PL201904B1 - Sposób otrzymywania rekombinowanych alergenów jadu osy, ich zastosowanie oraz zawierające je preparaty farmaceutyczne - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania zasadniczo czystych rekombinowanych an- tygenów 5 alergenów jadu osy wytwarzanych rekombinacyjnie w komórkach bakterii, ich zastosowanie do specyficznej immunoterapii lub hipouczulania u pacjentów z alergi a na jad osy oraz do diagnozy alergii wywo lanych uzadleniem osy, a tak ze zawieraj ace je preparaty. Wed lug wynalazku bia lka aler- genów wytwarza si e w nierozpuszczalnych formach jako cia lka inkluzyjne w komórkach bakterii, na- st epnie takie nierozpuszczalne agregaty denaturuje si e bez dodatku czynników redukuj acych, a pro- dukty denaturacji przeprowadza si e w rozpuszczalne, monomeryczne alergeny poprzez dializ e, oraz przeprowadza si e ko ncow a dializ e wzgl edem wody destylowanej, przez co otrzymywany antygen 5 alergenu jest rozpuszczalny w wodzie destylowanej. W zale zno sci od warunków pierwszej dializy we- d lug wynalazku mo zna otrzyma c antygen 5 alergenu jadu osy o zredukowanej b ad z normalnej immu- nogenno sci lub reaktywno sci IgE. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zasadniczo czystych rekombinowanych antygenów 5 alergenu jadu osy wytwarzanych rekombinacyjnie w komórkach bakterii, a zwłaszcza specjalnego sposobu ich otrzymywania, ich zastosowania oraz zawierających je preparatów farmaceutycznych. Otrzymane alergeny mogą się różnić w zależności od tego czy są otrzymywane przy wykorzystaniu konformacji identycznych lub różnych od tych, które występują naturalnie.

Formy (konformery), odpowiadające naturalnym cząsteczkom mogą być stosowane, w indywidualnej diagnostyce różnicowania alergenów (in vitro lub in vivo) u alergików, a szczególnie u alergików wrażliwych na jad owadów.

Formy (konformery) różne od naturalnych mogą być też stosowane w leczeniu wspomagającym specyficzną immunoterapię. Tym samym formy rekombinowane mogą wykazywać pewne działanie lecznicze jako naturalne substancje czynne. Sposób według wynalazku został zaprojektowany tak, aby otrzymywanie przebiegało w procesie biotechnologicznym, co w przypadku farmaceutyków jest warunkiem koniecznym (GMP).

Alergie towarzyszące ukłuciu owadów, powodowane głównie przez osy i pszczoły, mogą prowadzić do ciężkich objawów systematycznych, potencjalnie śmiertelnych poprzez anafilaksję (M^ler, U.R., w: Insect sting allergy, Gustav Fischer Verlag; 1990). Do alergii typu 1 zalicza się substancje działające w proteinach, glikoproteinach lub polipeptydach owadów. Alergeny te reagują poprzez wstrzyknięcie cząsteczek IgE na powierzchni komórki tucznej osoby wrażliwej. Takie FcεRI cząsteczki IgE są sieciowane poprzez alergen razem, prowadząc do wytrząsania mediatorów (np. histaminy, Leukotriene) i cytokin przez komórki efektora, a tym samym do odpowiednich objawów klinicznych.

Enzym Hyaluronidase i fosfolipazy A2 działa poprzez peptyd Melittin jako część składowa alergenu pszczół (Habermann, E, 1972, Science 177, 314 - 322). W przypadku osy głównym enzymatycznie aktywnym alergenem jest Hyaluronidase, który jest podobny do tego u pszczoły (Hoffmann, D.R., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 337 - 343) i fosfolipaza A1. Najważniejszym alergenem jadu osy jest antygen 5, jak dotychczas żadne enzymatycznie aktywne alergeny nie zostały poznane (King et al.,1978, Biochemistry 17, 5165 - 5174). Niektóre znane alergeny są gotowymi cząsteczkami biologicznymi, a odpowiednie cząsteczki cDNA są klonowane (patrz Fang et al., 1988, PNAS, 895 - 899; Soldatova et al., 1993, FEBS, 145 - 149; Kuchler et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, 249 - 254). Za pomocą sekwencji cDNA możliwe jest tworzenie rekombinowanych alergenów, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii alergii (Scheiner i Kraft, 1995, Allegy 50, 384-391).

W alergenach według wynalazku antygen 5 głównego alergenu ma szczególne znaczenie. Aktywne jest około 25 kDa nieglikozydowanych protein. Pierwszorzędowa sekwencja 8 reszt cysteinowych ma cztery mostki disulfidowe (Hoffmann, D.R., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 707 - 716). Klasyczny sposób skutecznego działania terapeutycznego w przypadku alergii na jad owadów stanowi specyficzna immunoterapia lub hipouczulanie (M^ler, U.R., w: Insect sting allergy, Gustav Fischer Verlag; 1990). Pacjenci przyjmują naturalne ekstrakty alergenów we wzrastających dawkach wstrzykiwanych podskórnie. Jednak w metodzie tej istnieje niebezpieczeństwo alergicznej reakcji ze wstrząsem anafilaktycznym włącznie. W przypadku hipouczulania jadem owadów z czasem mogą wystąpić ostre reakcje.

Optymalizacja terapii rekombinowanymi alergenami jest możliwa szczególnie przy alergiach wywołanych ukłuciem owada. Przeprowadza się tu indywidualne uczulanie pacjentów odpowiednimi koktajlami rekombinowanych alergenów o wysokiej czystości (Scheiner i Kraft, 1995), przy czym ekstrakty z naturalnych źródeł alergenów mogą być rozdzielone. Realne perspektywy skutecznego hipouczulania rekombinowanymi alergenami tego typu mogą dać zmutowane rekombinowane alergeny, przy ich specyficznej IgE - Epitope, które nie są szkodliwe w terapiach przeznaczonych dla T - komórek Epitope (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414).

Znana jest niejednorodna ekspresja E.coli, w której proteiny eukariotyczne przybierają „naturalne konformacje. Skutkiem takich błędnych konformacji jest często nierozpuszczalność tych protein. Dotyczy to szczególnie protein zawierających cysteinę (Kuchler et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, 249 - 254). Szczególnie w przypadku antygenu 5 ekspresja w bakteriach prowadzi do nierozpuszczalnych agregatów, które nie mają naturalnych konformacji (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif. 16 (3): 410 - 416). Takie nierozpuszczalne agregaty nie nadają się ani do celów diagnostycznych ani też do terapii.

PL 201 904 B1

Nierozpuszczalne proteiny w E.coli są często wykorzystywane do badań eukariotycznego systemu ekspresji, na przykład drożdży lub komórek owadów (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif. 16 (3): 410 - 416; Soldatova et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101: 691 - 698). Eukariotyczne systemy ekspresji umożliwiają przede wszystkim hiperglikozydowanie (Grobe et al., 1999, Eur J Biochem 263: 33 - 40) i proteolityczne procesy degeneracji o porównywalnie małej wydajności produktu (Glover i Hames (eds.), 1995, Expressions Systems, IRL Press, Oxford-New York-Tokyo). Jednak przeważnie proteiny te nie nadają się do alergologicznych zastosowań w diagnostyce farmaceutyczno-medycznej i terapii.

Alergeny uzyskane sposobem według wynalazku, które mają konformacje naturalne, mogą być stosowane w diagnostyce in vitro i in vivo chorób alergicznych, szczególnie alergii po ukłuciu owada. Takie formy identyczne z naturalnymi (konformery) wykorzystuje się do detekcji przeciwciał IgE.

Z drugiej strony warianty według wynalazku, w których obserwuje się istotne zmniejszenie lub zanik reaktywności IgE konformacji, stosuje się jako komponenty hipoalergenów w preparatach do specyficznej immunoterapii. W niniejszym opisie, poprzez wyrażenie „hipoalergen rozumie się zmniejszone do zanikających, korzystnie około od 5 do 95%, szczególnie od 20 do 85% właściwości uczulające względem naturalnych alergenów, które warunkowane jest poprzez zmniejszenie odpowiedzi IgE.

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania zasadniczo czystego rekombinowanego antygenu 5 alergenu jadu osy, który charakteryzuje się tym, że wytwarza się białka alergenów w nierozpuszczalnych formach jako ciałka inkluzyjne w komórkach bakterii (E.coli), następnie takie nierozpuszczalne agregaty denaturuje się bez dodatku czynników redukujących, a produkty denaturacji (konformery). przeprowadza się w rozpuszczalne, monomeryczne alergeny poprzez dializę, oraz przeprowadza się końcową dializę względem wody destylowanej, przez co otrzymywany antygen 5 alergenu jest rozpuszczalny w wodzie destylowanej.

Denaturację przeprowadza się korzystnie chlorkiem guanidynowym.

Istotą wynalazku jest zwłaszcza sposób otrzymywania rekombinowanego antygenu 5 alergenu jadu osy z gatunku Vespula spec, a szczególnie Vespula vulgaris i Vespula germanica, Paravespula spec. i Apis mellifera.

Dla otrzymania antygenu 5 alergenu jadu osy o zredukowanej immunogenności lub reaktywności IgE, w sposobie według wynalazku do pierwszej dializy stosuje się bufory kwaśne, korzystnie o wartości pH pomiędzy 3.5 a 6.5, a szczególnie pomiędzy 4.0 i 5.5.

Takie rekombinowane alergeny jadu osy według wynalazku odznaczają się tym, że zmniejszają reaktywność IgE i wykazują zredukowane właściwości uczulające tych protein o 95% w porównaniu z alergenami naturalnymi.

Istotą wynalazku jest także zastosowanie takiego hipoalergicznego antygenu 5 alergenu jadu osy o zredukowanej immunogenności lub reaktywności IgE i otrzymanego sposobem według wynalazku do specyficznej immunoterapii lub hipouczulania u pacjentów z alergią na jad osy.

Istotą wynalazku jest dalej preparat farmaceutyczny, który zawiera odpowiednie różnorodne rekombinowane antygeny 5 alergenu jadu osy otrzymane sposobem według wynalazku, na przykład łagodzące reaktywność IgE oraz odpowiednie substancje pomocnicze i nośniki.

Dla otrzymania antygenu 5 alergenu jadu osy o normalnej immunogenności lub reaktywności IgE, w sposobie według wynalazku do pierwszej dializy stosuje się roztwory zawierające cysteinę.

Istotą wynalazku jest też zastosowanie takiego antygenu 5 alergenu jadu osy o normalnej immunogenności lub reaktywności IgE i otrzymanego sposobem według wynalazku do diagnozy in vitro alergii wywołanych użądleniem osy.

Sposób według wynalazku opisano szczegółowo poniżej.

Jako przykład opisano klonowanie alergenu jadu osy antygenu 5 z Vespula vulgaris (Ves v 5) i antygenu 5 z Vespula germanica (Ves g 5) w wektorze ekspresji pSE420 i transformowanie M15 pREP4 w szczepie bakterii K12. Schemat procesu znajduje się na rysunku fig. 1.

Do wytworzenia rekombinowanych alergenów używa się wyjściowego szczepu do zaszczepiania ekspresji kultur. Ekspresja indukuje się przez IPTG, w kolbie z przegrodami w temperaturze 37°C w LB - medium przy ograniczonym dostę pie tlenu (90 rpm/min). Bakterie są zbierane po pięciu godzinach ekspresji przez wirowanie (5000xg, 10 min, 20°C). Rozkład bakterii następuje po ponownym zawieszeniu komórek w buforze (50 mM Tris/HCL, 25% (w/v) sacharoza, pH 8.0) przez dodanie Lysozym (10 μg/g waga mokra). Następuje dodanie równej objętości roztworu detergentu (0.2 M NaCI, 1% (w/v) DOC, 1% (w/v) Nonidet P40). Roztwór traktuje się ultradźwiękami (3 min nad lodem, 130 Watt, impuls 0.5 s). Produkty pierwszorzędowej ekspresji otrzymuje się jako nierozpuszczalne agregaty

PL 201 904 B1 (ciałka inkluzyjne), dzięki ich dużej gęstości są oddzielane od pozostałych komponentów (fragmentów ścian komórek, rybosomów itd.) za pomocą wirowania 3000 x g. Dalsze oczyszczanie prowadzi się przez trzy kolejne etapy przemywania roztworem zawierającym detergent (1% Triton X-100). Na początku wytrącone ciałka oczyszczane są poprzez dodanie buforu denaturującego (6 M chlorek guanidynowy, 20 mM Tris/HCI, pH 8.0), na koniec wytrząsa się przez 2 h przy RT.

Do otrzymywania form (konformacji) o reaktywnych IgE, czynnik denaturujący wlewany jest na odcinku dializy (efekt filtracyjny 12-14 kDa) względem 100 części objętościowych roztworu cysteiny (5 mM cysteiny), dializa zachodzi podczas mieszania przez 12 h przy RT. Na koniec przeprowadza się dializę względem wody destylowanej, aby usunąć cysteinę.

Aby otrzymać konformacje o zmniejszonej reaktywności IgE, na początku przeprowadza się dializę względem 20 mM buforu octanu sodu (pH 5.0). Również tu efekt końcowy osiągany jest po przeprowadzeniu kolejnej dializy względem wody destylowanej. Następnie alergeny rozpuszczone w wodzie oddziela się przez wirowanie z wytrąconych agregatów. Następnie otrzymuje się żądany rozpuszczalny rekombinowany alergen. Dodaje się bufor octanu sodu lub inny kwaśny bufor, o zakresie pH od 3.5 do 6.5, korzystnie 4.0 i 5.0. Przykłady takich układów buforujących opisano w literaturze.

W przypadku obu sposobów otrzymywania osady rekombinowanych alergenów mogą być znowu denaturowane, ich obróbka przeprowadzana jest według podobnego schematu. Wskutek takich zabiegów wydajność wzrasta dwukrotnie.

Po etapie dializy produkty są czyste w ok. 95%. Kolejne etapy oczyszczania alergenów jadu owadów oparte są na chromatografii kationowymiennej (bufor pH 7.2) z np. Source S (Pharmacia, Freiburg, Germany) i filtracji żelowej. Filtracja żelowa służy obok oddzielania wysoko i niskocząsteczkowych zanieczyszczeń również do odsalania.

Kontrola jakości produktu oparta jest na badaniu następujących charakterystycznych właściwości, które dla antygenu 5 przedstawiono w poniższej tabeli.

nAntygen = naturalny antygen

Właściwość	Konformer o normalnej reaktywności IgE	Konformer o zmniejszonej reaktywności IgE
App. MW w SDS-PAGE (warunki nie zredukowane)	25 kDa	26 - 27 kDa
Stężenie soli do elucji w Source S	320 mM NaCI	400 mM NaCI
Rozszczepienie z proteazą V8	15 kDa fragment + peptyd	peptyd < 10 kDa
Antygen 5 specyficzne przeciwciała monoklonalne	detekcja przez 8E3, 1E11	detekcja możliwa tylko z 8E3
Częstość reaktywności IgE uczulania	> 95 %	< 10%
Zdolność alergenu do uczulania	Podobny do nAntygenu 5	> 10 x mniejsza niż nAg5

Sposób według wynalazku nadaje się do wszystkich rodzajów alergenów jadów owadów. Zastosowane techniki oczyszczania oraz rekombinowanego klonowania jak również techniki ekspresji są znane i mogą być zastąpione poprzez znane podobne techniki.

Claims (9)

1. Sposób otrzymywania zasadniczo czystego rekombinowanego antygenu 5 alergenu jadu osy wytwarzanego rekombinacyjnie w komórkach bakterii, znamienny tym, że wytwarza się białka alergenów w nierozpuszczalnych formach jako ciałka inkluzyjne w komórkach bakterii, następnie takie nierozpuszczalne agregaty denaturuje się bez dodatku czynników redukujących, a produkty denaturacji przeprowadza się w rozpuszczalne, monomeryczne alergeny poprzez dializę, oraz przeprowadza się końcową dializę względem wody destylowanej, a otrzymywany antygen 5 alergenu jest rozpuszczalny w wodzie destylowanej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że denaturację przeprowadza się chlorkiem guanidynowym.

PL 201 904 B1

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wykorzystuje się alergeny gatunków

Vespula spec, szczególnie Vespula vulgaris i Vespula germanica, Paravespula spec i Apis mellifera.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że do pierwszej dializy stosuje się bufory kwaśne a otrzymywany antygen 5 alergenu ma zredukowaną immunogenność lub reaktywność IgE.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do pierwszej dializy stosuje się bufory o wartości pH pomiędzy 3.5 a 6.5.

6. Preparat farmaceutyczny zawierający rekombinowany antygen 5 alergenu jadu osy otrzymany sposobem zdefiniowanym w zastrz. 4 albo 5 oraz odpowiednie środki pomocnicze i nośniki.

7. Zastosowanie antygenu 5 alergenu jadu osy otrzymanego sposobem zdefiniowanym w zastrz. 4 albo 5 do specyficznej immunoterapii lub hipouczulania u pacjentów z alergią na jad osy.

8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że do pierwszej dializy stosuje się roztwory zawierające cysteinę a otrzymywany antygen 5 alergenu ma normalną immunogenność lub reaktywność IgE.

9. Zastosowanie antygenu 5 alergenu jadu osy otrzymanego sposobem zdefiniowanym w zastrz. 8 do diagnozy in vitro alergii wywołanych użądleniem osy.