RU2264462C2 - АЛЛЕРГЕН ОСИНОГО ЯДА С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ IgE И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) - Google Patents
АЛЛЕРГЕН ОСИНОГО ЯДА С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ IgE И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2264462C2 RU2264462C2 RU2002117424/13A RU2002117424A RU2264462C2 RU 2264462 C2 RU2264462 C2 RU 2264462C2 RU 2002117424/13 A RU2002117424/13 A RU 2002117424/13A RU 2002117424 A RU2002117424 A RU 2002117424A RU 2264462 C2 RU2264462 C2 RU 2264462C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- allergen
- antigen
- wasp
- recombinant
- vespula
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 101000750404 Phoneutria keyserlingi CRISP-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 239000002578 wasp venom Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 title 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 241001415096 Vespula germanica Species 0.000 claims description 4
- 241000256834 Vespula vulgaris Species 0.000 claims description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 4
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 claims 2
- 241000256838 Vespula Species 0.000 claims 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000007815 allergy Effects 0.000 abstract description 14
- 239000002919 insect venom Substances 0.000 abstract description 11
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- -1 allergology Substances 0.000 abstract 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 abstract 1
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010058284 Allergy to arthropod sting Diseases 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 2
- OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N melitin Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(OC4C(C(O)C(O)C(COC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)O4)O)=C(C=4C=CC(O)=CC=4)O3)=O)=C(O)C=2)OC(C)C1O OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241000256837 Apidae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical group [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 208000034280 venom allergy Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
- C07K14/43568—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from wasps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к рекомбинантным аллергенам яда насекомых и специфическим способам их получения, в частности антигена 5 аллергена осиного яда. Рекомбинантный антиген 5 получают в бактериальных клетках в виде нерастворимых агрегатов с последующей их денатурацией и переводом в растворимый мономерный аллерген. Перевод осуществляют диализом с использованием кислотного буферного раствора (рН 3,5-6,5), в состав которого может входить гуанидин гидрохлорид, или с использованием растворителя, содержащего цистеин. На основе описанных способов выделяют практически чистый рекомбинантный антиген 5 аллергена осиного яда, который используют в фармацевтической композиции для гипосенсибилизации организма к аллергену осиного яда. Изобретение позволяет получить белок, имеющий пониженную реакционную способность JgE, благодаря чему может применяться в иммунотерапии для лечения аллергии. 4 н. И 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным аллергенам яда насекомых и к способу их целенаправленного получения, причем упомянутые аллергены могут принимать формы, аналогичные природным структурам, или отличающиеся от них в зависимости от способа получения.
Применение форм, которые соответствуют природной молекуле, заключается в моноаллергенной диагностике (in vitro или in vivo) расстройств у лиц, страдающих аллергией, особенно у страдающих аллергией на яд насекомых.
Искусственные формы могут применяться как терапевтические средства для специфической (индивидуальной) иммунотерапии, которая имеет незначительные побочные эффекты. Эти рекомбинантные формы, таким образом, могут обеспечивать более эффективное лечение, чем натуральный продукт. Разработанный способ позволяет реализовывать биотехнологическое производство в условиях, требуемых в фармацевтике (GMP).
Аллергия от жалящих насекомых вызывается преимущественно осами и медоносными пчелами и может приводить к серьезным системным симптомам или даже потенциально фатальной анафилаксии (Müller, U.R., in: Insect sting allergy, Gustav Fischer Verlag; 1990). Веществами, которые вызывают аллергию типа 1, являются протеины, гликопротеины или полипептиды яда насекомых. После инъекции восприимчивым людям, эти аллергены реагируют с молекулами IgE, связанными с поверхностью опорных клеток. Если связанные с FcεRI молекулы IgE этого типа сшиты друг с другом посредством аллергена, то это приводит к высвобождению медиаторов (например, гистамина, лейкотриенов) и цитокинов эффекторной клетки и, таким образом, к соответствующим клиническим симптомам.
Кроме пептида мелитина как аллергенные составляющие пчелиного яда действуют ферменты гиалуронидаза и фосфолипаза А2 (Habermann, E., 1972, Science 177, 314-322). В случае осы основные энзимоактивные аллергены аналогичны гиалуронидазе, которая подобна той, которая входит в состав пчелиного яда (Hoffmann, D.R., 1986, J. Allergy Clin.Immunol. 78, 337-343), и фосфолипазе А1. Важнейшим основным аллергеном яда осы является антиген 5, у которого до настоящего времени энзиматической активности не обнаружено (King и др., 1978, Biochemistry 17, 5165-5174). Все упомянутые аллергены уже охарактеризованы в молекулярной биологии и уже клонированы соответствующие молекулы кДНК (в том числе Fang и др., 1988, PNAS, 895-899; Soldatova и др., 1993, FEBS, 145-149; Kuchler и др., 1989, Eur. J. Biochem. 249-254). С помощью последовательности кДНК можно получать рекомбинантные аллергены, которые могут быть применены в диагностике и лечении аллергии (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).
По данному изобретению основной антиген 5 аллергена имеет особо важное значение, ниже эта молекула применяется в качестве образца. Эта молекула представляет собой негликозилированный протеин размером около 25 кДа. Первичная последовательность содержит 8 цистеиновых остатков, что свидетельствует о наличии четырех дисульфидных мостиков (Hoffman, D.R., 1993, J. Allergy Clin Immunol. 92: 707-716). Классический подход к эффективной терапии аллергии на яд насекомых состоит в специфической иммунотерапии или гипосенсибилизация (MÜller, U.R., in: Insect sting allergy, Gustav Fisher Verlag; 1990). При этом экстракты природного аллергена вводят пациенту подкожно возрастающими дозами. Однако этот метод влечет за собой риск возникновения аллергических реакций или даже анафилактического шока. Поскольку можно ожидать возникновения сильных реакций, особенно в случае гипосенсибилизации укуса насекомых, то лечение проводится исключительно в условиях стационара.
Оптимизация лечения при помощи аллергенов, получаемых рекомбинантными способами, может быть особенно существенной в случае аллергии на укусы насекомых. Экстракты аллергенов природного происхождения можно заменить определенными коктейлями из аллергенов высокой чистоты, получаемых рекомбинантными методами (Scheiner and Kraft, 1995), которые могут быть подходящими к индивидуальной сенсибилизации пациентов. Реальные перспективы более безопасной гипосенсибилизации открываются в связи с возможностью сознательного видоизменения рекомбинантных аллергенов, в которых антигенные детерминанты IgE удалены специфическим образом без ослабления спаренных Т-клеток антигенных детерминантов, которые восприимчивы к терапии (Schramm и др., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414).
Из гетерологической экспрессии в E.coli известно, что большинство эукариотических протеинов не вырабатываются со структурой, аналогичной природным структурам, или вырабатываются в очень незначительной степени. Результатом этих неправильных форм зачастую является нерастворимость этих протеинов. В частности, это наблюдается в цистеинсодержащих протеинах (Kuchler et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, 249-254). Об антигене 5 сообщается, что экспрессия в бактериях приводит к образованию нерастворимых агрегатов, не соответствующих природной структуре (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif. 16(3): 410-416). Нерастворимые агрегаты этого типа нельзя применять ни для диагностики, ни для терапии.
Протеины, которые нерастворимы в E.coli, часто приготавливают для исследовательских целей в системе эукариотической экспрессии, такой как, например, дрожжи или клетки насекомых (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif. 16(3): 410-416; Soldatova et al., 1998, J Allergy Clin Immunol 101: 691-698). Однако недостатками систем эукариотической экспрессии являются, в частности, возможность протекания процессов гипергликозилирования (Grobe et al., 1999, Eur. J.Biochem 263: 33-40) и протеолитической деградации, а также сравнительно небольшой выход продукции (Glover и Hames (eds.), 1995, Expression Systems, IRL Press, Oxford-New York-Tokyo). Следовательно, протеины этого типа обычно непригодны для аллергологического применения в областях фармацевтическо-медицинской диагностики и терапии.
Продукты, полученные способом по данному изобретению, которые имеют природную структуру, преимущественно можно применять in-vitro и in-vivo для диагностики аллергических расстройств, особенно аллергии на укусы насекомых. Эта природная форма пригодна для обнаружения антител IgE по известным методикам.
С другой стороны, варианты, получаемые по данному изобретению, которые отличаются совершенно неактивными или только частично активными структурами IgE, могут применяться как гипоаллергенные компоненты в препаратах для специфической иммунотерапии. В контексте данного изобретения, упомянутый термин "гипоаллерген" означает пониженную вплоть до отсутствия, предпочтительно от 5 до 95%, в особенности от 20 до 85%, способность вызывать аллергическую реакцию (по сравнению с природным аллергеном) за счет пониженного отклика IgE.
Предметом настоящего изобретения является способ, при помощи которого рекомбинантные аллергены можно получать в бактерии (Е.coli). Первый этап очистки осуществляют при помощи значительного обогащения агрегатами нерастворимых протеинов. Затем эти агрегаты денатурируют без добавления восстанавливающих агентов. В зависимости от условий последующего диализа получаются различные формы. Важно то, что эти молекулы являются мономерными и растворимыми. Активность IgE в первом варианте растворимой формы сравнима с активностью природного аллергена и, следовательно, может быть применена для диагностических целей. Продукт этого типа получают диализом с цистеинсодержащим раствором.
Другие альтернативные варианты растворимой формы структурно отличаются от природного аллергена и определяются пониженной или отсутствующей реакционной способностью IgE. По этой причине продукты этого типа пригодны для содействия усовершенствованной иммунотерапии. Гипоаллергенный продукт этого типа получают по данному изобретению посредством диализа с кислотными буферными растворами, предпочтительно в среде с рН между 3,5 и 6,5, особенно между 4,0 и 5,5.
Таким образом, данное изобретение относится к рекомбинантному аллергену насекомых, который отличается тем, что имеет пониженную активность IgE или пониженную способность вызывать аллергическую реакцию. По данному изобретению способность этих протеинов вызывать аллергическую реакцию является пониженной вплоть до 95% по сравнению с природным аллергеном.
В особенности изобретение относится к соответствующему рекомбинантному аллергену насекомого осы, а именно из Vespula vulgaris и Vespula germanica.
Кроме того, данное изобретение относится к способу выделения достаточно чистого рекомбинантного аллергена яда насекомых, который отличается тем, что аллергенные протеины получают в нерастворимой форме, в качестве "тел внедрения" в клетках бактерий; далее вышеупомянутые нерастворимые агрегаты денатурируют, и эти денатурированные продукты преобразуют посредством диализа в растворимые мономерные аллергены разных структурных форм и затем выделяют. Указанное денатурирование предпочтительно осуществляют с использованием хлорида гуанидиния без добавления восстанавливающих агентов.
Данное изобретение относится в особенности к способу выделения рекомбинантных аллергенов яда насекомых с пониженной аллергенностью или реакционной способностью IgE, по которому диализ проводят с применением кислотного буферного раствора; предпочтительно этим буфером является ацетат натрия с рН между 4,5 и 5,0.
Кроме того, изобретение относится также к способу выделения рекомбинантных аллергенов яда насекомых с обычной аллергенностью или реакционной способностью IgE; в этом случае диализ проводят с применением цистеинсодержащего раствора.
Изобретение относится также к рекомбинантному аллергену яда осы, который можно получить при помощи соответствующего способа, описанного выше и ниже.
Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим соответствующий рекомбинантный аллерген с пониженной или уменьшенной реакционной способностью IgE и соответствующие вспомогательные лекарственные вещества и вытяжки.
Наконец, данное изобретение относится к применению аллергенов яда насекомых, получаемых при помощи соответствующего способа, описанного выше и ниже, для диагноза аллергии на укусы насекомых in-vivo и in-vitro.
Ниже представлено подробное описание этого способа.
В конкретных примерах антиген 5 аллергенов яда осы из Vespula vulgaris (Ves v 5) и антиген 5 из Vespula germanica (Ves g 5) были клонированы в вектор экспрессии pSE420 и преобразованы в штамм M15 pREP4 бактерии К12. Схема последовательности операций при осуществлении этого способа показана на чертеже.
Рекомбинантные аллергены получают при помощи предварительного выращивания штамма для прививки культуры экспрессии. Экспрессию, индуцированную IPTG, производят во вращающемся контейнере с перемешиванием при 37°С в среде LB с ограниченным доступом кислорода (90 об/мин). Бактерии концентрируют центрифугированием (5000 × g, в течение 10 мин, при 20°С) через 5 часов после экспрессии. Бактериальное дигерирование осуществляют после повторного суспендирования клеток в буферном растворе (50 мМ трис/HCl, 25% (вес/объем) сахарозы, рН 8,0) при помощи добавления лизоцима (10 мг/г мокрого веса). Далее добавляют такой же объем раствора детергента (0,2 М NaCl, 1% (вес/объем) DOC, 1% (вес/объем) Nonidet P40). Этот дигерирующий раствор впоследствии обрабатывают ультразвуком (3 мин на льду, 130 Вт, импульс 0,5 сек). Поскольку продукты экспрессии первоначально находятся в форме нерастворимых агрегатов (тела включения), то благодаря их высокой плотности их можно отделить от большей части остальных компонентов (фрагменты стенок клеток, рибосомы и т.д.) центрифугированием при 3000 × g. Дальнейшая очистка выполняется в три последовательных этапа при помощи детергенсодержащих растворов (1% Triton X-100). Очищенные тела включения впоследствии дигерируют добавлением денатурирующего буферного раствора (6 М хлорида гуанидиния, 20 мМ трис/HCl, рН 8,0) и встряхивают в течение 2 часов в RT.
Для того чтобы выделить формы структур с активной IgE, денатурирующую смесь вводят в диализную трубку (предел дигерирования 12-14 кДа) и диализируют до 100 объемов раствора цистеина (5 мМ цистеина) в течение 12 часов при комнатной температуре, при перемешивании. Далее, для удаления цистеина, проводят диализ до дистиллированной воды.
Для того чтобы получить структуры с пониженной реакционной способностью IgE, сначала проводят диализ до 20 мМ буферного раствора ацетата натрия (рН 5,0). В этом случае тоже требуется проводить последующий диализ до дистиллированной воды. После удаления растворимые в воде аллергены отделяют от осажденных центрифугированием агрегатов. Надосадочная жидкость содержит целевые растворимые рекомбинантные аллергены. Вместо буферного раствора ацетата натрия можно также использовать другие кислотные буферные растворы, обладающие способностью к буферизации в диапазоне от 3,5 до 6,5, предпочтительно от 4,0 до 5,5. Примеры буферных систем этого типа в достаточной мере описаны в литературе.
Осажденные рекомбинантные аллергены, получаемые обоими способами, могут быть повторно денатурированы и очищены по этой же схеме. Это значительно увеличивает выход продукции.
После этапов диализа продукты имеют чистоту около 95%. Дальнейшие этапы очистки базовых аллергенов яда насекомых производят посредством катионообменной хроматографии (буферный раствор рН 7,2), при помощи, например, установки Source S (Pharmacia, Freiburg, Germany) и гель-хроматографии. Помимо удаления присутствующих в небольшом количестве высокомолекулярных и низкомолекулярных примесей гель-хроматография также служит для опреснения.
Контроль качества продукции осуществляют на основе ряда характеристических свойств, которые ниже представлены в табличном виде для антигена 5:
п-антиген=природный антиген
| Свойство | Форма с природной активностью IgE | Форма с пониженной активностью IgE |
| Установка. MW в SDS-странице (невосстанавливающие условия) | 25 кДа | 26-27 кДа |
| Концентрация соли для элюации в Source S | 320 мМ NaCl | 400 мМ NaCl |
| Расщепление протеазой V8 | Фрагмент 15 кДа + пептиды | пептиды <10 кДа |
| Моноклоновые антитела, специфические к антигену 5 | Регистрируются при помощи 8ЕЗ, 1Е11 | Регистрируются только с ВЕЗ |
| Частота проявлений активности IgE на сыворотку страдающих аллергией | >95% | <10% |
| Аллергенная сила | Аналогична п-антигену 5 | Более чем в 10 раз меньше, чем у п-антигена 5 |
Способ по данному изобретению пригоден для всех типов аллергенов яда насекомых. Используемая методика очистки, рекомбинантного клонирования и методы экспрессии известны специалистам и могут быть заменены другими аналогичными методиками.
Claims (8)
1. Способ получения практически чистого рекомбинантного антигена 5 аллергена осиного яда, отличающийся тем, что аллергенный белок получают в бактериальных клетках в виде нерастворимых агрегатов, нерастворимые агрегаты денатурируют в отсутствии восстановителей, полученные денатурированные продукты переводят в растворимый мономерный антиген 5 диализом с использованием кислотного буферного раствора и выделяют антиген.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что денатурацию производят с использованием буферного раствора, в состав которого входит гуанидин гидрохлорид.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при диализе используют буферный раствор с величиной рН между 3,5 и 6,5.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что используют аллерген осы вида Vespula sp., преимущественно Vespula vulgaris и Vespula germanica, Paravespula sp. и Apis mellifera.
5. Способ получения рекомбинантного антигена 5 аллергена осиного яда, отличающийся тем, что антиген 5 получают в бактериальных клетках в виде нерастворимых агрегатов, нерастворимые агрегаты денатурируют в отсутствии восстановителей, полученные денатурированные продукты переводят в растворимый мономерный аллерген диализом с использованием растворителя, содержащего цистеин.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют аллерген осы вида Vespula sp., преимущественно Vespula vulgaris и Vespula germanica, Paravespula sp. и Apis mellifera.
7. Рекомбинантный антиген 5 аллергена осиного яда, полученный по одному из способов по пп.1-6.
8. Фармацевтическая композиция для гипосенсибилизации организма к аллергену осиного яда, содержащая рекомбинантный антиген по п.7, полученный способом по любому из пп.5-6, а также вспомогательное вещество и носитель.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19957904A DE19957904A1 (de) | 1999-12-01 | 1999-12-01 | Insektengift-Allergene mit verminderter IgE-Reaktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE19957904.0 | 1999-12-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002117424A RU2002117424A (ru) | 2003-12-27 |
| RU2264462C2 true RU2264462C2 (ru) | 2005-11-20 |
Family
ID=7931044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002117424/13A RU2264462C2 (ru) | 1999-12-01 | 2000-11-27 | АЛЛЕРГЕН ОСИНОГО ЯДА С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ IgE И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7285397B1 (ru) |
| EP (2) | EP1512694B2 (ru) |
| JP (2) | JP5597336B2 (ru) |
| CN (1) | CN1205223C (ru) |
| AT (2) | ATE339444T1 (ru) |
| AU (1) | AU783505B2 (ru) |
| CA (1) | CA2393975C (ru) |
| CZ (1) | CZ20021874A3 (ru) |
| DE (3) | DE19957904A1 (ru) |
| ES (2) | ES2271764T5 (ru) |
| HU (1) | HUP0401012A2 (ru) |
| PL (1) | PL201904B1 (ru) |
| PT (2) | PT1512694E (ru) |
| RU (1) | RU2264462C2 (ru) |
| WO (1) | WO2001040266A2 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19957904A1 (de) † | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Merck Patent Gmbh | Insektengift-Allergene mit verminderter IgE-Reaktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| JPWO2011033588A1 (ja) * | 2009-09-18 | 2013-02-07 | 株式会社アドバンテスト | 試験装置および試験方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2838800B2 (ja) * | 1989-09-02 | 1998-12-16 | 株式会社林原生物化学研究所 | 減感作剤 |
| DE4139000A1 (de) * | 1991-11-27 | 1993-06-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf |
| CA2148713A1 (en) * | 1992-11-12 | 1994-05-26 | Mei-Chang Kuo | Allergenic proteins and peptides from japanese cedar pollen |
| JP3578787B2 (ja) * | 1993-05-14 | 2004-10-20 | ラホヤ インスティチュート フォア アレルギー アンド イムノロジー | 生物学的に活性なポリペプチドの組換え製造方法 |
| US5804201A (en) * | 1996-03-11 | 1998-09-08 | The Rockefeller University | Immunomodulatory peptides of vespid antigen 5 |
| AU714318B2 (en) * | 1996-06-11 | 2000-01-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Process for the activation of denatured protein |
| EP1007648A4 (en) * | 1996-12-20 | 2003-01-15 | Lilly Co Eli | ANTI-OBESITY PROTEINS |
| DE19957904A1 (de) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Merck Patent Gmbh | Insektengift-Allergene mit verminderter IgE-Reaktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
-
1999
- 1999-12-01 DE DE19957904A patent/DE19957904A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-11-27 DE DE50013480T patent/DE50013480D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 RU RU2002117424/13A patent/RU2264462C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-11-27 JP JP2001541021A patent/JP5597336B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 ES ES04027711T patent/ES2271764T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 CZ CZ20021874A patent/CZ20021874A3/cs unknown
- 2000-11-27 CN CNB008165343A patent/CN1205223C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 EP EP04027711A patent/EP1512694B2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 WO PCT/EP2000/011776 patent/WO2001040266A2/de active IP Right Grant
- 2000-11-27 PT PT04027711T patent/PT1512694E/pt unknown
- 2000-11-27 US US10/148,565 patent/US7285397B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 PT PT00987296T patent/PT1233984E/pt unknown
- 2000-11-27 AT AT04027711T patent/ATE339444T1/de active
- 2000-11-27 PL PL355166A patent/PL201904B1/pl unknown
- 2000-11-27 AT AT00987296T patent/ATE283284T1/de active
- 2000-11-27 AU AU23594/01A patent/AU783505B2/en not_active Ceased
- 2000-11-27 HU HU0401012A patent/HUP0401012A2/hu unknown
- 2000-11-27 CA CA2393975A patent/CA2393975C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 ES ES00987296T patent/ES2232518T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 EP EP00987296A patent/EP1233984B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 DE DE50008782T patent/DE50008782D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-08-09 US US11/889,108 patent/US8048424B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-09-30 JP JP2011216515A patent/JP5265745B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MONSALVE R.I. et al. Expression of recombinant venom allergen, antigen 5 of yellowjacket (Vespula vulgaris) and paper wasp (Polistes annularis), in bacteria and yeast. Protein Expression and Purification. 16, 1999, p.410-419. В.А.ФРАДКИН. Аллергены. Изд. Медицина. - М., 1978, с.167-172. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT1512694E (pt) | 2007-01-31 |
| US8048424B2 (en) | 2011-11-01 |
| PL355166A1 (en) | 2004-04-05 |
| CN1451015A (zh) | 2003-10-22 |
| CN1205223C (zh) | 2005-06-08 |
| EP1233984B1 (de) | 2004-11-24 |
| ES2271764T5 (es) | 2011-02-28 |
| ES2271764T3 (es) | 2007-04-16 |
| DE50008782D1 (de) | 2004-12-30 |
| WO2001040266A2 (de) | 2001-06-07 |
| US20070280884A1 (en) | 2007-12-06 |
| ATE339444T1 (de) | 2006-10-15 |
| CA2393975C (en) | 2012-06-19 |
| CA2393975A1 (en) | 2001-06-07 |
| AU2359401A (en) | 2001-06-12 |
| ATE283284T1 (de) | 2004-12-15 |
| EP1233984A2 (de) | 2002-08-28 |
| AU783505B2 (en) | 2005-11-03 |
| DE50013480D1 (de) | 2006-10-26 |
| ES2232518T3 (es) | 2005-06-01 |
| PL201904B1 (pl) | 2009-05-29 |
| EP1512694A1 (de) | 2005-03-09 |
| EP1512694B2 (de) | 2010-11-03 |
| JP5597336B2 (ja) | 2014-10-01 |
| CZ20021874A3 (cs) | 2002-08-14 |
| DE19957904A1 (de) | 2001-06-07 |
| JP2004525601A (ja) | 2004-08-26 |
| JP5265745B2 (ja) | 2013-08-14 |
| HUP0401012A2 (hu) | 2004-08-30 |
| JP2012087119A (ja) | 2012-05-10 |
| US7285397B1 (en) | 2007-10-23 |
| PT1233984E (pt) | 2005-04-29 |
| WO2001040266A3 (de) | 2002-02-28 |
| EP1512694B1 (de) | 2006-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3100005B2 (ja) | ヒト免疫不全ウィルス感染・増殖抑制剤 | |
| US6106844A (en) | Immunomodulatory peptides of vespid antigen 5 | |
| US20070231341A1 (en) | Cat dander allergen treatments | |
| JP2596491B2 (ja) | 有力なマクロファージ活性化因子へのヒトビタミンｄ結合蛋白のインビトロ酵素変換 | |
| EP1767543B1 (en) | Novel bee venom polypeptides and methods of use thereof | |
| NO178663B (no) | Framgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid | |
| RU2264462C2 (ru) | АЛЛЕРГЕН ОСИНОГО ЯДА С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ IgE И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) | |
| US6350590B1 (en) | Tolerogenic fragments of natural allergens | |
| RU2279888C1 (ru) | Аллергоид из яда пчел для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаление пчелами и способ его получения | |
| CN112724231A (zh) | 一种角蛋白bd-11、制法和其药物组合物与用途 | |
| RU2825993C1 (ru) | Кератин bd-6, способ его получения и его фармацевтическая композиция и применение | |
| RU2825992C1 (ru) | Кератин bd-11, способ его получения и его фармацевтическая композиция и применение | |
| RU2825991C1 (ru) | Кератин bd-13, способ его получения и его фармацевтическая композиция и применение | |
| Alam et al. | Production and properties of histamine-releasing factor of guinea pigs. | |
| KR920005973B1 (ko) | 유전자 재조합한 효모에서 인간 성장 호르몬의 정제 방법 | |
| SU623556A1 (ru) | Способ получени гиалуронидазы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171128 |