ES2232518T3 - Procedimiento para la produccion de alergenos del veneno de la avispa con reactividad ige reducida. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de alergenos del veneno de la avispa con reactividad ige reducida.Info
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Abstract
Procedimiento para obtener alergenos de veneno de avispa, antígeno 5, recombinantes, esencialmente puros con alergenicidad y reactividad IgE disminuida, caracterizado porque - las proteínas alergenas se producen en células bacterianas en forma insoluble como ¿inclusion bodies¿ (cuerpos de inclusión), - dichos agregados insolubles se desnaturalizan sin adición de medios de reducción, - los productos desnaturalizados se convierten mediante diálisis en alergenos monoméricos, solubles utilizando tampones ácidos y - se lleva a cabo una diálisis final frente a agua destilada.
Description
Procedimiento para la producción de alergenos del
veneno de la avispa con reactividad IgE reducida.
La invención se refiere a un procedimiento para
la producción de alergenos, antígeno 5, de veneno de avispa
recombinantes, pudiéndose diferenciar dichos alergenos mediante
plegamientos (conformaciones) de naturaleza idéntica o de
naturaleza diferente en función de la realización del procedimiento
de producción.
Una aplicación de las formas de plegamiento que
se corresponden con la molécula natural, consiste en el diagnóstico
diferencial de alergenos individuales (in vitro o in
vivo) de alérgicos, especialmente de alérgicos a los venenos de
insectos.
Las formas de plegamiento de naturaleza diferente
pueden utilizarse como medicamentos con pocas reacciones adversas
para el tratamiento inmunológico específico. De esta forma, estas
variantes de plegamiento recombinantes podrían constituir un
tratamiento más seguro que las sustancias naturales. El
procedimiento está ideado de manera que pueda llevarse a cabo una
producción biotecnológica en condiciones que son obligatorias para
los fármacos (BMP).
Las avispas y las abejas de miel son las
principales causas de alergias a la picadura de insectos y pueden
conducir a síntomas sistémicos graves hasta la anafilaxia, que
puede causar la muerte (Müller, U.R., en: Insect sting allergy,
editorial Gustav Fischer; 1990). En cuanto a las sustancias que
desencadenan la alergia de tipo 1, se trata de proteínas,
glucoproteínas o polipéptidos del veneno del insecto. Estos
alergenos reaccionan tras la inyección con las moléculas de IgE
unidas a la superficie de los mastocitos en las personan
sensibilizadas. Si este tipo de moléculas de IgE unidas a
Fc\varepsilonRI se reticulan entre sí mediante un alergeno, esto
conduce a una liberación de mediadores (por ejemplo, histamina,
leucotrienos) y citocinas por la célula efectora y con ello a los
síntomas clínicos correspondientes.
Además del péptido melitina, actúan como
componentes alergénicos del veneno de las abejas las enzimas
hialuronidasa y fosfolipasa A2 (Habermann, E, 1972, Science 177,
314-322). En el caso de las avispas, también
aparecen como alergenos principales enzimáticamente activos una
hialuronidasa, que es similar a la del veneno de las abejas
(Hoffmann, D. R., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78,
337-343) y una fosfolipasa A1. El alergeno principal
más importante del veneno de avispa es el antígeno 5 para el que
hasta la fecha no se podía demostrar ninguna actividad enzimática
(King et al., 1978, Biochemistry 17,
5165-5174). Ya se han caracterizado mediante
biología molecular todos los alergenos mencionados y se han clonado
las moléculas de ADNc correspondientes (entre otros Fang et
al., 1988, PNAS, 895-899; Soldatova et
al., 1993, FEBS, 145-149; Kuchler et
al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, 249-254). Con
ayuda de las secuencias de ADNc es posible producir alergenos
recombinantes que podrían encontrar aplicación en el diagnóstico y
tratamiento de alergias (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50,
384-391).
En relación con la presente invención, el
alergeno principal, antígeno 5, tiene una importancia especial, ya
que la invención usa esta molécula. En este sentido, se trata de
una proteína no glicosilada, de aproximadamente 25 kDa de tamaño.
La secuencia primaria comprende 8 restos de cisteína, que remite a
cuatro puentes de disulfuro (Hoffman, D.R., 1993, J. Allergy Clin
Immunol. 92:707-716). La inmunoterapia o
hiposensibilización específica representa un enfoque clásico del
tratamiento terapéutico eficaz de las alergias al veneno de los
insectos (Müller, U.R., en: Insect sting allergy, editorial Gustav
Fischer; 1990). En ese sentido, se inyecta a los pacientes dosis
crecientes subcutáneas de extractos de alergeno naturales. En este
método, existe sin embargo el peligro de reacciones alérgicas hasta
choque anafiláctico. Como justamente en el caso de las
hiposensibilizaciones en picaduras de insecto hay que contar con
reacciones fuertes, por el momento se trata exclusivamente mediante
hospitalización.
Con los alergenos recombinantes, sería posible
una optimización del tratamiento, especialmente en el caso de
alergia a la picadura de insectos. Extractos de fuentes naturales
de alergenos podrían desprender combinaciones definidas, dado el
caso, ajustadas a patrones individuales de sensibilización de los
pacientes, de alergenos altamente puros, producidos de manera
recombinante (Scheiner y Kraft, 1995). Las perspectivas realistas
que pueden conducir a una hiposensibilización segura con tales
alergenos recombinantes, ofrecen alergenos recombinantes, mutados
de manera encauzada, en los que se eliminan específicamente los
epítopos de IgE, sin dañar los epítopos de las células T esenciales
para el tratamiento (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162,
2406-2414). A partir de la expresión heteróloga en
E. coli, se sabe que la mayoría de las proteínas
eucarióticas no adoptan la conformación "natural" o sólo en una
pequeña medida. Con frecuencia, una consecuencia de estos
plegamientos inadecuados es la insolubilidad de estas proteínas.
Esto se observa especialmente en el caso de las proteínas que
contienen cisteína (Kuchier et al., 1989, Eur. J. Biochem.
184, 249-254). Se ha informado especialmente sobre
el antígeno 5 que la expresión en bacterias conduce a agregados
insolubles, que no poseen la conformación natural (Monsalve et
al., 1999, Protein Express Purif.
16(3):410-416). Tales agregados insolubles no
son útiles ni para el diagnóstico ni para el tratamiento. King
et al. (J. Immunol. 154(1995) 577-584)
describen un método para la producción recombinante de alergenos
del veneno de avispón Dol m 5.02 en bacterias.
Con frecuencia, las proteínas insolubles en E.
coli se representan en un sistema de expresión eucariótico para
fines de investigación, como por ejemplo levaduras o células de
insectos (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif
16(3):410-416; Soldatova et al., 1998,
J. Allergy Clin Immunol 101:691-698). Sin embargo,
representan desventajas de los sistemas de expresión eucarióticos
sobre todo posibles hiperglucosilaciones (Grobe et al.,
1999, Eur J Biochem 263:33-40), procesos
proteolíticos de degradación y comparativamente pequeños
rendimientos de producto (Glover y Hames (eds.), 1995, Expression
Systems, IRL Press, Oxford-Nueva
York-Tokio). Por eso, tales proteínas no son en su
mayoría adecuadas para la aplicación alergológica en término de
diagnóstico y tratamiento farmaceútico-médicos.
Los productos del procedimiento según la
invención que poseen la conformación natural pueden aplicarse de
manera ventajosa en el diagnóstico in vitro e in vivo
de las alergias a picadura de avispa. Esta forma de plegamiento
idéntica a la natural está disponible para la detección de
anticuerpos IgE en procedimientos establecidos.
Por otro lado, las variantes producidas con ayuda
de la invención, que se caracterizan esencialmente por una
conformación no reactiva mediante IgE o sólo parcialmente, pueden
aplicarse como componentes hipoalergénicos en preparados para la
inmunoterapia específica. Por la expresión "hipoalergénicos",
se entiende anteriormente y a continuación, según la invención una
alergenicidad (frente al alergeno natural) de reducida a ausente,
preferiblemente reducida del 5 al 95%, especialmente del 20 al 85%,
que se produce por una respuesta de IgE reducida.
En cuanto a la presente invención, se trata de un
procedimiento con el que pueden producirse alergenos recombinantes
en bacterias (E. coli). Mediante acumulación elevada de los
agregados de proteína insolubles tiene lugar una primera etapa de
purificación. Estos agregados se desnaturalizan entonces sin
adición de medios de reducción. Se obtienen diferentes formas de
plegamiento, en función de las condiciones de diálisis que se
siguen. En este sentido, es decisivo que se trate de monómeros y
moléculas solubles. Una de las variantes de plegamiento solubles
posee una reactividad IgE comparable al alergeno natural y por
consiguiente, puede utilizarse con fines diagnósticos. Un producto
de este tipo se obtiene mediante diálisis con solución que contiene
cisteína.
Las otras variantes de plegamiento solubles
alternativas son estructuralmente diferentes del alergeno natural y
destacan por una reactividad IgE disminuida o ausente. Por esta
razón, tales variantes son adecuadas para posibilitar una
inmunoterapia mejorada. Un producto hipoalergénico de este tipo se
obtiene según la invención mediante diálisis con tampones ácidos,
preferiblemente en un intervalo de valores de pH entre 3,5 y 6,5,
especialmente entre 4,0 y 5,5.
El alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
recombinante producido mediante un procedimiento según la invención
se caracteriza porque posee una reactividad IgE o alergenicidad
disminuida. Según la invención, la alergenicidad de esta proteína
se reduce hasta el 95%, en comparación con el alergeno natural.
Según la invención, se prefiere un alergeno de
insecto avispa, antígeno 5, recombinante correspondiente de
Vespula vulgaris y Vespula germanica.
Además, es objeto de la invención un
procedimiento para obtener alergenos de veneno de avispa, antígeno
5, recombinantes, esencialmente puros con alergenicidad o
reactividad IgE disminuida, caracterizado porque
- -
- las proteínas alergenas se producen en células bacterianas en forma insoluble como "inclusion bodies" (cuerpos de inclusión),
- -
- dichos agregados insolubles se desnaturalizan sin adición de medios de reducción,
- -
- los productos desnaturalizados se convierten mediante diálisis en alergenos monoméricos, solubles utilizando tampones ácidos y
- -
- se lleva a cabo una diálisis final frente a agua destilada.
Preferiblemente, dicha desnaturalización tiene
lugar con cloruro de guanidinio. Preferiblemente, para la diálisis
se utilizan tampones ácidos, preferiblemente tampón acetato de
sodio con un valor de pH entre 4,5 y 5,0.
Pero también es objeto de la invención un
procedimiento para obtener alergenos de veneno de avispa
recombinantes con alergenicidad o reactividad IgE normal,
utilizándose en la primera diálisis soluciones que contienen
cisteína en vez de tampones ácidos.
Además, es objeto de la invención una preparación
farmacéutica que contiene un correspondiente alergeno recombinante
con reactividad IgE disminuida o atenuada, así como
correspondientes sustancias adyuvantes y excipientes.
Finalmente, es objeto de la invención el uso de
alergenos de veneno de avispa, antígeno 5, con alergenicidad o
reactividad IgE normal, que pueden obtenerse según un procedimiento
descrito de manera correspondiente anteriormente o a continuación
para el diagnóstico in vitro de alergias a picadura de
avispa.
A continuación, se describe el procedimiento en
detalle:
A modo de ejemplo, se clonaron los alergenos de
veneno de avispa, antígeno 5 de Vespula vulgaris (Ves v 5) y
antígeno 5 de Vespula germanica (Ves g 5) en el vector de
expresión pSE420 y se transformaron en la cepa bacteriana K12 M15
pREP4. En la figura 1 se encuentra un esquema de flujo del
procedimiento.
Para la producción de los alergenos recombinantes
se necesita un cultivo previo de la cepa para inocular el cultivo
de expresión. La expresión, inducida mediante IPTG, tiene lugar en
un matraz con deflector a 37ºC en medio LB y aporte limitado de
oxígeno (90 rpm/min). Las bacterias se recogen mediante
centrifugación después de expresión durante 5 horas (5000 xg, 10
min, 20ºC). La disgregación de las bacterias se produce después de
la resuspensión de las células en tampón (Tris / HCl 50 mM, 25%
(p/v) de sacarosa, pH 8,0) mediante adición de lisozima (10
\mug/g de peso seco). Le sigue la adición del mismo volumen de
solución detergente (NaCl 0,2 M, 1% (p/v) de DOC, 1% (p/v) de
Nonidet P40). Esta solución de disgregación se trata a continuación
con ultrasonidos (3 min sobre hielo, 130 vatios, 0,5 s de impulso).
Como los productos de expresión se presentan principalmente como
agregados insolubles (cuerpos de inclusión, "inclusion
bodies"), debido a su alta densidad pueden separarse de una gran
parte de los componentes restantes (fragmentos de pared celular,
ribosomas, etc.) mediante centrifugación a 3000 xg. La otra
purificación tiene lugar mediante tres etapas de lavado sucesivas
con soluciones que contienen detergente (1% de Triton
X-100). A continuación, se desintegran los cuerpos
de inclusión purificados mediante adición de tampón de
desnaturalización (cloruro de guanidinio 6M, Tris / HCl 20 mM, pH
8,0) y se agitan durante 2 h a temperatura ambiente.
Para obtener formas de plegamiento reactivas por
IgE, la mezcla básica de desnaturalización se llena en un tubo
flexible de diálisis (límite de disgregación 12-14
kDa) y se dializa frente al volumen de solución de cisteína 100
veces mayor (cisteína 5 mM) durante 12 h, con agitación a
temperatura ambiente. A continuación, tiene lugar una diálisis
frente a agua destilada para eliminar la cisteína.
Para obtener conformaciones con reactividad IgE
disminuida, la primera diálisis se lleva a cabo frente a tampón
acetato de sodio 20 mM (pH 5,0). También aquí tiene lugar otra
diálisis frente a agua destilada. Tras la extracción, los alergenos
solubles en agua se separan de los agregados precipitados mediante
centrifugación. El sobrenadante contiene los alergenos recombinantes
solubles deseados. En vez de tampón acetato de sodio también pueden
utilizarse otros tampones ácidos que tienen capacidad tampón en un
intervalo de 3,5 a 6,5, preferiblemente entre 4,0 y 5,5. Ejemplos
de tales sistemas tampón se describen de manera suficiente en la
bibliografía.
Los alergenos recombinantes precipitados que se
producen en ambos métodos pueden desnaturalizarse de nuevo y
tratarse según el mismo esquema. De esta forma se aumenta
claramente el rendimiento.
Después de las etapas de diálisis, los productos
son en casi un 95% puros. Otras etapas de purificación de los
alergenos de veneno de insectos básicos son cromatografía de
intercambio de cationes (tampón pH 7,2) con por ejemplo Source S
(Pharmacia, Friburgo, Alemania) y filtración en gel. La filtración
en gel sirve, además de para separar impurezas mínimas de peso
molecular alto y bajo, también para desalar.
Los controles de calidad de los productos se
basan en las siguientes propiedades características, que se recogen
a modo de tabla para el antígeno 5: nAntígeno = antígeno
natural
| Propiedad | Plegamiento con reactividad IgE | Plegamiento con reactividad IgE |
| natural | disminuida | |
| PM aparente en la SDS-PAGE | 25 kDa | 26-27 kDa |
| (condición no limitante) | ||
| Concentración de sal para la | NaCl 320 mM | NaCl 400 mM |
| elución en la Source S | ||
| Escisión con proteasa V8 | Fragmento 15 kDa + Péptido | Péptido < 10 kDa |
| Anticuerpos monoclonales | Detección mediante 8E3, 1E11 | Detección sólo posible con 8E3 |
| específicos para el antígeno 5 | ||
| Frecuencia de reactividad IgE | > 95% | < 10% |
| con sueros de alérgicos | ||
| Potencia alergénica | Similar a nAntígeno 5 | > 10 veces inferior a nAg 5 |
El experto conoce y tiene acceso a las técnicas
de purificación utilizadas, así como a las técnicas de clonación y
expresión recombinantes que pueden sustituirse mediante técnicas de
procedimiento similares conocidas.
Claims (9)
1. Procedimiento para obtener alergenos de veneno
de avispa, antígeno 5, recombinantes, esencialmente puros con
alergenicidad y reactividad IgE disminuida, caracterizado
porque
- -
- las proteínas alergenas se producen en células bacterianas en forma insoluble como "inclusion bodies" (cuerpos de inclusión),
- -
- dichos agregados insolubles se desnaturalizan sin adición de medios de reducción,
- -
- los productos desnaturalizados se convierten mediante diálisis en alergenos monoméricos, solubles utilizando tampones ácidos y
- -
- se lleva a cabo una diálisis final frente a agua destilada.
2. Procedimiento según al reivindicación 1,
caracterizado porque la desnaturalización tiene lugar con
cloruro de guanidinio.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque se utiliza un tampón con un valor de pH
entre 3,5 y 6,5 en la diálisis.
4. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utilizan
alergenos de la especie Vespula spp., especialmente
Vespula vulgaris y Vespula germanica y Paravespula
spp.
5. Preparación farmacéutica que contiene un
alergeno recombinante, producido según uno de los procedimientos
descritos en las reivindicaciones 1 a 4, así como sustancias
adyuvantes y excipientes correspondientes.
6. Uso de alergeno de veneno de avispa, antígeno
5, obtenido según uno de los procedimientos descritos en las
reivindicaciones 1 a 4, para la producción de un medicamento para
la inmunoterapia o hiposensibilización específica de alérgicos al
veneno de avispa.
7. Procedimiento para obtener alergenos de veneno
de avispa, antígeno 5, recombinantes con alergenicidad o
reactividad IgE normal, caracterizado porque las etapas de
procedimiento se llevan a cabo según una o varias de las
reivindicaciones 1 ó 2, utilizándose sin embargo en la primera
diálisis soluciones que contienen cisteína en vez de tampón
ácido.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque se utilizan alergenos de la especie
Vespula spp., especialmente Vespula vulgaris y
Vespula germanica y Paravespula spp.
9. Uso de alergenos de veneno de avispa, antígeno
5, que se obtienen según uno de los procedimientos descritos en las
reivindicaciones 7 u 8, para el diagnóstico in vitro de
alergias a la picadura de avispa.
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