DE60030787T2

DE60030787T2 - Verwendung von l-carnitin als stabilitsator für proteine

Info

Publication number: DE60030787T2
Application number: DE60030787T
Authority: DE
Inventors: Menotti Calvani
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2000-12-15
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2020-12-16
Also published as: SK8902003A3; CY1106235T1; PL367204A1; HU230002B1; CA2434911A1; US20040120967A1; HUP0400737A3; DE60030787D1; EP1341813B1; AU2001223953A1; ES2272351T3; MXPA03006266A; WO2002048190A1; SK287787B6; CA2434911C; ATE339445T1; HUP0400737A2; PT1341813E; US7833977B2; EP1341813A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Stabilisierung von Proteinen, insbesondere die therapeutischen Gesichtspunkte der Proteinstabilisierung.
Hintergrund der Erfindung
Bei der Herstellung von Proteinen und Polypeptiden, entweder durch Extraktion oder durch rekombinante Biotechnologie-Verfahren, besteht das Problem, die korrekte Faltung des Proteins beizubehalten, um dadurch seine gewünschte Aktivität aufrecht zu halten.
Unfaltung oder inkorrekte oder sonst wie modifizierte Faltungen können wegen der technischen Manipulation oder dem allgemeinen Ver- und Bearbeitungssystem der Herstellung der Proteine auftreten.
Ein weiteres Problem bei der Be- bzw. Verarbeitung von proteinhaltigem Material ist durch die Aggregation der Proteine gegeben.
Viele Lösungsvorschläge werden im Stand der Technik angeboten. Einige davon sind in besonderem Maße chemischer Natur, was bedeutet, dass chemische Reagenzien, wie z.B. besondere Mischungen von Salzen, nachgerade in Pufferlösungen verwendet werden.
In US 5,728,804 von Research Corporation Technologies ist ein Verfahren zur Proteinrenaturierung mittels Detergens-freier Cyclodextrine offenbart. US 5,563,057 von Wisconsin Alumni Research Foundation vermittelt, anders als bei Cyclodextrin, die technische Lehre zur Verwendung bestimmter Detergenzien zur erneuten Faltung fehlgefalteter Enzyme.
US 5,874,075 von Amgen offenbart Protein:Phospholipid-Komplexe zur Stabilisierung von Proteinen gegen thermisch-induzierte Aggregation, Denaturierung und Aktivitätsverlust.
In US 5,756,672 von Genentech ist eine Zusammensetzung angegeben, die ein Polypeptid in einem bestimmten Puffer umfasst, wobei sich der genannte Puffer zur erneuten Faltung unsauber gefalteter Polypeptide eignet. Eine besondere Ausgestaltung ist für die erneute Faltung von fehlgefaltetem Insulin-artigen Wachstumsfaktor-I angegeben.
Die obigen Verfahren könnten einfach und bequem ablaufen, da leicht verfügbare Chemikalien eingesetzt werden, wobei es aber auch einige Sonderfälle für bestimmte eingesetzte Chemikalien, z.B. für Kupfer- oder Mangansalze, geben kann ( US 5,756,672 ).
Eine erneute Faltung ergibt sich auch durch chromatografische Verfahren, siehe M. M. Altamirano et al., Nat. Biotechnol., Febr. 1999; 17(2): 187–91.
Das Auffinden von Chaperoninen hat ein neues Gebiet für die Technologie der Proteinbearbeitung eröffnet.
Chaperonine, die auch als Hitzeschock-Proteine oder HSP bekannt sind, stellen natürliche Proteine dar, die eine biologische Rolle bei der Proteinfaltung spielen, siehe bezüglich eines umfassenden Überblicks http://www-ermm.cbcu.cam.ac.u/000021015h.htm von Julia C. Ranford, Anthony R. M. Coates und Brian Handerson.
Technisch sind Chaperonine intensiv als Mittel zur Bewältigung des obigen Problems der Proteinstabilisierung und deren erneuter Faltung untersucht.
Diese Erforschung führt zu neu aufgefundenen Chaperoninen und deren Verwendung zur Proteinstabilisierung, siehe z.B. US 5,428,131 von Yale University. Bezüglich eines Bildes von Chaperoninen für das in der vorliegenden Erfindung behandelte technische Problem siehe z.B. US 5,688,651 von RAMOT University; US 5,646,249 von U.S. Health Department; US 5,561,221 von Nippon Oil Company Limited; WO 00/20 606 von Reiman und Schirmbeck; JP 11 266 865 von Kaiyo Biotechnology Kenkyusho K. K.; WO 99/40 435 von Netzer; JP 10 327 869 von Kaiyo Biotechnology Kenkyusho K. K.; WO 00/71 723 von Roche Diagnostics; WO 00/55 183 und WO 99/05 163 von Medical Research Council.
Chaperonine sind ein nützliches Werkzeug zur Proteinstabilisierung und erneuten Faltung, aber einige technische Nachteile ergeben sich aus ihrer Verwendung. Da sie Proteine sind, neigen sie nachgerade zu Veränderungen, wie zu einer thermischen Veränderung, so dass sie ebenfalls eines Schutzfaktors bedürfen.
Für das technische Gebiet der Stabilisierung von Proteinen ist dieses Problem auch sehr entscheidend für die Zubereitung von HSP-Krebsimpfstoffen. Es ist beobachtet worden, dass die Immunogenizität eines gegebenen Antigens viel wirkungsvoller dargestellt wird, wenn es Immunzellen in einem Komplex mit HSPs dargelegt wird (J. M. Requena et al., Ars-Pharm. 1997, 38(2–3): 191–208; F. Castellino et al., J. Exp. Med. 2000, 191(11): 1957–1964). Insbesondere wird die Immunreaktion gegen Krebs mit HSP (d.h. mit HSP70 oder gp96) verstärkt, welche an ein antigenes Peptid gebunden werden ("spezifische antigene Fingerabdrücke"), von denen beide aus den Krebszellen des Patienten erhalten werden (Sp. Yedavelli et al., Int. J. Mol. Med. 1999, 4(3): 243–248). Es ist daher wichtig, über stabiles und/oder gut konserviertes HSP für Krebsimpfstoffe zu verfügen.
Interessanterweise sind einige Chaperonine, wie die Augenlinse-α-Kristallin-Proteine, Mitglieder der Familie der kleinen (small) Hitzeschock-Proteine (sHSP). An den sHSPs ist gezeigt worden, dass sie eine Funktion in einer Anzahl unterschiedlicher Prozesse ausüben, die von einer RNA-Stabilisierung bis zu einer Elastase-Inhibierung und einer Wechselwirkung mit dem Zytoskelett reichen.
AlpaA-Kristalliun ist hauptsächlich in der Linse lokalisiert, wobei sehr niedrige Gehaltsmengen in weiteren Geweben vorgefunden werden, wogegen alphaB-Kristalin nunmehr dafür bekannt ist, im Wesentlichen überall über den Körper hinweg vorzukommen (D. A. Heley et al., J. Mol. Biol. 1998, 277: 27–35). Die biologische Bedeutung von alphaB-Kristallin ist durch seine erhöhten Gehaltsmengen in ischämischem Herz und im Gehirn von Patienten mit multipler Sklerose, Alzheimer- und weiteren neurologischen Krankheiten hervorgehoben. In Übereinstimmung mit seiner Klassifizierung als ein HSP hat sich bei der Expression von alphaB-Kristallin gezeigt, dass es durch eine Vielfalt physiologischer Belastungen, einschließlich von Herz- und osmotischen Belastungen sowie von Metall-Toxizität, induziert wird. Die biologische Bedeutung von alphaA-Kristallin in der Linse ist durch seine wirkungsvolle Unterdrückung einer ungesteuerten Aggregation geschädigter Proteine hervorgehoben.
Swamy-Mruthinti et al. (FASEB Journal, Band 14, Nr. 4, 15. März 2000, Seite A504) berichten über die Inhibierung einer Glycierung und einer durch Veränderungen durch L-Carnitin in diabetischen Rattenlinsen mediierte Glycierung, wodurch eine potentielle therapeutische Verwendung von L-Carnitin bei der Behandlung diabetischer Augenkomplikationen nahe gelegt wird.
Peluso et al. (Journal of Cellular Biochemistry, 80: 1–10 (2000)) offenbaren die metabolische Rolle von L-Carnitin als Osmolit.
Wie aus den obigen Beispielen ersichtlich, ist die Stabilisierung von Chaperoninen entweder bezüglich ihrer Verwendung oder deren Stabilisierung in pathologischen Zuständen, in denen sie verändert werden, sehr wichtig auf medizinischem Gebiet.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist nun herausgefunden worden, dass L-Carnitin einen überraschenden Effekt bei der Stabilisierung von Proteinen und besonders günstig im Hinblick auf das medizinische Gebiet und ganze besonders zum Schutz der Chaperon-Aktivität ausübt, wobei diese Schutzaktivität über einen Stabilisiereffekt durch L-Carnitin gegenüber der Chaperon-Aktivität dargestellt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Verwendung von L-Carnitin oder eines Salzes davon zur Stabilisierung von Proteinen, insbesondere als Hilfsfaktor zum Schutz der Chaperon-Aktivität, anzugeben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird L-Carnitin zur Bewahrung der Aktivität des veränderten Chaperon-Proteins, des alpha-Kristallins, insbesondere des alphaA- oder alphaB-Kristallins, verwendet, wie in den Ansprüchen festgelegt.
Die obigen Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden nun im Details auch anhand von Beispielen erläutert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Als pharmazeutisch zulässiges Salz von L-Carnitin soll jedes organische und anorganische Salz mit der Eignung zur Verwendung auf medizinischem Gebiet, d.h. der Human- und Veterinärmedizin, gelten. Auf dem allgemeinen Gebiet der Proteinstabilisierung kann jedes Salz unter der Bedingung verwendet werden, dass es mit der spezifischen Anwendung verträglich ist.
Beispiele pharmakologisch geeigneter und zulässiger Salze von L-Carnitin sind, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Chlorid, Bromid, Jodid, Aspartat, saures Aspartat, Zitrat, saures Zitrat, Tartrat, saures Tartrat, Phosphat, saures Phosphat, Fumarat, saures Fumarat, Glycerophosphat, Glucosephosphat, Lactat, Maleat, saures Maleat, Mucat, Orotat, Oxalat, saures Oxalat, Sulfat, saures Sulfat, Trichloracetat, Trifluoracetat, Methansulfonat, Pamoat und saures Pamoat.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die Augenlinse ist ein transparentes Organ, das aus einer hoch konzentrierten und hoch geordneten Matrix aus Strukturproteinen aufgebaut ist, die als "Kristalline" bezeichnet werden, welche wahrscheinlich diejenigen Proteine des Körpers sind, die von der längsten Zeit an leben (G. Wistow und J. Piatigorsky (1988), Ann. Rev. Biochem. 57, 479–504; H. Bloemendal (1982), Biochem. 12, 1–38; F. A. Bettelheim (1985) The Ocular Lens, Structure, Function and Pathology, (H. Maisel, Hrsg.), S. 265–300, Marcel Dekker, Inc., New York; A. Tardieu und M. Delay (1988), Ann. Rev. Biophys. Chem. 17, 47–70).
Post-translationale Modifikationen von Linsenkristallin in der Folge von Alterung oder Krankheiten wie Diabetes können zu Konformationsänderungen und Aggregation dieser Proteine und zu Linsenopakifizierung und Kataraktbildung (Bildung von grünem Star) führen (D. Harding (1981), Molecular and Cellular Biology of the Eye Lens, H. Bloemendal, Hrsg.), S. 327–365, John Wiley and Sons, New York). Obwohl die Mechanismen der Kataraktogenese noch nicht ganz verstanden sind, wird eine Oxidation von Linsenproteinen mit grünem Star bei Säugern in Zusammenhang gebracht (P. J. Francis (1999), Trends in Genetics 15, 191–196).
Die Linse unterliegt einer größeren oxidativen Belastung, weil sie konstant dem Licht und oxidierenden Mitteln ausgesetzt ist (S. D. Varma et al. (1984), Curr. Eye Res. 3, 35–57, A. Spector (1995), FASEB J. 9, 1173–1182; A. Taylor und K. J. Davies (1987), Free Radic Biol. Med. 3, 371–377; S. Zigman (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (G. Ducan, Hrsg.) S. 117–149, Academic press, New York; I. Dillon J. (1985), The Ocular Lens, Structure, Function and Pathology, H. Maisel, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, 349–366; S. Zigman (1985), The Ocular Lens, Structure, Function and Pathology (H. Maisel, Hrsg.) S. 301–347, Marcel Dekker Inc., New York). Die oxidativen Modifikationen schließen eine selektive Oxidation spezifischer Aminosäuren ein, die zu Ladungsänderungen, Proteinabbau, Proteinvernetzung und Bildung unlöslicher Proteine sowie zu einer erhöhten Nicht-Tryptophan-Fluoreszenz führt (A. Spector und W. H. Gamer (1981), Exp Eye Res. 33, 673–681; U. P. Andley (1987), Photochem. Photobiol. 46, 1057–1066; K. J. A. Davies et al. (1987), J. Biol. Chem. 262, 9914–9920; R. C. Augusteyn (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (G. Ducan, Hrsg.) S. 72–115, Academic Press, London; J. S. Zigler Jr. et al. (1989), Free Radic Biol. Med. 7, 499–505). Als Folge davon hat die Linse antioxdierende Systeme und Reparaturmechanismen zur Bekämpfung der Auswirkung von Oxidanzien entwickelt. Die erste Abwehrlinie gegen Oxidationsbelastung wird durch Radikal-abfangende Antioxidanzien erstellt, die eine oxidative Verletzung verringern. Beispielsweise üben Glutathion (GSH) und Taurin, die beide in hohem Maße in Linsengewebe vertreten sind, Schutzwirkungen in einem in vitro-Modell von diabetischem grünen Star aus (R. C. Richard et al. (1998), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397–407; R. A. V. Jones und J. S. Hothersall (1999), Exp. Eye Res. 69, 291–300). Ferner fungiert alpha-Kristallin, das bis zu 50% der Gesamtproteinmasse der Säugetierlinse ausmacht, als molekulares Chaperon, das eine durch Wärme induzierte Aggregation vieler Proteine verhindert und zur Renaturierung chemisch-denaturierter Proteine benötigt wird (R. A. V. Jones und J. S. Hothersall (1999), Exp. Eye Res. 69, 291–300). Ein Schlüsselelement der α-Kristallin-Funktion ist dessen Befähigung zur Verhinderung irrtümlicher Proteinassoziationen durch Bindung an übergänglich freigelegte hydrophobe Proteinoberflächen (P. R. van den Ussel et al. (1996), Ophthalmic Res. 28, 39–43). Weil α-Kristallin sowohl eine durch UV-Strahlung als auch durch freie Radikale induzierte Aggregation von Proteinen in vitro verhindert (P. J. Groenen et al. (1994) Eur. J. Biochem. 225, 1–19; U. P. Andley et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 31252–31261; J. S. Lee et al. (1997) J. Protein Chem. 16, 283–289; J. A. Kramps et al. (1978), Biochem. Biophys. Acta 533, 487–495; F. S. M. van Kleef et al. (1976), Eur. J. Biochem. 66, 477–483; R. H. P. H. Smulders et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060–29066), mag es auch Linsenproteine vor fotooxidiativen Änderungen in vivo schützen.
In US 5,037,851 vom 06.08.1991 mit der Priorität vom 15.11.1988 derselben Anmelderin wie der der vorliegenden Erfindung ist ein therapeutisches Verfahren zur Behandlung von Katarakt (grünem Star) beansprucht, wobei man einer Person, die an grünem Star leidet, 1000 bis 2000 mg/Tag Acetyl-D-carnitin oder eine äquivalente Menge eines ihrer pharmakologisch zulässigen Salze oral oder parenteral verabreicht. Die technische Lehre aus diesem Patent ist auf Acetyl-D-carnitin eingeschränkt.
Die hier auftretenden Erfinder und Kollegen haben bereits früher gezeigt, dass bei Versuchstier-Diabetes das Absinken von Linsen-Carnitin, einem überall auftretenden Molekül, das an vielen biologischen Abläufen beteiligt ist, einen frühen wichtigen und selektiven Vorgang darstellt, der möglicherweise mit einer Katarakt-Bildung zusammenhängt (P. Pessotto et al. (1997) Exp. Eye Res. 64, 195–201). In dieser Veröffentlichung wird offenbart, wie es bei diabetischen Zuständen zu einem Verlust von L-Carnitin in der Linse kommt und die Gehaltsmengen von Carnitin in den weiteren Augengeweben im Wesentlichen unbeeinflusst zu bleiben scheinen. Die Autoren folgern, dass die Rolle von L-Carnitin in der Linse immer noch unklar ist, dessen Verlust aber mit dem Auftreten von Katarakt zusammenhängen kann. Es gibt eine starke Vermutung in dieser Literaturstelle dahingehend, Acetylcarnitin zu verwenden, wobei es gute Gründe für einen zu erwartenden Erfolg zur Verhinderung des Auftretens von Katarakt durch eine pharmakologische Wirkung gibt, wie sie für Aspirin bereits dargelegt worden ist. Der Grund für eine zu erwartende günstige Wirkung durch Acetylcarnitin, im Hinblick auf die gut bekannte Wirkung von Aspirin, beruht darauf, dass beide Verbindungen Acetyliereigenschaften aufweisen, die ihrerseits wiederum für den Schutz von Linsenproteinen verantwortlich sind.
Zusätzlich zu ihrer Primärfunktion als Träger langkettiger Fettsäuren aus dem Zytoplasma zu den Stellen der β-Oxidation, ist vorhergesagt worden, dass L-Carnitin auch dazu dienen könnte, Zell-Homeostase aufrecht zu halten.
S. Swamy-Mruthinti und A. L. Carter (1999), Exp. Eye Res. 69, 109–115, belegen, dass sich L-Carnitin als wirkungslos in einer in vitro-Glycierung von Linsen-Kristallinen erweist, während Acetyl-L-carnitin und Acetylsalicylsäure die Kristallin-Glycierung absenken. Diese Erwägungen erklären, warum L-Carnitin-Gehaltsmengen in verschiedenen Lebewesengeweben nicht invariabel mit dem Energiebedarf von Gewebe oder mit dem Lipid-Metabolismus korrelieren. Beispielsweise weist die Augenlinse, ein nicht-vaskularisiertes Gewebe, dessen Hauptenergiequelle aus Augenflüssigkeiten absorbierte Glucose ist, höhere L-Carnitin-Konzentrationen als andere Augenabteilungen auf (P. Pessotto et al. (1994), J. Ocul. Pharmacol. 10, 643–651).
Es besteht die Absicht, L-Carnitin und seine pharmakologisch geeigneten Salze zur Erzeugung einer ophthalmischen pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung von Katarakt, insbesondere eines Katarkts nicht-diabetischen Ursprungs, zu verwenden. In der Praxis wird eine therapeutisch wirkungsvolle Menge von L-Carnitin oder einer gleichwertigen Menge eines seiner pharmakologisch geeigneten Salze dem Auge verabreicht, wobei die Zusammensetzung gegebenenfalls einen weiteren Wirkbestandteil zur Behandlung von Katarkt nicht-diabetischen Ursprungs umfasst.
Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung in der Form eines Collyrium vor. Das Collyrium wird entsprechend der therapeutischen Notwendigkeit angewandt, wie sie vom Fachmann bestimmt wird und vom Zustand des Patienten, der Strenge der Krankheit und weiteren Faktoren abhängt, die vom Fachmann erwogen werden. Beispielsweise können sich 2 bis 3 Tropfen 3 bis 4 Mal täglich als geeignet erweisen.
Die Zusammensetzungen für das Collyrium umfassen die übliche sterile isotonische Lösung. Die Wahl der geeigneten Exzipienten liegt im Befähigungsrahmen des Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technologie. Beispielsweise gelangen Exzipienten wie Natriumchlorid, dibasisches Natriumphosphat, monobasisches Kaliumphosphat, Benzalkoniumchlorid und Ethylalkohol zur Anwendung. Die Zusammensetzung wird auf das korrekte Volumen mit destilliertem Wasser gestellt.
Beispiel
Materialien und Verfahren
Linsenorgan-Kultur
4 Monate alte Sprague-Dawley-Ratten wurden mit 5 mg/kg Xylazin und 65 mg/kg Ketamin betäubt und dann enthauptet. Unmittelbar danach wurden die Augen ausgekernt, entnommen und in 2 mL modifiziertes TC-199-Medium gegeben. Die Unversehrtheit der Linse wurde durch Messung des Proteins bewertet, das in das Medium nach 30 bis 60 min Kulturzeit ausgelaugt wurde; geschädigte Linsen wurden verworfen. 1 Linse von jedem Paar wurde in Kulturmedium mit keinem H₂O₂ gegeben und als Vergleich herangezogen. Nach 24 h Kulturzeit unterschieden sich die Vergleichslinsen von frisch ausgekernten Linsen in keinem der in dieser Studie bewerteten Parameter. Die controlaterale Linse jeden Paars wurde in Medium gegeben und, nach Einstellung des Gleichgewichts unter 5% CO₂ bei 37°C, 500 μM H₂O₂ in der Ab- oder Anwesenheit von 300 μM L-Carnitin ausgesetzt. Nach 24 h Inkubation wurden morphologische Charakteristika und Veränderungen aufgenommen und die Linsen fotografiert. Die Linsen wurden mit Kochsalzlösung gespült, auf Filterpapier als Blot aufgebracht, gewogen und dann sofort zur biochemischen Analyse verarbeitet. Zur Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase (LDH)-Leckage wurden die Linsen individuell im jeweiligen unterschiedlichen Medium inkubiuert und das Medium täglich geerntet und zur LDH-Analyse aufbewahrt.
Extraktion von Linsenproteinen
Entkapselte Linsen wurden mit verfügbaren Pistillen homogenisiert und dann in Extrakt-Puffer (20 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreitol, 450 mM NaCl, 25% Glycerin, 0,5 μM/mL Leupeptin, 0,5 μg/mL Protinin, 0,5 mM Phenylmethansulfonylfluorid) auf Eis einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Anteile des Homogenats aus jeder inkubierten Linse wurden zur GHS-(Glutathion)- und L-Carnitin-Analyse entnommen. Der Rest wurde 25 min lang bei 20.000 × g zur Abtrennung des Überstands von Pellets zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 1,0 mL Puffer gewaschen und unter Stickstoff getrocknet. Diese Fraktion wurde als "wasserunlösliche Fraktion" bezeichnet. Die Überstandsfraktion wurde 2 Mal gegen 3 mL 0,025 mol/L Phosphat-Puffer, pH = 7,4, 48 h lang dialysiert und gefriergetrocknet. Diese Fraktion wurde als "wasserlösliche Fraktion" bezeichnet. Die wasserlöslichen und wasserunlöslichen Fraktionen wurden mit 3,0 mL Chlorform:Methanol (2:1) 16 h lang unter Schütteln und anschließender Zentrifugation bei 2.000 × g 5 min lang von Lipid befreit.
Nach Verwerfen des organischen Lösungsmittels wurde der Rückstand mit 2,0 mL Diethylether behandelt, 5 min stehen gelassen und dann bei 2.000 × g 5 min lang zentrifugiert. Das Pellet wurde unter Luft getrocknet und bei 4°C in einem Desikkator aufbewahrt.
Zubereitung von Kristallinen
Die wasserlöslichen Kristallin-Fraktionen wurden durch präparative Sephacryl S-300-HR-Gelpermeationschromatografie isoliert, wie vorher beschrieben (R. H. P. H. Smulders et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060–29066, de Jong et al. (1974), Eur. J. Biochem. 48, 271–276). Kurz gesagt, wurde lösliches Protein auf eine Säule von 100 × 1,5 cm gegeben und isokratisch mit Phosphat-Puffer entwickelt. Die Gesamtfraktionen aus dem Vergleich und aus mit H₂O₂ ± L-Carnitin behandelten Linsen wurden durch Ultrafiltration in einem Diaflo-Apparat auf konzentriert und deren Reinheit mit SDS-PAGE gemäß Laemmli mit einem Bio-Rad Mino-Protean II-System überprüft. Die Protein-Konzentrationen wurden mit einem Bradford-Protein-Assaykit (Bio-Rad) gemessen.
Western-Blotting
Gesamt-Linsenhomogenat wurde auf 4 bis 20% Gradient-Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gele mit Tricin-Puffern gegeben und dann auf Polyvinylidendifluorid-Membranen überführt. Western-Blotting wurde wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (S. Y. Kim et al. (1995), J. Invest. Dermatol. 104, 211–217). Die Konzentration von Antikörpern betrug 5 μg/mL für primären Antikörper (anti-γ-Glutamyl-ε-Lysin-Isopeptid) und 0,1 μg/mL für sekundären Antikörper. Der Blot wurde dann durch verstärkte Chemilumineszenz entwickelt (Pierce, Mailand, Italien). Anschließend wurden die Banden mit sehr hohem Molekulargewicht ausgeschnitten, in SDS-Puffer, enthaltend durch Ionenpaar-Extraktion von SDS befreites Tricin, eluiert (W. H. Königsberg und L. Henderson (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2467–2471) und einer Aminosäure-Analyse unterzogen.
Messung der Isopeptid-Vernetzungen in wasserunlöslichen Proteinen
Die wasserunlöslichen Proteine wurden in 0,2 M N-Ethylmorpholinacetat (pH = 8,1) suspendiert. Eine Anteilsmenge (10%) wurde zur quantitativen Bestimmung der Menge an Gesamtprotein verwendet. Proben wurden durch die der Reihe nach erfolgende Zugabe von proteolytischen Enzymen (Kollagenase, Pronase, Aminopeptidase und Carboxypeptidase A, Carboxypeptidase B und Carboxypeptidase y) direkt zur Reaktionsmischung bei 37°C in der Gegenwart von 0,02% Natriumazid abgebaut. Nach enzymatischem Abbau wurde die freie N-(γ-Glutamyl)lysin-Isopeptid-Vernetzung durch HPLC aufgelöst und durch Aminosäure-Analyse quantitativ bestimmt (D. Hohl et al. (1991), J. Biol. Chem. 266, 6626–6636). In einem entsprechenden Satz von Versuchen wurde der Isopeptidgehalt der Linsen ohne vorherige Extraktion bestimmt.
Tryptophan-Fluoreszenz
Der Verlust von Protein-Tryptophan-Fluoreszenz, ein Indikator der Tryptophan-Oxidation, scheint ein Marker der Unversehrtheit von Kristallinen zu sein. Es wurde daher die Tryptophan-Fluoreszenz (Perkin-Elmer 650-40-Spektrofotometer) in Linsen-Kristallin gemäß dem vorher beschriebenen Verfahren gemessen (R. H. V. Jones und J. S. Hothersall (1993), Exp. Eye Res. 57, 783–790). Die Anregungswellenlänge wurde auf 295 nm festgelegt, und die Fluoreszenzemission wurde bei 330 nm nachgewiesen.
Bewertung der molekularen Chaperon-Aktivität von α-Kristallinen aus Vergleichs- und in vitro-behandelten Rattenlinsen
Die folgenden Versuche wurde im Wesentlichen wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (J. Horwitz (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449–10453). Die Chaperon-artige Aktivität von α-Kristallin aus Vergleichslinsen und mit H₂O₂ ± L-Carnitin-behandelten Linsen wurde durch Wärme-Denaturierungsstudien ermittelt. Das Ausmaß, bis zu welchem die unmodifizierte oder modifizierte α-Kristallin-Zubereitung β_L-Kristallin (verwendet als das Ziel-Protein) vor Wärme-induzierter Denaturierung und Aggregation schützte, wurde wie folgt analysiert: 100 oder 200 μg α-Kristallin wurden zu 200 μg β_L-Kristallin in einer 1,5 mL-Küvette gegeben und auf ein Endvolumen von 1 mL mit 50 mM Phosphat-Puffer, pH = 7,0, aufgefüllt. Die Küvette wurde in einen Temperatur-geregelten Zell-Halter gegeben, der an ein UV-Spektrofotometer angeschlossen war. Die Lichtstreuung durch Proteindenaturierung und Aggregation wurde bei 360 nm Absorption 3.000 s lang bei 55°C oder 1.800 s lang bei 58°C verfolgt und aufgezeichnet.
Zwischenfilamentanordnung und Viskositätsassayverfahren mit α-Kristallinen
Der Sedimentationsassay, entworfen von Nicholl und Quinlan (I. D. Nicholl und R. A. Quinlan (1994), EMBO J. 13, 945–953), wurde zur Analyse der α-Kristallin-induzierten Inhibierung einer Zwischenfilamentanordnung angewandt. Gereinigtes fibriläres saures Nervenbodenprotein (glial fibrillary acidic protein = GFAP) vom Schwein wurde für diese Studien herangezogen; es wurde aus dem Rückenmarkstrang des Schweins durch axonale Flotation gereinigt, wie bereits früher beschrieben (M. D. Pemg et al. (1999), J. Cell Sci. 112, 2099–2112; S. MacLean-Fletcher und T. D. Pollard (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 96, 18–27). Der Gelbildungsassay beruhte auf einem Verfahren, das zur Verfolgung der Actin-Bindungsproteinaktivität durch Kugelfall-Viskometrie angewandt wurde (M. D. Pemg et al. (1999), J. Cell Sci. 112, 2099–2112). α-Kristalline wurden mit GFAP in 8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 5 mM EDTA und 25 mM 2-Mercaptoethanol vermischt und dann stufenweise in 10 mM Tris-HCl, pH = 8,0, und in 25 mL 2-Mercaptoethanol dialysiert. Die Zusammenbauanordnung der GFAP-Zwischenfilamente wurde in der An- oder Abwesenheit von α-Kristallin durch die Zugabe eines 20-fach konzentrierten Puffers induziert, um eine Endkonzentration von 100 mM Imidazol-HCl, pH = 6,8, und 0,5 mM DTT zu ergeben. Ein Probenanteil von 100 μL wurde in ein Glasröhrchen geladen und für den Viskositätsassay herangezogen. Das Röhrchen wurde dann in ein Wasser-Bad von 37°C 1 h lang vor Durchführung des Gelbildungsassay getaucht. Eine Kugel wurde dann in das Röhrchen gegeben, und die Befähigung der Lösung, die Kugel zu stützen, wurde verfolgt und aufgezeichnet.
Mikroskopische Untersuchung der Linse
Nach Inkubation über 24 h mit oder ohne H₂O₂ in der An- oder Abwesenheit von L-Carnitin wurden Linsen Standardprozeduren zur histologischen Analyse unterzogen. Zur optischen Mikroskopie wurden die Linsen aus dem Kulturmedium entnommen, in Fixativ (neutrales gepuffertes Formalin) getaucht, in Ethanol entwässert, in Xylol geklärt und in Paraffinwachs für Schnittproben eingebettet. Schnitte von 5 μm wurden zubereitet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Zur Rasterelektronenmikroskopie wurden die Linsen durch Eintauchen über mindestens 24 h bei Raumtemperatur in eine Lösung von 2,5% Glutaraldehyd und 6% Sucrose, gepuffert auf pH = 7,2 mit 50 mM Natriumcacodylat, fixiert. Die Proben wurden durch eine abgestufte Serie von Ethanol entwässert, mit CO₂ bis zum kritischen Punkt getrocknet, auf einen Aluminium-Stumpf montiert, mit Gold-Spucker überzogen und mit einem Leica-Stereoscan-440-Mikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 3 bis 7 kV untersucht.
Zur Transmissionselektronenmikroskopie wurden die Linsen wie oben für die Rasterelektronenmikroskopie beschrieben fixiert, in OsO₄, gepuffert mit 150 mM Natrium-Kaliumphosphat (pH = 7,4), nachfixiert, eingebettet, als Schnittprobe angefertigt und zur Elektronenmikroskopie gefärbt. Die Schnittproben wurden an einem JEOL 100B-Elektronenmikroskop untersucht.
Ergebnisse
Änderungen der Linsenmorphologie
Nach 24 h Inkubation behielten die ohne H₂O₂ inkubierten Linsen (die Vergleichslinsen) ihre Klarheit bei, aber die an 500 mM H₂O₂ ausgesetzten wurden einheitlich neblig über den äußeren Kortikalbereich hinweg und quollen (Daten nicht angegeben). Wie in Tabelle 1 angegeben, waren am Ende der Inkubation die mit H₂O₂ behandelten Linsen deutlich schwerer als die Vergleichslinsen (47 ± 0,2 mg gegenüber 25 ± 0,1 mg). Es gab keine Gewichtsunterschiede zwischen den Vergleichslinsen und den mit L-Carnitin + H₂O₂ behandelten Linsen. Die mit H₂O₂ allein behandelten Linsen wurden opak, wogegen die mit L-Carnitin plus H₂O₂ behandelten Linsen klar blieben. Optische und Elektronenmikroskopie zeigten, dass die Zellform unverändert war und die Faserzellen in den Vergleichslinsen und in mit L-Carnitin plus H₂O₂ behandelten Linsen intakt waren. Ballonbildung, Verflüssigung und verschiedene Grade von Faserquellung wurden in den Linsen beobachtet, die H₂O₂ alleine ausgesetzt waren.
L-Carnitin- und GSH-Konzentrationen in Vergleichs- und mit H₂O₂-behandelten Linsen
Unter den hierin angewandten Versuchsbedingungen gab es keinen signifikanten Unterschied bei den GSH- und L-Carnitin-Konzentrationen in den Vergleichslinsen, wogegen die Behandlung mit 500 mM H₂O₂ einen jähen Abfall der GSH- und L-Carnitin-Gehaltsmengen verursachte (Tabelle 1). Die Zugabe von L-Carnitin (300 mM) zum Linsen-Inkubationsmedium vor der H₂O₂-Behandlung verhinderte den Verlust von GSH nicht, hielt aber die Carnitin-Konzentration nahezu auf dem in den Vergleichslinsen gefundenden Niveau aufrecht. Zur Bestimmung, ob die Abnahme von GSH- und L-Carnitin mit einer Linsenschädigung zusammenhing, wurde die Leckage von LDH in das Medium gemessen. Wie erwartet, wurde nach der H₂O₂-Behandlung die Abnahme bei den GSH- und L-Carnitin-Gehaltsmengen von einem signifikanten Anstieg der LDH in den Überständen begleitet, was anzeigte, dass die Erschöpfung dieser Faktoren tatsächlich mit der Linsenschädigung zusammenhing. Zur Bestimmung der Schutzwirkung von L-Carnitin wurden Linsen in Kulturmedium, enthaltend 300 mM des Moleküls, inkubiert. Wie erwartet, sank die GSH-Konzentration in mit L-Carnitin plus H₂O₂ behandelten Linsen auf ungefähr das gleiche Niveau wie in an H₂O₂ allein ausgesetzten Linsen ab, die LDH-Konzentration im Medium aus der mit L-Carnitin plus H₂O₂ behandelten Linse war aber ähnlich der in den Vergleichslinsen beobachteten. Dies zeigt, dass L-Carnitin dieser Konzentration von H₂O₂ Stand zu halten vermag.
Gewinnung von Proteinen mit hohem Molekulargewicht in den wasserunlöslichen Linsenfraktionen mit Isopeptid-Vernetzungen
Wasserunlösliche Proteine machten nur 5% der Gesamtproteine in den Vergleichslinsen aus, stiegen aber auf 41% Gesamtproteine in den mit H₂O₂ behandelten Linsen an (Tabelle 1). Die Konzentrationen wasserunlöslicher Proteine in den mit L-Carnitin plus H₂O₂ behandelten Linsen waren die gleichen wie die in den Vergleichslinsen beobachteten.
Chaperon-artige Funktion von α-Kristallin
Die Chaperon-Eigenschaften des gereinigten wasserlöslichen α-Kristallins wurden durch einen Kristallin (Ziel-Protein)-Aggreagationsassay ermittelt. In charakteristischer Weise aggregiert β_L-Kristallin bei erhöhten Temperaturen. Entweder verhindert die Zugabe von α-Kristallin die Wärme-induzierte Aggregation von β_L-Kristallin oder sie senkt diese ab, was durch Lichtstrahlung bei 360 nm gemessen wird. Da das Verhältnis von α zu β den Grad des Schutzes vor einer Wärme-induzierten Aggregation bestimmt, wurden 100 oder 200 μg α-Kristallin und 200 μg β_L-Kristallin herangezogen. Wie erwartet, übte α-Kristallin aus Vergleichslinsen eine Chaperon-Aktivität aus. Nach Inkubation mit H₂O₂ gab es eine signifikante Abnahme bei der Befähigung von α-Kristallin, die Wärme-induzierte Aggregation von β_L-Kristallin zu verhindern, wogegen die Anwesenheit von L-Carnitin in der Linsen-Inkubationsmischung diesen negativen Effekt verhindert.
Gelbildungsassay
Da Zwischenfilamente wie GFAP ein physiologisches Ziel von α-Kristallinen sind, wurde die α-Kristallin-Chaperon-Aktivität mit Kugelfallviskosimetrie im Gelbildungsassay getestet (S. MacLean-Fletcher und T. D. Pollard (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 96, 18–27).
GFAP stellt ein geeignetes Ziel wegen des Vermögens von α-Kristallin zur Disaggregierung von GFAP-Zytoplasma-Emulsionen dar. Bei Abwesenheit von α-Kristallin bildet GFAP ein Proteingel, das die im Viskositätstest eingesetzte Kugel stützt. Zur Bestimmung, ob die H₂O₂-Behandlung die Befähigung von Linsen-α-Kristallin zur Zerstörung des GFAP-Netzwerks beeinflusste, wurde α-Kristallin aus Vergleichslinsen oder aus mit H₂O₂ ± L-Carnitin behandelten Linsen zum Gelbildungsassay gegeben. α-Kristallin aus Vergleichslinsen inhibierte die Bildung und Beibehaltung des GFAP-Gels im Viskositätsassay vollkommen, wogegen α-Kristallin aus mit H₂O₂ alleine behandelten Linsen die Gelbildung nicht beeinflusste. Außerdem blockierte α-Kristallin aus mit L-Carnitin plus H₂O₂ behandelten Linsen die GFAP-Gelbildung im gleichen Ausmaß wie α-Kristallin aus Vergleichslinsen.
Tryptophan-Fluoreszenzmessungen
Die Tryptophan-Fluoreszenz wurde in α-Kristallin-Fraktionen aus Vergleichs- und behandelten Linsen gemessen, um Konformationsänderungen zu identifizieren. In α-Kristallin aus mit H₂O₂ behandelten Linsen gab es einen 2,7-fachen Verlust der Tryptophan-Fluoreszenz; wiederum stellte L-Carnitin den Basiswert erneut her.
Linsen, die L-Carnitin und oxidativer Belastung ausgesetzt waren, blieben transparent. Obgleich die hier auftretenden Erfinder nicht an eine Theorie gebunden sein wollen, ist der Schutzeffekt von L-Carnitin nicht leicht zu erklären, weil L-Carnitin per se nicht dafür bekannt ist, antioxidierende Aktivität auszuüben (A. Arduini et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 12673–81). Auch rettete L-Carnitin die GSH-Erschöpfung nicht, was bedeutet, dass der vorteilhafte Effekt nicht durch einen Anstieg von GSH durch z.B. eine anaplerotische Wirkung auf NADPH, einen Cofaktor des Glutathion-Reduktaseenzyms, mediiert wurde (M. D. Pemg (1999), J. Biol. Chem. 47, 33235–33243; S. A. Wuensch und P. D. Ray (1997), Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 118, 599–605). Vielmehr zeigt die Tatsache, dass die LDH-Leckage in das Medium in einer Linse, die mit L-Carnitin behandelt wurde und einer oxidativen Belastung ausgesetzt war, an, dass das Molekül die Unversehrtheit der Linse aufrecht zu halten vermag. Hier wird gezeigt, dass eine Linsen-α-Kristallin-Chaperon-Aktivität durch eine in vitro-Oxidationsbelastung verringert wird, und es wird der Vorschlag gestützt, dass Linsenproteine, die oxidativ verletzt wurden, einen hohen Grad post-translationaler Modifikationen aushalten (M. Cherian und E. C. Abraham (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 184–189). L-Carnitin verringert nicht nur die erhöhten post-translationalen Modifikationen der Linsenproteine, sondern ergab auch einen signifikanten Schutz vor einer abgesunkenen Chaperon-Aktivität von α-Kristallin. Bei α-Kristallin ist gezeigt worden, dass die Aggregation denaturierter Proteine in den Studien unterdrückt wurde, in denen Mischungen thermisch belasteter β-Kristalline als Substrat dienten (J. A. Kramps et al. (1978), Biochem. Biophys. Acta 533, 487–495). Es ist belegt worden, dass eine oxidative Belastung die α-Kristallin-Chaperon-Aktivität zerstört, die zur Aufrechterhaltung der Linsentransparenz entscheidend ist (J. S. Zigler Jr. et al. (1989), Free Radic. Biol. Med. 7, 499–505; R. C. Richard et al. (1998), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397–407). Daher beeinflusst L-Carnitin in vorteilhafter Weise die Linsentransparenz durch direkte Einwirkung auf α-Kristallin.
Sowohl α- als auch β-Kristalline sind N-endständig acetyliert. Durch Siebung mit Spot-Blot-Analyse (Fleck-Punkt-Analyse), kombiniert mit Massenspektrometrie, lieferten Takemoto et al. einen Beleg dafür, dass das endständig N-acetylierte Methionin von α-Kristallin zu Methioninsulfoxid in vivo oxidiert werden kann (N. R. Sims et al. (2000), Brain Res. Mol. Brain Res. 77, 176–184). Diese Oxidation des N-endständigen Methionins, das zur Außenseite des Polypeptids freigelegt wird, kann die Funktion des Proteins negativ beeinflussen. Zusätzlich zur NH₃-endständigen Acetylierung sind die Aminogruppen der Lysin (Lys)-Reste einer Acetylierung unterworfen. Alle 7 Lys-Reste von Rinder-α-Kristallin reagieren mit Aspirin, wobei das Ausmaß der Acetylierung von 10% für Lys 88, des am wenigsten reaktiven Restes, bis 60% für Lys 166, dem reaktivsten Rest, variiert (L. Takemoto et al. (1992), Curr. Eye Res. 11, 651–655; G. N. Rao et al. (1985), Biochem. Biophys. Res. Commun. 128, 1125–1127). Aspirin inhibiert sowohl die Glycierung als auch die Carbamoylierung sowie eine Aggregation der Linsenproteine, vermutlich durch Acetylierung von Lys-Resten (A. Hasan et al. (1993), Exp. Eye Res. 57, 29–35; N. Cromptonm, K. C. Rixon und J. J. Harding (1985), Exp. Eye Res. 40, 297–311; G. N. Rao und E. Cotlier (1988), Biochem. Biophys. Res. Commun. 151, 991–996; R. Huby und J. J. Harding (1988), Exp. Eye Res. 47, 53–59; R. Ajiboye und D. Harding (1989), Exp. Eye Res. 49, 31–41; R. Blakytin und J. J. Harding (1992), Exp. Eye Res. 54, 509–518). Kürzlich ist gezeigt worden, dass Acetyl-L-carnitin die Glycierung von α-Kristallin in größerem Ausmaß als weitere Kristalline durch Acetylierung der potentiellen Glycerierungsstellen inhibiert (P. J. Groenen et al. (1993), Biochem. J. 295, 399–404). Die Glycierung scheint schädlicher als eine Acetylierung zu sein, weil nur Glycierungsprodukte an einer Protein-Vernetzung und der signifikanten Abnahme der α-Kristall-Chaperon-Aktivität beteiligt sind (P. J. Groenen et al. (1993), Biochem. J. 295, 399–404, R. Blakytin und J. J. Harding (1992), Exp. Eye Res. 54, 509–518).

Claims

Verwendung von L-Carnitin oder eines Salzes davon zur Bewahrung der Aktivität eines veränderten Chaperonprotein-α-Kristallins.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das genannte α-Kristallin alphaA-Kristallin ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, worin das genannte α-Kristallin alphaB-Kristallin ist.