CZ283615B6 - Způsob výroby vakcín proti dermatofytózám zvířat a dermatofytických alergenů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby vakcín proti dermatofytozám zvířat. Při tomto postupu je využito šetrného způsobu inaktivace vakcinačních kmenů dermatofytů ozářením Co.sup.60.n.. Využití navrženého postupu umožňuje připravit rovněž dermatofytické alergeny.ŕ

Description

Oblast techniky

Veterinární medicína, imunologie, alergeny, očkovací látky.

Dosavadní stav techniky

V současné době jsou v široké veterinární praxi používány vakcíny proti dermatofytózám skotu, koní a kožešinových zvířat (A. CH. Sarkisov a kol., AO ČSSR č. 160324; K. Wawrzkiewicz a kol. patent PLR 100/958; A. Rybnikář a kol., patent ČR č. 279982; A. Rybnikář a kol., AO ČSSR 246791; A. Rybnikář a kol., AO ČSSR 261460; A. Rybnikář a kol., pat. ČR 279278; A. Ch. Sarkisov a S. V. Petrovič, AO SSSR 548947; A. CH. Sarkisov a kol., AAO SSSR 955570; A. Ch. Sarkisov a L. I. Nikiforov, AO SSSR 835446; aj.). Ve všech uvedených případech se jedná o vakcíny, obsahující živé kmeny rodu Trichophyton. Při použití těchto vakcín nelze vyloučit možnost ohrožení zdraví lidí nebo zvířat živým vakcinačním kmenem. Proto byly další práce zaměřeny na vývoj inaktivovaných vakcín.

S. V. Petrovič a kol. (pat. SU 1734762) navrhli inaktivovanou vakcínu pro profylaxi dermatofytóz domácích a laboratorních zvířat. Vakcinační kmeny Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis a M. gypseum inaktivovali formaldehydem. Jako adjuvans použili nukleát sodný.

M. Werner a M. Strobel (EP O 393371 AI) patentovali vakcínu, připravenou z kultur M. canis, M. gypseum, Altemaria sp. nebo z dalších dvaceti kmenů dermatofytů a hydroxidu hlinitého nebo mléčného Ringerova roztoku. K inaktivaci použili rovněž formaldehyd.

Další inaktivovanou vakcínu proti dermatofytózám připravili ruští autoři I. D. Poljakov a L. G. Ivanova ze šesti kmenů dermatofytů. Jako inaktivační činidlo navrhují formaldehyd, mertiolát sodný nebo beta-propiolakton. Vakcína obsahuje fermentovanou hydrolyzovanou svalovou bílkovinu nebo extrakt z kvasnic.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je způsob výroby vakcín proti dermatofytózám zvířat, při jehož využití lze rovněž připravit dermatofytické alergeny. Dermatofytické kmeny Microsporum canis CCM 8211 nebo kmen Trichophyton verrucosum CCM F-765, nebo kmen Trichophyton equinum CCM 787 se pomnoží za podmínek, vhodných k produkci strukturálně bohaté houbové hmoty: na agarové živné půdě při teplotě 26 až 29 °C po dobu 11 až 21 dnů. Homogenizace narostlých kultur probíhá v destilované vodě nebo ve fyziologickém roztoku o složení 1 1 destilované vody, 3 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného, 2,38 g sekundárního fosforečnanu sodného, 0,2 g kyselého fosforečnanu draselného, do získání homogenní suspenze. Na rozdíl od výše uvedených postupů, ve kterých jsou k inaktivaci vakcinačních kmenů použita chemická činidla, je při novém způsobu prováděna inaktivace fyzikálně. Navržená metoda ozářením Co⁶⁰ při adsorbovaném množství 2,5 Mrad patří k nejšetmějším způsobům inaktivace živých mikroorganismů. Antigenní struktura houbových buněk je při tomto postupu poškozena oproti chemickým metodám pouze nepatrně, což se příznivě projevuje v imunogenních schopnostech takto připravených vakcín. Další výhodou navrženého způsobu je skutečnost, že vakcína neobsahuje chemická inaktivační činidla, z nichž většina může mít po zavedení do těla zvířat i nežádoucí zdravotní účinky. Zamezí se rovněž možnosti kontaminace potravního řetězce těmito činidly, které by se mohly nepříznivě projevit v humánní populaci. K. inaktivované houbové suspenzi se přidává roztok montanidu

- 1 CZ 283615 B6 v poměru 1:1 nebo aluminiumfosfátu nebo aluminium hydroxidu do celkové koncentrace A1₂O₃ 0,25 až 0,5% hmotnostních.

Navržené vakcíny obsahují na rozdíl od většiny uvedených inaktivovaných vakcín vždy pouze jeden vakcinační kmen. Tato technologie výroby je proto podstatně jednodušší. Mimoto je známo, že při použití vakcín, obsahujících více dermatofytických kmenů, může dojít ktzv. kompetici antigenů a tím i k nižší účinnosti oproti monovalentním vakcínám (S. V. Petrovič a kol., Bjul. Vses. ord. Lenina inst. exper. vet., 12, 1972, s. 20 - 22; A. Rybnikář, Acta vet. Brno, 62, 1993, s. 167- 172).

Příklady provedení

Příklad 1 - výroba vakcíny proti Microsporum canis koček

Pomnožení vakcinačního kmene Microsporum canis CCM 8211 proběhlo na živné půdě o složení: 1 litr destilované vody, 15 g agaru, 18 g glukózy, 18 g maltózy, 8 g peptonu. Živná půda byla sterilizována při přetlaku 70 - 90 kPa po dobu 25 minut a za horka rozplněna do skleněných kultivačních lahví po 350 až 450 ml. Po uzavření zátkami s papírovým kloboučkem byly kultivační láhve znovu sterilizovány při stejných poměrech. Po ukončení sterilizace a vychladnutí byly láhve umístěny na pět dnů do termostatu při teplotě 26 až 29 °C a kontrolovány z hlediska sterility. Živná půda byla inokulována vakcinačním kmenem tak, že na 100 cm² jejího povrchu bylo rovnoměrně rozmístěno minimálně 1,4 x 10⁶ CFU M. canis CCM 8211. Inkubace proběhla po dobu 11 až 21 dnů při teplotě 26 až 29 °C. Porost vakcinačního kmene byl oddělen od živného média a homogenizován při 8 až 10 tisících otáčkách za minutu v prostředí fyziologického roztoku o složení: 1 litr destilované vody, 3 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného, 2,38 g sekundárního fosforečnanu sodného, 0,2 g kyselého fosforečnanu draselného. Doba homogenizace byla 3 až 4 minuty. Vzniklý homogenizát byl filtrován přes gázu. Potom bylo provedeno mikroskopické zjištění denzity vakcinačního kmene, které bylo vyšší než 1 milion konidií nebo úlomků hyf v 1 ml.

Takto připravená suspenze byla exponována Co⁶⁰ při adsorbovaném množství 2,5 Mrad. Po expozici Co⁶⁰ byl k houbové suspenzi přidán sterilní roztok montanidu v poměru 1:1. Vzniklá vakcína byla po dobu 1 min znovu homogenizována při 6 až 8 tisíci ot./min.

Vakcína byla rozplněna á 1 ml do lékovek obsahu 3 ml a sterilně uzavřena gumovými zátkami. Lékovky s vakcínou byly opatřeny hliníkovými pertlemi.

Příklad 2 - výroba alergenu Trichophyton verrucosum

Byla připravena živná půda o složení: 1 litr destilované vody, 100 ml kanditního sladového výtažku, 13,2 g agaru, 5,5 g peptonu. pH půdy bylo upraveno na 6,0 až 6,9. Sterilizace živné půdy, její rozplnění do kultivačních lahví a další sterilizace proběhly stejným způsobem, jako v příkladu 1. Vychladlé, sterilní kultivační médium bylo inokulováno suspenzí spor a mycelia kmene Trichophyton verrucosum CCM F-765 v množství 3,5 až 6,0 x 10⁷ CFU na jednu kultivační láhev. Po 11 až 21 dnech kultivace při teplotě 26 až 29 °C byla narostlá houbová hmota oddělena od živného média a homogenizována 5 min v destilované vodě při 8 až 10 tisíci ot./min. Neředění homogenizátu destilovanou vodou bylo provedeno tak, aby 1 ml konečného produktu obsahoval minimálně 3 miliony konidií kmene T. verrucosum. Takto vzniklý alergen byl rozplněn po 1 ml do lékovek obsahu 3 ml. Lékovky byly uzavřeny gumovými zátkami a opatřeny hliníkovým uzávěrem. Lékovky s alergenem byly exponovány Co⁶⁰ při adsorbovaném množství 2,5 Mrad.

-2 CZ 283615 B6

Takto připravený alergen byl použit ke kožním alergickým testům u skotu.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   10 1. Způsob výroby vakcín proti dermatofytózám zvířat a výroby dermatofytických alergenů, vyznačující se tím, že se kmen Microsporum canis CCM 8211 nebo kmen Trichophyton verrucosum CCM F-765 nebo kmen Trichophyton equinum CCM 787 pomnoží na agarové živné půdě při teplotě 26 až 29 °C po dobu 11 až 21 dnů, homogenizuje se v pufrovaném fyziologickém roztoku nebo v destilované vodě do získání homogenní suspenze a exponuje se

   15 Co⁶⁰ při adsorbovaném množství 2,5 Mrad.
2. 2. Způsob výroby vakcíny a alergenů podle nároku 1, vyznačující se tím, že pufrovaný fyziologický roztok obsahuje 1 litr destilované vody, 3 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného, 2,38 g sekundárního fosforečnanu sodného, 0,2 g kyselého fosforečnanu

   20 draselného.
3. 3. Způsob výroby vakcíny podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že se k inaktivované houbové suspenzi přidává roztok montanidu v poměru 1:1, nebo aluminiumfosfátu nebo aluminiumhydroxidu do celkové koncentrace kysličníku hlinitého 0,25 až 0,5 %

   25 hmotn.