CN114099461A - 用于治疗炎症的免疫修饰性颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及给受试者施用带负电的颗粒诸如聚苯乙烯、PLGA或金刚石颗粒以改善炎性免疫反应。另外，本发明描述了通过施用这些相同的带负电的颗粒来治疗炎性疾病的方法。

Description

用于治疗炎症的免疫修饰性颗粒
本申请是申请日为2014年3月13日提交，申请号为201480026034.6，发明名称为“用于治疗炎症的免疫修饰性颗粒”的中国发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2013年3月13日的美国临时申请No.61/779,182；提交于2013年7月11日的美国临时申请No.61/844,961；提交于2013年8月13日的美国临时申请No.61/865,392以及提交于2013年10月4日的美国临时申请No.61/877,212的优先权，所述美国临时申请每一份的内容据此全部以引用方式并入。
以电子方式提交的文本文件的说明
与此一起以电子方式提交的文本文件的内容全部以引用方式并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：COUR-001_01WO_ST25.txt，记录日期：2014年3月13日，文件大小1.2兆字节)。
背景技术
炎性疾病和紊乱是这样的病症，其中异常的或以其他方式失调的炎性反应促成疾病的病因或严重程度。例子包括自身免疫疾病，诸如类风湿性关节炎、多发性硬化症、乳糜泻和糖尿病；传染性疾病，诸如肺结核及各种形式的脑膜炎和脑炎，包括西尼罗病毒脑炎；以及缺血再灌注疾病，诸如心肌梗塞和移植再灌注损伤。另外，在手术、损伤或其他组织创伤之后观察到的炎症的加重可对患者的恢复具有不利影响。
这些疾病或紊乱中的许多种的特征在于组织损伤或其他损害的部位处的多核/单核细胞浸润。已在这些浸润中观察到的单核细胞的例子包括淋巴细胞、尤其是T淋巴细胞，以及单核吞噬细胞系统的细胞(MPS细胞)，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、小胶质细胞及其他细胞。
单核细胞浸润中观察到的细胞中的许多种疑似在这些异常炎性反应中具有作用。例如，在诸如多发性硬化症的疾病中，已知CD4+ T细胞在病理性自身免疫反应中起到中心作用。在T细胞活化的较早时间点，树突细胞和其他MPS细胞可负责CD4+ T细胞的活化。MPS细胞也可通过吞噬作用促进炎症，但在至少一些炎性疾病中，尚不清楚在不存在CD4+ T细胞的情况下此类细胞是否能够起到这种作用。
根据某些细胞表面分子表达与否，可将外周血单核细胞分类为一个或多个组。具体地讲，人类“定居单核细胞”或“成熟单核细胞”应理解为具有CD14loCD16+表型(小鼠对应表型为CX3CR1hiCCR2-Gr1-)。另一组细胞“炎性单核细胞”或“未成熟单核细胞”应理解为具有CD14+CD16-表型(小鼠对应表型为CX3CR1loCCR2+Gr1+)。(Geissmann F.et al.2003Immunity19:71-82(Geissmann F.等人，2003年，《免疫》，第19卷，第71-82页))
已发现炎性单核细胞在广泛范围的免疫介导的疾病和紊乱中起作用。在进入发炎组织后，LY6Chi炎性单核细胞分化成组织巨噬细胞或树突细胞(DC)，这些细胞可分泌多种促炎性细胞因子、蛋白酶和其他介质，包括一氧化氮，最终导致组织损伤、瘢痕形成，甚至死亡。(Getts et al.,2008J.Exp.Med.205:2319-2337(Getts等人，2008年，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页)；Lin et al,2011J Immunol 186:508-515(Lin等人，2011年，《免疫学杂志》，第186卷，第508-515页)；Schiopu et al.2012 Atherosclerosis 223:291-298(Schiopu等人，2012年，《动脉粥样硬化》，第223卷，第291-298页)；Swirski et al.,2010 JClin Invest 120:2627-2634(Swirski等人，2010年，《临床研究杂志》，第120卷，第2627-2634页)；Swirski et al,2009Science 325:612-616(Swirski等人，2009年，《科学》，第325卷，第612-616页)；Getts et al.,J.Neuroinflamm.In press(Getts等人，《神经炎症杂志》，出版中)；Nahrendorf et al.,2010 Circulation 121:2437-2445(Nahrendorf等人，2010年，《循环》，第121卷，第2437-2445页))。炎性单核细胞的抑制不仅减轻了病理状态，而且能够提早起始某些炎性病症中的修复机制。迄今为止，还没有安全且有效的疗法可以特异性地靶向炎性单核细胞而改变这些预后。医生依赖于广泛作用的甾类、非甾类抗炎剂或抗体，它们能短暂中和炎性单核细胞反应的组分。
考虑到炎性单核细胞和多形核细胞在大多数疾病病症中的作用、它们在血流中的治疗可及性以及它们与颗粒相互作用的固有倾向，基于颗粒的治疗剂可能比抗体或小分子更具备条件特异性地靶向这些细胞。迄今为止，该领域中的工作集中于缓释小分子治疗剂的配制，所述缓释小分子治疗剂缀合到纳米颗粒或微颗粒，以能够增强癌治疗剂或用于疫苗接种目的的抗原材料的递送(De Jong et al.,2008 Int J Nanomedicine 3:133-149(De Jong等人，2008年，《纳米医学国际杂志》，第3卷，第133-149页))。然而，不携带活性药物成分的颗粒自身的体内免疫调节潜能在大多数情况下被忽视。
天然白细胞清除及诱导细胞凋亡的能力仍然是旨在减轻与特定细胞亚群(包括炎性来源的巨噬细胞和树突细胞)相关的病理状态的疗法的主要目标。已令人惊讶地发现，衍生自聚苯乙烯、纳米金刚石或可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)的免疫修饰颗粒(IMP)在输注时会由炎性单核细胞通过胶原样结构巨噬细胞受体(MARCO)摄取，从而触发单核细胞迁移并俘获在脾中，其中它们经历半胱天冬酶3介导的细胞凋亡。可能更令人惊讶的是，炎症急性模型中的免疫修饰性颗粒(IMP)的靶向施用不仅减少炎症原发部位处的炎性单核细胞积累，而且减轻所有模型中的病理状态和疾病严重程度。IMP是炎性单核细胞所引起或增强的疾病的通用、易转化治疗选择。IMP代表新型且安全的炎性单核细胞特异性疗法。
调节性T细胞(或Treg)是外周中控制自身免疫和全身性炎症所重要的免疫调节细胞类型。Treg是通常组成型表达CD25的CD4阳性细胞。因此，Treg通常是CD4+CD25+ T细胞。这些调节性T细胞是一系列炎性病症中的T细胞介导的免疫的强效抑制因子，这些炎性病症包括但不限于传染性疾病、自身免疫、妊娠和肿瘤。在体内，少量Treg可控制大量活化的效应T细胞。虽然新鲜分离的Treg表现出极小的组成型抑制功能，但体外连接T细胞抗原受体(TCR)或者体内用高剂量自身抗原预先免疫小鼠，会刺激Treg抑制功能。TCR连接对于增强T细胞抑制功能的必要性是反常的，因为大多数T细胞被认为识别组成型表达的自身抗原。
希望在炎性情况诸如自身免疫疾病中增强Treg抑制功能，以便减轻对自身蛋白的炎性反应。相反地，例如，当尝试增强对肿瘤的免疫反应时，可能希望通过阻断Treg的功能或将Treg重编程为能够产生对所需靶标的炎性免疫反应的效应T细胞，来关闭Treg功能。
发明内容
本发明涉及这样的惊人发现：单独的修饰颗粒(即，没有偶联到其上的肽)能有效改善有需要的患者中的炎性免疫反应。令人惊讶地，抑制炎性免疫反应并治疗炎性疾病所有需要的就是施用带负电的颗粒，而不必在其上偶联肽。
在一个实施例中，本发明提供诱导受试者中的单核细胞、粒细胞和/或中性粒细胞凋亡的方法，所述方法包括给受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物。在另外一个实施例中，带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分。在一些实施例中，带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为金刚石颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。在一些实施例中，颗粒为
Figure BDA0003320877280000041
稳定的聚硫化丙烯颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒被羧化。
在一个实施例中，本发明提供受试者中的抗炎CD103+树突细胞和调节性T细胞的诱导和扩增的方法，所述方法包括给受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物。在另外一个实施例中，带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分。
在一个实施例中，本发明提供从具有炎性紊乱的受试者的炎性环境中移除促炎介质的方法，所述方法包括给受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物。在另外一个实施例中，带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分。在一些实施例中，带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为金刚石颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。在一些实施例中，颗粒为
Figure BDA0003320877280000051
稳定的聚硫化丙烯颗粒。在另外一个实施例中，带负电的颗粒被羧化。在另外一个实施例中，带负电的颗粒结合于受试者中产生的促炎多肽。
在一个实施例中，本发明提供从具有炎性紊乱的受试者的炎性环境中浓缩并递呈调节蛋白的方法，所述方法包括给受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物。在另外一个实施例中，带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分。在一些实施例中，带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为金刚石颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。在一些实施例中，颗粒为
Figure BDA0003320877280000052
稳定的聚硫化丙烯颗粒。在另外一个实施例中，带负电的颗粒被羧化。在另外一个实施例中，带负电的颗粒结合于受试者中产生的调节蛋白。
在又一个实施例中，本发明提供用于控制受试者中的病理和/或不需要的炎性免疫反应的方法，所述方法包括给受试者施用包含带负电的颗粒的药物组合物，所述带负电的颗粒预先吸收有调节蛋白，使得在施用后，带负电的颗粒浓缩并递呈调节蛋白以改善受试者中的炎性免疫反应。在另外一个实施例中，带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分。在一些实施例中，带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为金刚石颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。在一些实施例中，颗粒为
Figure BDA0003320877280000053
稳定的聚硫化丙烯颗粒。在另外一个实施例中，带负电的颗粒被羧化。
在一个实施例中，本发明提供诱导受试者中的抗原特异性耐受的方法，所述方法包括给所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含其内包埋有一个或多个抗原的带负电的颗粒，以及载体。在另外一个实施例中，带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分。在一些实施例中，带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为金刚石颗粒。在其他实施例中，带负电的颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。在一些实施例中，颗粒为
Figure BDA0003320877280000061
稳定的聚硫化丙烯颗粒。在另外一个实施例中，带负电的颗粒被羧化。在另外一个实施例中，带负电的颗粒结合于受试者中产生的促炎多肽。
在一个实施例中，颗粒偶联到包含一个或多个表位的抗原。在另外一个实施例中，表位与变态反应、自身免疫疾病或炎性疾病或紊乱相关。在一个实施例中，表位与1型糖尿病、多发性硬化症、乳糜泻或炎性肠疾病(包括克罗恩氏病或结肠炎，例如溃疡性结肠炎)相关。在一个实施例中，表位是表1或2中所述的表位。在一个实施例中，颗粒偶联到抗原，所述抗原包含与一种疾病和/或紊乱相关的仅一个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与相同疾病和/或紊乱相关的不止一个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与不同疾病和/或紊乱相关的不止一个表位。
在一个实施例中，带负电的颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。在另一个实施例中，带负电的颗粒具有小于约-50mV的ζ电势。在一个实施例中，带负电的颗粒具有-100mV与0mV之间的ζ电势。在一些实施例中，具有-75mV与0mV之间的ζ电势的带负电的颗粒被羧化。在另一个实施例中，带负电的颗粒具有-60mV与0mV之间的ζ电势。在另一个实施例中，带负电的颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。在具体实施例中，带负电的颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。在另一个实施例中，带电的颗粒具有-100mV与-50mV之间的ζ电势。在一个实施例中，带电的颗粒具有-75mV与-50mV之间的ζ电势。
在一个实施例中，本发明的药物制剂降低和/或抑制炎性单核细胞对炎性病灶的浸润。在另一个实施例中，本发明的药物制剂改善炎性免疫反应。
在一个实施例中，本发明的药物制剂增加调节性T细胞的数量。在另一个实施例中，本发明的药物制剂改善炎性免疫反应。
在一个实施例中，本发明的药物制剂包含具有约0.1μm至约10μm的平均直径的带负电的颗粒。在另一个实施例中，带负电的颗粒具有约0.2μm至约2μm的平均直径。在另外一个实施例中，带负电的颗粒具有约0.3μm至约5μm的平均直径。在再一个实施例中，带负电的颗粒具有约0.5μm至约3μm的平均直径。在又一个实施例中，带负电的颗粒具有约0.5μm的平均直径。
在一个实施例中，受试者已接受或将接受手术。在另外一个实施例中，在手术之前将带负电的颗粒施用给受试者。在再一个实施例中，在手术期间将带负电的颗粒施用给受试者。在再一个实施例中，在手术之后将带负电的颗粒施用给受试者。在另一个实施例中，受试者为移植接受者。
在另外一个实施例中，受试者最近经历了物理创伤。在另外一个实施例中，受试者最近经历了损伤。在再一个实施例中，损伤为运动损伤。在另外一个实施例中，损伤为脑震荡。
在一个实施例中，受试者具有自身免疫紊乱。在另外一个实施例中，自身免疫紊乱为多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。在具体实施例中，自身免疫疾病为多发性硬化症。在另外一个实施例中，自身免疫疾病为乳糜泻。在另外一个实施例中，自身免疫疾病为1型糖尿病。在另外一个实施例中，自身免疫疾病为炎性肠疾病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
在一个实施例中，受试者具有变应性紊乱。在另外一个实施例中，变应性紊乱为湿疹、哮喘、变应性鼻炎或皮肤超敏反应。在另一个实施例中，受试者为移植接受者。
在一个实施例中，受试者具有缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化或罹患心肌梗塞。在另一个实施例中，受试者具有牛皮癣或皮炎。
在一个实施例中，受试者具有病毒感染。在另外一个实施例中，病毒感染为疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染或副流感病毒感染。在另外一个实施例中，病毒感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。在又一个实施例中，病毒感染引起病毒性脑炎或病毒性脑膜炎。
在一个实施例中，受试者具有细菌感染。在另外一个实施例中，细菌感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。在又一个实施例中，细菌感染引起败血症细菌性脑炎或细菌性脑膜炎。
在另外一个实施例中，本发明颗粒的施用防止受试者中可能引起病理状态的中性粒细胞和其他粒细胞的积累。在另外一个实施例中，受试者具有癌。
在一个实施例中，本发明颗粒的施用增强受试者中受损组织的再生。在一个实施例中，本发明颗粒的施用增强具有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或创伤后应激紊乱(PTSD)的受试者中受损组织的再生。在另外一个实施例中，颗粒的施用增强上皮细胞的再生。在再一个实施例中，颗粒的施用增强神经元的髓鞘再生。在另一个实施例中，受试者具有自身免疫疾病。在又一个实施例中，受试者具有炎性肠疾病、溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病。在又一个实施例中，受试者具有多发性硬化症。在一个实施例中，带负电的颗粒的施用诱导受试者中的抗原特异性耐受。在一个实施例中，诱导抗原特异性耐受的颗粒包含与变态反应、自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的一个或多个表位。在一个实施例中，表位选自表1或2中所述的那些。在一个实施例中，带负电的颗粒为聚苯乙烯、金刚石、
Figure BDA0003320877280000081
稳定的聚硫化丙烯或聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。在一个实施例中，颗粒被羧化。在一个实施例中，颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。在一个实施例中，颗粒具有约-75mV与0mV之间，例如-50mV与0mV之间、或-100mV与-50mV之间、或-75mV与-50mV之间、或-50mV与-40mV之间的ζ电势。在一个实施例中，颗粒具有约0.1μm至约10μm，例如约0.2μm至约2μm、或约0.3μm至约5μm、或0.5μm至约3μm、或约0.5μm至约1μm的平均直径。
在一个实施例中，受试者具有自身免疫疾病。在一个实施例中，自身免疫疾病为多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个髓鞘碱性蛋白表位。在一个实施例中，髓鞘碱性蛋白表位为SEQ ID NO:4975或SEQ ID NO:4976中的一者或多者。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个髓鞘少突胶质细胞糖蛋白表位。在一个实施例中，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白表位为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4978中的一者或多者。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个胰岛素表位。在一个实施例中，所述一个或多个胰岛素表位为SEQ ID NO:4981。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个谷氨酸脱羧酶表位。在一个实施例中，谷氨酸脱羧酶表位为SEQ ID NO:4982。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个蛋白脂质蛋白表位。在一个实施例中，蛋白脂质蛋白表位为SEQ ID NO:4977。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个麦胶蛋白表位。在一个实施例中，麦胶蛋白表位包含SEQ ID NO:4983-4985。
在一个实施例中，所述方法包括通过任何合适的方式施用带负电的颗粒。在一个实施例中，经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用组合物。在具体实施例中，经鼻施用羧化颗粒。在又一个实施例中，经静脉内施用带负电的颗粒。在又一个实施例中，皮下施用带负电的颗粒。
在一个实施例中，所述方法包括诊断受试者中的炎性病症的方法。在具体实施例中，所述方法包括从受试者中取出血液并且将血液或源于此的血清/血浆与带负电的颗粒一起温育，以及确定是否存在表6中所列的蛋白，其中表6的一种或多种蛋白的存在指示炎性免疫反应。在另一个实施例中，所述方法包括将包含带负电的颗粒的药物组合物注射到受试者的血循环中，并且随后从血循环中取出颗粒，以及确定从受试者中取出的颗粒的表面上是否存在表6中所列的蛋白，其中表6的一种或多种蛋白的存在指示炎性免疫反应。
附图说明
图1示出了(A-G)用PS-IMP处理WNV感染的小鼠以改善疾病病理状态的能力。在≥5％体重减轻的时候用PS-IMP处理WNV感染的小鼠，使得本来会死于疾病的小鼠获得60％的存活率(a)。该效应在用聚苯乙烯中性颗粒(PSNP)处理的小鼠中显著减弱，并且在溶媒对照中不存在该效应(a)。在免疫后第7天，炎性单核细胞来源的巨噬细胞向WNV感染的小鼠的脑中的浸润在用聚苯乙烯免疫修饰性颗粒(PS-IMP)处理的小鼠中显著减少，而对于用NP处理的小鼠则减少较小程度(b)。用聚(乳酸-共-乙醇酸)免疫修饰性颗粒(PLGA-IMP)或纳米金刚石(ND)-IMP处理WNV感染的动物，也使得本来会死于感染的小鼠获得约60％的存活率(c)。IMP的负电荷对于该效应至关重要，因为在免疫后第7天，用基于聚苯乙烯的聚苯乙烯正电颗粒(PS-PP)处理WNV感染的小鼠未减少炎性单核细胞巨噬细胞向脑中的浸润(d)或改善存活率(e)。已确定促进WNV感染的小鼠的存活的PS-IMP的最佳剂量为0.355mg，相当于约4×109个颗粒(f、g)。存活数据代表10-20只小鼠/组的三个单独实验。使用Mantel-Haenszel对数秩检验进行统计分析。流式细胞术数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。使用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验进行统计分析。在将PS-IMP组和NP组与溶媒对照组进行比较时，P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P≤0.001(***)。在将PS-IMP组与NP组进行比较时，P≤0.05(#)，P≤0.01(##)，P≤0.001(###)。
图2示出了(A-G)在用PS-IMP处理时IM向脾的重定向。静脉内注射后二十四小时，FITC-PS-IMP定位于肺、脾和肝，而在脑、肾或胸腺中很少观察到(a)。在脾中，FITC-PS-IMP与模拟感染动物中类似数量的Ly6ChiΦIM、B220+ B细胞、CD3+ T细胞和NK1.1+NK细胞相关(b、c)。在WNV感染的动物中，FITC-PS-IMP主要定位于Ly6ChiΦIM(b、c)。(d)在免疫后第7天处理脾以用于流式细胞术，并且对活细胞(R1)设门。从该群体中，选择CD45+白细胞(R2)，并且对CD11b+、Ly6G-单核细胞设门以排除小群体的Ly6G+中性粒细胞(R3；d)。发现FITC-PS-IMP在WNV感染的动物中与Ly6ChiΦIM相关，相比之下，在模拟感染的动物中与Ly6Clo单核细胞相关(e)。在WNV感染的动物的免疫后第7天，输注PS-IMP及较小程度上的NP导致Ly6ChiΦIM在脾中积累(f)以及这些细胞的数量在血液中显著减少(g)。免疫组织化学数据代表3只小鼠/组的三个单独实验。用DAPI(蓝色)复染玻片以鉴定细胞核。流式细胞术数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。使用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验进行统计分析。在将PS-IMP组和NP组与溶媒对照组进行比较时，P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P≤0.001(***)。在将PS-IMP组与NP组进行比较时，P≤0.05(#)，P≤0.01(##)，P≤0.001(###)。
图3示出了(A-F)PS-IMP处理减少了炎性单核细胞向WNV感染的小鼠的CNS的归巢。在免疫后第6天，从模拟感染和WNV感染的供体的骨髓中分离Ly6Chi/CD11b+/CD11c-/Ly6G-ΦIM，在免疫后第6天，用PKH26标记并注射到匹配的接受者中，紧接着单独注射溶媒、NP或PS-IMP(a)。在免疫后第7天处理脑(b)和脾(c)以用于流式细胞术，并且对CD45hi/CD11b+巨噬细胞设门(R1)。PS-IMP显著减少了过继转移的PKH26+/Ly6Chi骨髓来源的ΦIM向脑中的浸润(b、d)，这与PKH26+细胞在脾中的积累相关(c、e)。发现超过70％过继转移的ΦIM摄取了脾中的FITC-PS-IMP(即，PKH26+/FITC+细胞；g，R1)，分化成表达CD11c和CD103的细胞(g，R2)。在5％体重减轻的时候PS-IMP向去脾小鼠中的输注(f)未能减少单核细胞向脑中的运输，其中PS-IMP处理和溶媒处理的动物具有类似数量的单核细胞，如通过流式细胞术所测定(f)。流式细胞术数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。使用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验进行统计分析。在将PS-IMP组和NP组与溶媒对照组进行比较时，P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P≤0.001(***)。在将PS-IMP组与NP组进行比较时，P≤0.05(#)，P≤0.01(##)，P≤0.001(###)。
图4示出了(A-I)炎性单核细胞表达对于IMP活性至关重要的MARCO。测试了PS-IMP抑制单核细胞向巯基乙酸盐致炎腹膜中的迁移的能力(a中所示的方案)。野生型和MARCO-/-小鼠对巯基乙酸盐注射作出类似反应，如由从腹膜分离的Ly6Chi/CD11b+单核细胞(ΦIM)的数量所测定(b、e)。在注射了巯基乙酸盐的野生型动物中在48小时时PS-IMP处理(如a中所示)显著减少了ΦIM向腹膜腔中的浸润，但未减少从MARCO-/-小鼠的腹膜腔分离的ΦIM(b、e)。发现FITC-PS-IMP(绿色)与脾边缘区中的MARCO+(红色荧光)细胞相关(c)。WNV感染上调了ΦIM上的MARCO表达(d)。在注射了巯基乙酸盐的野生型小鼠中，PS-IMP处理与脾中ΦIM数量的显著增加相关，在MARCO-/-动物中未观察到这种情况(b、e)。与MARCO-/-动物相比，从注射了巯基乙酸盐的野生型小鼠的脾中分离出显著更高数量的PS-IMP+Ly6ChiΦIM(f)。PS-IMP输注到巯基乙酸盐诱导的野生型小鼠中，导致表达细胞凋亡标记物膜联蛋白V(g、h)和半胱天冬酶-3(i)的Ly6ChiΦIM的数量显著增加。在MARCO-/-动物中未观察到这种情况。流式细胞术数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。使用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验进行统计分析。在将野生型PS-IMP组与所有其他组进行比较时，P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P≤0.001(***)。
图5示出了(A-S)PS-IMP改善了EAE、心肌炎症和炎性肠疾病中的疾病病理状态和炎性单核细胞的浸润。在用PLP139-151免疫的SJL小鼠中，在EAE发作(a)或初治复发(b)时开始的PLGA-IMP输注显著减少了平均临床评分。对自免疫后第7天起用PLGA-IMP或溶媒处理7天的小鼠的脊髓进行的流式细胞术表明，具有显著更少的炎症，如由减少的CD45+CD11b+CD11c+Ly6Chi细胞所测定(c)。这种减少的单核细胞向脊髓中的流入与脾中增加的CD45+CD11b+Ly6C+单核细胞相关(d)。作为炎症的另一种模型，还在永久左前降支动脉闭塞模型中测试了PLGA-IMP(如h中所示输注)。与溶媒处理的对照相比，如(h)中所示的PLGA-IMP输注三天导致梗塞面积减小，如“材料与方法”中所述的H&E组织学和图像分析所测定(i、j)。另外，与溶媒处理的对照相比，PLGA-IMP处理的小鼠中减小的闭塞大小与更少的CD68+巨噬细胞相关(k、l，红色荧光)。在炎症的另一种模型中，将动脉结扎45分钟，随后使血流返回。用PLGA-IMP处理小鼠6天，如(m)中所指示。在第1天和第5天，与溶媒处理的对照相比，在用IMP处理的动物中血清肌酐清除显著更大(n)。这与IMP处理的动物中减轻的肾小管萎缩相关(o)。作为炎症的另一种模型，在DSS诱导的结肠炎模型中使用(p)中所示的PS-IMP或溶媒的输注方案测试PS-IMP疗法，减轻了DSS诱导的结肠炎的总体临床严重程度(q)。减小的临床评分与减少数量的具有单核细胞(即，非多形核)形态的Gr-1+细胞相关(r、s)。EAE平均临床评分数据代表10-20只小鼠/组的三个单独实验。流式细胞术数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。心肌梗塞数据代表至少3只小鼠/组的2个实验。肾缺血再灌注数据代表至少4-5只小鼠/组的2个实验。DSS-结肠炎数据代表至少3只小鼠/组的至少3个实验。如“材料与方法”中所述的那样进行图像分析。使用不成对双尾学生T检验进行统计分析。在将PS-IMP组与溶媒对照组进行比较时，P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P≤0.001(***)。使用具有事后检验邦弗朗尼修正的双因素方差分析(ANOVA)(Graph Pad Prism 6.0软件)进行比较的统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。对于假性对照而言，n＝5；第1天每组n＝7；对于对照组而言，第5天n＝4-5(因为在第3-4天3只动物死亡。我们仅在大约第4.3天收集到一个样品，因此包括肾小管评分数据)且第5天阴性微珠n＝7。
图6示出了(A-P)IMP处理显著减少了WNV感染的脑中的炎性细胞因子水平。在免疫后第6天用PS-IMP处理模拟感染和WNV感染的小鼠，并且在免疫后第7天将脑分离并匀浆。使用多重ELISA分析细胞因子和趋化因子水平。与对照相比，在用IMP处理的WNV感染的动物的脑中观察到显著减少水平的CCL2(a)、IFN-γ(b)、IL-6(c)、TNF(d)、IL-10(e)、IL-4(f)、CCL3(g)、IL-12(h)、GM-CSF(k)、IL-1α(l)、IL-9(n)、IL-1β(o)和IL-2(p)。IMP处理时，IL-3(h)、CCL5(j)和IL-15(m)的水平未显著减少。
图7示出了(A-F)WNV感染的脑中存在很少IMP，且IMP高度有效减少腹膜炎中的炎性单核细胞。在免疫后第7天无法检测到亮蓝NP或PS-IMP。在免疫后第6天注射之后经免疫组织化学分析WNV感染的脑(a)。相似地，通过流式细胞术在WNV感染的脑中无法检测到FITC-NP或PS-IMP(b)。在C57BL/6小鼠的巯基乙酸腹膜炎模型中测试PS-IMP，如(c)所示。在巯基乙酸盐输注后24小时输注PS-IMP减少了从腹膜分离的Ly6ChiCD11b+(R3)单核细胞的数量(c、d)。该效应在去脾小鼠中被消除(e)。颗粒免疫组织化学和流式细胞术数据代表至少3只小鼠/组的三个单独实验。用DAPI(蓝色)复染玻片以鉴定细胞核。巯基乙酸盐数据代表5只小鼠/组的至少3个实验。流式细胞术数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。
图8示出了(A-G)在EAE、心肌梗塞及DSS诱导的结肠炎中的上皮修复期间IMP促进了ΦIM在脾中的积累。在PLGA-IMP输注后第14天EAE脑中观察到显著减少的CD45+CD11b+单核细胞来源的细胞的浸润(a)。与溶媒处理的对照相比，脑中单核细胞来源的细胞的减少与ΦIM在PLGA-IMP处理的动物的脾中的显著积累相对应(b)。与溶媒处理的对照相比，在心肌梗塞后，在PLGA-IMP处理的动物中观察到ΦIM在脾中的显著积累(c、d)。与H2O对照组相比，在DSS激发的第9天横结肠的Ki67+免疫组织化学染色(f)揭示了上皮中的特征Ki67+染色，而DSS激发的动物中染色相对较弱(f)。在用PS-IMP处理的DSS激发的小鼠中观察到较少隐窝脓肿(crypt fallout)(f)。此外，在这些动物中，Ki67+染色在固有层中更常见且强烈。将DSS诱导的结肠炎溶媒与PS-IMP相比较的图像分析(g)显示所观察到的Ki67差异是统计上显著的。EAE数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。心肌梗塞数据代表至少3只小鼠/组的2个实验。DSS-结肠炎数据代表至少3只小鼠/组的至少3个实验。如“材料与方法”中所述的那样进行图像分析。使用不成对双尾学生T检验进行统计分析。在将PS-IMP组与溶媒对照组进行比较时，P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P≤0.001(***)。
图9示出了经调理的IMP具有降低的抑制巨噬细胞向脑迁移的能力。从模拟或WNV感染的动物取出第7天血浆，并与PS-IMP一起温育。在免疫后第6天，将这些“经调理的”颗粒或未经调理的(未处理微珠)颗粒重新输注到WNV感染的小鼠中。在第7天，通过流式细胞术检查脑中的炎性单核细胞流入。虽然未处理(正常IMP)导致脑中减少的单核细胞流入，但模拟血浆包被IMP不能抑制单核细胞迁移。值得关注的是，相对于未包被IMP而言，WNV血清包被IMP具有降低的抑制单核细胞的能力，但仍然能够在一定程度上减少迁移。
图10示出了在TG模型中PLGA-IMP诱导炎性单核细胞和中性粒细胞两者的凋亡。PLGA-IMP输注到巯基乙酸盐诱导的野生型小鼠中，导致表达细胞凋亡标记物膜联蛋白V和半胱天冬酶-3的Ly6ChiΦIM和Ly6G+中性粒细胞的数量显著增加。在模拟处理动物中未观察到这种情况。流式细胞术数据为平均值±标准偏差，并且代表4-5只小鼠/组的三个单独实验。使用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验进行统计分析。在将野生型PS-IMP组与所有其他组进行比较时，P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P≤0.001(***)。
图11示出了(A-B)可在PLGA或PS IMP输注后2小时内检测到细胞凋亡。注射后两小时，PS-IMP定位于模拟和TG腹膜炎诱导的小鼠的脾中的CD11b+Ly6C+Ly6G-单核细胞中。PS-IMP的摄取与指示细胞凋亡的酶半胱天冬酶-3的活性相关(a)。在PS-IMP处理、TG腹膜炎诱导的小鼠中，增加数量的单核细胞对半胱天冬酶-3活性呈阳性(b)。
图12示出了PLGA-IMP避免了心肌梗塞模型中的炎性损伤。与溶媒处理的对照相比，PLGA-IMP输注四天导致梗塞面积减小，如H&E组织学和图像分析所测定。另外，与溶媒处理的对照相比，PLGA-IMP处理的小鼠中减小的闭塞大小与更少的CD68+巨噬细胞及脾中的Ly6Chi细胞的增加相关。
图13示出了PLGA-IMP输注避免了心肌缺血(LAD闭塞)-再灌注模型中的炎性损伤。将冠状动脉闭塞并在30分钟后使血流返回。用PLGA-IMP处理小鼠4天。与PBS对照动物相比，用PLGA-IMP进行处理显著减小了梗塞瘢痕大小和收缩期射血分数。
图14示出了(A)聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)颗粒的显微图。B和C示出了通过动态光散射分析对表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒进行的表征，包括PLG-PEMA颗粒的平均尺寸(nm)和ζ电势(mV)。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(Malvern ZetasizerNano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司(Malvern Instruments,Westborough,MA))上以2.5×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒群体每批差异为5-15％，但一般具有567nm的Z-平均直径、670nm的峰值直径和0.209的多分散指数。
图15示出了(A)示出了PLGA-IMP输注避免了EAE中的炎性损伤。在处理停止后，存在无病期，然而，随时间推移，疾病复发。(B)PLGA-IMP输注(而非溶媒对照)导致表达抗炎蛋白质如PD-1的调节性T细胞的扩增和诱导。(C)这些Treg在IMP处理期间最丰富，并且在处理停止后随时间推移而下降。
图16示出了(A)从具有炎性紊乱的受试者的血液中移除病原性蛋白和细胞碎片，以及(B)来自具有炎性紊乱的受试者的血流的调节蛋白的浓缩和递呈。
图17示出了示意性带负电的颗粒能够确定来自受试者血清的蛋白存在与否，以确定受试者是否正经历炎性过程。
具体实施方式
本发明人令人惊讶地发现，当给受试者施用带负电的颗粒，诸如一定尺寸和ζ电势的聚苯乙烯、PLGA或金刚石颗粒时，炎性免疫反应得以改善。另外，本发明人还令人惊讶地发现，这些相同的带负电的颗粒在施用给受试者时，会诱导受试者中的单核细胞和/或中性粒细胞凋亡及改善的清除。还令人惊讶的是，这些相同的带负电的颗粒在施用给受试者时，会诱导致耐受树突细胞、抑制细胞和调节性T细胞。还已发现，这些带负电的颗粒能从炎性环境中移除促炎介质。相似地，带负电的颗粒还可浓缩并递呈调节介质以进一步诱导调节性T细胞反应或以其他方式改善炎性免疫反应。因此，带负电的颗粒可用于治疗特征在于过度炎性免疫反应的任何疾病或病症诸如自身免疫疾病，以及可用于治疗细菌和病毒感染。最后，包埋有一种或多种抗原的颗粒会诱导受试者中的抗原特异性耐受。
如本文所用的“颗粒”是指任何非组织来源的微小物质组合物，其可为微球或微球状实体或微珠。术语“颗粒”和术语“微珠”可互换使用。另外，术语“颗粒”可用于涵盖微珠和微球。
“羧化颗粒”或“羧化微珠”或“羧化微球”包括经修饰而在其表面上包含羧基的任何颗粒。在一些实施例中，羧基的添加增强了吞噬细胞/单核细胞从血循环中摄取颗粒，例如通过与清道夫受体诸如MARCO相互作用。可使用能添加羧基的任何化合物来实现羧化作用，所述化合物包括但不限于聚(乙烯-马来酸酐)(PEMA)。
“带负电的颗粒”或“带负电的微珠”或“带负电的微球”包括本身具有负电荷或经修饰而具有负电荷的任何颗粒。在一些实施例中，通过颗粒的羧化作用而使颗粒具有负电荷。
如本文所用的“抗原部分”是指被宿主的免疫系统识别的任何部分，例如肽。抗原部分的例子包括但不限于自身抗原和/或细菌或病毒蛋白、肽或组分。不受理论的约束，虽然带负电的微珠自身可被免疫系统识别，但出于本发明的目的，其上没有附接任何其他物质的带负电的微珠并不视为“抗原部分”。
如本文所用的“裸微珠”或“裸颗粒”或“裸微球”是指未经羧化或以其他方式修饰的微珠、颗粒或微球。
如本文所用的“促炎介质”或“促炎多肽”是指诱导、维持或延迟受试者的炎症的多肽或其片段。促炎介质的例子包括但不限于细胞因子和趋化因子。
如本文所用的“炎性环境”或“炎性病灶”是指受试者中发生炎症或促炎介质浓度增加的部位。炎性环境可涵盖整体的受试者血循环。例如，当受试者罹患系统性炎性紊乱时，可在整个受试者的血循环中找到炎性介质。因此，在这些实施例中，炎性环境不包含于离散区域内。
所谓“调节性T细胞”或“Treg”或“抑制T细胞”意指能够调节T细胞免疫反应的T细胞。例如，Treg可为能够抑制CD4+或CD8+ T细胞反应的效应子功能的CD4+或CD8+ T细胞。
颗粒可具有任何颗粒形状或构象。然而，在一些实施例中，优选的是使用不太可能在体内结块的颗粒。这些实施例内的颗粒的例子是具有球形形状的那些。
不需要每个颗粒尺寸均匀，但颗粒必须大体上具有足以触发抗原递呈细胞或其他MPS细胞中的吞噬作用的尺寸。优选地，颗粒尺寸为微米级或纳米级，以增强溶解度，避免可能体内聚集引起的并发症，并有利于胞饮作用。粒度可为从间隙空间摄取到淋巴细胞成熟的区域中的因素。具有约0.1μm至约10μm的平均直径的颗粒能够触发吞噬作用。因此，在一个实施例中，颗粒具有这些限值内的直径。在另一个实施例中，颗粒具有约0.2μm至约2μm的平均直径。在另一个实施例中，颗粒具有约0.3μm至约5μm的平均直径。在又一个实施例中，颗粒具有约0.5μm至约3μm的平均直径。在另外一个实施例中，颗粒具有约0.1μm、或约0.2μm或约0.3μm或约0.4μm或约0.5μm或约1.0μm或约1.5μm或约2.0μm或约2.5μm或约3.0μm或约3.5μm或约4.0μm或约4.5μm或约5.0μm的平均尺寸。在具体实施例中，颗粒具有约0.5μm的尺寸。组合物中的颗粒不必具有均匀直径。举例来说，药物制剂可包含多个颗粒，其中的一些为约0.5μm，而其他为约1.0μm。这些给定范围内的粒度的任何混合都将为可用的。
在一些实施例中，颗粒为非金属的。在这些实施例中，颗粒可由聚合物形成。在一个优选的实施例中，颗粒为在个体中可生物降解的。在该实施例中，颗粒可以多个剂量在个体中提供，而颗粒不会在个体中积累。合适颗粒的例子包括聚苯乙烯颗粒、PLGA颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒和金刚石颗粒。
优选地，颗粒表面由使非特异性或不需要的生物相互作用最小化的材料构成。颗粒表面与间质之间的相互作用可为在淋巴吸收中起作用的因素。颗粒表面可包被有防止或减少非特异性相互作用的材料。通过用亲水层诸如聚(乙二醇)(PEG)及其共聚物诸如
Figure BDA0003320877280000181
(包括聚(乙二醇)-bl-聚(丙二醇)-bl-聚(乙二醇)的共聚物)包被颗粒使空间稳定，可降低与间质的蛋白的非特异性相互作用，如皮下注射后改善淋巴吸收所证实。所有这些事实表明了颗粒的物理性质在淋巴吸收方面的重要性。可生物降解的聚合物可用于制备所有或一些聚合物和/或颗粒和/或层。可生物降解的聚合物可发生降解，例如由官能团与溶液中的水反应所引起。如本文所用的术语“降解”是指通过减小分子量或通过将疏水基团转化为亲水基团而变为可溶的。具有酯基的聚合物一般会进行自发水解，例如，聚交酯和聚乙交酯。
本发明的颗粒也可包含附加组分。例如，载体可具有掺入或缀合到载体的显像剂。目前可商购获得的具有显像剂的载体纳米球的例子为Kodak X-sight纳米球。无机量子限制发光纳米晶体(称为量子点(QD))已成为FRET应用中的理想供体：当在单紫外线波长下激发时，它们的高量子产率和可调谐的尺寸依赖性斯托克斯位移允许不同尺寸发射蓝光到红外光。(Bruchez,et al.,Science,1998,281,2013(Bruchez等人，《科学》，1998年，第281卷，第2013页)；Niemeyer,C.M Angew.Chem.Int.Ed.2003,42,5796(Niemeyer,C.M，《应用化学国际版》，2003年，第42卷，第5796页)；Waggoner,A.Methods Enzymol.1995,246,362(Waggoner,A.，《酶学方法》，1995年，第246卷，第362页)；Brus,L.E.J.Chem.Phys.1993,79,5566(Brus,L.E.，《化学物理杂志》，1993年，第79卷，第5566页))。量子点，诸如基于称为树枝状聚合物的一类聚合物的混合有机/无机量子点，可用于生物标记、成像以及光学生物传感系统。(Lemon,et al.,J.Am.Chem.Soc.2000,122,12886(Lemon等人，《美国化学会志》，2000年，第122卷，第12886页))。与传统无机量子点的合成不同，这些混合量子点纳米颗粒的合成不需要高温或高毒性、不稳定的试剂。(Etienne,et al.,Appl.Phys.Lett.87,181913,2005(Etienne等人，《应用物理学快报》，第87卷，第181913页，2005年))。
颗粒可以由各种各样的材料形成。颗粒优选地由适合于生物用途的材料构成。例如，颗粒可由玻璃、二氧化硅、羟基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酸酐、或羟基羧酸和二羧酸的共聚物构成。更一般地说，载体颗粒可以由以下构成：直链或支链的、取代或未取代的、饱和或不饱和的、线性或交联的烷基、卤烷基、硫烷基、氨烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基、或烷氧基羟基酸的聚酯，或直链或支链的、取代或未取代的、饱和或不饱和的、线性或交联的烷基、卤烷基、硫烷基、氨烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基、或烷氧基二羧酸的聚酸酐。另外，载体颗粒可以是量子点、或由量子点诸如量子点聚苯乙烯颗粒构成(Joumaaet al.(2006)Langmuir 22:1810-6(Joumaa等人，2006年，《朗缪尔》，第22卷，第1810-6页))。还可以采用包括酯和酸酐键的混合物(例如乙醇酸和癸二酸的共聚物)的载体颗粒。例如，载体颗粒可包含包括以下的材料：聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(乳酸-共-癸二酸)共聚物(PLSA)、聚(乙醇酸-共-癸二酸)共聚物(PGSA)、聚硫化丙烯聚合物、聚(己内酯)、壳聚糖等。可用于本发明的其他生物相容性、可生物降解的聚合物包括己内酯、碳酸盐、酰胺、氨基酸、原酸酯、缩醛、氰基丙烯酸酯、以及可降解聚氨酯的聚合物或共聚物，以及它们与直链或支链的、取代或未取代的烷基、卤烷基、硫烷基、氨烷基、烯基、或芳香族羟基酸或二羧酸的共聚物。另外，具有反应性侧链基团的生物学上重要的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、以及半胱氨酸、或它们的对映异构体，可以包括在与任何上述材料的共聚物中，以便为与抗原肽和蛋白质或缀合部分的缀合提供反应性基团。适合于本发明的可生物降解的材料包括金刚石、PLA、PGA、聚硫化丙烯聚合物和PLGA聚合物。生物相容但不可生物降解的材料也可以用于本发明的载体颗粒中。例如，可以采用丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯、酰基取代的乙酸纤维素、不可降解的聚氨酯、苯乙烯、氯乙烯、氟乙烯、乙烯基咪唑、氯磺化烯烃、环氧乙烷、乙烯醇、
Figure BDA0003320877280000201
(特拉华州威明顿的杜邦公司(DuPont,Wilmington,Del.))、以及尼龙的不可生物降解聚合物。
在一个实施例中，与免疫修饰颗粒接触的缓冲溶液可具有碱性pH。碱性溶液的合适碱性pH包括7.1、7.5、8.0、8.5、9.5、10.0 10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0和13.5。缓冲溶液也可由任何合适的碱及其缀合物制成。在本发明的一些实施例中，缓冲溶液可包括但不限于碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢锂、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢锂及其缀合物。
在本发明的一个实施例中，免疫修饰颗粒包含共聚物。这些共聚物可具有不同的摩尔比。本发明免疫修饰颗粒的合适共聚物比率可为25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91；:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:0。在另一个实施例中，共聚物可为周期、统计、线性、支链(包括星形、刷状或梳状共聚物)共聚物。在一些实施例中，共聚物比率可为但不限于聚苯乙烯：聚(羧酸乙烯酯)/80:20、聚苯乙烯：聚(羧酸乙烯酯)/90:10、聚(羧酸乙烯酯)：聚苯乙烯/80:20、聚(羧酸乙烯酯)：聚苯乙烯/90:10、聚乳酸：聚乙醇酸/50:50、聚乳酸：聚乙醇酸/80:20、或聚乳酸：聚乙醇酸/90:10。
本发明的颗粒可通过本领域通常已知的任何方式制造。制造颗粒的示例性方法包括但不限于微乳液聚合、界面聚合、沉淀聚合、乳化挥发、乳化扩散、溶剂置换和盐析(Astete and Sabliov,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.,17:247-289(2006)(Astete和Sabliov，《生物材料科学杂志-聚合物版》，第17卷，第247-289页，2006年))。PLGA颗粒的制造过程的操纵可控制颗粒性质(例如，尺寸、尺寸分布、ζ电势、形态、疏水性/亲水性、多肽截留等)。颗粒的尺寸受到多种因素影响，包括但不限于PLGA的浓度、用于制造颗粒的溶剂、有机相的性质、用于制造的表面活性剂、连续和不连续相的粘度、所用溶剂的性质、所用水的温度、超声处理、蒸发率、添加剂、剪切应力、灭菌以及任何包封抗原或多肽的性质。
粒度受到聚合物浓度的影响；更大颗粒由更高聚合物浓度形成。例如，当使用溶剂碳酸丙烯酯时，PLGA浓度从1％升高到4％(w/v)可使平均粒度从约205nm增加到约290nm。或者，在乙酸乙酯和5％Pluronic F-127中，PLGA浓度从1％升高到5％(w/v)会使平均粒度从120nm增加到230nm。
连续和不连续相的粘度也是重要的参数，它会影响扩散过程，即形成较小颗粒的关键步骤。颗粒的尺寸随分散相的粘度增加而增大，而颗粒的尺寸随更粘的连续相而减小。一般来讲，有机溶剂与水溶剂的相比率越低，粒度越小。
匀浆器速度和搅拌也影响粒度；一般来讲，更高的速度和搅拌会使粒度减小，但存在这样的点，其中进一步增加速度和搅拌时粒度不再减小。与只是高速搅拌相比，在用高压匀浆器对乳液匀浆时，对尺寸减小起到有利影响。例如，在5％PVA中20％的相比率下，搅拌情况下的平均粒度为288nm，而匀浆(300巴的高压)情况下的平均粒度为231nm。
可通过如下方式实现颗粒的重要尺寸减小：改变所加入的水的温度，以改善溶剂的扩散。平均粒度随水温升高而减小。
包封在颗粒中的多肽的性质也影响粒度。一般来讲，与更亲水的多肽的包封相比，疏水多肽的包封导致形成更小颗粒。在复乳化过程中，通过使用高分子质量PLGA和高分子质量的引起更高内相粘度的第一表面活性剂，来改善更亲水的多肽的截留。溶剂、聚合物与多肽之间的相互作用影响多肽掺入颗粒中的效率。
PLGA分子质量影响最终平均粒度。一般来讲，分子质量越高，平均粒度越大。例如，当PLGA的组成和分子质量变化(例如，对于50:50PLGA而言12至48kDa；对于75:25PLGA而言12至98kDa)时，平均粒度也变化(分别约102nm-154nm；约132nm到152nm)。即使当颗粒为相同分子质量时，它们的组成也可影响平均粒度；例如，具有50:50比率的颗粒一般形成的颗粒比具有75:25比率的颗粒更小。聚合物上的端基也影响粒度。例如，用酯端基制备的颗粒形成平均尺寸为740nm(PI＝0.394)的颗粒，相比之下，对于酸性PLGA端基而言，平均尺寸为240nm(PI＝0.225)。
所用溶剂也可影响粒度；降低溶液的表面张力的溶剂也减小粒度。
通过真空蒸发移除有机溶剂，以避免聚合物和多肽损坏并促进最终粒度减小。有机溶剂的真空蒸发能更有效地形成更小的颗粒。例如，真空蒸发产生的平均粒度比正常蒸发速率下产生的平均粒度小约30％。
超声处理波长的振幅也影响颗粒特性。波长的振幅应超过20％且超声处理600至800s以形成稳定细乳液，而液滴尺寸不再变化。然而，超声处理的主要缺点是所形成的乳液不具有单分散性。
可用于产生本发明的颗粒的有机相包括但不限于乙酸乙酯、甲基乙基酮、碳酸丙烯酯和苯甲醇。可使用的连续相包括但不限于表面活性剂泊洛沙姆188。
多种表面活性剂可用于制造本发明的颗粒。表面活性剂可为阴离子、阳离子或非离子的。泊洛沙姆和泊洛沙胺家族中的表面活性剂通常用于颗粒合成。可使用的表面活性剂包括但不限于PEG、吐温-80、明胶、葡聚糖、pluronic L-63、PVA、甲基纤维素、卵磷脂和DMAB。另外，可生物降解且生物相容性的表面活性剂包括但不限于维生素E TPGS(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)。在某些实施例中，需要两种表面活性剂(例如，在复乳化挥发方法中)。这两种表面活性剂可包括用于第一乳液的疏水表面活性剂以及用于第二乳液的疏水表面活性剂。
可用于产生本发明的颗粒的溶剂包括但不限于丙酮、四氢呋喃(THF)、氯仿以及氯族的成员、氯甲烷。有机溶剂的选择需要两种选择标准：聚合物必须可溶于该溶剂，以及溶剂必须与水相完全混溶。
可用于产生本发明的颗粒的盐包括但不限于氯化镁六水合物、乙酸镁四水合物。
常见盐析剂包括但不限于电解质(例如，氯化钠、乙酸镁、氯化镁)或非电解质(例如，蔗糖)。
可通过加入化合物改善本发明的颗粒的稳定性和尺寸，所述化合物包括但不限于脂肪酸或短碳链。较长碳链的月桂酸的加入与颗粒特性的改善相关。此外，疏水添加剂的加入可改善粒度、多肽向颗粒中的掺入以及释放特性。可通过冻干使颗粒的制剂稳定。冷冻保护剂诸如海藻糖的加入可减少冻干时颗粒的聚集。
目前可商购获得的合适的微珠包括聚苯乙烯微珠，诸如FluoSpheres(俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,Oreg.))。
物理性质还涉及在具有不成熟淋巴细胞的区域内摄取和保留之后的纳米颗粒的适用性。它们包括机械性质，诸如刚性或弹性。一些实施例是基于弹性核心，例如具有覆盖层例如亲水覆盖层的聚(硫化丙烯)(PPS)核心，如在PEG中，如在最近开发并且表征用于全身性(但不是靶向或免疫的)递送的PPS-PEG系统中。弹性核心与大体上刚性的核心相反，如在聚苯乙烯或金属纳米颗粒系统中。术语弹性是指除天然或合成橡胶之外的某些有弹性的材料，而弹性是聚合物领域的技术人员所熟悉的术语。例如，交联PPS可用于形成疏水弹性核心。PPS是一种聚合物，其在氧化条件下降解为聚亚砜以及最后形成聚砜，从疏水橡胶转变为亲水的水溶性聚合物。其他硫化物聚合物可能适合使用，其中术语硫化物聚合物是指在基体的主链中具有硫的聚合物。其他可以使用的弹性聚合物是在水合条件下的玻璃化转变温度低于约37℃的聚酯。疏水核心可以有利地与亲水覆盖层一起使用，因为核心和覆盖层会倾向于不混合，因而覆盖层倾向于在空间上从核心扩张开来。核心是指其上具有层的颗粒。层是指覆盖核心的至少一部分的材料。层可以是吸附的或共价结合的。颗粒或核心可以是实心或中空的。弹性疏水核心优于刚性疏水核心，诸如结晶或玻璃(如在聚苯乙烯的情况下)核心，因为具有弹性疏水核心的颗粒可以携带更高的疏水药物负载量。
另一个物理性质是表面的亲水性。亲水材料当它未交联时可在水中具有至少1克每升的溶解度。具有亲水聚合物的颗粒的空间稳定可通过减少非特异性相互作用而提高从间质的摄取；然而，颗粒增加的隐身性质也可以减少具有不成熟淋巴细胞的区域中吞噬细胞的内在化。然而，已经遇到了平衡这些抵触的特征的挑战，并且本申请记载了用于有效地通过淋巴递送至DC和淋巴结中的其他APC的纳米颗粒的产生。一些实施例包括亲水组分，例如亲水材料层。合适的亲水材料的例子是以下中的一种或多种：聚环氧烷、聚环氧乙烷、多糖、聚丙烯酸和聚醚。可以调整层中的聚合物的分子量以便在体内提供有用的位阻程度，例如约1,000至约100,000或甚至更多；技术人员会立即了解可设想到明确说明的范围内的所有范围和数值，例如在10,000和50,000之间。
已发现颗粒的组成会影响颗粒存留于体内的时长，并且耐受要求快速颗粒摄取和清除/降解。由于超过50:50丙交酯：乙交酯的比率会减缓降解速率，本发明的颗粒具有约50:50或更低的丙交酯：乙交酯比率。在一个实施例中，本发明的颗粒具有约50:50D,L-丙交酯：乙交酯比率。
颗粒可以掺入用于进一步反应的官能团。用于进一步反应的官能团包括亲电试剂或亲核试剂；它们便于与其他分子反应。亲核试剂的例子为伯胺、硫醇和羟基。亲电试剂的例子是琥珀酰亚胺酯、醛、异氰酸酯、以及马来酰亚胺。
胶体治疗剂诸如本发明的带负电的颗粒的疗效与颗粒的体内分布密切相关。可通过测定ζ电势来预测胶体体系的分布。ζ电势是分散介质与附着于分散的颗粒上的稳定流体层之间的电势差的量度，并且指示分散体中相邻、类似带电的颗粒之间的排斥程度。高ζ电势预示胶体制剂的稳定性和良好分散性。在优选的实施例中，本发明的药物制剂的ζ电势预示制剂在体内的良好分散性。
本发明的颗粒可具有具体的ζ电势。在某些实施例中，ζ电势为负的。在一个实施例中，ζ电势小于约-100mV。在一个实施例中，ζ电势小于约-50mV。在某些实施例中，颗粒具有-100mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-75mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-60mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。在又一个实施例中，颗粒具有-40mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-30mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-20mV与+0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-10mV与-0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-100mV与-50mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-75mV与-50mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
本发明的颗粒可以以有效抑制有需要的受试者的炎性免疫反应，或治疗有需要的受试者的细菌或病毒感染的任何剂量给予。在某些实施例中，对个体提供约102至约1020个颗粒。在另外一个实施例中，提供约103至约1015个之间的颗粒。在再一个实施例中，提供约106至约1012个之间的颗粒。在又一个实施例中，提供约108至约1010个之间的颗粒。在一个优选的实施例中，优选的剂量是0.1％固含量/ml。因此，对于0.5μ的微珠，优选的剂量是大约4≥109个微珠，对于0.05μ的微珠，优选的剂量是大约4≥1012个微珠，对于3μ的微珠，优选的剂量是2≥107个微珠。然而，本发明涵盖任何有效治疗有待治疗的具体病症的剂量。
本发明可用于治疗免疫相关紊乱，诸如自身免疫疾病、移植排斥、炎性疾病和/或紊乱、缺血再灌注、中风、心肌梗塞和变态反应。取代合成的生物相容性颗粒系统以诱导免疫耐受可导致制造更容易、扩大治疗剂的可用性、增加样品之间的均一性、增加潜在治疗部位的数量、以及显著降低对载体细胞的变态反应的可能性。
如本文所用，术语“免疫反应”包括T细胞介导和/或B细胞介导的免疫反应。示例性免疫反应包括T细胞反应，例如细胞因子的产生和细胞的细胞毒性。另外，术语免疫反应包括由T细胞活化所间接影响的免疫反应，例如抗体产生(体液反应)和细胞因子应答细胞例如巨噬细胞的活化。参与免疫反应的免疫细胞包括淋巴细胞，诸如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Th1和Th2细胞)；抗原递呈细胞(例如，专职性抗原递呈细胞诸如树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、郎格罕细胞，以及非专职性抗原递呈细胞诸如角化细胞、内皮细胞、星形细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞，诸如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施例中，本发明的修饰颗粒有效减少运输到炎症部位的炎性细胞。
如本文所用，术语“炎性单核细胞”是指表达CD14/CD16和CCR2的任何组合的任何骨髓细胞。如本文所用，术语“抑制性中性粒细胞”涵盖单核细胞来源的抑制细胞和/或中性粒细胞。
如本文所用，术语“无反应”、“耐受”、或“抗原特异性耐受”是指T细胞对T细胞受体介导的刺激不敏感。这种不敏感通常是抗原特异性的，并且在停止暴露于抗原肽之后仍持续。例如，T细胞无反应的特征为缺乏细胞因子产生，例如IL-2。当T细胞暴露于抗原并在不存在第二信号(协同刺激信号)的情况下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时可发生T细胞无反应。在这些条件下，细胞重新暴露于相同的抗原(即使重新暴露是在协同刺激分子存在的情况下发生)导致不能产生细胞因子，并且随后不能增殖。因此，不能产生细胞因子能防止增殖。然而，如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，则无反应的T细胞可以增殖。例如，还可以观察到因T淋巴细胞的IL-2产生缺乏，T细胞无反应，如通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖测定所测量。或者，可以使用报告基因构建体。例如，无反应T细胞不能起始由异源启动子在5'IL-2基因增强子的控制下诱导的或者由可在增强子中发现的API序列多聚体诱导的DL-2基因转录(Kang et al.1992Science.257:1134(Kang等人，1992年，《科学》，第257卷，第1134页))。
如本文所用，术语“免疫耐受”是指与未治疗的受试者相比，对一部分接受治疗的受试者执行的方法，其中：a)特异性免疫反应(认为至少部分是由抗原特异性效应T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗体、或它们的等同物所介导)的水平降低；b)特异性免疫反应的发作和发展延迟；或者c)特异性免疫反应发作或发展的风险降低。当与其他相比优先引发针对某些抗原的免疫耐受时，发生“特异性”免疫耐受。当针对导致炎性免疫反应的抗原的免疫耐受的引发无差别时，发生“非特异性”免疫耐受。当针对导致致病性免疫反应的抗原而未对导致保护性免疫反应的其他抗原半区别性地引发免疫耐受时，发生“准特异性”免疫耐受。
致耐受活性的一个代表是颗粒在靶位点刺激适当细胞因子的产生的能力。由T抑制细胞在靶位点释放的免疫调节性细胞因子被认为是TGF-β(Miller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:421,1992(Miller等人，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第421页，1992年))。在耐受期间可以产生的其他因子是细胞因子IL4和IL-10、以及介质PGE。相反，经历主动免疫破坏的组织中的淋巴细胞分泌诸如IL-I、IL-2、IL-6和IFNγ的细胞因子。因此，修饰颗粒的疗效可通过测量其刺激适当类型的细胞因子的能力来评价。
有鉴于此，可以使用动物模型系统来进行用于修饰颗粒、有效粘膜结合组分、有效组合、或粘膜施用的有效模式和时程的快速筛选测试。用测试颗粒组合物处理动物的粘膜表面，并且有时通过施用致病性抗原或感染性病原体对动物进行激发。分离脾细胞，并在浓度为约50μg/mL的致病性抗原或来源于感染性病原体的抗原存在下体外培养。可以通过标准免疫测定来定量向培养基中的细胞因子分泌。
颗粒抑制细胞活性的能力可使用从用修饰颗粒免疫的动物分离的细胞，或通过建立对致病性抗原或病毒抗原靶抗原作出反应的细胞系来测定(Ben-Nun et al.,Eur.J.Immunol.11:195,1981(Ben-Nun等人，《欧洲免疫学杂志》，第11卷，第195页，1981年))。在此实验的一个变型中，轻度照射(约1000至1250拉德)抑制细胞群以防止增殖，将抑制细胞与应答细胞一起培养，并且然后使用氚化胸苷掺入法(或MTT)来定量应答细胞的增殖活性。在另一个变型中，在双腔transwell培养系统(马萨诸塞州剑桥的Costar公司(Costar,Cambridge Mass.))的上层和下层中培养抑制细胞群和应答细胞群，所述培养系统允许细胞群在相互由聚碳酸酯膜隔开1mm内共温育(WO 93/16724)。在这种方法中，照射抑制细胞群是不必要的，因为应答细胞的增殖活性可单独测量。
用于治疗特定疾病的组合物和施用模式的有效性还可以在相应的动物疾病模型中进行阐述。在适合于所采用的模型的疾病的循环生物化学和免疫学标志、受影响的组织的免疫组织学、以及总体临床特征的层面上监测所述治疗减弱或延迟疾病症状的能力。可用于测试的动物模型的非限制性例子包括在以下部分内。
本发明可设想到通过调节TH1反应、TH2反应、TH17反应、或这些反应的组合来调节耐受性。调节TH1反应涵盖改变例如干扰素-γ的表达。调节TH2反应涵盖改变例如IL-4、IL-5、IL-10以及IL-13的任何组合的表达。通常TH2反应的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10、或IL-13中至少一个的表达的增加(减少)；更通常TH2反应的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10、或IL-13中至少两个的表达增加，最通常TH2反应的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10、或IL-13中至少三个的增加，而理想地TH2反应的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10、和IL-13中全部的表达的增加(减少)。调节TH 17涵盖改变例如TGF-β、IL-6、IL-21和IL23的表达以及IL-17、IL-21和IL-22的效应水平。
对自身抗原和自身免疫疾病的耐受是通过多种包括胸腺中自身反应性T细胞的阴性选择的机制，以及那些逃脱胸腺清除并在外周中发现的自身反应性T细胞的外周耐受的机制来实现。提供外周T细胞耐受的机制的例子包括自身抗原的“忽视”、对自身抗原无反应或不应答、细胞因子免疫偏离、以及活化诱导的自身反应性T细胞的细胞死亡。另外，调节性T细胞已经显示参与介导外周耐受。参见例如Walker et al.(2002)Nat.Rev.Immunol.2:11-19(Walker等人，2002年，《自然综述：免疫学》，第2卷，第11-19页)；Shevach et al.(2001)Immunol.Rev.182:58-67(Shevach等人，2001年，《免疫学综述》，第182卷，第58-67页)。在一些情况下，失去(或破坏)对自身抗原的外周耐受并且接着发生自身免疫反应。例如，在EAE的动物模型中，显示通过TLR先天性免疫受体使抗原递呈细胞(APC)活化会破坏自身耐受性并导致诱发EAE(Waldner et al.(2004)J.Clin.Invest.113:990-997(Waldner等人，2004年，《临床研究杂志》，第113卷，第990-997页))。在某些实施例中，本发明的颗粒能够通过增加Treg的频率和/或效应子功能，来诱导耐受或全身免疫调节。由本发明的颗粒大体上调的Treg为CD4+CD25+Treg，其也表达转录抑制因子叉头框P3(FoxP3)。然而，由本发明的颗粒上调的Treg也可为CD8+Treg或抑制细胞。
因此，在一些实施例中，本发明提供用于增加抗原递呈同时抑制或减少TLR7/8、TLR9、和/或TLR 7/8/9依赖性细胞刺激的方法。如本文所述，施用具体修饰颗粒导致DC或APC的抗原递呈，同时抑制与免疫刺激性多核苷酸相关的TLR 7/8、TLR9、和/或TLR7/8/9依赖性细胞反应。这种抑制可包括一种或多种TLR相关性细胞因子的水平降低。
在本发明的另一个方面，带负电的颗粒充当分子壑以从具有炎性反应的受试者的血液中清除促炎介质、病理蛋白和细胞碎片，如图16A中所描绘。作为另外一种选择或除此之外，本发明的带负电的颗粒可通过结合于具有炎性反应的受试者的血液中的调节蛋白来浓缩调节蛋白，并且将这些调节蛋白递呈到其同源受体，以进一步改善免疫反应，如图16B中所描绘。如下文更详细讨论，本发明人已发现，在具有主动炎性免疫反应的受试者中发现至少15种血清蛋白结合于带负电的颗粒，而未发现带负电的颗粒结合于未接受过治疗的受试者(
Figure BDA0003320877280000291
subject)或未发生免疫反应的受试者。这不仅可用于上述方法，其中颗粒可充当促炎库或充当免疫调节剂的浓缩器/递呈者，而且可用于诊断方法的情形。具体地讲，在其他方法诸如质谱法和其他蛋白质组学方法已失败的情况下，本发明的带负电的颗粒可用于血液样品的大规模诊断方法。令人惊讶地发现，当将炎性血浆或血清与本文所述的带负电的颗粒温育时，这导致不存在于非炎性或内稳态条件下的血清/血浆中的蛋白质的结合及随后纯化。
在本发明的另一个方面，提供了包含抗原的颗粒。其表面上携带有抗原的纳米颗粒已成功用于诱导T细胞耐受(Getts et al.,2012Nature Biotechnology 30:1217-1223(Getts等人，2012年，《自然生物技术》，第30卷，第1217-1223页))。由肽偶联颗粒诱导的耐受取决于T细胞无反应的诱导和调节性T细胞的活性两者，并且可代表通过诱导T细胞耐受来治疗自身免疫紊乱的替代方式。当使用肽偶联到可生物降解的(PLG)颗粒时，观察到该T细胞耐受。
在一个实施例中，本发明的颗粒偶联到抗原，所述抗原包含与变态反应、自身免疫疾病和/或炎性疾病或紊乱相关的一个或多个表位。抗原可包含一个或多个拷贝的表位。在一个实施例中，抗原包含与一种疾病或紊乱相关的单个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与相同疾病或紊乱相关的不止一个表位。在再一个实施例中，抗原包含与不同疾病或紊乱相关的不止一个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与一种或多种变态反应相关的一个或多个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与多发性硬化症、1型糖尿病、乳糜泻和/或炎性肠疾病(包括克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)相关的一个或多个表位。
在一个实施例中，表位来自髓鞘碱性蛋白(例如，SEQ ID NO:4975和4976)、蛋白脂质蛋白(例如，SEQ ID NO:4977)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(例如，SEQ ID NO:1和4978)、水通道蛋白(例如，SEQ ID NO:4979)、髓鞘相关糖蛋白(例如，SEQ ID NO:4980)、胰岛素(例如，SEQ ID NO:4981)、谷氨酸脱羧酶(例如，SEQ ID NO:4982)、麦胶蛋白(例如，SEQ ID NO:4983-4985、或5136-5140)、或IV型胶原的α3链(例如，SEQ ID NO:5017)、或它们的片段、同源物或亚型。在另外一个实施例中，表位来自谷蛋白，包括来自麦胶蛋白和/或麦谷蛋白。在一个实施例中，表位来自胰岛素同源物，诸如美国专利No.8,476,228中所述的那些，所述专利据此全文并入以用于所有目的。在一个实施例中，麦胶蛋白表位是美国专利申请No.20110293644中的SEQ ID NO:13、14、16、320或321，或Sollid et al.(2012)Immunogenetics 65:455-460(Sollid等人，2012年，《免疫遗传学》，第65卷，第455-460页)中所述的那些，两篇文献据此全文并入以用于所有目的。
本发明所设想的与各种自身免疫疾病和/或炎性疾病或紊乱相关的表位的另外非限制性例子描述于表1和2中。
表1-代表性的线性表位
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Figure BDA0003320877280000321
并非所有表位都是线性表位；表位也可为不连续的构象表位。与自身免疫疾病或炎性疾病和/或紊乱相关的多种不连续表位是已知的。不连续表位的非限制性例子描述于表2中。
表2-代表性的不连续表位
Figure BDA0003320877280000322
Figure BDA0003320877280000331
Figure BDA0003320877280000341
Figure BDA0003320877280000351
在本发明的另一个方面，提供了包封抗原的颗粒。可使用将抗原包封在颗粒内的颗粒诱导受试者的T细胞耐受。可包封在本发明颗粒内的抗原的例子包括但不限于，外源性抗原诸如病毒和细菌抗原、内源性抗原、自身抗原、肿瘤抗原和/或天然抗原。
单核细胞和巨噬细胞在炎症的引发和消退方面起到中心作用，主要通过吞噬作用、炎性细胞因子、反应性氧物质的释放及获得性免疫系统的激活来起作用(Auffray etal.,2009 Annu Rev Immunol 27:669-692(Auffray等人，2009年，《免疫学年鉴》，第27卷，第669-692页))。通常，单核细胞在血流中循环很短时间，之后便发生细胞凋亡，然而，刺激信号可通过抑制细胞凋亡通路而触发单核细胞存活，从而有助于维持炎性反应。抗凋亡蛋白的作用方式是抑制半胱天冬酶或凋亡程序的激活。磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)/Akt、ERK、Fas、TNF、热休克蛋白和抗凋亡分子等等在决定单核细胞寿命方面起到关键作用。在炎性反应期间，炎性细胞诸如单核细胞和巨噬细胞被募集到炎症部位。该募集对于感染的有效控制和清除至关重要，但募集的单核细胞也会促使炎性疾病和退行性疾病发病。单核细胞的积累可能是有害的，并会加重疾病，诸如动脉粥样硬化、关节炎和多发性硬化症。炎症的消退需要减少和/或抑制炎性细胞进入炎性病灶，并且已存在炎性细胞的细胞凋亡。细胞凋亡半胱天冬酶通过降解具有多种生物学功能的蛋白以蛋白分解的方式使细胞解体而起到基础性作用。例如，半胱天冬酶-3活化对于CD14+单核细胞的细胞凋亡至关重要(Fahy etal.,1999J.Immunol.163:1755-1762(Fahy等人，1999年，《免疫学杂志》，第163卷，第1755-1762页))。
本发明的带负电的颗粒(本文有时称为“免疫修饰颗粒”或“IMP”)特异性地抑制炎性单核细胞向炎性病灶中的迁移。炎性单核细胞以胶原样结构巨噬细胞受体(MARCO)依赖性方式摄取IMP，并迁移到脾，它们在此发生半胱天冬酶3介导的细胞死亡。重要的是，IMP疗法显示出对西尼罗病毒(WNV)脑炎、腹膜炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、心肌梗塞后心功能、肾再灌注损伤以及结肠炎具有积极影响。IMP提供了以MARCO依赖性方式抑制炎性单核细胞的替代的高特异性工具。由于利用了天然白细胞清除通路，IMP代表新型且安全的炎性单核细胞特异性疗法。
在一个方面，本发明的方法包括诱导受试者中的单核细胞、粒细胞和/或中性粒细胞的细胞凋亡，以减轻炎性反应的严重程度或减少炎性反应的持续时间。在一个实施例中，施用本发明的带负电的颗粒会诱导单核细胞、粒细胞和/或中性粒细胞的细胞凋亡和清除，从而有助于炎症的消退。
在一个方面，本发明的方法可设想到使用本发明的颗粒作为“分子壑”，其结合于细胞所产生的炎性分子和多肽，从而阻止它们发挥作用。当发生炎症时，细胞诸如巨噬细胞和单核细胞会将促炎介质诸如细胞因子和趋化因子释放到周围的促炎性环境中。促炎介质的例子包括但不限于白介素、TNF家族成员、干扰素和集落刺激因子。这些介质增强炎性反应，从而加重了炎性病理状态。如本文所述，本发明的颗粒结合于经历炎性免疫反应的动物的血清中的炎性介质。其上结合有本发明颗粒的炎性介质包括但不限于，热休克蛋白β-1、蛋白S100-A7、蛋白S100-A8、蛋白S100-A9、脂肪酸结合蛋白、膜联蛋白A1以及泛素交叉反应蛋白前体。给动物施用本发明的未包被颗粒会导致存在于炎性病灶中的炎性单核细胞减少、炎性症状减轻以及感染的动物的存活率提高。
如上文所讨论，本发明提供了具有可用于治疗免疫介导的紊乱的生物学性质的新型化合物。
因此，在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包含颗粒并且任选地包含药学上可接受的载体。在某些实施例中，这些组合物任选地还包含一种或多种另外的治疗剂。在另一个实施例中，本发明的颗粒可包封抗原或包埋有抗原。或者，本发明的颗粒可与一种或多种其他治疗剂的施用组合施用给有需要的患者。例如，用于联合施用或包含于具有本发明的化合物的药物组合物中的另外的治疗剂可以是已批准的抗炎剂，或者它可以是在食品与药品管理局(Food and Drug Administration)正在进行批准的多种药剂中的任一种，这些药剂最终获得批准用于治疗任何特征为不受控制的炎性免疫反应或者细菌或病毒感染的紊乱。还应当理解，本发明的某些修饰颗粒可以以游离形式存在以用于治疗，或适当时以其药学上可接受的衍生物形式存在。
本发明的药物组合物另外包含药学上可接受的载体，本文所用的载体包括适于所希望的具体剂型的任何及所有溶剂、稀释剂、或其他液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington'sPharmaceutical Sciences,Sixteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)(《雷明顿药物科学》，第十六版，E.W.Martin，宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司，1980年)公开了用于配制药物组合物的各种载体以及其已知制备技术。除非任何常规载体介质与本发明的化合物不相容，诸如因产生任何不希望的生物效应，或者另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则预期其使用是在本发明的范围内。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括但不限于，糖诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂诸如可可油和栓剂蜡；油诸如花生油、棉籽油；红花油、芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇；诸如丙二醇；酯诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂诸如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原质水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇、和磷酸盐缓冲溶液、以及其他无毒相容性润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以根据配制者的判断而存在于组合物中。
用于口服施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物之外，液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体来说，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、和失水山梨醇脂肪酸酯、以及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。
可注射制剂，例如无菌注射水性或油性悬浮液可根据已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的溶媒和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.以及等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可采用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。另外，脂肪酸诸如油酸可用于制备可注射剂。
例如，可通过截留细菌的过滤器过滤，或通过掺入灭菌剂来对可注射制剂进行灭菌，呈可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物的形式。
为了延长药物的作用，通常需要减慢皮下注射或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性较差的液体悬浮液或结晶性或无定形材料来实现。药物的吸收速率因此取决于它的溶解速率，而溶解速率又可以取决于结晶尺寸和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮于油性溶媒中来实现。可注射贮库形式是通过在可生物降解的聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊基质来制备。根据药物与聚合物的比率和所用具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮库可注射制剂还可以通过将药物截留于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。在某些实施例中，药物和治疗剂可包封在本发明的颗粒中以便施用给受试者。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂以及颗粒剂。在此类固体剂型中，将修饰颗粒与至少一种以下材料混合：惰性的药学上可接受的赋形剂或载体，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、以及硅酸，b)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖以及阿拉伯胶，c)保湿剂，诸如甘油，d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐、以及碳酸钠，e)溶解阻滞剂，诸如石蜡，f)吸收促进剂，诸如季铵化合物，g)润湿剂，诸如十六烷醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸附剂，诸如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、以及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物还可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软或硬填充式明胶胶囊中用作填充剂。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂以及颗粒剂的固体剂型可以制备成具有包衣和外壳，诸如肠溶包衣和药物配制领域中众所周知的其他包衣。它们可以任选地包含乳浊剂并且还可以具有使它们仅在或优先在肠道的某一部分中任选地以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物还可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软或硬填充式明胶胶囊中用作填充剂。
修饰颗粒还可以呈具有一种或多种上文所述的赋形剂的微囊化形式。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂以及颗粒剂的固体剂型可以制备成具有包衣和外壳，诸如肠溶包衣、释放控制包衣以及药物配制领域中众所周知的其他包衣。在此类固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂诸如蔗糖、乳糖和淀粉混合。此类剂型在正常实践中还可以包含除惰性稀释剂外的另外物质，例如压片润滑剂以及其他压片助剂，诸如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。它们可以任选地包含乳浊剂并且还可以具有使它们仅在或优先在肠道的某一部分中任选地以延迟方式释放修饰颗粒的组成。可使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。
本发明涵盖本发明修饰颗粒的药学上可接受的局部制剂。本文所用的术语“药学上可接受的局部制剂”意指对于通过将制剂涂覆到表皮上来皮内施用本发明的修饰颗粒是药学上可接受的任何制剂。在本发明的某些实施例中，局部制剂包含载体体系。药学上有效的载体包括但不限于，溶剂(如醇、多元醇、水)、乳膏、洗剂、软膏、油、膏药、脂质体、散剂、乳液、微乳液以及缓冲溶液(如低渗或缓冲盐水)或本领域已知用于局部施用药物的任何其他载体。业内已知载体的更完整清单由本领域的标准参考著作提供，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,16th Edition,1980and 17th Edition,1985(《雷明顿药物科学》，第16版，1980年，及第17版，1985年)，两个版本都是由宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,Pa.)出版，其公开内容以引用的方式整体并入本文。在某些其他实施例中，本发明的局部制剂可包含赋形剂。任何本领域已知的药学上可接受的赋形剂都可用于制备本发明的药学上可接受的局部制剂。可包含在本发明的局部制剂中的赋形剂的例子包括但不限于，防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、润肤剂、缓冲剂、增溶剂、其他渗透剂、皮肤保护剂、表面活性剂、和推进剂、和/或与修饰颗粒组合使用的另外治疗剂。合适的防腐剂包括但不限于，醇、季胺、有机酸、对羟基苯甲酸酯以及酚。合适的抗氧化剂包括但不限于，抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚、生育酚、以及螯合剂，如EDTA和柠檬酸。合适的保湿剂包括但不限于，甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、尿素以及丙二醇。用于本发明的合适的缓冲剂包括但不限于，柠檬酸缓冲液、盐酸缓冲液以及乳酸缓冲液。合适的增溶剂包括但不限于，季铵氯化物、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂、以及聚山梨醇酯。可用于本发明的局部制剂中的合适的皮肤保护剂包括但不限于维生素E油、尿囊素、二甲基硅油、甘油、凡士林、以及氧化锌。
在某些实施例中，本发明的药学上可接受的局部制剂至少包含本发明的修饰颗粒和渗透增强剂。局部制剂的选择将取决于若干因素，包括待治疗的病症、本发明化合物和存在的其他赋形剂的物理化学特征、它们在制剂中的稳定性、可用的制造设备、以及成本限制。如本文所用，术语“渗透增强剂”意指能够转运药理学活性化合物穿过角质层并进入表皮或真皮而优选地很少或没有全身吸收的试剂。已经评估了多种化合物在增强药物穿过皮肤的渗透率方面的有效性。参见例如Percutaneous Penetration Enhancers,MaibachH.I.and Smith H.E.(eds.),CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1995)(《经皮渗透增强剂》，Maibach H.I.和Smith H.E.编辑，CRC出版公司，佛罗里达州博卡拉顿，1995年)，其调查了不同皮肤渗透增强剂的使用和测试，以及Buyuktimkin et al.,Chemical Means ofTransdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal and Topical DrugDelivery Systems,Gosh T.K.,Pfister W.R.,Yum S.I.(Eds.),Interpharm Press Inc.,Buffalo Grove,Ill.(1997)(Buyuktimkin等人，《透皮及局部药物递送系统中的透皮药物渗透增强的化学方式》，Gosh T.K.、Pfister W.R.、Yum S.I.编辑，国际药物出版公司，伊利诺伊州比弗洛格罗夫，1997年)。在某些示例性实施例中，用于本发明的渗透剂包括但不限于，甘油三酯(例如，大豆油)、芦荟组合物(例如，芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如，豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、单油酸甘油酯、以及丙二醇单油酸酯)以及N-甲基吡咯烷酮。
在某些实施例中，组合物可以呈软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片的形式。在某些示例性实施例中，根据本发明的组合物的制剂是乳膏剂，该乳膏剂可进一步包含饱和或不饱和的脂肪酸，诸如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、鲸蜡醇或油醇，硬脂酸特别优选。本发明的乳膏剂还可以包含非离子表面活性剂，例如聚氧-40-硬脂酸酯。在某些实施例中，活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要时任何所需要的防腐剂或缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂或滴眼剂也设想包括在本发明的范围内。另外，本发明可设想到使用具有提供化合物向身体的控制递送的附加优势的透皮贴片。这种剂型是通过将化合物溶解或分散于适当的介质中来制备的。如上文所讨论，渗透增强剂还可以用来增加化合物穿过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。
可通过气雾剂来施用修饰颗粒。这是通过制备包含修饰颗粒的水性气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒来实现的。可以使用非水的(例如，碳氟化合物推进剂)悬浮液。
通常，水性气雾剂是通过将药剂的水性溶液或悬浮液与常规药学上可接受的载体和稳定剂配制在一起而制成。载体和稳定剂随具体化合物的要求而改变，但通常包括非离子表面活性剂(吐温、
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或聚乙二醇)、无害的蛋白如血清白蛋白、失水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸诸如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。气雾剂一般由等渗溶液制备。
还应当理解，可以配制本发明的修饰颗粒和药物组合物并且在组合疗法中使用，即，化合物或药物组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医学程序一起配制或与其同时、在其之前或之后施用。用于组合方案中的疗法(治疗剂或程序)的具体组合将考虑到所需治疗剂和/或程序的相容性及待实现的所需治疗效果。还应当理解，所用疗法对于同样的紊乱可以实现所需的效果(例如，可以同时施用本发明的化合物与另一种抗炎剂)，或者它们可以实现不同的效果(例如，控制任何不良作用)。
在某些实施例中，包含本发明的修饰颗粒的药物组合物还包含一种或多种另外的治疗活性成分(例如，抗炎剂和/或姑息剂)。出于本发明的目的，术语“姑息剂”是指着重于减轻疾病症状和/或治疗方案的副作用但并非治愈的治疗。例如，姑息性治疗涵盖止痛药、防晕药以及止吐药。
本发明提供调节个体(优选为哺乳动物，更优选为人)的免疫反应的方法，所述方法包括给个体施用本文所述的修饰颗粒。由本发明提供的免疫调节方法包括遏制和/抑制先天性免疫反应或适应性免疫反应的方法，所述免疫反应包括但不限于由免疫刺激性多肽或病毒或细菌组分刺激的免疫反应。
施用足够调节免疫反应的量的修饰颗粒。如本文所述，免疫反应的调节可以是体液的和/或细胞的，并且使用本领域的标准技术并如本文所述的那样进行测量。
在某些实施例中，个体罹患与不需要的免疫活化相关的紊乱，诸如变应性疾病或病症、变态反应和哮喘。患有变应性疾病或哮喘的个体是具有现有变应性疾病或哮喘的可识别症状的个体。
在某些实施例中，个体罹患与不需要的免疫活化相关的紊乱，诸如自身免疫疾病和炎性疾病。患有自身免疫疾病或炎性疾病的个体是具有现有自身免疫疾病或炎性疾病的可识别症状的个体。
自身免疫性疾病可以分为两大类：器官特异性和全身性。自身免疫疾病包括但不限于，类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、II型糖尿病、多发性硬化症(MS)、免疫介导的不孕症诸如卵巢功能早衰、硬皮病、舍格伦病、白癜风、脱发(秃头)、多腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、炎性肠疾病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、乳糜泻、自身免疫性肝炎(包括与乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)相关的肝炎)、垂体功能减退、移植物抗宿主病(GvHD)、心肌炎、艾迪生氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、以及甲状旁腺功能减退。
自身免疫疾病也可包括但不限于，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、桥本氏甲状腺炎、I型和II型自身免疫性多腺体综合征、副肿瘤性天疱疮、水疱性类天疱疮、疱疹样皮炎、线状IgA疾病、获得性大疱性表皮松解症、结节红斑、妊娠性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、原发性混合型冷球蛋白血症、小儿慢性大疱性疾病、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、重症肌无力、伊顿-兰伯特肌无力综合征、僵人综合征、急性播散性脑脊髓炎、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、伴有传导阻滞的多灶性运动神经病、伴有单克隆丙种球蛋白病的慢性神经病变、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征、小脑变性、脑脊髓炎、视网膜病、原发性胆道硬化症、硬化性胆管炎、谷蛋白敏感性肠病、强直性脊柱炎、反应性关节炎、多发性肌炎/皮肌炎、混合性结缔组织病、白塞氏综合征、牛皮癣、结节性多动脉炎、变应性血管炎与肉芽肿(Churg-Strauss疾病)、多血管炎重叠综合征、超敏性血管炎、韦格纳氏肉芽肿、颞动脉炎、大动脉炎、川崎病、中枢神经系统孤立性血管炎、血栓闭塞性脉管炎、类肉瘤病、肾小球性肾炎和寒冷病。这些病症在医学领域是众所周知的，并且描述于例如Harrison's Principles of Internal Medicine,14th ed.,Fauci A S et al.,eds.,New York:McGraw-Hill,1998(《哈里森内科学》，第14版，Fauci AS等人编辑，纽约，麦格劳希尔公司，1998年)。
由本发明颗粒治疗的受试者优选地为人类，然而，颗粒可用于治疗非人动物物种。可由本发明颗粒治疗的非人动物物种包括但不限于，狗、猫、鸡、鹅、鸭、绵羊、奶牛、山羊、猪、非人灵长类动物、猴、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠和马。
用于研究自身免疫疾病的动物模型在本领域中是已知的。例如，表现出与人自身免疫疾病最相似的动物模型包括自发地产生特定疾病的高发病率的动物品系。此类模型的例子包括但不限于，发生类似1型糖尿病的疾病的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠以及易发生狼疮样疾病的动物，诸如新西兰杂交种、MRL-Faslpr以及BXSB小鼠。已经诱发自身免疫疾病的动物模型包括但不限于，作为多发性硬化症的模型的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)、作为类风湿性关节炎的模型的胶原蛋白诱发性关节炎(CIA)、以及作为葡萄膜炎的模型的实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)。自身免疫疾病的动物模型还已经通过遗传操纵构建出来，并且包括例如用于炎性肠病的IL-2/IL-10基因敲除小鼠、用于SLE的Fas或Fas配体基因敲除、以及用于类风湿性关节炎的IL-I受体拮抗剂基因敲除。
在某些实施例中，个体罹患细菌或病毒感染。患有细菌或病毒感染的个体是具有现有细菌或病毒感染的可识别症状的个体。
可用本发明的修饰颗粒治疗的病毒感染的非限制性列表包括疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染、副粘病毒感染、副流感病毒感染、以及逆转录病毒感染。优选的病毒是那些感染受试者的中枢神经系统的病毒。最优选的病毒是那些引起脑炎或脑膜炎的病毒。
可用本发明的修饰颗粒治疗的细菌感染的非限制性列表包括葡萄球菌感染、链球菌感染、分枝杆菌感染、芽孢杆菌感染、沙门氏菌感染、弧菌感染、螺旋体感染、以及奈瑟氏菌感染。优选的是感染受试者的中枢神经系统的细菌。最优选的是引起脑炎或脑膜炎的细菌。
在一些实施例中，本发明涉及在疾病发作之前使用本发明的组合物。在其他实施例中，本发明涉及使用本发明的组合物来抑制正发展的疾病。在一些实施例中，本发明涉及改善受试者的疾病。所谓改善受试者的疾病意在包括治疗、预防或抑制受试者的疾病。
在一些实施例中，本发明涉及预防疾病的复发。例如，不需要的免疫反应可以发生在肽的一个区域(诸如抗原决定子)。与不需要的免疫反应相关的疾病的复发可能因在肽的不同区域具有免疫反应攻击而发生。由于本发明的带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分，因此颗粒将有效针对多个表位。在一些包括MS和其他ThI/17介导的自身免疫疾病在内的免疫反应紊乱中的T细胞反应可以是动态的，并且在复发缓解型和/或慢性进行性疾病的过程中演变。T细胞组库的动态性质暗示可用于治疗某些疾病，因为靶标可以随着疾病发展而变化。在此之前，需要预先了解反应型态以便预测疾病的发展。本发明提供可以防止动态变化的疾病的作用，即“表位扩展”的功能的组合物。用于复发的已知模型是对蛋白脂蛋白(PLP)的免疫反应作为多发性硬化症(MS)的模型。初始免疫反应可通过对PLP139-15的反应而发生。随后的疾病发作可以通过对PLP[pi]s-iβi的复发免疫反应而发生。
本发明的某些实施例涉及治疗与不需要的超敏反应相关的病理学病症。超敏反应可以是I、II、III以及IV型中的任一种。速发型(I型)超敏反应。施用的频率通常与过敏原暴露的时机相对应。合适的动物模型在本领域是已知的(例如，Gundel et al.,Am.Rev.Respir.Dis.1 46:369,1992(Gundel等人，《美国呼吸系统疾病综论》，第146卷，第369页，1992年)；Wada et al.,J.Med.Chem.39,2055,1996(Wada等人，《药物化学杂志》，第39卷，第2055页，1996年)；以及WO 96/35418)。
本发明的其他实施例涉及移植。这是指组织样品或移植物从供体个体转移到接受个体，并且经常对需要组织以便恢复由所述组织提供的生理学功能的人接受者进行。移植的组织包括(但不限于)完整器官诸如肾、肝、心脏、肺；器官组分诸如皮肤移植物和眼角膜；以及细胞悬浮液诸如骨髓细胞和从骨髓或循环血液选择并扩增的细胞培养物，以及全血输血。
任何移植的严重潜在并发症将因宿主接受者与移植组织之间的抗原性差异而发生。根据差异的性质和程度，可能存在宿主对移植物或移植物对宿主进行免疫攻击的风险，或两者都可能发生。通过追踪受过相似治疗的具有相似表型的受试者的群体中的反应型态，并且根据公认的临床程序使各种可能的贡献因素相关联来确定风险的程度。免疫攻击可能是预先存在的免疫反应(诸如预先形成的抗体)的结果，或者是大致在移植时起始的免疫反应(诸如产生TH细胞)的结果。抗体、TH细胞、或Tc细胞可能参与相互之间及与各种效应分子和细胞的任何组合。然而，参与免疫反应的抗原通常并不知道，因此在设计抗原特异性疗法或诱导抗原特异性耐受方面造成困难。本发明的修饰颗粒特别适用于预防器官排斥反应，因为不需要附接的肽或抗原与修饰颗粒缀合来使颗粒有效诱导耐受或改善炎性免疫反应。
本发明的某些实施例涉及减小宿主抗移植物疾病，从而引起接受者对组织移植物的排斥反应的风险。可施行治疗来预防或减少超急性排斥反应、急性排斥反应或慢性排斥反应的影响。优先在移植之前足够长的时间开始治疗，以使得耐受性在安置移植物时即就位；但是在这样不可能的情况下，可以与移植同时或在移植之后开始治疗。不管开始的时间如何，治疗通常将定期持续至少移植后的第一个月。如果出现移植物的充分适应则可能不需要后续剂量，但是如果存在移植物排斥或炎症的任何迹象则可以重新开始。当然，本发明的耐受程序可与其他形式的免疫抑制组合以实现甚至更低水平的风险。
本发明的某些实施例涉及减轻或以其他方式改善作为对手术的反应而诱导的炎性反应。在本发明的一个实施例中，在手术之前施用免疫修饰性颗粒。在本发明的另外一个实施例中，在手术的同时或手术期间施用免疫修饰性颗粒。在本发明的再一个实施例中，在手术之后施用免疫修饰性颗粒。
本发明的颗粒也可用于治疗脓肿或积脓症，以减轻在暴露于感染性病原体诸如细菌或寄生虫之后受试者中产生的炎性反应。在本发明的一个实施例中，免疫修饰性颗粒与本领域已知的抗菌和/或抗寄生虫治疗联合施用。
本发明的颗粒也可用于减轻或以其他方式改善作为对物理创伤或损伤的反应而诱导的炎性反应，所述物理创伤或损伤包括但不限于，运动损伤、伤口、脊髓损伤、脑损伤和/或软组织损伤。在本发明的一个实施例中，在受试者经历创伤或损伤之后施用免疫修饰性颗粒。
本发明的颗粒也可用于减轻与癌细胞的发育和/或生长相关的炎性反应。可治疗的癌包括但不限于，中枢神经系统癌、基底细胞癌、癌性脑瘤、伯基特氏淋巴瘤、淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、肝癌、非小细胞和小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞)癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌以及甲状腺癌。在一个实施例中，本发明的颗粒的皮下注射防止抑制性中性粒细胞或单核细胞来源的抑制细胞的积累，从而增强或促进癌症患者的肿瘤特异性免疫反应。
本发明的颗粒也可用于受损组织的再生。在一个实施例中，给患者施用颗粒能增强消化道中受损的上皮细胞的再生。在另外一个实施例中，患者罹患溃疡性结肠炎、克罗恩氏病或炎性肠疾病。在另一个实施例中，给患者施用本发明的颗粒能增强神经元的髓鞘再生。在另外一个实施例中，患者罹患多发性硬化症。
实例
提供以下实例以便进一步说明本发明的优点和特征，但并非旨在限制本公开的范围。
材料与方法
小鼠
对于WNV和IBD研究，从澳大利亚西澳大利亚州的动物资源中心(AnimalResources Centre(WA,Australia))获得八周龄的雌性C57BL/6小鼠。所有程序都是在悉尼大学动物伦理学委员会(University of Sydney Animal Ethics Committee)的允许下进行的。对于EAE研究，从美国印地安纳州印第安纳波利斯的哈伦实验室(HarlanLaboratories(Indianapolis,IN,USA))获得八周龄的雌性SJL/J小鼠。对于巯基乙酸盐研究，从美国马里兰州的国家癌症研究所(National Cancer Institute(MD,USA))获得八周龄的雌性Balb/c。具有Balb/c背景的MARCO-/-动物由美国马萨诸塞州哈佛大学(HarvardUniversity,MA,USA)的Lester Kobzik友情提供。对于心脏炎症研究，从美国缅因州的杰克逊实验室(Jackson Laboratory(ME,USA))购得十二周龄的雄性C57BL/6小鼠。所有程序都是在西北大学动物管理和使用委员会(Northwestern University Institutional AnimalCare and Use Committee)的允许下进行的。在特定的无病原体条件下圈养所有动物，随意提供食物和水。
WNV感染
WNV(Sarafend株)来源于新生小鼠的脑并且在体外细胞培养中繁殖(Getts etal.,J.Exp Med.205:2319-2337,2008(Getts等人，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2008年))。在C57BL/6动物中进行WNV感染(Getts et al.,J.Exp Med.205:2319-2337,2008(Getts等人，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2008年))。用10μL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS；美国加利福尼亚州的英杰公司(Invitrogen,CA,USA))中的6×104或6×103PFU WNV对小鼠进行鼻内感染。仅使用无菌PBS来进行模拟24感染。感染后每天称量小鼠。
巯基乙酸盐诱导的腹膜炎
通过腹腔内注射无菌水(美国密苏里州的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,MO,USA))中制备的1ml 4％(w/v)巯基乙酸盐肉汤，来进行腹膜炎的诱导。通过使用冰冷的0.05mM EDTA PBS溶液进行腹腔灌洗(清洗)，在限定时间点处分离白细胞。
EAE诱导
在SJL/J小鼠中诱导PLP139-151(HSLGKWLGHPDKF)肽诱导的EAE(Getts et al.,J.Immunol.187:2405-2417,2011(Getts等人，《免疫学杂志》，第187卷，第2405-2417页，2011年))。每天观察个体动物，并且以盲检方式在如下0-5标度上评估临床评分。0＝无异常；1＝尾部无力或后肢虚弱；2＝尾部无力和后肢虚弱；3＝后肢瘫痪；4＝后肢瘫痪和前肢虚弱；以及5＝濒死状态。这些数据作为平均临床评分记录。使瘫痪动物更易获取食物和水。
心肌梗塞
在C57BL/6小鼠中进行心肌梗塞。通过手术使左前降支动脉永久闭塞(Yeap etal.,Methods in Molecular Biology,In Press(Yeap等人，《分子生物学方法》，出版中))。
肾缺血再灌注诱导
将肾动脉结扎45分钟，然后释放以允许肾的完全再灌注。
炎性肠疾病诱导
诱导IBD的经DSS诱导的结肠炎模型(Bao et al.,Immunol.Cell Bio.89:853-860,2011(Bao等人，《免疫学和细胞生物学》，第89卷，第853-860页，2011年))。将溶解于自来水中的2.5％w/v 25葡聚糖硫酸钠(DSS，MW 36,000-44,000D；澳大拉西亚的ICN生物医学公司(ICN Biomedicals,Australasia))随意施用9个连续天数41。在此期间对照组仅接受自来水。每天测量体重和临床评估值。体重减轻百分比计算如下：((第0-9天)时的平均体重/第0天时的体重)×100。在体重测量后，检查小鼠的临床参数，包括可动性和步态、叫声、群体交互与梳理行为。每个参数赋予0-2的分值，其中0-1的总数值代表正常，2-4轻微、5-7中度、8-10严重41。尽可能每天测量排泄物评估值。为排泄物稠度、便血和直肠出血给予评分。0-6之间的总数值反映了排泄物评分，其中0值代表正常外观的排泄物，并且6值代表严重腹泻、直肠出血且粪便中有血。
颗粒的静脉内递送
从美国宾夕法尼亚州(PA,USA)的Polysciences公司获得FITC或亮蓝(BB)Flouresbrite普通型和羧化的聚苯乙烯颗粒(0.5μm直径)。从美国马萨诸塞州(MA,USA)的Phosphorex公司获得FITC聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)及FITC聚苯乙烯普通型、羧化和胺化的颗粒(500nm直径)。在澳大利亚新南威尔士州(NSW,Australia)的麦考瑞大学(MacquarieUniversity)或悉尼大学(Sydney University)处生成羧化的500nm纳米金刚石。将颗粒在无菌PBS中稀释到所指示的浓度，并且如所指示的，静脉内注射200μL。溶媒对照动物仅接受200μL无菌PBS。在指定时间点收获组织，并进行处理以用于流式细胞术、组织学或免疫组织化学。如Getts等人2008年所述的那样进行骨髓来源的Ly6Chi炎性单核细胞的分离和分选，其中分离的细胞用PKH26(英杰公司(Invitrogen))标记，在免疫后第6天，在模拟感染和WNV感染的接受者中静脉内注射2.0×106个细胞。表3中定义了特定颗粒性质。
流式细胞术
将小鼠麻醉并用50mL无菌PBS灌注。分离脾、脑、骨髓、血液和腹膜液，并处理成单细胞悬浮液(Getts et al.,J.Exp Med.205:2319-2337,2008(Getts等人，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2008年))。将细胞与抗CD16/32一起温育，并且使用台盼蓝排斥实验对通常显示>95％活力的活细胞进行计数。然后将细胞与针对CD45、CD11b、Ly6C、Ly6G、CD11c、CD103、ETC的荧光标记抗体(Biolegend)一起温育。使用FACS Diva程序(美国新泽西州的碧迪公司(Becton Dickinson,NJ,USA))在FACS LSR-II上测量细胞表面分子表达。活细胞群由前向散射和侧向散射来设门，并且随后通过前向设门测定标识的荧光细胞群。使用流式细胞术程序Flow Jo(美国俄勒冈州的Tree Star公司(Tree Star,Inc.OR,USA))对获取的FACS数据文件进行分析。基于分析时的流式细胞仪百分比和来自每个器官的绝对细胞计数，计算所关注的细胞群的定量。
过继转移
在免疫后第6天，将WNV感染的动物的骨髓处理成单细胞悬浮液，并与针对CD11b、Ly6C和Ly6G的荧光标记抗体一起温育。使用FACS Diva程序(碧迪公司(BectonDickinson))在FACS Aria上分选CD11b+、Ly6Chi、Ly6G-单核细胞，其中严格性被设定为能实现>98％纯度。然后根据制造商的说明用荧光膜染料PKH26(英杰公司(Invitrogen))标记细胞。在免疫后第6天，为匹配的模拟感染和WNV感染的接受者静脉内注射2.0×106个分选的Ly6Chi单核细胞，在200μL PBS中递送。在免疫后第7天(转移后24小时)从接受者中分离脑和脾，并进行处理以用于流式细胞术，如上文所述。
组织学和免疫组织化学
将小鼠麻醉并用50mL无菌PBS灌注。除心脏之外(心脏被处理成石蜡块)(Getts etal.,J.Neurochem 103:10919-1030,2007(Getts等人，《神经化学杂志》，第103卷，第10919-11030页，2007年)，将所有器官分离并速冻于最佳切割温度化合物(Optimum CuttingTemperature Compound)(OCT；日本东京的Tissue-Tek公司(Tissue-Tek,Tokyo,Japan))中。在恒冷切片机中切割八微米组织切片、风干过夜，然后保存在-80℃下直到需要为止。将冷冻的切片解冻并且进行组织学(标准苏木精伊红染色)或免疫组织化学(Getts et al.,J.Exp Med 205:2319-2337,2008(Getts等人，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2008年))。如所指示的那样使用针对MARCO、SIGN-R1和SIGLEC-1(美国明尼苏达州的安迪生物科技公司(R&D Systems,MN,USA))、CD68(美国马萨诸塞州的艾博抗公司(Abcam,MA,USA))及Ki67(艾博抗公司(Abcam))的抗体。使用DP-70相机和DP manager 2.2.1软件在Olympus BX-51显微镜(日本东京的奥林巴斯公司(Olympus,Tokyo,Japan))上获取图像。
组织学和免疫组织化学
将小鼠麻醉并用50mL无菌PBS灌注。除心脏之外(心脏被处理成石蜡块)(Getts etal.,J.Neurochem 103:10919-1030,2007(Getts等人，《神经化学杂志》，第103卷，第10919-11030页，2007年)，将所有器官分离并速冻于最佳切割温度化合物(Optimum CuttingTemperature Compound)(OCT；日本东京的Tissue-Tek公司(Tissue-Tek,Tokyo,Japan))中。在恒冷切片机中切割八微米组织切片、风干过夜，然后保存在-80℃下直到需要为止。将冷冻的切片解冻并且进行组织学(标准苏木精伊红染色)或免疫组织化学(Getts et al.,J.Exp Med 205:2319-2337,2008(Getts等人，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2008年))。如所指示的那样使用针对MARCO、SIGN-R1和SIGLEC-1(美国明尼苏达州的安迪生物科技公司(R&D Systems,MN,USA))、CD68(美国马萨诸塞州的艾博抗公司(Abcam,MA,USA))及Ki67(艾博抗公司(Abcam))的抗体。使用DP-70相机和DP manager 2.2.1软件在Olympus BX-51显微镜(日本东京的奥林巴斯公司(Olympus,Tokyo,Japan))上获取图像。
多重ELISA
根据制造商说明，使用Quansys Q-plex小鼠细胞因子Screen IR 16-plex进行多重板ELISA(Quansys生物科学公司(Quansys Biosciences))。在Li-Cor Odyssey IR成像系统(Li-Cor生物技术公司(Li-Cor Biotechnology))上观测板。使用Quansys Q-view软件(Quansys生物科学公司(Quansys Biosciences))分析图像。
表3：颗粒的物理性质
物理性质
Figure BDA0003320877280000521
Figure BDA0003320877280000531
Figure BDA0003320877280000541
统计学
在GraphPad Prism(美国圣地亚哥的GraphPad软件公司(GraphPad software,SDG,USA))中制作图表，并进行统计分析。为了比较两个样品，进行不成对双尾学生T检验。为了比较三个或更多个样品，进行具有Tukey-Kramer事后检验的单因素方差分析。对于存活数据，进行Mantel-Haenszel对数秩检验。对于这些检验，P≤0.05(*)被视为显著，并且P≤0.01(**)被视为非常显著。
实例1
经调理的IMP具有降低的抑制巨噬细胞向脑迁移的能力。
从模拟或WNV感染的动物取出第7天血浆，并与PS-IMP一起温育。在免疫后第6天，将这些“经调理的”颗粒或未经调理的(未处理微珠)颗粒重新输注到WNV感染的小鼠中。在第7天，通过流式细胞术检查脑中的炎性单核细胞流入。虽然未处理(正常IMP)导致脑中减少的单核细胞流入，但模拟血浆包被IMP不能抑制单核细胞迁移(图9)。相对于未包被IMP而言，WNV血清包被IMP具有降低的抑制单核细胞的能力，但仍然能够在一定程度上减少迁移。
实例2
免疫修饰性颗粒减少了炎性单核细胞迁移并提高了WNV存活率
急性和许多慢性炎性疾病的标志是单核细胞向炎症区域中的流入。之前，我们已证实，与WNV脑感染相关的发病是炎性单核细胞向脑中运输的直接结果(Getts,2008；Getts,2007；Terry,2012；Getts,2012)。在该模型中，≥5％的体重减轻是与ΦIM向脑中运输及因此致死率相关的生物标记物(Getts et al.,J.Neuroinflammation,In Press(Getts等人，《神经炎症杂志》，出版中))。至少50％的感染的动物将继续减轻体重，其中100％通常将在初始体重减轻的72小时内死于感染(图1A)。体重未减轻的动物未显示脑炎的任何其他症状，但仍然形成终身清除性免疫(图1A)。为了监测单核细胞运输，在初始体重减轻(第6天)时，非预期性地输注羧化、带负电的聚苯乙烯颗粒(PS-IMP)，而非聚苯乙烯中性颗粒(PS-NP)。令人惊讶的是，输注几乎立即减轻了症状，诸如皮毛起皱、不适和癫痫，这些症状与临床WNV中枢神经系统(CNS)感染一致地相关。该减轻与局部促炎性细胞因子和趋化因子的减少相关(图6)。此外，每天输注PS-IMP持续最多5天使得本来会死于感染的小鼠获得60％存活率(图1A)。在这些小鼠中，体重通常稳定并在5-6天内恢复到对照水平(未示出)。PS-NP或溶媒处理的小鼠显示出持续的体重减轻，存活率<10％。此外，在输注之前用来自WNV或模拟感染的动物的血清预先调理IMP，不会影响疾病预后(未示出)。与我们之前在WNV脑炎中的观察结果(Getts,2008；Getts,2007；Terry,2012；Getts,2012)一致的是，与磷酸盐缓冲盐水(溶媒)处理或PS-NP处理的对照动物相比，存活率与PS-IMP处理的小鼠的脑中的ΦIM来源的巨噬细胞的显著减少相关(图1B，图7)。
实例3
免疫修饰性颗粒必须带负电
用其他羧化颗粒(具体地讲，ND IMP和PLGA-IMP)处理WNV感染的动物，得到与用PS-IMP处理的动物中所见的存活统计数据(图1C)类似的存活统计数据，这表明颗粒核心与负责治疗效果的性质无关。初始实验性研究使用ζ电势小于-50mV的羧化PS-IMP(表3)。我们因此比较了ζ电势为-50mV的PS颗粒、ζ电势为约-0.5mV的PS颗粒(中性；聚苯乙烯中性颗粒；PS-NP)或ζ电势为+40mV的PS颗粒(胺化颗粒、聚苯乙烯正电颗粒；PS-PP)。在减少炎性单核细胞向脑运输的方面，PS-IMP(-50mV)显示出最大影响(图1D)。相比之下，PP并未减少IM来源的巨噬细胞的浸润(图1D)，也未提高存活率(图1E)。患有WNV脑炎的小鼠中500nm PS-IMP的剂量反应显示最大有效剂量为约4x109个IMP颗粒或0.355mg颗粒/小鼠(图1F-G)。
实例4
PS-IMP处理导致炎性巨噬细胞重定向到脾
在输注后，PS-IMP主要定位于肺、脾和肝(图2A)，脑和胸腺中没有FITC+颗粒(图7A-B)并且外周淋巴结中不存在任何颗粒(数据未示出)。流式细胞术揭示了IMP在炎性单核细胞、BB20+ B细胞、CD3+ T细胞和NK1.1细胞间相对均匀的分布(图2B-C)，然而，在感染的小鼠中，发现炎性单核细胞比脾中的任何其他细胞类型摄取显著更多的IMP(图2B-C)在血循环内，模拟感染小鼠中含IMP的单核细胞的表型为Ly6C阴性的，而被感染动物中IMP主要定位于Ly6C阳性单核细胞(图2D-E)。此外，与用NP或溶媒对照处理的小鼠相比，来自用FITC-PS-IMP处理的WNV感染的小鼠的脾具有显著更多的炎性单核细胞(图2F；图9)，与这些小鼠外周血中的循环炎性单核细胞减少(图2G)紧密对应。
之前已表明，WNV脑炎的发病由炎性单核细胞引起(Terry等人，2012；Getts等人，2012)。当将这些之前的发现与此处所获得的数据相结合时，我们推测IMP通过如下方式介导其治疗活性：结合于炎性单核细胞，消除其向发炎脑的迁移，相反使其转移到脾。为了证实这点，在免疫后第6天从WNV感染的小鼠的骨髓分选Ly6Chi单核细胞，用PKH26标记，并且在免疫后第6天向模拟感染和WNV感染的接受者中静脉内转移(图3A)。紧接着仅注射PS-IMP、NP或溶媒。PKH26标记的Ly6Chi炎性单核细胞运输到WNV感染的脑中，分化成巨噬细胞，且在模拟感染的脑中未观察到外周免疫细胞(图3B，数据未示出)。如Getts等人(J.Exp.Med.205:2319-2337,2008(《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2008年))所述，PS-IMP处理减少了宿主炎性单核细胞向WNV感染的脑中的浸润(图3B)，且显著更少的过继转移的PKH26+细胞迁移到脑中(图3B和3D)。在模拟感染和WNV感染的小鼠中观察到PKH26标记的细胞向脾中迁移(图3C和3E)，然而，PS-IMP处理导致WNV感染的小鼠的脾中显著更多的Ly6Chi单核细胞积累(图3E)。在去脾小鼠中证实了脾在IMP处理的疗效方面的重要性。与去脾、溶媒处理、WNV感染的对照小鼠相比，IMP输注未能减少炎性单核细胞向WNV感染的去脾小鼠的脑中的迁移(图3F)。最近已证实脾具有单核细胞的储库，所述单核细胞被鉴定为CD11b+/Ly6Chi/CD11c-，它们可在某些炎性病症下从脾募集(Swirski et al.,Science325:612-616；2009(Swirski等人，《科学》，第325卷，第612-616页，2009年)；Leuschner etal.,J.Exp.Med.209:123-137,2012(Leuschner等人，《实验医学杂志》，第209卷，第123-137页，2012年)；Robbins et al.,Circulation 125:364-374,2012(Robbins等人，《循环》，第125卷，第364-374页，2012年))。我们推测IMP输注增强了该脾单核细胞库。然而，摄取了IMP并迁移到脾的超过70％过继转移的单核细胞表达CD11c和CD103(图3E和3G)，使得这一推测不太可能。总而言之，这些数据表明，输注的IMP被炎性单核细胞摄取，这些单核细胞被转移到脾，导致血液中减少的炎性单核细胞数量可供迁移到炎症部位。
实例5
IMP抑制炎性单核细胞向发炎腹膜中的迁移
显而易见的是，单核细胞是WNV脑炎期间观察到的免疫病理状态的重要介质，然而，感染导致涉及其他细胞亚群的一系列复杂的免疫反应。为了解决炎症期间IMP对于炎性单核细胞的特异性，使用无菌巨噬细胞介导的腹膜炎症的模型。白细胞向巯基乙酸盐致炎腹膜中的迁移遵循常规模式，其中在最开始4-18小时内引发中性粒细胞，然后是从大约12小时起ΦIM来源的巨噬细胞的CCR2依赖性积累(Tsou等人，2007)。在腹膜内巯基乙酸盐注射后24小时，PS-IMP(图7D-E；图4A-B)或PLGA-IMP(未示出)的输注显著减少了炎性单核细胞向炎症部位的运输，该运输在去脾小鼠中被消除(图7F)。该数据合起来不仅突出了IMP在主要巨噬细胞介导的炎性模型中的抗炎性质，而且突出了脾对于IMP疗效的重要性。
实例6
炎性单核细胞表达对于IMP活性至关重要的MARCO。
颗粒诸如IMP将通过清道夫受体通路被摄取(Kanno等人，2007)。一种专门参与结合带负电的颗粒以及聚苯乙烯的关键清道夫受体为MARCO(Chao等人，2012；Kanno等人，2007)。在脾中，PS-IMP与表达MARCO的细胞群共定位于边缘区中，这与我们之前对于静脉内输注后凋亡细胞摄取所述的结果类似(Getts等人，2011；Getts等人，2012)(图4C)。还发现，在从WNV感染的动物(而非模拟感染的动物)的脾分离的Ly6chi/CD11b+/CD11c-ΦIM上，MARCO上调(图4D)。为了进一步说明MARCO的作用，使用巯基乙酸盐在MARCO缺陷型(MARCO-/-)动物中诱导腹膜炎症。在巯基乙酸盐施用后48小时，从野生型小鼠和MARCO-/-小鼠中分离出类似数量的腹膜单核细胞(图4B、4E)。然而，在野生型小鼠中PS-IMP处理导致腹膜中减少数量的Ly6Chi/CD11b+ΦIM，与野生型小鼠不同的是，PS-IMP处理输注并未减少从MARCO-/-动物分离的腹膜Ly6Chi/CD11b巨噬细胞的数量(图4B、4D)，这直接指明了MARCO在IMP的摄取和疗效方面的作用。另外，已证实，MARCO也在吞噬了二氧化硅颗粒的巨噬细胞中起到细胞凋亡诱导方面的直接作用(Hamilton等人，2006)。有趣的是，在PS-IMP(图4G-I；图11B)或PLGA-IMP(未示出)输注后2小时，IMP显著增加了野生型小鼠(而非MARCO-/-小鼠)脾中膜联蛋白V和半胱天冬酶-3阳性炎性单核细胞的数量。细胞凋亡在中性粒细胞和炎性单核细胞中均被诱导，并且可在IMP输注后2小时内检测到(图10)。用PS-IMP或PBS注射小鼠，并在随后2小时处死小鼠。将脾取出，处理成单细胞悬浮液，并且用抗CD11b、Ly6C、CD11b、Ly6G、可固定细胞活力染料(Fixable viability dye)eFluor780(eBioscience)染色。使用CaspGLOWTM荧光素活性半胱天冬酶-3染色试剂盒(Fluorescein Active Caspase-3Staining Kit)检测凋亡细胞。PLGA-IMP输注到巯基乙酸盐诱导的野生型小鼠中，导致表达细胞凋亡标记物膜联蛋白V和半胱天冬酶-3的Ly6ChiΦIM和Ly6G+中性粒细胞的数量显著增加。在模拟处理动物中未观察到这种情况。注射后两小时(图11)，PS-IMP定位于模拟和TG腹膜炎诱导的小鼠的脾中的CD11b+Ly6C+Ly6G-单核细胞中。PS-IMP的摄取与指示细胞凋亡的酶半胱天冬酶-3的活性相关(a)。在PS-IMP处理、TG腹膜炎诱导的小鼠中，增加数量的单核细胞对半胱天冬酶-3活性呈阳性(b)。
坏死细胞非常少(少于5％)，这指示细胞死亡与降解IMP不相关。
总而言之，数据表明，IMP可能通过MARCO清道夫受体被摄取，该受体可介导下游信号传导7通路，该通路导致脾中的炎性单核细胞迁移、积累和随后的细胞凋亡。
实例7
IMP疗法抑制EAE中的炎性单核细胞
为了进一步理解IMP的治疗潜能，检查了多种不相关炎性疾病模型。首先，测试了CNS炎症的另一种非感染性模型，即实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。在EAE中，循环的Ly6Chi炎性单核细胞分化成巨噬细胞和小胶质细胞，在EAE中，这些相同的细胞主要分化成促进T细胞活化和表位扩展的CD11c+DC(Getts et al.,J.Exp.Med.205:2319-2337,2007(Getts等人，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2007年)；King et al.,Blood113:3190-3197,2009(King等人，《血液》，第113卷，第3190-3197页，2009年)；Getts etal.,J.Neuroinflammation,In Press(Getts等人，《神经炎症杂志》，出版中))。在疾病发作时每天静脉内灌注可生物降解的PLGA-IMP持续7天，不仅在处理期间改善了疾病，而且与延长的疗效相关，如在处理停止后14天症状消失所确定(图5A)。更重要的是，原发性疾病期间每天灌注IMP处理，导致在处理时间段期间减小的疾病评分和复发起始的抑制(图5B)。发作时处理的动物中减小的疾病评分，与脊髓中减轻的炎症相关，如通过流式细胞术所确定(图5C、D和图8A)，且在炎性单核细胞来源的DC区室内观察到最显著的减小(图5C-D和图8A)。与罹患WNV脑炎或腹膜炎的动物中的观察结果类似，EAE CNS中的炎性单核细胞的减少，与表达Ly6C的单核细胞在脾中的显著积累相关(图5D和图8B)。
实例8
IMP疗法减轻缺血再灌注所引起的损伤
炎性单核细胞涉及包括动脉粥样硬化和心肌梗塞的心脏疾病的发病，并且与不良预后相关(Swirski et al.,Science 325:612-616,02009(Swirski等人，《科学》，第325卷，第612-616页，2009年)；Leuschner et al.,J.Exp.Med.209:123-137,2012(Leuschner等人，《实验医学杂志》，第209卷，第123-137页，2012年)；Robbins et al.,Circulation 125:364-374,2012(Robbins等人，《循环》，第125卷，第364-374页，2012年)；Bailey et al.,Nat.Immunol 8:172-180,2007(Bailey等人，《自然免疫学》，第8卷，第172-180页，2007年))。使用永久左前降支动脉闭塞模型(Yeap et al.,Methods in Molecular Biology,InPress(Yeap等人，《分子生物学方法》，出版中))，确定了PLGA-IMP处理3天的影响(图5H)。在溶媒处理的动物中，闭塞导致单核细胞向心肌的强烈浸润，涉及到最多至40％的左心室壁(图5I-J)。IMP处理显著减小了炎性病灶的大小，使总体心脏炎症减轻了15-20％(图5i、j)。此外，观察到梗塞区内CD68+巨噬细胞数量显著减少，相对于溶媒处理对照而言，IMP处理导致CD68+细胞/mm2的数量减少30％(图5K、L)。重要的是，该减少同样与脾中的Ly6Chi炎性单核细胞的数量的显著增加相关(图8D-E)。为了进一步说明再灌注损伤模型中IMP疗法的潜能，在啮齿动物中测试了IMP，其中将肾动脉结扎45分钟，随后使血流返回。在结扎后12小时开始IMP处理。明显地，在第1天和第5天，与溶媒处理的对照相比，血清肌酐清除在已用IMP处理的动物中显著更大(n)，与在这些时间点处理的动物中减小的肾小管萎缩评分相关(o)。总之，已经充分确定移植过程中的移植物失功以及心肌梗塞后的长期预后分别与炎症程度和梗塞面积直接相关(Nahrendorf et al.,Circulation 121:2437-2445,2010(Nahrendorf等人，《循环》，第121卷，第2437-2445页，2010年)；Leuschner et al.,J.Exp.Med.209:123-137,2012(Leuschner等人，《实验医学杂志》，第209卷，第123-137页，2012年)；Nahrendorf,et al.,J.Exp.Med.204:3037-3047,2007(Nahrendorf等人，《实验医学杂志》，第204卷，第3037-3047页，2007年))。此处的数据表明有力支持了IMP不仅能减轻炎症，而且更重要的是与增强的器官功能相关。
实例9
IMP疗法缓解炎性肠疾病的症状
肠代表与脑、腹膜或心脏不同的独特器官系统。单核细胞在炎性肠疾病(IBD)中的重要性已有所描述(Bain et al.,Mucosal Immunol,2012(Bain等人，《粘膜免疫学》，2012年)；Xu et al.,Cell Res.18:1220-1229,2008(Xu等人，《细胞研究》，第18卷，第1220-1229页，2008年))，其中使用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型表明了趋化因子GM CSF以及Ly6Chi炎性单核细胞涉及IBD的发病(Xu et al.,Cell Res.18:1220-1229,2008(Xu等人，《细胞研究》，第18卷，第1220-1229页，2008年))。Ly6Chi炎性单核细胞向发炎结肠中的运输的减少被认为能减轻疾病严重程度。因此，在患有DSS诱导的结肠炎的动物中研究了IMP处理(图5P)。与溶媒对照相比，用PS-IMP处理的动物中结肠炎症状显著减弱(图5G)。此外，进入发炎结肠中的具有单核细胞形态的GR1+细胞的数量减少，如通过免疫组织化学确定(图5R-S)。在PS-IMP处理的动物中，这与减少的上皮细胞破坏和显著增加数量的标记有增殖标记物Ki67的上皮细胞相关(图8F-G)。上皮细胞增殖与DSS激发后的肠道恢复相关，其中IMP的灌注明显能够使DSS介导的损伤提早修复。
实例10
IMP疗法避免了心肌梗塞模型中的炎性损伤
使用永久左前降支动脉闭塞模型(Yeap et al.,Methods in MolecularBiology,In Press(Yeap等人，《分子生物学方法》，出版中))，确定了裸PLGA-IMP处理4天的影响(图9)。在溶媒处理的动物中，闭塞导致炎症加重。IMP处理显著减小了炎性病灶的大小，从而减轻了总体心脏炎症。此外，观察到梗塞区内CD68+巨噬细胞数量显著减少，相对于溶媒处理对照而言，IMP处理导致CD68+细胞/mm2的数量减少。重要的是，该减少区与脾中的Ly6Chi炎性单核细胞的数量的显著增加相关。
为了进一步说明IMP疗法在心肌缺血(LAD闭塞)-再灌注模型中的潜能，在啮齿动物中测试了IMP，其中将左前降支冠状动脉闭塞，接着在随后30分钟释放。在结扎后24小时开始IMP处理并持续4天。如图10所示，在IR后28天，与PBS处理的动物相比，处理动物中的梗塞瘢痕大小减小45％。另外，与对照动物相比，PLG-IMP处理的动物中的收缩期射血分数增加21％。
前述实例中的这些数据指示，IMP可成功用于多种感染性和非感染性炎性紊乱以减少炎性单核细胞向炎症部位的运输。这导致显著减轻的临床疾病症状，并且也可使修复机制能够起始，否则该修复机制可能被炎性单核细胞产生的促炎性环境抑制。
实例11
带负电的免疫修饰性颗粒(IMP)的制备
向聚(乙烯-马来酸酐)(PEMA)在D2O中的溶液(4mL,1％w/v)中逐滴加入聚(丙交酯-共-乙醇酸)(PLG)在二氯甲烷(DCM)中的溶液(2mL,20％w/v)。使用VC 30超声波处理器(Ultrasonic Processor)以16瓦特在冰上对混合物超声处理30秒。然后将所得均质化粗产物倾倒入D2O溶液(200mL，包含0.5％w/v PEMA)中。使用贝尔克玻璃公司(Bellco Glass,Inc.)的Bellstir Multi-stir 9磁力搅拌器(10W持续10s，16W持续10s，16W持续30s)以3.5的速度设置将均质化浆液搅拌过夜。
结果
在搅拌三小时后，在一次性聚苯乙烯比色管中使用动态光散射进行粒度分析。
a.10W，10s-Z-平均＝499.9nm–PdI＝0.23，峰值＝634.5nm
b.16W，10s-Z-平均＝528.9nm–PdI＝0.227，峰值＝657.5nm
c.16W，30s-Z-平均＝471.6nm–PdI＝0.228，峰值＝580.5nm
d.16W，60s-Z-平均＝491.1nm–PdI＝0.275，峰值＝600.8nm
在完成反应后，然后纯化所得的粗悬浮液。
纯化
将新鲜的D2O和10x碳酸氢钠缓冲液过夜冷却到4℃。使用40μm细胞滤网，将36mL的颗粒悬浮液从每个批次过滤到装有4mL冷却的10x碳酸氢钠缓冲液的适当标记的50mL离心管中。每个烧杯制得大约6个此类管。将所有管在4℃下以7000g离心约15分钟，并且吸出上清液。使用上述程序重复悬浮液的制备，尽可能使大部分颗粒沉淀物悬浮在1mL冷却的D2O中。
将悬浮的颗粒转移到含有4mL冷却的10x碳酸氢钠缓冲液的新管中。(步骤1)
重复颗粒的重悬，直到所有颗粒沉淀物成功重悬为止。(步骤2)
然后将6个离心管合并到一个离心管(50mL管)中，并且在管中填充剩余体积到40mL的冷却D2O(洗涤1)。
将管在4℃下以7000g离心20分钟，并且吸出上清液。
将所得颗粒的步骤1和2及洗涤1每次再重复至少两次。最后，将所得的颗粒沉淀物在液氮中进行急冻，并且在歧管中冻干至无水，而获得带负电的IMP。
图14示出了通过动态光散射分析对表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司(Malvern Instruments,Westborough,MA))上以2.5×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的群体具有567nm的Z-平均直径、670nm的峰值直径和0.209的多分散指数。
表4示出了表面官能化的PLG-PEMA颗粒的测量值。表中的数据是代表性的，因为每个批次略有差异。但表中的数字是基于对颗粒的若干批次的组合。复乳化颗粒的测量值与表3中的那些类似。
表4-表面官能化的PLG-PEMA颗粒的测量值
Figure BDA0003320877280000631
实例12
IMP诱导调节性T细胞
之前已证实，MS模型实验性自身免疫性脑脊髓炎中的IMP灌注可抑制疾病。在该模型中，在第0天，用弗氏完全佐剂和髓鞘抗原即蛋白脂质蛋白139-158免疫小鼠。每天监测疾病症状，并且当疾病发作明显时，进行10天的IMP处理。在该实例中，从疾病发作时起每天静脉内灌注可生物降解的PLGA-IMP持续10天，不仅在处理期间改善了疾病，而且与无症状的14天治疗后时间相关(图15A)。发作时处理的动物的减小的疾病评分，与处理期间增加数量的C4+CD25+FOXP3+TIM3+调节性T细胞相关(图15B和C)。在第20天(处理开始后10天)，这些Treg表达阴性协同刺激分子PD-1(图15B)。给药停止后10天，发现Treg的数量降至基线，这与疾病复发相关(图15A)。
实例13
IMP结合于炎性血液中相比于初始血液不同的蛋白
通过心脏穿刺从西尼罗病毒感染或模拟(未感染)小鼠中收集小鼠血浆到肝素管中。随后通过本领域熟知的标准方法，将血浆与其他血液组分(例如，白血细胞和红血细胞)分离。随后将血浆与3×108免疫修饰性纳米颗粒一起在室温下温育30分钟。30分钟后，洗涤颗粒并在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白，并且将每个泳道切成12个等同的凝胶薄片。对薄片进行胰蛋白酶消化，并且通过偶联到串联质谱的反相液相色谱(LC-MS/MS)分析所得的肽混合物。对蛋白进行GeLC-MS分析。简而言之，在存在二硫苏糖醇和碘乙酰胺的情况下将蛋白还原并烷基化。通过真空离心干燥条带，并且与240ng胰蛋白酶一起在4℃下温育1小时。移除过量的胰蛋白酶，并更换为50mM碳酸氢铵以在37℃下温育过夜。在质谱分析之前，使用包含Poros R2树脂的预先制造的微柱(马萨诸塞州弗雷明汉的前景生物系统公司(PerseptiveBiosystems,Framingham MA))，将肽浓缩并脱盐。将洗脱的肽再溶解于0.1％甲酸中并且进行反相LC-MS/MS。由重复LC-MS/MS实验生成大约41,000个MS/MS谱。在Mascot中提取串联质谱，对电荷状态去卷积并扣除同位素谱(deisotoped)，并且使用Mascot和X！Tandem进行分析。针对SWISS-PROT数据库中包括的小家鼠(小鼠)条目搜索数据，显著性阈值设定为p<0.05。以15ppm的碎片离子质量公差和0.2Da的前体离子公差执行搜索。甲硫氨酸亚砜、脲甲基-半胱氨酸以及脱酰胺的天冬酰胺和谷氨酰胺被指定为可变修饰。使用支架对多个MS/MS实验求积分，并且验证基于MS/MS的肽和蛋白鉴定。仅在Mascot离子评分对于双电荷、三电荷和四电荷肽分别超过30、40和40时，才考虑这些肽。X！Tandem鉴定要求-Log(预期评分)评分大于2.0。如果鉴定出匹配上述标准的最少2条肽，则接受这些蛋白鉴定。五种蛋白被视为鉴定出，虽然仅匹配一条肽。在这种情况下，在多个场合对肽测序，并且单条肽所获得的序列覆盖率大于5％。
这些研究的结果鉴定了以下与初始血清温育会结合于颗粒的蛋白：
表5初始血清中结合IMP的蛋白
Figure BDA0003320877280000651
Figure BDA0003320877280000661
Figure BDA0003320877280000671
Figure BDA0003320877280000681
Figure BDA0003320877280000691
然而，有趣的是，这些方法鉴定了15个独特的蛋白，所述蛋白在炎性条件下结合于IMP而未发现在非炎性或初始条件下会结合于IMP。这些蛋白列于表6中。
表6：仅结合炎性血清中的IMP的蛋白
Figure BDA0003320877280000692
Figure BDA0003320877280000701
这些结果指示，本发明的颗粒不仅可用于充当分子壑以清除炎性介质、病理蛋白和/或细胞碎片诸如S100蛋白和/或脂肪酸结合蛋白(图16A)，同时也可用于浓缩调节蛋白诸如膜联蛋白1(图16B)。
另外，这些结果可用于本文所述的诊断方法，其中将血清与IMP在体外或体内温育，并且随后通过液相色谱、质谱、HPLC或免疫沉淀从IMP纯化蛋白，例如以便确定/诊断受试者中炎性免疫反应的存在(图17)。
虽然已经描述和说明了本发明的具体实施例，但这些实施例应该仅仅被认为是说明本发明，而非限制本发明，本发明是根据随附权利要求书来解释。
本文所引用的所有专利、申请以及其他参考文献以引用的方式整体并入本文。
本发明提供了：
1.一种诱导受试者中的单核细胞和/或中性粒细胞凋亡的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物，其中所述颗粒不含有附接的肽或抗原部分。
2.根据项1所述的方法，其中所述带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒、金刚石颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。
3.根据项2所述的方法，其中所述颗粒为聚苯乙烯颗粒。
4.根据项2所述的方法，其中所述颗粒为金刚石颗粒。
5.根据项2所述的方法，其中所述颗粒为PLGA颗粒。
6.根据项1所述的方法，其中所述颗粒被羧化。
7.根据项1和6所述的方法，其中所述颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。
8.根据项7所述的方法，其中所述颗粒具有-75mV与0mV之间的ζ电势。
9.根据项8所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。
10.根据项9所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
11.根据项1所述的方法，其中所述组合物改善炎性免疫反应。
12.根据项1所述的方法，其中炎性单核细胞、粒细胞或抑制性中性粒细胞向炎性病灶的浸润减少和/或受抑制。
13.根据项1和6所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.1μm至约10μm之间。
14.根据项13所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.3μm至约5μm之间。
15.根据项14所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约3μm之间。
16.根据项15所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约1μm之间。
17.根据项16所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm。
18.根据项1所述的方法，其中所述受试者具有自身免疫紊乱。
19.根据项18所述的方法，其中所述自身免疫紊乱选自多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
20.根据项19所述的方法，其中所述自身免疫疾病为多发性硬化症。
21.根据项1所述的方法，其中所述受试者为移植接受者。
22.根据项1所述的方法，其中所述受试者具有缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化或罹患心肌梗塞。
23.根据项1所述的方法，其中所述受试者具有牛皮癣或皮炎。
24.根据项1所述的方法，其中所述受试者罹患变应性紊乱。
25.根据项24所述的方法，其中所述变应性紊乱为湿疹、哮喘、变应性鼻炎或皮肤超敏反应。
26.根据项1所述的方法，其中所述受试者具有细菌或病毒感染。
27.根据项26所述的方法，其中所述病毒感染为疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染或副流感病毒感染。
28.根据项27所述的方法，其中所述病毒感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
29.根据项28所述的方法，其中所述病毒感染引起病毒性脑炎或病毒性脑膜炎。
30.根据项26所述的方法，其中所述细菌感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
31.根据项30所述的方法，其中所述细菌感染引起败血症细菌性脑炎或细菌性脑膜炎。
32.根据项1所述的方法，其中所述受试者已接受或将接受手术。
33.根据项32所述的方法，其中在手术之前将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
34.根据项32所述的方法，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
35.根据项32所述的方法，其中在手术之后将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
36.根据项1所述的方法，其中所述受试者经历了物理创伤或损伤。
37.根据项1所述的方法，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
38.一种用于从具有炎性紊乱的受试者的炎性环境中移除促炎介质的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物，其中所述颗粒不含有附接的肽或抗原部分。
39.根据项38所述的方法，其中所述受试者中产生的所述促炎介质结合于所述带负电的颗粒。
40.根据项39所述的方法，其中所述带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒、金刚石颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。
41.根据项40所述的方法，其中所述颗粒为聚苯乙烯颗粒。
42.根据项40所述的方法，其中所述颗粒为金刚石颗粒。
43.根据项40所述的方法，其中所述颗粒为PLGA颗粒。
44.根据项38所述的方法，其中所述颗粒被羧化。
45.根据项38或44所述的方法，其中所述颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。
46.根据项45所述的方法，其中所述颗粒具有-75mV与0mV之间的ζ电势。
47.根据项46所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。
48.根据项47所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
49.根据项38所述的方法，其中所述组合物改善炎性免疫反应。
50.根据项38所述的方法，其中炎性单核细胞、单核细胞来源的抑制细胞和/或抑制性中性粒细胞向炎性病灶的浸润减少和/或受抑制。
51.根据项38和44所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.1μm至约10μm之间。
52.根据项51所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.3μm至约5μm之间。
53.根据项52所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约3μm之间。
54.根据项53所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约1μm之间。
55.根据项54所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm。
56.根据项38所述的方法，其中所述受试者具有自身免疫紊乱。
57.根据项56所述的方法，其中所述自身免疫紊乱选自多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
58.根据项57所述的方法，其中所述自身免疫疾病为多发性硬化症。
59.根据项38所述的方法，其中所述受试者为移植接受者。
60.根据项38所述的方法，其中所述受试者具有缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化或罹患心肌梗塞。
61.根据项38所述的方法，其中所述受试者具有牛皮癣或皮炎。
62.根据项38所述的方法，其中所述受试者罹患变应性紊乱。
63.根据项62所述的方法，其中所述变应性紊乱为湿疹、哮喘、变应性鼻炎或皮肤超敏反应。
64.根据项38所述的方法，其中所述受试者具有细菌或病毒感染。
65.根据项64所述的方法，其中所述病毒感染为疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染或副流感病毒感染。
66.根据项65所述的方法，其中所述病毒感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
67.根据项66所述的方法，其中所述病毒感染引起病毒性脑炎或病毒性脑膜炎。
68.根据项64所述的方法，其中所述细菌感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
69.根据项68所述的方法，其中所述细菌感染引起败血症细菌性脑炎或细菌性脑膜炎。
70.根据项38所述的方法，其中所述受试者已接受或将接受手术。
71.根据项70所述的方法，其中在手术之前将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
72.根据项70所述的方法，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
73.根据项70所述的方法，其中在手术之后将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
74.根据项38所述的方法，其中所述受试者经历了物理创伤或损伤。
75.根据项38所述的方法，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
76.一种诱导受试者中的抗原特异性耐受的方法，所述方法包括给所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含其内包埋有一个或多个抗原的带负电的颗粒，以及载体。
77.根据项76所述的方法，其中所述带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒、金刚石颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。
78.根据项77所述的方法，其中所述颗粒为聚苯乙烯颗粒。
79.根据项77所述的方法，其中所述颗粒为金刚石颗粒。
80.根据项77所述的方法，其中所述颗粒为PLGA颗粒。
81.根据项76所述的方法，其中所述颗粒被羧化。
82.根据项76或81所述的方法，其中所述颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。
83.根据项82所述的方法，其中所述颗粒具有-75mV与+0mV之间的ζ电势。
84.根据项83所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。
85.根据项84所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
86.根据项76所述的方法，其中所述组合物改善炎性免疫反应。
87.根据项76所述的方法，其中炎性单核细胞、粒细胞和/或抑制性中性粒细胞向炎性病灶的浸润减少和/或受抑制。
88.根据项76或81所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.1μm至约10μm之间。
89.根据项88所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.3μm至约5μm之间。
90.根据项89所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约3μm之间。
91.根据项90所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约1μm之间。
92.根据项91所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm。
93.根据项76所述的方法，其中所述受试者具有自身免疫紊乱。
94.根据项93所述的方法，其中所述自身免疫紊乱选自多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
95.根据项94所述的方法，其中所述自身免疫疾病为多发性硬化症。
96.根据项76所述的方法，其中所述受试者为移植接受者。
97.根据项76所述的方法，其中所述受试者具有缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化或罹患心肌梗塞。
98.根据项76所述的方法，其中所述受试者具有牛皮癣或皮炎。
99.根据项76所述的方法，其中所述受试者罹患变应性紊乱。
100.根据项99所述的方法，其中所述变应性紊乱为湿疹、哮喘、变应性鼻炎或皮肤超敏反应。
101.根据项76所述的方法，其中所述受试者具有细菌或病毒感染。
102.根据项101所述的方法，其中所述病毒感染为疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染或副流感病毒感染。
103.根据项102所述的方法，其中所述病毒感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
104.根据项103所述的方法，其中所述病毒感染引起病毒性脑炎或病毒性脑膜炎。
105.根据项101所述的方法，其中所述细菌感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
106.根据项105所述的方法，其中所述细菌感染引起败血症细菌性脑炎或细菌性脑膜炎。
107.根据项76所述的方法，其中所述受试者已接受或将接受手术。
108.根据项107所述的方法，其中在手术之前将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
109.根据项107所述的方法，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
110.根据项107所述的方法，其中在手术之后将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
111.根据项76所述的方法，其中所述受试者经历了物理创伤或损伤。
112.根据项76所述的方法，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
113.根据项22、60或97所述的方法，其中所述组合物提供所述受试者中的保护，避免心肌梗塞后的炎性损伤。
114.根据项22、60或97所述的方法，其中所述组合物提供所述受试者中的保护，避免再灌注后的炎性损伤。
115.一种增强有需要的患者中的受损组织的再生的方法，所述方法包括施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物，其中所述颗粒不含有附接的肽或抗原部分。
116.根据项115所述的方法，其中在结肠炎患者中增强上皮细胞再生。
117.根据项115所述的方法，其中在多发性硬化症患者中增强髓鞘再生。
118.一种诱导受试者中的单核细胞、粒细胞和/或中性粒细胞凋亡的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物，其中所述颗粒包含抗原，所述抗原包含与变态反应、自身免疫疾病和/或炎性疾病或紊乱相关的一个或多个表位。
119.一种诱导受试者中的抗原特异性耐受的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物，其中所述颗粒包含抗原，所述抗原包含与变态反应、自身免疫疾病和/或炎性疾病或紊乱相关的一个或多个表位。
120.根据项118或119所述的方法，其中所述一个或多个表位选自表1或2中所述的那些。
121.根据项118或119所述的方法，其中所述带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒、金刚石颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。
122.根据项121所述的方法，其中所述颗粒被羧化。
123.根据项118或119所述的方法，其中所述颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。
124.根据项123所述的方法，其中所述颗粒具有-75mV与+0mV之间的ζ电势。
125.根据项124所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。
126.根据项125所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
127.根据项118或119所述的方法，其中所述组合物改善炎性免疫反应。
128.根据项118或119所述的方法，其中炎性单核细胞和/或抑制性中性粒细胞向炎性病灶的浸润减少和/或受抑制。
129.根据项118或119所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.1μm至约10μm之间。
130.根据项129所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.3μm至约5μm之间。
131.根据项130所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约3μm之间。
132.根据项131所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约1μm之间。
133.根据项132所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm。
134.根据项118或119所述的方法，其中所述受试者具有自身免疫紊乱。
135.根据项134所述的方法，其中所述自身免疫紊乱选自多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
136.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含髓鞘碱性蛋白的一个或多个表位。
137.根据项136所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4975或SEQ ID NO:4976的一个或多个表位。
138.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的一个或多个表位。
139.根据项138所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4978的一个或多个表位。
140.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含胰岛素的一个或多个表位。
141.根据项140所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4981的一个或多个表位。
142.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含谷氨酸脱羧酶(GAD)的一个或多个表位。
143.根据项142所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4982的一个或多个表位。
144.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含蛋白脂质蛋白的一个或多个表位。
145.根据项144所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4977的一个或多个表位。
146.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含麦胶蛋白的一个或多个表位。
147.根据项147所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4983-4985或5136-5140的一个或多个表位。
148.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含水通道蛋白的一个或多个表位。
149.根据项149所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4979的一个或多个表位。
150.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含髓鞘相关糖蛋白的一个或多个表位。
151.根据项150所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4980的一个或多个表位。
152.根据项118或119所述的组合物，其中所述抗原包含IV型胶原的α3链的一个或多个表位。
153.根据项152所述的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:5017的一个或多个表位。
154.一种用于诱导受试者中的调节性T细胞的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物，其中所述带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分。
155.根据项154所述的方法，其中所述调节性T细胞为CD4+ T细胞。
156.根据项155所述的方法，其中所述CD4+调节性T细胞为CD25+和/或FoxP3+。
157.根据项154所述的方法，其中所述调节性T细胞为CD4+CD25+FoxP3+。
158.根据项154所述的方法，其中所述带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒、金刚石颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。
159.根据项158所述的方法，其中所述颗粒为聚苯乙烯颗粒。
160.根据项158所述的方法，其中所述颗粒为金刚石颗粒。
161.根据项158所述的方法，其中所述颗粒为PLGA颗粒。
162.根据项154所述的方法，其中所述颗粒被羧化。
163.根据项154或162所述的方法，其中所述颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。
164.根据项163所述的方法，其中所述颗粒具有-75mV与0mV之间的ζ电势。
165.根据项164所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。
166.根据项165所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
167.根据项154或162所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.1μm至约10μm之间。
168.根据项167所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.3μm至约5μm之间。
169.根据项168所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约3μm之间。
170.根据项169所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约1μm之间。
171.根据项170所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm。
172.根据项154所述的方法，其中所述受试者具有自身免疫紊乱。
173.根据项172所述的方法，其中所述自身免疫紊乱选自多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
174.根据项173所述的方法，其中所述自身免疫疾病为多发性硬化症。
175.根据项154所述的方法，其中所述受试者为移植接受者。
176.根据项154所述的方法，其中所述受试者具有缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化或罹患心肌梗塞。
177.根据项154所述的方法，其中所述受试者具有牛皮癣或皮炎。
178.根据项154所述的方法，其中所述受试者罹患变应性紊乱。
179.根据项178所述的方法，其中所述变应性紊乱为湿疹、哮喘、变应性鼻炎或皮肤超敏反应。
180.根据项154所述的方法，其中所述受试者具有细菌或病毒感染。
181.根据项180所述的方法，其中所述病毒感染为疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染或副流感病毒感染。
182.根据项181所述的方法，其中所述病毒感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
183.根据项182所述的方法，其中所述病毒感染引起病毒性脑炎或病毒性脑膜炎。
184.根据项180所述的方法，其中所述细菌感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
185.根据项184所述的方法，其中所述细菌感染引起败血症细菌性脑炎或细菌性脑膜炎。
186.根据项154所述的方法，其中所述受试者已接受或将接受手术。
187.根据项186所述的方法，其中在手术之前将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
188.根据项186所述的方法，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
189.根据项186所述的方法，其中在手术之后将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
190.根据项154所述的方法，其中所述受试者经历了物理创伤或损伤。
191.根据项154所述的方法，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
192.一种用于从具有炎性紊乱的受试者的血清或血浆中浓缩调节蛋白的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含带负电的颗粒和载体的药物组合物，其中所述颗粒不含有附接的肽或抗原部分。
193.根据项38所述的方法，其中所述受试者中产生的所述调节蛋白结合于所述带负电的颗粒。
194.根据项193所述的方法，其中所述带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒、金刚石颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。
195.根据项194所述的方法，其中所述颗粒为聚苯乙烯颗粒。
196.根据项194所述的方法，其中所述颗粒为金刚石颗粒。
197.根据项194所述的方法，其中所述颗粒为PLGA颗粒。
198.根据项192所述的方法，其中所述颗粒被羧化。
199.根据项192或198所述的方法，其中所述颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。
200.根据项199所述的方法，其中所述颗粒具有-75mV与0mV之间的ζ电势。
201.根据项200所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。
202.根据项201所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
203.根据项192所述的方法，其中所述组合物改善炎性免疫反应。
204.根据项192所述的方法，其中炎性单核细胞、单核细胞来源的抑制细胞和/或抑制性中性粒细胞向炎性病灶的浸润减少和/或受抑制。
205.根据项192和198所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.1μm至约10μm之间。
206.根据项205所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.3μm至约5μm之间。
207.根据项206所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约3μm之间。
208.根据项207所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约1μm之间。
209.根据项208所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm。
210.根据项192所述的方法，其中所述受试者具有自身免疫紊乱。
211.根据项210所述的方法，其中所述自身免疫紊乱选自多发性硬化症、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠疾病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、乳糜泻、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
212.根据项211所述的方法，其中所述自身免疫疾病为多发性硬化症。
213.根据项192所述的方法，其中所述受试者为移植接受者。
214.根据项192所述的方法，其中所述受试者具有缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化或罹患心肌梗塞。
215.根据项192所述的方法，其中所述受试者具有牛皮癣或皮炎。
216.根据项192所述的方法，其中所述受试者罹患变应性紊乱。
217.根据项216所述的方法，其中所述变应性紊乱为湿疹、哮喘、变应性鼻炎或皮肤超敏反应。
218.根据项192所述的方法，其中所述受试者具有细菌或病毒感染。
219.根据项218所述的方法，其中所述病毒感染为疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染或副流感病毒感染。
220.根据项219所述的方法，其中所述病毒感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
221.根据项220所述的方法，其中所述病毒感染引起病毒性脑炎或病毒性脑膜炎。
222.根据项218所述的方法，其中所述细菌感染使所述受试者的中枢神经系统被感染。
223.根据项68所述的方法，其中所述细菌感染引起败血症细菌性脑炎或细菌性脑膜炎。
224.根据项192所述的方法，其中所述受试者已接受或将接受手术。
225.根据项224所述的方法，其中在手术之前将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
226.根据项224所述的方法，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
227.根据项224所述的方法，其中在手术之后将所述带负电的颗粒施用给所述受试者。
228.根据项192所述的方法，其中所述受试者经历了物理创伤或损伤。
229.根据项192所述的方法，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
230.一种用于诊断受试者中的炎性状态的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者中取出血液；
(b)分离所述血液以分离出血清和/或血浆；
(c)将所述血清和/或血浆与带负电的颗粒一起温育一段时间；
(d)分离或纯化结合于所述带负电的颗粒的蛋白；以及
(e)当从(d)中所述带负电的颗粒纯化的所述蛋白包括表6中所列的所述蛋白中的一种或多种时，确定受试者正处于炎性状态。
231.一种用于诊断受试者中的炎性状态的方法，所述方法包括：
(a)给所述受试者经静脉内施用包含带负电的颗粒的组合物，其中所述带负电的颗粒不含有附接的肽或抗原部分；
(b)将步骤(a)中施用的所述带负电的颗粒从所述受试者的所述血液取出；
(c)分离或纯化结合于所述带负电的颗粒的蛋白；以及
(d)当从(c)中所述带负电的颗粒纯化的所述蛋白包括表6中所列的所述蛋白中的一种或多种时，确定受试者正处于炎性状态。
232.根据项230或231所述的方法，其中从(c)中所述带负电的颗粒纯化的所述蛋白包括表6中所列的所述蛋白中的两种或更多种。
233.根据项230或231所述的方法，其中从(c)中所述带负电的颗粒纯化的所述蛋白包括表6中所列的所述蛋白中的三种或更多种。
234.根据项230或231所述的方法，其中从(c)中所述带负电的颗粒纯化的所述蛋白包括表6中所列的所述蛋白中的四种或更多种。
235.根据项230或231所述的方法，其中从(c)中所述带负电的颗粒纯化的所述蛋白包括表6中所列的所述蛋白中的五种或更多种。
236.根据项230或231所述的方法，其中从(c)中所述带负电的颗粒纯化的所述蛋白包括表6中所列的所述蛋白中的十种或更多种。
237.根据项230或231所述的方法，其中所述带负电的颗粒为聚苯乙烯颗粒、金刚石颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒、或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)颗粒。
238.根据项237所述的方法，其中所述颗粒为聚苯乙烯颗粒。
239.根据项237所述的方法，其中所述颗粒为金刚石颗粒。
240.根据项237所述的方法，其中所述颗粒为PLGA颗粒。
241.根据项230或231所述的方法，其中所述颗粒被羧化。
242.根据项241所述的方法，其中所述颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。
243.根据项242所述的方法，其中所述颗粒具有-75mV与0mV之间的ζ电势。
244.根据项243所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。
245.根据项244所述的方法，其中所述颗粒具有-50mV与-40mV之间的ζ电势。
246.根据项230或231所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.1μm至约10μm之间。
247.根据项246所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.3μm至约5μm之间。
248.根据项247所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约3μm之间。
249.根据项248所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm至约1μm之间。
250.根据项249所述的方法，其中所述带负电的颗粒的直径为约0.5μm。

Claims (64)

1.包含带负电的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚乳酸(PLA)、或聚(乙醇酸)(PGA)颗粒和载体的药物组合物在制备用于治疗癌症、脊髓损伤或脑损伤的组合物中的用途，所述颗粒具有-75mV至-30mV之间的ζ电势，其中所述带负电的颗粒不含有其它治疗剂。
2.权利要求1的用途，其中所述带负电的颗粒是PLGA颗粒。
3.权利要求1的用途，其中所述带负电的颗粒是PLA颗粒。
4.权利要求1的用途，其中所述带负电的颗粒是PGA颗粒。
5.权利要求1的用途，其中所述带负电的颗粒被羧化。
6.权利要求1的用途，其中所述带负电的颗粒具有-50mV和-30mV之间的ζ电位。
7.权利要求1的用途，其中所述药物组合物调节炎症免疫反应。
8.权利要求7的用途，其中所述药物组合物降低或抑制所述炎性免疫反应。
9.权利要求1或权利要求5的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.1μm至10μm之间。
10.权利要求9的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至5μm之间。
11.权利要求10的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至3μm之间。
12.权利要求11的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至1μm之间。
13.权利要求12的用途，其中所述带负电的颗粒的直径为0.5μm。
14.权利要求1的用途，其中所述癌症选自脑癌、黑素瘤、基底细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、中枢神经系统癌、肝癌、结肠癌或直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、膀胱癌、甲状腺癌、肾癌、睾丸癌、白血病和淋巴瘤。
15.权利要求14的用途，其中所述组合物改善所述癌症的一种或多种症状，任选地其中所述癌症的一种或多种症状选自肿瘤大小、肿瘤发展、抑制性中性粒细胞或单核细胞抑制细胞的水平和针对肿瘤的免疫反应的激活。
16.权利要求15的用途，其中所述组合物的用途减少所述肿瘤中的抑制性中性粒细胞或单核细胞衍生的抑制细胞。
17.权利要求1的用途，其中所述组合物诱导单核细胞和/或中性粒细胞凋亡。
18.权利要求14的用途，其中所述受试者患有白血病或淋巴瘤，并且其中所述受试者已经接受了骨髓移植。
19.权利要求18的用途，其中所述受试者由于移植而患有移植物抗宿主病(GvHD)。
20.权利要求19的用途，其中所述组合物减轻GvHD的一种或多种症状。
21.权利要求1的用途，其中所述受试者已经接受或将接受手术。
22.权利要求21的用途，其中在手术前将所述带负电的颗粒施用于所述受试者。
23.权利要求21的用途，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用于所述受试者。
24.权利要求21的用途，其中在手术后将所述带负电的颗粒施用于所述受试者。
25.权利要求1的用途，其中所述受试者已经经历了损伤。
26.权利要求25的用途，其中所述损伤是物理创伤。
27.权利要求1的用途，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
28.包含带负电的PLGA、PLA或PGA颗粒和载体的药物组合物在制备用于从受试者的炎性环境中移除促炎介质的组合物中的用途，所述颗粒具有-75mV至-30mV之间的ζ电势，其中所述组合物用于从受试者的炎性环境中移除促炎介质的方法，所述方法包括给所述受试者施用所述药物组合物，其中所述带负电的颗粒不含有其它治疗剂，并且其中所述受试者患有脊髓损伤或脑损伤。
29.权利要求28的用途，其中所述受试者中产生的促炎介质结合于所述带负电的颗粒。
30.权利要求29的用途，其中所述带负电的颗粒是PLGA颗粒。
31.权利要求30的用途，其中所述带负电的颗粒是PLA颗粒。
32.权利要求30的用途，其中所述带负电的颗粒是PGA颗粒。
33.权利要求28的用途，其中所述带负电的颗粒被羧化。
34.权利要求28的用途，其中所述带负电的颗粒具有-50mV和-30mV之间的ζ电位。
35.权利要求28的用途，其中所述药物组合物改善炎性免疫反应。
36.权利要求28的用途，其中所述药物组合物促进组织修复。
37.权利要求28或权利要求33的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.1μm至10μm之间。
38.权利要求37的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至5μm之间。
39.权利要求38的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至3μm之间。
40.权利要求39的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至1μm之间。
41.权利要求40的用途，其中所述带负电的颗粒的直径为0.5μm。
42.权利要求28的用途，其中所述受试者已经接受或将接受手术。
43.权利要求42的用途，其中在手术前将所述带负电的颗粒施用于所述受试者。
44.权利要求42的用途，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用于所述受试者。
45.权利要求28的用途，其中所述受试者已经经历了损伤。
46.权利要求28的用途，其中所述受试者已经经历了损伤。
47.权利要求28的用途，其中所述损伤是物理创伤。
48.权利要求28的用途，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
49.包含带负电荷的PLGA、PLA或PGA颗粒和载体的药物组合物在制备用于在有需要的受试者中增加受损组织再生的组合物中的用途，所述颗粒具有-75mV和-30mV之间的ζ电位，其中所述组合物用于增加受试者中受损组织再生的方法，其中所述方法包括施用所述药物组合物，其中所述带负电荷的颗粒不含其他治疗剂，并且其中所述受试者患有脊髓损伤或脑损伤。
50.权利要求49的用途，其中所述带负电的颗粒是PLGA颗粒。
51.权利要求50的用途，其中所述带负电的颗粒被羧化。
52.权利要求49的用途，其中所述带负电的颗粒具有-50mV和-30mV之间的ζ电位。
53.权利要求49的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.1μm至10μm之间。
54.权利要求53的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至5μm之间。
55.权利要求54的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至3μm之间。
56.权利要求55的用途，其中所述带负电的颗粒的直径在0.3μm至1μm之间。
57.权利要求56的用途，其中所述带负电的颗粒的直径为0.5μm。
58.权利要求49的用途，其中所述受试者已经接受或将接受手术。
59.权利要求58的用途，其中在手术前将所述带负电的颗粒施用于受试者。
60.权利要求59的用途，其中在手术期间将所述带负电的颗粒施用于所述受试者。
61.权利要求59的用途，其中在手术后将所述带负电的颗粒施用于受试者。
62.权利要求49的用途，其中所述受试者已经经历了损伤。
63.权利要求62的用途，其中所述损伤是物理创伤。
64.权利要求49的用途，其中经口、经鼻、经静脉内、经肌内、经眼部、经皮或皮下施用所述组合物。
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