ES2272351T3

ES2272351T3 - Uso de l-carnitina como agente estabilizante de proteinas.

Info

Publication number: ES2272351T3
Application number: ES00987614T
Authority: ES
Inventors: Menotti Calvani
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2000-12-15
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: CA2434911C; SK287787B6; WO2002048190A1; PT1341813E; CA2434911A1; DK1341813T3; HU230002B1; EP1341813B1; ATE339445T1; PL367204A1; EP1341813A1; PL199984B1; HUP0400737A2; HUP0400737A3; US20040120967A1; AU2001223953A1; DE60030787T2; CY1106235T1; DE60030787D1; MXPA03006266A

Abstract

Uso de L-carnitina o una sal de la misma para conservar la actividad de la proteína caperona alterada a-cristalina.

Description

Uso de L-carnitina como agente estabilizante de proteínas.

La presente invención se refiere al campo técnico de la estabilización de proteínas, en particular a los aspectos terapéuticos de estabilización de proteínas.

Antecedentes de la invención

En la producción de proteínas y polipéptidos, bien mediante técnicas de extracción o mediante técnicas de biotecnología recombinante, existe el problema de mantener el plegamiento correcto de la proteína de modo que se mantenga su actividad deseada.

El no plegamiento o plegamientos incorrectos o modificados en otra forma puede suceder debido a la manipulación técnica o al sistema de procesamiento general para la producción de las proteínas.

Otro problema en el procesamiento de material proteinaceo se da con al agregación de proteínas.

Se ofrecen muchas soluciones en el estado de la técnica. Algunas de ellas son productos químicos peculiares, queriendo decir con esto que se usan reactivos químicos, tales como, por ejemplo, mezclas particulares de sales, incluso en soluciones tampón.

El documento US 5.728.804, de Research Corporation Technologies, describe un procedimiento para la re-naturalización de proteína por medio de ciclodextrinas exentas de detergente. El documento US 5.563.057, de Wisconsin Alumni Research Foundation describe el uso de ciertos detergentes, distintos de ciclodextrina, para el replegamiento de enzimas que perdieron su plegamiento.

El documento US 5.874.075 de Amgen describe complejos de proteína:fosfolípidos útiles para estabilización de proteínas frente a agregación inducida térmicamente, desnaturalización y pérdida de actividad.

El documento US 5.756.672, de Genentech, proporciona una composición que comprende un polipéptido en un determinado tampón. Siendo dicho tampón adecuado para el replegamiento de polipéptidos plegados de forma inapropiada. Se da una realización particular para el replegamiento de factor-I del crecimiento similar a la insulina que perdió su plegamiento.

Los procedimientos anteriormente citados podrían ser convenientes ya que se usan productos químicos fácilmente disponibles, pero algunos casos pueden dar lugar para ciertos productos químicos, por ejemplo, sales de cobre o manganeso (documento US 5.756.672).

El replegamiento tiene lugar también mediante técnicas cromatográficas, véase Altamirano MM. y col. Nat. Biotechnol. Febrero de 1999; 17(2): 187-91.

El descubrimiento de caperoninas ha abierto un nuevo campo para la tecnología del procesamiento de proteínas.

Las caperoninas, también conocidas como proteínas de choque térmico o HSP; son proteínas naturales que ejercen un papel biológico en el plegamiento de proteínas. Véase para una revisión extensiva http://www-emm-cbcu.cam.ac.uk/000021015h.htm de Julia C. Ranford, Anthony R.M. Coates y Brian Handerson.

Técnicamente, las caperoninas se estudian de forma intensiva como medios para afrontar el problema anteriormente citado de la estabilización y replegamiento de proteínas.

Esta búsqueda conduce a caperoninas nuevas descubiertas y a su uso para la estabilización de proteínas, véase, por ejemplo, el documento US 5.428.131, de la Universidad de Yale. Para una ilustración de caperoninas para el problema técnico afrontado por la presente invención, véase, por ejemplo, el documento US 5.688.651, de la Universidad de RAMOT; documento US 5.646.249, del Departamento de Sanidad de Estados Unidos; documento US 5.561.221, de Nippon Oil Company Limited, documento WO 00/20606, de Reiman y Schimbeck, documento JP 11266865, de Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK, documento WO 99/40435, de Netzer; documento JP 10327869, de Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK; documento WO 00/71723, de Roche Diagnostics; documentos WO 00/55183 y WO 99/05163, de Medical Research Council.

Las caperoninas son una herramienta útil para la estabilización y re-plegamiento de proteínas, pero de su uso se desprenden algunas desventajas técnicas. Debido a que son proteínas, son proclives a la alteración, tal como a alteración térmica, de modo que están muy necesitadas de algo de factor protector.

Para el campo técnico de proteínas de estabilización, este problema es también muy importante para la preparación de vacunas de cáncer de HSP. Se ha observado que la inmunogenicidad de un antígeno dado se vuelve mucho más eficiente cuando se presenta a células inmunes en un complejo con HSP (Requena JM y col, Ars-Pharm 1997, 38 (2-3): 191-208; Castellino F, y col., J Exp Med 2000, 191(11):1957-1964). De forma particular, la respuesta inmune a cáncer se refuerza con HSP (es decir, HSP70 o gp96) que están unidos a un péptido de antígeno ("huellas dactilares antigénicas específicas"), ambos se obtienen de las células cancerígenas del paciente (Yedavelli Sp y col Int J Mol Med 1999, 4(3): 243-248). Es por tanto importante tener HSP estable y/o bien conservado para vacunas de cáncer.

De forma interesante, algunas caperoninas, tales como las proteínas alfa-cristalina del cristalino del ojo, son miembros de la familia de las proteínas de choque térmico pequeñas (HSP), se ha demostrado que las HSP funcionan en una pluralidad de diferentes procedimientos que van desde la estabilización de RNA a la inhibición de la elastasa e interacción con el citoesqueleto.

La alfaA-cristalina se localiza principalmente en el cristalino con muy bajos niveles en otros tejidos, mientras que la alfaB-cristalina se sabe ahora que está esencialmente omnipresente en todo el cuerpo (Haley DA y col, J Mol Biol 1998, 277:27-35). La importancia biológica de la alfaB-cristalina es realzada por sus elevados niveles en corazón isquémico y en los cerebros de pacientes con esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurológicas. En consistencia, con su clasificación como una HSP, la expresión de la alfaB-cristalina se ha demostrado que es inducida por una variedad de tensiones fisiológicas incluyendo calor, estrés osmótico, y toxicidad por metales. La importancia biológica de la alfaA-cristalina en cristalino es realzada por su supresión eficiente de agregación no controlada de proteínas dañadas.

Swamy-Mruthinti y col. (FASEB Journal, vol. 14, número 4, 15 de Marzo de 2000, página A504) describen la inhibición de la glicación y cambios mediados por glicación por parte de L-carnitina en cristalinos de rata diabética, lo que sugiere un uso potencialmente terapéutico de L-carnitina en el tratamiento de complicaciones del ojo por
diabetes.

Peluso y col. (Journal of Cellular Biochemistry, 80:1-10 (2000)) describen el papel metabólico de L-carnitina como osmolito.

Tal como se desprende de los anteriores ejemplos, la estabilización de caperoninas, bien para su uso o para la estabilización de las mismas en aquellos estados patológicos en los que estas son alteradas, es muy importante en el campo médico.

Resumen de la invención

Se ha encontrado ahora que la L-carnitina tiene un efecto sorprendente en la estabilización de proteínas, y en un aspecto particularmente favorable para el campo médico, la L-carnitina tiene un efecto sorprendente en la actividad protectora de la caperona, ejerciéndose esta actividad protectora mediante un efecto estabilizante de L-carnitina hacia la actividad de la caperona.

Por tanto, es un objeto de la presente invención el uso de L-carnitina o de una sal de la misma para la estabilización de proteínas, en particular como factor auxiliar en la actividad protectora de la caperona.

De acuerdo con la presente invención, se usa L-carnitina para conservar la actividad de la proteína caperona alterada, alfacristalina, en particular alfaA- o alfaB-cristalina como se establece en las reivindicaciones.

El anterior objeto de la presente invención se ilustrará con detalle también por medio de ejemplos.

Descripción detallada de la invención

Para la sal farmacéuticamente aceptable de L-carnitina, es válida cualquier sal orgánica e inorgánica, adecuada para uso en el campo médico, humano y veterinario. En el campo general de estabilización de proteína se puede usar cualquier sal, con la condición de que sea compatible con la aplicación específica.

Ejemplos de sales farmacológicamente aceptables de L-carnitina, aunque no exclusivamente estos, son cloruro; bromuro; yoduro; aspartato; aspartato ácido; citrato; citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido; fumarato; fumarato ácido; glicerofosfato; glucosa fosfato; lactato; maleato; maleato ácido; mucato; orotato; oxalato; oxalato ácido; sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato; metanosulfonato; pamoato y pamoato ácido.

Descripción detallada de la realización preferida

El cristalino ocular es un órgano transparente constituido por una matriz altamente concentrada y altamente ordenada de proteínas estructurales, denominadas "cristalinas", que son probablemente las mayores proteínas vivas del cuerpo (Wistow, G., y Piatigorsky, J. (1988), Ann. Rev. Biochem, 57, 479-504; Biomendal, H: (1982) Biochem. 12, 1-38; Bettelheim, F.A. (1985) The Ocular Lens. Structure, Function, and Pathology, (Maisel H. ed.) páginas 265-300, Marcel Dekker, Inc, Nueva York; Tardieu, A., y Delay, M. (1988), Ann. Rev. Biophys. Chem. 17, 47-70).

Las modificaciones post-translacionales de cristalina de la cristalina del cristalino, consecuencia del envejecimiento o enfermedades tales como diabetes, puede dar lugar a cambios de conformación y agregación de estas proteínas, y conducir a la opacificación del cristalino y formación de cataratas (Harding, D. (1981), Molecular and Cellular Biology of the Eye Lens (Bioemendal H., ed) páginas 327 a 365, John Wiley and Sons, Nueva York). Si bien los mecanismos de cataratogénesis no son bien entendidos, la oxidación de proteínas del cristalino se asocia con cataratas en mamíferos (Francis, P.J. (1999), Trends in Genetics 15, 191-196).

El cristalino sufre estrés oxidante agudo debido a que está expuesto de forma constante a luz y oxidantes (Varma, S.D., y col. (1984), Curr Eye Res 3, 35-57, Spector, A. (1995), FASEB J. 9, 1173-1182; Taylor, A., y Davies, KJ. (1987), Free Radic Biol Med 3, 371-377; Zigman, S. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan G. ed.) páginas 117-149, Academic Press, Nueva York; I. Dillon, J. (1985), The Ocular Lens. Structure, function, and Pathology, Maisel H. ed., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, 349-366 Zigman, S. (1985), The Ocular Lens. Structure, Function and Pathology (Maisel H. ed) páginas 301-347 Marcel Dekker, Inc., Nueva York). Las modificaciones por oxidación incluyen oxidación selectiva de aminoácidos específicos que da lugar a alteraciones de carga, degradación de proteínas, reticulación de proteínas e insolubilización, y mayor fluorescencia no debida al triptófano (Spector, A., y Gamer, W.H. (1981), Exp Eye Res. 33, 673-681 Andley, U.P. (1987), Photochem. Photobiol. 46, 1057-1066 Davies, K.J.A. y col (1987), J Biol Chem 262, 9914-9920 Augusteyn, R.C. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.) páginas 72-115, Academic Press, London Zigler, J.S. Jr y col (1989), Free Radic Biol Med. 7, 499-505). En consecuencia, el cristalino ha desarrollado sistemas y mecanismos de reparación para contrarrestar el efecto de los oxidantes. La primera línea de defensa contra el estrés oxidante está constituida por antioxidantes de limpieza de radicales que reducen el ataque oxidante. Por ejemplo, glutationa (GSH) y taurina, que se encuentran ambas altamente representados en el tejido del cristalino, ejerciendo efectos protectores en un modelo in vitro de catarata diabética (Richard RC y col (1998), Proc Soc Exp Biol Med 217, 3 97-407 Jones, R.A.V. y Hothersall, J.S. (1999), Exp Eye Res. 69, 291-300). Además, la \alpha-cristalina, que constituye hasta el 50% de la masa proteica total del cristalino de mamíferos, actúa como una caperona molecular que evita la agregación inducida por calor de numerosas proteínas y es requerida para la re-naturalización de proteínas desnaturalizadas químicamente (Jones, R.A.V. y Hothersall, J.S. (1999), Exp Eye Res. 69, 291-300). Un elemento clave de la función de la \alpha-cristalina es su capacidad para prevenir las asociaciones de proteínas aberrantes mediante unión a superficies hidrófobas de proteínas expuesta de forma transitoria (van den Ussel P.R. y col. (1996), Ophtalmic Res. 28, 39-43). Ya que la \alpha-cristalina previene la agregación de proteínas in vitro inducida tanto por radiación ultravioleta como por radicales libres (Groenen PJ y col (1994) Eur. J. Biochem. 225, 1-19 Andley, U.P. y col (1998) J Biol Chem. 273, 31252-31261; Lee, J.S. y col (1997) J Protein Chem. 16, 283-289; Kramps, J.A. y col (1978), Biochem Biophys Acta 533, 487-495; Van Kleef, F.S.M., y col. (1976), Eur J Biochem 66, 477-483 Smulders, R.H.P.H. y col (1996), J Biol Chem 271, 29060-29066), esto también puede proteger proteínas del cristalino de cambios fotoxidantes in vivo.

La patente de Estados Unidos número 5.037.851, concedida el 6 de Agosto de 1991, con una reivindicación de prioridad de 14 de Noviembre de 1988, a nombre del mismo cesionario de la presente invención, reivindica un procedimiento terapéutico para el tratamiento de cataratas que comprende la administración por vía oral o parenteral a un sujeto que tiene cataratas, de 1000 a 2000 mg/día de acetil-D-carnitina o una cantidad equivalente de una de sus sales farmacológicamente aceptables. Las indicaciones de esta patente se limitan a acetil-D-carnitina.

El presente inventor y colegas demostraron previamente que en diabetes animal experimental la disminución de carnitina del cristalino, una molécula omnipresente implicada en muchas rutas biológicas, es un fenómeno precoz importante y selectivo, relacionado posiblemente con la formación de cataratas (Pessotto P, y col. (1997) Exp. Eye Res. 64, 195-201). En este documento, se ha descrito cómo en los estados diabéticos hay una pérdida de L-carnitina en el cristalino y las cantidades de carnitina en los tejidos del otro ojo parecen sustancialmente no afectados. Los autores concluyen que el papel de la L-carnitina en el cristalino aún no está claro, pero su pérdida puede relacionarse con la aparición de cataratas. Hay una fuerte insinuación en esta referencia al uso de acetil-carnitina, dando una buena razón para esperar el éxito en la prevención de la aparición de cataratas mediante una acción farmacológica, como se ha demostrado para la aspirina. La razón para esperar una acción favorable por parte de la acetil carnitina, a la vista de la acción bien conocida de la aspirina, es que ambos compuestos tienen propiedades acetilantes que, por otra parte son responsables de la protección de las proteínas del cristalino.

Además de su función primaria como un vehículo para ácidos grasos de cadena larga desde el citoplasma a los sitios de \beta-oxidación, se ha anticipado que la L-carnitina podría servir también para mantener la homeostasis celular.

Swamy-Mruthinti, S., y Carter, A.L. (1999), Exp Eye Res 69, 109 a 115 demuestran que la L-carnitina resulta inefectiva en la glicación in vitro de cristalinas del cristalino, mientras que la acetil-L-carnitina y el ácido acetilsalicílico disminuyeron la glicación de cristalina. Estas consideraciones explican porqué los niveles de L-carnitina en diversos tejidos animales no se correlacionan de forma invariable con los requerimientos de energía del tejido o con el metabolismo de lípidos. Por ejemplo, el cristalino del ojo, un tejido no vascularizado cuya fuente principal de energía es la glucosa absorbida desde los fluidos oculares, tiene mayores concentraciones de L-carnitina que otros compartimentos oculares (Pessotto, P. y col (1994) J. Ocul. Pharmacol. 10, 643-651).

Se pretende usar L-carnitina y sus sales farmacéuticamente aceptables para producir una composición farmacéutica oftálmica para el tratamiento terapéutico de cataratas, en particular cataratas de origen no diabético. En la práctica, una cantidad terapéuticamente efectiva de L-carnitina o una cantidad equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables se administra al ojo, opcionalmente comprendiendo un principio activo adicional útil para el tratamiento de cataratas de origen no diabético.

Preferiblemente, la composición se encuentra en la forma de un colirio. El colirio se aplica en la extensión de necesidad terapéutica, como se determine por parte del especialista en la técnica y en función de las condiciones del paciente, la gravedad de la enfermedad y cualquier otro factor considerado por el especialista en la técnica. Por ejemplo, puede ser adecuado de 2 a 3 gotas de 3 a 4 veces al día.

Las composiciones para el colirio comprenden la solución isotónica estéril habitual. La elección de los excipientes adecuados se encuentra dentro de las capacidades de un especialista en tecnología farmacéutica. Por ejemplo, se hace uso de excipientes tales como cloruro de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de potasio monobásico, cloruro de benzalconio y alcohol etílico. La composición se lleva hasta el volumen correcto con agua destilada.

Ejemplo Materiales y procedimientos Cultivo de órgano de cristalino

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley de cuatro meses de edad con 5 mg/kg de xilazina y 65 mg/kg de quetamina, y se decapitaron. Inmediatamente después, se sacaron los ojos, se extrajeron y se colocaron en 2 ml de medio TC-199 modificado. Se valoró la integridad del cristalino mediante medida de proteína lixiviada en el medio después de 30 a 60 minutos de cultivo; se desecharon los cristalinos dañados. Se dispuso un cristalino de cada par en medio de cultivo sin H_{2}O_{2} y se usó como un control. Después de 24 horas de cultivo los cristalinos de control no diferían de los cristalinos recién extraídos en alguno de los parámetros evaluados en este estudio. El cristalino controlateral de cada par se dispuso en medio y, tras equilibrado en CO_{2} al 5% a 37ºC, se expuso a H_{2}O_{2} 500 \muM en ausencia o presencia de L-carnitina 300 \muM. Después de 24 horas de incubación se registraron las características y cambios morfológicos, y se fotografiaron los cristalinos. Se aclararon los cristalinos incubados con solución salina, se secaron sobre papel de filtro, se pesaron, y luego se procesaron inmediatamente para el análisis bioquímico. Para determinar la pérdida de lactato deshidrogenasa (LDH) se incubaron los cristalinos individualmente en un medio diferente, y se recogió diariamente medio y se conservó para análisis de LDH.

Extracción de proteínas del cristalino

Se homogenizaron los cristalinos descapsulados con trituradores desechables y luego se sometieron a ultrasonidos en tampón de extracto (HEPES 20 mM, EDTA 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM, NaCl 450 mM, glicerol al 25%, leupeptina 0,5 \muM/ml, protinina 0,5 \mug/ml, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 0,5 mM) en hielo. Se retiraron alícuotas de homogenato de cada uno de los cristalinos incubados para análisis de GSH y L-carnitina. Se centrifugó el resto durante 25 minutos a 20.000 x g para separar el sobrenadante del agregado. Se lavó el agregado con 1,0 ml de tampón y se secó en nitrógeno. Esta fracción se denominó "fracción insoluble en agua". Se dializó la fracción de sobrenadante dos veces junto con 3 ml de tampón de fosfato 0,025 mol/l, pH 7,4 durante 48 horas y se liofilizó. Esta fracción se denominó fracción "soluble en agua". Se eliminaron los lípidos en las fracciones soluble en agua e insoluble en agua con 3,0 ml de cloroformo:metanol (2:1) durante 16 horas con agitación seguido de centrifugación a 2000 g durante 5 minutos.

Después de eliminar el disolvente orgánico, se trató el residuo con 2,0 ml de dietiléter, se dejó reposar durante 5 minutos y luego se centrifugó a 2000 g durante 5 minutos. Se secó el agregado en aire y se conservó a 4ºC en un desecador.

Preparación de cristalinas

Se aislaron las fracciones de cristalina solubles en agua mediante cromatografía de exclusión molecular con Sephacryl S-300-HR preparativa como se describió previamente (Smulders, R.H.P.H. y col (1996), J Biol Chem 271, 29060-29066, de Jong, y col (1974), Eur J Biochem, 48, 271-276). De forma resumida, se aplicó la proteína soluble a una columna de 100 x 1,5 cm y se desarrolló isocráticamente con tampón de fosfato. Se concentraron las fracciones totales de cristalinos de control y tratados con H_{2}O_{2} \pm L-carnitina mediante ultrafiltración en un equipo Diaflo y se comprobó su pureza mediante SDS-PAGE, llevado a cabo de acuerdo con Laemmli usando un sistema Bio-Rad Mini-Protean II. Se midieron las concentraciones de proteína con un kit de ensayo de proteína Bradford (Bio-Rad).

Western blotting

Se aplicó homogenato de cristalino total sobre geles de dodecilsulfato de sodio (SDS) con gradiente de 4 a 20% usando tampones de tricina y luego se transfirió a membranas de poli(difluoruro de vinilideno). Se realizó el Western blotting como se describe en otra parte (Kim, S.Y. y col (1995), J Invest Dermatol 104, 211-217). La concentración de anticuerpos fue de 5 \mug/ml para anticuerpo primario (isopéptido anti-\gamma-glutamil-\varepsilon-lisina) y de 0,1 \mug/ml para anticuerpo secundario. Se analizó luego la mancha mediante quimioluminiscencia potenciada (Pierce, Milán, Italia). Subsiguientemente se apartaron las bandas de peso molecular muy alto, se eluyó en tampón de SDS que contiene tricina, se liberaron del SDS mediante extracción del par iónico (Konigsberg, W.H., y Henderson, L. (1983) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos, 80, 2467-2471), y se sometieron a análisis de aminoácidos.

Medida de reticulaciones de isopéptido en proteínas insolubles en agua.

\newpage

Se suspendieron las proteínas insolubles en agua en acetato de N-etilmorfolina 0,2 M (pH 8,1). Se usó una alícuota (al 10%) para cuantificar la cantidad de proteína total. Se digirieron las muestras mediante la adición secuencial de enzimas proteolíticas (colagenasa, pronasa, aminopeptidasa y carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B y carboxipeptidasa y), directamente a la mezcla de reacción a 37ºC en presencia de azida sódica al 0,02%. Después de la digestión enzimática se resolvió la reticulación del isopéptido N-(\gamma-glutamil)lisina libre mediante HPLC y se cuantificó mediante análisis de aminoácidos (Hohl, D., y col (1991), J. Biol Chem, 226, 6626-6636). En un grupo relacionado de experimentos se determinó el contenido de isopéptido de cristalinos sin extracción previa.

Fluorescencia del triptófano

La pérdida de fluorescencia de la proteína triptófano, un indicador de la oxidación del triptófano, parece ser un marcador de la integridad de la cristalina. Por tanto se midió la fluorescencia del triptófano en cristalina del cristalino (espectrofotómetro Perkin-Elmer 650-40) de acuerdo con un procedimiento descrito previamente (Jones, R.H.V., y Hothersall, J.S. (1993), Exp Eye Res 57, 783-790). La longitud de onda de excitación se estableció en 295 nm, y se detectó la emisión de fluorescencia a 330 nm.

Evaluación de la actividad de la caperona molecular de \alpha-cristalinas en cristalinos de rata de control y tratados in vitro.

Se realizaron los siguientes experimentos esencialmente como se describe en otra parte (Horwitz, J. (1992) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 89, 10449-10453). Se determinó la actividad tipo caperona de \alpha-cristalina de cristalinos de control y tratados con H_{2}O_{2} \pm L-carnitina mediante estudios de desnaturalización con calor. Se valoró como sigue la extensión en la que \betaL-cristalina protegida con preparación de \alpha-cristalina no modificada o modificada (usada como la proteína diana) sufre desnaturalización y agregación inducidas por calor: se añadieron 100 \mug ó 200 \mug de \alpha-cristalina a 200 \mug de \beta_{L}-cristalina en una cubeta de 1,5 ml y se llevaron hasta un volumen final de 1 ml con tampón de fosfato 50 mM, pH 7,0. Se dispuso la cubeta en un soporte de célula con regulación de temperatura unido a un espectrofotómetro UV. Se siguió la dispersión de luz debida a la desnaturalización y agregación de proteína a absorbancia de 360 nm durante 3.000 segundos a 55ºC o durante 1.800 segundos a
58ºC.

Ensayos de ensamblaje de filamento intermedio y viscosidad que implican \alpha-cristalinas.

Se usó el ensayo de sedimentación ideado por Nicholl y Quinlan (Nicholl, I.D., y Quinlan, R.A. (1994), EMBO J 13, 945-953) para valorar la inhibición inducida por \alpha-cristalina del ensamblaje de filamento intermedio. Se usó para estos estudios proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) porcina purificada; ésta se purificó de la médula espinal porcina mediante flotación axonal como se describió previamente (Pemg, M.D., y col (1999), J. Cell Sci. 112, 2099-2112, MacLean-Fletcher, S., y Pollard, T.D. 81980), Biochem Biophys Res Commun 96, 18-27). El ensayo de gelificación se basó en un procedimiento usado para seguir la actividad de la proteína que se une a actina mediante medida de la viscosidad por caída de bola (Pemg, M.D. y col (1999), J Cell Sci. 112, 2099-2112). Se mezclaron \alpha-cristalinas con GFAP en urea 8 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM, 2-mercaptoetanol 25 mM y luego se dializó por etapas en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, 2-mercaptoetanol 25 mM. Se indujo el ensamblaje de los filamentos intermedios de la GFAP en presencia o ausencia de \alpha-cristalina, mediante la adición de un tampón concentrado 20 veces para dar una concentración final de clorhidrato de imidazol 100 mM, pH 6,8, DTT 0,5 mM. Se cargó una alícuota de 100 \mul de la muestra en un tubo de vidrio y se usó para el ensayo de la viscosidad. Se sumergió luego el tubo en un baño de agua a 37ºC durante 1 hora antes del ensayo de gelificación. Se dispuso luego una bola dentro del tubo y se siguió la capacidad de la solución para soportar la
bola.

Examen microscópico del cristalino

Después de una incubación de 24 horas con o sin H_{2}O_{2} en presencia o ausencia de L-carnitina, se sometieron los cristalinos a procedimientos convencionales de análisis histológico. Para la microscopía óptica se retiraron los cristalinos del medio de cultivo, se sumergieron en medio de fijación (formalina tamponada neutra), se deshidrataron en etanol, se clarificaron en xileno, y se embebieron en cera de parafina para seccionamiento. Se prepararon cinco secciones micrométricas y se tintaron con hematoxilina y eosina. Para la microscopía electrónica de barrido se fijaron los cristalinos mediante inmersión, durante al menos 24 horas a temperatura ambiente, en una solución de glutaraldehído al 2,5% y sacarosa al 6%, tamponada a pH 7,2 con cacodilato de sodio 50 mM. Se deshidrataron muestras mediante una serie de diluciones graduadas de etanol, se secaron en el punto crítico usando CO_{2}, se montaron en tubos de aluminio, se recubrieron por pulverización con oro, y se examinaron con un microscopio Leica Stereoscan 440 a un voltaje de aceleración de 3 a 7 kV.

Para la microscopía electrónica de transmisión se fijaron los cristalinos como se describió anteriormente para el procedimiento de microscopía electrónica de barrido, se fijaron posteriormente en OsO_{4} tamponado con fosfato de sodio y potasio 150 mM (pH 7,4), se embebieron, se seccionaron y se tintaron para la microscopía electrónica. Se examinaron en un microscopio electrónico JEOL 100B.

Resultados Cambios en la morfología de los cristalinos

Después de 24 horas de incubación, los cristalinos incubados sin H_{2}O_{2} (cristalinos de control) conservaron su claridad, pero aquellos expuestos a H_{2}O_{2} 500 mM se volvieron uniformemente turbios en toda la región cortical externa y se hincharon (datos no mostrados). Como se muestra en la tabla 1, al final de la incubación, los cristalinos tratados con H_{2}O_{2} eran significativamente más pesados que los cristalinos de control (47 \pm 0,2 mg frente a 25 \pm 0,1 mg). No hubo diferencias en peso entre cristalinos de control y cristalinos tratados con ambos, L-carnitina y H_{2}O_{2}. Los cristalinos tratados sólo con H_{2}O_{2} se volvieron opacos, mientras que los cristalinos tratados con L-carnitina y H_{2}O_{2} permanecieron claros. La microscopía óptica y electrónica mostró que la forma celular se mantenía inalterada y que las células de fibra estaban intactas en los cristalinos de control y en los cristalinos tratados con L-carnitina y H_{2}O_{2}. Se observaron balonamiento, licuefacción y distintos grados de hinchamiento de fibra en cristalinos expuestos sólo a H_{2}O_{2}.

Concentraciones de L-carnitina y GSH en cristalinos de control y tratados con H_{2}O_{2}.

En las condiciones experimentales no había diferencia significativa en concentraciones de GSH y L-carnitina en cristalinos de control, mientras que el tratamiento con H_{2}O_{2} 500 mM provocó una caída precipitada en niveles de GSH y L-carnitina (tabla 1). La adición de L-carnitina (300 mM) al medio de incubación de cristalino antes del tratamiento con H_{2}O_{2} no evitó la pérdida de GSH, pero mantenía la concentración de carnitina casi al nivel encontrado en los cristalinos de control. Para determinar si la disminución de GSH y L-carnitina estaba relacionada con el daño del cristalino se midió la pérdida de LDH en el medio. Como se esperaba, después del tratamiento con H_{2}O_{2} la reducción en niveles de GSH y L-carnitina estaba acompañada de un aumento significativo de LDH en los sobrenadantes, lo que indica que la eliminación de estos factores estaba asociada realmente con el daño del cristalino. Para determinar el efecto protector de la L-carnitina se incuban cristalinos en medio de cultivo que contiene 300 mM de la molécula. Como se esperaba, la concentración de GSH en cristalinos tratados con L-carnitina y H_{2}O_{2} disminuyó en aproximadamente el mismo nivel que en cristalinos expuestos a H_{2}O_{2} sólo, pero la concentración de LDH en el medio del cristalino tratado con L-carnitina y H_{2}O_{2} era similar a la observada en cristalinos de control. Esto indica que la L-carnitina puede soportar esta concentración de H_{2}O_{2}.

Recuperación de las proteínas de alto peso molecular en las fracciones de cristalino insolubles en agua que contienen reticulaciones de isopéptido.

Proteínas insolubles en agua constituían sólo el 5% de las proteínas totales en cristalinos de control, pero aumentaron al 41% de las proteínas totales en cristalinos tratados con H_{2}O_{2} (tabla 1). Las concentraciones de proteínas insolubles en agua en cristalinos tratados con L-carnitina y H_{2}O_{2} eran las mismas que las observadas en cristalinos de control.

Función tipo caperona de \alpha-cristalina

Se determinaron las propiedades de caperona de \alpha-cristalina soluble en agua purificada mediante ensayo de agregación de cristalina (proteína diana). Característicamente, \beta_{L}-cristalina se agrega a temperaturas elevadas. La adición de \alpha-cristalina bien evita o bien disminuye la agregación inducida por calor de \beta_{L}-cristalina, que se mide mediante dispersión de luz a 360 nm. Debido a que la relación de \alpha a \beta determina el grado de protección frente a la agregación inducida por calor, se usó 100 \mug ó 200 \mug de \alpha-cristalina y 200 \mug de \beta_{L}-cristalina. Como se esperaba, \alpha-cristalina de los cristalinos de control ejercieron actividad de caperona. Después de la incubación con H_{2}O_{2}, hubo una disminución significativa en la capacidad de \alpha-cristalina para evitar la agregación inducida por calor de \beta_{L}-cristalina, mientras que la presencia de L-carnitina en la mezcla de incubación de cristalino evita este efecto
negativo.

Ensayo de gelificación

Debido a que los filamentos intermedios tales como GFAP son una diana fisiológica de \alpha-cristalinas, se ensayó la actividad caperona de \alpha-cristalina usando medida de la viscosidad por caída de la bola en el ensayo de gelificación (MacLean-Fletcher, S., y Pollard, T.D. (1980), Biochem Biophys Res Commun 96, 18-27).

GFAP es una diana apropiada debido a la propiedad de la \alpha-cristalina de disgregar inclusiones citoplasmáticas de GFAP. En ausencia de \alpha-cristalina, GFAP forma un gel de proteína que soporta la bola usada en el ensayo de viscosidad. Para determinar si el tratamiento con H_{2}O_{2} afectaba la capacidad de la \alpha-cristalina del cristalino para interrumpir la red de GFAP, se añadió \alpha-cristalina del control o del cristalino tratado con H_{2}O_{2} \pm L-carnitina al ensayo de gelificación. La \alpha-cristalina de los cristalinos de control inhibieron por completo la formación y mantenimiento del gel de GFAP en el ensayo de viscosidad, mientras que la \alpha-cristalina de los cristalinos tratados sólo con H_{2}O_{2} no afectaron la gelificación. Además, \alpha-cristalina de cristalinos tratados con L-carnitina y H_{2}O_{2} bloqueó la gelificación de GFAP en la misma extensión que la \alpha-cristalina de cristalinos de control.

Medidas de fluorescencia del triptófano

Se midió la fluorescencia del triptófano en fracciones de \alpha-cristalina de cristalinos de control y tratados para identificar cambios de conformación. En \alpha-cristalina de cristalinos tratados con H_{2}O_{2} hubo una pérdida de 2,7 veces de fluorescencia de triptófano; de nuevo, L-carnitina restableció el valor basal.

Los cristalinos expuestos a L-carnitina y estrés oxidante permanecieron transparentes. Aunque los presentes inventores no desean unirse a teoría alguna, el efecto protector de la L-carnitina no se explica fácilmente debido a que la L-carnitina por si sola no es conocida por ejercer actividad antioxidante (Arduini, A. y col. (1992), J Biol Chem. 267, 12673-81). La L-carnitina no redimió el agotamiento de GSH, lo que significa que el efecto beneficioso no estaba mediado por un aumento de GSH, por ejemplo, mediante un efecto anaplerótico sobre NADPH, un cofactor del enzima glutationreductasa (Pemg, M.D., (1999), J. Biol. Chem 47, 3323 5-33243. Wuensch, S.A. y Ray, P.D. (1997), Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 118, 599-605). Más bien, el hecho de que la pérdida de LDH en el medio no aumentase en cristalino tratado con L-carnitina y expuesto a estrés oxidante indica que la molécula puede mantener la integridad del cristalino. Aquí se demuestra que la actividad caperona de \alpha-cristalina del cristalino se reduce por estrés oxidante in vitro, y proporcionan apoyo para el objetivo de que las proteínas del cristalino sometidas a ataque oxidante mantengan un grado elevado de modificaciones post-translacionales (Cherian, M., y Abraham, E.C. (1995), Biochem Biophys Res Commun. 212, 184-189). L-carnitina no redujo sólo las mayores modificaciones post-translacionales de proteínas del cristalino sino que también dio protección significativa frente a la reducida actividad caperona de \alpha-cristalina. Se ha demostrado que la \alpha-cristalina suprime la agregación de proteínas desnaturalizadas en estudios en los que mezclas de \beta-cristalinas estresadas térmicamente sirvieron como sustrato (Kramps, J.A. y col (1978), Biochem Biophys Acta 533, 487-495). Se ha demostrado que el estrés oxidante interrumpe la actividad caperona de \alpha-cristalina, que es crucial para el mantenimiento de la transparencia del cristalino (Zigler, J.S. Jr y col (1989), Free Radic Biol Med. 7, 499-505; Richard RC y col (1998), Proc Soc Exp Biol Med 217, 3 97-407). Por tanto, L-carnitina afecta de forma beneficiosa la transparencia del cristalino actuando directamente sobre la \alpha-cristalina.

Ambas \alpha- y \beta-cristalinas están acetiladas N-terminalmente. Usando análisis spot-blot de detección combinado con espectrometría de masas, Takernoto y col., proporcionaron evidencia de que la metionina con terminal N-acetilado de \alpha-cristalina se puede oxidar en sulfóxido de metionina in vivo (Sims, N.R., y col (2000), Brain Res Mol Brain Res. 77, 176-184). Esta oxidación de la metionina N-terminal, que está expuesta en la parte exterior del polipéptido, puede afectar de forma negativa la función de la proteína. Además de la acetilación NH3-terminal, los grupos amino de residuos de lisina (Lys) son objeto de acetilación. Todos los siete residuos Lys de \alpha-cristalina bovina reaccionan con aspirina, variando la extensión de la acetilación desde 10% para Lys 88, el menos reactivo, hasta el 60% para lys 166, el más reactivo (Takemoto, L. y col (1992), Curr. Eye. Res. 11, 651-655; Rao, G.N. y col (1985), biochem. Biophys. Res. Commun. 128, 1125-1127). La aspirina inhibe tanto la glicación como la carbamoilación así como también la agregación de proteínas del cristalino, presumiblemente mediante acetilación de residuos de Lys (Hasan, A. y col (1993), Exp Eye Res. 57, 29-35; Cromptonm, Rixon, K.C., y Harding, J.J. (1985), Exp. Eye Res. 40, 297-311; Rao. G.N., y Cotlier, E. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 151, 991-996; Huby, R., y Harding, J.J. (1988), Exp Eye Res, 47, 53-59; Ajiboye, R. y Harding D. (1989), Exp. Eye Res. 49, 31-41; Blakytin, R., y Harding J.J. (1992), Exp Eye Res. 54, 509-518). Recientemente, se ha mostrado que la acetil-L-carnitina muestra glicación de \alpha-crisalina, en una extensión mayor que otras cristalinas, a través de la acetilación de los sitios de glicación potenciales (Groenen, P.J. y col (1993), Biochem J. 295, 399-404). La glicación parece ser más dañina que la acetilación debido a que sólo los productos de glicación están involucrados en la reticulación de proteínas y en una disminución significativa en la actividad caperona de \alpha-cristalina (Groenen, P.J. y col (1983), Biochem J. 295, 399-404, Blakytin, R., y Harding J.J. (1982), Exp Eye Res. 54, 509-518).

TABLA 1

1

Claims

1. Uso de L-carnitina o una sal de la misma para conservar la actividad de la proteína caperona alterada \alpha-cristalina.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha \alpha-cristalina es alfaA-cristalina.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha \alpha-cristalina es alfaB-cristalina.