MXPA02006650A - Metodo para preparar un polipeptido soluble en un solvente acuoso en ausencia de detergente. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo novedoso para preparar un polipeptido soluble en un solvente acuoso en ausencia de detergente, y polipeptidos obtenibles por dicho metodo; la invencion tambien se refiere al-uso de dichos polipeptidos, en particular para preparar medicinas o vacunas, para combatir infecciones bacterianas o virales o canceres.

Description

MÉTODO PARA PREPARAR UN POLIPEPTIPO SOLUBLE EN UN SOLVENTE ACUOSO EN AUSENCIA DE DETERGENTE MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a un método novedoso para preparar un polipéptido soluble en un solvente acuoso en ausencia de detergente, y también a polipéptidos que se pueden obtener usando el método de confopnidad con la invención. La invención también se refiere al uso de dichos polipéptidos, en particular para preparar productos medicinales o vacunas, diseñados para combatir infecciones bacterianas o virales particulares o cánceres. Los métodos para preparar proteínas, en particular cuando son de naturaleza hidrófoba o cuando se producen en particular por recombinación genética en los cuerpos de inclusión de células transformadas, por lo general requieren la adición de detergente durante los pasos de extracción, purificación o renaturalización, a fin de obtener una proteína soluble en solvente acuoso. Se puede mencionar, por ejemplo, las patentes norteamericanas E.U.A. 5,846,751 y E.U.A. 5,814,455, que describen un método para preparar antígenos para diagnóstico, derivados de Helicobacter pylori, usando un método que comprende un paso para solubilizar células de H. pylori en presencia de detergente, seguido por un paso de cromatografía de exclusión de tamaño (tamiz molecular) las fracciones de masa molecular menores que 300 000 Da que presentan actividad de ureasa disminuida siendo escogidas después del análisis de todas las fracciones obtenidas por electroforesis de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, y también la solicitud de patente europea EP 0 334 278, que describe un método para purificar proteína de Micoplasma Pne?moniae que no comprende un paso de solubilización en presencia de un agente desnatural izador. También se hace mención, por ejemplo, del método para preparar la proteína recombinante de Klebsiella pneumoniae OmpA, denominada rP40, descrita en las solicitudes de patente internacional WO 95/27787 o WO 96/14451 y en las solicitudes de patente francesas FR 98/14007 y FR 99/01917. Para estos métodos, la solución final de proteína recomblnante renaturalizada y purificada obtenida contenía 0.1% de detergente zwiteriónico a fin de asegurar la solubilidad de la proteína. Sin embargo, cuando dichas proteínas están diseñadas, en particular, para ser inyectadas in vivo, la presencia de estos detergentes es potencialmente tóxica (riesgos de necrosis, etc.). Además, dichos métodos para preparar proteínas, en particular proteínas recombinantes, que requieren la adición de detergente a fin de incrementar su solubilidad en solvente acuoso, confieren sobre estas proteínas una estructura terciaria que, dependiendo de la naturaleza de la proteína preparada, no es la estructura terciaria la que hace posible obtener la mejor actividad para esta proteína, como se demuestra más adelante en los ejemplos. Por lo tanto, existe hoy la necesidad de un método para preparar proteína que haga posible obtener una proteína soluble en solvente acuoso, en particular después de la renaturalización, en ausencia de detergente, o en presencia de una cantidad insignificante y, donde esa propiedad, que tiene una estructura terciaria diferente de aquella obtenida usando un método para preparar proteína que requiere la presencia final de detergente a fin de incrementar la solubilidad de la misma en solvente acuoso, dicha estructura terciaria diferente haciendo posible que obtenga mejor actividad. Este es precisamente el tema de la presente invención. La presente invención se refiere a un método para preparar una solución purificada de polipéptido soluble en solvente acuoso en ausencia de detergente, a partir de una solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) remover dicho detergente de la solución purificada que contiene un detergente; b) solubilizar el polipéptido obtenido en el paso a) en una solución que contiene un agente desnaturalizador; c) eluir en medio acuoso el polipéptido solubilizado en el paso b), mediante tamizado molecular sobre una columna de cromatografía; El término "polipéptido" también pretende denotar un péptido o una proteína, estos tres términos siendo usados de manera indiferente en la presente descripción.

Sorprendentemente, los inventores han mostrado que el método de preparación novedoso de acuerdo con la invención usando un paso de cromatografía de tamizado molecular en agua hace posible obtener una proteína renaturalizada, en particular una proteína de membrana recombinante, soluble en agua en ausencia de algún detergente, en particular potencialmente tóxico cuando se inyecta in vivo. El polipéptido contenido en dicha solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente se puede escoger de los polipéptidos purificados a partir de una muestra biológica que contiene dicho polipéptido, en particular de cultivos de microorganismos o de células que pueden o no ser transformadas, o de una solución obtenida durante la síntesis del péptido. Entre los polipéptidos purificados a partir de cultivos de microorganismos o de células que pueden o no ser transformadas, se da preferencia en particular a aquellos, purificados en presencia de detergente, que se han derivado la membrana, en particular las proteínas Omp localizadas en la membrana exterior de las bacterias (Omp para proteína de membrana externa), tal como P40 natural (Omp tipo A) de Klebsiella pneumoniae. Cuando dicho polipéptido es un polipéptido producido por síntesis química, se da preferencia a los polipéptidos que presentan fuerte homología con las proteínas de membrana externa de bacterias gramnegativas, en particular los polipéptidos cuya secuencia forma láminas ß que son de naturaleza hidrófoba. El método de conformidad con la invención se caracteriza preferiblemente porque dicho polipéptido purificado contenido en la solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente es un polipéptido hidrófobo (o polipéptido que es de naturaleza hidrófoba). El término "polipéptido hidrófobo" (o polipéptido que es de naturaleza hidrófoba)" pretende denotar un polipéptido cuya secuencia comprende uno o más dominios hidrófobos. Dichos dominios hidrófobos pueden, por ejemplo, determinarse usando el algoritmo de Kyte y Doolittle (J.

Mol. Biol.., 157, 105-132, 1982). El término "proteína hidrófoba" preferiblemente denota aquí un polipéptido cuya forma nativa o recombinante o cuya forma obtenida después de síntesis química, u otra forma renaturalizada, no es soluble en solvente acuoso (tal como agua o en solución salina), o no es soluble en solvente acuoso en una cantidad suficiente para usarse en particular en composiciones farmacéuticas en ausencia de detergente. Muy preferiblemente, el término "proteína hidrófoba" denota aquí un polipéptido soluble en solvente acuoso en presencia de un detergente o de agente desnaturalizador, tal como urea o clorhidrato de guanidina, dicha proteína hidrófoba siendo insoluble o insuficientemente soluble en solvente acuoso en ausencia de detergente. El término "renaturalizada" denota un polipéptido que tiene propiedades biológicas similares al polipéptido nativo, es decir, puede disminuir, ser igual o amplificarse, pero diferente de estas consideraciones de escala, las consecuencias de añadir un polipéptido u otro a una muestra biológica son similares. De esta manera, se entenderá que las estructuras terciarias del polipéptido renatural izado de acuerdo con la definición y del polipéptido nativo pueden ser diferentes. En una modalidad preferida, la invención comprende un método de conformidad con la invención, caracterizado porque dicho polipéptido purificado contenido en la solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente es un polipéptido recombinante. En una modalidad preferida, dicho polipéptido recombinante se escoge a partir de los polipéptidos recombinantes cuya forma nativa es de naturaleza hidrófoba, que son insolubles en solvente acuoso, o para los cuales la invención va a incrementar la solubilidad en solvente acuoso, y/o de los polipéptidos recombinantes producidos en cuerpos de inclusión citoplásmicos de la célula hospedero transformada. En una modalidad preferida, la invención comprende un método de acuerdo con la invención, caracterizado porque dicho polipéptido purificado contenido en dicha solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente es un polipéptido cuya estructura terciaria es el tipo de lámina ß, ésta siendo una estructura terciaria correspondiente en particular a la forma de la proteína nativa y/o a la forma de la proteína recombinante, en donde es apropiado después de la renaturalización. En una modalidad también preferida, dicho polipéptido recombinante se escoge a partir de los polipéptidos recombinantes cuya estructura terciaria de la forma nativa es de tipo de lámina ß.

El paso a) para remover el detergente, del método de conformidad con la presente invención, se puede llevar a cabo por precipitación, en particular mediante adición de alcohol orgánico, pero también por diálisis o por filtración de gel en alcohol orgánico. El paso b) para solubilizar el polipéptido obtenido en el paso a) del método de conformidad con la presente invención se puede llevar a cabo recogiendo el precipitado, en particular, con un agente desnaturalizador, pero también por diálisis o por filtración de gel en estos agentes desnaturalizadores, tales como urea o clorhidrato de guanidina. La invención preferiblemente comprende un método de conformidad con la presente invención, caracterizado porque el paso a) para remover el detergente de dicha solución purificada se lleva a cabo precipitando el polipéptido en presencia de un alcohol orgánico, preferiblemente etanol. La invención preferiblemente también comprende un método de acuerdo con la invención, caracterizado porque el agente desnaturalizador usado en el paso b) es urea o clorhidrato de guanidina. En una modalidad igualmente preferida, la invención comprende un método de acuerdo con la invención, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido recombinante consiste de la secuencia completa o parcial de una proteína de membrana exterior de las bacterias, preferiblemente de las bacterias gran-negativas. La expresión "secuencia completa o parcial" significa la secuencia completa o parte de la secuencia que hace posible obtener la misma actividad biológica o una actividad biológica similar a aquella obtenida con el polipéptido codificado por la secuencia completa. Por lo tanto, puede ser posible imaginar una secuencia de polipéptido en la cual la secuencia de señal ha sido suprimida, o una secuencia de polipéptidos que consiste de varias secuencias, colocadas lado a lado, que pueden o no tener actividad biológica y que no están diseñadas concomitantemente en la proteína nativa. En una modalidad aún más preferida, la invención comprende un método de conformidad con la invención, caracterizado porque dicho polipéptido es la proteína OmpA de Klebsiella pneumoniae de secuencia SEQ ID No. 2 o una proteína cuya secuencia tiene el porcentaje de identidad de por io menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2. Para los propósitos de la presente invención, el término "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos denota un porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias para ser comparados, obtenidos después de la mejor alineación, este porcentaje siendo puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias siendo distribuidas aleatoriamente y en toda su longitud. La mejor alineación o la alineación óptima es aquella por la cual el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que van a ser comparadas, determinadas más adelante, es mayor. Las comparaciones de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo de manera convencional comparando estas secuencias después de haberlas alineado en forma óptima, dicha comparación llevadas a cabo por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para que pueda producirse la comparación, además de hacerlo en forma manual, usando algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], usando el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol.. 48:443], usando el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444], usando programas de computadora que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl o BLASTP). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas en forma óptima, la secuencia de aminoácidos que va a ser comparada posiblemente comparando adiciones o deleciones relacionadas con la secuencia de referencia para obtener alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el residuo de aminoácidos es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas entre el número total de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. El programa BLAST es usado convenientemente por los inventores y los expertos en la técnica para comparar y determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos. Los parámetros tales como el "costo de espacio" y la matriz de sustitución son seleccionados directamente por el programa como una función de la longitud de las secuencias que van a ser comparadas. Por ejemplo, se pueden usar las "secuencias BLAST 2" del programa BLAST, que está disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/-gorf/bl2.htlm. los parámetros usados siendo aquellos dados por omisión (en particular para los parámetros "sanción de espacio abierto": 5 y "sanción de espacio de extensión": 2; ia matriz escogida siendo, por ejemplo, la matriz BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que van a ser comparadas siendo calculado directamente por el programa. La invención también comprende un método de acuerdo con la invención, para modificar la estructura terciaria de una proteína recombinante hidrófoba, preferiblemente para modificar una estructura terciaria del tipo de lámina ß a ia estructura terciaria del tipo de hélice a. También sorprendentemente, los inventores han demostrado que la proteína recombinante obtenida de acuerdo con el método de preparación de acuerdo con la invención conserva las propiedades biológicas de la proteína rP40 purificada como se describe en la solicitud de patente internacional WO 95/27787 o WO 96/14415, e incluso presenta ciertas actividades biológicas que son amplificadas. La proteína P40 recombinante obtenida de acuerdo con el método de preparación de conformidad con la invención (denominada rP40s, "s" para soluble) está en forma estable, con hélices a, y es hidrófoba, un resultado inesperado ya que la proteína nativa es hidrófoba y presenta una estructura de lámina ß. Sin embargo, como lo demostrarán los ejemplos, las dos proteínas tienen actividad biológica similar, la actividad de la proteína obtenida de acuerdo con el método de conformidad con la invención siendo aún mayor que aquella observada para la proteína nativa, esto posiblemente se debe al hecho de que el método de conformidad con la invención hace posible obtener una proteína que tiene una estructura terciaria novedosa que generalmente no se observa y, en particular, que no existe en forma natural. Esta protema que tiene dichas propiedades por lo tanto también es uno de los temas de la invención. De esta manera, la invención comprende los polipéptidos solubles en agua, caracterizados porque se obtienen o se pueden obtener usando el método de conformidad con la Invención, especialmente los polipéptidos recombinantes, en particular los polipéptidos recombinantes, en donde es apropiado renaturalizados, y correspondiendo a una secuencia completa o parcial de la proteína P40 de Klebsiella pneumoniae de la secuencia SEQ ID No. 2 o de una proteína cuya secuencia tiene un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% con la secuencia SEQ ID No. 2. La presente invención también comprende un polipéptido de conformidad con la invención caracterizado porque dicho polipéptido tiene una estructura terciaria del tipo de hélice a. La proteína rP40 es una OmpA derivada de la membrana externa de Klebsiella pneumoniae. La extracción y purificación de esta proteína han sido descritas previamente en las solicitudes de patente WO 95/27787 y WO 96/14415. Esta proteína tiene propiedades que son muy ventajosas desde un punto de vista inmunológico, en particular para las siguientes actividades: - proteína portadora capaz de inducir la respuesta de un anticuerpo (AB) dirigida contra un hapteno (hapteno de polisacárido o péptido) (véase solicitudes de patente WO 95/27787 y WO 96/14415), - promueve el desarrollo de una respuesta citotóxica contra los antígenos con los cuales es co-inyectada (véase solicitud de patente FR 99 01917), - se fija selectivamente a células que presentan antígeno (APC) tales como células dendríticas (DC) (véase solicitud de patente FR 98 14007). Por lo tanto, esta proteína es de ventaja invaluable en terapéutica en la generación de una respuesta de linfocitos B (y en particular AB específicos) o una respuesta de linfocitos T citotóxica contra una molécula dada, que es introducida en el organismo al mismo tiempo que rP40 (asociada o como una mezcla). Además, debido a su capacidad para fijarse selectivamente a APC, y en particular a células dendríticas, rP40 se puede usar para promover la orientación a un objetivo, presentación y/o expresión de moléculas de APC. Puesto que estas células son responsables de iniciar respuestas específicas de linfocitos B y T, rP40 es por lo tanto una herramienta considerable para generar una respuesta específica por el organismo contra una molécula dada. La proteína rP40 es por lo tanto de valor en todas las condiciones patológicas en las cuales muestra ser benéfica para inducir o amplificar una respuesta inmune específica no existente o ineficiente, en particular para uno de los siguientes usos: (i) la vacunología terapéutica, en particular, vacunología anticáncer o profiláctica, particularmente vacunología antiinfecciones (virus, bacterias, parásitos, hongos), y (ii) en infecciones crónicas o recurrentes. Su capacidad para fijarse a DC amplía el campo de uso a diversas condiciones patológicas en las cuales es ventajoso orientar a un objetivo las APC con una molécula química o biológica. Se puede hacer mención, en particular, a enfermedades autoinmunes, rechazo de transplantes, enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas o enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia. Las DC juegan un papel esencial en el desarrollo de una respuesta inmune y en el inicio de una respuesta específica de linfocitos T (Steinman R.M. et al., Immuno. Rev. (1997) 156, 25, y Sella M. et al., Curr. Opin. Immunoi. (1997) 9, 10). Periféricamente, las células dendríticas son inmaduras y captura y digiere antígenos de manera muy eficiente. Después de la estimulación antigénica in vivo o la estimulación por moléculas proinflamatorias, las DC que han capturado los antígenos migran hacia los órganos linfoides. Durante esta migración, las DC sufren modificaciones funcionales y fenotípicas que se agrupan entre sí bajo el término maduración. Esta maduración se caracteriza por un incremento, en su superficie de moléculas implicadas en la activación de linfocitos T (tales como CD40, CD54, CD58, CD86 y MHC de clase l/ll), la producción de citosinas (tales como, FNT e IL-12) y la inducción de expresión de superficie de moléculas específicas (tales como CD83 para células humanas), y la pérdida de su capacidad para procesar antígeno. En las regiones dependientes del timo de los órganos linfoides, las DC que han migrado han adquirido propiedades inmunoestimulantes poderosas y por lo tanto activarán los linfocitos T intactos circulantes de manera muy eficiente. De esta manera, las moléculas que hacen posible no sólo orientar a un objetivo las DC sino también inducir la maduración de estas células son de valor considerable en terapéutica para inducir una respuesta inmune específica contra un antígeno dado. En otro aspecto, un tema de la invención es por lo tanto el uso de un polipéptido de conformidad con la presente invención, solo o como un adyuvante, para preparar una composición terapéutica soluble en agua en ausencia de detergente. La invención se refiere en particular al uso de un polipéptido recombinante, renaturalizado y soluble en agua de conformidad con la invención, solo o como un adyuvante, para preparar un producto medicinal preferiblemente diseñado para modular la respuesta inmune del hospedero. La invención también se refiere al uso de dicho polipéptido de conformidad con la invención, en combinación con un antígeno o un hapteno, para preparar un producto medicinal diseñado para modular la respuesta inmune del hospedero contra dicho antígeno o hapteno. El antígeno o el hapteno puede ser cualquier compuesto de interés terapéutico. Preferiblemente, el hapteno se escoge del grupo que comprende péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos o cualquier molécula química capaz de inducir una respuesta inmune dirigida específicamente contra dicho antígeno o hapteno. El antígeno o hapteno se puede usar en combinación con el poiipéptido de conformidad con la invención, ya sea en una simple método o después de acoplarse a dicho poiipéptido, en particular mediante enlace químico, preferiblemente del tipo de enlace covalente. El enlace covalente, en particular, se puede obtener produciendo proteínas híbridas, el polipéptido así obtenido siendo renaturalizado usando el método de conformidad con la invención. Por lo tanto, preferiblemente, el uso de dicho polipéptido de conformidad con la invención se caracteriza porque el antígeno o hapteno es acoplado a dicho polipéptido mediante enlace químico, preferiblemente el tipo de enlace covalente. Dichos polipéptidos obtenidos se pueden usar, de acuerdo con un método de conformidad con la invención en muchas aplicaciones, en particular en terapéutica humana o animal, preferiblemente, como ya se describió en cualquier aplicación diseñada para modular el sistema inmune y/o respuesta inmune en un mamífero. La invención también comprende el uso de dicho polipéptido de conformidad con la invención, para preparar una vacuna, en particular una vacuna antiviral, antibacteriana o anticancerosa. De conformidad con otro aspecto, la invención comprende un método para modular el sistema inmune de un mamífero contra un antígeno, en particular un antígeno bacteriano, viral o tumoral, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) aislar células dendríticas inmaduras de un mamífero; b) inducir la maduración de dichas células aisladas en el paso a) incubando en presencia de un polipéptido de conformidad con la invención; c) incubar las células obtenidas en el paso b) en presencia de dicho antígeno, o transformando dichas células con un vector que exprese dicho antígeno; d) inyectar las células obtenidas en el paso c) en un mamífero, siendo posiblemente el mamífero del paso a). En otro aspecto, la invención comprende un método para modular el sistema inmune de un mamífero, caracterizado porque comprende un paso de inyectar un polipéptido de conformidad con la invención, solo o como un adyuvante.

Las propiedades observadas para los polipéptidos de conformidad con la invención, en particular para la proteína rP40s, renaturalizada de acuerdo con un método de conformidad con la invención, se puede optimizar aislando células dendríticas de un mamífero, madurando dichas células dendríticas ex vivo usando un polipéptido de conformidad con la invención y después cargándolas con antígenos particulares, ya sea externamente o después de transfección con un plásmido que codifique uno o más antígenos de interés, y reinyectando estas células cargadas con antígeno en la circulación de dicho mamífero u otro mamífero. Este método para modular el sistema inmune es también uno de los temas de la presente invención y se puede poner en práctica en particular en el caso de cáncer, para tumores débilmente inmunogénicos, o para cualquier otra enfermedad bacteriana, viral, micótica y/o parasitaria crónica o recurrente, caracterizada en particular por una respuesta inmune relativamente ineficiente. Se puede hacer mención, sin que esta lista sea limitante, de infección con VIH, con virus sinciciales respiratorios, con los virus del sarampión o paperas, las formas de hepatitis, tuberculosis, micosis, etc. En un aspecto final, la presente invención se refiere a una composición terapéutica que comprende, en un medio farmacéuticamente aceptable, por lo menos un polipéptido preparado, o que se puede obtener, usando un método de preparación de acuerdo con la invención (polipéptido de acuerdo con la presente invención).

La invención también se refiere a una composición terapéutica caracterizada porque comprende, en un medio farmacéuticamente aceptable, por lo menos un adyuvante que consiste de un polipéptido de conformidad con la invención. Preferiblemente, la composición terapéutica de conformidad con la invención comprende, en un medio farmacéuticamente aceptable, por lo menos un polipéptido de conformidad con la invención en combinación con un antígeno o un hapteno. La invención también comprende una vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con la invención, libre de detergente. 1 En particular, la vacuna de conformidad con la invención comprende por lo menos un adyuvante que consiste de un polipéptido de conformidad con la invención. Dicha vacuna preferiblemente comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con la invención en combinación con un antígeno o un hapteno. Las leyendas a las figuras siguientes, y también los siguientes ejemplos, están diseñados para ilustrar la invención sin limitar de alguna manera el alcance de la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DÉ LAS FIGURAS Figura 1: Comparación de la masa aparente de rP40 y rP40s sobre gel de poliacrilamida. Se llevó a cabo SDS PAGE en las proteínas no calentadas.

Columna 1 : marcador de masa molecular; columna 2: rP40; columna 3: rP40s.

Figura 2: rP40s induce la expresión de CD83 en DC humanas. DC generadas a partir de monocitos que se originan de 2 individuos ( y -i) se expusieron a varias concentraciones de rP40s. Después de 4 días, la expresión de CD83 se evaluó por FACS. Los resultados se expresan como porcentajes de células que expresan CD83.

Figura 3: rP40s induce la producción de interleucina (IL-12 por DC humanas). DC generadas a partir de monocitos que se originan de 3 individuos (ß, ,y D) se expusieron a varias concentraciones de rP40s. Después de 2 días, la producción de IL-12 se evaluó en los sobrenadantes por FACS. Los resultados expresan en pg/ml.

Figura 4: Producción de IL-12 inducida por rP40s no es inhibida por polimixina B. Las DC generadas a partir de monocitos que se originan de 3 individuos (exp. 1 , exp.2 y exp. 3) se expusieron a varias concentraciones de rP40s en ausencia (B) o presencia ( ) de 5 µg/ml de polimixina B. Por medio de un control, las DC de un individuo se expusieron a 1 ng/ml de lipopollsacárido (LPS) en ausencia (B) o en presencia ( ) de 5 µg/ml de polimixina B. Después de 2 días, la producción de IL-12 se evaluó en los sobrenadantes por FACS. Los resultados se expresan en ng/ml.

Figura 5: rP40s induce la producción de IL-12 mayor por DC que rP40. Las DC generadas a partir de monocitos que se originan a partir de un individuo se expusieron a varias concentraciones de rP40s (B) y de ( ). Después de 2 días, la producción de IL-12 se evaluó en los sobrenadantes por FACS. Los resultados se expresan en pg/ml.

Figuras 6A y 6B: Inducción de una respuesta de anticuerpos anti-hapteno. La comparación de los niveles de anti-TNP para los conjugados rP40s-TNP (B) o los conjugados rP40-TNP (D). TT ( ): toxoide tetánico-TNP.

La figura 6A muestra las respuestas de lgG2a, expresadas como absorbancia, para una dilución de 1/2500 del suero. La figura 6B muestra las respuestas de lgG1 expresadas en µg de anticuerpo por ml de suero.

Figuras 7A y 7B: Pruebas comparativas de P40 soluble (P40s. fiqura 7B) versus detergente zwiteriónico P40 (P40Z. figura 7A) para la inducción de una respuesta de CTL dirigida contra el péptido ELA. Las figuras 7A y 7B representan el porcentaje obtenido de lisis (porcentaje de citotoxicidad), calculado usando la fórmula: 100 X (lisis de la prueba - lisis espontánea/lisis total - lisis espontánea), como una función de una gama de células efectoras expresadas como porcentaje de células efectoras a células totales E/T. Las figuras 7A y 7B representan las curvas así obtenidas para las células EL4 A2/kb cargadas (B) o no cargadas ( • ) con el péptido ELA, los ratones HLA A2/kb habiendo sido preinmunizados en presencia de P40Z (figura 7A) o P40S (figura 7B).

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Clonación del gen rP40 en un vector de expresión El gen que codifica rP40 se obtuvo por amplificación de PCR usando el ADN genómico de Klebsiella pneumoniae IP 1145 (Nguyen et al., Gene, 1998). El fragmento de gen que codifica rP40 es insertado en varios vectores de expresión, en particular un vector bajo el control del promotor del operón Trp. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de péptidos deducida de rP40 están representadas en el listado de secuencia por la secuencia SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2, respectivamente. Una cepa K 2 productora de E. Coli fue transformada con un vector de expresión pvaLP40. La proteína rP40 se produce en forma de cuerpos de inclusión, con un rendimiento considerable (> 10%, g de proteínas/g de biomasa seca). Este ejemplo es sólo una ilustración de la expresión de rP40, pero se puede extender a otras cepas bacterianas y también a otros vectores de expresión.

EJEMPLO 2 Método para fermentar proteínas de fusión rP40 Un matraz Erlenmeyer que contiene 250 ml de medio TSM (caldo de soya tríptico, difco), ampicilina (100 µl/ml, sigma) y tetraciclina (8 µl/ml, Sigma) es inoculado con la cepa de E. Coli recombinante descrita en el ejemplo 1. Después de incubarse durante la noche a 37°C, 200 ml de este cultivo se usan para sembrar 2 litros de medio de cultivo en un fermentador (Biolafitte, Francia). De manera convencional, el medio de cultivo puede estar compuesto de agentes químicos complementados con vitaminas y/o extractos de levadura. Los diversos complementos usados serán optimizados por aquellos expertos en la técnica que deseen inducir crecimiento de células bacterianas elevado. Los parámetros controlados durante la fermentación: pH, agitación, temperatura, nivel de oxígeno y suministro de fuentes basadas en carbono (glicerol o glucosa). En general, el pH es regulado a 7.0 y la temperatura se fija a 37°C. El crecimiento se controla suministrando el cultivo con glicerol (87%) a una velocidad de flujo constante (12 ml/hr) para mantener la señal de tensión de oxígeno disuelto a 30 %. Cuando la turbidez del cultivo (medido a 580 nm) alcanza el valor de 80 (después de cultivarse durante aproximadamente 24 horas), la producción de las proteínas es activada añadiendo ácido indol acrílico (lAA) a la concentración final de 25 mg/l. Aproximadamente 4 horas después de la inducción, las células son cosechadas por centrifugación. Se obtiene una cantidad de aproximadamente 200 g de biomasa húmeda.

EJEMPLO 3 Método para extraer y purificar la proteína rP40 Extracción de rP40 Después de centrifugar el caldo de cultivo (400 rpm, 10 min, 4°C), las células son resuspendidas en un regulador de pH Tris-HCl en un 25 mM, pH 8.5. Los cuerpos de inclusión se obtienen después de la lisis de las bacterias con lisozima (0.5 g/litro, 1 hora a temperatura ambiente/agitación suave). La pastilla de cuerpos de inclusión obtenida por centrifugación (15 minutos a 10 000 g a 4°C) se recoge en un reguiador de pH de Tris-HCl 25 mM a un pH de 8.5 que contiene MgCI2 5 mM, y después se centrifuga (15 minutos a 10 000 g). Los cuerpos de inclusión son solubillzados mediante tratamiento con una solución de Tris-HCl 25 mM, pH 8.5, que contiene urea 7M (agente desnaturalizador) y 10 mM de ditiotreitol (reducción de puentes de disulfuro) durante 2 horas a 37°C. La centrifugación durante 15 minutos a 10 000 g hace posible las partículas insolubles. La suspensión se mezcla con 13 volúmenes de regulador de pH Tris-HCl 25 mM, pH 8.5, que contiene NaCI (8.76 g/l) y detergente zwiteriónico 3-14 (0.1%, p:v). La solución se deja durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave en contacto con el aire a fin de promover la renaturalización de las proteínas por dilución y reoxidación de los puentes de disulfuro.

Purificación de la proteína rP40 Paso de cromatografía de intercambio de iones Después de centrifugación adicional, la solución es dializada contra 100 volúmenes de regulador de pH de Tris-HCl 25 mM, pH 8.5, que contiene 0.1% de detergente zwiteriónico 3-14 durante la noche a 4°C. El dializado se carga en una columna de cromatografía que contiene un soporte del tipo de intercamblador de aniones fuerte (Macro prep High Q gel, Biorad) equilibrado en el regulador de pH descrito anteriormente a una velocidad de flujo lineal de 15 cm/hr. Las proteínas se detectan a 280 nm. La proteína rP40 es eluida, con una velocidad de flujo lineal de 60 cm/hr, para una concentración de 0.2 M de NaCI en el regulador de pH Tris-HCl 25 mM, pH 8.5; 0.1% de detergente zwiteriónico 3-14.

Paso de cromatografía de intercambio de cationes Las fracciones que contienen la proteína rP40 se mezclan y después se concentran por ultrafiltración por medio de un sistema de células Amicon con agitación, usados con una membrana Diaflo del tipo YM10 (umbral de corte de 10 kDa), para volúmenes del orden de 100 ml, o por medio de un sistema de filtración de flujo tangencial Miilipore Minitan, usado con placas de membrana que tienen un umbral de corte de 10 kDa, para volúmenes más grandes. La fracción concentrada es dializada durante la noche a 4°C contra un regulador de pH de citrato 20 mM, pH 3.0, que contiene 0.1 % de detergente zwiteriónico 3-14. El dializado se carga en una columna que tiene un soporte del tipo de intercambiador de cationes fuerte (gel biorad Macro Prep High S) equilibrado en el regulador de pH de citrato 20 mM, pH 3.0, que contiene 0.1% de detergente zwiteriónico 3-14. La proteína rP40 es eluida (velocidad de 61 cm/hr) para una concentración de 0.7 M de NaCl. Los perfiles electroforéticos muestran un grado de pureza del orden de 95%. El estado de la proteína es monitoreado por SDS-PAGE.

EJEMPLO 4 Implementación del método de conformidad con la invención. Producción de proteína rP40s Remoción de detergente zwiteriónico 3-14 por precipitación de rP40 con etanol Se añade etanol frío (-20°C) a la solución purificada de rP40 (aproximadamente 4 mg/ml) en una relación de 5 a 1. Después de 1 hora a 4°C, la solución se centrifuga durante 10 minutos a 10 000 g. El precipitado se recoge en una solución de 7 M urea en agua, para lograr una concentración de rP40 de 2 mg/ml.

Renaturalización de rP40 en agua por tamizado molecular. La solución de rP40 en 7 M de urea se carga en una columna de Fractogel EMD Biosec (volumen cargado: 5% del volumen de la columna). La rP40s se eluye a una velocidad lineal de 30 cm/hr. El pico que contiene la rP40s se recoge y el material eluído se esteriliza por filtración y se almacena a 4°C. Dependiendo de su estructura terciaria, la proteína rP40 tiene un comportamiento electroforético característico (migración). La forma nativa hidrófoga (estructura de lámina ß) de hecho tiene una masa molecular aparente que es más baja que la forma que presenta una estructura de hélice a. Se observa que la proteína rP40s obtenida de acuerdo con el método de conformidad con la invención es la forma de hélice a, que es hidrófoga y estable.

Demostración de las modificaciones conformacionales entre rP40 y rP40s RP40, ia OmpA de Klebsiella pneumoniae, tiene la propiedad de cambiar masa aparente por SDS-PAGE dependiendo del estado conformocional de la proteína ("proteína modificable con calor", véase Rosenbusch, J. Biol. Chem. (1974), 249: 8019-8029). Sin calentar a 100°C en presencia del regulador de pH usado para recoger la muestra para (SDS-PAGE), la proteína nativa, que consiste de láminas ß, tiene una masa aparente de aproximadamente 32 kDa, mientras que la proteína desnaturalizada con calor tiene una masa aparente de 38 kDa. La forma desnaturalizada absorbe menor SDS, que explica esta migración disminuida en el gel de electroforesis. Esta adsorción disminuida de SDS se debe a estructuras de hélice a (Nakamura y Mizushima, J. Biochem, (1976), 80: 1411-1422). Como se muestra en la figura 1, la rP40 no calentada, se preparó en el ejemplo 3, tiene una masa aparente de 32 kDa (láminas ß), mientras que la rP40s, tampoco calentada tiene una masa aparente de 38 kDa, característica de estructuras de hélice a.

EJEMPLO $ Inducción de maduración de células dendríticas humanas por rP40s El ejemplo 5 muestra que rP40s induce la expresión de la molécula de CD83 y la producción de IL-12 por DC humanas. Estos dos parámetros están asociados con el proceso de maduración de DC humanas. En particular, la expresión de la molécula de CD83 caracteriza las DC maduras, esta molécula no se expresa en DC inmaduras.

Inducción de la expresión de la molécula de CD83 en DC humanas - Aislamiento de células dendríticas humanas inmaduras in vitro Las células dentríticas humanas se aislan de monocitos aislados de sangre periférica. La sangre se muestrea mediante leucaféresis en presencia de un anticoagulante, tal como por ejemplo heparinato de litio. Las células mononucleares (MNCs) se aislan de individuos sanos por centrifugación en un gradiente de Ficoll-Hypaque (densidad = 1.077) (Amersham Pharmacia biotech, Uppsala, Suecia). En breve, las células de la sangre se centrifugan a 1500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las MNCs, localizadas en la interfaz de ficoll-plasma, son recuperadas y lavadas en presencia de medio RPMI 1640 (Life Technologies, Cergy-Pontoise, Francia).

Los monociios son purificados por selección positiva usando un separador de células magnéticas (MACS ™; Miltenyi biotex, Bergisch gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En breve, las MNCs son incubadas durante 20 minutos a 4°C con esferas magnéticas a las cuales se fija un anticuerpo monoclonal CD14 antihumana. Después de lavarse, las células más la suspensión de esferas se carga en una columna y se somete a un campo magnético. Después de tres lavados, la columna ya no se somete al campo magnético y los monocitos son recogidos por gravedad. La pureza de los monocitos se evalúa por citometría de flujo (citometría de flujo FACScan; Becton Dickinson, Erembodegem, Bélgica) sobre la base de los parámetros de tamaño-granulocidad de las células. La pureza es mayor que 98%. Los monocitos después se cultivan a una concentración de 5 x 106 células/ml en el siguiente medio (subsecuentemente medio de cultivo medio): medio RPLMI 1640 complementado con 10% de suero de ternera fetal descomplementado (calentamiento a 56°C durante 30 minutos), 2 nM de L-glutamina, 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina (Life Technologies) en placa de cultivo de 6 pozos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en una proporción de 5 ml de medio por pozo. Las células son activadas con 20 ng/ml de IL-4 recombinante humano y 20 ng/ml GM-CSF de recombinante humano (R & D Systems, Abingdon, Reino Unido). Después de cultivarse durante 6 días (37°C, 5% de CO2 en atmósfera húmeda), el fenotipo de las células se define por citometría de flujo.

En breve, una alícuota de la suspensión de célula es removida. Las células se lavan en regulador de pH de FACS (regulador de pH de fosfato 10 mM, pH 7.4, que contiene 1% de albúmina de suero de bovino y 0.01% de acida de sodio) y después se distribuye en pozos de una placa de cultivo de 96 pozos (Nunc) en una proporción de 2 x IO5 células en un volumen de 50 µl de regulador de pH. Ya sea un anticuerpo CD1a humano marcado con fluorescina (Bector dickinson) o un anticuerpo CD83 antihumano marcado con fluorescina (Becton dickinson) se añade aparatoso. Después de incubarse durante 20 minutos a 4°C, las células se lavan tres veces con 200 µl de regulador de pH de FACS y después se vuelve a suspender en 200 µl de este mismo regulador de pH. El análisis de la expresión de CD1a versus CD83 se evalúa por FACS. Solo se usaron células dendríticas inmaduras caracterizadas por la expresión de la molécula de CD1a (intensidad de fluorescencia promedio (MFl) > 100) y la ausencia de expresión de CD83.

- Análisis de citometría de flujo de expresión CD83 en DC Las DC inmaduras se recogieron, se lavaron y después se regresaron al cultivo en un medio completo a una concentración de 105 células en volumen de 200 µl en placas de cultivo de 96 pozos de fondo plano (Costar, Cabridge, E.U.A.). Las células se incubaron con rP40s. Después de cultivarse durante cuatro días, la expresión de la molécula de CD83 se evaluó por FACS usando un anticuerpo anti-CD83 revelado con un anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón marcado con fluorescina (Silenus, Hauworth, Australia). Los anticuerpos isotípicos de control usados se originaron de Becton dickinson. Las células se lavaron en regulador de pH FACS y después se distribuyeron en pozos de una placa de 96 pozos de fondo cónico, en la proporción de 2 x IO5 células en un volumen de 50 µl de regulador de pH FACS. Se añade un anticuerpo en cada pozo. Después de incubarse durante 20 minutos a 4°C, las células se lavaron tres veces con 200 µl de regulador de pH FACS y después se volvieron a suspender en 200 µl de este mismo reguiador de pH. El análisis de la expresión de los marcadores de superficie se evalúa por FACS. Los resultados dados en la figura 2 muestran que rP40s induce, de una manera dependiente de la dosis, la expresión de la molécula CD83 en una fracción de DC inmadura. Se obtuvieron resultados idénticos con las células que se originaron de dos individuos diferentes (B) y ( ). rP40s induce la producción de 1L-12 por DC humanas - Evaluación de la producción de interleucina 12 (IL-12) por DC Las DC inmaduras obtenidas como se describe en el ejemplo 4 son recogidas, lavadas y después regresadas al cultivo en un medio completo a una concentración de 105 en un volumen de 200 µl en placas de 96 pozos de fondo plano (Costar, Cabridge, EUA). Las células se incubaron con rP40s. Después de cultivarse durante dos días, la concentración del heterodímero p40/p35 de IL-12 activo (IL-12 p75) en sobrenadantes sin células se determinó usando una prueba de inmunofluorescencia de citometría de flujo (Bioergonomics, St. Paul, MN) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (sensibilidad de 5 pg/ml). Los resultados dados en la figura 3 (expresados en pg/ml o en ng/ml) muestran que rP40s induce la producción de la dosis de IL-12 biológicamente activa por DC humanas, que depende de la concentración de rP40s. Los resultados se obtuvieron con las células que se originaban de tres individuos diferentes (B), ( ) y (D).

EJEMPLO 6 El efecto de rP40s sobre la maduración de DC no se debe a endotoxinas contaminantes Las endotoxinas y en particular lipopolisacáridos (LPS) son moléculas que inducen una maduración muy rápida y considerable de DC. Las DC inmaduras por lo tanto se expusieron a rP40s en presencia de polimixina B para excluir el hecho de que el efecto de rP40s sobre la maduración de DC se puede deber a endotoxinas contaminantes. La polimixina B inhibe el efecto de LPS. Las DC inmaduras obtenidas de monocitos como se describe en el ejemplo 5 se recogieron, se lavaron y después se regresaron al cultivo en un medio completo a una concentración de 105 células en un volumen de 200 µl en placas de cultivo de 96 pozos de fondo plano (Costar, Cabridge, EUA). Las DC se incuban con rP40s o con lipopolisacárido (LPS) (purificadas del isotipo Escherichia coli de cepa de 0111 : B4; sigma) en ausencia o en presencia de 5 µg/ml de sulfato de polimixina B (Sígma). Después de cultivarse durante dos días, el nivel de heterodímero p40/p35 IL-12 biológicamente activo (IL-12 p75) en los sobrenadantes de cultivo se mide por ELISA, usando un equipo comercial (R & D systems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (sensibilidad de 0.5 pg/ml). Los resultados (expresados en ng/ml) muestran que: - LPS induce la producción de IL-12 por DC, - el efecto de LPS sobre la producción de IL-12 por DC es inhibido por polimixina B, - el efecto de rP40s sobre la producción de IL-12 por DC no es inhibido por polimixina B (los resultados obtenidos usando las células derivadas de 3 diferentes individuos se dan en la figura 4). Además, la polimixina B no inhibe la expresión de la molécula CD83 en las DC inducidas por rP40s (no se muestran datos). De esta manera, todos los datos muestran que el efecto de rP40s sobre la maduración de DC humanas no se debe a la presencia de endotoxinas contaminantes, sino que claramente la proteína rP40s obtenida de acuerdo con el método de conformidad con la invención tiene actividad biológica que permite la maduración de células dentríticas.

EJ MPLO 7 La molécula de rP40s purificada y renaturalizada de acuerdo con la invención induce una maduración mucho mayor de DC que la molécula de rP40 El efecto de rP40s y de rP40 sobre la maduración de DC se comparó. La figura 5 muestra que rP40s induce la producción de IL-12 mucho mayor que rP40. Las DC inmaduras obtenidas como se describe en el ejemplo 5 se recogieron, se lavaron y después se regresaron al cultivo en un medio completo a una concentración de 105 células en un volumen de 200 µl en placas de cultivo de 96 pozos de fondo plano. Las DC se incubaron con rP40s o con rP40. Después de cultivarse durante dos días, la IL-12 bioactiva se probó en los sobrenadantes como se describe en el ejemplo 5. Los resultados (expresados en pg/ml) muestran que rP40s es mucho más efectiva que rP40 en la inducción de la producción de IL-12 por DC. También es posible mostrar que rP40s es también mucho más efectiva que rP40 en inducir la expresión de CD83 sobre DC inmaduras (no se muestran datos). Por lo tanto, todos estos resultados muestran que rP40s. purificada y renaturalizada de acuerdo con el método descrito en la presente invención, induce la maduración de DC humanas y tiene una actividad biológica similar a y mayor que la proteína rP40 purificada de acuerdo con técnicas convencionales. EJEMPLO 8 Inducción de anticuerpos anti-TNP por rP40-TNF y rP40s-TNF Preparación de conjugados de rP40-TNP. rP40s-TNF y KLH- TNF. La solución de TNP-ácido sulfónico (Sigma) a una concentración final de 25 mM se añade a la solución de proteína (1 mg/ml, en 0.1 M Na2C03). Tres proteínas son acopladas: rP40, rP40s y KLH (Pierce). Después de incubarse durante cinco horas a temperatura ambiente en la oscuridad, la solución se dializa en PBS durante la noche.

La inmunización de animales y la determinación de la respuesta de anticuerpo anti-TNP 100 µl de conjugados se inyectan por vía antiperitoneal en ratones Balb/c (n = 5), en DO y D21 , en presencia de alum. El suero se recoge en D14 y D30. La respuesta de anticuerpo anti-hapteno (IgGla y lgG2a anti-TNP) se determina por ELISA usando placas recubiertas con TNP-BSA, preparadas usando el mismo protocolo que antes.

La respuesta de anticuerpo anti-TNP inducida por los conjugados de rP40s-TNP es similar a la inducida por los conjugados rP40-TNP La figura 6A ilustra las respuestas de anticuerpo lgG2a anti-TNP inducida respectivamente por los conjugados de toxoide tetánico-TNP (TT), rP40s-TNP (rP40s) y rP40-TNP (rP40). Las respuestas de anticuerpo anti- TNP se expresan como densidad óptica para dilución en suero de 2500 veces.

Como se muestra en la figura, las respuestas inducidas por los conjugados de rP40s y rP40 son estadísticamente similares a las dos veces probadas. La respuesta inducida por los conjugados TT es temprana. La figura 6B ilustra las respuestas de anticuerpo IgGI anti-TNP inducidas, respectivamente por conjugados de toxoide tetánico-TNP (TT, rP40s-TNP (rP40s) y rP40-TNP (rP40). Las respuestas de anticuerpos son expresadas en µg de anticuerpo anti-TNP por ml. La figura muestra que, para ese tipo de anticuerpo, las respuestas también son similares a las proteínas rP40s y rP40, estas respuestas siendo en gran medida mayores en aquellas observadas por los conjugados de TT. La proteína rP40s tiene las mismas propiedades que rP40 en términos de inducción de una respuesta anti-hapteno.

EJEMPLO 9 Inducción de una respuesta citotóxica por conjugados de rP40- ovalbúmína y rP40s-ovalbúmina Preparación de conjugados rP40-ova v rP40s-ova rP40s y rP40 se conjugan a ovalbúmina mediante acoplamiento de glutaraldehído de acuerdo con el método de Avrameas (Avrameas and Teminck, Immunochemistry (1969), 5: 53).

Inmunización de animales y determinación de la respuesta de CTL inducida 100 µg de conjugados de rP40s-ovalbúmina (rP40s-ova) y rP40-ovalbúmina (rP40-ova) en 200 µl de PBS se inyectan en ratones C57BU6 hembras de 5 a 8 semanas de edad (H-2b). Los animales son sacrificados 7 días después de la inmunización y los bazos son removidos. 40 x 106 células de bazo se cultivan en matraces de 25 cm2 en 10 ml de medio cDMEM, durante 5 días, en presencia de 7 x 106 células E.G7 irradiadas (4000 rad). En la prueba de citólisis, las células objetivo (EL-4, EL-4 pulsadas con péptido SIINFEKL y E.G7) se incuban con µCi/106 células de cromato de sodio (5 Cr) durante cuatro horas a 37°C y se lavan tres veces con medio de cDMEM, antes de usarse. Las células efectoras, que consisten de las células del bazo de los cultivos de reestimulación, son cultivadas con 10 000 células objetivo marcadas con 51Cr durante cinco horas. Después de la incubación, 100 µl de sobrenadante de los cultivos preparados por triplicado se remueven y se cuentan. El cuadro 1 siguiente representa los resultados obtenidos, estos resultados siendo expresados como porcentaje de lisis específica para tres relaciones de células efectoras/células objetivo: 100:1 , 33:1, 11 :1.

CUADRO 1 Porcentaje de lisis específica obtenida en las pruebas de citolisis Los resultados obtenidos con rP40s son similares a aquellos obtenidos con rP40; ia capacidad de los conjugados de rP40s para inducir una respuesta citotóxica es del mismo orden que la de los conjugados de rP40.

EJEMPLO JQ Prueba comparativa de P40 soluble (P40S) con detergente zwiteriónico P40 (P40Z) para inducción para una respuesta de CTL dirigida en contra del péptido de ELA Para este experimento, a ratones HLA A2/kb de 6 semanas de edad se inyecta por vía subcutánea, en la base de la cola, una mezcla de P40Z+ELA o P40S+ELA, a una relación de 300:50, en ausencia de algún adyuvante. La relación de vehículo/péptido se escogió como una función de datos disponibles para la molécula P40Z y puede no ser la relación óptima para usarse para la mezcla de P40S. Diez días después de la inyección, los ratones son sacrificados y se prepara una suspensión de células a partir de los modos linfáticos inguinales y para-aórticos que drenan el sitio de inyección del producto. Las células se colocan en cultivo y son estimuladas, in vitro, mediante la adición de células EL4 A2/kb cargadas con péptido ELA e irradiadas. 7 días después, una estimulación adicional de las células efectoras, in vitro, como se describió antes, se lleva a cabo, después de 5 días de cultivo, se lleva a cabo una prueba de citotoxicidad usando el método de 51Cr. En esta prueba, las células objetivo EL4 A2/kb, cargadas con el péptido y marcadas con 51Cr, se mezclan entre sí con una gama de células efectoras durante 4 horas, y la cantidad de 51Cr liberado se calcula contando la radiación ?. Las células EL4 A2/kb no cargadas con el péptido y tratadas de la misma manera se usan como un control de lisis no específica. Para estos dos tipos de células, el porcentaje de citotoxicidad se calcula usando la fórmula: 100 X (lisis de la prueba - lisis espontánea/iisis total - lisis espontánea). Se grafican dos curvas: una, de los datos obtenidos con las células EL4 A2/kb no cargadas, corresponde a la lisis no específica; la otra, de las células EL4 A2/Lb no cargadas con el péptido. La substracción de estas dos curvas (representadas en las figuras 7A y 7B) da la actividad del producto. Los resultados dados en las figuras 7A y 7B muestran que P40S coadministrado con ELA (figura 7B) es capaz de inducir la generación de una respuesta citotóxica antipéptido de una manera comparable a P40Z (figura 7A). Este resultado es el más sorprendente ya que, a diferencia de P40Z, para la cual se llevan a cabo muchas pruebas para establecer la relación de P40/péptido a fin de obtener este resultado, no se llevan a cabo pruebas para establecer P40S. Por lo tanto, probablemente es posible mejorar en forma notable este resultado.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> MÉTODO PARA PREPARAR UN POLIPEPTIDO SOLUBLE EN UN SOLVENTE ACUOSO EN AUSENCIA DE DETERGENTE <130> D18390 <140> PCT/FR01/00023 <141> 2001-01-04 <150> FR 00 00070 <151> 2000-01-04 <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1035 <212> ADN <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> CDS <222> (1 )..(1032) <220> <223> P40 <400> 1 ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG 48 Met Lys Ala He Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln CTT GGT GCT GGT GCG TC GGT GGT TAC CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC 336 Leu Gly Tyr Pro He Thr Asp Asp Leu Asp He Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 GTT CC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC 480 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp He Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT 528 Gln Trp Val Asn Asn He Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TC GGT CAG GAA 576 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT GAC GTT CTG TTC AAC TC AAC 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA GAC GGT CC GCT GTT GTT CTG 768 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT CC GAA GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT 816 Gly Tyr Thr Asp Arg He Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC 864 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly He 275 280 285 CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT 912 Pro Ala Gly Lys He Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu He Asp 305 310 315 320 TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu He Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 GAA GTT GTA ACT CAG CCG GCG GGT TAA 1035 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly * 340 <210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <220> <223> P40 <400> 2 Met Lys Ala He Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 Leu Gly Tyr Pro He Thr Asp Asp Leu Asp He Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp He Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 Gln Trp Val Asn Asn He Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val X95 200 205 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 Gly Tyr Thr Asp Arg He Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly He 275 280 285 Pro Ala Gly Lys He Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu He Asp 305 310 315 320 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu He Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340

Claims (28)

NOVEDAD BE LA I VENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método novedoso para preparar una solución purificada en un solvente acuoso en ausencia de detergente de una solución purificada deun polipéptido que contiene detergente, que comprende los siguientes pasos: a) remover dicho detergente de la solución purificada que contiene un detergente; b) solubilizar el polipéptido obtenido en el paso (a) en una solución que contiene un agente desnaturalizador; c) eluir en medio acuoso el polipéptido solubilizado en el paso b), mediante tamizado molecular sobre una columna de cromatografía.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho poiipéptido purificado contenido en la solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente es un polipéptido hidrófobo.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque dicho polipéptido purificado contenido en la solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente es un polipéptido recombinante.

4.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque dicho polipéptido purificado contenido en la solución purificada de un polipéptido que contiene un detergente es un polipéptido cuya estructura terciaria es del tipo de lámina ß-

5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el paso a) para remover el detergente de dicha solución purificada se lleva a cabo precipitando el polipéptido en presencia de un alcohol orgánico, preferiblemente etanol.

6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque el agente desnaturalizador usado en el paso b) es urea o clorhidrato de guanidina.

7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la secuencia dei polipéptido consiste de la secuencia completa o parcial de una proteína de membrana exterior de las bacterias.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque las bacterias son bacterias gram-negativas.

9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, caracterizado además porque el polipéptido es la proteína OmpA de Klebsiella pneumoniae de secuencia SEQ ID No. 2 o una proteína cuya secuencia tiene el porcentaje de identidad de por lo menos 80%, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2.

10.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, para modificar la estructura terciaria de un polipéptido, preferiblemente para modificar una estructura terciaria del tipo de lámina ß a la estructura terciaria del tipo de hélice a.

11.- Un polipéptido recombinante, renaturalizado soluble en agua que se puede obtener usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque tiene una estructura terciaria del tipo de hélice.

13.- El polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 11 ó 12.

14.- El polipéptido de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado además porque el polipéptido es la proteína OmpA de Klebsiella pneumoniae de secuencia SEQ ID No. 2 o una proteína cuya secuencia tiene el porcentaje de identidad de por lo menos 80%, después de alineación óptima, con la secuencia SEQ ID No. 2.

15.- El uso de un polipéptido de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 14, solo o como un adyuvante, para preparar una composición terapéutica soluble en agua en ausencia de detergente.

16.- El uso de un polipéptido de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 14, solo o como un adyuvante, para preparar un producto medicinal diseñado para modular la respuesta inmune del hospedero.

17.- El uso de conformidad con la reivindicación 16, en combinación con un antígeno o hapteno, para preparar un producto medicinal diseñado para modular la respuesta inmune de un hospedero contra dicho antígeno o hapteno.

18.- El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde el antígeno o el hapteno se escoge del grupo que comprende péptidos, iipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos y lípidos.

19.- El uso de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, en donde el antígeno o el hapteno se acopla a dicho polipéptido mediante enlace covalente.

20.- El uso de un polipéptido de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 14, para preparar una vacuna, en particular una vacuna antiviral, antibacteriano o anticanceroso.

21.- Una composición terapéutica, caracterizada además porque comprende, en un medio farmacéuticamente aceptable, por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

22.- Una composición terapéutica, caracterizada además porque comprende, en un medio farmacéuticamente aceptable, por lo menos un polipéptido de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 14, y es libre de detergente.

23.- Una composición terapéutica, caracterizada además porque comprende, en un medio farmacéuticamente aceptable, por lo menos un adyuvante que consiste de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

24.- Una composición terapéutica, caracterizada además porque comprende, en un medio farmacéuticamente aceptable, por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en combinación con un antígeno o un hapteno.

25.- Una vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

26.- Una vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, y es libre de detergente.

27.- Una vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un adyuvante que consiste de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

28.- Una vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en combinación con un antígeno o un hapteno.