ES2271764T5 - Alã‰rgenos de veneno de insectos con reactividad ige reducida y procedimiento para su obtenciã“n. - Google Patents
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Abstract
Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias, con alergenicidad o bien reactividad IgE disminuida, obtenible mediante la realización de las siguientes etapas del procedimiento: - obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble como "inclusion bodies" (cuerpos de inclusión), - desnaturalización de dichos agregados, insolubles, sin adición de agentes reductores, - transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con empleo de tampones ácidos, en alergenos monómeros, solubles y - realización de una diálisis final frente a agua destilada.
Description
La invención se refiere a alergenos de veneno de avispa antígeno 5, recombinantes, pudiéndose diferenciar dichos alergenos mediante plegamientos (conformaciones) de naturaleza idéntica o de naturaleza diferente en función de la realización del procedimiento de obtención.
Una aplicación de las formas de plegamiento que se corresponden con la molécula natural, consiste en la diagnosis diferencial de alergenos individuales (in vitro o in vivo) de alérgicos, especialmente de alérgicos a los venenos de insectos.
Las formas de plegamiento de naturaleza diferente pueden utilizarse como medicamentos con pocas reacciones adversas para el tratamiento inmunológico específico. De esta forma, estas variantes de plegamiento recombinantes podrían constituir un tratamiento más seguro que las sustancias naturales. El procedimiento está ideado de manera que pueda llevarse a cabo una producción biotecnológica en condiciones que son obligatorias para los fármacos (GMP).
Las avispas y las abejas de miel son las principales causas de alergias a la picadura de insectos y pueden conducir a síntomas sistémicos graves hasta la anafilaxia, que puede causar la muerte (Müller, U.R., en: Insect sting allergy, editorial Gustav Fischer; 1990). En cuanto a las sustancias que desencadenan la alergia de tipo 1, se trata de proteínas, glucoproteínas o polipéptidos del veneno del insecto. Estos alergenos reaccionan tras la inyección con las moléculas de IgE unidas a la superficie de los mastocitos en las personan sensibilizadas. Si este tipo de moléculas de IgE unidas a FcεRI se reticulan entre sí mediante un alergeno, esto conduce a una liberación de mediadores (por ejemplo, histamina, leucotrienos) y citocinas por la célula efectora y con ello a los síntomas clínicos correspondientes.
Además del péptido melitina, actúan como componentes alergénicos del veneno de las abejas las enzimas hialuronidasa y fosfolipasa A2 (Habermann, E, 1972, Science 177, 314-322). En el caso de las avispas, también aparecen como alergenos principales enzimáticamente activos una hialuronidasa, que es similar a la del veneno de las abejas (Hoffmann, D. R., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 337343) y una fosfolipasa A1. El alergeno principal más importante del veneno de avispa es el antígeno 5 para el que hasta la fecha no se podía demostrar ninguna actividad enzimática (King et al., 1978, Biochemistry 17, 5165-5174). Ya se han caracterizado mediante biología molecular todos los alergenos mencionados y se han clonado las moléculas de ADNc correspondientes (entre otros Fang et al., 1988, PNAS, 895-899; Soldatova et al., 1993, FEBS, 145-149; Kuchler et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, 249-254). Con ayuda de las secuencias de ADNc es posible producir alergenos recombinantes que podrían encontrar aplicación en la diagnosis y tratamiento de alergias (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).
En relación con la presente invención, el alergeno principal, antígeno 5, tiene una importancia especial, ya que la invención usa esta molécula. En este sentido, se trata de una proteína no glicosilada, de aproximadamente 25 kDa de tamaño. La secuencia primaria comprende 8 restos de cisteína, que remite a cuatro puentes de disulfuro (Hoffman, D.R., 1993, J. Allergy Clin Immunol. 92: 707-716). La inmunoterapia o la hiposensibilización específica representan un enfoque clásico del tratamiento terapéutico eficaz de las alergias al veneno de los insectos (Müller, U.R., en: Insect sting allergy, editorial Gustav Fischer; 1990). En ese sentido, se inyecta a los pacientes dosis crecientes subcutáneas de extractos de alergeno naturales. En este método, existe sin embargo el peligro de reacciones alérgicas hasta choque anafiláctico. Como justamente en el caso de las hiposensibilizaciones en picaduras de insecto hay que contar con reacciones fuertes, por el momento se trata exclusivamente mediante hospitalización.
Con los alergenos preparados de manera recombinantes, sería posible una optimización del tratamiento, especialmente en el caso de alergia a la picadura de insectos. Extractos de fuentes naturales de alergenos podrían desprender combinaciones definidas, dado el caso, ajustadas a patrones individuales de sensibilización de los pacientes, de alergenos altamente puros, producidos de manera recombinante (Scheiner y Kraft, 1995). Los alergenos recombinantes, mutados de manera específica ofrecen perspectivas realistas, que pueden conducir a una hiposensibilización segura con tales alergenos recombinantes, en los que se eliminan específicamente los epítopos de IgE, sin perjudicar los epítopos de las células T esenciales para la terapia (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414). A partir de la expresión heteróloga en E. coli, se sabe que la mayoría de las proteínas eucarióticas no adoptan la conformación “natural” o sólo en una pequeña medida.
Con frecuencia, una consecuencia de estos plegamientos inadecuados es la insolubilidad de estas proteínas. Esto se observa especialmente en el caso de las proteínas que contienen cisteína (Kuchier et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184, 249254). Se ha informado especialmente sobre el antígeno 5 que la expresión en bacterias conduce a agregados insolubles, que no poseen la conformación natural (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif. 16(3):410-416). Tales agregados insolubles no son útiles ni para la diagnosis ni para el tratamiento.
Con frecuencia, las proteínas insolubles en E. coli se representan en un sistema de expresión eucariótico para fines de investigación, como por ejemplo levaduras o células de insectos (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif 16(3):410-416; Soldatova et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol 101:691-698). Sin embargo, representan desventajas de los sistemas de expresión eucarióticos sobre todo posibles hiperglucosilaciones (Grobe et al., 1999, Eur J Biochem 263:33-40), procesos proteolíticos de degradación y comparativamente pequeños rendimientos de producto (Glover y Hames (eds.), 1995, Expression Systems, IRL Press, Oxford-Nueva York-Tokio). Por eso, tales proteínas no son en su mayoría adecuadas para la aplicación alergológica en término de diagnosis y tratamiento farmaceútico-médicos.
Los productos del procedimiento según la invención que poseen la conformación natural pueden aplicarse de manera ventajosa en el diagnosis in vitro e in vivo de las alergias a picadura de avispa. Esta forma de plegamiento idéntica a la natural está disponible para la detección de anticuerpos IgE en procedimientos establecidos.
Por otro lado, las variantes producidas con ayuda de la invención, que se caracterizan esencialmente por una conformación no reactiva mediante IgE o sólo parcialmente, pueden aplicarse como componentes hipoalergénicos en preparados para la inmunoterapia específica. Por la expresión “hipoalergénicos”, se entiende anteriormente y a continuación, según la invención una alergenicidad (frente al alergeno natural) de reducida a ausente, preferentemente reducida del 5 al 95 %, especialmente del 20 al 85 %, que se produce por una respuesta de IgE reducida.
En cuanto a la presente invención, se trata de un procedimiento con el que pueden producirse alergenos recombinantes en bacterias (E. coli). Mediante enriquecimiento elevado de los agregados de proteína insolubles tiene lugar una primera etapa de purificación. Estos agregados se desnaturalizan a continuación sin adición de agentes reductores. Se obtienen diferentes formas de plegamiento, en función de las condiciones de diálisis que se siguen. En este sentido, es decisivo que se trate de monómeros y moléculas solubles en agua destilada. Una de las variantes de plegamiento solubles posee una reactividad IgE comparable al alergeno natural y por consiguiente, puede utilizarse para la diagnosis. Un producto de este tipo se obtiene mediante diálisis con solución que contiene cisteína.
Las otras variantes de plegamiento solubles alternativas son estructuralmente diferentes del alergeno natural y destacan por una reactividad IgE disminuida o ausente. Por esta razón, tales variantes son adecuadas para posibilitar una inmunoterapia mejorada. Un producto hipoalergénico de este tipo se obtiene según la invención mediante diálisis con tampones ácidos, preferentemente en un intervalo de valores de pH entre 3,5 y 6,5, especialmente entre 4,0 y 5,5.
Así pues, el objeto de la invención está constituido por un correspondiente alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, recombinante; que se caracterizan porque tiene una reactividad IgE o bien alergenicidad disminuida. Según la invención, la alergenicidad de esta proteína se reduce hasta el 95 %, en comparación con el alergeno natural.
De forma especial, el objeto es un correspondiente alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, recombinante, especialmente de Vespula vulgaris y Vespula germanica.
El alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias, con alergenicidad o bien con reactividad IgE disminuidas, puede obtenerse mediante la realización de las fases siguientes del procedimiento:
- -
- obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble
- como “inclusion bodies” (cuerpos de inclusión),
- -
- desnaturalización de dichos agregados insolubles sin adición de agentes
- reductores,
- -
- transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con
- empleo de tampón ácido en alergenos monoméricos, solubles y
- -
- realización de una diálisis final frente a agua destilada.
- En este caso se utilizan tampones ácidos para la diálisis, preferentemente
tampón de acetato de sodio con un valor de pH comprendido entre 4,5 y 5,0.
Del mismo modo, constituye un objeto de la invención un alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, combinante, con alergenicidad o bien reactividad IgE normal, utilizándose para la diálisis soluciones que contienen cisteína en lugar de de tampones ácidos.
Además, el objeto de la invención consiste en una preparación farmacéutica, que contiene un correspondiente alergeno recombinante con reactividad IgE disminuida o bien atenuada, así como productos auxiliares y excipientes correspondientes.
Finalmente, constituye un objeto de la invención el empleo de alergenos de veneno de avispa, antígeno 5, con alergenicidad o bien reactividad IgE normal, que pueden obtenerse según un procedimiento descrito de manera correspondiente en lo que antecede o que se describirá a continuación para el diagnosis in vivo e in vitro de alergias provocadas por a la picadura de insectos.
A continuación, se describe el procedimiento en detalle:
A modo de ejemplo, se clonaron los alergenos de veneno de avispa, antígeno 5 de Vespula vulgaris (Ves v 5) y antígeno 5 de Vespula germanica (Ves g 5) en el vector de expresión pSE420 y se transformaron en la cepa bacteriana K12 M15 pREP4. En la figura 1 se encuentra un esquema de flujo del procedimiento.
Para la producción de los alergenos recombinantes se necesita un cultivo previo de la cepa para inocular el cultivo de expresión. La expresión, inducida mediante IPTG, tiene lugar en un matraz con deflector a 37ºC en medio LB y aporte limitado de oxígeno (90 rpm/min). Las bacterias se recogen mediante centrifugación después de expresión durante 5 horas (5000 xg, 10 min, 20ºC). La disgregación de las bacterias se produce después de la resuspensión de las células en tampón (Tris / HCl 50 mM, 25 % (p/v) de sacarosa, pH 8,0) mediante adición de lisozima (10 µg/g de peso seco). Le sigue la adición del mismo volumen de solución detergente (NaCl 0,2 M, 1 % (p/v) de DOC, 1 % (p/v) de Nonidet P40). Esta solución de disgregación se trata a continuación con ultrasonidos (3 min sobre hielo, 130 vatios, 0,5 s de impulso). Como los productos de expresión se presentan principalmente como agregados insolubles (cuerpos de inclusión, “inclusion bodies”), debido a su alta densidad pueden separarse de una gran parte de los componentes restantes (fragmentos de pared celular, ribosomas, etc.) mediante centrifugación a 3000 xg. La otra purificación tiene lugar mediante tres etapas de lavado sucesivas con soluciones que contienen detergente (1% de Triton X-100). A continuación, se desintegran los cuerpos de inclusión purificados mediante adición de tampón de desnaturalización (cloruro de guanidinio 6M, Tris / HCl 20 mM, pH 8,0) y se agitan durante 2 h a temperatura ambiente.
5 Para obtener formas de plegamiento reactivas por IgE, la mezcla básica de desnaturalización se llena en un tubo flexible de diálisis (límite de disgregación 1214 kDa) y se dializa frente al volumen de solución de cisteína 100 veces mayor (cisteína 5 mM) durante 12 h, con agitación a temperatura ambiente. A continuación, tiene lugar una diálisis frente a agua destilada para eliminar la cisteína.
10 Para obtener conformaciones con reactividad IgE disminuida, la primera diálisis se lleva a cabo frente a tampón acetato de sodio 20 mM (pH 5,0). También aquí tiene lugar otra diálisis frente a agua destilada. Tras la extracción, los alergenos solubles en agua se separan de los agregados precipitados mediante centrifugación. El sobrenadante contiene los alergenos recombinantes solubles deseados. En vez de
15 tampón de acetato de sodio, también pueden utilizarse otros tampones ácidos, que puedan actuar como tampón en un intervalo de 3,5 a 6,5, preferentemente entre 4,0 y 5,5. En la literatura se han descrito ejemplos suficientes de tales sistemas tampón.
Los alergenos recombinantes, precipitados, que se forman según ambos métodos, pueden desnaturalizarse de nuevo y tratarse según el mismo esquema. De 20 esta forma se aumenta claramente el rendimiento.
Después de las etapas de diálisis, los productos tienen una pureza del 95 % aproximadamente. Otras etapas de purificación de los alergenos de veneno de insectos básicos son la cromatografía de intercambio de cationes (tampón pH 7,2) con, por ejemplo, Source S (Pharmacia, Friburgo, Alemania) y filtración en gel. La
25 filtración en gel sirve, además de para separar impurezas mínimas de peso molecular alto y bajo, también para desalar. Los controles de calidad de los productos se basan en las siguientes propiedades características, que se han reunido en forma de tabla para el antígeno 5: nAntígeno = antígeno natural
- Propiedad
- Plegamiento con reactividad IgE natural Plegamiento con reactividad IgE diminuida
- PM aparente en la SDS
- 25 kDa 26-27 kDa
- PAGE (condición no limitante)
- Concentración de sal para la elución con Source S
- NaCl 320 mM NaCl 400 mM
- Escisión con proteasa V8
- Fragmento 15 kDa + Péptido Péptido < 10 kDa
- Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno 5
- Detección mediante 8E3, 1E11 Detección sólo posible con 8E3
- Frecuencia de reactividad IgE con sueros de alérgicos
- > 95% < 10%
- Potencia alergénica
- Similar a nAntígeno 5 > 10 veces menos que nAg 5
El experto conoce y tiene acceso a las técnicas de purificación utilizadas, así como a las técnicas de clonación y expresión recombinantes que pueden sustituirse mediante técnicas de procedimiento similares conocidas.
Claims (8)
1.-Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias, con alergenicidad o bien reactividad IgE disminuida, obtenible mediante la realización de las siguientes etapas del procedimiento:
- -
- obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble
- como “inclusion bodies” (cuerpos de inclusión),
- -
- desnaturalización de dichos agregados, insolubles, sin adición de agentes
- reductores,
- -
- transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con
- empleo de tampones ácidos, en alergenos monómeros, solubles y
- -
- realización de una diálisis final frente a agua destilada.
- 2.-Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la desnaturalización se lleva a cabo con cloruro de guanidinio.
3.-Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque en la diálisis se utiliza un tampón con un valor de pH entre 3,5 y 6,5.
4.-Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el alergeno es de la especie Vespula spec., especialmente Vespula vulgaris y Vespula germanica y Paravespula spec.
5.-Preparación farmacéutica que contiene un alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, así como productos auxiliares y excipientes correspondientes.
6.-Empleo de alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, para la obtención de un medicamento para la inmunoterapia o para la hiposensibilización, específicas, de alérgicos al veneno de avispa.
7.-Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias, con alergenicidad o bien reactividad IgE normal, obtenible mediante la realización de las siguientes etapas del procedimiento: -obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble
como “inclusion bodies” (cuerpos de inclusión),
-desnaturalización de dichos agregados, insolubles, sin adición de agentes reductores, -transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con empleo de soluciones, que contienen cisteina, en alergenos monómeros, 5 solubles y -realización de una diálisis final frente a agua destilada.
8.-Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, según la reivindicación 7, caracterizado porque el alergeno es de la especie Vespula spec., especialmente Vespula vulgaris y Vespula germanica y Paravespula spec.
10 9.-Empleo de alergenos de veneno de avispa, antígeno 5, según una o varias de las reivindicaciones 7 u 8, para la diagnosis in vitro de alergias provocadas por la picadura de avispa.
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