ES2272351T3 - Uso de l-carnitina como agente estabilizante de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Uso de L-carnitina o una sal de la misma para conservar la actividad de la proteína caperona alterada a-cristalina.
Description
Uso de L-carnitina como agente
estabilizante de proteínas.
La presente invención se refiere al campo
técnico de la estabilización de proteínas, en particular a los
aspectos terapéuticos de estabilización de proteínas.
En la producción de proteínas y polipéptidos,
bien mediante técnicas de extracción o mediante técnicas de
biotecnología recombinante, existe el problema de mantener el
plegamiento correcto de la proteína de modo que se mantenga su
actividad deseada.
El no plegamiento o plegamientos incorrectos o
modificados en otra forma puede suceder debido a la manipulación
técnica o al sistema de procesamiento general para la producción de
las proteínas.
Otro problema en el procesamiento de material
proteinaceo se da con al agregación de proteínas.
Se ofrecen muchas soluciones en el estado de la
técnica. Algunas de ellas son productos químicos peculiares,
queriendo decir con esto que se usan reactivos químicos, tales como,
por ejemplo, mezclas particulares de sales, incluso en soluciones
tampón.
El documento US 5.728.804, de Research
Corporation Technologies, describe un procedimiento para la
re-naturalización de proteína por medio de
ciclodextrinas exentas de detergente. El documento US 5.563.057, de
Wisconsin Alumni Research Foundation describe el uso de ciertos
detergentes, distintos de ciclodextrina, para el replegamiento de
enzimas que perdieron su plegamiento.
El documento US 5.874.075 de Amgen describe
complejos de proteína:fosfolípidos útiles para estabilización de
proteínas frente a agregación inducida térmicamente,
desnaturalización y pérdida de actividad.
El documento US 5.756.672, de Genentech,
proporciona una composición que comprende un polipéptido en un
determinado tampón. Siendo dicho tampón adecuado para el
replegamiento de polipéptidos plegados de forma inapropiada. Se da
una realización particular para el replegamiento de
factor-I del crecimiento similar a la insulina que
perdió su plegamiento.
Los procedimientos anteriormente citados podrían
ser convenientes ya que se usan productos químicos fácilmente
disponibles, pero algunos casos pueden dar lugar para ciertos
productos químicos, por ejemplo, sales de cobre o manganeso
(documento US 5.756.672).
El replegamiento tiene lugar también mediante
técnicas cromatográficas, véase Altamirano MM. y col. Nat.
Biotechnol. Febrero de 1999; 17(2):
187-91.
El descubrimiento de caperoninas ha abierto un
nuevo campo para la tecnología del procesamiento de proteínas.
Las caperoninas, también conocidas como
proteínas de choque térmico o HSP; son proteínas naturales que
ejercen un papel biológico en el plegamiento de proteínas. Véase
para una revisión extensiva
http://www-emm-cbcu.cam.ac.uk/000021015h.htm
de Julia C. Ranford, Anthony R.M. Coates y Brian Handerson.
Técnicamente, las caperoninas se estudian de
forma intensiva como medios para afrontar el problema anteriormente
citado de la estabilización y replegamiento de proteínas.
Esta búsqueda conduce a caperoninas nuevas
descubiertas y a su uso para la estabilización de proteínas, véase,
por ejemplo, el documento US 5.428.131, de la Universidad de Yale.
Para una ilustración de caperoninas para el problema técnico
afrontado por la presente invención, véase, por ejemplo, el
documento US 5.688.651, de la Universidad de RAMOT; documento US
5.646.249, del Departamento de Sanidad de Estados Unidos; documento
US 5.561.221, de Nippon Oil Company Limited, documento WO 00/20606,
de Reiman y Schimbeck, documento JP 11266865, de Kaiyo
Biotechnology Kenkyusho KK, documento WO 99/40435, de Netzer;
documento JP 10327869, de Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK;
documento WO 00/71723, de Roche Diagnostics; documentos WO 00/55183
y WO 99/05163, de Medical Research Council.
Las caperoninas son una herramienta útil para la
estabilización y re-plegamiento de proteínas, pero
de su uso se desprenden algunas desventajas técnicas. Debido a que
son proteínas, son proclives a la alteración, tal como a alteración
térmica, de modo que están muy necesitadas de algo de factor
protector.
Para el campo técnico de proteínas de
estabilización, este problema es también muy importante para la
preparación de vacunas de cáncer de HSP. Se ha observado que la
inmunogenicidad de un antígeno dado se vuelve mucho más eficiente
cuando se presenta a células inmunes en un complejo con HSP (Requena
JM y col, Ars-Pharm 1997, 38 (2-3):
191-208; Castellino F, y col., J Exp Med 2000,
191(11):1957-1964). De forma particular, la
respuesta inmune a cáncer se refuerza con HSP (es decir, HSP70 o
gp96) que están unidos a un péptido de antígeno ("huellas
dactilares antigénicas específicas"), ambos se obtienen de las
células cancerígenas del paciente (Yedavelli Sp y col Int J Mol Med
1999, 4(3): 243-248). Es por tanto importante
tener HSP estable y/o bien conservado para vacunas de cáncer.
De forma interesante, algunas caperoninas, tales
como las proteínas alfa-cristalina del cristalino
del ojo, son miembros de la familia de las proteínas de choque
térmico pequeñas (HSP), se ha demostrado que las HSP funcionan en
una pluralidad de diferentes procedimientos que van desde la
estabilización de RNA a la inhibición de la elastasa e interacción
con el citoesqueleto.
La alfaA-cristalina se localiza
principalmente en el cristalino con muy bajos niveles en otros
tejidos, mientras que la alfaB-cristalina se sabe
ahora que está esencialmente omnipresente en todo el cuerpo (Haley
DA y col, J Mol Biol 1998, 277:27-35). La
importancia biológica de la alfaB-cristalina es
realzada por sus elevados niveles en corazón isquémico y en los
cerebros de pacientes con esclerosis múltiple, enfermedad de
Alzheimer y otras enfermedades neurológicas. En consistencia, con
su clasificación como una HSP, la expresión de la
alfaB-cristalina se ha demostrado que es inducida
por una variedad de tensiones fisiológicas incluyendo calor, estrés
osmótico, y toxicidad por metales. La importancia biológica de la
alfaA-cristalina en cristalino es realzada por su
supresión eficiente de agregación no controlada de proteínas
dañadas.
Swamy-Mruthinti y col. (FASEB
Journal, vol. 14, número 4, 15 de Marzo de 2000, página A504)
describen la inhibición de la glicación y cambios mediados por
glicación por parte de L-carnitina en cristalinos de
rata diabética, lo que sugiere un uso potencialmente terapéutico de
L-carnitina en el tratamiento de complicaciones del
ojo por
diabetes.
diabetes.
Peluso y col. (Journal of Cellular
Biochemistry, 80:1-10 (2000)) describen el papel
metabólico de L-carnitina como osmolito.
Tal como se desprende de los anteriores
ejemplos, la estabilización de caperoninas, bien para su uso o para
la estabilización de las mismas en aquellos estados patológicos en
los que estas son alteradas, es muy importante en el campo
médico.
Se ha encontrado ahora que la
L-carnitina tiene un efecto sorprendente en la
estabilización de proteínas, y en un aspecto particularmente
favorable para el campo médico, la L-carnitina tiene
un efecto sorprendente en la actividad protectora de la caperona,
ejerciéndose esta actividad protectora mediante un efecto
estabilizante de L-carnitina hacia la actividad de
la caperona.
Por tanto, es un objeto de la presente invención
el uso de L-carnitina o de una sal de la misma para
la estabilización de proteínas, en particular como factor auxiliar
en la actividad protectora de la caperona.
De acuerdo con la presente invención, se usa
L-carnitina para conservar la actividad de la
proteína caperona alterada, alfacristalina, en particular alfaA- o
alfaB-cristalina como se establece en las
reivindicaciones.
El anterior objeto de la presente invención se
ilustrará con detalle también por medio de ejemplos.
Para la sal farmacéuticamente aceptable de
L-carnitina, es válida cualquier sal orgánica e
inorgánica, adecuada para uso en el campo médico, humano y
veterinario. En el campo general de estabilización de proteína se
puede usar cualquier sal, con la condición de que sea compatible con
la aplicación específica.
Ejemplos de sales farmacológicamente aceptables
de L-carnitina, aunque no exclusivamente estos, son
cloruro; bromuro; yoduro; aspartato; aspartato ácido; citrato;
citrato ácido; tartrato; tartrato ácido; fosfato; fosfato ácido;
fumarato; fumarato ácido; glicerofosfato; glucosa fosfato; lactato;
maleato; maleato ácido; mucato; orotato; oxalato; oxalato ácido;
sulfato; sulfato ácido; tricloroacetato; trifluoroacetato;
metanosulfonato; pamoato y pamoato ácido.
El cristalino ocular es un órgano transparente
constituido por una matriz altamente concentrada y altamente
ordenada de proteínas estructurales, denominadas "cristalinas",
que son probablemente las mayores proteínas vivas del cuerpo
(Wistow, G., y Piatigorsky, J. (1988), Ann. Rev. Biochem, 57,
479-504; Biomendal, H: (1982) Biochem. 12,
1-38; Bettelheim, F.A. (1985) The Ocular Lens.
Structure, Function, and Pathology, (Maisel H. ed.) páginas
265-300, Marcel Dekker, Inc, Nueva York; Tardieu,
A., y Delay, M. (1988), Ann. Rev. Biophys. Chem. 17,
47-70).
Las modificaciones
post-translacionales de cristalina de la cristalina
del cristalino, consecuencia del envejecimiento o enfermedades
tales como diabetes, puede dar lugar a cambios de conformación y
agregación de estas proteínas, y conducir a la opacificación del
cristalino y formación de cataratas (Harding, D. (1981), Molecular
and Cellular Biology of the Eye Lens (Bioemendal H., ed) páginas
327 a 365, John Wiley and Sons, Nueva York). Si bien los mecanismos
de cataratogénesis no son bien entendidos, la oxidación de proteínas
del cristalino se asocia con cataratas en mamíferos (Francis, P.J.
(1999), Trends in Genetics 15, 191-196).
El cristalino sufre estrés oxidante agudo debido
a que está expuesto de forma constante a luz y oxidantes (Varma,
S.D., y col. (1984), Curr Eye Res 3, 35-57, Spector,
A. (1995), FASEB J. 9, 1173-1182; Taylor, A., y
Davies, KJ. (1987), Free Radic Biol Med 3, 371-377;
Zigman, S. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human
Lens (Ducan G. ed.) páginas 117-149, Academic Press,
Nueva York; I. Dillon, J. (1985), The Ocular Lens. Structure,
function, and Pathology, Maisel H. ed., Marcel Dekker, Inc. Nueva
York, 349-366 Zigman, S. (1985), The Ocular Lens.
Structure, Function and Pathology (Maisel H. ed) páginas
301-347 Marcel Dekker, Inc., Nueva York). Las
modificaciones por oxidación incluyen oxidación selectiva de
aminoácidos específicos que da lugar a alteraciones de carga,
degradación de proteínas, reticulación de proteínas e
insolubilización, y mayor fluorescencia no debida al triptófano
(Spector, A., y Gamer, W.H. (1981), Exp Eye Res. 33,
673-681 Andley, U.P. (1987), Photochem. Photobiol.
46, 1057-1066 Davies, K.J.A. y col (1987), J Biol
Chem 262, 9914-9920 Augusteyn, R.C. (1981),
Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.)
páginas 72-115, Academic Press, London Zigler, J.S.
Jr y col (1989), Free Radic Biol Med. 7, 499-505).
En consecuencia, el cristalino ha desarrollado sistemas y
mecanismos de reparación para contrarrestar el efecto de los
oxidantes. La primera línea de defensa contra el estrés oxidante
está constituida por antioxidantes de limpieza de radicales que
reducen el ataque oxidante. Por ejemplo, glutationa (GSH) y taurina,
que se encuentran ambas altamente representados en el tejido del
cristalino, ejerciendo efectos protectores en un modelo in
vitro de catarata diabética (Richard RC y col (1998), Proc Soc
Exp Biol Med 217, 3 97-407 Jones, R.A.V. y
Hothersall, J.S. (1999), Exp Eye Res. 69, 291-300).
Además, la \alpha-cristalina, que constituye hasta
el 50% de la masa proteica total del cristalino de mamíferos, actúa
como una caperona molecular que evita la agregación inducida por
calor de numerosas proteínas y es requerida para la
re-naturalización de proteínas desnaturalizadas
químicamente (Jones, R.A.V. y Hothersall, J.S. (1999), Exp Eye Res.
69, 291-300). Un elemento clave de la función de la
\alpha-cristalina es su capacidad para prevenir
las asociaciones de proteínas aberrantes mediante unión a
superficies hidrófobas de proteínas expuesta de forma transitoria
(van den Ussel P.R. y col. (1996), Ophtalmic Res. 28,
39-43). Ya que la
\alpha-cristalina previene la agregación de
proteínas in vitro inducida tanto por radiación ultravioleta
como por radicales libres (Groenen PJ y col (1994) Eur. J. Biochem.
225, 1-19 Andley, U.P. y col (1998) J Biol Chem.
273, 31252-31261; Lee, J.S. y col (1997) J Protein
Chem. 16, 283-289; Kramps, J.A. y col (1978),
Biochem Biophys Acta 533, 487-495; Van Kleef,
F.S.M., y col. (1976), Eur J Biochem 66, 477-483
Smulders, R.H.P.H. y col (1996), J Biol Chem 271,
29060-29066), esto también puede proteger proteínas
del cristalino de cambios fotoxidantes in vivo.
La patente de Estados Unidos número 5.037.851,
concedida el 6 de Agosto de 1991, con una reivindicación de
prioridad de 14 de Noviembre de 1988, a nombre del mismo cesionario
de la presente invención, reivindica un procedimiento terapéutico
para el tratamiento de cataratas que comprende la administración por
vía oral o parenteral a un sujeto que tiene cataratas, de 1000 a
2000 mg/día de acetil-D-carnitina o
una cantidad equivalente de una de sus sales farmacológicamente
aceptables. Las indicaciones de esta patente se limitan a
acetil-D-carnitina.
El presente inventor y colegas demostraron
previamente que en diabetes animal experimental la disminución de
carnitina del cristalino, una molécula omnipresente implicada en
muchas rutas biológicas, es un fenómeno precoz importante y
selectivo, relacionado posiblemente con la formación de cataratas
(Pessotto P, y col. (1997) Exp. Eye Res. 64,
195-201). En este documento, se ha descrito cómo en
los estados diabéticos hay una pérdida de
L-carnitina en el cristalino y las cantidades de
carnitina en los tejidos del otro ojo parecen sustancialmente no
afectados. Los autores concluyen que el papel de la
L-carnitina en el cristalino aún no está claro,
pero su pérdida puede relacionarse con la aparición de cataratas.
Hay una fuerte insinuación en esta referencia al uso de
acetil-carnitina, dando una buena razón para esperar
el éxito en la prevención de la aparición de cataratas mediante una
acción farmacológica, como se ha demostrado para la aspirina. La
razón para esperar una acción favorable por parte de la acetil
carnitina, a la vista de la acción bien conocida de la aspirina, es
que ambos compuestos tienen propiedades acetilantes que, por otra
parte son responsables de la protección de las proteínas del
cristalino.
Además de su función primaria como un vehículo
para ácidos grasos de cadena larga desde el citoplasma a los sitios
de \beta-oxidación, se ha anticipado que la
L-carnitina podría servir también para mantener la
homeostasis celular.
Swamy-Mruthinti, S., y Carter,
A.L. (1999), Exp Eye Res 69, 109 a 115 demuestran que la
L-carnitina resulta inefectiva en la glicación in
vitro de cristalinas del cristalino, mientras que la
acetil-L-carnitina y el ácido
acetilsalicílico disminuyeron la glicación de cristalina. Estas
consideraciones explican porqué los niveles de
L-carnitina en diversos tejidos animales no se
correlacionan de forma invariable con los requerimientos de energía
del tejido o con el metabolismo de lípidos. Por ejemplo, el
cristalino del ojo, un tejido no vascularizado cuya fuente
principal de energía es la glucosa absorbida desde los fluidos
oculares, tiene mayores concentraciones de
L-carnitina que otros compartimentos oculares
(Pessotto, P. y col (1994) J. Ocul. Pharmacol. 10,
643-651).
Se pretende usar L-carnitina y
sus sales farmacéuticamente aceptables para producir una composición
farmacéutica oftálmica para el tratamiento terapéutico de cataratas,
en particular cataratas de origen no diabético. En la práctica, una
cantidad terapéuticamente efectiva de L-carnitina o
una cantidad equivalente de una de sus sales farmacéuticamente
aceptables se administra al ojo, opcionalmente comprendiendo un
principio activo adicional útil para el tratamiento de cataratas de
origen no diabético.
Preferiblemente, la composición se encuentra en
la forma de un colirio. El colirio se aplica en la extensión de
necesidad terapéutica, como se determine por parte del especialista
en la técnica y en función de las condiciones del paciente, la
gravedad de la enfermedad y cualquier otro factor considerado por el
especialista en la técnica. Por ejemplo, puede ser adecuado de 2 a 3
gotas de 3 a 4 veces al día.
Las composiciones para el colirio comprenden la
solución isotónica estéril habitual. La elección de los excipientes
adecuados se encuentra dentro de las capacidades de un especialista
en tecnología farmacéutica. Por ejemplo, se hace uso de excipientes
tales como cloruro de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de
potasio monobásico, cloruro de benzalconio y alcohol etílico. La
composición se lleva hasta el volumen correcto con agua
destilada.
Se anestesiaron ratas
Sprague-Dawley de cuatro meses de edad con 5 mg/kg
de xilazina y 65 mg/kg de quetamina, y se decapitaron.
Inmediatamente después, se sacaron los ojos, se extrajeron y se
colocaron en 2 ml de medio TC-199 modificado. Se
valoró la integridad del cristalino mediante medida de proteína
lixiviada en el medio después de 30 a 60 minutos de cultivo; se
desecharon los cristalinos dañados. Se dispuso un cristalino de
cada par en medio de cultivo sin H_{2}O_{2} y se usó como un
control. Después de 24 horas de cultivo los cristalinos de control
no diferían de los cristalinos recién extraídos en alguno de los
parámetros evaluados en este estudio. El cristalino controlateral
de cada par se dispuso en medio y, tras equilibrado en CO_{2} al
5% a 37ºC, se expuso a H_{2}O_{2} 500 \muM en ausencia o
presencia de L-carnitina 300 \muM. Después de 24
horas de incubación se registraron las características y cambios
morfológicos, y se fotografiaron los cristalinos. Se aclararon los
cristalinos incubados con solución salina, se secaron sobre papel de
filtro, se pesaron, y luego se procesaron inmediatamente para el
análisis bioquímico. Para determinar la pérdida de lactato
deshidrogenasa (LDH) se incubaron los cristalinos individualmente en
un medio diferente, y se recogió diariamente medio y se conservó
para análisis de LDH.
Se homogenizaron los cristalinos descapsulados
con trituradores desechables y luego se sometieron a ultrasonidos en
tampón de extracto (HEPES 20 mM, EDTA 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM,
NaCl 450 mM, glicerol al 25%, leupeptina 0,5 \muM/ml, protinina
0,5 \mug/ml, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 0,5 mM) en hielo. Se
retiraron alícuotas de homogenato de cada uno de los cristalinos
incubados para análisis de GSH y L-carnitina. Se
centrifugó el resto durante 25 minutos a 20.000 x g para separar el
sobrenadante del agregado. Se lavó el agregado con 1,0 ml de tampón
y se secó en nitrógeno. Esta fracción se denominó "fracción
insoluble en agua". Se dializó la fracción de sobrenadante dos
veces junto con 3 ml de tampón de fosfato 0,025 mol/l, pH 7,4
durante 48 horas y se liofilizó. Esta fracción se denominó fracción
"soluble en agua". Se eliminaron los lípidos en las fracciones
soluble en agua e insoluble en agua con 3,0 ml de cloroformo:metanol
(2:1) durante 16 horas con agitación seguido de centrifugación a
2000 g durante 5 minutos.
Después de eliminar el disolvente orgánico, se
trató el residuo con 2,0 ml de dietiléter, se dejó reposar durante 5
minutos y luego se centrifugó a 2000 g durante 5 minutos. Se secó el
agregado en aire y se conservó a 4ºC en un desecador.
Se aislaron las fracciones de cristalina
solubles en agua mediante cromatografía de exclusión molecular con
Sephacryl S-300-HR preparativa como
se describió previamente (Smulders, R.H.P.H. y col (1996), J Biol
Chem 271, 29060-29066, de Jong, y col (1974), Eur J
Biochem, 48, 271-276). De forma resumida, se aplicó
la proteína soluble a una columna de 100 x 1,5 cm y se desarrolló
isocráticamente con tampón de fosfato. Se concentraron las
fracciones totales de cristalinos de control y tratados con
H_{2}O_{2} \pm L-carnitina mediante
ultrafiltración en un equipo Diaflo y se comprobó su pureza mediante
SDS-PAGE, llevado a cabo de acuerdo con Laemmli
usando un sistema Bio-Rad
Mini-Protean II. Se midieron las concentraciones de
proteína con un kit de ensayo de proteína Bradford
(Bio-Rad).
Se aplicó homogenato de cristalino total sobre
geles de dodecilsulfato de sodio (SDS) con gradiente de 4 a 20%
usando tampones de tricina y luego se transfirió a membranas de
poli(difluoruro de vinilideno). Se realizó el Western
blotting como se describe en otra parte (Kim, S.Y. y col (1995), J
Invest Dermatol 104, 211-217). La concentración de
anticuerpos fue de 5 \mug/ml para anticuerpo primario (isopéptido
anti-\gamma-glutamil-\varepsilon-lisina)
y de 0,1 \mug/ml para anticuerpo secundario. Se analizó luego la
mancha mediante quimioluminiscencia potenciada (Pierce, Milán,
Italia). Subsiguientemente se apartaron las bandas de peso molecular
muy alto, se eluyó en tampón de SDS que contiene tricina, se
liberaron del SDS mediante extracción del par iónico (Konigsberg,
W.H., y Henderson, L. (1983) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos, 80,
2467-2471), y se sometieron a análisis de
aminoácidos.
Medida de reticulaciones de isopéptido en
proteínas insolubles en agua.
\newpage
Se suspendieron las proteínas insolubles en agua
en acetato de N-etilmorfolina 0,2 M (pH 8,1). Se usó
una alícuota (al 10%) para cuantificar la cantidad de proteína
total. Se digirieron las muestras mediante la adición secuencial de
enzimas proteolíticas (colagenasa, pronasa, aminopeptidasa y
carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B y carboxipeptidasa y),
directamente a la mezcla de reacción a 37ºC en presencia de azida
sódica al 0,02%. Después de la digestión enzimática se resolvió la
reticulación del isopéptido
N-(\gamma-glutamil)lisina libre mediante
HPLC y se cuantificó mediante análisis de aminoácidos (Hohl, D., y
col (1991), J. Biol Chem, 226, 6626-6636). En un
grupo relacionado de experimentos se determinó el contenido de
isopéptido de cristalinos sin extracción previa.
La pérdida de fluorescencia de la proteína
triptófano, un indicador de la oxidación del triptófano, parece ser
un marcador de la integridad de la cristalina. Por tanto se midió la
fluorescencia del triptófano en cristalina del cristalino
(espectrofotómetro Perkin-Elmer
650-40) de acuerdo con un procedimiento descrito
previamente (Jones, R.H.V., y Hothersall, J.S. (1993), Exp Eye Res
57, 783-790). La longitud de onda de excitación se
estableció en 295 nm, y se detectó la emisión de fluorescencia a 330
nm.
Evaluación de la actividad de la caperona
molecular de \alpha-cristalinas en cristalinos de
rata de control y tratados in vitro.
Se realizaron los siguientes experimentos
esencialmente como se describe en otra parte (Horwitz, J. (1992)
Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 89, 10449-10453).
Se determinó la actividad tipo caperona de
\alpha-cristalina de cristalinos de control y
tratados con H_{2}O_{2} \pm L-carnitina
mediante estudios de desnaturalización con calor. Se valoró como
sigue la extensión en la que \betaL-cristalina
protegida con preparación de \alpha-cristalina no
modificada o modificada (usada como la proteína diana) sufre
desnaturalización y agregación inducidas por calor: se añadieron 100
\mug ó 200 \mug de \alpha-cristalina a 200
\mug de \beta_{L}-cristalina en una cubeta de
1,5 ml y se llevaron hasta un volumen final de 1 ml con tampón de
fosfato 50 mM, pH 7,0. Se dispuso la cubeta en un soporte de célula
con regulación de temperatura unido a un espectrofotómetro UV. Se
siguió la dispersión de luz debida a la desnaturalización y
agregación de proteína a absorbancia de 360 nm durante 3.000
segundos a 55ºC o durante 1.800 segundos a
58ºC.
58ºC.
Ensayos de ensamblaje de filamento intermedio y
viscosidad que implican \alpha-cristalinas.
Se usó el ensayo de sedimentación ideado por
Nicholl y Quinlan (Nicholl, I.D., y Quinlan, R.A. (1994), EMBO J 13,
945-953) para valorar la inhibición inducida por
\alpha-cristalina del ensamblaje de filamento
intermedio. Se usó para estos estudios proteína ácida fibrilar de
la glía (GFAP) porcina purificada; ésta se purificó de la médula
espinal porcina mediante flotación axonal como se describió
previamente (Pemg, M.D., y col (1999), J. Cell Sci. 112,
2099-2112, MacLean-Fletcher, S., y
Pollard, T.D. 81980), Biochem Biophys Res Commun 96,
18-27). El ensayo de gelificación se basó en un
procedimiento usado para seguir la actividad de la proteína que se
une a actina mediante medida de la viscosidad por caída de bola
(Pemg, M.D. y col (1999), J Cell Sci. 112,
2099-2112). Se mezclaron
\alpha-cristalinas con GFAP en urea 8 M,
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM,
2-mercaptoetanol 25 mM y luego se dializó por etapas
en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0,
2-mercaptoetanol 25 mM. Se indujo el ensamblaje de
los filamentos intermedios de la GFAP en presencia o ausencia de
\alpha-cristalina, mediante la adición de un
tampón concentrado 20 veces para dar una concentración final de
clorhidrato de imidazol 100 mM, pH 6,8, DTT 0,5 mM. Se cargó una
alícuota de 100 \mul de la muestra en un tubo de vidrio y se usó
para el ensayo de la viscosidad. Se sumergió luego el tubo en un
baño de agua a 37ºC durante 1 hora antes del ensayo de gelificación.
Se dispuso luego una bola dentro del tubo y se siguió la capacidad
de la solución para soportar la
bola.
bola.
Después de una incubación de 24 horas con o sin
H_{2}O_{2} en presencia o ausencia de
L-carnitina, se sometieron los cristalinos a
procedimientos convencionales de análisis histológico. Para la
microscopía óptica se retiraron los cristalinos del medio de
cultivo, se sumergieron en medio de fijación (formalina tamponada
neutra), se deshidrataron en etanol, se clarificaron en xileno, y se
embebieron en cera de parafina para seccionamiento. Se prepararon
cinco secciones micrométricas y se tintaron con hematoxilina y
eosina. Para la microscopía electrónica de barrido se fijaron los
cristalinos mediante inmersión, durante al menos 24 horas a
temperatura ambiente, en una solución de glutaraldehído al 2,5% y
sacarosa al 6%, tamponada a pH 7,2 con cacodilato de sodio 50 mM. Se
deshidrataron muestras mediante una serie de diluciones graduadas de
etanol, se secaron en el punto crítico usando CO_{2}, se montaron
en tubos de aluminio, se recubrieron por pulverización con oro, y se
examinaron con un microscopio Leica Stereoscan 440 a un voltaje de
aceleración de 3 a 7 kV.
Para la microscopía electrónica de transmisión
se fijaron los cristalinos como se describió anteriormente para el
procedimiento de microscopía electrónica de barrido, se fijaron
posteriormente en OsO_{4} tamponado con fosfato de sodio y
potasio 150 mM (pH 7,4), se embebieron, se seccionaron y se tintaron
para la microscopía electrónica. Se examinaron en un microscopio
electrónico JEOL 100B.
Después de 24 horas de incubación, los
cristalinos incubados sin H_{2}O_{2} (cristalinos de control)
conservaron su claridad, pero aquellos expuestos a H_{2}O_{2}
500 mM se volvieron uniformemente turbios en toda la región cortical
externa y se hincharon (datos no mostrados). Como se muestra en la
tabla 1, al final de la incubación, los cristalinos tratados con
H_{2}O_{2} eran significativamente más pesados que los
cristalinos de control (47 \pm 0,2 mg frente a 25 \pm 0,1 mg).
No hubo diferencias en peso entre cristalinos de control y
cristalinos tratados con ambos, L-carnitina y
H_{2}O_{2}. Los cristalinos tratados sólo con H_{2}O_{2} se
volvieron opacos, mientras que los cristalinos tratados con
L-carnitina y H_{2}O_{2} permanecieron claros.
La microscopía óptica y electrónica mostró que la forma celular se
mantenía inalterada y que las células de fibra estaban intactas en
los cristalinos de control y en los cristalinos tratados con
L-carnitina y H_{2}O_{2}. Se observaron
balonamiento, licuefacción y distintos grados de hinchamiento de
fibra en cristalinos expuestos sólo a H_{2}O_{2}.
Concentraciones de L-carnitina y
GSH en cristalinos de control y tratados con H_{2}O_{2}.
En las condiciones experimentales no había
diferencia significativa en concentraciones de GSH y
L-carnitina en cristalinos de control, mientras que
el tratamiento con H_{2}O_{2} 500 mM provocó una caída
precipitada en niveles de GSH y L-carnitina (tabla
1). La adición de L-carnitina (300 mM) al medio de
incubación de cristalino antes del tratamiento con H_{2}O_{2}
no evitó la pérdida de GSH, pero mantenía la concentración de
carnitina casi al nivel encontrado en los cristalinos de control.
Para determinar si la disminución de GSH y
L-carnitina estaba relacionada con el daño del
cristalino se midió la pérdida de LDH en el medio. Como se esperaba,
después del tratamiento con H_{2}O_{2} la reducción en niveles
de GSH y L-carnitina estaba acompañada de un aumento
significativo de LDH en los sobrenadantes, lo que indica que la
eliminación de estos factores estaba asociada realmente con el daño
del cristalino. Para determinar el efecto protector de la
L-carnitina se incuban cristalinos en medio de
cultivo que contiene 300 mM de la molécula. Como se esperaba, la
concentración de GSH en cristalinos tratados con
L-carnitina y H_{2}O_{2} disminuyó en
aproximadamente el mismo nivel que en cristalinos expuestos a
H_{2}O_{2} sólo, pero la concentración de LDH en el medio del
cristalino tratado con L-carnitina y H_{2}O_{2}
era similar a la observada en cristalinos de control. Esto indica
que la L-carnitina puede soportar esta concentración
de H_{2}O_{2}.
Recuperación de las proteínas de alto peso
molecular en las fracciones de cristalino insolubles en agua que
contienen reticulaciones de isopéptido.
Proteínas insolubles en agua constituían sólo el
5% de las proteínas totales en cristalinos de control, pero
aumentaron al 41% de las proteínas totales en cristalinos tratados
con H_{2}O_{2} (tabla 1). Las concentraciones de proteínas
insolubles en agua en cristalinos tratados con
L-carnitina y H_{2}O_{2} eran las mismas que las
observadas en cristalinos de control.
Se determinaron las propiedades de caperona de
\alpha-cristalina soluble en agua purificada
mediante ensayo de agregación de cristalina (proteína diana).
Característicamente, \beta_{L}-cristalina se
agrega a temperaturas elevadas. La adición de
\alpha-cristalina bien evita o bien disminuye la
agregación inducida por calor de
\beta_{L}-cristalina, que se mide mediante
dispersión de luz a 360 nm. Debido a que la relación de \alpha a
\beta determina el grado de protección frente a la agregación
inducida por calor, se usó 100 \mug ó 200 \mug de
\alpha-cristalina y 200 \mug de
\beta_{L}-cristalina. Como se esperaba,
\alpha-cristalina de los cristalinos de control
ejercieron actividad de caperona. Después de la incubación con
H_{2}O_{2}, hubo una disminución significativa en la capacidad
de \alpha-cristalina para evitar la agregación
inducida por calor de \beta_{L}-cristalina,
mientras que la presencia de L-carnitina en la
mezcla de incubación de cristalino evita este efecto
negativo.
negativo.
Debido a que los filamentos intermedios tales
como GFAP son una diana fisiológica de
\alpha-cristalinas, se ensayó la actividad
caperona de \alpha-cristalina usando medida de la
viscosidad por caída de la bola en el ensayo de gelificación
(MacLean-Fletcher, S., y Pollard, T.D. (1980),
Biochem Biophys Res Commun 96, 18-27).
GFAP es una diana apropiada debido a la
propiedad de la \alpha-cristalina de disgregar
inclusiones citoplasmáticas de GFAP. En ausencia de
\alpha-cristalina, GFAP forma un gel de proteína
que soporta la bola usada en el ensayo de viscosidad. Para
determinar si el tratamiento con H_{2}O_{2} afectaba la
capacidad de la \alpha-cristalina del cristalino
para interrumpir la red de GFAP, se añadió
\alpha-cristalina del control o del cristalino
tratado con H_{2}O_{2} \pm L-carnitina al
ensayo de gelificación. La \alpha-cristalina de
los cristalinos de control inhibieron por completo la formación y
mantenimiento del gel de GFAP en el ensayo de viscosidad, mientras
que la \alpha-cristalina de los cristalinos
tratados sólo con H_{2}O_{2} no afectaron la gelificación.
Además, \alpha-cristalina de cristalinos tratados
con L-carnitina y H_{2}O_{2} bloqueó la
gelificación de GFAP en la misma extensión que la
\alpha-cristalina de cristalinos de control.
Se midió la fluorescencia del triptófano en
fracciones de \alpha-cristalina de cristalinos de
control y tratados para identificar cambios de conformación. En
\alpha-cristalina de cristalinos tratados con
H_{2}O_{2} hubo una pérdida de 2,7 veces de fluorescencia de
triptófano; de nuevo, L-carnitina restableció el
valor basal.
Los cristalinos expuestos a
L-carnitina y estrés oxidante permanecieron
transparentes. Aunque los presentes inventores no desean unirse a
teoría alguna, el efecto protector de la L-carnitina
no se explica fácilmente debido a que la L-carnitina
por si sola no es conocida por ejercer actividad antioxidante
(Arduini, A. y col. (1992), J Biol Chem. 267,
12673-81). La L-carnitina no redimió
el agotamiento de GSH, lo que significa que el efecto beneficioso
no estaba mediado por un aumento de GSH, por ejemplo, mediante un
efecto anaplerótico sobre NADPH, un cofactor del enzima
glutationreductasa (Pemg, M.D., (1999), J. Biol. Chem 47, 3323
5-33243. Wuensch, S.A. y Ray, P.D. (1997), Comp
Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 118, 599-605).
Más bien, el hecho de que la pérdida de LDH en el medio no aumentase
en cristalino tratado con L-carnitina y expuesto a
estrés oxidante indica que la molécula puede mantener la integridad
del cristalino. Aquí se demuestra que la actividad caperona de
\alpha-cristalina del cristalino se reduce por
estrés oxidante in vitro, y proporcionan apoyo para el
objetivo de que las proteínas del cristalino sometidas a ataque
oxidante mantengan un grado elevado de modificaciones
post-translacionales (Cherian, M., y Abraham, E.C.
(1995), Biochem Biophys Res Commun. 212, 184-189).
L-carnitina no redujo sólo las mayores
modificaciones post-translacionales de proteínas del
cristalino sino que también dio protección significativa frente a
la reducida actividad caperona de
\alpha-cristalina. Se ha demostrado que la
\alpha-cristalina suprime la agregación de
proteínas desnaturalizadas en estudios en los que mezclas de
\beta-cristalinas estresadas térmicamente
sirvieron como sustrato (Kramps, J.A. y col (1978), Biochem Biophys
Acta 533, 487-495). Se ha demostrado que el estrés
oxidante interrumpe la actividad caperona de
\alpha-cristalina, que es crucial para el
mantenimiento de la transparencia del cristalino (Zigler, J.S. Jr y
col (1989), Free Radic Biol Med. 7, 499-505; Richard
RC y col (1998), Proc Soc Exp Biol Med 217, 3
97-407). Por tanto, L-carnitina
afecta de forma beneficiosa la transparencia del cristalino actuando
directamente sobre la \alpha-cristalina.
Ambas \alpha- y
\beta-cristalinas están acetiladas
N-terminalmente. Usando análisis
spot-blot de detección combinado con espectrometría
de masas, Takernoto y col., proporcionaron evidencia de que la
metionina con terminal N-acetilado de
\alpha-cristalina se puede oxidar en sulfóxido de
metionina in vivo (Sims, N.R., y col (2000), Brain Res Mol
Brain Res. 77, 176-184). Esta oxidación de la
metionina N-terminal, que está expuesta en la parte
exterior del polipéptido, puede afectar de forma negativa la función
de la proteína. Además de la acetilación
NH3-terminal, los grupos amino de residuos de lisina
(Lys) son objeto de acetilación. Todos los siete residuos Lys de
\alpha-cristalina bovina reaccionan con aspirina,
variando la extensión de la acetilación desde 10% para Lys 88, el
menos reactivo, hasta el 60% para lys 166, el más reactivo
(Takemoto, L. y col (1992), Curr. Eye. Res. 11,
651-655; Rao, G.N. y col (1985), biochem. Biophys.
Res. Commun. 128, 1125-1127). La aspirina inhibe
tanto la glicación como la carbamoilación así como también la
agregación de proteínas del cristalino, presumiblemente mediante
acetilación de residuos de Lys (Hasan, A. y col (1993), Exp Eye Res.
57, 29-35; Cromptonm, Rixon, K.C., y Harding, J.J.
(1985), Exp. Eye Res. 40, 297-311; Rao. G.N., y
Cotlier, E. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 151,
991-996; Huby, R., y Harding, J.J. (1988), Exp Eye
Res, 47, 53-59; Ajiboye, R. y Harding D. (1989),
Exp. Eye Res. 49, 31-41; Blakytin, R., y Harding
J.J. (1992), Exp Eye Res. 54, 509-518).
Recientemente, se ha mostrado que la
acetil-L-carnitina muestra glicación
de \alpha-crisalina, en una extensión mayor que
otras cristalinas, a través de la acetilación de los sitios de
glicación potenciales (Groenen, P.J. y col (1993), Biochem J. 295,
399-404). La glicación parece ser más dañina que la
acetilación debido a que sólo los productos de glicación están
involucrados en la reticulación de proteínas y en una disminución
significativa en la actividad caperona de
\alpha-cristalina (Groenen, P.J. y col (1983),
Biochem J. 295, 399-404, Blakytin, R., y Harding
J.J. (1982), Exp Eye Res. 54, 509-518).
Claims (3)
1. Uso de L-carnitina o
una sal de la misma para conservar la actividad de la proteína
caperona alterada \alpha-cristalina.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicha \alpha-cristalina es
alfaA-cristalina.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicha \alpha-cristalina es
alfaB-cristalina.
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