MX2013012591A - Nanoportadores sintéticos tolerogénicos. - Google Patents

Nanoportadores sintéticos tolerogénicos.

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MX2013012591A
MX2013012591A MX2013012591A MX2013012591A MX2013012591A MX 2013012591 A MX2013012591 A MX 2013012591A MX 2013012591 A MX2013012591 A MX 2013012591A MX 2013012591 A MX2013012591 A MX 2013012591A MX 2013012591 A MX2013012591 A MX 2013012591A
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MX
Mexico
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antigen
synthetic nanocarriers
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composition according
apc
Prior art date
Application number
MX2013012591A
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Grayson B Lipford
Christopher Fraser
Roberto A Maldonado
Christopher J Roy
Original Assignee
Selecta Biosciences Inc
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Abstract

Esta invención se refiere, al menos en parte, a composiciones que comprenden nanoportadores sintéticos e inmunosupresores que ejercen efectos supresores inmunitarios; tales composiciones pueden comprender además antígeno y proporcionar respuestas inmunitarias tolerogénicas.

Description

NANOPORTADORES SINTÉTICOS TOLEROGÉNICOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio conforme con lo dispuesto en §119 de 35 U.S.C. de la solicitud provisional de los Estados Unidos 61/480,946, presentada el 29 de abril de 2011 , 61/513,514, presentada el 29 de julio de 2011, 61/531 ,147, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531,153, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531 ,164, presentada el 6 de septiembre de 2011, 61/531 ,168, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531 ,175, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531 ,180, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531 ,194, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531 ,204, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531 ,209, presentada el 6 de septiembre de 2011 , 61/531 ,215, presentada el 6 de septiembre de 2011 , el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere, al menos en parte, a composiciones que comprenden nanoportadores sintéticos e inmunosupresores que pueden proporcionar supresión inmunitaria específica para un antígeno, preferentemente, respuestas inmunitarias tolerogénicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las estrategias convencionales para generar inmunosupresión asociadas con una respuesta inmunitaria no deseada se basan en fármacos inmunosupresores de amplio espectro. Además, para mantener la inmunosupresión, la terapia con fármacos inmunosupresores es generalmente una propuesta de por vida. Desafortunadamente, el uso de inmunosupresores de amplio espectro está asociado con el riesgo de padecer efectos secundarios graves, tales como tumores, infecciones, nefrotoxicidad y trastornos metabólicos. Por consiguiente, disponer de nuevas terapias inmunosupresoras sería beneficioso.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, se proporciona una composición que comprende (i) una primera población de nanoportadores sintéticos acoplados a un inmunosupresor y (ii) un antígeno presentable por APC. En una realización, el inmunosupresor está en la composición en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica al antígeno presentable por APC. En una realización, el antígeno presentable por APC se acopla a nanoportadores sintéticos de la primera población de nanoportadores sintéticos. En otra realización, el antígeno presentable por APC se acopla a nanoportadores sintéticos de una segunda población de nanoportadores sintéticos.
En una realización, la primera población y la segunda población son la misma población.
En una realización, la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población es un diámetro superior a 100 nm. En otra realización, el diámetro es superior a 150 nm. En otra realización, el diámetro es superior a 200 nm. En otra realización, el diámetro es superior a 250 nm. En otra realización, el diámetro es superior a 300 nm.
En una realización, el inmunosupresor comprende una estatina, un inhibidor de mTOR, un agente señalizador de TGF-ß, un corticosteroide, un inhibidor de la función mitocondrial, un inhibidor de P38, un inhibidor de NF-?ß, un agonista de los receptores de adenosina, un agonista de la prostaglandina E2, un inhibidor de la fosfodiesterasa 4, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de proteasomas. En otra realización, el inhibidor de mTOR es la rapamicina o un análogo de esta.
En una realización, el antígeno presentable por APC comprende un epítopo restringido por MHC de clase I y/o MHC de clase II y/o de linfocitos B. En otra realización, el antígeno presentable por APC es una proteína. En otra realización, el antígeno presentable por APC es un polipéptido o péptido que comprende un epítopo restringido por MHC de clase I y/o MHC de clase II y/o de linfocitos B. En otra realización, el antígeno presentable por APC es un lípido que se une a CD1d. En una realización, el antígeno presentable por APC es una proteína terapéutica o porción de esta, un autoantígeno o un alérgeno o está asociado con una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia, el rechazo de un órgano o tejido, o la enfermedad del injerto contra el huésped.
En una realización, la carga del inmunosupresor y/o antígeno presentable por APC como promedio entre la población de primeros y/o segundos nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.0001% y un 50% (peso/peso). En otra realización, la carga del inmunosupresor y/o antígeno presentable por APC como promedio entre la población de primeros y/o segundos nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.1% y un 10% (peso/peso).
En una realización, los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos comprenden nanopartículas lipídicas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsiones a base de surfactantes, dendrímeros, futbolenos, nanohilos, partículas pseudovíricas, o partículas peptídicas o proteicas.
En una realización, cuando los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos comprenden nanopartículas poliméricas, las nanopartículas poliméricas comprenden un polímero que es un polímero Pluronic no terminado en metoxi. En otra realización, las nanopartículas poliméricas comprenden un poliéster, un poliéster acoplado a un poliéter, poliaminoácido, policarbonato, poliacetal, policetal, polisacárido, polietiloxazolina o polietilenimina. En otra realización, el poliéster comprende un poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o policaprolactona. En otra realización, las nanopartículas poliméricas comprenden un poliéster y un poliéster acoplado a un poliéter. En otra realización, el poliéter comprende polietilenglicol o polipropilenglicol.
En otra realización, la relación entre las dimensiones de los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos es superior a 1 :1 , 1 :1.2, 1 :1.5, 1 :2, 1 :3, 1 :5, 1 :7 o 1 :10.
En otra realización, la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, se proporciona una forma farmacéutica que comprende cualquiera de las composiciones proporcionadas.
En otro aspecto, se proporciona un método que comprende administrar cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas en la presente a un sujeto. En una realización, el sujeto necesita tolerancia específica para un antígeno. En otra realización, el sujeto padece una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia, la enfermedad del injerto contra el huésped, el rechazo de un órgano o tejido, o ha sido sometido o se someterá a un trasplante. En otra realización, el sujeto ha recibido, está recibiendo o recibirá una proteína terapéutica contra la cual ha experimentado, está experimentando o cabe esperar que experimente una respuesta inmunitaria no deseada.
En otra realización, cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas puede estar o se puede administrar en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria tolerogénica específica para el antígeno presentable por APC. En otra realización, la forma farmacéutica se administra al sujeto de acuerdo con un protocolo que se ha demostrado previamente que produce una respuesta inmunitaria tolerogénica específica para el antígeno presentable por APC en uno o más sujetos objeto de estudio.
En otra realización de cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas, la composición puede generar una respuesta inmunitaria deseada o reducir una respuesta inmunitaria no deseada, por ejemplo, en un sujeto.
En una realización, el método comprende además proporcionar o identificar el sujeto. En otra realización, el método comprende además evaluar la generación de la respuesta inmunitaria tolerogénica específica para el antígeno presentable por APC en el sujeto.
En una realización, la forma farmacéutica se administra por administración intravenosa, trasmucosal, intraperitoneal, oral, subcutánea, pulmonar, intranasal, intradérmica o intramuscular. En otra realización, la administración se trata de una administración por inhalación, intravenosa, subcutánea o transmucosal.
En otro aspecto, cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas se puede emplear en terapia o profilaxis.
En otro aspecto, cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas se puede emplear en terapia o profilaxis en un sujeto que ha sido sometido o se someterá a un trasplante, o que ha recibido, está recibiendo o recibirá una proteína terapéutica contra la cual ha experimentado, está experimentando o cabe esperar que experimente una respuesta inmunitaria no deseada.
En otro aspecto, cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas se puede emplear en cualquiera de los métodos proporcionados.
En otro aspecto, cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas se puede emplear en un método para inducir una respuesta inmunitaria tolerogénica.
En otro aspecto, cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas se puede emplear en un método de profilaxis o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia, el rechazo de un órgano o tejido, la enfermedad del injerto contra el huésped o una respuesta inmunitaria no deseada.
En otro aspecto, cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas se puede emplear en un método de terapia o profilaxis que comprende la administración por cualquiera de las vías proporcionadas en la presente.
En otro aspecto, se proporciona el uso de cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas proporcionadas para la elaboración de un medicamento para su uso en cualquiera de los métodos proporcionados.
En una realización de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en la presente, los antígenos son péptidos. En algunas realizaciones, tales antígenos comprenden al menos un epítopo como los descritos en cualquier sección de la presente pero también comprenden aminoácidos adicionales que flanquean uno o ambos extremos del epítopo. En las realizaciones, los antígenos comprenden una proteína antigénica entera. Estos antígenos se pueden acoplar a nanoportadores sintéticos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 proporciona un ejemplo representativo de un análisis por citometría de flujo de linfocitos Treg.
La Fig. 2 demuestra la inducción específica para el antígeno de FoxP3+ en linfocitos Treg CD4+CD25alto por parte de tDC tratadas con rapamicina encapsulada en nanoportadores junto con péptido(323-339) de ovoalbúmina libre.
La Fig. 3 muestra la inducción específica para el antígeno de FoxP3+ en linfocitos Tref CD4+CD25alto.
La Fig. 4 muestra un efecto sobre el número de linfocitos T efectores específicos para el antígeno y el porcentaje de células FoxP3+ con nanoportadores sintéticos de la invención que comprenden un inmunosupresor (rapamicina o simvastatina).
La Fig. 5 muestra una reducción en el número de células de los ganglios linfáticos poplíteos con nanoportadores sintéticos de la invención que comprenden un inmunosupresor (rapamicina o simvastatina).
La Fig. 6 demuestra una reducción en CD69, un marcador de la activación de los linfocitos T, con el suministro mediante nanoportadores sintéticos del inmunosupresor rapamicina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención detalladamente, se debe sobreentender que esta invención no está limitada a los materiales o parámetros de proceso particularmente ejemplificados, ya que, por supuesto, estos pueden variar. También se debe sobreentender que la terminología utilizada en la presente tiene como fin únicamente describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que limite el uso de terminología alternativa para describir la presente invención.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente, ya sea previa o posteriormente, se incorporan a la presente por referencia en su totalidad a todos los efectos.
Las formas en singular "un/una" y "el/la", tal como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye una mezcla de dos o más de tales moléculas o una mezcla de pesos moleculares diferentes de una única especie polimérica, la referencia a "un nanoportador sintético" incluye una mezcla de dos o más de tales nanoportadores sintéticos o una pluralidad de tales nanoportadores sintéticos, la referencia a "una molécula de ADN" incluye una mezcla de dos o más de tales moléculas de ADN o una pluralidad de tales moléculas de ADN, la referencia a "un inmunosupresor" incluye una mezcla de dos o más de tales materiales o una pluralidad de moléculas inmunosupresoras, y similares.
Se debe interpretar que el término "comprenden" o variaciones de este tales como "comprende" o "que comprende", tal como se utilizan en la presente, indican la inclusión de cualquier entidad mencionada (p. ej., un aspecto, elemento, característica, propiedad, limitación o paso del proceso/método) o grupo de entidades (p. ej., aspectos, elementos, características, propiedades, limitaciones o pasos del proceso/método), pero no la exclusión de ninguna otra entidad o grupo de entidades. De este modo, la expresión "que comprende", tal como se utiliza en la presente, es inclusiva y no excluye entidades ni pasos del proceso/método adicionales que no se hayan mencionado.
En las realizaciones de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en la presente, la expresión "que comprende" se puede reemplazar por "constituido esencialmente por" o "constituido por". La expresión "constituido esencialmente por" se emplea en la presente para requerir la(s) entidad(es) o pasos especificados, así como también aquellos que no afectan materialmente al carácter o la función de la invención reivindicada. La expresión "constituido", tal como se utiliza en la presente, se emplea para indicar la presencia únicamente de la entidad mencionada (p. ej., un aspecto, elemento, característica, propiedad, limitación o paso del proceso/método) o grupo de entidades (p. ej., aspectos, elementos, características, propiedades, limitaciones o pasos del proceso/método).
A. Introducción Tal como se ha mencionado previamente, los inmunosupresores convencionales actuales son de amplio espectro y generalmente producen una reducción sistémica global del sistema inmunitario. Las composiciones y métodos proporcionados en la presente ofrecen efectos inmunitarios más localizados al permitir, por ejemplo, la liberación localizada en células inmunitarias de interés. Por lo tanto, las composiciones y métodos pueden conseguir supresión inmunitaria de una forma más localizada. Tal como se muestra en los Ejemplos, las composiciones de la invención se utilizaron con éxito para inducir la generación de células reguladoras y para reducir la activación de los linfocitos T tal como demuestra la reducción de CD69.
Los inventores han descubierto inesperada y sorprendentemente que los problemas y las limitaciones que se han indicado anteriormente se pueden resolver llevando a la práctica la invención que se describe en la presente. En particular, los inventores han descubierto inesperadamente que es posible proporcionar composiciones y métodos relacionados que proporcionan inmunosupresión y, en algunas realizaciones, efectos tolerogénicos específicos para un antígeno. Las composiciones descritas en la presente son composiciones que comprenden 1) una población de nanoportadores sintéticos a los cuales se acopla un inmunosupresor y 2) un antígeno presentable por células presentadoras de antígeno (APC). La captación eficiente de tales composiciones por parte de las APC es una forma conveniente de modificar in vivo o in vitro la respuesta inmunitaria en favor de efectos inmunosupresores (p. ej., efectos tolerogénicos), tales como el desarrollo de linfocitos T reguladores (Treg) específicos para el antígeno presentable por APC.
En una realización, el antígeno presentable por APC está acoplado a los mismos nanoportadores sintéticos a los que está acoplado el inmunosupresor. En otra realización, el antígeno presentable por APC está acoplado a nanoportadores sintéticos diferentes. En otra realización más, el antígeno presentable por APC no está acoplado a un nanoportador sintético. En otra realización, el inmunosupresor está en la composición en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica al antígeno presentable por APC.
En otra realización más, la carga del inmunosupresor como promedio entre la población de los nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.0001% y un 50% (peso/peso). En otra realización, la carga del antígeno presentable por APC como promedio entre una población de los nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.0001% y un 50% (peso/peso). Preferentemente, en algunas realizaciones, la carga del inmunosupresor como promedio entre la población de nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.1% y un 10% (peso/peso), y/o la carga del antígeno presentable por APC como promedio entre una población de nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.1% y un 10% (peso/peso).
En otro aspecto, se proporcionan formas farmacéuticas de cualquiera de las composiciones de la presente. Tales formas farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que lo necesite, tal como sujetos que necesitan tolerancia específica para un antígeno. En una realización, el sujeto es aquel que padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, el rechazo de un órgano o tejido, la enfermedad del injerto contra el huésped o una alergia. En otra realización, el sujeto es aquel que ha sido sometido o se someterá a un trasplante. En otra realización más, el sujeto es aquel que ha sido o será tratado con un agente terapéutico que estimula una respuesta inmunitaria no deseada.
A continuación, la invención se describirá más detalladamente.
B. Definiciones El término "administrar" o "administración" se refiere a proporcionar un material a un sujeto de una manera que sea farmacológicamente útil.
El término "alérgenos" se refiere a cualesquiera sustancias que pueden provocar una respuesta inmunitaria (es decir, una reacción o respuesta alérgica) no deseada (p. ej., hipersensibilidad de tipo 1) en un sujeto. Los alérgenos incluyen, sin carácter limitante, los alérgenos de las plantas (p. ej., polen, el alérgeno de la ambrosía), alérgenos de los insectos, alérgenos de las picaduras de insectos (p. ej., alérgenos de las picaduras de abejas), alérgenos de los animales (p. ej., alérgenos de las mascotas, tales como la caspa de los animales o el antígeno Fel d1 felino), alérgenos del látex, alérgenos del moho, alérgenos fúngicos, alérgenos de los productos cosméticos, alérgenos de los fármacos, alérgenos de los alimentos, polvo, veneno de los insectos, virus, bacterias, etc. Los alérgenos de los alimentos incluyen, sin carácter limitante, alérgenos de la leche, alérgenos de los huevos, alérgenos de los frutos secos (p. ej., alérgenos del cacahuate o las nueces arbóreas, etc. (p. ej., nueces, anacardos, etc.)), alérgenos del pescado, alérgenos del marisco, alérgenos de la soya, alérgenos de las legumbres, alérgenos de las semillas y alérgenos del trigo. Los alérgenos de las picaduras de insectos incluyen los alérgenos que son o están asociados con picaduras de abejas, picaduras de avispas, picaduras de avispones, picaduras de véspulas, etc. Los alérgenos de los insectos también incluyen los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico (p. ej., el antígeno Der P1) y los alérgenos de las cucarachas. Los alérgenos de los fármacos incluyen los alérgenos que son o están asociados con antibióticos, AINE, anestésicos, etc. Los alérgenos del polen incluyen los alérgenos del pasto, alérgenos de los árboles, alérgenos de las malezas, alérgenos de las flores, etc. Los sujetos que desarrollan o corren el riesgo de desarrollar una respuesta inmunitaria no deseada a cualquiera de los alérgenos proporcionados en la presente se pueden tratar con cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en la presente. Los sujetos que se pueden tratar con cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados también incluyen aquellos que padecen o corren el riesgo de padecer una alergia a cualquiera de los alérgenos proporcionados.
El término "alergia", denominado también "afección alérgica" en la presente, se refiere a cualquier afección en la que se produce una respuesta inmunitaria (es decir, una reacción o respuesta alérgica) no deseada (p. ej., una hipersensibilidad de tipo 1) a una sustancia. Este tipo de sustancias se denominan alérgenos en la presente. Las alergias o afecciones alérgicas incluyen, sin carácter limitante, el asma alérgica, rinitis alérgica primaveral, urticaria, eccema, alergias a las plantas, alergias a las picaduras de abejas, alergias a las mascotas, alergias al látex, alergias al moho, alergias a los productos cosméticos, alergias alimentarias, rinitis alérgica o coriza, reacciones alérgicas tópicas, anafilaxia, dermatitis atópica, reacciones de hipersensibilidad y otras afecciones alérgicas. La reacción alérgica puede ser el resultado de una reacción inmunitaria a cualquier alérgeno. En algunas realizaciones, la alergia es una alergia alimentaria. Las alergias alimentarias incluyen, sin carácter limitante, las alergias a la leche, alergias a los huevos, alergias a los frutos secos, alergias al pescado, alergias el marisco, alergias a la soya o alergias al trigo.
La expresión "cantidad eficaz", en el contexto de una composición o forma farmacéutica para su administración un sujeto, se refiere a una cantidad de la composición o forma farmacéutica que produce una o más respuestas inmunitarias deseadas en el sujeto, por ejemplo, la generación de una respuesta inmunitaria tolerogénica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una cantidad eficaz es cualquier cantidad de una composición proporcionada en la presente que produce una o más de estas respuestas inmunitarias deseadas. Esta cantidad puede ser para aplicaciones in vitro o in vivo. Para las aplicaciones in vivo, la cantidad puede ser aquella que un médico considere que pueda ejercer un beneficio clínico para un sujeto que necesite la inducción de inmunotolerancia específica para el antígeno. Tales sujetos incluyen aquellos que padecen o corren el riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una alergia, el rechazo de un órgano o tejido, o la enfermedad del injerto contra el huésped. Tales sujetos también incluyen aquellos que han sido sometidos o serán sometidos a un trasplante. Tales sujetos incluyen además aquellos que han experimentado, están experimentando o cabe esperar que experimenten una respuesta inmunitaria no deseada contra una proteína terapéutica.
Las cantidades eficaces pueden suponer únicamente reducir el nivel de una respuesta inmunitaria no deseada, aunque en algunas realizaciones, suponen prevenir una respuesta inmunitaria no deseada por completo. Las cantidades eficaces también pueden suponer ralentizar la aparición de una respuesta inmunitaria no deseada. Una cantidad que es eficaz también puede ser una cantidad de una composición proporcionada en la presente que produce un objetivo terapéutico deseado o un resultado terapéutico deseado. Las cantidades eficaces, preferentemente, producen una respuesta inmunitaria tolerogénica a un antígeno en un sujeto. El logro de cualquiera de los resultados anteriores se puede monitorizar mediante métodos rutinarios.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados, la cantidad eficaz es aquella en la que la respuesta inmunitaria deseada persiste en el sujeto durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 5 años o más. En otras realizaciones de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados, la cantidad eficaz es aquella que produce una respuesta inmunitaria deseada medible, por ejemplo, una reducción medible en una respuesta inmunitaria (p. ej., a un antígeno específico) durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 5 años o más.
Las cantidades eficaces dependerán, obviamente, del sujeto particular que se esté tratando; la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno; los parámetros individuales del paciente, que incluyen la edad, el estado físico, el tamaño y el peso; la duración del tratamiento; la naturaleza de las terapias concurrentes (en caso de que las haya); la vía específica de administración y factores similares comprendidos entre los conocimientos y las competencias del profesional sanitario. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con estos factores los cuales se pueden determinar simplemente mediante experimentación rutinaria. Por lo general, se prefiere emplear una dosis máxima, es decir, la dosis segura más elevada de acuerdo con un juicio médico razonable. Sin embargo, los expertos en la técnica sobreentenderán que un paciente puede insistir en tomar una dosis inferior o una dosis tolerable por motivos médicos, motivos psicológicos o virtualmente por cualquier otro motivo.
En general, las dosis de los inmunosupresores y/o antígenos en las composiciones de la invención pueden variar entre aproximadamente 10 pg/kg y aproximadamente 100 000 pg/kg. En algunas realizaciones, las dosis pueden variar entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. En otras realizaciones más, las dosis pueden variar entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, entre aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, entre aproximadamente 50 mg/kg y aproximadamente 75 mg/kg o entre aproximadamente 75 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. Como alternativa, la dosis se puede administrar en función del número de nanoportadores sintéticos que proporcionen la cantidad deseada de inmunosupresores y/o antígenos. Por ejemplo, las dosis útiles incluyen más de 106, 107, 108, 109 o 1010 nanoportadores sintéticos por dosis. Otros ejemplos de dosis útiles incluyen entre aproximadamente 1x106 y aproximadamente 1x1010, entre aproximadamente 1x107 y aproximadamente 1x109 o entre aproximadamente 1x108 y aproximadamente 1x109 nanoportadores sintéticos por dosis.
El término "antígeno" se refiere a un antígeno de linfocitos B o un antígeno de linfocitos T. La expresión "tipo(s) de antígenos" se refiere a moléculas que comparten las mismas características antigénicas o sustancialmente las mismas. En algunas realizaciones, los antígenos pueden ser proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, glucolípidos, polinucleótidos, polisacáridos o están contenidos o se expresan en células. En algunas realizaciones, tales como cuando los antígenos no están bien definidos o caracterizados, los antígenos pueden estar contenidos dentro de un preparado celular o tisular, residuos celulares, exosomas celulares, medios acondicionados, etc. Un antígeno se puede combinar con los nanoportadores sintéticos en la misma forma a la que está expuesto un sujeto la cual provoca una respuesta inmunitaria no deseada pero también puede ser un fragmento o derivado de esta. Sin embargo, cuando se trate de un fragmento o derivado, una respuesta inmunitaria deseada a la forma a la que se expone dicho sujeto es el resultado preferible con las composiciones y métodos proporcionados.
La expresión "específica para el antígeno" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria debida a la presencia del antígeno o porción de este, o que genera moléculas que reconocen o se unen específicamente al antígeno. Por ejemplo, si la respuesta inmunitaria es la producción de anticuerpos específicos para el antígeno, se producen anticuerpos que se unen específicamente al antígeno. Como otro ejemplo, si la respuesta inmunitaria es la proliferación y/o actividad específica para el antígeno de linfocitos T o linfocitos B, la proliferación y/o actividad se debe al reconocimiento del antígeno o porción de este, solo o en un complejo con moléculas MHC, por parte de los linfocitos B, etc.
La expresión "antígenos asociados" con una enfermedad, trastorno o afección proporcionada en la presente se refiere a antígenos que pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada contra la enfermedad, trastorno o afección, como resultado de esta o en conjunción con esta; la causa de la enfermedad, trastorno o afección (o un síntoma o efecto de esta); y/o pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada que es un síntoma, resultado o efecto de la enfermedad, trastorno o afección. Preferentemente, en algunas realizaciones, el uso de un antígeno asociado con una enfermedad, trastorno o afección, etc. en las composiciones y métodos proporcionados en la presente producirá una respuesta inmunitaria tolerogénica contra el antígeno y/o las células mediante, sobre o en las cuales se expresa el antígeno. Los antígenos pueden encontrarse en la misma forma en la que se expresan en un sujeto que padece la enfermedad, trastorno o afección, pero también pueden ser uno de sus fragmentos o derivados. Sin embargo, cuando se trate de un fragmento o derivado, una respuesta inmunitaria deseada a la forma expresada en dicho sujeto es el resultado preferible con las composiciones y métodos proporcionados. En algunas realizaciones, los antígenos asociados con una enfermedad, trastorno o afección, etc. comprenden epítopos restringidos por MHC de clase I y/o epítopos restringidos por MHC de clase II y/o epítopos de linfocitos B y/o comprenden un lípido que se une a CD1d o forma un complejo con este.
En una realización, el antígeno es un antígeno asociado con una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, el rechazo de un órgano o tejido, o la enfermedad del injerto contra el huésped. Tales antígenos incluyen autoantígenos, tales como la proteína básica de la mielina, colágeno (p. ej., colágeno de tipo II), gp 39 del cartílago humano, cromogranina A, gp130-RAPS, proteína proteolipídica, fibrilarina, proteínas nucleares, proteínas nucleolares (p. ej., proteína nucleolar pequeña), receptor del factor estimulador de la tiroides, histonas, glicoproteína gp 70, proteínas ribosomales, dihidrolipoamida-acetiltransferasa de la piruvato-deshidrogenasa, antígenos de los folículos pilosos, isoforma 5 de la tropomiosina humana, proteínas mitocondriales, proteínas de células ß pancreáticas, glicoproteína mielínica oligodendrocitaria, insulina, ácido glutámico-descarboxilasa (GAD), gluten, y fragmentos o derivados de estos. Otros autoantígenos se proporcionan más adelante en la Tabla 1.
Los antígenos también incluyen aquellos asociados con el rechazo de un órgano o tejido. Los ejemplos de tales antígenos incluyen, sin carácter limitante, antígenos de células alogeneicas, p. ej., antígenos de un extracto de células alogeneicas y antígenos de otras células, tales como antígenos de células endoteliales.
Los antígenos también incluyen aquellos asociados con una alergia. Tales antígenos incluyen los alérgenos descritos en otras secciones de la presente.
Los antígenos también incluyen aquellos asociados con un injerto trasplantable. Estos antígenos están asociados con un injerto trasplantable o una respuesta inmunitaria no deseada en un receptor de un injerto trasplantable la cual se genera como resultado de la introducción del injerto trasplantable en el receptor, cuyos antígenos pueden ser presentados para su reconocimiento por parte de las células del sistema inmunitario y pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada. Los antígenos de un trasplante incluyen aquellos asociados con el rechazo de un órgano o tejido, o la enfermedad del injerto contra el huésped. Los antígenos de un trasplante se pueden obtener o derivar de células de un material biológico o de información relacionada con un injerto trasplantable. Los antígenos de un trasplante generalmente incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, glucolípidos, polinucleótidos o están contenidos o se expresan en células. La información relacionada con un injerto trasplantable es cualquier información referente a un injerto trasplantable que se puede utilizar para obtener o derivar antígenos de un trasplante. Dicha información incluye información referente a antígenos que cabría esperar que estuviera presente en o sobre células de un injerto trasplantable tal como, por ejemplo, información sobre las secuencias, los tipos o las clases de antígenos y/o sus restricciones de presentación por linfocitos B o MHC de clase I o MHC de clase II. Esta información también puede incluir información sobre el tipo de injerto trasplantable (p. ej., autoinjerto, aloinjerto, xenoinjerto), la composición molecular y celular del injerto, la parte del cuerpo de la cual se deriva el injerto o en la cual se ha de trasplantar el injerto (p. ej., un órgano entero o parte de este, piel, hueso, nervios, tendón, neuronas, vasos sanguíneos, grasa, córnea, etc.).
Los antígenos también incluyen antígenos asociados con una proteína terapéutica que pueden ser presentados para su reconocimiento por parte de las células del sistema inmunitario y que pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada contra la proteína terapéutica. Los antígenos de proteínas terapéuticas incluyen generalmente proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas o están contenidos o expresados en, sobre o por células.
Los antígenos pueden ser antígenos que estén completamente definidos o caracterizados. Sin embargo, en algunas realizaciones, un antígeno no está completamente definido o caracterizado. Por lo tanto, los antígenos también incluyen aquellos que están contenidos dentro de un preparado celular o tisular, residuos celulares, exosoma celular o medios acondicionados, y pueden ser suministrados de tal forma en algunas realizaciones.
La expresión "antígeno presentable por APC" se refiere a un antígeno que puede ser presentado para su reconocimiento por parte de las células del sistema inmunitario, tal como presentado por células presentadoras de antígeno que incluyen, sin carácter limitante, células dendríticas, linfocitos B o macrófagos. El antígeno presentable por APC puede ser presentado para su reconocimiento por parte de, por ejemplo, linfocitos T.
Tales antígenos pueden ser reconocidos por un linfocito T y desencadenan una respuesta inmunitaria en este mediante la presentación del antígeno o porción de este unido a una molécula del complejo principal de histocompatibildad ( HC) de clase I o clase II, o unido a una molécula CD1d. CD1d es una molécula presentadora de antígeno que se une a lípidos y glicolípidos endógenos y exógenos, y que normalmente se encuentra sobre células presentadoras de antígeno. También se encuentra sobre células no hematopoyéticas tales como los hepatocitos. CD1d contiene un surco hidrofóbico que se une a lípidos hidrofóbicos, normalmente para su presentación a linfocitos iNKT. Preferentemente, con las composiciones proporcionadas en la presente se producen una o más respuestas inmunitarias tolerogénicas específicas para el antígeno presentable por APC. Tales respuestas inmunitarias se pueden conseguir, por ejemplo, mediante la estimulación, producción, inducción o atracción de células reguladoras, tales como linfocitos Treg CD4+ y/o linfocitos Treg CD8+.
Los antígenos presentables por APC generalmente incluyen péptidos, polipéptidos, proteínas enteras o lisados celulares enteros. En una realización, el antígeno presentable por APC comprende un epítopo restringido por MHC de clase I. En otra realización, el antígeno presentable por APC comprende un epítopo restringido por MHC de clase II. En otra realización, el antígeno presentable por APC comprende un epítopo de linfocitos B. Sin embargo, en otra realización, el antígeno presentable por APC es un lípido que se une a CD1d o forma un complejo con este.
En otras realizaciones, los antígenos presentables por APC en las composiciones de la invención se proporcionan en forma de un ácido nucleico que codifica el péptido, polipéptido o proteína. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, tal como ARNm. En las realizaciones, las composiciones de la invención comprenden un complemento, tal como un complemento de longitud completa, o una forma redundante (debido a la redundancia del código genético) de cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la presente. En las realizaciones, el ácido nucleico es un vector de expresión que se puede transcribir cuando se transfiere a una línea celular. En las realizaciones, el vector de expresión puede comprender un plásmido, retrovirus o un adenovirus, entre otros.
En una realización, el antígeno está asociado con una enfermedad, trastorno o afección descrita en la presente y combinado con un inmunosupresor puede producir una respuesta inmunitaria tolerogénica específica para la enfermedad, trastorno o afección.
La expresión "evaluar una respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier medición o determinación del nivel, la presencia o ausencia, reducción, incremento, etc. de una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo. Tales mediciones o determinaciones se pueden llevar a cabo en una o más muestras obtenidas de un sujeto. Dicha evaluación se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos proporcionados en la presente o conocidos en la técnica.
Un sujeto "que corre el riesgo de" es aquel que un profesional sanitario considera que es posible que desarrolle una enfermedad, afección a trastorno como los proporcionados en la presente o es aquel que un profesional sanitario considera que es posible que experimente una respuesta inmunitaria no deseada como las proporcionadas en la presente.
La expresión "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a cualquier enfermedad en la que el sistema inmunitario ejerce una respuesta inmunitaria no deseada contra sí mismo (p. ej., uno o más autoantígenos). En algunas realizaciones, una enfermedad autoinmunitaria comprende una destrucción aberrante de células del cuerpo como parte de la respuesta inmunitaria autodirigida. En algunas realizaciones, la autodestrucción se manifiesta como la disfunción de un órgano, por ejemplo, el colon o el páncreas. En otras secciones de la presente se describen ejemplos de enfermedades autoinmunitarias. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con otras enfermedades autoinmunitarias y la invención no está limitada en este sentido.
El término "promedio", tal como se utiliza la presente, se refiere a la media aritmética a menos que se indique lo contrario.
La expresión "antígeno de linfocitos B" se refiere a cualquier antígeno que desencadena una respuesta inmunitaria en este (p. ej., un antígeno que es reconocido específicamente por un linfocito B o un receptor de este). En algunas realizaciones, un antígeno que es un antígeno de linfocitos T también es un antígeno de linfocitos B. En otras realizaciones, el antígeno de linfocitos T no es además un antígeno de linfocitos B. Los antígenos de linfocitos B incluyen, sin carácter limitante, proteínas, péptidos, moléculas de bajo peso molecular y carbohidratos. En algunas realizaciones, el antígeno de linfocitos B comprende un antígeno no proteico (es decir, un antígeno no proteico ni peptídico). En algunas realizaciones, el antígeno de linfocitos B comprende un autoantígeno. En otras realizaciones, el antígeno de linfocitos B se obtiene o deriva de un alérgeno, autoantígeno, proteína terapéutica o injerto trasplantare.
El término "concomitantemente" se refiere a administrar dos o más sustancias a un sujeto de un modo que está correlacionado en el tiempo, preferentemente lo suficientemente correlacionado en el tiempo para proporcionar una modulación de la respuesta inmunitaria. En las realizaciones, la administración concomitante puede tener lugar mediante la administración de dos o más sustancias en la misma forma farmacéutica. En otras realizaciones, la administración concomitante puede englobar la administración de dos o más sustancias en diferentes formas farmacéuticas, pero dentro de un periodo especificado de tiempo, preferentemente en 1 mes, más preferentemente en 1 semana, aún más preferentemente en 1 día e incluso más preferentemente en 1 hora.
El término "acoplar", "acoplado" o "se acopla" (y similares) se refiere a asociar químicamente una entidad (por ejemplo, un resto) con otra. En algunas realizaciones, el acoplamiento es covalente, lo cual significa que el acoplamiento tiene lugar en el contexto de la presencia de un enlace covalente entre las dos entidades. En las realizaciones no covalentes, el acoplamiento no covalente está mediado por interacciones no covalentes que incluyen, sin carácter limitante, interacciones de cargas, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones de receptor-sustrato, interacciones hidrófobas, interacciones aromáticas, interacciones de puente de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de estas. En las realizaciones, la encapsulación es una forma de acoplamiento.
La expresión "forma farmacéutica" se refiere a un material farmacológica y/o inmunológicamente activo en un medio, portador, vehículo o dispositivo adecuado para su administración a un sujeto.
El término "encapsular" se refiere a encerrar al menos una porción de una sustancia dentro de un nanoportador sintético. En algunas realizaciones, una sustancia se encierra completamente dentro de un nanoportador sintético. En otras realizaciones, la mayor parte o la totalidad de una sustancia que está encapsulada no está expuesta al entorno local externo al nanoportador sintético. En otras realizaciones, no más de un 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% (peso/peso) está expuesto al entorno local. La encapsulación es distinta de la absorción, que sitúa la mayor parte o la totalidad de una sustancia sobre una superficie de un nanoportador sintético y deja la sustancia expuesta al entorno local externo al nanoportador sintético.
El término "epítopo", también conocido como determinante antigénico, es la parte de un antígeno que es reconocida por el sistema ¡nmunitario, específicamente por, por ejemplo, anticuerpos, linfocitos B o linfocitos T. La expresión "epítopos restringidos por HC de clase I", tal como se utiliza en la presente, se refiere a epítopos que son presentados a las células inmunitarias por moléculas MHC de clase I en células nucleadas. La expresión "epítopos restringidos por MHC de clase II" se refiere a epítopos que son presentados a las células inmunitarias por moléculas MHC de clase II que se encuentran en células presentadoras de antígeno (APC), Por ejemplo, en células inmunitarias presentadoras de antígeno profesionales, tales como macrófagos, linfocitos B y células dendríticas, o en células no hematopoyéticas, tales como hepatocitos. La expresión "epítopos de linfocitos B" se refiere a estructuras moleculares que son reconocidas por anticuerpos o linfocitos B. En algunas realizaciones, el propio epítopo es un antígeno.
Los expertos en la técnica estarán familiarizados con múltiples epítopos y los epítopos ilustrativos adecuados de acuerdo con algunos aspectos de esta invención incluyen, sin carácter limitante, los enumerados en la base de datos de epítopos inmunitarios (www.immuneepitope.org, Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Sette A, Peters B. The immune epitope datábase 2.0. Nucleic Acids Res. enero de 2010;38(edición de la base de datos) :D854-62; el contenido de la cual se incorpora en su totalidad a la presente por referencia así como también todas las entradas de la base de datos de la versión 2.4 de IEDB, agosto de 2011 , y en particular todos los epítopos descritos en ellas). Los epítopos también se pueden identificar con algoritmos de acceso público, por ejemplo, los algoritmos descritos en Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. 2010. Peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 2010, 11 :568; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. 2008. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4):e1000048; Nielsen M, Lund O. 2009. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bioinformatics. 10:296; Nielsen M, Lundegaard C, Lund O. 2007. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8:238; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothé BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Immunogenetics. 57:304-314; Sturniolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci O, Sahin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat Biotechnol. 17(6):555-561 ; Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. 2003. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Sci 12:1007-1017; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics 57:304-314; Peters B, Sette A. 2005. Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method. BMC Bioinformatics 6:132; Chou PY, Fasman GD. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148; Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol 55:836-839; Karplus PA, Schulz GE. 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften 72:212-213; Kolaskar AS, Tongaonkar PC. 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett276: 172-174; Parker JM, Guo D, Hodges RS. 1986. New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry 25:5425-5432; Larsen JE, Lund O, Nielsen M. 2006. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res 2:2; Ponomarenko JV, Bourne PE. 2007. Antibody-protein interactions: benchmark dataseis and prediction tools evaluation. BMC Struct Biol 7:64; Haste Andersen P, Nielsen M, Lund O. 2006. Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15:2558-2567; Ponomarenko JV, Bui H, Li W, Fusseder N, Bourne PE, Sette A, Peters B. 2008. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics 9:514; Nielsen M, Lundegaard C, Blicher T, Peters B, Sette A, Justesen S, Buus S, and Lund O. 2008. PLoS Comput Biol.4(7)e1000107. Quantitative predictions of peptide binding to any HLA-DR molecule of known sequence: NetMHCIIpan; el contenido de cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad a la presente por referencia para la descripción de métodos y algoritmos para la identificación de epítopos.
Otros ejemplos de epítopos que se pueden acoplar a los nanoportadores sintéticos proporcionados en la presente incluyen cualquiera de los epítopos de linfocitos B, restringidos por MHC de clase I y restringidos por MHC de clase II proporcionados como las SEQ ID NO: 1-943. Sin que ello suponga ceñirse a ninguna teoría particular, los epítopos restringidos por MHC de clase I incluyen aquellos expuestos en las SEQ ID NO: 1-186, los epítopos restringidos por MHC de clase II incluyen aquellos expuestos en las SEQ ID NO: 187-537 y los epítopos de linfocitos B incluyen aquellos expuestos en las SEQ ID NO: 538-943. Estos epítopos incluyen autoantígenos restringidos por MHC de clase I, epítopos restringidos por MHC de clase II de alérgenos, y epítopos de linfocitos B de autoantígenos y alérgenos.
El término "generar" se refiere a provocar una acción, tal como una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta inmunitaria tolerogénica), ya sea directamente uno mismo o indirectamente, tal como, sin carácter limitante, un tercero no relacionado que ejerce una acción debido a la confianza en la información o acciones de otro.
El término "identificar" se refiere a una acción o un conjunto de acciones que permite a un médico reconocer a un sujeto como aquel que se puede beneficiar de las composiciones y métodos proporcionados en la presente. Preferentemente, el sujeto identificado es aquel que necesita una respuesta inmunitaria tolerogénica como las proporcionadas en la presente. La acción o conjunto de acciones puede tratarse de directamente uno mismo o indirectamente, tal como, sin carácter limitante, un tercero no relacionado que ejerce una acción debido a la confianza en la información o acciones de otro.
El término "inmunosupresor" se refiere a un compuesto que hace que una APC ejerza un efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico). Un efecto inmunosupresor generalmente se refiere a la producción o expresión de citocinas u otros factores por parte de la APC que reduce, inhibe o previene una respuesta inmunitaria no deseada o que promueve una respuesta inmunitaria deseada. Cuando la APC produce un efecto inmunosupresor sobre células inmunitarias que reconocen un antígeno presentado por la APC, el efecto inmunosupresor se califica como específico para el antígeno presentado. Tal efecto también se denomina en la presente efecto tolerogénico. Sin que ello suponga ceñirse a ninguna teoría particular, se cree que el efecto inmunosupresor es un resultado de la administración del inmunosupresor a la APC, preferentemente en presencia de un antígeno (p. ej., un antígeno administrado o uno que ya está presente in vivó). Por consiguiente, el inmunosupresor incluye compuestos que proporcionan una respuesta inmunitaria tolerogénica a un antígeno que puede ser proporcionado o no en la misma composición o en una composición diferente. En una realización, el inmunosupresor es aquel que hace que una APC fomente un fenotipo regulador en una o más células efectoras inmunitarias.
Por ejemplo, el fenotipo regulador puede estar caracterizado por la producción, inducción, estimulación o atracción de células inmunitarias reguladoras. Esto puede ser el resultado de la conversión de linfocitos T CD4+ (p. ej., linfocitos Treg CD4+CD25altoFoxP3+) en un fenotipo regulador. Esto también puede ser el resultado de la inducción de FoxP3 en otras células inmunitarias, tales como linfocitos T CD8+, macrófagos y linfocitos ¡NKT. En una realización, el inmunosupresor es aquel que afecta a la respuesta de la APC después de que esta procese un antígeno. En otra realización, el inmunosupresor no es aquel que interfiere en el procesamiento del antígeno. En otra realización, el inmunosupresor no es una molécula de señalización apoptótica. En otra realización, el inmunosupresor no es un fosfolípido.
Los inmunosupresores incluyen, sin carácter limitante, estatinas; inhibidores de mTOR, tales como la rapamicina o un análogo de la rapamicina; agentes señalizadores de TGF-ß; agonistas de los receptores de TGF-ß; inhibidores de la histona-deacetilasa, tales como Tricostatina A; corticosteroides; inhibidores de la función mitocondrial, tales como rotenona; inhibidores de P38; inhibidores de NF-?ß, tales como 6Bio, Dexametasona, TCPA-1 , IKK VII; agonistas de los receptores de adenosina; agonistas de la prostaglandina E2 (PGE2), tales como Misoprostol; inhibidores de la fosfodiesterasa, tales como un inhibidor de la fosfodiesterasa 4 (PDE4), tales como Rolipram; inhibidores de proteasomas; inhibidores de cinasas; agonistas de receptores acoplados a proteínas G; antagonistas de receptores acoplados a proteínas G; glucocorticoides; retinoides; inhibidores de citocinas; inhibidores de los receptores de citocinas; activadores de los receptores de citocinas; antagonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas; agonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas; inhibidores de la histona-deacetilasa; inhibidores de calcineurina; inhibidores de fosfatasas; inhibidores de PI3KB, tales como TGX-221 ; inhibidores de la autofagia, tales como 3-Metiladenina; inhibidores de los receptores de aril-hidrocarburos; inhibidor del proteasoma I (PSI); y ATP oxidados, tales como los bloqueadores de los receptores P2X. Los inmunosupresores también incluyen IDO, vitamina D3, ciclosporinas, tales como la ciclosporina A, inhibidores de los receptores de aril-hidrocarburos, resveratrol, azatiopurina (Aza), 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), FK506, sanglifehrina A, salmeterol, micofenolato mofetilo (MMF), aspirina y otro inhibidores de COX, ácido niflúmico, estriol y triptolida. En las realizaciones, el inmunosupresor puede comprender cualquiera de los agentes proporcionados en la presente.
El inmunosupresor puede ser un compuesto que proporcione directamente el efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico) sobre las APC o puede ser un compuesto que proporcione el efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico) indirectamente (es decir, después de haber sido procesado de alguna forma tras la administración). Por lo tanto, los inmunosupresores incluyen las formas de profármaco de cualquiera de los compuestos proporcionados en la presente.
Los inmunosupresores también incluyen los ácidos nucleicos que codifican los péptidos, polipéptidos o proteínas proporcionados en la presente que proporcionan una respuesta inmunitaria inmunosupresora (p. ej., tolerogénica). Por lo tanto, en algunas realizaciones, el inmunosupresor es un ácido ribonucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína que produce una respuesta inmunitaria inmunosupresora (p. ej., tolerogénica) y es el ácido nucleico que está acoplado al nanoportador sintético.
El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, tal como ARNm. En las realizaciones, las composiciones de la invención comprenden un complemento, tal como un complemento de longitud completa, o una forma redundante (debido a la redundancia del código genético) de cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la presente. En las realizaciones, el ácido nucleico es un vector de expresión que se puede transcribir cuando se transfiere a una línea celular. En las realizaciones, el vector de expresión puede comprender un plásmido, retrovirus o un adenovirus, entre otros. Los ácidos nucleicos se pueden aislar o sintetizar utilizando métodos de biología molecular estándar, por ejemplo, utilizando una reacción en cadena de la polimerasa para producir un fragmento de ácido nucleico, que a continuación se purifica y clona en un vector de expresión. Se pueden consultar otras técnicas útiles para llevar a la práctica esta invención en Current Protocols in Molecular Biology 2007 de John Wiley and Sons, Inc.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Tercera Edición) Joseph Sambrook, Instituto del Cáncer Peter MacCallum, Melbourne, Australia; David Russell, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, Cold Spring Harbor.
En las realizaciones, los inmunosupresores proporcionados en la presente están acoplados a nanoportadores sintéticos. En las realizaciones preferentes, el inmunosupresor es un elemento que se suma al material que constituye la estructura del nanoportador sintético. Por ejemplo, en una realización, donde el nanoportador sintético está constituido por uno o más polímeros, el inmunosupresor es un compuesto que se suma y está acoplado al polímero o polímeros. Como otro ejemplo, en una realización, donde el nanoportador sintético está constituido por uno o más lípidos, el inmunosupresor de nuevo se suma y está acoplado al lípido o lípidos. En las realizaciones, tales como donde el material del nanoportador sintético también produce un efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico), el inmunosupresor es un elemento presente que se suma al material del nanoportador sintético que produce un efecto inmunosupresor (p. ej., tolerogénico).
Otros inmunosupresores ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, fármacos de bajo peso molecular, productos naturales, anticuerpos (p. ej., anticuerpos contra CD20, CD3, CD4), fármacos biológicos, fármacos a base de carbohidratos, nanopartículas, liposomas, ARNi, ácidos nucleicos antisentido, aptámeros, metotrexato, AINE; fingolimod; natalizumab; alemtuzumab; anti-CD3; tacrolimus (FK506), etc. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con otros inmunosupresores y la invención no está limitada a este respecto.
La expresión "enfermedad inflamatoria" se refiere a cualquiera enfermedad, trastorno o afección en la que se produce una inflamación no deseada.
El término "carga" del inmunosupresor o antígeno es la cantidad del inmunosupresor o antígeno acoplado a un nanoportador sintético en función del peso total de los materiales en un nanoportador sintético completo (peso/peso). En general, la carga se calcula como un promedio entre una población de nanoportadores sintéticos. En una realización, la carga del inmunosupresor como promedio entre la primera población de nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.0001% y un 50%. En otra realización, la carga del antígeno como promedio entre la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos está comprendida entre un 0.0001% y un 50%. En otra realización adicional, la carga del inmunosupresor y/o antígeno está comprendida entre un 0.01% y un 20%. En otra realización, la carga del inmunosupresor y/o antígeno está comprendida entre un 0.1% y un 10%. En otra realización adicional, la carga del inmunosupresor y/o antígeno está comprendida entre un 1% y un 10%. En otra realización adicional, la carga del inmunosupresor y/o el antígeno es de al menos un 0.1%, al menos un 0.2%, al menos un 0.3%, al menos un 0.4%, al menos un 0.5%, al menos un 0.6%, al menos un 0.7%, al menos un 0.8%, al menos un 0.9%, al menos un 1%, al menos un 2%, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al menos un 10%, al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un 13%, al menos un 14%, al menos un 15%, al menos un 16%, al menos un 17%, al menos un 18%, al menos un 19% o al menos un 20% como promedio entre una población de nanoportadores sintéticos. En otra realización adicional, la carga del inmunosupresor y/o el antígeno es de un 0.1%, un 0.2%, un 0.3%, un 0.4%, un 0.5%, un 0.6%, un 0.7%, un 0.8%, un 0.9%, un 1%, un 2%, un 3%, un 4%, un 5%, un 6%, un 7%, un 8%, un 9%, un 10%, un 11%, un 12%, un 13%, un 14%, un 15%, un 16%, un 17%, un 18%, un 19% o un 20% como promedio entre una población de nanoportadores sintéticos. En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la carga del inmunosupresor y/o el antígeno no es superior a un 25% como promedio entre una población de nanoportadores sintéticos. En las realizaciones, la carga se calcula como se describe en los Ejemplos.
En las realizaciones de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados, la carga se calcula como se indica a continuación: se recogen aproximadamente 3 mg de nanoportadores sintéticos y se centrifugaron para separar el sobrenadante del pellet de nanoportadores sintéticos. Se añade acetonitrilo al pellet, y la muestra se sónica y centrifuga para eliminar cualquier material insoluble. El sobrenadante y el pellet se inyectan en un RP-HPLC y se lee la absorbancia a 278 nm. Los pg que se encuentran en el pellet se utilizan para calcular el % atrapado (carga) y los pg en el sobrenadante y el pellet se utilizan para calcular los pg totales recuperados.
La expresión "dosis de mantenimiento" se refiere a una dosis que se administra a un sujeto, después de que una dosis inicial haya provocado una respuesta inmunosupresora (p. ej., tolerogénica) en un sujeto, para mantener una respuesta inmunosupresora deseada (p. ej., tolerogénica). Una dosis de mantenimiento puede ser, por ejemplo, aquella que mantiene el efecto tolerogénico conseguido después de la dosis inicial, previene una respuesta inmunitaria no deseada en el sujeto o previene que el sujeto se convierta en un sujeto que corra el riesgo de experimentar una respuesta inmunitaria no deseada, incluido un nivel no deseado de una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la dosis de mantenimiento es aquella que es suficiente para mantener un nivel adecuado de una respuesta inmunitaria deseada.
La expresión "dimensión máxima de un nanoportador sintético" se refiere a la mayor dimensión de un nanoportador medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. La expresión "dimensión mínima de un nanoportador sintético" se refiere a la dimensión más pequeña de un nanoportador sintético medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. Por ejemplo, para un nanoportador sintético esferoidal, la dimensión máxima y la mínima del nanoportador sintético serían sustancialmente idénticas y serían del tamaño de su diámetro. De manera similar, para un nanoportador sintético cuboidal, la dimensión mínima del nanoportador sintético sería la más pequeña de su altura, ancho o largo, mientras que la dimensión máxima del nanoportador sintético sería la mayor de su altura, ancho o largo. En una realización, la dimensión mínima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es mayor o igual a 100 nm. En una realización, la dimensión máxima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es inferior o igual a 5 µ??. Preferentemente, la dimensión mínima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es superior a 110 nm, más preferentemente superior a 120 nm, más preferentemente superior a 130 nm y aún más preferentemente superior a 150 nm. Las relaciones entre dimensiones para las dimensiones máxima y mínima de los nanoportadores sintéticos de la invención pueden variar dependiendo de la realización. Por ejemplo, las relaciones entre dimensiones para las dimensiones máxima frente a mínima de los nanoportadores sintéticos pueden variar desde 1 :1 hasta 1 000 000:1 , preferentemente desde 1 :1 hasta 100 000:1 , más preferentemente desde 1 :1 hasta 10 000:1 , más preferentemente desde 1 :1 hasta 1000:1 , aún más preferentemente desde 1:1 hasta 100:1 , e incluso más preferentemente desde 1 :1 hasta 10:1. Preferentemente, la dimensión máxima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es menor o igual a 3 µ?t?, más preferentemente menor o igual a 2 µ?t?, más preferentemente menor o igual a 1 µ?t?, más preferentemente menor o igual a 800 nm, más preferentemente menor o igual a 600 nm, y aún más preferentemente menor o igual a 500 nm. En las realizaciones preferidas, la dimensión mínima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es mayor o igual a 100 nm, más preferentemente mayor o igual a 120 nm, más preferentemente mayor o igual a 130 nm, más preferentemente mayor o igual a 140 nm, y aún más preferentemente mayor o igual a 150 nm. La medición de las dimensiones de los nanoportadores sintéticos (p. ej., diámetro) se obtiene suspendiendo los nanoportadores sintéticos en un medio líquido (generalmente acuoso) y utilizando dispersión de luz dinámica (DLS) (p. ej., utilizando un instrumento Brookhaven ZetaPALS). Por ejemplo, una suspensión de nanoportadores sintéticos se puede diluir a partir de un tampón acuoso en agua purificada para conseguir una concentración final de la suspensión de nanoportadores sintéticos comprendida entre aproximadamente 0.01 y 0.1 mg/mL. La suspensión diluida se puede preparar directamente dentro de una cubeta adecuada para el análisis por DLS o se puede transferir a dicha cubeta. A continuación, la cubeta se puede colocar en el DLS, dejar que se equilibre hasta la temperatura controlada y después escanear durante un tiempo suficiente para adquirir una distribución estable y reproducible basándose en los parámetros adecuados para la viscosidad del medio y los índices de refracción de la muestra. A continuación se registra el diámetro eficaz o la media de la distribución. El término "dimensión", "tamaño" o "diámetro" de los nanoportadores sintéticos se refiere a la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica.
El término "MHC" se refiere al complejo de histocompatibilidad principal, una familia de genes o región genómica grande que se encuentra en la mayoría de los vertebrados la cual codifica moléculas MHC que exhiben fragmentos o epítopos de proteínas procesadas en la superficie celular. La presentación de MHC:péptido en las superficies celulares permite la vigilancia por parte de las células inmunitarias, normalmente un linfocito T. Existen dos clases generales de moléculas MHC: Clase I y Clase II. Generalmente, las moléculas MHC de clase I se encuentran en células nucleadas y presentan péptidos a los linfocitos T citotóxicos. Las moléculas MHC de clase II se encuentran en ciertas células inmunitarias, principalmente macrófagos, linfocitos B y células dendríticas, conocidas de forma colectiva como APC profesionales. Los genes más conocidos en la región MHC son el subconjunto que codifica proteínas presentadoras de antígeno en la superficie celular. En los seres humanos, estos genes se denominan genes de antígenos leucocitarios humanos (HLA, por sus siglas en inglés).
La expresión "polímero no terminado en metoxi" se refiere a un polímero que posee al menos un extremo terminal que termina en un resto que no sea metoxi. En algunas realizaciones, el polímero posee al menos dos extremos terminales que terminan en un resto que no sea metoxi. En otras realizaciones, el polímero no tiene ningún extremo terminal que termine en metoxi. La expresión "polímero Pluronic no terminado en metoxi" se refiere a un polímero que no sea un polímero Pluronic lineal con metoxi en ambos extremos terminales. Las nanopartículas poliméricas proporcionadas en la presente pueden comprender polímeros no terminados en metoxi o polímeros Pluronic no terminados en metoxi.
La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material farmacológicamente inactivo empleado junto con los nanoportadores sintéticos mencionados para formular las composiciones de la invención. Los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden diversos materiales conocidos en la técnica que incluyen, sin carácter limitante, sacáridos (como la glucosa, lactosa y similares), conservantes tales como los agentes antimicrobianos, adyuvantes de reconstitución, colorantes, solución salina (tal como solución salina tamponada con fosfato) y tampones.
El término "protocolo" se refiere a cualquier régimen posológico de una o más sustancias para un sujeto. Un régimen posológico puede incluir la cantidad, la frecuencia y/o el modo de administración. En algunas realizaciones, este tipo de protocolo se puede utilizar para administrar una o más composiciones de la invención a uno o más sujetos objeto de estudio. Las respuestas inmunitarias en estos sujetos objeto de estudio se pueden evaluar posteriormente para determinar si el protocolo ha sido o no eficaz a la hora de reducir una respuesta inmunitaria no deseada o generar una respuesta inmunitaria deseada (p. ej., fomentar un efecto tolerogénico).
También se puede evaluar cualquier otro efecto terapéutico y/o profiláctico en vez de o además de las respuestas inmunitarias mencionadas anteriormente. Se puede determinar si un protocolo ejerce o no un efecto deseado utilizando cualquiera de los métodos proporcionados en la presente o conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener una población de células de un sujeto al cual se le ha administrado una composición proporcionada en la presente de acuerdo con un protocolo específico con el fin de determinar si se ha producido o no la reducción, generación, activación, etc. de células inmunitarias específicas, citocinas, anticuerpos, etc. Los métodos útiles para detectar la presencia y/o el número de células inmunitarias incluyen, sin carácter limitante, métodos de citometría de flujo (p. ej., FACS) y métodos inmunohistoquímicos. Se pueden adquirir de proveedores comerciales anticuerpos y otros agentes ligantes para la tinción específica de marcadores de células inmunitarias. Los kits de este tipo normalmente incluyen reactivos colorantes para múltiples antígenos que permiten la detección, separación y/o cuantificación basadas en FACS de una población de células deseada a partir de una población heterogénea de células.
La expresión "proporcionar a un sujeto" se refiere a cualquier acción o conjunto de acciones que hacen que un médico entre en contacto con un sujeto y le administre una composición proporcionada en la presente o para llevar a cabo seguidamente un método proporcionado en la presente. Preferentemente, el sujeto es aquel que necesita una respuesta inmunitaria tolerogénica como las proporcionadas en la presente. La acción o conjunto de acciones puede tratarse de directamente uno mismo o indirectamente, tal como, sin carácter limitante, un tercero no relacionado que ejerce una acción debido a la confianza en la información o acciones de otro.
El término "sujeto" se refiere a animales, incluidos los mamíferos de sangre caliente tales como seres humanos y primates; aves; animales domésticos, mascotas o animales de granja tales como gatos, perros, ovejas, cabras, reses, caballos y cerdos; animales de laboratorio tales como ratones, ratas y conejillos de Indias; peces; reptiles; animales de zoológico y animales salvajes; y similares.
La expresión "nanoportador(es) sintético(s)" se refiere a un objeto específico que no se encuentra en la naturaleza y que posee al menos una dimensión que tiene un tamaño menor o igual a 5 mieras. Las nanopartículas de albúmina generalmente se incluyen como nanoportadores sintéticos, sin embargo, en ciertas realizaciones los nanoportadores sintéticos no comprenden nanopartículas de albúmina. En las realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención no comprenden quitosano. En otras realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención no son nanopartículas a base de lípidos. En otras realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención no comprenden un fosfolípido.
Un nanoportador sintético puede ser, sin carácter limitante, una o una pluralidad de nanopartículas a base de lípidos (también denominadas en la presente nanopartículas lipídicas, es decir, nanopartículas en las que la mayor parte del material que constituye su estructura son lípidos), nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsiones a base de surfactante, dendrímeros, futbolenos, nanohilos, partículas pseudovíricas (es decir, partículas que están constituidas principalmente por proteínas estructurales víricas pero que no son infecciosas o tienen una infectividad baja), partículas a base de péptidos o proteínas (también denominadas en la presente partículas proteicas, es decir, partículas en las que la mayor parte del material que constituye su estructura son péptidos o proteínas) (tales como nanopartículas de albúmina) y/o nanopartículas que se elaboran utilizando una combinación de nanomateriales tales como nanopartículas poliméricas-lipídicas. Los nanoportadores sintéticos pueden tener una variedad de formas diferentes, incluidas, sin carácter limitante, esferoidal, cuboidal, piramidal, oblonga, cilindrica, toroidal y similares. Los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención comprenden una o más superficies. Los nanoportadores sintéticos ilustrativos que pueden adaptarse para emplearlos en la práctica de la presente invención comprenden: (1) las nanopartículas biodegradables descritas en la Patente de EE. UU. 5,543,158 concedida a Gref et al., (2) las nanopartículas poliméricas de la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20060002852 concedida a Saltzman et al., (3) las nanopartículas construidas litográficamente de la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20090028910 concedida a DeSimone et al., (4) la descripción de WO 2009/051837 concedida a von Andrian et al., (5) las nanopartículas descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 2008/0145441 concedida a Penades et al., (6) las nanopartículas proteicas descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20090226525 concedida a de los Ríos et al., (7) las partículas pseudovíricas descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20060222652 concedida a Sebbel et al., (8) las partículas pseudovíricas acopladas a ácido nucleico descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20060251677 concedida a Bachmann et al., (9) las partículas pseudovíricas descritas en WO2010047839A1 o WO2009106999A2, (10) las nanopartículas nanoprecipitadas descritas en P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010), o (11) células apoptóticas, cuerpos apoptóticos o los miméticos sintéticos o semisintéticos descritos en la Publicación de EE. UU. 2002/0086049. En las realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación entre dimensiones superior a 1:1, 1 :1.2, 1 :1.5, 1 :2, 1 :3, 1 :5, 1 :7 o superior a 1:10.
Los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención que tienen una dimensión mínima menor o igual a aproximadamente 100 nm, preferentemente menor o igual a 100 nm, no comprenden una superficie con grupos hidroxilo que activen el complemento o, como alternativa, comprenden una superficie constituida esencialmente por restos que no son grupos hidroxilo que activan el complemento. En una realización preferida, los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención que tienen una dimensión mínima menor o igual a aproximadamente 100 nm, preferentemente menor o igual a 100 nm, no comprenden una superficie que active sustancialmente el complemento o, como alternativa, comprenden una superficie constituida esencialmente por restos que no activan sustancialmente el complemento. En una realización más preferida, los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención que tienen una dimensión mínima menor o igual a aproximadamente 100 nm, preferentemente menor o igual a 100 nm, no comprenden una superficie que active el complemento o, como alternativa, comprenden una superficie constituida esencialmente por restos que no activan el complemento. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos excluyen partículas pseudovíricas. En las realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación entre dimensiones superior a 1 :1 , 1 :1.2, 1 :1.5, 1 :2, 1 :3, 1 :5, 1 :7 o superior a 1 :10.
La expresión "antígeno de linfocitos T" se refiere a un antígeno de linfocitos T CD4+, antígeno de linfocitos CD8+ o un antígeno restringido por CD1d. La expresión "antígeno de linfocitos T CD4+" se refiere a cualquier antígeno que es reconocido por un linfocito T CD4+ y desencadena una respuesta inmunitaria en este, p. ej., un antígeno que es reconocido específicamente por un receptor de linfocitos T en un linfocito T CD4+ por medio de la presentación del antígeno o una porción de este que se une a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de Clase II. La expresión "antígeno de linfocitos T CD8+" se refiere a cualquier antígeno que es reconocido por un linfocito T CD8+ y desencadena una respuesta inmunitaria en este, p. ej., un antígeno que es reconocido específicamente por un receptor de linfocitos T en un linfocito T CD8+ por medio de la presentación del antígeno o una porción de este que se une a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I. La expresión "antígeno restringido por CD1d" se refiere a un antígeno que comprende uno o más epítopos que se unen a moléculas CD1d, forman complejos con estas o son presentados por ellas. Por lo general, los antígenos de linfocitos T restringidos por CD1d son lípidos presentados a linfocitos NKT invariantes. Los antígenos de linfocitos T restringidos por CD1d pueden comprender uno o más lípidos o glicolípidos incluidos, sin carácter limitante: a-galactosilceramida (a-GalCer), glicoesfingolípidos unidos en a (de Sphingomonas spp.), galactosil diacilgliceroles (de Borrelia burgdorferi), lipofosfoglicano (de Leishmania donovani), ß-glucosilceramida endógena o exógena y fosfatidilinositol tetramanosida (PIM4) (de Mycobactenum leprae). Para consultar lípidos y/o glicolípidos adicionales útiles como antígenos de restringidos por CD1d, remítase a V. Cerundolo et al., "Harnessing invariant NKT cells in vaccination strategies". Nature Rev Immun, 9:28-38 (2009). En algunas realizaciones, un antígeno que es un antígeno de linfocitos T también es un antígeno de linfocitos B. En otras realizaciones, el antígeno de linfocitos T no es además un antígeno de linfocitos B. Los antígenos de linfocitos T son generalmente proteínas o péptidos, pero pueden ser otras moléculas tales como lípidos y glicolípidos.
La expresión "proteína terapéutica" se refiere a cualquier proteína o terapia a base de proteínas que se puede administrar a un sujeto y ejerce un efecto terapéutico. Tales terapias incluyen las terapias de reemplazo proteico y suplemento proteico. Tales terapias también incluyen la administración de una proteína exógena o externa, terapias con anticuerpos y terapias celulares o a base de células. Las proteínas terapéuticas incluyen enzimas, cofactores enzimáticos, hormonas, factores de coagulación sanguínea, citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. En otras secciones de la presente se proporcionan ejemplos de otras proteínas terapéuticas. Las proteínas terapéuticas se pueden producir en, sobre o mediante células y se pueden obtener a partir de tales células o se pueden administrar en forma de tales células. En las realizaciones, la proteína terapéutica se produce en, sobre o mediante células de mamíferos, células de insectos, células de levaduras, células de bacterias, células de plantas, células de animales transgénicos, células de plantas transgénicas, etc. La proteína terapéutica se puede producir recombinantemente en tales células. La proteína terapéutica se puede producir en, sobre o mediante una célula transformada víricamente. La proteína terapéutica también se puede producir en, sobre o mediante células autólogas que han sido transfectadas, transducidas o manipuladas de otro modo para expresarla. Como alternativa, la proteína terapéutica se puede administrar como un ácido nucleico o mediante la introducción de un ácido nucleico en un virus, VLP (siglas en inglés de partícula pseudovírica), liposoma, etc. Como alternativa, la proteína terapéutica se puede obtener a partir de tales formas y se puede administrar como la propia proteína terapéutica. Por lo tanto, los sujetos incluyen cualquier sujeto que ha recibido, esté recibiendo o recibirá cualquiera de los elementos anteriores. Tales sujetos incluyen sujetos que han recibido, estén recibiendo o recibirán terapia génica, células autólogas que han sido transfectadas, transducidas o manipuladas de otro modo para expresar una proteína terapéutica, polipéptido o péptido; o células que expresan una proteína terapéutica, polipéptido o péptido.
La expresión "antígeno de proteína terapéutica" se refiere a un antígeno que está asociado con una proteína terapéutica o una porción de este que puede ser presentado para su reconocimiento por parte de células del sistema inmunitario y puede generar una respuesta inmunitaria no deseada (p. ej., la producción de anticuerpos específicos para la proteína terapéutica) contra la proteína terapéutica. Los antígenos de proteínas terapéuticas incluyen generalmente proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas o están contenidos o expresados en, sobre o por células.
La expresión "respuesta inmunitaria tolerogénica" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria que puede conducir a la supresión inmunitaria específica para un antígeno o una célula, tejido, órgano, etc. que exprese dicho antígeno. Tales respuestas inmunitarias incluyen cualquier reducción, retraso o inhibición de una respuesta inmunitaria deseada específica para el antígeno o célula, tejido, órgano, etc. que exprese dicho antígeno. Tales respuestas inmunitarias también incluyen cualquier estimulación, producción, inducción, promoción o atracción de una respuesta inmunitaria deseada específica para el antígeno o célula, tejido, órgano, etc. que exprese dicho antígeno. Por lo tanto, las respuestas inmunitarias tolerogénicas incluyen la ausencia o la reducción de una respuesta inmunitaria no deseada a un antígeno que puede ser mediada por células sensibles al antígeno así como también la presencia o promoción de células supresoras. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas proporcionadas en la presente incluyen la inmunotolerancia. La expresión "generar una respuesta inmunitaria tolerogénica" se refiere a la generación de cualquiera de las respuestas inmunitarias anteriores específicas para un antígeno o célula, tejido, órgano, etc. que exprese dicho antígeno. La respuesta inmunitaria tolerogénica puede ser el resultado de la presentación restringida por MHC de clase I y/o la presentación restringida por MHC de clase II y/o la presentación de linfocitos B y/o la presentación por parte de CD1d, etc.
Las respuestas inmunitarias tolerogénicas incluyen cualquier reducción, retraso o inhibición de la proliferación y/o actividad de linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ o linfocitos B. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también incluyen una reducción de la producción de anticuerpos específicos para el antígeno. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también pueden incluir cualquier respuesta que produzca la estimulación, inducción, producción o atracción de células reguladoras tales como linfocitos Treg CD4+, linfocitos Treg CD8+, linfocitos Breg, etc. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria tolerogénica es aquella que provoca la conversión en un fenotipo regulador caracterizado por la producción, inducción, estimulación o atracción de células reguladoras.
Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también incluyen cualquier respuesta que provoque la estimulación, producción o atracción de linfocitos Treg CD4+ y/o linfocitos Treg CD8+. Los linfocitos Treg CD4+ pueden expresar el factor de transcripción FoxP3 e inhibir respuestas inflamatorias y enfermedades inflamatorias autoinmunitarias (Human regulatory T cells in autoimmune diseases. Cvetanovich GL, Hafler DA. Curr Opin Immunol. Diciembre de 2010;22(6):753-60. Regulatory T cells and autoimmunity. Vila J, Isaacs JD, Anderson AE. Curr Opin Hematol. Julio de 2009;16(4):274-9). Tales células también suprimen la ayuda de los linfocitos T a los linfocitos B e inducen tolerancia tanto a antígenos exógenos como endógenos (Therapeutic approaches to allergy and autoimmunity based on FoxP3+ regulatory T-cell activation and expansión. Miyara M, Wing K, Sakaguchi S. J Allergy Clin Immunol. Abril de 2009;123(4):749-55). Los linfocitos Treg CD4+ reconocen el antígeno cuando este es presentado por proteínas de clase II en las APC. Los linfocitos Treg CD8+, que reconocen el antígeno presentado por la clase I (y Qa-1), también pueden suprimir la ayuda de los linfocitos T a los linfocitos B y provocan la activación de la supresión específica para el antígeno induciendo tolerancia tanto a antígenos exógenos como endógenos. Se ha demostrado que la disrupción de la interacción de Qa-1 con los linfocitos Treg CD8+ altera las respuestas inmunitarias y provoca el desarrollo de la formación de autoanticuerpos y un lupus eritematoso sistémico letal autoinmunitario (Kim et al., Nature. 16 de septiembre de 2010, 467 (7313): 328-32). También se ha demostrado que los linfocitos Treg CD8+ inhiben modelos de enfermedades inflamatorias autoinmunitarias que incluyen la artritis reumatoide y la colitis (CD4+CD25+ regulatory T cells in autoimmune arthritis. Oh S, Rankin AL, Catón AJ. Immunol Rev. Enero de 2010;233(1):97-111. Regulatory T cells in inflammatory bowel disease. Boden EK, Snapper SB. Curr Opin Gastroenterol. Noviembre de 2008;24(6):733-41. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas pueden producir de forma eficaz ambos tipos de respuestas (CD4+ Treg y CD8+ Treg). En otras realizaciones, se puede inducir FoxP3 en otras células ¡nmunitarias, tales como macrófagos, linfocitos iNKT, etc. y las composiciones proporcionadas en la presente también pueden provocar una o más de estas respuestas.
Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también incluyen, sin carácter limitante, la inducción de citocinas reguladoras, tales como citocinas Treg; la inducción de citocinas inhibitorias; la inducción de citocinas inflamatorias (p. ej., IL-4, IL-1b, IL-5, TNF-a, IL-6, GM-CSF, IFN-?, IL-2, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21 , IL-22, IL-23, M-CSF, proteína C reactiva, proteína de fase aguda, quimiocinas (p. ej., MCP-1, RANTES, ???-1a, ???-1ß, MIG, ITAC o IP-10), la producción de citocinas antiinflamatorias (p. ej., IL-4, IL-13, IL-10, etc.), quimiocinas (p. ej., CCL-2, CXCL8), proteasas (p. ej., MMP-3, MMP-9), leucotrienos (p. ej., CysLT-1 , CysLT-2), prostaglandinas (p. ej., PGE2) o histaminas; la inhibición de la polarización para obtener una respuesta inmunitaria de Th17, Th1 o Th2; la inhibición de citocinas específicas para las células efectoras: Th17 (p. ej., IL-17, IL-25), Th1 (IFN-?), Th2 (p. ej., IL-4, IL- 13); la inhibición de factores de transcripción específicos para Th1 , Th2 o TH17; la inhibición de la proliferación de linfocitos T efectores; la inducción de la apoptosis de linfocitos T efectores; la inducción de genes específicos para células dendríticas tolerogénicas, la inducción de la expresión de FoxP3, la inhibición de la inducción de IgE o respuestas inmunitarias mediadas por IgE; la inhibición de respuestas de anticuerpos (p. ej., producción de anticuerpos específicos para el antígeno); la inhibición de la respuesta de linfocitos T cooperadores; la producción de TGF-ß y/o IL-10; la inhibición de la función efectora de autoanticuerpos (p. ej., la inhibición de la reducción del número de células, lesión celular o tisular o activación del complemento); etc.
Cualquiera de las respuestas anteriores se puede medir in vivo en uno o más modelos en animales o se puede medir in vitro. Un experto en la técnica estará familiarizado con tales mediciones in vitro o in vivo. Las respuestas inmunitarias no deseadas o respuestas inmunitarias tolerogénicas se puede monitorizar utilizando, por ejemplo, métodos para determinar el número y/o la función de las células inmunitarias, análisis de tetrámeros, ELISPOT, análisis basado en citometría de flujo de la expresión de citocinas, secreción de citocinas, obtención del perfil de expresión de citocinas, obtención del perfil de expresión génica, obtención del perfil de expresión proteica, análisis de marcadores de la superficie celular, detección basada en PCR del uso de genes receptores de células inmunitarias (remítase a T. Clay et al., "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cáncer" Clinical Cáncer Research 7:1127-1135 (2001)), etc. Las respuestas inmunitarías no deseadas o respuestas inmunitarias tolerogénicas también se pueden monitorizar utilizando, por ejemplo, métodos para determinar los niveles proteicos en plasma o suero, ensayos de la función y/o proliferación de las células inmunitarias, etc. En algunas realizaciones, las respuestas inmunitarias tolerogénicas se pueden monitorizar evaluando la inducción de FoxP3. Además, en los Ejemplos se describen métodos específicos más detalladamente.
Preferentemente, las respuestas inmunitarias tolerogénicas provocan la inhibición del desarrollo, el avance o la patología de las enfermedades, trastornos o afecciones descritos en la presente. El que las composiciones de la invención puedan provocar o no la inhibición del desarrollo, el avance o la patología de las enfermedades, trastornos o afecciones descritos en la presente se puede medir con modelos en animales de tales enfermedades, trastornos o afecciones.
En algunas realizaciones, la reducción de una respuesta inmunitaria no deseada o la generación de una respuesta inmunitaria tolerogénica se puede evaluar determinando variables de evaluación clínica, la eficacia clínica, síntomas clínicos, biomarcadores de la enfermedad y/o puntajes clínicos. Las respuestas inmunitarias no deseadas o respuestas inmunitarias tolerogénicas también se pueden evaluar con pruebas de diagnóstico para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad, trastorno o afección como los proporcionados en la presente. Las respuestas inmunitarias no deseadas también se pueden evaluar mediante métodos de medición de los niveles y/o la función de proteínas terapéuticas en un sujeto. En las realizaciones, los métodos para monitorizar o evaluar respuestas alérgicas no deseadas incluyen evaluar una respuesta alérgica en un sujeto por su reactividad cutánea y/o producción de anticuerpos específicos para alérgeno.
En algunas realizaciones, la monitorización o evaluación de la generación de una respuesta inmunitaria no deseada o una respuesta inmunitaria tolerogénica en un sujeto puede ser antes de la administración de una composición de nanoportadores sintéticos proporcionada en la presente y/o antes de la administración de un injerto trasplantable o una proteína terapéutica o la exposición a un alérgeno. En otras realizaciones, la evaluación de la generación de una respuesta inmunitaria no deseada o una respuesta inmunitaria tolerogénica puede ser después de la administración de una composición de nanoportadores sintéticos proporcionada en la presente y/o después de la administración de un injerto trasplantable o una proteína terapéutica o la exposición a un alérgeno. En algunas realizaciones, la evaluación se lleva a cabo después de la administración de la composición de nanoportadores sintéticos, pero antes de la administración de un injerto trasplantable o una proteína terapéutica o la exposición a un alérgeno. En otras realizaciones, la evaluación se lleva a cabo después de la administración un injerto trasplantable o una proteína terapéutica o la exposición a un alérgeno, pero antes de la administración de la composición. En otras realizaciones más, la evaluación se lleva a cabo tanto antes de la administración de los nanoportadores sintéticos como la administración de un injerto trasplántatele o una proteína terapéutica o la exposición a un alérgeno, mientras que en otras realizaciones adicionales, la evaluación se lleva a cabo tanto después de la administración de los nanoportadores sintéticos como de la administración de un injerto trasplantare o una proteína terapéutica o la exposición a un alérgeno. En otras realizaciones, la evaluación se lleva a cabo tanto antes como después de la administración de los nanoportadores sintéticos y/o la administración de un injerto trasplantare o una proteína terapéutica o la exposición a un alérgeno. En otras realizaciones más, la evaluación se lleva a cabo más de una vez en el sujeto para determinar si se mantiene un estado inmunitario deseable en el sujeto, tal como un sujeto que padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una alergia, el rechazo de un órgano o tejido, o la enfermedad del injerto contra el huésped. Otros sujetos incluyen aquellos que han sido sometidos o se someterán a un trasplante así como también aquellos que han recibido, están recibiendo o recibirán una proteína terapéutica contra la cual han experimentado, están experimentando o cabe esperar que experimenten una respuesta inmunitari no deseada.
Una respuesta de anticuerpos se puede evaluar determinando una o más titulaciones de anticuerpos. La expresión "titulación de anticuerpos" se refiere a un nivel medible de producción de anticuerpos. Los métodos para medir las titulaciones de anticuerpos son muy conocidos en la técnica e incluyen el enzimoinmunoensayo (ELISA). En las realizaciones, la respuesta de anticuerpos se puede cuantificar, por ejemplo, como el número de anticuerpos, la concentración de anticuerpos o la titulación. Los valores pueden ser absolutos o pueden ser relativos. Los ensayos para cuantificar una respuesta de anticuerpos incluyen los ensayos de captura de anticuerpos, enzimoinmunoensayos (ELISA), ensayos de inhibición de la absorción en fase líquida (ILPAA), ensayos de inmunoelectroforesis en cohete (RIE) y ensayos de inmunoelectroforesis en línea (LIE). Cuando una respuesta de anticuerpos se compara con otra respuesta de anticuerpos, es preferible utilizar el mismo tipo de valor cuantitativo (p. ej., titulación) y método de medición (p. ej., ELISA) para realizar la comparación.
Un método ELISA para medir una titulación de anticuerpos, por ejemplo, un ELISA de tipo sándwich típico, puede consistir en los siguientes pasos: (i) preparar un material de revestimiento de placas de ELISA de modo tal que la diana del anticuerpo de interés se acople a un sustrato polimérico u otro material adecuado (ii) preparar el material de revestimiento en una solución acuosa (tal como PBS) e introducir la solución del material de revestimiento en los pocilios de una placa de múltiples pocilios para que el revestimiento se deposite sobre la placa de múltiples pocilios durante la noche (iii) lavar minuciosamente la placa de múltiples pocilios con tampón de lavado (tal como Tween-20 al 0.05% en PBS) para eliminar el material de revestimiento en exceso (iv) bloquear la placa para la unión no específica aplicando una solución diluyente (tal como suero fetal bovino al 10% en PBS), (v) retirar la solución de bloqueo/diluyente de la placa lavando con tampón de lavado (vi) diluir la muestra o las muestras séricas que contienen anticuerpos y los estándares adecuados (controles positivos) con diluyente según se requiera para obtener una concentración que sature de forma adecuada la respuesta de ELISA (vii) diluir en serie las muestras de plasma en la placa de múltiples pocilios de modo que se abarque un rango de concentraciones adecuado para generar una curva de respuesta de ELISA (viii) incubar la placa para que se produzca la unión del anticuerpo-diana (ix) lavar la placa con tampón de lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan unido al antígeno (x) añadir una concentración adecuada de un anticuerpo de detección secundario en el mismo diluyente tal como un anticuerpo de detección acoplado a biotina capaz de unirse al anticuerpo primario (xi) incubar la placa con el anticuerpo de detección aplicado y a continuación lavar con tampón de lavado (xii) añadir una enzima tal como estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) que se unirá a la biotina que se encuentra en los anticuerpos biotinilados e incubar (xiii) lavar añadir sustrato(s) (tal la placa de múltiples pocilios (xiv) como solución de TMB) a la placa (xv) aplicar una solución de parada (tal como ácido sulfúrico 2 N) cuando haya finalizado el desarrollo de color (xvi) realizar una lectura de la densidad óptica de los pocilios de la placa a una longitud de onda específica para el sustrato (450 nm con sustracción de las lecturas a 570 nm) (xvi) aplicar un ajuste de curvas multiparamétrico adecuado a los datos y definir la concentración efectiva media(es) (CE5o) como la concentración en la curva en la que consigue la mitad del valor de la DO máxima para los estándares de la placa.
La expresión "injerto trasplantable" se refiere a un material biológico, tal como células, tejidos y órganos (enteros o en parte), que se puede administrar a un sujeto. Los injertos trasplantares pueden ser autoinjertos, aloinjertos o xenoinjertos de, por ejemplo, un material biológico tal como un órgano, tejido, piel, hueso, nervios, tendón, neuronas, vasos sanguíneos, grasa, córnea, células pluripotentes, células diferenciadas (obtenidas o derivadas in vivo o in vitró), etc. En algunas realizaciones, un injerto trasplantable se forma, por ejemplo, a partir de cartílago, hueso, matriz extracelular o matrices de colágeno. Los injertos trasplantares también pueden ser células individuales, suspensiones de células y células en tejidos y órganos que pueden ser trasplantadas. Las células trasplantares normalmente tienen una función terapéutica, por ejemplo, una función reducida en un sujeto receptor o de la que este carece. Algunos ejemplos no limitantes de células trasplantabas son células ß, hepatocitos, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales, neuronas, células gliales o células mielinizantes. Las células trasplantares pueden ser células que no estén modificadas, por ejemplo, células obtenidas a partir de un sujeto donante y que se pueden usar en trasplantes sin ninguna modificación genética o epigenética. En otras realizaciones, las células trasplantabas pueden ser células modificadas, por ejemplo, células obtenidas a partir de un sujeto portador de un defecto genético en las que el defecto genético ha sido corregido, o células que se derivan de células reprogramadas, por ejemplo, células diferenciadas derivadas de células obtenidas a partir de un sujeto.
El término "trasplante" se refiere al proceso de transferir (desplazar) un injerto trasplantable a un sujeto receptor (p. ej., desde un sujeto donante, desde una fuente in vitro (p. ej., células autólogas diferenciadas o nativas heterólogas o pluripotentes inducidas)) y/o desde una parte del cuerpo hasta otra parte del cuerpo en el mismo sujeto.
La expresión "respuesta inmunitaria no deseada" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria no deseada que es el resultado de la exposición a un antígeno, fomenta o agrava una enfermedad, trastorno o afección proporcionada en la presente (o uno de sus síntomas), o es sintomática de una enfermedad, trastorno o afección proporcionada en la presente. Tales respuestas inmunitarias generalmente ejercen un impacto negativo sobre la salud de un sujeto o son sintomáticas de un impacto negativo sobre la salud de un sujeto.
C. Composiciones de la Invención En la presente se proporcionan composiciones de nanoportadores sintéticos e inmunosupresores que cuando se administran a un sujeto pueden provocar efectos inmunosupresores. Preferentemente, las composiciones también comprenden un antígeno y el efecto inmunosupresor es específico para el antígeno y, por lo tanto, se trata de un efecto tolerogénico. Tales composiciones pueden provocar cualquiera de las respuestas tolerogénicas proporcionadas en la presente, tales como la estimulación, inducción, producción o atracción de células reguladoras (p. ej., linfocitos Treg CD4+ y/o linfocitos Treg CD8+). En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria tolerogénica es aquella que produce la conversión en un fenotipo regulador caracterizado por la producción, inducción, estimulación o atracción de células reguladoras (p. ej., linfocitos Treg).
Tal como se ha mencionado anteriormente, los nanoportadores sintéticos están diseñados para comprender inmunosupresores y, en algunas realizaciones, un antígeno contra el cual se desea obtener un efecto tolerogénico. Se pueden utilizar una amplia variedad de nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos son esferas o esferoides. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos son planos o en forma de placa. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos son cubos o cúbicos. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos son óvalos o elipses. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos son cilindros, conos o pirámides.
En algunas realizaciones, es deseable utilizar una población de nanoportadores sintéticos que sea relativamente uniforme en cuanto al tamaño, la forma y/o la composición, de modo que cada nanoportador sintético tenga propiedades similares. Por ejemplo, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95% de los nanoportadores sintéticos, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos, puede tener una dimensión mínima o dimensión máxima comprendida dentro de un 5%, 10% o 20% del diámetro medio o la dimensión media de los nanoportadores sintéticos. En algunas realizaciones, una población de nanoportadores sintéticos puede ser heterogénea con respecto al tamaño, la forma y/o la composición.
Los nanoportadores sintéticos pueden ser sólidos o estar huecos y pueden comprender una o más capas. En algunas realizaciones, cada capa tiene una composición única y propiedades únicas con respecto a la(s) otra(s) capa(s). Para proporcionar solamente un ejemplo, los nanoportadores sintéticos pueden tener una estructura de núcleo/cubierta, donde el núcleo es una capa (p. ej., un núcleo polimérico) y la cubierta es una segunda capa (p. ej., una monocapa o bicapa lipídica). Los nanoportadores sintéticos pueden comprender una pluralidad de capas diferentes.
En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más lípidos. En algunas realizaciones, un nanoportador sintético puede comprender un liposoma. En algunas realizaciones, un nanoportador sintético puede comprender una bicapa lipídica. En algunas realizaciones, un nanoportador sintético puede comprender una monocapa lipídica. En algunas realizaciones, un nanoportador sintético puede comprender una micela. En algunas realizaciones, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo que comprenda una matriz polimérica rodeada de una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). En algunas realizaciones, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo no polimérico (p. ej., partícula metálica, punto cuántico, partícula de cerámica, partícula ósea, partícula vírica, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, etc.) rodeado de una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.).
En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos no comprenden ningún componente polimérico. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden comprender partículas metálicas, puntos cuánticos, partículas cerámicas, etc. En algunas realizaciones, un nanoportador sintético no polimérico es un agregado de componentes no poliméricos, tal como un agregado de átomos metálicos (p. ej., átomos de oro).
En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente una o más entidades anfifílicas. En algunas realizaciones, una entidad anfifílica puede propiciar la producción de nanoportadores sintéticos con mayor estabilidad, uniformidad mejorada o mayor viscosidad. En algunas realizaciones, las entidades anfifílicas pueden asociarse con la superficie interior de una membrana lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). Muchas entidades anfifílicas conocidas en la técnica son adecuadas para ser utilizadas en la preparación de nanoportadores sintéticos de acuerdo con la presente invención. Dichas entidades anfifílicas incluyen, sin carácter limitante, fosfoglicéridos; fosfatidilcolinas; dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE); dioleiloxipropiltrietilamonio (DOTMA); dioleoilfosfatidilcolina; colesterol; éster de colesterol; diacilglicerol; succinato de diacilglicerol; difosfatidilglicerol (DPPG); hexanodecanol; alcoholes grasos tales como polietilenglicol (PEG); éter polioxietilen-9-laurílico; un ácido graso tensioactivo, tal como ácido palmítico o ácido oleico; ácidos grasos; monoglicéridos de ácidos grasos; diglicéridos de ácidos grasos; amidas de ácidos grasos; glicocolato de trioleato de sorbitán (Span®85); monolaurato de sorbitán (Span®20); polisorbato 20 (Tween®20); polisorbato 60 (Tween®60); polisorbato 65 (Tween®65); polisorbato 80 (Tween®80); polisorbato 85 (Tween®85); monoestearato de polioxietileno; surfactina; un poloxómero; un éster de ácido graso de sorbitán tal como trioleato de sorbitán; lecitina; lisolecitina; fosfatidilserina; fosfatidilinositol; esfingomielina; fosfatidiletanolamina (cefalina); cardiolipina; ácido fosfatídico; cerebrósídos; fosfato de dicetilo; dipalmitoilfosfatidilglicerol; estearilamina; dodecilamina; hexadecilamina; palmitato de acetilo; ricinoleato de glicerol; estearato de hexadecilo; miristato de isopropilo; tiloxapol; polietilenglicol 5000-fosfatidiletanolamina; monoestearato de polietilenglicol 400; fosfolípidos; detergentes sintéticos y/o naturales que tienen buenas propiedades tensioactivas; desoxicolatos; ciclodextrinas; sales caotrópicas; agentes de apareamiento iónico y combinaciones de estos. Un componente de la entidad anfifílica puede ser una mezcla de entidades anfifílicas diferentes. Los expertos en la técnica reconocerán que se trata de una lista ilustrativa, pero no exhaustiva, de sustancias con actividad tensioactiva. Puede utilizarse cualquier entidad anfifílica en la producción de nanoportadores sintéticos que se han de utilizar de acuerdo con la presente invención.
En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más carbohidratos. Los carbohidratos pueden ser naturales o sintéticos. Un carbohidrato puede ser un carbohidrato natural derivatizado. En ciertas realizaciones, un carbohidrato comprende un monosacárido o disacárido, incluidos, sin carácter limitante, glucosa, fructosa, galactosa, ribosa, lactosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, celbiosa, mañosa, xilosa, arabinosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galatosamina y ácido neurámico. En ciertas realizaciones, un carbohidrato es un polisacárido, incluidos, sin carácter limitante, pululano, celulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxicelulosa (HC), metilcelulosa (MC), dextrano, ciclodextrano, glicógeno, hidroxietilalmidón, carragenina, glicón, amilosa, quitosano, N,0-carboxilmetilquitosano, algina y ácido algínico, almidón, quitina, inulina, konjac, glucomanán, pustulán, heparina, ácido hialurónico, curdlano y xantano. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención no comprenden (o excluyen específicamente) carbohidratos tales como un polisacárido. En ciertas realizaciones, el carbohidrato puede comprender un derivado de un carbohidrato tal como un alcohol de un azúcar, incluidos, sin carácter limitante, manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, maltitol y lactitol.
En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden comprender uno o más polímeros. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que se tratan de un polímero Pluronic no terminado en metoxi. En algunas realizaciones, al menos un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que constituyen los nanoportadores sintéticos son polímeros Pluronic no terminados en metoxi. En algunas realizaciones, todos los polímeros que constituyen los nanoportadores sintéticos son polímeros Pluronic no terminados en metoxi. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que se tratan de un polímero no terminado en metoxi. En algunas realizaciones, al menos un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que constituyen los nanoportadores sintéticos son polímeros no terminados en metoxi. En algunas realizaciones, todos los polímeros que constituyen los nanoportadores sintéticos son polímeros no terminados en metoxi. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que no comprenden un polímero Pluronic. En algunas realizaciones, al menos un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que constituyen los nanoportadores sintéticos no comprenden un polímero Pluronic. En algunas realizaciones, todos los polímeros que constituyen los nanoportadores sintéticos no comprenden un polímero Pluronic. En algunas realizaciones, dicho polímero puede estar rodeado por una capa de recubrimiento (p. ej., liposoma, monocapa lipídica, micela, etc.). En algunas realizaciones, varios elementos de los nanoportadores sintéticos pueden acoplarse al polímero.
Los inmunosupresores y/o antígenos se pueden acoplar a los nanoportadores sintéticos mediante cualquiera de diversos métodos. En general, el acoplamiento puede ser el resultado de la unión entre los inmunosupresores y/o antígenos y los nanoportadores sintéticos. Esta unión puede hacer que los inmunosupresores y/o antígenos estén adheridos a la superficie de los nanoportadores sintéticos y/o contenidos dentro de (encapsulados por) los nanoportadores sintéticos. Sin embargo, en algunas realizaciones, los inmunosupresores y/o antígenos están encapsulados por los nanoportadores sintéticos como resultado de la estructura de los nanoportadores sintéticos en lugar de por la unión a los nanoportadores sintéticos. En las realizaciones preferidas, los nanoportadores sintéticos comprenden un polímero como los descritos en la presente, y los inmunosupresores y/o antígenos están acoplados al polímero.
Cuando el acoplamiento es el resultado de la unión entre los inmunosupresores y/o antígenos y los nanoportadores sintéticos, el acoplamiento puede tener lugar a través de un resto de acoplamiento. Un resto de acoplamiento puede ser cualquier resto a través del cual un inmunosupresor y/o antígeno se una a un nanoportador sintético. Tales restos incluyen enlaces covalentes, tales como un enlace de tipo amida o un enlace de tipo éster, así como también moléculas independientes que unen (covalentemente o no covalentemente) el inmunosupresor y/o antígeno al nanoportador sintético. Tales moléculas incluyen conectores o polímeros o una de sus unidades. Por ejemplo, el resto de acoplamiento puede comprender un polímero cargado al cual se une un inmunosupresor y/o antígeno electrostáticamente. Como otro ejemplo, el resto de acoplamiento puede comprender un polímero o una de sus unidades al cual está unido covalentemente.
En las realizaciones preferidas, los nanoportadores sintéticos comprenden un polímero como los proporcionados en la presente. Estos nanoportadores sintéticos pueden ser completamente poliméricos o pueden ser una mezcla de polímeros y otros materiales.
En algunas realizaciones, los polímeros de un nanoportador sintético se asocian para formar una matriz polimérica. En algunas de estas realizaciones, un componente, tal como un inmunosupresor o antígeno, puede estar asociado covalentemente con uno o más polímeros de la matriz polimérica. En algunas realizaciones, la asociación covalente está mediada por un conector. En algunas realizaciones, un componente puede estar asociado no covalentemente con uno o más polímeros de la matriz polimérica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un componente puede estar encapsulado dentro de una matriz polimérica, ser rodeados por esta y/o dispersarse en ella. Como alternativa o además, un componente puede estar asociado con uno o más polímeros de una matriz polimérica mediante interacciones hidrofóbicas, interacciones de carga, fuerzas de van der Waals, etc. Convencionalmente se conoce una amplia variedad de polímeros y métodos para formar matrices poliméricas a partir de estos.
Los polímeros pueden ser polímeros naturales o no naturales (sintéticos). Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros que comprenden dos o más monómeros. En cuanto a la secuencia, los copolímeros pueden ser aleatorios, en bloque o comprender una combinación de secuencias aleatorias y en bloque. Normalmente, los polímeros de acuerdo con la presente invención son polímeros orgánicos.
En algunas realizaciones, el polímero comprende un poliéster, policarbonato, poliamida o poliéter, o una de sus unidades. En otras realizaciones, el polímero comprende poli(etilenglicol) (PEG), polipropilenglicol, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o una policaprolactona, o una de sus unidades. En algunas realizaciones, se prefiere que el polímero sea biodegradable. Por lo tanto, en estas realizaciones, se prefiere que si el polímero comprende un poliéter, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o una de sus unidades, el polímero comprenda un copolímero en bloque de un poliéter y un polímero biodegradable, de modo que el polímero sea biodegradable. En otras realizaciones, el polímero no comprende únicamente un poliéter o una de sus unidades, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o una de sus unidades.
Otros ejemplos de polímeros adecuados para utilizar en la presente invención incluyen, sin carácter limitante, polietilenos, policarbonatos (p. ej., poli(1 ,3-dioxan-2-ona)), polianhídrldos (p. ej., anhídrido pollsebácico), polipropilfumeratos, poliamidas (p. ej., policaprolactama), poliacetales, poliéteres, poliésteres (p. ej., poliláctido, poliglicólido, poliláctido-co-glicólido, policaprolactona, ácido polihidroxi (p. ej., poli(P-hidroxialcanoato)), poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliureas, poliestirenos y poliaminas, polilisina, copolímeros de polilisina-PEG, y poli(etilenimina), copolímeros de poli(etilenimina)-PEG.
En algunas realizaciones, los polímeros de acuerdo con la presente invención incluyen los polímeros que han sido aprobados para su uso en humanos por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA) en virtud de la sección 177.2600 del título 21 del Código de Reglamentos Federales e incluyen, sin carácter limitante, poliésteres (p. ej., ácido poliláctico, pol'i(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona, polivalerolactona, poli(1 ,3-dioxan-2-ona)); polianhídridos (p. ej., poli(anhídrido sebácico)); poliéteres (p. ej., polietilenglicol); poliuretanos; polimetacrilatos; poliacrilatos; y policianoacrilatos.
En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser hidrófilos. Por ejemplo, los polímeros pueden comprender grupos aniónicos (p. ej., grupo fosfato, grupo sulfato, grupo carboxilato); grupos catiónicos (p. ej., grupo de amina cuaternaria); o grupos polares (p. ej., grupo hidroxilo, grupo tiol, grupo amina). En algunas realizaciones, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrófila genera un entorno hidrófilo dentro del nanoportador sintético. En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser hidrófobos. En algunas realizaciones, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrófoba genera un entorno hidrófobo dentro del nanoportador sintético. La selección de la hidrofilicidad o hidrofobicidad del polímero puede afectar a la naturaleza de los materiales que se incorporen (p. ej., se acoplen) dentro del nanoportador sintético.
En algunas realizaciones, los polímeros pueden modificarse con uno o más restos y/o grupos funcionales. Se pueden emplear varios restos o grupos funcionales de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, los polímeros se pueden modificar con polietilenglicol (PEG), con un carbohidrato y/o con poliacetales acíclicos derivados de polisacáridos (Papisov, 2001 , Serie de Congresos de la ACS, 786:301). Ciertas realizaciones se pueden preparar empleando los conocimientos generales que se describen en la Patente de EE. UU. N.° 5543158 concedida a Gref et al. o la publicación WO WO2009/051837 de Von Andrian et al.
En algunas realizaciones, los polímeros se pueden modificar con un grupo de tipo ácido graso o lípido. En algunas realizaciones, un grupo de tipo ácido graso puede ser uno o más de los siguientes: ácido butírico, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behénico o lignocérico. En algunas realizaciones, un grupo de tipo ácido graso puede ser uno o más de los siguientes: ácido palmitoleico, oleico, vaccénico, linoleico, alfa-linoleico, gamma-linoleico, araquidónico, gadoleico, araquidónico, eicosapentaenoico, docosahexaenoico o erúcico.
En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser poliésteres, incluidos los copolímeros que comprenden unidades de ácido láctico y ácido glicólico, tales como poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) y poli(láctido-co-glicólido), denominados colectivamente en la presente "PLGA"; y homopolímeros que comprenden unidades de ácido glicólico, denominados en la presente "PGA", y unidades de ácido láctico, tales como ácido poli-L-láctico, ácido poli-D-láctico, ácido poli-D,L-láctico, poli-L-láctido, poli-D-láctido y poli-D,L-láctido, denominados colectivamente en la presente "PLA". En algunas realizaciones, los poliésteres ilustrativos incluyen, por ejemplo, polihidroxiácidos; copolímeros de PEG y copolímeros de láctido y glicólido (p. ej., copolímeros de PLA-PEG, copolímeros de PGA-PEG, copolímeros de PLGA-PEG y derivados de estos. En algunas realizaciones, los poliésteres incluyen, por ejemplo, poli(caprolactona), copolímeros de poli(caprolactona)-PEG, poli(L-láctido-co-L-lisina), poli(éster de serina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico] y derivados de estos.
En algunas realizaciones, un polímero puede ser PLGA. PLGA es un copolímero biocompatible y biodegradable de ácido láctico y ácido glicólico, y varias formas de PLGA se caracterizan por la proporción de ácido láctico:ácido glicólico. El ácido láctico puede ser ácido L-láctico, ácido D-láctico o ácido D, L-láctico. La tasa de degradación del PLGA puede ajustarse alterando la proporción de ácido láctico:ácido glicólico. En algunas realizaciones, el PLGA que se ha de utilizar de acuerdo con la presente invención se caracteriza por una proporción de ácido láctico:ácido glicólico de aproximadamente 85:15, aproximadamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75 o aproximadamente 15:85.
En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser uno o más polímeros acrílicos. En ciertas realizaciones, los polímeros acrílicos incluyen, por ejemplo, copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), copolímero de alquilamida de ácido metacrílico, poli(metacrilato de metilo), poli(anhídrido de ácido metacrílico), metacrilato de metilo, polimetacrilato, copolímero de poli(metacrilato de metilo), poliacrilamida, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, copolímeros de metacrilato de glicidilo, policianoacrilatos y combinaciones que comprenden uno o más de los polímeros precedentes. El polímero acrílico puede comprender copolímeros totalmente polimerizados de ésteres de ácido acrílico y metacrílico con un bajo contenido de grupos amonio cuaternario.
En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser polímeros catiónicos. En general, los polímeros catiónicos son capaces de condensar y/o proteger hebras de ácidos nucleicos con carga negativa (p. ej., ADN o sus derivados). Los polímeros que contienen amina, tales como los dendrímeros de poli(lísina) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; y Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), poli(etilenimina) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297) y poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; y Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) están cargados positivamente a pH fisiológico, forman pares iónicos con ácidos nucleicos y median la transfección en varias líneas celulares. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención pueden no comprender (o pueden excluir) polímeros catiónicos.
En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser poliésteres degradables que contienen cadenas laterales catiónicas (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 :5633, y Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). Los ejemplos de estos poliésteres incluyen poli(L-láctido-co-L-lisina) (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010), poli(éster de serina) (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 :5633) y pol¡(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim etal., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633).
Las propiedades de estos y otros polímeros y los métodos para prepararlos son muy conocidos en la técnica (remítase, por ejemplo, a las Patentes de EE. UU. 6,123,727, 5,804,178, 5,770,417, 5,736,372, 5,716,404, 6,095,148, 5,837,752, 5,902,599, 5,696,175, 5,514,378, 5,512,600, 5,399,665, 5,019,379, 5,010,167, 4,806,621 , 4;638,045 y 4,946,929; Wang et al., 2001 , J. Am. Chem. Soc, 123:9480; Lim ef al., 2001 , J. Am. Chem. Soc, 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Reléase, 62:7; y Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). De forma más general, se describen varios métodos para sintetizar ciertos polímeros adecuados en Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. de Goethals, Pergamon Press, 1980; Principies of Polymerization de Odian, John Wiley & Sons, Cuarta Edición, 2004; Contemporary Polymer Chemistry de Allcock et al., Prentice-Hall, 1981 ; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; y en las Patentes de EE. UU. 6,506,577, 6,632,922, 6,686,446 y 6,818,732.
En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser polímeros lineales o ramificados. En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser dendrímeros. En algunas realizaciones, los polímeros pueden estar sustancialmente reticulados entre sí. En algunas realizaciones, los polímeros pueden estar sustancialmente exentos de reticulación. En algunas realizaciones, los polímeros pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención sin someterse a una etapa de reticulación. Se debe sobreentender además que los nanoportadores sintéticos de la invención pueden comprender copolímeros en bloque, copolímeros de injerto, combinaciones, mezclas y/o aductos de cualquiera de los polímeros anteriores y otros polímeros. Los expertos en la técnica reconocerán que los polímeros enumerados en la presente representan una lista ilustrativa, pero no exhaustiva, de los polímeros que pueden ser de utilidad de acuerdo con la presente invención.
Las composiciones de acuerdo con la invención comprenden nanoportadores sintéticos combinados con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como conservantes, tampones, solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Las composiciones se pueden preparar utilizando técnicas farmacéuticas convencionales de elaboración y formulación para obtener formas farmacéuticas útiles. En una realización, los nanoportadores sintéticos de la invención están suspendidos en solución salina estéril para su inyección junto con un conservante.
En las realizaciones, cuando se preparan nanoportadores sintéticos como portadores, los métodos para acoplar componentes a los nanoportadores sintéticos pueden resultar útiles. Si el componente es una molécula de bajo peso molecular, puede resultar beneficioso unir el componente a un polímero antes de acoplar los nanoportadores sintéticos. En las realizaciones, también puede resultar beneficioso preparar los nanoportadores sintéticos con grupos superficiales que se emplean para acoplar los componentes al nanoportador sintético mediante el uso de estos grupos superficiales en lugar de unir los componentes a un polímero y después emplear este conjugado polimérico en la construcción de los nanoportadores sintéticos.
En ciertas realizaciones, el acoplamiento puede ser un conector covalente. En las realizaciones, los péptidos de acuerdo con la invención se pueden acoplar covalentemente a la superficie externa a través de un conector de tipo 1 ,2,3-triazol formado mediante la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de grupos azido sobre la superficie del nanoportador con un antígeno o inmunosupresor que contiene un grupo alquino o mediante la reacción de cicloadición 1 ,3-d ¡polar de alquinos sobre la superficie del nanoportador con antígenos o inmunosupresores que contienen un grupo azido. Estas reacciones de cicloadición se llevan a cabo preferentemente en presencia de un catalizador de Cu(l) junto con un ligando de Cu(l) adecuado y un agente reductor para reducir el compuesto de Cu(ll) al compuesto de Cu(l) catalíticamente activo. Esta cicloadición de azida-alquino catalizada por Cu(l) (CuAAC) también se puede denominar reacción "click".
Además, el acoplamiento covalente puede comprender un conector covalente que comprende un conector de tipo amida, un conector de tipo disulfuro, un conector de tipo tioéter, un conector de tipo hidrazona, un conector de tipo hidrazida, un conector de tipo imina u oxima, un conector de tipo urea o tiourea, un conector de tipo amidina, un conector de tipo amina y un conector de tipo sulfonamida.
Un conector de tipo amida se forma mediante un enlace de tipo amida entre una amina en un componente, tal como el antígeno o inmunosupresor, y el grupo ácido carboxílico de un segundo componente, tal como el nanoportador. El enlace de tipo amida en el conector se puede obtener empleando cualquiera de las reacciones convencionales para formar enlaces de tipo amida con aminoácidos protegidos de forma adecuada y un ácido carboxílico activado tal como un éster activado con N-hidroxisuccinimida.
Un conector de tipo disulfuro se obtiene mediante la formación de un enlace de tipo disulfuro (S-S) entre dos átomos de azufre de la forma, por ejemplo, de R1-S-S-R2. Un enlace de tipo disulfuro se puede formar mediante el intercambio de un tiol de un antígeno o inmunosupresor que contiene un grupo tiol/mercaptano(-SH) con otro grupo tiol activado en un polímero o nanoportador, o un nanoportador que contiene grupos tiol/mercaptano con un antígeno o inmunosupresor que contiene un grupo tiol activado.
Un conector de tipo triazol, concretamente un 1 ,2,3-triazol de la forma y R2 pueden ser cualesquiera entidades químicas, se obtiene mediante la reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar de una azida unida a un primer componente, tal como el nanoportador, con un alquino terminal unido a un segundo componente, tal como el inmunosupresor o antígeno. La reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar se lleva a cabo con o sin un catalizador, preferentemente con un catalizador de Cu(l), que une los dos componentes a través de una función de tipo 1 ,2,3-triazol. Este tipo de química se describe detalladamente en Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41 (14), 2596, (2002) y Meldal et al., Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015 y a menudo se denomina reacción "click" o CuAAC.
En las realizaciones, se prepara un polímero que contiene un grupo azida o alquino terminal respecto a la cadena polimérica. A continuación, este polímero se utiliza para preparar un nanoportador sintético de manera tal que una pluralidad de los grupos alquino o azida se posicionen sobre la superficie de dicho nanoportador. Como alternativa, el nanoportador sintético se puede preparar mediante otra ruta y posteriormente se puede funcionalizar con grupos alquino o azida. El componente se prepara en presencia de un grupo alquino (si el polímero contiene una azida) o un grupo azida (si el polímero contiene un alquino). A continuación, se permite que el componente reaccione con el nanoportador mediante la reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar con o sin un catalizador, de este modo el componente se acopla covalentemente a la partícula a través de un conector de tipo 1 ,2,3-triazol 1 ,4-disustituido.
Un conector de tipo tioéter se obtiene mediante la formación de un enlace de tipo azufre-carbono (tioéter) en la forma, por ejemplo, de Ri-S-f¾. El tioéter se puede obtener mediante la alquilación de un grupo tiol/mercaptano (-SH) en un componente con un agrupo alquilante, tal como un haluro o un epóxido, en un segundo componente. Los conectores de tipo tioéter también se pueden formar mediante la adición de Michael de un grupo tiol/mercaptano en un componente a un grupo alqueno deficiente en electrones en un segundo componente que contiene un grupo maleimida o un grupo vinilsulfona como aceptor de Michael. De otro modo, los conectores de tipo tioéter se pueden preparar mediante la reacción radicalaria tiol-eno de un grupo tiol/mercaptano en un componente con un grupo alqueno en un segundo componente.
Un conector de tipo hidrazona se obtiene mediante la reacción de un grupo hidrazida en un componente con un grupo aldehído/cetona en el segundo componente.
Un conector de tipo hidrazida se forma mediante la reacción de un grupo hidrazina en un componente con un grupo ácido carboxílico en el segundo componente. Esta reacción se lleva a cabo generalmente utilizando una química similar a la de la formación del enlace de tipo amida, donde el ácido carboxílico se activa con un reactivo activante.
Un conector de tipo ¡mina u oxima se forma mediante la reacción de un grupo amina o /V-alcoxiamina (o aminooxi) en un componente con un grupo aldehido o cetona en el segundo componente.
Un conector de tipo urea o tiourea se prepara mediante la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo isocianato o tioisocianato en el segundo componente.
Un conector de tipo amidina se prepara mediante la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo imidoéster en el segundo componente.
Un conector de tipo amina se obtiene mediante la reacción de alquilación de un grupo amina en un componente con un grupo alquilante, tal como un grupo haluro, epóxido o éster sulfonato, en el segundo componente. Como alternativa, un conector de tipo amina también se puede obtener mediante la aminación reductiva de un grupo amina en un componente con un grupo aldehido o cetona en el segundo componente empleando un reactivo reductor adecuado, tal como cianoborohidruro de sodio o triacetoxiborohidruro de sodio.
Un conector de tipo sulfonamida se obtiene mediante la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo haluro de sulfonilo (tal como cloruro de sulfonilo) en el segundo componente.
Un conector de tipo sulfona se obtiene mediante la adición de Michael de un nucleófilo a una sulfona vinílica. La sulfona vinílica o el nucleófilo pueden estar sobre la superficie del nanoportador o unidos a un componente.
El componente también se puede conjugar con el nanoportador mediante métodos de conjugación no covalente. Por ejemplo, se puede conjugar un inmunosupresor o antígeno con carga negativa a un nanoportador con carga positiva mediante adsorción electrostática. También se puede conjugar un componente que contenga un ligando de metales a un nanoportador que contenga un complejo metálico mediante un complejo metal-ligando.
En las realizaciones, el componente se puede unir un polímero, por ejemplo, ácido poliláctico-bloque-polietilenglicol, antes de acoplar el nanoportador sintético, o se puede formar el nanoportador sintético con grupos reactivos o activables sobre su superficie. En el último caso, el componente se puede preparar con un grupo que sea compatible con la química de enlace presentada por la superficie del nanoportador sintético. En otras realizaciones, un componente peptídico se puede unir a VLP o liposomas empleando un conector adecuado. Un conector es un compuesto o reactivo capaz de acoplar dos moléculas entre sí. En una realización, el conector puede ser un reactivo homobifuncional o heterobifuncional como los descritos en Hermanson 2008. Por ejemplo, un nanoportador sintético de liposomas o VLP que contenga un grupo carboxílico sobre la superficie se puede tratar con un conector homobifuncional, dihidrazida adípica (ADH, pos sus siglas en inglés), en presencia de EDC para formar el nanoportador sintético correspondiente con el conector ADH. El nanoportador (NC, por sus siglas en inglés) sintético unido al conector ADH resultante se conjuga a continuación con un componente peptídico que contiene un grupo ácido a través del otro extremo del conector ADH en NC para producir el correspondiente conjugado peptídico de liposoma o VLP.
Para consultar descripciones detalladas de métodos de conjugación disponibles, remítase a Hermanson G T "Bioconjugate Techniques", 2.a edición, publicado por Academic Press, Inc., 2008. Además de la unión covalente, el componente se puede acoplar mediante adsorción a un nanoportador sintético preformado o se puede acoplar mediante encapsulación durante la formación del nanoportador sintético.
Cualquiera de los ¡nmunosupresores proporcionados en la presente se puede acoplar al nanoportador sintético. Los ¡nmunosupresores incluyen, sin carácter limitante, estatinas; inhibidores de mTOR, tales como la rapamicina o un análogo de la rapamicina; agentes señalizadores de TGF-ß; agonistas de los receptores de TGF-ß; inhibidores de la histona-deacetilasa (HDAC); corticosteroides; inhibidores de la función mitocondrial, tales como rotenona; Inhibidores de P38; inhibidores de NF-?ß; agonistas de los receptores de adenosina; agonistas de la prostaglandina E2; inhibidores de la fosfodiesterasa, tales como un inhibidor de la fosfodiesterasa 4; inhibidores de proteasomas; inhibidores de cinasas; agonistas de receptores acoplados a proteínas G; antagonistas de receptores acoplados a proteínas G; glucocorticoides; retinoides; inhibidores de citocinas; inhibidores de los receptores de citocinas; activadores de los receptores de citocinas; antagonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas; agonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas; inhibidores de la histona-deacetilasa; inhibidores de calcineurina; inhibidores de fosfatasas y ATP oxidados. Los inmunosupresores también incluyen IDO, vitamina D3, ciclosporina A, inhibidores de los receptores de aril-hidrocarburos, resveratrol, azatiopurina, 6-mercaptopurina, aspirina, ácido niflúmico, estriol, tripolide, interleucinas (p. ej., IL-1 , IL-10), ciclosporina A, citocinas que tienen como diana ARNip o receptores de citocinas y similares.
Los ejemplos de estatinas incluyen atorvastatina (LIPITOR®, TORVAST®), cerivastatina, fluvastatina (LESCOL®, LESCOL® XL), lovastatina (MEVACOR®, ALTOCOR®, ALTOPREV®), mevastatina (COMPACTIN®), pitavastatina (LIVALO®, PIAVA®), rosuvastatina (PRAVACHOL®, SELEKTINE®, LIPOSTAT®), rosuvastatina (CRESTOR®) y simvastatina (ZOCOR®, LIPEX®).
Los ejemplos de inhibidores de mTOR incluyen rapamicina y análogos de esta (p. ej., CCL-779, RAD001 , AP23573, C20-metalilrapamicina (C20-Marap), C16-(S)-butilsulfonamidorapamicina (C16-BSrap), C16-(S)-3-metilindolerapamicina (C16-iRap) (Bayle et al., Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (NVP-BEZ235), ácido crisofánico (crisofanol), deforolimus (MK-8669), everolimus (RAD0001), KU-0063794, PI-103, PP242, temsirolimus y WYE-354 (comercializado por Selleck, Houston, TX, EE. UU.).
Los ejemplos de agentes señalizadores de TGF-ß incluyen los ligados de TGF-ß (p. ej., activina A, GDF1 , GDF11 , proteínas morfogenéticas óseas, nodal, TGF-ß) y sus receptores (p. ej., ACVR1B, ACVR1C, ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, BMPR1A, BMPR1 B, TGFpRI, TGF RII), R-SMADS/co-SMADS (p. ej., SMAD1 , SMAD2, SMAD3, SMAD4, S AD5, SMAD8), e inhibidores de ligandos (p. ej., folistatina, nogina, cordina, DAN, lefty, LTBP1 , THBS1 , Decorina).
Los ejemplos de inhibidores de la función mitocondrial incluyen atractilosido (sal dipotásica), ácido bongkrekico (sal triamónica), carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona, carboxiatractilosido (p. ej., de Atractylis gummifera), CGP-37157, (-)-Deguelin (p. ej., de Mundulea sericea), F16, péptido del dominio de unión a VDAC de la hexocinasa II, oligomicina, rotenona, Ru360, SFK1 y valinomicina (p. ej., de Streptomyces fulvissimus) (EMD4Biosciences, EE. UU.).
Los ejemplos de inhibidores de P38 incluyen SB-203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)1 H-imidazol), SB-239063 {trans-? -(4-hidroxiciclohexil)-4-(fluorofenil)-5-(2-metoxipirimidin-4-il)imidazol), SB-220025 (5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1 -(4-piperidinil)imidazol)) y ARRY-797.
Los ejemplos de inhibidores de NF (p. ej., ??-?ß) incluyen IFRD1 , 2-(1 ,8-naftiridin-2-il)fenol, ácido 5-aminosalicílico, BAY 11-7082, BAY 11-7085, CAPE (éster fenetílico del ácido cafeico), maleato de dietilo, inhibidor IV de IKK-2, IMD 0354, lactacistina, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], inhibidor III de la activación de NFKB, inhibidor II de la activación de NF-??, JSH-23, partenolido, óxido de fenilarsina (PAO), PPM-18, sal amónica del ácido pirrolidinditiocarbámico, QNZ, RO 106-9920, rocaglamida, rocaglamida AL, rocaglamida C, rocaglamida I, rocaglamida J, rocaglaol, (R)-MG-132, salicilato sódico, triptolide (PG490), wedelolactona.
Los ejemplos de agonistas de los receptores de adenosina incluyen CGS-21680 y ATL-146e.
Los ejemplos de agonistas de la prostaglandina E2 incluyen E-Prostanoide 2 y E-Prostanoide 4.
Los ejemplos de inhibidores de la fosfodiesterasa (inhibidores selectivos y no selectivos) incluyen cafeína, aminofilina, IBMX (3-isobutil-1-metilxantina), paraxantina, pentoxifilina, teobromina, teofilina, xantinas metiladas, vinpocetina, EHNA (erithro-9-(2-hidroxi-3-nonil)adenina), anagrelida, enoximona (PERFAN™), milrinona, levosimendán, mesembrina, ibudilast, piclamilast, luteolina, drotaverina, roflumilast (DAXAS™, DALIRESP™), sildenafilo (REVATION®, VIAGRA®), tadalafilo (ADCIRCA®, CIALIS®), vardenafilo (LEVITRA®, STAXYN®), udenafilo, avanafilo, icariin, 4-metilpiperazina y pirazolopirimidin-7-ona.
Los ejemplos de inhibidores de proteasomas incluyen bortezomib, disulfiram, epigalocatequin-3-galato y salinosporamida A.
Los ejemplos de inhibidores de cinasas incluyen bevacizumab, BIBW 2992, cetuximab (ERBITUX®), imatinib (GLEEVEC®), trastuzumab (HERCEPTIN®), gefitinib (IRESSA®), ranibizumab (LUCENTIS®), pegaptanib, sorafenib, dasatinib, sunitinib, erlotinib, nilotinib, lapatinib, panitumumab, vandetanib, E7080, pazopanib, mubritinib.
Los ejemplos de glucocorticoides incluyen hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA) y aldosterona.
Los ejemplos de retinoides incluyen retinol, retinal, tretinoína (ácido retinoico, RETIN-A®), isotretinoína (Accutane®, Amnesteem®, Claravis®, Sotret®), alitretinoína (PANRETIN®), etretinato (TEGISON™) y su metabolito acitretina (SORIATANE®), tazaroteno (Tazorac®, Avage®, Zorac®), bexaroteno (TARGRETIN®) y adapaleno (DIFFERIN®).
Los ejemplos de inhibidores de citocinas incluyen IL1ra, antagonista del receptor de IL1, IGFBP, TNF-BF, uromodulina, alfa-2-macroglobulina, ciclosporina A, pentamidina y pentoxifilina (Pentopak®, Pentoxil®, Trental®).
Los ejemplos de antagonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas incluyen GW9662, antagonista III de PPARy, G335, T0070907 (EMD4Biosciences, EE. UU.).
Los ejemplos de agonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas incluyen pioglitazona, ciglitazona, clofibrato, GW1929, GW7647, L-165,041, LY 171883, el activador de PPARy, Fmoc-Leu, troglitazona y WY-14643 (EMD4Biosciences, EE. UU.).
Los ejemplos de inhibidores de la histona-deacetilasa incluyen ácidos hidroxámicos (o hidroxamatos) tales como tricostatina A, tetrapéptidos cíclicos (tales como trapoxina B) y depsipéptidos, benzamidas, cetonas electrófilas, compuestos de ácidos alfáticos tales como fenilbutirato y ácido valproico, ácidos hidroxámicos tales como vorinostat (SAHA), belinostat (PXD101), LAQ824 y panobinostat (LBH589), benzamidas tales como entinostat (MS-275), CI994 y mocetinostat (MGCD0103), nicotinamida, derivados de NAD, dihidrocoumarina, naftopiranona y 2-hidroxinafaldehídos.
Los ejemplos de inhibidores de calcineurina incluyen ciclosporina, pimecrolimus, voclosporina y tacrolimus.
Los ejemplos de inhibidores de fosfatasas incluyen clorhidrato de BN82002, CP-91149, caliculina A, ácido cantarídico, cantaridina, cipermetrina, etil-3,4-defostatina, sal sódica de fostriecina, MAZ51 , metil-3,4-defostatina, NSC 95397, norcantaridina, sal amónica del ácido okadaico de Prorocentrum concavum, ácido okadaico, sal potásica del ácido okadaico, sal sódica del ácido okadaico, óxido de fenilarsina, diversos cócteles de inhibidores de fosfatasas, proteína fosfatasa 1C, inhibidor de la proteína fosfatasa 2A, proteína fosfatasa 2A1 , proteína fosfatasa 2A2, ortovanadato de sodio.
En algunas realizaciones, los antígenos presentables por APC descritos en la presente también están acoplados a nanoportadores sintéticos. En algunas realizaciones, los antígenos presentables por APC están acoplados a los mismos o diferentes nanoportadores sintéticos a los que están acoplados los inmunosupresores. En otras realizaciones, los antígenos presentables por APC no están acoplados a ningún nanoportador sintético. Los antígenos presentables por APC incluyen cualquiera de los antígenos proporcionados en la presente. Tales antígenos incluyen antígenos asociados con enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias, alergia, la enfermedad del injerto contra el huésped, el rechazo de un órgano o tejido, antígenos de trasplantes y antígenos de proteínas terapéuticas.
Las proteínas terapéuticas incluyen, sin carácter limitante, proteínas terapéuticas, enzimas, cofactores enzimáticos, hormonas, factores de coagulación sanguínea, citocinas e interferones, factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales (p. ej., que se administran a un sujeto como terapia de reemplazo), y proteínas asociadas con la enfermedad de Pompe (p. ej., alglucosidasa alfa, rhGAA (p.ej., Myozime y Lumizyme (Genzyme)) administrables por infusión. Las proteínas terapéuticas también incluyen proteínas que participan en la cascada de coagulación sanguínea. Las proteínas terapéuticas incluyen, sin carácter limitante, el Factor VIII, Factor VII, Factor IX, Factor V, Factor de von Willebrand, Factor de von Heldebrant, activador tisular del plasminógeno, insulina, hormona del crecimiento, eritropoyetina alfa, VEGF, trombopoyetina, lisozima, antitrombina y similares. Las proteínas terapéuticas también incluyen adipocinas, tales como la leptina y adiponectina. Otros ejemplos de proteínas terapéuticas son como las que se describen más adelante y en otras secciones de la presente. También se incluyen los fragmentos o derivados de cualquiera de las proteínas terapéuticas proporcionadas como antígeno.
Los ejemplos de proteínas terapéuticas empleadas en la terapia de reemplazo enzimático de sujetos que padecen un trastorno por almacenamiento lisosómico incluyen, sin carácter limitante, imiglucerasa para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher (p. ej., CEREZYME™), a-galactosidasa A (a-gal A) para el tratamiento de la enfermedad de Fabry (p. ej., agalsidasa beta, FABRYZYME™), a-glucosidasa ácida (GAA) para el tratamiento de la enfermedad de Pompe (p. ej., alglucosidasa alfa, LUMIZYME™, MYOZYME™), arilsulfatasa B para el tratamiento de mucopolisacaridosis (p. ej., laronidasa, ALDURAZYME™, idursulfasa, ELAPRASE™, arilsulfatasa B, NAGLAZYME™).
Los ejemplos de enzimas incluyen oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.
Los ejemplos de hormonas incluyen melatonina (A/-acetil-5-metoxitriptamina), Serotonina, tiroxina (o tetraiodotironina) (una hormona tiroidea), triiodotironina (una hormona tiroidea), epinefrina (o adrenalina), norepinefrina (o noradrenalina), dopamina (o hormona inhibidora de prolactina), hormona antimülleriana (u hormona o factor inhibidor mülleriano), adiponectina, hormona adrenocorticotropa (o corticotropina), angiotensinógeno y angiotensina, hormona antidiurética (o vasopresina, arginina vasopresina), péptido atrial-natriurético (o atriopeptina), calcitonina, colecistocinina, hormona liberadora de corticotropina, eritropoyetina, hormona estimuladora de los folículos, gastrina, grelina, glucagón, péptido similar al glucagón (GLP-1), GIP, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de la hormona del crecimiento, gonadotropina coriónica humana, lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, factor de crecimiento insulinoide (o somatomedina), leptina, hormona luteinizante, hormona estimuladora de melanocitos, orexina, oxitocina, hormona paratiroidea, prolactina, relaxina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimuladora de la tiroides (o tirotropina), hormona liberadora de tirotropina, cortisol, aldosterona, testosterona, dehidroepiandrosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, estradiol, estrona, estriol, progesterona, calcitriol (1 ,25-dihidroxivitamina D3), calcidiol (25-hidroxivitamina D3), prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, hormona liberadora de prolactina, lipotropina, péptido natriurético cerebral, neuropéptido Y, histamina, endotelina, polipéptido pancreático, renina y encefalina.
Los ejemplos de factores sanguíneos y de coagulación sanguínea incluyen el Factor I (fibrinógeno), Factor II (protrombina), factor tisular, Factor V (proacelerina, factor lábil), Factor VII (factor estable, proconvertina), Factor VIII (globulina antihemofílica), Factor IX (factor de Christmas o componente tromboplastínico del plasma), Factor X (factor de Stuart-Prower), Factor Xa, Factor XI, Factor XII (factor de Hageman), Factor XIII (factor estabilizante de fibrina), factor de von Willebrand, precalicreína (factor de Fletcher), cininógeno de alto peso molecular (HMWK) (factor de Fitzgerald), fibronectina, fibrina, trombina, antitrombina III, cofactor II de la heparina, proteína C, proteína S, proteína Z, inhibidor de proteasa dependiente de ia proteína Z (ZPI), plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador tisular del plasminógeno (tPA), urocinasa, inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 1 (PAI1), inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 2 (PAI2), procoagulante de cáncer y epoetina alfa (Epogen, Procrit).
Los ejemplos de citocinas incluyen linfocinas, interleucinas y quimiocinas, citocinas de tipo 1 tales como IFN-?, TGF-ß, y citocinas de tipo 2, tales como IL-4, IL-10 e IL-13.
Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen adrenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrino, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento fibroblástico (FGF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), factor de crecimiento y diferenciación 9 (GDF9), factor de crecimiento hepatocitario (HGF), factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF), factor de crecimiento insulinoide (IGF), factor estimulador de la migración, miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF) y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformador alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformador beta (TGF-ß), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vía de señalización Wnt, factor de crecimiento placentario (PIGF), [(somatotrofina fetal bovina)] (FBS), IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-7.
Los ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen Abagovomab, Abciximab, Adalimumab, Adecatumumab, Afelimomab, Afutuzumab, Alacizumab pegol, ALD, Alemtuzumab, Altumomab pentetato, Anatumomab mafenatox, Anrukinzumab, globulina antitimocítica, Apolizumab, Arcitumomab, Aselizumab, Atlizumab (tocilizumab), Atorolimumab, Bapineuzumab, Basiliximab, Bavituximab, Bectumomab, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Biciromab, Bivatuzumab mertansina, Blinatumomab, Brentuximab vedotina, Briakinumab, Canakinumab, Cantuzumab mertansina, Capromab pendétido, Catumaxomab, Cedelizumab, Certolizumab pegol, Cetuximab, Citatuzumab bogatox, Cixutumumab, Clenoliximab, Clivatuzumab tetraxetán, Conatumumab, Dacetuzumab, Daclizumab, Daratumumab, Denosumab, Detumomab, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, Ecromeximab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Elotuzumab, Elsilimomab, Enlimomab pegol, Epitumomab cituxetán, Epratuzumab, Erlizumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Exbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab, Farletuzumab, Felvizumab, Fezakinumab, Figitumumab, Fontolizumab , Foravirumab, Fresolimumab, Galiximab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab ozogamicina, GC1008, Girentuximab, Glembatumumab vedotina, Golimumab, Gomiliximab, Ibalizumab, Ibritumomab tiuxetán, Igovomab, Imciromab, Infliximab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab ozogamicina, Ipilimumab, Iratumumab, Keliximab, Labetuzumab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lerdelimumab, Lexatumumab, Libivirumab, Lintuzumab, Lorvotuzumab mertansina, Lucatumumab, Lumiliximab, Mapatumumab, Maslimomab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mitumomab, Morolimumab, Motavizumab, uromonab-CD3, Nacolomab tafenatox, Naptumomab estafenatox, Natalizumab, Nebacumab, Necitumumab, Nerelimomab, Nimotuzumab, Nofetumomab merpentán, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Omalizumab, Oportuzumab boronato, Oregovomab, Otelixizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Panitumumab, Panobacumab, Pascolizumab, Pemtumomab, Pertuzumab, Pexelizumab, Pintumomab, Priliximab, Pritumumab, Rafivirumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raxibacumab, Regavirumab Reslizumab, Rilotumumab, Rituximab, Robatumumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Satumomab pendétido, Sevirumab, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuximab, Siplizumab, Solanezumab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulesomab, Tacatuzumab tetraxetán, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab paptox, Tefibazumab, Telimomab aritox, Tenatumomab, Teneliximab, Teplizumab, Ticilimumab (tremelimumab), Tigatuzumab, Tocilizumab (atlizumab), Toralizumab, Tositumomab, Trastuzumab, Tremelimumab, Tucotuzumab celmoleucina, Tuvirumab, Urtoxazumab, Ustekinumab, Vapaliximab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab, Visilizumab, Volociximab, Votumumab, Zalutumumab, Zanolimumab, Ziralimumab y Zolimomab aritox.
Los ejemplos de terapia de infusión o proteínas terapéuticas inyectables incluyen, por ejemplo, Tocilizumab (Roche/Actemra®), alfa-1 antitripsina (Kamada/AAT), Hematide® (Affymax y Takeda, péptido sintético), albinterferón alfa-2b (Novartis/Zalbin™), Rhucin® (Pharming Group, terapia de reemplazo con el inhibidor C1), tesamorelina (Theratechnologies/Egrifta, factor liberador de la hormona de crecimiento sintética), ocrelizumab (Genentech, Roche y Biogen), belimumab (GlaxoSmithKIine/Benlysta®), pegloticasa (Savient Pharmaceuticals/Krystexxa™), taliglucerasa alfa (Protalix/Uplyso), agalsidasa alfa (Shire/Replagal®), velaglucerasa alfa (Shire).
Otras proteínas terapéuticas útiles de acuerdo con los aspectos de esta invención serán evidentes para los expertos en la técnica y la invención no está limitada en este sentido.
En algunas realizaciones, se puede aislar un componente tal como un antígeno o inmunosupresor. El término "aislado" se refiere a la separación del elemento de su entorno nativo y su presencia en cantidades suficientes para permitir su identificación o uso. Esto significa, por ejemplo, que el elemento se puede (i) producir selectivamente por clonación de expresión o (ii) purificar, por ejemplo, por cromatografía o electroforesis. Los elementos aislados pueden ser, aunque no necesariamente, sustancialmente puros. Dado que un elemento aislado se puede mezclar con un excipiente farmacéuticamente aceptable en un preparado farmacéutico, puede que el elemento constituya únicamente un pequeño porcentaje en peso del preparado. No obstante, el elemento está aislado porque se ha separado de las sustancias con las cuales puede estar asociado en sistemas vivos, es decir, se ha separado de otras proteínas o lípidos. Cualquiera de los elementos proporcionados en la presente puede estar aislado. Cualquiera de los antígenos proporcionados en la presente se puede incluir en las composiciones en forma aislada.
D. Métodos para preparar v emplear las composiciones de la invención y métodos relacionados Los nanoportadores sintéticos se pueden preparar empleando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los nanoportadores sintéticos se pueden formar mediante métodos tales como nanoprecipitación, flujo focalizado utilizando canales fluídicos, deshidratación por aspersión, evaporación de disolvente de emulsión simple o doble, extracción de disolvente, separación de fases, molienda, procedimientos de microemulsión, microfabricación, nanofabricación, capas sacrificiales, coacervación simple y compleja, y otros métodos con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Como alternativa o además, se han descrito síntesis en disolventes acuosos y orgánicos para nanomateriales semiconductores monodispersos, conductores, magnéticos, orgánicos y de otros tipos (Pellegrino et al., 2005, Small, 1 :48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; y Trindade et al., 2001, Chem. Mal, 13:3843). En la bibliografía se han descrito métodos adicionales (remítase, p. ej., a Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC Press, Boca Ratón, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Reléase, 5:13; Mathiowitz et al., 987, Reactive Polymers, 6:275; y Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; Patentes de EE. UU. 5578325 y 6007845); P. Paolicelli et ai, "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).
Se pueden encapsular diferentes materiales en nanoportadores sintéticos, según sea deseable, utilizando diversos métodos, que incluyen, sin carácter limitante, C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, N.° 3, págs. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1 :321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8- 21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Pueden utilizarse otros métodos adecuados para encapsular materiales en nanoportadores sintéticos, que incluyen, sin carácter limitante, los métodos descritos en la Patente de EE. UU. 6,632,671 concedida a Unger el 14 de octubre de 2003.
En ciertas realizaciones, los nanoportadores sintéticos se preparan mediante un proceso de nanoprecipitación o deshidratación por aspersión. Las condiciones utilizadas en la preparación de los nanoportadores sintéticos se pueden modificar para proporcionar partículas que tengan un tamaño o una propiedad deseada (p. ej., hidrofobicidad, hidrofilicidad, morfología externa, "adhesividad", forma, etc.). El método de preparación de los nanoportadores sintéticos y las condiciones (p. ej., disolvente, temperatura, concentración, tasa de flujo de aire, etc.) utilizadas pueden depender de los materiales que se deseen acoplar a los nanoportadores sintéticos y/o la composición de la matriz polimérica.
Si las partículas preparadas por cualquiera de los métodos anteriores presentan un rango de tamaños fuera del rango deseado, se le puede dar a las partículas un tamaño adecuado, por ejemplo, utilizando un tamiz.
Los componentes (es decir, elementos) de los nanoportadores sintéticos de la invención (tales como restos por los cuales está compuesta una superficie inmunoactiva, restos de direccionamiento, matrices poliméricas, antígenos, inmunosupresores y similares) pueden acoplarse al nanoportador sintético global, p. ej., a través de uno o más enlaces covalentes, o pueden acoplarse a través de uno o más conectores. Otros métodos de funcionalización de nanoportadores sintéticos pueden adaptarse a partir de la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 2006/0002852 concedida a Saltzman et al., la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 2009/0028910 concedida a DeSimone et al. o la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO/2008/127532 A1 concedida a Murthy et al.
Como alternativa o además, los nanoportadores sintéticos se pueden acoplar a elementos como los proporcionados en la presente directa o indirectamente mediante interacciones no covalentes. En las realizaciones no covalentes, el acoplamiento no covalente está mediado por interacciones no covalentes que incluyen, sin carácter limitante, interacciones de cargas, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones de receptor-sustrato, interacciones hidrófobas, interacciones aromáticas, interacciones de puente de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de estas. Dichos acoplamientos pueden disponerse para que estén sobre una superficie externa o una superficie interna de un nanoportador sintético de la invención. En las realizaciones, la encapsulación y/o absorción es una forma de acoplamiento. En las realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención se pueden combinar con un antígeno mezclándolos en el mismo vehículo o sistema de suministro.
Las poblaciones de nanoportadores sintéticos se pueden combinar para obtener formas farmacéuticas de acuerdo con la presente invención empleando métodos de mezcla farmacéuticos tradicionales. Estos incluyen la mezcla líquido-líquido en la cual dos o más suspensiones, donde cada una de ellas contiene uno o más subconjuntos de nanoportadores, se combinan directamente o se juntan por medio de uno o más recipientes que contienen diluyente. Dado que los nanoportadores sintéticos también se pueden producir o almacenar en forma de polvo, se podría realizar una mezcla polvo-polvo en seco al igual que una resuspensión de dos o más polvos en un medio común. Dependiendo de las propiedades de los nanoportadores y sus potenciales de interacción, se pueden conferir ventajas a una u otra ruta de mezcla.
Las composiciones típicas de la invención que comprenden nanoportadores sintéticos pueden comprender tampones orgánicos o inorgánicos (p. ej., sales sódicas o potásicas de fosfato, carbonato, acetato o citrato) y agentes para ajusfar el pH (p. ej., ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o potasio, sales de citrato o acetato, aminoácidos y sus sales), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, alfa-tocoferol), tensioactivos (p. ej., polisorbato 20, polisorbato 80, polioxietileno 9-10 nonilfenol, desoxicolato de sodio), estabilizantes de soluciones y/o crio/lioestabilizantes (p. ej., sacarosa, lactosa, manitol, trehalosa), agentes para el ajuste osmótico (p. ej., sales o azúcares), agentes antibacterianos (p. ej., ácido benzoico, fenol, gentamicina), agentes antiespumantes (p. ej., polidimetilsilozona), conservantes (p. ej., timerosal, 2-fenoxietanol, EDTA), estabilizantes poliméricos y agentes para ajusfar la viscosidad (p. ej., polivinilpirrolidona, poloxámero 488, carboximetilcelulosa) y codisolventes (p. ej., glicerol, polietilenglicol, etanol).
Las composiciones de acuerdo con la invención comprenden nanoportadores sintéticos de la invención combinados con excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones se pueden preparar utilizando técnicas farmacéuticas convencionales de elaboración y formulación para obtener formas farmacéuticas útiles. Las técnicas adecuadas para ser empleadas en la práctica de la presente invención se pueden consultar en el Handbook of Industrial Mixinct: Science and Practice, editado por Edward L. Paul, Víctor A. Atiemo-Obeng y Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; y Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Pesian, 2.a ed. editado por M. E. Auten, 2001 , Churchill Livingstone. En una realización, los nanoportadores sintéticos de la invención están suspendidos en solución salina estéril para su inyección junto con un conservante.
Se debe sobreentender que las composiciones de la invención se pueden obtener de cualquier manera adecuada y la invención no está limitada de ningún modo a las composiciones que se pueden producir utilizando los métodos descritos en la presente. La selección de un método adecuado puede requerir prestar atención a las propiedades de los restos particulares que se están asociando.
En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención se elaboran en condiciones estériles o se esterilizan al final de su elaboración. Esto puede garantizar que las composiciones resultantes sean estériles y no infecciosas, de este modo se mejora la seguridad en comparación con las composiciones no estériles. Esto proporciona una medida de seguridad valiosa, especialmente cuando los sujetos que reciben los nanoportadores sintéticos presentan defectos inmunitarios, padecen una infección y/o son propensos a padecer una infección. En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos de la invención se pueden liofilizar y almacenar en suspensión o como polvo liofilizado, dependiendo de la estrategia de formulación, durante periodos prolongados sin perder actividad.
Las composiciones de la invención se pueden administrar por varias vías, incluidas, sin carácter limitante, la vía subcutánea, intranasal, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transmucosal, transmucosal, sublingual, rectal, oftálmica, pulmonar, intradérmica, transdérmica, transcutánea o intradérmica, o mediante una combinación de estas vías. Las vías de administración también incluyen la administración por inhalación o aerosol pulmonar. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con las técnicas para preparar sistemas de suministro en aerosol (remítase, por ejemplo, a Sciarra y Cutie, "Aerosols," en Reminaton's Pharmaceutical Sciences. 18.a edición, 1990, págs. 1694-1712; incorporado por referencia).
Los injertos trasplantabas o las proteínas terapéuticas proporcionados como una terapia a base de células de la invención se pueden administrar por administración parenteral, intraarterial, intranasal o intravenosa, o por inyección en los ganglios linfáticos o la cámara anterior del ojo o por administración local a un órgano o tejido de interés. La administración puede ser por inyección subcutánea, intratecal, intraventricular, intramuscular, intraperitoneal, intracoronaria, intrapancreática, intrahepática o bronquial.
Las composiciones de la invención se pueden administrar en cantidades eficaces, tales como las cantidades eficaces descritas en otras secciones de la presente. Las dosis de las formas farmacéuticas contienen cantidades variables de poblaciones de nanoportadores sintéticos y/o cantidades variables de antígenos y/o inmunosupresores, de acuerdo con la invención. La cantidad de nanoportadores sintéticos y/o antígenos y/o inmunosupresores presente en las formas farmacéuticas de la invención puede variar de acuerdo con la naturaleza de los antígenos y/o inmunosupresores, el beneficio terapéutico que se desea conseguir y otros parámetros de este tipo. En algunas realizaciones, se pueden realizar estudios posológicos para establecer la cantidad terapéutica óptima de la población de nanoportadores sintéticos y la cantidad de antígenos y/o inmunosupresores que han de estar presentes en la forma farmacéutica. En las realizaciones, los nanoportadores sintéticos y/o los antígenos y/o inmunosupresores están presentes en la forma farmacéutica en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica a los antígenos al administrarlos a un sujeto. Se podrían determinar las cantidades de los antígenos y/o inmunosupresores eficaces para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica utilizando técnicas y estudios posológicos convencionales en sujetos. Las formas farmacéuticas de la invención se pueden administrar con varias frecuencias. En una realización preferida, al menos una administración de la forma farmacéutica es suficiente para generar una respuesta farmacológicamente relevante. En las realizaciones más preferidas, se emplean al menos dos administraciones, al menos tres administraciones o al menos cuatro administraciones de la forma farmacéutica para garantizar una respuesta farmacológicamente relevante.
La administración profiláctica de las composiciones de la invención se puede iniciar antes de la aparición de una enfermedad, trastorno o afección, o la administración terapéutica se puede iniciar después de que se haya establecido un trastorno, enfermedad o afección.
En algunas realizaciones, la administración de nanoportadores sintéticos tienen lugar, p. ej., antes de la administración de una proteína terapéutica, un injerto trasplantable o la exposición a un alérgeno. En las realizaciones ilustrativas, los nanoportadores sintéticos se administran una o más veces, incluidos, sin carácter limitante 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 días antes de la administración de una proteína terapéutica, un injerto trasplantable o la exposición a un alérgeno. Además o como alternativa, los nanoportadores sintéticos se pueden administrar a un sujeto después de la administración de una proteína terapéutica, un injerto trasplantable o la exposición a un alérgeno. En las realizaciones ilustrativas, los nanoportadores sintéticos se administran una o más veces, incluidos, sin carácter limitante 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, etc. después de la administración de una proteína terapéutica, un injerto trasplantable o la exposición a un alérgeno.
En algunas realizaciones, se administra una dosis de mantenimiento (p. ej., de una composición de nanoportadores sintéticos proporcionada en la presente) a un sujeto después de que una administración inicial haya provocado una respuesta tolerogénica en el sujeto, por ejemplo, para mantener el efecto tolerogénico conseguido después de la dosis inicial, para prevenir una reacción inmunitaria no deseada en el sujeto o para prevenir que el sujeto se convierta en un sujeto que corra el riesgo de experimentar una respuesta inmunitaria no deseada o un nivel no deseado de una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la dosis de mantenimiento es la misma dosis que la dosis inicial recibida por el sujeto. En algunas realizaciones, la dosis de mantenimiento es una dosis menor que la dosis inicial. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la dosis de mantenimiento es aproximadamente 3/4, aproximadamente 2/3, aproximadamente 1/2, aproximadamente 1/3, aproximadamente 1/4, aproximadamente 1/8, aproximadamente 1/10, aproximadamente 1/20, aproximadamente 1/25, aproximadamente 1/50, aproximadamente 1/100, aproximadamente 1/1000, aproximadamente 1/10 000, aproximadamente 1/100 000 o aproximadamente 1/1 000 000 (peso/peso) de la dosis inicial.
Las composiciones y métodos descritos en la presente se pueden utilizar para inducir o fomentar una respuesta inmunitaria tolerogénica y/o para suprimir, modular, dirigir o redirigir una respuesta inmunitaria no deseada a efectos de supresión inmunitaria. Las composiciones y los métodos descritos en la presente se pueden utilizar en el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones en los que la supresión inmunitaria (p. ej., respuesta inmunitaria tolerogénica) conferiría un beneficio durante el tratamiento. Tales enfermedades, trastornos o afecciones incluyen enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, alergias, el rechazo de un órgano o tejido y la enfermedad del injerto contra el huésped. Las composiciones y los métodos descritos en la presente también se pueden utilizar en sujetos que han sido sometidos o se someterán a un trasplante. Las composiciones y los métodos descritos en la presente también se pueden utilizar en sujetos que han recibido, están recibiendo o recibirán una proteína terapéutica contra la cual han generado o cabe esperar que generen una respuesta inmunitaria no deseada.
Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, sin carácter limitante, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo I o mediada por el sistema inmunitario, enfermedad intestinal inflamatoria (p. ej., enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa), lupus eritematoso sistémico, psoriasis, esclerodermia, enfermedad de la tiroides autoinmunitaria, alopecia areata, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barré, celiaquía, síndrome de Sjógren, fiebre reumatoide, gastritis, gastritis atrófica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, insulitis, ooforitis, orquitis, uveitis, uveitis facogénica, miastenia gravis, mixedema primaria, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, nefritis, por ejemplo, glomerulonefritis, psoriasis, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmía simpatética, púrpura trombocitopénica idiopática, leucopenia idiopática, granulomatosis de Wegener y poli/dermatomiositis.
Algunas enfermedades autoinmunitarias ilustrativas adicionales, autoantígenos y autoanticuerpos asociados, que se contemplan para su uso en la invención, se describen a continuación en la Tabla 1 : TABLA 1 Las enfermedades inflamatorias incluyen, sin carácter limitante, alzhéimer, artritis, asma, aterosclerosis, enfermedad de Crohn, colitis, fibrosis quística, dermatitis, diverticulitis, hepatitis, síndrome del intestino irritable (Sil), lupus eritematoso, distrofia muscular, nefritis, párkinson, herpes y colitis ulcerativa. Las enfermedades inflamatorias también incluyen, por ejemplo, la enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), bronquiectasia, colecistitis crónica, tuberculosis, tiroiditis de Hashimoto, sepsis, sarcoidosis, silicosis y otras pneumoconiosis, y un cuerpo extraño implantado en una herida, pero no se limitan a estas. El término "sepsis", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un síndrome clínico bien reconocido asociado con una respuesta inflamatoria sistémica del huésped a una invasión microbiana. El término "sepsis", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una afección que generalmente se caracteriza por fiebre o hipotermia, taquicardia y taquipnea, y, en casos graves, puede evolucionar a hipotensión, disfunción de un órgano e incluso la muerte.
En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad intestinal inflamatoria no autoinmunitaria, adhesiones posquirúrgicas, enfermedad arterial coronaria, fibrosis hepática, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, pancreatitis inflamatoria aguda, pancreatitis inducida por colangiopancreatografía retrógrada endoscópica, quemaduras, aterogénesis de arterias coronarias, cerebrales y periféricas, apendicitis, colecistitis, diverticulitis, trastornos fibróticos viscerales, cicatrización, trastornos cicatrizantes de la piel (queloides, hidradenitis supurativa), trastornos granulomatosos (sarcoidosis, cirrosis biliar primaria), asma, pioderma gangrenoso, síndrome de Sweet, enfermedad de Behcet, colangitis esclerosante primaria o un absceso. En alguna realización preferida, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad intestinal inflamatoria (p. ej., enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa).
Las enfermedades inflamatorias incluyen, sin carácter limitante, alzhéimer, espondilitis anquilosante, artritis, asma, aterosclerosis, enfermedad de Behcet, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria autoinmunitaria, diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus, diabetes juvenil, diabetes autoinmunitaria espontánea, gastritis, gastritis atrófica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, insulitis, ooforitis, orquitis, uveitis, uveitis facogénica, esclerosis múltiple, miastenia gravis, mixedema primaria, tirotoxicosis, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Graves, glomerulonefritis, psoriasis, pénfigo vulgar, penfigoide, eccema, penfigoide bulloso, optalmia simpatética, púrpura trombocilopénica idiopática, leucopenia ¡diopática, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica, granulomatosis de Wegener, poli/dermatomiositis, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, lupus o lupus eritematoso sistémico.
La enfermedad del injerto contra el huésped (EICH) es una complicación que puede ocurrir después de un trasplante de una célula pluripotente (p. ej., célula madre) o médula ósea en la que el material recién trasplantado produce un ataque en el cuerpo del receptor del trasplante. En algunos casos, la EICH se produce después de una transfusión de sangre. La enfermedad del injerto contra el huésped se puede dividir en una forma aguda y una forma crónica. La forma aguda o fulminante de la enfermedad (ElCHa) normalmente se observa en los 100 primeros días postrasplante y supone un gran problema para los trasplantes debido a la morbilidad y mortalidad asociadas. La forma crónica de la enfermedad del injerto contra el huésped (ElCHc) normalmente se produce después de 100 días. La aparición de casos entre moderados y graves de ElCHc afecta de forma adversa a la supervivencia a largo plazo.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Nanopartículas de sílice mesoporosa con ibuprofeno acoplado (teórico) Se crean núcleos de nanopartículas de S1O2 mesoporosa mediante un proceso sol-gel. Se disuelve bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) (0.5 g) en agua desionizada (500 mL) y a continuación se añade una solución acuosa 2 M de NaOH (3.5 mL) a la solución de CTAB. La solución se agita durante 30 min y a continuación se añade tetraetoxisilano (TEOS) (2.5 mL) a la solución. El gel resultante se agita durante 3 h a una temperatura de 80 °C. El precipitado blanco que se forma se captura por filtración, seguida de lavado con agua desionizada y secado a temperatura ambiente. El surfactante restante se extrae a continuación de las partículas por suspensión en una solución etanólica de HCI durante la noche. Las partículas se lavan con etanol, se centrifugan y se vuelven a dispersar con ultrasonicación. Este procedimiento de lavado es repite dos veces más.
Las nanopartículas de Si02 se funcionalizan posteriormente con grupos amino utilizando (3-aminopropil)trietoxisilano (APTMS). Para hacer esto, las partículas se suspenden en etanol (30 mL) y se añade APTMS (50 pL) a la suspensión. La suspensión se deja reposar a temperatura ambiente durante 2 h y después se hierve durante 4 h, manteniendo el volumen constante mediante adiciones periódicas de etanol. Los reactivos remanentes se eliminan con cinco ciclos de lavado mediante centrifugación y redispesión en etanol puro.
En una reacción independiente, se crean semillas de oro con un diámetro de 1-4 nm. Toda el agua empleada en esta reacción se desioniza primero y después se destila en vidrio. Se introduce agua (45.5 mL) en un matraz de fondo redondo de 100 mL. Mientras se agita, se añade NaOH acuoso 0.2 M (1.5 mL), seguido de una solución acuosa al 1% de cloruro de tetrakis(hidroximetil)fosfonio (THPC) (1.0 mL). Dos minutos después de añadir la solución de THPC, se añade una solución acuosa de 10 mg/mL de ácido cloroáurico (2 mL), la cual se ha dejado reposar al menos 15 min. Las semillas de oro se purifican mediante diálisis frente a agua.
Para formar los nanoportadores de núcleo/cubierta, las nanopartículas de Si02 funcionalizadas con grupos amino formadas anteriormente se mezclan primero con las semillas de oro durante 2 h a temperatura ambiente. Las partículas de S1O2 decoradas con oro se recogen mediante centrifugación y se mezclan con una solución acuosa de ácido cloroáurico y bicarbonato de potasio para formar la cubierta de oro. A continuación, las partículas se lavan mediante centrifugación y se vuelven a dispersar en agua. El ibuprofeno se carga suspendiendo las partículas en una solución de ibuprofeno sódico (1 mg/L) durante 72 h. Después, el ibuprofeno libre se lava de las partículas mediante centrifugación y se vuelven a dispersar en agua.
EJEMPLO 2 Liposomas que contienen ciclosporina A (teórico) Los liposomas se forman utilizando hidratación de película fina. Se disuelven 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (32 µ?t???), colesterol (32 pmol) y ciclosporina A (6.4 pmol) en cloroformo puro (3 mL). Esta solución lipídica se introduce en un matraz de fondo redondo de 50 mL, y el disolvente se evapora en un evaporador rotatorio a una temperatura de 60 °C. A continuación, el matraz de purga con nitrógeno gaseoso para eliminar el disolvente remanente. Se añaden solución salina tamponada con fosfato (2 mL) y cinco microesferas de vidrio al matraz, y la película lipídica formada se hidrata agitando a 60 °C durante 1 h para formar una suspensión. La suspensión se transfiere a un tubo de presión pequeño y se sónica a 60 °C durante cuatro ciclos de pulsos de 30 s con una separación de 30 s entre cada pulso. A continuación, la suspensión se deja reposar a temperatura ambiente durante 2 h para permitir que se complete la hidratación. Los liposomas se lavan mediante centrifugación y se vuelven a suspender en solución tamponada con fosfato recién preparada.
EJEMPLO 3 Nanoportador polimérico que contiene un conjugado de polímero- rapamicina (teórico) Preparación del conjugado de PLGA-rapamicina: El polímero PLGA con un grupo terminal ácido (7525 DLG1A, índice de acidez: 0.46 mmol/g, Lakeshore Biomaterials; 5 g, 2.3 mmol, 1.0 eq) se disuelve en 30 mL de diclorometano (DCM). Se añade N,N-diciclohexilcarbodimida (1.2 eq, 2.8 mmol, 0.57 g) seguida de rapamicina (1.0 eq, 2.3 mmol, 2.1 g) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (2.0 eq, 4.6 mmol, 0.56 g). La mezcla se agita a TA durante 2 días. A continuación, la mezcla se filtra para eliminar la diciclohexilurea insoluble. El filtrado se concentra hasta un volumen de aproximadamente 10 mL y se añade a 100 mL de alcohol isopropílico (IPA) para que precipite el conjugado de PLGA-rapamicina. La capa de IPA se eliminó y el polímero se lavó posteriormente con 50 mL de IPA y 50 mL de éter f-butil metílico (MTBE). A continuación, el polímero se secó al vacío a 35 °C durante 2 días para obtener PLGA-rapamicina como un sólido blanco (aprox. 6.5 g).
Preparación de un nanoportador que contiene un conjugado de PLGA-rapamicina y péptido (323-339) de ovoalbúmina: El nanoportador que contiene PLGA-rapamicina se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 como se indica a continuación: Se preparan las soluciones para formar el nanoportador como se indica a continuación: Solución 1 : Péptido 323-339 de ovoalbúmina con una concentración de 20 mg/mL en una solución acuosa de ácido clorhídrico diluido. La solución se prepara disolviendo el péptido de ovoalbúmina en una solución 0.13 M de ácido clorhídrico a temperatura ambiente. Solución 2: PLGA-rapamicina con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo el PLGA-rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo el PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
En primer lugar, se prepara una emulsión primaria de agua en aceite (W1/01). La W1/01 se prepara combinando la solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.75 mL) y la solución 3 (0.25 ml_) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 50% durante 40 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. A continuación, se prepara una emulsión secundaria (W1/01 W2) combinando la solución 4 (3.0 mL) con la emulsión primaria W1/01 , agitando en un vórtex durante 10 s y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos utilizando el sonicador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión W1/01/W2 se añade a un vaso de precipitados que contiene solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agita a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evapore y se formen los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lava transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifugación, centrifugando a 75 600*g y 4 °C durante 35 min, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repite y el pellet se vuelve a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores final de aproximadamente 10 mg/mL.
EJEMPLO 4 Preparación de nanoportadores de oro ÍAuNC) que contienen rapamicina (teórico) Preparación de HS-PEG-rapamicina: Una solución de disulfuro de PEG-ácido (1.0 eq), rapamicina (2.0-2.5 eq), DCC (2.5 eq) y DMAP (3.0 eq) en DMF anhidro se agita a TA durante la noche. La diciclohexilurea insoluble se elimina por filtración, y el filtrado se añade a alcohol isopropílico (IPA) para que precipite el PEG-disulfuro-di-éster de rapamicina y se lava con IPA y se seca. A continuación, el polímero se trata con clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina en DMF para reducir el disulfuro de PEG a tiol-PEG-éster de rapamicina (HS-PEG-rapamicina). El polímero resultante se recupera mediante precipitación en IPA y se seca como se ha descrito previamente y se analiza por HRMN y GPC.
Formación de nanoportadores de oro (AuNC): Se calienta una solución ac. de 500 mL de HAuCI4 1 mM hasta reflujo durante 10 min con agitación vigorosa en un matraz de fondo redondo de 1 L equipado con un condensador. A continuación se añade rápidamente una solución de 50 mL de citrato de trisodio 40 mM a la solución agitada. La solución de color vino tinto intenso resultante se mantiene a reflujo durante 25-30 min, se deja de calentar y la solución se enfría hasta temperatura ambiente. A continuación, la solución se filtra a través de un filtro de membrana de 0.8 pm para proporcionar la solución de AuNC. Los AuNC se caracterizan empleando espectroscopia visible y microscopía electrónica de transmisión. Los AuNC tienen un diámetro de aproximadamente 20 nm, están bloqueados con citrato y presentan una absorción máxima a 520 nm.
Conjugado de AuNC con HS-PEG-rapamicina: Una solución de 150 \iL de HS-PEG-rapamicina (10 µ? en tampón de carbonato 10 mM, pH 9.0) se añade a 1 mL de nanoportadores de oro bloqueados con citrato con un diámetro de 20 nm (1.16 nM) para producir una relación molar de tiol frente a oro de 2500:1. La mezcla se agita a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 1 hora para permitir que se complete el intercambio de tiol con citrato en los nanoportadores de oro. A continuación, los AuNC con PEG-rapamicina sobre la superficie se purifican por centrifugación a 12 000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se decanta y el pellet que contiene AuNC-S-PEG-rapamicina se lava en forma de pellet con 1x tampón PBS. A continuación, los nanoportadores de oro-PEG-rapamicina purificados se vuelven a suspender en un tampón adecuado para su análisis y bioensayos posteriores.
EJEMPLO 5 Respuesta inmunitaria de los nanoportadores sintéticos con rapamicina acoplada con y sin péptido (323-339) de ovoalbúmina Materiales El péptido 323-339 de ovoalbúmina, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de linfocitos T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió en Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; # de pieza 4065609). La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; # de catálogo del producto R1017). El PLGA con una proporción de láctido:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0.75 dl_/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211 ; código de producto 7525 DLG 7A). El alcohol polivinílico (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Solución 1 : Péptido 323-339 de ovoalbúmina con una concentración de 20 mg/mL en una solución acuosa de ácido clorhídrico diluido. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en una solución 0.13 M de ácido clorhídrico a temperatura ambiente. Solución 2: Rapamicina con una concentración de 50 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo la rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLGA con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 4: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
Método para preparar nanoportadores sintéticos que contienen rapamicina v ovoalbúmina (323-339) En primer lugar, se preparó una emulsión primaria de agua en aceite (W1/01). La W1/01 se preparó combinando la solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.2 mL) y la solución 3 (1.0 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 50% durante 40 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. A continuación, se preparó una emulsión secundaria (W1/01/W2) combinando la solución 4 (3.0 mL) con la emulsión primaria W1/01 , agitando en un vórtex durante 10 s y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos utilizando el sonicador Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión W1/01/W2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores sintéticos. Una porción de los nanoportadores sintéticos se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores sintéticos a un tubo de centrifugación, centrifugando a 21 000xg y 4 °C durante una hora, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores sintéticos final de aproximadamente 10 mg/mL.
Las cantidades de péptido y rapamicina en los nanoportadores sintéticos se determinaron mediante análisis por HPLC. La masa seca total de nanoportadores sintéticos por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
Método para producir nanoportadores sintéticos que contienen rapamicina En primer lugar, se preparó una emulsión primaria de agua en aceite (W1/01). La W1/01 se preparó combinando una solución 0.13 M de ácido clorhídrico (0.2 mL), la solución 2 (0.2 mL) y la solución 3 (1.0 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 50% durante 40 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. A continuación, se preparó una emulsión secundaria (W1/01 W2) combinando la solución 4 (3.0 ml_) con la emulsión primaria W1/01 , agitando en un vórtex durante 10 s y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos utilizando el sonicador Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión W1/01/W2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores sintéticos. Una porción de los nanoportadores sintéticos se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores sintéticos a un tubo de centrifugación, centrifugando a 21 000xg y 4 °C durante una hora, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores sintéticos final de aproximadamente 10 mg/mL.
La cantidad de rapamicina en el nanoportador sintético se determinó mediante análisis por HPLC. La masa seca total de nanoportadores sintéticos por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
Método para medir la carga de rapamicina Se recogieron aproximadamente 3 mg de nanoportadores sintéticos y se centrifugaron para separar el sobrenadante del pellet de nanoportadores sintéticos. Se añadió acetonitrilo al pellet, y la muestra se sónico y centrifugó para eliminar cualquier material insoluble. El sobrenadante y el pellet se inyectaron en un RP-HPLC y se leyó la absorbancia a 278 nm. Los pg encontrados en el pellet se utilizaron para calcular el % atrapado (carga), y los pg en el sobrenadante y el pellet se utilizaron para calcular los pg totales recuperados.
Método para medir la carga de ovoalbúmina (323-339) Se recogieron aproximadamente 3 mg de nanoportadores sintéticos y se centrifugaron para separar el sobrenadante del pellet de nanoportadores sintéticos. Se añadió trifluoroetanol al pellet y la muestra se sonicó para disolver el polímero, se añadió ácido trifluoroacético al 0.2%, y la muestra se sonicó y después se centrifugó para eliminar cualquier material insoluble. El sobrenadante y el pellet se inyectaron en un RP-HPLC y se leyó la absorbancia a 215 nm. Los pg encontrados en el pellet se utilizaron para calcular el % atrapado (carga), y los pg en el sobrenadante y el pellet se utilizaron para calcular los pg totales recuperados.
Actividad de las células dendríticas toleroqénicas (tDC) específicas para el antíqeno sobre el desarrollo de linfocitos Treg El ensayo incluyó el uso de ratones OTII que tienen un receptor de linfocitos T transgénico específico para un péptido (323-339) de ovoalbúmina inmunodominante. Con el fin de crear tDC específicas para el antígeno, se aislaron esplenocitos CD11c+ y se añadió el péptido (323-339) de ovoalbúmina in vitro con una concentración de 1 Mg/mL o nada de antígeno. A continuación, se añadió la rapamicina soluble o encapsulada en nanoportadores a las DC durante 2 horas, las cuales se lavaron posteriormente de forma exhaustiva para eliminar la rapamicina libre del cultivo. Se aislaron células CD4+CD25" respondedoras purificadas de ratones OTII y se añadieron a tDC en una proporción de 10:1 de T respecto a DC. A continuación, la mezcla de tDC y linfocitos T de OTII se cultivó durante 4-5 días, y la frecuencia de linfocitos Treg (CD4+CD25altoFoxP3+) se analizó mediante citometría de flujo como se muestra en la Fig. 1. Se seleccionaron regiones en función de los controles isotípicos.
Método de determinación las dimensiones de los nanoportadores La medición de las dimensiones de los nanoportadores sintéticos se obtuvo mediante dispersión de luz dinámica (DLS). Una suspensión de los nanoportadores sintéticos se diluyó con agua purificada para conseguir una concentración final de la suspensión de nanoportadores sintéticos comprendida entre aproximadamente 0.01 y 0.1 mg/mL. La suspensión diluida se preparó directamente dentro de una cubeta adecuada para el análisis por DLS. A continuación la cubeta se colocó en un ZetaPALS de Brookhaven Instruments Corp., se dejó equilibrar hasta 25 °C y después se escaneó durante un tiempo suficiente para adquirir una distribución estable y reproducible basándose en los parámetros adecuados para la viscosidad del medio y los índices de refracción de la muestra. A continuación se registró el diámetro eficaz o la media de la distribución.
Resultados Para comprobar los experimentos conceptuales, el fármaco inductor de tolerancia rapamicina se utilizó combinado con el péptido 323-339 de ovoalbúmina ligante de clase II. La rapamicina es un inmunosupresor utilizado para suprimir el rechazo de trasplante alogénico y es un inhibidor de mTOR, que es un regulador de las funciones celulares graves incluido el comportamiento de APC y linfocitos T. Los nanoportadores sintéticos se prepararon de acuerdo con los ejemplos representativos anteriores, los cuales se describen más detalladamente en las siguientes tablas (Tablas 2-4).
TABLA 2 Nanoportadores sintéticos que contienen tanto rapamicina como un nivel bajo de concentración de ovoalbúmina (323-339) TABLA 3 Nanoportadores sintéticos que contienen tanto rapamicina como un nivel alto de concentración de ovoalbúmina (323-339) TABLA 4 Nanoportadores sintéticos que contienen rapamicina Los resultados de un análisis por citometría de flujo representativo muestran un aumento en el número de células CD4+CD25altoFoxP3+ (Fig. 1) cuando las DC se trataron con rapamicina libre y ovoalbúmina (323-339) libre.
La rapamicina libre o los nanoportadores sintéticos que contienen rapamicina se combinaron con ovoalbúmina (323-339) soluble libre para evaluar la inducción de tDC (Fig. 2). Se descubrió que los nanoportadores que contienen rapamicina combinados con ovoalbúmina (323-339) libre inducen el desarrollo de Treg. Resumiendo, los tDC específicos para antígenos se obtuvieron aislando células dendríticas (esplenocitos CD11c+) y cultivándolas combinadas con el péptido (323-339) de ovoalbúmina junto con rapamicina soluble o encapsulada en nanoportadores (nanoportadores sintéticos # 13, 14, 15 y 16) durante 2 horas y a continuación mediante lavado extensivo. Se aislaron células CD4+CD25" respondedoras purificadas de ratones OTII y se añadieron a las tDC. A continuación, la mezcla de tDC y linfocitos T de OTII se cultivó durante 4-5 días, y la frecuencia de linfocitos Treg (CD4+CD25altoFoxP3+) se analizó mediante citometría de flujo. Los datos muestran un aumento dependiente de la dosis en CD4+CD25altoFoxP3+ tanto para la rapamicina libre como la rapamicina encapsulada en nanoportadores lo cual sugiere la inducción de Treg por células DC tratadas con nanoportadores de rapamicina.
Se utilizaron diversas composiciones de nanoportadores para evaluar la inducción de tDC (Fig. 3) y se demostró la inducción de Treg. Se descubrió que los nanoportadores con rapamicina y péptido (323-339) de ovoalbúmina coencapsulados dieron como resultado una inducción mayor de células que expresaban FoxP3 (6.5%) que los no estimulados (1.3%) o que contenían rapamina sola (2.7%). Curiosamente, dos composiciones de nanoportadores independientes que contenían rapamicina sola (Nanoportadores sintéticos # 7 y 8) demostraron una inducción superior de células que expresaban FoxP3 (22.4% y 27.2%, respectivamente) cuando se combinaron con una población de nanoportadores sintéticos que contenían ovoalbúmina (323-339) en comparación con una mezcla con péptido (323-339) de ovoalbúmina libre (12.7% y 17.7%, respectivamente). En conjunto, los datos muestran un aumento en CD4+CD25altoFoxP3+ cuando se utiliza rapamicina encapsulada en nanoportadores con respuestas superiores observadas con péptido (323-339) de ovoalbúmina coencapsulado o con nanoportadores que contienen péptido (323-339) de ovoalbúmina combinado.
EJEMPLO 6 Evaluación de la respuesta inmunitaria tolerogénica mediante un análisis fenotípico de linfocitos T (teórico) Se disuelve una composición de la invención en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se inyecta por vía intramuscular en ratas Lewis hembra en 0.1-0.2 ml_ que contienen 500 g de la composición. Un grupo de ratas de control recibe 0.1-0.2 ml_ de PBS. Entre nueve y diez días después de la inyección, se extirpan el bazo y los ganglios linfáticos de las ratas y se obtienen suspensiones de células de un único tipo macerando los tejidos a través de un filtro celular de nailon de 40 µ?t?. Las muestras se tiñen en PBS (FCS al 1%) con la dilución adecuada de anticuerpos monoclonales relevantes. Las células teñidas con yoduro de propidio se excluyen del análisis. Se adquieren muestras en un citómetro de flujo LSR2 (BD Biosciences, EE. UU.) y se analizan utilizando el software FACS Diva. Se analiza la expresión de los marcadores CD4, CD25alto y FoxP3 en las células. La presencia de células CD4+CD25altoFoxP3+ sugiere una inducción de linfocitos Treg CD4+.
EJEMPLO 7 Evaluación de la respuesta inmunitaria tolerogénica a antígenos presentables por APC in vivo (teórico) Se inmunizan ratones Balb/c con antígeno presentable por APC en adyuvante de Freund incompleto para inducir la proliferación de linfocitos T (p. ej., linfocitos T CD4+) cuyo nivel se evalúa. Subsecuentemente, se administra una composición de la invención que comprende el antígeno presentable por APC y un inmunosupresor por vía subcutánea de un modo dependiente de la dosis. A continuación, los mismos ratones se exponen de nuevo al antígeno presentable por APC y se vuelve a evaluar el nivel de proliferación de linfocitos T. Los cambios en la población de linfocitos T se monitorizan posteriormente con una reducción en la proliferación de linfocitos T tras la subsecuente estimulación con el antígeno presentable por APC lo cual indica que se ha producido una respuesta inmunitaria tolerogénica.
EJEMPLO 8 Evaluación de las respuestas inmunitarias tolerogénicas con nanoportadores sintéticos que comprenden inmunosupresores y antíqenos presentables por APC in vivo Materiales y métodos para producir nanoportadores sintéticos Nanoportador 1 La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; # de catálogo del producto R1017). El PLGA con una proporción de láctido.glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0.75 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211 ; código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó un copolímero en bloque de PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20 000 Da. El alcohol polivinílico (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como se indica a continuación: Solución 1: Rapamicina con una concentración de 50 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo la rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 2: PLGA con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
Se utilizó una emulsión de aceite en agua (O/W) para preparar los nanoportadores. La emulsión O/W se preparó combinando la solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.75 mL), la solución 3 (0.25 mL) y la solución 4 (3 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión O/W se añadió a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifugación, centrifugando a 21 000xg y 4 °C durante 45 min, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores final de aproximadamente 10 mg/mL.
El tamaño de los nanoportadores se determinó mediante dispersión de luz dinámica. La cantidad de rapamicina en el nanoportador se determinó mediante análisis por HPLC. La masa seca total del nanoportador por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
Nanoportador 2 El péptido 323-339 de ovoalbúmina, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de linfocitos T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió en Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; # de pieza 4065609). El PLGA con una proporción de láctido:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0.75 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211 ; código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó un copolímero en bloque de PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20 000 Da. El alcohol polivinílico (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como se indica a continuación: Solución 1 : Péptido 323-339 de ovoalbúmina con una concentración de 20 mg/mL en una solución acuosa de ácido clorhídrico diluido. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en una solución 0.13 M de ácido clorhídrico a temperatura ambiente. Solución 2: PLGA con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
En primer lugar, se preparó una emulsión primaria de agua en aceite (W1/01). La W1/01 se preparó combinando la solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.75 mL) y la solución 3 (0.25 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 50% durante 40 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. A continuación, se preparó una emulsión secundaria (W1/01/W2) combinando la solución 4 (3.0 mL) con la emulsión primaria W1/01 , agitando en un vórtex durante 10 s y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos utilizando el sonicador Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión W1/01/W2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavaron transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifugación, centrifugando a 75 600*g y 4 °C durante 35 min, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores final de aproximadamente 10 mg/mL.
El tamaño de los nanoportadores se determinó mediante dispersión de luz dinámica. La cantidad de péptido en el nanoportador se determinó mediante análisis por HPLC. La masa seca total del nanoportador por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
Nanoportador 3 La simvastatina se adquirió en LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; # de catálogo del producto S3449). El PLGA con una proporción de láctido:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0.75 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211 ; código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó un copolímero en bloque de PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20 000 Da. El alcohol polivinílico (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como se indica a continuación: Solución 1: Simvastatina con una concentración de 50 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo la simvastatina en cloruro de metileno puro. Solución 2: PLGA con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
Se utilizó una emulsión de aceite en agua (O/W) para preparar los nanoportadores. La emulsión O/W se preparó combinando la solución 1 (0.15 mL), la solución 2 (0.75 mL), la solución 3 (0.25 mL) y la solución 4 (3 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión O/W se añadió a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavó transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifugación, centrifugando a 75 600*g y 4 °C durante 35 min, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores final de aproximadamente 10 mg/mL.
El tamaño de los nanoportadores se determinó mediante dispersión de luz dinámica. La cantidad de simvastatina en el nanoportador se determinó mediante análisis por HPLC. La masa seca total del nanoportador por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
Nanoportador 4 El péptido 323-339 de ovoalbúmina, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de linfocitos T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió en Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; # de pieza 4065609). La rapamicina se adquirió en TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, A 01702; # de catálogo del producto R1017). El PLGA con una proporción de láctido:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0.75 dL/g se adquirió en SurModics Phamnaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211 ; código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó un copolímero en bloque de PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20 000 Da. El alcohol polivinílico (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como se indica a continuación: Solución 1: Péptido 323-339 de ovoalbúmina con una concentración de 20 mg/mL en una solución acuosa de ácido clorhídrico diluido. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en una solución 0.13 M de ácido clorhídrico a temperatura ambiente. Solución 2: Rapamicina con una concentración de 50 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo la rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLGA con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 4: PLA-PEG con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 5: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
En primer lugar, se preparó una emulsión primaria de agua en aceite (W1/01). La W1/01 se preparó combinando la solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.2 mL), la solución 3 (0.75 mL) y la solución 4 (0.25 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 50% durante 40 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. A continuación, se preparó una emulsión secundaria (W1/01/W2) combinando la solución 5 (3.0 mL) con la emulsión primaria W1/01 , agitando en un vórtex durante 10 s y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos utilizando el sonicador Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión W1/01/W2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavaron transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifugación, centrifugando a 21 000*g y 4 °C durante 45 min, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores final de aproximadamente 10 mg/mL El tamaño de los nanoportadores se determinó mediante dispersión de luz dinámica. Las cantidades de péptido y rapamicina en el nanoportador se determinaron mediante análisis por HPLC. La masa seca total del nanoportador por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
Nanoportador 5 El péptido 323-339 de ovoalbúmina, un péptido de 17 aminoácidos que se sabe que es un epítopo de linfocitos T y B de la proteína ovoalbúmina, se adquirió en Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; # de pieza 4065609). La simvastatina se adquirió en LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; # de catálogo del producto S3449). El PLGA con una proporción de láctido:glicólido de 3:1 y una viscosidad inherente de 0.75 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211 ; código de producto 7525 DLG 7A). Se sintetizó un copolímero en bloque de PLA-PEG con un bloque de PEG de aproximadamente 5000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 20 000 Da. El alcohol polivinílico (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como se indica a continuación: Solución 1 : Péptido 323-339 de ovoalbúmina con una concentración de 20 mg/mL en una solución acuosa de ácido clorhídrico diluido. La solución se preparó disolviendo el péptido de ovoalbúmina en una solución 0.13 M de ácido clorhídrico a temperatura ambiente. Solución 2: Simvastatina con una concentración de 50 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo la simvastatina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLGA con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 4: PLA-PEG con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 5: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
En primer lugar, se preparó una emulsión primaria de agua en aceite (W1/01). La W1/01 se preparó combinando la solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.15 mL), la solución 3 (0.75 mL) y la solución 4 (0.25 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 50% durante 40 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier 250. A continuación, se preparó una emulsión secundaria (W1/01/W2) combinando la solución 5 (3.0 mL) con la emulsión primaria W1/01 , agitando en un vórtex durante 10 s y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos utilizando el sonicador Branson Digital Sonifier 250.
La emulsión W1/01/W2 se añadió a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 ml_) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavaron transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifugación, centrifugando a 75 600xg y 4 °C durante 35 min, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores final de aproximadamente 10 mg/mL.
El tamaño de los nanoportadores se determinó mediante dispersión de luz dinámica. Las cantidades de péptido y simvastatina en el nanoportador se determinaron mediante análisis por HPLC. La masa seca total del nanoportador por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
Administración 1 in vivo Se extirparon bazos de ratones B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) y C57BL/6 (B6), se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 µ? para obtener una suspensión de células de un único tipo. Las células CD4+CD25- purificadas se extrajeron posteriormente en un proceso de dos pasos. Utilizando un separador celular magnético AutoMACS de Miltenyi Biotec, se marcaron primero las células de los bazos con un kit II de aislamiento de linfocitos T CD4+ y se eliminaron las células CD25+ de la fracción no marcada con un kit de depleción de CD25. Las células de B6 purificadas se tiñeron con colorante intracelular, éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), antes de mezclarlas en concentraciones iguales con las células de OTII purificadas. A continuación, se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) en ratones receptores B6.SJL-Pfprca/BoyAi (CD45.1).
Al día siguiente, los ratones receptores CD45.1 se trataron con partículas de vacuna sintética tolerogénicas dirigidas (^SVP). Se cargaron con combinaciones de péptido (323-339) de ovoalbúmina (OVA 323-339)_ rapamicina (Rapa) y/o simvastatina (Simva), y se administraron por vía subcutánea (s.c).
La inyección constituye un tratamiento tolerogénico, después del cual se realizaron 4 inyecciones más, en intervalos de 2 semanas entre cada una. Una vez se completó el régimen de tratamiento, los animales CD45.1 receptores se sacrificaron y se extirparon sus bazos y ganglios linfáticos poplíteos, se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 µ? para obtener una suspensión de células de un único tipo. Se eliminaron los eritrocitos (RBC, por sus siglas en inglés) de las células de los bazos incubando con tampón de lisis de RBC (Stem Cell Technologies) y se realizaron recuentos celulares tanto en los bazos como en los ganglios linfáticos.
Las células de los bazos o los ganglios linfáticos se cultivaron en CM (siglas en inglés de medio completo) suplementado con 10 U/mL de IL-2, se volvieron a estimular con OPII con una densidad de 0.3x106 células/pocilio en placas de fondo redondo (RB, por sus siglas en inglés) de 96 pocilios y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2. Las células se dividieron el Día 2 y se recogieron el Día 5. Se recogió el sobrenadante y se congeló, mientras que las células se tiñeron para el análisis fenotípico por citometría de flujo. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FacsCanto de Becton Dickinson.
Administración 2 ¡n vivo Se extirparon bazos de ratones B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) y C57BL/6 (B6), se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 µ? para obtener una suspensión de células de un único tipo. Las células CD4+CD25- purificadas se extrajeron posteriormente en un proceso de dos pasos utilizando un separador celular magnético AutoMACS de Miltenyi Biotec. Las células de los bazos se marcaron utilizando un kit II de aislamiento de linfocitos T CD4+ de Miltenyi. Se eliminaron las células CD25+ de la fracción de linfocitos T CD4+ no marcada con un kit de depleción de CD25. Las células CD4 purificadas de ratones B6 se tiñeron con colorante intracelular, éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), antes de mezclarlas en concentraciones ¡guales con las células de OTII purificadas. A continuación, se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) en ratones receptores B6.SJL-Pfprca/BoyAi (CD45.1).
Al día siguiente, los ratones receptores CD45.1 se trataron con partículas de vacuna sintética tolerogénicas dirigidas. Estas comprendían combinaciones de péptido (323-339) de ovoalbúmina (OVA 323-339), rapamicina (Rapa) y simvastatina (Simva), y se administraron por vía subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.).
Una vez se completó el régimen de tratamiento, los animales CD45.1 receptores se sacrificaron y se extirparon sus bazos y ganglios linfáticos poplíteos, se disociaron mecánicamente y se filtraron por separado a través de un tamiz de 70 µ? para obtener una suspensión de células de un único tipo. Se eliminaron los eritrocitos (RBC, por sus siglas en inglés) de las células de los bazos mediante la incorporación de tampón de lisis de RBC (Stem Cell Technologies) y se realizaron recuentos celulares tanto en los bazos como en los ganglios linfáticos.
Las células de los bazos o los ganglios linfáticos se cultivaron en CM suplementado con 10 U/mL de IL-2, se volvieron a estimular con OPII 1 µ? con una densidad de 0.3x106 células/pocilio en placas de fondo redondo (RB) de 96 pocilios y se incubaron a 37°C, 5% de C02. Las células se dividieron el Día 2 y se recogieron el Día 5. Se recogió el sobrenadante y se congeló, mientras que las células se tiñeron para el análisis fenotípico por citometría de flujo. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FacsCanto de Becton Dickinson.
Resultados Los resultados se muestran en las Figs. 4 y 5 (Inmunomodulador 1 : rapamicina; inmunomodulador 2: simvastatina). Las figuras muestran los efectos ¡n vivo y demuestran que el número de células inmunitarias se reduce con los nanoportadores sintéticos que comprenden antígeno e inmunosupresores en comparación con el nanoportador con antígeno únicamente. La Fig. 5 demuestra un aumento en el porcentaje de células inmunitarias que expresan FoxP3 con nanoportadores sintéticos que comprenden antígeno e inmunosupresor.
EJEMPLO 9 Evaluación de la activación de CD69 con nanoportadores sintéticos que comprenden inmunosupresor Nanoportadores Se adquirió a-galactosilceramida (KRN7000) en Avanti Polar Lipids, Inc. (700 Industrial Park Drive Alabaster, Alabama 35007-9105; número de catálogo 867000P). El PLGA con una proporción de láctido:glicólido de 1 :1 y una viscosidad inherente de 0.45 dl_/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211 ; código de producto 5050 DLG 4.5A). El alcohol polivinílico (85-89% hidrolizado) se adquirió en EMD Chemicals (número de producto 1.41350.1001).
Las soluciones se prepararon como se indica a continuación: Solución 1 : KRN7000 en una concentración de 2 mg/mL en sulfóxido de dimetilo (DMSO). La solución se preparó disolviendo el lípido anhidro en DMSO puro. Solución 2: PLGA con una concentración de 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo el PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 3: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.
Se preparó una emulsión de agua en aceite (W/O) combinando la solución 1 (1 mL), la solución 2 (1 mL) y la solución 3 (3 mL) en un tubo de presión pequeño y sonicando con una amplitud del 30% durante 60 segundos con un sonicador Branson Digital Sonifier modelo 250, con el tubo de presión sumergido en un baño de agua helada. La emulsión W/O se añadió a continuación a un vaso de precipitados que contenía solución tampón de fosfato 70 mM, pH 8 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el cloruro de metileno se evaporara y se formaran los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lavaron transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifugación, centrifugando a 75 600*g a 4 °C durante 45 min, retirando el sobrenadante y volviendo a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato. El procedimiento de lavado se repitió y el pellet se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportadores final de aproximadamente 10 mg/mL. El tamaño de los nanoportadores se determinó mediante dispersión de luz dinámica. La cantidad de KRN7000 en el nanoportador se presenta como la carga teórica sin que se hayan producido pérdidas durante el procesamiento. La masa seca total del nanoportador por mL de suspensión (concentración de NP) se determinó mediante un método gravimétrico.
Inmunización Se asignaron ratones a grupos que recibieron únicamente PBS, sol. de aGC+soIRAPA, sol. de aGC+NP RAPA. Los ratones se inyectaron a las 9 am y las 9.30 am recibieron BrefeldinA i.v. para evitar la liberación de las citocinas ¡ntracelulares producidas. A la 1 pm, los ratones se sacrificaron, se perfundió PBS en el hígado y este se procesó para obtener una suspensión de células de un único tipo enriquecida en linfocitos. Las células se tiñeron con marcadores de la superficie celular para los linfocitos iNKT (tetrámeros CD1d cargados con age) y el receptor de linfocitos T (TCRb), y el marcador de la activación CD69. Las células se adquirieron en un citómetro de flujo FacsCanto y se analizaron con un FlowJo.
Resultados Los linfocitos iNKT de los ratones que habían recibido aGC se activaron tal como indican la producción de citocinas y el aumento de CD69 en su superficie. Tanto la rapamicina de los nanoportadores como la soluble provocó una reducción significativa de los niveles superficiales de CD69 en los linfocitos iNKT, lo cual sugiere que las células se activaron menos después del tratamiento en comparación con el control de tratamiento con PBS. Los resultados se muestran en la Fig. 6.
EJEMPLO 10 Nanoportadores de núcleo-cubierta de sílice mesoporosa-oro que contienen ovoalbúmina (teórico) Se crean núcleos de nanopartículas de Si02 mesoporosa mediante un proceso sol-gel. Se disuelve bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) (0.5 g) en agua desionizada (500 mL) y a continuación se añade una solución acuosa 2 M de NaOH (3.5 mL) a la solución de CTAB. La solución se agita durante 30 min y a continuación se añade tetraetoxisilano (TEOS) (2.5 mL) a la solución. El gel resultante se agita durante 3 h a una temperatura de 80 °C. El precipitado blanco que se forma se captura por filtración, seguida de lavado con agua desionizada y secado a temperatura ambiente. El surfactante restante se extrae a continuación de las partículas por suspensión en una solución etanólica de HCI durante la noche. Las partículas se lavan con etanol, se centrifugan y se vuelven a dispersar con ultrasonicación. Este procedimiento de lavado es repite dos veces más.
Las nanopartículas de Si02 se funcionalizan posteriormente con grupos amino utilizando (3-aminopropil)trietoxisilano (APTMS). Para hacer esto, las partículas se suspenden en etanol (30 mL) y se añade APTMS (50 µ?_) a la suspensión. La suspensión se deja reposar a temperatura ambiente durante 2 h y después se hierve durante 4 h, manteniendo el volumen constante mediante adiciones periódicas de etanol. Los reactivos remanentes se eliminan con cinco ciclos de lavado mediante centrifugación y redispesión en etanol puro.
En una reacción independiente, se crean semillas de oro con un diámetro de 1-4 nm. Toda el agua empleada en esta reacción se desioniza primero y después se destila en vidrio. Se introduce agua (45.5 mL) en un matraz de fondo redondo de 100 mL. Mientras se agita, se añade NaOH acuoso 0.2 M (1.5 mL), seguido de una solución acuosa al 1% de cloruro de tetrakis(hidroximetil)fosfonio (THPC) (1.0 mL). Dos minutos después de añadir la solución de THPC, se añade una solución acuosa de 10 mg/mL de ácido cloroáurico (2 mL), la cual se ha dejado reposar al menos 15 min. Las semillas de oro se purifican mediante diálisis frente a agua.
Para formar los nanoportadores de núcleo/cubierta, las nanopartículas de Si02 funcionalizadas con grupos amino formadas anteriormente se mezclan primero con las semillas de oro durante 2 h a temperatura ambiente. Las partículas de Si02 decoradas con oro se recogen mediante centrifugación y se mezclan con una solución acuosa de ácido cloroáurico y bicarbonato de potasio para formar la cubierta de oro. A continuación, las partículas se lavan mediante centrifugación y se vuelven a dispersar en agua. Se carga ovoalbúmina tiolada (preparada tratando ovoalbúmina con clorhidrato de 2-iminotiolano) suspendiendo las partículas en una solución de ovoalbúmina tiolada (1 mg/L) durante 72 h. Las partículas se lavan en forma de pellet con 1x PBS (pH 7.4) para eliminar la proteína libre. A continuación, los nanoportadores de núcleo-cubierta de sílice-oro resultantes que contienen ovoalbúmina se vuelven a suspenden en 1x PBS para su análisis y ensayos posteriores.
EJEMPLO 11 Liposomas que contienen rapamicina y ovoalbúmina (teórico) Los liposomas se forman mediante hidratación de película fina. Se disuelven 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (32 pmol), colesterol (32 pmol) y rapamicina (6.4 pmol) en cloroformo puro (3 mL). Esta solución lipídica se añade a un tubo de vidrio de 10 mL, y el disolvente se elimina con una corriente de nitrógeno gaseoso y se deseca durante 6 h al vacío. Se obtienen vesículas multilamelares mediante la hidratación de la película con 2.0 mL de tampón MOPS 25 mM, pH 8.5, que contiene una cantidad en exceso de ovoalbúmina. El tubo se agita en un vórtex hasta que la película lipídica se separa de la superficie del tubo. Para dividir las vesículas multilamelares en monolamelares, se aplican diez ciclos de congelación (nitrógeno líquido) y descongelación (baño de agua a 30 °C). A continuación, la muestra se diluye hasta 1 mL en tampón MOPS 25 mM, pH 8.5. El tamaño del liposoma resultante se homogeneiza por extrusión haciendo pasar la muestra 10 veces a través de filtros de policarbonato con poros de 200 nm. Los liposomas resultantes se utilizan posteriormente para su análisis y bioensayos posteriores.
EJEMPL0 12 Nanoportadores poliméricos compuestos por poliaminoácido modificado con ovoalbúmina conjugada en su superficie (teórico) Paso-1. Preparación de poli(ácido ?-glutámico) (?-?T?) modificado con éster etílico de L-fenilalanina (L-PAE): Se disuelven 4.7 unidades en mmol de ?-PGA (Mn= 300 kD) en solución acuosa 0.3 N de NaHC03 (50 ml_). Se añaden L-PAE (4.7 mmol) y EDC.HCI (4.7 mmol) a la solución y se agita durante 30 min a 4 °C. La solución se mantiene posteriormente a temperatura ambiente con agitación durante 24 h. Los productos químicos de bajo peso molecular se eliminan por diálisis utilizando una membrana de diálisis con un PMNL (peso molecular nominal límite) de 50 kD. El y-PGA-injerto-L-PAE resultante se obtiene por liofilización.
Paso-2. Preparación de nanopartículas a partir del polímero ?-PGA-injerto-L-PAE: Las nanopartículas compuestas de ?-PGA-injerto-L-PAE se preparan mediante un método de precipitación y diálisis. Se disolvió ?-PGA-injerto-L-PAE (20 mg) en 2 mL de DMSO y a continuación se añadieron 2 mL de agua para formar una solución translúcida. Posteriormente, la solución se dializó frente a agua destilada utilizando un tubo de membrana de celulosa (PMNL= 50 000) para formar las nanopartículas y para eliminar los disolventes orgánicos durante 72 h a temperatura ambiente. El agua destilada se reemplazó en intervalos de 12 h. La solución de nanopartículas resultante (10 mg/mL en agua) se utilizó posteriormente para su conjugación con el antígeno.
Paso-3. Conjugación de ovoalbúmina con nanopartículas de ?-PGA: Los grupos ácido carboxílico superficiales de las nanopartículas de ?-PGA (10 mg/mL) se activan primero con EDC y NHS (10 mg/mL de cada uno en tampón de fosfato, pH 5.8) durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras lavar en forma de pellet para eliminar el exceso de EDC/NHS, las nanopartículas activadas se mezclan con 1 mL de ovoalbúmina (10 mg/mL) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4) y la mezcla se incuba a 4-8 °C durante 24 h. Las nanopartículas de ?-PGA conjugadas con ovoalbúmina resultantes se lavan dos veces con PBS y se vuelven a suspender con una concentración de 5 mg/mL en PBS para su análisis y bioensayos posteriores.
EJEMPLO 13 Nanopartículas de v-PGA con eritropovetina (EPO) encapsulada (teórico Para preparar las nanopartículas de ?-PGA con EPO encapsulada, se disuelven 0.25-4 mg de EPO en 1 mL de PBS (pH 7.4) y se añade 1 mL del ?-PGA-injerto-L-PAE (10 mg/mL en DMSO) a la solución de EPO. La solución resultante se centrifuga a 14 000 x g durante 15 min y se vuelve a lavar repetidamente con PBS. Las nanopartículas de ?-PGA con EPO encapsulada resultantes se vuelven a suspender posteriormente en PBS (5 mg/mL) para su análisis y bioensayo posteriores.
EJEMPL0 14 Preparación de nanoportadores de oro (AuNC) que contienen ovoalbúmina (teórico) Paso-1. Formación de nanoportadores de oro (AuNC): Se calienta una solución ac. de 500 mL de HAuCI4 1 mM hasta reflujo durante 10 min con agitación vigorosa en un matraz de fondo redondo de 1 L equipado con un condensador. A continuación se añade rápidamente una solución de 50 mL de citrato de trisodio 40 mM a la solución agitada. La solución de color vino tinto intenso resultante se mantiene a reflujo durante 25-30 min, se deja de calentar y la solución se enfría hasta temperatura ambiente. A continuación, la solución se filtra a través de un filtro de membrana de 0.8 pm para proporcionar la solución de AuNC. Los AuNC se caracterizan empleando espectroscopia visible y microscopía electrónica de transmisión. Los AuNC tienen un diámetro de aproximadamente 20 nm, están bloqueados con citrato y presentan una absorción máxima a 520 nm.
Paso-2. Conjugación de ovoalbúmina con AuNC: Una solución de 150 pL de ovoalbúmina tiolada (10 µ? en tampón de carbonato 10 mM, pH 9.0) se añade a 1 mL de nanoportadores de oro bloqueados con citrato con un diámetro de 20 nm (1.16 nM) para producir una relación molar de tiol frente a oro de 2500:1. La mezcla se agita a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 1 hora para permitir que se complete el intercambio de tiol con citrato en los nanoportadores de oro. A continuación, los AuNC con ovoalbúmina sobre la superficie se purifican por centrifugación a 12 000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se decanta y el pellet que contiene AuNC-ovoalbúmina se lava en forma de pellet con 1x tampón PBS. A continuación, los nanoportadores de oro-ovoalbúmina se vuelven a suspender en un tampón adecuado para su análisis y bioensayos posteriores.
F. Referencias La enumeración de cualquier referencia en la presente no supone una admisión de que la referencia o su contenido sea una técnica anterior.
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Delivery of rapamycin-loaded nanoparticle down regulates ICAM-1 expression and maintains an immunosuppressive profile in human CD34+ progenitor-derived dendritic cells. Das S, Haddadi A, Veniamin S, Samuel J. J Biomed Mater Res A. 15 de junio de 2008;85(4):983-92.
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Rapamycin-conditioned donor dendritic cells differentiate CD4CD25Foxp3 T cells in vitro with TGF-beta1 for islet transplantation. Pothoven KL, Kheradmand T, Yang Q, Houlihan JL, Zhang H, Degutes M, Miller SD, Luo X. Am J Transplant. Agosto de 2010; 10(8): 1774-84.
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Claims (42)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende: (i) una primera población de nanoportadores sintéticos acoplados a un inmunosupresor y (ii) un antígeno presentable por APC.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el inmunosupresor en la composición está en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria tolerogénica al antígeno presentable por APC.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque el antígeno presentable por APC está acoplado a los nanoportadores sintéticos de la primera población de nanoportadores sintéticos.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque el antígeno presentable por APC está acoplado a los nanoportadores sintéticos de una segunda población de nanoportadores sintéticos.
5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población es un diámetro superior a 100 nm.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el diámetro es superior a 150 nm.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el diámetro es superior a 200 nm.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el diámetro es superior a 250 nm.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el diámetro es superior a 300 nm.
10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada además porque el inmunosupresor comprende una estatina, un inhibidor de mTOR, un agente señalizador de TGF-ß, un corticosteroide, un inhibidor de la función mitocondrial, un inhibidor de P38, un inhibidor de NF-?ß, un agonista de los receptores de adenosina, un agonista de la prostaglandina E2, un inhibidor de la fosfodiesterasa 4, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de proteasomas.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el inhibidor de mTOR es rapamicina.
12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizada además porque el antígeno presentable por APC comprende un epítopo restringido por MHC de clase I y/o MHC de clase II.
13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizada además porque el antígeno presentable por APC es un lípido que se une a CD1d.
14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque el antígeno presentable por APC es una proteína terapéutica o porción de la misma, un autoantígeno o un alérgeno, o está asociado con una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia, el rechazo de un órgano o tejido, o la enfermedad del injerto contra el huésped.
15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada además porque la carga del inmunosupresor en promedio en la población de los primeros nanoportadores sintéticos es entre 0.0001% y 50% (peso/peso).
16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque la carga del inmunosupresor en promedio en la población de los primeros nanoportadores sintéticos es entre 0.1% y 10% (peso/peso).
17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada además porque la carga del antígeno presentable por APC en promedio en la población de los primeros y/o segundos nanoportadores sintéticos es entre 0.0001% y 50% (peso/peso).
18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque la carga del antígeno presentable por APC en promedio en la población de los primeros y/o segundos nanoportadores sintéticos es entre 0.1% y 10% (peso/peso).
19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada además porque los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos comprenden nanopartículas lipídicas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsiones a base de surfactantes, dendrímeros, futbolenos, nanohilos, partículas pseudovíricas, o partículas peptídicas o proteicas.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos comprenden nanopartículas poliméricas, las nanopartículas poliméricas comprenden polímero que es polímero Plurónico no terminado en metoxi.
21. La composición de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizada además porque las nanopartículas poliméricas comprenden un poliéster, un poliéster acoplado a un poliéter, poliaminoácido, policarbonato, poliacetal, policetal, polisacárido, polietiloxazolina o polietilenimina.
22. La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque el poliéster comprende un poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o policaprolactona.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, caracterizada además porque las nanopartículas poliméricas comprenden un poliéster y un poliéster acoplado a un poliéter.
24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizada además porque el poliéter comprende polietilenglicol o polipropilenglicol.
25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada además porque la relación entre las dimensiones de los nanoportadores sintéticos de la primera y/o segunda población de nanoportadores sintéticos es superior a 1 :1 , 1 :1.2, 1:1.5, 1 :2, 1 :3, 1:5, 1 :7 ó 1:10.
26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada además porque la composición además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
27. Una forma de dosificación que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.
28. El uso de la forma de dosificación para la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria tolerogénica específica al antígeno presentable por APC en un sujeto.
29. El uso como se reclama en la reivindicación 28, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable al sujeto de acuerdo con un protocolo que se mostró previamente que resultó en una respuesta inmunitaria tolerogénica específica al antígeno presentable por APC en uno o más sujetos de prueba.
30. El uso como se reclama en la reivindicación 28 ó 29, en donde el sujeto se proporciona o identifica adicionalmente.
31. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde la generación de la respuesta inmunitaria tolerogénica específica al antígeno presentable por APC se analiza adicionalmente en el sujeto.
32. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 28-31 , en donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia, el rechazo de un órgano o tejido, o la enfermedad del injerto contra el huésped o ha experimentado o experimentará un trasplante.
33. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde el sujeto ha recibido, está recibiendo o recibirá una proteína terapéutica contra la cual ha experimentado, están experimentando o se espera que experimenten una respuesta inmunitaria no deseada.
34. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por administración intravenosa, transmucosal, intraperitoneal, oral, subcutánea, pulmonar, intranasal, intradermal o intramuscular.
35. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inhalación o por administración intravenosa, subcutánea o transmucosal.
36. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o forma de dosificación de la reivindicación 27 para usarse en terapia o profilaxis.
37. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o forma de dosificación de la reivindicación 27 para usarse en la terapia o profilaxis en un sujeto que ha experimentado o experimentará un trasplante, o que ha recibido, está recibiendo o recibirá una proteína terapéutica contra la que se ha experimentado, se está experimentando o se espera que se experimente una respuesta inmunitaria no deseada.
38. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o forma de dosificación de la reivindicación 27 para usarse en la inducción de una respuesta inmunitaria tolerogénica especifica al antígeno presentable por APC.
39. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o forma de dosificación de la reivindicación 27 para usarse en la inducción de una respuesta inmunitaria tolerogénica.
40. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o forma de dosificación de la reivindicación 27 para usarse en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad inmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia, enfermedad del injerto contra el huésped o una respuesta inmunitaria no deseada.
41. La forma de dosificación para usarse de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la composición o forma de dosificación está adaptada para ser administrable mediante las vías como se definen en la reivindicación 34 o reivindicación 35.
42. El uso de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o forma de dosificación de la reivindicación 27 para la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria tolerogénica específica al antígeno presentable por APC o la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia, una enfermedad del injerto contra el huésped o una respuesta inmunitaria no deseada.
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