PT1512694E - Alergenios de veneno de insecto com uma reactividade ige reduzida e processo para o seu fabrico - Google Patents
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DESCRIÇÃO "ALERGÉNIOS DE VENENO DE INSECTO COM UMA REACTIVIDADE IGE REDUZIDA E PROCESSO PARA O SEU FABRICO" A invenção refere-se a antigénio 5 alergénios de veneno de vespa recombinantes, podendo os referidos alergénios ser distintos consoante a realização do processo de fabrico através de configurações (conformações) idênticas ou diferentes das que existem na natureza.
Uma aplicação de formas de configuração, que correspondem à molécula natural, consiste no diagnóstico diferenciado em função dos diferentes alergénios (in vitro ou in vivo) de substâncias alérgicas, em especial substâncias alérgicas de veneno de insectos.
As formas de configuração diferentes das naturais podem ser empregues como meios terapêuticos na imunoterapia especifica, com reduzidos efeitos secundários. Deste modo, estas variantes de configuração recombinantes poderão proporcionar um tratamento mais seguro do que a substância natural. 0 processo está concebido de modo a ser possível um fabrico biotecnológico sob as condições necessárias aos produtos farmacêuticos (GMP).
As alergias a picadas de insectos são principalmente causadas por vespas e por abelhas, e podem levar a graves sintomas sistémicos, e até mesmo a uma anafilaxia potencialmente mortal (Miiller, U. R., in "Insect sting allergy", Gustav Fischer Verlag; 1990). As substâncias que levam à alergia tipo 1 tratam-se de proteínas, glicoproteínas ou polipéptidos de veneno de insecto. Estes 2 alergénios reagem depois de injectados com as moléculas IgE ligadas à superfície dos mastócitos dos indivíduos sensibilizados. Se estas moléculas IgE ligadas por FcsRI forem reticuladas umas com as outras por meio de um alergénio, isto levará à distribuição de mediadores (por exemplo, histamina, leucotrienos) e citoquinas pela célula efectora e, assim, aos respectivos sintomas clínicos.
Como componentes alergénios do veneno de abelha actuam as enzimas hialuronidase e fosfolipase A2 (Habermann, E, 1972, "Science" 177, 314 - 322), além do péptido melitina. No caso das vespas, surgem também, como alergénios principais enzimaticamente activos, uma hialuronidase semelhante à do veneno de abelha (Hoffmann, D. R., 1986, "J. Allergy Clin. Immunol." 78, 337 - 343) e uma fosfolipase AI. 0 alergénio principal mais importante do veneno de vespa é o antigénio 5, para o qual não era possível até à data detectar actividade enzimática (King et al., 1978, "Biochemistry" 17, 5 165 - 5 174). Todos os alergénios referidos já foram caracterizados pela biologia molecular e as respectivas moléculas de cADN já forma clonadas (entre outros, Fang et al., 1988, PNAS, 895 - 899 ; Soldatova et al., 1993, FEBS, 145 - 149; Kuchler et al., 1989, "Eur. J. Biochem. " 18 4, 249 - 254) . Recorrendo às sequências de cADN, é possível produzir alergénios recombinantes, que podem ser empregues no diagnóstico e na terapia de alergias (Scheiner and Kraft, 1995, "Allergy" 50, 384 - 391).
No âmbito da presente invenção, o antigénio 5 do principal alergénio é de grande peso, visto que a invenção faz uso desta molécula. Trata-se aqui de uma proteína não glicosilada, com um tamanho de cerca de 25 kDa. A sequência primária contém 8 radicais cisteína, o que indica quatro 3 pontes de dissulfureto (Hoffmann, D. R., 1993, "J. Allergy Clin Immunol.", 92: 707 - 716). Um princípio clássico para o tratamento terapêutico eficaz de alergias a veneno de insectos, é representado pela hipossensibilização ou imunoterapia específica (Muller, U. R., in "Insect sting allergy", Gustav Fischer Verlag; 1990). Neste caso, injecta-se subcutaneamente no paciente extractos alergénios naturais em doses crescentes. Em todo o caso, corre-se com este método o risco de reacções alérgicas até ao choque anafilático. Dado que se deve contar com fortes reacções justamente em casos de hipossensibilização a picadas de insectos, o tratamento é hoje em dia feito exclusivamente de forma estacionária.
Seria possível uma optimização terapêutica com alergénios produzidos de forma recombinante, sobretudo no caso de alergias a picadas de insectos. Os cocktails, definidos e eventualmente ajustados aos modelos de sensibilização individuais dos pacientes, de alergénios produzidos de forma recombinante e extremamente puros (Scheiner e Kraft, 1995) conseguiram substituir extractos de origens alergénicas naturais. Perspectivas realistas, que podem levar a uma hipossensibilização segura com estes alergénios recombinantes, fornecem alergénios recombinantes que sofreram mutações específicas e nos quais se elimina de forma específica os epitopos IgE, sem afectar os epitopos das células T essenciais à terapia (Schramm et al., 1999, "J. Immunol." 162, 2 406 - 2 414). Sabe-se da expressão heteróloga nas E. Coli, que a maior parte das proteínas eucarióticas não assumem, ou apenas o fazem em estrita medida, a conformação "natural". Uma consequência destas configurações incorrectas é frequentemente a insolubilidade destas proteínas. Isto observa-se sobretudo nas proteínas 4 que contêm cisteína (Kuchler et al., 1989, "Eur. J. Biochem.", 184, 249 - 254). Verificou-se sobretudo no caso do antigénio 5, que a expressão em bactérias leva a agregados insolúveis, que não têm a conformação natural (Monsalve et al., 1999, "Protein Express Purif." 16(3): 410 - 416). Este tipo de agregados insolúveis não pode ser empregue nem para fins de diagnóstico nem terapêuticos.
As proteínas insolúveis nas E. Coli são com frequência preparadas para fins de investigação num sistema de expressão eucariótico, como, por exemplo, levedura ou células de insectos (Monsalve et al., 1999, "Protein Express Purif" 16(3): 410 - 416; Soldatova et al., 1998, "J. Allergy Clin Immunol" 101 : 691 - 698) . Contudo, as desvantagens dos sistemas de expressão eucarióticos têm sobretudo a ver com possíveis hiperglicosilações (Grobe et al., 1999, "Eur J. Biochem." 263 : 33 - 40), processos de degradação proteolíticos e rendimentos dos produtos comparativamente baixos (Glover and Hames (eds.), 1995, "Expression Systems", IRL Press, Oxford-Nova Iorque-Tóquio). Por isso, estas proteínas são na maior parte das vezes inadequadas à aplicação alergológica no sentido de um diagnóstico e duma terapia fármaco-médicos.
Os produtos do processo de acordo com a invenção, que têm a conformação natural, podem ser aplicados com vantagem no diagnóstico in vitro e in vivo de alergias à picada de vespas. Esta forma de configuração idêntica às que existem na natureza fica disponível para a detecção de anticorpos IgE em processos estabelecidos.
Por outro lado, as variantes produzidas ao abrigo da invenção, que se distinguem por conformações essencialmente 5 não IgE-reactivas ou apenas IgE-semi-reactivas, podem ser aplicadas como componentes hipoalergénios em preparados destinados à imunoterapia específica. A expressão "hipoalergénio" trata-se, tanto anterior como posteriormente segundo a invenção, de uma alerginidade reduzida ou inexistente, de preferência reduzida em 5 a 95%, em particular 20 a 85% (em comparação com o alergénio natural), a qual está condicionada por uma baixa resposta IgE. A presente invenção consiste num método que possibilite a produção de alergénios recombinantes em bactérias (E. coli) . Através de uma elevada concentração dos agregados proteicos insolúveis, ocorre uma primeira etapa de purificação. Estes agregados são depois desnaturados sem a adição de redutores. Em função das seguintes condições de diálise, assim se obtém formas de configuração diferentes. É decisivo o facto de tratar-se de moléculas monoméricas e solúveis em água destilada. A variante de configuração solúvel tem uma reactividade IgE comparável ao alergénio natural, podendo por conseguinte ser empregue para fins de diagnóstico. Um produto deste género é obtido por diálise com solução contendo cisteína.
As outras variantes de configuração solúveis alternativas são estruturalmente diferentes do alergénio natural e distinguem-se por uma reactividade IgE reduzida ou inexistente. Por este motivo, estas variantes adequam-se a permitir uma melhor imunoterapia. Um produto hipoalergénio deste tipo é obtido, segundo a invenção, por meio de diálise com tampões ácidos, de preferência dentro de valores de pH de 3,5 a 6,5, em particular de 4,0 a 5,5. 6
Objecto da invenção é então um antigénio 5 alergénio de veneno de vespa recombinante, caracterizado por ter uma alerginidade ou reactividade IgE reduzida. De acordo com a invenção, a alerginidade destas proteínas é reduzida até 95%, em comparação com o alergénio natural.
Objecto é preferencialmente um correspondente alergénio de veneno de vespa recombinante, antigénio 5, particularmente da Vespula vulgaris e da Vespula germanica. 0 antigénio 5 alergénio de veneno de vespa, produzido de modo recombinante em bactéria e solúvel em água destilada com alerginidade ou reactividade IgE reduzida pode ser obtido por realização dos seguintes processos: - Produção das proteínas alergénicas em células bacterianas na forma insolúvel como "inclusion bodies", - Desnaturação dos referidos agregados insolúveis sem a adição de redutores, - Transformação dos produtos desnaturados por diálise, mediante a utilização de tampões ácidos, em alergénios monoméricos solúveis, e - Realização de uma diálise final contra água destilada.
Emprega-se na diálise tampões ácidos, preferencialmente tampão de acetato de sódio com um valor de pH entre 4,5 e 5, 0 . A invenção tem igualmente por objecto um antigénio 5 alergénio de veneno de vespa recombinante com uma 7 reactividade IgE ou uma alerginidade normal, empregando-se na diálise soluções contendo cisteína em vez de tampões ácidos. A invenção tem ainda por objecto uma preparação farmacêutica, que contém um alergénio recombinante correspondente com uma reactividade IgE reduzida ou enfraquecida, assim como as respectivas substâncias de suporte e auxiliares.
Por fim, é objecto da invenção a utilização de antigénio 5 alergénio de veneno de vespa, com uma alerginidade ou uma reactividade IgE normal, que pode ser obtido por um processo correspondente acima ou abaixo descrito, com vista à diagnose in vivo e in vitro de alergias à picada de vespas. 0 processo é seguidamente descrito em pormenor: A título de exemplo, clonou-se o antigénio 5 alergénio do veneno de vespa da Vespula vulgaris (Ves v 5) e o antigénio 5 da Vespula germanica (Ves g 5) no vector de expressão pSE420, e transformou-se na extirpe de bactérias K12 M15 pREP4. A Figura 1 contém um diagrama de fluxo do processo.
No fabrico dos alergénios recombinantes, emprega-se uma cultura prévia da estirpe para a inoculação de uma cultura de expressão. A expressão, induzida por IPTG, tem lugar num balão de chicana a 37 °C em meio de laboratório e com um fornecimento limitado de oxigénio (90 rpm/min). As bactérias são recolhidas depois de 5 horas de expressão por meio de centrifugação (5000 xg, 10 min, 20 °C) . 0 afloramento das bactérias ocorre depois da ressuspensão das células em tampao (50 mM de Tris/HCl, 25% (p/v) de sucrose, pH de 8,0) através da adição de lisozima (10 pg/g de peso molhado). Segue-se a adição do mesmo volume de solução detergente (0,2 M de NaCl, 1% (p/v) DOC; 1% (w/v) Nonidet P40). Esta solução de afloramento é seguidamente tratada com ultra-sons (3 min em gelo, 130 Watt, 0,5 s de impulso). Dado que os produtos de expressão se encontram primariamente na forma de agregados insolúveis (corpos de inclusão. "inclusion bodies") , os mesmos podem ser separados, por centrifugação a 3000 x g, de uma grande parte dos demais componentes (fragmentos de paredes celulares, ribossomas, etc.), devido à sua grande densidade. A re-purificação é feita por três etapas consecutivas de lavagem com soluções contendo detergente (1% de Triton X-100). Subsequentemente, os corpos de inclusão purificados são aflorados por meio da adição de tampão desnaturante (6 M de cloreto de guanidínio, 20 mM de Tris/HCl, pH de 8,0) e agitados durante 2 h à temperatura ambiente.
Para obter as formas de configuração IgE-reactivas, deita-se a preparação de desnaturação numa manga de diálise (limite de exclusão 12 - 14 kDa) e sujeita-se a diálise contra 100 vezes o volume de solução com cisteína (5 mM de cisteína), durante 12 h mediante agitação à temperatura ambiente. Em seguida, é feita a diálise contra água destilada de modo a remover a cisteína.
Para obter conformações com uma reduzida reactividade IgE, a primeira diálise é realizada contra 20 mM de tampão de acetato de sódio (pH de 5,0). Também aqui ocorre outra diálise contra água destilada. Depois da remoção, ocorre a separação dos alergénios hidrossolúveis dos agregados 9 precipitados, por meio de centrifugação. 0 resíduo contém os alergénios recombinantes solúveis pretendidos. Em vez de tampão de acetato de sódio, também é possível empregar outros tampões ácidos, que permitem uma tamponagem entre 3,5 e 6,5, de preferência entre 4,0 e 5,5. Os exemplos destes sistemas tampão encontram-se bastante descritos na literatura.
Os alergénios recombinantes, que se precipitam em ambos os métodos, podem ser de novo desnaturados e ser tratados de acordo com o mesmo diagrama. Desse modo, o rendimento sofre um claro aumento.
Depois das etapas de diálise, os produtos ficam puros até cerca de 95%. Outras etapas de purificação dos alergénios básicos de veneno de insecto são a cromatografia de permuta catiónica (tampão pH de 7,2) com, por exemplo, Source S (Pharmacia, Freiburg, Alemanha) e a permeação em gel. A permeação em gel também serve para a dessalinização além de para a separação de impurezas mínimas de elevado e de baixo peso molecular.
Os controlos de qualidade dos produtos têm por base as seguintes propriedades características reunidas na tabela para o antigénio 5: nAntigénio = antigénio natural 10
Propriedade Configuração com reactividade IgE natural Configuração com reactividade IgE reduzida MW app. na SDS-PAGE (condições não redutoras) 25 kDa 26 - 27 kDa Concentração salina para a eluição na Source S 320 mM de NaCl 400 mM de NaCl Dissociação com a protease V8 15 kDa de fragmento + péptidos Péptidos < 10 kDa Anticorpos monoclonais Detecção por 8E3, Detecção apenas específicos do antigénio 5 1E11 possível com 8E3 Frequência da reactividade IgE com alergizantes > 95% < 10% Potência alergénica Semelhante ao nAntigénio 5 > 10 x inferior ao nAg5
Lisboa, 11 de Dezembro de 2006
As técnicas de purificação clonagens recombinantes e as conhecidas e acessíveis ao substituídas por técnicas conhecidas. utilizadas, assim como as técnicas de expressão são especialista, podendo ser processuais semelhantes
Claims (9)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Antigénio 5 alergénio do veneno de vespa, produzido de modo recombinante em bactéria, solúvel em água destilada, com alerginidade ou reactividade IgE reduzida obtenível por realização dos seguintes procedimentos: -Produção das proteínas alergénicas em células bacterianas na forma insolúvel como "inclusion bodies", -Desnaturação dos referidos agregados insolúveis sem a adição de redutores, -Transformação dos produtos desnaturados por diálise, mediante a utilização de tampões ácidos, em alergénios monoméricos solúveis, e -Realização de uma diálise final contra água destilada.
2. Antigénio 5 alergénio do veneno de vespa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a desnaturação ser realizada com cloreto de guanidínio.
3. Antigénio 5 alergénio do veneno de vespa de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por na diálise serem utilizados tampões com um valor de pH entre 3,5 e 6,5.
4. Antigénio 5 alergénio do veneno de vespa de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado por 2 se tratar de um alergénio da espécie Vespula spec., em particular Vespula vulgaris e Vespula germanica e Paravespula spec..
5. Preparação farmacêutica, compreendendo um antigénio 5 alergénio do veneno de vespa de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, assim com as respectivas substâncias de suporte e auxiliares.
6. Utilização de antigénio 5 alergénios do veneno de vespa de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, para o fabrico dum medicamento para a imunoterapia ou hipossensibilização especifica de indivíduos alérgicos ao veneno de vespa.
7. Antigénio 5 alergénio do veneno de vespa, produzido de modo recombinante em bactéria, solúvel em água destilada, com alerginidade ou reactividade IgE normal obtenível por realização dos seguintes procedimentos: -Produção das proteínas alergénicas em células bacterianas na forma insolúvel como "inclusion bodies", -Desnaturação dos referidos agregados insolúveis sem a adição de redutores, -Transformação dos produtos desnaturados por diálise, mediante a utilização de soluções contendo cisteína, em alergénios monoméricos solúveis, e -Realização de uma diálise final contra água destilada. 3
8. Antigénio 5 alergénio do veneno de vespa de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se tratar de um alergénio da espécie Vespula spec., em particular Vespula vulgaris e Vespula germanica e Paravespula spec..
9. Utilização do antigénio 5 alergénio de veneno de vespa de acordo com uma ou mais das reivindicação 7 ou 8, para diagnóstico in vitro de alergias à picada de vespa. Lisboa, 11 de Dezembro de 2006
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