas po sições de numeração EU 118-215 pode ser combinada com uma se-quência da cadeia H de tamanho completo para a produção de um an-ticorpo que tem apenas um Fab (anticorpo monovalente) e é útil para avaliação de afinidade.
[0533] A mutação que substitui Lys por Arg na posição de numera ção EU 409 e a mutação que substitui Arg por His na posição de nume-ração EU 435 são mutações para modificar as propriedades de anticorpos para estar próximo das propriedades da IgG1 humana e IgG3 humana, respectivamente.
(3-1) Modificação da afinidade de um anticorpo anti-CD3 humanizado através de mutações pontuais
[0534] Primeiro, mutações pontuais foram introduzidas em FR1, FR2, FR3, CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência do anticorpo anti-cadeia CD3ε humana humanizado e produzido no Exemplo 2, hCE115HA- ERY27_HE (SEQ ID NO: 55) para preparar anticorpos modificados. Em seguida, determinou-se a afinidade destes anticorpos modificados pela cadeia CD3ε humana solúvel. Combinação de sítios que têm efeito de aumento da afinidade forneceu anticorpos modificados que têm as afi-nidades mostradas na Tabela 8.Tabela 8
(3-2) Modificação da afinidade de um anticorpo anti-GPC3 humani- zado
[0535] Primeiro, mutações pontuais foram introduzidas em CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência do anticorpo anti-GPC3 humana biespecí- fico produzido no Exemplo 2, H0000-ERY27_HK (SEQ ID NO: 54) para preparar anticorpos modificados. Em seguida, determinou-se a afinidade deste anticorpo modificado pela GPC3 humana solúvel. Combinação de sítios que têm efeito de aumento da afinidade forneceram anticorpos modificados que têm as afinidades mostradas na Tabela 9.Tabela 9
(3-3) Modificação de pI por mutações pontuais
[0536] Na produção comercial de anticorpos biespecíficos, um elevado nível de pureza é necessário. Quando se usa cromatografia de permuta iônica, foi reportado que modificação do ponto isoelétrico mo-lecular (pI) é eficaz (PLoS One 2013; 8 (2): e57479). Portanto, mutações pontuais para modificações do pI foram introduzidos em CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência do anticorpo anti-GPC3 humana humanizado pro-duzido no Exemplo 2, H0000-ERY27_HK (SEQ ID NO: 54), para preparar anticorpos modificados. Em seguida, determinou-se a afinidade destes anticorpos modificados pela GPC3 humana solúvel.
[0537] Como um resultado, descobriu-se que as modificações de aminoácidos que podem diminuir o pI ao mesmo tempo em que mantém a afinidade pela GPC3 humana são os aminoácidos nas posições 19, 43, 53 e 61 de acordo com a numeração de Kabat.
[0538] A combinação dos sítios que mostram os efeitos de manter a afinidade pela GPC3 humana e reduzir o pI forneceu anticorpos com afinidades e os valores de pI mostrados na Tabela 10.Tabela 10
(3-4) Modificação da capacidade de ligação à matriz extracelular por mutação pontual
[0539] Foi reportado que a ligação não especifica à matriz extrace-lular (ECM) pode ter efeitos sobre a farmacocinética (MAbs, Nov-Dez de 2012; 4 (6): 753-60). Portanto, a capacidade de ligação à ECM dos anticorpos modificados obtidos nos Exemplos foi determinada por meio do método descrito no Exemplo de Referência 4. Como um resultado, foi confirmado que o anticorpo biespecífico anti-GPC3 humana e anti- cadeia CD3ε humana humanizado, GPC3_ERY27_hCE115 (SEQ ID NOs : 54, 55 e 56) tem altas habilidades de ligação à ECM. Portanto, qualquer uma das mutações pontuais examinadas nos Exemplos 3-1, 3-2 e 3-3 para a sequência do anticorpo anti-CD3ε humana humanizado hCE115HA-ERY27_HE (SEQ ID NO: 55) foi investigada como sendo uma combinação para redução da capacidade de ligação à ECM. Como um resultado, descobriu-se os aminoácidos nas posições 11, 16, 52a, 53, 98 e 100 pela numeração de Kabat contribuem para a manutenção de afinidade por CD3ε e têm influência sobre a redução da capacidade de ligação à ECM e os anticorpos com uma capacidade de ligação reduzida à ECM em comparação com aquela de uma variante de anticorpo do anticorpo biespecífico anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana humanizado, GPC3_ERY27_hCE115, foram obtidos (Tabela 11).Tabela 11
(3-5) Modificação da capacidade de ligação ao ligante SuReTM por mutações pontuais
[0540] Um exemplo onde a ligação de um anticorpo à Proteína A depende de sua sequência de região variável (VH3) é conhecido (J Bi-omol Tech. Julho de 2011; 22(2): 50-2). Na purificação em Proteína A do anticorpo biespecífico anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana humanizado, a remoção do anticorpo anti-CD3 homomérico é importante para a supressão de reações não específicas através de CD3. Portanto, considera-se desejável suprimir a ligação do anticorpo anti- CD3 homomérico à Proteína A. Presumivelmente, o ligante SuReTM será usado em produção comercial e, assim, mutações pontuais para ligação ao ligante SuReTM foram introduzidas na CDR2 das variantes de cadeia H do anticorpo anti-CD3 humanizado, TR01H082-E2702GsKsc e TR01H084-E2702GsKsc (SEQ ID NO: 398 e 399) para preparar anticorpos modificados. A capacidade de ligação destes anticorpos modificados ao ligante SuReTM foi determinada por meio do método descrito no Exemplo de Referência 5. Como um resultado, descobriu-se que os aminoácidos nas posições 19, 57 e 59 pela numeração de Kabat contri-buem para a manutenção da afinidade por CD3ε e têm influência sobre a capacidade de ligação ao ligante SuReTM e anticorpos com uma ca-pacidade reduzida de ligação ao ligante SuReTM em comparação com aquela de TR01H082-E2702GsKsc/L0011-K0 (SEQ ID NOs: 398 e 410) ou TR01H084- E2702GsKsc/L0011-K0 (SEQ ID NOs: 399 e 410) foram obtidos (Tabela 12).Tabela 12
(3-6) Produção de anticorpos biespecíficos otimizados através da combinação de mutações pontuais que levam a um aprimoramento de diversas propriedades
[0541] Os anticorpos modificados otimizados podem ser produzidos através de combinação de mutações pontuais que levam a um aprimo-ramento de diversas propriedades, conforme descrito nos Exemplos 31 a 3-5. Como exemplos de tais anticorpos modificados, os anticorpos descritos na Tabela 13 foram produzidos e foram submetidas à avaliação de citotoxicidade celular dependente de células T (TDCC) usando métodos similares àqueles do Exemplo 1. Os resultados são mostrados nas Figuras 4 a 9. Como um resultado, anticorpos biespecíficos anti- GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados que mostram uma citotoxicidade celular dependente de células T equivalente ou maior do que aquela de GPC3_ERY22_rCE115 antes de humanização foram obtidos.Tabela 13
[0542] Os Exemplos 3-1 a 3-6 mostraram que os resíduos de ami- noácidos a seguir, por exemplo, são importantes para manutenção das propriedades dos anticorpos biespecíficos anti-GPC3 humana e anti-ca-deia CD3ε humana otimizados que mostram uma citotoxicidade celular dependente de células T otimizada equivalente ou maior do que aquela de GPC3_ERY22_rCE115 antes de humanização.
[0543] Em anticorpos anti-cadeia CD3ε humana, os exemplos são Leu na posição 11, Gly na posição 16, Asp na posição 52a, Gln na po-sição 53, Ala na posição 72, Ile na posição 78, Ala na posição 98, Gly na posição 100 e Ile na posição 102. Em anticorpos anti-GPC3 humana, os exemplos são Thr na posição 19, Glu na posição 43, Gly na posição 52a, Pro ou Glu na posição 53, Pro na posição 55 e Glu na posição 61. Além disso, em cadeias L em comum de anticorpo, os exemplos são Pro na posição 25, Pro na posição 27a, Pro na posição 27b, Ile na posição 33, Gln na posição 34, Arg ou Trp na posição 56 e Tyr na posição 89 (todas as posições são indicadas pela numeração de Kabat).
[Exemplo 4] Avaliação da Eficácia In Vivo
[0544] Alguns dos anticorpos descritos acima foram avaliados quanto à sua eficácia in vivo usando modelos portadores de tumor.
[0545] A avaliação de eficácia in vivo foi realizada em anticorpos re presentativos dentre aqueles apresentados na Tabela 13, os quais foram confirmados como tendo atividades citotóxicas no ensaio in vitro descrito no Exemplo 3-6. No avaliação de eficácia in vivo, qualquer influência causada por diferenças no microambiente do tumor em virtude da formação de agregados sobre os resultados da avaliação foi levado em consideração. Portanto, dois tipos de linhagens de células cancerosas humanas que têm diferentes sensibilidades à eficácia do anticorpo medicamentoso, isto é, PC-10 e NCI-H446, foram usadas para a avali-ação, embora os níveis de expressão de GPC3 destas linhagens de cé-lulas fossem praticamente iguais. As linhagens de células foram trans-plantadas para os camundongos NOD SCID e os camundongos NOD SCID com formação de tumor confirmada foram submetidos a transplante de células T cultivadas por meio de cultura in vitro de PBMCs humanas. Os camundongos (ditos como um modelo com injeção de células T) foram tratados por meio de administração dos anticorpos bies- pecíficos anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados.
[0546] Mais especificamente, nos testes de eficácia de recombi- nante dos anticorpos biespecíficos anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados usando o modelo com injeção de células T PC-10, foram realizados os testes abaixo. As células T foram expansivamente cultivadas usando PBMCs separadas do sangue coletadas de voluntários saudáveis e o kit de ativação/expansão de células T humanas (MACS Miltenyi Biotec). A linhagem de células de câncer humano PC-10 (1 x 107 células) foi misturada com MatrigelTM Basement Membrane Matrix (BD) e transplantadas para a região inguinal subcutânea de camundongos NOD SCID (CLEA Japan, fêmeas, 6 semanas). O dia do transplante foi definido como o dia 0. No dia antes do transplante, o anticorpo anti-asialo GM1 (Wak0 Pure Chemicals) foi administrado por via intraperitoneal aos camundongos a 0,2 mg/camundongo. Nos dias 13 a 15 após o transplante, os camundongos foram separados em grupos de acordo com seu peso corporal e tamanho do tumor e o anticorpo anti-asialo GM1 foi novamente administrado por via intraperitoneal aos camundongos a 0,2 mg/camundongo. No dia seguinte, as células T ob-tidas pela cultura expansiva mencionada foram transplantadas intrape- ritonealmente a 3 x 107 células/camundongo. Quatro horas após o trans-plante de células T, os anticorpos biespecíficos anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados foram administrados por via intravenosa através da veia da cauda a 1 mg/kg. Os anticorpos biespecíficos anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados foram admi-nistrados apenas uma vez.
[0547] Como um resultado, atividades antitumor foram mais clara mente observadas no grupo administrado com anticorpo biespecífico anti-GPC3 humana e anti-cadeia de CD3ε otimizado do que no grupo administrado com solvente (Figuras 10a, b).
[0548] Testes de eficácia de fármaco com os anticorpos biespecífi- cos anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados sobre o modelo com injeção de células T NCI-H446 foram realizados através de métodos similares. Os anticorpos biespecíficos anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados foram administrados uma vez por via intravenosa através da veia da cauda a 5 mg/kg contra NCI-H446.
[0549] Como um resultado, as atividades antitumores foram mais claramente observadas no grupo administrado com anticorpos biespe- cíficos anti-GPC3 humana e anti-cadeia CD3ε humana otimizados do que no grupo administrado com solvente (Figuras 11a, b).
Exemplos de Referência [Exemplo de Referência 1] Produção de Vetores de Expressão de Anticorpo e Expressão e Pu-rificação de Anticorpo
[0550] Substituições de aminoácidos foram introduzidas através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, tal como usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), PCR ou o kit de clonagem In-fusion Advantage PCR (Takara) para construir vetores de expressão. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão obtidos foram determinadas por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica. Os plasmídeos foram transitoriamente in-troduzidos em células da linhagem de células derivada de câncer de rim embrionário humano HEK293H (Invitrogen) ou FreeStyle293 (Invitro- gen) para expressar anticorpos. A partir dos sobrenadantes de cultura obtidos, os anticorpos foram purificados usando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare) por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica. A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpos purificados foi medida usando um espectrofotômetro e as concentrações de anticorpos foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de absorção calculado por meio do método de PACE (Protein Science, 1995; 4: 2411-2423).
[Exemplo de Referência 2] Atividade de ADCC de Cada Anticorpo de Teste Usando Células Mononucleares de Sangue Periférico Humano Como a Célula Efe- tora
[0551] A atividade de ADCC de cada anticorpo de teste foi determi nada de acordo com o método abaixo.
[0552] Células mononucleares de sangue periférico humano (daqui em diante ditas como PBMCs humanas) foram usadas como a célula efetora para medir a atividade de ADCC de cada anticorpo de teste conforme abaixo.
(1) Preparação de uma Solução de PBMCs Humanas
[0553] A partir de um voluntário saudável (adulto masculino) da Chugai Pharmaceutical Co. Ltda., 50 mL de sangue periférico foram ob-tidos usando uma seringa pré-carregada com 200 μL de uma solução de heparina a 1000 unidades/mL (Novo Heparin-Injecção 5000 unidades, Novo Nordisk). O sangue periférico foi diluído duas vezes com PBS (-), dividido em quatro alíquotas e adicionado a um tubo de separação de linfócitos Leucosep (Greiner Bio-One) que tinha sido carregado com 15 mL de Ficoll-Paque PLUS e submetido à centrifugação antecipadamente. Este tubo de separação que contêm alíquotas de sangue periférico foi centrifugado a 2150 rpm durante dez minutos em temperatura ambiente e, em seguida, a fração de células mononucleares foi coletada. As células em cada fração foram lavadas uma vez com Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (SIGMA) que contêm FBS a 10% (daqui em diante dito como FBS a 10%/D-MEM) e, então, suspensas em FBS a 10%/D-MEM em uma densidade celular de 5 x 106 células/ml. Após incubação em uma incubadora a 37 °C durante uma hora, as células foram lavadas uma vez com FBS a 10%/D-MEM e as células foram suspensas em FBS a 10%/D-MEM para produzir uma densidade celular de 2 x 105 células/mL. A suspensão de células foi submetida ao experimento a seguir como a célula alvo.
(2) Ensaio de Liberação de Cromo (Atividade de ADCC)
[0554] A atividade de ADCC foi avaliada a partir da taxa de liberação específica de cromo de acordo com o método de liberação de cromo. Primeiro, as soluções de anticorpos preparadas para cada concentração de (0, 0,004, 0,04, 0,4, 4 e 40 μg/mL) foram adicionadas a uma placa de fundo em U com 96 cavidades a 50 μL por cavidade. Em seguida, as células alvo foram semeadas a 50 μL por cavidade (1 x 104 cé- lulas/cavidade) e esta foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de PBMC humana preparada em (1) foi adicionada a 100 μL por cavidade (5 x 105 células/cavidade) e a placa foi deixada em repouso em um incubador de gás dióxido de carbono a 5% a 37 °C durante quatro horas, seguido por centrifugação. A radioatividade de 100 μL de sobrenadante de cultura em cada cavidade da placa foi medida usando um contador gama. A taxa de liberação específica de cromo foi determinada com base na seguinte equação: taxa de liberação de específica de cromo (%) = (A-C) x 100/(B-C)
[0555] Nesta equação, A representa o valor médio da radioatividade (cpm) de 100 μL de sobrenadante de cultura em cada cavidade; B re-presenta o valor médio da radioatividade (cpm) de 100 μL de sobrena- dante de cultura na cavidade, onde 100 μL de uma solução aquosa de NP-40 a 2% (Nonidet P-40, Nacalai Tesque) e 50 μL de FBS a 10%/D- MEM tinha sido adicionada às células alvo; e C representa o valor médio da radioatividade (cpm) de 100 μL de sobrenadante de cultura na cavidade, onde 150 μL de FBS a 10%/MEM-D tinha sido adicionada às células alvo. Os experimentos foram realizados em triplicata e os valores médios e os desvios padrão das taxas de liberação específica de cromo (%) no experimento mencionado acima reflete a atividade de ADCC foram calculados para cada um dos anticorpos de teste.
[Exemplo de Referência 3] Avaliação da Tm dos Anticorpos Modificados Por Meio de Fluorime- tria de Varredura Diferencial
[0556] Neste experimento, o valor de Tm (temperatura de desnatu ração térmica) dos anticorpos modificados foi avaliada por meio de flu- orimetria de varredura diferencial usando Rotor Gene-Q (QIAGEN). Foi reportado que este método tem uma correlação com a avaliação favorável da Tm usando um calorímetro de varredura diferencial amplamente conhecido como um método para avaliar a estabilidade térmica dos an-ticorpos (Journal of Pharmaceutical Science 2010; 4: 1707-1720).
[0557] SYPROTM Orange concentrado 5000X (Molecular Probes) foi diluído com PBS (Sigma) e depois misturado com as soluções de anti-corpo para preparar amostras de medição. Alíquotas de 20 μL de cada amostra foram colocadas em tubos de medição e a temperatura foi au-mentada de 30 °C para 99 °C em uma velocidade de elevação da tem-peratura de 240 °C/h. Alterações na fluorescência que acompanham a elevação de temperatura foram detectadas a 470 nm (comprimento de onda de excitação)/555 nm (comprimento de onda de fluorescência).
[0558] Os dados foram analisados usando o software Rotor Gene Q Series (QIAGEN) para calcular a temperatura na qual foi observada a transição de fluorescência esta temperatura foi definida como a Tm.
[Exemplo de Referência 4] Avaliação da Capacidade de Ligação a ECM
[0559] A avaliação foi realizada de acordo com o método descrito no documento WO2012093704. Especificamente, BD Matrigel (BD Biosciences, #356237) foi preparada a 2 mg/mL usando TBS (Takara, #T903) e esta foi distribuída em uma placa de medição com 96 cavidades (Meso Scale Discovery #L15XB-3 (alta Bind)) em 5 μL por cavidade e depois foi deixada repousar durante a noite em um local fresco. Em seguida, 150 μL de um tampão de bloqueio de ECL (PBS que contêm Tween 20 a 0,05%, BSA a 0,5% e azida de sódio a 0,01%) foram distri-buídos por cada cavidade da placa e esta foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante duas horas ou mais.
[0560] Um anticorpo de cabra anti-IgG(y) humana (Invitrogen, #628400) foi marcado com rutênio com MSD sulfo-NHS Éster TAG (Meso Scale Discovery #R91AN-2) seguindo as instruções anexas. Este foi diluído em um tampão de diluição de ECL (PBS que contêm Tween 20 a 0,01%, BSA a 0,1% e azida de sódio a 0,01%) para ter uma concentração final de 2 μg/mL. Além disso, o anticorpo padrão e os anticorpos de teste foram diluídos em PBS-T (PBS que contêm Tween 20 a 0,05% e azida de sódio a 0,01%) para ter uma concentração final de 3 μg/mL.
[0561] A uma placa de reação com 96 cavidades (Thermo Scientific, Nunc #145399), 10 μL do tampão de diluição de ECL, 20 μL do anticorpo padrão e anticorpo de teste (3 μg/mL) e 30 μL do anticorpo marcado com rutênio (2 μg/mL) foram adicionados sequencialmente e esta foi deixada reagir durante uma hora em temperatura ambiente com agitação no escuro.
[0562] O tampão de bloqueio de ECL foi removido da placa de me dição com 96 cavidades por meio de inclinação, 50 μL da solução de amostra da placa de reação com 96 cavidades foram adicionados e esta foi deixada em repouso no escuro em temperatura ambiente durante uma hora. Isto foi seguido por remoção da solução de amostra da placa de medição com 96 cavidades por meio de inclinação e, imediatamente após a adição de 150 μL de 2X tampão T (4x MSD Read Buffer T (Meso Scale Discovery), diluído duas vezes usando o tampão de diluição de ECL), foram tomadas medições de ECL. O SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery) foi usado para fazer as medições.
[0563] As análises foram realizadas dividindo-se a intensidade de fluorescência do anticorpo de teste pela intensidade de fluorescência do anticorpo padrão para calcular e comparar as intensidades ao definir o valor para o anticorpo padrão como 1.
[Exemplo de Referência 5] Avaliação da Capacidade de Ligação ao Ligante SuReTM
[0564] A capacidade de se ligar ao ligante SuReTM foi avaliada usando BiacoreTM-T200 (GE Healthcare Japão). HBS-EP+ (GE Healthcare Japão) foi usado para o tampão contínuo e um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare Japão) foi usado para ligar covalente- mente o Ligante Mab Select SuReTM (GE Healthcare Japão) ao chip CM5 (chip revestido de carboximetil dextrana). O anticorpo usado como o analito foi preparado a 5 μg/mL usando HBS-EP+. As medições foram realizadas injetando primeiro a solução de anticorpo a 5 μg/mL em uma taxa de fluxo de 10 μL/min durante 3 minutos e, então, trocando para HBS-EP+ e medindo a resposta (RU) após permitir que o fluxo continue durante 0,5 minutos. Após conclusão das medições, o chip sensor foi regenerado por meio de lavagem com Gly-HCl a 10 mM em um pH de 1,5. Para a célula de fluxo de controle, um experimento similar foi realizado sem ligação covalente do ligante ao chip e a afinidade pelo ligante SuReTM foi analisada com base na diferença entre as respostas (RU).
[0565] As sequências correspondentes às SEQ ID NOs mencionadas aqui são mostradas na Tabela abaixo.TABELA 14
Aplicabilidade Industrial
[0566] A presente invenção fornece novas moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas que mantêm a forte atividade antitumor pos-suída pelo BiTE e a excelente propriedade de segurança de não induzir a uma "explosão" de citocinas ou similar independentemente do antí- geno canceroso e também têm meia-vidas longas no sangue. Agentes indutores de citotoxicidade que compreendem uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção como um ingrediente ativo podem ter como alvo células que expressam glipicana 3 e tecidos tumorais que contêm estas células e induzir à lesão celular. A administração de uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente invenção a pacientes torna possível obter um tratamento desejável que não apenas tem um elevado nível de segurança, mas também uma carga física re-duzida e é altamente conveniente.

Claims (6)

1. Uso de um anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição farmacêutica para ativar a atividade citotóxica, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico de qualquer um a partir de (a1) a (a6) abaixo: (a1) um anticorpo biespecífico que tem uma primeira cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e uma região constante como mostrado pela sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 61; uma segunda cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 e uma região constante como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; e duas cadeias leves de anticorpo idênticas que compreendem uma região variável de cadeia leve de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (a2) um anticorpo biespecífico que tem uma primeira cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante como mostrado pela sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 61; uma segunda cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 e uma região constante como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; e duas cadeias leves de anticorpo idênticas que compreendem uma região variável de cadeia leve de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (a3) um anticorpo biespecífico que tem uma primeira cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante como mostrado pela sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 61; uma segunda cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 e uma região constante como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; e duas cadeias leves de anticorpo idênticas que compreendem uma região variável de cadeia leve de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (a4) um anticorpo biespecífico que tem uma primeira cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante como mostrado pela sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 61; uma segunda cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 e uma região constante como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; e duas cadeias leves de anticorpo idênticas que compreendem uma região variável de cadeia leve de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (a5) um anticorpo biespecífico que tem uma primeira cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e uma região constante como mostrado pela sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 61; uma segunda cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 e uma região constante como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e duas cadeias leves de anticorpo idênticas que compreendem uma região variável de cadeia leve de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; e (a6) um anticorpo biespecífico que tem uma primeira cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e uma região constante como mostrado pela sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 61; uma segunda cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 e uma região constante como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; e duas cadeias leves de anticorpo idênticas que compreendem uma região variável de cadeia leve de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; em que a região variável de cadeia pesada compreendida na primeira cadeia pesada de anticorpo e a região variável de cadeia leve compreendida em uma cadeia leve forma uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3, a região variável de cadeia pesada compreendida na segunda cadeia pesada de anticorpo e a região variável de cadeia leve compreendida em outra cadeia leve forma uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que nas duas cadeias leves idênticas do anticorpo biespecífico compreende adicionalmente uma região constante de cadeia leve como mostrado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO:63.
3. Uso de anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição farmacêutica para ativar a atividade citotóxica, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo bi- específico que compreende uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 e uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T, em que a região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 e a região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T são regiões variáveis de anticorpos compreendendo quaisquer combinações de cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 e de cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir de (b1) a (b5) abaixo: (b1) cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 211; cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em uma região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223; cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequências de ami- noácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 142, cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223; (b2) cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206; cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em uma região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223; cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às se-quências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 com-preendidas na SEQ ID NO: 142, cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de li-gação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequên-cias de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na SEQ ID NO: 223; (b3) cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206; cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em uma região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na SEQ ID NO: 223; cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 164, cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223; (b4) cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 206; cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em uma região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223; cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às se-quências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 com-preendidas em SEQ ID NO: 168, cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de li-gação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequên-cias de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223; (b5) cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 211; cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em uma região variável do anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3 que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223; cadeias pesadas CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 164, cadeias leves CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas na região variável do anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T que são idênticas às sequências de aminoácidos das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendidas em SEQ ID NO: 223.
4. Uso de um anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição farmacêutica para ativar a atividade citotóxica, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico de qualquer um a partir de (c1) a (c6) abaixo: (c1) anticorpo biespecífico que tem uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211; uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 142; e duas regiões variáveis de cadeias leve de anticorpo idênticas como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (c2) anticorpo biespecífico que tem uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 142; e duas regiões variáveis de cadeias leve de anticorpo idênticas como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (c3) anticorpo biespecífico que tem uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 164; e duas regiões variáveis de cadeias leve de anticorpo idênticas como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (c4) anticorpo biespecífico que tem uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 168; e duas regiões variáveis de cadeias leve de anticorpo idênticas como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (c5) anticorpo biespecífico que tem uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211; uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo como mostrado pela sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 164; e duas regiões variáveis de cadeias leve de anticorpo idênticas como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; em que a primeira região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve formam uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação à glipicana 3, a segunda região variável de cadeia pesada e outra região variável de cadeia leve formam uma região variável de anticorpo que tem atividade de ligação ao complexo receptor de células T.
5. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende adicionalmente uma região Fc heterodimérica com atividade de ligação reduzida ao receptor Fcy.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a região Fc heterodimérica está em combinação com as sequências de aminoácidos de (d1) abaixo: (d1) uma cominação de uma sequência de aminoácidos idêntica à região Fc de uma região constante como mostrado pela se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO:60 ou 62, e uma sequência de aminoácidos idêntica à região Fc de uma região constante como mostrado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61.
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