CZ20001529A3 - Způsob přípravy toleranci indikujících extraktů, preparátů a jejich použití - Google Patents
Způsob přípravy toleranci indikujících extraktů, preparátů a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20001529A3 CZ20001529A3 CZ20001529A CZ20001529A CZ20001529A3 CZ 20001529 A3 CZ20001529 A3 CZ 20001529A3 CZ 20001529 A CZ20001529 A CZ 20001529A CZ 20001529 A CZ20001529 A CZ 20001529A CZ 20001529 A3 CZ20001529 A3 CZ 20001529A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- kda
- hmw
- fraction
- allergenic
- allergen
- Prior art date
Links
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 11
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 71
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 claims description 29
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 claims description 21
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 claims description 21
- 239000001648 tannin Substances 0.000 claims description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 19
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 15
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 11
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 10
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 5
- 241000238876 Acari Species 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 4
- 239000000428 dust Substances 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 31
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 15
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 8
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 11
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 10
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000123966 Blomia tropicalis Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241001465379 Parietaria judaica Species 0.000 description 5
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 235000003129 Ambrosia artemisiifolia var elatior Nutrition 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000721467 Parietaria Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 4
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 4
- 244000037005 Ambrosia artemisiifolia var. elatior Species 0.000 description 3
- 235000002992 Betula pubescens Nutrition 0.000 description 3
- 241001520764 Betula pubescens Species 0.000 description 3
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 3
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 3
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 2
- 108010082974 polysarcosine Proteins 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- PZEUTLIKVUEDLB-UHFFFAOYSA-N 2-[[[2-[[6-amino-2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[2-[[1-[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]propanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]acetyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoylamino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(carbamoylamino)propanoyl]-(3-amino-3-oxopropyl)carbamoyl]amino]pentanediamide Chemical compound CCC(C)C(NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CNC(N)=O)C(=O)N(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(N)=O PZEUTLIKVUEDLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 244000036975 Ambrosia artemisiifolia Species 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 235000004355 Artemisia lactiflora Nutrition 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 240000006891 Artemisia vulgaris Species 0.000 description 1
- 208000012657 Atopic disease Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039558 Galectin-3 Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000007767 bonding agent Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000003975 dentin desensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940066369 honey bee venom Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- -1 hydroxymethylethyl Chemical group 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000009342 ragweed pollen Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000732 tissue residue Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940046536 tree pollen allergenic extract Drugs 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000001319 vasomotor rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43527—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from ticks
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
ZPŮSOB PŘÍPRAVY TOLERANCI INDUKUJÍCÍCH EXTRAKTŮ, PREPARÁTŮ A
JEJICH POUŽITÍ
OBLAST TECHNIKY
Navrhovaný vynález popisuje proces kontrolovaného enzymatického štěpení přečištěných a depigmentováných aktivních alergenních proteinů venkovního i vnitřního prostředí, které dávají vzniknout fragmentům alergenů, které si zachovávají přirozené epitopy stimulující T-buňky, ale jsou zbaveny IgE vazebných B-buněčných epitopů a komplement aktivujících složek, Vynález také popisuje nové farmaceutické produkty. Tyto alergeny nevykazují nevýhody konvenčního alergenního extraktu určeného pro imunotherapii a mohou být bezpečně použity pro indukci specifické anergie T-buněk a navození imunologické tolerance u alergických pacientů.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Vodné extrakty různých substrátů z prostředí, jako je domovní prach, odpadlé částečky a zbytky pokožky zvířat, pylová zrna trav, plevelů, stromů a některé další substráty jsou běžně používány pro in vivo a in vitro diagnostiku alergických onemocnění, jako je bronchiální astma, vasomotorická rýma a senná rýma u lidí s vrozenou dispozicí, nazývaných „atopičtí“ pacienti. Od první klinické zprávy z r. 1911 od Noona a Freemana, jsou tyto extrakty také používány pro léčbu atopických alergických chorob pomocí podkožních injekcí vedoucích k „desenzitizaci“, „hyposenzitizaci“ nebo imunotherapii těchto onemocnění. Vzhledem k pozorováním, že kauzativní a predominantní alergenní komponentou těchto extraktů je proteinová složka o melekulové hmotnosti v rozmezí 10 až 70 kDa, je běžnou praxí, při přípravě alergenních extraktů, dialyzovat nebo pomocí ultrafiltrace separovat vodný extrakt přes membránu propouštějící molekuly o velikosti nižší než 10 kDa a tak odstranit méně důležité molekuly o velikosti nižší než 10 kDa a dát tak vzniknout extraktu obsahujícímu multivalentní antigenní proteiny v rozmezí velikosti od 10 do 100 kDa, tak aby se zlepšila kvalita alergenních extraktů pro klinickou aplikaci. V některých případech může být spodní hranice snížena na 3 nebo 5 kDa. V souladu se současnou teorií, podání alergenů z vnějšího prostředí člověku, způsobuje vytváření alergen - specifických protilátek třídy IgG nebo IgE. V imunologickém kontextu, mohou tedy být alergeny považovány za obvyklé antigeny indukující tvorbu IgG protilátek, obdařené však další vlastností a to buď díky speciálnímu charakteru molekuly nebo simultánní přítomnosti alergenního extraktu patřičných modulátorů, což vede k tvorbě protilátek třídy IgE. Za takové situace je možné tyto antigeny nazývat spíše „atopickými alergeny“ (1). Genetické
predispozice, u člověka nazývané „atopické“ vedou k náchylnosti odpovídat na takový podnět zvýšenou tvorbou alergen - specifických protilátek třídy IgE. Po počáteční indukci „senzitizační“ fáze jakýkoliv další kontakt s alergenem vede k vzniku lokálních komplexů alergen - IgE protilátka, což je příčinou vzniku symptomů choroby. Konkrétněji, interakce alergenu se specifickou protilátkou navázanou na IgE receptor na buněčné membráně (např. na povrchu mastocytů nebo bazofilních leukocytů) vede ke spuštění sekvence biochemických reakcí vedoucích k uvolnění mediátorů zodpovědných za klinicky manifestovatelné symptomy alergie. O tom jak minimalizovat riziko anafylaktické reakce během imunotherapie byla napsána řada publikací. Poslední, PCT/EP96/01733 byla publikována 7. ledna 1996 a popisuje nový farmaceutický prostředek pro použití při desenzitizační therapii u pacientů trpících alergiemi. Tento prostředek obsahuje tyrosin a polymerizovaný antigen. Další postupy byly popsány již v osmdesátých letech, nejsou však dostatečně účinné. GB-A-1,492,973 popisuje koprecipitaci tyrosinu a alergen, který byl modifikovaný látkou způsobující intramolekulámí propojení. EP-A0,367,306 popisuje proces přípravy polymerizovaného alergenu také za použití propojovací látky což údajně vede ke snížení alergenicity. Další starší publikace EP-B-0,038,154 vyšlá v roce 1981 popisuje léčbu alergenem s polysarkosinem který jeho alergenicitu redukuje. Podle publikace je použitelný polysarkosin o molekulové hmotnosti 2 000 až 12 000.V UK patentu č. 1,282,163 je popisována vylepšená forma terapie, kde alergenicita alergenu je redukována inkubací s glutaraldehydem, což ponechává nezměněnou schopnost indukovat tvorbu blokujících protilátek, ale podstatně snižuje alergenicitu a tím je alergen daleko přijatelnější pro desenzitizační terapii. Alternativní postup popisuje UK patent č. 1,578,348 kde je uvedeno, že konjugát alergenu s polyethylen glykolem je schopen vyvolat požadovaná terapeutický efekt potlačením alergen specifické IgE produkce. O těchto materiálech je uváděno, že jsou nealergické a neimunogenní. Pro zamýšlenou imunotherapii alergických poruch pomocí tolerogenních fragmentů alergenů, tyto produkty mohou být velmi podobné přirozeným Tbuněčným epitopům, které vytvářejí tzv. „antigen prezentující buňky“ (APC) pomocí kyselých hydroláz a dalších enzymů za fyziologických podmínek. Tento konkrétní postup byl popsán v současném stavu techniky v US patentu č. 4,469,667 a Evropském patentu EP 0113712 B1 (viz. reference č. 6 a 7). Takovými přirozenými elementy jsou i různé na peptid navázané haptenové struktury a mohou být napodobeny v laboratoři vystavením alergenního extraktu vlivu proteolytického štěpení za kontrolovaných podmínek.Jedna z mnoha možností výzkumu v této oblasti naznačuje, že léčba alergie může být prováděna pomocí derivátů alergenů, které neindukují tvorbu specifických protilátek třídy IgE, tzn. derivátů alergenů zbavených tzv. IgEvazebné B-buněčné domény.
Existuje tedy celá řada různých cest jak připravit prostředek pro desenzitizaci např. redukcí alergenicity, které byly popsány v posledních dvaceti letech. Bylo vynaloženo značné úsilí zaměřit pozornost různými směry, ale bez valného výsledku. Pro lepší porozumění požadavkům léčby je nezbytné zjistit co se ve skutečnosti děje během indukce a průběhu alergické reakce. Indukce imunitní reakce proti cizím antigenům, vyžaduje kooperaci různých kategorií buněk, např. v nejjednodušší variantě tzv. „antigen prezentujících buněk“ (APC) a T a B lymfocytů. První signál, zejména mezi APC a T-lymfocyty je vyvolán fragmentem antigenního peptidů, který vzniká během intracelulámího zpracování (proteolytickým štěpením) cizorodého antigenu v APC, např. v makrofágu. Cizí antigenní fragment (také známý jako T-buněěný epitop) je následně převeden na vnější membránu APC, kde bude vystaven ve formě ligandu asociovaného s membránově vázaným antigenem hlavního histokompatibilitního komplexu II třídy (MHC II). Některé populace pomocných T-lymfocytů (Thi a Th2 lymfocyty) rozeznávají tento T-buněčný epitop na APC a spolupracují mezi sebou a s imunoglobuliny sekretujícími B-buňkami, aktivace alergen specifických klonů Th2-buněk pak pravděpodobně hraje klíčovou roli při vzniku atopického onemocnění u člověka. To se neděje pakliže jsou aktivovány lymfocyty třídy Thi. Th2-lymfocyty aktivované po kontaktu s APC exprimující správný T-buněčný epitop na svém povrchu, produkují relativně vysoká množství interleukinů 4 a 5 (IL-4 a IL-5), které pak dohromady působí spolu s dalšími faktory jako cytokinový signál pro biosyntézu IgE v Blymfocytech nebo plazmatických buňkách. Na tomto poznatku je založena současná teorie, že v případě „okamžité alergie Typ I“ (atopické) dochází k nepřiměřeně vysoké aktivaci Th2 buněk vzhledem k buňkám Thi, což vede k nadměrné syntéze IgE a cílem aktivní terapie je tedy přesunout rovnováhu alergen specifické T-buněčné reakce zTh2>Thi na Thi>Th2- Zamýšlená manipulace s alergen specifickými T-buněčnými klony pomocí T-buněčných epitopů derivovaných z alergenních molekul tedy naznačuje novou možnou cestu imunotherapie, s tím omezením, že tyto epitopy se nesmí vázat nebo indukovat alergen specifické IgE protilátky (2,3). Poslední klinické testy s některými syntetickými strukturně definovanými epitopy T-buněčných peptidů odvozenými od aminokyselinové sekvence zvoleného antigenu vážícího IgE získaného molekulárním klonováním a rekombinantní technologií zcela selhaly a nepřinesly žádný podstatný efekt (4,5) a tak se zdá, že takový typ terapie nevede k požadovaným výsledkům.
Bez ohledu na uznávané teorie, je zcela jasné, že interakce mezi APC a Th-buňkou vyžaduje kostimulační faktory, kterými mohou být například některé membránové receptory. Existují také důkazy, že pokud je přítomen pouze první signál, tzn. rozeznání T-buněčného epitopu, může dojít k anergii T-buněk. Po úvodní fázi stimulace se stávají tyto Th2 buňky neodpovídající na další stimulaci prostřednictvím alergenem pulsovaných APC.
9 9 9 9 9 · · ··
9 9 9 9 · ♦ • · · · · · 9 9·· · • · 9 · · · · 9999
999 99 99 99 99
T-buněčná anergie může být tedy indukována i u alergen specifických Th2-buněěných klonů následně po stimulaci peptidem odvozeným od alergenu. Tyto anergické Th buňky potom nemohou indukovat tvorbu IgE B-buňkami, což výsledně vede ke snížení hladiny IgE v organismu. Existují i některá předběžná klinická data, která podporují teorii že podávání nebo aplikace supra-optimálních dávek, nebo předem vytvořených MHC kompatibilních T-buněěných epitopů, může v absenci kostimulačního signálu a pravděpodobně i před vypuknutím choroby, indukovat T-buněěnou anergii a imunologickou toleranci (6,7).
Extrakty individuálních zdrojů alergenních materiálů obsahují celou řadu různých proteinových alergenů vážících IgE. Navíc, jakýkoliv individuální proteinový alergen z jednoho zdroje může obsahovat celou řadu různých T-buněčných epitopů nevážících IgE. Vzhledem k obrovskému množství epitopů aktivujících T-buňky a obtížnosti volby toho nej vhodnějšího tolerogenního peptidu, se zdá být rozumné, že efektivní širokospektrá imunotherapie pomocí T-buněčných epitopů může nejlépe probíhat pomocí fragmentů nevážících IgE získaných z přirozené knihovny alergenů izolovaných z přirozených materiálů, spíše něž pomocí několika syntetických peptidů nebo dokonce rekombinantní ch alergenů. To se zdá být ještě důležitější v kontextu s pravděpodobnou chemickou povahou dominantních epitopů. Současné poznatky které tvrdí, že T-buněčné epitopy jsou lineární peptidy o jasné aminokyselinové sekvenci, takže mohou být, jakmile jsou dostatečně popsány, produkovány synteticky. Tento pohled zcela popírá, že přirozeně se vyskytující alergeny procházejí většinou posttranslačními úpravami a modifikacemi postranních řetězců pomocí sacharidů nebo jiných organických látek připojených na proteinovou kostru. Tyto chemicky modifikované skupiny, obecně nazývané hapteny, často představují imunodominantní místa, která setrvávají na enzymaticky produkovaných fragmentech alergenů, zcela však chybí na syntetických nebo rekombinantně produkovaných alergenech. Navíc, věda a technologie zabývající se alergeny je zcela bezmocná v nej důležitějším praktickém bodě, konkrétně v chemických a fyzikálních interakcích v širokém spektru komponent v nepřečištěném alergenním extraktu, vedoucí k degradaci produktu a vytváření nefyziologických molekulárních komplexů. Z těchto důvodů v kombinaci s nedostatkem praktických výsledků s výše uvedenými prostředky, byla použita alternativní cesta tak aby bylo možno připravit vhodnější prostředek pro léčbu alergií.
PODSTATA VYNALEZU
Jak z výše uvedeného vyplývá, imunitní systém zachází s alergeny stejným způsobem jako s obvyklými antigeny. Toto tvrzení však nedává vysvětlení, proč alergeny, narozdíl od obyčejných proteinových antigenů, indukují tvorbu specifických protilátek třídy IgE v tandemu • · to to to · · · · · ·· ·· ··« ··· ·«·· ♦ ···· · ···· · ·· « • · ··· ·· ··· ·· · ·< · ···· ···· ·· ··· ·· ·· ·· ·· s protilátkami IgG, a ani nedává vysvětlení proč pouze malé procento lidské populace (tzv. atopičtí pacienti), nejen že produkují zvýšené množství těchto protilátek třídy IgE, ale také vykazují klinicky manifestovatelné příznaky choroby. Je zřejmé, že musí být objasněny další faktory ovlivňující tuto situaci, ještě před přípravou vhodného alergenu nebo jeho fragmentu pro potlačení patomechanismu alergické choroby. Jeden z těchto faktorů je systém komplementu a aktivace jeho komponent pomocí součástí alergenních extraktů.
O vodných extraktech alergenních materiálů z vnitřního prostředí je již dlouho známo, že aktivují hemolytické složky komplementu (huC) v lidském séru in vitro (8). Chemické studie řady alergenních extraktů prokázaly téměř univerzální přítomnost produktů rozkladu organických látek, které obsahují >10 kDa reakční produkt Maillardova typu proteinu nebo peptidů se sacharidy (např. melanoidiny), stejně tak jako rozpustné (eu-) melaniny v extraktu domovního prachu a organických zbytků živočišného původu. Tyto látky byly shledány zodpovědnými za aktivaci komplementu a částečně také za in vivo pozitivní kožní reakci u atopických alergických pacientů. Na druhou stranu, vodné extrakty typických alergenů z vnějšího prostředí, jako jsou rostlinné pyly, obsahují jako hlavní složku zodpovědnou za aktivaci komplementu, jak již dříve zjistili autoři vynálezu, jsou volné nebo na proteiny naabsorbované kondenzované nebo hydrolyzované taniny nebo flavonoidy a podobné polyfenolové konjugáty ,které jsou s vysokou denzitou konjugovány k proteinovému nosiči ve formě haptenů. Degradační produkty melanoidinu, melaninu nebo taninů byly samy o sobě popsány v roce 1983 jako neimunogenní a tedy pouze jejich přítomnost ve fyzické asociaci s proteinovým antigenem v extraktu může vést k tvorbě protilátek třídy IgE (9).
Mechanismus aktivace komplementu bez přítomnosti protilátek pomocí těchto složek alergenního extraktu vyžaduje aktivaci složek Cl, C4, C2 a za speciálních podmínek i C3, v případě klasické aktivační kaskády. Lokální aktivace komplementu za pomoci složek alergenního extraktu může tedy vést k vytváření silného histamin liberátoru anafylatoxinu C3a a fragmentu C3b, klíčového faktoru regulace buněčných reakcí imunitního systému. Bylo také zjištěno, že komplement v séru atopických jedinců je citlivější k aktivačním faktorům, než je obvyklé u séra zdravých jedinců (8).
Bylo překvapivým zjištěním, že taniny a melanoidiny v alergenních extraktech jsou schopné aktivace komplementu i v nepřítomnosti antigenu. Tyto látky tedy jednoznačně vykazují adjuvantní schopnosti generováním faktorů komplementu jako je (multivalentní) C3b, které pak zajišťují patřičný druhý signál pro proliferující B-lymfocyty a tak aktivují syntézu protilátek. Inkriminovaný membránový receptor (CD21) pro C3b na B-buňkách je sám o sobě ligandem lektinu CD23 na B-lymfocytech , který může být rozpoznáván jako nízkoafmitní IgE (Fc)9 · ·
receptor. Ačkoli detaily řetězce interakcí T-buňky / B-buňky / komplement jsou zcela mimo rámec navrhovaného vynálezu, je evidentní, že stimul pro alergen specifickou aktivaci komplementu a alergen nespecifickou aktivaci komplementu, jsou velmi podobné (10). Neboť obecně se má za to že zvýšená produkce protilátek třídy IgE je přímou příčinou klinických projevů alergické reakce, je zřejmé, že látky aktivující komplement, CD21 a CD23, přítomné v alergenním extraktu jsou pro indukci zamýšlené imunotherapie a tolerance nežádoucí a musí být eliminovány v maximální možné míře před tím než může být dosaženo úspěšné indukce Tbuněčné anergie. Spojení těchto předpokladů a jejich praktických implementací je zcela nové a dosud neznámé v současném stavu techniky.
Rozeznání alespoň dvou funkčně odlišných skupin organických látek v alergenním extraktu, např. komplement aktivujících taninů nebo meíanoidinů (nebo adjuvans) na jednu stranu fungujících synergisticky a antigenním (glyko)proteinem nebo naopak reprezentujících nový směr ve snaze pochopit alergické poruchy způsobené IgE u člověka, je důležitým technologickým parametrem pro navržení a produkci nových léčiv. Logickým pokračováním je příprava tolerogenních T-buněčných epitopů, které nestimulují produkci protilátek třídy IgE, přičemž výchozí alergenní materiál musí být v maximální možné míře přečištěný od komplement aktivujících faktorů.
Nehledě k jejich schopnostem aktivovat komplement, taniny a melanoidiny vykazují celou řadu dalších nežádoucích efektů. Tyto látky se adsorbují těsně na většinu proteinů mnohonásobnými vodíkovými a hydrofóbními interakcemi, což brání protein před štěpením pomocí proteáz. Naopak, taniny a melanoidiny inhibují celou řadu enzymů pracujících při neutrálním či mírně alkalickém fyziologickém pH, včetně serinové proteázy trypsinu, chymotripsinu a kalikreinu (11). Jelikož fyzikální síly zapojené v interakci tanin/melanoidin s proteinem reverzibilně klesají na nulu, klesne-li pH pod 2,5, proteinázy vhodné pro enzymatickou produkci T-buněčných epitopů z alergenních makromolekul je enzym přítomný v trávicím traktu - pepsin, jehož optimální pH aktivita je při pH = 2,0. Při takové hodnotě pH taniny a melanoidiny (s maximální molekulovou hmotností okolo 5 kDa) disociují od proteinu a je možné je odstranit dialýzou nebo ultracentrifugací. Je tedy zcela nezbytné, aby procesu enzymatického štěpení pomocí pepsinu vedoucí k fragmentaci alergenu předcházela dialýza v kyselém médiu (pH méně než 2,5) v nepřítomnosti enzymu, tak aby byly odstraněny interferující taniny a/nebo melanoidiny bez ovlivnění alergenní struktury proteinu. Pokud by tyto komplement aktivující polyhydroxylové substance nebyly odstraněny před procesem štěpení pomocí enzymu, během neutralizace by opět asociovaly s požadovanými T-buněčnými peptidy a učinili by je nepoužitelné pro finální farmaceutický produkt. Kandidáty výchozího materiálu pro enzymatické štěpení jsou fcfc 9999 99 fc· ·· ·♦ • •fc fcfcfc fcfcfc·
- fcfc fcfcfc · · ··· · ·· · ·· ·♦··♦··♦··· ·· · ·«·· ···· fcfc fcfcfc 99 ·· ·· ·· depigmentované alergeny připravené při pH 2 v nepřítomnosti enzymu a detailně popsané v Evropském patentu č. 0 662 080 Bl. Taniny a/nebo melanoidiny mohou být odstraněné pomocí dialýzy přes 5 kDa membránu.
Jak je detailně popsáno v EP 0 662 080 Bl, proces depigmentace alergických proteinů v roztoku naředěné kyseliny chlorovodíkové nebo sírové při pH 2,0 ± 0,1 odstraní příslušnou část (15 až 16 % hmotnosti, v závislosti na zdroji materiálu) rozpuštěných komponent >10 kDa z alergického extraktu při dialýze nebo ultrafiltraci přímo z kyselého média přes 10 kDa dělící membránu. Molekulová hmotnost odstraněných komponent je tedy v rozsahu do 10 kDa a jedná se o přirozené taniny, (eu)melaniny a melanoidiny, které mají obvykle molekulovou hmotnost okolo 5 kDa. Pokud tento krok kyselé dialýzy nepředchází fázi štěpení enzymem, např. pepsinem, jak nepopisuje US patent č. 4,469,667 a Evropský patent EP 0113712 Bl, neutralizace kyselého prostředí nezbytného pro pepsinové štěpení, které probíhá při pH = 2, způsobí reasociaci komplexů tanin-peptid, jak bylo uvedeno výše a tím dojde k zamaskování T-buněčných epitopů a následné zablokování možnosti rozeznání imunitním systémem. Při selhání pokusu o odstranění taninů a melanoidinů před enzymatickým štěpením také ponechá neovlivněnou komplement aktivující schopnost finálního produktu a vede poté k nežádoucí stimulaci syntézy IgE po aplikaci u člověka.
Bez ohledu na to zda depigmentační proces proběhl správně, chemicky navázané polyfenolické a Maillardovy struktury mohou být stále chemicky a spektroskopicky identifikovány na důkladně depigmentovaných proteinech (12). Takto konjugované polyfenolické a sacharidové deriváty tvoří integrální část struktury molekuly proteinového alergenu a nemohou být proto odstraněny v kyselém médiu. Bylo také prokázáno, že tyto neproteinové postranní řetězce mohou, pravděpodobně jako hapteny, tvořit část B-buněčných epitopů rozeznávaných specifickými protilátkami tříd IgG a IgE, jak je uvedeno v US patentu 5,384,395 a Evropském patentu EP A 0,387,952. Fakticky, eliminace fyzicky absorbovaných taninů a melanoidinů depigmentačním procesem podle EP 0 662 080 Bl vedoucí k odmaskování těchto haptenových struktur, způsobí částečné snížení vazby specifických protilátek třídy IgE. Na druhou stranu distribuce haptenu a denzita proteinového antigenního nosiče může být taková, že >10 kDa depigmentace (HMW-D) nestačí k tomu aby takto upravené alergeny mohly být štěpeny enzymaticky, jak bylo zjištěno v případě pylu rostliny Parietaria judaica (12). Na rozdíl od toho co se uvádí v Evropském patentu EP 0113712 Bl, snadnost enzymatického štěpení pepsinem se odlišuje u různých depigmentovaných >10 kDa variant alergenu, což znamená, že podmínky enzymatické hydrolýzy musí být přizpůsobeny v závislosti na zdroji alergenu. Jak je uvedeno v příkladech na
0000 • 0
000
0« 00 00 00
0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0« 000 00 0 00 0 0000 0000 00 000 00 00 00 00 obrázku 1, míra výskytu volných peptidových aminoskupin, tak jak byla stanovena ninhydrinem během pepsinového štěpem vykazuje variabilitu v rámci různých příprav alergenních pylů. Dominantní haptenová struktura připojená na alergenní proteinovou kostru náleží do skupiny polyhydroxylových flavonoidů a jiných polyfenolů, které za oxidativních podmínek tvoří silné thioetherové vazby s cysteinovými residui v proteinové makromolekule, nebo reprezentují chemicky modifikované produkty hexóz nebo pentóz připojené na e-aminoskupinu postranního řetězce lysinu (1). Obě, S-připojené a N(e)-připojené haptenové struktury adsorbují ultrafialové záření v rozsahu od 300 do 350 nm, zatímco absorpce čistého proteinu je zanedbatelná. Jak ukazuje příklad na obrázku 2, nepřímá úměrnost je pozorována mezi denzitou haptenu stanovenou UV-spektroskopií a mírou štěpení alergenního komplexu protein-hapten pomocí pepsinu, jak bylo stanoveno pomocí uvolnění ninhydrin reaktivních volných aminoskupin.
V některých případech silně pepsin rezistentních HMW-D preparací, může být pomocí elektroforézy prokázáno, že bez ohledu na malé množství uvolněných aminoskupin (obr. 1), fragmentace je patrná díky ztrátě detekovatelných proteinových konstituentů. V případě pylu rostliny Parietaria, může být fragmentace prokázána ztrátou schopnosti aktivace komplementu, ale ne ztrátou schopnosti vázat IgE, u enzymaticky získaných fragmentů (Fb-D) faktorem alespoň 100. Vzhledem k silně redukovaným schopnostem polyfenol- nebo lysin- cukerných strukturních elementů, oxidace může být v některých případech nezbytnou podmínkou pro úplnou eliminaci jak IgE vazebných tak komplement aktivujících domén. Oxidace HMW-D preparátů před fragmentací může být provedena pomocí řady chemických agens, např. pomocí perjodových solí (viz níže). Nicméně , kvůli ochraně možných sacharidových T-buněčných epitopů, je nej vhodnějším způsobem oxidace pomocí ultrafialového záření, která, jak bylo prokázáno, vede ke snížení jak komplement aktivujícího tak IgE vazebného potenciálu (13).
V případě HMW-D preparátů z pylů některých plevelů, stromů a rostlin, může být oxidační proces zařazen za depigmentaci, ale před krok enzymatického štěpení (viz níže).
Enzymatická fragmentace a (možná) oxidace podle navrhovaného vynálezu je použitelná pro všechny známé alergeny, z vnitřního i vnějšího prostředí, jako jsou roztoči, hmyz, plísně, pylová zrna z trav, plevelů a stromů, organický prach atd. Takový materiál může být extrahován depigmentován jak bylo popsáno výše např. v EP 0 662 080 Bl, předmět tohoto patentuje zde uveden jako reference. Následná správná volba fragmentačních podmínek (pre-oxidace, poměr enzymu a substrátu, trvání enzymatické hydroiýzy, atd.) pro proteolytickou degradaci alergenního substrátu v extraktu může záležet na předchozím experimentálním ověření, a závisí čistě na povaze zdrojového materiálu. Tato volba pak závisí na úvaze odborníka v současném stavu techniky.
• · ·*· · • · * ···
9111 11 99
9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9 · • 9 9 111 9 9 9
1 1111 1111 19 111 11 11 11 11
Navrhovaná příprava přirozených T-buněčných epitopů představuje řadu kroků které jsou vysvětlené v postupech popsaných v příkladech. Obecně, technika podle navrhovaného vynálezu je technika produkce extraktu navozujícího po aplikaci toleranci k alergennímu materiálu a tato technika zahrnuje ;
a) extrakce alergenního materiálu
b) odstranění látek s nižší molekulovou hmotností, než 3,5 kDa, tak aby vznikla HMW-N frakce, která může být zamražena a vysušena
c) odstranění taninů a melanoidinů, které jsou pomocí nekovalentních interakcí připojené k alergennímu materiálu v HMW-N frakci, čímž vznikne depigmentovaná HMW-D frakce, která neobsahuje taniny a melanoidiny a která může být zamražena a vysušena
d) degradace proteinů přítomných v HMW-D frakci čímž vzniknou fragmenty o molekulové hmotnosti mezi 1 a 10 kDa, který je označený Fb-D a operace probíhající v krocích a až d budou probíhat následně a způsobem pro takové operace obvyklým.
Vynález také popisuje extrakt alergenních materiálů obsahujících fragmenty alergenů se zachovanými přirozenými epitopy stimulujícími T-lymfocyty ale neobsahujícími žádné epitopy vážící IgE, s minimálním obsahem látek aktivujících komplement a bezpečné pro použití v prostředcích pro indukci specifické stabilní T-buněčné anergie a imunologické tolerance u alergických pacientů. Extrakt podle navrhovaného vynálezu může být získán z alergenních zdrojů z různých známých alregenních materiálů ať z vnějšího nebo z vnitřního prostředí, jako jsou roztoči, hmyz, plísně, pyly trav, plevelů, květin, keřů či stromů a nebo ze zcela jiných alergenních prostředí.
V tomto extraktu by měl být IgE vazebný potenciál alergenních fragmentů, vyjádřený jako množství zamraženého materiálu pro 50 % inhibici vazby IgE za standartních testovacích podmínek, 100 krát nižší než v případě neupraveného extraktu ve stejném rozpouštědle a za stejných podmínek. Alternativně, nebo v kombinaci s výše uvedeným, extrakt podle navrhovaného vynálezu by měl být schopnost alergenních fragmentů aktivovat komplement, vyjádřená jako množství zamraženého materiálu pro 50 % inhibici hemolytické aktivity lidského komplementu je alespoň 100 krát nižší než v případě neupraveného extraktu ve stejném rozpouštědle a za stejných podmínek.
Extrakt podle navrhovaného vynálezu, v jakékoliv zvýše uvedených variant by měl mít stimulační index T-lymfocytů pomocí alergenních fragmentů v rozsahu 50 až 150 % vzhledem k neupravenému extraktu. Extrakt podle navrhovaného vynálezu obsahuje alergenní fragmenty o molekulové hmotnosti mezi 1 kDa a 10 kDa, což bylo stanoveno pomocí dialýzy v kyselém prostředí při pH 7,0 přes membránu s patřičnou propustností. Extrakt podle navrhovaného • · ·tttt · • · tttttttt • tt tttt ttw tttt • tttt · * tt ♦ • · tttttt tt tttt ·
9 9 tttttt tttt · tttt · tttttttt tttttttt • tt tttttt tttt tttt tttt tttt vynálezu je zbaven všech volných a/nebo na protein absorbovaných taninů, melanoidinů a jiných pigmentů.
V krátkosti, příprava výše charakterizovaného extraktu a způsob preparace také spadá do rámce vynálezu. Tento prostředek by měl být nakonec převeden do farmaceuticky přijatelné formy, tak aby bylo možno aplikovat ho lidem či zvířatům v případě potřeby.
Použití prostředku podle navrhovaného vynálezu jako aktivní složky pro medicínskou léčbu alergenních jedinců pomocí navození tolerance k přirozeným alergenním substrátům od kterých je prostředek odvozen, je také jednou variantou navrhovaného vynálezu.
PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH
Obrázek 1 : Kinetika uvolňování ninhydrin reaktivních volných aminoskupin u reprezentativních HMW-D alergenních preparátů enzymaticky štěpených pepsinem. Podmínky : viz text.
Obrázek 2 : Nepřímá úměrnost mezi štěpitelností HMW-D preparátů z pylových zrn pepsinem (tzn. zabarvení ninhydrinu po 6 hodinách štěpení při 37 °C a pH 2) a extinkční koeficient E(1 %, 1 cm) při 325 nm v ultrafialovém spektru v 0,01 M fosfátovém pufru pH 7.
Obrázek 3 : Proliferační aktivita T- buněk v kultuře periferních lymfocytů (měřeno inkorporací radioaktivně značeného thymidinu, relativní jednotky) z krve (a) specificky alergických pacientů a (b) kožní testy negativních zdravých kontrol po stimulaci depigmentovaným preparátem HMW-D a fragmenty Fb-D připravenými zBlomia tropicalis.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
PŘÍKLAD 1. Příprava HMW-N
Vysušený alergenní materiál zbavený mastných kyselin, jako je prášek z pylových zrn, zbytky zvířecích tkání, kultury roztočů nebo vysušená tělíčka čistých roztočů nebo jiných hmyzích druhů, jsou přenesena do roztoku 0,01 M fosfátového pufru o pH 7,0, který obsahuje 0,15 M HC1 (PBS). Extrakce probíhá dvakrát za stálého míchání při 4 °C, nejprve po dobu 4 hodin, a sediment oddělený centrifugací je opět extrahován po dobu 18 hodin a opět centrifugo ván. Kombinované extrakty jsou dialyzovány proti 5 objemům destilované vody za použití systému ·· 9999 9» 9« 9* ·· • 99 999 9999
Π ! ί*·*♦ · ί Σ ί**9 · ϊ Σ Σ Σ • 9 9 9999 9999
999 99 99 99 99
Pellicon ® s 10 kDa membránou (Millipore ® , PLBC 000 05). Dialýza zadrží všechny látky >10 kDa a ty jsou poté lyofilizovány tak aby vznikl surový alergenní produkt HMW-N. V některých případech, zejména když minoritní alergeny o velikosti nižší než 10 kDa, může být membrána nahrazena 3,5 kDa dialyzační blánou.
PŘÍKLAD 2. Příprava HMW-D
Detaily depigmentačního procesu jsou uvedeny vEP 0 662 080 Bl. Obecně, lyofilizovaný HMW-N produkt podle příkladu 1, je rozpuštěn při pokojové teplotě v destilované vodě na koncentraci 10 mg/ml. K tomuto roztoku je při pokojové teplotě a za stálého míchání přidávána 2 N HC1, a nakonec jen 0,1 N HC1 tak aby pH roztoku kleslo na 2,0 ± 0,1 a roztok je za stálého míchání inkubován dalších 15 minut. Barevné substance nebo pigmenty nahromaděné v kyselém médiu z HMW-N jsou poté odstraněny opakovanou dialýzou nebo ultracentrifugací při 4 °C po dobu 17 hodin proti několikrát vyměněné destilované vodě přes 10 kDa membránu, dokud pH roztoku obsahujícího složky větší než 10 kDa nestoupne na 3,5. Roztok získaný po intenzivní dialýze je převeden na pH 7,0 ± 0,1 pomocí přidání 1,0 až 0,1 N NaOH. Neutralizovaný roztok je na závěr centrifugován, přefiltrován přes sterilní filtr s propustností do 0,2 pm a lyofilizací vysušen tak aby vznikl depigmentovaný alergenní produkt HMW-D.
PŘÍKLAD 3. Příprava HMW-Dox
V příkladu tohoto procesu je vzorek lyofilizovaného HMW-D rozpuštěn v 0,05 M (50 mM) metaperjodátu sodného při pH 3,5 a za stálého míchání je inkubován 1 hodinu při pokojové teplotě. Roztok je poté přečištěn přes malou kolonu obsahující Sephadex ® G25 v destilované vodě a první frakce, která projde skrz kolonu je sebrána a lyofilizována tak aby vznikl oxidovaný produkt HMW-Dox. Účinnost oxidované frakce je stanovena porovnáním s původním HMW-D produktem pomocí stanovení hemolytické aktivace komplementu a inhibice vazby specifických IgE protilátek, pomocí běžně používaných laboratorních technik. Příklad těchto testů prováděný s extraktem z pylových zrn Parietaria judaica je uveden v tabulce 1. Aby bylo zabráněno kontaminaci zbytkem použitých chemikálií nebo nežádoucích štěpených produktů, je vhodnější aby oxidace HMW-D ve vodném roztoku probíhala spíše pomocí ozáření ultrafialovými paprsky, jak je popsáno v současném stavu techniky (13).
PŘÍKLAD 4. Příprava enzymaticky štěpených fragmentů Fb-D
V popsané proceduře pro přípravu přirozených peptidů nebo komplexů peptid-hapten tvořících T-buněčné epitopy získaných enzymatickým štěpením proteinů, je výchozím materiálem
• 4 • 444
444 • 4 44 • 4 4
4 4
4· »4 4 »4 4
4 4 4 depigmentovaný preparát HMW-D získaný podle popisu uvedeného v příkladu 2 a v Evropském patentu EP 0 662 080 Bl nebo HMW-Dox popsaný v příkladu 3. Postup přípravy enzymaticky štěpených fragmentů Fb-D z obou výchozích produktů je identický a je popsán dále. Lyofilizovaný depigmentovaný materiál HMW-D (nebo HMW-Dox) je rozpuštěn v 10 objemech redestilované vody a přenesen do dvoustěnné nádoby umožňující cirkulaci vody o teplotě 37 ± 1 °C mezi vnitřní a vnější stěnou, tato cirkulace je zajištěna po dobu štěpení pomocí peristaltické pumpy. K tomuto roztoku je za stálého míchání 2 N HCl tak aby pH kleslo na 2,5. Proteolytický enzym pepsin v mobilizované formě navázaný na Sepharosu® (Sepharose-pepsin, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA, ref. Cat. P-3286) je postupně přidán ve formě suchého prášku v poměru 4 jednotky aktivity pepsinu na 1 mg HMW-D (tzn. asi 1:5 enzym/substrát hmotnostní poměr, nebo přibližně tolik v závislosti na zdroji alergenu). Pomocí přikapávání 0,1 N HCl je pH roztoku upraveno na 2,0 ± 0,1 a roztok je za stálého míchání po dobu alespoň 6 hodin při 37 ± 1 °C, a stálého udržování pH na 2,0 ± 1 °C pomocí automatického pH-stat přístroje. Po ukončení štěpení je směs neutralizována na pH 7,0 pomocí 2,0 až 0,1 N NaOH a poté přefiltrována přes 0,4 μιη membránu aby byly odstraněny částice s navázaným enzymem. Je přidána destilovaná voda a směs je naředěna na polovinu a následuje dialýza vMinitanu®, tangenciálním průtokovém systému vybaveném 10 kDa Milipore membránou. Vnější kapalina (molekulová hmotnost <10 kDa) je izolována a vnitřní kapalina obsahující endo-fragmenty Fa-D o molekulové hmotnosti >10 kDa je odstraněna. Pro ilustraci následuje několik analytických detailů o endo-fragmentech Fa-D >10 kDa, jsou to převážně heteropolysacharidy, popsané v tabulce I, která následuje. Složky o molekulové hmotnosti menší než 10 kDa jsou opět dialyzovány v přístroji Minitan za použití 1 kDa membrány, kde jsou izolovány a odstraněny látky o molekulové hmotnosti nižší než 1 kDa, které jsou po tomto kroku ve vnější kapalině. Získaný konečný filtrát je nakonec sterilizován pomocí filtrace přes 0,22 μηι filtrovací membránu a lyofilizován tak aby vznikl požadovaný produkt ve formě fragmentů o molekulové hmotnosti vyšší než 1 kDa a nižší než 10 kDa.
Výtěžky a spektroskopické analýzy výchozího materiálu HMW-N, meziproduktů HMW-D (nebo HMW-Dox), neštěpitelné frakce (heteropolysacharidy větší než 10 kDa), postranní produkt Fa-D a požadovaný koncový produkt Fb-D, jsou shrnuty pro sérii reprezentativních zdrojů alergenních materiálů v tabulce II.
Kontrola procesu štěpení
Postup enzymatického štěpení je monitorována pomocí uvolňování volných aminoskupin. V pravidelných intervalech , během procesu enzymatické hydrolýzy, jsou odebírány 0,5 ml ·· ·· • » · · • ♦ · ·
• · 9 9 9 9
9 9 9
99
9 9 ·
99 vzorky ze směsi pepsin/protein, jejich koncentrace je upravena na 0,5 mg/ml v 4 N pufru octanu sodného při pH 5,5 a poté jsou zahřátý na 100 °C po dobu 15 minut s 50 μΐ 2 % anhydrinu v octanem pufrované methylcelulóze. Po ochlazení je při 541 nm změřena absorbance proti reakčnímu blanku. Reprezentativní příklady kinetiky štěpení založené na stanovování uvolněných aminoskupin jsou shrnuty na obrázku 1.
Jak je patrné z obrázku 1, uvolňování volných aminoskupin některými alergeny může být velmi nízké (např. Parietaria, Artemisia, Ambrosia). To však neznamená, že k fragmentaci pomocí pepsinu nedochází, s výjimkou pylu Parietaria judaica (12), neboť enzymatické fragmenty Fb-D těchto alergenů mají značně sníženou vazebnou kapacitu pro specifické protilátky třídy IgE, tzn. jejich B-buněčných epitopů (tabulka II). Obecně se má za to, že ninhydrin může být za určitých podmínek blokován polyfenolickými peptidovými postranními řetězci. Nej důležitějším předpokladem pro přípravu a kontrolu produkce finálních fragmentů Fb-D je otestování ztráty jejich IgE vazebné kapacity a komplement aktivačního potenciálu, zároveň se zachováním jejich stimulační kapacity vzhledem k T-buňkám.
Kontrola konečného produktu
Vazba alergen specifických protilátek třídy IgE
Schopnost Fb-D konečných produktů vázat in vitro specifické IgE protilátky, je testována pomocí stanovení inhibiční kapacity, za použití séra specificky senzitizovaných alergických pacientů. IgE vazebný potenciál fragmentů, vyjádřený jako množství vysušeného materiálu pro navození 50 % inhibice vazby za standartních technických podmínek, musí být alespoň 100 krát nižší než vazebný potenciál výchozích HMW-D a HMW-Dox materiálů za standardizovaných podmínek, tzn. redukce vazebné kapacity odpovídá méně než 1 % kapacity výchozího materiálu před fragmentací. Některá reprezentativní data získaná pomocí neoxidovaných preparátů HMWD jsou shrnuta v tabulce III.
Aktivace komplementu
Schopnost Fb-D konečných produktů aktivovat komplementový systém, je testována pomocí hemolytické nebo imunoenzymové techniky podle publikovaných postupů (8,13). Komplementaktivační potenciál fragmentů, vyjádřený jako množství vysušeného materiálu pro 50 % snížení hemolytické kapacity komplementu za standartních technických podmínek, musí být alespoň 100 krát nižší než potenciál výchozích HMW-D a HMW-Dox materiálů za standardizovaných *· «<·«· ·* ·« |* 91
Η· · « ·♦· · * * 9
9 911 1 9 11» » Λ 9 9 • · * · ι 11 119 11 9 *· · © · · · 1111
111 11 11 »9 11 podmínek, tzn. redukce vazebné kapacity odpovídá méně než 1 % kapacity výchozího materiálu před fragmentací.
Stimulace T-buněk
Pro ověření použitelnosti produktu Fb-D jako vhodného preparátu zachovávajícího si základní Tbuněčné epitopy, jsou Fb-D fragmenty testovány na svou schopnost indukovat proliferaci Tlymfocytů izolovaných z krve specificky alergických pacientů, pomocí standartních imunologických testů. T-buněčný stimulační index výsledných fragmentů může být v rozmezí 50 až 150 % vzhledem k výchozímu HMW-D preparátu. Obrázek 3 shrnuje některá reprezentativní data získaná pomocí peptidových fragmentů Fb-D připravených fragmentací HMW-D preparátu izolovaného z kultury vysoce alergenních tropických roztočů Blomia tropicalis.
Další testy
Všechny koncové produkty Fb-D jsou rutinně kontrolovány dalšími testy, jako je např. izoelektrická fokusace na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti Ampholinu ® v rozmezí pH od 3 do 10, kde se na rozdíl od výchozího preparátu HMW-D neobjevují konstituované proužky detekovatelné proteinovým značením. Elektroforetická separace v polyakrylamidovém gelu v dodecylsulfátu sodném (SDS-page) v přítomnosti tricinu (N-2-hydroxy-l,l-bis(hydroxymethylethyljglycinu) ukazuje distribuční rozložení proužků, barvitelných Coomassie blue barvivém, které je zcela odlišné od toho, které bylo získáno při použití výchozího HMW-D preparátu, a tento test pak může být použit k ověření reprodukovatelnosti procesu přípravy.
Výčet některých analytických dat pro některé reprezentativní alergenní preparáty je uveden v tabulkách II a III.
• t ·*·· ν» • · · · · · ··«· • · 999 · « ·«· · · * · • · · · · ** · · · 9 9 φ • · · · · « 9 9 9 9 9
999 99 99 ·· 99
Seznam použité literatury:
Patenty:
Primary-toxic compounde or allergens, which may be isolated from plant materiál as wellas methods for their preparation and application.
vynálezce: Berrens, L. Evropský patent č. A 0,387,952, patentováno 1995
- Method for the isolation of primary toxic compounds or allergens from plant materiál, vynálezce : Berrens, L. US patent 5,384,395, patentováno 24.1.1995
- A process for the purification of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extract obtainable according to this process as wellas their use.
vynálezce : Berrens, L. Evropský patent č EP 0 662 080 Bl, patentováno 5.2.1997, podáno 21.9.1992
Polypeptide active pollen immunosupressant ífaction.
vynálezce: Michael JG, Pesce AJ, US patent č. 4,338,297, patentováno 6.61982, podáno
14.4. 1980
Polypeptide active pollen immunosupressant fřaction.
vynálezce: Michael JG, Pesce AJ, Evropský patent č EP 0113712 Bl, založeno na Mezinárodní patentové aplikaci č. PCT/US82/00886, patentovánol5.3.1989, podáno 30.6.1982.
Literární odkazy:
[1] Berrens L. The Chemistry of Atopie Allergens. Monographs in Allergy, Vol. 7 (Karger, Basel 1971), [2] Shakib F (Ed). Immunological Intervention Strategies in Allergy. Biochem Soc Trans 1997; 25-· 383-403.
[31 Van Neerven RJJ, Ebner C, Yssel H, Kapsenberg ML, Lamb JR. T-cell responses to allergens: epitope-specificity and clinical relevance. Immunology Today 1996; 17:526-32, [4] Simons FER, Imada M, Li Y, Watson WTA, HayGlass KT. Fel d 1 peptides: Effect on skin tests and cytokine synthesis in cat— allergic human subjects. Int Immunology 1996; 8:1937-45,
• · · »· 111 • σ 1 i ·· ·· • · ♦ * • · · ♦
9 1 1 • 11 1
11 [5] Nxcodeaus C, Philip G, Jones N, Hlrani S, Norman P. Integrated clinical experience with tolerogenic peptides. Int Arch Allergy Immunol 1997! 113:326-8.
[6] Litwin A, Pesce A, Michael JG. Regulation of the immune response to allergens by immunosuppressive allergenic fragmente. I. Peptide fragmente of honeybee venom phospholipase A2, Int Arch Allergy Appl Immunol 1988; 87:361-6, [γ] Litwin A, Pesce AJ, Fischer T, Michael M, Michael JG. Regulation of the human immune response to ragweed pollen by immunotberapy. A controlled trial comparing the effect of iwmunosuppressive peptic fragmente of short ragweed with standard treatment. Clin Exp Allergy 1991; 21:457-65.
[8] Berrens L. The Atopen : A Rehabilitation. Ann Allergy 1976; 36:351*61.
[93 Francus TG, Siskind GW, Decker CG. Role of antigen structure in the regulation of IgE isotype expression. Proč Nati Acad Sci USA 1983! 80:3430-4.
[10] Sutton BJ, Gould HJ, The human IgE network. Nátuře 1993; 366: 4218.
[11] Berrens L. Digestion of atopic allergens with trypsin, ohymotrypain and pancreatic kallikrein, and influence of the allergens upon the proteolytic and esterolytic activity of these enzymes. Immunochemistry 1968; 5-.585-605.
[12] González Romano ML, Gallego MT. Berrens L. Extraordinary stability of IgE-binding Parietaria pollen allergens in relation to chemically bound flavonoids. Mol Immunol 1996; 33: I2S7-93.
[13] Berrens L, Hénocq E, Radermecker M, Photoinactivated allergens. I, Preparation, physicochemical and biological properties, Clin Allergy 1973: 3:449-59.
Tabulka I
Vliv oxidace pomocí metaperjodátu sodného na IgE vazebné a komplement aktivační vlastnosti depigmentovaného alergenního preparátu HMW-D izolovaného z pylových zrn Parietaria judaica.
·· ···· · · · · • · · · · · • ···· · · ···
| Produkt | pg nezbytných pro 50 % hemolýzu | redukční faktor |
| HMW-D | 0,49 | |
| HMW-Dox | 12,36 | 25,2 |
| pg nezbytných pro 50 % inhibici vazby IgE | redukční faktor | |
| HMW-D | 1,5 | |
| HMW-Dox | 4,12 | 2,7 |
·· ···· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · • ···· · ···· · ·· · • · · · · ·· ··· ·· · • · · ···· ···· ·· ·· · ·· · · ·· ··
Tabulka II
Analýza peptidových alergenních fragmentů
| Zdroj alergenu | Frakce (*) | Výtěžek ze sušiny pyl/kultura hmot. % | 50 % inhib. IgE (disk) pg na test | 50 % inhib. IgE (EIA) pg na test |
| Ambrosia elatior | HMW-N HMW-D Fa-D Fb-D | 15,03 8,59 4,52 0,75 | n.d. 72,04 1312,06 bez inhibice | n.d. 0,2 bez inhibice bez inhibice |
| Betula alba | HMW-N | 2,67 | n.d. | 0,009 |
| HMW-D | 1,72 | n.d. | 0,011 | |
| Fa-D | 0,87 | n.d. | 0,442 | |
| Fb | 0,42 | n.d. | 3,162 | |
| Lolium pereme | HMW-N | 8,88 | n.d. | 0,081 |
| HMW-D | 5,07 | 0,81 | 0,012 | |
| Fa-D | 2,50 | 324,00 | 5,51 | |
| Fb | 1,20 | 854,00 | 138,70 | |
| Olea europea | HMW-N | 8,20 | n.d. | n.d. |
| HMW-D | 5,15 | 11,08 | 0,011 | |
| Fa-D | 1,70 | 141,30 | 2,54 | |
| Fb | 0,80 | 1077,00 | 17,61 | |
| Parietaria | HMW-N | 3,60 | 5,18 | 0,008 |
| judaica | HMW-D | 1,85 | 3,82 | 0,0126 |
| Fa-D | 0,93 | 3,77 | 0,012 | |
| Fb | 0,14 | 4,17 | 0,0102 | |
| D. peronyssinus | HMW-N | 14,96 | n.d. | n.d. |
| HMW-D | 14,51 | 2,84 | n.d. | |
| Fa-D | 6,08 | 52,70 | n.d. | |
| Fb | 2,59 | 452,20 | n.d. | |
| Blomia tropicalis | HMW-N HMW-D Fa-D Fb | 9,60 5,70 3,40 1,20 | n.d. n.d. n.d. n.d. | 0,0143 0,0072 0,0085 2,667 |
(*) Fa-D frakce obsahuje neštěpitelné zbytky o molekulové hmotnosti vyšší než 10 kDa
Fb-D fragmenty v rozmezí molekulových hmotností 1 kDa až 10 kDa • · · · · · • φ • · ·· • ·
Tabulka III
Analýza peptidových alergenních fragmentů
| Zdroj alergenu | E(l%, lem) (270 nm) pH 7,4 | E(l%, lem) (325-350 nm) pH 7 | ninhydrin pozitiv, materiál v % ekvivalentech glycinu | % sacharidů anthronová techn. jako % galaktózy |
| Ambrosia elatior | 58,64 | 38,24 | n.d. | n.d. |
| 5,080 | 38,68 | 1,96 | 41,13 | |
| 0,40 | 1,24 | 1,58 | 36,08 | |
| 39,48 | 27,08 | 3,92 | 28,45 | |
| Betula alba | 10,56 | n.d. | n.d. | |
| 6,92 | - | n.d. | n.d. | |
| 5,13 | - | n.d. | n.d. | |
| 6,83 | - | n.d. | n.d. | |
| Lolium perenne | 7,33 | 2,82 | n.d. | n.d. |
| 7,95 | 2,90 | 3,70 | 35,41 | |
| 1,87 | 0,73 | 2,67 | 56,48 | |
| 7,59 | 1,63 | 7,70 | 8,25 | |
| Olea europea | 51,04 | 29,02 | n.d. | n.d. |
| 24,16 | 10,82 | 4,37 | 25,37 | |
| 11,14 | 5,62 | 2,97 | 42,09 | |
| 11,84 | 4,90 | 7,89 | 8,47 | |
| Parietaria | 76,20 | 41,68 | 5,44 | n.d. |
| judaica | 40,64 | 18,92 | 3,35 | 30,07 |
| 30,72 | 15,29 | 3,18 | 30,35 | |
| 38,88 | 24,00 | 4,09 | 38,83 | |
| D. peronyssinus | 11,14 | n.d. | n.d. | n.d. |
| 10,08 | n.d. | 3,10 | 39,78 | |
| 10,70 | n.d. | 1,69 | 64,60 | |
| 8,55 | n.d. | 2,02 | 20,27 | |
| Blomia tropicalis | 26,22 | n.d. | 100,00 | 16,53 |
| 25,42 | n.d. | 81,00 | 22,49 | |
| 30,16 | n.d. | 70,00 | 24,07 | |
| 17,12 | n.d. | 100,00 | 18,54 |
(*) Fa-D frakce obsahuje neštěpitelné zbytky o molekulové hmotnosti vyšší než 10 kDa
Fb-D fragmenty v rozmezí molekulových hmotností 1 kDa až 10 kDa • · ··· · • · • · · · · · · • ···· · · ··· · • · · · · · · ··· ·· · ···· ···· ·· ·«· · · · · · · ··
Tabulka IV
Redukční faktor IgE vazebného potenciálu (reaktivita sB-buněčným epitopem) stanovená inhibicí vazby IgE ze specifických lidských sér individuální alergeny byly produkovány chemickým připojením HMW-D* s kyanogen bromidem na papírových discích (RAST inhibice). Nakonec byly hodnoty přepočítány na relativní potenciál kde HMW-D =1.
| Zdroj alergenu | HMW-D > 10 kDa | Frakce FaD >10 kDa | lkDa < Fb/D < 10 kDa |
| Ambrosia elatior | 1 | 18 | 1500 |
| Betula alba | 1 | 169 | 1123 |
| Lolium perenne | 1 | 400 | 1054 |
| Olea europea | 1 | 13 | 97 |
| Artemisia vulgaris** | 1 | 8 | 61 |
| Parietaria judaica | 1 | 1 | 1 |
| D. peronyssinus | 1 | 19 | 159 |
| Blomia tropicalis** | 1 | 1 | 370 |
* neoxidovaný preparát ** redukční faktory kalkulované z enzymové imunotechniky na mikrotitračních destičkách, s povrchem jamek pokrytých HMW-D
Claims (15)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy toleranci indukujících extraktů pro léčbu jedinců za účelem navození tolerance na alergenní podněty, vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje:a) extrakce hmoty obsahující alergenb) odstranění látek s molekulovou hmotností nižší než 3,5 kDa, což dá vzniknout frakci označované jako HMW-N, která může být poté lyofilizovánac) odstranění taninů a melanoidinů, které jsou nekovalentně připojené k molekule alergenu ve frakci HMW-N, čímž vznikne frakce označovaná jako HMW-D, zbavená taninů a melanoidinů a nekonjugováných taninů a melanoidinů, která může být poté lyofilizovánad) degradace proteinů přítomných v HMW-D frakci, čímž vzniknou fragment s molekulovou hmotností mezi 1 až 10 kDa a produkt této reakce je označen jako Fb-D.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zdroj alergenních materiálů pochází ze známého alergenního prostředí a to jak venkovního tak vnitřního, jako je hmyz, roztoči, plísně, pylová zrna trav, plevelů, květin, keřů a stromů a organického prachu z pracovních prostředí.
- 3. Způsob podle nároků 1 a 2 , vyznačující se tím, že v kroku a) je vytvořena suspenze materiálu obsahujícího alergeny ve fosfátovém pufru, která je následně dialyzována proti destilované vodě, za použití polopropustné dialyzační membrány s hodnotou 3,5 kDa v kroku b).
- 4. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že v kroku b) jsou odstraněny látky s molekulovou hmotností nižší než 10 kDa, přičemž musí být známo, že příslušný alergenní materiál neobsahuje tzv. „minoritní“ alergeny s molekulovou hmotností nižší než 10 kDa, čímž vznikne frakce označená jako HMW-N.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že v kroku a) je vytvořena suspenze materiálu obsahujícího alergeny ve fosfátovém pufru, která je následně dialyzována proti destilované vodě, za použití polopropustné dialyzační membrány s hodnotou 10 kDa v krokub).
- 6. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že zahrnuje depigmentační krok během něhož je pH sníženo na hodnotu nižší než 2,5, následovaný odstraněním taninů a melanoidinů a jiných pigmentů, čímž vznikne frakce označená HMW22 ·· ··· · A A ·· • A A · A AA AAAA A AAAA ·· · · A A A · A A ·· AAA AA AA A A AAD, která je zcela zbavena všech těchto komponent, např. pomocí dialýzy přes polopropustnou membránu s definovanou propustností.
- 7. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že krok c) zahrnuje depigmentační fázi kdy pH je sníženo na hodnotu nižší než 2,5, která je následována krokem postačujícím pro odstraněním výsledné frakce obsahující volné taniny a melanoidiny, např. pomocí dialýzy přes 10 kDa membránu, čímž zůstane oddělená frakce s molekulovou hmotností nižší než 10 kDa, která je následována dialýzou přes 1 kDa membránu a tím vznikne frakce s molekulovou hmotností nad 1 kDa.
- 8. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že krok c) zahrnuje závěrečný krok, kterým je úprava pH roztoku HMW-D na neutrální hodnotu.
- 9. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že krok d) zahrnuje proteolytické štěpení proteinu.
- 10. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že krok d) zahrnuje proteolytické štěpení pomocí některé kyselé proteinázy, přičemž příslušné podmínky fragmentace jsou upraveny podle známých parametrů a v závislosti na použitém výchozím materiálu a zvolené proteináze.
- 11. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že krok d) zahrnuje proteolytické štěpení kyselou proteinázou pepsinem.
- 12. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že krok d) zahrnuje proteolytické štěpení pomocí kyselé proteinázy, následované izolací frakce s molekulovou hmotností nižší než 10 kDa, čehož může být dosaženo např. dialýzou přes 10 kDa membránu.
- 13. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku, vyznačující se tím, že oxidační krok je vložen mezi kroky c) a d) a je proveden pomocí ozáření roztoku HMW-D ultrafialovým zářením o vlnové délce 250 nm nebo 360 nm.
- 14. Způsob podle jakéhokoliv předcházejícího nároku 1 až 12, vyznačující se tím, že oxidační krok je vložen mezi kroky c) a d) a je proveden pomocí inkubace s perjodátem sodným a následnou izolací nadbytku oxidačního činidla, např. pomocí gelové filtrace.• · ···· * · · · • · · · · · • · «·· · · ··· ·· ·♦···· • · · · · · · ► · · ’ • · · « » · · 4 • · · ·
- 15. Extrakt připravený pomocí způsobů uvedených v nárocích 1 až 14, vyznačující se tím, že je určený pro použití jako aktivní složka léku pro léčbu alergických jedinců, za účelem navození tolerance k přirozeným alergenům ze kterých je preparát připraven
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/NL1997/000598 WO1999022762A1 (en) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | Tolerogenic fragments of natural allergens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001529A3 true CZ20001529A3 (cs) | 2000-10-11 |
| CZ302352B6 CZ302352B6 (cs) | 2011-03-30 |
Family
ID=19866218
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001529A CZ302352B6 (cs) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | Zpusob prípravy extraktu poskytujících toleranci proti alergenu a jejich použití |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6350590B1 (cs) |
| EP (2) | EP1024829B1 (cs) |
| JP (1) | JP3790099B2 (cs) |
| AT (1) | ATE417626T1 (cs) |
| AU (1) | AU729589C (cs) |
| BR (1) | BR9714899A (cs) |
| CA (1) | CA2307655C (cs) |
| CZ (1) | CZ302352B6 (cs) |
| DE (1) | DE69739174D1 (cs) |
| DK (1) | DK1024829T3 (cs) |
| ES (1) | ES2319341T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0004831A3 (cs) |
| IL (1) | IL135881A0 (cs) |
| PL (1) | PL187544B1 (cs) |
| PT (1) | PT1024829E (cs) |
| WO (1) | WO1999022762A1 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6350590B1 (en) * | 1997-10-30 | 2002-02-26 | C.B.F. Leti, S.A. | Tolerogenic fragments of natural allergens |
| WO2003020306A1 (fr) * | 2001-08-29 | 2003-03-13 | Kyogo Itoh | Desensibilisants |
| EP1872792A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-02 | Biotech Tools S.A. | A method for the production of hydrolyzed allergen |
| EP2224953A1 (en) * | 2008-01-02 | 2010-09-08 | Biotech Tools S.A. | Pharmaceutical formulation for allergen preparation |
| KR20200057789A (ko) | 2011-04-29 | 2020-05-26 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 합성 나노운반체로부터의 면역억제제의 조절 방출 |
| JP6760838B2 (ja) | 2013-05-03 | 2020-09-23 | セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＳｅｌｅｃｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． | 望ましくない液性免疫応答を低減するための投薬の組み合わせ |
| KR102692773B1 (ko) | 2014-09-07 | 2024-08-08 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 유전자 편집 항-바이러스 전달 벡터 면역 반응을 약화시키기 위한 방법 및 조성물 |
| ES2868631T3 (es) | 2016-10-05 | 2021-10-21 | Asit Biotech S A | Prevención de la alergia |
| CA3055936A1 (en) | 2017-03-11 | 2018-09-20 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US150389A (en) | 1874-05-05 | Improvement in combined paper-clips and letter-folders | ||
| GB1282163A (en) | 1969-08-06 | 1972-07-19 | Beecham Group Ltd | Modified allergens and a process for their preparation |
| GB1492973A (en) | 1974-02-16 | 1977-11-23 | Beecham Group Ltd | Process for preparing injectable compositions |
| GB1578348A (en) | 1976-08-17 | 1980-11-05 | Pharmacia Ab | Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic |
| US4338297A (en) | 1980-02-19 | 1982-07-06 | Michael Jacob G | Polypeptide active pollen immunosuppressant fraction |
| DE3160926D1 (en) | 1980-04-15 | 1983-10-27 | Beecham Group Plc | Allergens modified with polysarcosines |
| JPS58115120A (ja) | 1981-12-28 | 1983-07-08 | Nippon Oil Co Ltd | ピツチ系炭素繊維の製造方法 |
| ES2013359A6 (es) | 1988-11-04 | 1990-05-01 | Corporacion Biolog Farmaceutic | Procedimiento para la fabricacion de alergenos inmunogenicos polimerizados. |
| NL8900652A (nl) | 1989-03-16 | 1990-10-16 | Leti Lab | Primair-toxische stoffen of allergenen, isoleerbaar uit plantaardig materiaal, alsmede werkwijzen ter bereiding ervan en de toepassing ervan. |
| US5792506A (en) * | 1991-10-12 | 1998-08-11 | The Regents Of The University Of California | Neutralization of food allergens by thioredoxin |
| JP3397791B2 (ja) | 1992-09-21 | 2003-04-21 | ラボラトリオス レティ ソシエダッド アノニマ | アレルゲンとして活性なタンパク質を含有する水性エキスの精製方法，この方法で得られるエキスならびにそれらの使用 |
| AU675629B2 (en) | 1992-09-21 | 1997-02-13 | Laboratorios Leti S.A. | A process for the purification of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extracts obtainable according to this process as well as their use |
| CA2206852A1 (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Novo Nordisk A/S | Polypeptide with reduced allergenicity |
| CZ283615B6 (cs) * | 1996-05-31 | 1998-05-13 | Bioveta, A.S. | Způsob výroby vakcín proti dermatofytózám zvířat a dermatofytických alergenů |
| US6350590B1 (en) * | 1997-10-30 | 2002-02-26 | C.B.F. Leti, S.A. | Tolerogenic fragments of natural allergens |
| US7210010B2 (en) | 2002-09-30 | 2007-04-24 | Insignia Solutions Plc | Efficient system and method for updating a memory device |
-
1997
- 1997-10-30 US US09/530,277 patent/US6350590B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 AT AT97954496T patent/ATE417626T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-30 PT PT97954496T patent/PT1024829E/pt unknown
- 1997-10-30 DK DK97954496T patent/DK1024829T3/da active
- 1997-10-30 CZ CZ20001529A patent/CZ302352B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-30 AU AU58833/98A patent/AU729589C/en not_active Ceased
- 1997-10-30 EP EP97954496A patent/EP1024829B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 EP EP08171363A patent/EP2042192A3/en not_active Withdrawn
- 1997-10-30 DE DE69739174T patent/DE69739174D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 CA CA002307655A patent/CA2307655C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-30 JP JP2000518693A patent/JP3790099B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-30 IL IL13588197A patent/IL135881A0/xx unknown
- 1997-10-30 BR BR9714899-7A patent/BR9714899A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-30 WO PCT/NL1997/000598 patent/WO1999022762A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-30 ES ES97954496T patent/ES2319341T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 PL PL97340293A patent/PL187544B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-10-30 HU HU0004831A patent/HUP0004831A3/hu unknown
-
2001
- 2001-12-04 US US10/000,453 patent/US6660495B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3790099B2 (ja) | 2006-06-28 |
| AU729589B2 (en) | 2001-02-08 |
| US6660495B2 (en) | 2003-12-09 |
| BR9714899A (pt) | 2000-08-22 |
| US6350590B1 (en) | 2002-02-26 |
| CZ302352B6 (cs) | 2011-03-30 |
| EP2042192A2 (en) | 2009-04-01 |
| ATE417626T1 (de) | 2009-01-15 |
| AU5883398A (en) | 1999-05-24 |
| JP2001521907A (ja) | 2001-11-13 |
| HUP0004831A2 (hu) | 2001-05-28 |
| DE69739174D1 (de) | 2009-01-29 |
| ES2319341T3 (es) | 2009-05-06 |
| CA2307655C (en) | 2005-05-24 |
| AU729589C (en) | 2001-08-30 |
| EP1024829A1 (en) | 2000-08-09 |
| PT1024829E (pt) | 2009-03-18 |
| PL340293A1 (en) | 2001-01-29 |
| IL135881A0 (en) | 2001-05-20 |
| DK1024829T3 (da) | 2009-02-09 |
| EP1024829B1 (en) | 2008-12-17 |
| EP2042192A3 (en) | 2009-05-27 |
| HUP0004831A3 (en) | 2001-09-28 |
| PL187544B1 (pl) | 2004-07-30 |
| CA2307655A1 (en) | 1999-05-14 |
| WO1999022762A1 (en) | 1999-05-14 |
| US20020086348A1 (en) | 2002-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| King | Chemical and biological properties of some atopic allergens | |
| Machado et al. | Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen‐specific IgE | |
| JP2013256520A (ja) | アレルゲンペプチド断片およびその利用 | |
| JP2006520380A5 (cs) | ||
| RU2572230C2 (ru) | Способ получения экстракта аллергена | |
| Breiteneder et al. | Isolation and characterization of messenger RNA from male inflorescences and pollen of the white birch (Betula verrucosa) | |
| US7595052B2 (en) | Composition and method for the prevention and/or the treatment of allergy | |
| CZ20001529A3 (cs) | Způsob přípravy toleranci indikujících extraktů, preparátů a jejich použití | |
| Ekramoddoullah et al. | Allergenic cross-reactivity of cytochromes c of Kentucky bluegrass and perennial ryegrass pollens | |
| WO1997032600A1 (fr) | Agent immunotherapeutique a base peptidique pour le traitement des allergies | |
| RU2481122C2 (ru) | Аллергены и аллергоиды из пчелиного яда | |
| AU2001243964A1 (en) | Composition and method for the prevention and/or the treatment of allergy | |
| AT503296B1 (de) | Protein-allergen-derivat | |
| JPH10505356A (ja) | ヒトへの投与のための組成物および方法、抗原特異的免疫応答のダウンレギュレーションを行うことが可能なペプチド | |
| RU2279888C1 (ru) | Аллергоид из яда пчел для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаление пчелами и способ его получения | |
| US20100086568A1 (en) | Modification of allergens | |
| Alam et al. | Production and properties of histamine-releasing factor of guinea pigs. | |
| AU2012202084B9 (en) | Allergen peptide fragments and use thereof | |
| JP2007176953A (ja) | アレルギー疾患に対するペプチド免疫療法剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20171030 |