BR112014032207B1 - Composição compreendendo um antígeno acoplado a uma partícula transportadora e uso de um antígeno acoplado a uma partícula transportadora - Google Patents

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Abstract

composição compreendendo um antígeno acoplado a uma partícula transportadora e uso de um antígeno acoplado a uma partícula transportadora. a presente invenção fornece composições compreendendo partículas de poli (lactida-co-glicolida) (plg) acopladas a peptídeo. em particular, partículas de plg são funcionalizadas na superfície para permitir acoplamento de moléculas de peptídeo à superfície das partículas (por exemplo, para uso em elicitar indução de tolerância imunológica).

Description

DECLARAÇÃO DE PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente US 61/662.687, depositado em 21 de junho de 2012, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
APOIO FEDERAL
[0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob R01 EB013198 concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos nesta invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] Doenças inflamatórias e distúrbios são condições nas quais uma resposta inflamatória anormal ou desregulada de outro modo contribui para a etiologia e gravidade da doença. Exemplos incluem doenças autoimunes, como diabetes do tipo 1 e doença celíaca.
[0004] Muitas dessas doenças são caracterizadas por uma infiltração de células mononucleares no local de uma lesão no tecido ou outro insulto. Exemplos de células mononucleares que foram observadas nessas infiltrações incluem linfócitos, especialmente linfócitos T e células do sistema fagócito mononuclear (células MPS), como monócitos, macrófagos, células dendríticas, células microgliais e outras.
[0005] Muitas das células observadas nos infiltrados de células mononucleares são suspeitas de terem um papel nessas respostas inflamatórias anormais. Por exemplo, em doenças como esclerose múltipla, as células T CD4+ são conhecidas por desempenharem um papel central na resposta autoimune patológica. Em um ponto de tempo mais cedo na ativação de células T, células dendríticas e outras células MPS podem ser responsáveis pela ativação das células T CD4+. Células MPS também poderiam contribuir para a inflamação através de fagocitose, embora pelo menos em algumas doenças inflamatórias não está claro se essas células seriam capazes disso, na ausência de células T CD4+.
[0006] Monócitos do sangue periférico podem ser classificados em um dos dois grupos de acordo com a expressão ou não de certas moléculas da superfície celular. Em particular, os monócitos humanos “residentes” ou “monócitos maduros” são entendidos como tendo um fenótipo CD14loCD16+ (a contrapartida do camundongo é CX3CR1hiCCR2-Gr1-). Outro grupo de células, os “monócitos inflamatórios” ou monócitos “imaturos” são entendidos como tendo um fenótipo CD14+CD16- (a contrapartida do camundongo é CX3CR1loCCR2+Gr1+). (Geissmann F. et al 2003 Immunity. 19: 71-82)
[0007] É importante notar que, enquanto os últimos são entendidos como sendo “inflamatórios” no sentido de que eles são observados para migrar para o tecido inflamado a partir de medula óssea derivada de células de sangue periférico, estas células não demonstraram causar inflamação diretamente ou através da ação de outras células. Além disso, as várias células MPS que podem ser formadas quando estas células se diferenciam também não demonstraram causar inflamação.
[0008] Estratégias clínicas convencionais para a imunossupressão geral a longo prazo em distúrbios associados com uma resposta imune indesejada está baseada na administração a longo prazo de drogas imunossupressoras gerais que atuam, por exemplo, bloqueadores de sinal 1, como ciclosporina A (CsA), FK506 (tacrolimus) e corticosteroides. O uso a longo prazo de doses elevadas destas drogas pode ter efeitos secundários tóxicos. Além disso, mesmo para aqueles pacientes que são capazes de tolerar essas drogas, a necessidade de terapia com droga imunossupressora ao longo da vida acarreta um risco significativo de efeitos secundários graves, incluindo tumores, infecções graves, nefrotoxicidade e distúrbios metabólicos.
[0009] Os métodos para induzir tolerância específica para o antígeno foram desenvolvidos, incluindo o acoplamento de células de um antígeno ou de peptídeo. Por exemplo, em um método, tolerância de célula acoplada induzida por peptídeo envolveu coleta, tratamento e separação das células do sangue periférico com doenças de autoantígenos específicos e reagente de acoplamento etileno carbodi-imida (ECDI) sob condições estéreis, e reinfusão posterior para o doador/paciente. Este processo é caro e deve ser conduzido sob condições cuidadosamente monitorados por médicos qualificados e é limitado no número de centros que podem conduzir o procedimento. O uso de células vermelhas do sangue como o tipo de célula doadora expande a fonte potencial para incluir doadores alogênicos, aumentando assim o fornecimento de células de origem de forma dramática e potencialmente ampliando a liberação desta terapia para qualquer configuração certificada para transfusão de sangue. Essas abordagens têm limitações significativas em termos de fornecimento de células de origem e de necessidade para o tipo de tecido de correspondência para minimizar a resposta imune às células do doador. Além disso, o tratamento local das células para acoplar autoantígenos através de EDCI apresenta um problema de controlo de qualidade significativo. Além disso, essas abordagens também exigem pelo menos algum conhecimento do antígeno patológico pelo qual a tolerância imunológica é requerida.
[0010] Recentemente, partículas acopladas com peptídeos foram descritas, que elimina a necessidade de um fornecimento de células de origem e contorna o requisito de tipificação de tecido de uma das abordagens anteriores, ver WO 2010/085509, aqui incorporada por referência na sua totalidade. No entanto, estas abordagens ainda dependem de tolerância imune específica para o antígeno.
[0011] Tolerância específica para o antígeno, geralmente não é ideal porque antígenos específicos/epítopos geralmente não são conhecidos em doenças humanas. Além disso, os antígenos podem variar de sujeito para sujeito, a fim de que uma abordagem específica de antígeno seja eficaz, portanto, seria necessário determinar quais antígenos cada paciente individual reconhecer, ou seria necessário acoplar uma biblioteca de peptídeos possíveis para as partículas antes da administração. A síntese e acoplamento individual destes peptídeos é ao mesmo tempo demorado e caro. Portanto, existe uma necessidade de uma terapia que resolve ambos estes problemas, eliminando desta forma a necessidade de uma fonte de células de tecido correspondente e, ao mesmo tempo elimina a necessidade de sintetizar e acoplar grandes painéis de peptídeos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições (por exemplo, para a indução de tolerância específica para o antígeno) que compreende uma partícula transportadora (por exemplo, partículas de PLG) ligada a um peptídeo antigênico. Em certas modalidades, a partícula transportadora é uma partículas de poli (lactida coglicolida) (PLG).
[0013] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições compreendendo: um antígeno acoplado a uma partícula transportadora com um potencial zeta negativo . Em algumas modalidades, o potencial zeta das partículas é de cerca de -100 mV a cerca de 0 mV. Em algumas modalidades, o potencial zeta da partícula é de cerca de -50 mV até cerca de -40 mV. Em algumas modalidades, a partícula é um copolímero possuindo uma razão molar de cerca de 80:20 a cerca de 100: 0. Em algumas modalidades, a proporção de copolímeros pode ser, entre outras, poliestireno: poli (carboxilato de vinil)/80: 20, poliestireno: poli (carboxilato de vinil)/90:10, poli (carboxilato de vinil): poliestireno/80:20, poli (carboxilato de vinil): poliestireno/90: 10, ácido poliláctico: ácido poliglicólico/80: 20, ou ácido poliláctico: ácido poliglicólico/90: 10. Ainda em outras modalidades, a partícula é uma partícula de poliestireno, uma partícula de poliestireno carboxilada, ou uma partícula poli (ácido láctico-co-glicólico). Em algumas modalidades, a partícula é uma partícula poli (ácido láctico-coglicólico).
[0014] Em algumas modalidades, a partícula tem um diâmetro de entre cerca de 0,1 μm a cerca de 10 μm. Em algumas modalidades, a partícula tem um diâmetro de entre cerca de 0,3 μm a cerca de 5 μm. Em algumas modalidades, a partícula tem um diâmetro de entre cerca de 0,5 μm a cerca de 3 μm. Em algumas modalidades, a partícula tem um diâmetro de entre cerca de 0,5 μm a cerca de 1 μm. Em algumas modalidades, a partícula tem um diâmetro de cerca de 0,5 μm.
[0015] Em outras modalidades, o antígeno compreende pelo menos uma porção de um antígeno autoimune, um antígeno expresso sobre um tecido a ser transplantado em um sujeito, ou um alérgeno. Em algumas modalidades, o antígeno compreende pelo menos uma porção da proteína básica de mielina, receptor de acetilcolina, antígeno endógeno, glicoproteína oligodendrocítica de mielina, antígeno das células beta do pâncreas, insulina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD), colágeno tipo 11, gp39 de cartilagem humana, fp130 -RAPS, proteína proteolipídeo, fibrilarina, pequena proteína nucleolar, receptor do fator estimulador da tireoide, histonas, glicoproteína gp70, piruvato acetiltransferase de-hidrolipoamida desidrogenase (PCD-E2), antígeno folículo piloso, A-gliaden e isoforma 5 tropomiosina humana, pólen de gramíneas Bahia (BaGP), alérgeno de pêssego Pru p 3, alérgeno de leite caseína alfa s 1, alérgeno de aipo Apig1, alérgeno de castanha do Pará Bere1, alérgeno de leite B-lactoglobulina, albumina de soro bovino, alérgeno de Avelã Cor a 1.04, ou alérgeno de ovo ovalbumina.
[0016] Em outras modalidades, o antígeno compreende um antígeno autoimune, um antígeno expresso sobre um tecido a ser transplantado em um sujeito, ou um alérgeno. Em modalidades não limitativas, o antígeno compreende, por exemplo, proteína básica de mielina, receptor de acetilcolina, antígeno endógeno, glicoproteína oligodendrocítica de mielina, antígeno das células beta do pâncreas, insulina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD), colágeno tipo 11, cartilagem humana gp39, fp130-RAPS, proteína proteolipídeo, fibrilarina, pequena proteína nucleolar, receptor do fator estimulador da tireoide, histonas, glicoproteína gp70, piruvato acetiltransferase de-hidrolipoamida desidrogenase (PCD-E2), antígeno folículo piloso, A-gliaden, ou isoforma 5 de tropomiosina humana, pólen de gramíneas Bahia (BaGP), alérgeno de pêssego Pru p 3, alérgeno de leite caseína alfa s 1, alérgeno de Apig1, alérgeno de castanha do Pará Bere1, alérgeno de leite B-lactoglobulina, albumina de soro bovino, alérgeno de Avelã Cor a 1.04, ou alérgeno de ovo ovalbumina.
[0017] Em algumas modalidades, o antígeno é acoplado à referida partícula por uma molécula de conjugado. Em algumas modalidades, o antígeno é acoplado à referida partícula por um ligante. Em algumas modalidades, a molécula de conjugado é etileno carbodi-imida (ECDI). Em algumas modalidades, oantígeno é acoplado ao exterior da partícula com um potencial zeta negativo. Em algumas modalidades, o antígeno é encapsulado na partícula, que tem um potencial zeta de superfície negativo.
[0018] Em algumas modalidades, a partícula é biodegradável. Em algumas modalidades, a superfície das partículas é funcionalizada. Em algumas modalidades, a partícula ésuperfície de carboxilato funcionalizado.
[0019] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona métodos para induzir tolerância específica para o antígeno em um sujeito, que compreende: a administração ao dito sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma partícula acoplada ao antígeno ao dito sujeito, em que a dita partícula tem um potencial zeta negativo, e em que a dita partícula e antígeno induzem a tolerância do dito antígeno em dito sujeito. Em algumas modalidades, administração é realizada para tratar ou prevenir uma doença ou condição. Em algumas modalidades, administração é realizada antes ou depois do aparecimento de uma doença ou condição que é causada pelo dito antígeno. Em algumas modalidades, a doença ou condição é selecionada de entre o grupo consistindo de: uma doença autoimune, doença inflamatória, alergia, rejeição de transplantes, e uma resposta hiperimune. Em algumas modalidades, a doença ou condição é selecionada a partir do grupo que consiste em: esclerose múltipla, diabetes de tipo 1, asma, alergia alimentar, uma alergia ambiental, doença celíaca, e uma condição causada pelo dito antígeno em dito sujeito para reduzir a reação excessiva a dito antígeno. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda repetir a dita administração da dita composição no dito sujeito.
[0020] Em algumas modalidades, a composição é administrada por via intravenosa.
[0021] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona ainda um processo para a preparação de uma partícula imunológica modificada com um potencial zeta negativo compreendendo o dito processo: o contato de um precursor de partícula modificada imune com uma solução tampão em condições eficazes para formar a partícula modificada imune com um potencial zeta negativo. Em algumas modalidades, o precursor de partículas imune modificado é formado por copolimerização. Em algumas modalidades, a solução tampão tem um pH básico. Em algumas modalidades, uma solução tampão é bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, bicarbonato de lítio, di- hidrogenofosfato de potássio, di-hidrogenofosfato de sódio, di- hidrogenofosfato ou fosfato de lítio.
[0022] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um antígeno encapsulado dentro do núcleo de um lipossoma funcionalizado na superfície. Em outra modalidade, o lipossoma é composto na proporção de 30:30:40 fosfatidilcolina: fosfatidilglicerol: colesterol. Em ainda outra modalidade, o dito antígeno compreende um antígeno autoimune, um antígeno expresso sobre um tecido a ser transplantado em um sujeito, ou um alérgeno.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0023] A Figura 1 mostra (A) mostra uma micrografia de uma partícula poli (lactida coglicolida) (PLG). B e C mostram a caracterização de partículas poli (lactida coglicolida) funcionalizadas na superfície por meio de análise de espalhamento de luz dinâmica. Partículas poli(lactida- coglicolida) de superfície funcionalizada foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 2,5 x 10 5 contagens por segundo em 18,2 mQ água. A população de partículas poli (lactida coglicolida) de superfície funcionalizada variou de 5-15%, por lote, mas geralmente tinha um diâmetro médio Z de 567 nm, um pico de diâmetro de 670 nm e um índice de polidispersividade de 0,209.
[0024] A Figura 2 mostra que as nanopartículas de PLG induzem tolerância específica para o antígeno. A proteína proteolipídica imunodominante PLP139-151 epítopo (PLG-PLP139-151) foi utilizada para induzir a tolerância para a prevenção de reincidência da encefalite autoimune experimental (R-EAE). Os camundongos foram tratados com PLP139-151-PLGA (N = 5), OVA323-339-PLGA (N = 5), ouPLGA não conjugado (N = 5) no dia -7 em relação ao momento da imunização (dia 0). Doença de Peak foi tipicamente observada em torno do dia 12 a 14, e os camundongos são classificados para a doença clínica. Partículas sem peptídeo, ou modificadas com o peptídeo controle OVA323-339 não impediram a indução da doença. No entanto, as partículas de PLGA modificadas com PLP 139-151 produziram um escore clínico de 0 (sem doença) em todos, exceto escores clínicos baixos de menos de 1 exibidos entre os dias 20 e 30.
[0025] A Figura 3 mostra que o tipo de partícula administrada tem um efeito sobre o desenvolvimento de EAE no modelo do camundongo. A) mostra o escore clínico médio e B) mostra o escore cumulativo médio dos animais EAE. Os camundongos foram tratados com OVA323-339-PLS (N=5), OVA323-339-PLGAPHOSPOREX (N=5), OVA323-339-PLGAPEMA (N=5), PLP139-151-PLA (N=5), PLP139-151-PLGAPHOSPOREX (N=5), ou PLP139-151-PLGPEMA (N = 5) no dia -7 em relação ao momento da imunização (dia 0). Doença de Peak foi tipicamente observada em torno do dia 12 a 14, e os camundongos sãoclassificados para a doença clínica. Partículas, de qualquercomposição que foram modificadas com o peptídeo controle OVA323-339 não impediram a indução da doença. No entanto, o PLP 139-151 acopladas às esferas PLG foram mais eficazes na indução de umaregulação para baixo de R-EAE do que PLP 139-151 PLG acoplado(phosphorex) comercial ou poliestireno.
[0026] A Figura 4 mostra que os camundongos tratados com OVA solúvel no dia 28 exibiram um decréscimo de temperatura em comparação com os animais tratados com a partícula OVA-PLG. Nenhuma diminuição da temperatura corporal foi observada dentro de 1 hora da liberação das partículas.
[0027] A Figura 5 mostra que a administração de PLG-PLP durante a remissão não resulta em qualquer mortalidade associada à anafilaxia. A EAE foi induzida em camundongos fêmeas SJL/J de seis a oito semanas de idade por injeção subcutânea de PLP139-151 em CFA, e o desenvolvimento da doença clínica foi monitorado e registrado (B). No dia 21 em relação à indução da doença, os camundongos receberam injeções IV do PLP139-151 solúvel (quadrados claros), OVA323-339 solúvel (círculos claros), ou os mesmos peptídeos acoplados a nanopartículas de PLG (sólidos). Temperatura dos animais foi monitorada e registrada a cada 10 minutos durante 1 hora após a injeção (A)
[0100] A Figura 6 mostra a dose ideal de PLP139-151-PLG administrada por via intravenosa sete dias antes da indução da doença. O desenvolvimento de doença clínica foi medido em comparação com os camundongos SJL/J tratados com OVA323-339-PLG (A). Camundongos fêmeas SJL/J de seis a oito semanas de idade foram injetados iv com PLP139-151 (quadrado) - ou OVA323-339 (círculo) - juntamente nanopartículas de PLG. A EAE foi induzida por injeção subcutânea de PLP139-151 em CFA 7 dias (B), 25 dias (C), ou 50 dias (D) depois. Os animais do painel B foram acompanhados por doença clínica por 100 dias. No dia 8 em relação à indução da doença, uma hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) a reação foi realizada em um subconjunto dos camundongos mostrados no painel B (E). Animais representativos selecionados dos grupos iniciados com PLP139-151 /CFA no painel B (OVA323-339-PLG e PLP139-151-PLG) foram desafiados na orelha com o epítopo de iniciação PLP139-151 e peptídeo controle OVA323-339. Inchaço da orelha como uma medida de DTH foi determinado 24 horas mais tarde e as respostas antes do desafio foram subtraídas. Camundongos fêmeas SJL/J de seis a oito semanas de idade foram injetados por via intravenosa com PLP178-191 (triângulo)-, OVA323-339 (círculo) ou PLP139-151 (quadrado) acoplados a nanopartículas de PLG, ou com partículas não acopladas sozinhas (círculo delineado) (F). A EAE foi induzida 7 dias mais tarde por injeção subcutânea de PLP178-191 em CFA, e doença foi monitorada nos pontos de tempo indicados.
[0101] A Figura 7A-D mostra que a tolerância profilática é mais eficiente quando partículas PLG-PLP139-151 são administradas por via intravenosa ou intraperitoneal. Os animais tratados com PLP139-151-PLG administrados por via intravenosa não desenvolveram a doença e apresentaram escores clínicos médios de 0 na maioria dos pontos de tempo.
[0102] Figura 8A-F mostra que a administração de partículas OVA323-339-PLG inibiu as respostas Th1 e Th17 nos animais tratados.
[0103] Figura 9A-C mostra uma redução na infiltração de células imunes no interior da medula espinal de animais tratados com PLP139-151-PLG e que era mais semelhante ao tecido natural do que para tecido de animais tratados com OVA323-339-PLG. Animais tratados com OVA323-339-PLG apresentaram coloração positiva para CD45, CD4, e CD11b; enquanto que, animais tratados apresentaram com PLP139-151-PLG tiveram coloração mínima para esses fatores.
[0104] Figura 10A-C mostra que a administração de partículas PLP139-151-PLG inibe o rompimento da barreira hematoencefálica (BHE) e ativação de macrófagos na medula espinhal de camundongos tratados. Os animais foram tratados com adjuvante completo de Freund (CFA), partículas OVA323-339 PLG, ou partículas PLP139-151- PLG. Os escores clínicos e incidência percentual de EAE foram determinados (B) e as medulas espinhais observadas via imagem in vivo (A e C).
[0028] Figura 11A e B mostram as medulas espinhais de camundongos tratados através de imagem in vivo. C-D são gráficos mostrando a quantificação dos dados de imagem.
[0029] A Figura 12 mostra que a administração de partículas de PLG em que PLP139-151 foi encapsulada inibe a indução de R-EAE em camundongos. A capacidade de encapsular autoantígenos permite o uso de misturas complexas de proteínas ou ainda homogeneizados de órgãos que não são possíveis com a ligação à superfície, permitindo uma maior cobertura antígeno e tratando assim de forma mais eficaz com epítopo se espalhando.
[0030] A Figura 13 mostra que os animais tratados com o partículas PLP139-151-PLG e um anticorpo anti-CD25 demonstrou, por vezes, um escore clínico médio maior do que nos animais tratados com partículas PLP139-151-PLG e um anticorpo de controle IgG.
[0031] A Figura 14 mostra que a tolerância terapêutica induzida por partículas PLP139-151-PLG em EAE ativa e adotiva. EAE Adotiva foi induzida em camundongos fêmeas SJL/J de seis a oito semanas de idade por transferência adotiva de 2,5x106 blastos ativados por PLP139-151. Os camundongos foram injetados iv com peptídeo PLP139-151 (quadrados) ou OVA323-339 (círculos) acoplado a 500nm de nanopartículas PLG 2 dias (A) ou 14 dias (C) após a indução da doença. Escores clínicos de doença foram comparados com aqueles após o tratamento com esplenócitos acoplados com antígeno (A). Cérebro e medula espinhal foram coletados de camundongos tornados tolerantes por PLP139-151- ou OVA323-339 para análise histológica no dia 42. Secções de camundongos do painel A foram coradas para proteína PLP e CD45 (B). Secções da medula espinhal de camundongos a partir do painel (C) foram coradas com Luxol Fast Blue (D). As áreas de desmielinização e de infiltração celular são indicadas por setas.
[0032] A Figura 15 mostra gráficos que ilustram os escores clínicos médios de camundongos com EAE ativa e EAE adotiva após tratamento com partículas SP ou PLG conjugadas com OVA 323-339 ou PLP139-151. Os camundongos foram injetados iv com peptídeo PLP139- 151-SP, PLP139-151-PLG, ou OVA323-339-SP, ou OVA323-339-PLG acoplado a 500nm de nanopartículas 10 dias (A) ou 2 dias (B) após a indução da doença e o escore clínico médio foi determinado. Em ambos os casos, a administração de partículas PLP139-151-PLG induz tolerância nos camundongos.
[0033] A Figura 16 mostra a infiltração de células imunes do sistema nervoso central também é reduzida drasticamente em camundongos tornados tolerantes com PLP-PLG. Camundongos SJL/J foram injetados i.v. com 500nm de nanopartículas PLG juntamente com PLP139-151 (quadrados) ou OVA323-339 (círculos) 2 dias após a indução de EAE por transferência adotiva. No pico da doença (dia 14) os cérebros e medulas espinhais foram removidos e os números de linfócitos (B), APC (C), microglia (D), células dendríticas periféricas (E), células dendríticas mieloides (F) e macrófagos (G) foram contados por citometria de fluxo. A estratégia de propagação para estas populações está representada em (A). Preparações de células do SNC foram estimuladas com PMA e ionomicina durante 5 h antes da coloração intracelular para a IL-17A e IFN-Y (H).
[0034] A Figura 17 mostra que a administração do peptídeo PLP 139-151 encapsulado em uma partícula PLG induz tolerância quando a partícula é administrada com PBS. No entanto, a administração do anticorpo anti-PD-1 diminui esta tolerância.
[0035] A Figura 18 mostra que a administração do peptídeo PLP 139-151 encapsulado em uma partícula PLG induz tolerância quando a partícula é administrada com PBS. A administração de um anticorpo anti-CD40 diminui esta tolerância, mas esta diminuição na tolerância é invertida pela adição de um anticorpo anti-IL- 12.
[0036] A Figura 19A-G mostra que a administração profilática de OVA-PLG reduziu a secreção de IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10, e reduziu os níveis de OVA IgE sérico e eosinófilos no pulmão.
[0037] A Figura 20 mostra que OVA encapsulado em partículas PLG profilaticamente inibe respostas de recall específicas de OVAin vitro de linfonodos do mediastino. A proliferação de linfonodo observada após re-estimulação com 25 μg de OVA é reduzida nesses animais tratados com OVA-PLG (A). Além disso, o tratamento com OVA-PLG reduz a liberação de citocinas após re- estimulação com OVA. Os níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10 são reduzidos em camundongos tratados com OVA-PLG (B).
[0038] A Figura 21 mostra que a administração terapêutica de OVA-PLG reduziu a secreção de IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10, e reduziu os níveis séricos de OVA IgE e eosinófilos no pulmão.
[0039] A Figura 22 mostra que OVA encapsulado em partículas PLG terapeuticamente regula negativamente as citocinas Th2 específicas de OVA no BAL melhor do que partículas de PLG acopladas ao OVA. Os camundongos foram tratados por via intraperitoneal com OVA/alum com uma dose de 10 μg/camundongo no dia 0 e dia 14. Os camundongos foram administrados por via intravenosa com OVA-acoplado às partículas de PLG ou OVA encapsulado em partículas de PLG nos dias 28, e 42. Entre dias 56-58, os camundongos foram tratados três vezes com OVA em aerossol. Os gráficos mostram a secreção de citocinas quando os animais foram tratados com OVA acoplado às partículas de PLG (A) ou OVA encapsulados dentro de partículas de PLG (B).
[0040] A Figura 23 mostra os níveis de glicose no sangue de animais diabéticos tipo 1 após o tratamento com partículas de p31-PLG. A administração do peptídeo p31 acoplado às partículas de PLG resultou em baixos níveis de glicose no sangue em comparação com os observados após a administração com partículas peptídicas acopladas ao peptídeo MOG35-55 (A e B). A percentagem de células que secretam IFN-y observada nos animais também foi reduzida nos camundongos tratados com p31-PLG em comparação com camundongos tratados com peptídeo MOG35-55 -PLG (C).
[0041] Figura 24A-B mostra que a tolerância induzida por p31- PLG requer Tregs. O diabetes tipo 1 foi induzida em camundongos por transferência adotiva. Duas horas após as células ativadas terem sido transferidas para os camundongos NOD.SCID, os camundongos foram tornados tolerantes com p31-PLG ou partículas MOG35-55 PLG. A exaustão das Tregs revoga a tolerância induzida pela administração de partículas p31-PLG.
[0042] A Figura 25 mostra que a administração de partículas PLG acopladas à insulina aumentou significativamente a percentagem de camundongos que não desenvolveram diabetes mais de 300 dias (69,6% comparado com 22,7%; p = 0,0027). Camundongos NOD foram tratados com partículas PLG acopladas a BSA (N = 22) ou insulina (N = 23) através de administração intravenosa em 6, 8, e 10 semanas de idade. Os camundongos foram, em seguida, avaliados para o desenvolvimento de diabetes.
[0043] A Figura 26 mostra a percentagem de células doadoras CD45.1 observadas nos camundongos receptores. Camundongos fêmeas CD45.2 foram tornados tolerantes com OVA-PLG ou Dby-PLG no dia - 7. No dia -1, os camundongos foram irradiados com 200 rads e foram então transplantados com 1x106, 5x106, ou 1x107 células de medula óssea de camundongos machos CD45.1 no dia 0. Os camundongos receptores foram então tornados tolerantes com OVA- PLG, Dby-SP, ou Dby-PLG no dia 1 e o sangue colhido para análise FACS de quimerismo.
[0044] A Figura 27 mostra a percentagem de células doadoras CD45.1 nos camundongos receptores após a indução de tolerância com OVA-PLG, Dby-SP, ou Dby-PLG no dia 1. Um camundongo de controle positivo não demonstrou enxerto significativo (~ 10%). Todos os camundongos de controle negativo não enxertaram células doadoras. Um camundongo Dby-SP não demonstrou enxerto significativo (~ 10%). Dois camundongos OVA-PLG enxertaram células doadoras (~ 10%): um completamente rejeitou pela Semana 16. Um camundongo Dby-PLG começou a rejeitar na Semana 12 e estava em 10% na Semana 16. O grupo Dby-PLG variou de 10% -56% de enxerto pela Semana 16. Os camundongos OVA-PLG demonstraram: 1) enxerto espontâneo, 2) homologia de sequência entre OVA323 e Dby, ou 3) propriedades tolerogênicas de partículas. Dby-PLG permite mais enxerto do que Dby-SP e OVA-PLG.
[0045] A Figura 28 mostra que a tolerância de temporização tem um efeito sobre a percentagem de células CD45.1 no camundongo receptor. Controles positivos mostram menos enxerto (~4%) do que o esperado (~10%). Um camundongo de controle negativo tinha 5% enxerto Fora de todos os 3 grupos OVA-PLG, um camundongo no grupo Dia -7, Dia +1 mostrou o enxerto (12%). Tolerância no dia 1 é clinicamente mais relevante do que a tolerância no dia -7.
[0046] A Figura 29 mostra que as partículas de PLGA cumarina- 6, que foram acopladas a um antígeno ou estavam isentas de antígeno, foram detectáveis 3 horas após a administração, mas não 24 horas após a administração. As partículas foram detectáveis 3 horas após a administração, mas não 24 horas após a administração. Camundongos naive não injetados (linha superior) em comparação com iv micropartículas PLGA/PEMA fluorescente injetada em seções de baço de camundongo (coluna da esquerda), fígado (coluna do meio) e pulmão (coluna da esquerda) em 3 horas após a injeção (linha do meio) e 24 horas (linha inferior) após injeção contrastadas com DAPI.
[0047] A Figura 30 mostra que o partículas PLGA colocalizadas após 6 e 15 horas com células F4/80+ no fígado.
[0048] A Figura 31 mostra que os macrófagos da zona marginal predominantemente absorvem partículas acopladas a PLP139-151 marcadas com TAMRA 24 horas após a infusão intravenosa. O maior percentual de células PLP139-151+ são os macrófagos da zona marginal.
[0049] A Figura 32 ilustra o escore clínico médio diário contra o número de dias PLP139-151/iniciação CFA. R-EAE induzida por PLP139-151/CFA é inibida em camundongos SJL/J por meio da indução de tolerância imunológica utilizando partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo PLP139-151 solúvel nos seus núcleos.
[0050] A Figura 33 mostra que os camundongos tratados com OVA-PLG encapsulado apresentou a maior redução no acúmulo de eosinófilos.
[0051] A Figura 34 mostra que camundongos tratados com OVA- PLG encapsulado mostrou a maior redução no nível de IgE sérico em comparação com animais não tratados ou tratados com controle.
[0105] A Figura 35 mostra a caracterização de partículas poli (lactida coglicolida) funcionalizadas na superfície partículas contendo PLP139-151 solúvel dentro de seus núcleos por meio de análise de espalhamento de luz dinâmica. Partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 1,792 x 105 contagens por segundo em 18,2 MO água. A população de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinha um diâmetro médio Z de 584 nm, um diâmetro de pico de 679 nm e um índice de polidispersividade de 0,162. Estes resultados são representativos de seis lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito.
[0106] A Figura 36 mostra a caracterização de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo PLP139-151 solúvel dentro de seus núcleos por medição de potencial Z- Partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 6,67 x 104 contagens por segundo em 18,2 MO água. A população de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinha um pico potencial Z de - 48,9 mV e um desvio Z de 5,14 mV. Estes resultados são representativos de seis lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito.
[0107] A Figura 37 mostra a caracterização de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo ovalbumina solúvel dentro de seus núcleos por meio de análise de espalhamento de luz dinâmica. Partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 1,822 x 105 contagens por segundo em 18,2 MO água. A população de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinham um diâmetro médio Z de 569,7 nm, um pico de diâmetro de 700,3 nm e um índice de polidispersividade de 0,230. Estes resultados são representativos de três lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito.
[0108] A Figura 38 mostra a caracterização de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo ovalbumina solúvel nos seus núcleos por medição potencial Z. Partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 2,67 x 104 contagens por segundo em 18,2 MO água. A população de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinha um pico potencial Z de -52,2 mV e um desvio Z de 5,38 mV. Estes resultados são representativos de três lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito.
[0109] A Figura 39 mostra um gráfico que demonstra que os lipossomas de superfície funcionalizada contendo peptídeo PLP139- 151 solúvel nos seus núcleos induz a tolerância imunológica no modelo murino de esclerose múltipla. Os animais foram tratados com lipossomas com superfície funcionalizada contendo peptídeo PLP139-151 solúvel nos seus núcleos (círculos) ou lipossomas com superfície funcionalizada contendo peptídeo OVA323-339 solúvel (quadrados). Os escores clínicos médios dos animais que receberam os lipossomos de peptídeo PLP139-151 foi menor do que de animais que receberam lipossomos de peptídeo OVA323-339 .
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0110] Os presentes inventores descobriram que as nanopartículas acopladas ao antígeno podem induzir tolerância à doença autoimune e diminuir a resposta imune. Estas partículas podem induzir tolerância, independentemente do fato de serem ligadas à superfície da partícula ou encapsuladas dentro. Estas partículas, por conseguinte, podem ser úteis no tratamento de qualquer doença ou condição caracterizada por uma resposta imune inflamatória excessiva, como as doenças autoimunes.
[0111] “Partícula” como aqui utilizado refere-se a qualquer composição não derivada de tecido objeto, pode ser uma esfera ou uma entidade do tipo esfera, grânulo, ou lipossomas. O termo “partícula”, o termo “partícula modificadora imune”, o termo “partículas transportadoras”, e o termo “esfera” podem ser utilizados alternadamente, dependendo do contexto. Além disso, o termo “partícula” pode ser usado para abranger grânulos e esferas.
[0112] “Partícula com carga negativa” como aqui utilizado refere-se às partículas que foram modificadas para possuírem uma carga de superfície líquida que é menor do que zero.
[0113] “Partículas carboxiladas” ou “grânulos carboxilados” ou “esferas carboxiladas” incluem qualquer partícula que foi modificada para conter um grupo carboxil na sua superfície. Em algumas modalidades a adição do grupo carboxil aumenta a absorção de fagócitos/monócitos das partículas de circulação, por exemplo, através da interação com receptores limpadores como MARCO. A carboxilação de partículas pode ser conseguida utilizando qualquer composto que adiciona grupos carboxil, incluindo, entre outros, poli (etileno-anidrido maleico) (PEMA).
[0114] “Fração antigênica” como aqui utilizado refere-se a qualquer fração, por exemplo, um peptídeo, que é reconhecido pelos hospedeiros do sistema imune. Exemplos de frações antigênicas incluem, entre outras, autoantígenos e/ou proteínas bacterianas ou virais, peptídeos ou componentes. Sem estar limitado pela teoria, enquanto as próprias esferas carboxiladas podem ser reconhecidas pelo sistema imune, as esferas carboxiladas com nada mais a elas ligado não são consideradas uma “fração antigênica” para os fins da presente invenção.
[0115] “Esferas naked” ou “partículas naked” ou “esferas naked” como aqui utilizado referem-se a grânulos, partículas ou esferas que não foram carboxilados.
[0116] “Mediadores pró-inflamatórios” ou “polipeptídeos pró- inflamatórios” como aqui utilizados referem-se aos polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos que induzem, mantêm ou prolongam a inflamação em um sujeito. Exemplos de mediadores pró- inflamatórios incluem, entre outras, citocinas e quimiocinas.
[0117] A partícula pode ter qualquer forma ou conformação de partícula. No entanto, em algumas modalidades, prefere-se utilizar partículas que são menos propensos a aglutinar-se, in vivo. Exemplos de partículas dentro destas modalidades são aqueles que têm uma forma esférica.
[0118] Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição que compreende uma partícula imune modificada com um potencial zeta negativo e livre de frações antigênicas. Em outra modalidade, a invenção proporciona composições que compreendem uma partícula imune modificada com um potencial zeta negativo acoplada a um antígeno. Em outra modalidade, o antígeno é acoplado ao exterior da partícula. Em ainda outra modalidade, o antígeno é encapsulado no interior da partícula.
[0119] Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um processo para a preparação de uma partícula imune modificada com um potencial zeta negativo e livre de frações antigênicas. O processo envolve o contato de um precursor de partícula modificado imune com uma solução tampão em condições eficazes para formar a partícula imune modificada com um potencial zeta negativo. Em algumas modalidades da presente invenção, o precursor de partícula modificado imune é formado através de copolimerização. A microestrutura das partículas pode depender do método de copolimerização.
[0120] Em algumas modalidades, uma molécula de peptídeo antigênico é acoplada ao transportador de partícula (por exemplo, partícula modificada imune) através de uma molécula de conjugado e/ou grupo ligante. Em algumas modalidades, o acoplamento do peptídeo antigênico e/ou molécula de sinalização apoptótica para o transportador (por exemplo, partículas de PLG) compreende um ou mais interações covalentes e/ou não covalentes. Em algumas modalidades, o peptídeo antigênico está ligado à superfície da partícula transportadora com um potencial zeta negativo. Em algumas modalidades, o peptídeo antigênico é encapsulado dentro da partícula transportadora com um potencial zeta negativo.
[0121] Em uma modalidade, a solução tampão de contato da partícula modificada imune pode ter um pH básico. O pH básico adequado para a solução de base inclui 7,1, 7,5, 8,0, 8,5, 9,5, 10,0 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, e 13,5. A solução tampão pode também ser feita de qual base adequada e o seu conjugado. Em algumas modalidades da invenção, a solução tampão pode incluir, sem limitação, bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, bicarbonato de lítio, di-hidrogenofosfato de potássio, di-hidrogenofosfato de sódio, ou di-hidrogenofosfato de lítio e conjugados dos mesmos.
[0122] Em uma modalidade da invenção, as partículas modificadas imune contêm copolímeros. Estes copolímeros podem ter variadas razões molares. Razão de copolímero apropriado das presentes partículas modificadas imunes pode ser de 80:20, 81:19, 82:18, 83:17, 84:16, 85:15, 86:14, 87:13, 88:12, 89:11, 90:10, 91:9, 92:8, 93:7, 94:6, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 99:1, ou 100:0. Em outra modalidade, o copolímero pode ser copolímeros periódicos, estatísticos, lineares, ramificados (incluindo estrela, escova ou pente de copolímeros). Em algumas modalidades, a proporção de copolímeros pode ser, entre outras, poliestireno: poli (carboxilato de vinil)/80: 20, poliestireno: poli (carboxilato de vinil)/90: 10, poli (carboxilato de vinil): poliestireno/80:20, poli (carboxilato de vinil): poliestireno/90: 10, ácido poliláctico: ácido poliglicólico/80: 20, ou ácido poliláctico: ácido poliglicólico/90: 10.
[0123] Em uma modalidade, a partícula é um lipossoma. Em outra modalidade, a partícula é um lipossoma constituído pelos seguintes lipídeos nas seguintes razões molares - 30:30:40 fosfatidilcolina: fosfatidilglicerol: colesterol. Em ainda outra modalidade, a partícula é encapsulada dentro de um lipossoma.
[0124] Não é necessário que cada partícula seja uniforme em tamanho, embora as partículas devam geralmente ser de um tamanho suficiente para estimular a fagocitose em uma célula apresentadora de antígeno ou de outras células MPS. De preferência, as partículas são microscópicas ou nanoscópicas em tamanho, de modo a aumentar a solubilidade, evitar possíveis complicações causadas pela agregação in vivo e para facilitar a pinocitose. O tamanho das partículas pode ser um fator de absorção a partir do espaço intersticial para áreas de maturação de linfócitos. Uma partícula com um diâmetro de cerca de 0,1 μ m até cerca de 10 μ m é capaz de desencadear fagocitose. Deste modo, em uma modalidade, a partícula tem um diâmetro dentro destes limites. Em outra modalidade, a partícula tem um diâmetro de cerca de 0,3 μm a cerca de 5 μm. Em ainda outra modalidade, a partícula tem um diâmetro de cerca de 0,5 μm a cerca de 3 μm. Em outra modalidade a partícula tem um tamanho de cerca de 0,1 μm, ou cerca de 0,2 μm ou cerca de 0,3 μm ou cerca de 0,4 μm ou cerca de 0,5 μm ou cerca de 1,0 μm ou cerca de 1,5 μm ou cerca de 2,0 μm ou cerca de 2,5 μm ou cerca de 3,0 μm ou cerca de 3,5 μm ou cerca de 4,0 μm ou cerca de 4,5 μm ou cerca de 5,0 μm. Em uma modalidade particular, a partícula tem um tamanho de cerca de 0,5 μ m. Em algumas modalidades, os pesos globais das partículas são menos do que cerca de 10.000 kDa, menos do que cerca de 5.000 kDa, ou inferior a cerca de 1000 kDa, 500 kDa, 400 kDa, 300 kDa, 200 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 20 kDa, 10 kDa. As partículas em uma composição não precisam ser de diâmetro uniforme. A título de exemplo, uma formulação farmacêutica pode conter uma pluralidade de partículas, algumas das quais são cerca de 0,5 μ m, enquanto outras são cerca de 1,0 μ m. Qualquer mistura de tamanhos de partículas dentro destas faixas dadas será útil.
[0125] As partículas da invenção podem possuir um potencial zeta em particular. Em certas modalidades, o potencial zeta é negativo. Em uma modalidade, o potencial zeta é inferior a cerca de -100 mV. Em uma modalidade, o potencial zeta é inferior a cerca de -50 mV. Em certas modalidades, as partículas possuem um potencial zeta de entre -100 mV e 0 mV. Em outra modalidade, as partículas possuem um potencial zeta de entre -75 mV e 0 mV. Em outra modalidade, as partículas possuem um potencial zeta de entre -60 mV e 0 mV. Em outra modalidade, as partículas possuem um potencial zeta de entre -50 mV e 0 mV. Em ainda outra modalidade, as partículas possuem um potencial zeta de entre -40 mV e 0 mV. Em outra modalidade, as partículas possuem um potencial zeta de entre -30 mV e 0 mV. Em outra modalidade, as partículas possuem um potencial zeta de entre -20 mV e +0 mV. Em outra modalidade, as partículas possuem um potencial zeta de entre -10 mV e -0 mV. Em uma modalidade particular, as partículas possuem um potencial zeta de entre -50 mV e -40mV.
[0126] Em algumas modalidades, a carga de um transportador (por exemplo, positivo, negativo, neutro) é selecionada para conferir benefícios específicos da aplicação (por exemplo, a compatibilidade fisiológica, interações peptídeo-superfície benéfica, etc.). Em algumas modalidades, um transportador tem uma carga neutra ou negativa líquida (por exemplo, para reduzir a ligação não especifica às superfícies celulares que, em geral, suportam uma carga global negativa). Em certas modalidades transportadores são capazes de serem conjugados, diretamente ou indiretamente, a um antígeno ao qual é desejada a tolerância (também dito aqui como um peptídeo específico para o antígeno, peptídeo antigênico, autoantígeno, antígeno indutor ou antígeno que gera tolerância). Em alguns casos, um transportador tem múltiplos sítios de ligação (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10... 20... 50... 100, ou mais), a fim de ter múltiplas cópias de um peptídeo específico de antígeno, ou múltiplos peptídeos diferentes, expostos na superfície (por exemplo, para aumentar a probabilidade de uma resposta de tolerância). Em algumas modalidades, um transportador exibe um único tipo de peptídeo antigênico. Em algumas modalidades, um transportador exibe vários peptídeos antigênicos diferentes sobre a superfície. Em algumas modalidades, uma superfície do transportador exibe os grupos funcionais para a ligação covalente de frações selecionadas (por exemplo, peptídeos antigênicos). Em algumas modalidades, os grupos funcionais de superfície do transportador proporcionam sítios para a interação não covalente com frações selecionadas (por exemplo, peptídeos antigênicos). Em algumas modalidades, um transportador tem uma superfície à qual frações de conjugação podem ser adsorvidas sem formação de uma ligação química.
[0127] Em algumas modalidades, a partícula é não metálica. Nestas modalidades a partícula pode ser formada a partir de um polímero. Em uma modalidade preferencial, a partícula é biodegradável em um indivíduo. Nesta modalidade, as partículas podem ser fornecidas a um indivíduo através de doses múltiplas sem que haja um acúmulo de partículas no indivíduo. Exemplos de partículas adequadas incluem partículas de poliestireno, partículas de PLGA, e partículas de diamante.
[0128] De preferência, a superfície da partícula é composta de um material que minimiza as interações biológicas não específicas ou indesejadas. As interações entre a superfície das partículas e o interstício pode ser um fator que desempenha um papel na absorção linfática. A superfície das partículas pode ser revestida com um material para prevenir ou diminuir as interações não específicas. Estabilização estérica por partículas de revestimento com camadas hidrofílicos, como poli (etileno glicol) (PEG) e seus copolímeros, como PLURONICS (incluindo copolímeros de poli (etileno-glicol) -bl-poli (propileno glicol) -bl-poli (etileno-glicol)) pode reduzir as interações não específicas com proteínas do interstício, como demonstrado por absorção linfática melhorada após injeções subcutâneas. Todos estes fatos apontam para a importância das propriedades físicas das partículas em termos de absorção linfática. Os polímeros biodegradáveis podem ser utilizados para preparar a totalidade ou alguns dos polímeros e/ou de partículas e/ou camadas. Os polímeros biodegradáveis podem sofrer degradação, por exemplo, por um resultado de grupos funcionais que reagem com a água na solução. O termo “degradação” como aqui utilizado refere-se a tornar-se solúvel, por redução do peso molecular ou por conversão de grupos hidrofóbicos aos grupos hidrofílicos. Polímeros com grupos éster são geralmente sujeitos a hidrólise espontânea, por exemplo, polilactidas e poliglicolidas.
[0129] As partículas da presente invenção podem também conter componentes adicionais. Por exemplo, os transportadores podem ter incorporados os agentes de imagem ou conjugado com o transportador. Um exemplo de um transportador de nanoesferas tendo um agente de imagem que é atualmente comercialmente disponível é as nanoesferas Kodak X-sight. Nanocristais luminescentes confinados em quânticos inorgânicos, conhecidos como pontos quânticos (QDs), surgiram como doadores ideais em aplicações FRET: seu alto rendimento quântico e deslocamentos de Stokes dependentes de tamanho ajustável permitem tamanhos diferentes para emitir do azul ao infravermelho quando excitados a um único comprimento de onda ultravioleta. (Bruchez, et al., Science, 1998, 281, 2013; Niemeyer, C. M Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 5796; Waggoner, A. Methods Enzymol. 1995, 246, 362; Brus, L. E. J. Chem. Phys. 1993, 79, 5566). Os pontos quânticos, como pontos quânticos híbridos orgânicos/inorgânicos baseados em uma classe de polímeros conhecida como dendrímeros, podem ser utilizados na rotulagem biológica, imagem e sistemas de biodetecção óptica. (Lemon, et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 12886). Ao contrário da síntese tradicional de pontos quânticos inorgânicos, a síntese destas nanopartículas de pontos quânticos híbridos não exige temperaturas elevadas ou reagentes altamente tóxicos e instáveis. (Etienne, et al., Appl. Phys. Lett. 87, 181913, 2005).
[0130] As partículas podem ser formadas a partir de uma vasta gama de materiais. A partícula é de preferência composta de um material adequado para utilização biológica. Por exemplo, as partículas podem ser compostas de vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidridos de ácidos dicarboxílicos, ou copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos e de ácidos dicarboxílicos. Mais geralmente, as partículas transportadoras podem ser compostas de poliésteres de cadeia linear ou ramificada, substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, linear ou reticulado, alcanil, haloalquil, tioalquil, aminoalquil, aril, aralquil, alquenil, aralquenil, heteroaril, ou ácidos alcoxi hidroxi, ou polianidridos de cadeia linear ou ramificada, substituído ou não substituído, saturado ou insaturado, lineares ou reticulados, alcanil, haloalquil, tioalquil, aminoalquil, aril, aralquil, alquenil, aralquenil, heteroaril, alcoxil ou ácidos dicarboxílicos. Além disso, as partículas transportadoras podem ser pontos quânticos, ou composto de pontos quânticos, como partículas de poliestireno de pontos quânticos (Joumaa et al. (2006) Langmuir 22: 1810-6). As partículas transportadoras, incluindo misturas de éster e ligações de anidrido (por exemplo, copolímeros de ácido glicólico e de ácido sebácico), podem também ser empregues. Por exemplo, as partículas transportadoras podem compreender materiais, incluindo polímeros de ácido poliglicólico (PGA), polímeros de ácido poliláctico (PLA), polímeros de ácido polisebácico (PSA), copolímeros de ácido poli (ácido láctico-co- glicólico) (PLGA ou PLG, os termos são intercambiáveis), copolímeros de ácido [rho]oli(láctico-co-ácido sebácico) (PLSA), copolímeros de ácido poli (láctico-co-ácido sebácico) (PGSA), etc. Outros polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, úteis na presente invenção incluem polímeros ou copolímeros de caprolactonas, carbonatos, amidas, aminoácidos, ortoésteres, acetais, cianoacrilatos e uretanos biodegradáveis, bem como copolímeros destes com cadeia linear ou ramificada, substituído ou não substituído, alcanil, haloalquil, tioalquil, aminoalquil, alquenil, ou hidroxi aromático ou ácidos dicarboxílicos. Além disso, os aminoácidos biologicamente importantes com os grupos da cadeia lateral reativos, como lisina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina, tirosina e cisteína, ou os seus enantiômeros, podem ser incluídos em copolímeros com os quais um dos materiais acima mencionados fornece grupos reativos para a conjugação de peptídeos antigênicos e proteínas ou frações de conjugação. Materiais biodegradáveis apropriados para a presente invenção incluem polímeros diamante, PLA, PGA, e PLGA. Materiais biocompatíveis não biodegradáveis também podem ser usados nas partículas transportadoras da invenção. Por exemplo, os polímeros não biodegradáveis de acrilatos, acetatos de etileno-vinil, acetatos de celulose substituída com acil, uretanos não degradáveis, estirenos, cloretos de vinil, fluoreto de vinil, imidazois de vinil, olefinas clorossulfonadas, óxido de etileno, álcoois vinílicos, TEFLON® (DuPont, Wilmington, Del.), e náilons podem ser empregues.
[0131] Esferas adequadas que estão atualmente disponíveis comercialmente incluem esferas de poliestireno, como FluoSpheres (Molecular Probes, Eugene, Oreg.).
[0132] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona sistemas, compreendendo: (a) uma estrutura de liberação configurada para a liberação de agentes químico e/ou biológicos para um sujeito; e (b) partículas poli (lactida coglicolida) acopladas a antígeno para a indução de tolerância específica para o antígeno. Em algumas modalidades, pelo menos uma fração da dita estrutura de liberação é microporosa. Em algumas modalidades, as partículas de poli-(lactida coglicolida) acopladas ao antígeno são encapsuladas no interior de dita estrutura. Em algumas modalidades, os agentes biológicos e químicos e/ou são selecionados a partir do grupo que consiste em: proteínas, peptídeos, moléculas pequenas, ácidos nucleicos, células e partículas. Em algumas modalidades os agentes biológicos, químicos e/ou compreendem célula, e ditas células compreendem células de ilhotas pancreáticas.
[0133] Propriedades físicas também estão relacionadas com a utilidade de uma nanopartícula após captação e retenção em áreas com linfócitos imaturos. Estas incluem propriedades mecânicas como rigidez ou elasticidade. Algumas modalidades baseiam-se em um núcleo elástico, por exemplo, um núcleo poli(sulfeto de propileno) (PPS) com uma camada exterior, por exemplo, uma camada exterior hidrofílica, como em PEG, como no sistema PPS- PEG recentemente desenvolvido e caracterizado por liberação sistêmica (mas não alvo ou imunes). O núcleo elástico está em contraste com um núcleo substancialmente rígido como em um sistema de nanopartículas de poliestireno ou de metal. O termo elástico refere-se a determinados materiais resilientes além de borrachas naturais ou sintéticas, com elástico sendo um termo familiar para especialistas nas técnicas de polímero. Por exemplo, o PPS reticulado pode ser usado para formar um núcleo elástico hidrofóbico. PPS é um polímero que se degrada emcondições oxidantes a polissulfóxido e, finalmente, apolissulfona, mudando de uma borracha hidrofóbica para umpolímero solúvel em água hidrofílico. Outros polímeros desulfeto podem ser adaptados para uso, com o termo polímero sulfeto que se refere a um polímero com um átomo de enxofre na estrutura do mer. Outros polímeros de borracha que podem ser utilizados são poliésteres com temperatura de transição de vidro sob condições hidratadas que é inferior a cerca de 37°C. Um núcleo hidrofóbico pode ser vantajosamente utilizado com uma camada exterior hidrofílica, uma vez o núcleo e a camada exterior tenderão a misturar-se, de modo que a camada exterior tende a se expandir estericamente para fora do núcleo. Um núcleo refere-se a uma partícula que tem uma camada sobre esta. Uma camada refere-se a um material de cobertura, pelo menos, uma fração do núcleo. Uma camada pode ser adsorvida ou ligada covalentemente. Uma partícula ou o núcleo pode ser sólido ou oco. Núcleos hidrofóbicos elásticos são vantajosos sobre os núcleos hidrofóbicos rígidos, como núcleos cristalinos ou vítreos (como no caso de poliestireno), em que as cargas mais elevadas de drogas hidrofóbicas podem ser transportadas por partículas com os núcleos hidrofóbicos elásticos.
[0134] Outra propriedade física é hidrofilicidade da superfície. Um material hidrofílico pode ter uma solubilidade em água de pelo menos 1 grama por litro quando não é reticulada. Estabilização estérica das partículas com polímeros hidrofílicos pode melhorar a absorção a partir do interstício por redução de interações não específicas; no entanto, o aumento da natureza furtiva das partículas também pode reduzir a internalização pelas células fagocíticas em áreas que têm linfócitos imaturos. O desafio de equilibrar esses recursos concorrentes foi atendido, no entanto, e este pedido documenta a criação de nanopartículas para liberação linfática eficaz para DCs e outras APCs nos gânglios linfáticos. Algumas modalidades incluem um componente hidrofílico, por exemplo, uma camada de material hidrofílico. Exemplos de materiais hidrofilicos adequados são um ou mais dos óxidos de polialquileno, óxidos de polietileno, polissacarídeos, ácidos poliacrílicos e poliéteres. O peso molecular dos polímeros em uma camada pode ser ajustado para proporcionar um grau útil de impedimento estérico in vivo, por exemplo, desde cerca de 1.000 a cerca de 100.000 ou mais; técnicos apreciarão imediatamente que todas as faixas e os valores dentro das faixas explicitamente declaradas são contempladas, por exemplo, entre 10.000 e 50.000.
[0135] As nanopartículas podem incorporar grupos funcionais para reação posterior. Os grupos funcionais para posterior reação incluem eletrófilos ou nucleófilos; estes são convenientes para reagir com outras moléculas. Exemplos de nucleófilos são aminas primárias, tióis, e hidroxilos. Exemplos de eletrófilos são ésteres succinimidil, aldeídos, isocianatos, e maleimidas.
[0136] Uma grande variedade de meios, bem conhecidos na técnica, pode ser utilizada para conjugar peptídeos antigênicos e proteínas para os transportadores. Estes métodos incluem qualquer química padrão que não destrói ou limita severamente a atividade biológica dos peptídeos antigênicos e proteínas, e que permitem um número suficiente de peptídeos antigênicos e proteínas para serem conjugados com o transportador em uma orientação que permite que a interação do peptídeo antigênico ou proteína com um receptor de células T cognato. Geralmente, são preferenciais os métodos que conjugam as regiões C-terminais de um peptídeo antigênico ou proteína ou as regiões C-terminais de um peptídeo antigênico ou proteína de fusão, ao ganhador. Os produtos químicos exatos serão, naturalmente, dependem da natureza do material ganhador, a presença ou ausência de fusões C-terminais para o peptídico antigênico ou proteína, e/ou a presença ou ausência de frações de conjugação.
[0137] Os grupos funcionais podem estar localizados na partícula conforme necessário para disponibilidade. Um sítio pode ser como grupos laterais ou terminais no polímero do núcleo ou polímeros que são camadas de um núcleo ou polímeros de outro modo amarrados à partícula. Por exemplo, os exemplos estão incluídos aqui que descrevem PEG estabilizando as nanopartículas que podem ser facilmente funcionalizadas para ter como alvo a célula específica ou proteína e de liberação de drogas de peptídeo.
[0138] Conjugados carbodi-imida como etileno (ECDI), diisocianato de hexametileno, di-propilenoglicol glicidiléter que contêm dois resíduos de epoxi, e epicloro-hidrina pode ser usado para a fixação de peptídeos ou proteínas para a superfície do transportador. Sem estar limitado pela teoria, ECDI é suspeito de realização duas funções principais para a indução de tolerância: (a) este quimicamente acopla proteína/peptídeos à superfície da célula por meio de catálise de formação da ligação peptídica entre grupos amino livre e carboxil livres; e (b) este induz o transportador a imitar a morte celular apoptótica de tal modo que são captados pelas células apresentadoras de antígeno do hospedeiro no baço e induzem a tolerância. Esta é a apresentação às células T hospedeiras de uma forma não imunogênica que leva à indução direta de anergia em células autorreativas. Além disso, ECDI serve como um potente estímulo para a indução de células T reguladoras específicas.
[0139] Em uma série de modalidades, os peptídeos antigênicos e as proteínas são ligados ao transportador através de uma ligação química covalente. Por exemplo, um grupo reativo ou fração perto do C-terminal do antígeno (por exemplo, o grupo carboxil C-terminal, ou um grupo hidroxil, tiol, ou um grupo amina de uma cadeia lateral de aminoácido) podem ser conjugados diretamente com um grupo reativo ou fração na superfície do transportador (por exemplo, um grupo hidroxil ou carboxil de um polímero PLA ou PGA, um grupo amina ou carboxil terminal de um dendrímero, ou um grupo hidroxil, carboxil ou fosfato de um fosfolipídeo) por reação química direta. Alternativamente, pode haver uma fração de conjugação que covalente conjuga a ambos os peptídeos antigênicos e proteínas e o transportador, ligando-os, assim, em conjunto.
[0140] Grupos carboxil reativos na superfície de um transportador podem ser ligados a aminas livres (por exemplo, a partir de resíduos de Lys) sobre o peptídeo antigênico ou proteína, fazendo-os reagir com, por exemplo, 1-etil-3-[3,9- dimetil aminopropil] carbodi-imida (EDC), ou éster de N- hidroxissuccinimida (NHS). Da mesma forma, a mesma química pode ser utilizada para conjugar aminas livres na superfície de um transportador com carboxilas livres (por exemplo, a partir de C- terminal, ou a partir de resíduos Asp ou Glu) sobre o peptídeo antigênico ou proteína. Em alternativa, os grupos amina livres na superfície de um transportador podem ser ligados covalentemente a peptídeos antigênicos e proteínas, ou peptídeo antigênico ou proteínas de fusão, usando química de sulfo-SIAB, essencialmente como descrito por Arano et al., (1991) Chem. 2:71-6.
[0141] Em outra modalidade, uma ligação não covalente entre um ligante ligado ao peptídeo antigênico ou proteína e um anticorpo antiligante ligado ao transportador pode conjugar o antígeno ao transportador. Por exemplo, uma marcação de sequência de reconhecimento da biotina ligase pode ser unida à extremidade C-terminal de um peptídeo antigênico ou proteína, e esta marcação pode ser biotinilada por biotina ligase. A biotina pode, então, servir como um ligante para conjugar de uma forma não covalente o peptídeo antigênico ou proteína a avidina ou estreptavidina que é adsorvido ou de outra forma ligado à superfície do transportador como um antiligante. Alternativamente, se os peptídeos antigênicos e proteínas são fundidos a um domínio de imunoglobulina tendo uma região Fc, como descrito acima, o domínio Fc pode atuar como um ligante, e proteína A, covalentemente ou não covalentemente ligada à superfície do transportador, pode servir como o antiligante de uma forma a conjugar de modo não covalente o antígeno peptídico ou proteína ao transportador. Outros meios são bem conhecidos na técnica que podem ser empregues para conjugar de forma não covalente aos peptídeos antigênicos e proteínas aos transportadores, incluindo técnicas de quelação de íons metálicos (por exemplo, usando uma marcação poli-His no C- terminal do peptídeo antigênico ou proteína ou peptídeo antigênico ou proteínas de fusão, e um transportador revestido com Ni+), e estes métodos podem ser substituídos aos descritos aqui.
[0142] A conjugação de uma fração de ácido nucleico para uma molécula da plataforma pode ser realizada em qualquer número de maneiras, envolvendo tipicamente um ou mais agentes de ligação cruzada e os grupos funcionais sobre a fração de ácido nucleico e molécula de plataforma. Os grupos de ligação são adicionados às plataformas usando técnicas padrão de química de síntese. Os grupos de ligação podem ser adicionados às frações de ácidos nucleicos usando técnicas sintéticas padrões. O especialista tem um número de opções para os antígenos utilizados nas combinações da presente invenção. O antígeno de indução presente na combinação contribui para a especificidade da resposta tolerogênica que é induzida. Ele pode ou não ser o mesmo que o antígeno alvo, que é o antígeno presente ou a ser colocado no sujeito a ser tratado, que é um alvo para a resposta imunológica não desejada, e para os quais é desejada tolerância.
[0143] Um antígeno de indução desta invenção pode ser um polipeptídeo, polinucleotídeo, carboidrato, glicolipídeo, ou outra molécula isolada a partir de uma fonte biológica, ou pode ser uma molécula pequena quimicamente sintetizada, polímero, ou derivado de um material biológico, desde que tenha a capacidade para induzir tolerância de acordo com esta descrição, quando combinado com o componente de ligação da mucosa.
[0144] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um transportador (por exemplo, partículas de modificação imune) acoplado a um ou mais peptídeos, polipeptídeos e/ou proteínas. Em algumas modalidades, um transportador (por exemplo, transportador de PLG), como aqueles aqui descritos, são eficazes para induzir tolerância específica para o antígeno e/ou prevenir o aparecimento de uma doença imune relacionada (como EAE em um modelo de camundongo) e/ou diminuir a gravidade de uma doença imune pré-existente relacionada. Em algumas modalidades, as composições e métodos da presente invenção podem produzir células T para realizar os eventos precoces associados com a ativação de células T, mas não permitem que as células T adquiram função efetora. Por exemplo, a administração de composições da presente invenção pode resultar em células T ativadas com um fenótipo quase ativado, como CD69 e/ou CD44 regulação positiva, mas não exibem a função efetora, como indicado por uma falta de IFN-Y ou síntese de IL- 17. Em algumas modalidades, a administração de composições da presente invenção resulta em células T ativadas com um fenótipo quase ativado sem ter conversão de células T específicas de antígenos naive a um fenótipo regulatório, como aqueles que possuem fenótipos CD25+/Foxp3+.
[0145] Em algumas modalidades, a superfície de um transportador (por exemplo, partículas) compreende frações químicas e/ou grupos funcionais que permitem a ligação (por exemplo, de forma covalente, de forma não covalente) de peptídeos antigênicos e/ou outros elementos funcionais para o transportador. Em algumas modalidades, o número, a orientação, espaçamento, etc., de frações químicas e/ou grupos funcionais sobre o transportador (por exemplo, partículas) varia de acordo com a química do transportador, a aplicação desejada, etc.
[0146] Em algumas modalidades, um transportador compreende um ou mais agentes biológicos ou químicos, aderidos a, adsorvidos sobre, encapsulados no interior, e/ou contidos ao longo do transportador. Em algumas modalidades, um agente químico ou biológico é encapsulado dentro de e/ou contido através das partículas. A presente invenção não é limitada pela natureza dos agentes químicos ou biológicos. Tais agentes incluem, entre outros, proteínas, moléculas de ácidos nucleicos, drogas de moléculas pequenas, carboidratos, lipídeos, células, componentes celulares, e outros semelhantes. Em algumas modalidades, dois ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, etc.) diferentes agentes químicos ou biológicos estão incluídos em ou dentro do transportador. Em algumas modalidades, os agentes são configurados para taxas de libertação específicas. Em algumas modalidades, vários agentes diferentes são configurados para diferentes taxas de libertação. Por exemplo, um primeiro agente pode liberar ao longo de um período de horas, enquanto um segundo agente libera durante um longo período de tempo (por exemplo, dias, semanas, meses, etc.). Em algumas modalidades, o transportador ou uma fração do mesmo está configurada para liberação lenta de agentes biológicos ou químicos. Em algumas modalidades, a liberação lenta proporciona a liberação de quantidades biologicamente ativas do agente ao longo de um período de pelo menos 30 dias (por exemplo, 40 dias, 50 dias, 60 dias, 70 dias, 80 dias, 90 dias, 100 dias, 180 dias, etc.). Em algumas modalidades, o transportador ou uma fração do mesmo está configurado para ser suficientemente poroso para permitir o crescimento de células para dentro dos poros. O tamanho dos poros pode ser selecionado para tipos de células particulares de interesse e/ou para a quantidade de crescimento interno desejado.
[0147] O encapsulamento dos antígenos, agentes biológicos e/ou químicos na partícula da invenção surpreendentemente demonstrou induzir tolerância imunológica e tem várias vantagens. Em primeiro lugar, as partículas encapsuladas têm uma resposta de citocinas mais lenta. Em segundo lugar, quando se utilizam vários antígenos, agentes biológicos e/ou químicos, o encapsulamento elimina a competição entre estas várias moléculas que podem ocorrer se os agentes foram fixados à superfície da partícula. Em terceiro lugar, o encapsulamento permite que mais antígenos, agentes biológicos e/ou químicos sejam incorporados com a partícula. Em quarto lugar, o encapsulamento permite o uso mais fácil de antígenos proteicos complexos ou homogeneizados de órgãos (por exemplo, homogeneizado de pâncreas para diabetes tipo 1 ou extrato de amendoim para alergia ao amendoim). Finalmente, o encapsulamento de antígenos, agentes biológicos e/ou químicos no interior da partícula, em vez de conjugação para a superfície da partícula mantêm a carga negativa líquida na superfície da partícula.
[0148] Em certas modalidades, a presente invenção proporciona transportadores possuindo nestes células ou outros agentes biológicos ou químicos. Quando se utilizam células, os transportadores não se limitam a um tipo particular de células. Em algumas modalidades, os transportadores têm neles as células das ilhotas pancreáticas. Em algumas modalidades, os transportadores microporosos, adicionalmente, têm nestes as proteínas ECM e/ou exendina-4. Os transportadores não se limitam a um tipo particular. Em algumas modalidades, um transportador tem regiões de porosidade variável (por exemplo, variando o tamanho de poro, a profundidade do poro, e/ou a densidade de poro). Em algumas modalidades, os transportadores têm neles agentes farmacêuticos, DNA, RNA, proteínas de matriz extracelular, exendina-4, etc. Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para o transplante de células de ilhéus pancreáticos com tais transportadores. Em certas modalidades da presente invenção, o antígeno de indução é uma única molécula isolada ou produzida de forma recombinante. Para o tratamento de condições em que o antígeno alvo é difundido para vários locais no hospedeiro, é geralmente necessário que o antígeno de indução seja idêntico ou imunologicamente relacionado com o antígeno alvo. Exemplos de tais antígenos são na maioria antígenos de polinucleotídeos, e alguns antígenos de carboidratos (como antígenos dos grupos sanguíneos).
[0149] Quaisquer antígenos adequados podem encontrar utilização no escopo da presente invenção. Em algumas modalidades, o antígeno de indução contribui para a especificidade da resposta tolerogênica que é induzida. Os antígenos de indução podem ou não ser o mesmo que o antígeno alvo, que é o antígeno presente ou a ser colocado no sujeito a ser tratado que é um alvo para a resposta imunológica não desejada, e para os quais é desejada tolerância.
[0150] Quando o antígeno alvo é preferencialmente expresso em um órgão, célula ou tipo de tecido particular, o praticante novamente tem a opção de usar um antígeno de indução que é idêntico ou imunologicamente relacionado com o antígeno alvo. No entanto, existe também a opção adicional de uso de um antígeno que é um espectador para o alvo. Este é um antígeno que não pode ser imunologicamente relacionado com o antígeno alvo, mas é preferencialmente expresso em um tecido em que o antígeno alvo é expresso. Uma teoria de trabalho como para a eficácia de supressão esperada é que a supressão é um processo mediado por células ativas que regula negativamente o braço efetor da resposta imune nas células alvo. As células supressoras são especificamente estimuladas pelo antígeno indutor na superfície da mucosa, e alojam para um local de tecido onde o antígeno espectador é preferencialmente expresso. Através de um mecanismo interativo ou mediado por citocinas, as células supressoras localizadas então regulam negativamente as células efetoras (ou indutores de células efetoras) na vizinhança, independentemente contra o que são reativas. Se as células efetoras são específicas para um alvo diferente do antígeno de indução, em seguida, o resultado é um efeito espectador. Para elaboração adicional da reação espectadora e uma lista de peptídeos possuindo este efeito tolerogênico, o leitor é referenciado para a Publicação da Patente Internacional WO 93/16724. Uma implicação da teoria do espectador é que um especialista não precisa identificar ou isolar um antígeno alvo em particular contra o qual se deseja a tolerância para a prática da presente invenção. O praticante só precisa ser capaz de obter pelo menos uma molécula expressa preferencialmente no local alvo para o uso como um antígeno de indução.
[0151] Em certas modalidades da presente invenção, o antígeno de indução não está na mesma forma como expressa no indivíduo a ser tratado, mas é um fragmento ou derivado do mesmo. Antígenos de indução da presente invenção incluem peptídeos baseados em uma molécula com a especificidade adequada, mas adaptadas por fragmentação, substituição de resíduo, marcação, a conjugação, e/ou de fusão com os peptídeos possuindo outras propriedades funcionais. A adaptação pode ser realizada por quaisquer efeitos desejáveis, incluindo, entre outros, eliminação de qualquer propriedade indesejável, como toxicidade ou imunogenicidade; ou para melhorar qualquer propriedade desejável, como a ligação da mucosa, a penetração da mucosa, ou a estimulação do braço tolerogênico da resposta imune. Termos como peptídeo de insulina, peptídeo de colágeno e peptídeos de proteína básica de mielina como aqui utilizados, referem-se não só à subunidade intacta, mas também a variantes alotípicas e sintéticas, fragmentos, peptídeos de fusão, conjugados, e outros produtos derivados que contêm uma região que é homóloga (de preferência 70% idêntica, mais preferencialmente 80% idêntica e ainda mais preferencialmente 90% idêntica ao nível dos aminoácidos) de pelo menos 10 e preferencialmente 20 aminoácidos consecutivos da respectiva molécula para a qual é um análogo, em que a região homóloga do derivado compartilha com a respectiva molécula parente a capacidade de induzir a tolerância ao antígeno alvo.
[0152] Reconhece-se que as regiões tolerogênicas de um antígeno de indução são muitas vezes diferentes dos epítopos imunodominantes para a estimulação de uma resposta de anticorpos. Regiões tolerogênicas são geralmente regiões que podem ser apresentadas em interações celulares particulares envolvendo células T. Regiões tolerogênicas podem estar presentes e capazes de induzir tolerância mediante a apresentação do antígeno intacto. Alguns antígenos contêm regiões tolerogênicas crípticas, em que o processamento e apresentação do antígeno nativo normalmente não provocam tolerância. Uma elaboração de antígenos crípticos e a sua identificação é encontrada na Publicação de Patente Internacional WO 94/27634.
[0153] Em certas modalidades da presente invenção, dois, três, ou pluralidade maior de antígenos de indução são usados. Pode ser desejável implementar estas modalidades, quando há uma pluralidade de antígenos alvo, ou para proporcionar uma pluralidade de espectadores para o alvo. Por exemplo, a insulina e glucagon podem ser misturados com um componente de ligação à mucosa no tratamento de diabetes. Pode também ser desejável proporcionar uma mistura de antígenos para cobrir vários alvos alternativos possíveis. Por exemplo, um coquetel de fragmentos de antígeno de histocompatibilidade poderia ser usado para gerar tolerância de um sujeito, em antecipação ao futuro transplante com um aloenxerto de fenótipo desconhecido. Regiões alovariantes de antígenos de leucócitos humanos são conhecidas na técnica: por exemplo, Immunogenetics 29: 231, 1989. Em outro exemplo, uma mistura de alérgenos pode servir como antígeno de indução para o tratamento de atopia.
[0154] Antígenos de indução podem ser preparados por um número de técnicas conhecidas na técnica, dependendo da natureza da molécula. Antígenos de polinucleotídeos, polipeptídeo, e carboidrato podem ser isolados a partir de células da espécie a serem tratadas em que são enriquecidas. Peptídeos curtos são convenientemente preparados por síntese de aminoácidos. Proteínas mais longas de sequência conhecida podem ser preparadas através da síntese de uma sequência de codificação ou amplificação em PCR de uma sequência de codificação de uma fonte natural ou vetor, e, em seguida, expressando a sequência de codificação em uma célula hospedeira bacteriana ou eucariota adequada.
[0155] Em certas modalidades da presente invenção, a combinação compreende uma mistura complexa de antígenos obtida a partir de uma célula ou tecido, um ou mais das quais desempenha o papel de antígeno de indução. Os antígenos podem estar sob a forma de células inteiras, intactas ou tratadas com um fixador como formaldeído, glutaraldeído, ou álcool. Os antígenos podem estar sob a forma de um lisado celular, criados por solubilização detergente ou ruptura mecânica de células ou de tecidos, seguido por clarificação. Os antígenos podem também ser obtidos por fracionamento subcelular, particularmente um enriquecimento da membrana plasmática por meio de técnicas como centrifugação diferencial, opcionalmente seguido por solubilização detergente e diálise. Outras técnicas de separação também são adequadas, como cromatografia de afinidade ou de troca iônica de proteínas de membrana solubilizadas.
[0156] Em uma modalidade, o peptídeo antigênico ou proteína é um autoantígeno, um aloantígeno ou um antígeno de transplantação. Em ainda outra modalidade particular, o autoantígeno é selecionado a partir do grupo consistindo de proteína básica de mielina, colágeno ou fragmentos dos mesmos, DNA, proteínas nucleares e nucleolares, proteínas mitocondriais e proteínas de células β pancreáticas.
[0157] A invenção proporciona a indução de tolerância a um autoantígeno para o tratamento de doenças autoimunes por meio da administração do antígeno para o qual é desejada a tolerância. Por exemplo, autoanticorpos dirigidos contra a proteína básica de mielina (MBP) são observados em pacientes com esclerose múltipla, e, em conformidade, peptídeos antigênicos MBP ou proteínas podem ser usados na invenção para ser liberados utilizando as composições da presente invenção para tratar e prevenir esclerose múltipla.
[0158] Por meio de outro exemplo não limitativo, um indivíduo que é um candidato para um transplante de um gêmeo não idêntico que pode sofrer de rejeição das células enxertadas, os tecidos ou órgãos, uma vez que os antígenos enxertados são estranhos ao destinatário. Tolerância anterior do indivíduo receptor ao enxerto pretendido anula ou reduz a rejeição mais tarde. A redução ou eliminação de terapias anti-rejeição crônica pode ser alcançada pela prática da presente invenção. Em outro exemplo, várias doenças autoimunes são caracterizadas por uma resposta imune celular a um antígeno endógeno ou autoantígeno. A tolerância do sistema imunitário ao antígeno endógeno é desejável para controlar a doença.
[0159] Em outro exemplo, a sensibilização de um indivíduo a um poluente ou químico industrial, como pode ser encontrado no local de trabalho, apresenta um risco de uma resposta imune. Antes de tolerância do sistema imune do indivíduo para o produto químico, em especial sob a forma do produto químico reagido com as proteínas endógenas do indivíduo, pode ser desejável para impedir o desenvolvimento ocupacional posterior de uma resposta imune.
[0160] Os alérgenos são outros antígenos para os quais a tolerância da mesma resposta imune é também desejável. Em uma modalidade, o antígeno é um gliaden. Em outra modalidade, o antígeno é A-gliaden.
[0161] Notavelmente, mesmo em doenças em que o autoantígeno patogênico é desconhecido, a supressão do espectador pode ser induzida utilizando antígenos presentes na vizinhança anatômica. Por exemplo, autoanticorpos para o colágeno são observadas na artrite reumatoide e, por conseguinte, um gene que codifica o colágeno pode ser utilizado como um módulo de genes que expressa o antígeno a fim de tratar a artrite reumatoide (ver, por exemplo, Choy (2000) Curr Opin Investig Drugs 1: 58 -62). Além disso, a tolerância para autoantígenos de células beta pode ser utilizada para prevenir o desenvolvimento de diabetes do tipo 1 (ver por exemplo, Bach e Chatenoud (2001) Ann Rev Immunol 19: 131-161).
[0162] Como outro exemplo, autoanticorpos dirigidos contra a glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) são observadas em encefalomielite autoimune e em muitas outras doenças do sistema nervoso central, assim como a esclerose múltipla (ver, por exemplo, Iglesias et al (2001) Glia 36:. 22-34). Por conseguinte, o uso de construtos de antígeno expressando MOG na invenção permite o tratamento de esclerose múltipla, bem como doenças autoimunes relacionados com o sistema nervoso central.
[0163] Ainda outros exemplos de autoantígenos candidatos para utilização no tratamento de doenças autoimunes incluem: antígenos das células beta pancreáticas, insulina e GAD para o tratamento da diabetes mellitus dependente de insulina; colágeno tipo 11, gp 39 de cartilagem humana (HCgp39) e gpl30-RAPS para utilização no tratamento de artrite reumatoide; proteína básica de mielina (MBP), proteína de proteo lipídeos (PLP) e glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG, ver acima) para tratar a esclerose múltipla; fibrilarina e pequena proteína nucleolar (snoRNP) para tratar escleroderma; receptor do fator de estimulação da tiroide (TSH-R) para utilização no tratamento da doença de Graves; antígenos nucleares, histonas, glicoproteína gp70 e proteínas ribossomais para uso no tratamento de lúpus eritematoso sistêmico; piruvato desidrogenase de-hidrolipoamida acetiltransferase (PCD-E2) para utilização no tratamento de cirrose biliar primária; antígenos do folículo piloso para uso no tratamento de alopecia areata; e isoforma 5 de tropomiosina humana (hTM5) para utilização no tratamento de colite ulcerativa.
[0164] As combinações podem ser testadas quanto à sua capacidade para promover a tolerância através da realização de experimentos com células isoladas ou em modelos animais.
[0165] Em algumas modalidades, composições de indução de tolerância da presente invenção contêm uma molécula de sinalização de apoptose (por exemplo, em adição a um peptídeo antigênico ou outra molécula antigênica). Em algumas modalidades, a molécula de sinalização da apoptose é acoplada e/ou associada com a superfície do transportador. Em algumas modalidades uma molécula de sinalização apoptótica permite a um transportador ser percebido como um corpo de apoptose por células apresentadoras de antígenos do hospedeiro, como células do sistema reticuloendotelial hospedeiro; isto permite a apresentação dos epítopos de peptídeos associados de uma forma a induzir a tolerância. Sem estar limitado pela teoria, presume-se que isto evite regulação positiva de moléculas envolvidas na estimulação de células imunes, como as moléculas de MHC de classe I/II, e coestimuladoras. Estas moléculas de sinalização de apoptose também podem servir como marcadores fagocíticos. Por exemplo, as moléculas de sinalização de apoptose adequadas para a presente invenção foram descritas no pedido de patente US 20050113297, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Moléculas adequadas para a presente invenção incluem moléculas que têm como alvo os fagócitos, que incluem macrófagos, células dendríticas, monócitos e neutrófilos.
[0166] Em algumas modalidades, as moléculas adequadas, como as moléculas de sinalização apoptótica atuam para melhorar a tolerância dos peptídeos associados. Além disso, um transportador ligado a uma molécula de sinalização apoptótica pode ser ligado por Clq no reconhecimento de célula apoptótica (Paidassi et al, (2008) J. Immunol. 180: 2329-2338; incorporado aqui por referência na sua totalidade). Por exemplo, as moléculas que podem ser úteis como moléculas de sinalização de apoptose incluem fosfatidil serina, anexina-1, anexina-5, glóbulo de gordura do leite por EGF fator 8 (MFG-E8), ou a família de tromboespondinas (por exemplo, tromboespondina-1 (TSP-1)). Várias moléculas adequadas para utilização como moléculas de sinalização de apoptose com a presente invenção são discutidas, por exemplo, no pedido de patente US 2012/0076831; aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[0167] Em algumas modalidades, a molécula de sinalização apoptótica pode ser conjugada com o peptídeo específico de antígeno. Em alguns casos, a molécula de sinalização apoptótica e o peptídeo específico para o antígeno são conjugados com a criação de uma proteína de fusão. Por exemplo, uma proteína de fusão pode compreender pelo menos um peptídeo específico para o antígeno (ou um fragmento ou uma variante do mesmo) acoplado a pelo menos uma molécula de uma molécula de sinalização apoptótica (ou um fragmento ou uma variante do mesmo). Para a criação de proteínas de fusão, os termos “proteína de fusão”, “peptídeo de fusão”, “polipeptídeo de fusão” e “peptídeos quiméricos” são utilizados de forma intercambiável. Os fragmentos adequados do peptídeo específico para o antígeno inclui qualquer fragmento do peptídeo de comprimento completo que retém a função de gerar a função de tolerância específica para o antígeno desejado da presente invenção. A proteína de fusão pode ser criada por vários meios conhecidos na técnica (por exemplo, fusão genética, conjugação química, etc). As duas proteínas podem ser fundidas diretamente ou através de um ligante de aminoácidos. Os polipeptídeos que formam a proteína de fusão são tipicamente ligados do C-terminal ao N-terminal, embora podem também ser ligados em C-terminal para C-terminal, N-terminal para N-terminal ou N-terminal para C-terminal. Os polipeptídeos da proteína de fusão podem estar em qualquer ordem. Uma sequência de peptídeo ligante pode ser empregue para separar os primeiros e segundos componentes de polipeptídeo por uma distância suficiente para assegurar que cada polipeptídeo se dobre nas suas estruturas secundária e terciária. Sequências de aminoácidos que podem ser utilmente empregues como ligantes incluem as reveladas em Maratea et. al., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986); Patente US 4.935.233 e Patente US 4.751.180; aqui incorporadas por referência na sua totalidade. A sequência ligante pode ser geralmente de 1 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, as sequências de ligantes não são necessárias e/ou utilizadas, por exemplo, quando o primeiro e segundo polipeptídeos têm regiões de aminoácidos não essenciais no N-terminal que podem ser utilizadas para separar os domínios funcionais e prevenir a interferência estérica.
[0168] Um proxy para a atividade tolerogênica é a capacidade de um antígeno intacto ou fragmento em estimular a produção de uma citocina adequada no local alvo. A citocina imunorregulatória liberada pelas células T supressoras no local alvo é pensada para ser TGF-β (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:421, 1992). Outros fatores que podem ser produzidos durante a tolerância são as citocinas IL4 e IL-10, e o mediador de PGE. Em contraste, os linfócitos nos tecidos submetidos a destruição imune ativa secretam citocinas, como IL-I, IL-2, IL- 6, e IFN-Y. Assim, a eficácia de um antígeno candidato de indução pode ser avaliada medindo a sua capacidade para estimular o tipo apropriado de citocinas.
[0169] Com isso em mente, um teste rápido de triagem para epítopos tolerogênicos do antígeno de indução, componentes de ligação à mucosas eficazes, combinações eficazes, ou modos eficazes e cronogramas de administração à mucosa podem ser realizados utilizando animais singeneicos como doadores para ensaios in vitro de células. Os animais são tratados em uma superfície da mucosa com a composição de teste, e em algum momento são desafiados com a administração parenteral do antígeno alvo em adjuvante de Freund completo. As células do baço são isoladas, e cultivadas in vitro na presença do antígeno alvo a uma concentração de cerca de 50 μg/mL. Antígeno alvo pode ser substituído com proteínas candidatas ou subfragmentos para mapear a localização de epítopos tolerogênicos. Secreção de citocinas no meio pode ser quantificada por meio de imunoensaio padrão.
[0170] A capacidade das células para suprimir a atividade de outras células pode ser determinada utilizando células isoladas a partir de um animal imunizado com o antígeno alvo, ou através da criação de uma linhagem celular que responde ao antígeno alvo (Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol. 11 :195, 1981, aqui incorporada por referência na sua totalidade). Em uma variação desta experiência, a população de células supressoras é ligeiramente irradiada (entre 1000 e 1250 rads) para evitar a proliferação, os supressores são cocultivados com as células de resposta, e, em seguida, incorporação de timidina tritiada (ou MTT) é utilizada para quantificar a atividade proliferativa dos respondentes. Em outra variação, a população de células supressoras e a população de células respondentes são cultivadas em níveis superiores e inferiores de um sistema de cultura de dupla câmara transwell (Costar, Cambridge, Mass.), que permite que as populações sejam incubadas simultaneamente dentro de 1 mm uma da outra, separadas por uma membrana de policarbonato (WO 93/16724). Nesta abordagem, a irradiação da população de células supressoras é desnecessária, uma vez que a atividade proliferativa dos respondentes pode ser medida separadamente.
[0171] Em modalidades da invenção em que o antígeno alvo já está presente no indivíduo, não há necessidade de isolar o antígeno ou previamente combinar este com o componente de ligação da mucosa. Por exemplo, o antígeno pode ser expresso no indivíduo de um certo modo, como resultado de uma condição patológica (como doença inflamatória do intestino ou a doença celíaca), ou através de digestão de um alérgeno alimentar. Os testes são realizados conferindo o componente de ligação da mucosa em uma ou mais doses ou formulações, e determinação da sua capacidade para promover a indução de tolerância contra o antígeno in situ.
[0172] A eficácia das composições e modos de administração para o tratamento de doenças específicas pode também ser elaborada em um modelo de doença em animais correspondente. A capacidade do tratamento para diminuir ou atrasar a sintomatologia da doença é monitorada ao nível bioquímicas de circulação e características e imunológicas da doença, imunohistologia do tecido afetado, e características clínicas brutas como apropriado para ser utilizado o modelo. Exemplos não limitantes de modelos animais que podem ser utilizados para o ensaio estão incluídos na secção seguinte.
[0173] A invenção contempla a modulação de tolerância por meio da modulação de resposta TH1, resposta TH2, resposta TH17, ou uma combinação de tais respostas. A modulação da resposta TH1 engloba alterar a expressão de, por exemplo, o interferon-gama. A modulação da resposta TH2 engloba alterar a expressão de, por exemplo, qualquer combinação de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Tipicamente, um aumento (redução) em resposta TH2 irá compreender um aumento (redução) na expressão de pelo menos um de IL-4, IL-5, IL-10, ou IL-13; mais tipicamente um aumento (redução) em resposta TH2 irá compreender um aumento da expressão de, pelo menos, dois de IL-4, IL-5, IL-10, EL-13 ou, mais tipicamente, um aumento (redução) em resposta TH2 irá compreender um aumento de pelo menos três de DL-4, IL-5, IL-10, ou IL-13, enquanto idealmente um aumento (redução) em resposta TH2 irá compreender um aumento (redução) na expressão de todos IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. A modulação da TH 17 engloba alterar a expressão de, por exemplo, TGF-beta, IL-6, IL-21 e IL23, e níveis efeitos de IL-17, IL-21 e IL-22.
[0174] Outros métodos adequados para avaliar a eficácia das composições e métodos da presente invenção são conhecidos na técnica, como são discutidos, por exemplo, no Pedido de Pat. 2012/0076831 (aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[0175] Certas modalidades desta invenção dizem respeito a iniciação de tolerância imune em um indivíduo não previamente tornado tolerantes por intervenção terapêutica. Estas modalidades implicam geralmente uma pluralidade de administrações de uma combinação do componente de antígeno e ligação da mucosa. Tipicamente, pelo menos três administrações, frequentemente pelo menos quatro administrações, e, por vezes, pelo menos seis administrações são executadas durante a iniciação a fim de atingir um resultado de longa duração, embora o sujeito possa exibir manifestações de tolerância precoce no curso de tratamento. Na maioria das vezes, cada dose é administrada como uma administração em bolus, mas formulações sustentadas capazes de liberação às mucosas são também adequadas. Quando múltiplas administrações são realizadas, o tempo entre administrações é geralmente entre 1 dia e 3 semanas, e tipicamente entre cerca de 3 dias e 2 semanas. Geralmente, o mesmo antígeno e componente de ligação à mucosa estão presentes na mesma concentração, e a administração é dada a mesma superfície da mucosa, mas as variações de qualquer uma destas variáveis durante um curso de tratamento podem ser acomodadas.
[0176] Outras modalidades desta invenção dizem respeito a aumentar ou prolongar a persistência de uma tolerância imunológica previamente estabelecida. Estas modalidades geralmente envolvem uma administração ou um curso curto de tratamento em um momento em que a tolerância estabelecida está em declínio ou em risco de declínio. O reforço realiza-se geralmente de 1 mês a 1 ano, e tipicamente 2 a 6 meses após a injeção ou um impulso anterior. Esta invenção também inclui variantes que envolvem a manutenção regular de tolerância em um cronograma de administrações que ocorrem duas vezes por semana, semanal, quinzenal, ou em qualquer outro horário regular.
[0177] As partículas da presente invenção podem ser administradas em qualquer dose eficaz para atenuar a resposta imune inflamatória, em um sujeito com necessidade da mesma ou para o tratamento de uma infecção bacteriana ou viral, em um sujeito com necessidade do mesmo. Em certas modalidades, cerca de 102 a cerca de 1020 partículas são fornecidas ao indivíduo. Em outra modalidade entre cerca de 103 a cerca de 1015 partículas são fornecidas. Em ainda outra modalidade entre cerca de 106 a cerca de 1012 partículas são fornecidas. Em ainda outra modalidade entre cerca de 108 a cerca de 1010 partículas são fornecidas. Em uma modalidade preferencial, a dose preferencial é de 0,1% de sólidos/ml. Portanto, para grânulos de 0,5 μ m, uma dose preferencial é de aproximadamente 4 x 109 grânulos, para grânulos de 0,05 μ m, uma dose preferencial é aproximadamente 4 x 1012 grânulos, para grânulos de 3 μ m, uma dose preferencial é de 2 x 107 grânulos. No entanto, qualquer dose que seja eficaz no tratamento da condição particular a ser tratada é englobada pela presente invenção.
[0178] A invenção é útil para o tratamento de distúrbios relacionados com a imunidade, como doença autoimune, rejeição de transplante e reações alérgicas. Substituição de um sistema de partícula sintética, biocompatível, para induzir a tolerância imune pode levar a facilidade de fabricação, ampla disponibilidade de agentes terapêuticos, aumento da uniformidade entre as amostras, aumento do número de potenciais locais de tratamento e reduz dramaticamente o potencial para respostas alérgicas a uma célula transportadora.
[0179] Como aqui utilizado, o termo “resposta imune” inclui respostas imunes mediadas por células T e/ou células B. Exemplos de respostas imunes incluem respostas das células T, por exemplo, a produção de citocina e citotoxicidade celular. Além disso, o termo resposta imune inclui respostas imunes que são realizadas indiretamente através da ativação de células T, por exemplo, a produção de anticorpos (respostas humorais) e ativação de células que respondem a citocinas, por exemplo, macrófagos. As células imunes envolvidas na resposta imune incluem linfócitos, como as células B e as células T (CD4+ CD8+ Th1 e Th2); células apresentadoras de antígeno (por exemplo, células apresentadoras de antígenos profissionais, como células dendríticas, macrófagos, linfócitos B, células de Langerhans e células apresentadoras de antígeno não profissionais, como queratinócitos, células endoteliais, astrócitos, fibroblastos, oligodendrócitos); células natural killer; células mieloides, como macrófagos, eosinófilos, mastócitos, basófilos, e granulócitos. Em algumas modalidades, as partículas modificadas da presente invenção são eficazes para reduzir o tráfico de células inflamatórias para o local da inflamação.
[0180] Como aqui utilizado, o termo “anergia”, “tolerância” ou “tolerância específica para o antígeno” refere-se a insensibilidade das células T para estimulação mediada pelo receptor de células T. Tal insensibilidade é geralmente específica para o antígeno e persiste após exposição ao peptídeo antigênico ter cessado. Por exemplo, a anergia em células T caracteriza-se pela falta de produção de citocinas, por exemplo, IL-2. A anergia de células T ocorre quando as células T são expostas ao antígeno e recebem um primeiro sinal (um receptor de células T ou um sinal mediado por CD-3), na ausência de um segundo sinal (um sinal coestimulador). Sob estas condições, renova exposição das células ao mesmo antígeno (mesmo se ocorrer nova exposição, na presença de uma molécula coestimuladora) resulta na incapacidade de produzir citocinas e, posteriormente, falha de se proliferar. Assim, uma falha na produção de citocinas impede a proliferação. Células T anérgicas podem, no entanto, se proliferar se cultivadas com citocinas (por exemplo, IL-2). Por exemplo, anergia das células T também pode ser observada pela falta de produção de IL-2 pelos linfócitos T, como medido por ELISA ou por um ensaio de proliferação utilizando uma linhagem celular indicadora. Alternativamente, uma construção de gene repórter pode ser utilizada. Por exemplo, as células T anérgicas falham em iniciar a transcrição do gene de DL-2 induzida por um promotor heterólogo sob o controle de 5’ estimulador do gene IL-2 ou por um multímero da sequência de API que pode ser encontrado dentro do intensificador (Kang et al. 1992 Science. 257:1134).
[0181] Como aqui utilizado, o termo “tolerância imunológica” refere-se aos métodos realizados em uma proporção de sujeitos tratados, em comparação com sujeitos não tratados em que: a) uma redução do nível de uma resposta imunológica específica (que parece ser mediada pelo menos em parte por linfócitos T efetores específicos de antígeno, linfócitos B, anticorpo, ou seus equivalentes); b) um atraso no início ou progressão de uma resposta imunológica específica; ou c) a redução do risco do início ou progressão de uma resposta imunológica específica. Tolerância imunológica “específica” ocorre quando a tolerância imunológica é preferencialmente invocada contra certos antígenos, em comparação com os outros. Tolerância imunológica “não específica” ocorre quando a tolerância imunológica é invocada indiscriminadamente contra antígenos que conduzem a uma resposta inflamatória imune. Tolerância imunológica “quase específica” ocorre quando a tolerância imunológica é invocado semi-discriminadamente contra antígenos que conduzem a uma resposta imune patogênica mas não para outros, que levam a uma resposta imune protetora.
[0182] Tolerância a autoantígenos e doença autoimune é alcançada através de uma variedade de mecanismos, incluindo a seleção negativa de células T autorreativas no timo e nos mecanismos de tolerância periférica para as células T autorreativas que escapam da eliminação do timo e são encontrados na periferia. Exemplos de mecanismos que proporcionam a tolerância das células T periféricas incluem “ignorância” de autoantígenos, anergia ou falta de responsividade ao autoantígeno, desvio imune de citocinas e morte celular induzida por ativação de células T autorreativas. Além disso, as células T reguladoras demonstraram estar envolvidas na mediação da tolerância periférica. Ver, por exemplo, Walker et al. (2002) Nat. Rev. Immunol. 2: 11-19; Shevach et al. (2001) Immunol. Rev. 182:58-67. Em algumas situações, a tolerância periférica a um autoantígeno é perdida (ou quebrada) e segue-se uma resposta autoimune. Por exemplo, em um modelo animal de EAE, a ativação de células apresentadoras de antígeno (APCs) através de receptores imunes inatos TLR demonstrou quebrar a auto-tolerância e resultar na indução de EAE (Waldner et al. (2004) J. Clin. Invest. 113:990-997).
[0183] Por conseguinte, em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para aumentar a apresentação do antígeno ao suprimir ou reduzir a estimulação celular dependente de TLR7/8, TLR9, e/ou TLR 7/8/9. Como aqui descrito, a administração de partículas particulares modificadas resulta na apresentação de antígeno pelas DCs ou APCs enquanto suprime as respostas celulares dependentes de TLR 7/8, TLR9 e/TLR7/8/9 associadas com polinucleotídeos imunoestimulantes. Tal supressão pode incluem os níveis reduzidos de uma ou mais citocinas associadas com TLR.
[0184] Como discutido acima, esta invenção proporciona novos compostos que possuem propriedades biológicas úteis para o tratamento de distúrbios mediados por Mac-1 e LFA-1.
[0185] Deste modo, em outro aspecto da presente invenção, as composições farmacêuticas são fornecidas, que compreendem as partículas modificadoras do sistema imunológico e opcionalmente compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, estas composições compreendem opcionalmente ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Alternativamente, as partículas modificadas da presente invenção podem ser administradas a um paciente em necessidade do mesmo em combinação com a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos. Por exemplo, agentes terapêuticos adicionais para a administração conjunta ou inclusão em uma composição farmacêutica com um composto da desta invenção podem ser um agente anti-inflamatório aprovado, ou podem ser qualquer um de um número de agentes submetidos a homologação em Food and Drug Administration, que em última instância, obtêm aprovação para o tratamento de qualquer distúrbio caracterizado por uma resposta imune inflamatória descontrolada ou uma infecção bacteriana ou viral. Será também apreciado que determinadas partículas modificadas da presente invenção podem existir na forma livre para tratamento, ou quando apropriado, como um derivado do mesmo farmaceuticamente aceitável.
[0186] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável, que, como aqui utilizado, inclui qualquer e todos os solventes, diluentes, ou outros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou de suspensão, agentes surfactantes, agentes isotônicos, espessantes ou emulsionantes, conservantes, ligantes sólidos, lubrificantes e similares, como adequados para a forma de dosagem particular desejada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) divulga vários carreadores usados na formulação de composições farmacêuticas e as técnicas conhecidas para a sua preparação. Exceto na medida em que qualquer meio transportador convencional é incompatível com os compostos da invenção, como ao produzir qualquer efeito biológico indesejável ou interagir de outro modo de um modo prejudicial com qualquer outro componente da composição farmacêutica, a sua utilização está contemplada como estando dentro do escopo da presente invenção. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, açúcares como lactose, glicose e sacarose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes como manteiga de cacau e ceras para supositório; óleos como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de cártamo, óleo de gergelim; azeite de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis; como propilenoglicol; ésteres como oleato de etilo e laurato de etilo; ágar; agentes tamponantes, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água apirogênica; solução salina isotônica; Solução de Ringer; álcool etílico, e soluções de tampão fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos, como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, adoçantes, agentes aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.
[0187] As formas de dosagem líquidas para administração oral incluem, entre outras, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição aos compostos ativos, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes comumente utilizados na técnica como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsionantes como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzil, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular, de semente de algodão, amendoim, milho, gérmen, oliva, rícino, e gergelim), glicerol, álcool tetra- hidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e suas misturas. Além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes como agentes molhantes, agentes emulsionantes e de suspensão, edulcorantes, aromatizantes e agentes perfumantes.
[0188] As partículas da invenção podem ser administradas por via oral, por via nasal, por via intravenosa, intramuscular, ocular, transdérmica, por via intraperitoneal, ou por via subcutânea. Em uma modalidade, as partículas da invenção são administradas por via intravenosa.
[0189] As quantidades eficazes e método de administração da presente invenção para a modulação de uma resposta imune podem variar de acordo com o indivíduo, a condição a ser tratada e outros fatores evidentes para um especialista na técnica. Os fatores a ser considerados incluem a via de administração e o número de doses a serem administradas. Tais fatores são conhecidos na técnica e é estão dentro da habilidade daqueles na técnica para fazer tais determinações sem experimentação indevida. Um intervalo de dosagem adequado é aquele que proporciona a regulação desejada do sistema imune. As faixas de dosagem úteis do transportador, administradas em quantidades de transportador liberado, podem ser, por exemplo, de cerca de qualquer uma das seguintes: 0,5 a 10 mg/kg, 1 a 9 mg/kg, 2 a 8 mg/kg, 3 a 7 mg/kg, 4 a 6 mg/kg, 5 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, de 5 a 10 mg/kg. Alternativamente, a dosagem pode ser administrada de acordo com o número de partículas. Por exemplo, as dosagens úteis do transportador, administradas em quantidades de transportador liberado, podem ser, por exemplo, cerca de 106, 107, 108, 109, 1010, ou maior número de partículas por dose. A quantidade absoluta dada a cada paciente depende das propriedades farmacológicas como biodisponibilidade, taxa de eliminação e da via de administração. Detalhes de carreadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes e excipientes e os métodos de preparação de composições e formulações farmacêuticas são fornecidos em Remmingtons Pharmaceutical Sciences 18th Edition, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA., que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0190] A quantidade eficaz e modo de administração da formulação transportadora particular podem variar com base no paciente individual, resultado desejado e/ou o tipo de distúrbio, o estágio da doença e de outros fatores evidentes para um especialista na técnica. As vias de administração úteis em uma aplicação particular são evidentes para um especialista na técnica. As vias de administração incluem, entre outras, tópica, dérmica, transdérmica, transmucosa, epidérmica, parenteral, gastrointestinal, e nasofaríngea e pulmonar, incluindo transbrônquica e transalveolar. Um intervalo de dosagem adequado é aquele que proporciona composição contendo IRP suficiente para atingir uma concentração de tecido de cerca de 1-50 μM como medido pelos níveis sanguíneos. A quantidade absoluta dada a cada paciente depende das propriedades farmacológicas como biodisponibilidade, taxa de eliminação e da via de administração.
[0191] A presente invenção proporciona formulações transportadoras adequadas para aplicação tópica, incluindo, entre outras, implantes fisiologicamente aceitáveis, pomadas, cremes, lavagens e géis. Exemplos de vias de administração dérmica são aquelas que são menos invasivas, como a transmissão transdérmica, a administração epidérmica e injeção subcutânea.
[0192] A administração transdérmica é realizada por aplicação de um creme, lavagem, gel, etc. capaz de permitir que o transportador penetre na pele e entre na corrente sanguínea. As composições adequadas para administração transdérmica incluem, entre outras, suspensões farmaceuticamente aceitáveis, óleos, cremes e pomadas aplicados diretamente na pele ou incorporados em um transportador protetor como um dispositivo transdérmico (chamado “adesivo”). Exemplos de cremes apropriados, pomadas, etc. podem ser encontrados, por exemplo, em Physician's Desk Reference. Transmissão transdérmica pode também ser conseguida por iontoforese, por exemplo, usando adesivos disponíveis comercialmente, que fornecem os seus produtos continuamente através da pele, por períodos de vários dias ou mais. A utilização deste método permite a transmissão controlada das composições farmacêuticas em concentrações relativamente grandes, permite a infusão de drogas de combinação e permite a utilização simultânea de um promotor de absorção.
[0193] Vias parenterais de administração incluem, entre outras, elétrica (iontoforese) ou injeção direta como a injeção direta em uma linha venosa central, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea. Formulações de transportadores adequadas para administração parenteral são geralmente formuladas de água USP ou água para injeção e podem ainda compreender tampões de pH, agentes de volume de sais, conservantes, e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Polinucleotídeo imunorregulador para injeção parenteral pode ser formulado em soluções estéreis farmaceuticamente aceitáveis isotônicas como salina tamponada com fosfato e solução salina para injeção.
[0194] Vias de administração gastrointestinais incluem, entre outras, ingestão e via retal e pode incluir o uso de, por exemplo, pós, comprimidos farmaceuticamente aceitáveis ou líquidos para ingestão e supositórios para administração retal.
[0195] Administração naso-faríngea e pulmonar são realizadas por inalação, e incluem vias de liberação, como vias intranasais, transbrônquica e transalveolares. A invenção inclui formulações de carreador apropriado para administração por inalação, incluindo, entre outras, suspensões líquidas para formar aerossóis, assim como formas em pó dos sistemas de liberação por inalação de pó seco. Dispositivos adequados para a administração por inalação de formulações de transportadores incluem, entre outros, atomizadores, vaporizadores, nebulizadores e dispositivos de inalação de pó seco.
[0196] As preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida utilizando agentes dispersantes ou umectantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução injetável estéril, suspensão ou emulsão em um diluente não tóxico por via parenteral aceitável ou solvente, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos fixos estéreis são convencionalmente utilizados como um meio solvente ou de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixo brando pode ser empregue incluindo di ou mono glicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos como ácido oleico são utilizados na preparação de injetáveis.
[0197] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por absorção de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril antes de usar.
[0198] De modo a prolongar o efeito de uma droga, é muitas vezes desejável retardar a absorção da droga a partir da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido pela utilização de uma suspensão líquida ou um material cristalino ou amorfo com fraca solubilidade em água. A taxa de absorção da droga depende então da sua velocidade de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de droga administrada por via parenteral é conseguida por dissolução ou suspensão da droga em um transportador oleoso. As formas de depósito injetáveis são feitas pela formação de matrizes de microencapsulação da droga em polímeros biodegradáveis como polilactida-poliglicolida. Dependendo da proporção de droga para polímero e da natureza do polímero particular empregue, a taxa de liberação da droga pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem (poli (ortoésteres) e poli (anidridos). As formulações injetáveis de depósito são também preparadas por aprisionamento da droga em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos corporais.
[0199] Em algumas modalidades, as partículas biodegradáveis sintéticas da presente invenção proporcionam a facilidade de fabricação, ampla disponibilidade de agentes terapêuticos, e aumento dos locais de tratamento. Em modalidades particulares, partículas biodegradáveis poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície com uma elevada densidade de grupos carboxilato na superfície, sintetizadas utilizando o surfactante poli (etileno-alt-anidrido maleico) proporcionam um transportador que oferece numerosas vantagens em relação a outras partículas transportadoras e/ou outras superfícies. Os experimentos realizados durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção demonstraram a conjugação de peptídeos (por exemplo, peptídeo PLP139-151) a estas partículas. Tais partículas acopladas com peptídeos têm demonstrado que eles são eficazes para a prevenção do desenvolvimento da doença e a indução de tolerância imunológica (por exemplo, em modelo murino de R-EAR induzida por SJL/J PLP139-151 /CFA de esclerose múltipla). Portadores de peptídeos acoplados da presente invenção proporcionam numerosas vantagens sobre outras estruturas de indução de tolerância. Em algumas modalidades, as partículas são biodegradáveis e, portanto, não serão mantidas durante longos períodos no corpo. O tempo para a degradação completa pode ser controlado. Em algumas modalidades, as partículas são funcionalizadas para facilitar a internalização sem ativação das células (por exemplo, fosfatidilserina carregada em microesferas de PLG). Em algumas modalidades, as partículas incorporam ligantes que têm como alvo uma população de células específica. Em algumas modalidades, as citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e TGF-β, estão incluídas em ou dentro de partículas para limitar a ativação do tipo de célula que está internalizando nas partículas e para facilitar a indução de tolerância por meio de energia e/ou deleção e a ativação de células T reguladoras.
[0200] As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós, e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, as partículas modificadas são misturadas com pelo menos um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável inerte como citrato de sódio ou fosfato dicálcio e/ou a) enchimentos ou diluentes como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e ácido silícico, b) ligantes como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarose, e acácia, c) umectantes como glicerol, d) agentes desintegrantes como ágar- ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos, e carbonato de sódio, e) agentes de retardamento de solução como parafina, f) aceleradores de absorção como compostos de amônio quaternário, g) agentes molhantes como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol, h) absorventes como caulino e argila de bentonita, e i) lubrificantes como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, e misturas dos mesmos. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma de dosagem pode também compreender agentes tamponantes.
[0201] As composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser empregues como agentes de enchimento em cápsulas de gelatina mole e dura, utilizando excipientes como lactose ou açúcar do leite bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e semelhantes. As formas de dosagem sólidas de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas, e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Estas podem conter opcionalmente agentes opacificantes e podem também ter uma composição tal que libere os ingredientes ativos apenas, ou preferencialmente, em uma certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de uma forma retardada. Exemplos de composições embutidas que podem ser utilizados incluem substâncias poliméricas e ceras. As composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser empregues como agentes de enchimento em cápsulas de gelatina mole e dura, utilizando excipientes como lactose ou açúcar do leite bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e semelhantes.
[0202] As partículas modificadas podem também estar em forma micro-encapsulada com um ou mais excipientes, como dito acima. As formas de dosagem sólidas de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas, e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, como revestimentos entéricos, revestimentos de controle de liberação e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólida o composto ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte como sacarose, lactose e amido. Tais formas de dosagem podem também compreender, como é prática normal, outras substâncias adicionais além de diluentes inertes, por exemplo, lubrificantes de comprimidos e outros auxiliares de prensagem como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes tamponantes. Eles podem conter opcionalmente agentes opacificantes e podem também ter uma composição tal que libere as partículas modificadas apenas, ou preferencialmente, em uma certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de uma forma retardada. Exemplos de composições embutidas que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
[0203] A presente invenção abrange formulações tópicas farmaceuticamente aceitáveis das partículas modificadas da invenção. O termo “formulação tópica farmaceuticamente aceitável” como aqui utilizado significa qualquer formulação que seja farmaceuticamente aceitável para administração por via intradérmica de micropartículas modificadas da invenção, por aplicação da formulação para a epiderme. Em certas modalidades da invenção, a formulação tópica compreende um sistema carreador. Carreadores farmaceuticamente eficazes incluem, entre outros, solventes (por exemplo, álcoois, poli álcoois, água), cremes, loções, pomadas, óleos, emplastros, lipossomas, pós, emulsões, microemulsões, e soluções tamponadas (por exemplo, hipotônico ou solução salina tamponada) ou qualquer outro carreador conhecido na técnica para a administração tópica de fármacos. Uma lista mais completa de carreadores conhecidos na técnica é fornecida por textos de referência que são padrão na técnica, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, 1980 e 17th Edition, 1985, ambos publicados por Mack Publishing Company, Easton, Pa., cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Em certas outras modalidades, as formulações tópicas da presente invenção podem compreender excipientes. Qualquer excipiente farmaceuticamente aceitável conhecido na técnica pode ser utilizado para preparar as formulações tópicas farmaceuticamente aceitáveis da invenção. Exemplos de excipientes que podem ser incluídos nas formulações tópicas da presente invenção incluem, entre outros, conservantes, antioxidantes, hidratantes, emolientes, agentes de tamponamento, agentes solubilizantes, outros agentes de penetração, protetores da pele, agentes surfactantes, e agentes propulsores e/ou agentes terapêuticos adicionais usados em combinação com as partículas modificadas. Os conservantes adequados incluem, entre outros, álcoois, aminas quaternárias, ácidos orgânicos, parabenos, e fenóis. Os antioxidantes adequados incluem, entre outros, ácido ascórbico e os seus ésteres, bissulfito de sódio, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, tocoferol, e agentes quelantes, como EDTA e ácido cítrico. Hidratantes adequados incluem, entre outros, glicerina, sorbitol, polietileno glicóis, ureia e propileno glicol. Agentes de tamponamento adequados para utilizar com a invenção incluem, entre outros, ácido cítrico, ácido clorídrico, e os tampões de ácido láctico. Agentes de solubilização adequados incluem, entre outros, cloretos de amônio quaternário, ciclodextrinas, benzoato de benzil, lecitina e polissorbatos. Protetores da pele adequados que podem ser utilizados nas formulações tópicas da presente invenção incluem, entre outros, óleo de vitamina E, alatoína, dimeticona, glicerina, petrolato, e óxido de zinco.
[0204] Em certas modalidades, as formulações tópicas farmaceuticamente aceitáveis da invenção compreendem, pelo menos, as partículas modificadas da invenção e um agente de aumento da penetração. A escolha de uma formulação tópica dependerá de vários fatores, incluindo a condição a ser tratada, as características físico-químicas do composto da presente invenção e outros excipientes presentes, suas estabilidades na formulação, equipamento de fabricação disponível e custos de restrições. Como aqui utilizado, o termo “agente de aumento de penetração” significa um agente capaz de transportar um composto farmacologicamente ativo através do estrato córneo e para a epiderme ou derme, preferencialmente, com absorção sistêmica pouca ou nenhuma. Uma ampla variedade de compostos foi avaliada quanto à sua eficácia na melhoria da taxa de penetração de drogas através da pele. Ver, por exemplo, Percutaneous Penetration Enhancers, Maibach H. I. e Smith H. E. (eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1995), que examina a utilização e ensaio de vários potencializadores da penetração na pele, e Buyuktimkin et al., Chemical Means of Transdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, Gosh T. K., Pfister W. R., Yum S. I. (Eds.), Interpharm Press Inc., Buffalo Grove, Ill. (1997). Em certas modalidades exemplificativas, os agentes de penetração para utilização com a invenção incluem, entre outros, os triglicerídeos (por exemplo, óleo de soja), (por exemplo, composições de aloé, gel de aloé vera), álcool etílico, álcool isopropílico, octolifenilpolietileno glicol, ácido oleico, polietileno glicol 400, propileno glicol, N-decilmetilsulfóxido, ésteres de ácidos graxos (por exemplo, miristato de isopropil, laurato de metil, mono-oleato de glicerol, e mono-oleato de propileno glicol) e N- metilpirrolidona.
[0205] Em certas modalidades, as composições podem estar na forma de pomadas, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inalantes ou adesivos. Em certas modalidades exemplificativas, as formulações das composições de acordo com a invenção são cremes, que podem ainda conter ácidos graxos saturados ou insaturados como ácido esteárico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido palmito-oleico, álcoois cetil ou oleil, sendo particularmente preferenciais o ácido esteárico. Cremes da invenção podem também conter um agente surfactante não iônico, por exemplo, polioxi-40-estearato. Em certas modalidades, o componente ativo é misturado sob condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários conforme necessário. A formulação oftálmica, gotas otológicas, e colírios são também contemplados como estando dentro do escopo da presente invenção. Além disso, a presente invenção contempla a utilização de adesivos transdérmicos, que têm a vantagem adicional de proporcionar a liberação controlada de um composto ao corpo. Tais formas de dosagem são preparadas por dissolução ou dispensação do composto no meio adequado. Como discutido acima, os agentes de melhora de penetração também podem ser usados para aumentar o fluxo do composto através da pele. A velocidade pode ser controlada proporcionando uma membrana controladora da velocidade ou por dispersão do composto em uma matriz de polímero ou gel.
[0206] As partículas modificadas podem ser administradas por aerossol. Isto é conseguido através da preparação de um aerossol aquoso, a preparação lipossômica ou partículas sólidas que contêm as partículas modificadas. Uma suspensão não aquosa (por exemplo, propulsor de fluorocarboneto) pode ser utilizada.
[0207] Normalmente, um aerossol aquoso é feito através da formulação de uma solução ou suspensão aquosa do agente em conjunto com transportadores ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis convencionais. Os transportadores ou estabilizantes variam de acordo com os requisitos do composto particular, mas incluem tipicamente surfactantes não iônicos (Tweens, Pluronics ou polietileno glicol), proteínas como a albumina de soro inócuos, ésteres de sorbitano, ácido oleico, lecitina, aminoácidos como glicina, tampões, sais, açúcares ou álcoois de açúcar. Os aerossóis são geralmente preparados a partir de soluções isotônicas.
[0208] Será também apreciado que as partículas modificadas e composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas e empregues em terapias combinadas, isto é, os compostos e as composições farmacêuticas podem ser formulados com ou administrados em simultâneo com, antes de, ou subsequentemente a, uma ou mais outras terapêuticas ou procedimentos médicos desejados. A combinação em particular de terapias (terapêuticas ou procedimentos) para empregar em um regime combinado terá em conta a compatibilidade das terapêuticas desejadas e/ou procedimentos e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será também apreciado que as terapias utilizadas podem conseguir um efeito desejado para o mesmo distúrbio (por exemplo, um composto inventivo pode ser administrado concorrentemente com outro agente anti- inflamatório), ou podem conseguir efeitos diferentes (por exemplo, o controle de qualquer efeito adverso).
[0209] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas que contêm as partículas modificadas da presente invenção compreendem ainda um ou mais ingredientes adicionais terapeuticamente ativos (por exemplo, anti-inflamatórios e/ou paliativos). Para os fins da invenção, o termo “paliativo” refere-se ao tratamento que é focado sobre o alívio de sintomas de uma doença e/ou efeitos colaterais de um regime terapêutico, mas não é curativo. Por exemplo, o tratamento paliativo abrange analgésicos, drogas antináuseas e drogas anti-doença.
[0210] A invenção proporciona métodos de regulação de uma resposta imune em um indivíduo, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano, compreendendo a administração ao indivíduo de partículas modificadas, aqui descritas. Métodos de imunorregulação fornecidos pela invenção incluem aqueles que suprimem e/ou inibem uma resposta imune inata ou uma resposta imune adaptativa, incluindo, entre outras, uma resposta imune estimulada por polipeptídeos imunoestimulantes ou componentes virais ou bacterianos.
[0211] As partículas modificadas são administradas em uma quantidade suficiente para regular uma resposta imune. Como aqui descrito, a regulação de uma resposta imune pode ser humoral e/ou celular, e é medida utilizando técnicas padrão na técnica e como aqui descrito.
[0212] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas são administradas juntamente com (por exemplo, em simultâneo com, antes de, ou a seguir) de um implante (por exemplo, dispositivo) e/ou transplante (por exemplo, tecido, células, órgão) para mediar, negar, e regular/ou reduzir a resposta imunológica associada com as mesmas.
[0213] Em certas modalidades, o indivíduo sofre de uma doença associada com a ativação imune indesejada, como a doença ou condição alérgica, alergia e asma. Um indivíduo tendo uma doença alérgica ou asma é um indivíduo com um sintoma identificável de uma doença alérgica ou asma existente. A tolerância pode ser induzida em tal indivíduo, por exemplo, por partículas complexadas com os alimentos específicos (por exemplo, proteínas de amendoim, etc), substâncias injetadas (por exemplo, proteínas de veneno de abelha, etc.), ou substâncias inaladas (por exemplom proteínas do pólen de tasneira, proteínas de pelos de animal de estimação, etc.) que provocam a reação alérgica.
[0214] Em certas modalidades, o indivíduo sofre de uma doença associada com a ativação imune indesejada, como doença autoimune e doença inflamatória. Um indivíduo com uma doença autoimune ou doença inflamatória é um indivíduo com um sintoma reconhecido de uma doença autoimune existente ou doença inflamatória. A tolerância pode ser induzida em tal indivíduo, por exemplo, por partículas complexadas com os autoantígenos relevantes conduzindo a doença autoimune particular.
[0215] Em certas modalidades, o indivíduo sofre de um distúrbio associado com a terapia de substituição enzimática. A tolerância pode ser induzida em tal indivíduo, por exemplo, por partículas complexadas com as enzimas cujos pacientes com deficiências genéticas não conseguem produzir, para impedi-los de ter respostas a anticorpos neutralizantes para enzimas recombinantemente produzidas administradas para tratar a deficiência em particular, por exemplo, tolerância ao Fator VIII humano em pacientes com hemofilia devido a uma deficiência genética na capacidade de preparar o Fator VIII.
[0216] Em certas modalidades, o indivíduo sofre de um distúrbio associado com a terapia de doença. No caso de anticorpos recombinantes, a tolerância induzida, por exemplo, a um anticorpo humanizado a ser utilizado em um contexto terapêutico para evitar um paciente de, por exemplo, tolerância a um subconjunto imune de humanizado esgotando anticorpo ou anticorpo anticitocina sendo utilizado como um tratamento para a doença autoimune.
[0217] Doenças autoimunes podem ser divididas em duas grandes categorias: sistêmicas e específicas do órgão. Doenças autoimunes incluem, entre outras, a artrite reumatoide (AR), lúpus eritematoso sistêmico (LES), diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, esclerose múltipla (MS), infertilidade imunomediada como falha ovariana prematura, esclerodermia, doença Sjogren, vitiligo, alopecia (calvície), insuficiência poliglandular, doença de Grave, hipotireoidismo, polimiosite, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, doença inflamatória do intestino incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa, hepatite autoimune incluindo a associada com o vírus da hepatite B (HBV) e vírus da hepatite C (HCV), hipopituitarismo, doença do enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), miocardite, doença de Addison, doenças de pele autoimunes, uveíte, anemia perniciosa, doença celíaca, e hipoparatiroidismo.
[0218] Doenças autoimunes também podem incluir, entre outras, tireoidite de Hashimoto, síndromes poliglandulares autoimunes tipo I e tipo II, pênfigo paraneopásico, penfigoide bolhoso, dermatite herpetiforme, doença de IgA linear, epidermólise bolhosa adquirida, eritema nodoso, penfigoide gestacional, penfigoide cicatricial, crioglobulinemia essencial mista, doença bolhosa crônica da infância, anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica, síndrome de Goodpasture, neutropenia autoimune, miastenia gravis, síndrome miastênica de Eaton- Lambert, síndrome stiff-man, encefalomielite disseminada aguda, síndrome de Guillain-Barre, poliradiculoneuropatia inflamatória desmielinizante, neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução, neuropatia crônica com gamapatia monoclonal, síndrome opsonoclonus-mioclonia, degeneração cerebelar, encefalomielite, retinopatia, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, enteropatia sensível ao glúten, espondilite anquilosante, artrites reativas, polimiosite/dermatomiosite, doença mista do tecido conjuntivo, síndrome de Bechet, psoríase, poliarterite nodosa, anguitis alérgica e granulomatose (doença de Churg- Strauss), síndrome de sobreposição poliangite, vasculite de hipersensibilidade, granulomatose de Wegener, arterite temporal, arterite de Takayasu, doença de Kawasaki, vasculite isolada do sistema nervoso central, tromboangiutis obliterante, sarcoidose, glomerulonefrite, e criopatias. Estas condições são bem conhecidas nas técnicas médicas e são descritas, por exemplo, em Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th ed., Fauci A S et al., eds., New York: McGraw-Hill, 1998.
[0219] Os modelos animais para o estudo de doenças autoimunes são conhecidos na técnica. Por exemplo, modelos animais que aparecem mais semelhante à doença autoimune humana incluem cepas de animais que desenvolvem espontaneamente uma elevada incidência da doença em particular. Exemplos de tais modelos incluem, entre outros, os camundongos não obesos diabéticos (NOD), que desenvolveram uma doença semelhante ao diabetes do tipo 1, doenças e animais propensas ao lúpus, como camundongos híbridos New Zealand, MRL-Faslpr e BXSB. Os modelos animais de artrite, em que uma doença autoimune tem sido induzida incluem, entre outros, encefalomielite autoimune experimental (EAE), que é um modelo para a esclerose múltipla, artrite induzida por colágeno (CIA), que é um modelo para a artrite reumatoide, e uveíte autoimune experimental (EAU), que é um modelo para a uveíte. Os modelos animais para a doença autoimune foram criados por manipulação genética e incluem, por exemplo, camundongos knockout IL-2/IL-10 para a doença inflamatória do intestino, nocaute de ligante Fas ou Fas para o SLE, e nocaute de antagonista do receptor de IL-I para a artrite reumatoide.
[0220] Em certas modalidades, o indivíduo sofre de uma infecção bacteriana ou viral. Um indivíduo que tem uma infecção bacteriana ou viral é um indivíduo com um sintoma reconhecido de uma infecção bacteriana ou viral existente.
[0221] Uma lista não limitante de infecções virais que podem ser tratadas com as partículas modificadas da presente invenção inclui infecções por vírus do herpes, infecções por vírus da hepatite, infecções por vírus do Nilo Ocidental, infecções por flavivírus, infecções por vírus de gripe, infecções de rinovírus, infecções por papilomavírus, infecções paromixovírus, infecções por vírus parainfluenza, e infecções por retrovírus. Vírus preferenciais são aqueles vírus que infectam o sistema nervoso central do sujeito. A maioria dos vírus preferenciais são aqueles que causam a encefalite ou meningite.
[0222] Uma lista não limitante de infecções bacterianas tratáveis com as partículas modificadas da presente invenção incluem infecções por Staphylococcus, infecções por Streptococcus, infecções por micobactérias, infecções por bacilos, infecções por Salmonella, infecções por Vibrio, infecções por espiroquetas, e infecções por Neisseria. Os preferenciais são as bactérias que infectam o sistema nervoso central do sujeito. As mais preferenciais são as bactérias que causam a encefalite ou meningite.
[0223] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a utilizações de composições de acordo com esta invenção antes do aparecimento da doença. Em outras modalidades, a invenção refere-se a utilizações das composições da presente invenção para inibir a doença em curso. Em algumas modalidades, a invenção refere-se a melhorar a doença em um sujeito. Ao melhorar a doença em um sujeito pretende-se incluir o tratamento, prevenção ou supressão da doença no sujeito.
[0224] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a prevenir a recidiva da doença. Por exemplo, uma resposta imune indesejada pode ocorrer a uma região de um peptídeo (como um determinante antigênico). A recorrência de uma doença associada a uma resposta imune indesejada pode ocorrer ao ter um ataque da resposta imune a uma região diferente do peptídeo. Uma vez que as partículas modificadoras do sistema imunológico da presente invenção estão livres de peptídeos ligados ou frações antigênicas, as partículas serão eficazes contra epítopos múltiplos. Respostas de células T em resposta a algumas doenças imunes, incluindo esclerose múltipla e outras doenças autoimunes mediadas por Th1/17 podem ser dinâmicas e evoluem durante o decorrer da doença remitente-recorrente e/ou crônica progressiva. A natureza dinâmica do repertório de células T tem implicações para o tratamento de determinadas doenças, uma vez que o alvo pode mudar à medida que a doença progride. Anteriormente, o conhecimento pré-existente do padrão de respostas foi necessário para prever a progressão da doença. A presente invenção proporciona composições que podem impedir o efeito da dinâmica da mudança da doença, uma função de “espalhamento de epítopos.” Um modelo conhecido na recaída é uma reação imune à proteína proteolipídica (PLP) como um modelo para a esclerose múltipla (EM). Resposta imune inicial pode ocorrer por uma resposta a PLP139-15. Início da doença posterior pode ocorrer por uma resposta imune de recaída a PLP [pi]s-iβi.
[0225] Outras modalidades desta invenção dizem respeito à transplante. Isto refere-se à transferência de uma amostra de tecido ou de enxerto a partir de um indivíduo doador para um indivíduo receptor, e é frequentemente realizada em receptores humanos que precisam do tecido, a fim de restaurar uma função fisiológica fornecida pelo tecido. Os tecidos que são transplantados incluem (entre outros) órgãos inteiros, como rim, fígado, coração, pulmão; componentes de órgãos, como enxertos de pele e da córnea do olho; e suspensões de células como células da medula óssea e as culturas de células selecionadas e expandidas a partir de medula óssea ou do sangue em circulação, e transfusões de sangue total.
[0226] Uma complicação potencial séria de qualquer transplante resulta das diferenças antigênicas entre o receptor hospedeiro e o tecido enxertado. Dependendo da natureza e grau da diferença, pode haver um risco de um ataque imunológico do enxerto pelo hospedeiro, ou do hospedeiro pelo enxerto, ou ambos, podem ocorrer. A extensão do risco é determinada seguindo o padrão de resposta em uma população de indivíduos tratados de forma semelhante a um fenótipo semelhante, e correlacionando aos diversos fatores possíveis que contribuem de acordo com procedimentos clínicos bem aceitos. O ataque imunológico pode ser o resultado de uma resposta imunológica pré-existente (como um anticorpo pré-formado), ou um que é iniciado sobre o tempo de transplante (como a geração de células TH). Anticorpo, células TH, ou células Tc podem estar envolvidas em qualquer combinação umas com as outras e com várias moléculas efetoras e células. No entanto, os antígenos que estão envolvidos na resposta imune em geral não são conhecidos, por conseguinte, o que levanta dificuldades na concepção de terapias específicas para o antígeno ou induzir tolerância específica para o antígeno.
[0227] Certas modalidades da invenção referem-se à redução do risco de doença de enxerto versus hospedeiro, resultando em rejeição do enxerto de tecidos pelo beneficiário. O tratamento pode ser realizado para prevenir ou reduzir o efeito de uma resposta de rejeição hiperaguda, aguda, ou crônica. O tratamento é preferencialmente iniciado com suficiente antecedência do transplante de modo que a tolerância estará em vigor quando o enxerto é instalado; mas quando isso não for possível, o tratamento pode ser iniciado em simultâneo com ou após o transplante. Independentemente do período de iniciação, o tratamento irá geralmente continuar em intervalos regulares durante pelo menos o primeiro mês após o transplante. Doses de acompanhamento podem não ser necessárias, caso ocorra uma acomodação suficiente do enxerto, mas pode ser retomada se houver qualquer evidência de rejeição ou inflamação do enxerto. É claro, os procedimentos de indução de tolerância desta invenção podem ser combinados com outras formas de imunossupressão para alcançar um nível ainda menor do risco.
[0228] Em algumas modalidades, as composições da presente invenção (por exemplo, transportador de PLG acoplado a molécula antigênica) encontram utilização com uma ou mais estruturas, matrizes e/ou sistemas de liberação (Ver, por exemplo, Pedido de Patente US 2009/0238879; Patente US 7.846.466; Patente US 7.427.602; Patente US 7.029.697; Patente US 6.890.556; Patente US 6.797.738; Patente US 6.281.256; aqui incorporada por referência na sua totalidade). Em algumas modalidades, as partículas (por exemplo, partículas de PLG acopladas ao antígeno) são associadas com, adsorvidas em, encaixadas dentro, conjugadas a, uma estrutura, etc., matriz, e/ou sistema de liberação (por exemplo, para liberação de material biológico/químico, células, tecidos e/ou um órgão a um sujeito). Em algumas modalidades, uma estrutura de suporte, matriz, e/ou sistema de liberação (por exemplo, para liberação de material químicos/biológico, células, tecidos e/ou um órgão a um indivíduo) compreende e/ou é feita a partir de materiais aqui descritos (por exemplo, PLG conjugado com um ou mais peptídeos antigênicos).
[0229] Em algumas modalidades, estruturas microporosas (por exemplo, para o transplante de material biológico (por exemplo, células, tecido, etc.) em um sujeito) são fornecidas. Em algumas modalidades, são proporcionados transportadores microporosos tendo nestes agentes (por exemplo, proteínas de matriz extracelular, a exendina-4) e material biológico (por exemplo, células de ilhotas pancreáticas). Em algumas modalidades, os transportadores são utilizados no tratamento de doenças (por exemplo, diabetes tipo 1), e métodos relacionados (por exemplo, métodos de diagnóstico, métodos de investigação, de pesquisa de drogas). Em algumas modalidades, estruturas são fornecidas com os transportadores de antígenos conjugados descritos aqui em e/ou dentro da estrutura. Em algumas modalidades, estruturas são produzidas a partir de materiais de conjugados de antígeno (por exemplo, PLG conjugado a antígeno).
[0230] Em algumas modalidades, uma estrutura e/ou sistema de liberação compreende uma ou mais camadas e/ou tem um ou mais produtos químicos e/ou entidades/agentes biológicos (por exemplo, proteínas, partículas conjugadas ao peptídeo, moléculas pequenas, células, tecido, etc.), ver, por exemplo, Pedido de Patente US 2009/0238879; aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, partículas acopladas com antígenos são coadministradas com um sistema de liberação de estrutura para provocar a indução de tolerância imunológica à estrutura e os materiais associados. Em algumas modalidades, estrutura microporosa é administrada a um sujeito com partículas aqui descritas sobre ou dentro da estrutura. Em algumas modalidades, partículas acopladas com antígeno acopladas a um sistema de liberação de estrutura. Em algumas modalidades, um sistema de liberação de estrutura compreende partículas acopladas com antígeno.
[0231] Várias modificações, recombinação, e a variação das características descritas e modalidades serão evidentes para os especialistas na técnica sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora modalidades específicas tenham sido descritas, deverá ser entendido que a invenção como reivindicada não deverá ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos e modalidades que são óbvias para os especialistas nos campos relevantes descritos destinam- se a estar dentro do escopo das seguintes reivindicações. Por exemplo, Pedidos de Patente US 2012/0076831, 2002/0045672, 2005/0090008, 2006/0002978, e 2009/0238879 (cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade) e Patente US 7.846.466; 7.427.602; 7.029.697; 6.890.556;.6,797,738; e 6.281.256 (cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade) fornecem detalhes, modificações e variações que encontram usam em várias modalidades aqui descritas.
[0232] Todas as publicações e patentes mencionadas no presente pedido e/ou listadas abaixo são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.EXEMPLOS
[0233] Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar adicionalmente as vantagens e características da invenção, mas não pretendem limitar o escopo desta divulgação.
Materiais e MétodosGeração de camundongos quiméricos
[0234] Camundongos de seis a oito semanas de idade B6.SJL- PtprcaPep3b/BoyJ (CD45.1) foram irradiadas com uma dose de 950 rads. Doze horas mais tarde, os camundongos foram reconstituídos com 107 células da medula óssea de doadores C57BL/6-7.2fms-EGFP. Os camundongos receberam sulfametoxazol (Sigma Aldrich) e trimetoprim (Sigma Aldrich) em água potável durante 10 dias após irradiação. Os camundongos foram infectados com WNV seis semanas após a irradiação, como descrito acima. Quimerismo foi verificado por citometria de fluxo e foi invariavelmente encontrado para ser 96-99% de origem do doador, como demonstrado anteriormente (Getts et al., J Neurochem. 103: 1019, 2007).
Imuno-histologia
[0235] Os camundongos foram anestesiados e perfundidos com 50 mL de PBS estéril. Com a exceção do coração, que foram processados em blocos de parafina (Getts et al., J. Neurochem 103:10919-1030, 2007), todos os órgãos foram isoladas e congeladas rapidamente em Optimum Cutting Temperature Compound (OCT; Tissue-Tek, Tokyo, Japan). Secções de tecido de oito mícrons foram cortadas em um micrótomo criostato, durante a noite, secas ao ar e, em seguida, armazenada a -80°C até serem necessárias. As secções congeladas foram descongeladas e histologia (hematoxilina e eosina padrão) ou imuno-histoquímica foram realizadas (Getts et al., J. Exp Med 205:2319-2337, 2008). Os anticorpos contra MARCO, SIGN-R1 and SIGLEC-1 (R&D Systems, MN, USA), CD68 (Abcam, MA, USA) e Ki67 (Abcam), foram usados como indicado. As imagens foram adquiridas em um microscópio Olympus BX-51 usando uma câmera DP-70 e software DP manager 2.2.1 (Olympus, Tokyo, Japão).
Microscópio e aquisição de imagem
[0236] As imagens foram adquiridas em um microscópio Olympus BX-51 (Olympus, Japão), utilizando uma câmera DP-70 e software DP manager 2.2.1 (Olympus).
Isolamento de leucócitos a partir do cérebro e do fígado
[0237] Como descrito anteriormente (Getts et al, J Exp Med. 29: 2319, 2007) leucócitos foram obtidos a partir de cérebros de camundongos perfundidos por PBS por digestão dos cérebros durante 60 minutos a 37°C em PBS com desoxi-ribonuclease (0,005 g/ml, Sigma Aldrich) e colagenase IV (0,05 g/mL, Sigma Aldrich). A digestão foi parada com 10% de FCS, e o homogenato foi passado através de um filtro de células de 70μm de náilon (Becton Dickinson, NJ, EUA). O pellet, obtido após 10 minutos de centrifugação a 340xg, foi ressuspenso em 30% de Percoll (Amersham, Noruega) e colocado em camadas sobre 80% de Percoll. Os leucócitos foram coletados a partir da interface de 30%/80% depois da centrifugação a 1140xg durante 25 minutos à temperatura ambiente. O mesmo protocolo é também utilizado para derivar os leucócitos a partir do fígado, com o tecido pesado antes do processamento.
Isolamento de leucócitos a partir do baço, medula óssea e sangue
[0238] Para a análise de citometria de fluxo, o fêmur direito foi dissecado e células da medula óssea expelidas usando seringas carregadas com PBS. Para isolamento de precursor da medula óssea, fêmures e tíbias de pelo menos 4 camundongos foram utilizados. A suspensão celular obtida após a lavagem foi filtrada através de um filtro de células de 70μm e centrifugada durante 5 min a 340 g. Células vermelhas do sangue no pellet resultante foram lisadas em tampão de lise de glóbulos vermelhos à base de NH4Cl (BD Pharm Lyse TM ; BD Pharmingen), antes de centrifugação durante 5 min a 340xg. No caso do sangue periférico, o sangue foi coletado através de punção cardíaca e imediatamente transferido para tampão de citrato (mMol, Sigma Alrich). A suspensão resultante foi colocada em camadas sobre 70% de Percoll e centrifugadas a 1140xg durante 20 minutos à temperatura ambiente com o freio. A interface foi coletada e as células lavadas uma vez em PBS, centrifugadas a 340xg. Para o isolamento de leucócitos de baço, os baços foram passados através de um filtro de células de 7070μm e centrifugados durante 5 min a 340 g. Células vermelhas do sangue no pellet resultante foram lisadas em tampão de lise de glóbulos vermelhos à base de NH4Cl (BD Pharm LyseTM ; BD Pharmingen), antes de centrifugação durante 5 min a 340xg.
Citometria de fluxo
[0239] As células coletadas (como descrito acima) a partir do cérebro, fígado, sangue e medula óssea foram lavadas em PBS, e bloqueadas com anticorpo anti-CD16/CD32 (BioLegend). As células viáveis foram contadas utilizando exclusão com azul de tripano, a qualquer mostrou rotineiramente> 95% de viabilidade celular.
[0240] Expressão de molécula da superfície da célula foi medida e a classificação das células realizada em FACS ARIA (Becton Dickinson), equipado com um íon de argônio e laser HeNe. Populações viáveis foram barradas por dispersão frontal e lateral e populações fluorescentes identificadas determinadas por barramento de frente ao depois. Classificação foi realizada utilizando parâmetros fluorescentes e de dispersão especiais que identificam a população de interesse. Rigores de triagem foram ajustados para pureza para atingir > 98% de pureza para as populações de medula óssea.
[0241] Arquivos de dados FACS adquiridos foram analisados utilizando o programa de citometria de fluxo, Fluxo de Jo (FlowJo, Ashland, OR, EUA). A quantificação de populações de células de interesse foi calculada com base em percentagens em citometria de fluxo e análise de contagens absolutas de célula a partir de cada órgão.Transferência adotiva
[0242] Os experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção para investigar um segundo modelo de doença ativa denominado transferência adotiva. Em vez de imunização dos animais com o peptídeo, os linfócitos do baço de camundongos com doença ativa foram transferidos para um receptor, que, subsequentemente, desenvolve a doença. Os experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção para caracterizar a capacidade das nanopartículas de PLG em desativar as células efetoras ativadas adotivamente transferidas. Camundongos tratados com partículas ou esplenócitos juntamente com um peptídeo de controle tiveram um aumento no escore clínico com início no dia 4. Camundongos tratados com partículas PLG- PLP139-151 no dia 2 teve um escore médio clínica de 0 para todos, mas dois pontos no tempo até ao dia 40, e o escore clínico médio para esses outros pontos de tempo foi de 0,25.
ELISA Multiplex
[0243] ELISAs em placa multiplexadas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante (Quansys Biosciences, Logan, Utah, EUA). Resumidamente, o cérebro, baço, fígado e tecido foram homogeneizados em PBS, clarificados por uma rotação 1000xg, e armazenados a -20°C até que o ensaio fosse realizado. Também foram utilizadas amostras de soro. Amostras descongeladas e padrões foram diluídos no tampão fornecido, e 30 μ l de cada uma foram colocadas em cada poço que contém 16 pontos contendo em cada um anticorpo de captura para uma proteína solúvel em particular. As placas foram então incubadas durante 1 hora em um agitador orbital a 120 rpm As placas foram lavadas 3 vezes, e 30 μ l de anticorpo de detecção foi adicionado a cada poço e incubadas durante mais uma hora. Depois de lavar 3 vezes, estreptavidina-HRP foi adicionada e incubada durante mais 15 minutos. As placas foram então lavadas 6 vezes, e mistura de substrato foi adicionada. As placas foram imediatamente lidas em um sensor CCD (Kodak, Rochester NY, EUA). Imagens das placas foram analisadas utilizando software Quansys Q-view (Quansys Biosciences).Indução e avaliação de encefalite autoimune experimental (EAE)
[0244] Os camundongos foram injetados subcutaneamente com 0,1 mg emulsão contendo Peptídeo MOG (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEQ ID NO: 1); Auspep, Parkville, Victoria, Australia; > 95% por HPLC purificado) e adjuvante completo de Freund contendo 2 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis (Sigma Aldrich). Dois dias mais tarde, os camundongos foram administrados com 500 μ l de toxina pertussis (Sigma Aldrich) i.p. Os camundongos foram monitorados durante a progressão da doença, e classificados na seguinte escala: 1, cauda fraca e/ou fraqueza do 1 membro traseiro; 2, fraqueza em mais de um membro, distúrbio da marcha; 3, paralisia em 1 membro; 4, paralisia em mais de um membro, incontinência; 5, moribundos.
Estatística
[0245] Os gráficos foram feitos e a análise estatística foi realizada de modo computadorizado em GraphPad Prism, e InStat, respectivamente (ambos os programas de software GraphPad, San Diego, CA, EUA). Dependendo dos dados, um teste t de Student de duas caudas não pareado, ou ANOVA de uma via com teste pós de Tukey-Kramer foi realizado, com P<0,05 considerado significativo.
[0246] Para a análise de correlação entre os parâmetros, como a perda de peso, a infiltração, e título do vírus, uma regressão não linear (ajuste de curva) foi usada, com um polinômio de segunda ordem (Y=A + B*X + C*X*2).Exemplo 1 Preparação de partículas modificadoras imune carregadas negativamente (IMPs)
[0247] À uma solução de Poli(anidrido etileno-maleico) (PEMA), em D2O (4 mL, 1% p/v) foi adicionada gota a gota uma solução de poli (ácido lactida-co-glicólico) (PLG) em diclorometano (DCM) (2 mL, 20% p/v). A mistura foi deixada em sonicação em gelo a 16 watts durante 30 segundos, utilizando o processador ultrassônico VC 30. O homogeneizado bruto resultante foi então vertido em uma solução de D2O (200 mL contendo 0,5% p/v de PEMA). A suspensão homogeneizada foi deixada agitar durante a noite ajustando a velocidade de 3,5 usando Bellco Glass, Inc., Bellstir multi-9 agitador magnético (10 W durante 10 s, 16 W durante 10 s, 16 W durante 30 s).Resultados
[0248] Após três horas de agitação, análise de tamanho de partícula foi realizada usando dispersão dinâmica da luz em cubetas de poliestireno descartáveisa. 10 W, 10 s - média Z = 499,9 nm - Pdl = 0,23, Pico = 634,5 nmb. 16 W, 10 s - média Z = 528,9 nm - Pdi = 0,227, Pico = 657,5 nmc. 16 W, 30 s - média Z = 471,6 nm - Pdi = 0,228, Pico = 580,5 nmd. 16 W, 60 s - média Z = 491,1 nm - Pdi = 0,275, Pico = 600,8 nm
[0249] Depois de a reação estar completa, a suspensão resultante em bruto foi então purificada.
Purificação
[0250] D2O fresco e 10x tampão de bicarbonato de sódio foram resfriados durante a noite a 4°C. Utilizando um filtro de células de 40 μm, 36 mL de suspensão de partículas foram filtrados a partir de cada lote para um tubo de centrífuga de 50 mL apropriadamente marcado contendo 4 mL de 10x tampão de bicarbonato de sódio refrigerado. Cada proveta produziu aproximadamente 6 tais tubos. Todos os tubos foram centrifugados durante cerca de 15 minutos a 7000g a 4°C e o sobrenadante foi aspirado. Preparação da suspensão foi repetida utilizando o procedimento acima mencionado e em muito dos pellets de partículas foram suspensas conforme possível em 1 mL de D2O gelado.
[0251] As partículas ressuspensas foram transferidas para um novo tubo com 4 ml de tampão de bicarbonato de sódio 10x resfriado. (Etapa 1)
[0252] Ressuspensão das partículas foi repetida até os pellets de partículas inteiros terem sido ressuspensos com sucesso. (Etapa 2)
[0253] Os seis tubos de centrífuga foram então combinadas em um tubo de centrífuga (tubo 50 mL) e o tubo foi cheio com o restante volume para 40 mL de D2O gelado (Lavagem 1).
[0254] O tubo foi centrifugado durante 20 minutos a 7000g a 4°C e o sobrenadante foi aspirado.
[0255] Etapas 1 e 2 e Lavagem 1 da partícula resultante foram repetidos cada vez, pelo menos, mais duas vezes. Finalmente, os pellets de partículas resultantes foram então submetidos a um congelamento rápido em nitrogênio líquido e liofilizados até à secura no distribuidor para obter IMPs negativamente.
[0256] A Figura 1 mostra caracterização de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície por meio de análise de espalhamento de luz dinâmica. Partículas de poli(lactida-coglicolida) de superfície funcionalizada foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 2,5 x 105 contagens por segundo em 18,2 mQ água. A população de partículas de poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinham um diâmetro médio Z de 567 nm, um pico de diâmetro de 670 nm e um índice de polidispersividade de 0,209.
[0257] A Tabela 1 mostra as medições de partículas PLG-PEMA de superfície funcionalizada. Os dados na tabela são representativos, uma vez que cada lote é ligeiramente diferente. Os números na tabela foram baseados na combinação de vários lotes de partículas. As medições para as partículas de emulsão dupla são semelhantes às da Tabela 1.Tabela 1 -Medidas para partículas PLG-PEMA de superfície funcionalizada
Figure img0001
Exemplo 2A administração de grânulos de PLGA acoplados aos antígenos impedem Encefalite Autoimune Experimental recidivante
[0258] Nanopartículas PLG foram investigadas com a proteína imunodominante proteolipídeo PLP139-151 epítopo (PLG-PLP139-151) para induzir tolerância para a prevenção de autoimune experimental Encefalite recidivante (R-EAE). Os camundongos R-EAE foram gerados como descrito acima.
[0259] Os peptídeos administrados aos animais foram acoplados a partículas com o diâmetro médio de 500 nm. Os camundongos foram tratados com PLP139-151-PLGA (N = 5), OVA323-339-PLGA (N = 5), ou PLGA não conjugado (N = 5) no dia -7 em relação ao momento da imunização (dia 0). Doença de Peak foi tipicamente observada em torno do dia 12 a 14, e os camundongos são classificados para a doença clínica. Partículas sem peptídeo, ou modificadas com o peptídeo controle OVA323-339 não impediram a indução da doença. No entanto, as partículas de PLGA modificadas com PLP139-151 produziram um escore clínico de 0 (sem doença) em todos exceto escores clínicos baixos de menos de 1 apresentados entre os dias 20 e 30 (Figura 2). Estudos anteriores com PLG inalterado ou usando partículas de poliestireno não produziram esta redução eficaz da doença, com partículas ligadas a poliestireno comumente desencadeando anafilaxia.
[0260] Além disso, a inativação específica de células T CD4+ específicas para mielina foi demonstrada pela falta de respostas de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) para imunizar ambos epítopos PLP139-151. Tomados em conjunto, o tratamento profilático com PLG-PLP139-151 no dia-7 especificamente impediu o desenvolvimento de EAE, e representa uma melhoria na capacidade das partículas em prevenir a doença. Os escores produzidos com as partículas são tão bons quanto, e, talvez, melhores, do que os escores produzidos com esplenócitos acoplados a antígeno.
[0261] O tipo de partícula administrada também tem um efeito sobre o desenvolvimento de EAE no modelo do camundongo. Os camundongos foram tratados com OVA323-339-PLS (N=5), OVA323-339- PLGAPHOSPOREX (N=5), OVA323-339-PLGAPEMA (N=5), PLP139-151-PLA (N=5), PLP139-151-PLGAPHOSPOREX (N=5), ou PLP139-151-PLGPEMA (N = 5) no dia -7 em relação ao momento da imunização (dia 0). Doença de Peak foi tipicamente observada em torno do dia 12 a 14, e os camundongos são classificados para a doença clínica. Partículas, de qualquer composição que foram modificadas com o peptídeo controle OVA323-339 não impediram a indução da doença. No entanto, grânulos PLG acoplados a PLP139-151 foram mais eficazes na indução de uma regulação para baixo de R-EAE do que PLP139-151 acoplado a pLG comercial (Phosphorex) ou poliestireno (Figuras 3A e 3B).Exemplo 3A infusão intravenosa de partículas PLG acopladas a antígeno não induz a queda de temperatura induzida por anafilaxia em animais pré-sensibilizadas OVA/Alum.
[0262] Devido à presença da doença ativa, anafilaxia aos antígenos é uma preocupação, o que poderia resultar em mortalidade imediata, e tem sido descrito com partículas de poliestireno ligado. Anafilaxia está associada com uma queda significativa na temperatura do corpo. Para testar se a administração intravenosa de OVA-PLG induz uma queda de temperatura induzida por anafilaxia em animais pré- sensibilizados, os camundongos foram imunizados no dia 0 com 10 μg de OVA/alum via injeção intraperitoneal. No dia 14, os camundongos foram novamente imunizados com 10 μg de OVA/alum, por injeção intraperitoneal, e, em seguida, tornados tolerantes com OVA-PLG administradas por via intravenosa no dia 21. No dia 28, os camundongos foram, em seguida, tornados tolerantes com quaisquer partículas OVA-PLG ou de OVA por administração endovenosa.
[0263] Como mostrado na Figura 4 os camundongos tratados com OVA solúvel no dia 28 apresentaram redução de temperatura em comparação com os animais tratados com a partícula OVA-PLG. Nenhuma diminuição da temperatura corporal foi observada dentro de 1 hora da liberação das partículas.
[0264] A Figura 5 mostra que a administração de PLG-PLP durante a remissão não resulta em qualquer mortalidade associada à anafilaxia. A EAE foi induzida em camundongos SJL/J fêmeas de seis a oito semanas de idade por injeção subcutânea de PLP139-151 em CFA, e o desenvolvimento da doença clínica foi monitorada e registrada (Figura 5B). Em relação ao d21 da indução da doença, os camundongos receberam injeções iv de PLP139-151 solúvel (quadrados claros) OVA323-339 solúvel (círculos claros), ou os mesmos peptídeos acoplados a nanopartículas de PLG (sólidos). Temperatura dos animais foi monitorada e registrada a cada 10 minutos durante 1 hora após a injeção (Figura 5A).Exemplo 4O tratamento profilático com as partículas de PLG-PLP induz a longo prazo, a tolerância específica ao antígeno
[0265] Dosagem ideal foi determinada pela administração intravenosa de concentrações crescentes de PLP139-151-PLG sete dias antes da indução da doença, e monitorada para o desenvolvimento da doença clínica, em comparação com camundongos SJL/J tratados com OVA323-339-PLG (Figura 6A). Camundongos fêmeas SJL/J de seis a oito semanas de idade foram injetados iv com PLP139-151 (quadrado) - ou OVA323-339 (círculo) - juntamente nanopartículas de PLG. A EAE foi induzida por injeção subcutânea de PLP139-151 em CFA 7 dias (Figura 6B), 25 dias (Figura 6C), ou 50 dias (Figura 6D) mais tarde. Os animais do painel B foram acompanhados por doença clínica por 100 dias. A Figura 6E mostra que no dia 8 em relação à indução da doença, uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) foi realizada em um subconjunto de camundongos mostrado no painel B. Animais representativos selecionados dos grupos iniciados com PLP139-151 /CFA no painel B (OVA323-339-PLG e PLP139-151-PLG) foram desafiados na orelha com o epítopo de iniciação PLP139-151 e peptídeo controle OVA323-339. Inchaço da orelha como uma medida de DTH foi determinado 24 horas mais tarde e as respostas antes do desafio foram subtraídas. Figura 6F mostra que camundongos fêmeas SJL/J de seis a oito semanas de idade foram injetados por via intravenosa com PLP178-191 (triângulo)-, OVA323-339 (círculo) ou PLP139-151 (quadrado) acoplados a nanopartículas PLG, ou com partículas desacopladas sozinhas (círculo descrito). A EAE foi induzida 7 dias mais tarde por injeção subcutânea de PLP178-191 em CFA, e doença foi monitorada nos pontos de tempo indicados.Exemplo 5Tratamento de Encefalite Autoimune Experimental recidivante com partículas acopladas com antígeno
[0266] Os experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção para investigar a capacidade de partículas PLG-PLP139-151 para tratar doença em vez de prevenir a doença, e para determinar se a via de administração alterou o desenvolvimento da doença. Os camundongos foram imunizados no dia 0 com PLP139-151 e um adjuvante. Camundongos têm normalmente escores clínicos máximos no dia 12-14. Neste modelo, os camundongos foram tratados no dia 10 com partículas PLG-PLP139-151 ou com partículas de controle de PLG-OVA323-339 por administração de via intravenosa (iv), por via intraperitoneal (ip), administração subcutânea (sc), ou por via oral. Como mostrado na Figura 7, a tolerância profilática é mais eficiente quando partículas PLG-PLP139-151 são administradas por via intravenosa ou intraperitoneal. Os animais tratados com PLP139-151-PLG administrados por via intravenosa não desenvolveram a doença e apresentaram escores clínicos médios de 0 na maioria dos pontos de tempo. Isto está em contraste com os animais tratados com partículas PLP139-151 poliestireno, em que> 70% dos animais foram observados para morrer de anafilaxia.Exemplo 6 Tolerância de partícula acoplada ao antígeno inibe a indução de respostas Th1 e Th17 específicas de antígeno em Encefalite autoimune experimental recidivante ativa
[0267] Para determinar se a administração de partículas acopladas com antígeno inibiram a indução de células T helper, MOG35-55-PLG ou OVA323-339-PLG em partículas foram administrados por via intravenosa aos camundongos BALB/c no dia -7. No Dia 0, partículas OVA323-339-PLG e Adjuvante Completo de Freund (CFA) foram administradas subcutaneamente aos camundongos. Os animais foram novamente estimulados com partículas MOG35-55-PLG ou OVA323- 339-PLG no dia 10 e as células dos nódulos linfáticos de drenagem foram isoladas. O níveis de CPM e de IL-17, GM-CSF, IFN-Y, IL-10 e IL-4 foram medidos no Dia 10. Como mostrado na Figura 8, a administração de partículas OVA323-339-PLG inibiu as respostas Th1 e Th17 nos animais tratados.Exemplo 7Tolerância é induzida por partículas PLP-139-151 acopladas a PLGA
[0268] Uma estratégia de tolerância terapêutica adicional foi realizada mediante a liberação de PLP139-151-PLG ou OVA323-339 PLG para camundongos. A análise histológica mostrou que a administração das partículas PLP139-151-PLG inibe a inflamação da medula espinhal cervical e desmielinização. Os camundongos foram tratados com PLP-PLG ou OVA323-339-PLG e o tecido foi recuperado no dia 40. A medula espinhal cervical foi isolada e seccionada para investigar a resposta imune no sistema nervoso central, que está subjacente à patologia de R-EAE e esclerose múltipla. A Figura 9 mostra uma redução de infiltração de células imunes no interior da medula espinhal de animais tratados com PLP139-151-PLG e que foi mais semelhante ao tecido natural do que tecido de animais tratados com OVA323-339-PLG. Animais tratados com OVA323-339-PLG apresentaram coloração positiva para CD45, CD4, e CD11b; enquanto que, animais tratados apresentaram com PLP139-151-PLG tiveram coloração mínima para esses fatores.
[0269] A administração de partículas PLP139-151-PLG também inibe rompimento de barreira hematoencefálica (BHE) e ativação de macrófagos na medula espinhal de camundongos tratados. Osanimais foram tratados com adjuvante completo de Freund (CFA), partículas OVA323-339 PLG, ou partículas PLP139-151-PLG. Os escores clínicos e incidência percentual de EAE foram determinados (Figura 10B) e as medulas espinhais observadas via imagem in vivo (Figuras 10A e 11). Angiossenso mede vazamento vascular no SNC e prosense reportar macrófagos ativados (ativação de catepsina cliva o repórter revelando o sinal fluorescente). Os gráficos de barras geram os números numéricos para a intensidade do sinal mostrada nas varreduras cerebrais e SC.
[0270] A tolerância também pode ser induzida por partículas em que o antígeno tenha sido encapsulado. A Figura 12 mostra que a administração de partículas de PLG em que PLP139-151 foi encapsulada inibe a indução de R-EAE em camundongos. A capacidade para encapsular autoantígenos permite a utilizado de misturas complexas de proteínas ou mesmo homogenatos de órgãos para conseguir mais antígeno de cobertura e, assim, tratar de forma mais eficaz com o espalhamento de epítopos.Exemplo 8Tolerância induzida por partículas de PLGA acopladas a PLP- 139-151 é parcialmente dependente da expansão/ativação das células T reguladoras
[0271] Camundongos SJL/J foram tratados com um anticorpo anti-CD25, um marcador comum para células T reguladoras (Treg) no dia -9, e então no dia -7 foram tratadas com partículas OVA323- 339 PLG e anti-CD25 anticorpo, partículas OVA323-339 PLG e um anticorpo de IgG de controle, partículas PLP139-151-PLG e um anticorpo anti-CD25, ou partículas PLP139-151-PLG e um anticorpo de controle IgG. Como mostrado na Figura 13, os animais tratados com o partículas PLP139-151-PLG e o anticorpo anti-CD25 demonstraram, por vezes, um escore clínico médio maior do que nos animais tratados com partículas PLP139-151-PLG e um anticorpo de controle IgG. Isto confirma que as Tregs, ou pelo menos as células T que expressam CD25, desempenham um papel na iniciação de tolerância.Exemplo 9Tolerância terapêutica é induzida por partículas PLP139-151- PLG em EAE ativa e adotiva
[0272] Tolerância terapêutica induzida por partículas PLP139- 151-PLG foi comparada em EAE ativa e adotiva. EAE Adotiva foi induzida em camundongos fêmeas SJL/J de seis a oito semanas de idade por transferência adotiva de 2,5x106 blastos ativados por PLP139-151. Os camundongos foram injetados iv com PLP139-151(quadrados) ou peptídeo OVA323-339 (círculos) acoplado a 500nm de nanopartículas PLG 2 por dias (Figura 14A) ou 14 dias (Figura 14-C) após a indução da doença. Escores clínicos de doença foram comparados com aqueles após o tratamento com esplenócitos acoplados ao antígeno (Figura 14A). Cérebro e medula espinhal foram coletados de camundongos tornados tolerantes por PLP139-151- ou OVA323-339 para análise histológica no dia 42. Seções de camundongos a partir do painel A foram corados para proteína PLP e CD45 (Figura 14B). Secções da medula espinhal de camundongos a partir do painel C foram coradas com azul Luxol Fast (Figura 14D). As áreas de desmielinização e de infiltração celular são indicadas por setas. Os resultados mostram que a tolerância seja induzida por partículas PLP139-151-PLG adotiva em camundongos com EAE.
[0273] A Figura 15 mostra gráficos que ilustram os escores clínicos médios de camundongos com EAE ativa e EAE adotiva após tratamento com partículas SP ou PLG conjugadas com OVA323-339 ou PLP139-151. Os camundongos foram injetados iv com peptídeo PLP139- 151-SP, PLP139-151-PLG, ou OVA323-339-SP, ou OVA323-339-PLG acoplado a 500nm nanopartículas por 10 dias (Figura 15a) ou 2 dias (Figura 15B) após a indução da doença e o escore clínico médio foi determinado. Em ambos os casos, a administração de partículas PLP139-151-PLG reduziu a doença, indicativo de indução de tolerância.
[0274] A infiltração de células do sistema imune do sistema nervoso central também é reduzida drasticamente nos camundongos tornados tolerantes por PLP-PLG. Camundongos SJL/J foram injetados i.v. com 500nm de nanopartículas PLG juntamente com PLP139-151 (quadrados) ou OVA323-339 (círculos) 2 dias após a indução de EAE por transferência adotiva. No pico da doença (dia 14) os cérebros e medulas espinhais foram removidos e o número de linfócitos (Figura 16B), APC (Figura 16C), microglia (Figura 16D), células dendríticas periféricas (Figura 16E), células dendríticas mieloides (Figura 16F) e macrófagos (Figura 16G) foram contadas por citometria de fluxo. A estratégia de propagação para estas populações está representada na (Figura 16A). Preparações de células do SNC foram estimuladas com PMA e ionomicina durante 5 h antes da coloração intracelular para IL- 17A e IFN-Y (Figura 16H).Exemplo 10 O tratamento com um anticorpo monoclonal anti-PD-1 anula a indução de tolerância com nanopartículas PLG encapsulando PLP139- 151 em EAE de transferência adotiva
[0275] Para testar o efeito do tratamento com um anticorpo anti-DP-1 em PLP139-151 induziu tolerância em camundongos com EAE adotiva, no Dia 0, os camundongos receberam 3x106 blastos de células T ativados por PLP139-151 por via endovenosa. No Dia 2, receberam PLP139-151 ou OVA323-339 encapsulado em partículas de PLG por via endovenosa, com PBS ou um anticorpo anti-PD-1. Nos dias 4, 6, 8, 10, 12 e todos os animais receberam 250 μg anticorpo anti-PD-1 ou PBS.
[0276] Como mostrado na Figura 17, a administração do peptídeo PLP139-151 encapsulado em uma partícula PLG induz tolerância quando a partícula é administrada com PBS. No entanto, a administração do anticorpo anti-PD-1 diminui esta tolerância.Exemplo 11O tratamento com um anticorpo monoclonal anti-CD40 agonista anula a indução de tolerância com nanopartículas de PLG encapsulando PLP139-151 na transferência adotiva de EAE de uma forma dependente de IL-12
[0277] Para testar o efeito do tratamento com um anticorpo anti-CD40 agonista em tolerância induzida por PLP139-151 em camundongos com EAE adotiva, no Dia 0, os camundongos receberam 3x106 blastos de células T ativadas por PLP139-151 por via intravenosa. No dia 2, os camundongos receberam PLP139-151 ou OVA323-339 encapsulado em partículas de PLG por via intravenosa. No dia 3, os animais receberam um anticorpo de controle de IgG2a, um anticorpo anti-CD40 ou um anticorpo anti-CD40 e um anticorpo anti-IL-12.
[0278] Como mostrado na Figura 18, a administração do peptídeo PLP139-151 encapsulado em uma partícula PLG induz tolerância quando a partícula é administrada com PBS. A administração do anticorpo anti-CD40 agonista diminui a tolerância, mas esta redução da tolerância é invertida pela adição de um anticorpo anti-IL-12.Exemplo 12OVA encapsulado em partículas de PLG profilaticamente inibe a inflamação alérgica das vias respiratórias e respostas Th2 in vivo específicas para OVA
[0279] Para testar o efeito profilático de OVA encapsulado em partículas de PLG sobre a inflamação das vias aéreas, os camundongos foram tratados intravenosamente com OVA-PLG no dia - 7. No dia 0, os camundongos receberam injeções intraperitoneais de OVA/alum com uma dose de 10 μg/camundongo. No dia 7, os camundongos foram novamente tratados por via intravenosa com OVA-PLG e receberam mais 10 μg/camundongo de injeção ip de OVA/Alum no dia 14. Entre os dias 28 e 30, os camundongos foram tratados três vezes com OVA em aerossol.
[0280] Como mostrado na Figura 19, a administração profilática de OVA-PLG reduziu a secreção de IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10, e reduziram os níveis de OVA IgE no soro e eosinófilos no pulmão.
[0281] OVA encapsulada em partículas PLG profilaticamente inibe respostas de recall in vitro específicas de OVA a partir de linfonodos do mediastino. Como mostrado na Figura 20A, a proliferação observada de linfonodo após nova estimulação com 25 μg de OVA é reduzida nesses animais tratados com OVA-PLG. Além disso, o tratamento com OVA-PLG reduz a liberação de citocinas após re-estimulação com OVA. A Figura 20B mostra que os níveis de IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10 são reduzidos em camundongostratados com OVA-PLG.Exemplo 13OVA encapsulado em partículas de PLG terapeuticamente inibe a inflamação alérgica das vias respiratórias e respostas Th2 in vivo específicas para OVA
[0282] Para testar o efeito terapêutico de OVA encapsulado em partículas de PLG sobre a inflamação das vias aéreas, os camundongos foram tratados intraperitonealmente com OVA/alum com uma dose de 10 μg/camundongo no dia 0 e dia 14. Os camundongos foram administrados por via intravenosa com OVA-PLG nos dias 28, e 42. Entre dias 56-58, os camundongos foram tratados três vezes com OVA em aerossol.
[0283] Como mostrado na Figura 21, a administração terapêutica de OVA-PLG reduziu a secreção de IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10, e reduziram os níveis de OVA IgE no soro e eosinófilos no pulmão.
[0284] A Figura 22 mostra OVA encapsulada em partículas PLG que terapeuticamente regula negativamente citocinas Th2 específicas para OVA no fluido BAL melhor do que partículas PLG acopladas a OVA. Os animais foram tratados como descrito acima, exceto que nos dias 28 e 42, os camundongos foram tratados com OVA encapsulado em partículas de PLG, ou OVA acoplado a partículas de PLG. Surpreendentemente, a OVA encapsulada inibiu a secreção de citocinas Th2 mais do que o peptídeo OVA acoplado à superfície da partícula de PLG.Exemplo 14A tolerância induzida por partículas de PLG e peptídeo chromogranis A p31 inibe a diabetes tipo 1
[0285] O diabetes tipo 1 foi induzido em camundongos BDC2.5 isolando linfonodos de baço, axila, braquial, inguinal, e pancreáticas de camundongos em 3 semanas. As células isoladas foram cultivadas e ativadas in vitro por incubação de 2x106 células/mL com o peptídeo p31 0,5 uM durante 96 horas. 5x106 células foram transferidas através da administração intravenosa aos camundongos NOD.SCID (6-8 semanas) no tempo 0. Os camundongos foram tornados tolerantes através de administração intravenosa com peptídeo p31 ou MOG35-55 acoplados a um SP ou PLG 2 horas a 3 dias mais tarde.
[0286] Figuras 23A e 23B mostram os níveis de glicose no sangue nos animais após o tratamento. Administração do peptídeo p31 acoplado a PLG resultou em menores níveis de glicose no sangue, em comparação aos observados após a administração com o peptídeo MOG35-55 acoplado às partículas. A Figura 23C mostra que a percentagem de células que secretam IFNY observadas nos animais também foi reduzida nos camundongos tratados com p31-PLG em comparação com camundongos tratados com peptídeo MOG35-55-PLG.
[0287] Tolerância induzida por p31-PLG requer Tregs. Tipo 1 diabetes foi induzido em camundongos, como descrito acima, e 2 horas depois de as células ativadas terem sido transferidas para os camundongos NOD.SCID, os camundongos foram tornados tolerantes com ou partículas de p31-PLG ou MOG 35-55 PLG. Como mostrado na Figura 24, a depleção de Tregs anula a tolerância induzida pela administração de partículas de PLG-p31.Exemplo 15A tolerância induzida por partículas de PLG acopladas a insulina inibe o desenvolvimento espontâneo de diabetes do tipo 1 em camundongos NOD
[0288] Camundongos NOD foram tratados com partículas PLG acopladas a BSA (N = 22) ou insulina (N = 23) através de administração intravenosa em 6, 8, e 10 semanas de idade. Os camundongos foram, em seguida, ensaiados para o desenvolvimento de diabetes, que foi definido como a glicose no sangue > 250 mg/dL. Como mostrado na Figura 25, a administração de insulina acoplada a partículas de PLG aumentou significativamente a percentagem de camundongos que não desenvolvem diabetes mais de 300 dias (69,6% comparado com 22,7%; p = 0,0027).Exemplo 16Cinética de enxerto
[0289] Camundongos fêmea CD45.2 foram tornados tolerantes ou com OVA-PLG ou o peptídeo de controle Dby-PLG (o principal antígeno H-Y expresso por camundongos C57BL/6) no dia -7. No dia -1, os camundongos foram irradiados com 200 rads e foram então transplantados com 1x106, 5x106 ou 1x107 células de medula óssea de camundongos machos CD45.1 no dia 0. Os camundongos receptores foram então tornados tolerantes com OVA-PLG, Dby-SP, ou Dby-PLG no dia 1 e o sangue colhido para análise FACS de quimerismo. A Figura 26 mostra a percentagem de células doadoras CD45.1 observadas nos camundongos receptores.
[0290] A Figura 27 mostra a percentagem de células doadoras CD45.1 nos camundongos receptores após a indução de tolerância com OVA-PLG, Dby-SP, ou Dby-PLG no dia 1. Um camundongo de controle positivo não demonstrou enxerto significativo (~ 10%). Todos os camundongos de controle negativo não enxertaram células doadoras. Um camundongo Dby-SP não demonstrou enxerto significativo (~ 10%). Dois camundongos OVA-PLG enxertaramcélulas doadoras (~ 10%): um completamente rejeitou pela Semana 16. Um camundongo Dby-PLG começou a rejeitar na Semana 12 e estava em 10% na Semana 16. O grupo Dby-PLG variou de 10% -56% de enxerto pela Semana 16. Os camundongos OVA-PLG demonstraram: 1) enxerto espontâneo, 2) homologia de sequência entre OVA323 e Dby, ou 3) propriedades tolerogênicas de partículas. Dby-PLG permite mais enxerto do que Dby-SP e OVA-PLG.
[0291] A Figura 28 mostra que a tolerância de temporização tem um efeito sobre a percentagem de células CD45.1 no camundongo receptor. Controles positivos mostram menos enxerto (~4%) do que o esperado (~ 10%). Um camundongo de controle negativo tinha 5% enxerto Fora de todos os 3 grupos OVA-PLG, um camundongo no grupo Dia -7, Dia +1 mostrou o enxerto (12%). Tolerância no dia 1 é clinicamente mais relevante do que a tolerância no dia -7.Exemplo 17Partículas de PLGA e cumarina-6 não são detectáveis 24 horas após a administração
[0292] Os camundongos foram tratados com partículas de cumarina-6 PLGA que foram acopladas a um antígeno ou livre de antígeno. Como mostrado na Figura 29, as partículas foram detectáveis em 3 horas após a administração, mas não em 24 horas após a administração. Camundongos naive não injetados (linha superior) em comparação com iv micropartículas PLGA/PEMA fluorescente injetada em seções de baço de camundongo (coluna da esquerda), fígado (coluna do meio) e pulmão (coluna da esquerda) em 3 horas após a injeção (linha do meio) e 24 horas (linha inferior) após injeção contrastada com DAPI.Exemplo 18As nanopartículas são associadas com macrófagos in vivo
[0293] Análise do fígado 6 horas e 15 horas após a administração mostra que partículas PLGA a colocalizou com células F4/80 + no fígado (Figura 30).
[0294] Os macrófagos da zona marginal predominantemente captam partículas acopladas a PLP139-151 marcado com TAMRA 24 horas após a infusão intravenosa. Como mostrado na Figura 31, a maior percentagem de células PLP139-151+ são macrófagos da zona marginal.Exemplo 19Inibição de R-EAE em camundongos SJL/J, usando partículas poli (lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo PLP139-151 solúvel nos seus núcleos.
[0295] Grupos de camundongos SJL/J foram injetados IV com 2,5 mg 500 nm - 700 nm partículas de poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície com peptídeo PLP139-151 solúvel dentro de seus núcleos no dia -7 e dia -1 antes em relação à iniciação com PLP139- 151/CFA no dia 0. Os camundongos de controle foram condicionados no Dia 0, mas não recebeu o tratamento de partículas no dia -7 ou Dia -1. Os camundongos foram observados para sinais clínicos de R-EAE durante mais 20 dias.
[0296] Os resultados apresentados na Figura 32 mostram o escore clínico médio diário contra o número de dias da iniciação de PLP139-151/CFA. R-EAE induzida por PLP139-151/CFA é inibida em camundongos SJL/J por meio da indução de tolerância imunológica utilizando partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo PLP139-151 solúvel nos seus núcleos.Exemplo 20A inibição da inflamação alérgica das vias respiratórias por partículas poli (lactida-coglicolida) de superfície funcionalizada contendo de ovalbumina solúvel.
[0297] Inflamação alérgica das vias respiratórias (AIA) foi induzida em camundongos. Grupos de camundongos Balb/c foram injetados por via intravenosa com 2,5 mg de 500 nm - 700 nm, partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície com ovalbumina solúvel ou albumina de soro bovino solúvel (controle) nos seus núcleos no dia -7 e Dia +7 antes de iniciar com ovalbumina/alum nos dias 0 e +14. Camundongos foram desafiados nos dias + 28-30 com ovalbumina em aerossol. Os camundongos foram sacrificados e lavados broncoalveolar obtidos. Os níveis séricos de IgE específica para ovalbumina foram medidas também.
[0298] A contagem de eosinófilos no lavado bronco-alveolar indica a gravidade da AAI - maior contagem indicou pior doença. Os níveis séricos de IgE indicam a gravidade da AAI - níveis mais elevados indicam pior doença.
[0299] A Figura 33 mostra que os camundongos tratados com OVA-PLG encapsulado apresentou a maior redução no acúmulo de eosinófilos. A Figura 34 mostra que camundongos tratados com OVA-PLG encapsulado mostrou a maior redução no nível de IgE sérico em comparação com animais não tratados ou tratados com controle.
[0300] Inflamação alérgica das vias respiratórias induzida por Ovalbumina/alúmen em camundongos Balb/c foi inibida pela indução de tolerância imunológica utilizando partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo ovalbumina solúvel nos seus núcleos.Exemplo 21_Síntese de partículas poli-(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície encapsulando antígeno
[0301] O presente Exemplo detalha a formulação e caracterização parcial de partículas poli (lactida coglicolida) biodegradáveis que foram funcionalizadas na superfície com uma alta densidade de grupos carboxilato e contêm o antígeno solúvel dentro de seus núcleos que são circundados por um invólucro de poli (lactida coglicolida) para a indução de tolerância em doenças autoimunes e para o tratamento de alergias.
[0302] A elevada densidade de grupos carboxilato foi alcançada através da utilização de poli (etileno-alt-ácido anidrido maleico (PEMA)), um polímero com grupos carboxilato incorporados na sua estrutura, como o surfactante para o processo de emulsificação.
[0303] Como descrito acima, partículas poli (lactida coglicolida) biodegradáveis contendo PLP139-151 solúvel nos seus núcleos e a superfície funcionalizada com uma elevada densidade de grupos carboxilato são eficazes para a indução de tolerância imunológica em modelo murino de R-EAR de esclerose múltipla induzida por SJL/J PLP139-151/CFA. Além disso, partículas poli (lactida coglicolida) biodegradáveis contendo ovalbumina solúvel nos seus núcleos e a superfície funcionalizada com uma elevada densidade de grupos carboxilato são eficazes para a indução de tolerância imunológica em camundongos Balb/c de modelo murino AAI de asma alérgica induzida por ovalbumina/alúmen.
[0304] Partículas poli(lactida-coglicolida) contendo ovalbumina solúvel ou albumina de soro bovino, com os seus núcleos e com uma elevada densidade de grupos carboxilato funcionalizadas na superfície foram sintetizadas utilizando um método evaporação dupla de emulsão-solvente como se segue:1. 150 μL de 200 mg/mL de ovalbumina ou albumina de soro bovino em água isenta de endotoxina foi adicionada gota a gota a 2 ml de 20% p/v de poli(lactida coglicolida) em diclorometano em um frasco de cintilação de 20 mL.2. A mistura resultante foi colocada em gelo e sonicada durante 30 segundos a 10 watts usando um sonicador de sonda.3. 10 mL de 1% p/v de poli (etileno-alt-anidrido maleico) em água foi adicionada.4. A mistura resultante foi colocada em gelo e sonicada durante 30 segundos a 16 watts usando um sonicador de sonda.5. A emulsão resultante foi vertida em 200 mL de solução 0,5% p/v de poli (etileno-alt-anidrido maleico) em uma proveta de 600 mL e agitada durante a noite para permitir endurecimento de partícula.6. As partículas endurecidas foram, em seguida, purificadas por centrifugação e lavadas três vezes com tampão bicarbonato, pH 9,6.7. As partículas purificadas foram ressuspensas em 4% p/v de sacarose e 3% p/v D-manitol em água, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e liofilizadas até secura.
[0305] A Figura 35 mostra a caracterização de partículas poli(lactida coglicolida) funcionalizadas na superfície partículas contendo PLP139-151 solúvel dentro de seus núcleos por meio de análise de espalhamento de luz dinâmica. Partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 1,792 x 105 contagens por segundo em água de 18,2 MO. A população de partículas de poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinha um diâmetro médio Z de 584 nm, um diâmetro de pico de 679 nm e um índice de polidispersividade de 0,162. Estes resultados são representativos de seis lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito.
[0306] A Figura 36 mostra a caracterização de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo PLP139-151 solúvel dentro de seus núcleos por medição de potencial Z- Partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 6,6 7 x 104 contagens por segundo em 18,2 MO água. A população de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinha um pico potencial Z de - 48,9 mV e um desvio Z de 5,14 mV. Estes resultados são representativos de seis lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito.
[0307] A Figura 37 mostra a caracterização de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo ovalbumina solúvel dentro de seus núcleos por meio de análise de espalhamento de luz dinâmica. Partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 1,822 x 105 contagens por segundo em água de 18,2 MO. A população de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinham um diâmetro médio Z de 569,7 nm, um pico de diâmetro de 700,3 nm e um índice de polidispersividade de 0,230. Estes resultados são representativos de três lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito.
[0308] Figura 38 mostra Caracterização de partículas de poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo ovalbumina solúvel dentro de seus núcleos pela medição de potencial Z. Partículas de poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície foram analisadas em um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Westborough, MA) a uma taxa de contagem de 2,67 x 104 contagens por segundo em água de 18,2 MQ. A população de partículas poli(lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície tinha um pico potencial Z de - 52,2 mV e um desvio Z de 5,38 mV. Estes resultados são representativos de três lotes de sínteses, seguindo o protocolo acima escrito. Exemplo 22Lipossomas com superfície funcionalizada solúvel contendo PLP139-151 nos seus núcleos induz a tolerância imunológica no modelo murino de R-EAE de esclerose múltipla
[0309] Os presentes inventores também descobriram que os veículos de liberação de lipossomas biodegradáveis que foram funcionalizados na superfície com uma elevada densidade de grupos de carga negativa e contêm antígeno solúvel dentro dos seus núcleos induzem a tolerância imunológica no modelo murino de R-EAE de esclerose múltipla.
[0310] Os lipossomas utilizados neste estudo foram compostos dos seguintes lipídeos nas seguintes proporções molares - 30:30:40 fosfatidilcolina:fosfatidilglicerol:colesterol. Grupos de camundongos SJL/J foram injetados IV com lipossomas 200 nm funcionalizados na superfície (10 pmol de lipídeos totais por camundongo) com peptídeo PLP139-151 solúvel dentro de seus núcleos no dia -7 relativos para iniciar com PLP139-151 /CFA no dia 0. Os camundongos de controle foram iniciados no dia 0 e receberam lipossomas com superfície funcionalizada 500 nm - 700 nm (10 μmol de lipídeos total por camundongo) com peptídeo OVA323-339 solúvel nos seus núcleos no dia -7. Os camundongos foram observados quanto a sinais clínicos de R-EAE durante um período adicional de 17 dias.
[0311] Os resultados representam o escore clínico médio diário contra o número de dias da iniciação PLP139-151 /CFA. Como mostrado na Figura 39, os animais tratados com os lipossomas de superfície funcionalizada com peptídeo PLP139-151 solúvel nos seus núcleos tinha um escore clínico menor do que nos animais tratados com os lipossomas de superfície funcionalizada contendo peptídeo OVA323-339 solúvel.
[0312] Os resultados deste estudo demonstram que os lipossomas contendo PLP139-151 biodegradáveis solúveis nos seus núcleos e com elevada densidade de grupos de carga negativa na superfície funcionalizada são eficazes para a indução de tolerância imunológica em modelo murino R-EAE de esclerose múltipla induzido por SJL/J PLP139-151 /CFA.
[0313] A tolerância induzida por partículas acopladas ao antígeno ou encapsuladas é dependente da dose e específica do antígeno e de longa duração (> 150 dias). A tolerância é mais bem induzida por administração intravenosa de uma partícula acoplada que é entre 500 nm e 1 μm em diâmetro com um potencial zeta < -5- mV. A indução de tolerância é dependente da absorção das partículas pelo receptor de limpeza MARCO com superfícies polianiônicos (por exemplo, partículas PS/PLG carboxiladas). A tolerância é induzida e mantida por uma combinação de anergia (parcialmente invertida por anticorpos anti-CD40 e anti-PD-1 agonistas) e iTregs (parcialmente invertidas por anticorpos anti-CD25). As partículas da invenção se acumulampredominantemente nos macrófagos da zona marginal do fígado e baço (CD11bhi CD11clo MARCO+ Sign-R1+ Siglec-1-).
[0314] Existem numerosas vantagens da utilização de partículas acopladas com antígeno para o tratamento de doenças autoimunes, em comparação com células dendríticas imaturas tolerogênicas dirigidas para o antígeno ou pulsadas pelo antígeno ou Tregs específicas de antígenos modificadas. A rapidez e simplicidade de preparação tolerogênica e indução usando um fabricável com GMP, transportador tolergênico universal fora da prateleira; não há necessidade de isolar e expandir células dendríticas imaturas ou Tregs ex vivo; não há necessidade de se preocupar com as células dendríticas imaturas sendo ativadas mediante manipulação ex vivo e tornando-se estimulatórias em vez de tolerogênicas ou de Tregs convertendo a Th1/17 após a transferência; uma vez que aquelas APCs imaturas da zona marginal processam e representam o antígeno de forma tolerogênica, APCs hospedeiras podem selecionar os auto epítopos imunodominantes relevantes de partículas PLG encapsulando autoantígenos intactos ou extratos de tecidos (por exemplo, partículas PLG encapsulada por OVA evitam AAD induzida por Alum OVA/); e o protocolo é com nenhuma supressão de espectador específico para o antígeno, é segura, altamente eficiente, e pode induzir a falta de responsividade em células T efetoras (Th1, Th2, Th17, e CD8) e células T naive envolvidas com espalhamento de epítopos.
[0315] Partículas e lipossomas sintéticos biodegradáveis pode levar a facilidade de fabricação, uma ampla disponibilidade de agentes terapêuticos, e aumentar o número de sítios potenciais de tratamento. Para este fim, especificamente concebemos partículas poli (lactida coglicolida) funcionalizadas na superfície biodegradável com uma elevada densidade de grupos carboxilato na superfície, utilizando o surfactante poli (etileno-alt-anidrido maleico).
[0316] Também foram desenvolvidos lipossomas com superfície funcionalizada utilizando uma proporção 30:30:40 de fosfatidilcolina:fosfatidilglicerol:colesterol.
[0317] Nós projetamos ainda mais essas partículas para conter ovalbumina solúvel dentro de seus núcleos a fim de contornar problemas de contaminação e de pureza químicas circundantes à conjugação de superfície de peptídeo ou proteína. Estas partículas de poli (lactida-coglicolida) funcionalizadas na superfície contendo ovalbumina solúvel nos seus núcleos são eficazes para a prevenção do desenvolvimento da doença e, consequentemente, a indução de tolerância imunológica no modelo murino de asma alérgica AAI induzida por ovalbumina/alúmen em Balb/c. Peptídeo ou proteína conjugada com partículas poli (lactida coglicolida) funcionalizadas com carboxilato usando EDC estão ligados de forma indiscriminada, resultando em agregados de antígenos e os agregados de partículas-antígeno-partícula que são difíceis de caracterizar e purificar em populações homogêneas.
[0318] Nós produzimos uma população homogênea de partículas poli (lactida-co glicolida) superfície funcionalizada contendo de ovalbumina solúvel nos seus núcleos que não requerem a conjugação de superfície do antígeno.
[0319] Ainda demonstramos que os lipossomas biodegradáveis contendo PLP139-151 solúvel nos seus núcleos e com elevada densidade de grupos de carga negativa na superfície funcionalizada são eficazes para a indução de tolerância imunológica em modelo murino de R-EAE de esclerose múltipla induzido em SJL/J PLP139-151/CFA.
[0320] A lipossomas e partículas poli (lactida coglicolida) da presente invenção oferecem numerosas vantagens. As vantagens incluem:1) Partículas biodegradáveis não persistirão durante longos períodos no corpo, e o tempo para completa degradação podem ser controlados. 2) Partículas e lipossomas pode ser funcionalizadas de modo a facilitar a internalização sem a ativação das células. Com esse objetivo, carregamos fosfatidilserina em microgrânulos de PLG.3) Partículas e os lipossomas podem também ser concebidos para incorporar ligantes dirigidos para uma população de células específica.4) Citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e TGF-β, também podem ser incluídas para limitar a ativação do tipo de célula que está internalizando as partículas e para facilitar a indução de tolerância via anergia e/ou exclusão e a ativação de células T reguladoras.
[0321] Esta função combinatória da partícula ou lipossomas pode direcionar a indução de tolerância a partir de várias perspectivas, assim partículas projetadas são um avanço significativo em relação às partículas de poliestireno. Aplicações clínicas potenciais desta tecnologia induzindo tolerância incluem:(1) doenças autoimunes mediadas por célula T e anticorpos (como a esclerose múltipla, diabetes tipo 1, artrite reumatoide, lúpus sistêmico, etc.) - tolerância seria induzida com partículas complexadas com os autoantígenos relevantes direcionando a doença autoimune particular,(2) produtos alimentares e alergias pulmonares, alergias de pele e asma - tolerância seria induzida com partículas complexadas com os alimentos específicos (por exemplo, proteínas do amendoim, etc.), injetadas (proteínas do veneno de abelhas, etc.), ou substâncias inaladas (por exemplo, proteínas pólen de ervas, proteínas da caspa de animal de estimação, etc.) que provocam a reação alérgica (3) rejeição de transplantes - seria induzida tolerância aos antígenos de transplante sobre órgãos doadores ou células antes do transplante de órgãos para evitar a rejeição por parte do receptor(4) a terapia de reposição enzimática - tolerância seria induzida para enzimas cujos pacientes com deficiências genéticas não conseguem produzir, para impedi-los de produzir respostas de anticorpos neutralizantes para enzimas produzidas recombinantemente administradas para tratar a sua deficiência particular.
[0322] Embora modalidades específicas da invenção tenham sido descritas e ilustradas, tais modalidades devem ser consideradas ilustrativas da presente invenção apenas e não como limitantes da invenção, como interpretado de acordo com as reivindicações anexas.
[0323] Todas as patentes, pedidos e outras referências aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade.

Claims (14)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula transportadora de poliestireno carboxilada ou uma partícula transportadora de poli(ácido lático-co-glicólico) tendo um potencial zeta negativo e compreendendo um antígeno encapsulado, em que o potencial zeta da partícula é de -100 mV a 0 mV.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o potencial zeta da partícula é de -100 mV a -30 mV, opcionalmente de -50 mV a -40 mV.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula é uma partícula de poli(ácido láctico-co-glicólico) carboxilada.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula tem um diâmetro entre 0,1 μm a 10 μm, entre 0,3 μm a 5 μm, entre 0,5 μm a 3 μm, entre 0,5 μm a 1 μm ou 0,5 μm.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno compreende um antígeno autoimune, um antígeno expresso em um tecido a ser transplantado para um sujeito ou um alérgeno.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno compreende pelo menos uma porção de uma proteína selecionada do grupo consistindo em: proteína básica de mielina, receptor de acetilcolina, antígeno endógeno, glicoproteína de oligodendrócito de mielina, antígeno de beta-célula pancreática, insulina, ácido glutâmico decarboxilase (GAD), colágeno tipo 11, cartilagem humana gp39, fp130-RAPS, proteína de proteolipídeo, fibrilarina, proteína nucleolar pequena, receptor do fator estimulante de tireoide, histonas, glicoproteína gp70, piruvato desidrogenase diidrolipoamida acetiltransferase (PCD-E2), antígeno de folículo piloso, A-gliadina e isoforma de tropomiosina humana 5, pólen de grama Bahia (BaGP), alérgeno de pêssego Pru p 3, alérgeno de Leite de Caseína alfa s 1, alérgeno do aipo Api g 1, alérgeno da castanha-do-pará Bere1, alérgeno do Leite B-Lactoglobulina, albumina do soro Bovino, alérgeno de Avelã Cor a 1.04 ou alérgeno de Ovo Ovalbumina.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende proteína básica de mielina, receptor de acetilcolina, antígeno endógeno, glicoproteína de oligodendrócito de mielina, antígeno de beta-célula pancreática, insulina, ácido glutâmico decarboxilase (GAD), colágeno tipo 11, cartilagem humana gp39, fp130-RAPS, proteína de proteolipídeo, fibrilarina, proteína nucleolar pequena, receptor do fator estimulante de tireoide, histonas, glicoproteína gp70, piruvato desidrogenase diidrolipoamida acetiltransferase (PCD-E2), antígeno de folículo piloso, A-gliadina e isoforma de tropomiosina humana 5, pólen de grama Bahia (BaGP), alérgeno de pêssego Pru p 3, alérgeno de Leite de Caseína alfa s 1, alérgeno do aipo Apig1 , alérgeno da castanha-do- pará Bere1, alérgeno do Leite B-Lactoglobulina, albumina do soro Bovino, alérgeno de Avelã Cor a 1.04 ou alérgeno de Ovo Ovalbumina.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida partícula é biodegradável.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida partícula é funcionalizada na superfície.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida partícula é funcionalizada na superfície com carboxilato.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável.
12. Uso de um antígeno acoplado a uma partícula transportadora com um potencial zeta negativo caracterizado por ser na preparação de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para indução de tolerância específica de antígeno em um sujeito, através da administração da composição ao sujeito, em que dito sujeito tem uma doença ou condição selecionada do grupo que consiste de uma doença autoimune, doença inflamatória, uma alergia, rejeição a transplante, e uma resposta hiperimune.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que dita doença ou condição é selecionada a partir do grupo que consiste de esclerose múltipla, diabetes tipo 1, asma, alergia alimentar, alergia ambiental, doença celíaca, e uma condição causada por dito antígeno em dito sujeito para reduzir a hiperreação ao dito antígeno.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que dita composição é administrada intravenosamente.
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ZA (1) ZA201409305B (pt)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX358598B (es) 2010-11-12 2018-08-27 Cour Pharmaceuticals Dev Company Partículas inmuno-moduladoras modificadas.
WO2013163176A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Allertein Therapeutics, Llc Nanoparticles for treatment of allergy
CA2876495C (en) 2012-06-21 2023-10-17 Northwestern University Peptide conjugated particles
CA2932532C (en) 2012-12-04 2021-06-22 Phosphorex, Inc. Microparticles and nanoparticles having negative surface charges
KR20210057832A (ko) 2013-03-13 2021-05-21 코어 파마슈티칼스 디벨롭먼트 컴퍼니 인크. 염증 치료용 면역-변형된 입자
CN105188741A (zh) 2013-04-03 2015-12-23 阿勒丁医疗公司 新型纳米颗粒组合物
FI3033102T4 (fi) 2013-08-13 2024-03-01 Univ Northwestern Peptidikonjugoituja hiukkasia
EP3393514A4 (en) * 2015-12-23 2019-08-14 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. PARTICLES CONJUGATED BY COVALENCE OF THE POLYMER-ANTIGEN TYPE
US20190365656A1 (en) * 2016-01-04 2019-12-05 Cour Pharmaceuticals Development Company, Inc. Particles encapsulating fusion proteins containing linked epitopes
GB2550586A (en) 2016-05-23 2017-11-29 A-Fax Ltd Racking protection device
US20210115378A1 (en) * 2018-05-09 2021-04-22 Yale University Compositions and systems for ex vivo cell modulation and methods of use thereof
WO2019217780A1 (en) * 2018-05-11 2019-11-14 Phosphorex, Inc. Microparticles and nanoparticles having negative surface charges
WO2021231898A2 (en) * 2020-05-14 2021-11-18 Op-T Llc Nanoparticle compositions and uses thereof
WO2023070104A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Treatment of primary biliary cholangitis (pbc) with tolerizing nanoparticles
WO2024026452A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell epitopes associated with type 1 diabetes

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4565696A (en) * 1983-08-03 1986-01-21 The Regents Of The University Of California Production of immunogens by antigen conjugation to liposomes
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
HU220357B (hu) 1992-02-28 2001-12-28 Autoimmune Inc. Eljárás és készítmények autoimmun betegségek kezelésére bystander antigén alkalmazásával
US6004763A (en) 1992-09-11 1999-12-21 Institut Pasteur Antigen-carrying microparticles and their use in the induction of humoral or cellular responses
FR2695563B1 (fr) 1992-09-11 1994-12-02 Pasteur Institut Microparticules portant des antigènes et leur utilisation pour l'induction de réponses humorales ou cellulaires.
JPH06157592A (ja) 1992-11-24 1994-06-03 Hitachi Chem Co Ltd ペプチドもしくはその誘導体、それらとタンパク質との結合体、及びこれらを免疫源とする抗エンドセリン−１抗体の製造方法
AU674584B2 (en) 1993-06-02 1997-01-02 Tvw Telethon Institute For Child Health Research Cryptic peptides for use in inducing immunologic tolerance
US5804201A (en) 1996-03-11 1998-09-08 The Rockefeller University Immunomodulatory peptides of vespid antigen 5
JP4085341B2 (ja) 1997-03-31 2008-05-14 ザ、リージエンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、ミシガン 開いたポアの生分解性マトリックス
US7427602B1 (en) 1998-05-13 2008-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Sustained DNA delivery from structural matrices
DE69937580D1 (de) 1999-08-18 2007-12-27 Ind Academic Coop Agent zur induktion einer immunologischen toleranz
CA2410510A1 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
WO2002016414A2 (en) 2000-08-22 2002-02-28 Micromet Ag Composition for the elimination of autoreactive b-cells
US6890556B1 (en) 2001-02-14 2005-05-10 Northwestern University Controlled surface-associated delivery of genes and oligonucleotides
US7029697B2 (en) 2001-02-14 2006-04-18 Northwestern University Controlled surface-associated delivery of genes and oligonucleotides
NZ532274A (en) * 2001-10-03 2006-02-24 Chiron Corp Adjuvanted meningococcus compositions
AU2002364701B8 (en) 2001-11-20 2006-06-22 Alkermes, Inc. Compositions for sustained action product delivery
AU2003216851B2 (en) 2002-03-19 2008-04-17 Powderject Research Limited Imidazoquinoline adjuvants for vaccines
JP2005535581A (ja) 2002-05-02 2005-11-24 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 肺感染の拡大を制限する処方物
EP1551449B1 (en) 2002-07-12 2010-10-06 The Johns Hopkins University Reagents and methods for engaging unique clonotypic lymphocyte receptors
US7465463B2 (en) 2002-09-04 2008-12-16 Polyheal, Ltd. Compositions comprising microspheres with anti-inflammatory properties for healing of ocular tissues
WO2004053056A2 (en) 2002-09-24 2004-06-24 University Of Kentucky Research Foundation Nanoparticle-based vaccine delivery system containing adjuvant
WO2005000272A1 (en) 2003-06-04 2005-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Long-circulating liposomal compositions
WO2005015160A2 (en) 2003-08-07 2005-02-17 The Children's Hospital Of Philadelphia Functionalized polymeric colloids
US8198020B2 (en) 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
WO2005020933A2 (en) 2003-09-02 2005-03-10 University Of South Florida Nanoparticles for drug-delivery
WO2005046722A2 (en) 2003-11-05 2005-05-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Carbohydrate antigen-nanoparticle conjugates and uses thereof as antimetastatic agents in treating cancer
ES2246695B1 (es) 2004-04-29 2007-05-01 Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. Composicion estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende nanoparticulas a base de un copolimero de metil vinil eter y anhidrido maleico.
US7846466B2 (en) 2004-06-10 2010-12-07 Northwestern University Biodegradable scaffolds and uses thereof
US7534448B2 (en) 2004-07-01 2009-05-19 Yale University Methods of treatment with drug loaded polymeric materials
JP2006248978A (ja) * 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
MX2007016039A (es) 2005-06-17 2008-10-27 Univ North Carolina Metodos, sistemas y materiales de fabricacion de nanoparticulas.
CN101213226A (zh) 2005-07-01 2008-07-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 羧基化胶乳粒子
WO2007008755A2 (en) 2005-07-08 2007-01-18 The Board Of Regents, The University Of Texas System Surface functionalization of polymeric materials
GB0514262D0 (en) 2005-07-12 2005-08-17 Renovo Ltd Promotion of epithelial regeneration
US20070041934A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
US20100028450A1 (en) 2006-01-25 2010-02-04 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi S Tolerogenic biodegradable artificial antigen presenting system
EP1991259B1 (en) 2006-02-15 2012-10-10 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Viral display vehicles for treating multiple sclerosis
AU2007221154A1 (en) * 2006-02-24 2007-09-07 Novartis Ag Microparticles containing biodegradable polymer and cationic polysaccharide for use in immunogenic compositions
US20090325931A1 (en) 2006-07-28 2009-12-31 University Court Of The University Of Edinburgh Use of cdk inhibitors for the treatment of granulocyte mediated disorders
EP3590503A1 (en) 2006-10-12 2020-01-08 The University of Queensland Compositions and methods for modulating immune responses
US20090214474A1 (en) 2006-11-01 2009-08-27 Barbara Brooke Jennings Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
US8501159B2 (en) 2006-12-18 2013-08-06 Colorobbia Italia S.P.A. Magnetic nanoparticles for the application in hyperthermia, preparation thereof and use in constructs having a pharmacological application
CN101678090B (zh) 2007-03-07 2012-04-11 乌第有限合伙公司 用于预防和治疗自身免疫病的组合物和方法
US20080311140A1 (en) 2007-05-29 2008-12-18 Baylor College Of Medicine Antigen specific immunosuppression by dendritic cell therapy
KR20100083150A (ko) * 2007-09-18 2010-07-21 리고사이트 파머슈티컬즈 인코퍼레이티드 노로바이러스에 대한 보호면역반응을 제공하는 방법
EP2620157A3 (en) * 2007-10-12 2013-10-16 Massachusetts Institute of Technology Vaccine nanotechnology
WO2009049365A1 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Cooperative Research Centre For Asthma A method of prophylaxis and agents for use therein
WO2009052561A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Compositions and methods for manipulating an immune response
EP2057998A1 (en) 2007-10-31 2009-05-13 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Use of modified cells for the treatment of multiple sclerosis
US20090123509A1 (en) 2007-11-08 2009-05-14 Cory Berkland Biodegradable Colloidal Gels as Moldable Tissue Engineering Scaffolds
US20090238879A1 (en) 2008-01-24 2009-09-24 Northwestern University Delivery scaffolds and related methods of use
US9669057B2 (en) 2008-04-25 2017-06-06 Duke University Regulatory B cells and their uses
US20110206773A1 (en) 2008-05-20 2011-08-25 Yale University Sustained delivery of drugs from biodegradable polymeric microparticles
EP2123261A1 (en) 2008-05-20 2009-11-25 Stallergenes S.A. Mucoadhesive particulate formulation for inducing antigen-specific immune tolerance
US8323696B2 (en) 2008-08-29 2012-12-04 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Nanoparticles for immunotherapy
CA2738855A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 The Corporation Of Mercer University Nanospheres encapsulating bioactive material and method for formulation of nanospheres
EP2352568B1 (en) 2008-10-02 2017-11-29 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Administration of an adsorbent polymer for treatment of systemic inflammation
EP2367561B1 (en) 2008-11-30 2015-05-20 Immusant, Inc. Compositions and methods for treatment of celiac disease
AU2009326818A1 (en) 2008-12-11 2011-07-07 The Govenors Of The University Of Alberta Methods and systems for inducing immunologic tolerance to non-self antigens
CN102325546A (zh) * 2009-01-20 2012-01-18 西北大学 用于诱导抗原-特异性耐受的组合物和方法
EP2255831A1 (en) 2009-05-25 2010-12-01 Institut Pasteur Liposome based diepitope constructs
CN102481376B (zh) 2009-05-27 2016-12-21 西莱克塔生物科技公司 免疫调节剂-聚合物化合物
WO2011031441A1 (en) 2009-08-28 2011-03-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Therapy with a chimeric molecule and a pro-apoptotic agent
US20110135744A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 The Regents Of The University Of California Nanoparticle Based Therapy for Dispersing Mucin
EP2538969A4 (en) 2010-02-22 2013-11-27 Liquidia Technologies Inc VACCINES FROM POLYSACCHARIDE PARTICLES
US8207290B2 (en) 2010-03-26 2012-06-26 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for generating nanoparticles
WO2011133617A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nano-hybrid delivery system for sequential utilization of passive and active targeting
CN102933625B (zh) 2010-06-04 2014-07-02 同济大学 芘和吡咯的共聚物以及制备该共聚物的方法
WO2011153532A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Flow Pharma Inc. Peptide particle formulation
CA2805024A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of multiples sclerosis, rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders
CA2807141C (en) 2010-07-31 2019-02-26 The Scripps Research Institute Compositions and methods for inducing immune tolerance
EP2600878A4 (en) 2010-08-04 2014-06-11 Univ Duke REGULATORY B-CELLS AND ITS USES
MX358598B (es) 2010-11-12 2018-08-27 Cour Pharmaceuticals Dev Company Partículas inmuno-moduladoras modificadas.
EP2643396B1 (en) * 2010-11-24 2019-03-13 Nanyang Technological University Method for coating particles with calcium phosphate and particles, microparticles and nanoparticles formed thereof
US10064406B2 (en) 2011-01-06 2018-09-04 Cytosorbents Corporation Polymeric sorbent for removal of impurities from whole blood and blood products
WO2012101638A2 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Nanoparticles for cosmetic applications
US9289477B2 (en) 2011-04-29 2016-03-22 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers to reduce cytotoxic T lymphocyte responses
WO2013019658A2 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers comprising polymers comprising multiple immunomodulatory agents
WO2013036293A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Selecta Biosciences, Inc. Dendritic cell subsets for generating induced tolerogenic dendritic cells and related compositions and methods
US20130202659A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Cerulean Pharma Inc. Polymer-agent conjugates, particles, compositions, and related methods of use
CA2876495C (en) 2012-06-21 2023-10-17 Northwestern University Peptide conjugated particles
KR20210057832A (ko) 2013-03-13 2021-05-21 코어 파마슈티칼스 디벨롭먼트 컴퍼니 인크. 염증 치료용 면역-변형된 입자
FI3033102T4 (fi) 2013-08-13 2024-03-01 Univ Northwestern Peptidikonjugoituja hiukkasia

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