PT1024829E - Fragmentos tolerogénicos de alérgenos naturais - Google Patents
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Description
Descrição
Fragmentos tolerogénicos de alérgenos naturais
Resumo da invenção A presente invenção refere-se a um processo para a clivagem enzimática controlada de proteínas activas alergénicas despigmentadas e purificadas de materiais de fontes internas e externas, este processo produz fragmentos de alérgenos que retêm os epítopos que estimulam os linfócitos T naturais, mas estão depletados dos epitopos de células B de ligação à IgE e dos agentes de activação de complemento. A invenção refere-se também a produtos farmacêuticos novos. Estes fragmentos de alérgenos não exibem as desvantagens dos extractos alergénicos convencionais para a imunoterapia e podem ser utilizados com segurança para induzir um estado anergia nas células T especificas e uma tolerância imunológica nas pessoas alérgicas.
Antecedentes gerais
Os extractos aquosos de substratos de vários ambientes, como pó de casa, os resíduos epiteliais da pele deixados pelos animais, os grãos de pólen das gramíneas, das ervas daninhas, das árvores, e outros materiais são muito utilizados para o diagnóstico das doenças alérgicas in vivo e in vitro como a asma brônquica, a rinite vasomotora e a polinose nos seres humanos com predisposição, os quais são denominados "atópicos". Desde os primeiros relatórios clínicos de Noon e Freeman em 1911, estes extractos foram aplicados também no tratamento das doenças alérgicas atópicas num regime de injecções subcutâneas para a "dessensibilização", para a "hipossensibilização", ou para a "imunoterapia" destas doenças. Baseado na observação de que os componentes alergénicos causadores e predominantes nos extractos compreendem estruturas do esqueleto das proteínas com um peso 1/33 molecular que varia entre 10 e 70 kDa, tornou-se prática habitual no processo de fabricação dos extractos alergénicos dialisar ou ultrafiltrar os extractos aquosos através de membranas de corte nominal de 10 kDa para remover os componentes menos relevantes com um tamanho molecular menor do que 10 kDa, retendo assim as proteínas antigénicas polivalentes na margem de 10-100 kDa para melhorar a qualidade dos extractos alergénicos na aplicação clinica. Nalguns casos, é escolhido um limite de corte menor do que 3 kDa ou 5 kDa.
De acordo com a teoria actual a exposição do homem a alérgenos ambientais provoca a formação de anticorpos específicos de alérgenos para os isótopos IgG e IgE. Dentro de um contexto imunológico, os alérgenos podem portanto ser considerados como anticorpos IgG comuns que induzem antigénios estranhos dotados com a propriedade auxiliar - tanto devido às características moleculares especiais ou à presença simultânea nos extractos alergénicos de moduladores apropriados - para adicionalmente promoverem a biossíntese dos anticorpos da classe IgE. Anteriormente, estes antigénios foram portanto mais apropriadamente denominados "alérgenos atópicos" [1]. Os seres humanos denominados "atópicos" geneticamente predispostos, são neste caso particularmente propensos a responder a níveis elevados de anticorpos IgE alérgeno específico. Após a fase de indução inicial ou de "sensibilização", o contacto renovado com o alérgeno é considerado para conduzir a formação local sendo os complexos de alérgenos-anticorpos (IgE) os responsáveis máximos dos sintomas da doença. Mais particularmente, é a interacção dos alérgenos com os seus anticorpos sésseis específicos de classe IgE ligados a receptores de IgE(e) nas membranas celulares (isto é nos mastócitos ou leucócitos basofílicos) que pensamos que desencadeia a sequência de eventos bioquímicos que eventualmente conduzem à libertação das substâncias mediadoras responsáveis dos sintomas da alergia manifestados clinicamente. Para reduzir o risco das reacções secundárias anafiláticas durante a imunoterapia um grande número de abordagens têm sido descritas. 2/33
Recentemente, o Pedido de Patente PCT/EP96/01733 publicado (7 de
Novembro de 1996) descreve uma composição farmacêutica nova para ser utilizada num tratamento de dessensibilização de doentes alérgicos. Esta composição compreende tirosina e um alérgeno polimerizado. No inicio dos anos oitenta já tinham sido apresentadas outras abordagens mas foi descoberto que estas eram inadequadas. 0 Pedido de Patente do GB-A-1.492,973 descreve um coprecipitado de tirosina e um alérgeno que foi modificado por um agente para provocar a reticulação intramolecular. 0 Pedido de Patente europeia EP-A-0.367.306 descreve um processo para a preparação de alérgenos polimerizados provendo também a reticulação e supostamente resultando numa alergenicidade reduzida. Noutra publicação anterior EP-B-0.038154 que foi publicada no ano 1981 descreve o tratamento de um alérgeno com poli-sarcosina para reduzir a sua alergenicidade.
Particularmente e de acordo com esta publicação a poli-sarcosina utilizada tem um peso molecular entre 2.000 e 12.000. Este documento refere-se também ao pedido de Patente do Reino Unido UK 1.282.163 que descreve uma forma aperfeiçoada de tratamento em que a alergenicidade de um alérgeno é reduzida com um tratamento com glutaraldeido, que é sugerido como tendo a capacidade de provocar os anticorpos de bloqueio mas exibindo alergenicidade reduzida, tornando-o assim mais adequado para o tratamento de dessensibilização. Uma abordagem alternativa foi provida pelo Pedido de Patente do Reino Unindo UK N°. 1.578.348 no qual foi verificado que os conjugados alérgenos polietilenoglicol são capazes de desencadear o efeito terapêutico desejado de supressão da produção de IgE especifica de alérgeno. Estes materiais estão declarados como não alergénicos e não imunogénicos. Para a imunoterapia pretendida das doenças alérgicas através de fragmentos alérgenos tolerogénicos, os produtos seleccionados deverão ser muito parecidos aos epítopos das células T naturais gerados dentro das denominadas "células apresentadoras de antigénios" (APCs) por hidrolases ácidas e outras enzimas em condições fisiológicas.
Esta abordagem particular foi retirada da técnica anterior do 3/33
Pedido de Patente norte-americano 4,469,667 e do Pedido de Patente europeia EP 0113712 BI (ver também refa. 6 e 7). Estes elementos naturais incluem possiveis estruturas quimicas hapténicas ligadas a peptideos e podem ser imitadas no laboratório submetendo os componentes do extracto alergénico à clivagem proteolitica em condições controladas. Uma das muitas vias de investigação nesta área sugere que o tratamento da alergia no homem deverá ser executada com a utilização de derivados de alérgeno que não induzam anticorpos IgE específicos, isto é derivados de alérgeno depletados das suas denominadas "epitopos de células B" que se ligam à IgE.
Outras publicações ([12], WO94/06821) descrevem um processo para a obtenção de fragmentos de proteínas alergénicas. Contudo, nestas a fase de oxidação não foi executada. O documento XP002071094 avalia o consumo do complemento hemolítico de um extracto de pólen. Neste documento o processo de purificação não está descrito.
Assim, durante os últimos vinte anos têm sido propostas diversas formas para prover composições para a dessensibilização, isto é, a redução da alergenicidade. Têm sido feitos esforços consideráveis para solucionar o problema de diversas maneiras, e até agora com poucos resultados. Para obter uma melhor compreensão dos requisitos para o tratamento, é essencial verificar o que realmente acontece durante a indução ou o desencadeamento de uma resposta alérgica. A indução de uma resposta imunitária a antigénios estranhos requer a cooperação de várias categorias de células, isto é, na forma mais simples, as denominadas "células apresentadoras de
antigénios" (APC) e as populações de linfócitos T e B. O primeiro sinal, nomeadamente entre as APCs e os linfócitos T, está composto de fragmentos de peptideos antigénicos que aumentam durante o processamento intracelular (por clivagem proteolitica) de um antigénio estranho internalizado por APC, 4/33 por exemplo macrófagos. Os fragmentos antigénicos (estranhos) (também conhecidos como "epítopos de células T") são posteriormente reciclados nas membranas externas das APC, onde seguidamente elas ficam expostas na forma de ligandos associados com antigénios de Classe II ligados à membrana do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC). De Entre as populações de linfócitos T (auxiliares) (células Thl e Th2) gue reconhecem estes epitopos das células T nas APCs e cooperando por si mesmas com os linfócitos B que segregam a imunoglobulina, a activação dos clones das células Th2 de alérgeno especifico está em particular considerada que exerce um papel fundamental no desenvolvimento das doenças atópicas nos humanos. Ao contrário das células Thl, as células Th2 activadas por contacto com as APCs expressam os epitopos das células T apropriados na sua superfície produzem quantidades relativamente grandes de interleucinas 4 (IL-4) e 5 (IL-5), que podem agir, entre outras formas, como sinais de citoquina para promover a biossíntese IgE através dos linfócitos B ou com as células plasmáticas. Com base nisto, uma teoria contemporânea de alergia (atópica) "imediata Tipo I" opina que nos seres humanos atópicos uma preponderância relativa dos linfócitos Th2 sobre os Thl resultam na síntese de IgE aumentada e que, portanto, o tratamento activo deverá ter como objectivo restabelecer o equilíbrio da actividade das células T alérgeno-específicas desde Th2>Thl até Thl>Th2. A manipulação deliberada dos clones das células T alérgeno-específicas por meio dos epítopos das células T derivados das moléculas alergénicas sugere ela própria uma nova abordagem possível para uma imunoterapia com sucesso, com a restrição de que estes epítopos não deverão ligar nem induzir os anticorpos IgE alérgenos-específicos [2,3]. No entanto, ensaios clínicos recentes com alguns epítopos de peptídeos das células T sintéticas definidos estruturalmente a partir da sequência de aminoácidos dos antigénios seleccionados da ligação IgE, derivados da clonação molecular e da tecnologia recombinante, até ao momento não foi possível obter os efeitos benéficos 5/33 desejados [4,5] de forma que esta via tomada mais recentemente parece que não conduz a resultados.
Sem desejarmos estar vinculados pela teoria, parece bem estabelecido que a interacção entre as APCs e as células Th requer factores co-estimuladores envolvendo vários receptores de membrana. Existem também indicios que se só o primeiro sinal, isto é, se o reconhecimento dos epítopos das células T se dá, este pode resultar na anergia das células T. Após uma fase inicial da estimulação estas células Th2 tornam-se não responsivas à estimulação adicional por APCs de alérgeno pulsado. Portanto, a anergia das células T pode ser induzida nos clones das células Th2 de alérgeno específico, seguido da estimulação com peptídeos derivados de alérgenos. Estas células Th anergéticas não ajudam a prover as células B na produção IgE, conduzindo a uma regulação descendente dos níveis de IgE. Existem alguns dados clínicos preliminares que sustentam a ideia de que a apresentação ou a administração de doses supra-óptimas de epítopos das células T de MHC compatíveis pré-formadas podem induzir, na ausência de sinais co-estimuladores e talvez mesmo no estado imunológico preexistente, à anergia das células T e à tolerância imunológica [6,7]. É sabido que os extractos de materiais de fontes alergénicas individuais incluem uma grande variedade de diferentes alérgenos de proteína de ligação à IgE. Além disso, qualquer alérgeno de proteína individual de uma única fonte pode mostrar uma grande variedade de epítopos de células T que não se ligam à IgE.
Devido à abundância de epítopos activadores das células T e à dificuldade de entre eles seleccionar os peptídeos tolerogénicos apropriados, seria razoável assumir que a eficácia da imunoterapia de largo espectro com epítopos das células T pode ser melhor obtida com colecções de fragmentos de que não se ligam à IgE da biblioteca natural de alérgenos no material da fonte, do que com alguns peptídeos sintéticos seleccionados ou mesmo com alérgenos recombinantes. Isto torna-se ainda mais 6/33 agudo no contexto da natureza química provável dos epítopos dominantes. Uma opinião actual mantém que os epítopos das células T são peptídeos da sequência linear de aminoácidos que -uma vez identificados - podem ser produzidos sinteticamente. No entanto, este ponto de vista nega totalmente que os alérgenos de origem natural muitas vezes transportam cadeias laterais pós-traducionais compostas por hidratos de carbono ou outros compostos orgânicos conjugados quimicamente nas estruturas da proteína. Estas estruturas conjugadas quimicamente ou "háptenas" muitas vezes representam sítios imunodominantes que são retidos nos fragmentos produzidos enzimaticamente de alérgenos, mas que carecem de peptídeos sintéticos ou transcrições do alérgeno recombinante. E, por último, a tecnologia e a ciência dos alérgenos mantêm-se totalmente em silêncio enquanto à questão prática mais importante, nomeadamente enquanto às interacções químicas e físicas que têm lugar nos numerosos componentes nos extractos alergénicos não refinados, originando produtos de degradação e a formação de complexos moleculares não fisiológicos. Por estas razões, em combinação com a falta de resultados práticos das composições acima descritas, uma abordagem alternativa foi tomada para desenvolver preparações mais apropriadas para o tratamento das alergias.
Antecedentes da invenção
Anteriormente foi assumido, como se faz normalmente, que o sistema imunitário lida com os alérgenos da mesma maneira que com os antigénios estranhos comuns. No entanto, esta presunção não explica porque os alérgenos, contrariamente aos antigénios
de proteínas comuns, induzem a formação de anticorpos lgE específicos em tandem com os anticorpos IgG nem ajuda a entender por que só um pequeno segmento da população humana (as pessoas "atópicas") não só produz níveis elevados destes anticorpos lgE, mas é ainda propenso a desenvolver doenças alérgicas que se manifestam clinicamente. Obviamente, outros factores devem ser considerados antes de desenhar as preparações de alérgeno ou 7/33 fragmentos de alérgenos mais adequadas para contra-regular o(s) patomecanismo(s) da doença alérgica. Um destes factores refere-se ao sistema complemento e à sua activação por componentes de extractos alergénicos. Há já muito tempo que é sabido que os extractos aquosos de materiais de fonte alergénica "de interiores" consumem o complemento hemolitico (huC) no soro humano in vitro [8]. Os estudos quimicos de diversos extractos alergénicos detectaram a presença quase universal dos produtos de decomposição orgânicos, que incluem >10 kDa de produtos reagentes de proteinas do tipo Maillard ou peptídeos com hidratos de carbono (isto é, as melanoidinas), assim como (eu-)melaninas solúveis nos extractos do pó de casa e nas escamas de pele ou penas de animais. Foi mostrado que estes constituintes eram os responsáveis da activação do complemento e parcialmente também das reacções de pele positivas in vivo nos indivíduos alérgicos atópicos. Por outro lado, nos extractos aquosos de alérgenos "exteriores" tipicos como os pólens das plantas, os agentes principais envolvidos na activação do complemento foram recentemente identificados pelos inventores como taninos condensados ou hidrolisáveis livres de ou adsorvidas por proteinas, ou flavonóides e outros polifenóis conjugados numa densidade maior do que as moléculas portadoras de proteína na forma de háptenas. A melanoidina, melanina ou produtos de degradação de tanino sozinhos já tinham sido descritos em 1983 como não imunogénicos, apesar de que elas possam estar sozinhas em associação física com os antigénios da proteína nos extractos, levando deste modo à indução preferencial dos anticorpos da classe IgE [9]. O mecanismo de activação de complemento não mediado por anticorpos com estes componentes particulares dos extractos alergénicos envolve os componentes Cl, C4, C2, e em condições especiais C3 das reacções químicas clássica. Assim, a activação local de complemento para compostos de modulação nos extractos alergénicos podem conduzir à geração da anafilotoxina C3 e do 8/33 fragmento C3b que liberta histamina potente, um factor fundamental na regulação do sistema imunitário celular. Além disso, foi demonstrado que o complemento no soro de indivíduos "atópicos" tende a ser mais sensivel aos factores de activação do que os observados nos soros de pessoas que serviram de controlo saudáveis [8].
Inesperadamente observamos que a presença de taninos e de melanoidinas nos extractos alergénicos foram capazes de activar o sistema complemento mesmo na ausência de antigénios. Portanto, estes agentes de facto exibem propriedades adjuvantes ao gerar factores de complemento como C3b (polivalente) , que proveem os "segundos" sinais apropriados para a proliferação dos linfócitos B e para a estimulação da sintese de anticorpos. 0 receptor envolvido CD21 da membrana externa de C3b nas células B é ele próprio um ligando para a lectina CD23 nos linfócitos B, que por seu lado foram reconhecidos como um receptor Fc de lgE de baixa afinidade. Apesar de que os pormenores da cadeia das células T/células B e das interacções do receptor do complemento estão para além do âmbito deste documento, parece evidente que os estimulos para a sintese de anticorpos de alérgeno especifico
IgE e para a activação de complemento de um alérgeno não especifico poderão estar estreitamente ligados [10] . Uma vez que a produção aumentada de IgE anti-alérgena é geralmente considerada o desencadeador das reacções alérgicas que se manifestam clinicamente, conclui-se então que os agentes activadores de complemento CD21 e CD23 nos extractos alergénicos destinados à imunoterapia e à indução de tolerância são indesejáveis e tanto quanto possivel devem ser eliminados antes de que se possa por fim ter tentado uma indução bem sucedida da anergia das células T. O conhecimento deste requisito prévio e a sua implementação prática é completamente novo e inaudito na técnica anterior. O reconhecimento de pelo menos dois grupos funcionalmente diferentes dos compostos orgânicos nos extractos alergénicos, 9/33 isto é, por um lado taninos e melanoidinas (ou "adjuvantes") de activação do sistema de complemento, que agem sinergeticamente com os componentes das (glico)proteínas e por outro lado, representa um novo e grande avanço inesperado na compreensão das doenças alérgicas mediadas por IgE nos seres humanos, que têm repercussões tecnológicas importantes para o desenho e para a produção de medicamentos novos. Assim, por exemplo, deduziu-se que para o fabrico das composições de epítopos das células T tolerogénicas, que não conduzem a indução dos anticorpos IgE, os factores activadores de complemento devem tanto quanto possível ser removidos da matéria-prima alergénica.
Além das suas propriedades activadoras de complemento, os taninos e as melanoidinas exercem muitos outros efeitos indesejáveis. Estes compostos adsorvem fortemente a maioria das proteínas por múltiplas interacções hidrofóbicas e ligações de hidrogénio, protegendo assim as proteínas dos ataques enzimáticos. Inversamente, os taninos e as melanoidinas inibem
uma grande variedade de enzimas que operam em valores de pH fisiológicos neutros ou ligeiramente alcalinos, incluindo as serina proteinases tripsina, quimotripsina e calicreína [11].
Devido a que as forças físicas envolvidas na interacção da proteína tanino/melanoidina desceram contrariamente a zero nos valores de pH inferiores a 2.5, a proteinase escolhida para a produção enzimática dos epítopos das células T das macromuléculas alergénicas é a enzima gástrica pepsina com actividade óptima de pH 2. Com este valor de pH, os taninos e melanoidinas (que têm um tamanho molecular máximo de aproximadamente 5 kDa) dissociam-se das proteínas e podem ser removidas por diálise ou por ultrafiltração. Portanto, é absolutamente vital que o processo de digestão enzimática com pepsina para a fragmentação do alergénio esteja precedido por uma fase de diálise com meio ácido (pH inferior a 2.5) na ausência de enzimas para remover os taninos e/ou as melanoidinas interferentes sem que afecte as estruturas das proteínas alergénicas. Se estas substâncias polihidroxílicas activadoras 10/33 de complemento não são removidas antes do processo de digestão péptica, elas voltarão a associar-se com os peptideos das células T após a neutralização, tornando-as indisponiveis no produto farmacêutico final. A matéria-prima candidata para a fragmentação enzimática pode, portanto, compreender os alérgenos "despigmentados" preparados com pH 2 na ausência de enzima e estes estão descritos detalhadamente no Pedido de Patente europeia número EP 0 662 080 BI. Os taninos e/ou as melanoidinas podem ser removidos numa fase de diálise através das membranas 5kDa.
Como o detalhado no Pedido de Patente europeia EP 0 662 080 Bl, o processo de despigmentação das proteinas alergénicas numa solução de ácido cloridrico ou de ácido sulfúrico diluido com pH 2.0 ± 0.1 remove uma proporção substancial (15-60 % em peso, dependendo do material da fonte) dos componentes >10 kDa dissolvidos nos extractos alergénicos por diálise ou por ultrafiltração directamente do meio ácido através das membranas de corte de 10 kDa. Portanto, o tamanho molecular dos componentes dessorvidos está num intervalo inferior a 10 kDa, e inclui os taninos naturais, (eu)melaninas e melanoidinas que têm normalmente uma massa molecular à volta de 5 kDa. Se esta fase de diálise preventiva não for aplicada antes da fase de digestão, por exemplo uma fase de digestão com pepsina adicionada, como a que não foi incorporada nos procedimentos descritos no Pedido de Patente norte-americana US 4,469,667 e no Pedido de Patente europeia EP 0113712 Bl, a neutralização da solução acidica no caso da pepsina após a hidrólise com pH 2 provocará a re-associação dos complexos de peptídeos-taninos como o acima discutido, protegendo assim os epítopos das células T desejadas do reconhecimento posterior pelo sistema imune celular. Se os taninos e as melanoidinas não são removidos antes da digestão enzimática, isto conduzirá também a que a potência activadora de complemento do produto final não seja afectado e conduzirá à estimulação indesejada da sintese de IgE na aplicação humana. 11/33
Apesar de um processo de despigmentação executado correctamente, as estruturas polifenólicas e as de tipo Maillard ligadas quimicamente podem muitas vezes serem ainda identificadas química e espectroscopicamente, mesmo nas proteínas alergénicas despigmentadas adequadamente [12]. Estes derivados de hidratos de carbono e polifenólicos conjugados são uma parte integral da estrutura molecular dos alergénios de proteína e não podem ser removidos num meio ácido. De facto, tem sido demonstrado que estas cadeias laterais não proteicas podem mesmo como háptenas, formar parte dos sítios de epítopos de célula B reconhecidos por anticorpos IgE e IgG específicos, como o descrito no Pedido de Patente norte-americana 5,384,395 e no Pedido de Patente europeia EP A 0,387,952. Efectivamente, a eliminação dos taninos e das melanoidinas adsorvidos fisicamente pelo processo de despigmentação do Pedido de Patente europeia EP 0 662 080 Bl ajuda a não disfarçar estas estruturas hapténicas conjugadas de proteínas, que na maioria dos alérgenos conduzem a um ligeiro aumento na ligação dos anticorpos IgE específicos. Por outro lado, a distribuição hapténica e a densidade no portador de antigénios proteicos pode ser tal que as preparações despigmentadas (HMW-D) >10 kDa particulares não possam facilmente ser hidrolisadas enzimaticamente, como o referido para os alérgenos de pólen de Parietaria judaica [12]. Contrariamente ao que foi implicado no Pedido de Patente europeia EP 0113712 Bl, foi descoberto que a facilidade de digestão enzimática por pepsina era diferente entre as diferentes preparações de alérgenos despigmentadas >10 kDa, o que significa que as condições de hidrólise enzimática devem ser adaptadas de acordo com a fonte de alérgeno. Como o mostrado nos exemplos da figura 1 do objecto do Pedido de Patente, o nível de aparência dos grupos amino livres de peptídeos determinados com um reagente de ninhidrina durante a digestão da pepsina efectivamente mostra variações marcadas entre as várias preparações de pólen alergénico. 12/33
As estruturas hapténicas dominantes encontram-se incorporadas nos esqueletos de proteinas alergénicas, que ou pertencem ao grupo dos flavonóides polihidroxilicos e outros polifenóis, que em condições oxidativas formam fortes ligações de tioéter com residuos de cisteina na macromolécula de proteina ou representam produtos de reestruturação quimica das hexoses ou pentoses ligadas aos grupos e-amino das cadeias laterais de lisina [1]. Tanto as estruturas hapténicas ligadas a S e a N (e) absorvem a luz ultravioleta na margem de 300-350 nm, em que a absorção da proteina pura é negligivel. Como o ilustrado nos exemplos da figura 2, é de facto observada uma relação invertida, entre a densidade hapténica aproximada por espectroscopia de UV e o nivel de digestão dos complexos hapténicos proteicos alergénicos por pepsina, medidos enquanto aos grupos amino livres de reagentes de ninhidrina libertada.
Nalguns casos as preparações de HMW-D, de pepsina altamente resistente, podem ser mostrados por métodos electroforéticos que, apesar da escassez dos grupos amino livres libertados (figura 1), é, no entanto, evidente a fragmentação pela perda de constituintes proteicos detectáveis. No exemplo do pólen
Parietaria, a fragmentação bem cortada pode também ser demonstrada pela perda de potência de activação de complemento, mas não da ligaçãp de IgE, nos fragmentos enzimáticos (Fb-D) por um factor de pelo menos 100. Em vista das fortes propriedades de redução dos elementos estruturais do açúcar de polifenol ou de lisina, a oxidação é um requisito prévio fundamental para a plena eliminação da ligação de IgE assim como dos sítios de activação de complemento. A oxidação das preparações HMW-D antes da fragmentação é executada utilizando uma variedade de agentes químicos, como por exemplo, com sais de periodato (ver abaixo) .
No entanto, para proteger os epítopos das células T de possíveis hidratos de carbono, o método escolhido é a oxidação por meio da irradiação ultravioleta, a qual mostrou a diminuição da activação do complemento assim como das potências de ligação de
IgE (13) . No caso das preparações HMW-D com pólen de algumas 13/33 ervas daninhas, árvores e ervas uma fase de oxidação suplementar pode por conseguinte ser introduzida, após a despigmentação mas antes da fragmentação (ver abaixo). A fragmentação enzimática e os procedimentos de oxidação de acordo com a invenção são aplicáveis a todos os ambientes alergénicos conhecidos, materiais de interior e de exterior, incluindo ácaros, insectos, bolores, pólen das famílias das gramíneas, ervas daninhas e árvores, pós orgânicos dos ambientes ocupacionais, etc. Estes materiais podem ser extraídos e
submetidos a um processo de despigmentação, como o por exemplo descrito no Pedido de Patente europeia EP 0 662 080 Bl. A escolha correcta subsequente das condições de fragmentação (pré-oxidação, rácio entre enzima e substrato, período de hidrólise enzimática, etc.) para obter a degradação proteolítica da matéria alergénica no extracto pode depender da verificação experimental preliminar devido à natureza do material da fonte. Esta escolha para um técnico especializado é uma mera rotina e pode ser executada sem grande esforço. A preparação proposta dos epítopos das células T naturais segue uma série de fases que são exemplificadas no procedimento descrito no exemplo. Em termos gerais o método de acordo com a invenção é um método para produzir um extracto para prover a tolerância aplicado a um indivíduo com o fim de prover a tolerância contra o material alergénico, compreendendo o dito método: a) a extracção de material de fonte alergénica; b) a remoção de material com um peso molecular inferior a 3.5
kDa, dando assim a fracção HMW-N, opcionalmente HMW-N liofilizado; c) a remoção dos taninos e das melanoidinas que estão fisicamente presas ao material alérgeno no HMW-N da fracção, 14/33 dando assim a fracção livre despigmentada HMW-D de taninos e melanoidinas livres e taninos e melanoidinas não conjugados, opcionalmente o HMW-D liofilizado; d) a oxidação de HMW-D, provendo deste modo a fracção HMW-Dox; e) a degradação da proteina presente na fracção HMW-Dox produzindo assim fragmentos com um peso molecular entre 1 e lOkDa, sendo o dito produto da fase d) Fb-D e as operações das fases a-d executadas de maneira conhecida per se para as ditas fases. A invenção também compreende um extracto de material de fonte alergénica que compreende fragmentos de alérgenos que conservam os seus epitopos de estimulação dos linfócitos T naturais mas sem os epitopos de ligação IgE, depletados o mais possível dos agentes de activação do complemento, e seguros para serem utilizados como composições para induzir um estado de anergia das células T específicas e a tolerância imunológica nos seres humanos alérgicos. 0 extracto de acordo com a invenção pode ser derivado de fontes alergénicas seleccionadas de um ambiente conhecido, materiais alergénicos de interiores ou de exteriores, incluindo os insectos, ácaros, bolores, pólen das gramíneas, ervas daninhas, flores, arbustos ou árvores e de materiais alergénicos nos ambientes ocupacionais.
Preferencialmente este extracto é um em que a potência de ligação de IgE dos fragmentos de alérgenos expressos como a quantidade de material liofilizado requerido para 50% de inibição da ligação de IgE em condições de ensaio Standard é pelo menos 100 vezes menor do que a de um extracto não tratado no mesmo dissolvente e nas mesmas condições. Alternativamente ou em combinação com o anterior de acordo com a invenção o extracto é um em que a potência de activação do complemento dos fragmentos de alérgeno expressos por exemplo como a quantidade de material liofilizado para provocar a perda de 50% de 15/33 complemento hemolitico humano, é pelo menos 100 vezes menor do que a de um extracto não tratado no mesmo dissolvente e nas mesmas condições. 0 extracto de acordo com a invenção em qualquer uma das formas de realizar a invenção acima mencionadas pode ser um, em que o indice de estimulação do linfócito T dos fragmentos alérgenos seja 50-150% em relação ao extracto não tratado no mesmo dissolvente e nas mesmas condições. Em particular, o extracto de acordo com a invenção é um em que os fragmentos alérgenos têm um peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa, como o determinado por diálise de uma solução aquosa com pH 7.0 através das membranas destes valores de corte nominal. O extracto de acordo com a invenção está privado de taninos, melanoidinas e outros pigmentos livres e/ou adsorvidos de proteínas.
Resumidamente, uma preparação obtenível de acordo com o método da invenção como o descrito está também dentro do âmbito da invenção. De acordo com a invenção esta preparação estará disponível adequadamente numa dose aceite na Indústria Farmacêutica para ser aplicada a seres humanos e/ou animais.
De acordo com a invenção a utilização de uma preparação como componente activo de um medicamento para o tratamento de um indivíduo alérgico com o objectivo de induzir tolerância à substância alergénica natural, da qual a preparação é derivada, será também considerada uma forma adequada de realizar a invenção.
Exemplo que ilustra a extracção, despigmentação e fragmentação num processo de acordo com a invenção
A. Preparação de HMW-N
Os materiais de fonte alergénica seca como os pós do pólen das plantas, as escamas da pele ou penas dos animais, as culturas de 16/33 gastas de ácaros ou os corpos secos de ácaros limpos ou outros corpos de insectos foram suspensos numa solução 0.01 M de tampão fosfato com pH 7.0, que continha 0.15 M NaCl (PBS) . A extracção foi realizada duas vezes com agitação continua num lugar frio a +4 °C, nomeadamente, na primeira realização durante 4h, onde o residuo foi de novo extraido após a centrifugação durante 18 h e centrifugado. Os extractos combinados foram dialisados em 5 volumes de água destilada utilizando um sistema Pellicon® equipado com membranas de corte nominal de 10 kDa (Ref: Millipore®, PLBC 000 05). O retentado >10 kDa dialisado é seguidamente seco mediante liofilização para dar >10 kDa do produto alérgeno bruto HMW-N. Nos casos seleccionados, nomeadamente onde é conhecida a existência de alérgenos "menores" inferiores a 10 kDa, as membranas 10 kDa podem ser substituídas por placas de diálise de 3,5 kDa.
B. Preparação de HMW-D
Os pormenores do procedimento de despigmentação estão estabelecidos no Pedido de Patente europeia EP 0 662 080 BI. Resumidamente, o produto liofilizado HMW-N da alinea A) foi dissolvido à temperatura ambiente em água destilada a uma concentração de 10 mg/ml. A esta solução foi adicionado ' à temperatura ambiente e com agitação constante 2 N HC1 e ao aproximar-se do ponto final adicionou-se 0.1 N HC1, para diminuir o pH a 2.0 ± 0.1; continuando a agitar durante pelo menos 15 minutos. As substâncias cromofóricas ou "pigmentos" dessorvidos no meio acidico de HMW-N foram seguidamente eliminadas por diálise ou ultrafiltração repetida num lugar frio a 4 °C durante pelo menos 17 h com várias mudanças de água destilada através das membranas de corte de 10 kDa, em que o pH da solução retentada de >10 kDa aumenta até um valor de aproximadamente 3.5. A solução retentada após uma diálise exaustiva, o pH é elevado a 7.0 ± 0.1, pela adição de 1,0 - 0,1 N NaOH. Por último a solução neutralizada foi centrifugada, 17/33 passada através de um filtro estéril de 0.2 μΜ e seca por liofilização para dar o produto alergénico despigmentado HMW-D. C. Preparação de HMW-Dox
Num procedimento protótipo, uma amostra de HMW-D liofilizada foi dissolvida 0.05M (50 mM) de metaperiodato de sódio a pH 5.3 e sob agitação durante 1 h à temperatura ambiente. A solução foi seguidamente passada através de uma pequena coluna de Sephadex® G25 em água destilada e as primeiras fracções do eluido provenientes da coluna foram agrupadas e liofilizadas para obter a preparação oxidada HMW-Dox. A potência das preparações oxidadas foi determinada comparando-as com os produtos originais HMW-D por meio do consumo do complemento hemolitico e por inibição da ligação de anticorpos IgE específicos de acordo com as técnicas estabelecidas. Um exemplo para o caso de HMW-D a partir do pólen de Parietaria judaica é dado no quadro I. No entanto, para evitar a contaminação com produtos quimicos residuais ou produtos de fissura indesejáveis, deverá ser dada preferência à oxidação de HMW-D em solução aquosa por irradiação com luz ultravioleta como o descrito na técnica anterior (13).
D. Preparação de fragmentos enzimáticos Fb-D
No procedimento proposto para obter os peptídeos dos epítopos das células T naturais ou háptenos de peptídeos derivados da digestão da proteína, as matérias primas são as preparações despigmentadas obtidas de HMW-D de acordo com os processos descritos na alínea B) e no Pedido de Patente europeia EP 0 662 080 BI ou HMW-Dox descrito na alínea C) . O procedimento para obter os fragmentos enzimáticos Fb-D das duas matérias primas é idêntico e se detalham como segue. 0 material despigmentado liofilizado HMW-D (ou HMW-Dox) foi dissolvido em 10 volumes de água bidestilada e posto num 18/33 recipiente com parede dupla para permitir a circulação da água a 37±1 °C através da parede externa e interna por meio de uma bomba peristáltica durante o período de digestão. A esta solução foi adicionada com uma agitação constante 2 N HC1 para baixar o pH aproximadamente 2.5. A enzima proteolítica pepsina na forma imobilizada acoplada a 4% de Sepharose® reticulada (Sepharose-pepsin, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA, ref. cat. P-3286) foi seguidamente adicionada na forma de pó seco num rácio de 4 unidades de actividade de pepsina por mg de HMW-D (isto é, aproximadamente 1:5 de enzima/substrato p/p ou de outra forma, dependendo da fonte do alérgeno). A suspensão foi seguidamente ajustada a pH 2.0 ± 0.1. adicionando gota a gota 0.1 N HC1 e continuando a agitação durante pelo menos 6 horas a 37±1 °C, mantendo o valor do pH da mistura a 2.0 ± 0.1 por controlo automático pH-stat. No fim do período de digestão, a mistura foi neutralizada a pH 7.0 com 2.0 N-0.1 N NaOH e seguidamente filtrada através de uma membrana 0.4 μΜ para remover as partículas enzimáticas. Seguidamente adicionamos água destilada para dar um volume final duas vezes maior que a solução original, seguida de diálise num sistema de fluxo tangencial
Minitan® equipado com uma membrana Millipore de 10 kDa. O líquido externo (tamanho molecular M<10 kDa) foi recolhido e o fluido interno que continha os endofragmentos Fa-D >10 kDa foi descartado. A título de ilustração alguns pormenores analíticos dos endof ragmentos Fa-D >10 kDa, compostos na sua maioria por heteropolissacarídeos, são dados no quadro I deste documento. O material M<10 kDa é seguidamente passado através de outros ciclos de fases de diálise Minitan utilizando uma membrana 1 kDa, pelo qual o retentado >1 kDa foi retido e o líquido externo foi descartado. Por último a solução do retentado foi passada por um filtro estéril através das membranas de filtro 0.22 μΜ e liofilizada para dar o produto de fragmento desejado 1 kDa>Fb-D<10 kDa. 19/33
Os rendimentos e as características espectroscópicas das matérias primas HMW-N, as preparações intermédias HMW-D (ou HMW-Dox) , os não digeridos (amplamente>10 kDa heteropolissacarideos) por produtos Fa-D e os produtos finais desejados Fb-D são no quadro II mostrados no seu conjunto por uma série de materiais de fontes alergénicas representativas.
Controlo do processo 0 progresso da digestão da enzima foi monotorizada pela libertação dos grupos amino livres. A intervalos regulares durante o processo de hidrólise enzimática, amostras de 0.5 ml são retiradas das misturas de pepsina/proteina, ajustadas a uma concentração final de 0,5 mg/ml num tampão de acetato de sódio 4N pH 5.5 e seguidamente aquecidas durante 15 minutos a 100 °C com 50 μΐ de 2% ninhidrina em tampão de acetato de metil cellosolve. Após o arrefecimento, a absorvância foi lida em 541 nm em contraste com um branco de reagentes. Exemplos representativos das curvas de digestão cinética baseadas na libertação dos grupos amino livres são ilustrados no seu conjunto na figura 1.
Como pode ser observado na figura 1, a libertação dos grupos amino livres detectáveis com algumas preparações alergénicas podem ser muito baixas (por exemplo, Parietaria, Artemísia, Ambrósia). No entanto, esta necessidade não significa que a fragmentação sob a influência de pepsina não se dê porque, exceptuando o pólen de Parietaria judaica [12], os fragmentos enzimáticos Fb-D destes produtos alergénicos têm de perder um grau considerável da sua capacidade de ligação para anticorpos lgE específicos, isto é, os seus epítopos de célula B (quadro II) . Pode ser assumido que o reagente de ninhidrina pode às vezes ser bloqueado por cadeias laterais de peptídeos polifenólicos. No entanto, o ponto importante no controlo do produto é que os produtos do fragmento final Fb-D devem ser 20/33 rastreados para a perda da ligação de IgE e da potência de activação do complemento, juntamente com a não diminuição das propriedades que estimulam as células T.
Controlo do produto final
Ligação dos anticorpos IgE de alérgenos específicos A capacidade in vitro dos produtos finais Fb-D de se combinarem com anticorpos de classe IgE específicos foi controlada por qualquer um dos procedimentos de inibição estabelecidos, utilizando os soros de pacientes alérgicos especificamente sensibilizados. A potência dos fragmentos de ligação IgE, expressos como a quantidade de material seco para provocar 50% de inibição da ligação em condições de ensaio standars, deve ser pelo menos 100 vezes inferior às da preparação HMW-D ou HMW-Dox original em condições idênticas, isto é, uma redução igual ou menor do que 1% em relação à matéria prima antes da fragmentação. No quadro III, alguns dados representativos obtidos com as preparações não oxidadas de HMW-D são mostradas no seu conjunto.
Activação de complemento A capacidade in vitro dos produtos finais Fb-D de activarem o sistema de complemento foi estabelecida por ensaios hemolíticos ou imunoenzimáticos, de acordo com os procedimentos publicados (8,13). A potência da activação de complemento dos fragmentos, expressos por exemplo como a quantidade de material seco para provocar uma perda de 50% de complemento hemolítico, deve ser pelo menos 100 vezes menor do que a preparação HMW-D ou HMW-Dox, original avaliadas em condições idênticas, isto é, uma redução igual ou inferior a 1% da potência da matéria prima antes da fragmentação. 21/33
Estimulação das células T
Para verificar a aplicabilidade dos produtos finais Fb-D como preparações viáveis que retêm os epítopos essenciais das células T, os fragmentos Fb-D foram examinados para a sua capacidade de indução da proliferação dos linfócitos T isolados do sangue de doentes especificamente alérgicos de acordo com os procedimentos imunológicos estabelecidos. 0 índice de estimulação das células T dos fragmentos finais em relação à preparação HMW-D original deverá ser entre 50-150%. A figura 3 resume alguns dados representativos relativos aos fragmentos pépticos Fb-D obtidos pela fragmentação de uma preparação HMW-D isolada das culturas de ácaros tropicais Blomia tropicalis altamente alergénicos.
Metodologias diversas
Todos os produtos finais Fb-D foram submetidos de forma rotineira a procedimentos adicionais de controlo, por exemplo por focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida na presença de Ampholines® com o pH na margem de 3-10, que em contraste com as preparações HMW-D originais não revelaram nenhuma banda constituinte detectável com coloração da proteína habitual. A separação electroforética em géis de poliacrilamida que utilizam dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) na presença de tricina (N-2-hidroxi- 1.1.-bis [hidroximetiletil]glicina) revela modelos de distribuição de bandas coradas Coomassie Blue que são totalmente diferentes das observadas com as preparações HMW-D originais e que podem ser utilizadas para verificar a reprodutibilidade do processo de produção.
Nos quadros II e III é dada uma listagem dos dados analíticos para algumas preparações alergénicas.
Patentes 22/33 * Compostos tóxicos primários ou alérgenos, que podem ser isolados a partir de material vegetal assim como métodos para a sua preparação e aplicação.
Inventor: Berrens, L. Número de Patente europeia A 0,387,952. concedida em 1995. * Método para o isolamento de compostos tóxicos primários ou alérgenos a partir de material vegetal.
Inventor: Berrens, L. Patente norte-americana 5,384,395. Data da patente: 24 de Janeiro de 1995 * Um processo para a purificação de extractos aquosos que contêm proteínas alergenicamente activas, extractos obteníveis de acordo com este processo assim como a sua utilização.
Inventor: Berrens L. Número de Patente europeia EP 0 662 080 Bl, data de concessão: 5 de Fevereiro de 1997. Data de depósito: 21.09.92. * Fracção imunodepressora de pólen activo polipeptídeo.
Michael JG, Pesce AJ (inventores). Patente norte-americana 4,338,297, com data de 6 de Julho de 1982. Data de depósito 14.04.80. * Fracção imunodepressora de pólen activo polipeptídeo.
Michael JG, Pesce AJ (inventores). Patente europeia EP 0113712 Bl, baseada no Pedido de Patente Internacional PCT/US82/00886, data de depósito 30.06.82, data de publicação da descrição da patente 15.03.89.
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Quadro I
Efeito da oxidação com metaperiodato de sódio na ligação de IgE e potências de activação de complemento das preparações alergénicas despigmentadas HMW-D do pólen de Parietaria judaica.
Produto μρ num ensaio para 50% hemólise factor redução de HMW-D 0, 49 HMW-Dox 12, 36 25,2 μ*? no teste para 50% inib. factor de ligação IgE redução HMW-D 1,5 HMW-Dox 4,12 2,7 Quadro II . Análise dos fragmentos alérgenos pépticos Fonte de Fracçã Produção de 50% inibição 50% inibição de IgE 25/33 alérgeno o (*) pólen seco/cultur a, % p/p de IgE (discos) μρ no teste (EIA) μρ no teste Ambrósia HMW-N 15, 03 n. d. n. d. elatior HMW-D 8,59 72,04 0,2 Fa-D 4,52 1312,06 sem inibição Fb-D 0,75 sem inibição sem inibição Bétula HMW-N 2, 67 n. d. 0,009 alba HMW-D 1,72 n. d. 0,011 Fa-D 0,87 n. d. 0,442 Fb-D 0,42 n. d. 3,162 Lolium HMW-N 8,88 n. d. 0,081 perenne HMW-D 5,07 0,81 0,012 Fa-D 2,50 324,00 5,51 Fb-D 1,20 854,00 138,70 Olea HMW-N 8,20 n. d. n. d. europaea HMW-D 5,15 11,08 0,011 Fa-D 1,70 141,30 2,54 Fb-D 0,80 1077,00 17, 61 Parietar HMW-N 3, 60 5, 18 0,008 ia HMW-D 1,85 3, 82 0,0126 j udaica Fa-D 0, 93 3,77 0,012 Fb-D 0,14 4, 17 0,0102 D.perony HMW-N 14, 96 n. d. n. d. ssinus HMW-D 14,51 2,84 n. d. Fa-D 6, 08 52,70 n. d. Fb-D 2,59 452,20 n. d. 26/33
Blomia HMW-N 9, 60 n. d. 0,0143 tropical HMW-D 5,70 n. d. 0,0072 is Fa-D 3,40 n. d. 0,0085 Fb-D 1,20 n. d. 2, 667 (*) As fracções de Fa-D compreendem resíduos não digestíveis >10 kDa.
Os fragmentos Fb-D de 1 kDa < M < 10 kDa compreendem os produtos finais desejados.
Quadro II. Análise dos fragmentos alérgenos pépticos
Fonte de alérgeno E (1 %, 1 cm) (270 nm) pH 7.4 E(1%, 1 cm) (325-350 nm) pH 7 Material ninhidrina-positiva como % equiv, glicina Método de Antrona % de hidratos de carbono como % galactose Ambrósia 58, 64 38,24 n. d. n. d. elatior 50,80 38, 68 1, 96 41, 13 0,40 1,24 1,58 36, 08 39,48 27,08 3, 92 28,45 Bétula 10,56 - n. d. n. d. alba 6, 92 - n. d. n. d. 5, 13 - n. d. n. d. 6, 83 - n. d. n. d. Lolium 7,33 2,82 n. d. n. d. perenne 7, 95 2, 90 3,70 35,41 1,87 0,73 2, 67 56,48 7,59 1, 63 7,70 8,25 27/33
Olea 51, 04 29, 02 n.d. n.d. europaea 24, 16 10,82 4,37 25,37 11, 14 5, 62 2, 97 42,09 11, 84 4, 90 7,89 8,47 Parietar 76, 20 41, 68 5, 44 n.d. ia 40, 64 18, 92 3, 35 30,07 judaica 30, 72 15,29 3, 18 30,35 38, 88 24,00 4,09 38,83 D.perony 11, 14 n. d. n.d. n.d. s 10, 08 n. d. 3,10 39, 78 sinus 10, 70 n. d. 1, 69 64, 60 8,55 n. d. 2,02 20,27 Blomia 26, 22 n. d. 100,00 16, 53 tropical 25, 42 n. d. 81,00 22,49 is 30, 16 n.d. 70,00 24,07 17, 12 n. d. 100,00 18,54 (*) As fracções de >10 kDa. Fa-D compreendem resíduos não digestíveis
Os fragmentos Fb-D de 1 kDa < M < 10 kDa compreendem os produtos finais desejados.
Quadro III
Factores de redução para potência de ligação de IgE (reactividade com epitopos de células B) determinados pela inibição da ligação de IgE a de soros específicos humanos para os produtos alérgenos individuais para a HMW-D* quimicamente conjugado com brometo de cianogénio para discos de papel ("inibição RAST"). Recalculado para a potência relativa de HMW-D = 1.
Fonte de alérgeno Fracção 28/33
HMW-D>10 kDa FaD>10 kDa lkDa<FbD<10kD
Ambrósia elatior 1 18 1500 Bétula alba 1 169 1123 Lolium perenne 1 400 1054 Olea europaea 1 13 97 Artemisia 1 8 61 vulgaris** 1 1 1 Parietaria judaica 1 19 159 D. pteronyssinus 1 19 370
Blomia tropicalis** * preparações despigmentadas não oxidadas ** factores de redução calculados nos ensaios imunoenzimáticos em placas de microtitulação, com HMW-D revestidas à superficie dos poços.
Legendas das figuras
Figura 1: Cinética da libertação de grupos amino livres de ninhidrinas reactivas a partir das séries representativas das preparações alergénicas HMW-D enzimaticamente hidrolisadas por pepsina. Condições: ver texto.
Figura 2: Relação inversa entre a digestibilidade das preparações HMW-D de pólen por pepsina (isto é, a ninhidrina fica com cor após 6 horas de hidrólise a 37 °C e pH 2), e os coeficientes de extinção E (1%, 1 cm) a 325 nm tomados a partir dos espectros ultravioleta em 0,01 M tampão de fosfato pH 7.0.
Figura 3: Proliferação das células T em culturas de linfócitos periféricos (incorporação de timidina radioactiva, unidades relativas) do sangue de (a) pacientes especificamente alérgicos e (b) controlos de saúde negativos no teste de pele sobre a 29/33 estimulação pela preparação despigmentada HMW-D e os fragmentos Fb-D preparados a partir de extractos de Blomia tropicalis.
Lisboa, 30/33
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração foi tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a este respeito a EPO declina qualquer responsabilidade.
Documentos de Pedidos de Patente citados na descrição
W A A B A A A BI A BI A A A Pesce AJ W EP 9601733 GB 1492973 EP 0367306 EP 0038154 GB 1282163 GB 1578348 US 4469667 EP 0113712 WO 9406821 EP 0662080 US 5384395 EP 0387952 US 4338297 Michael JG, US 8200886
Literatura citada na descrição que não é Pedido de Patente BERRENS L. The Chemistry of Atopic Allergens. Monogragraphs in Allergy, 1971, vol. 7
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Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES 1. Um método para produzir um extracto que provê tolerância aplicado a um indivíduo com o fim de prover tolerância contra o material alergénico, caracterizado por o dito método compreender: a) a extracção de material de fonte alergénica; b) a remoção de material com um peso molecular inferior a 3,5 kDa, dando assim a fracção HMW-N, opcionalmente HMW-N liofilizado; c) a remoção dos taninos e das melanoidinas que estão fisicamente presas ao material alérgeno no HMW-N da fracção, dando assim a fracção livre despigmentada HMW-D de taninos e melanoidinas livres e taninos e melanoidinas não conjugados, opcionalmente o HMW-D liofilizado; d) a oxidação de HMW-D, provendo deste modo a fracção HMW-Dox; e) a degradação da proteína presente na fracção HMW-Dox produzindo assim fragmentos com um peso molecular entre 1 e lOkDa, sendo o dito produto da fase d) Fb-D.
- 2. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material da fonte alergénica ser seleccionado material de interior e de exterior de um ambiente alergénico, incluindo insectos, ácaros, bolores, pólen de gramíneas, ervas daninhas, flores, arbustos e árvores, pós nos ambientes ocupacionais.
- 3. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a fase a) compreender a suspensão do material da fonte alergénica num tampão de fosfato, seguido de diálise contra água destilada utilizando uma membrana semipermeável com um valor de corte de 3,5 kDa na fase b). 1/4
- 4. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase b) compreender a remoção de material com um peso molecular inferior a 10 kDa, quando os alérqenos denominados "menores" com PM inferior a 10 kDa são conhecidos por estarem ausentes no material de fonte alergénica, dando lugar assim à fracção HMW-N.
- 5. Um método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a fase a) compreender a suspensão do material da fonte alergénica em tampão de fosfato, seguido da extracção contra água destilada utilizando diálise com um corte de 10 kDa na fase b) .
- 6. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase c) compreender uma fase de despigmentação em que o pH é reduzido a um nivel inferior a 2.5, seguida de uma fase que assegura a remoção dos taninos livres, melanoidinas e outros pigmentos, provendo assim uma preparação HMW-D depletada destes compostos por diálise utilizando pelo menos uma membrana semipermeável com um valor de corte de tamanho molecular especifico.
- 7. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase c) compreender uma fase de despigmentação em que o pH é reduzido a um nivel inferior a 2.5 seguido de uma fase quanto baste para assegurar a remoção da fracção resultante com taninos e melanoidinas livres que provêem HMW-D livre de taninos e melanoidinas livres por diálise sobre uma membrana com um valor de corte de 10 kDa, retendo assim a fracção com uma peso molecular inferior a 10 kDa.
- 8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase c) compreender uma fase final que ajusta a solução HMW-D a um valor de pH neutro. 2/4
- 9. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase e) compreende a degradação enzimática da proteina.
- 10. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase e) compreender a degradação proteolítica com pepsina, pelo qual as condições da fragmentação correcta são escolhidas de acordo com a variação dependendo da natureza do material de fonte e da pepsina seleccionada.
- 11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase e) compreender a degradação proteolítica com a pepsina de proteinase ácida.
- 12. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase e) compreender a clivagem proteolítica por pepsina, seguida da retenção de uma fracção com peso molecular inferior a lOkDa, podendo esta ser obtida por diálise sobre uma membrana com um corte de 10 kDa.
- 13. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a fase de oxidação se dar mediante irradiação da solução HMW-D com luz ultravioleta.
- 14. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado por a fase de oxidação compreender o tratamento de HMW-D com metaperiodato de sódio seguido da purificação para remover o excesso de oxidante por peneiração molecular. 3/4 15. 0 extracto obtenível por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14 caracterizado por este ser utilizado como um componente activo de um medicamento para o tratamento de um indivíduo alérgico, com o objectivo de induzir a tolerância à substância natural alergénica, da qual a preparação foi derivada. Lisboa, 4/4
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