ES2806268T3 - Nanoportadores sintéticos tolerogénicos para reducir las respuestas de anticuerpos - Google Patents

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Christopher Fraser
Takashi Kei Kishimoto
Roberto A Maldonado
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Abstract

Una composición para usar en un método que promueve una respuesta inmunitaria tolerogénica a un antígeno que de otro modo causaría una respuesta inmunitaria no deseada cuando se administra a un sujeto, en donde: (a) la composición comprende nanoportadores sintéticos acoplados a: rapamicina o un análogo de rapamicina con una carga de no más de 25% (p/p); y epítopos restringidos por MHC de clase II de dicho antígeno con una carga de no más de 25% (p/p); y (b) la composición está en una cantidad efectiva para reducir la producción de anticuerpos específicos para dicho antígeno en el sujeto, y en donde la composición no comprende epítopos de células B que generan una respuesta humoral no deseada contra dicho antígeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanoportadores sintéticos tolerogénicos para reducir las respuestas de anticuerpos
Campo de la invención
se describen en el presente documento composiciones sintéticas de nanoportadores que comprenden inmunosupresores y epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., en un sujeto) y métodos relacionados. Las composiciones y métodos pueden reducir las respuestas inmunitarias humorales no deseadas. Las composiciones y métodos permiten una captación eficiente por las APC para cambiar la respuesta inmunitaria a favor de reducir el desarrollo de respuesta inmunitaria humoral no deseada específica para los antígenos. Las composiciones y métodos permiten la estimulación de respuestas inmunitarias tolerogénicas, tal como a través de la reducción de la ayuda de células T CD4+ específicas de antígeno.
Antecedentes de la invención
Las respuestas de anticuerpos típicamente requieren células T CD4+ auxiliares para establecer una respuesta del centro germinal e inducir el cambio de isotipo. La reducción de la función y/o el número de células T auxiliares CD4+ puede mejorar las respuestas de anticuerpos no deseadas. Sin embargo, hacerlo con fármacos inmunosupresores convencionales, que son de acción amplia, puede no ser deseable. Además, con el fin de mantener la inmunosupresión, la terapia con fármacos inmunosupresores generalmente es una propuesta de por vida. Desafortunadamente, el uso de inmunosupresores de acción amplia se asocia con un riesgo de efectos secundarios graves, tales como tumores, infecciones, nefrotoxicidad y trastornos metabólicos. Por consiguiente, las nuevas terapias inmunosupresoras serían beneficiosas.
El documento WO2008043157 (y el US2010151000 relacionado) implica el suministro de agentes a células inmunitarias que comprenden un inhibidor de la ruta de señalización de NF-kappa-B y un antígeno.
Moghimi (2011) J. Thromb. Haemost. 9 (8):1524-1533 describe un protocolo que usa rapamicina para F.VIII.
Resumen de la invención
La invención proporciona composiciones para usar como se define en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que esta invención no se limita a lo que se presenta en los ejemplos a modo de ilustración.
Descripción técnica de referencia
Esta descripción técnica va más allá de la mera descripción de la invención, y proporciona la base para una serie de otros desarrollos adicionales, como se ilustra, entre otros, en los ejemplos de referencia. Se apreciará que ninguno de estos aspectos adicionales y otros se presentan o reivindican como la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas.
Esta descripción técnica describe composiciones que comprenden (i) una primera población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a inmunosupresores, y (ii) una segunda población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada. En un aspecto de esta descripción técnica, la primera población y la segunda población son la misma población. En otro aspecto de esta descripción técnica, la primera población y la segunda población son poblaciones diferentes.
El antígeno puede ser uno que genera, o se espera que genere, una respuesta inmunitaria humoral no deseada en uno o más sujetos.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la primera población y/o la segunda población de nanoportadores sintéticos también están acopladas a epítopos restringidos por MHC de clase I y/o a epítopos de células B del antígeno. En otro aspecto de esta descripción técnica, la composición no comprende sustancialmente epítopos de células B del antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., en un sujeto). En un caso, la primera población y/o la segunda población de nanoportadores sintéticos están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II y, en algunos casos, a epítopos restringidos por MHC de clase I, pero no comprenden sustancialmente epítopos de células B que generen una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., en un sujeto).
En otro aspecto de esta descripción técnica, la respuesta inmunitaria humoral no deseada es la generación de proliferación y/o actividad de células T CD4+ específicas de antígeno o anticuerpos específicos de antígeno. En otro aspecto de esta descripción técnica, la respuesta inmunitaria humoral no deseada es la generación de proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno. La respuesta inmunitaria humoral no deseada puede estar en un sujeto.
En otro aspecto de esta descripción técnica, los inmunosupresores comprenden una estatina, un inhibidor de mTOR, un agente de señalización de TGF-p, un corticosteroide, un inhibidor de la función mitocondrial, un inhibidor de P38, un inhibidor de NF-Kp, un agonista del receptor de adenosina, un agonista de prostaglandina E2, un inhibidor de fosfodiesterasa 4, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de proteasoma. En otro aspecto de esta descripción técnica, el inhibidor de mTOR es rapamicina o un análogo de rapamicina.
En otro aspecto de esta descripción técnica, un antígeno que comprende los epítopos mencionados anteriormente está acoplado con los nanoportadores sintéticos. En otro aspecto de esta descripción técnica, una parte del antígeno que comprende los epítopos mencionados anteriormente está acoplada con los nanoportadores sintéticos. En otro aspecto más de esta descripción técnica, la parte del antígeno acoplada a los nanoportadores sintéticos puede ser el epítopo solo. El antígeno puede ser un alergeno, un autoantígeno o una proteína terapéutica, o estar asociado con una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de órganos o tejidos o enfermedad de injerto contra huésped.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la composición está en una cantidad efectiva para reducir una respuesta inmunitaria humoral no deseada contra el antígeno cuando se administra a un sujeto.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la carga de los inmunosupresores y/o epítopos en promedio en la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos está entre 0,0001% y 50% (peso/peso). En otro aspecto de esta descripción técnica, la carga de los inmunosupresores y/o epítopos en promedio en la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos está entre 0,1% y 10% (peso/peso).
En otro aspecto de esta descripción técnica, los nanoportadores sintéticos de la primera población y/o segunda población comprenden nanopartículas lipídicas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsiones basadas en tensioactivos, dendrímeros, bolas de bucky, nanocables, partículas similares a virus o partículas de péptidos o proteínas. En otro aspecto de esta descripción técnica, los nanoportadores sintéticos de la primera población y/o segunda población comprenden nanopartículas lipídicas. En otro aspecto de esta descripción técnica, los nanoportadores sintéticos de la primera población y/o segunda población comprenden liposomas. En otro aspecto de esta descripción técnica, los nanoportadores sintéticos de la primera población y/o segunda población comprenden nanopartículas metálicas. En otro aspecto de esta descripción técnica, las nanopartículas metálicas comprenden nanopartículas de oro. En otro aspecto de esta descripción técnica, los nanoportadores sintéticos de la primera población y/o segunda población comprenden nanopartículas poliméricas. En otro aspecto de esta descripción técnica, las nanopartículas poliméricas comprenden polímeros plurónicos no terminados en metoxi. En otro aspecto de esta descripción técnica, las nanopartículas poliméricas comprenden un poliéster, un poliéster acoplado con un poliéter, poliaminoácido, policarbonato, poliacetal, policetal, polisacárido, polietiloxazolina o polietilenimina. En otro aspecto de esta descripción técnica, el poliéster comprende un poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-coglicólico) o policaprolactona. En otro aspecto de esta descripción técnica, las nanopartículas poliméricas comprenden un poliéster y un poliéster acoplado con un poliéter. En otro aspecto de esta descripción técnica, el poliéter comprende polietilenglicol o polipropilenglicol.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la media de una distribución del tamaño de partículas obtenida usando la dispersión dinámica de la luz de los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población es un diámetro mayor de 100 nm. En otro aspecto de esta descripción técnica, el diámetro es mayor de 150 nm. En otro aspecto de esta descripción técnica, el diámetro es mayor de 200 nm. En otro aspecto de esta descripción técnica, el diámetro es mayor de 250 nm. El diámetro puede ser mayor de 300 nm.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la relación de tamaños de los nanoportadores sintéticos de la primera población y/o segunda población es mayor de 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 o 1:10.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se contempla una forma farmacéutica que comprende cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se contempla un método que comprende administrar cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas descritas en el presente documento. En un aspecto de esta descripción técnica, se reduce una respuesta inmunitaria humoral no deseada contra el antígeno en el sujeto. En otro aspecto de esta descripción técnica, la respuesta inmunitaria humoral no deseada es la producción de anticuerpos específicos del antígeno. En otro aspecto de esta descripción técnica, la respuesta inmunitaria humoral no deseada es la proliferación y/o actividad de células T CD4+ específicas de antígeno. En otro aspecto de esta descripción técnica, la respuesta inmunitaria humoral no deseada es la proliferación y/o actividad de las células B.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se describe un método que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende (i) una primera población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a inmunosupresores, y (ii) una segunda población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., en un sujeto), en donde la composición está en una cantidad efectiva para reducir una respuesta inmunitaria humoral no deseada contra el antígeno en el sujeto. En otro aspecto de esta descripción técnica, se describe un método que comprende reducir una respuesta inmunitaria humoral no deseada contra un antígeno en un sujeto mediante la administración de una composición que comprende (i) una primera población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a inmunosupresores, y (ii) una segunda población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II del antígeno. En otro aspecto de esta descripción técnica, se contempla un método que comprende administrar una composición a un sujeto de acuerdo con un protocolo que se ha mostrado previamente que reduce una respuesta inmunitaria humoral no deseada frente a un antígeno en uno o más sujetos de ensayo; en donde la composición comprende (i) una primera población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a inmunosupresores, y (ii) una segunda población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II del antígeno.
En un aspecto de esta descripción técnica, la primera población y la segunda población son la misma población. En otro aspecto de esta descripción técnica, la primera población y la segunda población son poblaciones diferentes.
En otro aspecto de esta descripción técnica, el método comprende además proporcionar o identificar al sujeto.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se administran una o más dosis de mantenimiento de la composición que comprende la primera población y la segunda población de nanoportadores sintéticos al sujeto. En otro aspecto de esta descripción técnica, el método comprende además evaluar la respuesta inmunitaria humoral no deseada en el sujeto antes y/o después de la administración de la composición que comprende la primera población y la segunda población de nanoportadores sintéticos. En otro aspecto de esta descripción técnica, la evaluación comprende determinar el nivel de proliferación y/o actividad de células T CD4+ específicas de antígeno y/o el nivel de producción de anticuerpos específicos de antígeno y/o el nivel de proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno.
En otro aspecto de esta descripción técnica, el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una alergia o enfermedad de injerto contra huésped. En otro aspecto de esta descripción técnica, el sujeto se ha sometido o se someterá a un trasplante. En otro aspecto de esta descripción técnica, el sujeto ha recibido, está recibiendo o recibirá una proteína terapéutica.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la administración es por administración intravenosa, intraperitoneal, transmucosa, oral, subcutánea, pulmonar, intranasal, intradérmica o intramuscular. En otro aspecto de esta descripción técnica, la administración es por administración por inhalación o intravenosa, subcutánea o transmucosa.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se describe un método que comprende (i) producir una primera población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a inmunosupresores, y (ii) producir una segunda población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada, o se espera que la genere, en un sujeto.
En otro aspecto de esta descripción técnica, el método comprende además asegurar que la segunda población de nanoportadores sintéticos no comprenda sustancialmente epítopos de células B del antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada. En otro aspecto de esta descripción técnica, el método comprende además hacer una forma farmacéutica que comprende la primera población y la segunda población de nanoportadores sintéticos. En otro aspecto de esta descripción técnica, el método comprende además hacer una composición que comprende la primera población y la segunda población de nanoportadores sintéticos o la forma farmacéutica disponible para un sujeto para administración. En otro aspecto de esta descripción técnica, el método comprende además evaluar el nivel de una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., en un sujeto) con una composición que comprende la primera población y la segunda población de nanoportadores sintéticos o una forma farmacéutica de los mismos. En otro aspecto de esta descripción técnica, la evaluación comprende determinar el nivel de proliferación y/o actividad de células T CD4+ y/o el nivel de producción de anticuerpos específicos de antígeno y/o el nivel de proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno.
En otro aspecto de esta descripción técnica, la primera población y la segunda población de nanoportadores sintéticos que se producen son como se definen en cualquiera de las composiciones o métodos descritos en el presente documento.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se describe un procedimiento para producir una composición o forma farmacéutica que comprende las etapas de (i) acoplar una primera población de nanoportadores sintéticos a inmunosupresores, y (ii) acoplar una segunda población de nanoportadores sintéticos a epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada. En un caso, el procedimiento comprende las etapas definidas en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se contempla una composición o forma farmacéutica que se puede obtener por cualquiera de los métodos o procedimientos descritos en el presente documento.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se contempla cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas descritas en el presente documento para usar en terapia o profilaxis.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se contempla cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas descritas en el presente documento para usar en un método para reducir una respuesta inmunitaria humoral no deseada frente a un antígeno en un sujeto, el tratamiento o la profilaxis de alergias, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria, rechazo de órganos o tejidos o enfermedad de injerto contra huésped o en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se contempla el uso de cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas descritas en el presente documento para la fabricación de un fármaco para usar en un método de reducción de una respuesta inmunitaria humoral no deseada frente a un antígeno en un sujeto, el tratamiento o profilaxis de alergias, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria, rechazo de órganos o tejidos o enfermedad de injerto contra huésped o en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
En otro aspecto de esta descripción técnica, se contempla una forma farmacéutica que comprende cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento.
En un aspecto de cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento, los antígenos que son proteínas que comprenden los epítopos mencionados anteriormente, se pueden acoplar a los nanoportadores sintéticos. En otro aspecto de esta descripción técnica, los polipéptidos o péptidos que comprenden los epítopos mencionados anteriormente excepto aminoácidos adicionales que flanquean uno o ambos extremos del(los) epítopo(s) se pueden acoplar a los nanoportadores sintéticos. En otro caso, se acoplan los propios epítopos a los nanoportadores sintéticos.
Breve descripción de las figuras
La fig. 1 muestra resultados de un análisis de citometría de flujo de Treg.
La fig. 2 muestra un efecto sobre el número de células T efectoras específicas de antígeno con nanoportadores sintéticos que comprenden inmunosupresor (rapamicina o simvastatina) (después de una sola inyección).
La fig. 3 muestra una disminución en el número de células de ganglios linfáticos poplíteos con nanoportadores sintéticos que comprenden inmunosupresor (rapamicina o simvastatina) (después de múltiples inyecciones).
La fig. 4 demuestra la reducción de los anticuerpos IgG anti-OVA con nanoportadores sintéticos que comprenden el inmunosupresor rapamicina y el antígeno ova.
La fig. 5 demuestra en los grupos de control y pasivos la reducción de los anticuerpos IgG anti-OVA con nanoportadores sintéticos que comprenden el inmunosupresor rapamicina y el antígeno OVA.
La fig. 6 muestra una reducción en los niveles de IgG específicos de antígeno con la administración de nanoportadores sintéticos que comprenden péptido ova y el inmunosupresor rapamicina.
La fig. 7 demuestra una reducción en el número de células B específicas de antígeno con nanoportadores sintéticos que comprenden péptido ova y el inmunosupresor rapamicina.
La fig. 8 demuestra una reducción en el número de células T CD4+ en muestras de lavado de sujetos animales de modelo de asma tratados con nanoportadores sintéticos que comprenden péptido ova e inmunosupresor.
La fig. 9 demuestra una reducción en el porcentaje de células T CD4+ en división como resultado del tratamiento con nanoportadores sintéticos que comprenden péptido ova y el inmunosupresor rapamicina en sujetos animales modelo de asma.
Descripción detallada
Al igual que la descripción técnica de referencia anterior en el presente documento, también la presente descripción detallada va más allá de la mera descripción de la invención, y proporciona la base para una serie de otros desarrollos y adicionales, como se ilustra, entre otros, en los ejemplos de referencia. Se apreciará que ninguno de estos otros aspectos y adicionales se presentan o reivindican como la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye una mezcla de dos o más de dichas moléculas o una mezcla de diferentes pesos moleculares de una sola especie de polímero, la referencia a "un nanoportador sintético" incluye una mezcla de dos o más de dichos nanoportadores sintéticos o un la pluralidad de dichos nanoportadores sintéticos, la referencia a "una molécula de ADN" incluye una mezcla de dos o más de dichas moléculas de ADN o una pluralidad de dichas moléculas de ADN, la referencia a "un inmunosupresor" incluye una mezcla de dos o más de dichos materiales o una pluralidad de moléculas inmunosupresoras.
Como se usa en el presente documento, el término "comprender" o sus variaciones, tales como "comprende" o "que comprende", deben leerse para indicar la inclusión de cualquier número entero mencionado (p. ej., una cualidad, elemento, característica, propiedad, etapas del método/procedimiento o limitación) o grupo de números enteros (p. ej., cualidades, elementos, características, propiedades, etapas del método/procedimiento o limitaciones) pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término "que comprende" es inclusivo y no excluye números enteros o etapas del método/procedimiento adicionales, no mencionados.
En aspectos de cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento, "que comprende" se puede reemplazar por "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". La frase "que consiste esencialmente en" se usa en el presente documento para requerir el(los) número(s) entero(s) o etapas especificados, así como aquellos que no afectan materialmente al carácter o función de la invención reivindicada. Como se usa en el presente documento, el término "que consistente" se usa para indicar la presencia del número entero mencionado (p. ej., una cualidad, elemento, característica, propiedad, etapa del método/procedimiento o limitación) o grupo de números enteros (p. ej., cualidades, elemento, características, propiedades, etapas del método/procedimiento o limitaciones) solo.
A. Introducción
Como se ha mencionado previamente, los inmunosupresores convencionales actuales son de acción amplia y generalmente dan como resultado una regulación por disminución sistémica general del sistema inmunitario. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento permiten efectos inmunitarios más dirigidos, por ejemplo, permitiendo el suministro dirigido a células inmunitarias de interés. Por lo tanto, las composiciones y métodos pueden lograr la supresión inmunitaria de una manera más dirigida. Se ha descubierto que el suministro de inmunosupresores y epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada, más directamente en los sitios de acción en células de interés, en particular las APC, puede reducir la cantidad de células T auxiliares CD4+ disponibles y dar como resultado respuestas inmunitarias tolerogénicas beneficiosas específicas frente a los antígenos. En general, también se espera que dicho suministro reduzca los efectos y la toxicidad fuera del objetivo. Esta invención es útil, por ejemplo, para promover respuestas inmunitarias tolerogénicas en sujetos que tienen o corren el riesgo de tener una alergia, enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria. Esta invención también se puede usar para promover respuestas inmunitarias tolerogénicas en sujetos que tienen o están en riesgo de tener rechazo de órganos o tejidos o enfermedad de injerto contra huésped. Esta invención también es útil para promover respuestas inmunitarias tolerogénicas en sujetos que se han sometido o se someterán a un trasplante. Esta invención también es útil para promover respuestas inmunitarias tolerogénicas en sujetos que han recibido, están recibiendo o recibirán una proteína terapéutica contra la cual se generan o se espera que se generen respuestas inmunitarias humorales no deseadas. La presente invención puede tener aplicación en la prevención o supresión de respuestas inmunitarias humorales no deseadas que pueden neutralizar el efecto beneficioso de determinados tratamientos terapéuticos.
Los autores de la invención han descubierto de manera inesperada y sorprendente que los problemas y limitaciones indicados antes se pueden superar poniendo en práctica la invención descrita en el presente documento. En particular, los autores de la invención han descubierto inesperadamente que se pueden proporcionar composiciones de nanoportadores sintéticos, y métodos relacionados, que inducen una respuesta inmunitaria tolerogénica. Las composiciones descritas en el presente documento incluyen composiciones que comprenden (i) una primera población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a inmunosupresores, y (ii) una segunda población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera, o se espera que genere una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., en un sujeto). Se describen formas farmacéuticas de las composiciones del presente documento. En otro aspecto, cualquiera de las composiciones, incluyendo formas farmacéuticas, descritas en el presente documento, se administra a un sujeto. Dichas composiciones se pueden administrar a un sujeto, tal como un sujeto que lo necesita (p. ej., que necesita respuestas inmunitarias tolerogénicas específicas de antígeno). Las composiciones se pueden administrar en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica en el sujeto contra un antígeno (p. ej., una reducción en la generación de proliferación y/o actividad de células T CD4+ específicas de antígeno y/o producción de anticuerpos específicos de antígeno y/o proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno, etc.). En un caso, se administra una composición a un sujeto de acuerdo con un protocolo que se ha mostrado previamente que reduce la generación de una respuesta inmunitaria humoral no deseada frente al antígeno en uno o más sujetos. En otros casos más, cualquiera de los métodos puede comprender además una etapa de evaluar la presencia o ausencia o nivel de una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., la generación de proliferación y/o actividad de células T CD4+ específicas de antígeno y/o producción de anticuerpos específicos de antígeno y/o proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno, etc.) frente al antígeno en uno o más sujetos.
Las composiciones descritas también se pueden administrar como una o más dosis de mantenimiento a un sujeto. En dichos casos, las composiciones descritas se administran de modo que la generación de una respuesta inmunitaria humoral no deseada se reduce durante un cierto periodo de tiempo. Ejemplos de dichos periodos de tiempo se describen en otra parte del presente documento.
En otro aspecto más de la presente descripción, se describe un método para (i) producir una primera población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a inmunosupresores, y (ii) producir una segunda población de nanoportadores sintéticos que están acoplados a epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral no deseada (p. ej., en un sujeto). En un caso, el método comprende además producir una forma farmacéutica que comprende la primera y segunda poblaciones de nanoportadores sintéticos.
B. Definiciones
"Administrar" o "administración" significa proporcionar un material a un sujeto de una manera que sea farmacológicamente útil.
Los "alergenos" son cualquier sustancia que puede causar una respuesta inmunitaria no deseada (p. ej., una hipersensibilidad de tipo 1) (es decir, una respuesta o reacción alérgica) en un sujeto. Los alergenos incluyen, pero no se limitan a alergenos de plantas (p. ej., polen, alergeno de artemisa), alergenos de insectos, alergenos de picadura de insectos (p. ej., alergenos de picadura de abejas), alergenos de animales (p. ej., alergenos de mascotas, tales como caspa de animales o antígeno Fel d 1 de gato), alergenos de látex, alergenos de moho, alergenos de hongos, alergenos cosméticos, alergenos de fármacos, alergenos alimentarios, polvo, veneno de insectos, virus, bacterias, etc. Los alergenos alimentarios incluyen, pero no se limitan a alergenos de la leche, alergenos del huevo, alergenos de nueces (p. ej., alergenos de cacahuete o frutos con cáscara, etc. (p. ej., nueces, anacardos, etc.)), alergenos de pescado, alergenos de mariscos, alergenos de soja, alergenos de leguminosas, alergenos de semillas y alergenos del trigo. Los alergenos de picaduras de insectos incluyen alergenos que son o están asociados con picaduras de abejas, picaduras de avispas, picaduras de avispones, picaduras de avispas chaqueta amarilla, etc. Los alergenos de insectos también incluyen alergenos de ácaros del polvo doméstico (p. ej., antígeno Der P1) y alergenos de cucarachas. Los alergenos de fármacos incluyen alergenos que son o están asociados con antibióticos, AINE, anestésicos, etc. Los alergenos del polen incluyen alergenos de hierba, alergenos de árboles, alergenos de malezas, alergenos de flores, etc. Los sujetos que desarrollan o están en riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria no deseada frente a cualquier de los alergenos descritos en el presente documento se pueden tratar con cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Los sujetos que se pueden tratar con cualquiera de las composiciones y métodos descritos también incluyen los que tienen o están en riesgo de tener una alergia a cualquiera de los alergenos descritos.
Una "alergia" también mencionada en el presente documento como una "afección alérgica", es cualquier afección donde hay una respuesta inmunitaria no deseada (p. ej., una hipersensibilidad de tipo 1) (es decir, respuesta o reacción alérgica) a una sustancia. Dichas sustancias se denominan en el presente documento alergenos. Las alergias o afecciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a asma alérgica, fiebre del heno, urticaria, eczema, alergias a las plantas, alergias a las picaduras de abejas, alergias a mascotas, alergias al látex, alergias a mohos, alergias a cosméticos, alergias alimentarias, rinitis alérgica o coriza, reacciones alérgicas tópicas, anafilaxia, dermatitis atópica, reacciones de hipersensibilidad y otras afecciones alérgicas. La reacción alérgica puede ser el resultado de una reacción inmunitaria a cualquier alergeno. En algunos casos, la alergia es una alergia alimentaria. Las alergias alimentarias incluyen, entre otras, alergias a la leche, alergias al huevo, alergias a nueces, alergias al pescado, alergias a mariscos, alergias a la soja o alergias al trigo.
"Cantidad efectiva" en el contexto de una composición o forma farmacéutica para administrar a un sujeto se refiere a una cantidad de la composición o forma farmacéutica que produce una o más respuestas inmunitarias deseadas en el sujeto, por ejemplo, la generación de una respuesta inmunitaria tolerogénica (p. ej., una reducción en la proliferación, activación, inducción, reclutamiento de células T CD4+ específicas de antígeno o células B específicas de antígeno o una reducción en la producción de anticuerpos específicos de antígeno). Por lo tanto, en algunos casos, una cantidad efectiva es cualquier cantidad de una composición descrita en el presente documento que produce una o más de estas respuestas inmunitarias deseadas. Esta cantidad puede ser para fines in vitro o in vivo. Para fines in vivo, la cantidad puede ser una que un médico creería que podría tener un beneficio clínico para un sujeto que necesita una tolerancia específica de antígeno.
Las cantidades efectivas pueden implicar solo reducir el nivel de una respuesta inmunitaria no deseada, aunque en algunos casos, implica prevenir por completo una respuesta inmunitaria no deseada. Las cantidades efectivas también pueden implicar retrasar la aparición de una respuesta inmunitaria no deseada. Una cantidad que es efectiva también puede ser una cantidad de una composición descrita en el presente documento que produce un punto final terapéutico deseado o un resultado terapéutico deseado. Las cantidades efectivas, preferiblemente, dan como resultado una respuesta inmunitaria tolerogénica en un sujeto a un antígeno. El logro de cualquiera de los anteriores se puede controlar por métodos rutinarios.
En algunos casos de cualquiera de las composiciones y métodos descritos, la cantidad efectiva es aquella en la que la respuesta inmunitaria deseada persiste en el sujeto durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 5 años o más. En otros casos de cualquiera de las composiciones y métodos descritos, la cantidad efectiva es aquella que produce una respuesta inmunitaria deseada medible, por ejemplo, una disminución medible en una respuesta inmunitaria (p. ej., a un antígeno específico), durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 5 años o más.
Las cantidades efectivas dependerán, por supuesto, del sujeto particular que se esté tratando; la gravedad de una afección, enfermedad o trastorno; los parámetros individuales del paciente que incluyen edad, condición física, tamaño y peso; la duración del tratamiento; la naturaleza de la terapia concurrente (si hay alguna); la ruta específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional de la salud. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden abordar con solo experimentación rutinaria. En general, se prefiere usar una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con un bien criterio médico. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que un paciente puede insistir en una dosis más baja o una dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o prácticamente cualquier otra razón.
En general, las dosis de los inmunosupresores y/o antígenos en las composiciones de la invención pueden estar en el intervalo de aproximadamente 10 gg/kg a aproximadamente 100.000 gg/kg. En algunos casos, las dosis pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En otros casos, las dosis pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 75 mg/kg o de aproximadamente 75 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. Alternativamente, la dosis se puede administrar en función del número de nanoportadores sintéticos que proporcionan la cantidad deseada de inmunosupresores y/o antígenos. Por ejemplo, las dosis útiles incluyen más de 106, 107, 108, 109 o 1010 nanoportadores sintéticos por dosis. Otros ejemplos de dosis útiles incluyen de aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1010, de aproximadamente 1x107 a aproximadamente 1x109 o de aproximadamente 1x108 a aproximadamente 1 x109 nanoportadores sintéticos por dosis.
"Antígeno" significa un antígeno de células B o antígeno de células T. "Tipo(s) de antígeno(s)" significa moléculas que comparten las mismas, o sustancialmente las mismas, características antigénicas. En algunos casos, los antígenos pueden ser proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, glucolípidos, polinucleótidos, polisacáridos o están contenidos o son expresados en células. En algunos casos, tal como cuando los antígenos no están bien definidos o caracterizados, los antígenos pueden estar contenidos dentro de una preparación celular o tisular, restos celulares, exosomas celulares, medios condicionados, etc. Un antígeno se puede combinar con los nanoportadores sintéticos en la misma forma a lo que está expuesto un sujeto al que le produce una respuesta inmunitaria no deseada, pero también puede ser un fragmento o derivado del mismo. Sin embargo, cuando es un fragmento o derivado, una respuesta inmunitaria deseada frente a la forma encontrada por dicho sujeto es el resultado preferible con las composiciones y métodos descritos.
"Específico de antígeno" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria que es resultado de la presencia del antígeno, o parte del mismo, o que genera moléculas que reconocen o se unen específicamente al antígeno. Por ejemplo, cuando la respuesta inmunitaria es la producción de anticuerpos específicos de antígeno, se producen anticuerpos que se unen específicamente al antígeno. Como otro ejemplo, donde la respuesta inmunitaria es la proliferación y/o actividad de células B o células T CD4+ específicas de antígeno, la proliferación y/o actividad es resultado del reconocimiento del antígeno, o parte del mismo, solo o en complejo con moléculas de MHC, por células B, etc.
Los "antígenos asociados" con una enfermedad, trastorno o afección descritos en el presente documento son antígenos que pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada contra, como resultado de, o conjuntamente con la enfermedad, trastorno o afección; la causa de la enfermedad, trastorno o afección (o un síntoma o efecto de la misma); y/o puede generar una respuesta inmunitaria no deseada que es un síntoma, resultado o efecto de la enfermedad, trastorno o afección. Preferiblemente, en algunos casos, el uso de un antígeno asociado con una enfermedad, trastorno o afección, etc. en las composiciones y métodos descritos en el presente documento conducirá a una respuesta inmunitaria tolerogénica contra el antígeno y/o las células, por, sobre o en las cuales el antígeno se expresa. Los antígenos pueden estar en la misma forma que se expresa en un sujeto con la enfermedad, trastorno o afección, pero también pueden ser un fragmento o derivado de los mismos. Sin embargo, cuando es un fragmento o derivado, una respuesta inmunitaria deseada a la forma expresada en dicho sujeto es el resultado preferible con las composiciones y métodos descritos.
En un caso, el antígeno es un antígeno asociado con una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, rechazo de órganos o tejidos o enfermedad de injerto contra huésped. Dichos antígenos incluyen autoantígenos, tal como la proteína básica de mielina, colágeno (p. ej., colágeno tipo 11), cartílago humano gp 39, cromogranina A, gp130-RAPS, proteína proteolípida, fibrilarina, proteínas nucleares, proteínas nucleolares (p. ej., proteína nucleolar pequeña), receptor del factor estimulante de tiroides, histonas, glicoproteína gp 70, proteínas ribosomales, piruvato deshidrogenasa deshidrolipoamida acetiltransferasa, antígenos del folículo piloso, isoforma 5 de tropomiosina humana, proteínas mitocondriales, proteínas de células p pancreáticas, glicoproteína de la mielina de oligodendrocitos, insulina, descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), gluten y fragmentos o derivados de los mismos. Otros autoantígenos se describen en la tabla 1 a continuación.
Los antígenos también incluyen los asociados con el rechazo de órganos o tejidos. Los ejemplos de dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a antígenos de células alogénicas, p. ej., antígenos de un extracto de células alogénicas y antígenos de otras células, tales como antígenos de células endoteliales.
Los antígenos también incluyen los asociados con una alergia. Dichos antígenos incluyen los alergenos descritos en otra parte del presente documento.
Los antígenos también incluyen los asociados con un injerto trasplantable. Dichos antígenos están asociados con un injerto trasplantable, o una respuesta inmunitaria no deseada en un receptor de un injerto trasplantable, que se genera como resultado de la introducción del injerto trasplantable en el receptor, que se pueden presentar para el reconocimiento por las células del sistema inmunitario y que pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada. Los antígenos de trasplantes incluyen los asociados con el rechazo de órganos o tejidos o la enfermedad de injerto contra huésped. Los antígenos de trasplantes se pueden obtener o derivar de células de un material biológico o de información relacionada con un injerto trasplantable. Los antígenos de trasplantes generalmente incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, glucolípidos, polinucleótidos o están contenidos o se expresan en las células. La información relacionada con un injerto trasplantable es cualquier información sobre un injerto trasplantable que se puede usar para obtener o derivar antígenos de trasplante. Dicha información incluye información sobre antígenos que se esperaría que estuvieran presentes en o sobre las células de un injerto trasplantable tal como, por ejemplo, información de secuencia, tipos o clases de antígenos y/o sus restricciones de presentación en MHC de clase I, MHC de clase II o células B. Dicha información también puede incluir información sobre el tipo de injerto trasplantable (p. ej., autoinjerto, aloinjerto, xenoinjerto), la composición molecular y celular del injerto, la ubicación corporal de la cual se deriva el injerto o al que se va a trasplantar el injerto (p. ej., órganos enteros o parciales, piel, huesos, nervios, tendones, neuronas, vasos sanguíneos, grasa, córnea, etc.).
Los antígenos también incluyen antígenos asociados con una proteína terapéutica que se puede presentar para el reconocimiento por células del sistema inmunitario y que puede generar una respuesta inmunitaria no deseada contra la proteína terapéutica. Los antígenos proteicos terapéuticos generalmente incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, o están contenidos o son expresados en, por o sobre las células.
Los antígenos pueden ser antígenos completamente definidos o caracterizados. Sin embargo, en algunos casos, un antígeno no está completamente definido o caracterizado. Los antígenos, por lo tanto, también incluyen aquellos que están contenidos dentro de una preparación celular o tisular, restos celulares, exosomas celulares o medios condicionados y que se pueden suministrar en dicha forma en algunos casos.
"Evaluar una respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier medición o determinación del nivel, presencia o ausencia, reducción, aumento, etc. de una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. Dichas mediciones o determinaciones se pueden realizar en una o más muestras obtenidas de un sujeto. Dicha evaluación se puede realizar con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la técnica.
Un sujeto "en riesgo" es aquel que un profesional sanitario cree que tiene una posibilidad de tener una enfermedad, trastorno o afección como se describe en el presente documento o es uno que un profesional sanitario cree que tiene una posibilidad de experimentar una respuesta inmunitaria no deseada como se describe en el presente documento.
Una "enfermedad autoinmunitaria" es cualquier enfermedad donde el sistema inmunitario monta una respuesta inmunitaria no deseada contra uno mismo (p. ej., uno o más autoantígenos). En algunos casos, una enfermedad autoinmunitaria comprende una destrucción aberrante de células del cuerpo como parte de la respuesta inmunitaria autodirigida. En algunos casos, la autodestrucción se pone de manifiesto en el mal funcionamiento de un órgano, por ejemplo, el colon o el páncreas. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias se describen en otra parte del presente documento. Los expertos en la técnica conocerán enfermedades autoinmunitarias adicionales y la invención no está limitada a este respecto.
"Promedio", como se usa en el presente documento, se refiere a la media aritmética a menos que se indique lo contrario.
"Antígeno de células B" significa cualquier antígeno que produce una respuesta inmunitaria en una célula B (p. ej., un antígeno que es reconocido específicamente por una célula B o un receptor sobre la misma). En algunos casos, un antígeno que es un antígeno de células T también es un antígeno de células B. En otros casos, el antígeno de células T no es también un antígeno de células B. Los antígenos de células B incluyen, pero no se limitan a proteínas, péptidos, moléculas pequeñas y carbohidratos. En algunos casos, el antígeno de células B comprende un antígeno no proteico (es decir, un antígeno no proteico o peptídico). En algunos casos, el antígeno de células B comprende un autoantígeno. En otros casos, el antígeno de células B se obtiene o deriva de un alergeno, autoantígeno, proteína terapéutica o injerto trasplantable.
"De forma concomitante" significa administrar dos o más sustancias a un sujeto de una manera correlativa en el tiempo, preferiblemente lo suficientemente correlativa en el tiempo para proporcionar una modulación en una respuesta inmunitaria. En casos, la administración concomitante puede ocurrir por la administración de dos o más sustancias en la misma forma farmacéutica. En otros casos, la administración concomitante puede abarcar la administración de dos o más sustancias en diferentes formas farmacéuticas, pero dentro de un período de tiempo especificado, preferiblemente en el espacio de 1 mes, más preferiblemente en el espacio de 1 semana, aún más preferiblemente en el espacio de 1 día, e incluso más preferiblemente en el espacio de 1 hora.
"Acoplamiento" o "acoplado" o "acoplamientos" (y similares) significa asociar químicamente una entidad (p. ej., un resto) con otra. En algunos casos, el acoplamiento es covalente, lo que significa que el acoplamiento se produce en el contexto de la presencia de un enlace covalente entre las dos entidades. En casos no covalentes, el acoplamiento no covalente es mediado por interacciones no covalentes que incluyen, pero no se limitan a interacciones de carga, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones hospedante-huésped, interacciones hidrófobas, interacciones de apilamiento TT, interacciones de enlace de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de las mismas. La encapsulación puede ser una forma de acoplamiento.
"Derivado" significa preparado a partir de un material o información relacionada con un material, pero no se "obtiene" del material. Dichos materiales pueden ser formas sustancialmente modificadas o procesadas de materiales tomados directamente de un material biológico. Dichos materiales también incluyen materiales producidos a partir de información relacionada con un material biológico.
"Forma farmacéutica" significa un material farmacológico y/o inmunológicamente activo en un medio, portador, vehículo o dispositivo adecuado para la administración a un sujeto.
"Encapsular" significa encerrar al menos una parte de una sustancia dentro de un nanoportador sintético. En algunos casos, una sustancia está encerrada completamente dentro de un nanoportador sintético. En otros casos, la mayoría o la totalidad de una sustancia que está encapsulada no está expuesta al entorno local externo al nanoportador sintético. En otros casos, no más de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% (peso/peso) está expuesto al entorno local. La encapsulación es distinta de la absorción, que coloca la mayor parte o la totalidad de una sustancia sobre una superficie de un nanoportador sintético, y deja la sustancia expuesta al entorno local externo del nanoportador sintético.
El "epítopo", también conocido como determinante antigénico, es la parte de un antígeno que es reconocida por el sistema inmunitario, específicamente por, por ejemplo, anticuerpos, células B o células T. Como se usa en el presente documento, los "epítopos restringidos por MHC de clase I" son epítopos que son presentados a las células inmunitarias por moléculas de MHC de clase I que se encuentran en células nucleadas. Los "epítopos restringidos por MHC de clase II" son epítopos que son presentados a células inmunitarias por las moléculas de MHC de clase II que se encuentran en células presentadoras de antígeno (APC), por ejemplo, en células inmunitarias presentadoras de antígeno profesionales, tales como macrófagos, células B y células dendríticas, o en células no hematopoyéticas, tales como hepatocitos. Los "epítopos de células B" son estructuras moleculares que son reconocidas por anticuerpos o células B. En algunos casos, el propio epítopo es un antígeno.
Los expertos en la técnica conocen una serie de epítopos, y los epítopos de ejemplo adecuados según algunos aspectos de esta invención incluyen, pero no se limitan a los citados en la base de datos de epítopos inmunitarios (www.immuneepitope.org, Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Sette A, Peters B. The immune epitope database 2.0. Nucleic Acids Res. enero 2010;38(Database issue):D854-62; cuyos contenidos completos, así como todas las entradas de la base de datos de IEDB versión 2.4, agosto 2011, y en particular todos los epítopos descritos en la misma, son relevantes). Los epítopos también se pueden identificar con algoritmos disponibles al público, por ejemplo, los algoritmos descritos en Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. 2010. Peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 2010, 11:568; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothe B, Sette A, Peters B. 2008. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4):e1000048; Nielsen M, Lund O. 2009. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bioinformatics. 10:296; Nielsen M, Lundegaard C, Lund O. 2007. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8:238; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Immunogenetics. 57:304-314; Sturniolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci O, Sahin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat Biotechnol. 17(6):555-561; Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. 2003. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Sci 12:1007-1017; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics 57:304-314; Peters B, Sette A. 2005. Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method. BMC Bioinformatics 6:132; Chou PY, Fasman GD. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148; Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol55:836-839; Karplus PA, Schulz GE. 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften 72:212-213; Kolaskar AS, Tongaonkar PC. 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett 276:172-174; Parker JM, Guo D, Hodges RS. 1986. New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry 25:5425-5432; Larsen JE, Lund O, Nielsen M. 2006. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res 2:2; Ponomarenko JV, Bourne PE. 2007. Antibody-protein interactions: benchmark datasets and prediction tools evaluation. BMC Struct Biol 7:64; Haste Andersen P, Nielsen M, Lund O.
2006. Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15:2558-2567; Ponomarenko JV, Bui H, Li W, Fusseder N, Bourne PE, Sette A, Peters B. 2008. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics 9:514; Nielsen M, Lundegaard C, Blicher T, Peters B, Sette A, Justesen S, Buus S, y Lund O. 2008. PLoS Comput Biol. 4(7)e1000107. Quantitative predictions of peptide binding to any HLA-DR molecule of known sequence: NetMHCIIpan; cuyos contenidos enteros de cada uno de ellos son relevantes para la descripción de métodos y algoritmos para la identificación de epítopos.
Otros ejemplos de epítopos que se pueden acoplar a nanoportadores sintéticos descritos en el presente documento incluyen cualquiera de los epítopos restringidos por MHC de clase I, restringidos por MHC de clase II y de células B como se describe en las SEQ ID NO: 1 -943. Sin desear estar limitados por ninguna teoría en particular, los epítopos restringidos por MHC de clase I incluyen los expuestos en las SEQ ID NO:1-186, los epítopos restringidos por MHC de clase II incluyen los expuestos en las SEQ ID NO:187-537 y los epítopos de células B incluyen los expuestos en las SEQ ID NO: 538-943. Estos epítopos incluyen autoantígenos restringidos por MHC de clase I, epítopos de alergenos restringido por MHC de clase II y epítopos de células B de autoantígenos y alergenos.
"Generar" significa hacer que se produzca una acción, tal como una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta inmunitaria tolerogénica), ya sea directamente uno mismo o indirectamente, tal como, pero no limitado a una tercera parte no relacionada que emprende una acción fundada en las palabras o hechos de uno mismo.
"Respuesta inmunitaria humoral" significa cualquier respuesta inmunitaria que da como resultado la producción o estimulación de células B y/o la producción de anticuerpos. Los expertos en la técnica conocen métodos para evaluar si se induce una respuesta humoral e incluyen evaluar la respuesta de anticuerpos midiendo los títulos de anticuerpos y/o evaluando el número y/o la actividad de las células T CD4+ y/o B. Cualquier respuesta inmunitaria humoral contra un antígeno como se describe en el presente documento, tal como donde la tolerancia contra el antígeno sería beneficiosa para un sujeto, puede ser indeseable. Un antígeno asociado con dichas respuestas inmunitarias humorales significa un antígeno que cuando se administra a un sujeto puede dar como resultado una o más de las respuestas inmunitarias humorales no deseadas (p. ej., da como resultado la producción de anticuerpos no deseada contra el antígeno o la proliferación o actividad de células T CD4+ o células B no deseada específica para el antígeno). La producción de anticuerpos se denomina en el presente documento una "respuesta de anticuerpos". "Título de anticuerpos" significa un nivel medible de anticuerpos. En algunos casos, los anticuerpos son anticuerpos de un cierto isotipo, tal como IgG o una subclase de los mismos. Los métodos para medir los títulos de anticuerpos son conocidos en la técnica y se describen en otra parte en el presente documento. Los métodos para medir la proliferación o actividad de células T CD4+ o B también se conocen en la técnica o se describen en otra parte en el presente documento.
"Identificar" es cualquier acción o conjunto de acciones que permite a un médico reconocer a un sujeto como uno que puede beneficiarse de los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Preferiblemente, el sujeto identificado es uno que necesita una respuesta inmunitaria tolerogénica como se describe en el presente documento. La acción o conjunto de acciones puede ser directamente uno mismo o indirectamente, tal como, pero no limitado a una tercera parte no relacionada que emprende una acción fundada en las palabras o hechos de uno mismo.
"Inmunosupresor" significa un compuesto que hace que una APC tenga un efecto inmunosupresor (p. ej., efecto tolerogénico). Un efecto inmunosupresor generalmente se refiere a la producción o expresión de citoquinas u otros factores por las APC que reducen, inhiben o previenen una respuesta inmunitaria no deseada o que promueven una respuesta inmunitaria deseada. Cuando las APC producen un efecto inmunosupresor en las células inmunitarias que reconocen un antígeno presentado por las APC, se dice que el efecto inmunosupresor es específico del antígeno presentado. Dicho efecto también se denomina en el presente documento un efecto tolerogénico. Sin estar sujetos a ninguna teoría en particular, se cree que el efecto inmunosupresor o tolerogénico es el resultado del inmunosupresor que se ha suministrado a la APC, preferiblemente en presencia de un antígeno (p. ej., un antígeno administrado o uno que ya está presente in vivo). Por consiguiente, el inmunosupresor incluye compuestos que proporcionan una respuesta inmunitaria tolerogénica frente a un antígeno que se puede proporcionar o no en la misma composición o en una composición diferente. En un caso, el inmunosupresor es uno que hace que una APC promueva un fenotipo regulador en una o más células efectoras inmunitarias. Por ejemplo, el fenotipo regulador se puede caracterizar por la inhibición de la producción, inducción, estimulación o reclutamiento de células T CD4+ o células B específicas de antígeno, la inhibición de la producción de anticuerpos específicos de antígeno, la producción, inducción, estimulación o reclutamiento de células Treg (p. ej., células Treg CD4+CD25highFoxP3+), etc. Esto puede ser el resultado de la conversión de células T CD4+ o células B a un fenotipo regulador. Esto también puede ser el resultado de la inducción de FoxP3 en otras células inmunitarias, tal como células T CD8+, macrófagos y células iNKT. En un caso, el inmunosupresor es uno que afecta a la respuesta de la APC después de que procesa un antígeno. En otro caso, el inmunosupresor no es uno que interfiera con el procesamiento del antígeno. En otro caso, el inmunosupresor no es una molécula de señalización apoptótica. En otro caso, el inmunosupresor no es un fosfolípido.
Los inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a estatinas; inhibidores de mTOR, tales como rapamicina o un análogo de rapamicina; agentes de señalización de TGF-p; agonistas del receptor de TGF-p; inhibidores de histona desacetilasa, tales como tricostatina A; corticosteroides; inhibidores de la función mitocondrial, tales como la rotenona; inhibidores de P38; inhibidores de NF-Kp, tales como 6Bio, dexametasona, TCPA-1, IKK VII; agonistas del receptor de adenosina; agonistas de prostaglandina E2 (PGE2), tales como misoprostol; inhibidores de fosfodiesterasa, tales como inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4), tales como rolipram; inhibidores de proteasoma; inhibidores de quinasa; agonistas del receptor acoplado a proteína G; antagonistas del receptor acoplado a proteína G; glucocorticoides; retinoides; inhibidores de citoquinas; inhibidores del receptor de citoquinas; activadores del receptor de citoquinas; antagonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas; agonistas de receptores activados por proliferador de peroxisomas; inhibidores de histona desacetilasa; inhibidores de calcineurina; inhibidores de fosfatasa; Inhibidores de PI3KB, tales como TGX-221; inhibidores de autofagia, tales como 3-metiladenina; inhibidores del receptor de hidrocarburos de arilo; inhibidor de proteasoma I (PSI); y ATP oxidados, tales como los bloqueadores del receptor P2X. Los inmunosupresores también incluyen IDO, vitamina D3, ciclosporinas, tales como ciclosporina A, inhibidores del receptor de hidrocarburos de arilo, resveratrol, azatiopurina (Aza), 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), FK506, sanglifehrina A, salmeterol, micofenolato de mofetilo (MMF), aspirina y otros inhibidores de COX, ácido niflúmico, estriol y triptolida.
Los inmunosupresores pueden ser un compuesto que proporciona directamente el efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico) sobre las APC o pueden ser un compuesto que proporciona el efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico) indirectamente (es decir, después de ser procesado de alguna manera después de la administración). Los inmunosupresores, por lo tanto, incluyen formas de profármacos de cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento.
Los inmunosupresores también incluyen ácidos nucleicos que codifican los péptidos, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento que dan como resultado una respuesta inmunitaria inmunosupresora (p. ej., tolerogénica). Por lo tanto, los inmunosupresores pueden incluir un ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína que da como resultado una respuesta inmunitaria inmunosupresora (p. ej., tolerogénica), y es el ácido nucleico que está acoplado al nanoportador sintético.
El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, tal como ARNm. Se contemplan composiciones que comprenden un complemento, tal como un complemento de longitud completa, o uno degenerado (debido a la degeneración del código genético) de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. En algunos casos, el ácido nucleico es un vector de expresión que se puede transcribir cuando se transfecta en una línea celular. En algunos casos, el vector de expresión puede comprender un plásmido, retrovirus o un adenovirus entre otros. Los ácidos nucleicos se pueden aislar o sintetizar usando enfoques de biología molecular convencionales, por ejemplo, usando una reacción en cadena de la polimerasa para producir un fragmento de ácido nucleico, que luego se purifica y se clona en un vector de expresión. Se pueden encontrar técnicas adicionales útiles en la práctica de esta invención en Current Protocols in Molecular Biology 2007 de John Wiley and Sons, Inc.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Cold Spring Harbor.
Los inmunosupresores descritos en el presente documento pueden estar acoplados a nanoportadores sintéticos. El inmunosupresor puede ser un elemento que es adicional al material que compone la estructura del nanoportador sintético. Por ejemplo, en un caso, donde el nanoportador sintético está compuesto por uno o más polímeros, el inmunosupresor es un compuesto está adicionalmente y se acopla a uno o más polímeros. Como otro ejemplo, en un caso, donde el nanoportador sintético está compuesto por uno o más lípidos, el inmunosupresor de nuevo está adicionalmente y se acopla al uno o más lípidos. En algunos casos, como cuando el material del nanoportador sintético también produce un efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico), el inmunosupresor es un elemento presente adicionalmente al material del nanoportador sintético que da como resultado un efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico).
Otros inmunosupresores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a fármacos de molécula pequeña, productos naturales, anticuerpos (p. ej., anticuerpos contra CD20, CD3, CD4), fármacos basados en productos biológicos, fármacos basados en carbohidratos, nanopartículas, liposomas, ARNi, ácidos nucleicos antiparalelos, aptámeros, metotrexato, AINE; fingolimod; natalizumab; alemtuzumab; anti-CD3; tacrolimus (FK506), etc. Los expertos en la técnica conocen otros inmunosupresores.
"Enfermedad inflamatoria" significa cualquier enfermedad, trastorno o afección en la que se produce una inflamación no deseada.
La "carga" del inmunosupresor o antígeno es la cantidad de inmunosupresor o antígeno acoplado a un nanoportador sintético basado en el peso total de los materiales en un nanoportador sintético completo (peso/peso). En general, la carga se calcula como un promedio de una población de nanoportadores sintéticos. En un caso, la carga del inmunosupresor en promedio de la primera población de nanoportadores sintéticos está entre 0.0001% y 50%. En otro caso, la carga del antígeno en promedio de la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos está entre 0,0001% y 50%. En otro caso más, la carga del inmunosupresor y/o antígeno está entre 0,01% y 20%. En otro caso, la carga del inmunosupresor y/o antígeno está entre 0,1% y 10%. En otro caso más, la carga del inmunosupresor y/o antígeno está entre 1% y 10%. En otro caso más, la carga del inmunosupresor y/o el antígeno es al menos 0,1%, al menos 0,2%, al menos 0,3%, al menos 0,4%, al menos 0,5%, al menos 0,6%, al menos 0,7%, al menos 0,8%, al menos 0,9%, al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15%, al menos 16%, al menos 17%, al menos 18%, al menos 19% o al menos 20% en promedio de una población de nanoportadores sintéticos. En otro caso más, la carga del inmunosupresor y/o el antígeno es 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% en promedio de una población de nanoportadores sintéticos. En algunos casos de los casos anteriores, la carga del inmunosupresor y/o el antígeno no es más de 25% en promedio de una población de nanoportadores sintéticos. En casos, la carga se calcula como se describe en los ejemplos.
La carga se puede calcular de la siguiente manera: se recogen y centrifugan aproximadamente 3 mg de nanoportadores sintéticos para separar el líquido sobrenadante del sedimento de nanoportadores sintéticos. Se añade acetonitrilo al sedimento, y la muestra se trata por ultrasonidos y se centrifuga para eliminar cualquier material insoluble. El líquido sobrenadante y el sedimento se inyectan en RP-HPLC y se lee la absorbancia a 278 nm. Los pg encontrados en el sedimento se usan para calcular el % atrapado (carga), los pg en el líquido sobrenadante y el sedimento se usa para calcular el total de pg recuperados.
La "dosis de mantenimiento" se refiere a una dosis que se administra a un sujeto, después de que una dosis inicial ha dado como resultado una respuesta inmunosupresora (p. ej., tolerogénica) en un sujeto, para mantener una respuesta inmunosupresora (p. ej., tolerogénica) deseada. Una dosis de mantenimiento, por ejemplo, puede ser una que mantenga el efecto tolerogénico logrado después de la dosis inicial, evite una respuesta inmunitaria no deseada en el sujeto o prevenga que el sujeto se convierta en un sujeto en riesgo de experimentar una respuesta inmunitaria no deseada, incluyendo un nivel no deseado de una respuesta inmunitaria. En algunos casos, la dosis de mantenimiento es una que es suficiente para mantener un nivel adecuado de respuesta inmunitaria deseada.
"Dimensión máxima de un nanoportador sintético" significa la dimensión más grande de un nanoportador medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. "Dimensión mínima de un nanoportador sintético" significa la dimensión más pequeña de un nanoportador sintético medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. Por ejemplo, para un nanoportador sintético esferoidal, la dimensión máxima y mínima de un nanoportador sintético serían sustancialmente idénticas, y serían el tamaño de su diámetro. De manera similar, para un nanoportador sintético cuboidal, la dimensión mínima de un nanoportador sintético sería la menor de su altura, anchura o longitud, mientras que la dimensión máxima de un nanoportador sintético sería la mayor de su altura, anchura o longitud. En algunos casos, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos el 90% de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es igual o mayor a 100 nm. En otro caso, una dimensión máxima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basada en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es igual a o menor de 5 pm. Preferiblemente, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es mayor de 110 nm, más preferiblemente mayor que 120 nm, más preferiblemente mayor que 130 nm, y más preferiblemente aún mayor que 150 nm. Las relaciones de aspecto de las dimensiones máximas y mínimas de los nanoportadores sintéticos pueden variar. Por ejemplo, las relaciones de aspecto de las dimensiones máximas a mínimas de los nanoportadores sintéticos pueden variar de 1:1 a 1.000.000:1, preferiblemente de 1:1 a 100.000:1, más preferiblemente de 1:1 a 10.000:1, más preferiblemente de 1:1 a 1000:1, aún más preferiblemente de 1:1 a 100:1, y aún más preferiblemente de 1:1 a 10:1. Preferiblemente, una dimensión máxima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basada en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra es igual a o menor que 3 pm, más preferiblemente igual a o menor que 2 pm, más preferiblemente igual a o menor que 1 pm, más preferiblemente igual a o menor que 800 nm, más preferiblemente igual a o menor que 600 nm, y más preferiblemente aún igual a o menor que 500 nm. En casos preferidos, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basada en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es igual a o mayor que 100 nm, más preferiblemente igual a o mayor que 120 nm, más preferiblemente igual a o mayor que 130 nm, más preferiblemente igual a o mayor que 140 nm y más preferiblemente aún igual a o mayor que 150 nm. La medición de las dimensiones del nanoportador sintético (p. ej., diámetro) se obtiene suspendiendo los nanoportadores sintéticos en un medio líquido (normalmente acuoso) y usando dispersión dinámica de luz (DLS) (p. ej., usando un instrumento Brookhaven ZetaPALS). Por ejemplo, una suspensión de nanoportadores sintéticos se puede diluir a partir de un tampón acuoso en agua purificada para lograr una concentración final de suspensión de nanoportadores sintéticos de aproximadamente 0,01 a 0,1 mg/ml. La suspensión diluida se puede preparar directamente dentro o transferir a una cubeta adecuada para el análisis de DLS. Después, la cubeta se puede colocar en el DLS, dejar que se equilibre a la temperatura controlada, y después hacer el barrido durante el tiempo suficiente para adquirir una distribución estable y reproducible basada en las entradas adecuadas para la viscosidad del medio y los índices de refracción de la muestra. Después se da el diámetro efectivo, o la media de la distribución. "Dimensión" o "tamaño" o "diámetro" de nanoportadores sintéticos significa la media de una distribución de tamaño de partículas obtenida usando dispersión dinámica de luz.
"MHC" se refiere al complejo principal de histocompatibilidad, una gran región genómica o familia de genes que se encuentra en la mayoría de los vertebrados, que codifica moléculas de MHC que presentan fragmentos o epítopos de proteínas procesadas en la superficie celular. La presentación de MHC:péptido en superficies celulares permite la vigilancia de las células inmunitarias, normalmente una célula T. Hay dos clases generales de moléculas de MHC: clase I y clase II. En general, las moléculas de MHC de clase I se encuentran en células nucleadas y presentan péptidos a las células T citotóxicas. Las moléculas de MHC de clase II se encuentran en ciertas células inmunitarias, principalmente macrófagos, células B y células dendríticas, conocidas colectivamente como APC profesionales. Los genes más conocidos en la región MHC son el subconjunto que codifica las proteínas presentadoras de antígeno en la superficie celular. En seres humanos, estos genes se denominan genes de antígeno leucocitario humano (HLA).
"Polímero no terminado en metoxi" significa un polímero que tiene al menos un extremo que termina con un resto distinto de metoxi. En algunos casos, el polímero tiene al menos dos extremos que terminan con un resto diferente de metoxi. En otros casos, el polímero no tiene extremos que terminen con metoxi. "Polímero plurónico no terminado en metoxi" significa un polímero distinto de un polímero plurónico lineal con metoxi en ambos extremos. Las nanopartículas poliméricas como se describe en el presente documento pueden comprender polímeros no terminados en metoxi o polímeros plurónicos no terminados en metoxi.
"Obtenido" significa tomado directamente de un material y usado sustancialmente sin modificación y/o procesamiento.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un material farmacológicamente inactivo usado junto con los nanoportadores sintéticos mencionados para formular las composiciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una variedad de materiales conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a sacáridos (tales como glucosa y lactosa), conservantes tales como agentes antimicrobianos, adyuvantes de reconstitución, colorantes, solución salina (tal como solución salina tamponada con fosfato) y tampones.
"Protocolo" se refiere a cualquier régimen de dosificación de una o más sustancias a un sujeto. Un régimen de dosificación puede incluir la cantidad, frecuencia y/o modo de administración. En algunos casos, dicho protocolo se puede usar para administrar una o más composiciones de la invención a uno o más sujetos de ensayo. Las respuestas inmunitarias en estos sujetos de ensayo se pueden evaluar para determinar si el protocolo era efectivo o no para reducir una respuesta inmunitaria no deseada o generar una respuesta inmunitaria deseada (p. ej., la promoción de un efecto tolerogénico). También se puede evaluar cualquier otro efecto terapéutico y/o profiláctico en lugar de o además de las respuestas inmunitarias mencionadas anteriormente. Se puede determinar si un protocolo tenía o no un efecto deseado usando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento o conocidos de otra manera en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener una población de células de un sujeto al que se le ha administrado una composición descrita en el presente documento de acuerdo con un protocolo específico con el fin de determinar si las células inmunitarias, citoquinas, anticuerpos, etc. específicos se redujeron, generaron, activaron, etc. Los métodos útiles para detectar la presencia y/o el número de células inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, métodos de citometría de flujo (p. ej., FACS) y métodos de inmunohistoquímica. Los anticuerpos y otros agentes de unión para la tinción específica de marcadores de células inmunitarias están disponibles en el mercado. Dichos kits incluyen típicamente reactivos de tinción para múltiples antígenos que permiten la detección, separación y/o cuantificación basada en FACS de una población celular deseada de una población heterogénea de células.
"Proporcionar un sujeto" es cualquier acción o conjunto de acciones que hace que un médico se ponga en contacto con un sujeto y administre una composición descrita en el presente documento o lleve a cabo un método descrito en el presente documento. Preferiblemente, el sujeto necesita una respuesta inmunitaria tolerogénica como se describe en el presente documento. La acción o conjunto de acciones puede ser directamente uno mismo o indirectamente, tal como, pero no limitado a una tercera parte no relacionada que emprende una acción fundada en las palabras o hechos de uno mismo.
"Sujeto" significa animales, incluyendo mamíferos de sangre caliente, tales como seres humanos y primates; aviares animales domésticos o de granja tales como gatos, perros, ovejas, cabras, vacas, caballos y cerdos; animales de laboratorio tales como ratones, ratas y cobayas; peces; reptiles animales de zoológico y salvajes.
"Sustancialmente sin epítopos de células B" se refiere a la ausencia de epítopos de células B en una cantidad (por sí misma, dentro del contexto del antígeno, conjuntamente con un portador o conjuntamente con una composición) que estimula la activación sustancial de una respuesta de células B. Una composición sustancialmente sin epítopos de células B puede no contener una cantidad medible de epítopos de células B de un antígeno. En otros casos, dicha composición puede comprender una cantidad medible de epítopos de células B de un antígeno, pero dicha cantidad no es efectiva para generar una respuesta inmunitaria de células B medible (por sí misma, dentro del contexto del antígeno, conjuntamente con un portador o conjuntamente con una composición), tal como la producción de anticuerpos específicos de antígeno o la proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno, o no es efectiva para generar una respuesta inmunitaria de células B medible significativa (por sí misma, dentro del contexto del antígeno, conjuntamente con un portador o conjuntamente con una composición). En algunos casos, una respuesta inmunitaria de células B medible significativa es aquella que produce o se esperaría que produjera un resultado clínico adverso en un sujeto. En otros casos, una respuesta inmunitaria de células B medible significativa es una que es mayor que el nivel del mismo tipo de respuesta inmunitaria (p. ej., producción de anticuerpos específicos de antígeno o proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno) producida por un antígeno de control (p. ej., uno que se sabe que no comprende epítopos de células B del antígeno o estimula las respuestas inmunitarias de células B). En algunos casos, una respuesta inmunitaria de células B medible significativa, tal como una medición de títulos de anticuerpos (p. ej., por ELISA) es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o mayor que el mismo tipo de respuesta producida por un control (p. ej., antígeno de control). En otros casos, una composición sustancialmente sin epítopos de células B es aquella que produce pocos o ningún título de anticuerpos específicos de antígeno (por sí misma, en el contexto del antígeno, conjuntamente con un vehículo o conjuntamente con una composición). Dichas composiciones incluyen aquellas que producen un título de anticuerpos (como un valor de CE50) de menos de 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20 o 10. En otros casos, una respuesta inmunitaria de células B significativa medible, es una medida del número o proliferación de células B que es 10%, 25%, 50%, 100%, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o más mayor que el mismo tipo de respuesta producida por un control. Los expertos en la técnica conocen otros métodos para medir las respuestas de las células B.
Para asegurar que una composición no comprenda sustancialmente epítopos de células B, los antígenos se pueden seleccionar de modo que no comprendan epítopos de células B para el acoplamiento a los nanoportadores sintéticos como se describe en el presente documento. En otros casos, para garantizar que una composición no comprende sustancialmente epítopos de células B de un antígeno, los nanoportadores sintéticos acoplados al antígeno se producen y ensayan las respuestas inmunitarias de células B (p. ej., producción de anticuerpos específicos de antígeno, proliferación de células B y/o actividad). Las composiciones que presentan las propiedades deseadas pueden entonces ser seleccionadas.
"Nanoportador(es) sintético(s)" significa un objeto discreto que no se encuentra en la naturaleza, y que posee al menos una dimensión que es menor que o igual a 5 micrómetros de tamaño. Las nanopartículas de albúmina generalmente se incluyen como nanoportadores sintéticos, sin embargo, en ciertos casos, los nanoportadores sintéticos no comprenden nanopartículas de albúmina. Los nanoportadores sintéticos pueden no comprender quitosano. Los nanoportadores sintéticos pueden no ser nanopartículas basadas en lípidos. Los nanoportadores sintéticos pueden no comprender un fosfolípido.
Un nanoportador sintético puede ser, pero no se limita a uno o una pluralidad de nanopartículas basadas en lípidos (también denominadas en el presente documento nanopartículas lipídicas, es decir, nanopartículas donde la mayoría del material que compone su estructura son lípidos), nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsiones basadas en tensioactivos, dendrímeros, bolas de bucky, nanocables, partículas similares a virus (es decir, partículas que están compuestas principalmente de proteínas estructurales virales pero que no son infecciosas o tienen baja infectividad), partículas basadas en péptidos o proteínas (también denominadas en la presente memoria partículas de proteína, es decir partículas donde la mayor parte del material que compone su estructura son péptidos o proteínas (tales como nanopartículas de albúmina) y/o nanopartículas que se desarrollan usando una combinación de nanomateriales tales como nanopartículas de lípido-polímero. Los nanoportadores sintéticos pueden tener una variedad de formas diferentes, que incluyen, pero no se limitan a esferoidales, cuboidales, piramidales, oblongas, cilíndricas y toroidales. Los nanoportadores sintéticos según la invención comprenden una o más superficies. Los nanoportadores sintéticos de ejemplo que se pueden adaptar para usar en la práctica de la presente invención comprenden: (1) las nanopartículas biodegradables descritas en la patente de EE.UU. 5.543.158 de Gref et al., (2) las nanopartículas poliméricas de la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20060002852 de Saltzman et al., (3) las nanopartículas litográficamente construidas de la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20090028910 de DeSimone et al., (4) la descripción del documento WO 2009/051837 de von Andrian et al., (5) las nanopartículas descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 2008/0145441 de Penades et al., (6) las nanopartículas de proteínas descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20090226525 de los Ríos et al., (7) las partículas similares a virus descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20060222652 de Sebbel et al., (8) las partículas similares a virus acopladas a ácido nucleico descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20060251677 de Bachmann et al., (9) las partículas similares a virus descritas en WO2010047839A1 o WO2009106999A2, (10) las nanopartículas nanoprecipitadas descritas en P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine 5 (6):843-853 (2010), o (11) células apoptóticas, cuerpos apoptóticos o los miméticos sintéticos o semisintéticos descritos en la publicación de EE.UU. 2002/0086049. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden tener una relación de aspecto mayor que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 o mayor que 1:10.
Los nanoportadores sintéticos que tienen una dimensión mínima igual a o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual a o menor que 100 nm, no comprenden una superficie con grupos hidroxilo que activan el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no son grupos hidroxilo que activan el complemento. Los nanoportadores sintéticos pueden tener una dimensión mínima igual a o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual a o menor que 100 nm, pueden no comprender una superficie que active sustancialmente el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan sustancialmente el complemento. En un caso más preferido, los nanoportadores sintéticos que tienen una dimensión mínima igual a o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual a o menor que 100 nm, no comprenden una superficie que activa el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan el complemento. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos excluyen partículas similares a virus. En otros casos, los nanoportadores sintéticos pueden tener una relación de aspecto mayor que 1:1, 1:1.2, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 o mayor que 1:10.
"Antígeno de células T" significa un antígeno de células T CD4+ o antígeno de células CD8+. "Antígeno de células T CD4+" se refiere a cualquier antígeno que es reconocido por y desencadena una respuesta inmunitaria en una célula T CD4+, p. ej., un antígeno que es reconocido específicamente por un receptor de células T en una célula T CD4+ a través de presentación del antígeno o una parte del mismo unida a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase II. "Antígeno de células T CD8+" significa cualquier antígeno que es reconocido por y desencadena una respuesta inmunitaria en una célula T CD8+, p. ej., un antígeno que es reconocido específicamente por un receptor de células T en una célula T CD8+ a través de la presentación del antígeno o parte del mismo unida a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal de clase I (MHC). En algunos casos, un antígeno que es un antígeno de células T también es un antígeno de células B. En otros casos, El antígeno de células T no es también un antígeno de células B. Los antígenos de células T generalmente son proteínas o péptidos.
Una "proteína terapéutica" se refiere a cualquier proteína o terapia basada en proteínas que se puede administrar a un sujeto y tener un efecto terapéutico. Dichas terapias incluyen terapias de reemplazo de proteínas y de suplementación de proteínas. Dichas terapias también incluyen la administración de proteínas exógenas o extrañas, terapias de anticuerpos y terapias celulares o basadas en células. Las proteínas terapéuticas incluyen enzimas, cofactores enzimáticos, hormonas, factores de coagulación sanguínea, citoquinas, factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. Ejemplos de otras proteínas terapéuticas se describen en otra parte del presente documento. Las proteínas terapéuticas se pueden producir en, sobre o por células y se pueden obtener de dichas células o administrar en forma de dichas células. La proteína terapéutica se puede producir en, sobre o por células de mamíferos, células de insectos, células de levaduras, células bacterianas, células vegetales, células de animales transgénicos, células vegetales transgénicas, etc. La proteína terapéutica se puede producir de forma recombinante en dichas células. La proteína terapéutica se puede producir en, sobre o por una célula transformada viralmente. La proteína terapéutica también se puede producir en, sobre o por células autólogas que han sido transfectadas, transducidas o manipuladas de otro modo para expresarla. Alternativamente, la proteína terapéutica se puede administrar como un ácido nucleico o introduciendo un ácido nucleico en un virus, VLP, liposoma, etc. Alternativamente, la proteína terapéutica se puede obtener de dichas formas y administrar como la propia proteína terapéutica. Los sujetos, por lo tanto, incluyen cualquier sujeto que ha recibido, está recibiendo o recibirá cualquiera de los anteriores. Dicho sujeto incluye sujetos que han recibido, están recibiendo o recibirán terapia génica, células autólogas que han sido transfectadas, transducidas o manipuladas de otro modo para expresar una proteína, polipéptido o péptido terapéutico; o células que expresan una proteína terapéutica, polipéptido o péptido.
"Antígeno proteico terapéutico" significa un antígeno que está asociado con una proteína terapéutica que se puede, o una parte de la misma se puede presentar para su reconocimiento por las células del sistema inmunitario y puede generar una respuesta inmunitaria no deseada (p. ej., la producción de anticuerpos específicos de la proteína terapéutica) contra la proteína terapéutica. Los antígenos de proteína terapéutica generalmente incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, o están contenidos o son expresados en, sobre o por células.
"Respuesta inmunitaria tolerogénica" significa cualquier respuesta inmunitaria que puede conducir a la supresión inmunitaria específica de un antígeno o una célula, tejido, órgano, etc. que expresa dicho antígeno. Dichas respuestas inmunitarias incluyen cualquier reducción, retraso o inhibición en una respuesta inmunitaria no deseada específica para el antígeno o célula, tejido, órgano, etc. que expresa dicho antígeno. Dichas respuestas inmunitarias también incluyen cualquier estimulación, producción, inducción, promoción o reclutamiento en una respuesta inmunitaria deseada específica para el antígeno o célula, tejido, órgano, etc. que expresa dicho antígeno. Por lo tanto, las respuestas inmunitarias tolerogénicas incluyen la ausencia o la reducción de una respuesta inmunitaria no deseada a un antígeno que puede ser mediada por células reactivas al antígeno, así como la presencia o promoción de células supresoras. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas como se describen en el presente documento incluyen tolerancia inmunológica. "Generar una respuesta inmunitaria tolerogénica" se refiere a la generación de cualquiera de las respuestas inmunitarias anteriores específicas para un antígeno o célula, tejido, órgano, etc. que expresa dicho antígeno. La respuesta inmunitaria tolerogénica puede ser el resultado de la presentación restringida por MHC de clase I y/o la presentación restringida por MHC de clase II y/o la presentación de células B y/o la presentación por CD1d, etc.
Las respuestas inmunitarias tolerogénicas incluyen cualquier reducción, retraso o inhibición en la proliferación y/o actividad de células T CD4+, células T CD8+ o células B. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también incluyen una reducción en la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también pueden incluir cualquier respuesta que conduzca a la estimulación, inducción, producción o reclutamiento de células reguladoras, tales como las células Treg CD4+, células Treg CD8+, células Breg, etc. En algunos casos, la respuesta inmunitaria tolerogénica es una que da como resultado la conversión a un fenotipo regulador caracterizado por la producción, inducción, estimulación o reclutamiento de células reguladoras.
Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también incluyen cualquier respuesta que conduzca a la estimulación, producción o reclutamiento de células Treg CD4+ y/o células Treg CD8+. Las células Treg CD4+ pueden expresar el factor de transcripción FoxP3 e inhibir las respuestas inflamatorias y enfermedades inflamatorias autoinmunitarias (Human regulatory T cells in autoimmune diseases. Cvetanovich GL, Hafler DA. Curr Opin Immunol. 2010 Dec;22(6):753-60. Regulatory T cells and autoimmunity. Vila J, Isaacs JD, Anderson AE. Curr Opin Hematol. 2009 Jul;16(4):274-9). Dichas células también suprimen las células T auxiliares a células B e inducen tolerancia tanto a antígenos propios como extraños (Therapeutic approaches to allergy and autoimmunity based on FoxP3+ regulatory T-cell activation and expansion. Miyara M, Wing K, Sakaguchi S. J Allergy Clin Immunol. 2009 Apr;123(4):749-55). Las células Treg CD4+ reconocen el antígeno cuando son presentadas por proteínas de clase II en APC. Las células Treg CD8+, que reconocen el antígeno presentado por la clase I (y Qa-1), también pueden suprimir las células T auxiliares a células B y dar como resultado la activación de la supresión específica del antígeno que induce tolerancia tanto a los autoantígenos como a antígenos extraños. Se ha demostrado que la interrupción de la interacción de Qa-1 con las células Treg CD8+ desregula las respuestas inmunitarias y da como resultado el desarrollo de la formación de autoanticuerpos y un lupus-eritematoso sistémico letal autoinmunitario (Kim et al., Nature. 2010 Sep 16, 467 (7313):328-32) También se ha demostrado que las células Treg CD8+ inhiben modelos de enfermedades inflamatorias autoinmunitarias, incluyendo la artritis reumatoide y la colitis (CD4+CD25+ regulatory T cells in autoimmune arthritis. Oh S, Rankin AL, Caton AJ. Immunol Rev. 2010 Jan;233(1):97-111. Regulatory T cells in inflammatory bowel disease. Boden EK, Snapper SB. Curr Opin Gastroenterol. 2008 Nov;24(6):733-41). En algunos casos, las composiciones descritas pueden dar lugar efectivamente a ambos tipos de respuestas (Treg CD4+ y Treg CD8+). En otros casos, FoxP3 puede inducirse en otras células inmunitarias, tales como macrófagos, células iNKT, etc., y las composiciones descritas en el presente documento pueden dar como resultado también una o más de estas respuestas.
Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también incluyen, pero no se limitan a la inducción de citoquinas reguladoras, tales como las citoquinas Treg; inducción de citoquinas inhibidoras; la inhibición de las citoquinas inflamatorias (p. ej., IL-4, IL-1b, IL-5, TNF-a, IL-6, GM-CSF, IFN-y, IL-2, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, M-CSF, proteína reactiva C, proteína de fase aguda, quimiocinas (p. ej., MCP-1, RANTES, MIP-1a, MIP-1 p, M iG, iTa C o IP-10), la producción de citoquinas antiinflamatorias (p. ej., IL-4, IL-13, IL-10, etc.), quimioquinas (p. ej., CCL-2, CXCL8), proteasas (p. ej., MMP- 3, MMP-9), leucotrienos (p. ej., CysLT-1, CysLT-2), prostaglandinas (p. ej., PGE2) o histaminas; la inhibición de la polarización a una respuesta inmunitaria Th17, Th1 o Th2; la inhibición de citoquinas específicas de células efectoras: Th17 (p. ej., IL-17, IL-25), Th1 (IFN-y), Th2 (p. ej., IL-4, IL-13); la inhibición de factores de transcripción específicos de Th1, Th2 o TH17; la inhibición de proliferación de células T efectoras; la inducción de apoptosis de células T efectoras; la inducción de genes específicos de células dendríticas tolerogénicas, la inducción de la expresión de FoxP3, la inhibición de la inducción de IgE o respuestas inmunitarias mediadas por IgE; la inhibición de respuestas de anticuerpos (p. ej., producción de anticuerpos específicos de antígeno); la inhibición de la respuesta de células T auxiliares; la producción de TGF-p y/o IL-10; la inhibición de la función efectora de los autoanticuerpos (p. ej., inhibición en el agotamiento de células, daño de células o tejidos o activación del complemento); etc.
Cualquiera de los anteriores se puede medir in vivo en uno o más modelos animales o se puede medir in vitro. Un experto en la técnica está familiarizado con dichas mediciones in vivo o in vitro. Las respuestas inmunitarias no deseadas o las respuestas inmunitarias tolerogénicas se pueden controlar usando, por ejemplo, métodos para evaluar el número y/o la función de las células inmunitarias, análisis de tetrámero, ELISPOT, análisis basado en citometría de flujo de la expresión de citoquinas, secreción de citoquinas, perfiles de expresión de citoquinas, perfiles de expresión génica, perfil de expresión de proteínas, análisis de marcadores de superficie celular, detección basada en PCR del uso del gen del receptor de células inmunitarias (véase T. Clay et al., "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer" Clinical Cancer Research 7:1127-1135 (2001), etc. Las respuestas inmunitarias no deseadas o las respuestas inmunitarias tolerogénicas también se pueden controlar usando, por ejemplo, métodos para evaluar los niveles de proteínas en plasma o suero, proliferación de células inmunitarias y/o ensayos funcionales, etc. En algunos casos, las respuestas inmunitarias tolerogénicas se pueden controlar evaluando la inducción de FoxP3. Además, se describen métodos específicos con más detalle en los ejemplos.
Preferiblemente, las respuestas inmunitarias tolerogénicas conducen a la inhibición del desarrollo, progresión o patología de las enfermedades, trastornos o afecciones descritas en el presente documento. Si las composiciones pueden conducir o no a la inhibición del desarrollo, progresión o patología de las enfermedades, trastornos o afecciones descritas en el presente documento, se puede medir con modelos animales de dichas enfermedades, trastornos o afecciones. En algunos casos, la reducción de una respuesta inmunitaria no deseada o la generación de una respuesta inmunitaria tolerogénica se puede evaluar determinando los criterios de valoración clínicos, eficacia clínica, síntomas clínicos, biomarcadores biológicos de la enfermedad y/o puntuaciones clínicas. Las respuestas inmunitarias no deseadas o las respuestas inmunitarias tolerogénicas también se pueden evaluar con ensayos de diagnóstico para evaluar la presencia o ausencia de una enfermedad, trastorno o afección como se describe en el presente documento. Las respuestas inmunitarias no deseadas se pueden evaluar adicionalmente mediante métodos para medir los niveles de proteínas terapéuticas y/o la función en un sujeto. Los métodos para controlar o evaluar respuestas alérgicas no deseadas incluyen evaluar una respuesta alérgica en un sujeto por la reactividad de la piel y/o la producción de anticuerpos específicos de alergenos.
En algunos casos, el control o evaluación de la generación de una respuesta inmunitaria no deseada o una respuesta inmunitaria tolerogénica en un sujeto puede ser anterior a la administración de una composición de nanoportadores sintéticos descritos en el presente documento y/o antes de la administración de un injerto trasplantable o proteína terapéutica o exposición a un alergeno. En otros casos, la evaluación de la generación de una respuesta inmunitaria no deseada o una respuesta inmunitaria tolerogénica puede ser después de la administración de una composición de nanoportadores sintéticos descritos en el presente documento y/o después de la administración de un injerto trasplantable o proteína terapéutica o exposición a un alergeno. En algunos casos, la evaluación se hace después de la administración de la composición de nanoportadores sintéticos, pero antes de la administración de un injerto trasplantable o proteína terapéutica o la exposición a un alergeno. En otros casos, la evaluación se hace después de la administración de un injerto trasplantable o proteína terapéutica o exposición a un alergeno, pero antes de la administración de la composición. En otros casos, la evaluación se realiza antes tanto de la administración de los nanoportadores sintéticos como de la administración de un injerto trasplantable o proteína terapéutica o la exposición a un alergeno, mientras que en otros casos más, la evaluación se realiza después tanto de la administración de nanoportadores sintéticos como de la administración de un injerto trasplantable o proteína terapéutica o exposición a un alergeno. La evaluación se puede realizar tanto antes como después de la administración de los nanoportadores sintéticos y/o la administración de un injerto trasplantable o proteína terapéutica o exposición a un alergeno. En otros casos más, la evaluación se realiza más de una vez en el sujeto para determinar que se mantiene un estado inmunitario deseable en el sujeto, tal que un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una alergia, rechazo de órganos o tejidos o enfermedad de injerto contra huésped. Otros sujetos incluyen aquellos que se han sometido o se someterán a un trasplante, así como aquellos que han recibido, están recibiendo o recibirán una proteína terapéutica contra la cual han experimentado, están experimentando o se espera que experimenten una respuesta inmunitaria no deseada.
Una respuesta de anticuerpos se puede evaluar determinando uno o más títulos de anticuerpos. "Título de anticuerpos" significa un nivel medible de producción de anticuerpos. Los métodos para medir títulos de anticuerpos son conocidos en la técnica e incluyen el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). La respuesta de anticuerpos se puede cuantificar, por ejemplo, como el número de anticuerpos, concentración de anticuerpos o título. Los valores pueden ser absolutos o pueden ser relativos. Los ensayos para cuantificar una respuesta de anticuerpos incluyen ensayos de captura de anticuerpos, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inhibición de absorción de fase líquida (ILPAA), ensayos de inmunoelectroforesis en cohete (RIE) y ensayos de inmunoelectroforesis en línea (LIE). Cuando se compara una respuesta de anticuerpos con otra respuesta de anticuerpos, preferiblemente se usa el mismo tipo de valor cuantitativo (p. ej., título) y método de medición (p. ej., ELISA) para hacer la comparación.
Un método ELISA para medir un título de anticuerpos, por ejemplo, un ELISA tipo sándwich típico, puede consistir en las siguientes etapas (i) preparar un material de recubrimiento de placa de ELISA de manera que el objetivo de anticuerpo de interés se acople a un polímero sustrato u otro material adecuado (ii) preparar el material de recubrimiento en una solución acuosa (tal como PBS) y suministrar la solución de material de recubrimiento a los pocillos de una placa multipocillos para depositar durante la noche el recubrimiento sobre la placa multipocillos, (iii) lavar a fondo la placa multipocillos con tampón de lavado (tal como Tween-20 al 0,05% en PBS) para eliminar el exceso de material de recubrimiento, (iv) bloquear la placa para la unión no específica aplicando una solución diluyente (tal como el suero bovino fetal al 10% en PBS), (v) lavar la solución de bloqueo/diluyente de la placa con tampón de lavado, (vi) diluir la(s) muestra(s) de suero que contienen anticuerpos y referencias adecuadas (controles positivos) con diluyente según sea necesario para obtener una concentración que sature adecuadamente la respuesta de ELISA, (vii) diluir de forma seriada las muestras de plasma en la placa multipocillos de modo que se cubra un intervalo de concentraciones adecuado para generar una curva de respuesta de ELISA, (viii) incubar la placa para proporcionar la unión anticuerpo-objetivo, (ix) lavar la placa con tampón de lavado para eliminar anticuerpos no unidos al antígeno, (x) añadir una concentración adecuada de un anticuerpo de detección secundario en el mismo diluyente tal como un anticuerpo de detección acoplado a biotina capaz de unirse al anticuerpo primario, (xi) incubar la placa con el anticuerpo de detección aplicado, seguido de lavado con tampón de lavado, (xii) añadir una enzima tal como estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) que se unirá a la biotina que se encuentra en los anticuerpos biotinilados e incubar, (xiii) lavar la placa de multipocillos, (xiv) añadir sustrato(s) (tal como solución TMB) a la placa, (xv) aplicar una solución de parada (tal como ácido sulfúrico 2 N) cuando se completa el desarrollo del color, (xvi) leer la densidad óptica de los pocillos de la placa a una longitud de onda específica para el sustrato (450 nm con sustracción de lecturas a 570 nm), (xvi) aplicar una curva multiparamétrica adecuada ajustada a los datos y definir la concentración efectiva semimáxima (CE50) como la concentración en la curva en la que se alcanza la mitad del valor máximo de DO para las referencias de la placa.
Un "injerto trasplantable" se refiere a un material biológico, tal como células, tejidos y órganos (enteros o en parte) que se pueden administrar a un sujeto. Los injertos trasplantables pueden ser autoinjertos, aloinjertos o xenoinjertos de, por ejemplo, un material biológico tal como un órgano, tejido, piel, hueso, nervios, tendones, neuronas, vasos sanguíneos, grasa, córnea, células pluripotentes, células diferenciadas (obtenidas o derivado in vivo o in vitro), etc. En algunos casos, un injerto trasplantable se forma, por ejemplo, a partir de cartílago, hueso, matriz extracelular o matrices de colágeno. Los injertos trasplantables también pueden ser células individuales, suspensiones de células y células en tejidos y órganos que se pueden trasplantar. Las células trasplantables típicamente tienen una función terapéutica, por ejemplo, una función de la que carece o está disminuida en un sujeto receptor. Algunos ejemplos no limitantes de células trasplantables son células p, hepatocitos, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales, neuronas, células gliales o células mielinizantes. Las células trasplantables pueden ser células que no están modificadas, por ejemplo, células obtenidas de un sujeto donante y que se pueden usar en trasplantes sin ninguna modificación genética o epigenética. En otros casos, las células trasplantables pueden ser células modificadas, por ejemplo, células obtenidas de un sujeto que tiene un defecto genético, en el que se ha corregido el defecto genético, o células que derivan de células reprogramadas, por ejemplo, células diferenciadas derivadas de células obtenidas de un sujeto.
"Trasplante" se refiere al procedimiento de transferir (mover) un injerto trasplantable a un sujeto receptor (p. ej., de un sujeto donante, de una fuente in vitro (p. ej., células pluripotentes autólogas o heterólogas diferenciadas nativas o inducidas)) y/o de una ubicación corporal a otra ubicación corporal en el mismo sujeto.
"Respuesta inmunitaria no deseada" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria no deseada que resulta de la exposición a un antígeno, promueve o exacerba una enfermedad, trastorno o afección descrita en el presente documento (o uno de sus síntomas), o es sintomática de una enfermedad, trastorno o afección descrita en el presente documento. Dichas respuestas inmunitarias en general tienen un impacto negativo en la salud de un sujeto o son síntomas de un impacto negativo en la salud de un sujeto. Las respuestas inmunitarias no deseadas incluyen la producción de anticuerpos específicos de antígeno, la proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno o la proliferación y/o actividad de células T CD4+ específicas de antígeno.
C. Información técnica relacionada con las composiciones
En el presente documento se describen composiciones de nanoportadores sintéticos tolerogénicos que comprenden inmunosupresores y epítopos restringidos por MHC de clase II de un antígeno que genera o se espera que genere respuestas inmunitarias humorales no deseadas, y métodos relacionados. Dichas composiciones y métodos son útiles para reducir la generación de respuestas inmunitarias humorales no deseadas o promover la generación de respuestas inmunitarias tolerogénicas, por ejemplo, reduciendo la producción de anticuerpos específicos de antígeno y/o la ayuda de células T CD4+ específicas de antígeno y/o la proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno. Las composiciones se pueden administrar a sujetos en los que se desea una respuesta inmunitaria tolerogénica. Dichos sujetos incluyen aquellos que tienen o están en riesgo de tener una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una alergia, rechazo de órgano o tejido o enfermedad de injerto contra huésped. Dichos sujetos también incluyen aquellos que han recibido, están recibiendo o recibirán una proteína terapéutica contra la cual el sujeto ha experimentado o se espera que experimente una respuesta inmunitaria no deseada. Dichos sujetos también incluyen aquellos que se han sometido o se someterán a trasplante.
Como se ha mencionado anteriormente, los nanoportadores sintéticos se diseñan para comprender inmunosupresores y, en algunos casos, antígeno contra el cual se desea un efecto tolerogénico. Los antígenos pueden comprender epítopos restringidos por MHC de clase II que, cuando se presentan conjuntamente con inmunosupresores, pueden conducir a efectos tolerogénicos, tales como la reducción de la ayuda de células T CD4+ específicas de antígeno. Los efectos tolerogénicos resultantes también incluyen una reducción en la proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno y/o una reducción en la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Se puede usar una amplia variedad de nanoportadores sintéticos. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son esferas o esferoides. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son planos o en forma de placa. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son cubos o cúbicos. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son óvalos o elipses. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son cilindros, conos o pirámides.
En algunos casos, es deseable usar una población de nanoportadores sintéticos que sea relativamente uniforme en términos de tamaño, forma y/o composición, de modo que cada nanoportador sintético tenga propiedades similares. Por ejemplo, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de los nanoportadores sintéticos, basado en el número total de nanoportadores sintéticos, pueden tener una dimensión mínima o una dimensión máxima que cae dentro del 5%, 10% o 20% del diámetro medio o dimensión media de los nanoportadores sintéticos. En algunos casos, una población de nanoportadores sintéticos puede ser heterogénea con respecto al tamaño, forma y/o composición.
Los nanoportadores sintéticos pueden ser sólidos o huecos y pueden comprender una o más capas. En algunos casos, cada capa tiene una composición única y propiedades únicas con respecto a la o las otras capas. Para dar solo un ejemplo, los nanoportadores sintéticos pueden tener una estructura de núcleo/cubierta, en donde el núcleo es una capa (p. ej., un núcleo polimérico) y la cubierta es una segunda capa (p. ej., una bicapa lipídica o monocapa). Los nanoportadores sintéticos pueden comprender una pluralidad de capas diferentes.
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más lípidos. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender un liposoma. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender una bicapa lipídica. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender una monocapa lipídica. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender una micela. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo que comprende una matriz polimérica rodeada por una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo no polimérico (p. ej., partículas metálicas, puntos cuánticos, partículas cerámicas, partículas óseas, partículas virales, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, etc.) rodeado por una capa de lípidos (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.).
En otros casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender partículas metálicas, puntos cuánticos, partículas cerámicas, etc. En algunos casos, un nanoportador sintético no polimérico es un añadiendo de componentes no poliméricos, tal como un añadiendo de átomos metálicos (p. ej., átomos de oro)
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente una o más entidades anfifílicas. En algunos casos, una entidad anfifílica puede promover la producción de nanoportadores sintéticos con mayor estabilidad, mayor uniformidad o mayor viscosidad. En algunos casos, las entidades anfifílicas se pueden asociar con la superficie interior de una membrana lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). Muchas entidades anfifílicas conocidas en la técnica son adecuadas para su uso en la fabricación de nanoportadores sintéticos. Dichas entidades anfifílicas incluyen, pero no se limitan a fosfoglicéridos; fosfatidilcolinas; dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE); dioleloxipropiltrietilamonio (DOTMA); dioleoilfosfatidilcolina; colesterol; éster de colesterol; diacilglicerol; diacilglicerolsuccinato; difosfatidilglicerol (DPPG); hexanodecanol; alcoholes grasos tales como polietilenglicol (PEG); polioxietilen-9-lauril éter; un ácido graso tensioactivo, tal como ácido palmítico o ácido oleico; ácidos grasos; monoglicéridos de ácidos grasos; diglicéridos de ácidos grasos; amidas de ácidos grasos; trioleato de sorbitán (Span®85) glicocolato; monolaurato de sorbitán (Span®20); polisorbato 20 (Tween®20); polisorbato 60 (Tween®60); polisorbato 65 (Tween®65); polisorbato 80 (Tween®80); polisorbato 85 (Tween®85); monoestearato de polioxietileno; surfactina; un poloxómero; un éster de ácido graso y sorbitán tal como trioleato de sorbitán; lecitina; lisolecitina; fosfatidilserina; fosfatidilinositol, esfingomielina; fosfatidiletanolamina (cefalina); cardiolipina; ácido fosfatídico; cerebrósidos; dicetilfosfato; dipalmitoilfosfatidilglicerol; estearilamina; dodecilamina; hexadecil-amina; palmitato de acetilo; ricinoleato de glicerol; esterato hexadecilo; miristato de isopropilo; tiloxapol; poli(etilenglicol) 5000-fosfatidiletanolamina; poli(etilenglicol)400-monoestearato; fosfolípidos; detergentes sintéticos y/o naturales que tienen altas propiedades tensioactivas; desoxicolatos; ciclodextrinas; sales caotrópicas; agentes de apareamiento de iones; y combinaciones de los mismos. Un componente de entidad anfifílica puede ser una mezcla de diferentes entidades anfifílicas. Los expertos en la técnica reconocerán que esta es una lista de ejemplo, no exhaustiva, de sustancias con actividad tensioactiva. Se puede usar cualquier entidad anfifílica en la producción de nanoportadores sintéticos.
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más carbohidratos. Los carbohidratos pueden ser naturales o sintéticos. Un carbohidrato puede ser un carbohidrato natural derivatizado. En ciertos casos, un carbohidrato comprende monosacárido o disacárido, que incluye, pero no se limita a glucosa, fructosa, galactosa, ribosa, lactosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, manosa, xilosa, arabinosa, ácido glucorónico, ácido galactorónico, ácido manurónico, glucosamina, galatosamina y ácido neurámico. En ciertos casos, un carbohidrato es un polisacárido, que incluye, pero no se limita a pululano, celulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxicelulosa (HC), metilcelulosa (MC), dextrano, ciclodextrano, glucógeno, hidroxietil-almidón, carragenina, glicón, amilosa, quitosano, N,O-carboxilmetilquitosano, algina y ácido algínico, almidón, quitina, inulina, konjac, glucomanano, pustulano, heparina, ácido hialurónico, curdlano y xantano. En casos, los nanoportadores sintéticos no comprenden (o excluyen específicamente) carbohidratos, tales como un polisacárido. En ciertos casos, el carbohidrato puede comprender un derivado de carbohidrato tal como un alcohol de azúcar, que incluye, pero no se limita a manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, maltitol y lactitol.
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender uno o más polímeros. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que son polímeros plurónicos no terminados en metoxi. En algunos casos, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros plurónicos no terminados en metoxi. En algunos casos, todos los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros plurónicos no terminados en metoxi. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que son un polímero no terminado en metoxi. En algunos casos, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros no terminados en metoxi. En algunos casos, todos los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros no terminados en metoxi. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que no comprenden polímero plurónico. En algunos casos, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos no comprenden polímero plurónico. En algunos casos, todos los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos no comprenden polímero plurónico. En algunos casos, dicho polímero puede estar rodeado por una capa de recubrimiento (p. ej., liposoma, monocapa lipídica, micela, etc.). En algunos casos, varios elementos de los nanoportadores sintéticos pueden estar acoplados con el polímero.
Los inmunosupresores y/o antígenos se pueden acoplar a los nanoportadores sintéticos por cualquiera de una serie de métodos. Generalmente, el acoplamiento puede ser un resultado de la unión entre los inmunosupresores y/o antígenos y los nanoportadores sintéticos. Esta unión puede dar como resultado que los inmunosupresores y/o antígenos se unan a la superficie de los nanoportadores sintéticos y/o estén contenidos dentro (encapsulados) de los nanoportadores sintéticos. Sin embargo, en algunos casos, los inmunosupresores y/o antígenos están encapsulados por los nanoportadores sintéticos como resultado de la estructura de los nanoportadores sintéticos en lugar de unirse a los nanoportadores sintéticos. En casos preferibles, los nanoportadores sintéticos comprenden un polímero como se describe en el presente documento, y los inmunosupresores y/o antígenos están acoplados al polímero.
Cuando se produce el acoplamiento como resultado de la unión entre los inmunosupresores y/o antígenos y nanoportadores sintéticos, el acoplamiento puede ocurrir a través de un resto de acoplamiento. Un resto de acoplamiento puede ser cualquier resto a través del cual un inmunosupresor y/o antígeno se une a un nanoportador sintético. Dichos restos incluyen enlaces covalentes, tales como un enlace amida o enlace éster, así como moléculas separadas que unen (covalente o no covalentemente) el inmunosupresor y/o antígeno al nanoportador sintético. Dichas moléculas incluyen conectores o polímeros o una unidad de los mismos. Por ejemplo, el resto de acoplamiento puede comprender un polímero cargado al que se une electrostáticamente un inmunosupresor y/o antígeno. Como otro ejemplo, el resto de acoplamiento puede comprender un polímero o unidad del mismo al que está unido covalentemente.
En casos preferidos, los nanoportadores sintéticos comprenden un polímero como se describe en el presente documento. Estos nanoportadores sintéticos pueden ser completamente poliméricos o pueden ser una mezcla de polímeros y otros materiales.
En algunos casos, los polímeros de un nanoportador sintético se asocian para formar una matriz polimérica. En algunos de estos casos, un componente, tal como un inmunosupresor o antígeno, se puede asociar covalentemente con uno o más polímeros de la matriz polimérica. En algunos casos, la asociación covalente es mediada por un conector. En algunos casos, un componente puede estar asociado de forma no covalente con uno o más polímeros de una matriz polimérica. Por ejemplo, en algunos casos, un componente se puede encapsular dentro, rodear de y/o dispersar por una matriz polimérica. Alternativa o adicionalmente, un componente se puede asociar con uno o más polímeros de una matriz polimérica por interacciones hidrófobas, interacciones de carga, fuerzas de van der Waals, etc. Se conoce convencionalmente una amplia variedad de polímeros y métodos para formar matrices poliméricas a partir de los mismos.
Los polímeros pueden ser polímeros naturales o no naturales (sintéticos). Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros que comprenden dos o más monómeros. En términos de secuencia, los copolímeros pueden ser aleatorios, de bloques o comprender una combinación de secuencias aleatorias y de bloque. Típicamente, los polímeros son polímeros orgánicos.
En algunos casos, el polímero comprende un poliéster, policarbonato, poliamida o poliéter, o una unidad del mismo. En otros casos, el polímero comprende poli(etilenglicol) (PEG), polipropilenglicol, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o una policaprolactona, o una unidad de los mismos. En algunos casos, se prefiere que el polímero sea biodegradable. Por lo tanto, en estos casos, se prefiere que, si el polímero comprende un poliéter, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o una unidad del mismo, el polímero comprenda un copolímero en bloques de un poliéter y un polímero biodegradable de modo que el polímero sea biodegradable. En otros casos, el polímero no comprende únicamente un poliéter o una unidad del mismo, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o una unidad del mismo.
Otros ejemplos de polímeros incluyen, pero no se limitan a polietilenos, policarbonatos (p. ej., poli(1,3-dioxan-2ona)), polianhídridos (p. ej., poli(anhídrido sebácico)), pol(fumeratos de propilo), poliamidas (p. ej., policaprolactama), poliacetales, poliéteres, poliésteres (p. ej., polilactida, poliglicólido, polilactida-co-glicólido, policaprolactona, polihidroxiácido (p. ej. poli(p-hidroxialcanoato))), poli(ortoésteres), policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliureas, poliestirenos y poliaminas, polilisina, copolímeros de polilisina-PEG y poli(etilenimina), copolímeros de poli(etilenimina)-PEG.
En algunas realizaciones, los polímeros incluyen polímeros que han sido aprobados para usar en seres humanos por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) bajo 21 CFR § 177.2600, que incluyen, pero no se limitan a poliésteres (p. ej., poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona, polivalerolactona, poli(1,3-dioxan-2ona)); polianhídridos (p. ej., poli(anhídrido sebácico)); poliéteres (p. ej., polietilenglicol); poliuretanos; polimetacrilatos; poliacrilatos; y policianoacrilatos.
En algunos casos, los polímeros pueden ser hidrófilos. Por ejemplo, los polímeros pueden comprender grupos aniónicos (p. ej., grupo fosfato, grupo sulfato, grupo carboxilato); grupos catiónicos (p. ej., grupo amina cuaternaria); o grupos polares (p. ej., grupo hidroxilo, grupo tiol, grupo amina). En algunos casos, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrófila genera un entorno hidrófilo dentro del nanoportador sintético. En algunos casos, los polímeros pueden ser hidrófobos. En algunos casos, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrófoba genera un entorno hidrófobo dentro del nanoportador sintético. La selección de la hidrofilicidad o hidrofobicidad del polímero puede tener un impacto en la naturaleza de los materiales que se incorporan (p. ej., se acoplan) dentro del nanoportador sintético.
En algunos casos, los polímeros se pueden modificar con uno o más restos y/o grupos funcionales. Se puede usar una variedad de restos o grupos funcionales. En algunos casos, los polímeros se pueden modificar con polietilenglicol (PEG), con un carbohidrato y/o con poliacetales acíclicos derivados de polisacáridos (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). También se pueden usar las enseñanzas generales de la patente de EE.UU. N° 5543158 de Gref et al. o publicación WO WO2009/051837 por Von Andrian et al.
En algunos casos, los polímeros se pueden modificar con un lípido o grupo ácido graso. En algunos casos, un grupo de ácido graso puede ser uno o más de ácido butírico, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behénico o lignocérico. En algunos casos, un grupo ácido graso puede ser uno o más de ácido palmitoleico, oleico, vaccénico, linoleico, alfa-linoleico, gamma-linoleico, araquidónico, gadoleico, araquidónico, eicosapentaenoico, docosahexaenoico o erúcico.
En algunos casos, los polímeros pueden ser poliésteres, que incluyen copolímeros que comprenden unidades de ácido láctico y ácido glicólico, tales como poli(ácido láctico-co-glicólico) y poli(lactida-co-glicólido), denominados colectivamente en el presente documento como "PLGA"; y homopolímeros que comprenden unidades de ácido glicólico, denominadas en el presente documento "PGA", y unidades de ácido láctico, tales como ácido poli-(ácido L-láctico(, poli-(ácido D-láctico), poli-( ácido D,L-láctico), poli-L-lactida, poli-D-lactida y poli-D,L-lactida, denominados colectivamente en el presente documento como "PLA". En algunos casos, los poliésteres de ejemplo incluyen, por ejemplo, polihidroxiácidos; copolímeros de PEG y copolímeros de lactida y glicólido (p. ej., copolímeros de PLA-PEG, copolímeros de PGA-PEG, copolímeros de PLGA-PEG y derivados de los mismos. En algunos casos, los poliésteres incluyen, por ejemplo, poli(caprolactona), copolímeros de poli(caprolactona)-PEG, poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de serina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico], y sus derivados.
En algunos casos, un polímero puede ser PLGA. El PLGA es un copolímero biocompatible y biodegradable de ácido láctico y ácido glicólico, y diferentes formas de PLGA se caracterizan por la relación de ácido láctico:ácido glicólico. El ácido láctico puede ser ácido L-láctico, ácido D-láctico o ácido D,L-láctico. La velocidad de degradación del PLGA se puede ajustar alterando la relación de ácido láctico:ácido glicólico. En algunos casos, el PLGA que se va a usar se caracteriza por una relación ácido láctico:ácido glicólico de aproximadamente 85:15, aproximadamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75, o aproximadamente 15:85.
En algunos casos, los polímeros pueden ser uno o más polímeros acrílicos. En ciertos casos, los polímeros acrílicos incluyen, por ejemplo, copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), copolímero de ácido metacrílico y alquilamida, poli(metacrilato de metilo), poli(anhídrido del ácido metacrílico), metacrilato de metilo, polimetacrilato, copolímero de poli(metacrilato de metilo), poliacrilamida, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, copolímeros de metacrilato de glicidilo, policianoacrilatos y combinaciones que comprenden uno o más de los polímeros anteriores. El polímero acrílico puede comprender copolímeros completamente polimerizados de ésteres de ácido acrílico y metacrílico con un bajo contenido de grupos de amonio cuaternario.
En algunos casos, los polímeros pueden ser polímeros catiónicos. En general, los polímeros catiónicos pueden condensar y/o proteger cadenas de ácidos nucleicos con carga negativa (p. ej., ADN o derivados de los mismos). Polímeros que contienen amina tales como poli(lisina) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; y Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem, 6:7), poli(etilenimina) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 1995, 92:7297), y dendrímeros de poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., e E.UU., 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; y Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) tienen carga positiva a pH fisiológico, forman pares de iones con ácidos nucleicos y median la transfección en una variedad de líneas celulares. Los nanoportadores sintéticos pueden no comprender (o pueden excluir) polímeros catiónicos.
En algunos casos, los polímeros pueden ser poliésteres degradables que llevan cadenas laterales catiónicas (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; y Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). Los ejemplos de estos poliésteres incluyen poli(L-lactida-co-L-lisina) (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010), poli(éster de serina) (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim et al., 1999, J. Am. Chem Soc., 121:5633), y poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc. 121:5633).
Las propiedades de estos y otros polímeros y métodos para prepararlos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.123.727; 5.804.178; 5.770.417; 5.736.372; 5.716.404; 6.095.148; 5.837.752; 5.902.599; 5.696.175; 5.514.378; 5.512.600; 5.399.665; 5.019.379; 5.010.167; 4.806.621; 4.638.045; y 4.946.929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; y uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). De forma más general, se describen una variedad de métodos para sintetizar ciertos polímeros adecuados en Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization de Odian, John Wiley & Sons, Cuarta Edición, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; y patentes de EE.UU. 6.506.577.
6.632.922. 6.686.446. y 6.818.732.
En algunos casos, los polímeros pueden ser polímeros lineales o ramificados. En algunos casos, los polímeros pueden ser dendrímeros. En algunos casos, los polímeros pueden estar sustancialmente reticulados entre sí. En algunos casos, los polímeros pueden estar sustancialmente exentos de reticulaciones. En algunos casos, los polímeros se pueden usar sin llevar a cabo una etapa de reticulación. Debe entenderse además que los nanoportadores sintéticos pueden comprender copolímeros de bloques, copolímeros de injerto, mezclas, mezclas y/o aductos de cualquiera de los polímeros anteriores y otros. Los expertos en la materia reconocerán que los polímeros citados en el presente documento representan una lista de ejemplo, no exhaustiva, de polímeros que pueden ser de utilidad.
En otros casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender partículas metálicas, puntos cuánticos, partículas cerámicas, etc. En algunos casos, un nanoportador sintético no polimérico es un añadiendo de componentes no poliméricos, tal como un añadiendo de átomos metálicos (p. ej., átomos de oro)
Las composiciones pueden comprender nanoportadores sintéticos en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como conservantes, tampones, solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Las composiciones se pueden hacer usando técnicas convencionales de fabricación y composición farmacéutica para llegar a formas farmacéuticas útiles. Los nanoportadores sintéticos se pueden suspender en solución salina estéril para inyección junto con un conservante.
Cuando se preparan nanoportadores sintéticos como portadores, los métodos para acoplar componentes a los nanoportadores sintéticos pueden ser útiles. Si el componente es una molécula pequeña, puede ser ventajoso unir el componente a un polímero antes del ensamblaje de los nanoportadores sintéticos. También puede ser una ventaja preparar los nanoportadores sintéticos con grupos de superficie que se usan para acoplar los componentes a los nanoportadores sintéticos mediante el uso de estos grupos de superficie en lugar de unir los componentes a un polímero y después usar este conjugado de polímero en la construcción de nanoportadores sintéticos.
El acoplamiento puede ser un conector covalente. Los péptidos se pueden acoplar covalentemente a la superficie externa a través de un conector de 1,2,3-triazol formado por la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de grupos azido en la superficie del nanoportador con antígeno o inmunosupresor que contiene un grupo alquino o por la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de alquinos en la superficie del nanoportador con antígenos o inmunosupresores que contienen un grupo azido. Dichas reacciones de cicloadición se llevan a cabo preferiblemente en presencia de un catalizador de Cu (I) junto con un ligando de Cu (I) adecuado y un agente de reducción para reducir el compuesto de Cu (II) a compuesto de Cu (I) catalíticamente activo. Esta cicloadición de azida-alquino catalizada por Cu (I) (CuAAC) también se puede denominar reacción de click.
Adicionalmente, el acoplamiento covalente puede comprender un conector covalente que comprende un conector amida, un conector disulfuro, un conector tioéter, un conector hidrazona, un conector hidrazida, un conector imina u oxima, un conector urea o tiourea, un conector amidina, un conector amina y un conector sulfonamida.
Un conector amida se forma a través de un enlace de amida entre una amina en un componente con el grupo de ácido carboxílico de un segundo componente tal como el nanoportador. El enlace amida en el conector se puede hacer usando cualquiera de las reacciones de formación de enlace amida convencionales con aminoácidos adecuadamente protegidos y ácido carboxílico activado tal como éster activado con N-hidroxisuccinimida.
Un conector disulfuro se crea por la formación de un enlace disulfuro (S-S) entre dos átomos de azufre de la forma, por ejemplo, de R1-S-S-R2. Se puede formar un enlace disulfuro por intercambio de tiol de un componente que contiene un grupo tiol/mercaptano (-SH) con otro grupo tiol activado en un polímero o nanoportador o un nanoportador que contiene grupos tiol/mercaptano con un componente que contiene grupo tiol activado.
Un conector de triazol, específicamente un 1,2,3-triazol de la forma
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entidad química, se hace por la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de una azida unida a un primer componente tal como el nanoportador con un alquino terminal unido a un segundo componente tal como el inmunosupresor o antígeno que comprende el epítopo. La reacción de cicloadición 1,3-dipolar se lleva a cabo con o sin un catalizador, preferiblemente con catalizador de Cu (I), que une los dos componentes a través de una función 1,2,3-triazol. Esta química se describe en detalle en Sharpless et al., Angew. Chem Int. Ed. 41 (14), 2596, (2002) y Meldal, et al, Chem. Rev, 2008, 108 (8), 2952-3015 y a menudo se conoce como reacción de "click" o CuAAC.
Se puede preparar un polímero que contiene un grupo azida o alquino terminal en la cadena polimérica. Este polímero después se usa para preparar un nanoportador sintético de tal manera que una pluralidad de grupos alquino o azida se colocan en la superficie de ese nanoportador. Alternativamente, el nanoportador sintético puede prepararse por otra ruta y posteriormente funcionalizar con grupos alquino o azida. El componente se prepara con la presencia de un grupo alquino (si el polímero contiene una azida) o una azida (si el polímero contiene un alquino). El componente después se deja reaccionar con el nanoportador por la reacción de cicloadición 1,3-dipolar con o sin un catalizador que acopla covalentemente el componente a la partícula a través del conector 1,2,3-triazol 1,4-disustituido.
Un conector tioéter se hace por la formación de un enlace azufre-carbono (tioéter) en forma, por ejemplo, de R1-S-R2. El tioéter se puede preparar por alquilación de un grupo tiol/mercaptano (-SH) en un componente con un grupo alquilante tal como haluro o epóxido en un segundo componente. Los conectores tioéter también se pueden formar por adición de Michael de un grupo tiol/mercaptano en un componente a un grupo alqueno deficiente en electrones en un segundo componente que contiene un grupo maleimida o un grupo vinilsulfona como el aceptor de Michael. De otra manera, los conectores tioéter se pueden preparar por la reacción radical tiol-eno de un grupo tiol/mercaptano en un componente con un grupo alqueno en un segundo componente.
Se crea un conector de hidrazona mediante la reacción de un grupo hidrazida en un componente con un grupo aldehído/cetona en el segundo componente.
Un conector hidrazida se forma por la reacción de un grupo hidrazina en un componente con un grupo ácido carboxílico en el segundo componente. Dicha reacción se lleva a cabo en general usando una química similar a la formación de un enlace amida donde el ácido carboxílico se activa con un reactivo activador.
Un conector imina u oxima se forma por la reacción de un grupo amina o N-alcoxiamina (o aminooxi) en un componente con un grupo aldehído o cetona en el segundo componente.
Un conector urea o tiourea se prepara por la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo isocianato o tioisocianato en el segundo componente.
Un conector de amidina se prepara por la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo imidoéster en el segundo componente.
Un conector amina se hace por la reacción de alquilación de un grupo amina en un componente con un grupo alquilante tal como un grupo haluro, epóxido o éster sulfonato en el segundo componente. Alternativamente, también se puede hacer un conector amina por aminación reductora de un grupo amina en un componente con un grupo aldehído o cetona en el segundo componente con un reactivo reductor adecuado tal como cianoborohidruro de sodio o triacetoxiborohidruro de sodio.
Un conector sulfonamida se hace por reacción de un grupo amina en un componente con un grupo haluro de sulfonilo (tal como cloruro de sulfonilo) en el segundo componente.
Un conector sulfona se hace por adición de Michael de un nucleófilo a una vinilsulfona. La vinilsulfona o el nucleófilo pueden estar en la superficie del nanoportador o unidos a un componente.
El componente también se puede conjugar con el nanoportador mediante métodos de conjugación no covalentes. Por ejemplo, un antígeno o inmunosupresor con carga negativa se puede conjugar con un nanoportador con carga positiva por adsorción electrostática. Un componente que contiene un ligando metálico también se puede conjugar a un nanoportador que contiene un complejo metálico mediante un complejo metal-ligando.
El componente se puede unir a un polímero, por ejemplo, poli(ácido láctico)-bloque-polietilenglicol, antes del ensamblaje del nanoportador sintético o el nanoportador sintético se puede formar con grupos reactivos o activables en su superficie. En el último caso, el componente se puede preparar con un grupo que sea compatible con la química de unión que presenta la superficie de los nanoportadores sintéticos. En otros casos, un componente peptídico se puede unir a VLP o liposomas usando un conector adecuado. Un conector es un compuesto o reactivo que es capaz de acoplar dos moléculas juntas. El conector puede ser un reactivo homobifuncional o heterobifuncional como se describe en Hermanson 2008. Por ejemplo, una VLP o un nanoportador sintético de liposoma que contiene un grupo carboxílico en la superficie se puede tratar con un conector homobifuncional, dihidrazida adípica (ADH), en presencia de EDC para formar el nanoportador sintético correspondiente con el conector ADH. El nanoportador sintético unido a ADH resultante se conjuga después con un componente peptídico que contiene un grupo ácido a través del otro extremo del conector ADH en NC para producir la correspondiente VLP o conjugado de péptido y liposoma.
Para descripciones detalladas de los métodos de conjugación disponibles, véase Hermanson GT "Bioconjugate Techniques", 2a edición publicada por Academic Press, Inc., 2008 . Además de la unión covalente, el componente se puede acoplar por adsorción a un nanoportador sintético preformado o se puede acoplar por encapsulación durante la formación del nanoportador sintético.
Cualquier inmunosupresor como se describe en el presente documento se puede acoplar al nanoportador sintético. Los inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a estatinas; inhibidores de mTOR, tales como rapamicina o un análogo de rapamicina; agentes de señalización de TGF-p; agonistas del receptor de TGF-p; inhibidores de histona desacetilasa (HDAC); corticosteroides; inhibidores de la función mitocondrial, tales como la rotenona; inhibidores de P38; inhibidores de NF-Kp; agonistas del receptor de adenosina; agonistas de prostaglandina E2; inhibidores de fosfodiesterasa, tales como inhibidor de fosfodiesterasa 4; inhibidores de proteasoma; inhibidores de quinasa; agonistas del receptor acoplado a proteína G; antagonistas del receptor acoplado a proteína G; glucocorticoides; retinoides; inhibidores de citoquinas; inhibidores del receptor de citoquinas; activadores del receptor de citoquinas; antagonistas de receptores activados por el proliferador de peroxisomas; agonistas de receptores activados por proliferador de peroxisomas; inhibidores de histona desacetilasa; inhibidores de calcineurina; inhibidores de fosfatasa y ATP oxidados. Los inmunosupresores también incluyen IDO, vitamina D3, ciclosporina A, inhibidores del receptor de hidrocarburos de arilo, resveratrol, azatiopurina, 6-mercaptopurina, aspirina, ácido niflumico, estriol, tripólido, interleucinas (p. ej., IL-1, IL-10), ciclosporina A, ARNip que se dirigen a citoquinas o receptores de citoquinas.
Los ejemplos de estatinas incluyen (LIPITOR®, TORVAST®), cerivastatina, fluvastatina (LESCOL®, LESCOL® XL), lovastatina (MEVACOR®, ALTOc Or®, ALTOPREV®), mevastatina (COMPACTIN®), pitavastatina (LIVALO®, PIAVA®), rosuvastatina (PrAVACHOL®, SELEKTINE®, LIPOSTAT®), rosuvastatina (c ReSTOR®), y simvastatina (ZOCOR®, LIPEX®).
Los ejemplos de inhibidores de mTOR incluyen rapamicina y análogos de la misma (p. ej., CCL-779, RAD001, AP23573, C20-metalilrapamicina (C20-Marap), C16-(S)-butilsulfonamidorapamicina (C16-BSrap), C16-(S)-3-metilindolrapamicina (C16 -iRap) (Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (n V p -BEZ235), ácido crisofánico (crisofanol), deforolimus (MK-8669), everolimus (RAD0001), Ku -0063794, PI-103, PP242, temsirolimus, y WYE-354 (disponible en Selleck, Houston, TX, EE.UU.).
Los ejemplos de agentes de señalización de TGF-p incluyen ligandos de TGF-p (p. ej., activina A, GDF1, GDF11, proteínas morfogénicas óseas, nodal, TGF-ps) y sus receptores (p. ej., ACVR1 B, ACVR1C, ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, BMPR1A, BMPR1B, TGFpRI, TGFpRII, R-SMADS/co-SMADS (p. ej., SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD8), e inhibidores de ligandos (p. ej., folistatina, nogina, cordina, Da n , lefty, LTBP1, THBS1, decorina).
Los ejemplos de inhibidores de la función mitocondrial incluyen atractilósido (sal de dipotasio), ácido bongkrékico (sal de triamonio), m-clorofenilhidrazona de carbonil-cianuro, carboxiatractilósido (p. ej., de Atractylis gummifera), CGP-37157, (-)-Deguelina (p. ej., de Mundulea sericea), F16, péptido de dominio de unión VDAC a hexoquinasa II, oligomicina, rotenona, Ru360, SFK1, y valinomicina (p. ej., de Streptomyces fulvissimus) (EMD4Biosciences, EE.UU.).
Los ejemplos de inhibidores de P38 incluyen SB-203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)1H-imidazol), SB-239063 (trans-1 -(4hidroxiciclohexil)-4-(fluorofenil)-5-(2-metoxi-pirimidin-4-il)imidazol), SB-220025 (5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1 -(4-piperidinil)imidazol)), y ARRy-797.
[Los ejemplos de inhibidores de NF (p. ej., NK-Kp) incluyen IFRD1, 2-(1,8-naftiridin-2-il)-fenol, ácido 5-aminosalicílico, BAY 11 -7082, BAY 11 -7085, CAPE (éster de fenetilo del ácido cafeico), maleato de dietilo, inhibidor de IKK-2 IV, IMD 0354, lactacistina, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], inhibidor III de activación de NFkB, inhibidor II de activación de NF-kB, JSH-23, partenolida, óxido de fenilarsina (PAO), PPM-18, sal de amonio del ácido pirrolidinaditiocarbámico, QNZ, RO 106-9920, rocaglamida, rocaglamida AL, rocaglamida C, rocaglamida I, rocaglamida J, rocaglaol, (R)-MG-132, salicilato de sodio, triptolida (PG490), wedelolactona.
Los ejemplos de agonistas de receptor de adenosina CGS-21680 y ATL-146e.
Los ejemplos de agonistas de receptor de prostaglandina E2 incluyen E-Prostanoide 2 y E-Prostanoide 4.
Los ejemplos de inhibidores de fosfodiesterasa (inhibidores no selectivos y selectivos) incluyen cafeína, aminofilina, IBMX (3-isobutil-1-metilxantina), paraxantina, pentoxifilina, teobromina, teofilina, xantinas metiladas, vinpocetina, EHNA (eritro-9-(2-hidroxo-3-nonil)adenina), anagrelida, enoximona (PERFAN™), milrinona, levosimendon, mesembrina, ibudilast, piclamilast, luteolina, drotaverina, roflumilast (DAXAS™, DALIRESP™), sildenafilo (REVATION®, VIAGRA®), tadalafilo (ADCIRCA®, CIALIS®), vardenafilo (LEVITRA®, STAXYN®), udenafilo, avanafilo, icariina, 4-metilpiperazina y pirazolo-pirimidin-7-1.
Los ejemplos de inhibidores de proteasoma incluyen bortezomib, disulfiram, epigalocatequin-3-galato y salinoesporamida A.
Los ejemplos de inhibidores de quinasa incluyen bevacizumab, BIBW 2992, cetuximab (ERBITUX®), imatinib (GLEEVEC®), trastuzumab (HERc EpTIN®), gefitinib (IRESSA®), ranibizumab (LUCENTIS®), pegaptanib, sorafenib, dasatinib, sunitinib, erlotinib, nilotinib, lapatinib, panitumumab, vandetanib, E7080, pazopanib, mubritinib.
Los ejemplos de glucocorticoides incluyen hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato dee fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA) y aldosterona.
Los ejemplos de retinoides incluyen retinol, retinal, tretinoina (ácido retinoico, RETIN-A®), isotretinoina (ACCUTANE®, AMNESTEEM®, CLARAVIS®, SOTRET®), alitretinoina (PANRETIN®), etretinato (TEGISON™) y su metabolito acitretina (SORIATANE®), tazaroteno (TAz OrAC®, AVAGE®, ZORAC®), bexaroteno (TARGRETIN®), y adapaleno (DIFFERIN®).
Los ejemplos de inhibidores de citoquinas incluyen IL1 ra, antagonista del receptor de IL1, IGFBP, TNF-BF, uromodulina, Alfa-2-Macroglobulina, ciclosporina A, pentamidina y pentoxifilina (PENTOPAK®, PENTOXIL®, TRENTAL®).
Los ejemplos de antagonistas del receptor activado por el proliferador de peroxisomas incluyen GW9662, antagonista III de PPARy, G335, T0070907 (EMD4Biosciences, EE.UU.).
Los ejemplos de agonistas del receptor activado por el proliferador de peroxisomas incluyen pioglitazona, ciglitazona, clofibrato, GW1929, GW7647, L-165,041, LY 171883, activador de PPARy, Fmoc-Leu, troglitazona y WY-14643 (EMD4Biosciences, EE.UU.).
Los ejemplos de inhibidores de histona desacetilasa incluyen ácidos hidroxámicos (o hidroxamatos) tales como tricostatina A, tetrapéptidos cíclicos (tales como trapoxina B) y depsipéptidos, benzamidas, cetonas electrófilas, compuestos de ácido alifático tales como fenilbutirato y ácido valproico, ácidos hidroxámicos tales como vorinostat (Sa Ha ), belinostat (PXD101), LAQ824 y panobinostat (LBH589), benzamidas tales como entinostat (MS-275), CI994 y mocetinostat (MGCD0103), nicotinamida, derivados de NAD, dihidrocumarina, naftopiranona y 2-hidroxinafataldehídos.
Los ejemplos de inhibidores de calcineurina incluyen ciclosporina, pimecrolimus, voclosporina y tacrolimus.
Los ejemplos de inhibidores de fosfatasa incluyen hidrocloruro de BN82002, CP-91149, calculina A, ácido cantarídico, cantaridina, cipermetrina, metil-3,4-defostatina, sal de sodio de fostriecina, MAZ51, metil-3,4-defostatina, NSC 95397, norcantaridina, sal de amonio del ácido okadaico de prorocentrum concavum, ácido okadaico, sal de potasio del ácido okadaico, sal de sodio del ácido okadaico, óxido de fenilarsina, varios cócteles inhibidores de fosfatasa, proteína fosfatasa 1C, proteína inhibidora de proteína fosfatasa 2A, proteína fosfatasa 2A1, proteína fosfatasa 2A2, ortovanadato de sodio.
En algunos casos, los antígenos como se describen en el presente documento también se acoplan a nanoportadores sintéticos. En algunos casos, los antígenos se acoplan a los mismos o diferentes nanoportadores sintéticos a los que se acoplan los inmunosupresores. En otros casos, los antígenos no se acoplan a ningún nanoportador sintético. Los antígenos incluyen cualquiera de los antígenos descritos en el presente documento, o fragmentos o derivados de los mismos, dichos antígenos están asociados con enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias, alergia, rechazo de órganos o tejidos, enfermedad de injerto contra huésped, antígenos de trasplante y antígenos proteicos terapéuticos. Los epítopos, o proteínas, polipéptidos o péptidos que comprenden los epítopos, se pueden obtener o derivar de cualquiera de los antígenos descritos o conocidos de otra manera en la técnica.
Las proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a proteínas terapéuticas infundibles, enzimas, cofactores enzimáticos, hormonas, factores de coagulación de la sangre, citoquinas e interferones, factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales (p. ej., que se administran a un sujeto como terapia de reemplazo), y proteínas asociadas con la enfermedad de Pompe (p. ej., alglucosidasa alfa, rhGAA (p. ej., Myozyme y Lumizyme (Genzyme)). Las proteínas terapéuticas incluyen proteínas implicadas en la cascada de coagulación de la sangre. Las proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a Factor VIII, Factor VII, Factor IX, Factor V, Factor de von Willebrand, Factor de von Heldebrant, activador del plasminógeno tisular, insulina, hormona de crecimiento, eritropoyetina alfa, VEGF, trombopoyetina, lisozima y antitrombina. Las proteínas terapéuticas también incluyen adipoquinas, tales como como leptina y adiponectina. Otros ejemplos de proteínas terapéuticas son como se describe a continuación y en otra parte del presente documento. También están incluidos fragmentos o derivados de cualquiera de las proteínas terapéuticas.
Los ejemplos de proteínas terapéuticas usadas en la terapia de reemplazo enzimático de sujetos que tienen un trastorno de almacenamiento lisosómico incluyen, pero no se limitan a imiglucerasa para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher (p. ej., CEREZYME™), a-galactosidasa A (a-gal A) para el tratamiento de la enfermedad de Fabry (p. ej., agalsidasa beta, FABRYZYME™), ácido a-glucosidasa (GAA) para el tratamiento de la enfermedad de Pompe (p. ej., alglucosidasa alfa, LUMIz Ym E™, MYOZYME™), arilsulfatasa B para el tratamiento de mucopolisacaridosis (p. ej., laronidasa, ALDu Ra ZYME™, idursulfasa, ELAPRASE™, arilsulfatasa B, NAGLAZYME™).
Los ejemplos de enzimas incluyen oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.
Los ejemplos de hormonas incluyen melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina), serotonina, tiroxina (o tetrayodotironina) (una hormona tiroidea), triyodotironina (una hormona tiroidea), epinefrina (o adrenalina), norepinefrina (o noradrenalina), dopamina (u hormona inhibidora de la prolactina), hormona antimulleriana (o factor u hormona inhibidora de la mulleriana), adiponectina, hormona adrenocorticotrópica (o corticotropina), angiotensinógeno y angiotensina, hormona antidiurética (o vasopresina, arginina vasopresina), péptido atrial-natriurético (o atriopeptina), calcitonina, colecistoquinina, hormona liberadora de corticotropina, eritropoyetina, hormona foliculoestimulante, gastrina, grelina, glucagón, péptido similar al glucagón (GLP-1), GIP, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona de crecimiento, gonadotropina coriónica humana, lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, factor de crecimiento similar a insulina (o somatomedina), leptina, hormona luteinizante, hormona estimuladora de melanocitos, orexina, oxitocina, hormona paratiroidea, prolactina, relaxina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimuladora de tiroides (o tirotropina), hormona liberadora de tirotropina, cortisol, aldosterona, testosterona, deshidroepiandrosterona, androstenodiona, dihidrotestosterona, estradiol, estrona, estriol, progesterona, calcitriol (1,25-dihidroxivitamina D3), calcidiol (25-hidroxivitamina D3), prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, hormona liberadora de prolactina, lipotropina, péptido natriurético cerebral, neuropéptido Y, histamina, endotelina, polipéptido pancreático, renina y encefalina.
Ejemplos de factores de sanguíneos y de coagulación sanguínea incluyen factor I (fibrinógeno), factor II (protrombina), factor tisular, factor V (proacelerina, factor lábil), factor VII (factor estable, proconvertina), factor VIII (globulina antihemofílica), factor IX (Factor Christmas o componente de tromboplastina plasmática), factor X (factor Stuart-Prower), factor Xa, factor XI, factor XII (factor Hageman), factor XIII (factor estabilizador de fibrina), factor de von Willebrand, precalicreína (factor Fletcher), quininógeno de alto peso molecular (HMWK) (factor de Fitzgerald), fibronectina, fibrina, trombina, antitrombina III, cofactor II de heparina, proteína C, proteína S, proteína Z, inhibidor de la proteasa relacionada con la proteína Z (ZPI), plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador del plasminógeno tisular (tPA), uroquinasa, inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI1), inhibidor del activador del plasminógeno-2 (PAI2), procoagulante del cáncer y epoetina alfa (Epogen, Procrit).
Los ejemplos de citoquinas incluyen linfoquinas, interleuquinas y quimioquinas, citoquinas tipo 1, tales como IFN-y, TGF-p y citoquinas tipo 2, tales como IL-4, IL-10 e IL-13.
Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen adrenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), factor de diferenciación de crecimiento-9 (GDF9), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor estimulante de la migración, miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF) y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ruta de señalización Wnt, factor de crecimiento placentario (P1GF), [(somatotrofina bovina fetal)] (FBS), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-7.
Los ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen Abagovomab, Abciximab, Adalimumab, Adecatumumab, Afelimomab, Afutuzumab, Alacizumab pegol, ALD, Alemtuzumab, Altumomab pentetate, Anatumomab mafenatox, Anrukinzumab, globina antitimocítica, Apolizumab, Arcitumomab, Aselizumab, Atlizumab (tocilizumab), Atorolimumab, Bapineuzumab, Basiliximab, Bavituximab, Bectumomab, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Biciromab, Bivatuzumab mertansina, Blinatumomab, Brentuximab vedotina, Briakinumab, Canakinumab, Cantuzumab mertansina, Capromab pendetida, Catumaxomab, Cedelizumab, Certolizumab pegol, Cetuximab, Citatuzumab bogatox, Cixutumumab, Clenoliximab, Clivatuzumab tetraxetano, Conatumumab, Dacetuzumab, Daclizumab, Daratumumab, Denosumab, Detumomab, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, Ecromeximab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Elotuzumab, Elsilimomab, Enlimomab pegol, Epitumomab cituxetano, Epratuzumab, Erlizumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Exbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab, Farletuzumab, Felvizumab, Fezakinumab, Figitumumab, Fontolizumab, Foravirumab, Fresolimumab, Galiximab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab ozogamicina, GC1008, Girentuximab, Glembatumumab vedotina, Golimumab, Gomiliximab, Ibalizumab, Ibritumomab tiuxetano, Igovomab, Imciromab, Infliximab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab ozogamicina, Ipilimumab, Iratumumab, Keliximab, Labetuzumab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lerdelimumab, Lexatumumab, Libivirumab, Lintuzumab, Lorvotuzumab mertansina, Lucatumumab, Lumiliximab, Mapatumumab, Maslimomab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mitumomab, Morolimumab, Motavizumab, Muromonab-CD3, Nacolomab tafenatox, Naptumomab estafenatox, Natalizumab, Nebacumab, Necitumumab, Nerelimomab, Nimotuzumab, Nofetumomab merpentano, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Omalizumab, Oportuzumab monatox, Oregovomab, Otelixizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Panitumumab, Panobacumab, Pascolizumab, Pemtumomab, Pertuzumab, Pexelizumab, Pintumomab, Priliximab, Pritumumab, Rafivirumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raxibacumab, Regavirumab Reslizumab, Rilotumumab, Rituximab, Robatumumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Satumomab pendetida, Sevirumab, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuximab, Siplizumab, Solanezumab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulesomab, Tacatuzumab tetraxetan, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab paptox, Tefibazumab, Telimomab aritox, Tenatumomab, Teneliximab, Teplizumab, Ticilimumab (tremelimumab), Tigatuzumab, Tocilizumab (atlizumab), Toralizumab, Tositumomab, Trastuzumab, Tremelimumab, Tucotuzumab celmoleukin, Tuvirumab, Urtoxazumab, Ustekinumab, Vapaliximab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab, Visilizumab, Volociximab, Votumumab, Zalutumumab, Zanolimumab, Ziralimumab, y Zolimomab aritox.
Los ejemplos de proteínas de terapia de infusión o terapéuticas inyectables incluyen, por ejemplo, Tocilizumab (Roche/Actemra®), alfa-1 antitripsina (Kamada/AAT), Hematide® (Affymax y Takeda, péptido sintético), albinterferón alfa-2b (Novartis/Zalbin™), Rhucin® (Pharming Group, terapia de reemplazo de inhibidor C1), tesamorelina (Theratechnologies/Egrifta, factor de liberación de homrona de crecimiento sintético), ocrelizumab (Genentech, Roche and Biogen), belimumab (GlaxoSmithKline/Benlysta®), pegloticasa (Savient Pharmaceuticals/Krystexxa™), taliglucerasa alfa (Protalix/Uplyso), agalsidasa alfa (Shire/Replagal®), velaglucerasa alfa (Shire).
Las proteínas terapéuticas útiles adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, y la invención no está limitada a este respecto.
En algunos casos, se puede aislar un componente, tal como un antígeno o inmunosupresor. Aislado se refiere al elemento que se separa de su entorno natural y está presente en cantidades suficientes para permitir su identificación o uso. Esto significa, por ejemplo, que el elemento se ser (i) producir selectivamente por clonación de expresión o (ii) purificar como por cromatografía o electroforesis. Los elementos aislados pueden ser, pero no necesariamente, sustancialmente puros. Debido a que un elemento aislado se puede mezclar con un excipiente farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el elemento puede comprender solo un pequeño porcentaje en peso de la preparación. No obstante, el elemento está aislado porque se ha separado de las sustancias con las que puede estar asociado en sistemas vivos, es decir, aislado de otros lípidos o proteínas. Se puede incluir cualquiera de los elementos descritos en el presente documento en las composiciones en forma aislada.
D. Métodos para hacer y usar composiciones y métodos relacionados
Los nanoportadores sintéticos se pueden preparar usando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los nanoportadores sintéticos se pueden formar por métodos como la nanoprecipitación, enfoque de flujo usando canales fluídicos, secado por atomización, evaporación de disolventes de emulsión simple y doble, extracción de disolventes, separación de fases, molienda, procedimientos de microemulsión, microfabricación, nanofabricación, capas sacrificiales, coacervación simple y compleja y otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Alternativa o adicionalmente, se han descrito síntesis en disolventes acuosos y orgánicos para nanomateriales semiconductores monodispersos, conductores, magnéticos, orgánicos y otros (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; y Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). Se han descrito métodos adicionales en la bibliografía (véase, p. ej., Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; y Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; patentes de EE.UU. 5578325 y 6007845; P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).
Se pueden encapsular diversos materiales en nanoportadores sintéticos según sea deseable usando una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pág. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Se pueden usar otros métodos adecuados para encapsular materiales en nanoportadores sintéticos, incluyendo sin limitación métodos descritos en la patente de EE.u U. 6.632.671 de Unger 14 de octubre de 2003.
En ciertos casos, los nanoportadores sintéticos se preparan por un procedimiento de nanoprecipitación o secado por atomización. Las condiciones usadas en la preparación de nanoportadores sintéticos se pueden alterar para producir partículas de un tamaño o propiedad deseados (p. ej., hidrofobicidad, hidrofilicidad, morfología externa, "adherencia", forma, etc.). El método de preparación de los nanoportadores sintéticos y las condiciones (p. ej., disolvente, temperatura, concentración, caudal de aire, etc.) usados pueden depender de los materiales que se van a acoplar a los nanoportadores sintéticos y/o la composición de la matriz polimérica.
Si las partículas preparadas por cualquiera de los métodos anteriores tienen un intervalo de tamaños fuera del intervalo deseado, las partículas se pueden ajustar de tamaño, por ejemplo, usando un tamiz.
Los elementos (es decir, los componentes) de los nanoportadores sintéticos (tales como restos de los que se compone una superficie de inmunocaracterización, restos dirigidos, matrices poliméricas, antígenos e inmunosupresores) se pueden acoplar al nanoportador sintético general, p. ej., mediante uno o más enlaces covalentes, o se pueden acoplar por medio de uno o más conectores. Se pueden adaptar métodos adicionales para funcionalizar nanoportadores sintéticos de la solicitud de patente de EE.UU. publicada2006/0002852 de Saltzman et al., solicitud de patente de EE.UU. publicada 2009/0028910 a DeSimone et al. o solicitud de patente internacional publicada WO/2008/127532 A1 de Murthy et al.
Alternativa o adicionalmente, los nanoportadores sintéticos se pueden acoplar a componentes directa o indirectamente a través de interacciones no covalentes. En casos no covalentes, el acoplamiento no covalente es mediado por interacciones no covalentes que incluyen, pero no se limitan interacciones de carga, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones hospedante-huésped, interacciones hidrófobas, interacciones de apilamiento TT, interacciones de enlace de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de las mismas. Dichos acoplamientos pueden estar dispuestos para estar sobre una superficie externa o una superficie interna de un nanoportador sintético. La encapsulación y/o absorción es una forma de acoplamiento. Los nanoportadores sintéticos se pueden combinar con antígenos mezclándolos en el mismo vehículo o sistema de suministro.
Las poblaciones de nanoportadores sintéticos se pueden combinar para formar formas farmacéuticas usando métodos de mezclamiento farmacéuticos tradicionales. Estos incluyen el mezclamiento líquido-líquido en el que dos o más suspensiones, conteniendo cada una uno o más subconjuntos de nanoportadores, se combinan directamente o se llevan juntas mediante uno o más recipientes que contienen diluyente. Puesto que los nanoportadores sintéticos también se pueden producir o almacenar en forma de un polvo, se podría realizar la mezcla de polvo-polvo seco al igual que la resuspensión de dos o más polvos en un medio común. Dependiendo de las propiedades de los nanoportadores y sus potenciales interacciones, puede haber ventajas conferidas a una u otra ruta de mezclamiento.
Las composiciones típicas que comprenden nanoportadores sintéticos pueden comprender tampones inorgánicos u orgánicos (p. ej., sales de sodio o potasio de fosfato, carbonato, acetato o citrato) y agentes de ajuste del pH (p. ej., ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o potasio, sales de citrato o acetato, aminoácidos y sus sales) antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, alfa-tocoferol), tensioactivos (p. ej., polisorbato 20, polisorbato 80, polioxietilen9-10 nonilfenol, desoxicolato de sodio), estabilizantes de solución y/o de crio/lio-estabilizantes (p. ej., sacarosa, lactosa, manitol, trehalosa), agentes de ajuste osmótico (p. ej., sales o azúcares), agentes antibacterianos (p. ej., ácido benzoico, fenol, gentamicina), agentes antiespumantes (p. ej., polidimetilsilozona), conservantes (p. ej., timerosal, 2-fenoxietanol, EDTA), estabilizantes poliméricos y agentes de ajuste de la viscosidad (p. ej., polivinilpirrolidona, poloxámero 488, carboximetilcelulosa) y codisolventes (p. ej., glicerol, polietilenglicol, etanol).
Las composiciones pueden comprender nanoportadores sintéticos en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones se pueden preparar usando técnicas convencionales de fabricación y composición farmacéutica para llegar a formas farmacéuticas útiles. Se pueden encontrar técnicas adecuadas en Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, editado por Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng y Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; y Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2a Ed. Editado por ME Auten, 2001, Churchill Livingstone.
Debe entenderse que las composiciones de la invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada, y la invención no se limita de ninguna manera a las composiciones que se pueden producir usando los métodos descritos en el presente documento. La selección de un método adecuado puede requerir atención a las propiedades de los restos particulares que se asocian.
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos se fabrican en condiciones estériles o se esterilizan terminalmente. Esto puede garantizar que las composiciones resultantes sean estériles y no infecciosas, mejorando así la seguridad en comparación con las composiciones no estériles. Esto proporciona una valiosa medida de seguridad, especialmente cuando los sujetos que reciben nanoportadores sintéticos tienen defectos del sistema inmunitario, padecen infección y/o son susceptibles a la infección. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos se pueden liofilizar y almacenar en suspensión o como polvo liofilizado, dependiendo de la estrategia de formulación durante períodos prolongados sin perder actividad.
Las composiciones se pueden administrar por una variedad de rutas, que incluyen, pero no se limitan a subcutánea, intranasal, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transmucosa, transmucosa, sublingual, rectal, oftálmica, pulmonar, intradérmica, transdérmica, transcutánea o intradérmica o por una combinación de estas rutas. Las vías de administración también incluyen la administración por inhalación o aerosol pulmonar. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para preparar sistemas de suministro de aerosoles (véase, por ejemplo, Sciarra y Cutie, "Aerosols", en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, 1990, págs. 1694-1712).
Los injertos trasplantables o las proteínas terapéuticas descritas como una terapia basada en células se pueden administrar por administración parenteral, intraarterial, intranasal o intravenosa o por inyección en los ganglios linfáticos o la cámara anterior del ojo o por administración local a un órgano o tejido de interés. La administración puede ser por inyección subcutánea, intratecal, intraventricular, intramuscular, intraperitoneal, intracoronaria, intrapancreática, intrahepática o bronquial.
Las composiciones se pueden administrar en cantidades efectivas, tales como las cantidades efectivas descritas en otra parte del presente documento. Las dosis de las formas farmacéuticas contienen cantidades variables de poblaciones de nanoportadores sintéticos y/o cantidades variables de antígenos y/o inmunosupresores. La cantidad de nanoportadores sintéticos y/o antígenos y/o inmunosupresores presentes en las formas farmacéuticas se puede variar de acuerdo con la naturaleza de los antígenos y/o inmunosupresores, el beneficio terapéutico que se va a lograr y otros parámetros similares. Se pueden llevar a cabo estudios de determinación de dosis para establecer la cantidad terapéutica óptima de la población de nanoportadores sintéticos y la cantidad de antígenos y/o inmunosupresores que deben estar presentes en la forma farmacéutica. Los nanoportadores sintéticos y/o los antígenos y/o inmunosupresores están presentes en la forma farmacéutica en una cantidad efectiva para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica frente a los antígenos tras la administración a un sujeto. Puede ser posible determinar cantidades de los antígenos y/o inmunosupresores efectivos para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica usando estudios y técnicas de convencionales intervalos de la dosis en sujetos. Las formas farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de frecuencias. Al menos una administración de la forma farmacéutica puede ser suficiente para generar una respuesta farmacológicamente relevante. En los casos más preferidos, se utilizan al menos dos administraciones, al menos tres administraciones, o al menos cuatro administraciones, de la forma farmacéutica para asegurar una respuesta farmacológicamente relevante.
La administración profiláctica de las composiciones se puede iniciar antes del inicio de la enfermedad, trastorno o afección o la administración terapéutica se puede iniciar después de que se establece un trastorno, trastorno o afección.
En algunos casos, la administración de nanoportadores sintéticos se lleva a cabo, p. ej., antes de la administración de una proteína terapéutica, injerto trasplantable o exposición a un alergeno. En casos ilustrativos, los nanoportadores sintéticos se administran una o más veces que incluyen, pero no se limitan a 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 días antes de la administración de una proteína terapéutica, injerto trasplantable o exposición a un alergeno. Además, o alternativamente, se pueden administrar nanoportadores sintéticos a un sujeto después de la administración de una proteína terapéutica, injerto trasplantable o exposición a un alergeno. En casos ilustrativos, los nanoportadores sintéticos se administran una o más veces, incluyendo, pero no limitado a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, etc. días después de la administración de una proteína terapéutica, injerto trasplantable o exposición a un alergeno.
En algunos casos, una dosis de mantenimiento (p. ej., de una composición de nanoportador sintético descrita en el presente documento) se administra a un sujeto después de que una administración inicial haya dado como resultado una respuesta tolerogénica en el sujeto, por ejemplo para mantener el efecto tolerogénico logrado después de la dosis inicial, para prevenir una reacción inmunitaria no deseada en el sujeto, o para prevenir que el sujeto se convierta en un sujeto en riesgo de experimentar una respuesta inmunitaria no deseada o un nivel no deseado de una respuesta inmunitaria. En algunos casos, la dosis de mantenimiento es la misma dosis que la dosis inicial que recibió el sujeto. En algunos casos, la dosis de mantenimiento es una dosis más baja que la dosis inicial. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis de mantenimiento es de aproximadamente 3/4, aproximadamente 2/3, aproximadamente 1/2, aproximadamente 1/3, aproximadamente 1/4, aproximadamente 1/8, aproximadamente 1/10, aproximadamente 1/20, aproximadamente 1/25, aproximadamente 1/50, aproximadamente 1/100, aproximadamente 1/1.000, aproximadamente 1/10.000, aproximadamente 1/100.000 o aproximadamente 1/1.000.000 (peso/peso) de la dosis inicial.
Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden usar para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria tolerogénica y/o para suprimir, modular, dirigir o redirigir una respuesta inmunitaria no deseada con el propósito de la inmunosupresión. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden usar en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones en las que la inmunosupresión (p. ej., la respuesta inmunitaria tolerogénica) conferiría un beneficio al tratamiento. Dichas enfermedades, trastornos o afecciones incluyen enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, alergias, rechazo de órganos o tejidos y enfermedad de injerto contra huésped. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento también se pueden usar en sujetos que se han sometido o se someterán a trasplante. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento también se pueden usar en sujetos que han recibido, están recibiendo o recibirán una proteína terapéutica contra la cual han generado o se espera que generen una respuesta inmunitaria no deseada.
Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, entre otras, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus inmunomediada o tipo I, enfermedad inflamatoria intestinal (p. ej., enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), lupus eritematoso sistémico, psoriasis, esclerodermia, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, alopecia areata, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad celíaca, síndrome de Sjogren, fiebre reumática, gastritis, gastritis atrófica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, insulitis, ooforitis, orquitis, uveítis, uveítis facogénica, miastenia grave, mixedema primario, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, nefritis, por ejemplo, glomerulonefritis, psoriasis, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmia simpática, púrpura trombocitopénica idiopática, feucopenia idiopática, granulomatosis de Wegener y poli/dermatomiositis.
Algunas enfermedades autoinmunitarias de ejemplo adicionales, autoantígenos asociados y autoanticuerpos, que están contemplados para usar en la invención, se describen en la siguiente tabla 1:
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Las enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a Alzheimer, artritis, asma, aterosclerosis, enfermedad de Crohn, colitis, fibrosis quística, dermatitis, diverticulitis, hepatitis, síndrome del intestino irritable (SII), lupus eritematoso, distrofia muscular, nefritis, Parkinson, herpes y colitis ulcerosa. Las enfermedades inflamatorias también incluyen, por ejemplo, enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), bronquiectasia, colecistitis crónica, tuberculosis, tiroiditis de Hashimoto, sepsis, sarcoidosis, silicosis y otras neumoconiosis, y un cuerpo extraño implantado en una herida, pero no están limitadas. Como se usa en el presente documento, el término "sepsis" se refiere a un síndrome clínico bien reconocido asociado con la respuesta inflamatoria sistémica del hospedante a la invasión microbiana. El término "sepsis" como se usa en el presente documento se refiere a una afección que típicamente está caracterizada por fiebre o hipotermia, taquicardia y taquipnea, y en casos graves puede evolucionar a hipotensión, disfunción de órganos e incluso la muerte.
En algunos casos, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria intestinal no autoinmunitaria, adherencias posquirúrgicas, enfermedad arterial coronaria, fibrosis hepática, síndrome de dificultad respiratoria aguda, pancreatitis inflamatoria aguda, pancreatitis inducida por colangiopancreatografía retrógrada endoscópica, quemaduras, aterogénesis de arterias coronaria, cerebral y periféricas, apendicitis, colecistitis, diverticulitis, trastornos fibróticos viscerales, cicatrización de heridas, trastornos de cicatrización de la piel (queloides, hidradenitis supurativa), trastornos granulomatosos (sarcoidosis, cirrosis biliar primaria), asma, pioderma gangrenoso, síndrome de Sweet, enfermedad de Behcet, colangitis esclerosante primaria o un absceso. En algunos casos preferidos, la enfermedad inflamatoria es la enfermedad inflamatoria intestinal (p. ej., enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa).
En otros casos, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad autoinmunitaria. La enfermedad autoinmunitaria en algunos casos es artritis reumatoide, fiebre reumática, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal autoinmunitaria, diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus, diabetes juvenil, diabetes autoinmunitaria espontánea, gastritis, gastritis atrófica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, insulitis, ooforitis, orquitis, uveítis, uveítis facogénica, esclerosis múltiple, miastenia gravis, mixedema primario, tirotoxicosis, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Graves, glomerulonefritis, psoriasis, pénfigo vulgar, penfigoide, eccema, pénfigo ampolloso, oftalmia simpática, púrpura trombocitopénica idiopática, feucopenia idiopática, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica, granulomatosis de Wegener, poli/dermatomiositis, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, lupus o lupus eritematoso sistémico.
La enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) es una complicación que puede ocurrir después de un trasplante de células pluripotentes (p. ej., células madre) o de médula ósea en el que el material recién trasplantado da como resultado un ataque en el cuerpo del receptor del trasplante. En algunos casos, la GVHD ocurre después de una transfusión de sangre. La enfermedad de injerto contra huésped se puede dividir en formas agudas y crónicas. La forma aguda o fulminante de la enfermedad (aGVHD) se observa normalmente dentro de los primeros 100 días después del trasplante, y es un desafío importante para los trasplantes debido a la morbilidad y mortalidad asociadas. La forma crónica de la enfermedad de injerto contra huésped (cGVHD) normalmente ocurre después de 100 días. La aparición de casos moderados a graves de cGVHD influye negativamente en la supervivencia a largo plazo.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos contienen ejemplos de referencia, que ilustran una serie de desarrollos distintos y adicionales que se describen en la Descripción técnica de referencia anterior y la Descripción detallada, pero que no se presentan o reivindican como la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1: Respuesta inmunitaria de nanoportadores sintéticos con rapamicina acoplada con y sin péptido de ovoalbúmina (323-339)
Materiales
El péptido de ovoalbúmina 323-339, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de células T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió de Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte n° 4065609). La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Catálogo de productos n° R1017). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió de EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Solución 1: péptido de ovoalbúmina 323-33920 mg/ml en solución acuosa diluida de ácido clorhídrico. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente.
Solución 2: rapamicina 50 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo rapamicina en cloruro de metileno puro.
Solución 3: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro.
Solución 4: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Método para preparar nanoportador sintético que contiene rapamicina y ovoalbúmina (323-339)
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 combinando la solución 1 (0,2 ml), la solución 2 (0,2 ml) y la solución 3 (1,0 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 4 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando el Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución de tampón de fosfato a pH 8 70 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores sintéticos. Una porción de los nanoportadores sintéticos se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores sintéticos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 21.000xg y 4°C durante una hora, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y se volvió a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores sintéticos de aproximadamente 10 mg/ml.
Las cantidades de péptido y rapamicina en los nanoportadores sintéticos se determinaron por análisis por HPLC. La masa total del nanoportador sintético seco por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Método para nanoportadores sintéticos que contienen rapamicina
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. La AG1/AC1 se preparó combinando una solución de ácido clorhídrico 0,13 M (0,2 ml), la solución 2 (0,2 ml) y la solución 3 (1,0 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 4 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando el Branson Digital Sonifier 250
La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución de tampón de fosfato a pH 8 70 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores sintéticos. Una porción de los nanoportadores sintéticos se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores sintéticos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 21.000xg y 4°C durante una hora, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y se volvió a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores sintéticos de aproximadamente 10 mg/ml.
La cantidad de rapamicina en el nanoportador sintético se determinó por análisis por HPLC. La masa total del nanoportador sintético seco por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Método para medir la carga de rapamicina
Se recogieron y centrifugaron aproximadamente 3 mg de nanoportadores sintéticos para separar el líquido sobrenadante del sedimento de nanoportadores sintéticos. Se añadió acetonitrilo al sedimento, y la muestra se trató con ultrasonidos y se centrifugó para eliminar cualquier material insoluble. El líquido sobrenadante y el sedimento se inyectaron en RP-HPLC y se leyó la absorbancia a 278 nm. Los pg encontrados en el sedimento se usaron para calcular el % atrapado (carga), los pg en el líquido sobrenadante y el sedimento se usaron para calcular el total de pg recuperados.
Método para medir la carga de ovoalbúmina (323-339)
Se recogieron y centrifugaron aproximadamente 3 mg de nanoportadores sintéticos para separar el líquido sobrenadante del sedimento de nanoportadores sintéticos. Se añadió trifluoroetanol al sedimento y la muestra se trató con ultrasonidos para disolver el polímero, se añadió ácido trifluoroacético al 0,2% y la muestra se trató con ultrasonidos y después se centrifugó para eliminar cualquier material insoluble. El líquido sobrenadante y el sedimento se inyectaron en RP-HPLC y se leyó la absorbancia a 215 nm. Los gg encontrados en el sedimento se usaron para calcular el % atrapado (carga), los gg en el líquido sobrenadante y el sedimento se usaron para calcular el total de gg recuperados.
Actividad de células dendríticas tolerogénicas específicas de antígeno (Tdc) en el desarrollo de células Treg
El ensayo incluía el uso de ratones OTII que tienen un receptor de células T transgénico específico para una ovoalbúmina inmunodominante (323-339). Con el fin de crear tDC específicas de antígeno, se aislaron esplenocitos CD11c+, y el péptido de ovoalbúmina (323-339) se añadió in vitro en 1 gg/ml o sin antígeno. Después se añadió rapamicina soluble o encapsulada en nanoportador a las DC durante 2 horas, que después se lavaron extensamente para eliminar la rapamicina libre del cultivo. Las células CD4+CD25- que respondían purificadas se aislaron de ratones OTII y se añadieron a tDC en una relación 10:1 de T a DC. Después la mezcla de células tDC y T de OTII se cultivaron durante 4-5 días, y la frecuencia de células Treg (CD4+CD25highFoxP3+) se analizó por citometría de flujo como se muestra en Figura 1. Las regiones se seleccionaron basándose en los controles de isotipo.
Ejemplo de referencia 2: nanopartículas de sílice mesoporosa con ibuprofeno acoplado (predictivo)
Los núcleos de nanopartículas de SiO2 mesoporosos se crean mediante un procedimiento de sol-gel. Se disuelve bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) (0,5 g) en agua desionizada (500 ml), y después se añade solución acuosa de NaOH 2 M (3,5 ml) a la solución de CTAB. La solución se agita durante 30 minutos, y después se añade tetraetoxisilano (TEOS) (2,5 ml) a la solución. El gel resultante se agita durante 3 h a una temperatura de 80°C. El precipitado blanco que se forma se captura por filtración, seguido de lavado con agua desionizada y secado a temperatura ambiente. El tensioactivo que queda se extrae después de las partículas por suspensión en una solución etanólica de HCl durante la noche. Las partículas se lavan con etanol, se centrifugan y se vuelven a dispersar con ultrasonidos. Este procedimiento de lavado se repite dos veces más.
Después, las nanopartículas de SiO2 se funcionalizan con grupos amino usando (3-aminopropil)-trietoxisilano (APTMS). Para hacer esto, las partículas se suspenden en etanol (30 ml) y se añade APTMS (50 gl) a la suspensión. La suspensión se deja reposar a temperatura ambiente durante 2 h y después se hierve durante 4 h, manteniendo constante el volumen añadiendo periódicamente etanol. Los reactivos restantes se eliminan mediante cinco ciclos de lavado por centrifugación y redispersión en etanol puro.
En una reacción separada, se crean semillas de oro de 1-4 nm de diámetro. Toda el agua usada en esta reacción se desioniza primero y después se destila del vidrio. Se añade agua (45,5 ml) a un matraz de fondo redondo de 100 ml. Mientras se agita, se añade solución acuosa de NaOH 0,2 M (1,5 ml), seguido de una solución acuosa al 1 % de cloruro de tetrakis(hidroximetil)fosfonio (THPC) (1,0 ml). Dos minutos después de la adición de la solución de THPC, se añade una solución acuosa de 10 mg/ml de ácido cloroaúrico (2 ml), que ha envejecido al menos 15 minutos. Las semillas de oro se purifican mediante diálisis contra agua.
Para formar los nanoportadores de núcleo-cubierta, las nanopartículas de SiO2 funcionalizadas con amino formadas anteriormente se mezclan primero con las semillas de oro durante 2 h a temperatura ambiente. Las partículas de SiO2 decoradas con oro se recogen por centrifugación y se mezclan con una solución acuosa de ácido cloroaúrico y bicarbonato de potasio para formar la cubierta de oro. Las partículas después se lavan por centrifugación y se vuelven a dispersar en agua. El ibuprofeno se carga suspendiendo las partículas en una solución de ibuprofeno de sodio (1 mg/l) durante 72 h. El ibuprofeno libre se lava después de las partículas por centrifugación y redispersión en agua.
Ejemplo de referencia 3: liposomas que contienen ciclosporina A (predictivo)
Los liposomas se forman usando hidratación de película delgada. Se disuelven 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (32 gmol), colesterol (32 gmol) y ciclosporina A (6,4 gmol) en cloroformo puro (3 ml). Esta solución lipídica se añade a un matraz de fondo redondo de 50 ml, y el disolvente se evapora en un evaporador rotatorio a una temperatura de 60°C. Después el matraz se lava por barrido con nitrógeno gaseoso para eliminar el disolvente restante. Se añaden solución salina tamponada con fosfato (2 ml) y cinco perlas de vidrio al matraz, y la película lipídica se hidrata agitando a 60°C durante 1 h para formar una suspensión. La suspensión se transfiere a un pequeño tubo de presión y se trata con ultrasonidos a 60°C durante cuatro ciclos de pulsos de 30 s con un retardo de 30 s entre cada pulso. Después la suspensión se deja sin perturbar a temperatura ambiente durante 2 h para permitir una hidratación completa. Los liposomas se lavan por centrifugación seguido de resuspensión en solución salina tamponada con fosfato de nueva aportación.
Ejemplo de referencia 4: nanoportador polimérico que contiene conjugado de polímero-rapamicina (predictivo)
Preparación del conjugado de PLGA-rapamicina:
El polímero PLGA con grupo final ácido (7525 DLG1A, índice de ácido 0,46 mmol/g, Lakeshore Biomaterials; 5 g, 2,3 mmol, 1,0 eq) se disuelve en 30 ml de diclorometano (DCM). Se añade N,N-diciclohexilcarbodimida (1,2 eq, 2,8 mmol, 0,57 g) seguido de rapamicina (1,0 eq, 2,3 mmol, 2,1 g) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (2,0 eq, 4,6 mmol, 0,56 g). La mezcla se agita a t.a. durante 2 días. La mezcla después se filtra para eliminar la diciclohexilurea insoluble. El filtrado se concentra hasta aproximadamente 10 ml en volumen y se añade a 100 ml de alcohol isopropílico (IPA) para precipitar el conjugado de PLGA-rapamicina. Se retira la capa de IPA y después el polímero se lava con 50 ml de IPA y 50 ml de metil t-butil éter (MTBE). Después, el polímero se seca a vacío a 35°C durante 2 días para dar PLGA-rapamicina como un sólido blanco (aproximadamente 6,5 g).
Preparación de nanoportador que contiene conjugado de PLGA-rapamicina y péptido de ovoalbúmina (323-339):
El nanoportador que contiene PLGA-rapamicina se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 1 de la siguiente manera:
Las soluciones para la formación del nanoportador se preparan de la siguiente manera:
Solución 1: péptido de ovoalbúmina 323-33920 mg/ml en solución acuosa diluida de ácido clorhídrico. La solución se prepara disolviendo el péptido de ovoalbúmina en solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente. Solución 2: PLGA-rapamicina 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo PLGA-rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM pH 8.
Primero se prepara una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se prepara combinando la solución 1 (0,2 ml), la solución 2 (0,75 ml) y la solución 3 (0,25 ml) en un pequeño tubo de presión y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. A La emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) se prepara combinando la solución 4 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos con el Branson Digital Sonifier 250. La emulsión AG1/AC1/AG2 se añade a un vaso de precipitados que contiene una solución tampón de fosfato a pH 870 mM (30 ml) y se agita a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evapore el cloruro de metileno y se formen los nanoportadores. Una parte de los nanoportadores se lava transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 35 min, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repite el procedimiento de lavado y se vuelve a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
Ejemplo de referencia 5: Preparación de nanoportadores de oro (AuNC) que contienen rapamicina (predictivo)
Preparación de HS-PEG-rapamicina:
Una solución de disulfuro de ácido PEG (1,0 eq), rapamicina (2,0-2,5 eq), DCC (2,5 eq) y DMAP (3,0 eq) en DMF seca se agita a t.a. durante la noche. La diciclohexilurea insoluble se elimina por filtración y el filtrado se añade a alcohol isopropílico (IPA) para precipitar el éster de PEG-disulfuro-di-rapamicina y se lava con IPA y se seca. El polímero se trata después con hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina en DMF para reducir el disulfuro de PEG a éster de tiol PEG rapamicina (HS-PEG-rapamicina). El polímero resultante se recupera por precipitación en IPA y se seca como se ha descrito previamente y se analiza por RMN de H y GPC.
Formación de NC de oro (AuNC):
Una solución acuosa de 500 ml de HAuCl4 1 mM se calienta a reflujo durante 10 min con agitación vigorosa en un matraz de fondo redondo de 1 litro equipado con un refrigerante. Después se añade rápidamente a la solución en agitación una solución de 50 ml de citrato trisódico 40 mM. La solución de color rojo vino oscuro resultante se mantiene a reflujo durante 25-30 minutos y se retira el calor, y la solución se enfría a temperatura ambiente. La solución después se filtra a través de un filtro de membrana de 0,8 gm para dar la solución de AuNC. Los AuNC se caracterizan por espectroscopía visible y microscopía electrónica de transmisión. Los AuNC tienen aproximadamente 20 nm de diámetro terminados por citrato con absorción máxima a 520 nm.
Los AuNC se conjugan con HS-PEG-rapamicina:
Se añade una solución de 150 gl de HS-PEG-rapamicina (10 gM en tampón de carbonato a pH 9,0 10 mM) a 1 ml de nanoportadores de oro terminados en citrato de 20 nm de diámetro (1,16 nM) para producir una relación molar de tiol a oro de 2500:1. La mezcla se agita a temperatura ambiente en atmósfera argón durante 1 hora para permitir el intercambio completo de tiol con citrato en los nanoportadores de oro. Los AuNC con PEG-rapamicina en la superficie se purifican después por centrifugación a 12.000 g durante 30 minutos. El líquido sobrenadante se decanta y el sedimento que contiene AuNC-S-PEG-rapamicina después se lava con un tampón 1x PBS. Los nanoportadores de Oro-PEG-rapamicina purificados después se vuelven a suspender en un tampón adecuado para su posterior análisis y bioensayos.
Ejemplo de referencia 6: Nanoportadores de núcleo-cubierta de sílice mesoporosa-oro que contienen ovoalbúmina (predictivo)
Los núcleos de nanopartículas de SiO2 mesoporosas se crean por un procedimiento de sol-gel. El bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) (0,5 g) se disuelve en agua desionizada (500 ml), y después se añade solución acuosa de NaOH 2 M (3,5 ml) a la solución de CTAB. La solución se agita durante 30 minutos, y después se añade tetraetoxisilano (TEOS) (2,5 ml) a la solución. El gel resultante se agita durante 3 h a una temperatura de 80°C. El precipitado blanco que se forma es capturado por filtración, seguido de lavado con agua desionizada y secado a temperatura ambiente. El tensioactivo restante después se extrae de las partículas por suspensión en una solución etanólica de HCl durante la noche. Las partículas se lavan con etanol, se centrifugan y se vuelven a dispersar con ultrasonidos. Este procedimiento de lavado se repite dos veces más.
Las nanopartículas de SiO2 después se funcionalizan con grupos amino usando (3-aminopropil)-trietoxisilano (APTMS). Para hacer esto, las partículas se suspenden en etanol (30 ml) y se añade APTMS (50 pl) a la suspensión. La suspensión se deja reposar a temperatura ambiente durante 2 h y después se hierve durante 4 h, manteniendo constante el volumen mediante la adición periódica de etanol. Los reactivos restantes se separan mediante cinco ciclos de lavado por centrifugación y redispersión en etanol puro.
En una reacción separada, se crean semillas de oro de 1-4 nm de diámetro. Toda el agua usada en esta reacción se desioniza primero y después se destila en vidrio. Se añade agua (45,5 ml) a un matraz de fondo redondo de 100 ml. Mientras se agita, se añade NaOH acuoso 0,2 M (1,5 ml), seguido de una solución acuosa al 1% de cloruro de tetrakis(hidroximetil)fosfonio (THPC) (1,0 ml). Dos minutos después de la adición de la solución de THPC, se añade una solución acuosa de ácido cloroaúrico 10 mg/ml (2 ml), que ha envejecido al menos 15 minutos. Las semillas de oro se purifican por diálisis contra agua.
Para formar los nanoportadores de núcleo-cubierta, las nanopartículas de SiO2 funcionalizadas con amino formadas anteriormente se mezclan primero con las semillas de oro durante 2 h a temperatura ambiente. Las partículas de SiO2 decoradas con oro se recogen por centrifugación y se mezclan con una solución acuosa de ácido cloroaúrico y bicarbonato de potasio para formar la cubierta de oro. Las partículas se lavan después por centrifugación y se vuelven a dispersar en agua. La ovoalbúmina tiolada (hecha tratando ovoalbúmina con hidrocloruro de 2-iminotiolano) se carga suspendiendo las partículas en una solución de ovoalbúmina tiolada (1 mg/l) durante 72 h. Después, las partículas se lavan del sedimento con 1x PBS (pH 7,4) para eliminar la proteína libre. Los nanoportadores de núcleo-cubierta de sílice-oro resultantes que contienen ovoalbúmina se vuelven a suspender en 1x PBS para análisis y ensayos adicionales.
Ejemplo de referencia 7: liposomas que contienen rapamicina y ovoalbúmina (predictivo)
Los liposomas se forman por hidratación de película fina. Se disuelven 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (32 pmol), colesterol (32 pmol) y rapamicina (6,4 pmol) en cloroformo puro (3 ml). Esta solución lipídica se añade a un tubo de vidrio de 10 ml y el disolvente se elimina con una corriente de nitrógeno gaseoso y se deseca durante 6 h. a vacío. Las vesículas multilamelares se obtienen por hidratación de la película con 2,0 ml de tampón MOPS 25 mM a pH 8,5, que contiene una cantidad en exceso de ovoalbúmina. El tubo se agita con vórtice hasta que la película lipídica se despega de la superficie del tubo. Para romper las vesículas multilamelares en monolamelares, se aplican diez ciclos de congelación (nitrógeno líquido) y descongelación (baño de agua a 30°C). La muestra después se diluye a 1 ml en tampón MOPS 25 mM a pH 8,5. El tamaño del liposoma resultante se homogeneiza por extrusión haciendo pasar la muestra 10 veces a través de filtros de policarbonato de poros de 200 nm. Los liposomas resultantes se usan después para análisis y bioensayos adicionales.
Ejemplo de referencia 8: nanoportadores poliméricos compuestos de poliaminoácido modificado con ovoalbúmina conjugada en la superficie (predictivo)
Etapa 1. Preparación de poli(ácido Y-glutámico) (y-PGA) modificado con éster etílico de L-fenilalanina (L-PAE): se disuelven 4,7 unidades de mmol de y-PGA (Mn = 300 kD) en una solución acuosa de NaHCO3 0,3 N (50 ml). Se añaden L-PAE (4,7 mmoles) y EDC.HCl (4,7 mmoles) a la solución y se agita durante 30 min a 4°C. La solución después se mantiene a temperatura ambiente con agitación durante 24 h. Los productos químicos de bajo peso molecular se eliminan por diálisis usando una membrana de diálisis con MWCO 50 kD. El Y-PGA-injerto-L-PAE resultante se obtiene por liofilización.
Etapa 2. Preparación de nanopartículas a partir de polímero de Y-PGA-injerto-L-PAE:
Las nanopartículas compuestas de Y-PGA-injerto-L-PAE se preparan por un método de precipitación y diálisis. Se disolvió Y-PGA-injerto-L-PAE (20 mg) en 2 ml de DMSO seguido de la adición de 2 ml de agua para formar una solución translúcida. Después, la solución se dializa contra agua destilada usando un tubo de membrana de celulosa (MWCO 50.000) para formar las nanopartículas y eliminar los disolventes orgánicos durante 72 h a temperatura ambiente. El agua destilada se intercambia a intervalos de 12 h. La solución de nanopartículas resultante (10 mg/ml en agua) se usa después para la conjugación de antígeno.
Etapa 3. Conjugación de ovoalbúmina con nanopartículas de y-PGA: los grupos de ácido carboxílico de la superficie de las nanopartículas de y-PGA (10 mg/ml) se activan primero por EDC y NHS (10 mg/ml cada uno en tampón de fosfato, pH 5,8) durante 2 h a temperatura ambiente. Después del lavado del sedimento para eliminar el exceso de EDC/NHS, las nanopartículas activadas se mezclan con 1 ml de ovoalbúmina (10 mg/ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y la mezcla se incuba a 4-8°C durante 24 h. Las nanopartículas de y-PGA conjugadas con ovoalbúmina resultantes se lavan dos veces con PBS y se vuelven a suspender a 5 mg/ml en PBS para análisis y bioensayos adicionales.
Ejemplo de referencia 9: Nanopartículas de y-PGA encapsuladas en eritropoyetina (EPO) (predictivo)
Para preparar las nanopartículas y-PGA encapsuladas en EPO, se disuelven 0,25-4 mg de EPO en 1 ml de PBS (pH 7,4) y se añade 1 ml de Y-PGA-injerto-L-PAE (10 mg/ml en DMSO) a la solución de EPO. La solución resultante se centrifuga a 14.000xg durante 15 minutos y se enjuaga repetidamente con PBS. Las nanopartículas de y-PGA encapsuladas en EPO resultantes después se vuelven a suspender en PBS (5 mg/ml) para análisis y bioensayo adicionales.
Ejemplo de referencia 10: Preparación de nanoportadores de oro (AuNC) que contienen ovoalbúmina (predictivo)
Etapa 1. Formación de NC de oro (AuNC): una solución ac. de 500 ml de HAuCl4 1 mM se calienta a reflujo durante 10 min con agitación vigorosa en un matraz de fondo redondo de 1 litro equipado con un refrigerante. Después se añade rápidamente a la solución con agitación una solución de 50 ml de citrato trisódico 40 mM. La solución de color rojo vino oscuro resultante se mantiene a reflujo durante 25-30 minutos y se retira el calor y la solución se enfría a temperatura ambiente. La solución después se filtra a través de un filtro de membrana de 0,8 pm para dar la solución de AuNC. Los AuNC se caracterizan por espectroscopía visible y microscopía electrónica de transmisión. Los AuNC tienen aproximadamente 20 nm de diámetro terminados con citrato con absorción máxima a 520 nm.
Etapa 2. Conjugación de ovoalbúmina a AuNC: Se añade una solución de 150 pl de ovoalbúmina tiolada (10 pM en tampón de carbonato 10 mM a pH 9,0) a 1 ml de nanoportadores de oro terminados con citrato de 20 nm de diámetro (1,16 nM) para producir una relación molar de tiol a oro de 2500:1. La mezcla se agita a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 1 hora para permitir el intercambio completo de tiol con citrato en los nanoportadores de oro. Los AuNC con ovoalbúmina en la superficie después se purifican por centrifugación a 12.000 g durante 30 minutos. El líquido sobrenadante se decanta y el sedimento que contiene AuNC-ovoalbúmina después se lava con tampón 1x PBS. Los nanoportadores de oro-ovoalbúmina purificados se vuelven a suspender en un tampón adecuado para análisis y bioensayo adicionales.
Ejemplo de referencia 11: Evaluación de la respuesta inmunitaria tolerogénica a la epoyetina alfa in vivo (predictivo)
Se inmunizan ratones Balb/c con epoyetina alfa en adyuvante de Freunds incompleto para inducir la proliferación de células T CD4+, cuyo nivel se evalúa. Posteriormente, se administra una composición que comprende epítopos restringidos por MHC de clase II de epoyetina alfa y un inmunosupresor por vía subcutánea de una manera dependiente de la dosis. Los mismos ratones se exponen de nuevo a la epoyetina alfa y se evalúa de nuevo el nivel de proliferación de células T CD4+. Los cambios en la población de células T CD4+ se controlan después con una reducción en la proliferación de células T CD4+ tras la posterior exposición a epoyetina alfa que indica una respuesta inmunitaria tolerogénica.
Ejemplo 12: Evaluación de las respuestas inmunitarias tolerogénicas con nanoportadores sintéticos que comprenden inmunosupresores y antígeno presentable en APC in vivo
Materiales y métodos de producción de nanoportadores sintéticos
Nanoportador 1
La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Catálogo de productos n° R1017). Se adquirió PLGA con una relación de lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó el copolímero de bloques PLA-PEG con un bloque PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon de la siguiente manera:
Solución 1: rapamicina 50 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo rapamicina en cloruro de metileno puro.
Solución 2: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro.
Solución 3: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro.
Solución 4: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Se usó una emulsión de aceite en agua para preparar los nanoportadores. La emulsión de AC/AG se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), solución 2 (0,75 ml), solución 3 (0,25 ml) y solución 4 (3 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. La emulsión de AC/AG se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato a pH 870 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión del nanoportador a un tubo de centrífuga y centrifugando a 21.000xg y 4°C durante 45 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión 10mg/ml dinámica de la luz. La cantidad de rapamicina en el nanoportador se determinó por análisis por HPLC. La masa total del nanoportador seco por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000039_0001
Nanoportador 2
El péptido de ovoalbúmina 323-339, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de células T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió de Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte n°4065609). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó el copolímero de bloques PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon de la siguiente manera:
Solución 1: péptido de ovoalbúmina 323-33920 mg/ml en solución acuosa diluida de ácido clorhídrico. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente.
Solución 2: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro.
Solución 3: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro.
Solución 4: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), solución 2 (0,75 ml) y solución 3 (0,25 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 4 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando el Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato a pH 8 70 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una parte de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 35 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño de los nanoportadores se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de péptido en el nanoportador se determinó por análisis por HPLC. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000040_0001
Nanoportador 3
La simvastatina se adquirió en LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; Catálogo de productos n° S3449). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó el copolímero de bloques PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon de la siguiente manera:
Solución 1: Simvastatina 50 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo la simvastatina en cloruro de metileno puro.
Solución 2: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro.
Solución 3: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro.
Solución 4: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Se usó una emulsión de aceite en agua para preparar los nanoportadores. La emulsión de AC/AG se preparó combinando la solución 1 (0,15 ml), solución 2 (0,75 ml), solución 3 (0,25 ml) y solución 4 (3 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. La emulsión de AC/AG se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato a pH 870 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y que se formaran los nanoportadores. Una parte de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 35 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado, y el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de simvastatina en el nanoportador se determinó por análisis por HPLC. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000040_0002
Nanoportador 4
El péptido de ovoalbúmina 323-339, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de células T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió de Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte n°4065609). La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Catálogo de productos n° R1017). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó el copolímero de bloques PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon de la siguiente manera:
Solución 1: péptido de ovoalbúmina 323-33920 mg/ml en solución acuosa diluida de ácido clorhídrico. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente.
Solución 2: rapamicina 50 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo rapamicina en cloruro de metileno puro.
Solución 3: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro.
Solución 4: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro.
Solución 5: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), solución 2 (0,2 ml), solución 3 (0,75 ml) y solución 4 (0,25 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 5 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato a pH 8 70 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión del nanoportador a un tubo de centrífuga y centrifugando a 21.000xg y 4°C durante 45 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y se volvió a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de péptido y rapamicina en el nanoportador se determinó por análisis por HPLC. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000041_0001
Nanoportador 5
El péptido de ovoalbúmina 323-339, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de células T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió de Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte n° 4065609). La simvastatina se adquirió en LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; Catálogo de productos n° S3449). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó el copolímero de bloques PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon de la siguiente manera:
Solución 1: péptido de ovoalbúmina 323-33920 mg/ml en solución acuosa diluida de ácido clorhídrico. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente.
Solución 2: Simvastatina 50 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo simvastatina en cloruro de metileno puro.
Solución 3: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro.
Solución 4: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro.
Solución 5: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM pH 8.
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), solución 2 (0,15 ml), solución 3 (0,75 ml) y solución 4 (0,25 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 5 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato a pH 8 70 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una parte de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 35 min, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y se volvió a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de péptido y simvastatina en el nanoportador se determinó por análisis por HPLC. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000042_0001
Administración in vivo 1
Se cultivaron bazos de ratones B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) y C57BL/6 (B6), se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 pM para producir una suspensión de células individuales. Después las células CD4+CD25- purificadas se extrajeron en un procedimiento de 2 etapas. Usando un separador de células magnético Miltenyi Biotec AutoMACS, las células de bazo primero se marcaron con el kit de aislamiento de células T CD4+ II y la fracción sin marcar se redujo en células CD25+ con el kit de reducción de CD25. Las células B6 purificadas se tiñeron con un colorante intracelular, éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE), antes de mezclarse en concentraciones iguales con las células OTII purificadas. Después se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) en ratones receptores B6.SJL_Pfprca/BoyAi (CD45.1).
Al día siguiente, los ratones receptores CD45.1 se trataron con partículas de vacuna sintéticas tolerogénicas dirigidas (t2SVP). Se cargaron con combinaciones de péptido de ovoalbúmina (323-339) (OVA323-339), rapamicina (Rapa) y/o simvastatina (Simva) y se administraron por vía subcutánea (s.c.).
La inyección constituye un tratamiento tolerogénico y le siguieron 4 inyecciones más cada una con 2 semanas de diferencia. Una vez completado el programa de tratamiento, los animales receptores CD45.1 se sacrificaron y se recogieron sus bazos y ganglios linfáticos poplíteos, se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 pM para producir una suspensión de células individuales. Las células del bazo se redujeron en glóbulos rojos (RBC) por incubación con tampón de lisis de RBC (Stem Cell Technologies) y se realizaron recuentos de células tanto en los bazos como en los ganglios linfáticos.
Se cultivaron células de bazo o ganglios linfáticos en CM (medio completo) complementado con IL-2 10 U/ml, se reestimularon con OPII a 0,3x106 células/pocillo en placas de fondo redondo (RB) de 96 pocillos y se incubaron a 37°C, 5% de CO2. Las células se dividieron el día 2 y se recolectaron el día 5. Los líquidos sobrenadantes se recogieron y congelaron mientras que las células se tiñeron para el análisis fenotípico por citometría de flujo. Las células se analizaron en un citómetro de flujo Becton Dickinson FacsCanto.
Administración in vivo 2
Se cultivaron bazos de ratones B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) y C57BL/6 (B6), se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 pM para producir una suspensión de células individuales. Después las células CD4+CD25- purificadas se extrajeron en un procedimiento de 2 etapas. Usando un separador de células magnético Miltenyi Biotec AutoMACS, las células de bazo primero se marcaron con el kit de aislamiento de células T CD4+ II de Miltenyi. La fracción de células T CD4+ sin marcar después se redujo en células CD25+ con el kit de reducción de CD25. Las células CD4 de ratones B6 purificadas después se tiñeron con un colorante intracelular, éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE), antes de mezclarse en concentraciones iguales con las células OTII purificadas. Después se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) en ratones receptores B6.SJL_Pfprca/BoyAi (CD45.1).
Al día siguiente, los ratones receptores CD45.1 se trataron con partículas de vacuna sintéticas tolerogénicas dirigidas. Comprendían combinaciones de péptido de ovoalbúmina (323-339) (OVA323-339), rapamicina (Rapa) y simvastatina (Simva) y se administraron por vía subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.).
Una vez completado el programa de tratamiento, los animales receptores CD45.1 se sacrificaron y se recogieron sus bazos y ganglios linfáticos poplíteos, se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 pM para producir una suspensión de células individuales. Las células del bazo se redujeron en glóbulos rojos (RBC) por incorporación con tampón de lisis de RBC (Stem Cell Technologies) y se realizaron recuentos de células tanto en el bazo como en los ganglios linfáticos.
Se cultivaron células de bazo o ganglios linfáticos en CM complementado con IL-210 U/ml, se reestimularon con OPII 1 pM a 0,3x106 células/pocillo en placas de fondo redondo (RB) de 96 pocillos y se incubaron a 37°C, 5% de CO2. Las células se dividieron el día 2 y se recolectaron el día 5. Los líquidos sobrenadantes se recogieron y congelaron mientras que las células se tiñeron para el análisis fenotípico por citometría de flujo. Las células se analizaron en un citómetro de flujo Becton Dickinson FacsCanto.
Resultados
Los resultados se muestran en las figs. 2 y 3 (Inmunomodulador 1 :rapamicina; inmunomodulador 2:simvastatina). Las figuras muestran efectos in vivo y demuestran que la expansión específica de antígeno de las células inmunitarias efectoras se reduce con nanoportadores sintéticos que comprenden antígeno e inmunosupresores en comparación con el antígeno solo o nanoportadores sintéticos que comprenden antígeno con y sin una molécula inmunoestimuladora.
Ejemplo 13: respuestas inmunitarias tolerogénicas con nanoportadores sintéticos
Materiales y métodos
Nanoportador 1
La proteína ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701; Código de producto 3048). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001). El copolímero de bloques PLA-PEG se sintetizó con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El hidrato de colato de sodio se adquirió en Sigma-Aldrich Corp. (3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103; Código de producto C6445).
Las soluciones se prepararon como sigue:
Solución 1: ovoalbúmina 50 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato. La solución se preparó disolviendo ovoalbúmina en solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente. Solución 2: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml e hidrato de colato de sodio 10 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), solución 2 (0,75 ml) y solución 3 (0,25 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 4 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando el Branson Digital Sonifier 250. La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato 70 mM a pH 8 (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una parte de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión del nanoportador a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 35 min, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de proteína en el nanoportador se determinó por un ensayo fluorométrico de o-ftalaldehído. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000044_0001
Nanoportador 2
La proteína ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701; Código de producto 3048). La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Catálogo de productos n° R1017). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). El copolímero de bloques PLA-PEG se sintetizó con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001). El hidrato de colato de sodio se adquirió en Sigma-Aldrich Corp. (3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103; Código de producto C6445).
Las soluciones se prepararon como sigue:
Solución 1: ovoalbúmina 50 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato. La solución se preparó disolviendo ovoalbúmina en solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente. Solución 2: rapamicina 50 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 4: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 5: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml e hidrato de colato de sodio 10 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), solución 2 (0,2 ml), solución 3 (0,75 ml) y solución 4 (0,25 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 5 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando Branson Digital Sonifier 250. La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato a pH 870 mM (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una parte de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión del nanoportador a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 35 min, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y se volvió a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de rapamicina en el nanoportador se determinó por análisis por HPLC. La cantidad de proteína en el nanoportador se determinó por un ensayo fluorométrico de o-ftalaldehído. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000044_0002
Inmunización
El propósito de este experimento era evaluar los efectos del inmunosupresor encapsulado (t2SVP) en respuestas de anticuerpos en curso midiendo inmunoglobulinas específicas de antígeno. Un grupo de animales permaneció sin inmunizar como control. Dos grupos de animales se inmunizaron usando "administración pasiva" de ovoalbúmina o inmunización activa con OVA y CpG con 3 inyecciones (d0, d14 y d28) seguido de una evaluación de los títulos de anticuerpos y una o dos semanas de descanso. Otros dos grupos recibieron las mismas inmunizaciones, pero recibieron refuerzos cada 2 semanas al mismo tiempo que recibían el tratamiento. Cada uno de estos grupos se dividió en tres subgrupos para ensayar la capacidad de diferentes tratamientos para modificar los títulos de Ig inducidos. Un subgrupo de control no recibió tratamiento tolerogénico. Se aplicaron otros dos tratamientos a los otros subgrupos, incluido NP que lleva solo proteína OVA o en combinación con inmunosupresor.
Para la inmunización, los animales recibieron 20 pl/extremidad de OVA+CpG (12,5 pg de OVA 10 pg de CpG), en ambas extremidades posteriores vía s.c. o 25 pg de OVA i.v. en 100 pl. El tratamiento tolerogénico incluía la administración de 200 |jl de t2SVP i.v. usando 10 |jg de OVA. Se proporcionaron nanopartículas con 500 pg/ml de contenido de OVA. t2SVP se diluyó de tal manera que se inyectaron las mismas cantidades de OVA en todos los grupos
Medición de IgG
Se midió el nivel de anticuerpos IgG. Este nivel es indicativo de inmunoglobulinas en general, incluidas las IgE, que son de particular relevancia en la alergia. Se usó bloqueador de caseína en PBS (Thermo Fisher, Catálogo n° 37528) como diluyente. Se usó Tween-20 al 0,05% en PBS como tampón de lavado, preparado por adición de 10 ml de Tween-20 ((Sigma, Catálogo n° P9416-100ml) a 2 litros de 10x solución madre de PBS (PBS: OmniPur® 10X PBS Liquid Concentrate, 4L, EMD Chemicals, Catálogo n° 6505) y 18 litros de agua desionizada. Se usó proteína OVA en una concentración madre de 5 mg/ml como material de recubrimiento. Se usó una dilución 1:1000 a 5 jg/m l como concentración de trabajo. Cada pocillo de las placas de ensayo se recubrió con 100 j l de OVA diluida por pocillo, las placas se sellaron con película de sellado (VWR catálogo n° 60941-120), y se incubaron durante la noche a 4°C. Se usaron placas de fondo plano de 96 pocillos Costar9017 como placas de ensayo, Costar9017.
Se usaron placas de 96 pocillos o tubos de polipropileno de baja unión como placas de preparación, en las que se preparaban las muestras antes de transferirlas a la placa de ensayo. Las placas de preparación no contenían ningún antígeno y, por lo tanto, los anticuerpos del suero no se unían a la placa durante la preparación de las muestras. Se usaron placas de preparación para la preparación de muestras para minimizar la unión que podría ocurrir durante la preparación o pipeteo de muestras si se usaba una placa recubierta con antígeno para preparar las muestras. Antes de preparar las muestras en la placa de preparación, los pocillos se recubrieron con diluyente para bloquear cualquier unión no específica y la placa se selló e incubó a 4°C durante la noche.
Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente de los pocillos después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 300 pl de diluyente a cada pocillo de la(s) placa(s) de ensayo para bloquear la unión no específica y las placas se incubaron al menos 2 horas a temperatura ambiente. Se prepararon muestras de suero en la placa de preparación en diluciones iniciales adecuadas. Las diluciones iniciales a veces también se prepararon en tubos de 1,5 ml usando diluyente. Las diluciones iniciales adecuadas se determinaron basándose en datos previos, cuando estaban disponibles. Cuando no había datos previos disponibles, la dilución inicial más baja era 1:40. Una vez diluido, se transfirieron 200 pl de la dilución inicial de la muestra de suero al pocillo adecuado de la placa de preparación.
A continuación, se describe una distribución de placa de preparación de ejemplo: las columnas 2 y 11 contenían la referencia de isotipo IgG2b monoclonal anti-Ovoalbúmina (AbCam, ab17291), diluida a 1 pg/ml (dilución 1:4000). Las columnas 3-10 contenían muestras de suero (en diluciones adecuadas). Las columnas 1 y 12 no se usaron para muestras o referencias para evitar cualquier sesgo de mediciones debido al efecto de borde. En cambio, las columnas 1 y 12 contenían 200 pl de diluyente. Se usó suero de ratón normal diluido 1:40 como control negativo. Se usó anti-IgG2a de ratón diluido 1:500 de una solución madre de 0,5 mg/ml (BD Bioscience) como control de isotipo.
Una vez que se prepararon todas las muestras en la placa de preparación, la placa se selló y se almacenó a 4°C hasta que se completó el bloqueo de las placas de ensayo. Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 100 pl de diluyente a todos los pocillos en las filas B-H de las placas de ensayo. Se usó una pipeta de 12 canales para transferir muestras desde la placa de preparación a la placa de ensayo. Las muestras se mezclaron antes de transferencia pipeteando 150 pl de suero diluido hacia arriba y hacia abajo 3 veces. Después de mezclar, se transfirieron 150 pl de cada muestra desde la placa de preparación y se añadieron a la fila A de la placa de ensayo respectiva.
Una vez que las diluciones iniciales de cada muestra se transfirieron de la placa de preparación a la fila A de la placa de ensayo, se pipetearon diluciones seriadas en la placa de ensayo como sigue: se retiraron 50 pl de cada muestra de suero de la fila A usando una pipeta de 12 canales y se mezclaron con los 100 pl de diluyente previamente añadidos a cada pocillo de la fila B. Este paso se repitió hacia abajo por toda la placa. Después de pipetear la dilución de la fila final, se retiraron 50 pl de fluido de los pocillos en la fila final y se descartaron, dando como resultado un volumen final de 100 pl en cada pocillo de la placa de ensayo. Una vez que se prepararon las diluciones de muestras en las placas de ensayo, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 2 horas.
Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado. El anticuerpo de detección (anti-IgG de cabra anti-ratón, HRP conjugado, AbCam ab98717) se diluyó 1:1500 (0,33 pg/ml) en diluyente y se añadieron 100 pl del anticuerpo diluido a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con tampón de lavado, incluyendo cada etapa de lavado un tiempo de remojo de al menos 30 segundos.
Después del lavado, se añadió sustrato de detección a los pocillos. Se combinaron partes iguales del sustrato A y el sustrato B (BD Biosciences TMB Substrate Reagent Set, catálogo n° 555214) inmediatamente antes de la adición a las placas de ensayo, y se añadieron 100 pl de la solución de sustratos mezclados a cada pocillo y se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 50 pl de solución de parada (H2SO4 2 N) a cada pocillo después del periodo de 10 minutos. La densidad óptica (DO) de los pocillos se evaluó inmediatamente después de añadir la solución de parada en un lector de placas a 450 nm con sustracción a 570 nm. El análisis de los datos se realizó con el software SoftMax Pro v5.4 de Molecular Device. En algunos casos, se preparó un gráfico de ajuste de curva logística de cuatro parámetros con la dilución en el eje x (escala logarítmica) y el valor de DO en el eje y (escala lineal), y se determinó la mitad del valor máximo (CE50) para cada muestra. La plantilla de la placa en la parte superior de la distribución se ajustó para reflejar la dilución de cada muestra (1 por columna).
Resultados
La Fig. 4 muestra una disminución en la producción de anticuerpos específicos de antígeno con nanoportadores que comprenden antígeno peptídico e inmunosupresor en comparación con nanoportadores que comprenden el péptido solo. El panel 3 muestra que el uso de un inmunoestimulador fuerte, CpG, contrarrestaba los efectos tolerogénicos de los nanoportadores sintéticos que comprenden rapamicina en algunos casos.
Ejemplo 14: respuestas inmunitarias tolerogénicas con nanoportadores sintéticos
Materiales y métodos
Se prepararon nanoportadores como en el ejemplo anterior (Ejemplo 13).
Inmunización
El propósito de este experimento era evaluar los efectos del inmunosupresor encapsulado (t2SVP) en respuestas de anticuerpos que aparecen midiendo inmunoglobulinas específicas de antígeno en animales que reciben el inmunógeno y tratamiento con NP al mismo tiempo. Un grupo de animales permaneció sin inmunizar como control (pero recibía tratamiento). Un segundo grupo de animales se inmunizó usando "administración pasiva" de ovoalbúmina y un tercer grupo se inmunizó con OVA y CpG en la región subescapular. Cada uno de estos grupos recibió una inyección quincenal de nanopartículas (NP) y se vigilaron los niveles de Ig anti-OVA el día previo al refuerzo. Para la inmunización, los animales recibieron 100 pl de OVA+ CpG vía s.c. (subescapular) o 25 pg de OVA vía i.v. en 100 pl. El tratamiento tolerogénico comprendía la administración de 100 pl de t2SVP vía i.v. Se proporcionaron nanoportadores en 5 mg/ml. t2SVP se diluyó de manera que se inyectaban las mismas cantidades de OVA en todos los grupos. Las inyecciones se realizaron en d0, d14, d28, d42, d56.
Medición de IgG
Se midió el nivel de anticuerpos IgG. Este nivel es indicativo de inmunoglobulinas en general, incluidas las IgE, que son de particular relevancia en la alergia. Se usó bloqueador de caseína en PBS (Thermo Fisher, Catálogo n° 37528) como diluyente. Se usó Tween-20 al 0,05% en PBS como tampón de lavado, preparado por adición de 10 ml de Tween-20 ((Sigma, Catálogo n° P9416-100ml) a 2 litros de 10x solución madre de PBS (PBS: OmniPur® 10X PBS Liquid Concentrate, 4L, EMD Chemicals, Catálogo n° 6505) y 18 litros de agua desionizada. Se usó proteína OVA en una concentración madre de 5 mg/ml como material de recubrimiento. Se usó una dilución 1:1000 a 5 pg/ml como concentración de trabajo. Cada pocillo de las placas de ensayo se recubrió con 100 pl de OVA diluida por pocillo, las placas se sellaron con película de sellado (VWR catálogo n° 60941-120), y se incubaron durante la noche a 4°C. Se usaron placas de fondo plano de 96 pocillos Costar9017 como placas de ensayo, Costar9017.
Se usaron placas de 96 pocillos o tubos de polipropileno de baja unión como placas de preparación, en las que se preparaban las muestras antes de transferirlas a la placa de ensayo. Las placas de preparación no contenían ningún antígeno y, por lo tanto, los anticuerpos del suero no se unían a la placa durante la preparación de las muestras. Se usaron placas de preparación para la preparación de muestras para minimizar la unión que podría ocurrir durante la preparación o pipeteo de muestras si se usaba una placa recubierta con antígeno para preparar las muestras. Antes de preparar las muestras en la placa de preparación, los pocillos se recubrieron con diluyente para bloquear cualquier unión no específica y la placa se selló e incubó a 4°C durante la noche.
Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente de los pocillos después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 300 pl de diluyente a cada pocillo de la(s) placa(s) de ensayo para bloquear la unión no específica y las placas se incubaron al menos 2 horas a temperatura ambiente. Se prepararon muestras de suero en la placa de preparación en diluciones iniciales adecuadas. Las diluciones iniciales a veces también se prepararon en tubos de 1,5 ml usando diluyente. Las diluciones iniciales adecuadas se determinaron basándose en datos previos, cuando estaban disponibles. Cuando no había datos previos disponibles, la dilución inicial más baja era 1:40. Una vez diluido, se transfirieron 200 pl de la dilución inicial de la muestra de suero al pocillo adecuado de la placa de preparación.
A continuación, se describe una distribución de placa de preparación de ejemplo: las columnas 2 y 11 contenían la referencia de isotipo IgG2b monoclonal anti-ovoalbúmina (AbCam, ab17291), diluida a 1 pg/ml (dilución 1:4000). Las columnas 3-10 contenían muestras de suero (en diluciones adecuadas). Las columnas 1 y 12 no se usaron para muestras o referencias para evitar cualquier sesgo de mediciones debido al efecto de borde. En cambio, las columnas 1 y 12 contenían 200 gl de diluyente. Se usó suero de ratón normal diluido 1:40 como control negativo. Se usó anti-IgG2a de ratón diluido 1:500 de una solución madre de 0,5 mg/ml (BD Bioscience) como control de isotipo.
Una vez que se prepararon todas las muestras en la placa de preparación, la placa se selló y se almacenó a 4°C hasta que se completó el bloqueo de las placas de ensayo. Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 100 gl de diluyente a todos los pocillos en las filas B-H de las placas de ensayo. Se usó una pipeta de 12 canales para transferir muestras desde la placa de preparación a la placa de ensayo. Las muestras se mezclaron antes de transferencia pipeteando 150 gl de suero diluido hacia arriba y hacia abajo 3 veces. Después de mezclar, se transfirieron 150 gl de cada muestra desde la placa de preparación y se añadieron a la fila A de la placa de ensayo respectiva.
Una vez que las diluciones iniciales de cada muestra se transfirieron de la placa de preparación a la fila A de la placa de ensayo, se pipetearon diluciones seriadas en la placa de ensayo como sigue: se retiraron 50 gl de cada muestra de suero de la fila A usando una pipeta de 12 canales y se mezclaron con los 100 gl de diluyente previamente añadidos a cada pocillo de la fila B. Este paso se repitió hacia abajo por toda la placa. Después de pipetear la dilución de la fila final, se retiraron 50 gl de fluido de los pocillos en la fila final y se descartaron, dando como resultado un volumen final de 100 gl en cada pocillo de la placa de ensayo. Una vez que se prepararon las diluciones de muestras en las placas de ensayo, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 2 horas.
Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado. El anticuerpo de detección (anti-IgG de cabra anti-ratón, HRP conjugado, AbCam ab98717) se diluyó 1:1500 (0,33 gg/ml) en diluyente y se añadieron 100 gl del anticuerpo diluido a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con tampón de lavado, incluyendo cada etapa de lavado un tiempo de remojo de al menos 30 segundos.
Después del lavado, se añadió sustrato de detección a los pocillos. Se combinaron partes iguales del sustrato A y el sustrato B (BD Biosciences TMB Substrate Reagent Set, catálogo n° 555214) inmediatamente antes de la adición a las placas de ensayo, y se añadieron 100 gl de la solución de sustratos mezclados a cada pocillo y se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 50 gl de solución de parada (H2SO4 2 N) a cada pocillo después del periodo de 10 minutos. La densidad óptica (DO) de los pocillos se evaluó inmediatamente después de añadir la solución de parada en un lector de placas a 450 nm con sustracción a 570 nm. El análisis de los datos se realizó con el software SoftMax Pro v5.4 de Molecular Device. En algunos casos, se preparó un gráfico de ajuste de curva logística de cuatro parámetros con la dilución en el eje x (escala logarítmica) y el valor de DO en el eje y (escala lineal), y se determinó la mitad del valor máximo (CE50) para cada muestra. La plantilla de la placa en la parte superior de la distribución se ajustó para reflejar la dilución de cada muestra (1 por columna).
Resultados
La Fig. 5 muestra una disminución en la producción de anticuerpos específicos de antígeno con nanoportadores que comprenden antígeno peptídico e inmunosupresor en comparación con nanoportadores que comprenden el antígeno solo. De nuevo los datos muestran que el uso de un inmunoestimulador fuerte, CpG, contrarrestaba los efectos tolerogénicos de los nanoportadores sintéticos que comprenden rapamicina en algunos casos.
Ejemplo 15: Evaluación de los efectos de los nanoportadores con antígenos e inmunosupresores en las respuestas inmunitarias
Materiales y métodos
Nanoportador 1
El péptido de ovoalbúmina 323-339, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de células T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió en Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte n° 4065609). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). El copolímero de bloques PLA-PEG se sintetizó con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como sigue:
Solución 1: péptido de ovoalbúmina 323-33920 mg/ml en solución acuosa diluida de ácido clorhídrico. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente. Solución 2: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), solución 2 (0,75 ml) y solución 3 (0,25 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 4 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos a una amplitud del 30% durante 60 segundos usando el Branson Digital Sonifier 250. La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato 70 mM a pH 8 (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión del nanoportador a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 35 min, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de péptido en el nanoportador se determinó por análisis por HPLC. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000048_0001
Nanoportador 2
El péptido de ovoalbúmina 323-339, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de células T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió en Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Parte n° 4065609). La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Catálogo de productos n° R1017). El PLGA se adquirió con una relación lactida:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0,75 dl/g de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Código de producto 7525 DLG 7A). El copolímero de bloques PLA-PEG se sintetizó con un bloque de PEG de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20.000 Da. El poli(alcohol vinílico) (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como sigue:
Solución 1: péptido de ovoalbúmina 323-33920 mg/ml en solución acuosa diluida de ácido clorhídrico. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente. Solución 2: rapamicina 50 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLGA 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 4: PLA-PEG 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 5: poli(alcohol vinílico) 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.
Primero se preparó una emulsión primaria de agua en aceite. AG1/AC1 se preparó combinando la solución 1 (0,2 ml), la solución 2 (0,2 ml), la solución 3 (0,75 ml) y la solución 4 (0,25 ml) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se preparó una emulsión secundaria (AG1/AC1/AG2) combinando la solución 5 (3,0 ml) con la emulsión primaria AG1/AC1, agitando con vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos al 30% de amplitud durante 60 segundos usando Branson Digital Sonifier 250. La emulsión AG1/AC1/AG2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía una solución tampón de fosfato 70 mM a pH 8 (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el cloruro de metileno y se formaran los nanoportadores. Una parte de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga y centrifugando a 21.000xg y 4°C durante 45 min, eliminando el líquido sobrenadante y volviendo a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió el procedimiento de lavado y se volvió a suspender el sedimento en solución salina tamponada con fosfato para una dispersión final de nanoportadores de aproximadamente 10 mg/ml.
El tamaño del nanoportador se determinó por dispersión dinámica de la luz. Las cantidades de péptido y rapamicina en el nanoportador se determinaron por análisis por HPLC. La masa total de nanoportadores secos por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.
Figure imgf000049_0001
Inmunización
Los animales recibieron inmunización cada 2 semanas al mismo tiempo que recibían el tratamiento. Cada uno de estos grupos se dividió en subgrupos para evaluar la capacidad de diferentes tratamientos para modificar los títulos de Ig inducidos. Un subgrupo de control no recibió tratamiento tolerogénico. Dos subgrupos recibieron nanoportadores que llevaban solo el péptido OVA323-339 o en combinación con rapamicina.
La inmunización se administró por las siguientes rutas (los valores son por animal): 20 pl/extremidad de OVA+CpG (12,5 pg de OVA+ 10 pg de CpG), en ambas extremidades posteriores por vía s.c. Se administraron tratamientos tolerogénicos por la siguiente ruta (los valores son por animal): se proporcionaron 200 pl de nanoportadores a 100 pg/ml de contenido OVA323-339.
Medición de IgG
Se midió el nivel de anticuerpos IgG. Este nivel es indicativo de inmunoglobulinas en general, incluidas las IgE, que son de particular relevancia en la alergia. Se usó bloqueador de caseína en PBS (Thermo Fisher, Catálogo n° 37528) como diluyente. Se usó Tween-20 al 0,05% en PBS como tampón de lavado, preparado por adición de 10 ml de Tween-20 ((Sigma, Catálogo n° P9416-100ml) a 2 litros de 10x solución madre de PBS (PBS: OmniPur® 10X PBS Liquid Concentrate, 4L, EMD Chemicals, Catálogo n° 6505) y 18 litros de agua desionizada. Se usó proteína OVA en una concentración madre de 5 mg/ml como material de recubrimiento. Se usó una dilución 1:1000 a 5 pg/ml como concentración de trabajo. Cada pocillo de las placas de ensayo se recubrió con 100 pl de OVA diluida por pocillo, las placas se sellaron con película de sellado (VWR catálogo n° 60941-120), y se incubaron durante la noche a 4°C. Se usaron placas de fondo plano de 96 pocillos Costar9017 como placas de ensayo, Costar9017.
Se usaron placas de 96 pocillos o tubos de polipropileno de baja unión como placas de preparación, en las que se preparaban las muestras antes de transferirlas a la placa de ensayo. Las placas de preparación no contenían ningún antígeno y, por lo tanto, los anticuerpos del suero no se unían a la placa durante la preparación de las muestras. Se usaron placas de preparación para la preparación de muestras para minimizar la unión que podría ocurrir durante la preparación o pipeteo de muestras si se usaba una placa recubierta con antígeno para preparar las muestras. Antes de preparar las muestras en la placa de preparación, los pocillos se recubrieron con diluyente para bloquear cualquier unión no específica y la placa se selló e incubó a 4°C durante la noche.
Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente de los pocillos después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 300 pl de diluyente a cada pocillo de la(s) placa(s) de ensayo para bloquear la unión no específica y las placas se incubaron al menos 2 horas a temperatura ambiente. Se prepararon muestras de suero en la placa de preparación en diluciones iniciales adecuadas. Las diluciones iniciales a veces también se prepararon en tubos de 1,5 ml usando diluyente. Las diluciones iniciales adecuadas se determinaron basándose en datos previos, cuando estaban disponibles. Cuando no había datos previos disponibles, la dilución inicial más baja era 1:40. Una vez diluido, se transfirieron 200 pl de la dilución inicial de la muestra de suero al pocillo adecuado de la placa de preparación.
A continuación, se describe una distribución de placa de preparación de ejemplo: las columnas 2 y 11 contenían la referencia de isotipo IgG2b monoclonal anti-ovoalbúmina (AbCam, ab17291), diluida a 1 pg/ml (dilución 1:4000). Las columnas 3-10 contenían muestras de suero (en diluciones adecuadas). Las columnas 1 y 12 no se usaron para muestras o referencias para evitar cualquier sesgo de mediciones debido al efecto de borde. En cambio, las columnas 1 y 12 contenían 200 pl de diluyente. Se usó suero de ratón normal diluido 1:40 como control negativo. Se usó anti-IgG2a de ratón diluido 1:500 de una solución madre de 0,5 mg/ml (BD Bioscience) como control de isotipo.
Una vez que se prepararon todas las muestras en la placa de preparación, la placa se selló y se almacenó a 4°C hasta que se completó el bloqueo de las placas de ensayo. Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 100 pl de diluyente a todos los pocillos en las filas B-H de las placas de ensayo. Se usó una pipeta de 12 canales para transferir muestras desde la placa de preparación a la placa de ensayo. Las muestras se mezclaron antes de transferencia pipeteando 150 pl de suero diluido hacia arriba y hacia abajo 3 veces. Después de mezclar, se transfirieron 150 pl de cada muestra desde la placa de preparación y se añadieron a la fila A de la placa de ensayo respectiva.
Una vez que las diluciones iniciales de cada muestra se transfirieron de la placa de preparación a la fila A de la placa de ensayo, se pipetearon diluciones seriadas en la placa de ensayo como sigue: se retiraron 50 pl de cada muestra de suero de la fila A usando una pipeta de 12 canales y se mezclaron con los 100 pl de diluyente previamente añadidos a cada pocillo de la fila B. Este paso se repitió hacia abajo por toda la placa. Después de pipetear la dilución de la fila final, se retiraron 50 pl de fluido de los pocillos en la fila final y se descartaron, dando como resultado un volumen final de 100 pl en cada pocillo de la placa de ensayo. Una vez que se prepararon las diluciones de muestras en las placas de ensayo, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 2 horas.
Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado. El anticuerpo de detección (anti-IgG de cabra anti-ratón, HRP conjugado, AbCam ab98717) se diluyó 1:1500 (0,33 pg/ml) en diluyente y se añadieron 100 pl del anticuerpo diluido a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con tampón de lavado, incluyendo cada etapa de lavado un tiempo de remojo de al menos 30 segundos.
Después del lavado, se añadió sustrato de detección a los pocillos. Se combinaron partes iguales del sustrato A y el sustrato B (BD Biosciences TMB Substrate Reagent Set, catálogo n° 555214) inmediatamente antes de la adición a las placas de ensayo, y se añadieron 100 pl de la solución de sustratos mezclados a cada pocillo y se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 50 pl de solución de parada (H2SO4 2 N) a cada pocillo después del periodo de 10 minutos. La densidad óptica (DO) de los pocillos se evaluó inmediatamente después de añadir la solución de parada en un lector de placas a 450 nm con sustracción a 570 nm. El análisis de los datos se realizó con el software SoftMax Pro v5.4 de Molecular Device. En algunos casos, se preparó un gráfico de ajuste de curva logística de cuatro parámetros con la dilución en el eje x (escala logarítmica) y el valor de DO en el eje y (escala lineal), y se determinó la mitad del valor máximo (CE50) para cada muestra. La plantilla de la placa en la parte superior de la distribución se ajustó para reflejar la dilución de cada muestra (1 por columna).
Determinación del % de células B que se dividen OVA+
La división de células B ovoalbúmina+ se evaluó por citometría de flujo. Los esplenocitos de animales de experimentación se tiñeron con Cell Tracker Orange (CTO), una sonda fluorescente reactiva con tiol adecuada para el marcaje celular a largo plazo, y se cultivaron en medio completos a 37°C, 5% de CO2 con proteína o péptido de ovoalbúmina durante 3 días. El día 3, las células se lavaron, se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 y después se tiñeron con anticuerpos conjugados específicos para B220 y CD19. La proteína de ovoalbúmina conjugada con Alexa 647 también se incubó con las células para marcar los BCR específicos de ovoalbúmina. Los esplenocitos que eran CD19+ B220+ OVA-Alexa647+ se evaluaron para determinar la proliferación comparando la tinción diferencial de CTO. Los que tenían bajo contenido de CTO se marcaron como células B Ovoalbúmina+ proliferativas y se compararon con las células B Ovoalbúmina+ con alto contenido en CTO para cuantificar los porcentajes.
Resultados
La Fig. 6 muestra una reducción en los niveles de IgG específica de antígeno con la administración de nanoportadores sintéticos que comprenden péptido de ova y el inmunosupresor rapamicina. La Fig. 7 también demuestra una reducción, pero del número de células B específicas de antígeno con los nanoportadores sintéticos. Estos resultados demuestran la reducción de respuestas inmunitarias no deseadas relevantes para la alergia y respuestas alérgicas con nanoportadores sintéticos acoplados al péptido de ova (que comprende un epítopo restringido por MHC de clase II) y el inmunosupresor.
Ejemplo 16: Evaluación de los efectos de nanoportadores con antígenos e inmunosupresores en el asma alérgico
Nanoportadores
Los nanoportadores se prepararon de acuerdo con los métodos descritos antes (Ejemplo 15).
Inmunización
Los nanoportadores se descongelaron y equilibraron. Las diluciones iniciales constituían 10x solución madre, y se diluyeron adicionalmente a una concentración de 100 pg/ml en OVA323-339, o 1x solución. Esta 1x solución se usó para inyecciones de 200 pl por inyección i.v. Los animales se inmunizaron con proteína OVA (OVA) y se trataron con péptido OVA323-339 para evaluar la capacidad de los nanoportadores para controlar la respuesta alérgica en ausencia de antígenos de células B. Las rutas de inmunización eran las siguientes: 10 pg de OVA+ 4 mg de Alum vía i.p. en 400 pl por cada ratón hembra Balb/C sin tratamiento inmunológico previo. Los grupos experimentales consistían en 5 animales cada uno. Las células de bazo se reestimularon con antígeno usando CFSE o CTO para determinar la cantidad de proliferación específica de Ag.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para usar en un método que promueve una respuesta inmunitaria tolerogénica a un antígeno que de otro modo causaría una respuesta inmunitaria no deseada cuando se administra a un sujeto, en donde:
(a) la composición comprende nanoportadores sintéticos acoplados a: rapamicina o un análogo de rapamicina con una carga de no más de 25% (p/p); y epítopos restringidos por MHC de clase II de dicho antígeno con una carga de no más de 25% (p/p); y
(b) la composición está en una cantidad efectiva para reducir la producción de anticuerpos específicos para dicho antígeno en el sujeto, y en donde la composición no comprende epítopos de células B que generan una respuesta humoral no deseada contra dicho antígeno.
2. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno es: una proteína terapéutica; un autoantígeno; un alergeno; o un antígeno asociado con una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de órganos o tejidos, o enfermedad de injerto contra huésped.
3. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los nanoportadores sintéticos comprenden nanopartículas poliméricas, que comprenden, por ejemplo, uno o más de: (a) un polímero plurónico no terminado con metoxi; o (b) un poliéster, opcionalmente acoplado a un poliéter, poliaminoácido, policarbonato, poliacetal, policetal, polisacárido, polietiloxazolina o polietilenimina.
4. La composición para el uso de la reivindicación 3, en donde la nanopartícula comprende: (a) un poliéster que comprende un poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o policaprolactona; y/o (b) poliéster y un poliéster acoplado a un poliéter, opcionalmente en donde el poliéter comprende polietilenglicol o polipropilenglicol.
5. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la media de una distribución de tamaño de partículas obtenida usando dispersión dinámica de luz de los nanoportadores sintéticos es un diámetro: mayor que 100 nm; mayor de 150 nm; mayor que 200 nm; mayor de 250 nm; o mayor que 300 nm.
6. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de los nanoportadores sintéticos tienen una dimensión mínima o dimensión máxima que está dentro de 5%, 10% o 20% del diámetro medio de los nanoportadores sintéticos.
7. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los nanoportadores están acoplados a rapamicina.
8. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los nanoportadores se acoplan además a epítopos restringidos por MHC de clase I.
9. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se van a administrar al sujeto una o más dosis de mantenimiento de la composición.
10. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición se va a administrar por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o intramuscular.
11. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sujeto: (a) tiene o está en riesgo de tener una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una alergia, rechazo de órganos o tejidos, o enfermedad de injerto contra huésped; y/o
(b) se ha sometido o se someterá a un trasplante; y/o
(c) tiene o está en riesgo de tener una respuesta no deseada contra una proteína terapéutica que se está administrando o se administrará al sujeto.
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