CZ302352B6

CZ302352B6 - Zpusob prípravy extraktu poskytujících toleranci proti alergenu a jejich použití

Info

Publication number: CZ302352B6
Application number: CZ20001529A
Authority: CZ
Inventors: Berrens@Lubertus; Romano@Maria Leticia Gonzales; Camara@Maria Teresa Gallego
Original assignee: C. B. F. Leti, S. A.
Priority date: 1997-10-30
Filing date: 1997-10-30
Publication date: 2011-03-30
Also published as: AU729589C; DE69739174D1; US6660495B2; PT1024829E; JP3790099B2; CZ20001529A3; BR9714899A; EP2042192A2; PL187544B1; US6350590B1; WO1999022762A1; DK1024829T3; EP2042192A3; JP2001521907A; AU729589B2; US20020086348A1; EP1024829B1; CA2307655C; HUP0004831A2; ES2319341T3

Abstract

Zpusob kontrolovaného enzymatického štepení precištených a depigmentovaných aktivních alergenních proteinu z vnitrního i venkovního prostredí, pomocí kterého jsou získány fragmenty alergenu, které si zachovaly prirozené stimulacní T-bunecné epitopy, ale jsou zbaveny všech IgE vazebných B-bunecných míst a komplement aktivujících složek. Rešení také popisuje nové farmaceutické produkty. Tyto alergenní fragmenty nemají nevýhody konvencních alergenních extraktu pro imunoterapii a je možné je bezpecne použít pro poskytnutí stálé a specifické T-bunecné anergie a imunologické tolerance u alergických jedincu.

Description

Způsob přípravy extraktů poskytujících toleranci proti alergenu a jejich použití

Oblast techniky

Navrhovaný vynález popisuje proces kontrolovaného enzymatického štěpení přečištěných a depigmento váných aktivních alergenních proteinů venkovního i vnitřního prostředí, které dávají vzniknout fragmentům alergenů, které si zachovávají přirozené epitopy stimulující T-buňky, ale jsou zbaveny IgE vazebných B-buněčných epitopů a komplement aktivujících složek. Vynález také popisuje nové farmaceutické produkty. Tyto alergeny nevykazují nevýhody konvenčního alergenního extraktu určeného pro imunoterapii a mohou být bezpečně použity pro indukci specifické anergie T-buněk a navození imunologické tolerance u alergických pacientů.

Dosavadní stav techniky

Vodné extrakty různých substrátů z prostředí, jako je domovní prach, odpadlé částečky a zbytky pokožky zvířat, pylová zrna trav, plevelů, stromů a některé další substráty jsou běžně používány pro in vivo a in vivo diagnostiku alergických onemocnění, jako je bronchiální astma, vasomotorická rýma a senná rýma u lidí s vrozenou dispozicí, nazývaných „atopičtí“ pacienti. Od první klinické zprávy z r. 1911 od Noona a Freemana, jsou tyto extrakty také používány pro léčbu atopických alergických chorob pomocí podkožních injekcí vedoucích k „desenzitizaci“, „hyposenzitizaci“ nebo imunoterapii těchto onemocnění. Vzhledem k pozorováním, že kauzativní a predominantní alergenní komponentou těchto extraktů je proteinová složka o molekulové hmotnosti v rozmezí 10 000 až 70 000 (10 až 70 kDa), je běžnou praxí, při přípravě alergenních extraktů, dialyzovat nebo pomocí ultrafiltrace separovat vodný extrakt přes membránu propouštějící molekuly o velikosti nižší než 10 000 (10 kDa) a tak odstranit méně důležité molekuly o velikosti nižší než 10 000 (10 kDa) a dát tak vzniknout extraktu obsahujícímu multivalentní antigenní proteiny v rozmezí velikosti od 10 000 do 100 000 (10 do 100 kDa), tak aby se zlepšila kvalita alergenních extraktů pro klinickou aplikaci. V některých případech může být spodní hranice snížena na 3000 nebo 5000 (3 nebo 5 kDa).

V souladu se současnou teorií, podání alergenů z vnějšího prostředí člověku, způsobuje vytváření alergen - specifických protilátek třídy IgG nebo IgE. V imunologickém kontextu, mohou tedy být alergeny považovány za obvyklé antigeny indukující tvorbu IgG protilátek, obdařené však další vlastností a to buď díky speciálnímu charakteru molekuly nebo simultánní přítomnosti alergenního extraktu patřičných modulátorů, což vede k tvorbě protilátek třídy IgE. Za takové situace je možné tyto antigeny nazývat spíše „atopickými alergeny“ (1). Genetické predispozice, u člověka nazývané „atopické“ vedou k náchylnosti odpovídat na takový podnět zvýšenou tvorbou alergen -- specifických protilátek třídy IgE. Po počáteční indukci „senzitizaění“ fáze jakýkoliv další kontakt s alergenem vede k vzniku lokálních komplexů alergen - IgE protilátka, což je příčinou vzniku symptomů choroby. Konkrétněji, interakce alergenu se specifickou protilátkou navázanou na IgE receptor na buněčné membráně (např. na povrchu mastocytů nebo bazofilních leukocytů) vede ke spuštění sekvence biochemických reakcí vedoucích k uvolnění mediátorů zodpovědných za klinicky manifestovatelné symptomy alergie. O tom jak minimalizovat riziko anafylaktické reakce během imunoterapie byla popsána řada publikací. Poslední, WO 96/34 626 publikována 7. ledna 1996, popisuje nový farmaceutický prostředek pro použití při desenzitizaění terapii u pacientů trpících alergiemi. Tento prostředek obsahuje tyrosin a polymerizovaný antigen. Další postupy byly popsány již v osmdesátých letech, nejsou však dostatečně účinné. GBA-l 492 973 popisuje koprecipitaci tyrosinu a alergen, který byl modifikovaný látkou způsobující intramolekulámí propojení. EP-A-0 367 306 popisuje proces přípravy polymerizovaného alergenu také za použití propojovací látky což údajně vede ke snížení alergenicity. Další starší publikace EP-B- 0 038 154 vyšlá v roce 1981 popisuje léčbu alergenem s polysarkosinem, který jeho alergenicitu redukuje. Podle publikace je použitelný polysarkosin o molekulové hmotnosti 2000 až 12 000. V GB patentu 1 282 163 je popisována vylepšená forma terapie, kde alergenicita

- 1 CZ 302352 B6 alergenu je redukována inkubací s glutaraldehydem, což ponechává nezměněnou schopnost indukovat tvorbu blokujících protilátek, ale podstatně snižuje alergenicitu a tím je alergen daleko přijatelnější pro desenzitizační terapii. Alternativní postup popisuje GB patent 1 578 348 kde je uvedeno, že konjugát alergenu s polyethylen gly kolem je schopen vyvolat požadovaný terapeu5 tický efekt potlačením alergen specifické IgE produkce. O těchto materiálech je uváděno, že jsou nealergické a neimunogenní. Pro zamýšlenou imunoterapii alergických poruch pomocí tolerogenních fragmentů alergenů, tyto produkty mohou být velmi podobné přirozeným T-buněčným epitopům, které vytvářejí tzv. „antigen prezentující buňky“ (APC) pomocí kyselých hydrolýz a dalších enzymů za fyziologických podmínek. Tento konkrétní postup byl popsán v současném io stavu techniky v US patentu 4 338 297 a Evropském patentu EP 0 113 712 B1 (viz. reference 6 a 7). Takovými přirozenými elementy jsou i různé na peptid navázané haptenové struktury a mohou být napodobeny v laboratoři vystavením alergenní ho extraktu vlivu proteolytického štěpení za kontrolovaných podmínek. Jedna z mnoha možností výzkumu v této oblasti naznačuje, že léčba alergie může být prováděna pomocí derivátů alergenů, které neindukují tvorbu specifických protilátek třídy IgE, tzn. derivátů alergenů zbavených tzv. IgE-vazebné B-buněčné domény.

Existuje tedy celá řada různých cest jak připravit prostředek pro desenzitizaci např. redukcí alergen icity, které byly popsány v posledních dvaceti letech. Bylo vynaloženo značné úsilí zaměřit pozornost různými směry, ale bez valného výsledku. Pro lepší porozumění požadavkům léčby je zo nezbytné zjistit, co se ve skutečnosti děje během indukce a průběhu alergické reakce. Indukce imunitní reakce proti cizím antigenům, vyžaduje kooperaci různých kategorií buněk, např. v nejjednodušší variantě tzv. „antigen prezentujících buněk” (APC) a T a B lymfocytů. První signál, zejména mezi APC a T-lymfocyty je vyvolán fragmentem antigenního peptidů, který vzniká během intracelulámího zpracování (proteolytickým štěpením) cizorodého antigenu v APC, např.

v makrofágu. Cizí antigenní fragment (také známý jako T-buněčný epitop) je následně převeden na vnější membránu APC, kde bude vystaven ve formě ligandů asociovaného s membránově vázaným antigenem hlavního histokompatibilitního komplexu II třídy (MHC II). Některé populace pomocných T-lymfocytů (T_hl a T_h2 lymfocyty) rozeznávají tento T-buněčný epitop na APC a spolupracují mezi sebou a s imunoglobulíny sekretujícími B-buňkami, aktivace alergen specifických klonů T_h2-buněk pak pravděpodobně hraje klíčovou roli při vzniku atopického onemocnění u člověka. To se neděje pakliže jsou aktivovány lymfocyty třídy T_hl, T_h2 aktivované po kontaktu s APC exprimující správný T-buněčný epitop na svém povrchu, produkují relativně vysoká množství interleukinů 4 a 5 (Ib-4 a IL-5), které pak dohromady působí spolu s dalšími faktory jako cytokinový signál pro biosyntézu IgE v B-lymfocytech nebo plazmatických buňkách. Na tomto poznatku je založena současná teorie, že v případě „okamžité alergie Typ I“ (atopické) dochází k nepřiměřeně vysoké aktivaci T_h2 buněk vzhledem k buňkám T_hi, což vede k nadměrné syntéze IgE a cílem aktivní terapie je tedy přesunout rovnováhu alergen specifické T-buněčné reakce z Th2>Thj na Thi>T_h2. Zamýšlená manipulace s alergen specifickými Tbuněčnými klony pomocí T-buněčných epitopů derivovaných z alergenních molekul tedy nazna40 čuje novou možnou cestu imunoterapie, s tím omezením, že tyto epitopy se nesmí vázat nebo indukovat alergen specifické IgE protilátky (2, 3). Poslední klinické testy s některými syntetickými strukturně definovanými epitopy T-buněčných peptidů odvozenými od aminokyselinové sekvence zvoleného antigenu vážícího IgE získaného molekulárním klonováním a rekombinantní technologií zcela selhaly a nepřinesly žádný podstatný efekt (4, 5) a tak se zdá, že takový typ terapie nevede k požadovaným výsledkům.

Bez ohledu na uznávané teorie, je zcela jasné, že interakce mezi APC a T_h-buňkou vyžaduje kostimu lační faktory, kterými mohou být například některé membránové receptory. Existují také důkazy, že pokud je přítomen pouze první signál, tzn. rozeznání T-buněčného epitopu, může dojít kanergii T-buněk. Po úvodní fázi stimulace se stávají tyto T_h2 buňky neodpovídající na další stimulaci prostřednictvím alergenem pulsovaných APC.

T-buněčná anergie může být tedy indukována i u alergen specifických T_h2-buněčných klonů následně po stimulaci peptidem odvozeným od alergenu. Tyto anergické T_h buňky potom nemo55 hou indukovat tvorbu IgE B-buňkami, což výsledně vede ke snížení hladiny IgE v organismu.

Existují i některá předběžná klinická data, která podporují teorii že podávání nebo aplikace supra-optimálních dávek, nebo předem vytvořených MHC kompatibilních T-buněčných epitopů, může v absenci kostimuladního signálu a pravděpodobně i před vypuknutím choroby, indukovat T-buněčnou anergii a imunologickou toleranci (6, 7).

Extrakty individuálních zdrojů alergenních materiálů obsahují celou radu různých proteinových alergenů vážících IgE. Navíc, jakýkoliv individuální proteinová alergen z jednoho zdroje může obsahovat celou řadu různých T-buněčných epitopů nevážících IgE. Vzhledem k obrovskému množství epitopů aktivujících T-buňky a obtížnosti volby toho nej v hodnějšího tolerogenního peptidu, se zdá být rozumné, že efektivní širokospektrá imunoterapie pomocí T-buněčných epitopů může nejlépe probíhat pomocí fragmentů nevážících IgE získaných z přirozené knihovny alergenů izolovaných z přirozených materiálů, spíše než pomocí několika syntetických peptidů nebo dokonce rekombinantních alergenů. To se zdá být ještě důležitější v kontextu s pravděpodobnou chemickou povahou dominantních epitopů. Současné poznatky které tvrdí, že T15 buněčné epitopy jsou lineární peptidy o jasné aminokyselinové sekvenci, takže mohou byt, jakmile j«snn dostatečně nnnsánv produkovány svntetickv. Tento Dohled zcela Dooírá. že přirozeně se vyskytující alergeny procházejí většinou posttranslačními úpravami a modifikacemi postranních řetězců pomocí sacharidů nebo jiných organických látek připojených na proteinovou kostru. Tyto chemicky modifikované skupiny, obecně nazývané hapteny, často představují imu20 nodominantní místa, která setrvávají na enzymaticky produkovaných fragmentech alergenů, zcela však chybí na syntetických nebo rekombinantně produkovaných alergenech. Navíc, věda a technologie zabývající se alergeny je zcela bezmocná v nej důležitějším praktickém bodě, konkrétně v chemických a fyzikálních interakcích v širokém spektru komponent v nepřečištěném alergenním extraktu, vedoucí k degradaci produktu a vytváření nefyziologických molekulárních kom25 plexů. Z těchto důvodů v kombinaci s nedostatkem praktických výsledků s výše uvedenými prostředky, byla použita alternativní cesta tak, aby bylo možno připravit vhodnější prostředek pro léčbu alergií.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu přípravy extraktů poskytujících toleranci proti alergenu spočívající v tom, že se

a) extrahuje zdroj alergenního materiálu,

b) odstraní látky s molekulovou hmotností nižší než 3500 z rozpuštěných proteinových složek za vzniku frakce označované jako HMW-N,

c) odstraní taniny a melanoidiny, které jsou navázané k alergennímu materiálu v HMW-N frakci, přičemž vznikne depigmentovaná HMW-D frakce zbavená taninů a melanoidů a nekonjugované taniny a melanoidiny,

d) oxiduje HMW-D frakce oxidačním činidlem, ultrafialovým ozařováním nebo obojím za vzniku HMW-Dox frakce,

e) štěpí HMW-Dox frakce proteo lyrickým i enzymy až většina proteinových složek z HMWDox frakci má molekulovou hmotnost mezi 1000 až 10 000, a

f) odstraní materiál s molekulovou hmotností nižší než 1000 a materiál s molekulovou hmot45 ností přes 10 000 pomocí dialýzy a ultrafiltrace, přičemž se získá extrakt pro navození tolerance v jedinci a získají se proteinové složky s molekulovou hmotností mezi 1000 až 10 000.

Jak zvýše uvedeného vyplývá, imunitní systém zachází salergeny stejným způsobem jako s obvyklými antigeny. Toto tvrzení však nedává vysvětlení, proč alergeny, narozdíl od obyčej50 ných proteinových antigenů, indukují tvorbu specifických protilátek třídy IgE v tandemu s protilátkami IgG, a ani nedává vysvětlení proč pouze malé procento lidské populace (tzv. atopičtí pacienti), nejen že produkují zvýšené množství těchto protilátek třídy IgE, ale také vykazují klinicky manifestovatelné příznaky choroby. Je zřejmé, že musí být objasněny další faktory

-3CZ 302352 B6 ovlivňující tuto situaci, ještě před přípravou vhodného alergenu nebo jeho fragmentu pro potlačení patomechanismu alergické choroby. Jeden z těchto faktorů je systém komplementu a aktivace jeho komponent pomocí součástí alergen nich extraktů.

O vodných extraktech alergenních materiálů z vnitřního prostředí je již dlouho známo, že aktivují hemolytické složky komplementu (huC) v lidském séru in vitro (8). Chemické studie řady alergenních extraktů prokázaly téměř univerzální přítomnost produktů rozkladu organických látek, které obsahují >10kDa reakční produkt Maillardova typu proteinu nebo peptidů se sacharidy (např. melanoidiny), stejně tak jako rozpustné (eu—) melaniny v extraktu domovního prachu a organických zbytků živočišného původu. Tyto látky byly shledány zodpovědnými za aktivaci komplementu a částečně také za in vivo pozitivní kožní reakci u atopických alergických pacientů. Na druhou stranu, vodné extrakty typických alergenů z vnějšího prostředí, jako jsou rostlinné pyly, obsahují jako hlavní složku zodpovědnou za aktivaci komplementu, jak již dříve zjistili autoři vynálezu, jsou volné nebo na proteiny naabsorbované kondenzované nebo hydrolyzované taniny nebo flavonoidy a podobné polyfenolové konjugáty, které jsou s vysokou denzitou konjugovány k proteinovému nosiči ve formě haptenů. Degradační produkty melanoidinu, melaninu nebo taninů byly samy o sobě popsány v roce 1983 jako neimunogenní a tedy pouze jejich přítomnost ve fyzické asociaci s proteinovým antigenem v extraktu může vést k tvorbě protilátek třídy IgE (9).

Mechanismus aktivace komplementu bez přítomnosti protilátek pomocí těchto složek alergenního extraktu vyžaduje aktivaci složek Cl, C4, C2 a za speciálních podmínek i C3, v případě klasické aktivační kaskády. Lokální aktivace komplementu za pomoci složek alergenního extraktu může tedy vést k vytváření silného histamin liberátoru anafylatoxinu C3a a fragmentu C3b, klíčového faktoru regulace buněčných reakcí imunitního systému. Bylo také zjištěno, že komplement v séru atopických jedinců je citlivější k aktivačním faktorům, než je obvyklé u séra zdravých jedinců (8).

Bylo překvapivým zjištěném, že taniny a melanoidiny v alergenních extraktech jsou schopné aktivace komplementu i v nepřítomnosti antigenu. Tyto látky tedy jednoznačně vykazují adjuvantní schopnosti generováním faktorů komplementu jako je (multivalentní) C3b, které pak zajišťují patřičný druhý signál pro proliferující B-lymfocyty a tak aktivují syntézu protilátek, ínkrimovaný membránový receptor (CD21) pro C3b na B-buňkách je sám o sobě ligandem lektinu CD23 na B-lymfocytech, který může být rozpoznáván jako nízkoafinitní IgE (Fc)-receptor. Ačkoli detaily řetězce interakcí T-buňky / B-buňky / komplement jsou zcela mimo rámec navrhovaného vynálezu, je evidentní, že stimul pro alergen specifickou aktivaci komplementu a alergen nespecifickou aktivaci komplementu, jsou velmi podobné (10). Neboť obecně se má za to, že zvýšená produkce protilátek třídy IgE je přímou příčinou klinických projevů alergické reakce, je zřejmé, že látky aktivující komplement, CD21 a CD23, přítomné v alergenním extraktu jsou pro indukci zamýšlené imunoterapie a tolerance nežádoucí a musí být eliminovány v maximální možné míře před tím než může být dosaženo úspěšné indukce T-buněčné anergie. Spojení těchto předpokladů a jejich praktických implementací je zcela nové a dosud neznámé v současném stavu techniky.

Rozeznání alespoň dvou funkčně odlišných skupin organických látek v alergenním extraktu, např. komplement aktivujících taninů nebo melanoidinů (nebo adjuvans) na jednu stranu fungujících synergisticky a antigenním (glyko)proteinem nebo naopak reprezentujících nový směr ve snaze pochopit alergické poruchy způsobené IgE u člověka, je důležitým technologickým parametrem pro navržení a produkci nových léčiv. Logickým pokračováním je příprava tolerogenních T-buněčných epitopů, které nestimulují produkci protilátek třídy IgE, přičemž výchozí alergenní materiál musí být v maximální možné míře přečištěný od komplement aktivujících faktorů.

Nehledě k jejich schopnostem aktivovat komplement, taniny a melanoidiny vykazují celou řadu dalších nežádoucích efektů. Tyto látky se adsorbují těsně na většinu proteinů mnohonásobnými vodíkovými a hydrofóbními interakcemi, což brání protein před štěpením pomocí proteáz. Nao-4CZ 302352 B6 pak, taniny a melanoidiny inhibují celou řadu enzymů pracujících při neutrálním či mírně alkalickém fyziologickém pH, včetně serinové proteázy trypsinu, chymotripsinu a kal i kře inu (11). Jelikož fyzikální síly zapojené v interakci tanin/melanoidin s proteinem reverzibilně klesají na nulu, klesne-li pH pod 2,5, proteinázy vhodné pro enzymatickou produkci T-buněěných epitopů z alergennich makromolekul je enzym přítomný v trávicím traktu - pepsin, jehož optimální pH aktivita je při pH - 2,0. Při takové hodnotě pH taniny a melanoidiny (s maximální molekulovou hmotností okolo 5000 (5 kDa)) disoctují od proteinu a je možné je odstranit dialýzou nebo ultracentrifugací. Je tedy zcela nezbytné, aby procesu enzymatického štěpení pomocí pepsinu vedoucí k fragmentaci alergenu předcházela dialýza v kyselém médiu (pH méně než 2,5) v nepřítomnosti io enzymu, tak aby byly odstraněny interferující taniny a/nebo melanoidiny bez ovlivnění alergenní struktury proteinu. Pokud by tyto komplement aktivující póly hydroxy lově substance nebyly odstraněny před procesem štěpení pomocí enzymu, během neutralizace by opět asociovaly s požadovanými T-buněčnými peptidy a učinili by je nepoužitelné pro finální farmaceutický produkt. Kandidáty výchozího materiálu pro enzymatické štěpení jsou depigmentované alergeny připravené při pH 2 v nepřítomnosti enzymu a detailně popsané v Evropském patentu č. 0 662 ΩΛΠ Rl Tantnv a/nebo melanoidiny mohou hvt odstraněné nomocí dialvzv nřes 5 kDa membránu.

Jak je detailně popsáno v EP 0 662 080 Bl, proces depigmentace alergických proteinů v roztoku naředěné kyseliny chlorovodíkové nebo sírové při pH 2,0 ± 0,1 odstraní příslušnou část (15 až 16% hmotnosti, v závislosti na zdroji materiálu) rozpuštěných komponent >10 000 (>10kDa) z alergického extraktu při dialýze nebo ultrafiltraci přímo z kyselého média přes 10 000 (10 kDa) dělící membránu. Molekulová hmotnost odstraněných komponent je tedy v rozsahu do 10 000 (10 kDa) a jedná se o přirozené taniny, (eu)melaniny a melanoidiny, které mají obvykle moleku25 lovou hmotnost okolo 5000 (5 kDa). Pokud tento krok kyselé dialýzy nepředchází fázi štěpení enzymem, např. pepsinem, jak nepopisuje US patent 4 469 667 a Evropský patent EP 0 113 712 Bl, neutralizace kyselého prostředí nezbytného pro pepsinové štěpení, které probíhá při pH = 2, způsobí reasociaci komplexů tanin-peptid, jak bylo uvedeno výše a tím dojde k zamaskování Tbuněčných epitopů a následné zablokování možnosti rozeznání imunitním systémem. Při selhání pokusu o odstranění taninů a melanoidinů před enzymatickým štěpením také ponechá neovlivněnou komplement aktivující schopnost finálního produktu a vede poté k nežádoucí stimulaci syntézy IgE po aplikaci u člověka.

Bez ohledu na to, zda depigmentační proces proběhl správně, chemicky navázané polyfenolické a

Maillardovy struktury mohou být stále chemicky a spektroskopicky identifikovány na důkladně depigmentovaných proteinech (12). Takto konjugované polyfenolické a sacharidové deriváty tvoří integrální část struktury molekuly proteinového alergenu a nemohou být proto odstraněny v kyselém médiu. Bylo také prokázáno, že tyto neproteinové postranní řetězce mohou, pravděpodobně jako hapteny, tvořit část B-buněčných epitopů rozeznávaných specifickými protilátkami tříd IgE a IgE, jak je uvedeno v US patentu 5 384 395 a Evropském patentu EP A 0 387 952. Fakticky, eliminace fyzicky absorbovaných taninů a melanoidinů depigmentačním procesem podle EP 0 662 080 Bl vedoucí kodmaskování těchto haptenových struktur, způsobí částečné snížení vazby specifických protilátek třídy IgE. Na druhou stranu distribuce haptenu a denzita proteinového antigenního nosiče může být taková, že >10 000 (> 10 kDa) depigmentace (HMW45 D) nestačí k tomu, aby takto upravené alergeny mohly být štěpeny enzymaticky, jak bylo zjištěno v případě pylu rostliny Parietaria judaica (12), Na rozdíl od toho, co se uvádí v Evropském patentu EP 0 113 712 Bl, snadnost enzymatického štěpení pepsinem se odlišuje u různých depigmentovaných >10 000 (> 10 kDa) variant alergenu, což znamená, že podmínky enzymatické hydrolýzy musí být přizpůsobeny v závislosti na zdroji alergenu. Jak je uvedeno v příkladech na obrázku 1, míra výskytu volných peptidových axninoskupin, tak jak byla stanovena ninhydrinem během popisovaného štěpení, vykazuje variabilitu v rámci různých příprav alergennich pylů.

Dominantní haptenová struktura připojená na alergenní proteinovou kostru náleží do skupiny pólyhydroxylových flavonoidů a jiných polyfenolů, které za oxidativních podmínek tvoří silné thioetherovc vazby s cysteinovými rezidui v proteinové makromolekule, nebo reprezentují

- 5 CZ 302352 B6 chemicky modifikované produkty hexóz nebo pentóz připojené na e-aminoskupinu postranního řetězce lysinu (1). Obě, S-připojené a N(e)-připojené haptenové struktury adsorbují ultrafialové záření v rozsahu od 300 do 350 nm, zatímco absorpce čistého proteinu je zanedbatelná. Jak ukazuje příklad na obrázku 2, nepřímá úměrnost je pozorována mezi denzitou haptenu stanovenou UV—spektroskopií a mírou štěpení alergenního komplexu protein-hapten pomocí pepsinu, jak bylo stanoveno pomocí uvolnění ninhydrin reaktivních volných aminoskupin.

V některých případech silně pepsin rezistentních HMW-D preparací, může být pomocí elektroforézy prokázáno, že bez ohledu na malé množství uvolněných aminoskupin (obr. 1), fragmentace je patrná díky ztrátě detekovatelných proteinových konstituentů. V případě pylu rostliny Parietaria, může být fragmentace prokázána ztrátou schopnosti aktivace komplementu, ale ne ztrátou schopnosti vázat IgE, u enzymaticky získaných fragmentů (Fb-D) faktorem alespoň 100. Vzhledem k silně redukovaným schopnostem polyfenol- nebo lysin- cukerných strukturních elementů, oxidace může být v některých případech nezbytnou podmínkou pro úplnou eliminaci jak IgE vazebných tak komplement aktivujících domén. Oxidace HMW-D preparátů před fragmentací může být provedena pomocí řady chemických agens, např. pomocí peijodových solí (viz níže). Nicméně, kvůli ochraně možných sacharidových T-buněčných epitopů, je nejvhodnějším způsobem oxidace pomocí ultrafialového záření, která, jak bylo prokázáno, vede ke snížení jak komplement aktivujícího tak IgE vazebného potenciálu (13). V případě HMW-D preparátů z pylů některých plevelů, stromů a rostlin, může být oxidační proces zařazen za depigmentaci, ale před krok enzymatického štěpení (viz níže).

Enzymatická fragmentace a (možná) oxidace podle předmětného vynálezu je použitelná pro všechny známé alergeny, z vnitřního i vnějšího prostředí, jako jsou roztoči, hmyz, plísně, pylová zrna z trav, plevelů a stromů, organický prach atd. Takový materiál může být extrahován, depigmentován, jak bylo popsáno výše např. v EP 0 662 080 B1, předmět tohoto patentu je zde uveden jako reference. Následná správná volba fragmentačních podmínek (pre-oxidace, poměr enzymu a substrátu, trvání enzymatické hydrolýzy, atd.) pro proteolytickou degradaci alergenního substrátu v extraktu může záležet na předchozím experimentálním ověření, a závisí čistě na povaze zdrojového materiálu. Tato volba pak závisí na úvaze odborníka v současném stavu techniky.

Předmětná příprava přirozených T-buněčných epitopů představuje řadu kroků, které jsou vysvětlené v postupech popsaných v příkladech. Obecně, technika podle navrhovaného vynálezu je technika produkce extraktu navozujícího po aplikaci toleranci k alergennímu materiálu a tato technika zahrnuje:

a) extrakce alergenního materiálu

b) odstranění látek s nižší molekulovou hmotností, než 3,5 kDa, tak aby vznikla HMW-N frakce, která může být zamražena a vysušena

c) odstranění taninů a melanoidinů, které jsou pomocí nekovalentních interakcí připojené k alergennímu materiálu v HMW-N frakci, čímž vznikne depigmentovaná HMW-D frakce, která neobsahuje taniny a melanoidiny a která může být zamražena a vysušena

d) degradace proteinů přítomných v HMW-D frakci čímž vzniknou fragmenty o molekulové hmotnosti mezi 1000 a 10 000 (1 a 10 kDa), který je označený Fb-D a operace probíhající v krocích a až d budou probíhat následně a způsobem pro takové operace obvyklým.

Vynález také popisuje extrakt alergenních materiálů obsahujících fragmenty alergenů se zachovanými přirozenými epitopy stimulujícími T-lymfocyty, ale neobsahujícímu žádné epitopy vážící IgE, s minimálním obsahem látek aktivujících komplement a bezpečné pro použití v prostředcích pro indukci specifické stabilní T-buněčné anergie a imunologické tolerance u alergických pacientů. Extrakt podle předmětného vynálezu může být získán z alergenních zdrojů z různých známých alergenních materiálů ať z vnějšího nebo z vnitřního prostředí, jako jsou roztoči, hmyz, plísně, pyly trav, plevelů, květin, keřů či stromů a nebo ze zcela jiných alergenních prostředí.

-6CZ 302352 B6

V tomto extraktu by měl být IgE vazebný potenciál alergenních fragmentů, vyjádřený jako množství zamraženého materiálu pro 50% inhibici vazby IgE za standardních testovacích podmínek, 100 krát nižší než v případě neupraveného extraktu ve stejném rozpouštědle a za stejných podmínek. Alternativně, nebo v kombinaci s výše uvedeným, extrakt podle navrhovaného vynálezu by měl mít schopnost alergenních fragmentů aktivovat komplement, vyjádřená jako množství zamraženého materiálu pro 50% inhibici hemolytické aktivity lidského komplementu je alespoň 100 krát nižší než v případě neupraveného extraktu ve stejném rozpouštědle a za stejných podmínek.

io Extrakt podle předmětného vynálezu, v jakékoliv z výše uvedených variant by měl mít stimulační index T-lymfocytů pomocí alergenních fragmentů v rozsahu 50 až 150 % vzhledem k neupravenému extraktu. Extrakt podle navrhovaného vynálezu obsahuje alergenní fragmenty o molekulové hmotnosti mezi 1000 a 10 000 (1 kDa a 10 kDa), což bylo stanoveno pomocí dialýzy v kyselém prostředí při pH 7,0 přes membránu s patřičnou propustností. Extrakt podle předmět15 ného vynálezu je zbaven všech volných a/nebo na protein absorbovaných taninů, melanoidinů a jinvrh niamentůV krátkosti, příprava výše charakterizovaného extraktu a způsob preparace také spadá do rámce vynálezu. Tento prostředek by měl být nakonec převeden do farmaceuticky přijatelné formy tak, aby bylo možno aplikovat ho lidem či zvířatům v případě potřeby.

Použití prostředku podle předmětného vynálezu jako aktivní složky pro medicínskou léčbu alergenních jedinců pomocí navození tolerance k přirozeným alergenním substrátům od kterých je prostředek odvozen, je také jednou variantou navrhovaného vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Kinetika uvolňování ninhydrin reaktivních volných aminoskupin u reprezentativních

HMW-D alergenních preparátů enzymaticky štěpených pepsinem. Podmínky: viz text.

Obrázek 2: Nepřímá úměrnost mezi štěpitelností HMW-D preparátů z pylových zrn pepsinem (tzn. zabarvení ninhydrinu po 6 hodinách štěpení při 37 °C a pH 2) a extinkční koe35 ficient E(1 %, 1 cm) při 325 nm v ultrafialovém spektru v 0,01 M fosfátovém pufru pH 7.

Obrázek 3: Proliferační aktivita T-buněk v kultuře periferních lymfocytů (měřeno inkorporací radioaktivně značeného thymidinu, relativní jednotky) z krve (a) specificky alergic40 kých pacientů a (b) kožní testy negativních zdravých kontrol po stimulaci depigmentovaným preparátem HMW-D a fragmenty Fb-D připravenými z Blomia tropicalis.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Příprava HMW-N

Vysušený alergenní materiál zbavený mastných kyselin, jako je prášek z pylových zrn, zbytky zvířecích tkání, kultury roztočů nebo vysušená tělíčka čistých roztočů nebo jiných hmyzích druhů, jsou přenesena do roztoku 0,01 M fosfátového pufru o pH 7,0, který obsahuje 0,15 M HCI (PBS). Extrakce probíhá dvakrát za stálého míchání při 4 °C, nejprve po dobu 4 hodin, a sediment oddělený centrifugací je opět extrahován po dobu 18 hodin a opět centrifugován. Kombino55 váné extrakty jsou dialyzovány proti 5 objemům destilované vody za použití systému Pellicon® s

-7CZ 302352 B6 kDa membránou (Millipore®, PLBC 000 05). Dialýza zadrží všechny látky >10 000 (> 10 kDa) a ty jsou poté lyofilizovány tak, aby vznikl surový alergenní produkt HMW-N. V některých případech, zejména když minoritní alergeny o velikosti nižší než 10 000 (10 kDa), může být membrána nahrazena 3500 (3,5 kDa) dialyzační blánou.

Příklad 2. Příprava HMW-D

Detaily depigmentačního procesu jsou uvedeny v EP 0 662 080 Bl. Obecně, lyofilizovaný io HMW-N produkt podle příkladu 1, je rozpuštěn při pokojové teplotě v destilované vodě na koncentraci 10 mg/ml. K tomuto roztoku je pri pokojové teplotě a za stálého míchání přidávána 2 N

HCI, a nakonec jen 0,1 N HCI tak, aby pH roztoku kleslo na 2,0 ± 0,1 a roztok je za stálého míchání inkubován dalších 15 minut. Barevné substance nebo pigmenty nahromaděné v kyselém médiu z HMW-N jsou poté odstraněny opakovanou dialýzou nebo ultracentrifugací při 4 °C po dobu 17 hodin proti několikrát vyměněné destilované vodě přes 10 000 (10 kDa) membránu, dokud pH roztoku obsahujícího složky větší než 10 000 (10 kDa) nestoupne na 3,5. Roztok získaný po intenzivní dialýze je převeden na pH 7,0 ± 0,1 pomocí přidání 1,0 až 0,1 N NaOH. Neutralizovaný roztok je na závěr centrifugován, přefiltrován přes sterilní filtr s propustností do 0,2 pm a lyofilizaci vysušen tak, aby vznikl depigmentovaný alergenní produkt HMW-D.

Příklad 3. Příprava HMW-Dox

V příkladu tohoto procesu je vzorek lyofilizovaného HMW-D rozpuštěn v 0,05 M (50 mM) metaperjodátu sodného při pH 3,5 a za stálého míchání je inkubován 1 hodinu pri pokojové teplotě. Roztok je poté přečištěn přes malou kolonu obsahující Sephadex® G25 v destilované vodě a první frakce, která projde skrz kolonu je sebrána a lyofilizována tak, aby vznikl oxidovaný produkt HMW-Dox. Účinnost oxidované frakce je stanovena porovnáním s původním HMW-D produktem pomocí stanovení herno lyrické aktivace komplementu a inhibice vazby specifických

IgE protilátek, pomocí běžně používaných laboratorních technik. Příklad těchto testů prováděný s extraktem z pylových zrn Parieíaria judaicayc uveden v tabulce 1. Aby bylo zabráněno kontaminaci zbytkem použitých chemikálií nebo nežádoucích štěpených produktů, je vhodnější, aby oxidace HMW-D ve vodném roztoku probíhala spíše pomocí ozáření ultrafialovými paprsky, jak je popsáno v současném stavu techniky (13).

Příklad 4. Příprava enzymaticky štěpených fragmentů Fb-D

V popsané proceduře pro přípravu přirozených peptidů nebo komplexů peptid-hapten tvořících

T-buněčné epitopy získaných enzymatickým štěpením proteinů, je výchozím materiálem depigmentovaný preparát HMW-D získaný podle popisu uvedeného v příkladu 2 a v Evropském patentu EP 0 662 080 Bt nebo HMW-Dox popsaný v příkladu 3. Postup přípravy enzymaticky štěpených fragmentů Fb-D z obou výchozích produktů je identický a je popsán dále.

Lyofilizovaný depigmentovaný materiál HMW-D (nebo HMW-Dox) je rozpuštěn v 10 objemech redestilované vody a přenesen do dvoustěnné nádoby umožňující cirkulaci vody o teplotě 37 ± 1 °C mezi vnitřní a vnější stěnou, tato cirkulace je zajištěna po dobu štěpení pomocí peristaltické pumpy. K tomuto roztoku je přidána za stálého míchání 2 N HCI tak, aby pH kleslo na 2,5. Proteolytický enzym pepsin v imobilizované formě navázaný na Sepharosu® (Sepharose50 pepsin, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA, ref. Cat. P-3286) je postupně přidán ve formě suchého prášku v poměru 4 jednotky aktivity pepsinu na 1 mg HMW-D (tzn. asi 1:5 enzym/substrát hmotnostní poměr, nebo přibližně tolik v závislosti na zdroji alergenu). Pomocí přikapávání 0,1 N HCI je pH roztoku upraveno na 2,0 ± 0,1 a roztok je za stálého míchání po dobu alespoň 6 hodin při 37 ± 1 °C, a stálého udržování pH na 2,0 ± 1 °C pomocí automatického pH-stat přístroje. Po ukončení štěpení je směs neutralizována na pH 7,0 pomocí 2,0 až 0,1 N

-8CZ 302352 B6

NaOH a poté přefiltrována přes 0,4 μηι membránu, aby byly odstraněny částice s navázaným enzymem. Je přidána destilovaná voda a směs je naředěna na polovinu a následuje dialýza v Minitanu®, tangenciálním průtokovém systému vybaveném 10 kDa Milipore membránou. Vnější kapalina (molekulová hmotnost <10 kDa) je izolována a vnitřní kapalina obsahující endo5 fragmenty Fa-D o molekulové hmotnosti > 10 kDa je odstraněna. Pro ilustrací následuje několik analytických detailů o endo-fragmentech Fa-D >10 000 (>10 kDa), jsou to převážně heteropolysacharidy, popsané v tabulce I, která následuje. Složky o molekulové hmotnosti menší než 10 000 (10 kDa) jsou opět dialyzovány v přístroji Minitan za použití 1000 (1 kDa) membrány, kde jsou izolovány a odstraněny látky o molekulové hmotnosti nižší než 1000 (1 kDa), které jsou io po tomto kroku ve vnější kapalině. Získaný konečný filtrát je nakonec sterilizován pomocí filtrace přes 0,22 gm filtrovací membránu a lyofilizován tak, aby vznikl požadovaný produkt ve formě fragmentů o molekulové hmotnosti vyšší než 1000 (1 kDa) a nižší než 10 000 (10 kDa).

Výtěžky a spektroskopické analýzy výchozího materiálu HMW-N, meziproduktů HMW-D (nebo HMW-Dox), neštěpitelné frakce (heteropolysacharidy větší než 10 000 (10 kDa)), nnctrmnl nmrlnVt F«—ΓΊ n nnŤadnvanv knncnvv nrodiikt Fh—D. isou shmutv oro sérii reorezentai------------ r ----- · - a _ * . _ _ .

tivních zdrojů alergenních materiálů v tabulce II.

Kontrola procesu štěpení

Postup enzymatického štěpení je monitorován pomocí uvolňování volných aminoskupin. V pravidelných intervalech, během procesu enzymatické hydrolýzy, jsou odebírány 0,5 ml vzorky z směsi pepsin/protein, jejich koncentrace je upravena na 0,5 mg/ml v 4 N pufru octanu sodného při pH 5,5 a poté jsou zahřátý na 100 °C po dobu 15 minut s 50 μ! 2 % anhydrinu v octanem pufrované methy leelulóze. Po ochlazení je při 541 nm změřena absorbance proti reakční mu blanku. Reprezentativní příklady kinetiky štěpení založené na stanovování uvolněných aminoskupin jsou shrnuty na obrázku 1.

Jak je patrné z obrázku 1, uvolňování volných aminoskupin některými alergeny může být velmi nízké (např. Parietaria, Artemisia,Ambrosia). To však neznamená, že k fragmentaci pomocí pepsinu nedochází, s výjimkou pylu Parietaria judaica (12), neboť enzymatické fragmenty Fb-D těchto alergenů mají značně sníženou vazebnou kapacitu pro specifické protilátky třídy IgE, tzn. jejich B-buněčných epitopů (tabulka II). Obecně se má za to, že ninhydrid může být za určitých podmínek blokován polyfenolickými peptidovými postranními řetězci. Nejdůležitějším předpo35 kladem pro přípravu a kontrolu produkce finálních fragmentů Fb-D je otestování ztráty jejich IgE vazebné kapacity a komplement aktivačního potenciálu, zároveň se zachováním jejich stimulační kapacity vzhledem k T-buňkám.

Kontrola konečného produktu

Vazba alergen specifických protilátek třídy IgE

Schopnost Fb-D konečných produktů vázat in vitro specifické IgE protilátky, je testována pomocí stanovení inhibiční kapacity, za použití séra specificky senzitizováných alergických pacientů.

IgE vazebný potenciál fragmentů, vyjádřený jako množství vysušeného materiálu pro navození 50% inhibice vazby za standardních technických podmínek, musí být alespoň lOOkrát nižší než vazebný potenciál výchozích HMW-D a HMW-Dox materiálů za standardizovaných podmínek, tzn. redukce vazebné kapacity odpovídá méně než 1 % kapacity výchozího materiálu před fragmentací. Některá reprezentativní data získaná pomocí neoxidovaných preparátů HMW-D jsou so shrnuta v tabulce III.

Aktivace komplementu

Schopnost Fb-D konečných produktů aktivovat komplementový systém, je testována pomocí hemolytické nebo imunoenzymové techniky podle publikovaných postupů (8,13). Komplement-9CZ 302352 B6 aktivační potenciál fragmentů, vyjádřený jako množství vysušeného materiálu pro 50% snížení hemolytické kapacity komplementu za standardních technických podmínek, musí být alespoň 100 krát nižší než potenciál výchozích HMW-D a HMW-Dox materiálů za standardizovaných podmínek, tzn. redukce vazebné kapacity odpovídá méně než 1 % kapacity výchozího materiálu před fragmentací.

Stimulace T-buněk

Pro ověření použitelnosti produktu Fb-D jako vhodného preparátu zachovávajícího si základní T-buněčné epitopy, jsou Fb-D fragmenty testovány na svou schopnost indukovat proliferaci Tlymfocytů izolovaných z krve specificky alergických pacientů, pomocí standardních imunologických testů. T-buněčný stimulační index výsledných fragmentů může být v rozmezí 50 až 150 % vzhledem k výchozímu HMW-D preparátu. Obrázek 3 shrnuje některá reprezentativní data získaná pomocí peptidových fragmentů Fb-D připravených fragmentací HMW-D preparátu izolovaného z kultury vysoce alergenních tropických roztočů Blomia tropicalis.

Další testy

Všechny koncové produkty Fb-D jsou rutinně kontrolovány dalšími testy, jako je např. izolelektrická fokusace na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti Ampholinu® v rozmezí pH od 3 do 10, kde se na rozdíl od výchozího preparátu HMW-D neobjevují konstituované proužky detekovatelné proteinovým značením. Elektroforetická separace v polyakrylamidovérn gelu v dodecylsulfátu sodném (SDS-page) v přítomnosti tricinu (N-2-hydroxy-l,l-bis(hydroxymethylethyl)glycinu) ukazuje distribuční rozložení proužků, barvitelných Coomassie blue barvivém, které je zcela odlišné od toho, které bylo získáno při použití výchozího HMW-D preparátu, a tento test pak může být použit k ověření reprodukovatelnosti procesu přípravy. Výčet některých analytických dat pro některé reprezentativní alergenní preparáty je uveden v tabulkách II a III.

Tabulka I

Vliv oxidace pomocí metaperjodátu sodného na IgE vazebné a komplement aktivační vlastnosti depigmentovaného alergenního reparátu HMW-D izolovaného z pylových zrn Parietaria judaica.

Produkt	pg nezbytných pro 50% hemolýzu	redukční faktor
HMW-D	0,49
HMW-Dox	12,36	25,2
	pg nezbytných pro 50% inhibici vazby IgE	redukční faktor
HMW-D	1,5
HMW-Dox	4,12	2,7

- 10CZ 302352 B6

Tabulka II

Analýza peptidových alergenntch fragmentů

Zdroj alergenu	Frakce (*)	Výtěžek ze sušiny pyl/kultura hmot. %	50% inhib. IgE (disk) pg na test	50% inhib. IgE (EIA) pg na test
Ambrosia elatior	HMW-N	15,03	n.d.	n.d.
	HMW-D	8,59	72,04	0,2
	Fa-D	4,52	1312,06	bez inhibice
	Fb-D	0,75	bez inhibice	bez inhibice
Betula alba	HMW-N	2,67	n.d.	0,009
	HMW-D	1,72	n.d.	0,011
	Fa-D	0,87	n.d.	0,442
	Fb	0,42	n.d.	3,162
Lolium perenne	HMW-N	8,88	n.d.	0,081
	HMW-D	5,07	0,81	0,012
	Fa-D	2,50	324,00	5,51
	Fb	1,20	854,00	138,70
Olea europea	HMW-N	8,20	n.d.	n.d.
	HMW-D	5,15	11,08	0,011
	Fa-D	1,70	141,30	2,54
	Fb	0,80	1077,00	17,61

Parietaria	HMW-N	3,60	5,18	0,008
judaica	HMW-D	1,85	3,82	0,0126
	Fa-D	0,93	3,77	0,012
	Fb	0,14	4,17	0,0102
D. peronyssinus	HMW-N	14,96	n.d.	n.d.
	HMW-D	14,51	2,84	n.d.
	Fa-D	6,08	52,70	n.d.
	Fb	2,59	452,20	n.d.
Blomia tropicalis	HMW-N	9,60	n.d.	0,0143
	HMW-D	5,70	n.d.	0,0072
	Fa-D	3,40	n.d.	0,0085
	Fb	1,20	n.d.	2,667

(*) Fa-D frakce obsahuje neštěpitelné zbytky o molekulové hmotnosti vyšší než 10 000 (10 kDa) Fb-D fragmenty v rozmezí molekulových hmotností 1000 až 10 000 (1 kDa až io 10 kDa)

- 11 CZ 302352 B6

Tabulka III ^(*)

Analýza peptidových alergenních fragmentů

Zdroj alergenu	E(l%, lem) (270 nm) pH 7,4	E(l%, lem) (325-350 nm) pH 7	ninhydrin pozitiv, materiál v % ekvivalentech glycinu	% sacharidů anthronová techn. jako % galaktózy
Ambrosia elatior	58,64	38,24	n.d.	n.d.
	5,080	38,68	1,96	41,13
	0,40	1,24	1,58	36,08
	39,48	27,08	3,92	28,45
Betula alba	10,56		n.d.	n.d.
	6,92	-	n.d.	n.d.
	5,13	-	n.d.	n.d.
	6,83	-	n.d.	n.d.
Lolium perenne	7,33	2,82	n.d.	n.d.
	7,95	2,90	3,70	35,41
	1,87	0,73	2,67	56,48
	7,59	1,63	7,70	8,25

Olea europea	51,04 24,16 11,14 11,84	29,02 10,82 5,62 4,90	n.d. 4,37 2,97 7,89	n.d. 25,37 42,09 8,47
Parietaria	76,20	41,68	5,44	n.d.
judaica	40,64	18,92	3,35	30,07
	30,72	15,29	3,18	30,35
	38,88	24,00	4,09	38,83
D. peronyssinus	11,14	n.d.	n.d.	n.d.
	10,08	n.d.	3,10	39,78
	10,70	n.d.	1,69	64,60
	8,55	n.d.	2,02	20,27
Blomia tropicalis	26,22	n.d.	100,00	16,53
	25,42	n.d.	81,00	22,49
	30,16	n.d.	70,00	24,07
	17,12	n.d.	100,00	18,54

-12CZ 302352 B6

Tabulka IV

Redukční faktor IgE vazebného potenciálu (reaktivita s B-buněčným epitopem) stanovená inhi5 bicí vazby IgE ze specifických lidských sér pro individuální alergeny byly získány chemickým připojením HMW-D* s kyanogen bromidem na papírových discích (RAST inhibice). Nakonec byly hodnoty přepočítány na relativní potenciál kde HMW-D = 1.

Zdroj alergenu	Frakce
HMW-D > 10 000 (HMW-D> 10 kDa)	FaD> 10 000 (FaD> 10 kDa) (	1000 < Fb/D <10 000 lkDa< Fb/D < 10 kDa)
Ambrosia elatior	1	18	ι5υύ
Betula alba	1	169	1123
Lolium perenne	1	400	1054
Olea europea	1	13	97
Artemisia vulgaris**	1	8	61
Parietaria judaica	1	1	1
D. peronyssinus	1	19	159
Blomía tropicaiis**	1	1	370

io * neoxidovaný preparát ** redukční faktory kalkulované z enzymově imunotechniky na mikrotitračních destičkách, s povrchem jamek pokiytých HMW-D

Seznam použité literatury:

Patenty:

- Primary-toxic compounde or allergens, which may be isolated from plant materiál as wellas methods for their preparation and application, vynálezce: Berrens, L. Evropský patent A 0 387 952 patentováno 1995

- Method for the isolation of primary toxic compounds or allergens from plant materiál, vynálezce: Berrens, L. US patent 5 384 395 patentováno 24. 1. 1995

- A process for the purifícation of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extract obtainable according to this process as wellas their use.

- 13 CZ 302352 B6 vynálezce: Berrens, L. Evropský patent č. EP 0 662 080 Bl, patentováno 5. 2. 1997, podáno 21.9. 1992

- Polypeptide active pollen immunosupressant fraction.

vynálezce: Michael JG, Pesce AJ, US patent 4 338 297, patentováno 6. 6. 1982, podáno 14.4. 1980

Polypeptide active pollen immunosupressant fraction.

vynálezce: Michael JG, Pesce AJ, Evropský patent EP 0 113 712 Bl, založeno na Mezinárodní patentové přihlášce PCT/US82/0086, patentováno 15. 3. 1989, podáno 30. 6. 1982.

Literární odkazy:

[1] Berrens L. The Chemistry of Atopic Allergens. Monographs in Allergy, Vol. 7 (Karger, Basel 1971).

[2] Shakib F (Ed). Immunological lntervention Strategies in Allergy. Biochem. Soc Trans 1997; 25:383-403.

[3] Van Neerven RJJ, Ebner C, Yssel H, Kapsenberg ML, Lamb JR. T-cell responses to allergens: epitope-specificity and clinical relevance. Immunology Today 1996; 17:526-32.

[4] Simons FER, Imada M, Li Y, Watson WTA, HayGlass KT. Fel d 1 peptides: Effect on skin tests and cytokine synthesis in cat-allergic human subjects. Int Immunology 1996; 8:193745.

[5] Nicodemus C. Philip G, Jones N, Hirani S, Norman P, Integrated clinical experience with tolerogenic peptides. Int Arch Allergy Immunol 1997: 113:326-8.

[6] Litwin A, Pesce A, Michael JG. Regulation of the immune response to allergens by immunosuppressive allergenic fragments. I. Peptide fragments of honeybee venom phospholipase A2. Int Arch Allergy Appl Immunol 1988; 87:361-6.

[7] Litwin A. Pesce AJ, Fischer T, Michael M, Michael JG. Regulation of the human immune response to ragweed pollen by immunotherapy. A controlled trial comparing the effect of immunosuppressive peptic fragment of short ragweed with standard treatment. Ctin Exp Allergy 1991;21:457-65.

[8] Berrens L. The Atopen: A Rehabilitation. Ann Allergy 1876; 36:351-61, [9] Francus TG, Siskind GW, Becker CG. Role of antigen structure in the regulation of IgE isotype expression. Proč Nati Acad Sci USA 1983; 80:3430-4.

[10] Sutton BJ, Gould HJ. The human IgE network. Nátuře 1993: 366: 421-8.

[11] Berrens L. Digestion of atopic allergens with trypsin, α-hymotrypsin and pancreatic kallikrein, and influence of the allergens upon the proteolytic and esterolytic activity of these enzymes. Immunochemistry 1968; 5:585-605.

[12] González Romano ML, Gallego MT, Berrens L. Extraordinary stability of lgE-bínding Parietaria pollen allergens in relation to chemically bound flavonoids. Mol Immunol 1996; 33:1287-93.

[13] Berrens L, Hénocq E, Radermecker M. Photoinactivated allergens. I. Preparaton, physicochemical and biological properties. Clin Allergy 1973; 3:449-59.

Claims

5 1. Způsob přípravy extraktů poskytujících toleranci proti alergenu, vyznačující se tím, že se

a) extrahuje zdroj alergenního materiálu,

b) odstraní látky s molekulovou hmotností nižší než 3500 z rozpuštěných proteinových složek za vzniku frakce označované jako HMW-N, io c) odstraní taniny a melanoidiny, které jsou připojené kalergennímu materiálu v HMW-N frakci, přičemž vznikne depigmentovaná HMW-D frakce zbavená taninů a melanoidů a nekonjugované taniny a melanoidiny,

d) oxiduje HMW-D frakce oxidačním činidlem, ultrafialovým ozařováním nebo obojím za vzniku HMW-Dox frakce,

15 e) štěpí HMW-Dox frakce proteolytickými enzymy az většina proteinových siužek v HMWDox frakci má molekulovou hmotnost mezi 1000 až 10 000, a

f) odstraní materiál s molekulovou hmotností nižší než 1000 a materiál s molekulovou hmotností pres 10 000 pomocí dialýzy a ultrafíltrace, přičemž se získá extrakt pro navození tolerance v jedinci a získají se proteinové složky s molekulovou hmotností mezi 1000 až 10 000.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako zdroj alergenních materiálů se použije skupina zahrnující hmyz, roztoče, plísně, pylová zrna trav, plevele, květiny, keře a stromy a organický prach.

25 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že v kroku b) se materiál s molekulovou hmotností nižší než 3500 odstraní pomocí dialýzy nebo ultrafíltrací.

4. Způsob podle nároku l, vyznačující se tím, že v kroku b) se odstraní materiál s molekulovou hmotností nižší než 10 000.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že v kroku b) se materiál s molekulovou hmotností nižší než 10 000 odstraní pomocí dialýzy nebo ultrafíltrací.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že depigmentace v kroku c) zahrnuje 35 inkubování frakce HMW-N při pH pod 2,5 a odstranění pigmentů pomocí dialýzy nebo ultrafdtrací přes membránu s hodnotou 10 000.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že oxidační krok d) se provede jodistanovou solí.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije imobilizovaný proteolytický enzym.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako proteolytický enzym pou45 žije kyselá proteináza.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se jako kyselá proteináza použije pepsin.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro vytvoření extraktů poskytujících toleranci v jedinci v kroku f) se použije sterilní filtrace proteinových složek.

- 15CZ 302352 B6

12. Extrakt přepravitelný způsobem podle nároků 1 až 11, pro použití jako aktivní složky léčiva pro léčení alergického jedince za účelem poskytnutí tolerance k přírodní látce přítomné ve zdroji alergenních materiálů.
3 výkresy

- 16 CZ 302352 B6 zabarvení ninhydrinu s korekcí pro autoabsorpci

0,70,6

0,5 0,4-

Leftum perenne Paecytfs gfomerata Olea europaea

Betula alba

Hantapo lancedata

Obr. 1

- 17 CZ 302352 B6 zabarvení ninhydrinu při 540 nm, 6 h * Daetyljs Lolium “i-¹—Ύ ¹ i---1-.-1

W 20 30 40 cn

800

700

600

500

400

300

200

WO

O

UV-absorpce E 1 cm) 325 nm, pH 7

Obr. 2

- 18CZ 302352 B6

I tn O V) O pacient I pacient II paceint III kontrola I kontrola II kontrola III proliferační index T-buněk

Obr. 3