JP5265745B2 - ＩｇＥ反応性の低減した昆虫毒アレルゲンおよびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、製造方法の効率に応じて天然と同一または天然と反対の折りたたみ構造（コンフォメーション）による分化が可能な組換え昆虫毒アレルゲンおよびこれをターゲットとするその製造方法に関する。

アレルギー患者、特に昆虫毒アレルギー患者の単一アレルゲン分化診断法(インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）)では、天然分子に対応する折りたたみ形が用いられる。

天然と反対の折りたたみ形は特定の免疫的治療のために副作用の少ない薬剤として用いることができる。したがってこれらの組換え折りたたみ変異体によれば天然品よりも安全な治療が行える。本発明の方法は生物工学的な製造が医薬品に必要な条件（ＧＭＰ）下に行えるように設計されている。

昆虫刺毒アレルギーは主としてスズメバチやミツバチによって引き起こされ、重大な全身症状あるいは場合によっては致命的なアナフィラキシーをもたらすこともある（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．Ｒ．：Ｉｎｓｅｃｔ ｓｔｉｎｇ ａｌｌｅｒｇｙ、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；１９９０）。タイプ１のアレルギーを誘発する物質は、昆虫毒のタンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。これらのアレルゲンは注入後、感作された人間においてマスト細胞表面に結合したＩｇＥ分子と反応する。このタイプのＦ_ＣεＲＩ結合ＩｇＥ分子がアレルゲンによって互いに架橋すると、結果としてエフェクター細胞の働きによりメディエーター（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン）やサイトカインが放出されこれらに対応した臨床症状が発生する。

ペプチドであるメリチンに加え酵素のヒアルロニダーゼおよびホスホリパーゼＡ２がミツバチ毒のアレルゲン性成分として働く（Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ．、１９７２、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７７、３１４−３２２）。スズメバチの場合も同様に、主要な酵素的に活性なアレルゲンはハチ毒におけるものと類似したヒアルロニダーゼ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｄ．Ｒ．、１９８６、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８、３３７−３４３）およびホスホリパーゼＡ１である。スズメバチ毒の最も重要な主要アレルゲンは抗原５であり、これは現在までのところ酵素活性は検出されていない（Ｋｉｎｇ他、１９７８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７、５１６５−５１７４）。これらのアレルゲンはすべて分子生物学的に同定されており、対応するｃＤＮＡ分子はクローン化されている（特に、Ｆａｎｇ他、１９８８、ＰＮＡＳ、８９５−８９９；Ｓｏｌｄａｔｏｖａ他、１９９３、ＦＥＢＳ、１４５−１４９；Ｋｕｃｈｌｅｒ他、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４、２４９−２５４）。ｃＤＮＡ配列を利用するとアレルギーの診断および治療に用い得る組換えアレルゲンを製造することが可能である（ＳｃｈｅｉｎｅｒおよびＫｒａｆｔ、１９９５、Ａｌｌｅｒｇｙ ５０、３８４−３９１、非特許文献１）。

本発明との関係では主要なアレルゲンである抗原５が特に重要である。なぜなら本発明はこの分子を例として用いているからである。これは約２５ｋＤａの大きさの非グリコシル化タンパク質である。一次配列は８つのシステイン残基を含むが、これは４個のジスルフィド架橋部があることを示すものである（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｄ．Ｒ．、１９９３、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２：７０７−７１６）。昆虫毒アレルギーを効果的に治療するための古典的アプローチは特定の免疫療法すなわち減感作療法である（Ｍｕｌｌｅｒ， Ｕ．Ｒ．：Ｉｎｓｅｃｔ ｓｔｉｎｇ ａｌｌｅｒｇｙ、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；１９９０）。この方法では投与量を増大させつつ天然アレルゲン抽出物を患者に皮下注射する。

しかしながら、この方法はアレルギー反応、場合によってはアナフィラキシーショックを起こすリスクを伴う。昆虫刺毒の減感作療法は特に強い反応が予想され得るため、治療は現在入院治療に限って行われる。

組換え法により製造されたアレルゲンを用いた治療の最適化は特に昆虫刺毒アレルギーの場合に可能でありうる。組換え法により製造された高純度アレルゲンの、場合によっては患者の個人感作パターンに適合する、決められた多剤混合物（ＳｃｈｅｉｎｅｒおよびＫｒａｆｔ、１９９５）を天然アレルゲン起源の抽出物に代えて用い得る。治療に不可欠なＴ細胞エピトープを損なうことなくＩｇＥエピトープを削除した慎重に変異された組換えアレルゲン（Ｓｃｈｒａｍｍ他、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２、２４０６−２４１４、非特許文献２）によって、このタイプの組換えアレルゲンを用いたより安全な減感作療法をもたらし得る現実的な展望が得られる。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の異種発現から、ほとんどの真核生物タンパク質は「天然の」コンフォメーションを取らず、取ったとしてもわずかであることが知られている。この不正確な折りたたみの結果、これらのタンパク質は多くの場合不溶性である。これは特にシステイン含有タンパク質において観察されている（Ｋｕｃｈｌｅｒ他、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４、２４９−２５４）。特に抗原５は細菌中での発現において天然のコンフォメーションをとらない不溶性凝集体を生じることが報告されている（Ｍｏｎｓａｌｖｅ他、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ．１６（３）：４１０−４１６）。このタイプの不溶性凝集体は診断や治療には用いることができない。

大腸菌に不溶のタンパク質は研究目的では真核生物の発現システム（例えば酵母または昆虫細胞）でしばしば製造されている（Ｍｏｎｓａｌｖｅ他、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ １６（３）：４１０−４１６；Ｓｏｌｄａｔｏｖａ他、１９９８、 Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０１：６９１−６９８）。しかし、真核生物発現システムの不利な点は、特にハイパーグリコシル化が起こり得る点（Ｇｒｏｂｅ他、１９９９、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６３：３３−４０）、タンパク質分解プロセスおよび収量が比較的少ない点（ＧｌｏｖｅｒおよびＨａｍｅｓ（編集）、１９９５、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｔｏｋｙｏ）である。したがってこのタイプのタンパク質は、通常、医薬的な診断および治療という意味ではアレルギー学的用法に適さない。

ＳｃｈｅｉｎｅｒおよびＫｒａｆｔ、１９９５、Ａｌｌｅｒｇｙ ５０、３８４−３９１ Ｓｃｈｒａｍｍ他、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２、２４０６−２４１４

本発明の方法による天然のコンフォメーションを有する生成物は、アレルギー疾患、特に昆虫刺毒のインビトロまたはインビボでの診断に有利に用いることができる。この天然と同一の折りたたみ形は確立された方法によりＩｇＥ抗体の検出に利用できる。

一方、本発明により得られ、実質的にＩｇＥ反応性コンフォメーションを有さずまたは部分的にしか有しないものとして区別される変種は、特定の免疫療法製剤の低アレルギー性成分として用いることができる。これまでのおよび以下の記述において、「低アレルギー性」という用語は、本発明に従い、ＩｇＥ反応性が低減したことによりアレルギー性が（天然アレルゲンと比較して）好ましくは５〜９５％、より好ましくは２０〜８５％低減しまたはなくなっているという意味である。

本発明は組換えアレルゲンがバクテリア（大腸菌）中で製造できる方法である。第１の精製ステップは不溶性凝集タンパク質を相当に富化することによって行う。次いでこれらの不溶性凝集物を還元剤の添加なしに変性する。これに続く透析条件に応じて異なる折りたたみ形が得られる。これらの分子はモノマーで可溶性であることが重要である。第１の可溶性折りたたみ変種は天然アレルゲンに匹敵するＩｇＥ反応性を有し、したがって診断目的に用いることができる。このタイプの生成物はシステイン含有溶液を用いた透析により得られる。

他方の可溶性折りたたみ変異体は天然のアレルゲンとは構造が異なっており、ＩｇＥ反応性が低いまたはないという点で区別される。この理由でこのタイプの変種はより容易に実施できるように改良された免疫療法に適している。このタイプの低アレルギー性生成物は、本発明に従い、酸性緩衝液により好ましくはｐＨ３．５〜６．５、より好ましくはｐＨ４．０〜５．５の範囲での透析で得ることができる。

実施例の方法のフローチャートである。

本発明はＩｇＥ反応性またはアレルゲン性が低減されたことを特徴とする組換え昆虫アレルゲンに関する。本発明によればこれらのタンパク質のアレルゲン性は天然のアレルゲンと比較して９５％まで低減される。

特に本発明は、対応する組換えスズメバチ昆虫アレルゲン、特にＶｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓおよびＶｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａに由来するものに関する。

本発明はさらに、細菌細胞中でアレルゲンタンパク質を封入体として不溶なかたちで製造し、前記不溶凝集物を変性し、この変性生成物を透析によって別の折りたたみコンフォメーションを有する可溶な単量体アレルゲン変換して単離することを特徴とする実質的に純粋な組換え昆虫毒アレルゲンを単離する方法に関する。この変性は好ましくは還元剤を添加せずに塩化グアジニウムを用いて行われる。

本発明は特に、前記の透析を緩衝液、好ましくは酸性緩衝液ｐＨ４．５〜５．０の酢酸ナトリウム緩衝液を用いて行うアレルゲン性またはＩｇＥ反応性が低減された組換え昆虫毒アレルゲンの単離方法に関する。

しかしながら、本発明はまた前記の透析をシステイン含有溶液を用いて行う、通常のアレルゲン性またはＩｇＥ反応性を有する組換え昆虫毒アレルゲンの単離方法にも関係する。

本発明はまた上述のおよび下記の対応する方法によって得られる組換えスズメバチ毒アレルゲンに関する。

本発明はさらにＩｇＥ反応性が低減されたまたは消失した対応する組換えアレルゲンおよび対応するアジュバントおよび賦形剤を含む医薬調剤に関する。

最後に、本発明は上述のまたは下記の対応する方法によって得られる昆虫毒アレルゲンのインビボおよびインビトロでの昆虫刺毒アレルギー診断のための使用に関する。

本発明の方法を以下さらに詳細に説明する。

実施例としてＶｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓに由来するスズメバチ毒アレルゲン抗原５（Ｖｅｓ ｖ５）およびＶｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａに由来する抗原５（Ｖｅｓ ｇ５）を発現ベクターｐＳＥ４２０にクローン化し、Ｋ１２細菌株Ｍ１５ｐＲＥＰ４内に形質転換した。この方法のフローチャートを図１に示す。

発現培養物の接種のために株の前培養を用いて組換えアレルゲンを製造する。発現はＩＰＴＧによって誘導され、シカンフラスコ中ＬＢ培地において３７℃、酸素供給制限条件（９０ｒｐｍ／分）で行う。５時間発現させた後、細菌を遠心分離（５０００×ｇ、１０分、２０℃）で回収する。細胞をリゾチーム添加（１０μｇ／ｇ、湿潤重量）により緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２５％（ｗ／ｖ）ショ糖、ｐＨ８．０）に細胞を再分散させた後、細菌の消化を行う。続いて界面活性剤溶液（０．２Ｍ ＮａＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ＤＯＣ、１％（ｗ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０）を等量添加する。次いでこの界面活性剤溶液を超音波（氷上３分間、１３０ワット、０．５秒パルス）で処理する。発現生成物は主として不溶性凝集物（封入体）のかたちで存在するため、これらが高密度であることから、遠心分離（３０００×ｇ）により残りの部分（細胞壁断片、リボゾームなど）の大部分から分離することができる。界面活性剤を含む溶液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）による洗浄を３回連続することによりさらなる精製を行う。次いで、精製された封入体を変性緩衝液（６Ｍ塩化グアジニウム、２０ｍＭ ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）の添加および室温で２時間振盪することにより消化する。

ＩｇＥ反応性折りたたみ形を得るためには、変性バッチを透析チューブ（消化限界１２〜１４ｋＤａ）に導入し、室温で撹拌しながら１２時間、システイン溶液（５ｍＭシステイン）の１００倍量に対して透析する。その後システインを除くためにこれを蒸留水に対して透析する。

ＩｇＥ反応性が低減されたコンフォメーションを得るためには最初の透析を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に対して行う。ここでも蒸留水に対してさらなる透析を行う。除去後水溶性アレルゲンを遠心分離により沈殿凝集物から分離する。上清は所望の可溶性組換えアレルゲンを含む。酢酸ナトリウム緩衝液の代わりに３．５〜６．５、好ましくは４．０〜５．５の緩衝能を有する他の酸性緩衝液を用いることも可能である。このタイプの緩衝系の例は文献に適宜記載されている。

いずれの方法でも沈殿した組換えアレルゲン生成物は同様なスキームに従ってさらに変性、処理することができる。これにより収量が顕著に増加する。

透析ステップ後生成物の純度は９５％である。塩基性昆虫毒アレルゲンのさらなる精製ステップは、例えば、Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ（ドイツ国フライブルク所在のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いた陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過により行う。ゲルろ過は高分子量および低分子量の微少量の不純物除去に加えて脱塩にも有効である。

生成物の品質管理は以下の特徴に基づいて行う。これは抗原５に対して表にまとめてある。表中ｎ抗原は天然抗原の意味である。

本発明による方法はすべての種類の昆虫毒アレルゲンに適している。用いた精製技術および組換えクローンおよびクローン発現技術は当業者に公知であり利用可能なものであって、さらに同様の公知の方法で置き換えることができる。

Claims (12)

1. 天然アレルゲンと比較してＩｇＥ反応性の低減した、細菌中で組換えにより調製され、蒸留水に可溶である、Ｖｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓまたはＶｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａｓに由来する可溶性スズメバチ毒アレルゲン抗原５であって、
   該抗原は、封入体として不溶の形で細菌細胞中で発現し、
   該封入体は、還元剤を加えることなく変性し、
   該変性により得られた変性体を、還元剤を含まない酸性緩衝液を用いて透析することにより、可溶な単量体アレルゲンとし、および
   蒸留水に対して更なる透析を行う、
   工程により得られることを特徴とする、スズメバチ毒アレルゲン抗原５。
2. 前記変性が塩化グアニジニウムを用いて行われる、請求項１に記載のスズメバチ毒アレルゲン抗原５。
3. 前記透析がｐＨ３．５から６．５の間の緩衝液で行われる、請求項１または２に記載のスズメバチ毒アレルゲン抗原５。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のスズメバチ毒アレルゲン抗原５、対応するアジュバント、および賦形剤を含む医薬組成物。
5. 特定の免疫療法又は減感作療法のための、請求項１から３のいずれかに記載のスズメバチ毒アレルゲン抗原５の使用。
6. 天然アレルゲンに匹敵するＩｇＥ反応性を有し、細菌中で組換えにより調製され、蒸留水に可溶である、Ｖｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓまたはＶｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａｓに由来する可溶性スズメバチ毒アレルゲン抗原５であって、
   該抗原は、封入体として不溶の形で細菌細胞中で発現し、
   該封入体は、還元剤を加えることなく変性し、
   該変性により得られた変性体を、システイン含有溶液を用いて透析することにより、可溶な単量体アレルゲンとし、および
   蒸留水に対して更なる透析を行う、
   工程により得られることを特徴とする、スズメバチ毒アレルゲン抗原５。
7. 請求項６に記載のスズメバチ毒アレルゲン抗原５を使用して、該抗原に特異的に刺激されるＴ細胞をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で検出する方法。
8. 天然アレルゲンと比較してＩｇＥ反応性の低減した、蒸留水に可溶であるＶｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓまたはＶｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａｓに由来する可溶性スズメバチ毒アレルゲン抗原５の調製方法であって、
   アレルゲンタンパク質を封入体として不溶の形で細菌細胞中で発現し、
   得られた不溶凝集物を還元剤を加えることなく変性し、
   該変性により得られた変性体を、酸性緩衝液を用いて透析することにより、可溶な単量体アレルゲンとし、および
   蒸留水を用いてさらなる透析を行う、
   ことを特徴とする調製方法。
9. 前記変性が塩化グアニジニウムを用いて行われる、請求項８に記載の調製方法。
10. 前記透析が、ｐＨ３．５から６．５の間の緩衝液で行われる、請求項８または９に記載の調製方法。
11. 天然アレルゲンに匹敵するＩｇＥ反応性を有する、蒸留水に可溶であるＶｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓまたはＶｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａｓに由来する可溶性スズメバチ毒アレルゲン抗原５の調製方法であって、
    アレルゲンタンパク質を封入体として不溶の形で細菌細胞中で発現し、
    得られた不溶凝集物を還元剤を加えることなく変性し、
    該変性により得られた変性体を、システイン含有溶液を用いて透析することにより、可溶な単量体アレルゲンとし、および
    蒸留水を用いてさらなる透析を行う、
    ことを特徴とする調製方法。
12. 前記変性が塩化グアニジニウムを用いて行われる、請求項１１に記載の方法。

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