ES2271764T3 - Alergenos de veneno de insectos con reactividad ige reducida y procedimiento para su obtencion. - Google Patents
Alergenos de veneno de insectos con reactividad ige reducida y procedimiento para su obtencion. Download PDFInfo
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Abstract
Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias, con alergenicidad o bien reactividad IgE disminuida, obtenible mediante la realización de las siguientes etapas del procedimiento: - obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble como "inclusion bodies" (cuerpos de inclusión), - desnaturalización de dichos agregados, insolubles, sin adición de agentes reductores, - transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con empleo de tampones ácidos, en alergenos monómeros, solubles y - realización de una diálisis final frente a agua destilada.
Description
Alergenos de veneno de insectos con reactividad
IgE reducida y procedimiento para su obtención.
La invención se refiere a alergenos de veneno de
avispa antígeno 5, recombinantes, pudiéndose diferenciar dichos
alergenos mediante plegamientos (conformaciones) de naturaleza
idéntica o de naturaleza diferente en función de la realización del
procedimiento de obtención.
Una aplicación de las formas de plegamiento que
se corresponden con la molécula natural, consiste en la diagnosis
diferencial de alergenos individuales (in vitro o in
vivo) de alérgicos, especialmente de alérgicos a los venenos de
insectos.
Las formas de plegamiento de naturaleza
diferente pueden utilizarse como medicamentos con pocas reacciones
adversas para el tratamiento inmunológico específico. De esta forma,
estas variantes de plegamiento recombinantes podrían constituir un
tratamiento más seguro que las sustancias naturales. El
procedimiento está ideado de manera que pueda llevarse a cabo una
producción biotecnológica en condiciones que son obligatorias para
los fármacos (GMP).
Las avispas y las abejas de miel son las
principales causas de alergias a la picadura de insectos y pueden
conducir a síntomas sistémicos graves hasta la anafilaxia, que puede
causar la muerte (Müller, U.R., en: Insect sting allergy, editorial
Gustav Fischer; 1990). En cuanto a las sustancias que desencadenan
la alergia de tipo 1, se trata de proteínas, glucoproteínas o
polipéptidos del veneno del insecto. Estos alergenos reaccionan
tras la inyección con las moléculas de IgE unidas a la superficie de
los mastocitos en las personan sensibilizadas. Si este tipo de
moléculas de IgE unidas a Fc\varepsilonRI se reticulan entre sí
mediante un alergeno, esto conduce a una liberación de mediadores
(por ejemplo, histamina, leucotrienos) y citocinas por la célula
efectora y con ello a los síntomas clínicos correspondientes.
Además del péptido melitina, actúan como
componentes alergénicos del veneno de las abejas las enzimas
hialuronidasa y fosfolipasa A2 (Habermann, E, 1972, Science 177,
314-322). En el caso de las avispas, también
aparecen como alergenos principales enzimáticamente activos una
hialuronidasa, que es similar a la del veneno de las abejas
(Hoffmann, D. R., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78,
337-343) y una fosfolipasa A1. El alergeno principal
más importante del veneno de avispa es el antígeno 5 para el que
hasta la fecha no se podía demostrar ninguna actividad enzimática
(King et al., 1978, Biochemistry 17,
5165-5174). Ya se han caracterizado mediante
biología molecular todos los alergenos mencionados y se han clonado
las moléculas de ADNc correspondientes (entre otros Fang et
al., 1988, PNAS, 895-899; Soldatova et
al., 1993, FEBS, 145-149; Kuchler et al.,
1989, Eur. J. Biochem. 184, 249-254). Con ayuda de
las secuencias de ADNc es posible producir alergenos recombinantes
que podrían encontrar aplicación en la diagnosis y tratamiento de
alergias (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50,
384-391).
En relación con la presente invención, el
alergeno principal, antígeno 5, tiene una importancia especial, ya
que la invención usa esta molécula. En este sentido, se trata de una
proteína no glicosilada, de aproximadamente 25 kDa de tamaño. La
secuencia primaria comprende 8 restos de cisteína, que remite a
cuatro puentes de disulfuro (Hoffman, D.R., 1993, J. Allergy Clin
Immunol. 92: 707-716). La inmunoterapia o la
hiposensibilización específica representan un enfoque clásico del
tratamiento terapéutico eficaz de las alergias al veneno de los
insectos (Müller, U.R., en: Insect sting allergy, editorial Gustav
Fischer; 1990). En ese sentido, se inyecta a los pacientes dosis
crecientes subcutáneas de extractos de alergeno naturales. En este
método, existe sin embargo el peligro de reacciones alérgicas hasta
choque anafiláctico. Como justamente en el caso de las
hiposensibilizaciones en picaduras de insecto hay que contar con
reacciones fuertes, por el momento se trata exclusivamente mediante
hospitalización.
Con los alergenos preparados de manera
recombinantes, sería posible una optimización del tratamiento,
especialmente en el caso de alergia a la picadura de insectos.
Extractos de fuentes naturales de alergenos podrían desprender
combinaciones definidas, dado el caso, ajustadas a patrones
individuales de sensibilización de los pacientes, de alergenos
altamente puros, producidos de manera recombinante (Scheiner y
Kraft, 1995). Los alergenos recombinantes, mutados de manera
específica ofrecen perspectivas realistas, que pueden conducir a una
hiposensibilización segura con tales alergenos recombinantes, en
los que se eliminan específicamente los epítopos de IgE, sin
perjudicar los epítopos de las células T esenciales para la terapia
(Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162,
2406-2414). A partir de la expresión heteróloga en
E. coli, se sabe que la mayoría de las proteínas eucarióticas
no adoptan la conformación "natural" o sólo en una pequeña
medida. Con frecuencia, una consecuencia de estos plegamientos
inadecuados es la insolubilidad de estas proteínas. Esto se observa
especialmente en el caso de las proteínas que contienen cisteína
(Kuchier et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184,
249-254). Se ha informado especialmente sobre el
antígeno 5 que la expresión en bacterias conduce a agregados
insolubles, que no poseen la conformación natural (Monsalve et
al., 1999, Protein Express Purif.
16(3):410-416). Tales agregados insolubles
no son útiles ni para la diagnosis ni para el tratamiento.
Con frecuencia, las proteínas insolubles en
E. coli se representan en un sistema de expresión eucariótico
para fines de investigación, como por ejemplo levaduras o células
de insectos (Monsalve et al., 1999, Protein Express Purif
16(3):410-416; Soldatova et al., 1998,
J. Allergy Clin Immunol 101:691-698). Sin embargo,
representan desventajas de los sistemas de expresión eucarióticos
sobre todo posibles hiperglucosilaciones (Grobe et al.,
1999, Eur J Biochem 263:33-40), procesos
proteolíticos de degradación y comparativamente pequeños
rendimientos de producto (Glover y Hames (eds.), 1995, Expression
Systems, IRL Press, Oxford-Nueva
York-Tokio). Por eso, tales proteínas no son en su
mayoría adecuadas para la aplicación alergológica en término de
diagnosis y tratamiento farmaceútico-médicos.
Los productos del procedimiento según la
invención que poseen la conformación natural pueden aplicarse de
manera ventajosa en el diagnosis in vitro e in vivo de
las alergias a picadura de avispa. Esta forma de plegamiento
idéntica a la natural está disponible para la detección de
anticuerpos IgE en procedimientos establecidos.
Por otro lado, las variantes producidas con
ayuda de la invención, que se caracterizan esencialmente por una
conformación no reactiva mediante IgE o sólo parcialmente, pueden
aplicarse como componentes hipoalergénicos en preparados para la
inmunoterapia específica. Por la expresión "hipoalergénicos",
se entiende anteriormente y a continuación, según la invención una
alergenicidad (frente al alergeno natural) de reducida a ausente,
preferentemente reducida del 5 al 95%, especialmente del 20 al 85%,
que se produce por una respuesta de IgE reducida.
En cuanto a la presente invención, se trata de
un procedimiento con el que pueden producirse alergenos
recombinantes en bacterias (E. coli). Mediante
enriquecimiento elevado de los agregados de proteína insolubles
tiene lugar una primera etapa de purificación. Estos agregados se
desnaturalizan a continuación sin adición de agentes reductores. Se
obtienen diferentes formas de plegamiento, en función de las
condiciones de diálisis que se siguen. En este sentido, es decisivo
que se trate de monómeros y moléculas solubles en agua destilada.
Una de las variantes de plegamiento solubles posee una reactividad
IgE comparable al alergeno natural y por consiguiente, puede
utilizarse para la diagnosis. Un producto de este tipo se obtiene
mediante diálisis con solución que contiene cisteína.
Las otras variantes de plegamiento solubles
alternativas son estructuralmente diferentes del alergeno natural y
destacan por una reactividad IgE disminuida o ausente. Por esta
razón, tales variantes son adecuadas para posibilitar una
inmunoterapia mejorada. Un producto hipoalergénico de este tipo se
obtiene según la invención mediante diálisis con tampones ácidos,
preferentemente en un intervalo de valores de pH entre 3,5 y 6,5,
especialmente entre 4,0 y 5,5.
Así pues, el objeto de la invención está
constituido por un correspondiente alergeno de veneno de avispa,
antígeno 5, recombinante; que se caracterizan porque tiene una
reactividad IgE o bien alergenicidad disminuida. Según la
invención, la alergenicidad de esta proteína se reduce hasta el 95%,
en comparación con el alergeno natural.
De forma especial, el objeto es un
correspondiente alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
recombinante, especialmente de Vespula vulgaris y Vespula
germanica.
El alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias,
con alergenicidad o bien con reactividad IgE disminuidas, puede
obtenerse mediante la realización de las fases siguientes del
procedimiento:
- -
- obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble como "inclusion bodies" (cuerpos de inclusión),
- -
- desnaturalización de dichos agregados insolubles sin adición de agentes reductores,
- -
- transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con empleo de tampón ácido en alergenos monoméricos, solubles y
- -
- realización de una diálisis final frente a agua destilada.
En este caso se utilizan tampones ácidos para la
diálisis, preferentemente tampón de acetato de sodio con un valor
de pH comprendido entre 4,5 y 5,0.
Del mismo modo, constituye un objeto de la
invención un alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, combinante,
con alergenicidad o bien reactividad IgE normal, utilizándose para
la diálisis soluciones que contienen cisteína en lugar de de
tampones ácidos.
Además, el objeto de la invención consiste en
una preparación farmacéutica, que contiene un correspondiente
alergeno recombinante con reactividad IgE disminuida o bien
atenuada, así como productos auxiliares y excipientes
correspondientes.
Finalmente, constituye un objeto de la invención
el empleo de alergenos de veneno de avispa, antígeno 5, con
alergenicidad o bien reactividad IgE normal, que pueden obtenerse
según un procedimiento descrito de manera correspondiente en lo que
antecede o que se describirá a continuación para el diagnosis in
vivo e in vitro de alergias provocadas por a la picadura
de insectos.
A continuación, se describe el procedimiento en
detalle:
A modo de ejemplo, se clonaron los alergenos de
veneno de avispa, antígeno 5 de Vespula vulgaris (Ves v 5) y
antígeno 5 de Vespula germanica (Ves g 5) en el vector de
expresión pSE420 y se transformaron en la cepa bacteriana K12 M15
pREP4. En la figura 1 se encuentra un esquema de flujo del
procedimiento.
Para la producción de los alergenos
recombinantes se necesita un cultivo previo de la cepa para inocular
el cultivo de expresión. La expresión, inducida mediante IPTG,
tiene lugar en un matraz con deflector a 37ºC en medio LB y aporte
limitado de oxígeno (90 rpm/min). Las bacterias se recogen mediante
centrifugación después de expresión durante 5 horas (5000 xg, 10
min, 20ºC). La disgregación de las bacterias se produce después de
la resuspensión de las células en tampón (Tris/HCl 50 mM, 25% (p/v)
de sacarosa, pH 8,0) mediante adición de lisozima (10 \mug/g de
peso seco). Le sigue la adición del mismo volumen de solución
detergente (NaCl 0,2 M, 1% (p/v) de DOC, 1% (p/v) de Nonidet P40).
Esta solución de disgregación se trata a continuación con
ultrasonidos (3 min sobre hielo, 130 vatios, 0,5 s de impulso). Como
los productos de expresión se presentan principalmente como
agregados insolubles (cuerpos de inclusión, "inclusion
bodies"), debido a su alta densidad pueden separarse de una gran
parte de los componentes restantes (fragmentos de pared celular,
ribosomas, etc.) mediante centrifugación a 3000 xg. La otra
purificación tiene lugar mediante tres etapas de lavado sucesivas
con soluciones que contienen detergente (1% de Triton
X-100). A continuación, se desintegran los cuerpos
de inclusión purificados mediante adición de tampón de
desnaturalización (cloruro de guanidinio 6M, Tris/HCl 20 mM, pH
8,0) y se agitan durante 2 h a temperatura ambiente.
Para obtener formas de plegamiento reactivas por
IgE, la mezcla básica de desnaturalización se llena en un tubo
flexible de diálisis (límite de disgregación 12-14
kDa) y se dializa frente al volumen de solución de cisteína 100
veces mayor (cisteína 5 mM) durante 12 h, con agitación a
temperatura ambiente. A continuación, tiene lugar una diálisis
frente a agua destilada para eliminar la cisteína.
Para obtener conformaciones con reactividad IgE
disminuida, la primera diálisis se lleva a cabo frente a tampón
acetato de sodio 20 mM (pH 5,0). También aquí tiene lugar otra
diálisis frente a agua destilada. Tras la extracción, los alergenos
solubles en agua se separan de los agregados precipitados mediante
centrifugación. El sobrenadante contiene los alergenos
recombinantes solubles deseados. En vez de tampón de acetato de
sodio, también pueden utilizarse otros tampones ácidos, que puedan
actuar como tampón en un intervalo de 3,5 a 6,5, preferentemente
entre 4,0 y 5,5. En la literatura se han descrito ejemplos
suficientes de tales sistemas tampón.
Los alergenos recombinantes, precipitados, que
se forman según ambos métodos, pueden desnaturalizarse de nuevo y
tratarse según el mismo esquema. De esta forma se aumenta claramente
el rendimiento.
Después de las etapas de diálisis, los productos
tienen una pureza del 95% aproximadamente. Otras etapas de
purificación de los alergenos de veneno de insectos básicos son la
cromatografía de intercambio de cationes (tampón pH 7,2) con, por
ejemplo, Source S (Pharmacia, Friburgo, Alemania) y filtración en
gel. La filtración en gel sirve, además de para separar impurezas
mínimas de peso molecular alto y bajo, también para desalar.
Los controles de calidad de los productos se
basan en las siguientes propiedades características, que se han
reunido en forma de tabla para el antígeno 5: nAntígeno = antígeno
natural
El experto conoce y tiene acceso a las técnicas
de purificación utilizadas, así como a las técnicas de clonación y
expresión recombinantes que pueden sustituirse mediante técnicas de
procedimiento similares conocidas.
Claims (9)
1. Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias,
con alergenicidad o bien reactividad IgE disminuida, obtenible
mediante la realización de las siguientes etapas del
procedimiento:
- -
- obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble como "inclusion bodies" (cuerpos de inclusión),
- -
- desnaturalización de dichos agregados, insolubles, sin adición de agentes reductores,
- -
- transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con empleo de tampones ácidos, en alergenos monómeros, solubles y
- -
- realización de una diálisis final frente a agua destilada.
2. Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
según la reivindicación 1, caracterizado porque la
desnaturalización se lleva a cabo con cloruro de guanidinio.
3. Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque en la
diálisis se utiliza un tampón con un valor de pH entre 3,5 y
6,5.
4. Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque el alergeno es de la especie Vespula
spec., especialmente Vespula vulgaris y Vespula
germanica y Paravespula spec.
5. Preparación farmacéutica que contiene un
alergeno de veneno de avispa, antígeno 5, según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 4, así como productos auxiliares y excipientes
correspondientes.
6. Empleo de alergeno de veneno de avispa,
antígeno 5, según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, para
la obtención de un medicamento para la inmunoterapia o para la
hiposensibilización, específicas, de alérgicos al veneno de
avispa.
7. Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
recombinante, soluble en agua destilada, preparado en bacterias,
con alergenicidad o bien reactividad IgE normal, obtenible mediante
la realización de las siguientes etapas del procedimiento:
- -
- obtención de las proteínas alergenas en células bacterianas en forma insoluble como "inclusion bodies" (cuerpos de inclusión),
- -
- desnaturalización de dichos agregados, insolubles, sin adición de agentes reductores,
- -
- transformación de los productos desnaturalizados mediante diálisis con empleo de soluciones, que contienen cisteina, en alergenos monómeros, solubles y
- -
- realización de una diálisis final frente a agua destilada.
8. Alergeno de veneno de avispa, antígeno 5,
según la reivindicación 7, caracterizado porque el alergeno
es de la especie Vespula spec., especialmente Vespula
vulgaris y Vespula germanica y Paravespula
spec.
9. Empleo de alergenos de veneno de avispa,
antígeno 5, según una o varias de las reivindicaciones 7 u 8, para
la diagnosis in vitro de alergias provocadas por la picadura
de avispa.
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