BR112013027514B1 - Composição compreendendo nanotransportadores sintéticos tolerogênicos, sua forma de dosagem e seu uso - Google Patents

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Roberto A. Maldonado
Christopher Fraser
Takashi Kei Kishimoto
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Selecta Biosciences, Inc.
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Abstract

composição compreendendo nanotrans- portadores sintéticos tolerogênicos, sua forma de dosagem, seu processo, bem como seu uso. a invenção refere-se a composições de nanotransportadores sintéticos, e métodos relacionados, compreendendo epitopos restritos a mhc de classe i e/ou restritos a mhc de classe ii associados a respostas de células t cd8+ indesejadas e imunossupressores que provêm respostas imunológicas tolerogênicas contra antígenos que compreendemos epitopos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefíciosob 35 U.S.C. §119, do Pedido de Patente Provisória US No. 61/480.946, registrado em 29 de abril de 2011, 61/513.514, registrado em 29 de julho de 2011, 61/531.147, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.153, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.164, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.168, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.175, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.180, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.194, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.204, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.209, registrado em 6 de setembro de 2011, 61/531.215, registrado em 6 de setembro de 2011, cujos conteúdos são incorporados na sua totalidade neste documento a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] Essa invenção refere-se a composições de nanotransportadores sintéticos com epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada e imunossupressores, e métodos relacionados. As composições e métodos permitem uma captação eficiente por APCs para deslocar a resposta imunológica no sentido de favorecer a redução do desenvolvimento de respostas imunológicas de células T CD8+ indesejadas específicas para os antígenos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] Células T CD8+ estão envolvidas em respostas imunológicas a antígenos. Reduzir o seu número e/ou função pode melhorar respostas imunológicas indesejadas. Todavia, fazê-lo com fármacos imunossupressores convencionais, que são de largo espectro, pode não ser desejável. Adicionalmente, para manter a imunos- supressão, a terapia com fármacos imunossupressores é geralmente um programa para toda a vida. Infelizmente, a utilização de imunossupressores de largo espectro está associada a um ris- para toda a vida. Infelizmente, a utilização de imunossupressores de largo espectro está associada a um risco de efeitos secundários graves, tais como tumores, infecções, nefrotoxicidade e distúrbios metabólicos. De acordo com esse fato, novas terapias imunossupressoras seriam benéficas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] Em um aspecto, é provida uma composição que compreende (i) uma primeira população de nanotransportadores sintéticos acoplados a imunossupressores, e (ii) uma segunda população de nanotransportadores sintéticos acoplados a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada (por exemplo, proliferação e/ou atividade de células T CD8+ específicas para antígenos). Em uma modalidade, a primeira população e a segunda população são a mesma população. Em outra modalidade, a primeira população e a segunda população são populações diferentes.
[0005] Em outra modalidade, a segunda população de nanotransportadores sintéticos também está acoplada a epitopos restritos a MHC de Classe II e/ou epitopos de células B. Em outras modalidades, a segunda população de nanotransportadores sintéticos também está acoplada a epitopos restritos a MHC de Classe II e compreende substancialmente nenhuns epitopos de células B. Em outras modalidades, a segunda população de nanotransportadores sintéticos compreende substancial-mente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II e substancialmente nenhuns epitopos de células B.
[0006] Em uma modalidade, a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada consiste em proliferação e/ou atividade de células T CD8+ (por exemplo, atividade de morte de células, produção de citocinas, etc.). Em outra modalidade, a composição reduz a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada ao antígeno quando administrada a um sujeito. Em outra modalidade, a composição está em uma quantidade eficaz para reduzir a resposta de células T CD8+ indesejada ao antígeno quando administrada a um sujeito.
[0007] Em outra modalidade, os imunossupressores compreendem uma estatina, um inibidor de mTOR, um agente de sinalização de TGF-β, um corticosteroide, um inibidor da função mitocondrial, um inibidor de P38, um inibidor de NF-Kβ, um agonista de receptores de adenosina, um agonista de prostaglandina E2, um inibidor da fosfodiesterase 4, um inibidor de HDAC ou um inibidor de proteassomos. Em outra modalidade, o inibidor de mTOR é rapamicina ou um análogo da rapamicina.
[0008] Em outra modalidade, um antígeno que compreende os epitopos acima mencionados é acoplado aos nanotransportadores sintéticos. Em outra modalidade, uma porção do antígeno que compreende os epitopos acima mencionados é acoplada aos nanotransportadores sintéticos. Ainda em outra modalidade, a porção do antígeno acoplada aos nanotransportadores sintéticos pode ser o epitopo isoladamente.
[0009] Em outra modalidade, o antígeno é um alergênio, autoantígeno ou proteína terapêutica, ou está associado a uma doença inflamatória, uma doença autoimune, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Em outra modalidade, o antígeno é uma proteína terapêutica, ou sua porção, ou é obtido ou derivado de um enxerto transplantável.
[00010] Em outra modalidade, a carga dos imunossupressores e/ou epitopos em média ao longo da primeira e/ou segunda populações de nanotransportadores sintéticos está situada entre 0,0001% e 50%. Em outra modalidade, a carga dos imunossupressores e/ou epitopos em média ao longo da primeira e/ou segunda populações de nanotransportadores sintéticos está situada entre 0,1% e 10%.
[00011] Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopartículas lipídicas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsões à base de tensoativos, dendrímeros, futebolenos, nanofios, partículas do tipo vírus ou partículas peptídicas ou proteicas. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopartículas lipídicas. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem lipossomos. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopartículas metálicas. Em outra modalidade, as nanopartículas metálicas compre-endemnanopartículas de ouro. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopartículas poliméricas. Em outra modalidade, a nanopartícula polimérica compreende um polímero que não é polímero Pluronic com terminação metóxi. Em outra modalidade, as nanopartículas poliméricas compreendem um poliéster, um poliéster acoplado a um poliéter, poliaminoácido, policarbonato, poliacetal, policetal, polissaca- rídeo, polietiloxazolina ou polietilenoimina. Em outra modalidade, o poliéster compreende um poli(ácido lático), poli(ácido glicólico), poli(ácido lático-co-glicólico) ou policaprolactona. Em outra modalidade, as nanopartículas poliméricas compreendem um poliéster e um poliéster acoplado a um poliéter. Em outra modalidade, o poliéter compreende polietileno glicol ou polipropileno glicol.
[00012] Em outra modalidade, a média de uma distribuição da dimensão das partículas, obtida usando dispersão dinâmica da luz, dos nanotransportadores sintéticos da primeira e/ou segunda populações é um diâmetro maior do que 100 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 150 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 200 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 250 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 300 nm. Em outra modalidade, a razão de aspecto dos nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população é maior do que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 ou 1:10.
[00013] Em outra modalidade, a composição também compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00014] Em outro aspecto, é proporcionada uma forma de dosagem compreendendo qualquer uma das composições proporcionadas aqui.
[00015] Em outro aspecto, é proporcionado um método que compreende administrar qualquer uma das composições ou formas de dosagem a um sujeito, como um sujeito necessitado de tolerização antígeno-específica. Em outra modalidade, uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada a um antígeno é reduzida no sujeito.
[00016] Em outro aspecto, é proporcionado um método que compreende administrar a um sujeito uma composição que compreende (i) uma primeira população de nanotransportadores sintéticos acoplados a imunossupressores, e (ii) uma segunda população de nanotransportadores sintéticos acoplados a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada, em que a composição está em uma quantidade eficaz para reduzir a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada ao antígeno no sujeito. Em outro aspecto, é proporcionado um método que compreende reduzir uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada a um antígeno em um sujeito por administração de uma composição que compreende (i) uma primeira população de nanotransportadores sintéticos acoplados a imunossupressores, e (ii) uma segunda população de nanotransportadores sintéticos acoplados a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II do antígeno. Em outro aspecto, é proporcionado um método que compreende administrar uma composição a um sujeito de acordo com um protocolo que previamente foi mostrado que reduz uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada a um antígeno em um ou mais sujeitos de teste; em que a composição compreende (i) uma primeira população de nanotransportadores sintéticos acoplados a imunossupressores, e (ii) uma segunda população de nanotransportadores sintéticos acoplados a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II do antígeno. Em uma modalidade, a primeira população e a segunda população são a mesma população. Em outra modalidade, a primeira população e a segunda população são populações diferentes.
[00017] Em outra modalidade, o método também compreende proporcionar ou identificar o sujeito.
[00018] Em outra modalidade, a segunda população de nanotransportadores sintéticos também está acoplada a epitopos restritos a MHC de Classe II e/ou epitopos de células B. Em outras modalidades, a segunda população de nanotransportadores sintéticos também está acoplada a epitopos restritos a MHC de Classe II e compreende substancialmente nenhuns epitopos de células B. Em outras modalidades, a segunda população de nanotransportadores sintéticos compreende substancial-mente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II e substancialmente nenhuns epitopos de células B.
[00019] Em uma modalidade, a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada consiste em proliferação e/ou atividade de células T CD8+ (por exemplo, atividade de morte de células, produção de citocinas, etc.). Em outra modalidade, a composição reduz a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada ao antígeno quando administrada a um sujeito. Em outra modalidade, a composição está em uma quantidade eficaz para reduzir a resposta de células T CD8+ indesejada ao antígeno quando administrada a um sujeito. Em uma modalidade, a composição está em uma quantidade eficaz para reduzir uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada ao antígeno no sujeito.
[00020] Em outra modalidade, os imunossupressores compreendem uma estatina, um inibidor de mTOR, um agente de sinalização de TGF-β, um corticosteroide, um inibidor da função mitocondrial, um inibidor de P38, um inibidor de NF-Kβ, um agonista de receptores de adenosina, um agonista de prostaglandina E2, um inibidor da fosfodiesterase 4, um inibidor de HDAC ou um inibidor de proteassomos. Em outra modalidade, o inibidor de mTOR é rapamicina ou um análogo da rapamicina.
[00021] Em outra modalidade, um antígeno que compreende os epitopos acima mencionados é acoplado aos nanotransportadores sintéticos. Em outra modalidade, uma porção do antígeno que compreende os epitopos acima mencionados é acoplada aos nanotransportadores sintéticos. Ainda em outra modalidade, a porção do antígeno acoplada aos nanotransportadores sintéticos pode ser o epitopo isoladamente.
[00022] Em outra modalidade, o antígeno é um alergênio, autoantígeno ou proteína terapêutica, ou está associado a uma doença inflamatória, uma doença autoimune, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Em outra modalidade, o antígeno é uma proteína terapêutica, ou sua porção, ou é obtido ou derivado de um enxerto transplantável.
[00023] Em outra modalidade, a carga dos imunossupressores e/ou epitopos em média ao longo da primeira e/ou segunda populações de nanotransportadores sintéticos está situada entre 0,0001% e 50%. Em outra modalidade, a carga dos imunossupressores e/ou epitopos em média ao longo da primeira e/ou segunda populações de nanotransportadores sintéticos está situada entre 0,1% e 10%.
[00024] Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopar- tículas lipídicas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsões à base de tensoativos, dendrímeros, futebolenos, nanofios, partículas do tipo vírus ou partículas peptídicas ou proteicas. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopartículas lipídicas. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem lipossomos. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopartículas metálicas. Em outra modalidade, as nanopartículas metálicas compreendem nanopartículas de ouro. Em outra modalidade, os nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população compreendem nanopartículas poliméricas. Em outra modalidade, a nanopartícula polimérica compreende um polímero que não é polímero Pluronic com terminação metóxi. Em outra modalidade, as nanopartículas poliméricas compreendem um poliéster, um poliéster acoplado a um poliéter, poliaminoácido, policarbonato, poliacetal, policetal, polissacarídeo, polietiloxazolina ou polietilenoimina. Em outra modalidade, o poliéster compreende um poli(ácido lático), poli(ácido glicólico), poli(ácido lático-co-glicólico) ou policaprolactona. Em outra modalidade, as nanopartículas poliméricas compreendem um poliéster e um poliéster acoplado a um poliéter. Em outra modalidade, o poliéter compreende polietileno glicol ou polipropileno glicol.
[00025] Em outra modalidade, a média de uma distribuição da dimensão das partículas, obtida usando dispersão dinâmica da luz, dos nanotransportadores sintéticos da primeira e/ou segunda populações é um diâmetro maior do que 100 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 150 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 200 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 250 nm. Em outra modalidade, o diâmetro é maior do que 300 nm. Em outra modalidade, a razão de aspecto dos nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população é maior do que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 ou 1:10.
[00026] Em outra modalidade, uma ou mais doses de manutenção da composição compreendendo a primeira população e a segunda população de nanotransportadores sintéticos são administradas ao sujeito. Em outra modalidade, o método também compreende avaliar a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada no sujeito antes e/ou após a administração da composição compreendendo a primeira população e a segunda população de nanotransportadores sintéticos. Em uma modalidade, a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada consiste em proliferação e/ou atividade de células T CD8+.
[00027] Em outra modalidade, o sujeito sofre ou está em risco de sofrer de uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma alergia, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Em outra modalidade, o sujeito foi submetido ou será submetido à transplantação. Em outra modalidade, o sujeito recebeu, está recebendo ou irá receber uma proteína terapêutica.
[00028] Em outra modalidade, a administração é efetuada por administração intravenosa, intraperitoneal, transmucosa, oral, subcutânea, pulmonar, intranasal, intradermal ou intramuscular. Em outra modalidade, a administração é efetuada por inalação ou administração intravenosa, subcutânea ou transmucosa. Em outra modalidade, a administração do enxerto transplantável ou proteína terapêutica, quando a proteína terapêutica é provida na forma de uma ou mais células, é efetuada por administração parenteral, intra-arterial, intranasal ou intravenosa ou por injeção em nódulos linfáticos ou câmara anterior do olho ou por administração local em um órgão ou tecido de interesse.
[00029] Em outro aspecto, é provido um método que compreende (i) produzir uma primeira população de nanotransportadores sintéticos que estão acoplados a imunossupressores, e (ii) produzir uma segunda população de nanotransportadores sintéticos acoplados a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada. Em uma modalidade, a primeira população e a segunda população são a mesma população. Em outra modalidade, a primeira população e segunda população são populações diferentes.
[00030] Em outra modalidade, o método também compreende garantir que a segunda população de nanotransportadores sintéticos compreende substancialmente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II. Em outra modalidade, o método também compreende garantir que a segunda população de nanotransportadores sintéticos compreende epitopos restritos a MHC de Classe II. Em outra modalidade, o método também compreende garantir que a segunda população de nanotransportadores sintéticos compreende substancialmente nenhuns epitopos de células B. Em outra modalidade, o método também compreende garantir que a segunda população de nanotransportadores sintéticos compreende epitopos de células B. Em outra modalidade, o método também compreende garantir que a segunda população compreende epitopos restritos a MHC de Classe I, restritos a MHC de Classe II e de células B. Em uma modalidade, essa garantia pode ser obtida acoplando uma proteína completa aos nanotransportadores sintéticos. Em outra modalidade, essa garantia pode ser obtida acoplando um polipeptídeo ou peptídeo compreendendo os epitopos aos nanotransportadores sintéticos. Métodos para testar nanotransportadores sintéticos com a finalidade de determinar as respostas imunológicas que podem ser produzidas são proporcionados aqui em outro local. Esses métodos, juntamente com outros métodos conhecidos dos profissionais, podem ser usados para garantir que os nanotransportadores sintéticos estão acoplados aos epitopos desejados.
[00031] Em outra modalidade, o método também compreende fabricar uma forma de dosagem compreendendo a primeira população e a segunda população de nanotransportadores sintéticos. Em outra modalidade, o método também compreende disponibilizar uma composição compreendendo a primeira população e segunda população de nanotransportadores sintéticos ou a forma galênica a um sujeito para administração. Em outra modalidade, o método também compreende avaliar a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada com uma composição compreendendo a primeira população e segunda população de nanotransportadores sintéticos. Em uma modalidade, a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada consiste em proliferação e/ou atividade de células T CD8+.
[00032] Em outra modalidade, a primeira população e a segunda população de nanotransportadores sintéticos que são produzidas são como definidas em qualquer um dos métodos proporcionados aqui.
[00033] Em outro aspecto, é provido um processo de produção de uma composição ou forma de dosagem que compreende as etapas de (i) acoplar uma primeira população de nanotransportadores sintéticos a imunossupressores, e (ii) acoplar uma segunda população de nanotransportadores sintéticos a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada. Em outra modalidade, o processo compreende as etapas como definidas em qualquer um dos métodos proporcionados aqui.
[00034] Em outra modalidade, um antígeno que compreende os epitopos acima mencionados é acoplado aos nanotransportadores sintéticos. Em outra modalidade, uma porção do antígeno que compreende os epitopos acima mencionados é acoplada aos nanotransportadores sintéticos. Ainda em outra modalidade, a porção do antígeno acoplada aos nanotransportadores sintéticos pode ser o epitopo isoladamente.
[00035] Em outro aspecto, é proporcionada uma composição ou forma de dosagem que pode ser obtida por qualquer um dos métodos ou processos proporcionados aqui.
[00036] Em outro aspecto, qualquer uma das composições ou formas de dosagem providas pode se destinar a utilização em terapia ou profilaxia. Em outro aspecto, qualquer uma das composições ou formas de dosagem providas pode se destinar a utilização em um método de redução de uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada a um antígeno em um sujeito, o tratamento ou profilaxia de alergia, doença autoimune, doença inflamatória, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro ou em qualquer um dos métodos providos aqui.
[00037] Em outro aspecto, é provida uma utilização de qualquer uma das composições ou formas de dosagem para a fabricação de um medicamento destinado a utilização em um método de redução de uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada a um antígeno em um sujeito, o tratamento ou profilaxia de alergia, doença autoimune, doença inflamatória, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro ou em qualquer um dos métodos providos aqui.
[00038] Em outro aspecto, é proporcionada uma forma de dosagem compreendendo qualquer uma das composições proporcionadas aqui.
[00039] Em uma modalidade de quaisquer das composições e métodos proporcionados aqui, as composições compreendem substancialmente nenhuns epitopos de células B. Em uma modalidade de quaisquer das composições e métodos proporcionados aqui, as composições compreendem substancialmente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II.
[00040] Em uma modalidade de qualquer uma das composições e métodos proporcionados aqui, antígenos que são proteínas que compreendem os epitopos acima mencionados podem ser acoplados aos nanotransportadores sintéticos. Em outra modalidade, polipep- tídeos ou peptídeos que compreendem os epitopos acima mencionados mas com aminoácidos adicionais que flanqueiam uma ou ambas as extremidades do(s) epitopo(s) podem ser acoplados aos nanotrans-portadores sintéticos. Em outra modalidade, os próprios epitopos são acoplados aos nanotransportadores sintéticos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00041] A figura 1 mostra resultados de uma análise de citometria de fluxo de células Treg.
[00042] A figura 2 mostra um efeito no número de células T efetoras específicas para antígenos e porcentagem de células FoxP3+ com nanotransportadores sintéticos da invenção compreendendo imunossu- pressor (rapamicina ou sinvastatina) (após uma única injeção).
[00043] A figura 3 mostra uma diminuição no número de células de nódulos linfáticos popliteais com nanotransportadores sintéticos da invenção compreendendo imunossupressor (rapamicina ou sinvas- tatina) (após múltiplas injeções).
[00044] A figura 4 mostra um nível reduzido de lise específica de células imunológicas expressando OVA usando nanotransportadores sintéticos compreendendo imunossupressor e OVA.
[00045] A figura 5 mostra uma redução do número de células T CD8+ com a administração de nanotransportadores sintéticos compreendendo imunossupressor e peptídeo de OVA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00046] Antes de descrever a presente invenção em detalhe, deve ser entendido que essa invenção não está limitada a materiais ou parâmetros de processos particularmente exemplificados, pois esses podem, obviamente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui se destina somente à finalidade de descrever modalidades particulares da invenção, não sendo pretendido que seja limitadora do uso de terminologia alternativa para descrever a presente invenção.
[00047] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados aqui, quer supra quer infra, são desse modo incorporados por referência na sua totalidade para todas as finalidades.
[00048] Como usado nesse relatório descritivo e nas reivindicações adjuntas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes plurais, a menos que o conteúdo claramente imponha o contrário. Por exemplo, referência a "um polímero"inclui uma mistura de duas ou mais dessas moléculas ou uma mistura de diferentes pesos moleculares de uma única espécie polimérica, referência a "um nanotransportador sintético"inclui uma mistura de dois ou mais desses nanotransportadores sintéticos ou uma pluralidade desses nanotransportadores sintéticos, referência a "uma molécula de DNA" inclui uma mistura de duas ou mais dessas moléculas de DNA ou uma pluralidade dessas moléculas de DNA, referência a "um imunossupressor" inclui uma mistura de dois ou mais desses materiais ou uma pluralidade de moléculas imunossupressoras, e semelhantes.
[00049] Como usado aqui, o termo "compreender" ou suas variações, como "compreende" ou "compreendendo", devem ser lidos como indicando a inclusão de qualquer inteiro (por exemplo, um aspecto, elemento, característica, propriedade, etapa ou limitação do método/processo) ou grupo de inteiros (por exemplo, aspectos, elementos, características, propriedades, etapas ou limitações do método/processo) relatados, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros. Assim, como usado aqui, o termo "compreendendo"é inclusivo e não exclui inteiros ou etapas do método/processo adicionais não relatados.
[00050] Em modalidades de quaisquer das composições e métodos providos aqui, "compreendendo" pode ser substituído por "consistindo essencialmente em" ou "consistindo em". A frase "consistindo essencialmente em"é usada aqui para requerer o(s) inteiro(s) ou etapas especificados, bem como aqueles que materialmente não afetam o caráter ou função da invenção reivindicada. Como usado aqui, o termo "consistindo"é usado para indicar a presença do inteiro (por exemplo, um aspecto, elemento, característica, propriedade, etapa ou limitação do método/processo) ou grupo de inteiros (por exemplo, aspectos, elementos, características, propriedades, etapas ou limitações do método/processo) citados isoladamente.
A. INTRODUÇÃO
[00051] Foi verificado que a distribuição de imunossupressores e epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a respostas imunológicas de células T CD8+ indesejadas mais diretamente nos sítios de ação em células de interesse, em particular APCs, pode reduzir a proliferação e/ou atividade de células T CD8+. As células T CD8+ podem ser citotóxicas, reconhecendo proteínas "estranhas" em células que expressam as proteínas e matando- as. Todavia, em alguns casos, a citotoxicidade é indesejada. Em consequência, seriam benéficos modos de tolerizar esse mecanismo, por exemplo, mediante regulação negativa da proliferação e/ou atividade de células T CD8+ e/ou conversão de células T CD8+ em células T CD8+ reguladoras.
[00052] Crê-se que a administração de nanotransportadores sintéticos compreendendo imunossupressor e epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II pode causar uma redução da quantidade de respostas imunológicas de células T CD8+ indesejadas e originar respostas imunológicas tolerogênicas benéficas. Como mostrado nos Exemplos, esses nanotransportadores sintéticos reduziram com êxito a porcentagem de morte específica de células expressando ovalbumina. Esses nanotransportadores sintéticos também foram usados com êxito para reduzir o número de células T CD8+. Em consequência, as composições e métodos proporcionados aqui, em algumas modalidades, podem originar as respostas tolerogênicas benéficas acima mencionadas. Adicionalmente, como mencionado anteriormente, os imunossupressores convencionais atuais são de largo espectro e geralmente resultam em uma regulação sistêmica global negativa do sistema imunológico. As composições e métodos proporcionados aqui permitem efeitos imunológicos mais direcionados, ao permitirem, por exemplo, a distribuição direcionada em células imunológicas de interesse. Desse modo, as composições e métodos podem alcançar imunossupressão de uma forma mais direcionada. Isso pode ajudar a reduzir efeitos fora do alvo e/ou toxicidade.
[00053] É esperado que a invenção proporcionada aqui seja útil, por exemplo, para promover respostas imunológicas tolerogênicas (por exemplo, a redução de respostas imunológicas de células T CD8+ específicas para antígenos). A redução da resposta imunológica de células T CD8+ também pode ter efeitos a jusante em respostas de células T CD4+, bem como em respostas de células B. Assim, a alguns sujeitos podem ser administradas as composições inventivas proporcionadas aqui. Esses sujeitos incluem sujeitos que sofrem ou estão em risco de sofrer de rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro, sujeitos que foram submetidos ou serão submetidos a transplantação, sujeitos que sofrem ou estão em risco de sofrer de alergia, doença autoimune ou uma doença inflamatória, e sujeitos que receberam, estão recebendo ou irão receber uma proteína terapêutica contra a qual são geradas ou é esperado que sejam geradas respostas imunológicas indesejadas.
[00054] Os inventores descobriram, de modo inesperado e surpreendente, que os problemas e limitações notados acima podem ser ultrapassados por meio da prática da invenção aqui divulgada. Em particular, os inventores descobriram inesperadamente que é possível proporcionar composições de nanotransportadores sintéticos, e métodos relacionados, que induzem uma resposta imunológica tolerogênica. As composições descritas aqui incluem composições que compreendem (i) uma primeira população de nanotransportadores sintéticos que estão acoplados a imunossupressores, e (ii) uma segunda população de nanotransportadores sintéticos acoplados a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada.
[00055] Em outro aspecto, são proporcionadas formas de dosagem de qualquer uma das composições aqui apresentadas. Essas formas de dosagem podem ser administradas a um sujeito (por exemplo, necessitado de respostas imunológicas tolerogênicas antígeno- específicas, como a redução de respostas imunológicas de células T CD8+ específicas para antígenos).
[00056] Em outro aspecto, qualquer uma das composições proporcionadas aqui é administrada a um sujeito. A composição pode ser administrada em uma quantidade eficaz para gerar uma resposta imunológica tolerogênica no sujeito contra um antígeno que compreende os epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II associados a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada. Em uma modalidade, uma composição é administrada a um sujeito de acordo com um protocolo que previamente foi mostrado que reduz a geração de uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada a esse antígeno em um ou mais sujeitos. Em modalidades, a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada consiste em proliferação e/ou atividade de células T CD8+. Ainda em outras modalidades, quaisquer dos métodos podem compreender adicionalmente uma etapa de avaliar a presença ou ausência ou nível da resposta imunológica de células T CD8+ indesejada em um ou mais sujeitos.
[00057] Em outras modalidades, as composições proporcionadas também podem ser administradas a um sujeito na forma de uma ou mais doses de manutenção. Em tais modalidades, as composições proporcionadas são administradas de modo que a geração de uma resposta imunológica indesejada é reduzida por um certo período de tempo. Exemplos de tais períodos de tempo são proporcionados aqui em outro local.
[00058] Ainda em outro aspecto, é provido um método para (i) produzir uma primeira população de nanotransportadores sintéticos acoplados a imunossupressores, e (ii) produzir uma segunda população de nanotransportadores sintéticos acoplados a epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a respostas imunológicas de células T CD8+ indesejadas. Em uma modalidade, o método também compreende produzir uma forma de dosagem compreendendo a primeira e a segunda populações de nanotransportadores sintéticos.
[00059] A invenção será agora descrita em mais detalhe embaixo.
B. DEFINIÇÕES
[00060] "Administrar" ou "administração"significa fornecer um material a um sujeito de uma forma que é farmacologicamente útil.
[00061] "Alergênios" são quaisquer substâncias que podem causar uma resposta imunológica indesejada (por exemplo, uma hipersensibilidade do Tipo 1) (isto é, resposta ou reação alérgica) em um sujeito. Alergênios incluem mas não estão limitados a alergênios de plantas (por exemplo, alergênio de pólen, tasneira), alergênios de insetos, alergênios de picadas de insetos (por exemplo, alergênios de picada de abelha), alergênios de animais (por exemplo, alergênios de animais de estimação, como pelagem de animais ou antígeno Fel d 1 de gato), alergênios de látex, alergênios de bolores, alergênios fúngicos, alergênios cosméticos, alergênios de fármacos, alergênios alimentares, poeira, veneno de insetos, vírus, bactérias, etc. Alergênios alimentares incluem mas não estão limitados a alergênios de leite, alergênios de ovo, alergênios de nozes (por exemplo, alergênios de amendoim ou fruto de casca rija, etc. (por exemplo, nozes, cajus, etc.)), alergênios de peixes, alergênios de moluscos, alergênios de soja, alergênios de legumes, alergênios de sementes e alergênios de trigo. Alergênios de picadas de insetos incluem alergênios que são ou estão associados a picadas de abelhas, picadas de vespas, picadas de vespões, picadas de vespas jaqueta amarela, etc. Alergênios de insetos também incluem alergênios de ácaros do pó doméstico (por exemplo, antígeno Der P1) e alergênios de baratas. Alergênios de fármacos incluem alergênios que são ou estão associados a antibióticos, NSAIDs, anestésicos, etc. Alergênios de pólen incluem alergênios de gramado, alergênios de árvores, alergênios de ervas daninhas, alergênios de flores, etc. Sujeitos que desenvolvem ou estão em risco de desenvolver uma resposta imunológica indesejada a quaisquer dos alergênios proporcionados aqui podem ser tratados com quaisquer das composições e métodos proporcionados aqui. Sujeitos que podem ser tratados com quaisquer das composições e métodos proporcionados também incluem aqueles que sofrem ou estão em risco de sofrer de uma alergia a quaisquer dos alergênios proporcionados.
[00062] Uma "alergia", também chamada aqui de "condição alérgica", é qualquer condição médica em que ocorre uma resposta imunológica indesejada (por exemplo, uma hipersensibilidade do Tipo 1) (isto é, resposta ou reação alérgica) a uma substância. Essas substâncias são chamadas aqui de alergênios. Alergias ou condições alérgicas incluem mas não estão limitadas a asma alérgica, febre dos fenos, urticária, eczema, alergias a plantas, alergias a picadas de abelha, alergias a animais domésticos, alergias a látex, alergias a bolores, alergias a cosméticos, alergias alimentares, rinite alérgica ou coriza, reações alérgicas tópicas, anafilaxia, dermatite atópica, reações de hipersensibilidade e outras condições alérgicas. A reação alérgica pode dever-se a uma reação imunológica a qualquer alergênio. Em algumas modalidades, a alergia é uma alergia alimentar. Alergias alimentares incluem mas não estão limitadas a alergias a leite, alergias a ovo, alergias a nozes, alergias a peixes, alergias a moluscos, alergias a soja ou alergias a trigo.
[00063] "Quantidade eficaz", no contexto de uma composição ou forma de dosagempara administração a um sujeito, refere-se a uma quantidade da composição ou forma de dosagemque produz uma ou mais respostas imunológicas desejadas no sujeito, por exemplo, a geração de uma resposta imunológica tolerogênica (por exemplo, uma redução da proliferação, ativação, indução, recrutamento de células T CD8+). Em consequência, em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é qualquer quantidade de uma composição proporcionada aqui que produz uma ou mais dessas respostas imunológicas desejadas. Essa quantidade pode se destinar a finalidades in vitro ou in vivo. Para finalidades in vivo, a quantidade pode ser tal que um médico crê poder ter um benefício clínico em um sujeito necessitado de tolerização antígeno-específica. Tais sujeitos incluem aqueles que sofrem ou estão em risco de sofrer de rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Esses sujeitos também incluem aqueles que foram submetidos ou serão submetidos a transplantação. Esses sujeitos também incluem aqueles que sofrem ou estão em risco de sofrer de uma doença autoimune, como diabetes de tipo I, em que uma resposta imunológica indesejada ocorreu, está ocorrendo ou há um risco de ocorrer no sujeito. Essas respostas imunológicas indesejadas podem conduzir a um ataque indesejado em células β pancreáticas. Outros sujeitos incluem os descritos aqui em outro local.
[00064] Quantidades eficazes podem envolver apenas reduzir o nível de uma resposta imunológica indesejada, apesar de, em algumas modalidades, envolver prevenir toda uma resposta imunológica indesejada. Quantidades eficazes também podem envolver retardar a ocorrência de uma resposta imunológica indesejada. Uma quantidade que é eficaz pode ser também uma quantidade de uma composição aqui proporcionada que produz um desfecho terapêutico desejado ou um resultado terapêutico desejado. De preferência, quantidades eficazes originam uma resposta imunológica tolerogênica a um antígeno em um sujeito. A obtenção de quaisquer dos anteriores pode ser monitorada por métodos de rotina.
[00065] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições e métodos proporcionados, a quantidade eficaz é tal que a resposta imunológica desejada persiste no sujeito por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 5 anos, ou mais. Em outras modalidades de qualquer uma das composições e métodos proporcionados, a quantidade eficaz é tal que produz uma resposta imunológica desejada mensurável, por exemplo, um decréscimo mensurável em uma resposta imunológica (por exemplo, a um antígeno específico), por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 5 anos, ou mais.
[00066] Quantidades eficazes irão depender, obviamente, do sujeito particular sendo tratado; da gravidade de uma condição médica, doença ou distúrbio; dos parâmetros do paciente individual, incluindo a idade, condição física, estatura e peso; da duração do tratamento; da natureza da terapia concorrente (se existir); da via de administração específica e fatores afins, no âmbito do conhecimento e perícia do profissional de saúde. Esses fatores são bem conhecidos dos profissionais e podem ser abordados com não mais do que experimentação de rotina. É geralmente preferido que seja usada uma dose máxima, isto é, a dose segura mais alta de acordo com uma avaliação médica fundamentada. Os profissionais entenderão, todavia, que um paciente pode insistir em uma dose mais baixa ou dose tolerável por motivos médicos, motivos psicológicos ou virtualmente por qualquer outro motivo.
[00067] Em geral, doses dos imunossupressores e/ou antígenos nas composições da invenção podem variar desde cerca de 10 μg/kg até cerca de 100 000 μg/kg. Em algumas modalidades, as doses podem variar desde cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg. Ainda em outras modalidades, as doses podem variar desde cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 25 mg/kg, cerca de 25 mg/kg até cerca de 50 mg/kg, cerca de 50 mg/kg até cerca de 75 mg/kg ou cerca de 75 mg/kg até cerca de 100 mg/kg. Em alternativa, a dose pode ser administrada com base no número de nanotransportadores sintéticos que proporcionam a quantidade desejada de imunossupressores e/ou antígenos. Por exemplo, doses úteis incluem mais de 106, 107, 108, 109 ou 1010 nanotransportadores sintéticos por dose. Outros exemplos de doses úteis incluem desde cerca de 1x106 até cerca de 1x1010, cerca de 1x107 até cerca de 1x109 ou cerca de 1x108 até cerca de 1x109 nanotransportadores sintéticos por dose.
[00068] "Antígeno"significa um antígeno de células B ou um antígeno de células T. "Tipo(s) de antígenos"significa moléculas que partilham as mesmas, ou substancialmente as mesmas, características antigênicas. Em algumas modalidades, antígenos podem ser proteínas, polipeptídeos, peptídeos, lipoproteínas, glicolipídeos, polinucleotídeos, polissacarídeos ou estão contidos ou são expressos em células. Em algumas modalidades, como quando os antígenos não estão bem definidos ou caracterizados, os antígenos podem estar contidos em uma preparação celular ou tecidual, detrito celular, exossomos celulares, meios condicionados, etc. Um antígeno pode ser combinado com os nanotransportadores sintéticos na mesma forma que provoca, em um sujeito exposto à mesma, uma resposta imunológica indesejada, mas também pode ser um respectivo fragmento ou derivado. Todavia, quando se tratar de um fragmento ou derivado, uma resposta imunológica desejada à forma à qual é exposto esse sujeito é o resultado preferível com as composições e métodos proporcionados.
[00069] "Antígeno-específica"refere-se a qualquer resposta imunológica que resulta da presença do antígeno, ou sua porção, ou que gera moléculas que reconhecem ou se ligam especificamente ao antígeno. Por exemplo, quando a resposta imunológica consiste em produção de anticorpos específicos para um antígeno, são produzidos anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno. Como outro exemplo, quando a resposta imunológica consistir em proliferação e/ou atividade de células T CD8+ específicas para antígenos, a proliferação e/ou atividade pode resultar do reconhecimento do antígeno, ou sua porção, isoladamente ou em complexo com moléculas de MHC.
[00070] "Antígenos associados" a uma doença, distúrbio ou condição médica proporcionados aqui são antígenos que podem gerar uma resposta imunológica indesejada contra, em resultado, ou em conjunção com a doença, distúrbio ou condição médica; a causa da doença, distúrbio ou condição médica (ou um respectivo sintoma ou efeito); e/ou podem gerar uma resposta imunológica indesejada que é um sintoma, resultado ou efeito da doença, distúrbio ou condição médica. De preferência, em algumas modalidades, a utilização de um antígeno associado a uma doença, distúrbio ou condição médica, etc., nas composições e métodos proporcionados aqui conduzirá a uma resposta imunológica tolerogênica contra o antígeno e/ou as células, pelas quais, sobre ou nas quais o antígeno é expresso. Os antígenos podem estar na mesma forma que é expressa em um sujeito com a doença, distúrbio ou condição médica, mas também podem consistir em um respectivo fragmento ou derivado. Todavia, quando se tratar de um fragmento ou derivado, uma resposta imunológica desejada à forma expressa em esse sujeito é o resultado preferível com as composições e métodos proporcionados. Os antígenos associados a uma doença, distúrbio ou condição médica, em algumas modalidades, compreendem epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou epitopos restritos a MHC de Classe II. Em algumas modalidades, os antígenos substancialmente não compreendem epitopos de células B, como quando a doença, distúrbio ou condição médica é uma doença autoimune ou uma alergia e a inclusão do epitopo de células B iria exacerbar uma resposta imunológica indesejada. Em outras modalidades, os antígenos compreendem epitopos de células B.
[00071] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno associado a uma doença inflamatória, doença autoimune, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Esses antígenos incluem autoantígenos, como proteína básica de mielina, colágeno (por exemplo, colágeno do tipo 11), gp 39 de cartilagem humana, cromogranina A, gp130-RAPS, proteína proteolipídica, fibrilarina, proteínas nucleares, proteínas nucleolares (por exemplo, pequena proteína nucleolar), receptor do fator estimulante da tireoide, histonas, glicoproteína gp 70, proteínas ribossomais, piruvato desidrogenase desidrolipoamida acetiltransferase, antígenos do folículo piloso, isoforma da tropomiosina humana 5, proteínas mitocondriais, proteínas de células pancreáticas, glicoproteína mielínica de oligodendrócitos, insulina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD), glúten, e respectivos fragmentos ou derivados. Outros autoantígenos são proporcionados na Tabela 1 abaixo.
[00072] Antígenos também incluem os associados a rejeição de órgão ou tecido. Exemplos desses antígenos incluem mas não estão limitados a antígenos de células alogeneicas, por exemplo, antígenos de um extrato de células alogeneicas e antígenos de outras células, como antígenos de células endoteliais.
[00073] Antígenos também incluem os associados a uma alergia. Esses antígenos incluem os alergênios descritos aqui em outro local.
[00074] Antígenos também incluem os associados a um enxerto transplantável. Esses antígenos estão associados a um enxerto transplantável, ou uma resposta imunológica indesejada em um receptor de um enxerto transplantável que é gerada devido à introdução do enxerto transplantável no receptor, que podem ser apresentados para reconhecimento por células do sistema imunológico e que podem gerar uma resposta imunológica indesejada. Antígenos de transplante incluem os associados a rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Antígenos de transplante podem ser obtidos ou derivados de células de um material biológico ou de informação relacionada a um enxerto transplantável. Antígenos de transplante incluem geralmente proteínas, polipeptídeos, peptídeos, lipoproteínas, glicolipídeos, polinucleotídeos ou estão contidos ou são expressos em células. Informação relacionada a um enxerto transplantável é qualquer informação sobre um enxerto transplantável que pode ser usada para obter ou derivar antígenos de transplante. Essa informação inclui informação sobre antígenos que é esperado que estejam presentes dentro ou sobre células de um enxerto transplantável, tal como, por exemplo, informação sobre sequências, tipos ou classes de antígenos e/ou suas restrições a MHC de Classe I, MHC de Classe II ou de apresentação por células B. Essa informação também pode incluir informação sobre o tipo de enxerto transplantável (por exemplo, autoenxerto, aloenxerto, xenoenxerto), a composição molecular e celular do enxerto, a localização corporal de onde o enxerto é derivado ou onde o enxerto deve ser transplantado (por exemplo, órgão completo ou parcial, pele, osso, nervos, tendão, neurônios, vasos sanguíneos, tecido adiposo, córnea, etc.).
[00075] Antígenos também incluem antígenos associados a uma proteína terapêutica que podem ser apresentados para reconhecimento por células do sistema imunológico e que podem gerar uma resposta imunológica indesejada contra a proteína terapêutica. Antígenos de proteínas terapêuticas incluem geralmente proteínas, polipeptídeos, peptídeos, lipoproteínas, ou estão contidos ou são expressos em, por ou sobre células.
[00076] Antígenos podem ser antígenos que estão totalmente definidos ou caracterizados. No entanto, em algumas modalidades, um antígeno não está totalmente definido ou caracterizado. Em consequência, antígenos também incluem os que estão contidos em uma preparação celular ou tecidual, detrito celular, exossomo celular ou meio condicionado e podem ser distribuídos nessa forma em algumas modalidades.
[00077] "Avaliação de uma resposta imunológica"refere-se a qualquer medição ou determinação do nível, presença ou ausência, redução, aumento, etc., de uma resposta imunológica in vitro ou in vivo. Essas medições ou determinações podem ser efetuadas em uma ou mais amostras obtidas de um sujeito. Essa avaliação pode ser efetuada por qualquer um dos métodos proporcionados aqui ou então conhecidos na área.
[00078] Um sujeito "em risco"é um sujeito que o profissional de saúde crê ser possível sofrer de uma doença, distúrbio ou condição médica como proporcionada aqui ou é um sujeito que o profissional de saúde crê ser possível sofrer de uma resposta imunológica indesejada como proporcionada aqui.
[00079] Uma "doença autoimune"é qualquer doença em que o sistema imunológico monta uma resposta imunológica indesejada contra si próprio (por exemplo, um ou mais autoantígenos). Em algumas modalidades, uma doença autoimune compreende uma destruição aberrante de células do corpo como parte da resposta imunológica autodirecionada. Em algumas modalidades, a autodestruição se manifesta na disfunção de um órgão, por exemplo, o cólon ou pâncreas. Exemplos de doenças autoimunes são descritos aqui em outro local. Doenças autoimunes adicionais serão conhecidas dos profissionais, e a invenção não está limitada a esse respeito.
[00080] "Média", como usado aqui, refere-se à média aritmética, a menos que notado em contrário.
[00081] "Antígeno de células B" significa qualquer antígeno que desencadeia uma resposta imunológica em uma célula B (por exemplo, um antígeno que é especificamente reconhecido por uma célula B ou um receptor aí presente). Em algumas modalidades, um antígeno que é um antígeno de células T também é um antígeno de células B. Em outras modalidades, o antígeno de células T não é um antígeno também de células B. Antígenos de células B incluem mas não estão limitados a proteínas, peptídeos, moléculas pequenas, e carboidratos. Em algumas modalidades, o antígeno de células B compreende um antígeno não proteico (isto é, não é um antígeno proteico nem peptídico). Em algumas modalidades, o antígeno de células B compreende um autoantígeno. Em outras modalidades, o antígeno de células B é obtido ou derivado de um alergênio, autoantígeno, proteína terapêutica, ou enxerto transplantável.
[00082] "Concomitantemente" significa administrar duas ou mais substâncias a um sujeito de um modo que está correlacionado no tempo, de preferência suficientemente correlacionado no tempo de forma a prover uma modulação de uma resposta imunológica. Em modalidades, pode ocorrer administração concomitante por meio da administração de duas ou mais substâncias na mesma forma galênica. Em outras modalidades, administração concomitante pode abranger a administração de duas ou mais substâncias em diferentes formas galênicas, mas em um período de tempo especificado, de preferência em 1 mês, com mais preferência em 1 semana, ainda com mais preferência em 1 dia, e ainda com mais preferência em 1 hora.
[00083] "Acoplar" ou "Acoplado" ou "Acopla" (e afins) significa a associação química de uma entidade (por exemplo, uma fração) a outra. Em algumas modalidades, o acoplamento é covalente, significando que o acoplamento ocorre no contexto da presença de uma ligação covalente entre as duas entidades. Em modalidades não covalentes, o acoplamento não covalente é mediado por interações não covalentes, incluindo mas não se limitando a interações de carga, interações de afinidade, coordenação metálica, adsorção física, interações hospedeiro-convidado, interações hidrofóbicas, interações de empilhamento TT, interações de ligação de hidrogênio, interações de van der Waals, interações magnéticas, interações eletrostáticas, interações dipolo-dipolo, e/ou respectivas combinações. Em modalidades, a encapsulação é uma forma de acoplamento.
[00084] "Derivado" significa preparado a partir de um material ou informação relacionada a um material, mas não é "obtido" do material. Esses materiais podem consistir em formas substancialmente modificadas ou processadas de materiais coletados diretamente de um material biológico. Esses materiais também incluem materiais produzidos a partir de informação relacionada a um material biológico.
[00085] "Forma de dosagem" significa um material farmacológica e/ou imunologicamente ativo em um meio, transportador, veículo, ou dispositivo adequado para administração a um sujeito.
[00086] "Encapsular" significa encerrar pelo menos uma porção de uma substância dentro de um nanotransportador sintético. Em algumas modalidades, uma substância é totalmente encerrada dentro de um nanotransportador sintético. Em outras modalidades, a maior parte ou a totalidade de uma substância que é encapsulada não está exposta ao ambiente local externo ao nanotransportador sintético. Em outras modalidades, não mais de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% (peso/peso) estão expostos ao ambiente local. Encapsulação é diferente de absorção, que coloca a maioria ou a totalidade de uma substância sobre uma superfície de um nanotransportador sintético, e deixa a substância exposta ao ambiente local externo ao nanotrans- portador sintético.
[00087] "Epitopo", também chamado de determinante antigênico, é a parte de um antígeno que é reconhecida pelo sistema imunológico, especificamente, por exemplo, por anticorpos, células B, ou células T. Como usado aqui, "epitopos restritos a MHC de Classe I"são epitopos que são apresentados a células imunológicas por moléculas de MHC de classe I presentes em células nucleadas. "Epitopos restritos a MHC de Classe II"são epitopos que são apresentados a células imunológicas por moléculas de MHC de classe II presentes em células apresentadoras de antígenos (APCs), por exemplo, em células imunológicas apresentadoras de antígenos profissionais, como em macrófagos, células B, e células dendríticas, ou em células não hematopoiéticas, como hepatócitos. "Epitopos de células B"são estruturas moleculares que são reconhecidas por anticorpos ou células B. Em algumas modalidades, o próprio epitopo é um antígeno.
[00088] Alguns epitopos são conhecidos dos profissionais, e epitopos exemplificativos adequados de acordo com alguns aspectos dessa invenção incluem mas não estão limitados aos listados na Immune Epitope Database (www.immuneepitope.org, Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Sette A, Peters B. "The immune epitope database 2.0". Nucleic Acids Res. janeiro 2010; 38 (Referência da base de dados): D854-62; cuja totalidade do seu conteúdo, bem como todas as entradas da base de dados da IEDB versão 2.4, agosto 2011, e particularmente todos os epitopos aí divulgados, são incorporados aqui por referência). Epitopos também podem ser identificados com algoritmos publicamente disponíveis, por exemplo, os algoritmos descritos em Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. 2010. "Peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules". BMC Bioinformatics 2010, 11:568; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. 2008. "A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach". PLoS Comput Biol. 4(4):e1000048; Nielsen M, Lund O. 2009. "NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction". BMC Bioinformatics. 10:296; Nielsen M, Lundegaard C, Lund O. 2007. "Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method". BMC Bioinformatics. 8:238; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothé BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Immunogenetics. 57:304314; Sturniolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci O, Sahin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999. "Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices". Nat Biotechnol. 17(6):555-561; Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. 2003. "Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations". Protein Sci 12:1007-1017; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. "Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications". Immunogenetics 57:304-314; Peters B, Sette A. 2005. "Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method". BMC Bioinformatics 6:132; Chou PY, Fasman GD. 1978. "Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence". Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148; Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. 1985. "Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide". J Virol 55:836-839; Karplus PA, Schulz GE. 1985. "Prediction of chain flexibility in proteins". Naturwissenschaften 72:212-213; Kolaskar AS, Tongaonkar PC. 1990. "A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens". FEBS Lett276:172-174; Parker JM, Guo D, Hodges RS. 1986. "New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites". Biochemistry 25:5425-5432; Larsen JE, Lund O, Nielsen M. 2006. "Improved method for predicting linear B-cell epitopes". Immunome Res 2:2; Ponomarenko JV, Bourne PE. 2007. "Antibody-protein interactions: benchmark datasets and prediction tools evaluation". BMC Struct Biol 7:64; Haste Andersen P, Nielsen M, Lund O. 2006. "Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures". Protein Sci 15:2558-2567; Ponomarenko JV, Bui H, Li W, Fusseder N, Bourne PE, Sette A, Peters B. 2008. "ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes". BMC Bioinformatics 9:514; Nielsen M, Lundegaard C, Blicher T, Peters B, Sette A, Justesen S, Buus S, e Lund O. 2008. PLoS Comput Biol.4(7)e1000107. "Quantitative predictions of peptide binding to any HLA-DR molecule of known sequence: NetMHCIIpan"; em que a totalidade do conteúdo de cada um é incorporada aqui por referência para divulgação de métodos e algoritmos para a identificação de epitopos.
[00089] Outros exemplos de epitopos proporcionados aqui incluem quaisquer dos epitopos restritos a MHC de Classe I, restritos a MHC de Classe II e de células B proporcionados na forma das SEQ ID NOs: 1943. Sem pretender ficar restringido por qualquer teoria particular, epitopos restritos a MHC de Classe I incluem os apresentados nas SEQ ID NOs: 1-186, epitopos restritos a MHC de Classe II incluem os apresentados nas SEQ ID NOs: 187-537, e epitopos de células B incluem os apresentados nas SEQ ID NOs: 538-943. Esses epitopos incluem autoantígenos restritos a MHC de Classe I, epitopos restritos a MHC de Classe II de alergênios e epitopos de células B de autoantígenos e alergênios.
[00090] "Gerar" significa causar a ocorrência de uma ação, tal como uma resposta imunológica (por exemplo, uma resposta imunológica tolerogênica), quer diretamente por si só ou indiretamente, tal como mas não se limitando a uma terceira parte não relacionada que efetua uma ação em função das palavras ou atos de alguém.
[00091] "Identificar" consiste em qualquer ação ou conjunto de ações que permite que um médico reconheça um sujeito como podendo beneficiar dos métodos e composições proporcionadas aqui. De preferência, o sujeito identificado está necessitado de uma resposta imunológica tolerogênica como proporcionada aqui. A ação ou conjunto de ações pode ser diretamente por si só ou indiretamente, tal como mas não se limitando a uma terceira parte não relacionada que efetua uma ação em função das palavras ou atos de alguém.
[00092] "Imunossupressor" significa um composto que faz com que uma APC exerça um efeito imunossupressor (por exemplo, efeito tolerogênico). Um efeito imunossupressor refere-se, em geral, à produção ou expressão de citocinas ou outros fatores pela APC que reduz, inibe ou previne uma resposta imunológica indesejada ou que promove uma resposta imunológica desejada. Quando a APC origina um efeito imunossupressor em células imunológicas que reconhecem um antígeno apresentado pela APC, é afirmado que o efeito imunossupressor é específico para o antígeno apresentado. Esse efeito também é aqui chamado de efeito tolerogênico. Sem pretender ficar restringido por qualquer teoria particular, pensa-se que o efeito imunossupressor ou tolerogênico resulta de o imunossupressor ser distribuído à APC, de preferência na presença de um antígeno (por exemplo, um antígeno administrado ou um que já está presente in vivo). Em conformidade, o imunossupressor inclui compostos que proporcionam uma resposta imunológica tolerogênica a um antígeno que pode ou não ser proporcionado na mesma composição ou em uma composição diferente. Em uma modalidade, o imunossupressor é tal que faz com que uma APC promova um fenótipo regulador em uma ou mais células efetoras imunológicas. Por exemplo, o fenótipo regulador pode ser caracterizado pela inibição da produção, indução, estimulação ou recrutamento de células T CD8+ específicas para antígenos, a produção, indução, estimulação ou recrutamento de células Treg, etc. Isso pode dever-se à conversão de células T CD8+ ou células B em um fenótipo regulador. Isso também pode dever-se a indução de FoxP3 em outras células imunológicas, tais como células T CD4+, macrófagos e células iNKT. Em uma modalidade, o imunossupressor é tal que afeta a resposta da APC depois de processar um antígeno. Em outra modalidade, o imunossupressor é tal que não interfere no processamento do antígeno. Em uma modalidade adicional, o imunossupressor não é uma molécula de sinalização apoptótica. Em outra modalidade, o imunossupressor não é um fosfolipídeo.
[00093] Imunossupressores incluem mas não estão limitados a estatinas; inibidores de mTOR, como rapamicina ou um análogo da rapamicina; agentes de sinalização de TGF-β; agonistas de receptores de TGF-β; inibidores da histona desacetilase, como Tricostatina A; corticosteroides; inibidores da função mitocondrial, como rotenona; inibidores de P38; inibidores de NF-Kβ, como 6Bio, Dexametasona, TCPA-1, IKK VII; agonistas de receptores de adenosina; agonistas de prostaglandina E2 (PGE2), como Misoprostol; inibidores de fosfodiesterases, como inibidor da fosfodiesterase 4 (PDE4), como Rolipram; inibidores de proteassomos; inibidores de cinases; agonistas de receptores acoplados à proteína G; antagonistas de receptores acoplados à proteína G; glucocorticoides; retinoides; inibidores de citocinas; inibidores de receptores de citocinas; ativadores de receptores de citocinas; antagonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos; agonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos; inibidores da calcineurina; inibidores de fosfatases; inibidores de PI3KB, como TGX-221; inibidores de autofagia, como 3-Metiladenina; inibidores de receptores de hidrocarbonetos arila; inibidor de proteassomo I (PSI); e ATPs oxidados, como bloqueadores de receptores P2X. Imunossupressores também incluem IDO, vitamina D3, ciclosporinas, como ciclosporina A, inibidores de receptores de hidrocarbonetos arila, resveratrol, azatiopurina (Aza), 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), FK506, sangliferina A, salmeterol, micofenolato de mofetil (MMF), aspirina e outros inibidores da COX, ácido niflúmico, estriol e triptolida. Em modalidades, o imunossupressor pode compreender qualquer um dos agentes proporcionados aqui.
[00094] O imunossupressor pode ser um composto que proporciona diretamente o efeito imunossupressor (por exemplo, tolerogênico) em APCs ou pode ser um composto que proporciona o efeito imunossu- pressor (por exemplo, tolerogênico) indiretamente (isto é, depois de ser processado de algum modo após a administração). Assim, imunossu- pressores incluem formas de pró-fármacos de quaisquer dos compostos proporcionados aqui.
[00095] Imunossupressores também incluem ácidos nucleicos que codificam os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas proporcionados aqui que originam uma resposta imunológica imunossupressora (por exemplo, tolerogênica). Assim, em modalidades, o imunossupressor é um ácido nucleico que codifica um peptídeo, polipeptídeo ou proteína que origina uma resposta imunológica imunossupressora (por exemplo, tolerogênica), e é o ácido nucleico que é acoplado ao nanotransportador sintético.
[00096] O ácido nucleico pode ser DNA ou RNA, como mRNA. Em modalidades, as composições inventivas compreendem um complemento, como um complemento completo, ou um degenerado (devido à degenerescência do código genético) de quaisquer dos ácidos nucleicos providos aqui. Em modalidades, o ácido nucleico é um vetor de expressão que pode ser transcrito quando transfectado em uma linhagem de células. Em modalidades, o vetor de expressão pode compreender um plasmídeo, retrovírus, ou um adenovírus, entre outros. Ácidos nucleicos podem ser isolados ou sintetizados usando abordagens comuns de biologia molecular, por exemplo, usando uma reação em cadeia de polimerase para produzir um fragmento de ácido nucleico, que então é purificado e clonado em um vetor de expressão. Técnicas adicionais úteis na prática dessa invenção podem ser encontradas em "Current Protocols in Molecular Biology" 2007 da John Wiley and Sons, Inc.; "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Terceira Edição) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Austrália; David Russell, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Cold Spring Harbor.
[00097] Em modalidades, os imunossupressores proporcionados aqui são acoplados a nanotransportadores sintéticos. Em modalidades preferíveis, o imunossupressor é um elemento que está presente para além do material que constitui a estrutura do nanotransportador sintético. Por exemplo, em uma modalidade, quando o nanotransportador sintético é constituído por um ou mais polímeros, o imunossupressor é um composto que está presente para além e acoplado ao um ou mais polímeros. Como outro exemplo, em uma modalidade, quando o nanotransportador sintético é constituído por um ou mais lipídeos, o imunossupressor está novamente presente para além e acoplado ao um ou mais lipídeos. Em modalidades, como quando o material do nanotransportador sintético também origina um efeito imunossupressor (por exemplo, tolerogênico), o imunossupressor é um elemento presente para além do material do nanotransportador sintético que origina um efeito imunossupressor (por exemplo, tolerogênico).
[00098] Outros imunossupressores exemplificativos incluem mas não estão limitados fármacos de moléculas pequenas, produtos naturais, anticorpos (por exemplo, anticorpos contra CD20, CD3, CD4), fármacos de base biológica, fármacos baseados em carboidratos, nanopartículas, lipossomos, RNAi, ácidos nucleicos antissenso, aptâmeros, metotrexato, NSAIDs; fingolimod; natalizumab; alemtuzumab; anti-CD3; tacrolimus (FK506), etc. Outros imunossupressores são conhecidos dos profissionais, e a invenção não está limitada a esse respeito.
[00099] "Doença inflamatória"significa qualquer doença, distúrbio ou condição médica onde ocorre inflamação indesejada.
[000100] "Carga" do imunossupressor ou antígeno é a quantidade do imunossupressor ou antígeno acoplado a um nanotransportador sintético com base no peso total dos materiais presentes em um nanotransportador sintético completo (peso/peso). Em geral, a carga é calculada na forma de uma média ao longo de uma população de nanotransportadores sintéticos. Em uma modalidade, a carga do imunossupressor em média ao longo da primeira população de nanotransportadores sintéticos está situada entre 0,0001% e 50%. Em outra modalidade, a carga do antígeno em média ao longo da primeira e/ou segunda populações de nanotransportadores sintéticos está situada entre 0,0001% e 50%. Em outra modalidade adicional, a carga do imunossupressor e/ou antígeno está situada entre 0,01% e 20%. Em uma modalidade adicional, a carga do imunossupressor e/ou antígeno está situada entre 0,1% e 10%. Em outra modalidade adicional, a carga do imunossupressor e/ou antígeno está situada entre 1% e 10%. Em outra modalidade adicional, a carga do imunossupressor e/ou do antígeno é pelo menos 0,1 %, pelo menos 0,2 %, pelo menos 0,3 %, pelo menos 0,4 %, pelo menos 0,5 %, pelo menos 0,6 %, pelo menos 0,7 %, pelo menos 0,8 %, pelo menos 0,9 %, pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, pelo menos 10 %, pelo menos 11 %, pelo menos 12 %, pelo menos 13 %, pelo menos 14 %, pelo menos 15 %, pelo menos 16 %, pelo menos 17 %, pelo menos 18 %, pelo menos 19 % ou pelo menos 20 % em média ao longo de uma população de nanotransportadores sintéticos. Ainda em outra modalidade, a carga do imunossupressor e/ou do antígeno é 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% em média ao longo de uma população de nanotransportadores sintéticos. Em algumas modalidades das modalidades acima, a carga do imunossupressor e/ou do antígeno é não mais do que 25% em média ao longo de uma população de nanotransportadores sintéticos. Em modalidades, a carga é calculada como descrito nos Exemplos.
[000101] Em modalidades de qualquer uma das composições e métodos proporcionados, a carga pode ser calculada do modo seguinte: Aproximadamente 3 mg de nanotransportadores sintéticos são coletados e centrifugados, para separar o sobrenadante do pélete de nanotransportadores sintéticos. Adiciona-se acetonitrila ao pélete, e a amostra é sonicada e centrifugada para remover qualquer material insolúvel. O sobrenadante e o pélete são injetados em RP-HPLC e a absorvância é lida a 278 nm. Os μg do pélete são usados para calcular a % encerrada (carga), os μg no sobrenadante e pélete são usados para calcular os μg totais recuperados.
[000102] "Dose de manutenção" se refere a uma dose que é administrada a um sujeito, depois de uma dose inicial ter resultado em um resposta imunossupressora (por exemplo, tolerogênica) em um sujeito, de forma a sustentar uma resposta imunossupressora (por exemplo, tolerogênica) desejada. Uma dose de manutenção, por exemplo, pode ser uma que mantenha o efeito tolerogênico alcançado depois da dose inicial, previna uma resposta imunológica indesejada no sujeito, ou impeça que o sujeito se torne um sujeito em risco de sofrer uma resposta imunológica indesejada, incluindo um nível indesejado de uma resposta imunológica. Em algumas modalidades, a dose de manutenção é aquela que é suficiente para manter um nível apropriado de uma resposta imunológica desejada. Em algumas modalidades, a dose de manutenção é tal que é suficiente para a manutenção de um nível apropriado ou nenhuma proliferação e/ou atividade de células T CD8+ ou defesa contra uma provocação com um agente que origina uma resposta imunológica indesejada.
[000103] "Dimensão máxima de um nanotransportador sintético"significa a maior dimensão de um nanotransportador mensurada ao longo de qualquer eixo do nanotransportador sintético. "Dimensão mínima de um nanotransportador sintético"significa a menor dimensão de um nanotransportador sintético mensurada ao longo de qualquer eixo do nanotransportador sintético. Por exemplo, para um nanotrans- portador sintético esferoidal, as dimensões máxima e mínima de um nanotransportador sintético são substancialmente idênticas, e têm o tamanho do seu diâmetro. De um modo semelhante, para um nanotransportador sintético cuboidal, a dimensão mínima de um nanotransportador sintético é menor da sua altura, largura ou comprimento, ao passo que a dimensão máxima de um nanotrans- portador sintético é o maior da sua altura, largura ou comprimento. Em uma modalidade, uma dimensão mínima de pelo menos 75 %, de preferência pelo menos 80 %, mais preferencialmente pelo menos 90 %, dos nanotransportadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanotransportadores sintéticos na amostra, é igual ou superior a 100 nm. Em uma modalidade, uma dimensão máxima de pelo menos 75 %, preferencialmente pelo menos 80 %, mais preferencial-mente pelo menos 90 %, dos nanotransportadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanotransportadores sintéticos na amostra, é igual ou inferior a 5 μm. Preferencialmente, uma dimensão mínima de pelo menos 75 %, preferencialmente pelo menos 80 %, mais preferencialmente pelo menos 90 %, dos nanotransportadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanotransportadores sintéticos na amostra, é superior a 110 nm, mais preferencialmente superior a 120 nm, mais preferencialmente superior a 130 nm, e ainda mais preferencialmente superior a 150 nm. As razões de aspecto das dimensões máxima e mínima dos nanotransportadores sintéticos inventivos podem variar, dependendo da modalidade. Por exemplo, as razões de aspecto entre as dimensões máxima e mínima dos nanotransportadores sintéticos podem variar desde 1:1 até 1 000 000:1, preferivelmente desde 1:1 até 100 000:1, mais preferivelmente desde 1:1 até 10 000:1, mais preferivelmente desde 1:1 até 1000:1, ainda mais preferivelmente desde 1:1 até 100:1, e ainda mais preferivelmente desde 1:1 até 10:1. De preferência, uma dimensão máxima de pelo menos 75%, de preferência pelo menos 80%, com mais preferência pelo menos 90%, dos nanotransportadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanotransportadores sintéticos presentes na amostra, é igual ou menor do que 3 μm, com mais preferência igual ou menor do que 2 μm, com mais preferência igual ou menor do que 1 μm, com mais preferência igual ou menor do que 800 nm, com mais preferência igual ou menor do que 600 nm, e com mais preferência ainda igual ou menor do que 500 nm. Em modalidades preferidas, uma dimensão mínima de pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, dos nanotransportadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanotransportadores sintéticos na amostra, é igual ou superior a 100 nm, mais preferencialmente igual ou superior a 120 nm, mais preferencialmente igual ou superior a 130 nm, mais preferencialmente igual ou superior a 140 nm e, mais preferencialmente ainda igual ou superior a 150 nm. A medição de dimensões de nanotransportadores sintéticos (por exemplo, diâmetro) é obtida por meio da suspensão dos nanotransportadores sintéticos em um meio líquido (habitualmente aquoso) e usando dispersão dinâmica da luz (DLS) (por exemplo, usando um instrumento Brookhaven ZetaPALS). Por exemplo, uma suspensão de nanotransportadores sintéticos pode ser diluída a partir de um tampão aquoso para água purificada, para alcançar uma concentração final da suspensão de nanotransportadores sintéticos de aproximadamente 0,01 a 0,1 mg/mL. A suspensão diluída pode ser preparada diretamente dentro de, ou transferida para, uma cuvete adequada para análise de DLS. A cuvete pode então ser colocada no DLS, deixada equilibrar para a temperatura controlada, e então submetida à varredura por um tempo suficiente para adquirir uma distribuição estável e reprodutível com base em entradas apropriadas para a viscosidade do meio e índices de refração da amostra. O diâmetro efetivo, ou média da distribuição, é então relatado. "Dimensão"ou "tamanho" ou "diâmetro"dos nanotransportadores sintéticos significa a média de uma distribuição do tamanho das partículas obtida utilizando dispersão dinâmica da luz.
[000104] "MHC" se refere ao complexo principal de histocompa- tibilidade, uma ampla região genômica ou família de genes presente na maioria dos vertebrados que codifica moléculas de MHC que apresentam fragmentos ou epitopos de proteínas processadas sobre a superfície da célula. A apresentação de MHC:peptídeo em superfícies celulares permite vigilância por células imunológicas, geralmente uma célula T. Há duas classes gerais de moléculas de MHC: Classe I e Classe II. Geralmente, as moléculas de MHC de Classe I se encontram em células nucleadas e apresentam peptídeos a células T citotóxicas. As moléculas de MHC de Classe II se encontram em certas células imunológicas, principalmente macrófagos, células B e células dendrí- ticas, chamadas coletivamente de APCs profissionais. Os genes mais bem conhecidos na região MHC são o subconjunto que codifica as proteínas apresentadoras de antígenos na superfície da célula. Nos seres humanos, estes genes são referidos como genes de antígenos leucocitários humanos (HLA).
[000105] "Polímero sem terminação metóxi"significa um polímero que tem pelo menos uma extremidade que termina com uma fração diferente de metóxi. Em algumas modalidades, o polímero tem pelo menos duas extremidades que terminam com uma fração diferente de metóxi. Em outras modalidades, o polímero não tem extremidades que terminem com metóxi. "Polímero que não é Pluronic com terminação metóxi"significa um polímero que não é um polímero Pluronic linear com metóxi em ambos os terminais. Nanopartículas poliméricas proporcionadas aqui podem compreender polímeros sem terminação metóxi ou polímeros que não são Pluronic com terminação metóxi.
[000106] "Obtido" significa coletado diretamente de um material e usado substancialmente sem modificação e/ou processamento.
[000107] "Excipiente farmaceuticamente aceitável"significa um material farmacologicamente inativo usado em conjunto com os nanotransportadores sintéticos relatados para formular as composições inventivas. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis compreendem uma variedade de materiais conhecidos na área, incluindo mas não se limitando a sacarídeos (tais como glicose, lactose, e afins), conservantes, como agentes antimicrobianos, auxiliares da reconstituição, corantes, solução salina (como solução salina tamponada com fosfato), e tampões.
[000108] "Protocolo" refere-se a qualquer regime de dosagem de uma ou mais substâncias a um sujeito. Um regime de dosagem pode incluir a quantidade, frequência e/ou modo de administração. Em algumas modalidades, esse protocolo pode ser usado para administrar uma ou mais composições da invenção a um ou mais sujeitos de teste. Respostas imunológicas em esses sujeitos de teste podem então ser avaliadas para determinar se o protocolo foi ou não eficaz na redução de uma resposta imunológica indesejada ou geração de uma resposta imunológica desejada (por exemplo, a promoção de um efeito tolerogênico). Qualquer outro efeito terapêutico e/ou profilático também pode ser avaliado em vez ou para além das respostas imunológicas acima mencionadas. Se um protocolo teve ou não um efeito desejado pode ser determinado usando qualquer um dos métodos proporci-onados aqui ou então conhecidos na área. Por exemplo, uma população de células pode ser obtida de um sujeito a quem foi administrada uma composição proporcionada aqui de acordo com um protocolo específico, para determinar se células imunológicas, citocinas, anticorpos específicos, etc., foram ou não reduzidos, gerados, ativados, etc. Métodos úteis para detectar a presença e/ou número de células imunológicas incluem mas não estão limitados a métodos de citometria de fluxo (por exemplo, FACS) e métodos de imunohistoquímica. Anticorpos e outros agentes de ligação para a coloração específica de marcadores de células imunológicas estão disponíveis no mercado. Tais estojos incluem tipicamente reagentes de coloração para múltiplos antígenos que permitem a detecção, separação e/ou quantificação, baseadas em FACS, de uma população celular desejada a partir de uma população heterogênea de células.
[000109] "Proporcionar um sujeito"é uma ação ou conjunto de ações que fazem com que um médico entre em contato com um sujeito e administre ao mesmo uma composição proporcionada aqui ou implemente no mesmo um método proporcionado aqui. De preferência, o sujeito está necessitado de uma resposta imunológica tolerogênica como proporcionada aqui. A ação ou conjunto de ações pode ser diretamente por si só ou indiretamente, tal como mas não se limitando a uma terceira parte não relacionada que efetua uma ação em função das palavras ou atos de alguém.
[000110] "Sujeito" significa animais, incluindo mamíferos de sangue quente, como humanos e primatas; aves domésticas; animais domésticos ou de criação, como gatos, cães, ovelhas, cabras, vacas, cavalos e porcos; animais laboratoriais, como camundongos, ratos e porquinhos-da-índia; peixes; répteis; animais de zoológicos e selvagens; e afins.
[000111] "Substancialmente nenhuns epitopos de células B" refere-se à ausência de epitopos de células B em uma quantidade (em si própria, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva) que estimula uma ativação substancial de uma resposta de células B. Em modalidades, uma composição com substancialmente nenhuns epitopos de células B não contém uma quantidade mensurável de epitopos de células B de um antígeno. Em outras modalidades, essa composição pode compreender uma quantidade mensurável de epitopos de células B de um antígeno, mas essa quantidade não é eficaz para gerar uma resposta imunológica de células B mensurável (em si própria, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva), como produção de anticorpos específicos para o antígeno ou proliferação e/ou atividade de células B específicas para o antígeno, ou não é eficaz para gerar uma resposta imunológica de células B mensurável significativa (em si própria, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva). Em algumas modalidades, uma resposta imunológica de células B mensurável significativa é tal que produz ou é esperado que produza um resultado clínico adverso em um sujeito. Em outras modalidades, uma resposta imunológica de células B mensurável significativa é tal que é maior do que o nível do mesmo tipo de resposta imunológica (por exemplo, produção de anticorpos específicos para o antígeno ou proliferação e/ou atividade de células B específicas para o antígeno) produzida por um antígeno de controle (por exemplo, um que é conhecido não compreender epitopos de células B do antígeno ou estimular respostas imunológicas de células B). Em algumas modalidades, uma resposta imunológica de células B mensurável significativa, como uma medição de títulos de anticorpos (por exemplo, por ELISA) é maior em 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes ou mais do que o mesmo tipo de resposta produzida por um controle (por exemplo, antígeno de controle). Em outras modalidades, uma composição com substancialmente nenhuns epitopos de células B é tal que produz poucos até nenhuns títulos de anticorpos específicos para o antígeno (em si própria, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva). Essas composições incluem aquelas que produzem um título de anticorpos (na forma de um valor EC50) menor do que 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20 ou 10. Em outras modalidades, uma resposta imunológica de células B mensurável significativa é uma medição do número ou proliferação de células B que é maior em 10 %, 25 %, 50 %, 100 %, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes ou mais do que o mesmo tipo de resposta produzida por um controle. Outros métodos de medição de respostas de células B são conhecidos dos profissionais.
[000112] Em modalidades, para assegurar que uma composição compreende substancialmente nenhuns epitopos de células B, são selecionados antígenos de modo a não compreenderem epitopos de células B para acoplamento aos nanotransportadores sintéticos proporcionados aqui. Em outras modalidades, para assegurar que uma composição compreende substancialmente nenhuns epitopos de células B de um antígeno, os nanotransportadores sintéticos acoplados ao antígeno são produzidos e testados quanto a respostas imunológicas de células B (por exemplo, produção de anticorpos específicos para o antígeno, proliferação e/ou atividade de células B). Composições que exibem as propriedades desejadas podem então ser selecionadas.
[000113] "Substancialmente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II" refere-se à ausência de epitopos restritos a MHC de Classe II em uma quantidade (em si própria, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva) que estimula uma ativação substancial de uma resposta imunológica de células T CD4+ específicas para o antígeno. Em modalidades, uma composição com substancialmente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II não contém uma quantidade mensurável de epitopos restritos a MHC de Classe II de um antígeno. Em outras modalidades, essa composição pode compreender uma quantidade mensurável de epitopos restritos a MHC de Classe II de um antígeno, mas essa quantidade não é eficaz para gerar uma resposta imunológica de células T CD4+ mensurável (em si própria, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva), ou não é eficaz para gerar uma resposta imunológica de células T CD4+ mensurável significativa (em si própria, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva). Em algumas modalidades, uma resposta imunológica de células T CD4+ mensurável significativa é tal que produz ou é esperado que produza um resultado clínico adverso em um sujeito. Em outras modalidades, uma resposta imunológica de células T CD4+ mensurável significativa é tal que é maior do que o nível do mesmo tipo de resposta imunológica produzida por um antígeno de controle (por exemplo, um que é conhecido não compreender epitopos de restritos a MHC de Classe II do antígeno ou estimular respostas imunológicas de células T CD4+). Em modalidades, as composições não compreendem epitopos restritos a MHC de Classe II (em si próprios, no contexto do antígeno, em conjunção com um transportador ou em conjunção com uma composição inventiva) que geram respostas imunológicas de células T CD4+ específicas para antígenos ou um seu nível indesejado.
[000114] Em modalidades, para assegurar que uma composição compreende substancialmente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II, são selecionados antígenos de modo a não compreenderem epitopos restritos a MHC de Classe II a serem carregados nos itDCs, ou seus precursores, como proporcionado aqui. Em outras modalidades, para assegurar que uma composição compreende substancialmente nenhuns epitopos restritos a MHC de Classe II de um antígeno, os itDCs, ou seus precursores, são produzidos e testados quanto a respostas imunológicas de células T CD4+ (por exemplo, proliferação e/ou atividade de células T CD4+ específicas para antígenos). Composições que exibem as propriedades desejadas podem então ser selecionadas.
[000115] "Nanotransportador(es) sintético(s)"significa um objeto discreto que não se encontra na natureza, e que possui pelo menos uma dimensão de tamanho menor ou igual a 5 mícrons. Nanopartículas de albumina geralmente são incluídas como nanotransportadores sintéticos, no entanto, em certas modalidades, os nanotransportadores sintéticos não compreendem nanopartículas de albumina. Em modalidades, nanotransportadores sintéticos inventivos não compreendem quitosana. Em outras modalidades, nanotransportadores sintéticos inventivos não são nanopar- tículas à base de lipídeos. Em modalidades adicionais, nanotransportadores sintéticos inventivos não compreendem um fosfolipídeo.
[000116] Um nanotransportador sintético pode ser mas não está limitado a uma ou uma pluralidade de nanopartículas à base de lipídeos (também aqui chamadas de nanopartículas lipídicas, isto é, nanopartículas em que a maioria do material que compõe a sua estrutura consiste em lipídeos), nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsões baseadas em tensoativos, dendrímeros, futebolenos, nanofios, partículas do tipo vírus (isto é, partículas que são principalmente constituídas por proteínas estruturais virais mas que não são infecciosas ou têm baixa infectividade), partículas à base de peptídeos ou proteínas (também aqui chamadas de partículas proteicas, isto é, partículas em que a maioria dos materiais que compõem a sua estrutura são peptídeos ou proteínas) (tais como nanopartículas de albumina) e/ou nanopartículas que são desenvolvidas utilizando uma combinação de nanomateriais, tais como nanopartículas de lipídeos-polímeros. Os nanotransportadores sintéticos podem ter uma variedade de formas diferentes, incluindo mas não se limitando a esferoidal, cuboidal, piramidal, alongada, cilíndrica, toroidal, e afins. Os nanotransportadores sintéticos de acordo com a invenção compreendem uma ou mais superfícies. Nanotransportadores sintéticos exemplificativos que podem ser adaptados para utilização na prática da presente invenção compreendem: (1) as nanopartículas biodegradáveis divulgadas na Patente US 5,543,158 atribuída a Gref et al., (2) as nanopartículas poliméricas do Pedido de Patente US Publicado 20060002852 atribuído a Saltzman et al., (3) as nanopartículas construídas de modo litográfico do Pedido de Patente US Publicado 20090028910 atribuído a DeSimone et al., (4) a divulgação de WO 2009/051837 atribuída a von Andrian et al., (5) as nanopartículas divulgadas no Pedido de Patente US Publicado 2008/0145441 atribuído a Penades et al., (6) as nanopartículas proteicas divulgadas no Pedido de Patente US Publicado 20090226525 atribuído a de los Rios et al., (7) as partículas do tipo vírus divulgadas no Pedido de Patente US publicado 20060222652 atribuído a Sebbel et al., (8) as partículas do tipo vírus acopladas a ácidos nucleicos divulgadas no Pedido de Patente US publicado 20060251677 atribuído a Bachmann et al., (9) as partículas do tipo vírus divulgadas em WO2010047839A1 ou WO2009106999A2, (10) as nanopartículas nanoprecipitadas divulgadas em P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles"Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010), ou (11) células apoptóticas, corpos apoptóticos ou os miméticos sintéticos ou semissintéticos divulgados na Publicação U.S. 2002/0086049. Em modalidades, os nanotransportadores sintéticos podem possuir uma razão de aspecto superior a 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, ou superior a 1:10.
[000117] Os nanotransportadores sintéticos de acordo com a invenção que têm uma dimensão mínima igual ou inferior a cerca de 100 nm, de preferência igual ou inferior a 100 nm, não compreendem uma superfície com grupos hidroxila que ativam o complemento ou, em alternativa, compreendem uma superfície que consiste essencialmente em porções que não são grupos hidroxila que ativam o complemento. Em uma modalidade preferida, os nanotransportadores sintéticos de acordo com a invenção que têm uma dimensão mínima igual ou inferior a cerca de 100 nm, de preferência igual ou inferior a 100 nm, não compreendem uma superfície que ativa substancialmente o complemento ou, em alternativa, compreendem uma superfície que consiste essencialmente em porções que não ativam substancialmente o complemento. Em uma modalidade mais preferida, os nanotransportadores sintéticos de acordo com a invenção que têm uma dimensão mínima igual ou inferior a cerca de 100 nm, de preferência igual ou inferior a 100 nm, não compreendem uma superfície que ativa o complemento ou, em alternativa, compreendem uma superfície que consiste essencialmente em porções que não ativam o complemento. Em modalidades, nanotransportadores sintéticos excluem partículas do tipo vírus. Em modalidades, os nanotransportadores sintéticos podem possuir uma razão de aspecto superior a 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, ou superior a 1:10.
[000118] "Antígeno de células T" significa um antígeno de células T CD4+ ou antígeno de células CD8+. "Antígeno de células T CD4+" significa qualquer antígeno que é reconhecido por uma célula T CD4+ e desencadeia uma resposta imunológica em uma célula T CD4+, por exemplo, um antígeno que é especificamente reconhecido por um receptor de células T em uma célula T CD4+ via apresentação do antígeno, ou sua porção, ligado a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de Classe II. "Antígeno de células T CD8+" significa qualquer antígeno que é reconhecido por uma célula T CD8+ e desencadeia uma resposta imunológica em uma célula T CD8+, por exemplo, um antígeno que é especificamente reconhecido por um receptor de células T em uma célula T CD8+ via apresentação do antígeno, ou sua porção, ligado a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de Classe I. Em algumas modalidades, um antígeno que é um antígeno de células T também é um antígeno de células B. Em outras modalidades, o antígeno de células T não é um antígeno também de células B. Antígenos de células T são geralmente proteínas ou peptídeos.
[000119] Uma "proteína terapêutica"refere-se a qualquer proteína ou terapia de base proteica que pode ser administrada a um sujeito e tem um efeito terapêutico. Essas terapias incluem terapias de substituição proteica e suplementação proteica. Essas terapias também incluem a administração de uma proteína exógena ou estranha, terapias com anticorpos, e terapias com células ou à base de células. Proteínas terapêuticas incluem enzimas, cofatores enzimáticos, hormônios, fatores de coagulação do sangue, citocinas, fatores de crescimento, anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais. Exemplos de outras proteínas terapêuticas são proporcionados aqui em outro local. Proteínas terapêuticas podem ser produzidas em, sobre ou por células e podem ser obtidas dessas células ou administradas na forma dessas células. Em modalidades, a proteína terapêutica é produzida em, sobre ou por células de mamífero, células de inseto, células de levedura, células de bactéria, células de planta, células de animais transgênicos, células de plantas transgênicas, etc. A proteína terapêutica pode ser produzida de modo recombinante em tais células. A proteína terapêutica pode ser produzida em, sobre ou por uma célula viralmente transformada. A proteína terapêutica também pode ser produzida em, sobre ou por células autólogas que foram transfectadas, transduzidas ou então manipuladas para a expressarem. Em alternativa, a proteína terapêutica pode ser administrada na forma de um ácido nucleico ou mediante introdução de um ácido nucleico em um vírus, VLP, lipossomo, etc. Em alternativa, a proteína terapêutica pode ser obtida dessas formas e administrada como a própria proteína terapêutica. Em consequência, sujeitos incluem qualquer sujeito que tenha recebido, esteja recebendo ou venha a receber quaisquer dos anteriores. Esse sujeito inclui sujeitos que tenham recebido, estejam recebendo ou venham a receber terapia genética, células autólogas que foram transfectadas, transduzidas ou então manipuladas para expressarem uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo terapêutico; ou células que expressam uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo terapêutico.
[000120] "Antígeno de proteína terapêutica"significa um antígeno que está associado a uma proteína terapêutica que pode ser, ou cuja porção pode ser, apresentada para reconhecimento por células do sistema imunológico e pode gerar uma resposta imunológica indesejada (por exemplo, a produção de anticorpos específicos para a proteína terapêutica) contra a proteína terapêutica. Antígenos de proteínas terapêuticas incluem geralmente proteínas, polipeptídeos, peptídeos, lipoproteínas, ou estão contidos ou são expressos em, sobre ou por células.
[000121] "Resposta imunológica tolerogênica"significa qualquer resposta imunológica que pode conduzir a supressão imunológica específica para um antígeno ou uma célula, tecido, órgão, etc., que expressa esse antígeno. Essas respostas imunológicas incluem qualquer redução, retardamento ou inibição de uma resposta imunológica indesejada específica para o antígeno ou célula, tecido, órgão, etc., que expressa esse antígeno. Essas respostas imunológicas também incluem qualquer estimulação, produção, indução, promoção ou recrutamento de uma resposta imunológica desejada específica para o antígeno ou célula, tecido, órgão, etc., que expressa esse antígeno. Em consequência, respostas imunológicas tolerogênicas incluem a ausência ou redução de uma resposta imunológica indesejada a um antígeno que pode ser mediada por células reativas com antígenos, bem como a presença ou promoção de células supressoras. Respostas imunológicas tolerogênicas proporcionadas aqui incluem tolerância imunológica. "Gerar uma resposta imunológica tolerogênica"refere-se à geração de qualquer uma das respostas imunológicas anteriores específicas para um antígeno ou célula, tecido, órgão, etc., que expressa esse antígeno. A resposta imunológica tolerogênica pode dever-se a apresentação restrita a MHC de Classe I e/ou apresentação restrita a MHC de Classe II e/ou apresentação por células B e/ou apresentação por CD1d, etc.
[000122] Respostas imunológicas tolerogênicas incluem qualquer redução, retardamento ou inibição da proliferação e/ou atividade de células T CD4+, células T CD8+ ou células B. Respostas imunológicas tolerogênicas também incluem uma redução da produção de anticorpos específicos para antígenos. Respostas imunológicas tolerogênicas também podem incluir qualquer resposta que conduza à estimulação, indução, produção ou recrutamento de células reguladoras, como células Treg CD4+, células Treg CD8+, células Breg, etc. Em algumas modalidades, a resposta imunológica tolerogênica é tal que leva à conversão em um fenótipo regulador caracterizado pela produção, indução, estimulação ou recrutamento de células reguladoras.
[000123] Respostas imunológicas tolerogênicas também incluem qualquer resposta que conduza à estimulação, produção ou recrutamento de células Treg CD4+ e/ou células Treg CD8+. Células Treg CD4+ podem expressar o fator de transcrição FoxP3 e inibir respostas inflamatórias e doenças inflamatórias autoimunes ("Human regulatory T cells in autoimmune diseases". Cvetanovich GL, Hafler DA. Curr Opin Immunol. dezembro 2010;22(6):753-60. "Regulatory T cells and autoimmunity". Vila J, Isaacs JD, Anderson AE.Curr Opin Hematol. julho 2009;16(4):274-9). Essas células também suprimem o auxílio de células T a células B e induzem tolerância a autoantígenos e antígenos estranhos ("Therapeutic approaches to allergy and autoimmunity based on FoxP3+ regulatory T-cell activation and expansion". Miyara M, Wing K, Sakaguchi S. J Allergy Clin Immunol. abril 2009;123(4):749-55). Células Treg CD4+ reconhecem antígenos quando apresentados por proteínas de Classe II em APCs. Células Treg CD8+, que reconhecem antígenos apresentados pela Classe I (e Qa-1), também podem suprimir o auxílio de células T a células B e levar à ativação de tolerância indutora de supressão antígeno-específica a autoantígenos e antígenos estranhos. Foi mostrado que a destruição da interação de Qa-1 com células Treg CD8+ desregula respostas imunológicas e leva ao desenvolvimento da formação de autoanticorpos e de um lúpus eritematoso sistêmico letal autoimune (Kim et al., Nature. 16 setembro 2010, 467 (7313): 328-32). Também foi mostrado que células Treg CD8+ inibem modelos de doenças inflamatórias autoimunes, incluindo artrite reumatoide e colite ("CD4+CD25+ regulatory T cells in autoimmune arthritis". Oh S, Rankin AL, Caton AJ. Immunol Rev. janeiro 2010;233(1):97-111. "Regulatory T cells in inflammatory bowel disease". Boden EK, Snapper SB. Curr Opin Gastroenterol. novembro 2008;24(6):733-41). Em algumas modalidades, as composições proporcionadas podem efetivamente resultar em ambos os tipos de respostas (Treg CD4+ e Treg CD8+). Em outras modalidades, FoxP3 pode ser induzido em outras células imunológicas, como macrófagos, células iNKT, etc., e as composições proporcionadas aqui também podem resultar em uma ou mais dessas respostas.
[000124] Respostas imunológicas tolerogênicas também incluem mas não estão limitadas à indução de citocinas reguladoras, como citocinas Treg; indução de citocinas inibidoras; a inibição de citocinas inflamatórias (por exemplo, IL-4, IL-1b, IL-5, TNF-α, IL-6, GM-CSF, IFN- Y, IL-2, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, M-CSF, proteína C reativa, proteína de fase aguda, quimiocinas (por exemplo, MCP-1, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MIG, ITAC ou IP-10), a produção de citocinas anti-inflamatórias (por exemplo, IL-4, IL-13, IL-10, etc.), quimiocinas (por exemplo, CCL-2, CXCL8), proteases (por exemplo, MMP-3, MMP-9), leucotrienos (por exemplo, CysLT-1, CysLT-2), prostaglandinas (por exemplo, PGE2) ou histaminas; a inibição de polarização a uma resposta imunológica de Th17, Th1 ou Th2; a inibição de citocinas específicas para células efetoras: Th17 (por exemplo, IL- 17, IL-25), Th1 (IFN-Y), Th2 (por exemplo, IL-4, IL-13); a inibição de fatores de transcrição Th1-, Th2- ou TH17-específicos; a inibição da proliferação de células T efetoras; a indução de apoptose de células T efetoras; a indução de genes específicos para células dendríticas tolerogênicas, a indução da expressão de FoxP3, a inibição da indução de IgE ou respostas imunológicas mediadas por IgE; a inibição de respostas de anticorpos (por exemplo, produção de anticorpos específicos para antígenos); a inibição de respostas de células T auxiliadoras; a produção de TGF-β e/ou IL-10; a inibição da função efetora de autoanticorpos (por exemplo, inibição da depleção de células, danos em células ou tecidos ou ativação do complemento); etc.
[000125] Qualquer uma das anteriores pode ser mensurada in vivo em um ou mais modelos animais, ou pode ser mensurada in vitro. O profissional está familiarizado com tais medições in vivo ou in vitro. Respostas imunológicas indesejadas ou respostas imunológicas tolerogênicas podem ser monitoradas usando, por exemplo, métodos de avaliação do número e/ou função de células imunológicas, análise de tetrâmeros, ELISPOT, análise da expressão de citocinas baseada em citometria de fluxo, secreção de citocinas, estabelecimento do perfil de expressão de citocinas, estabelecimento do perfil de expressão genética, estabelecimento do perfil de expressão de proteínas, análise de marcadores da superfície celular, detecção baseada em PCR da utilização de genes de receptores de células imunológicas (ver T. Clay et al., "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer" Clinical Cancer Research 7:1127-1135 (2001)), etc. Respostas imunológicas indesejadas ou respostas imunológicas tolerogênicas também podem ser monitoradas usando, por exemplo, métodos de avaliação de níveis de proteínas em plasma ou soro, proliferação de células imunológicas e/ou ensaios funcionais, etc. Em algumas modalidades, respostas imunológicas tolerogênicas podem ser monitoradas avaliando a indução de FoxP3. Adicionalmente, métodos específicos são descritos em mais detalhe nos Exemplos.
[000126] De preferência, respostas imunológicas tolerogênicas conduzem à inibição do desenvolvimento, progressão ou patologia das doenças, distúrbios ou condições médicas descritos aqui. Se as composições inventivas podem ou não conduzir à inibição do desenvolvimento, progressão ou patologia das doenças, distúrbios ou condições médicas descritos aqui pode ser mensurado com modelos animais de tais doenças, distúrbios ou condições médicas. Em algumas modalidades, a redução de uma resposta imunológica indesejada ou geração de uma resposta imunológica tolerogênica pode ser avaliada determinando desfechos clínicos, eficácia clínica, sintomas clínicos, biomarcadores de doença e/ou pontuações clínicas. Respostas imunológicas indesejadas ou respostas imunológicas tolerogênicas também podem ser avaliadas com testes de diagnóstico para averiguar a presença ou ausência de uma doença, distúrbio ou condição médica proporcionada aqui. Respostas imunológicas indesejadas também podem ser avaliadas por métodos de medição de níveis e/ou função de proteínas terapêuticas em um sujeito. Em modalidades, métodos de monitoração ou avaliação de respostas alérgicas indesejadas incluem avaliar uma resposta alérgica em um sujeito por reatividade na pele e/ou produção de anticorpos específicos para alergênios.
[000127] Em algumas modalidades, monitorar ou avaliar a geração de uma resposta imunológica indesejada ou de uma resposta imunológica tolerogênica em um sujeito pode anteceder a administração de uma composição de nanotransportadores sintéticos proporcionada aqui e/ou anteceder a administração de um enxerto transplantável ou proteína terapêutica ou exposição a um alergênio. Em outras modalidades, avaliar a geração de uma resposta imunológica indesejada ou resposta imunológica tolerogênica pode seguir-se à administração de uma composição de nanotransportadores sintéticos proporcionada aqui e/ou seguir-se à administração de um enxerto transplantável ou proteína terapêutica ou exposição a um alergênio. Em algumas modalidades, a avaliação é realizada após a administração da composição de nanotransportadores sintéticos, mas antes da administração de um enxerto transplantável ou proteína terapêutica ou exposição a um alergênio. Em outras modalidades, a avaliação é realizada após a administração de um enxerto transplantável ou proteína terapêutica ou exposição a um alergênio, mas antes da administração da composição. Ainda em outras modalidades, a avaliação é realizada antes da administração dos nanotransportadores sintéticos e administração de um enxerto transplantável ou proteína terapêutica ou exposição a um alergênio, ao passo que, em ainda outras modalidades, a avaliação é realizada após a administração dos nanotransportadores sintéticos e a administração de um enxerto transplantável ou proteína terapêutica ou exposição a um alergênio. Em modalidades adicionais, a avaliação é realizada antes e após a administração dos nanotransportadores sintéticos e/ou administração de um enxerto transplantável ou proteína terapêutica ou exposição a um alergênio. Ainda em outras modalidades, a avaliação é realizada mais do que uma vez no sujeito para determinar que um estado imunológico desejável é mantido no sujeito, como um sujeito que sofre ou está em risco de sofrer de uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma alergia, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Outros sujeitos incluem aqueles que foram submetidos ou serão submetidos à transplantação, bem como aqueles que receberam, estão recebendo ou irão receber uma proteína terapêutica contra a qual sofreram, estão sofrendo ou é esperado que venham a sofrer de uma resposta imunológica indesejada.
[000128] Uma resposta de anticorpos pode ser avaliada determinando um ou mais títulos de anticorpos. "Título de anticorpos" significa um nível mensurável de produção de anticorpos. Métodos de medição de títulos de anticorpos são conhecidos na área e incluem o Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA). Em modalidades, a resposta de anticorpos pode ser quantificada, por exemplo, como o número de anticorpos, concentração de anticorpos ou título. Os valores podem ser absolutos ou podem ser relativos. Ensaios para quantificar uma resposta de anticorpos incluem ensaios de captura de anticorpos, ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios de inibição da absorção em fase líquida (ILPAAs), ensaios de imunoele- troforese em foguete (RIE) e ensaios de imunoeletroforese em linha (LIE). Quando uma resposta de anticorpos é comparada com outra resposta de anticorpos, é preferivelmente usado o mesmo tipo de valor quantitativo (por exemplo, título) e método de medição (por exemplo, ELISA) para fazer a comparação.
[000129] Um método ELISA para mensurar um título de anticorpos, por exemplo, um ELISA de intercalar típico, pode consistir das etapas seguintes: (i) preparar um material de revestimento de placas de ELISA de modo que o alvo de anticorpo de interesse seja acoplado a um polímero de substrato, ou outro material adequado, (ii) preparar o material de revestimento em uma solução aquosa (como PBS) e distribuir a solução do material de revestimento nos poços de uma placa de múltiplos poços, para deposição por uma noite do revestimento sobre a placa de múltiplos poços, (iii) lavar extensamente a placa de múltiplos poços com tampão de lavagem (como 0,05 % Tween-20 em PBS), para remover material de revestimento em excesso, (iv) bloquear a placa quanto a ligação inespecífica mediante aplicação de uma solução diluente (como 10 % soro fetal de bovino em PBS), (v) lavar da placa a solução bloqueadora/diluente com tampão de lavagem, (vi) diluir a(s) amostra(s) de soro contendo anticorpos e padrões apropriados (controles positivos) com diluente, consoante o requerido, para se obter uma concentração que satura adequadamente a resposta de ELISA, (vii) diluir em série as amostras de plasma na placa de múltiplos poços de modo a abranger uma gama de concentrações adequadas para gerar uma curva de respostas de ELISA, (viii) incubar a placa de modo a proporcionar a ligação anticorpo-alvo, (ix) lavar a placa com tampão de lavagem para remover anticorpos não ligados a antígeno, (x) adicionar uma concentração apropriada de um anticorpo secundário de detecção no mesmo diluente, como um anticorpo de detecção acoplado a biotina, capaz de ligar-se ao anticorpo primário, (xi) incubar a placa com o anticorpo de detecção aplicado, seguido de lavagem com tampão de lavagem, (xii) adicionar uma enzima, como estreptavidina-HRP (peroxidase de rábano bravo), que irá se ligar à biotina presente em anticorpos biotinilados e incubar, (xiii) lavar a placa de múltiplos poços, (xiv) adicionar substrato(s) (como solução de TMB) à placa, (xv) aplicar uma solução de terminação (como 2 N ácido sulfúrico) depois de completado o desenvolvimento de cor, (xvi) ler a densidade ótica dos poços da placa a um comprimento de onda específico para o substrato (450 nm com subtração de leituras a 570 nm), (xvi) aplicar aos dados um ajustamento da curva multiparamétrico adequado e definir a concentração efetiva semimáxima (EC50) como a concentração na curva à qual é alcançada metade do valor OD máximo para os padrões da placa.
[000130] Um "enxerto transplantável"refere-se a um material biológico, como células, tecidos e órgãos (na totalidade ou em parte), que pode ser administrado a um sujeito. Enxertos transplantáveis podem ser autoenxertos, aloenxertos, ou xenoenxertos, por exemplo, de um material biológico, como um órgão, tecido, pele, osso, nervos, tendão, neurônios, vasos sanguíneos, tecido adiposo, córnea, células pluripotentes, células diferenciadas (obtidas ou derivadas in vivo ou in vitro), etc. Em algumas modalidades, um enxerto transplantável é formado, por exemplo, de cartilagem, osso, matriz extracelular, ou matrizes de colágeno. Enxertos transplantáveis também podem consistir em células isoladas, suspensões de células e células em tecidos e órgãos que podem ser transplantadas. As células transplantáveis têm tipicamente uma função terapêutica, por exemplo, uma função que está ausente ou decrescida em um sujeito receptor. Alguns exemplos não limitadores de células transplantáveis são células β, hepatócitos, células estaminais hematopoiéticas, células estaminais neuronais, neurônios, células da glia, ou células de mieliniza- ção. Células transplantáveis podem ser células que não estão modificadas, por exemplo, células obtidas de um sujeito doador e que podem ser usadas em transplantação sem quaisquer modificações genéticas ou epigenéticas. Em outras modalidades, células transplantáveis podem ser células modificadas, por exemplo, células obtidas de um sujeito com uma deficiência genética, em que a deficiência genética foi corrigida, ou células que são derivadas de células reprogramadas, por exemplo, células diferenciadas derivadas de células obtidas de um sujeito.
[000131] "Transplantação"refere-se ao processo de transferir (mover) um enxerto transplantável para um sujeito receptor (por exemplo, de um sujeito doador, de uma fonte in vitro (por exemplo, células pluripotentes diferenciadas autólogas ou heterólogas nativas ou induzidas)) e/ou de uma localização corporal para outra localização corporal no mesmo sujeito.
[000132] "Resposta imunológica indesejada" refere-se a qualquer resposta imunológica indesejada que resulta da exposição a um antígeno, promove ou exacerba uma doença, distúrbio ou condição médica proporcionada aqui (ou um seu sintoma), ou é sintomática de uma doença, distúrbio ou condição médica proporcionada aqui. Tais respostas imunológicas têm geralmente um impacto negativo no estado de saúde de um sujeito ou são sintomáticas de um impacto negativo no estado de saúde de um sujeito. Responses imunológicas indesejadas incluem proliferação e/ou atividade de células T CD8+ específicas para antígenos. Em consequência, respostas imunológicas desejadas incluem a deleção de células T CD8+ efetoras, a inibição da estimulação ou ativação de células T CD8+, a inibição da proliferação de células T CD8+, a inibição da produção de citocinas por células T CD8+, etc. Quando a produção de citocinas é inibida ou alterada, essa inibição ou alteração também pode originar uma redução do auxílio de células T CD4+ e/ou respostas imunológicas de células B. Métodos para testar essas respostas imunológicas são proporcionados aqui ou então são conhecidos dos profissionais.
C. COMPOSIÇÕES INVENTIVAS
[000133] São proporcionadas aqui composições de nanotransportadores sintéticos tolerogênicos compreendendo imunossupressores e epitopos restritos a MHC de Classe I e/ou restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a respostas imunológicas de células T CD8+ indesejadas, e métodos relacionados. Essas composições e métodos são úteis para reduzir a geração de respostas imunológicas indesejadas e promover a geração de respostas imunológicas tolerogênicas por redução de respostas imunológicas de células T CD8+ específicas para antígenos, como proliferação e/ou atividade. As composições podem ser administradas a sujeitos nos quais é desejada uma resposta imunológica tolerogênica. Tais sujeitos incluem aqueles que sofrem ou estão em risco de sofrer de uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma alergia, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro. Esses sujeitos também incluem aqueles a quem foi, está sendo ou será administrada uma proteína terapêutica contra a qual o sujeito sofreu ou é esperado que sofra de uma resposta imunológica indesejada. Esses sujeitos também incluem aqueles que foram submetidos ou serão submetidos à transplantação.
[000134] Como mencionado acima, os nanotransportadores sintéticos são planejados para compreenderem imunossupressores e, em algumas modalidades, antígeno contra o qual é desejado um efeito tolerogênico. Uma grande variedade de nanotransportadores sintéticos pode ser usada de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos são esferas ou esferoides. Em algumas modalidades, nanotransportadores sintéticos são planos ou têm a forma de placas. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos são cubos ou cúbicos. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos são ovais ou elíticos. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos são cilíndricos, cônicos ou piramidais.
[000135] Em algumas modalidades, é desejável usar uma população de nanotransportadores sintéticos que seja relativamente uniforme no que se refere ao tamanho, forma, e/ou composição, de modo que cada nanotransportador sintético tenha propriedades similares. Por exemplo, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % dos nanotransportadores sintéticos, com base no número total de nanotransportadores sintéticos, pode ter uma dimensão mínima ou dimensão máxima que cai dentro dos 5 %, 10 %, ou 20 % do diâmetro médio ou dimensão média dos nanotransportadores sintéticos. Em algumas modalidades, uma população de nanotransportadores sintéticos pode ser heterogênea relativamente ao tamanho, forma e/ou composição.
[000136] Os nanotransportadores sintéticos podem ser maciços ou ocos e podem compreender uma ou mais camadas. Em algumas modalidades, cada camada tem uma composição única e propriedades únicas em relação à(s) outra(s) camada(s). Para dar apenas um exemplo, os nanotransportadores sintéticos podem ter uma estrutura de núcleo/invólucro, em que o núcleo consiste em uma camada (por exemplo, um núcleo polimérico) e o invólucro consiste de uma segunda camada (por exemplo, uma bicamada ou monocamada lipídica). Os nanotransportadores sintéticos podem compreender uma pluralidade de diferentes camadas.
[000137] Em algumas modalidades, nanotransportadores sintéticos podem opcionalmente compreender um ou mais lipídeos. Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético pode compreender um lipossomo. Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético pode compreender uma bicamada lipídica. Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético pode compreender uma monocamada lipídica. Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético pode compreender um micélio. Em algumas modalidades, um nanotranspor- tador sintético pode compreender um núcleo, compreendendo uma matriz polimérica, rodeado por uma camada lipídica (por exemplo, bicamada lipídica, monocamada lipídica, etc.). Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético pode compreender um núcleo não polimérico (por exemplo, partícula metálica, ponto quântico, partícula cerâmica, partícula óssea, partícula viral, proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, etc.) rodeado por uma camada lipídica (por exemplo, bicamada lipídica, monocamada lipídica, etc.).
[000138] Em outras modalidades, nanotransportadores sintéticos podem compreender partículas metálicas, pontos quânticos, partículas cerâmicas, etc. Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético não polimérico é um agregado de componentes não poliméricos, como um agregado de átomos metálicos (por exemplo, átomos de ouro).
[000139] Em algumas modalidades, nanotransportadores sintéticos podem opcionalmente compreender uma ou mais entidades anfifílicas. Em algumas modalidades, uma entidade anfifílica pode promover a produção de nanotransportadores sintéticos com estabilidade aumentada, uniformidade melhorada, ou viscosidade aumentada. Em algumas modalidades, entidades anfifílicas podem estar associadas à superfície interior de uma membrana lipídica (por exemplo, bicamada lipídica, monocamada lipídica, etc.). Muitas entidades anfifílicas conhecidas na área são adequadas para utilização na preparação de nanotransportadores sintéticos de acordo com a presente invenção. Essas entidades anfifílicas incluem mas não estão limitadas a fosfoglicerídeos; fosfati- dilcolinas; dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC); dioleilfosfatidil etanolamina (DOPE); dioleiloxipropiltrietilamônio (DOTMA); dioleoilfosfatidilcolina; colesterol; éster de colesterol; diacilglicerol; succinato de diacilglicerol; difosfatidil glicerol (DPPG); hexanodecanol; álcoois graxos, como polietileno glicol (PEG); éter de polioxietileno-9-laurila; um ácido graxo com atividade de superfície, como ácido palmítico ou ácido oleico; ácidos graxos; monoglicerídeos de ácidos graxos; diglicerídeos de ácidos graxos; amidas de ácidos graxos; glicocolato de trioleato de sorbitana (Span®85); monolaurato de sorbitana (Span®20); polissorbato 20 (Tween®20); polissorbato 60 (Tween®60); polissorbato 65 (Tween®65); polissorbato 80 (Tween®80); polissorbato 85 (Tween®85); monoestearato de polioxie- tileno; surfactina; um poloxâmero; um éster de ácido graxo e sorbitana, como trioleato de sorbitana; lecitina; lisolecitina; fosfatidilserina; fosfatidilinositol; esfingomielina; fosfatidiletanolamina (cefalina); cardiolipina; ácido fosfatídico; cerebrosídeos; dicetilfosfato; dipalmitoilfosfatidilgli- cerol; estearilamina; dodecilamina; hexadecil-amina; palmitato de acetila; ricinoleato de glicerol; estearato de hexadecila; miristato de isopropila; tiloxapol; poli(etileno glicol)5000-fosfatidiletanolamina; monoestearato de poli(etileno glicol)400; fosfolipídeos; detergentes sintéticos e/ou naturais com altas propriedades tensoativos; desoxicolatos; ciclodextrinas; sais caotrópicos; agentes de emparelhamento iônico; e respectivas combinações. Um componente de uma entidade anfifílica pode ser uma mistura de diferentes entidades anfifílicas. Os profissionais reconhecerão que essa é uma lista exemplificativa, não exaustiva, de substâncias com atividade de tensoativo. Qualquer entidade anfifílica pode ser usada na produção de nanotransportadores sintéticos a serem usados de acordo com a presente invenção.
[000140] Em algumas modalidades, nanotransportadores sintéticos podem opcionalmente compreender um ou mais carboidratos. Os carboidratos podem ser naturais ou sintéticos. Um carboidrato pode ser um carboidrato natural derivatizado. Em certas modalidades, um carboidrato compreende monossacarídeo ou dissacarídeo, incluindo mas não se limitando a glicose, frutose, galactose, ribose, lactose, sacarose, maltose, trealose, celobiose, manose, xilose, arabinose, ácido glucurônico, ácido galacturônico, ácido manurônico, glucosamina, galactosamina, e ácido neurâmico. Em certas modalidades, um carboidrato é um polissacarídeo, incluindo mas não se limitando a pululana, celulose, celulose microcristalina, hidroxipropil metilcelulose (HPMC), hidroxice- lulose (HC), metilcelulose (MC), dextrana, ciclodextrana, glicogênio, hidroxietilamido, carragenana, glicon, amilose, quitosana, N,O-carboxilme- tilquitosana, algina e ácido algínico, amido, quitina, inulina, conjac, glucomanana, pustulana, heparina, ácido hialurônico, curdlana, e xantana. Em modalidades, os nanotransportadores sintéticos inventivos não compreendem (ou excluem especificamente) carboidratos, como um polissacarídeo. Em certas modalidades, o carboidrato pode compreender um derivado de carboidrato, como um álcool de açúcar, incluindo mas não se limitando a manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, maltitol, e lactitol.
[000141] Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos podem compreender um ou mais polímeros. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos compreendem um ou mais polímeros que não são um polímero Pluronic com terminação metóxi. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% (peso/peso) dos polímeros que constituem os nanotransportadores sintéticos são polímeros que não são Pluronic com terminação metóxi. Em algumas modalidades, todos os polímeros que constituem os nanotransportadores sintéticos são polímeros que não são Pluronic com terminação metóxi. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos compreendem um ou mais polímeros que não são um polímero com terminação metóxi. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% (peso/peso) dos polímeros que constituem os nanotransportadores sintéticos são polímeros que não têm terminação metóxi. Em algumas modalidades, todos os polímeros que constituem os nanotransportadores sintéticos são polímeros que não têm terminação metóxi. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos compreendem um ou mais polímeros que não compreendem polímero Pluronic. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% (peso/peso) dos polímeros que constituem os nanotransportadores sintéticos não compreendem polímero Pluronic. Em algumas modalidades, todos os polímeros que constituem os nanotransportadores sintéticos não compreendem polímero Pluronic. Em algumas modalidades, esse polímero pode estar rodeado por uma camada de revestimento (por exemplo, lipossomo, monocamada lipídica, micélio, etc.). Em algumas modalidades, vários elementos dos nanotransportadores sintéticos podem ser acoplados ao polímero.
[000142] Os imunossupressores e/ou antígenos podem ser acoplados aos nanotransportadores sintéticos por meio de alguns métodos. Em geral, o acoplamento pode ser um resultado da ligação entre os imunossu- pressores e/ou antígenos e os nanotransportadores sintéticos. Essa ligação pode fazer com que os imunossupressores e/ou antígenos fiquem ligados à superfície dos nanotransportadores sintéticos e/ou contidos dentro (encapsulados) dos nanotransportadores sintéticos. Em algumas modalidades, no entanto, os imunossupressores e/ou antígenos são encapsulados pelos nanotransportadores sintéticos devido à estrutura dos nanotransportadores sintéticos e não à ligação aos nanotransportadores sintéticos. Em modalidades preferíveis, os nanotransportadores sintéticos compreendem um polímero como proporcionado aqui, e os imunossupressores e/ou antígenos são acoplados ao polímero.
[000143] Quando ocorre acoplamento devido à ligação entre os imunossupressores e/ou antígenos e nanotransportadores sintéticos, o acoplamento pode ocorrer via uma fração de acoplamento. Uma fração de acoplamento pode ser qualquer fração através da qual um imunossupressor e/ou antígeno é ligado a um nanotransportador sintético. Tais frações incluem ligações covalentes, como uma ligação de amida ou ligação de éster, bem como moléculas separadas que ligam (de modo covalente ou não covalente) o imunossupressor e/ou antígeno ao nanotransportador sintético. Tais moléculas incluem ligadores ou polímeros ou uma unidade dos mesmos. Por exemplo, a fração de acoplamento pode compreender um polímero com carga ao qual se liga de modo eletrostático um imunossupressor e/ou antígeno. Como outro exemplo, a fração de acoplamento pode compreender um polímero ou unidade do mesmo ao qual se liga de modo covalente.
[000144] Em modalidades preferidas, os nanotransportadores sintéticos compreendem um polímero como proporcionado aqui. Esses nanotransportadores sintéticos podem ser totalmente poliméricos ou podem ser uma mistura de polímeros e outros materiais.
[000145] Em algumas modalidades, os polímeros de um nanotrans- portador sintético associam-se, formando uma matriz polimérica. Em algumas dessas modalidades, um componente, como um imunossu- pressor ou antígeno, pode ser associado de modo covalente a um ou mais polímeros da matriz polimérica. Em algumas modalidades, a associação covalente é mediada por um ligador. Em algumas modalidades, um componente pode ser associado de modo não covalente a um ou mais polímeros de uma matriz polimérica. Por exemplo, em algumas modalidades, um componente pode ser encapsulado dentro, rodeado por, e/ou disperso em toda uma matriz polimérica. Em alternativa ou adicionalmente, um componente pode ser associado a um ou mais polímeros de uma matriz polimérica mediante interações hidrofóbicas, interações de carga, forças de van der Waals, etc. É convencionalmente conhecida uma grande variedade de polímeros e métodos de formação de matrizes poliméricas a partir dos mesmos.
[000146] Os polímeros podem ser polímeros naturais ou não naturais (sintéticos). Os polímeros podem ser homopolímeros ou copolímeros compreendendo dois ou mais monômeros. Em termos da sequência, os copolímeros podem ser aleatórios, de bloco, ou compreender uma combinação de sequências aleatórias e de bloco. Tipicamente, os polímeros de acordo com a presente invenção são polímeros orgânicos.
[000147] Em algumas modalidades, o polímero compreende um poliéster, policarbonato, poliamida, ou poliéter, ou unidade dos mesmos. Em outras modalidades, o polímero compreende poli(etileno glicol) (PEG), polipropileno glicol, poli(ácido lático), poli(ácido glicólico), poli(ácido lático-co-glicólico), ou uma policaprolactona, ou unidade dos mesmos. Em algumas modalidades, é preferido que o polímero seja biodegradável. Portanto, em essas modalidades, é preferido que, se o polímero compreender um poliéter, como poli(etileno glicol) ou polipropileno glicol ou unidade do mesmo, o polímero compreenda um copolímero de bloco de um poliéter e um polímero biodegradável, de modo que o polímero seja biodegradável. Em outras modalidades, o polímero não compreende somente um poliéter ou unidade do mesmo, como poli(etileno glicol) ou polipropileno glicol ou unidade dos mesmos.
[000148] Outros exemplos de polímeros adequados para utilização na presente invenção incluem mas não estão limitados a polietilenos, policarbonatos (por exemplo poli(1,3-dioxan-2-ona)), polianidridos (por exemplo poli(anidrido sebácico)), polipropilfumeratos, poliamidas (por exemplo, policaprolactama), poliacetais, poliéteres, poliésteres (por exemplo, poliláctido, poliglicólido, poliláctido-co-glicólido, policaprolactona, polihidroxiácido (por exemplo, poli(β-hidroxialcanoato))), poli(ortoésteres), policianoacrilatos, álcoois de polivinila, poliuretanos, polifosfazenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliureias, poliestirenos, e poliaminas, polilisina, copolímeros de polilisina-PEG, e poli(etilenoimina), copolímeros de poli(etileno imina)-PEG.
[000149] Em algumas modalidades, polímeros de acordo com a presente invenção incluem polímeros que foram aprovados para utilização em humanos pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) ao abrigo de 21 C.F.R. § 177.2600, incluindo mas não se limitando a poliésteres (por exemplo, ácido polilático, poli(ácido lático-co-glicólico), policaprolactona, polivalerolactona, poli(1,3-dioxan-2-ona)); polianidridos (por exemplo, poli(anidrido sebácico)); poliéteres (por exemplo, polietileno glicol); poliuretanos; polimetacrilatos; poliacrilatos; e policianoacrilatos.
[000150] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser hidrofílicos. Por exemplo, os polímeros podem compreender grupos aniônicos (por exemplo, grupo fosfato, grupo sulfato, grupo carboxilato); grupos catiônicos (por exemplo, grupo de amina quaternária); ou grupos polares (por exemplo, grupo hidroxila, grupo tiol, grupo amina). Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético compreendendo uma matriz polimérica hidrofílica gera um ambiente hidrofílico dentro do nanotransportador sintético. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser hidrofóbicos. Em algumas modalidades, um nanotrans- portador sintético compreendendo uma matriz polimérica hidrofóbica gera um ambiente hidrofóbico dentro do nanotransportador sintético. A seleção da hidrofilicidade ou hidrofobicidade do polímero pode ter um impacto na natureza dos materiais que são incorporados (por exemplo, acoplados) dentro do nanotransportador sintético.
[000151] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser modificados com uma ou mais frações e/ou grupos funcionais. Uma variedade de frações ou grupos funcionais pode ser usada de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser modificados com polietileno glicol (PEG), com um carboidrato, e/ou com poliacetais acíclicos derivados de polissacarídeos (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786: 301). Certas modalidades podem ser implementadas usando os ensinamentos gerais da Patente US No 5543158 atribuída a Gref et al., ou publicação WO WO2009/051837 de Von Andrian et al.
[000152] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser modificados com um grupo lipídico ou de ácido graxo. Em algumas modalidades, um grupo ácido graxo pode ser um ou mais de ácido butírico, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behênico, ou lignocérico. Em algumas modalidades, um grupo ácido graxo pode ser um ou mais de ácido palmitoleico, oleico, vacênico, linoleico, alfa-linoleico, gama-linoleico, araquidônico, gadoleico, eicosapentaenoico, docosa-hexaenoico, ou erúcico.
[000153] Em algumas modalidades, polímeros podem ser poliésteres, incluindo copolímeros compreendendo unidades de ácido lático e ácido glicólico, como poli(ácido lático-co-ácido glicólico) e poli(láctido-co- glicólido), coletivamente chamados aqui de "PLGA"; e homopolímeros compreendendo unidades de ácido glicólico, chamados aqui de "PGA," e unidades de ácido lático, como ácido poli-L-lático, ácido poli-D-lático, ácido poli-D,L-lático, poli-L-láctido, poli-D-láctido, e poli-D,L-láctido, coletivamente chamados aqui de "PLA". Em algumas modalidades, poliésteres exemplificativos incluem, por exemplo, poli-hidroxiácidos; copolímeros de PEG e copolímeros de láctido e glicólido (por exemplo, copolímeros de PLA-PEG, copolímeros de PGA-PEG, copolímeros de PLGA-PEG, e respectivos derivados. Em algumas modalidades, poliésteres incluem, por exemplo, poli(caprolactona), copolímeros de poli(caprolactona)-PEG, poli(L-láctido-co-L-lisina), poli(éster de serina), poli(éster de 4-hidróxi-L-prolina), poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico], e respectivos derivados.
[000154] Em algumas modalidades, um polímero pode ser PLGA. O PLGA é um copolímero biocompatível e biodegradável de ácido láctico e ácido glicólico, e várias formas de PLGA são caracterizadas pela razão de ácido láctico:ácido glicólico. O ácido láctico pode ser ácido L-láctico, ácido D-láctico, ou ácido D,L-láctico. A taxa de degradação do PLGA pode ser ajustada alterando a razão de ácido lático:ácido glicólico. Em algumas modalidades, o PLGA a ser usado de acordo com a presente invenção é caracterizado por uma razão de ácido lático:ácido glicólico de aproximadamente 85:15, aproximadamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75, ou aproximadamente 15:85.
[000155] Em algumas modalidades, os polímeros podem consistir em um ou mais polímeros acrílicos. Em certas modalidades, polímeros acrílicos incluem, por exemplo, copolímeros de ácido acrílico e ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metila, metacrilatos de etoxietila, metacrilato de cianoetila, copolímero de metacrilato de aminoalquila, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), copolímero de ácido metacrílico e alquilamida, poli(metacrilato de metila), poli(anidrido do ácido metacrílico), metacrilato de metila, polimetacrilato, copolímero de poli(metacrilato de metila), poliacrilamida, copolímero de metacrilato de aminoalquila, copolímeros de metacrilato de glicidila, policianoacrilatos, e combinações compreendendo um ou mais dos polímeros anteriores. O polímero acrílico pode compreender copolímeros totalmente polimeri- zados de ésteres dos ácidos acrílico e metacrílico com um baixo teor de grupos de amônio quaternário.
[000156] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser polímeros catiônicos. Em geral, polímeros catiônicos são capazes de condensar e/ou proteger fitas com carga negativa de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, ou respectivos derivados). Polímeros contendo amina, como poli(lisina) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; e Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), poli(etileno imina) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92: 7297), e dendrímeros de poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; e Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) têm carga positiva ao pH fisiológico, formam pares iônicos com ácidos nucleicos, e medeiam a transfeção em uma variedade de linhagens de células. Em modalidades, os nanotransportadores sintéticos inventivos podem não compreender (ou podem excluir) polímeros catiônicos.
[000157] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser poliésteres degradáveis contendo cadeias laterais catiônicas (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32: 3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115: 11010); Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22: 3250; e Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; e Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). Exemplos desses poliésteres incluem poli(L-láctido-co-L-lisina) (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115: 11010), poli(éster de serina) (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23: 3399), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32: 3658; e Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121: 5633), e poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32: 3658; e Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121: 5633).
[000158] As propriedades desses e de outros polímeros e métodos para a sua preparação são bem conhecidos na área (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 6.123.727; 5.804.178; 5.770.417; 5.736.372; 5.716.404; 6.095.148; 5.837.752; 5.902.599; 5.696.175; 5.514.378; 5.512.600; 5.399.665; 5.019.379; 5.010.167; 4.806.621; 4.638.045; e 4.946.929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; e Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). Mais em geral, uma variedade de métodos para sintetizar certos polímeros adequados é descrita em "Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts", Editado por Goethals, Pergamon Press, 1980; "Principles of Polymerization" de Odian, John Wiley & Sons, Quarta Edição, 2004; "Contemporary Polymer Chemistry" de Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390: 386; e nas Patentes U.S. 6.506.577, 6.632.922, 6.686.446, e 6.818.732.
[000159] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser polímeros lineares ou ramificados. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser dendrímeros. Em algumas modalidades, os polímeros podem estar substancialmente reticulados entre si. Em algumas modalidades, os polímeros podem estar substancialmente desprovidos de reticulações. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser usados de acordo com a presente invenção sem sofrerem uma etapa de reticulação. Também deve ser entendido que os nanotransportadores sintéticos inventivos podem compreender copolímeros de bloco, copolímeros de enxerto, blendas, misturas, e/ou adutos de quaisquer dos anteriores e outros polímeros. Os profissionais reconhecerão que os polímeros listados aqui representam uma lista exemplificativa, não exaustiva, de polímeros que podem ser usados de acordo com a presente invenção.
[000160] Em outras modalidades, nanotransportadores sintéticos podem compreender partículas metálicas, pontos quânticos, partículas cerâmicas, etc. Em algumas modalidades, um nanotransportador sintético não polimérico é um agregado de componentes não poliméricos, como um agregado de átomos metálicos (por exemplo, átomos de ouro).
[000161] Composições de acordo com a invenção compreendem nanotransportadores sintéticos em combinação com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como conservantes, tampões, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato. As composições podem ser preparadas usando técnicas farmacêuticas convencionais de fabricação e composição para obter formas de dosagem úteis. Em uma modalidade, nanotransportadores sintéticos inventivos são suspensos em solução salina esterilizada para injeção juntamente com um conservante.
[000162] Em modalidades, na preparação de nanotransportadores sintéticos como transportadores, podem ser úteis métodos de acoplamento dos componentes aos nanotransportadores sintéticos. Se o componente for uma molécula pequena, pode ser vantajoso ligar o componente a um polímero antes da reunião dos nanotransportadores sintéticos. Em modalidades, também pode ser vantajoso preparar os nanotransportadores sintéticos com grupos de superfície que são usados para acoplar os componentes aos nanotransportadores sintéticos através da utilização desses grupos de superfície, em vez de ligar os componentes a um polímero e então usar esse conjugado de polímero na construção de nanotransportadores sintéticos.
[000163] Em certas modalidades, o acoplamento pode consistir em um ligador covalente. Em modalidades, peptídeos de acordo com a invenção podem ser acoplados de modo covalente à superfície externa via um ligador de 1,2,3-triazol, formado pela reação de cicloadição 1,3- dipolar de grupos azido na superfície do nanotransportador com antígeno ou imunossupressor contendo um grupo alcino, ou pela reação de cicloadição 1,3-dipolar de alcinos na superfície do nanotransportador com antígenos ou imunossupressores contendo um grupo azido. Essas reações de cicloadição são preferivelmente realizadas na presença de um catalisador de Cu(I) em conjunto com um ligante adequado para Cu(I) e um agente redutor para reduzir o composto Cu(II) no composto Cu(I) ativo catalítico. Essa cicloadição de azida-alcino catalisada por Cu(I) (CuAAC) também pode ser chamada de reação "click".
[000164] Adicionalmente, o acoplamento covalente pode compreender um ligador covalente que compreende um ligador de amida, um ligador de dissulfureto, um ligador de tioéter, um ligador de hidrazona, um ligador de hidrazida, um ligador de imina ou oxima, um ligador de ureia ou tioureia, um ligador de amidina, um ligador de amina, e um ligador de sulfonamida.
[000165] Um ligador de amida é formado via uma ligação amida entre uma amina em um componente e o grupo ácido carboxílico de um segundo componente, como o nanotransportador. A ligação amida no ligador pode ser preparada usando quaisquer das reações convencionais formadoras de ligações amida com aminoácidos adequadamente protegidos e ácido carboxílico ativado, como um éster ativado de N-hidroxissuccinimida.
[000166] Um ligador dissulfureto é preparado via a formação de uma ligação dissulfureto (S-S) entre dois átomos de enxofre na forma, por exemplo, de R1-S-S-R2. Uma ligação dissulfureto pode ser formada por troca de tiol de um componente contendo um grupo tiol/mercaptana (- SH) por outro grupo tiol ativado em um polímero ou nanotransportador, ou um nanotransportador contendo grupos tiol/mercaptana por um componente contendo um grupo tiol ativado.
[000167] Um ligador de triazol, especificamente um 1,2,3-triazol da forma
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, em que R1 e R2 podem ser quaisquer entidades químicas, é preparado por meio da reação de cicloadição 1,3-dipolar de uma azida ligada a um primeiro componente, como o nanotransportador, com um alcino terminal ligado a um segundo componente, como o imunossupressor ou antígeno. A reação de cicloadição 1,3-dipolar é realizada com ou sem um catalisador, de preferência com catalisador de Cu(I), que liga os dois componentes por meio de uma função 1,2,3-triazol. Essa química é descrita em detalhe por Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002) e Meldal, et al, Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015, e é muitas vezes chamada de reação "click" ou CuAAC.
[000168] Em algumas modalidades, é preparado um polímero contendo um grupo azida ou alcino, terminal à cadeia polimérica. Esse polímero é então usado para preparar um nanotransportador sintético de um modo tal que uma pluralidade dos grupos alcino ou azida está posicionada na superfície desse nanotransportador. Em alternativa, o nanotransportador sintético pode ser preparado por outra via, e ser subsequentemente funcionalizado com grupos alcino ou azida. O componente é preparado com a presença de um grupo alcino (se o polímero contiver uma azida) ou de um grupo azida (se o polímero contiver um alcino). O componente é então deixado reagir com o nanotransportador via a reação de cicloadição 1,3-dipolar, com ou sem um catalisador, que procede ao acoplamento covalente do componente à partícula através do ligador de 1,2,3-triazol 1,4-dissubstituído.
[000169] Um ligador de tioéter é preparado por meio da formação de uma ligação enxofre-carbono (tioéter) na forma, por exemplo, de R1-S- R2. Um tioéter pode ser preparado por alquilação de um grupo tiol/mercaptana (-SH) em um componente com um grupo de alquilação, como haleto ou epóxido, em um segundo componente. Os ligadores de tioéter também podem ser formados por meio da adição de Michael de um grupo tiol/mercaptana em um componente a um grupo alceno deficiente em elétrons em um segundo componente contendo um grupo maleimida ou grupo vinil sulfona, como aceitador de Michael. Em um outro modo, ligadores de tioéter podem ser preparados por meio da reação de tiol-eno mediada por radicais de um grupo tiol/mercaptana em um componente com um grupo alceno em um segundo componente.
[000170] Um ligador de hidrazona é preparado pela reação de um grupo hidrazida em um componente com um grupo aldeído/cetona no segundo componente.
[000171] Um ligador de hidrazida é formado pela reação de um grupo hidrazina em um componente com um grupo ácido carboxílico no segundo componente. Essa reação é geralmente realizada usando química similar à formação de uma ligação amida, em que o ácido carboxílico é ativado com um reagente ativador.
[000172] Um ligador de imina ou oxima é formado pela reação de um grupo amina ou N-alcoxiamina (ou amino-óxi) em um componente com um grupo aldeído ou cetona no segundo componente.
[000173] Um ligador de ureia ou tioureia é preparado pela reação de um grupo amina em um componente com um grupo isocianato ou tioisocianato no segundo componente.
[000174] Um ligador de amidina é preparado pela reação de um grupo amina em um componente com um grupo imidoéster no segundo componente.
[000175] Um ligador de amina é preparado pela reação de alquilação de um grupo amina em um componente com um grupo de alquilação, como um grupo haleto, epóxido, ou éster de sulfonato, no segundo componente. Em alternativa, um ligador de amina também pode ser preparado por aminação redutora de um grupo amina em um componente com um grupo aldeído ou cetona no segundo componente com um reagente redutor adequado, como cianoboridreto de sódio ou triacetoxiboridreto de sódio.
[000176] Um ligador de sulfonamida é preparado pela reação de um grupo amina em um componente com um grupo haleto de sulfonila (como cloreto de sulfonila) no segundo componente.
[000177] Um ligador de sulfona é preparado pela adição de Michael de um nucleófilo a uma vinil sulfona. A vinil sulfona ou o nucleófilo pode estar presente na superfície do nanotransportador ou ligado a um componente.
[000178] O componente também pode ser conjugado ao nanotransportador via métodos de conjugação não covalentes. Por exemplo, um antígeno ou imunossupressor de carga negativa pode ser conjugado a um nanotransportador com carga positiva através de adsorção eletrostática. Um componente contendo um ligante metálico também pode ser conjugado a um nanotransportador contendo um complexo metálico via um complexo metal-ligante.
[000179] Em modalidades, o componente pode ser ligado a um polímero, por exemplo, ácido polilático-bloco-polietileno glicol, antes da reunião do nanotransportador sintético, ou o nanotransportador sintético pode ser formado com grupos reativos ou ativáveis em sua superfície. No último caso, o componente pode ser preparado com um grupo que é compatível com a química de ligação que é apresentada pela superfície dos nanotransportadores sintéticos. Em outras modalidades, um componente peptídico pode ser ligado a VLPs ou lipossomos usando um ligador adequado. Um ligador é um composto ou reagente que é capaz de acoplar duas moléculas em conjunto. Em uma modalidade, o ligador pode ser um reagente homobifuncional ou heterobifuncional como descrito em Hermanson 2008. Por exemplo, um nanotransportador sintético de VLP ou lipossomo contendo um grupo carboxílico na superfície pode ser tratado com um ligador homobifuncional, dihidrazida adípica (ADH), na presença de EDC, para formar o nanotransportador sintético correspondente com o ligador de ADH. O nanotransportador sintético ligado a ADH resultante é então conjugado a um componente peptídico contendo um grupo ácido via a outra extremidade do ligador de ADH em NC, para produzir o correspondente conjugado peptídico de VLP ou lipossomo.
[000180] Quanto a descrições detalhadas de métodos de conjugação disponíveis ver Hermanson G T "Bioconjugate Techniques", 2a Edição Publicado pela Academic Press, Inc., 2008. Para além da ligação covalente, o componente pode ser acoplado por adsorção a um nanotransportador sintético pré-formado ou pode ser acoplado por encapsulamento durante a formação do nanotransportador sintético.
[000181] Qualquer imunossupressor proporcionado aqui pode ser acoplado ao nanotransportador sintético. Imunossupressores incluem mas não estão limitados a estatinas; inibidores de mTOR, como rapamicina ou um análogo da rapamicina; agentes de sinalização de TGF-β; agonistas de receptores de TGF-β; inibidores da histona desacetilase (HDAC); corticosteroides; inibidores da função mitocondrial, como rotenona; inibidores de P38; inibidores de NF-Kβ; agonistas de receptores de adenosina; agonistas de prostaglandina E2; inibidores de fosfodieste- rases, como inibidor da fosfodiesterase 4; inibidores de proteassomos; inibidores de cinases; agonistas de receptores acoplados à proteína G; antagonistas de receptores acoplados à proteína G; glucocorticoides; retinoides; inibidores de citocinas; inibidores de receptores de citocinas; ativadores de receptores de citocinas; antagonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos; agonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos; inibidores da calcineurina; inibidores de fosfatases e ATPs oxidados. Imunossupressores também incluem IDO, vitamina D3, ciclosporina A, inibidores de receptores de hidrocarbonetos arila, resveratrol, azatiopurina, 6-mercaptopurina, aspirina, ácido niflúmico, estriol, tripolida, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-10), siRNAs abordando citocinas ou receptores de citocinas e afins.
[000182] Exemplos de estatinas incluem atorvastatina (LIPITOR®, TORVAST®), cerivastatina, fluvastatina (LESCOL®, LESCOL® XL), lovastatina (MEVACOR®, ALTOCOR®, ALTOPREV®), mevastatina (COMPACTIN®), pitavastatina (LIVALO®, PIAVA®), rosuvastatina (PRAVACHOL®, SELEKTINE®, LIPOSTAT®), rosuvastatina (CRESTOR®), e sinvastatina (ZOCOR®, LIPEX®).
[000183] Exemplos de inibidores de mTOR incluem rapamicina e seus análogos (por exemplo, CCL-779, RAD001, AP23573, C20- metalilrapamicina (C20-Marap), C16-(S)-butilsulfonamidorrapamicina (C16-BSrap), C16-(S)-3-metilindolrapamicina (C16-iRap) (Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (NVP- BEZ235), ácido crisofânico (crisofanol), deforolimus (MK-8669), everolimus (RAD0001), KU-0063794, PI-103, PP242, temsirolimus, e WYE-354 (disponibilizados pela Selleck, Houston, TX, EUA).
[000184] Exemplos de agentes de sinalização de TGF-β incluem ligantes de TGF-β (por exemplo, activina A, GDF1, GDF11, proteínas morfogênicas do osso, nodal, TGF-βs) e seus receptores (por exemplo, ACVR1B, ACVR1C, ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, BMPR1A, BMPR1B, TGFβRI, TGFβRII), R-SMADS/co-SMADS (por exemplo, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD8), e inibidores de ligantes (por exemplo, folistatina, nogina, cordina, DAN, "lefty", LTBP1, THBS1, Decorina).
[000185] Exemplos de inibidores da função mitocondrial incluem atractilosídeo (sal dipotássico), ácido bongkréquico (sal de triamônio), carbonil cianeto de m-clorofenil-hidrazona, carboxia- tractilosídeo (por exemplo, de Atractylis gummifera), CGP-37157, (- )-Deguelina (por exemplo, de Mundulea sericea), F16, peptídeo do domínio de ligação de VDAC de hexocinase II, oligomicina, rotenona, Ru360, SFK1, e valinomicina (por exemplo, de Streptomyces fulvissimus) (EMD4Biosciences, EUA).
[000186] Exemplos de inibidores de P38 incluem SB-203580 (4-(4- Fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)1H-imidazol), SB-239063 (trans-1-(4-hidroxiciclo-hexil)-4-(fluorofenil)-5-(2-metóxi-pirimidin-4-il) imidazol), SB-220025 (5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1-(4- piperidinil)imidazol)), e ARRY-797.
[000187] Exemplos de inibidores de NF (por exemplo, NK-Kβ) incluem IFRD1, 2-(1,8-naftiridin-2-il)-Fenol, ácido 5-aminossalicílico, BAY 11-7082, BAY 11-7085, CAPE (Éster de Fenetila do Ácido Cafeico), maleato de dietila, Inibidor de IKK-2 IV, IMD 0354, lactacistina, MG-132 [Z-Leu-Leu- Leu-CHO], Inibidor da Ativação de NFKB III, Inibidor da Ativação de NF-KB II, JSH-23, partenolida, Óxido de Fenilarsina (PAO), PPM-18, sal de amônio do ácido pirrolidinoditiocarbâmico, QNZ, RO 106-9920, rocaglamida, rocaglamida AL, rocaglamida C, rocaglamida I, rocaglamida J, rocaglaol, (R)-MG-132, salicilato de sódio, triptolida (PG490), wedelolactona.
[000188] Exemplos de agonistas de receptores de adenosina incluem CGS-21680 e ATL-146e.
[000189] Exemplos de agonistas de prostaglandina E2 incluem E- Prostanoide 2 e E-Prostanoide 4.
[000190] Exemplos de inibidores de fosfodiesterases (inibidores não seletivos e seletivos) incluem cafeína, aminofilina, IBMX (3-isobutil-1- metilxantina), paraxantina, pentoxifilina, teobromina, teofilina, xantinas metiladas, vimpocetina, EHNA (eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil)adenina), anagrelida, enoximona (PERFANTM), milrinona, levosimendona, mesembrina, ibudilast, piclamilast, luteolina, drotaverina, roflumilast (DAXASTM, DALIRESPTM), sildenafil (REVATION®, VIAGRA®), tadalafil (ADCIRCA®, CIALIS®), vardenafil (LEVITRA®, STAXYN®), udenafil, avanafil, icariina, 4-metilpiperazina, e pirazol pirimidina-7-1.
[000191] Exemplos de inibidores de proteassomos incluem bortezomib, disulfiram, epigalocatequina-3-galato, e salinosporamida A.
[000192] Exemplos de inibidores de cinases incluem bevacizumab, BIBW 2992, cetuximab (ERBITUX®), imatinib (GLEEVEC®), trastuzumab (HERCEPTIN®), gefitinib (IRESSA®), ranibizumab (LUCENTIS®), pegaptanib, sorafenib, dasatinib, sunitinib, erlotinib, nilotinib, lapatinib, panitumumab, vandetanib, E7080, pazopanib, mubritinib.
[000193] Exemplos de glucocorticoides incluem hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilpredni- solona, dexametasona, betametasona, triancinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA), e aldosterona.
[000194] Exemplos de retinoides incluem retinol, retinal, tretinoína (ácido retinoico, RETIN-A®), isotretinoína (ACCUTANE®, AMNESTEEM®, CLARAVIS®, SOTRET®), alitretinoína (PANRETIN®), etretinato (TEGISONTM) e seu metabólito acitretina (SORIATANE®), tazaroteno (TAZORAC®, AVAGE®, ZORAC®), bexaroteno (TARGRETIN®), e adapaleno (DIFFERIN®).
[000195] Exemplos de inibidores de citocinas incluem IL1ra, antagonista de receptores de IL1, IGFBP, TNF-BF, uromodulina, Alfa-2- Macroglobulina, Ciclosporina A, Pentamidina, e Pentoxifilina (PENTOPAK®, PENTOXIL®, TRENTAL®).
[000196] Exemplos de antagonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos incluem GW9662, antagonista de PPARY III, G335, T0070907 (EMD4Biosciences, EUA).
[000197] Exemplos de agonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos incluem pioglitazona, ciglitazona, clofibrato, GW1929, GW7647, L-165,041, LY 171883, ativador de PPARY, Fmoc-Leu, troglitazona, e WY-14643 (EMD4Biosciences, EUA).
[000198] Exemplos de inibidores de histona desacetilase incluem ácidos hidroxâmicos (ou hidroxamatos) como tricostatina A, tetrapeptídeos cíclicos (como trapoxina B) e depsipeptídeos, benzamidas, cetonas eletrofílicas, compostos ácidos alifáticos, como butirato de fenila e ácido valproico, ácidos hidroxâmicos como vorinostat (SAHA), belinostat (PXD101), LAQ824, e panobinostat (LBH589), benzamidas como entinostat (MS-275), CI994, e mocetinostat (MGCD0103), nicotinamida, derivados de NAD, dihidrocumarina, naftopiranona, e 2-hidroxinaftaldeídos.
[000199] Exemplos de inibidores da calcineurina incluem ciclosporina, pimecrolimus, voclosporina, e tacrolimus.
[000200] Exemplos de inibidores de fosfatases incluem cloridrato de BN82002, CP-91149, caliculina A, ácido cantarídico, cantaridina, cipermetrina, etil-3,4-defostatina, sal de sódio de fostriecina, MAZ51, metil-3,4-defostatina, NSC 95397, norcantaridina, sal de amônio do ácido ocadaico de Prorocentrum concavum, ácido ocadaico, sal de potássio do ácido ocadaico, sal de sódio do ácido ocadaico, óxido de fenilarsina, vários coquetéis de inibidores de fosfatases, proteína fosfatase 1C, proteína inibidora da proteína fosfatase 2A, proteína fosfatase 2A1, proteína fosfatase 2A2, ortovanadato de sódio.
[000201] Em algumas modalidades, os antígenos como descrito aqui são também acoplados a nanotransportadores sintéticos. Em algumas modalidades, os antígenos são acoplados a nanotransportadores sintéticos iguais ou diferentes daqueles aos quais são acoplados os imunossupressores. Em outras modalidades, os antígenos não são acoplados a nenhuns nanotransportadores sintéticos. Antígenos incluem quaisquer dos antígenos proporcionados aqui, ou respectivos fragmentos ou derivados, cujos antígenos estão associados a doenças inflamatórias, autoimunes, alergia, rejeição de órgão ou tecido, doença enxerto versus hospedeiro, antígenos de transplantes e antígenos de proteínas terapêuticas. Os epitopos, ou proteínas, polipeptídeos ou peptídeos que compreendem os epitopos, podem ser obtidos ou derivados de quaisquer dos antígenos proporcionados ou então conhecidos na área.
[000202] Proteínas terapêuticas incluem mas não estão limitadas a proteínas terapêuticas aptas a serem infundidas, enzimas, cofatores enzimáticos, hormônios, fatores de coagulação do sangue, citocinas e interferons, fatores de crescimento, anticorpos monoclonais, e anticorpos policlonais (por exemplo, que são administrados a um sujeito como terapia de substituição), e proteínas associadas a doença de Pompe (por exemplo, alglucosidase alfa, rhGAA (por exemplo, Myozyme e Lumizyme (Genzyme)). Proteínas terapêuticas também incluem proteínas envolvidas na cascata de coagulação do sangue. Proteínas terapêuticas incluem mas não estão limitadas a Fator VIII, Fator VII, Fator IX, Fator V, Fator de von Willebrand, Fator de von Heldebrant, ativador do plasminogênio em tecidos, insulina, hormônio de crescimento, eritropoietina alfa, VEGF, trombopoietina, lisozima, antitrombina e afins. Proteínas terapêuticas também incluem adipocinas, como leptina e adiponectina. Outros exemplos de proteínas terapêuticas são descritos abaixo e aqui em outro local. Também estão incluídos fragmentos ou derivados de quaisquer das proteínas terapêuticas proporcionadas como o epitopo, ou proteína, polipeptídeo ou peptídeo que compreende o epitopo.
[000203] Exemplos de proteínas terapêuticas usadas em terapia de substituição enzimática de sujeitos com distúrbio de depósito lisossômico incluem mas não estão limitados à imiglucerase para o tratamento de doença de Gaucher (por exemplo, CEREZYMETM), a- galactosidase A (a-gal A) para o tratamento de doença de Fabry (por exemplo, agalsidase beta, FABRYZYMETM), a-glucosidase ácida (GAA) para o tratamento de doença de Pompe (por exemplo, alglucosidase alfa, LUMIZYMETM, MYOZYMETM), arilsulfatase B para o tratamento de Mucopolissacaridoses (por exemplo, laronidase, ALDURAZYMETM, idursulfase, ELAPRASETM, arilsulfatase B, NAGLAZYMETM).
[000204] Exemplos de enzimas incluem oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, e ligases.
[000205] Exemplos de hormônios incluem Melatonina (N-acetil-5- metoxitriptamina), Serotonina, Tiroxina (ou tetraiodotironina) (um hormônio da tireoide), Tri-iodotironina (um hormônio da tireoide), Epinefrina (ou adrenalina), Norepinefrina (ou noradrenalina), Dopamina (ou hormônio inibidor da prolactina), Hormônio anti-mulleriano (ou fator ou hormônio inibidor mulleriano), Adiponectina, Hormônio adrenocorti- cotrópico (ou corticotropina), Angiotensinogênio e angiotensina, Hormônio antidiurético (ou vasopressina, arginina vasopressina), Peptídeo atrial-natriurético (ou atriopeptina), Calcitonina, Colecisto- quinina, Hormônio de liberação de corticotropina, Eritropoietina, Hormônio estimulante do folículo, Gastrina, Grelina, Glucagon, Peptídeo do tipo glucagon (GLP-1), GIP, Hormônio de liberação de gonadotropina, Hormônio de liberação do hormônio de crescimento, Gonadotropina coriônica humana, Lactogênio placentário humano, Hormônio de crescimento, Inibina, Insulina, Fator de crescimento do tipo insulina (ou somatomedina), Leptina, Hormônio luteinizante, Hormônio estimulante de melanócitos, Orexina, Oxitocina, Hormônio da paratire- oide, Prolactina, Relaxina, Secretina, Somatostatina, Trombopoietina, Hormônio estimulante da tireoide (ou tirotropina), Hormônio de liberação de tirotropina, Cortisol, Aldosterona, Testosterona, Desidroepian- drosterona, Androstenodiona, Dihidrotestosterona, Estradiol, Estrona, Estriol, Progesterona, Calcitriol (1,25-dihidroxivitamina D3), Calcidiol (25-hidroxivitamina D3), Prostaglandinas, Leucotrienos, Prostaciclina, Tromboxano, Hormônio de liberação de prolactina, Lipotropina, Peptideo natriurético cerebral, Neuropeptídeo Y, Histamina, Endotelina, Polipeptídeo pancreático, Renina, e Encefalina.
[000206] Exemplos de fatores sanguíneos e de coagulação do sangue incluem Fator I (fibrinogênio), Fator II (protrombina), fator tecidual, Fator V (proacelerina, fator instável), Fator VII (fator estável, proconvertina), Fator VIII (globulina antihemofílica), Fator IX (fator de Christmas ou componente de tromboplastina plasmática), Fator X (fator de Stuart- Prower), Fator Xa, Fator XI, Fator XII (fator de Hageman), Fator XIII (fator estabilizador de fibrina), fator de von Willebrand, precalicreína (fator de Fletcher), quininogênio de alto peso molecular (HMWK) (fator de Fitzgerald), fibronectina, fibrina, trombina, antitrombina III, cofator de heparina II, proteína C, proteína S, proteína Z, inibidor de proteases relacionado à proteína Z (ZPI), plasminogênio, alfa 2-antiplasmina, ativador do plasminogênio em tecidos (tPA), urocinase, inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI1), inibidor do ativador do plasminogênio-2 (PAI2), pró-coagulante do câncer, e epoetina alfa (Epogen, Procrit).
[000207] Exemplos de citocinas incluem linfocinas, interleucinas, e quimiocinas, citocinas do tipo 1, como IFN-Y, TGF-β, e citocinas do tipo 2, como IL-4, IL-10, e IL-13.
[000208] Exemplos de fatores de crescimento incluem Adrenome- dulina (AM), Angiopoietina (Ang), Fator autócrino de motilidade, Proteínas morfogenéticas do osso (BMPs), Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), Fator de crescimento epidermal (EGF), Eritropoietina (EPO), Fator de crescimento de fibroblastos (FGF), Fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), Fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), Fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), Fator de diferenciação do crescimento-9 (GDF9), Fator de crescimento de hepatócitos (HGF), Fator de crescimento derivado de hepatoma (HDGF), Fator de crescimento do tipo insulina (IGF), Fator estimulador da migração, Miostatina (GDF-8), Fator de crescimento do nervo (NGF) e outras neurotrofinas, Fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), Trombopoietina (TPO), Fator de transformação do crescimento alfa (TGF-α), Fator de transformação do crescimento beta (TGF-β), Fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), Fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), Via de Sinalização da Wnt, fator de crescimento placentário (PlGF), [(Somatotrofina Bovina Fetal)] (FBS), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, e IL-7.
[000209] Exemplos de anticorpos monoclonais incluem Abagovomab, Abciximab, Adalimumab, Adecatumumab, Afelimomab, Afutuzumab, Alacizumab pegol, ALD, Alemtuzumab, Altumomab pentetato, Anatumomab mafenatox, Anrukinzumab, Globina antitimócitos, Apolizumab, Arcitumomab, Aselizumab, Atlizumab (tocilizumab), Atorolimumab, Bapineuzumab, Basiliximab, Bavituximab, Bectumomab, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Biciromab, Bivatuzumab mertansina, Blinatumomab, Brentuximab vedotina, Briakinumab, Canakinumab, Cantuzumab mertansina, Capromab pendetida, Catumaxomab, Cedelizumab, Certolizumab pegol, Cetuximab, Citatuzumab bogatox, Cixutumumab, Clenoliximab, Clivatuzumab tetraxetano, Conatumumab, Dacetuzumab, Daclizumab, Daratumumab, Denosumab, Detumomab, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, Ecromeximab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Elotuzumab, Elsilimomab, Enlimomab pegol, Epitumomab cituxetano, Epratuzumab, Erlizumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Exbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab, Farletuzumab, Felvizumab, Fezakinumab, Figitumumab, Fontolizumab, Foravirumab, Fresolimumab, Galiximab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab ozogamicina, GC1008, Girentuximab, Glembatumumab vedotina, Golimumab, Gomiliximab, Ibalizumab, Ibritumomab tiuxetano, Igovomab, Imciromab, Infliximab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab ozogamicina, Ipilimumab, Iratumumab, Keliximab, Labetuzumab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lerdelimumab, Lexatumumab, Libivirumab, Lintuzumab, Lorvotuzumab mertansina, Lucatumumab, Lumiliximab, Mapatumumab, Maslimomab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mitumomab, Morolimumab, Motavizumab, Muromonab-CD3, Nacolomab tafenatox, Naptumomab estafenatox, Natalizumab, Nebacumab, Necitumumab, Nerelimomab, Nimotuzumab, Nofetumomab merpentano, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Omalizumab, Oportuzumab monatox, Oregovomab, Otelixizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Panitumumab, Panobacumab, Pascolizumab, Pemtumomab, Pertuzumab, Pexelizumab, Pintumomab, Priliximab, Pritumumab, Rafivirumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raxibacumab, Regavirumab, Reslizumab, Rilotumumab, Rituximab, Robatumumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Satumomab pendetido, Sevirumab, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuximab, Siplizumab, Solanezumab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulesomab, Tacatuzumab tetraxetano, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab paptox, Tefibazumab, Telimomab aritox, Tenatumomab, Teneliximab, Teplizumab, Ticilimumab (tremelimumab), Tigatuzumab, Tocilizumab (atlizumab), Toralizumab, Tositumomab, Trastuzumab, Tremelimumab, Tucotuzumab celmoleucina, Tuvirumab, Urtoxazumab, Ustekinumab, Vapaliximab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab, Visilizumab, Volociximab, Votumumab, Zalutumumab, Zanolimumab, Ziralimumab, e Zolimomab aritox.
[000210] Exemplos de proteínas terapêuticas para terapia de infusão ou injetáveis incluem, por exemplo, Tocilizumab (Roche/Actemra®), alfa-1 antitripsina (Kamada/AAT), Hematide® (Affymax e Takeda, peptídeo sintético), albinterferon alfa-2b (Novartis/Zalbin™), Rhucin® (Pharming Group, terapia de substituição de inibidor de C1), tesamorelina (Theratechnologies/Egrifta, fator de liberação de hormônio de crescimento sintético), ocrelizumab (Genentech, Roche e Biogen), belimumab (GlaxoSmithKline/Benlysta®), pegloticase (Savient Pharmaceuticals/Krystexxa™), taliglucerase alfa (Protalix/Uplyso), agalsidase alfa (Shire/Replagal®), velaglucerase alfa (Shire).
[000211] Proteínas terapêuticas adicionais úteis de acordo com aspectos dessa invenção serão claras para os profissionais, e a invenção não está limitada a esse respeito.
[000212] Em algumas modalidades, um componente, como um antígeno ou imunossupressor, pode ser isolado. Isolado significa que o elemento está separado do seu ambiente nativo e está presente em quantidades suficientes para permitir a sua identificação ou utilização. Isso significa, por exemplo, que o elemento pode ser (i) seletivamente produzido por meio de clonagem por expressão ou (ii) purificado, tal como por meio de cromatografia ou eletroforese. Elementos isolados podem ser substancialmente puros, mas tal não é necessário. Uma vez que um elemento isolado pode ser misturado com um excipiente farmaceuticamente aceitável em uma preparação farmacêutica, o elemento pode compreender somente uma pequena porcentagem em peso da preparação. Ainda assim, o elemento está isolado, pois foi separado das substâncias às quais pode estar associado em sistemas vivos, por exemplo, isolado de outros lipídeos ou proteínas. Quaisquer dos elementos proporcionados aqui podem ser incluídos nas composições em forma isolada.
[000213] D. MÉTODOS DE FABRICAÇÃO E UTILIZAÇÃO DAS COMPOSIÇÕES INVENTIVAS E MÉTODOS RELACIONADOS
[000214] Nanotransportadores sintéticos podem ser preparados usando uma grande variedade de métodos conhecidos na área. Por exemplo, nanotransportadores sintéticos podem ser formados por meio de métodos tais como nanoprecipitação, focagem de fluxo usando canais fluídicos, secagem por pulverização, evaporação de solvente de emulsão simples e dupla, extração de solvente, separação de fases, moagem, procedimentos de microemulsão, microfabricação, nanofabri- cação, camadas sacrificiais, coacervação simples e complexa, e outros métodos bem conhecidos dos profissionais. Em alternativa ou adicionalmente, foram descritas sínteses com solventes aquosos e orgânicos para materiais semicondutores, condutores, magnéticos, orgânicos, e outros nanomateriais monodispersos (Pellegrino et al., 2005, Small, 1: 48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; e Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). Métodos adicionais foram descritos na literatura (ver, por exemplo, Doubrow, Editor, "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; e Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; Patentes US 5578325 e 6007845; P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).
[000215] Vários materiais podem ser encapsulados em nanotransportadores sintéticos consoante o desejável usando uma variedade de métodos, incluindo mas não se limitando a C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Volume 17, N° 3, páginas 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6): 843-853 (2010). Podem ser usados outros métodos adequados para a encapsulação de materiais em nanotransportadores sintéticos, incluindo, sem limitação, métodos divulgados na Patente dos Estados Unidos 6,632,671 atribuída a Unger, 14 de outubro de 2003.
[000216] Em certas modalidades, nanotransportadores sintéticos são preparados por um processo de nanoprecipitação ou secagem por vaporização. As condições usadas na preparação de nanotransportadores sintéticos podem ser alteradas para prover partículas com uma dimensão ou propriedade desejada (por exemplo, hidrofobicidade, hidrofilicidade, morfologia externa, "pegajosidade", forma, etc.). O método de preparação dos nanotransportadores sintéticos e as condições (por exemplo, solvente, temperatura, concentração, taxa de fluxo de ar, etc.) usadas podem depender dos materiais a serem acoplados aos nanotransportadores sintéticos e/ou da composição da matriz polimérica.
[000217] Se partículas preparadas por meio de qualquer um dos métodos acima tiverem um intervalo de dimensões fora do intervalo desejado, as partículas podem ser dimensionadas, por exemplo, usando um crivo.
[000218] Elementos (isto é, componentes) dos nanotransportadores sintéticos inventivos (como frações das quais é compreendida uma superfície imunoativa, frações de direcionamento, matrizes poliméricas, epitopos, ou proteínas, polipeptídeos ou peptídeos que compreendem os epitopos, imunossupressores e afins) podem ser acoplados ao nanotransportador sintético global, por exemplo, através de uma ou mais ligações covalentes, ou podem ser acoplados por meio de um ou mais ligadores. Métodos adicionais de funcionalização de nanotransportadores sintéticos podem ser adaptados do Pedido de Patente US Publicado 2006/0002852 atribuído a Saltzman et al., Pedido de Patente US Publicado 2009/0028910 atribuído a DeSimone et al., ou Pedido de Patente Internacional Publicado WO/2008/127532 A1 atribuído a Murthy et al.
[000219] Em alternativa ou adicionalmente, nanotransportadores sintéticos podem ser acoplados a componentes direta ou indiretamente via interações não covalentes. Em modalidades não covalentes, o acoplamento não covalente é mediado por interações não covalentes incluindo mas não se limitando a interações de carga, interações de afinidade, coordenação metálica, adsorção física, interações hospedeiro- convidado, interações hidrófobas, interações de empilhamento TT, interações de ligações de hidrogênio, interações de van der Waals, interações magnéticas, interações eletrostáticas, interações dipolo-dipolo, e/ou suas combinações. Esses acoplamentos podem ser dispostos de modo a se situarem sobre uma superfície externa ou uma superfície interna de um nanotransportador sintético inventivo. Em modalidades, a encapsulação e/ou absorção são formas de acoplamento. Em modalidades, os nanotransportadores sintéticos inventivos podem ser combinados com um antígeno por meio de mistura no mesmo veículo ou sistema de distribuição.
[000220] Populações de nanotransportadores sintéticos podem ser combinadas para preparar formas de dosagemfarmacêuticas de acordo com a presente invenção usando métodos farmacêuticos tradicionais de mistura. Esses incluem mistura líquido-líquido, na qual duas ou mais suspensões, cada uma contendo um ou mais subconjuntos de nanotransportadores, são diretamente combinadas ou são reunidas via um ou mais recipientes contendo diluente. Uma vez que nanotrans-portadores sintéticos também podem ser produzidos ou armazenados em uma forma em pó, pode ser efetuada mistura pó-pó a seco, bem como a ressuspensão de dois ou mais pós em um meio comum. Dependendo das propriedades dos nanotransportadores e de seus potenciais de interação, pode haver vantagens conferidas a uma ou outra via de mistura.
[000221] Composições típicas inventivas que compreendem nanotransportadores sintéticos podem compreender tampões inorgânicos ou orgânicos (por exemplo, sais de sódio ou potássio de fosfato, carbonato, acetato ou citrato) e agentes de ajustamento do pH (por exemplo, ácido clorídrico, hidróxido de sódio ou potássio, sais de citrato ou acetato, aminoácidos e seus sais) antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, alfa-tocoferol), tensoativos (por exemplo, polissorbato 20, polissorbato 80, polioxietileno 9-10 nonil fenol, desoxicolato de sódio), estabilizadores de solução e/ou crio/lio estabilizadores (por exemplo, sacarose, lactose, manitol, trealose), agentes de ajustamento osmótico (por exemplo, sais ou açúcares), agentes antibacterianos (por exemplo, ácido benzoico, fenol, gentamicina), agentes antiespumantes (por exemplo, polidimetilsilozona), conservantes (por exemplo, timerosal, 2-fenoxietanol, EDTA), estabilizadorespoliméricos e agentes de ajuste da viscosidade (por exemplo, polivinilpirrolidona, poloxâmero 488, carboximetilcelulose) e cossolventes (por exemplo, glicerol, polietileno glicol, etanol).
[000222] Composições de acordo com a invenção compreendem os nanotransportadores sintéticos da invenção em combinação com excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As composições podem ser preparadas usando técnicas farmacêuticas convencionais de fabricação e composição para obter formas de dosagem úteis. Técnicas adequadas para utilização na prática da presente invenção podem ser encontradas em "Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice", Editado por Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, e Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; e "Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design", 2a Edição Editado por M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. Em uma modalidade, os nanotransportadores sintéticos inventivos são suspensos em solução salina esterilizada para injeção em conjunto com um conservante.
[000223] Deve ser entendido que as composições da invenção podem ser preparadas de qualquer modo adequado, e a invenção não está limitada, de modo nenhum, a composições que podem ser produzidas usando os métodos descritos aqui. A seleção de um método apropriado pode requerer atenção às propriedades das frações particulares a serem associadas.
[000224] Em algumas modalidades, nanotransportadores sintéticos inventivos são fabricados sob condições esterilizadas ou são esterilizados de modo terminal. Isso pode assegurar que as composições resultantes são esterilizadas e não infecciosas, melhorando assim a segurança quando comparadas com composições não esterilizadas. Isso provê uma medida de segurança valiosa, em especial quando sujeitos que recebem nanotransportadores sintéticos têm deficiências imunológicas, sofrem de infecção, e/ou são suscetíveis à infecção. Em algumas modalidades, os nanotransportadores sintéticos inventivos podem ser liofilizados e armazenados em suspensão ou na forma de um pó liofilizado, dependendo da estratégia de formulação para períodos prolongados sem perda de atividade.
[000225] As composições da invenção podem ser administradas por uma variedade de vias, incluindo mas não se limitando a subcutânea, intranasal, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transmucosa, sublingual, retal, oftálmica, pulmonar, intradermal, transdermal, transcu- tânea ou por uma combinação dessas vias. Vias de administração também incluem administração por inalação ou aerossol pulmonar. Técnicas de preparação de sistemas de distribuição de aerossol são bem conhecidas dos profissionais (ver, por exemplo, Sciarra e Cutie, "Aerosols", em "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 18a edição, 1990, páginas 1694-1712; incorporado por referência).
[000226] Os enxertos transplantáveis ou proteínas terapêuticas proporcionadas como uma terapia baseada em células da invenção podem ser administradas por administração parenteral, intra-arterial, intranasal ou intravenosa ou por injeção em nódulos linfáticos ou na câmara anterior do olho ou por administração local em um órgão ou tecido de interesse. A administração pode ser efetuada mediante injeção subcutânea, intratecal, intraventricular, intramuscular, entrape- ritoneal, intracoronária, intrapancreática, intrahepática ou brônquica.
[000227] As composições da invenção podem ser administradas em quantidades eficazes, como as quantidades eficazes aqui descritas em outro local. Doses de formas de dosagem contêm quantidades variáveis de populações de nanotransportadores sintéticos e/ou quantidades variáveis de antígenos e/ou imunossupressores, de acordo com a invenção. A quantidade de nanotransportadores sintéticos e/ou antígenos e/ou imunossupressores presentes nas formas de dosagem inventivas pode ser variada de acordo com a natureza dos antígenos e/ou imunossupressores, o benefício terapêutico a ser alcançado, e outros parâmetros afins. Em modalidades, podem ser conduzidos estudos de variação de doses para estabelecer a quantidade terapêutica ótima da população de nanotransportadores sintéticos e a quantidade de antígenos e/ou imunossupressores a estarem presentes na forma galênica. Em modalidades, os nanotransportadores sintéticos e/ou os antígenos e/ou imunossupressores estão presentes na forma de dosagem em uma quantidade eficaz para gerar uma resposta imunológica tolerogênica aos antígenos por administração a um sujeito. Pode ser possível determinar quantidades dos antígenos e/ou imunossupressores eficazes para gerar uma resposta imunológica tolerogênica usando estudos e técnicas convencionais de variação de doses em sujeitos. Formas de dosagem inventivas podem ser administradas em uma variedade de frequências. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma administração da forma de dosagem é suficiente para gerar uma resposta farmacologicamente relevante. Em modalidades mais preferidas, pelo menos duas administrações, pelo menos três administrações ou, pelo menos, quatro administrações, da forma de dosagem são utilizadas para garantir uma resposta farmacologicamente relevante.
[000228] A administração profilática das composições inventivas pode ser iniciada antes do surgimento da doença, distúrbio ou condição médica, ou a administração terapêutica pode ser iniciada depois de estabelecido um distúrbio ou condição médica.
[000229] Em algumas modalidades, a administração de nanotransportadores sintéticos é efetuada, por exemplo, antes da administração de uma proteína terapêutica, enxerto transplantável ou exposição a um alergênio. Em modalidades exemplificativas, nanotransportadores sintéticos são administrados em um ou mais instantes, incluindo mas não se limitando a 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, ou 0 dias antes da administração de uma proteína terapêutica, enxerto transplantável ou exposição a um alergênio. Adicionalmente ou em alternativa, nanotransportadores sintéticos podem ser administrados a um sujeito após a administração de uma proteína terapêutica, enxerto transplantável ou exposição a um alergênio. Em modalidades exemplificativas, nanotransportadores sintéticos são administrados em um ou mais instantes, incluindo mas não se limitando a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, etc., dias após a administração de uma proteína terapêutica, enxerto transplantável ou exposição a um alergênio.
[000230] Em algumas modalidades, é administrada a um sujeito uma dose de manutenção (por exemplo, de uma composição de nanotransportadores sintéticos proporcionada aqui) depois de uma administração inicial ter originado uma resposta tolerogênica no sujeito, por exemplo, para manter o efeito tolerogênico alcançado após a dose inicial, para prevenir uma reação imunológica indesejada no sujeito, ou para evitar que o sujeito se torne em um sujeito em risco de sofrer de uma resposta imunológica indesejada ou um nível indesejado de uma resposta imunológica. Em algumas modalidades, a dose de manutenção é uma dose igual à dose inicial que o sujeito recebeu. Em algumas modalidades, a dose de manutenção é uma dose menor do que a dose inicial. Por exemplo, em algumas modalidades, a dose de manutenção é cerca de 3/4, cerca de 2/3, cerca de 1/2, cerca de 1/3, cerca de 1/4, cerca de 1/8, cerca de 1/10, cerca de 1/20, cerca de 1/25, cerca de 1/50, cerca de 1/100, cerca de 1/1 000, cerca de 1/10 000, cerca de 1/100 000, ou cerca de 1/1 000 000 (peso/peso) da dose inicial.
[000231] As composições e métodos descritos aqui podem ser usados para induzir ou intensificar uma resposta imunológica tolerogênica e/ou para suprimir, modular, direcionar ou redirecionar uma resposta imunológica indesejada com a finalidade de obter supressão imunológica. As composições e métodos descritos aqui podem ser usados no diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento de doenças, distúrbios ou condições médicas nos quais uma supressão imunológica (por exemplo, resposta imunológica tolerogênica) confere um benefício de tratamento. Essas doenças, distúrbios ou condições médicas incluem doenças inflamatórias, doenças autoimunes, alergias, rejeição de órgão ou tecido e doença enxerto versus hospedeiro. As composições e métodos descritos aqui também podem ser usados em sujeitos que foram submetidos ou serão submetidos à transplantação. As composições e métodos descritos aqui também podem ser usados em sujeitos que receberam, estão recebendo ou irão receber uma proteína terapêutica contra a qual geraram ou é esperado que gerem uma resposta imunológica indesejada.
[000232] Doenças autoimunes incluem mas não estão limitadas a artrite reumatoide, esclerose múltipla, diabetes mellitus imune-mediada ou de Tipo I, doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa), lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, escleroderma, doença da tireoide autoimune, alopecia areata, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, doença celíaca, síndrome de Sjogren, febre reumática, gastrite, gastrite atrófica autoimune, hepatite autoimune, insulite, ooforite, orquite, uveíte, uveíte facogênica, miastenia gravis, mixedema primário, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune, doença de Addison, escleroderma, síndrome de Goodpasture, nefrite, por exemplo, glomerulonefrite, psoríase, pênfigo vulgar, penfigoide, oftalmia simpática, púrpura trombocitopênica idiopática, leucopenia idiopática, granulomatose de Wegener e poli/der- matomiosite.
[000233] Algumas doenças autoimunes exemplificativas adicionais, autoantígenos associados, e autoanticorpos, que são contemplados para utilização na invenção, estão descritos na Tabela 1 embaixo:
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[000234] Doenças inflamatórias incluem mas não estão limitadas a doença de Alzheimer, Espondilite anquilosante, artrite, asma, aterosclerose, doença de Behcet, polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doença de Crohn, colite, fibrose cística, dermatite, diverticulite, hepatite, síndrome do intestino irritável (IBS), lúpus eritematoso, distrofia muscular, nefrite, doença de Parkinson, zona e colite ulcerativa. Doenças inflamatórias também incluem, por exemplo, doença cardiovascular, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), bronquiectasia, colecistite crônica, tuberculose, tireoidite de Hashimoto, sepsia, sarcoidose, silicose e outras pneumoconioses, e um corpo estranho implantado em uma ferida, mas não estão limitadas a essas. Como usado aqui, o termo "sepsia" refere-se a uma síndrome clínica bem reconhecida associada a uma resposta inflamatória sistêmica em um hospedeiro a invasão microbiana. O termo "sepsia", como usado aqui, refere-se a uma condição médica que é tipicamente sinalizada por febre ou hipotermia, taquicardia, e taquipneia, e em casos graves pode progredir para hipotensão, disfunção de órgãos, e mesmo morte.
[000235] Em algumas modalidades, a doença inflamatória é doença inflamatória do intestino não autoimune, adesões pós-cirúrgicas, doença da artéria coronária, fibrose hepática, síndrome da dificuldade respiratória aguda, pancreatite inflamatória aguda, pancreatite induzida por colangiopancreatografia retrógrada endoscópica, queimaduras, aterogênese de artérias coronárias, cerebrais e periféricas, apendicite, colecistite, diverticulite, distúrbios fibróticos viscerais, cura de feridas, distúrbios de cicatrização da pele (queloides, hidradenite supurativa), distúrbios granulomatosos (sarcoidose, cirrose biliar primária), asma, pioderma gandrenoso, síndrome de Sweet, doença de Behcet, colangite esclerosante primária ou um abcesso. Em algumas modalidades preferidas, a doença inflamatória é doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa).
[000236] Em outras modalidades, a doença inflamatória é uma doença autoimune. A doença autoimune, em algumas modalidades, é artrite reumatoide, febre reumática, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino autoimune, diabetes mellitus dependente de insulina, diabetes mellitus, diabetes juvenil, diabetes autoimune espontânea, gastrite, gastrite atrófica autoimune, hepatite autoimune, tireoidite, tireoidite de Hashimoto, insulite, ooforite, orquite, uveíte, uveíte facogênica, esclerose múltipla, miastenia gravis, mixedema primário, tireotoxicose, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune, doença de Addison, Espondilite anquilosante, sarcoidose, escleroderma, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barre, doença de Graves, glomerulonefrite, psoríase, pênfigo vulgar, penfigoide, eczema, penfigoide bolhoso, oftalmia simpática, púrpura trombocitopênica idiopática, leucopenia idiopática, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica, granulomatose de Wegener, poli/dermatomiosite, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, lúpus ou lúpus eritematoso sistêmico.
[000237] A doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) é uma complicação que pode ocorrer após um transplante de células pluripotentes (por exemplo, células estaminais) ou de medula óssea na qual o material transplantado de novo resulta em um ataque no corpo do receptor do transplante. Em alguns casos, GVHD ocorre após uma transfusão sanguínea. A doença enxerto-versus-hospedeiro pode ser dividida nas formas aguda e crônica. A forma aguda ou fulminante da doença (aGVHD) é normalmente observada nos primeiros 100 dias pós- transplante, e é um grande desafio para transplantes devido à morbidez e mortalidade associadas. A forma crônica da doença enxerto-versus- hospedeiro (cGVHD) ocorre normalmente passados 100 dias. O aparecimento de casos moderados até graves de cGVHD influencia de modo adverso a sobrevivência a longo prazo.
EXEMPLOS Exemplo 1: Resposta Imunológica de Nanotransportadores Sintéticos com Rapamicina Acoplada com e sem Peptídeo de Ovalbumina (323-339) Materiais
[000238] Peptídeo de ovalbumina 323-339, um peptídeo de 17 aminoácidos conhecido por ser um epitopo de células T e B de proteína Ovalbumina, foi adquirido à Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte # 4065609). Rapamicina foi adquirida à TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; # Catálogo do Produto R1017). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000239] Solução 1: Peptídeo de ovalbumina 323 - 339 @ 20 mg/mL em solução aquosa de ácido clorídrico diluído. A solução foi preparada dissolvendo peptídeo de ovalbumina em solução 0,13 M ácido clorídrico à temperatura ambiente.
[000240] Solução 2: Rapamicina @ 50 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo rapamicina em cloreto de metileno puro.
[000241] Solução 3: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro.
[000242] Solução 4: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
Método de Preparação de Nanotransportador Sintético Contendo Rapamicina e Ovalbumina (323-339)
[000243] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,2 mL), e solução 3 (1,0 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 4 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250.
[000244] A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores sintéticos. Uma porção dos nanotransportadores sintéticos foi submetida à lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores sintéticos para um tubo de centrifugação e centrifugação a 21 000xg e 4 °C por uma hora, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores sintéticos de cerca de 10 mg/mL.
[000245] As quantidades de peptídeo e rapamicina nos nanotransportadores sintéticos foram determinadas por análise de HPLC. A massa seca total de nanotransportadores sintéticos por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Método para Nanotransportador Sintético Contendo Rapamicina
[000246] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação de solução 0,13 M de ácido clorídrico (0,2 mL), solução 2 (0,2 mL), e solução 3 (1,0 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 4 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250.
[000247] A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores sintéticos. Uma porção dos nanotransportadores sintéticos foi submetida à lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores sintéticos para um tubo de centrifugação e centrifugação a 21 000xg e 4 °C por uma hora, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores sintéticos de cerca de 10 mg/mL.
[000248] A quantidade de rapamicina no nanotransportador sintético foi determinada por análise de HPLC. A massa seca total de nanotransportadores sintéticos por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Método de Medição da Carga de Rapamicina
[000249] Aproximadamente 3 mg de nanotransportadores sintéticos foram coletados e centrifugados, para separar o sobrenadante do pélete de nanotransportadores sintéticos. Adicionou-se acetonitrila ao pélete, e a amostra foi sonicada e centrifugada para remover qualquer material insolúvel. O sobrenadante e o pélete foram injetados em RP-HPLC e a absorvância foi lida a 278 nm. Os μg do pélete foram usados para calcular a % encerrada (carga), os μg no sobrenadante e pélete foram usados para calcular os μg totais recuperados.
Método de Medição da Carga de Ovalbumina (323-339)
[000250] Aproximadamente 3 mg de nanotransportadores sintéticos foram coletados e centrifugados, para separar o sobrenadante do pélete de nanotransportadores sintéticos. Adicionou-se ao pélete trifluoro- etanol e a amostra foi sonicada para dissolver o polímero, adicionou-se 0,2% de ácido trifluoroacético e a amostra foi sonicada e depois centrifugada, para remover qualquer material insolúvel. O sobrenadante e o pélete foram injetados em RP-HPLC e a absorvância foi lida a 215 nm. Os μg do pélete foram usados para calcular a % encerrada (carga), os μg no sobrenadante e pélete foram usados para calcular os μg totais recuperados.
Atividade de Células Dendríticas Tolerogênicas (Tdc) Antígeno- específicas no Desenvolvimento de Células Treg
[000251] O ensaio incluiu a utilização de camundongos OTII que têm um receptor transgênico de células T específico para uma ovalbumina (323-339) imunodominante. Para criar tDCs antígeno-específicas, esplenócitos CD11c+ foram isolados, e o peptídeo de ovalbumina (323339) foi adicionado in vitro a 1 μg/mL ou nenhum antígeno. Rapamicina solúvel ou encapsulada em nanotransportadores foi então adicionada às DCs por 2 horas, que então foram extensamente lavadas para remover da cultura rapamicina livre. Células CD4+CD25- respondedoras purificadas foram isoladas de camundongos OTII e adicionadas a tDC a uma razão 10:1 de T para DC. A mistura de tDC e células T de OTII foi então cultivada por 4-5 dias, e a frequência de células Treg (CD4+CD25highFoxP3+) foi analisada por citometria de fluxo, como mostrado na figura 1. Foram selecionadas regiões com base em controles de isotipo.
Exemplo 2: Nanopartículas de Sílica Mesoporosa com Ibuprofeno Acoplado (Profético)
[000252] Núcleos de nanopartículas de SiO2 mesoporosa são criados por um processo de sol-gel. Brometo de hexadeciltrimetil-amônio (CTAB) (0,5 g) é dissolvido em água desionizada (500 mL), e então solução aquosa 2 M de NaOH (3,5 mL) é adicionada à solução de CTAB. A solução é agitada por 30 minutos, e depois adiciona-se à solução Tetraetoxissilano (TEOS) (2,5 mL). O gel resultante é agitado por 3 horas a uma temperatura de 80 °C. O precipitado branco formado é capturado por filtração, seguido de lavagem com água desionizada e secagem à temperatura ambiente. O tensoativo remanescente é então extraído das partículas por suspensão em uma solução etanólica de HCl por uma noite. As partículas são lavadas com etanol, são centrifugadas, e novamente dispersas sob ultrassonicação. Esse procedimento de lavagem é repetido mais duas vezes.
[000253] As nanopartículas de SiO2 são depois funcionalizadas com grupos amino usando (3-aminopropil)-trietoxissilano (APTMS). Para esse fim, as partículas são suspensas em etanol (30 mL), e APTMS (50 μL) é adicionado à suspensão. A suspensão é deixada repousar à temperatura ambiente por 2 horas e então entra em ebulição por 4 horas, mantendo o volume constante por adição periódica de etanol. Os reagentes remanescentes são removidos mediante cinco ciclos de lavagem por centrifugação e redispersão em etanol puro.
[000254] Em uma reação separada são criadas sementes de ouro de 1-4 nm de diâmetro. Toda a água usada em essa reação é primeiramente desionizada e então é destilada em um destilador de vidro. Adiciona-se água (45,5 mL) a um balão de fundo redondo de 100 mL. Durante a agitação adiciona-se 0,2 M NaOH aquoso (1,5 mL), seguido de uma solução aquosa 1% de cloreto de tetraquis(hidroximetil)fosfônio (THPC) (1,0 mL). Dois minutos após a adição da solução de THPC adiciona-se uma solução aquosa 10 mg/mL de ácido cloroáurico (2 mL), que havia sido envelhecida durante pelo menos 15 minutos. As sementes de ouro são purificadas por diálise contra água.
[000255] Para formar os nanotransportadores núcleo-invólucro, as nanopartículas de SiO2 funcionalizadas com amino formadas acima são primeiramente misturadas com as sementes de ouro por 2 horas à temperatura ambiente. As partículas de SiO2 decoradas com ouro são coletadas mediante centrifugação e misturadas com uma solução aquosa de ácido cloroáurico e bicarbonato de potássio para formar o invólucro de ouro. As partículas são então lavadas mediante centrifugação e são novamente dispersas em água. Ibuprofeno é carregado por suspensão das partículas em uma solução de ibuprofeno sódico (1 mg/L) por 72 horas. Ibuprofeno livre é então lavado das partículas por centrifugação e redispersão em água.
Exemplo 3: Lipossomos Contendo Ciclosporina A (Profético)
[000256] Os lipossomos são formados usando hidratação de filme fino. 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (32 μmol), colesterol (32 μmol), e ciclosporina A (6,4 μmol) são dissolvidos em clorofórmio puro (3 mL). Essa solução lipídica é adicionada a um balão de fundo redondo de 50 mL, e o solvente é evaporado em um evaporador rotativo a uma temperatura de 60 °C. O balão é então sujeito a descarga de nitrogênio gasoso para remover o solvente remanescente. Solução salina tamponada com fosfato (2 mL) e cinco esférulas de vidro são adicionadas ao balão, e o filme lipídico é hidratado por agitação a 60 °C por 1 hora, para formar uma suspensão. A suspensão é transferida para um pequeno tubo de pressão e é sonicada a 60 °C por quatro ciclos de pulsos de 30 s com um retardamento de 30 s entre cada pulso. A suspensão é então deixada repousar à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir uma hidratação completa. Os lipossomos são lavados mediante centrifugação, seguido de ressuspensão em solução salina tamponada com fosfato fresca.
Exemplo 4: Nanotransportador Polimérico Contendo Conjugado de Polímero-Rapamicina (Profético)
[000257] Preparação do conjugado de PLGA-rapamicina:
[000258] Polímero PLGA com um grupo terminal ácido (7525 DLG1A, número de acidez 0,46 mmol/g, Lakeshore Biomaterials; 5 g, 2,3 mmol, 1,0 eq) é dissolvido em 30 mL de diclorometano (DCM). Adiciona-se N,N-diciclohexilcarbodi-imida (1,2 eq, 2,8 mmol, 0,57 g), seguida de rapamicina (1,0 eq, 2,3 mmol, 2,1 g) e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (2,0 eq, 4,6 mmol, 0,56 g). A mistura é agitada à t.a. por 2 dias. A mistura é então filtrada, para remover diciclohexilureia insolúvel. O filtrado é concentrado para um volume de cerca de 10 mL e é adicionado a 100 mL de álcool isopropílico (IPA), para precipitar o conjugado de PLGA- rapamicina. A camada de IPA é removida e o polímero é então lavado com 50 mL de IPA e 50 mL de éter de metil t-butila (MTBE). O polímero é então seco sob vácuo a 35 C por 2 dias, obtendo-se PLGA-rapamicina na forma de um sólido branco (cerca de 6,5 g).
[000259] Preparação de nanotransportador contendo conjugado de PLGA-rapamicina e peptídeo de ovalbumina (323-339):
[000260] Nanotransportador contendo PLGA-rapamicina é preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1, do modo seguinte:
[000261] As soluções para a formação do nanotransportador são preparadas do modo seguinte:
[000262] Solução 1: Peptídeo de ovalbumina 323 - 339 @ 20 mg/mL em solução aquosa de ácido clorídrico diluído. A solução é preparada dissolvendo peptídeo de ovalbumina em solução 0,13 M ácido clorídrico à temperatura ambiente. Solução 2: PLGA-rapamicina @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução é preparada dissolvendo PLGA- rapamicina em cloreto de metileno puro. Solução 3: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução é preparada dissolvendo PLA- PEG em cloreto de metileno puro. Solução 4: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
[000263] Em primeiro lugar é preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 é preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,75 mL), e solução 3 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) é então preparada por combinação da solução 4 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250. A emulsão W1/O1/W2 é adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores é submetida a lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 75 600xg e 4 °C por 35 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem é repetido, e o pélete é ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
Exemplo 5: Preparação de Nanotransportadores de Ouro (AuNCs) Contendo Rapamicina (Profético)
[000264] Preparação de HS-PEG-rapamicina:
[000265] Uma solução de dissulfureto ácido de PEG (1,0 eq), rapamicina (2,0-2,5 eq), DCC (2,5 eq) e DMAP (3,0 eq) em DMF seco é agitada à t.a. por uma noite. A diciclohexilureia insolúvel é removida por filtração e o filtrado é adicionado a álcool isopropílico (IPA), para precipitar o éster de PEG-dissulfureto-di-rapamicina, e lavado com IPA e seco. O polímero é então tratado com cloridrato de tris(2- carboxietil)fosfina em DMF, para reduzir o dissulfureto de PEG a éster de tiol PEG rapamicina (HS-PEG-rapamicina). O polímero resultante é recuperado por precipitação a partir de IPA e é seco como previamente descrito e analisado por H RMN e GPC.
[000266] Formação de NCs de Ouro (AuNCs):
[000267] Uma solução aquosa de 500 mL de 1 mM HAuCl4 é aquecida para o refluxo por 10 minutos, com agitação vigorosa, em um balão de fundo redondo de 1 L equipado com um condensador. Uma solução de 50 mL de 40 mM de citrato trissódico é então rapidamente adicionada à solução com agitação. A solução cor de vinho escura resultante é mantida no refluxo por 25-30 minutos e o calor é removido e a solução é esfriada para a temperatura ambiente. A solução é então filtrada em um filtro de membrana de 0,8 μm, para prover a solução de AuNCs. Os AuNCs são caracterizados usando espectroscopia visível e microscopia eletrônica de transmissão. Os AuNCs têm um diâmetro de cerca de 20 nm, protegidos por citrato, com absorção de pico a 520 nm.
[000268] Conjugado de AuNCs com HS-PEG-rapamicina:
[000269] Uma solução de 150 μL de HS-PEG-rapamicina (10 μM em 10 mM tampão de carbonato pH 9,0) é adicionada a 1 mL de nanotransportadores de ouro com proteção de citrato com 20 nm de diâmetro (1,16 nM) para produzir uma razão molar de tiol para ouro de 2500:1. A mistura é agitada à temperatura ambiente sob argônio durante 1 hora para permitir a troca completa de tiol com citrato sobre os nanotransportadores de ouro. Os AuNCs com PEG-rapamicina na superfície são então purificados por centrifugação a 12 000 g durante 30 minutos. O sobrenadante é decantado e o pélete contendo AuNC-S- PEG-rapamicina é então lavado com tampão 1x PBS. Os nanotransportadores purificados de Ouro-PEG-rapamicina são então ressuspensos em um tampão adequado para análise e bioensaios adicionais.
Exemplo 6: Nanotransportadores Núcleo-Invólucro de Sílica Mesoporosa-Ouro Contendo Ovalbumina (Profético)
[000270] Núcleos de nanopartículas de SiO2 mesoporosa são criados por um processo de sol-gel. Brometo de hexadeciltrimetil-amônio (CTAB) (0,5 g) é dissolvido em água desionizada (500 mL), e então solução aquosa 2 M de NaOH (3,5 mL) é adicionada à solução de CTAB. A solução é agitada por 30 minutos, e depois adiciona-se à solução Tetraetoxissilano (TEOS) (2,5 mL). O gel resultante é agitado por 3 horas a uma temperatura de 80 °C. O precipitado branco formado é capturado por filtração, seguido de lavagem com água desionizada e secagem à temperatura ambiente. O tensoativo remanescente é então extraído das partículas por suspensão em uma solução etanólica de HCl por uma noite. As partículas são lavadas com etanol, são centrifugadas, e novamente dispersas sob ultrassonicação. Esse procedimento de lavagem é repetido mais duas vezes.
[000271] As nanopartículas de SiO2 são depois funcionalizadas com grupos amino usando (3-aminopropil)-trietoxissilano (APTMS). Para esse fim, as partículas são suspensas em etanol (30 mL), e APTMS (50 μL) é adicionado à suspensão. A suspensão é deixada repousar à temperatura ambiente por 2 horas e então entra em ebulição por 4 horas, mantendo o volume constante por adição periódica de etanol. Os reagentes remanescentes são removidos mediante cinco ciclos de lavagem por centrifugação e redispersão em etanol puro.
[000272] Em uma reação separada são criadas sementes de ouro de 1-4 nm de diâmetro. Toda a água usada em essa reação é primeiramente desionizada e então é destilada em um destilador de vidro. Adiciona-se água (45,5 mL) a um balão de fundo redondo de 100 mL. Durante a agitação adiciona-se 0,2 M NaOH aquoso (1,5 mL), seguido de uma solução aquosa 1% de cloreto de tetraquis(hidroximetil)fosfônio (THPC) (1,0 mL). Dois minutos após a adição da solução de THPC adiciona-se uma solução aquosa 10 mg/mL de ácido cloroáurico (2 mL), que havia sido envelhecida durante pelo menos 15 minutos. As sementes de ouro são purificadas por diálise contra água.
[000273] Para formar os nanotransportadores núcleo-invólucro, as nanopartículas de SiO2 funcionalizadas com amino formadas acima são primeiramente misturadas com as sementes de ouro por 2 horas à temperatura ambiente. As partículas de SiO2 decoradas com ouro são coletadas mediante centrifugação e misturadas com uma solução aquosa de ácido cloroáurico e bicarbonato de potássio para formar o invólucro de ouro. As partículas são então lavadas mediante centrifugação e são novamente dispersas em água. Ovalbumina tiolada (preparada por tratamento de Ovalbumina com cloridrato de 2- iminotiolano) é carregada por suspensão das partículas em uma solução de Ovalbumina tiolada (1 mg/L) por 72 horas. O pélete de partículas é então lavado com 1x PBS (pH 7,4) para remover proteína livre. Os nanotransportadores núcleo-invólucro de sílica-ouro resultantes contendo Ovalbumina são então ressuspensos em 1x PBS para análise e ensaios adicionais.
Exemplo 7: Lipossomos Contendo Rapamicina e Ovalbumina (Profético)
[000274] Os lipossomos são formados por hidratação de filme fino. 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (32 μmol), colesterol (32 μmol), e rapamicina (6,4 μmol) são dissolvidos em clorofórmio puro (3 mL). Essa solução lipídica é adicionada a um tubo de vidro de 10 mL e o solvente é removido sob corrente de nitrogênio gasoso, e é dessecada por 6 horas sob vácuo. Vesículas multilamelares são obtidas por hidratação do filme com 2,0 mL de 25 mM tampão MOPS pH 8,5, contendo quantidade em excesso de Ovalbumina. O tubo é submetido a vórtice até o filme lipídico ser descolado da superfície do tubo. Para degradar as vesículas multilamelares em monolamelares são aplicados dez ciclos de congelação (nitrogênio líquido) e descongelação (banho de água a 30 °C). A amostra é então diluída para 1 mL em 25 mM tampão MOPS pH 8,5. A dimensão do lipossomo resultante é homogeneizada mediante extrusão, por passagem da amostra 10 vezes através de filtros de policarbonato com poros de 200 nm. Os lipossomos resultantes são então usados para análise e bioensaios adicionais.
Exemplo 8: Nanotransportadores Poliméricos Compostos de Poliaminoácido Modificado com Ovalbumina Conjugada na Superfície (Profético)
[000275] Etapa-1. Preparação de Poli(ácido Y—glutâmico) (y-PGA) modificado com éster de etila de L-fenilalanina (L-PAE): 4,7 unidades mmol de Y-PGA (Mn= 300 kD) são dissolvidas em solução aquosa 0,3 N de NaHCO3 (50 mL). L-PAE (4,7 mmol) e EDC.HCl (4,7 mmol) são adicionados à solução e o sistema é agitado por 30 minutos a 4 C. A solução é então mantida à temperatura ambiente com agitação por 24 horas. Os compostos químicos de baixo peso molecular são removidos por diálise, usando uma membrana de diálise com Corte de peso Molecular de 50 kD. O Y-PGA-enxerto-L-PAE resultante é obtido por liofilização.
[000276] Etapa-2. Preparação de nanopartículas de polímero Y-PGA- enxerto-L-PAE: Nanopartículas compostas de Y-PGA-enxerto-L-PAE são preparadas por um método de precipitação e diálise. Y-PGA- enxerto-L-PAE (20 mg) foi dissolvido em 2 mL de DMSO, seguido de adição de 2 mL de água para formar uma solução translúcida. A solução é então dialisada contra água destilada, usando tubagem de membrana de celulose (Corte de Peso Molecular 50 000) para formar as nanopartículas e para remover os solventes orgânicos, por 72 horas à temperatura ambiente. A água destilada é trocada em intervalos de 12 horas. A solução de nanopartículas resultante (10 mg/mL em água) é então usada para conjugação ao antígeno.
[000277] Etapa-3. Conjugação de Ovalbumina a nanopartículas de Y- PGA: Grupos ácido carboxílico de superfície das nanopartículas de Y- PGA (10 mg/mL) são primeiramente ativados por EDC e NHS (10 mg/mL cada em tampão de fosfato, pH 5,8) por 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem do pélete, para remover excesso de EDC/NHS, as nanopartículas ativadas são misturadas com 1 mL de Ovalbumina (10 mg/mL) em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) e a mistura é incubada a 4-8 C por 24 horas. As nanopartículas resultantes de Y-PGA conjugado a Ovalbumina são lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas a 5 mg/mL em PBS para análise e bioensaios adicionais.
Exemplo 9: Nanopartículas de Y-PGA com Eritropoietina (EPO) encapsulada (Profético)
[000278] Para preparar as nanopartículas de Y-PGA com EPO encapsulada, 0,25-4 mg de EPO são dissolvidos em 1 mL de PBS (pH 7,4) e 1 mL do Y—PGA—enxerto—L—PAE (10 mg/mL em DMSO) é adicionado à solução de EPO. A solução resultante é centrifugada a 14 000 x g por 15 minutos e é repetidamente enxaguada com PBS. As nanopartículas de Y-PGA com EPO encapsulada resultantes são então ressuspensas em PBS (5 mg/mL) para análise e bioensaio adicionais.
Exemplo 10: Preparação de Nanotransportadores de Ouro (AuNCs) Contendo Ovalbumina (Profético)
[000279] Etapa-1. Formação de NCs de Ouro (AuNCs): Uma solução aquosa de 500 mL de 1 mM HAuCl4 é aquecida para o refluxo por 10 minutos, com agitação vigorosa, em um balão de fundo redondo de 1 L equipado com um condensador. Uma solução de 50 mL de 40 mM de citrato trissódico é então rapidamente adicionada à solução com agitação. A solução cor de vinho escura resultante é mantida no refluxo por 25-30 minutos e o calor é removido e a solução é esfriada para a temperatura ambiente. A solução é então filtrada em um filtro de membrana de 0,8 μm, para prover a solução de AuNCs. Os AuNCs são caracterizados usando espectroscopia visível e microscopia eletrônica de transmissão. Os AuNCs têm um diâmetro de cerca de 20 nm, protegidos por citrato, com absorção de pico a 520 nm.
[000280] Etapa-2. Conjugação de Ovalbumina a AuNCs: Uma solução de 150 μL de Ovalbumina tiolada (10 μM em tampão de carbonato 10 mM pH 9,0) é adicionada a 1 mL de nanotransportadores de ouro com proteção de citrato com 20 nm de diâmetro (1,16 nM) para produzir uma proporção molar de tiol para ouro de 2500:1. A mistura é agitada à temperatura ambiente sob argônio durante 1 hora para permitir a troca completa de tiol com citrato sobre os nanotransportadores de ouro. Os AuNCs com Ovalbumina na superfície são então purificados por centrifugação a 12 000 g durante 30 minutos. O sobrenadante é decantado e o pélete contendo AuNC-Ovalbumina é lavado com tampão 1x PBS. Os nanotransportadores purificados de Ouro-Ovalbumina são então ressuspensos em um tampão adequado para análise e bioensaios adicionais.
Exemplo 11: Avaliação da Resposta Imunológica Tolerogênica por Análise Fenotípica de Células T (Profético)
[000281] Uma composição da invenção é dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e é injetada em ratos Lewis fêmeas intramuscularmente em 0,1-0,2 mL contendo 500 μg da composição. Um grupo de ratos de controle recebe 0,1-0,2 mL de PBS. Nove a dez dias após a injeção, baços e nódulos linfáticos são coletados dos ratos e obtêm-se suspensões de células isoladas mediante maceração dos tecidos em um coletor celular de 40 μm de náilon. As amostras são coradas em PBS (1% FCS) com a diluição apropriada de anticorpos monoclonais relevantes. As células coradas com iodeto de propídio são excluídas da análise. São adquiridas amostras em um citômetro de fluxo LSR2 (BD Biosciences, EUA) e são analisadas usando "software" FACS Diva. A expressão de marcadores CD4, CD8, etc. é analisada nas células. Uma redução da presença de células T CD8+, por exemplo, sugere uma indução de uma resposta imunológica desejada.
Exemplo 12: Avaliação da Resposta Imunológica Tolerogênica a Antígeno de Transplante Apresentável por APC In Vivo (Profético)
[000282] A camundongos Balb/c é administrado um autoantígeno, e é avaliado o nível de proliferação de células T CD8+. Subsequentemente, uma composição da invenção compreendendo o antígeno e um imunossupressor é administrada subcutaneamente de um modo dependente da dose. O nível de proliferação de células T CD8+ é avaliado de novo, com uma redução da proliferação de células T CD8+ indicando uma resposta imunológica tolerogênica.
Exemplo 13: Redução In Vivo de uma Resposta Imunológica Indesejada Contra Células Transplantáveis da Medula Óssea (Profético)
[000283] Uma população de pelo menos 106nanotransportadores sintéticos compreendendo imunossupressor e antígenos obtidos ou derivados de células da medula óssea é administrada subcutaneamente a um sujeito quatro semanas antes de o sujeito receber um transplante de medula óssea. Depois de o sujeito receber o transplante, a geração de uma resposta imunológica indesejada no sujeito é avaliada uma vez ao dia durante a primeira semana depois de receber o transplante, e então semanalmente durante as três semanas seguintes, e então mensalmente durante os 11 meses seguintes. Como parte da avaliação fazem-se contagens de células T CD8+, que são comparadas com contagens de células T CD8+ efetuadas antes da administração ao sujeito do transplante de medula óssea ou dos nanotransportadores sintéticos. Durante o primeiro ano são administradas bimensalmente ao sujeito doses de manutenção dos nanotransportadores sintéticos. É esperado que o sujeito exiba um nível nulo ou somente mínimo de uma resposta imunológica indesejada ao transplante de medula óssea.
Exemplo 14: Avaliação de Respostas Imunológicas Tolerogênicas com Nanotransportadores Sintéticos Compreendendo Imunossu- pressor e Antígeno Apresentável por APC In Vivo Materiais e Métodos para a Produção de Nanotransportadores Sintéticos Nanotransportador 1
[000284] Rapamicina foi adquirida à TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; # Catálogo do Produto R1017). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000285] Foram preparadas soluções do modo seguinte:
[000286] Solução 1: Rapamicina @ 50 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo rapamicina em cloreto de metileno puro.
[000287] Solução 2: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro.
[000288] Solução 3: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro.
[000289] Solução 4: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
[000290] Uma emulsão óleo-em-água foi usada para preparar os nanotransportadores. A emulsão O/W foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,75 mL), solução 3 (0,25 mL), e solução 4 (3 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. A emulsão O/W foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi submetida a lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 21 000xg e 4 °C por 45 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000291] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. A quantidade de rapamicina no nanotransportador foi determinada por análise de HPLC. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0006
Nanotransportador 2
[000292] Peptídeo de ovalbumina 323-339, um peptídeo de 17 aminoácidos conhecido por ser um epitopo de células T e B de proteína Ovalbumina, foi adquirido à Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte # 4065609). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000293] Foram preparadas soluções do modo seguinte:
[000294] Solução 1: Peptídeo de ovalbumina 323 - 339 @ 20 mg/mL em solução aquosa de ácido clorídrico diluído. A solução foi preparada dissolvendo peptídeo de ovalbumina em solução 0,13 M ácido clorídrico à temperatura ambiente.
[000295] Solução 2: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro.
[000296] Solução 3: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro.
[000297] Solução 4: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
[000298] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,75 mL), e solução 3 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 4 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250.
[000299] A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi submetida a lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 75 600xg e 4 °C por 35 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000300] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. A quantidade de peptídeo no nanotransportador foi determinada por análise de HPLC. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0007
Nanotransportador 3
[000301] Sinvastatina foi adquirida à LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; # Catálogo do Produto S3449). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000302] Foram preparadas soluções do modo seguinte:
[000303] Solução 1: Sinvastatina @ 50 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo sinvastatina em cloreto de metileno puro.
[000304] Solução 2: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro.
[000305] Solução 3: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro.
[000306] Solução 4: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
[000307] Uma emulsão óleo-em-água foi usada para preparar os nanotransportadores. A emulsão O/W foi preparada por combinação da solução 1 (0,15 mL), solução 2 (0,75 mL), solução 3 (0,25 mL), e solução 4 (3 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. A emulsão O/W foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi submetida a lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 75 600xg e 4 °C por 35 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000308] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. A quantidade de sinvastatina no nanotransportador foi determinada por análise de HPLC. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0008
Nanotransportador 4
[000309] Peptídeo de ovalbumina 323-339, um peptídeo de 17 aminoácidos conhecido por ser um epitopo de células T e B de proteína Ovalbumina, foi adquirido à Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte # 4065609). Rapamicina foi adquirida à TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; # Catálogo do Produto R1017). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000310] Foram preparadas soluções do modo seguinte:
[000311] Solução 1: Peptídeo de ovalbumina 323 - 339 @ 20 mg/mL em solução aquosa de ácido clorídrico diluído. A solução foi preparada dissolvendo peptídeo de ovalbumina em solução 0,13 M ácido clorídrico à temperatura ambiente.
[000312] Solução 2: Rapamicina @ 50 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo rapamicina em cloreto de metileno puro.
[000313] Solução 3: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro.
[000314] Solução 4: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro.
[000315] Solução 5: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
[000316] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,2 mL), solução 3 (0,75 mL), e solução 4 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 5 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250.
[000317] A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi sujeita à lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 21 000xg e 4 °C por 45 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000318] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. As quantidades de peptídeo e rapamicina no nanotransportador foram determinadas por análise de HPLC. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0009
Nanotransportador 5
[000319] Peptídeo de ovalbumina 323-339, um peptídeo de 17 aminoácidos conhecido por ser um epitopo de células T e B de proteína Ovalbumina, foi adquirido à Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte # 4065609). Sinvastatina foi adquirida à LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; # Catálogo do Produto S3449). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado.
Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000320] Foram preparadas soluções do modo seguinte:
[000321] Solução 1: Peptídeo de ovalbumina 323 - 339 @ 20 mg/mL em solução aquosa de ácido clorídrico diluído. A solução foi preparada dissolvendo peptídeo de ovalbumina em solução 0,13 M ácido clorídrico à temperatura ambiente.
[000322] Solução 2: Sinvastatina @ 50 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo sinvastatina em cloreto de metileno puro.
[000323] Solução 3: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro.
[000324] Solução 4: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro.
[000325] Solução 5: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
[000326] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,15 mL), solução 3 (0,75 mL), e solução 4 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 5 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250.
[000327] A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi submetida à lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 75 600xg e 4 °C por 35 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000328] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. As quantidades de peptídeo e sinvastatina no nanotransportador foram determinadas por análise de HPLC. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0010
Administração 1 In vivo
[000329] Baços de camundongos B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) e C57BL/6 (B6) foram coletados, mecanicamente dissociados e filtrados separadamente em um crivo de 70 μm para originar uma suspensão de células isoladas. Células CD4+CD25- purificadas foram então extraídas em um processo de 2 etapas. Usando um aparelho de triagem magnética de células Miltenyi Biotec AutoMACS, células do baço foram primeiramente etiquetadas com um estojo de isolamento de células T CD4+II e a fração não etiquetada foi depletada de células CD25+com um estojo de depleção de CD25. As células B6 purificadas foram coradas com um corante intracelulart, Éster de Succinimidila de Carboxifluoresceína (CFSE), antes de serem misturadas, em concentrações iguais, com as células de OTII purificadas. Então foram injetadas intravenosamente (i.v.) em camundongos receptores B6.SJL- Ptprca/BoyAi (CD45.1).
[000330] No dia seguinte, os camundongos receptores CD45.1 foram tratados com partículas direcionadas de vacina sintética tolerogênica (t2SVP). Foram carregadas com combinações de peptídeo de ovalbumina (323-339) (OVA 323-339), Rapamicina (Rapa) e/ou Sinvastatina (Sinva) e foram administradas subcutaneamente (s.c.).
[000331] A injeção constitui um tratamento tolerogênico, e foi seguida de mais 4 injeções, cada uma com um intervalo de 2 semanas entre si. Depois de completado o calendário do tratamento, os animais receptores CD45.1 foram mortos e seus baços e nódulos linfáticos popliteais foram coletados, mecanicamente dissociados e filtrados separadamente em um crivo de 70 μm para originar uma suspensão de células isoladas. As células do baço foram depletadas de glóbulos vermelhos (GVs) por incubação com tampão de lise de GV (Stem Cell Technologies) e efetuaram-se contagens de células nos baços e nódulos linfáticos.
[000332] Células do baço ou nódulo linfático foram cultivadas em CM (meio completo) suplementado com 10 U/mL de IL-2, foram novamente estimuladas com OPII a 0,3x106células/poço em placas de fundo redondo (FR) de 96 poços e incubadas a 37 °C, 5 % CO2. As células foram separadas no Dia 2 e coletadas no Dia 5. Os sobrenadantes foram coletados e glóbulos brancos congelados foram corados para análise fenotípica por citometria de fluxo. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo Becton Dickinson FacsCanto.
Administração 2 In vivo
[000333] Baços de camundongos B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) e C57BL/6 (B6) foram coletados, mecanicamente dissociados e filtrados separadamente em um crivo de 70 μm para originar uma suspensão de células isoladas. Células CD4+CD25- purificadas foram então extraídas em um processo em 2 etapas usando um aparelho de triagem magnética de células Miltenyi Biotec AutoMACS. As células do baço foram etiquetadas usando o estojo de isolamento de células T CD4+da Miltenyi II. A fração de células T CD4+ não etiquetadas foi então depletada de células CD25+ com um estojo de depleção de CD25. As células CD4 purificadas de camundongos B6 foram então coradas com um corante intracelular, Éster de Succinimidila de Carboxifluor- esceína (CFSE), antes de serem misturadas, em concentrações iguais, com as células de OTII purificadas. Então foram injetadas intravenosamente (i.v.) em camundongos receptores B6.SJL-Ptprca/BoyAi (CD45.1).
[000334] No dia seguinte, os camundongos receptores CD45.1 foram tratados com partículas direcionadas de vacina sintética tolerogênica. Compreenderam combinações de peptídeo de ovalbumina (323-339) (OVA 323-339), Rapamicina (Rapa) e Sinvastatina (Sinva) e foram administradas subcutaneamente (s.c.) ou intravenosamente (i.v.).
[000335] Depois de completado o calendário do tratamento, os animais receptores CD45.1 foram mortos e seus baços e nódulos linfáticos popliteais foram coletados, mecanicamente dissociados e filtrados separadamente em um crivo de 70 μm para originar uma suspensão de células isoladas. As células do baço foram depletadas de glóbulos vermelhos (GVs) por incorporação com tampão de lise de GV (Stem Cell Technologies) e efetuaram-se contagens de células nos baços e nódulos linfáticos.
[000336] Células do baço ou nódulo linfático foram cultivadas em CM suplementado com 10 U/mL de IL-2, foram novamente estimuladas com 1 μM OPII a 0,3x106células/poço em placas de fundo redondo (FR) de 96 poços e incubadas a 37°C, 5 % CO2. As células foram separadas no Dia 2 e coletadas no Dia 5. Os sobrenadantes foram coletados e glóbulos brancos congelados foram corados para análise fenotípica por citometria de fluxo. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo Becton Dickinson FacsCanto.
Resultados
[000337] Os resultados estão apresentados nas figuras 2 e 3 (Imunomodulador 1: rapamicina; imunomodulador 2: sinvastatina). As figuras mostram efeitos in vivo e demonstram uma redução do número de células imunológicas efetoras com nanotransportadores sintéticos compreendendo antígeno e imunossupressores em comparação com antígeno isoladamente ou nanotransportadores sintéticos compreen-dendoantígeno com e sem uma molécula imunoestimuladora. A figura 3 também demonstra um aumento da porcentagem que expressa FoxP3 com nanotransportadores sintéticos compreendendo antígeno e imunossupressor em comparação com nanotransportadores sintéticos que compreendem somente antígeno.
Exemplo 15: Respostas Imunológicas Tolerogênicas com Nanotransportadores Sintéticos Materiais e Métodos Nanotransportador 1
[000338] Proteína Ovalbumina foi adquirida à Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701; Código do Produto 3048). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Colato de sódio hidratado foi adquirido à Sigma- Aldrich Corp. (3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103; Código do Produto C6445).
[000339] Foram preparadas soluções do modo seguinte:
[000340] Solução 1: Ovalbumina @ 50 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato. A solução foi preparada dissolvendo ovalbumina em solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente. Solução 2: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro. Solução 3: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro. Solução 4: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL e colato de sódio hidratado @ 10 mg/mL em 100 mM tampão de fosfato pH 8.
[000341] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,75 mL), e solução 3 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 4 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250. A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi submetida a lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 75 600xg e 4 °C por 35 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000342] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. A quantidade de proteína no nanotransportador foi determinada por um ensaio fluorométrico com o- ftalaldeído. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0011
Nanotransportador 2
[000343] Proteína Ovalbumina foi adquirida à Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701; Código do Produto 3048). Rapamicina foi adquirida à TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; # Catálogo do Produto R1017). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001). Colato de sódio hidratado foi adquirido à Sigma-Aldrich Corp. (3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103; Código do Produto C6445).
[000344] Foram preparadas soluções do modo seguinte:
[000345] Solução 1: Ovalbumina @ 50 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato. A solução foi preparada dissolvendo ovalbumina em solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente. Solução 2: Rapamicina @ 50 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo rapamicina em cloreto de metileno puro. Solução 3: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro. Solução 4: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro. Solução 5: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL e colato de sódio hidratado @ 10 mg/mL em 100 mM tampão de fosfato pH 8.
[000346] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,2 mL), solução 3 (0,75 mL), e solução 4 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 5 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250. A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi submetida à lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 75 600xg e 4 °C por 35 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000347] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. A quantidade de rapamicina no nanotransportador foi determinada por análise de HPLC. A quantidade de proteína no nanotransportador foi determinada por um ensaio fluorométrico com o-ftalaldeído. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0012
Imunização
[000348] A finalidade desse experimento foi avaliar os efeitos de imunossupressor (t2SVP) encapsulado na lise celular de células que expressam OVA. Tais células servem para exemplificar células transplantáveis que expressam um antígeno. Um grupo de animais não foi imunizado, como controle (mas recebeu o tratamento). Um segundo grupo de animais foi imunizado usando "administração passiva" de Ovalbumina, e um terceiro grupo foi imunizado com OVA e CpG na região subescapular. Cada um desses grupos recebeu bissemanalmenteinjeção de nanotransportadores. Para a imunização, os animais receberam 100 μL de OVA+CpG s.c. (subescapular) ou 25 μg de OVA i.v. em 100 μL. O tratamento tolerogênico compreendeu a administração de 100 μL de t2SVP i.v. Os nanotransportadores foram proporcionados a 5 mg/mL. Nanotransportadores tolerogênicos foram diluídos de modo tal que as mesmas quantidades de OVA foram injetadas em todos os grupos. As injeções foram realizadas em d0, d14, d28, d42, d56.
Medição da Lise Celular
[000349] Células transgênicas em OVA foram etiquetadas com CFSE usando uma concentração de 5 μM, ao passo que células de controle (normais, de tipo selvagem) foram etiquetadas com uma concentração de 50 μM. Essas foram lavadas, contadas e misturadas em proporções iguais a serem transferidas para os animais do estudo. No dia seguinte, os animais foram sacrificados e os seus baços foram coletados. Uma suspensão de células isoladas desses órgãos foi preparada e etiquetada com 7AAD (corante de viabilidade celular) e contada. A análise por citometria de fluxo permite a detecção de CFSEalto (controle) versus CFSEbaixo (expressando OVA). A lise antígeno- específica conduz a perda seletiva da população CFSEbaixo em comparação com o controle não manipulado, não imunizado.
Resultados
[000350] A figura 4 mostra um decréscimo na lise celular com nanotransportadores compreendendo antígeno e imunossupressor em comparação com nanotransportadores compreendendo o antígeno isoladamente.
Exemplo 16: Avaliação dos Efeitos de Nanotransportadores com Antígenos e Imunossupressores Nanotransportadores
[000351] Peptídeo de ovalbumina 323-339, um peptídeo de 17 aminoácidos conhecido por ser um epitopo de células T e B de proteína Ovalbumina, foi adquirido à Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte # 4065609). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000352] Foram preparadas soluções do modo seguinte: Solução 1: Peptídeo de ovalbumina 323 - 339 @ 20 mg/mL em solução aquosa de ácido clorídrico diluído. A solução foi preparada dissolvendo peptídeo de ovalbumina em solução 0,13 M ácido clorídrico à temperatura ambiente. Solução 2: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro. Solução 3: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro. Solução 4: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8. Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em- óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,75 mL), e solução 3 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 4 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250.
[000353] A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi submetida a lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 75 600xg e 4 °C por 35 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000354] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. A quantidade de peptídeo no nanotransportador foi determinada por análise de HPLC. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0013
[000355] Peptídeo de ovalbumina 323-339, um peptídeo de 17 aminoácidos conhecido por ser um epitopo de células T e B de proteína Ovalbumina, foi adquirido à Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte # 4065609). Rapamicina foi adquirida à TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; # Catálogo do Produto R1017). PLGA com uma razão de láctido:glicólido de 3:1 e uma viscosidade inerente de 0,75 dL/g foi adquirido à SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código do Produto 7525 DLG 7A). Copolímero de bloco de PLA-PEG com um bloco PEG de aproximadamente 5 000 Da e um bloco PLA de aproximadamente 20 000 Da foi sintetizado. Álcool polivinílico (85-89% hidrolisado) foi adquirido à EMD Chemicals (Número do Produto 1.41350.1001).
[000356] Foram preparadas soluções do modo seguinte: Solução 1: Peptídeo de ovalbumina 323 - 339 @ 20 mg/mL em solução aquosa de ácido clorídrico diluído. A solução foi preparada dissolvendo peptídeo de ovalbumina em solução 0,13 M ácido clorídrico à temperatura ambiente. Solução 2: Rapamicina @ 50 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo rapamicina em cloreto de metileno puro. Solução 3: PLGA @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLGA em cloreto de metileno puro. Solução 4: PLA-PEG @ 100 mg/mL em cloreto de metileno. A solução foi preparada dissolvendo PLA-PEG em cloreto de metileno puro. Solução 5: Álcool polivinílico @ 50 mg/mL em 100 mM de tampão de fosfato pH 8.
[000357] Em primeiro lugar foi preparada uma emulsão água-em-óleo primária. A W1/O1 foi preparada por combinação da solução 1 (0,2 mL), solução 2 (0,2 mL), solução 3 (0,75 mL), e solução 4 (0,25 mL) em um pequeno tubo de pressão e sonicação a 50 % de amplitude por 40 segundos, usando um Sonificador Branson Digital 250. Uma emulsão secundária (W1/O1/W2) foi então preparada por combinação da solução 5 (3,0 mL) com a emulsão W1/O1 primária, sujeição a vórtice por 10 s, e sonicação a 30 % de amplitude por 60 segundos usando o Sonificador Branson Digital 250.
[000358] A emulsão W1/O1/W2 foi adicionada a um béquer que continha 70 mM de solução tampão de fosfato pH 8 (30 mL) e foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, para permitir a evaporação do cloreto de metileno e a formação dos nanotransportadores. Uma porção dos nanotransportadores foi sujeita à lavagem, por transferência da suspensão dos nanotransportadores para um tubo de centrifugação e centrifugação a 21 000xg e 4 °C por 45 minutos, remoção do sobrenadante, e ressuspensão do pélete em solução salina tamponada com fosfato. O procedimento de lavagem foi repetido, e o pélete foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato para uma dispersão final dos nanotransportadores de cerca de 10 mg/mL.
[000359] A dimensão dos nanotransportadores foi determinada por dispersão dinâmica da luz. As quantidades de peptídeo e rapamicina no nanotransportador foram determinadas por análise de HPLC. A massa de nanotransportador seco total por mL da suspensão foi determinada por um método gravimétrico.
Figure img0014
[000360] A medição das dimensões dos nanotransportadores sintéticos foi obtida mediante dispersão dinâmica da luz (DLS). Uma suspensão dos nanotransportadores sintéticos foi diluída com água purificada, para alcançar uma concentração final da suspensão de nanotransportadores sintéticos de aproximadamente 0,01 a 0,1 mg/mL. A suspensão diluída foi preparada diretamente dentro de uma cuvete adequada para análise de DLS. A cuvete foi então colocada em um ZetaPALS da Brookhaven Instruments Corp., foi deixada equilibrar para 25 °C, e então foi submetida à varredura por um tempo suficiente para adquirir uma distribuição estável e reprodutível com base em entradas apropriadas para a viscosidade do meio e índices de refração da amostra. O diâmetro efetivo, ou média da distribuição, foi então relatado.
Imunização
[000361] Os nanotransportadores foram descongelados e equilibrados. As diluições iniciais constituíram uma solução estoque 10x, e foram adicionalmente diluídas para uma concentração de 100 μg/mL em OVA323-339, ou uma solução 1x. Essa solução 1x foi usada para injeções a 200 μL por injeção i.v. Os animais foram imunizados com proteína OVA (OVA) e foram tratados com peptídeo de OVA323-339. As vias de imunização foram as seguintes: 10 μg de OVA+ 4 mg Alúmen i.p. em 400 μL por cada camundongo Balb/C fêmea imunologicamente não manipulado. Os grupos experimentais consistiram de 5 animais cada. Células do baço foram novamente estimuladas com antígeno, usando CFSE ou CTO, para determinar a quantidade de proliferação Ag-específica.
Níveis de Tipos Específicos de Células Imunológicas
[000362] Arquivos de FCS foram analisados usando "software" FlowJo. Células 7AAD positivas (um corante nuclear que marca células mortas) foram excluídas e morfologias celulares dependentes da expressão de CD4, CD8, Gr-1, F4/80, B220, TCRb e CD11b foram quantificadas.
[000363] Estratégia de visualização para subconjuntos de células T ^ 7AAD- F4/80- GR-1- TCRb+ CD4+/- CD8+/-
Resultados
[000364] A figura 5 demonstra a eficácia dos nanotransportadores em um modelo animal. De modo específico, a figura 5 demonstra uma redução do número de células T CD8+ em amostras de lavagem de sujeitos animais tratados com nanotransportadores sintéticos compreendendo OVA323-339 e imunossupressor.
Exemplo 17: Avaliação dos Efeitos de Nanotransportadores com Antígenos e Imunossupressores (Profético) Nanotransportadores
[000365] Nanotransportadores são preparados de modo similar ao exemplo acima (Exemplo 16) usando o peptídeo restrito a MHC de Classe I SINFEKL (SEQ ID NO: 944) em vez do peptídeo de ovalbumina.
Imunização
[000366] Os nanotransportadores são descongelados e equilibrados. As diluições iniciais constituem uma solução estoque 10x, e são adicionalmente diluídas para uma concentração de 100 μg/mL em peptídeo, ou uma solução 1x. Essa solução 1x é usada para injeções a 200 μL por injeção i.v. Os animais são imunizados com proteína compreendendo o peptídeo e são tratados com peptídeo. As vias de imunização são as seguintes: 10 μg de peptídeo + 4 mg Alúmen i.p. em 400 μL por cada camundongo Balb/C fêmea imunologicamente não manipulado. Os grupos experimentais consistem de 5 animais cada. Células do baço são novamente estimuladas com antígeno, usando CFSE ou CTO, para determinar a quantidade de proliferação Ag- específica.
Níveis de Tipos Específicos de Células Imunológicas
[000367] Arquivos de FCS são analisados usando "software" FlowJo. Células 7AAD positivas (um corante nuclear que marca células mortas) são excluídas e morfologias celulares dependentes da expressão de CD4, CD8, Gr-1, F4/80, B220, TCRb e CD11b são quantificadas.
[000368] Estratégia de visualização para subconjuntos de células T ^ 7AAD- F4/80- GR-1- TCRb+ CD4+/- CD8+/-

Claims (9)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) uma primeira população de nanotransportadores poliméricos sintéticos acoplados a imunossupressores, e (ii) uma segunda população de nanotransportadores poliméricos sintéticos acoplados a epítopos restritos a MHC de Classe II de um antígeno associado a uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada, opcionalmente compreendendo ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a carga dos imunossupressores, em média, ao longo da primeira população de nanotransportadores sintéticos é de pelo menos 2%, mas não maior que 25% (peso/peso), em que o imunossupressor é rapamicina ou um análogo de rapamicina, e em que a média de uma distribuição de tamanho de partícula obtida usando dispersão de luz dinâmica dos nanotransportadores sintéticos da primeira e/ou da segunda população é uma dimensão mínima que é maior que 110 nm e uma dimensão máxima que é igual ou menor que 500 nm.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, carac-terizada pelo fato de que: (a) a primeira população e a segunda população são a mesma população; e/ou (b) os nanotransportadores sintéticos da segunda população estão adicionalmente acoplados a epítopos de células B do antígeno, os nanotransportadores sintéticos compreendem substancialmente nenhum epítopo de células B do antígeno; e/ou (c) o antígeno é um alérgeno, autoantígeno ou proteína terapêutica, ou está associado a uma doença inflamatória, uma doença autoimune, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro; e/ou (d) a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada consiste em proliferação e/ou atividade de células T CD8+ específicas para o antígeno; e/ou (e) a composição está em uma quantidade eficaz para reduzir a resposta imunológica de células T CD8+ indesejada ao antígeno quando administrada a um indivíduo; e/ou (f) a carga dos epítopos em média ao longo dos nanotrans-portadores sintéticos está situada entre 0,0001% e 50% (peso/peso), por exemplo, entre 0,1% e 10% (peso/peso) ou entre 1% e 10% (peso/peso).
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que: (i) os nanotransportadores poliméricos compreendem um polímero que é um polímero plurônico com terminação não metóxi; e/ou (ii) os nanotransportadores poliméricos compreendem um poliéster, um poliéster acoplado a um poliéter, poliaminoácido, policarbo-nato, poliacetal, policetal, polissacarídeo, polietiloxazolina ou polietilenoi- mina, por exemplo, em que o poliéster compreende um poli(ácido lático), poli(ácido glicólico), poli(ácido lático-co-glicólico) ou policaprolactona e/ou os nanotransportadores poliméricos compreendem um poliéster e um poliéster acoplado a um poliéter, por exemplo, em que o poliéter compreende polietileno glicol ou polipropileno glicol.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a razão de aspecto dos nanotransportadores sintéticos da primeira população e/ou segunda população é maior do que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 ou 1:10.
5. Forma de dosagem, caracterizada pelo fato de que compreende a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 4 ou forma de dosagem de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é para utilização em terapia ou profilaxia.
7. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou forma de dosagem como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento destinado à utilização em um método para redução de uma resposta imunológica de células T CD8+ indesejada a um antígeno restrito a MHC de Classe II em um indivíduo, o tratamento ou profilaxia de alergia, doença autoimune, doença inflamatória, rejeição de órgão ou tecido ou doença enxerto versus hospedeiro .
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a carga dos imunossupressores, em média, ao longo da primeira população de nanotransportadores sintéticos é de pelo menos 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% ou 20% (peso / peso).
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da primeira população de nanotransportadores sintéticos têm uma dimensão mínima ou máxima que recai em 5%, 10% ou 20% do diâmetro médio dos nanotransportadores sintéticos.
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