CZ20021874A3 - Alergeny hmyzích jedů se sníľenou 1gE- reaktivitou a způsob jejich přípravy - Google Patents
Alergeny hmyzích jedů se sníľenou 1gE- reaktivitou a způsob jejich přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021874A3 CZ20021874A3 CZ20021874A CZ20021874A CZ20021874A3 CZ 20021874 A3 CZ20021874 A3 CZ 20021874A3 CZ 20021874 A CZ20021874 A CZ 20021874A CZ 20021874 A CZ20021874 A CZ 20021874A CZ 20021874 A3 CZ20021874 A3 CZ 20021874A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- allergens
- recombinant
- allergen
- insect
- reactivity
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 title 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 title 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000002919 insect venom Substances 0.000 claims abstract description 12
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 claims abstract description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000002578 wasp venom Substances 0.000 claims abstract description 5
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 13
- 238000004804 winding Methods 0.000 claims description 13
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 241001415096 Vespula germanica Species 0.000 claims description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 241000256834 Vespula vulgaris Species 0.000 claims description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 241000256838 Vespula Species 0.000 claims 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 206010058284 Allergy to arthropod sting Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 26
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 208000003014 Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101000750404 Phoneutria keyserlingi CRISP-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101710099833 Venom protein Proteins 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 208000034280 venom allergy Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
- C07K14/43568—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from wasps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká rekombinantních alergenů hmyzích jedů a způsobu jejich cílené výroby, přičemž se alergeny rozlišují podle provedení výrobního způsobu konformací neboli vinutím (folding”) identickým s přírodním nebo jiným než přírodním.
Použití pro formy vinutí, které odpovídají přírodním molekulám spočívá v diferenční diagnostice jednotlivých alergenů (in vitro nebo in vivo) od alergiků, zvláště alergiků na hmyzí j ed.
Umělé formy vinutí mohou být nasazeny jako léčiva s malými vedlejšími účinky ke speciální imunoterapii. Tím mohou tyto rekombinantní varianty vinutí ovlivňovat bezpečnější léčení než přírodní látka. Způsob je tak koncipován, že může být provedena biotechnologická výroba za podmínek nutných pro léčiva (GMP).
Dosavadní stav techniky
Alergie na hmyzí píchnutí jsou způsobovány hlavně vosami a včelami a mohou vést k těžkým systémickým příznakům, až ke smrtelně probíhající anafylaxi (Muller, U.R., Insect sting allergy, nak1adate1stbí Gustav Fischer 1990). U látek, vyvolávajících alergii typu 1, jde o proteiny, g1ykoproteiny nebo polypeptidy hmyzího jedu. Tyto alergeny reagují v případě senzibi 1 izovaných lidí po injekci s molekulami IgE vázanými na povrchu mastocytových buněk. Jestliže se takové Fc RI vázané molekuly alergenem navzájem zesítí, vyřadí se mediátory (například histamin, leukotrien) a cytokiny efektorovou buňkou a • · • · · · vyvjnou se odpovídající klinické symptomy.
Jako alergenové složky včelího jedu působí kromě peptidu melittin enzym hyaluroň idáza a fosfolipáza A2 (Habermann E., Science 177, str. 314 až 322, 1972). V případě vosy se vyskytují jako enzymaticky aktivní hlavní alergeny rovněž hyaluronidáza, která je podobná jako u včelího jedu (Hoffmann D.R., J. Aliergy Clin. Immunol. 78, str. 337 až 343, 1986) a fosfolipáza Al. Nejdůležitějším hlavním alergenem vosího jedu je antigen 5, pro který nebylo dosud možno prokázat žádnou enzymatickou aktivitu (King a kol., Biochemistry 17, str. 5165 až 5174, 1978). Všechny jmenované alergeny už byly charakterizovány z hlediska molekulární biologie a odpovídající molekuly cDNA klonovány (například Fang a kol., PNAS, str. 895 až 899, 1988; Soldátova a kol., FEBS str. 145 až 149, 1993; Kuchler a kol., Eur. J. Biochem., 184, str. 249 až 254, 1989). Pomocí sekvencí cDNA je možno připravovat rekombinantní alergeny, které by mohly nalézt uplatnění v diagnostice a terapii alergií (Scheiner a Kraft, Aliergy 50, str. 384 až 391, 1995).
Podle vynálezu má zvláštní význam jako hlavní alergen antigen 5, jelikož se vynález příkladně zabývá touto molekulou. Jde při tom o neglýkolyžovaný protein o velikosti přibližně 25 kDa. Primární sekvence obsahuje 8 cystě i nových zbytků, což poukazuje na čtyři disulfidové můstky (Hoffman D.R., J. Aliergy Clin. Immunol. 92, str. 707 až 716, 1993). Klasické nasazení k účinnému terapeutickému ošetřování alergií na hmyzí jed představuje imunoterapie nebo hyposenzibi láce (MÍiller U.R., Insect, sting aliergy, nakladatelství Gustav Fischer 1990). Pří tom se pacientovi injektují subkutánně alergenové extrakty ve vzrůstajících dávkách. Při tomto způsobu však nicméně přetrvává nebezpečí alergických reakcí až k anafylakt ickému šoku. Jelikož právě v případě hyposenzibilácí způsobených píchnutím hmyzem je nutno počítat se silnými reakcemi, provádí se dosud výhradně stacionárně.
Optimalisace terapie by byla možná s rekombinantně vyrobenými alergeny obzvláště v případech alergií na píchnutí hmyzem. Definované kokteily, případně přizpůsobené k individuálním senzibilačním vzorům pacientů, vysoce čistých alergenů vyrobených rekombinantně (Scheiner a Kraft, 1995) by mohly nahradit extrakty alergenů z přírodních zdrojů. Reálné perspektivy, které by mohly vést k bezpečné hyposenzibi 1aci těmito rekombinantnimi alergeny nabízejí cíleně mutované rekombinantní alergeny, při kterých se vyloučí specificky Ig-epitopy aniž se poškodí epitopy T-buněk nezbytné pro terapii (Schramm a kol., J. Immunol. 162, str. 2406 až 2414, 1999). 0 heterologové expresi v E-coli je známo, že většina eukaryontových proteinů nezaujímá přirozená uspořádání nebo jen je zaujímá v nepatrné míře. Důsledkem těchto chybných vinutí je často nerozpustnost těchto proteinů. To lze pozorovat zejména u proteinů obsahujících cystein (Kuchler a kol., Eur. J. Biochem. 184, str. 249 až 254, 1989). Obzvláště o antigenu 5 se uvádí, že exprese v bakteriích vede k nerozpustným agregátům, které nemají přírodní uspořádání. (Monsalve a kol., Protein Express Purif. 16(3), str. 410 až 416, 1999). Takové nerozpustné agregáty se nehodí ani k diagnostice, ani k terapii.
Často se proteiny nerozpustné v E.coli pro výzkumné účele připravují v eukaryotickém expresním systému, jako jsou například kvasnice nebo hmyzí buňky (Monsalve a kol., Protein Express Purif. 16(3), str. 410 až 416, 1999; Soldátova a kol.. J. Allergy Clin. Immunol. 101, str. 691 až 698, 1998). Nedostatky eukaryotických expresních systémů představují však především možné hyperg1ykosy1ace (Grobe a kol., Eur. J. Biochem. 263, str. 33 aš 40, 1999) proteocyk1 ické odbourávací procesy a porovnatelně žádné výtěžky produktu (Glover a Hames (vydvatelé) Expression Systems, IRL Press, Oxford-New York-Tokyo, 1995). Pro alergologické použití ve smyslu farmaceuticky-medičínské diagnostiky a terapie se proto takové proteiny většinou nehodí.
• · · · • · · · · · · • · · · · · · · • ·· ··· · · • · · · · · · • · ·· ·· · · · ·
Podstatou vynálezu je rekombinantní hmyzový alergen mající sníženou IgE-reakti v i tu, případně alergenitu.
Podstata vynálezu
Jde tedy o rekombinantní hmyzový alergen se 1gE-reakti vi tou, případně alergenitou. Podle vynálezu alergen i ta těchto proteinů snížena až o 95 % ve s př í rodri í m i a 1 ergeny.
sn í ženou je tato srovnán í
Produktů získaných způsobem podle vynálezu, které mají přírodní uspořádání, je možno s výhodou použít v diagnostice alergických onemocnění in vitro a in vivo, speciálně alergie na píchnutí hmyzem. Tato s přírodou identická forma vinutí je k disposici pro detekci protilátek IgE v zavedeném způsobu.
Na druhé straně se mohou používat varianty připravené podle vynálezu, které se vyznačují v podstatě nereaktívní nebo jen částečně 1gE-reaktivní konformací, jako hypoalergenové složky v prostředcích ke specifické imunoterapií. Výrazem hypoal ergen se podle vynálezu rozumí snížená o 5 až 95 %, obzvláště o 20 až 85 % nebo až chybějící alergie (oproti přírodním alergenům), která je podmíněna sníženou odezvou na IgE.
Vynález se týká způsobu, při kterém mohou být vytvářeny rekombinantní alergeny v bakteriích (E.coli). Vysokým obohacením nerozpustných proteinových agregátů dochází k prvnímu stupni čištění. Tyto agregáty se pak bez přidání redukčních prostředků denaturujί. V závísloasti na následujících dialysníeh podmínkách se získají různé formy vinutí. Rozhodující je, že se při tom jedná o monomerní a rozpustné molekuly. Jedna rozpustná varianta vinutí má reaktivitu IgE porovnatelnou s přírodními alergeny a může se jí podle toho používat k diagnostickým účelům. Takový produkt se získá dialyzou roztoku obsahuj í c í ho cystě i n.
Jiné alternativní rozpustné varianty vinutí se strukturou liší od přírodních alergenů a vyznačují se sníženou nebo chybějící 1gE-reakti v i tou. Z toho důvodu jsou vhodné takové varianty k umožnění zlepšené imunoterapie. Jeden takový hypoalergenový produkt se získá podle vynálezu dialyzou s kyselými pufry, výhodně při hodnotou pH 3,5 az 6,5, obzvláště 4,0 aš 5,5.
Obzvláště se vynález týká odpovídajícího rekombinantního vosího alergenu, zvláště z Vespula vulgaris a Vespula germanica.
Způsob získávání v podstatě čistého rekombinantního hmyzího alergenu spočívá podle vynálezu v tom, že se vyrábějí alergenové proteiny v buňkách bakterií v nerozpustné formě jako inkluzní tělíska, nerozpustné agregáty se denaturují a denaturované produkty se převádějí dialyzou na rozpustné monomerní alergeny různého uspořádání vinutí a izolují se. Denaturace se provádí s výhodou guanidiumchloridem bez přísady redukčních prostředků.
Vynález se týká obzvláště způsobu získávání rekombinantních alergenů hmyzího jedu se sníženou alergenitou, popřípadě s 1gE-reakti v i tou, při které se používá k dialyse kyselého pufru, s výhodou natriumacetátového pufru s hodnotou pH 4,5 aš 5, 0.
Vynález se týká také způsobu získávání rekombinantních alergeriů hmyzího jedu se normální alergenitou, popřípadě s lgEreaktivitou, přičemž se používá k dialyze roztoků obsahujících cystě i n.
Vynález se rovněž toho týká rekombinantních alergenů vosího jedu, který lze získat popsaným způsobem.
Vynález se dále týká farmaceutického prostředku, který obsahuje odpovídající rekombinantní alergen se sníženou, po6 případě se zeslabenou IgE-reaktivitou i odpovídající pomocné látky a nosiče.
Konečně se vynález týká také použití alergenů hmyzích jedů, získatelných popsaným způsobem, k diagnóze in vivo a in vitro alergie na hmy2.
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.
Příklady provedení vynálezu
Klonuje se například alergen vosího jedu antigen 5 Vespula vulgaris (Ves v 5) a antigen 5 Vespula germanica (Ves g 5) do expresního vektoru pSE420 a transformuje se ve kmeni bakterií K- 12 Ml 5 pREP4. Průběžné schéma je na obr. 1.
Obr. 1 Průběžné schéma ke způsobu rňg5 = rekombinantní antigen 5
···· · · ·· • ·
K vyrobení rekombinantních alergenů se použije předkultury kmene k naočkování expresní kultury. K expresi indukované
IPTG dochází v baňce s přepážkami při teplotě 37 C v LB-prostředí a s omezeným zásobováním kyslíkem (90 otáček za minulu) . Bakterie se sklidí po 5-hodinové expresi odstředěním
O (5000xg, 10 min, 20 C) . K rozrušení bakterií dochází po resuspendování buněk v pufru (50 mM Tris/HCl, 25 % sacharózy, hodnota pH 8) (hmotnost/objem) přidáním lysozymu (10 jjg/g hmotnost za mokra). Následuje přísda stejného objemu detergenčního roztoku (0,2 M chloridu sodného, 1 % (hmotnost/objem)
DOC, 1 % (hmotnost/objem) Nonidetu P40). Tento roztok se zpracuje ultrazvukem (3 min na ledu, 130 W, 0,5 s impuls). Jelikož se produkty exprese vyskytují primárně jako nerozpustné agregáty (včleněná tělíska, inkluzní tělíska), dají se vzhledem
- s k jejich vysoké hustotě od velké části ostatních složek (například fragmentů buněčných stěn, ribosomů) oddělit odstředěním při 3000xg. Dalčí čištění probíhá trojím následným promytím roztoky obsahujícími detergent (í% Triton X-100). Následně se vyčištěná uzavřená tělíska zpracují přísadou denaturačního pufru ( 6M guanidinchlorid, 20 mM Tris/HCl, pH 3,0) a 2 hodiny se vytřepávají při teplotě místnosti.
K získání 1gE-reaktivních forenm vinutí se denaturační vsázka naplní do dialyzní hadice (hranice 12 až 14 kDa) a dialyzuje se proti 100-násobnému objemu cysteinového roztoku (5mM cystein) 12 hodin za míchání při teplotě místnosti. Následuje dialysa proti destilované vodě k odstranění cysteinu.
K získání konformace se sníženou IgE-reaktivitou se provede první dialysa proti 20 mM natriumacetátovému pufru (hodnota pH 5,0). Také probíhá další dialyza proti destilované vodě. Po vyjmutí se ve vodě rozpustné alergeny odstraní od vysrážených agregátů odstředěním. Supernatant obsahuje žádané rozpustné rekombinantní alergeny. Místo natriumacetátového pufru je možno k pufrovárií použít i jiných kyselých pufrů s hodnotou pH 3,5 až 6,5, s výhodou 4,0 až 5,5 k pufrování. Příklady takových pufrových systémů jsou popsány v literatuře.
Vysrážené rekombinatnί, alergeny získané oběma způsoby, mohou býL znovu denaturovány a zpracovány podle stejného schéma. Tím se výtěžek významně zvýší.
Po dialyzových operacích mají produkty přibližně 95% čistotu. Další čisticí operace zásaditých alergenů hmyzího jedu jsou katexová chromatografie (pufr pH 7,2) například s produktem Source S (Pharmacia, Freiburg, Německo) a gelová filtrace. Gelová filtrace slouží vedle oddělení vysokomolekulárních a ηízkomolekulárních minimálních znečištění také k odsolení.
Posouzení jakosti produktů spočívá na následujících charak9 • · · ······ ·· ··· · · • · · · · ··· • ·· ·· ·· ····
LerisLických v 1dsLnuaLech, které jsou pro antigen 5 sestaveny v tabulce (riAntigen = přírodní antigen.
| V1astnost | Vinutí s normální IgE-reakti v i tou | Vinutí se sníženou IgE-reakt i vi tou |
| App MW v SDS-PAGE ( neredukují c í podm i nky) | 25 kDa | 26-27 kDa |
| Koncentrace sol i k eIuc i v Source S | 320 mM NaCl | 400 mM NaCl |
| Rozštěpení prote- ázou V8 | 15 kDa fragment + pept i dy | peptidy > 10 kDa |
| Monoklonální protilátky specifické pro antigen 5 | detekce 8E3, 1E11 | detekce možná pouze s 8E3 |
| Frekvenční lgE- reakt i v i ta se séry alergiků | > 95 % | < 10 % |
| Potence alergenu | podobná nAntigenu | 5 >10x menší než nAg5 |
Způsob podle vynálezu je vhodný pro všechny druhy alergenů hmyzích jedů. Různé způsoby přípravy i rekombinantní klonování s technikami exprese jsou pracovníkům v oboru známy a dostupné a mohou být nahrazeny známými podobnými způsoby.
Průmyslová využitelnost alergeny pro výrobu farmaceuRekombínantní hmyzové zeslabené tických prostředků k ochraně vosami a včelami.
proti píchnutí hmyzem zvláště
Claims (13)
- Rekombinantní hmyzový alergen mající sníženou1gE-reaktivitu, případně alergen i tu.
- 2. Rekombinantní nou alergen i tou až o hmyzový alergen podle nároku 95 v porovnání s přírodními1 , se sn í še alergeny.
- 3. Rekombinantní vosí alergen podle nároku 1 nebo 2.
- 4. Rekombinantní hlavní alergen antigen 5 2 Vespula vulgar-is a Vespula germanica podle nároku 3.
- 5. Způsob získávání v podstatě čistého rekombinantního hmyz í ho alergenu, vyznačuj ící se tím, še se vyrábějí alergenové proteiny v buňkách bakterií v nerozpustné formě jako inkluzní tělíska, nerozpustné agregáty se denaturují a děnaLurované produkty se převádějí dialysou na rozpustné monomerní alergeny různé konformace vinutí a izolují se.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že denaturace se provádí guanidiniumchloridem bez přísady redukčních prostředků.
- 7. Způsob získávání rekombinantních alergenů hmyzího jedu se sníženou alergenitou, popřípadě 1gE-reakti v i tou podle nároku 5a 6, vyznačující se tím, še se k dialyze používá kyselého pufru.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se používá natriumacetátový pufr s hodnotou pH 4,5 až 5,0.
- 9. Způsob získávání rekombinantních alergenů s normální alergenitou, případně 1gE-reakti v i tou 5 nebo 6, v y s n a č u j í c í se tím, še hmyzího jedu podle nároku se k dialyse- 1 1 • * ·· ·· ·« • · · « b « · • ···· » » · ·· ·· · · · · · • · · · · · · • · «« ·« ···· používá roztoků obsahujících cystein.
- 10. Způsob podle nároku 5 až 9, vyznačuj ící se tím, še se používá alergenů druhu Vespula spec., obzvláště Vespula vulgaris a Vespula germanica, Parevespula spec a ňpis mellifera.
- 11. Rekombinantní alergeny vosího jedu získané způsobem podle nároku 7 nebo 8.
- 12. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, še obsahuje rekombinantní alergen podle nároku 1 až 4 nebo 11 a odpovídající pomocné látky a nosiče.
- 13. Použití alergenů hmyzího jedu získaných způsobem podle nároku 9 k diagnose in vitro alergií na hmyzí píchnutí.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19957904A DE19957904A1 (de) | 1999-12-01 | 1999-12-01 | Insektengift-Allergene mit verminderter IgE-Reaktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021874A3 true CZ20021874A3 (cs) | 2002-08-14 |
Family
ID=7931044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021874A CZ20021874A3 (cs) | 1999-12-01 | 2000-11-27 | Alergeny hmyzích jedů se sníľenou 1gE- reaktivitou a způsob jejich přípravy |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7285397B1 (cs) |
| EP (2) | EP1512694B2 (cs) |
| JP (2) | JP5597336B2 (cs) |
| CN (1) | CN1205223C (cs) |
| AT (2) | ATE339444T1 (cs) |
| AU (1) | AU783505B2 (cs) |
| CA (1) | CA2393975C (cs) |
| CZ (1) | CZ20021874A3 (cs) |
| DE (3) | DE19957904A1 (cs) |
| ES (2) | ES2271764T5 (cs) |
| HU (1) | HUP0401012A2 (cs) |
| PL (1) | PL201904B1 (cs) |
| PT (2) | PT1512694E (cs) |
| RU (1) | RU2264462C2 (cs) |
| WO (1) | WO2001040266A2 (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19957904A1 (de) † | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Merck Patent Gmbh | Insektengift-Allergene mit verminderter IgE-Reaktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| JPWO2011033588A1 (ja) * | 2009-09-18 | 2013-02-07 | 株式会社アドバンテスト | 試験装置および試験方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2838800B2 (ja) * | 1989-09-02 | 1998-12-16 | 株式会社林原生物化学研究所 | 減感作剤 |
| DE4139000A1 (de) * | 1991-11-27 | 1993-06-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf |
| CA2148713A1 (en) * | 1992-11-12 | 1994-05-26 | Mei-Chang Kuo | Allergenic proteins and peptides from japanese cedar pollen |
| JP3578787B2 (ja) * | 1993-05-14 | 2004-10-20 | ラホヤ インスティチュート フォア アレルギー アンド イムノロジー | 生物学的に活性なポリペプチドの組換え製造方法 |
| US5804201A (en) * | 1996-03-11 | 1998-09-08 | The Rockefeller University | Immunomodulatory peptides of vespid antigen 5 |
| AU714318B2 (en) * | 1996-06-11 | 2000-01-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Process for the activation of denatured protein |
| EP1007648A4 (en) * | 1996-12-20 | 2003-01-15 | Lilly Co Eli | ANTI-OBESITY PROTEINS |
| DE19957904A1 (de) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Merck Patent Gmbh | Insektengift-Allergene mit verminderter IgE-Reaktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
-
1999
- 1999-12-01 DE DE19957904A patent/DE19957904A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-11-27 DE DE50013480T patent/DE50013480D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 RU RU2002117424/13A patent/RU2264462C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-11-27 JP JP2001541021A patent/JP5597336B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 ES ES04027711T patent/ES2271764T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 CZ CZ20021874A patent/CZ20021874A3/cs unknown
- 2000-11-27 CN CNB008165343A patent/CN1205223C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 EP EP04027711A patent/EP1512694B2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 WO PCT/EP2000/011776 patent/WO2001040266A2/de active IP Right Grant
- 2000-11-27 PT PT04027711T patent/PT1512694E/pt unknown
- 2000-11-27 US US10/148,565 patent/US7285397B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 PT PT00987296T patent/PT1233984E/pt unknown
- 2000-11-27 AT AT04027711T patent/ATE339444T1/de active
- 2000-11-27 PL PL355166A patent/PL201904B1/pl unknown
- 2000-11-27 AT AT00987296T patent/ATE283284T1/de active
- 2000-11-27 AU AU23594/01A patent/AU783505B2/en not_active Ceased
- 2000-11-27 HU HU0401012A patent/HUP0401012A2/hu unknown
- 2000-11-27 CA CA2393975A patent/CA2393975C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-27 ES ES00987296T patent/ES2232518T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 EP EP00987296A patent/EP1233984B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-27 DE DE50008782T patent/DE50008782D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-08-09 US US11/889,108 patent/US8048424B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-09-30 JP JP2011216515A patent/JP5265745B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT1512694E (pt) | 2007-01-31 |
| RU2264462C2 (ru) | 2005-11-20 |
| US8048424B2 (en) | 2011-11-01 |
| PL355166A1 (en) | 2004-04-05 |
| CN1451015A (zh) | 2003-10-22 |
| CN1205223C (zh) | 2005-06-08 |
| EP1233984B1 (de) | 2004-11-24 |
| ES2271764T5 (es) | 2011-02-28 |
| ES2271764T3 (es) | 2007-04-16 |
| DE50008782D1 (de) | 2004-12-30 |
| WO2001040266A2 (de) | 2001-06-07 |
| US20070280884A1 (en) | 2007-12-06 |
| ATE339444T1 (de) | 2006-10-15 |
| CA2393975C (en) | 2012-06-19 |
| CA2393975A1 (en) | 2001-06-07 |
| AU2359401A (en) | 2001-06-12 |
| ATE283284T1 (de) | 2004-12-15 |
| EP1233984A2 (de) | 2002-08-28 |
| AU783505B2 (en) | 2005-11-03 |
| DE50013480D1 (de) | 2006-10-26 |
| ES2232518T3 (es) | 2005-06-01 |
| PL201904B1 (pl) | 2009-05-29 |
| EP1512694A1 (de) | 2005-03-09 |
| EP1512694B2 (de) | 2010-11-03 |
| JP5597336B2 (ja) | 2014-10-01 |
| DE19957904A1 (de) | 2001-06-07 |
| JP2004525601A (ja) | 2004-08-26 |
| JP5265745B2 (ja) | 2013-08-14 |
| HUP0401012A2 (hu) | 2004-08-30 |
| JP2012087119A (ja) | 2012-05-10 |
| US7285397B1 (en) | 2007-10-23 |
| PT1233984E (pt) | 2005-04-29 |
| WO2001040266A3 (de) | 2002-02-28 |
| EP1512694B1 (de) | 2006-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5270150B2 (ja) | 細菌感染の治療 | |
| Pazgier et al. | Human defensins: synthesis and structural properties | |
| JP5390742B2 (ja) | アレルゲンペプチド断片を含む組成物 | |
| JP2006520380A5 (cs) | ||
| Uversky et al. | Multifunctionality and intrinsic disorder of royal jelly proteome | |
| CZ20021874A3 (cs) | Alergeny hmyzích jedů se sníľenou 1gE- reaktivitou a způsob jejich přípravy | |
| JP4763259B2 (ja) | 魚パルブアルブミンに基づく低アレルギー誘発性ポリペプチド | |
| JP2001186887A (ja) | サソリ毒由来の抗菌ペプチド | |
| BRPI0313613B1 (pt) | variantes do principal alérgeno phl p 1 de capim-timóteo, suas formas de enovelamento lm e hm, seus usos e seus processos de preparação e de purificação, molécula de dna, vetor de expressão de dna recombinante e seu uso, e composições farmacêuticas | |
| US20140121356A1 (en) | Hypoallergenic mutant polypeptides based on fish parvalbumin | |
| Maji | Amyloid: a natural nanomaterial | |
| JP4188897B2 (ja) | ウィルス感染・増殖抑制剤 | |
| Pulido-Gomez | Expanding the scope of the Ribonuclease A superfamily in the host immune defense system: Structural determinants of human RNases involved in antimicrobial host defense |