JP4126252B2 - 免疫調節オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、およびこのオリゴヌクレオチドの被験体における免疫応答を刺激する能力に基づく治療的有用性に関する。本発明はまた、被験体における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドにより開始される免疫系の活性化に関連する疾病を処置するための治療法に関する。この治療法は、非メチル化ＣｐＧ配列（すなわち、メチル化ＣｐＧ配列またはＣｐＧ配列なし）を含まないオリゴヌクレオチドを被験体に投与し、非メチル化ＣｐＧ核酸を結合について競合して優る工程を包含する。さらに、本発明は、アンチセンス療法において使用するための、またはインビボでのハイブリダイゼーションプローブとして使用するためのメチル化ＣｐＧ含有ジヌクレオチド、ならびに抗ウィルス治療剤として使用するための免疫阻害オリゴヌクレオチドに関する。
（政府の援助）
本発明において得られる研究は、一部、米国衛生研究所認可番号 Ｒ２９−ＡＲ４２５５６−０１号により援助された。従って、本発明のある種の権利が米国政府に与えられ得る。
【０００２】
【従来の技術】
（ＤＮＡは細胞膜に結合しインターナライズされる）
１９７０年代には、幾人かの研究者が、高分子量ＤＮＡの細胞膜への結合を報告した（Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｗ．Ｍｅｉｎｋｅ，およびＤ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９７１，「二倍体ヒトリンパ球の細胞質における膜結合ＤＮＡ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６８：１２１２；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．Ｋ．，Ｒ．Ｗ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｐ．Ｋ．ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，およびＢ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９７５，「白金−ピリミジン錯体を用いて電子顕微鏡により視覚化された腫瘍発生細胞における細胞表面結合核酸」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２：９２８）。１９８５年には、Ｂｅｎｎｅｔｔらが、ＤＮＡのリンパ球への結合がリガンド−レセプター相互作用に類似することを初めて示した：すなわち、結合は飽和可能であり、競合的であり、そしてＤＮＡのエンドサイトーシスおよび分解を引き起こす（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｇ．Ｔ．Ｇａｂｏｒ，およびＭ．Ｍ．Ｍｅｒｒｉｔｔ．１９８５，「ＤＮＡのヒト白血球への結合。ＤＮＡのレセプター媒介結合、インターナリゼーションおよび分解の証拠」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１８２）。ＤＮＡと同様に、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）は、飽和可能であり、配列独立性であり、そして温度およびエネルギー依存性の様式で細胞に入り得る（Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｗ．，およびＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，１９９１，「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの細胞取り込み」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：２３５；Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．，Ｙ．Ｓｈｏｊｉ，およびＲ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，１９９２，「アンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的安定性および膜輸送特性の薬学的局面」；Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ： Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ，Ｒ．Ｐ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，およびＪ．Ｇ．Ｉｚａｎｔ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１３３；ならびに、Ｚｈａｏ，Ｑ．，Ｔ．Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｈｅｒｒｅｒａ，およびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，１９９４，「マウス骨髄Ｂ細胞前駆体における時期特異的オリゴヌクレオチド取り込み」，Ｂｌｏｏｄ ８４：３６６０）。ＤＮＡまたはＯＤＮ取り込みのレセプターはクローン化されておらず、そしてＯＤＮ結合および細胞取り込みが高分子量ＤＮＡと同一のメカニズムを介して起こるのか異なるメカニズムを介して起こるのかはいまだ明らかではない。
【０００３】
リンパ球のＯＤＮ取り込みは細胞の活性化により調節されることが示されている。Ｂ細胞マイトジェンＬＰＳにより刺激された脾臓細胞は、Ｂ細胞集団におけるＯＤＮ取り込みを飛躍的に増大させたが、一方、Ｔ細胞マイトジェンＣｏｎ Ａで処理された脾臓細胞は、Ｂ細胞ではなくＴ細胞によるＯＤＮ取り込みの増大を示した（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｆ．Ｇｍｅｌｉｇ−Ｍｅｙｌｉｎｇ，Ｍ．Ｆ．Ｇｏｕｒｌｅｙ，Ｗ．Ｊ．Ｋｉｓｃｈ，Ｌ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｅｙ，およびＡ．Ｄ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，１９９１，「リンパ様細胞によるオリゴデオキシヌクレオチドの取り込みは不均質かつ誘導性である」，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１６１）。
（核酸の免疫効果）
いくつかのポリヌクレオチドが、生体応答調節因子として広範に評価されている。その最良の例は、おそらくポリ（Ｉ，Ｃ）であろう。これは、ＩＦＮ産生の強力なインデューサーであり、そしてマクロファージのアクチベーターおよびＮＫ活性のインデューサーである（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｊ．Ａｄａｍｓ，Ｈ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｌｅｎｚ，Ｍ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅ．Ｓｃｈｌｉｃｋ，Ｒ．Ｒｕｆｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｈ．Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，およびＭ．Ａ．Ｃｈｉｒｉｇｏｓ，１９８５，「ポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースと複合体化されたポリイノシン−ポリシチジル酸のマウスにおける免疫調節効果」，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：１０５８；Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．，Ｒ．Ｒ．Ｓａｌｕｐ，Ｔ．Ａ．Ｔｗｉｌｌｅｙ，およびＪ．Ｅ．Ｔａｌｍａｄｇｅ，１９８５，「ポリリボヌクレオチドによるナチュラルキラー活性の免疫調節」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．４：５１２；Ｋｒｏｗｎ，Ｓ．Ｅ．１９８６，「ガン処置におけるインターフェロンおよびインターフェロンインデューサー」，Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．１３：２０７；ならびに、Ｅｗｅｌ，Ｃ．Ｈ．，Ｓ．Ｊ．Ｕｒｂａ，Ｗ．Ｃ．Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ ＩＩ，Ｒ．Ｇ．Ｓｔｅｉｓ，Ｊ．Ｌ．Ｒｏｓｓｉｏ，Ｄ．Ｌ．Ｌｏｎｇｏ，Ｍ．Ｊ．Ｊｏｎｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ａｌｖｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．Ｐｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ，Ｋ．Ｌ．ＭｃＮｉｔｔ，および Ｓ．Ｐ．Ｃｒｅｅｋｍｏｒｅ，１９９２，「ガン患者におけるポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースで複合体化されたポリイノシン−ポリシチジル酸とインターロイキン２の組み合わせ：臨床的および免疫学的効果」，Ｃａｎｓ．Ｒｅｓ．５２：３００５）。このマウスＮＫの活性化は、ＩＦＮ β分泌の誘導のみに起因し得るようである（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒ．，および Ｃ．Ａ．Ｂｉｒｏｎ，１９９３，「ＩＦＮ誘導およびそれに関連する脾臓白血球分布における変化」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３７１３）。デオキシリボースは有効ではなかったので、この活性化はリボース糖に特異的であった。インビトロにおけるその強力な抗腫瘍活性により、（ＲＮＡｓｅによる分解を減少させるために）ポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースで複合体化されたポリ（Ｉ，Ｃ）を用いるいくつかの臨床的試験がなされている（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．ら，１９８５，前述；Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．ら，１９８５，前述；Ｋｒｏｗｎ，Ｓ．Ｅ．ら，１９８６，前述；および、Ｅｗｅｌ，Ｃ．Ｈ．ら，１９９２，前述）。不運なことに、毒性の副作用により、ポリ（Ｉ，Ｃ）は有用な治療薬剤になるにはほど遠かった。
【０００４】
Ｃ８位が臭素またはチオール基で置換されたグアニンリボヌクレオチドはＢ細胞マイトジェンであり、「Ｂ細胞分化因子」を置換し得る（Ｆｅｌｄｂｕｓｈ，Ｔ．Ｌ．，およびＺ．Ｋ．Ｂａｌｌａｓ，１９８５，「８−メルカプトグアノシンのリンホカイン様活性：ＴおよびＢ細胞分化の誘導」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：３２０４；ならびに、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｇ．，１９８６，「体液性免疫におけるＴ細胞シグナルとＣ８置換グアニンヌクレオシドとの間の共働作用のメカニズム：Ｂリンパ球性（Ｂ ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）サイトカインは、８−メルカプトグアノシンに対する応答性を誘導する」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３３３５）。８−メルカプトグアノシンおよび８−ブロモグアノシンはまた、ＭＨＣ拘束性ＣＴＬの生成に必要とされるサイトカインの代替物となり得（Ｆｅｌｄｂｕｓｈ，Ｔ．Ｌ．，１９８５，前述）、マウスＮＫ活性を増大させ得（Ｋｏｏ，Ｇ．Ｃ．，Ｍ．Ｅ．Ｊｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ｌ．Ｍａｎｙａｋ，Ｎ．Ｈ．Ｓｉｇａｌ，およびＬ．Ｓ．Ｗｉｃｋｅｒ，１９８８，「８−ブロモグアノシンによるマウスナチュラルキラー細胞およびマクロファージの活性化」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３２４９）、そして、マウスＬＡＫ生成の誘導においてＩＬ−２と共働作用し得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，およびＺ．Ｋ．Ｂａｌｌａｓ，１９９０，リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞。Ｖ。ＬＡＫ生成におけるＩＬ−２節約剤としての８−メルカプトグアノシン」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３５２４）。これらのＣ８置換グアノシンのＮＫおよびＬＡＫ増大活性は、それらのＩＦＮの誘導に起因するようである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら，１９９０，前述）。最近、マイコバクテリウムにより産生された５’三リン酸化チミジンが、ヒトγδＴ細胞のサブセットに対してマイトジェン性であることが見いだされた（Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｐ．，Ｆ．Ｄａｖｏｄｅａｕ，Ｍ．−Ａ．Ｐｅｙｒａｔ，Ｙ．Ｐｏｑｕｅｔ，Ｇ．Ｐｕｚｏ，Ｍ．Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ，およびＪ．−Ｊ．Ｆｏｕｒｎｉｅ，１９９４，「非ペプチド性マイコバクテリウムリガンドによるヒトγδＴ細胞の刺激」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：２６７）。この報告は、免疫系が微生物の核酸に優先的に応答する経路を展開し得ることを示した。
【０００５】
いくつかの観察により、ある種のＤＮＡ構造もまたリンパ球を活性化する潜在性を有し得ることが示唆されている。例えば、Ｂｅｌｌらは、脾臓細胞上清中のヌクレオソームタンパク質−ＤＮＡ複合体（裸のＤＮＡではない）がＢ細胞増殖および免疫グロブリン分泌を引き起こしたことを報告した（Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，Ｂ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，およびＰ．ＶａｎｄｅｎＢｙｇａａｒｔ，１９９０，「免疫原性ＤＮＡ関連因子」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１４８７）。他の場合においては、裸のＤＮＡが免疫効果を有することが報告されている。例えば、最近、Ｍｅｓｓｉｎａらは、ポリ（ｄＧ）・（ｄＣ）およびポリ（ｄＧ・ｄＣ）の２６０〜８００ｂｐのフラグメントが、Ｂ細胞に対してマイトジェン性であることを報告した（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｇ．Ｓ．Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，およびＤ．Ｓ．Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，１９９３，「天然および合成ポリヌクレオチド抗原によるマウスリンパ球のインビトロでの刺激に対するＤＮＡ構造の影響」，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１４８）。Ｔｏｋｕｎａｇａらは、ｄＧ・ｄＣがγ−ＩＦＮおよびＮＫ活性を誘導することを報告した（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，およびＫ．Ｎａｍｂａ，１９８８，「合成一本鎖ＤＮＡ、ポリ（ｄＧ・ｄＣ）はインターフェロン−α／βおよび−γを誘導し、ナチュラルキラー活性を増大させ、そして腫瘍成長を抑制する」，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：６８２）。このような人工的なホモポリマー配列に加えて、Ｐｉｓｅｔｓｋｙらは、純粋な哺乳動物ＤＮＡは検出可能な免疫効果を有さないが、ある種の細菌由来のＤＮＡがＢ細胞活性化および免疫グロブリン分泌を誘導することを報告した（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｇ．Ｓ．Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，およびＤ．Ｓ．Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，１９９１，「細菌ＤＮＡによるマウスリンパ球のインビトロでの増殖の刺激」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９）。これらのデータがある種の通常でない混入物によるものでないとすれば、これらの研究は、細菌ＤＮＡの特定の構造または他の特性が、細菌ＤＮＡを、Ｂ細胞活性化をトリガーし得るようにしていることを示唆している。マイコバクテリウムＤＮＡ配列の研究により、ある種のパリンドローム配列を含むＯＤＮがＮＫ細胞を活性化し得ることが示された（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｅ．Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｏ．Ｙａｎｏ，およびＴ．Ｔｏｋｕｎａｇａ，１９９２，「合成オリゴヌクレオチドにおける独特のパリンドローム配列が、ＩＮＦを誘導するために、およびＩＮＦ媒介ナチュラルキラー活性を増大させるために必要とされる」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２；Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｅ．，Ｏ．Ｙａｎｏ，Ｙ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｂａｂａ，Ｔ．Ｍａｋｉｎｏ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋａｔａｏｋａ，およびＴ．Ｔｏｋｕｎａｇａ，１９９２，「ナチュラルキラー細胞の活性化に必要とされるオリゴヌクレオチド配列」，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８３：１１２８、および欧州特許出願、公開番号０ ４６８ ５２０号）。
【０００６】
いくつかのホスホロチオエート修飾ＯＤＮが、インビトロまたはインビボでのＢ細胞刺激を誘導することが報告されている（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｃ．Ｃ．Ｃｈｕ，およびＷ．Ｅ．Ｐａｕｌ，１９９２，「Ｉγ２ｂ中の配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、γ２ｂ生殖系列転写物を増加させ、Ｂ細胞ＤＮＡ合成を刺激し、そして免疫グロブリン分泌を阻害する」， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：５９７；Ｂｒａｎｄａ，Ｒ．Ｆ．，Ａ．Ｌ．Ｍｏｏｒｅ，Ｌ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｊ．ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，およびＧ．Ｚｏｎ，１９９３，「ＨＩＶ−１のｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴマーによる免疫刺激」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：２０３７；ＭｃＩｎｔｙｒｅ，Ｋ．Ｗ．，Ｋ．Ｌｏｍｂａｒｄ−Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｊ．Ｒ．Ｐｅｒｅｚ，Ｃ．Ｋｕｎｓｃｈ，Ｕ．Ｍ．Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｊ．Ｄ．Ｌａｒｉｇａｎ，Ｋ．Ｔ．Ｌａｎｄｒｅｔｈ，およびＲ．Ｎａｒａｙａｎａｎ，１９９３，「転写因子ＮＦ−κβＴ６５の開始コドンに対するセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、配列特異的な免疫刺激を引き起こす」，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：３０９；ならびに、Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，およびＣ．Ｆ．Ｒｅｉｃｈ，１９９３，「単純ヘルペスウィルスに対するアンチセンス活性を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスリンパ球増殖の刺激」，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５４：１０１）。これらの報告は、これらのＯＤＮの効果を説明し得るこれらのＯＤＮにおける共通の構造的モチーフも共通の配列エレメントも示唆しない。
（転写因子のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーおよび複製におけるそれらの役割）
ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）および活性化転写因子（ＡＴＦ）、すなわち転写因子のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーは、偏在して発現する転写因子のクラスであり、そのうちの１１のメンバーが今までのところクローン化されている（ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｒ．Ｐ．，およびＰ．Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，「遺伝子発現のホルモンによる制御：環状アデノシン３’，５’−モノホスフェート−応答性核レギュレーターの多様性および多変性」，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．７：１４５，１９９３；Ｌｅｅ．Ｋ．Ａ．Ｗ．，およびＮ．Ｍａｓｓｏｎ，「ＣＲＥＢおよびその関連物質による転写調節」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７４：２２１，１９９３）。これらはすべて、塩基性領域／ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）クラスのタンパク質に属する。すべての細胞は１つ以上のＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質を発現するようであるが、発現されるメンバーおよびｍＲＮＡスプライシングの調節は組織特異的であるようである。活性化ドメインのディファレンシャルなスプライシングが、特定のＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質が転写インヒビターであるかアクチベーターであるかを決定し得る。多くのＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質がウィルス性転写を活性化し得るが、活性ドメインを有さないいくつかのスプライシング変異体は阻害性である。ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を介してホモダイマーまたはヘテロダイマーとしてＤＮＡを結合し得る。ＣＲＥのコンセンサス形態は、非メチル化配列ＴＧＡＣＧＴＣである（ＣｐＧがメチル化されている場合には、結合がなくされる）（Ｉｇｕｃｈｉ−Ａｒｉｇａ，Ｓ．Ｍ．Ｍ．，およびＷ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，「ｃＡＭＰ応答性エンハンサー／プロモーター配列ＴＧＡＣＧＴＣＡのＣｐＧのメチル化が、特定の因子の結合および転写活性化をなくさせる」，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：６１２，１９８９）。
【０００７】
ＣＲＥの転写活性は、Ｂ細胞活性化の間に増加する（Ｘｉｅ，Ｈ．Ｔ．Ｃ．Ｃｈｉｌｅｓ，およびＴ．Ｌ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，「Ｂ細胞の表面Ｉｇレセプターを介したＣＲＥＢ活性の誘導」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：８８０，１９９３）。ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、ＣＲＥを介して複数の遺伝子（免疫学的に重要な遺伝子を含む）の発現を調節するようである。このような遺伝子としては、例えば、以下が挙げられる：ｆｏｓ、ｊｕｎ Ｂ、Ｒｂ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１（Ｔｓｕｋａｄａ，Ｊ．，Ｋ．Ｓａｉｔｏ，Ｗ．Ｒ．Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．Ｗｅｂｂ，およびＰ．Ｅ．Ａｕｒｏｎ，「転写因子ＮＦ−ＩＬ６およびＣＲＥＢは、ヒトプロインターロイキン１β遺伝子における共通の必須部位を認識する」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７２８５，１９９４；Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｄ．，Ｏ．Ｍ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｄ．Ｈｅｂｅｌ，Ｍ．Ｒｏｏｔ，Ｊ．Ｍ．Ｐｏｗ−Ｓａｎｇ，およびＥ．Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，「ヌードマウスにおいてｃ−Ｈａ−ｒａｓオンコジーンにより誘導される腫瘍成長のアンチセンスＤＮＡ阻害」，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：５７７，１９９３）、ＩＦＮ−β（Ｄｕ，Ｗ．，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ「ＡＴＦ／ＣＲＥＢ結合部位タンパク質が、ヒトインターフェロンＢ遺伝子のウィルス誘導に必要とされる」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２１５０，１９９２）、ＴＧＦ−β１（Ａｓｉｅｄｕ，Ｃ．Ｋ．，Ｌ．Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｋ．Ａｓｓｏｉａｎ，およびＭ．Ｅｈｒｌｉｃｈ，「ヒトＴＧＦ−Ｂ１遺伝子下流の連続性部位へのＡＰ−１／ＣＲＥＢタンパク質およびＭＤＢＰの結合」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２１９：５５，１９９４）、ＴＧＦ−β２、クラスＩＩ ＭＨＣ（Ｃｏｘ，Ｐ．Ｍ．，およびＣ．Ｒ．Ｇｏｄｉｎｇ，「ＡＴＦ／ＣＲＥＢ結合モチーフが、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲａプロモーターの異常構成性発現およびＳＶ−４０ Ｔ−抗原による活性化に必要とされる」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：４８８１，１９９２），Ｅ−セレクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ−８α、生殖系列Ｉｇα定常領域遺伝子、ＴＣＲ Ｖβ遺伝子、および増殖細胞核抗原（Ｈｕａｎｇ，Ｄ．，Ｐ．Ｍ．Ｓｈｉｐｍａｎ−Ａｐｐａｓａｍｙ，Ｄ．Ｊ．Ｏｒｔｅｎ，Ｓ．Ｈ．Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，およびＭ．Ｂ．Ｐｒｙｓｔｏｗｓｋｙ，「増殖細胞核抗原遺伝子のプロモーター活性は、インターロイキン２−刺激Ｔリンパ球の誘導性ＣＲＥ−結合タンパク質に関連する」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４２３３，１９９４）。ｃＡＭＰ経路を介した活性化に加えて、ＣＲＥＢはまた、細胞内Ｃａ＋＋濃度の変化に対する転写応答を媒介し得る（Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ，およびＭ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，「膜の非極性化およびカルシウムが転写因子ＣＲＥＢのリン酸化を介するｃ−ｆｏｓ転写を誘導する」，Ｎｅｕｒｏｎ ４：５７１，１９９０）。
【０００８】
ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質による転写活性化におけるタンパク質−タンパク質相互作用の役割は、きわめて重要なようである。サイクリックＡＭＰ経路を介したＣＲＥＢの活性化は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）（これは、ＣＲＥＢ３４１をｓｅｒ１３３でリン酸化し、これを最近クローン化されたタンパク質ＣＢＰに結合させる）を必要とする（Ｋｗｏｋ，Ｒ．Ｐ．Ｓ．，Ｊ．Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｊ．Ｃ．Ｃｈｒｉｖｉａ，Ｊ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｈ．Ｐ．Ｂａｃｈｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．Ｇ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，およびＲ．Ｈ．Ｇｏｏｄｍａｎ，「核タンパク質ＣＢＰは、転写因子ＣＲＥＢのコアクチベーターである」，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：２２３，１９９４；Ａｒｉａｓ，Ｊ．，Ａ．Ｓ．Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｐ．Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｆ．Ｘ．Ｃｌａｒｅｔ，Ｔ．Ｓｍｅａ，Ｍ．Ｋａｒｉｎ，Ｊ．Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ，およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，「ｃＡＭＰおよびマイトジェン応答性遺伝子の活性化は、共通の核因子に依存する」，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：２２６，１９９４）。ＣＢＰは、次いで、基礎的な転写因子であるＴＦＩＩＢと相互作用して転写を増大させる。ＣＲＥＢはまた、ｄＴＡＦＩＩ １１０、ＴＡＴＡ結合タンパク質会合因子（この結合が転写を調節し得る）と相互作用することが報告されている（Ｆｅｒｒｅｒｉ，Ｋ．，Ｇ．Ｇｉｌｌ，およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，「ｃＡＭＰ調節転写因子ＣＲＥＢは、ＴＦＩＩＤ複合体の要素と相互作用する」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２１０，１９９４）。これらの相互作用に加えて、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、他の複数の核因子と特異的に結合し得る（Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｗ．Ｌｕｓｔｂａｄｅｒ，およびＣ．−Ｙ．Ｃｈｅｎ，「タンパク質−タンパク質相互作用により、環状アデノシン３’，５’−モノホスフェート応答エレメント結合タンパク質および活性化転写因子−２と相互作用する複数の核因子の同定」，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５：２５６，１９９１）。しかし、これらの相互作用の大部分についての生物学的意義は知られていない。ＣＲＥＢは、通常、ホモダイマーまたはいくつかの他のタンパク質とのヘテロダイマーのいずれかとしてＤＮＡと結合すると考えられている。驚くべきことに、ＣＲＥＢモノマーは、構成的に転写を活性化する（Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｗ．，およびＫ．Ａ．Ｗ．Ｌｅｅ，「細胞性転写因子ＣＲＥＢのモノマー誘導体は、構成性アクチベーターとして機能する」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７２０４，１９９４）。
【０００９】
細胞性転写の調節における重要な役割のほかに、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質がいくつかの感染性ウィルスおよびレトロウィルス（これらはウィルス性複製にＣＲＥＢ／ＡＴＰタンパク質を必要とする）によりくつがえされることが最近示されている。例えば、サイトメガロウィルス即時プロモーター（哺乳動物の最も強力な既知のプロモーターの１つ）は、プロモーター機能に必須である１１コピーのＣＲＥを含む（Ｃｈａｎｇ，Ｙ．−Ｎ．，Ｓ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓｔａｌｌ，Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｋ．−Ｔ．Ｊｅａｎｇ，およびＧ．Ｓ．Ｈａｙｗａｒｄ，「シミアンサイトメガロウィルス主要即時プロモーターにおけるパリンドロームシリーズＩ反復は、強力な基礎的エンハンサーおよびサイクリックＡＭＰ応答エレメントの両方として機能する」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２６４，１９９０）。アデノウィルスＥ１Ａタンパク質（これは多くのプロモーターを誘導する）の転写活性化効果のうちの少なくともいくつかは、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質、ＡＴＦ−２（これは、Ｅ１Ａ誘導性転写活性化を媒介する）のＤＮＡ結合ドメインへの結合に起因する（Ｌｉｕ，Ｆ．，およびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，「異なる細胞性ＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を介したアデノウィルスＥ１ａによるプロモーター標的化」，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：５２０，１９９４）。Ｅ１ＡがＣＲＥＢ結合タンパク質ＣＢＰに結合することも示唆されている（Ａｒａｎｙ，Ｚ．，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，およびＲ．Ｅｃｋｎｅｒ，「Ｅ１Ａ会合ｐ３００およびＣＲＥＢ会合ＣＢＰは、コアクチベーターの保存ファミリーに属する」，Ｃｅｌｌ ７７：７９９，１９９４）。ヒトＴ細胞白血病および熱帯痙性麻痺を引き起こすレトロウィルスであるヒトＴリンパ球性ウィルス−Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）もまた、複製にＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質を必要とする。この場合には、レトロウィルスはタンパク質Ｔａｘを産生する。Ｔａｘは、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質に結合し、これらをその通常の細胞性結合部位からＨＴＬＶ転写エンハンサー内に存在する異なるＤＮＡ配列（Ｇ−およびＣ− リッチ配列に隣接する）へと再方向付けする（Ｐａｃａ−Ｕｃｃａｒａｌｅｒｔｋｕｎ，Ｓ．，Ｌ．−Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｎ．Ａｄｙａ，Ｊ．Ｖ．Ｃｒｏｓｓ，Ｂ．Ｒ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｂｏｒｏｓ，およびＣ．−Ｚ．Ｇｉａｍ，「ヒトＴ細胞リンパ球性ウィルスＩ型転写アクチベーターＴａｘに対して高度に応答性のＤＮＡエレメントのインビトロでの選択」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４５６，１９９４；Ａｄｙａ，Ｎ．，Ｌ．−Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｗ．Ｈｕａｎｇ，Ｉ．Ｂｏｒｏｓ，およびＣ．−Ｚ．Ｇｌａｍ，「ＴａｘによるＣＲＥＢのＤＮＡ認識特異性の拡大は、ＣＲＥＢの保存ＤＮＡ結合ドメイン近傍の２８２〜２８４位のＡｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇとの相互作用から生じる」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６４２，１９９４）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物、このオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性に基づく有用な方法、中性オリゴヌクレオチド、中性オリゴヌクレオチドを用いる有用な方法、および免疫阻害オリゴヌクレオチド、免疫阻害オリゴヌクレオチドの種々の使用を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式Ｉ：５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’に従う少なくとも１つの核酸配列を含む、免疫刺激オリゴヌクレオチドであり：
ここで、ＣＧは、オリゴヌクレオチドに免疫刺激能力を付与する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドであり；Ｘ１およびＸ２の少なくとも１つはプリンであり；そして、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つはピリミジンである。
【００１２】
好適な実施形態では、上記式Ｉがパリンドロームではない。
【００１３】
さらに好適な実施形態では、Ｘ１がプリンヌクレオチドである。
【００１４】
さらに好適な実施形態では、Ｘ４がピリミジンヌクレオチドである。
【００１５】
さらに好適な実施形態では、Ｘ１の５’側にさらにチミジンヌクレオチドを含む。
【００１６】
さらに好適な実施形態では、上記式Ｉのヌクレオチド配列が、５’ ＧＡＣＧＴＴ ３’、５’ ＡＧＣＧＴＴ ３’、５’ ＡＡＣＧＣＴ ３’、５’ ＣＴＣＧＡＣ ３’、５’ ＧＴＣＧＧＴ ３’、５’ ＧＡＣＧＴＴ ３’、５’ ＴＴＣＧＡＴ ３’、５’ ＡＡＣＧＡＴ ３’および５’ ＡＴＣＧＡＣ３’からなる群から選択される。
【００１７】
さらに好適な実施形態では、上記式Ｉの配列を含む上記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端のヌクレオチド配列がポリＧヌクレオチドである。
【００１８】
さらに好適な実施形態では、１つ以上のホスフェート骨格修飾を有する。
【００１９】
さらに好適な実施形態では、上記１つ以上のホスフェート骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である。
【００２０】
さらに好適な実施形態では、約６〜約１００のヌクレオチドを含む。
【００２１】
さらに好適な実施形態では、約６〜約４０のヌクレオチドを含む。
【００２２】
さらに好適な実施形態では、上記オリゴヌクレオチドと標的化手段とを有する。
【００２３】
さらに好適な実施形態では、上記標的化手段が、コレステロール、ビロソーム、リポソーム、脂質および標的細胞特異的結合因子からなる群から選択される。
【００２４】
本発明はまた、免疫系不全にかかっているかまたはかかりやすいヒトを含む動物の予防または処置のための薬品を製造するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２５】
好適な実施形態では、上記免疫系不全が、ウィルス、細菌、真菌または寄生体の感染によって引き起こされる。
【００２６】
本発明はまた、ガンにかかっているヒトを含む動物の処置のための薬品を製造するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２７】
本発明はまた、ワクチンに対する動物の免疫応答を増大させるためにワクチン投与前またはワクチン投与と同時にヒトを含む動物に投与するためのアジュバントを調製するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２８】
本発明はまた、免疫系の活性化に関連する疾病にかかりやすいヒトを含む動物の予防のための薬品を製造するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２９】
好適な実施形態では、上記免疫系の活性化に関連する疾病が、自己免疫疾患である。
【００３０】
さらに好適な実施形態では、上記免疫系の活性化が、細菌、真菌または寄生体の感染によって引き起こされる。
【００３１】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的処方物である。
【００３２】
好適な実施形態では、別の治療剤をさらに含む。
【００３３】
本発明はまた、少なくとも１つのメチル化ＣＧジヌクレオチドを含む免疫中性オリゴヌクレオチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的処方物である。
【００３４】
本発明はまた、ヒトを含む動物の免疫系の活性化に関連する疾病の予防または処置のための薬品を調製するための、上記免疫中性オリゴヌクレオチドの使用である。
【００３５】
好適な実施形態では、上記疾病が全身性紅斑性狼瘡である。
【００３６】
好適な実施形態では、上記疾病が敗血症である。
【００３７】
好適な実施形態では、上記メチル化ＣＧジヌクレオチドが、５−メチルシトシンである。
【００３８】
【発明の実施の形態】
本発明は、非メチル化シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドを含むある種のオリゴヌクレオチドがインビトロおよびインビボデータにより示されるようにリンパ球を活性化するという知見に基づいている。この知見に基づいて、本発明は、１つの局面においては、新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物を特徴とする。
【００３９】
好ましい実施態様においては、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、合成物であり、２〜１００塩基対のサイズであり、そして以下の式で表されるコンセンサスマイトジェン性ＣｐＧモチーフを含む：
５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’
ここで、ＣおよびＧは、非メチル化であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はヌクレオチドであり；そしてＧＣＧトリヌクレオチド配列は、５’および３’末端にもその近傍にも存在しない。
【００４０】
細胞への取り込みを促進するためには、ＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。安定化されたオリゴヌクレオチド（特に、ホスホチオエート安定化オリゴヌクレオチド）を用いて、長期の免疫刺激が得られ得る。Ｘ１Ｘ２がジヌクレオチドＧｐＡおよび／またはＸ３Ｘ４がジヌクレオチド（最も好ましくはＴｐＣまたはＴｐＴ）である場合に、免疫刺激活性の増大が確認された。コンセンサスモチーフＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４が５’末端でＴにより先行される場合に、免疫刺激活性のさらなる増大が確認される。
【００４１】
第２の局面においては、本発明は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性に基づく有用な方法を特徴とする。例えば、リンパ球が被験体から得られ得、そして適切なオリゴヌクレオチドとの接触に際してエクスビボで刺激され得るか；または、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが被験体に投与され得、被験体のリンパ球のインビボでの活性化を促進し得る。本明細書に記載の方法で（例えば、エクスビボまたはインビボのいずれかで）刺激された、活性化されたリンパ球は、被験体の免疫応答を増強し得る。従って、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、免疫系不全（例えば、被験体の腫瘍またはガン、あるいは、ウィルス、真菌、細菌または寄生体による感染症）を処置し、防止し、または改善するために使用され得る。さらに、免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、ワクチンアジュバントとしても投与され得、被験体のワクチンに対する応答を刺激し得る。さらに、免疫刺激細胞が白血病性細胞を細胞周期に入るように誘導する能力を有するので、慢性白血病細胞の感受性を増大させた後、通常の除去化学療法（ａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）を施すことにより白血病を処置するための有用性が示唆される。
【００４２】
第３の局面においては、本発明は、中性オリゴヌクレオチド（すなわち、非メチル化ＣｐＧを含まないか、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）を特徴とする。好ましい実施態様においては、中和オリゴヌクレオチドは免疫刺激配列に相補的であるが、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の代わりにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、従って、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとの結合を完成し得る。好ましい実施態様においては、メチル化は、シトシンの６員環を含む４つの炭素および２つの窒素のうちの１つ以上で起こり、あるいは、グアニンの９員二重環を含む５つの炭素および４つの窒素のうちの１つ以上で起こる。好ましいメチル化ＣｐＧは、５’−メチルシトシンである。
【００４３】
第４の局面においては、本発明は、中性オリゴヌクレオチドを用いる有用な方法を特徴とする。例えば、中性オリゴヌクレオチドのインビボでの投与が、被験体における非メチル化ＣｐＧ２量体の存在により引き起こされるかまたは悪化させる疾病（例えば、全身性紅斑性狼瘡、敗血症および自己免疫疾患）の処置に有用であると判明するはずである。さらに、メチル化ＣｐＧ含有アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブは、インビボでの被験体への投与時に免疫反応を開始させない。従って、これらは、対応する非メチル化オリゴヌクレオチドよりも安全である。
【００４４】
第５の局面においては、本発明は、免疫阻害オリゴヌクレオチド（これは、ウィルス性または細胞性転写因子の活性を妨害し得る）を特徴とする。好ましい実施態様においては、免疫阻害オリゴヌクレオチドは、２〜１００塩基対のサイズの間であり、そして以下の式で表されるコンセンサス免疫阻害ＣｐＧモチーフを含む：
５’ ＧＣＧＸｎＧＣＧ ３’
ここで、Ｘはヌクレオチドであり；ｎは０〜５０の範囲である。好ましい実施態様においては、Ｘはピリミジンである。
【００４５】
細胞への取り込みを促進するためには、免疫阻害オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。安定化されたオリゴヌクレオチド（特に、ホスホチオエート安定化オリゴヌクレオチド）を用いて、長期の生物学的効果が得られ得る。
【００４６】
第６かつ最後の局面においては、本発明は、免疫阻害オリゴヌクレオチドの種々の使用を特徴とする。免疫阻害オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的とされるウィルス性配列との間の相補性に起因するいかなるアンチセンス効果とも無関係に、抗ウィルス活性を有する。
【００４７】
本発明の他の利点および特徴は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより明らかになるであろう。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書において用いられるように、以下の用語および表現は下記の意味を有する：
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、複数のヌクレオチド（すなわち、ホスフェート基および置換可能な有機塩基（置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））あるいは置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである）に結合した糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書において用いられるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）およびオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の両方を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオシド（すなわち、ホスフェートを含まないオリゴヌクレオチド）および任意の他の有機塩基含有ポリマーを包含する。オリゴヌクレオチドは、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得られ得るが、好ましくは合成である（例えば、オリゴヌクレオチド合成により産生される）。
【００４８】
「安定化されたオリゴヌクレオチド」は、インビボでの分解（例えば、エクソまたはエンドヌクレアーゼによる分解）に比較的耐性であるオリゴヌクレオチドを意味する。本発明の好ましい安定化されたオリゴヌクレオチドは、修飾ホスフェート骨格を有する。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾ホスフェート骨格（すなわち、ホスフェート酸素の少なくとも１つがイオウで置換された構造）を有する。他の安定化されたオリゴヌクレオチドは、非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキル−およびアリール−ホスホネート（荷電ホスホネート酸素が、アルキルまたはアリール基で置換される）、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分がアルキル化される））を包含する。いずれか一方または両方の末端にジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴヌクレオチドもまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている。
【００４９】
「免疫刺激オリゴヌクレオチド」、「免疫刺激ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」または「ＣｐＧ ＯＤＮ」は、シトシン、グアニンジヌクレオチド配列を含み、そして脊椎動物リンパ球を刺激する（例えば、マイトジェン効果を有する）オリゴヌクレオチドを意味する。好ましい免疫刺激オリゴヌクレオチドは、２〜１００塩基対のサイズであり、そして以下の式で表されるコンセンサスマイトジェン性ＣｐＧモチーフを含む：
５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’
ここで、ＣおよびＧは、非メチル化であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はヌクレオチドであり；そしてＧＣＧトリヌクレオチド配列は、５’および３’末端にもその近傍にも存在しない。
好ましくは免疫刺激オリゴヌクレオチドは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。さらに、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、好ましくは安定化されたオリゴヌクレオチドであり、特に好ましくはホスホロチオエートで安定化されたオリゴヌクレオチドである。好ましい１つの実施態様においては、Ｘ１Ｘ２はジヌクレオチドＧｐＡである。好ましい別の実施態様においては、Ｘ３Ｘ４は、好ましくはジヌクレオチドＴｐＣまたはＴｐＴである。特に好ましい実施態様においては、コンセンサスモチーフＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４は５’末端においてＴにより先行される。特に好ましいコンセンサス配列は、ＴＧＡＣＧＴＴまたはＴＧＡＣＧＴＣである。
【００５０】
「中性オリゴヌクレオチド」は、非メチル化ＣｐＧを含まないオリゴヌクレオチド、またはメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。好ましい実施態様においては、中和オリゴヌクレオチドは免疫刺激配列に相補的であるが、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の代わりにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、従って、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとの結合を完成し得る。好ましい実施態様においては、メチル化は、シトシンの６員環を含む４つの炭素および２つの窒素のうちの１つ以上で起こり、あるいは、グアニンの９員二重環を含む５つの炭素および４つの窒素のうちの１つ以上で起こる。好ましいメチル化ＣｐＧは、５’−メチルシトシンである。
【００５１】
「免疫阻害オリゴヌクレオチド」または「免疫阻害ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」は、ウィルス性または細胞性転写因子の活性を妨害し得るオリゴヌクレオチドである（明細書１０頁（英文明細書８頁）の発明の要旨に支持されている）。好ましい免疫阻害オリゴヌクレオチドは、２〜１００塩基対のサイズの間であり、そして以下の式で表され得る：
５’ ＧＣＧＸｎＧＣＧ ３’
ここで、Ｘはヌクレオチドであり；ｎは０〜５０の範囲である。好ましい実施態様においては、Ｘはピリミジンである。
【００５２】
細胞への取り込みを促進するためには、免疫阻害オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。安定化されたオリゴヌクレオチド（特に、ホスホロチオエート安定化オリゴヌクレオチド）を用いて、長期の免疫刺激が得られ得る。
【００５３】
「パリンドローム配列」は、逆方向反復（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’のような配列、ここでＡおよびＡ’は、通常のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成し得る塩基である）を意味する。インビボにおいては、このような配列は、二本鎖構造を形成し得る。
【００５４】
「オリゴヌクレオチド送達複合体」は、標的手段に結合した（例えば、標的手段にイオン的にまたは共有結合的に結合した；あるいは標的手段内にカプセル化された）オリゴヌクレオチドを意味する。標的手段は、例えば、標的細胞（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面との高親和性結合を生じる、および／または標的細胞による細胞性取り込みを増加させる分子である。オリゴヌクレオチド送達複合体の例としては、以下のものに結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる：ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、標的細胞特異性レセプターにより認識されるリガンド）。好ましい複合体は、標的細胞によるインターナリゼーション前の有意な非結合を防止するようにインビボで十分に安定でなければならない。しかし、複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的形態で放出されるよう、適切な条件下では細胞内で開裂可能でなければならない。
【００５５】
「免疫系不全」は、被験体の免疫系が通常の能力で機能しない疾病または障害を意味する。あるいは、被験体の免疫応答を増強し、例えば、被験体における腫瘍またはガン（例えば、脳、肺（例えば、小細胞および非小細胞）、卵巣、乳房、前立腺、結腸の腫瘍、ならびに他のガン腫および肉腫）、あるいは、ウィルス（例えば、ＨＩＶ、ヘルペス）、真菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）、細菌または寄生体（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）による感染症を取り除くことが有用である疾病または障害を意味する。
【００５６】
「免疫系の活性化に関連する疾病」は、被験体の免疫系の活性化により引き起こされるかまたは悪化される疾病または症状を意味する。例としては、全身性紅斑性狼瘡、敗血症および自己免疫疾患（例えば、リューマチ性関節炎、多発性硬化症）が挙げられる。
【００５７】
「被験体」は、ヒトまたは脊椎動物（イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラット、マウスなどを包含する）を意味する。
（ある種の非メチル化ＣｐＧ含有オリゴは、インビトロおよびインビボで示されるようにＢ細胞刺激活性を有する）
後述の実施例１および２に記載のプロトコールを用いて内在性レトロウィルス配列に特異的な２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのリンパ球刺激効果を調べると、驚くべきことに、２４の「コントロール」（「アンチセンス」ＯＤＮのパネルについての種々のスクランブル、センスおよびミスマッチコントロールを含む）のうちの２つもまたＢ細胞活性化およびＩｇＭ分泌を媒介するが、他の「コントロール」は効果を有さないことが見いだされた。
【００５８】
２つの観察から、この「コントロール」ＯＤＮによるＢ細胞の活性化は、アンチセンス効果を有し得ないことが示唆された：（１）ＧｅｎＢａｎｋにリストされる脊椎動物ＤＮＡ配列で比較すると、非刺激ＯＤＮで見られるものより大きな相同性を示さなかったこと、および、（２）２つのコントロールは、１０μｇの脾臓ポリＡ＋ＲＮＡを用いるノーザンブロットへのハイブリダイゼーションを示さなかったこと。異なる合成機によるこれらのＯＤＮの再合成またはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーによる十分な精製により、同一の刺激が得られた。このことは不純物の可能性を排除した。同様の刺激が、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＢ細胞を用いて得られた。このことはリポ多糖（ＬＰＳ）による汚染が原因となり得る可能性を排除した。
【００５９】
２つの「コントロール」ＯＤＮが２つの「アンチセンス」ＯＤＮと同様のＢ細胞活性化を引き起こしたという事実は、他のすべての非刺激コントロールＯＤＮには存在しない配列モチーフを含むある種の非アンチセンスメカニズムによってこれら４つのＯＤＮのすべてがＢ細胞を刺激するという可能性を提起した。これらの配列を比較すると、４つの刺激ＯＤＮはすべて、非刺激コントロールとは配列の異なるＯＤＮジヌクレオチドを含んでいた。
【００６０】
刺激ＯＤＮに存在するＣｐＧ要素が観察された刺激の原因となるかどうかを調べるために、５〜４２塩基の長さの範囲の３００を超えるＯＤＮ（これらは、種々の配列のメチル化、非メチル化、または非ＣｐＧジヌクレオチドを含む）を合成した。２つのもとの「コントロール」（ＯＤＮ１および２）および「アンチセンス」として独自に合成した２つ（ＯＤＮ ３Ｄおよび３Ｍ；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２４４８（１９８９））を含むこれらのＯＤＮを、脾臓細胞に対するインビトロでの効果を調べた（表１に代表的な配列を列挙する）。ＣｐＧジヌクレオチドを含むいくつかのＯＤＮが、Ｂ細胞活性化およびＩｇＭ分泌を誘導した；代表的には、刺激の程度は、ＣｐＧジヌクレオチドをより多く添加することにより増大し得た（表１；ＯＤＮ２を２ａに、または３Ｄを３Ｄａおよび３Ｄｂに比較のこと）。刺激は、アンチセンスメカニズムによるものでも不純物によるものでもないようである。ＯＤＮは、γδまたはその他のＴ細胞集団について検出可能な活性化を引き起こさなかった。
【００６１】
ＣｐＧジヌクレオチドが変異された場合（表１；ＯＤＮ１を１ａに；３Ｄを３Ｄｃに；３Ｍを３Ｍａに；および４を４ａに比較のこと）、または、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが５−メチルシトシンで置換された場合（表１；ＯＤＮ １ｂ、２ｂ、２ｃ、３Ｄｄ、および３Ｍｂ）には、マイトジェン性ＯＤＮ配列は一様に非刺激性となった。これに対して、他のシトシンがメチル化された場合には、ＯＤＮ活性は減少しなかった（ＯＤＮ １ｃ、２ｄ、３Ｄｅ、および３Ｍｃ）。これらのデータにより、ＣｐＧモチーフが、 Ｂ細胞を活性化する、ＯＤＮに存在する必須エレメントであることが確認された。
【００６２】
これらの研究において、ＣｐＧジヌクレオチドに隣接する塩基が、ＯＤＮに誘導されるＢ細胞活性化を決定する際に重要な役割を果たすことが明らかになった。最適刺激モチーフは、２つの５’プリン（好ましくは、ＧｐＡジヌクレオチド）および２つの３’ピリミジン（好ましくは、ＴｐＴまたはＴｐＣジヌクレオチド）に隣接するＣｐＧからなると決定された。この理想により近いＣｐＧモチーフをもたらすＯＤＮの変異により、刺激が改善された（例えば、ＯＤＮ ２を２ｅに；３Ｍを３Ｍｄに比較のこと）が、このモチーフを妨げる変異により刺激が減少した（例えば、ＯＤＮ ３Ｄを３Ｄｆに；４を４ｂ、４ｃおよび４ｄに比較のこと）。一方、ＣｐＧモチーフ外の変異によっては、刺激は減少しなかった（例えば、ＯＤＮ １を１ｄに；３Ｄを３Ｄｇに；３Ｍを３Ｍｅに比較のこと）。
【００６３】
試験されたもののうち、８塩基よりも短いＯＤＮは非刺激性であった（例えば、ＯＤＮ ４ｅ）。試験された４８の８塩基ＯＤＮのうち、同定された最も刺激性の配列はＴＣＡＡＣＧＴＴ（ＯＤＮ ４）であった。この配列は、自己相補性の「パリンドローム」ＡＡＣＧＴＴを含む。このモチーフをさらに最適化すると、（特に、末端のヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾により、ＯＤＮがヌクレアーゼ耐性とされる場合には、）両端部にＧを含むＯＤＮが増大した刺激を示すことが見いだされた。最初の２つおよび最後の５つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されているＯＤＮ １５８５（５’ ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＧ ３’（配列番号：１））は、両端の１０のＧが１０のＡで置換されていること以外はＯＤＮ １５８５と同じ配列を有するＯＤＮ １６３８により誘導されたマウス脾臓細胞増殖における平均３．２倍の増加に比較して、マウス脾臓細胞増殖における平均２５．４倍の増加を引き起こした。Ｇリッチ末端の効果はシスである；ポリＧ末端を有するがＣｐＧモチーフを有さないＯＤＮを１６３８と共に添加しても、増殖の増加は得られなかった。
【００６４】
最適モチーフに近似する場合には（例えば、ＯＤＮ ４ｂ、４ｃ）、５’末端にＴｐＣジヌクレオチドを有する６塩基のパリンドロームを含む他の８量体ＯＤＮもまた活性であった。５’末端の他のジヌクレオチドは、刺激を減少させた（例えば、ＯＤＮ ４ｆ；１６の可能なジヌクレオチドすべてについて試験した）。３’ジヌクレオチドの存在は、５’ジヌクレオチドの欠乏を補填するには不十分であった（例えば、ＯＤＮ ４ｇ）。パリンドロームの破壊により８量体ＯＤＮにおける刺激が取り除かれた（例えば、ＯＤＮ ４ｈ）が、より長いＯＤＮにはパリンドロームは必要とされなかった。
【００６５】
【表１】
＊刺激指数は、少なくとも３つの異なる実験から得られた平均および標準偏差であり、そしてＯＤＮを加えずに培養されたウェルと比較される。ＮＤは、試験せずを意味する。ＣｐＧジヌクレオチドは下線で示される。点は同一であることを示し；ダッシュは欠失を示す。Ｚは、５−メチルシトシンを示す。
【００６６】
マウス脾臓細胞を用いて白血球活性化の反応速度を調べた。ＯＤＮ添加と同時に細胞をパルスし、４時間後に細胞を集めると、３Ｈウリジン取り込みはすでに２倍に増加していた。刺激は１２〜４８時間後にピークとなり、その後減少した。２４時間後には、インタクトなＯＤＮは検出されず、おそらくこのことはその後の刺激の低下の原因となっている。（マイトジェン性以下の投与量での）抗ＩｇＭの存在下または非存在下で精製Ｂ細胞をＣｐＧ ＯＤＮとともに培養した場合に、２つのマイトジェンの組み合わせにより４８時間後には増殖が約１０倍と顕著に増加することが見いだされた。刺激の程度は濃度依存性であり、両方について最適条件の下では一致してＬＰＳの刺激の程度を上回っていた。ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドの約２００倍強力であった。
【００６７】
細胞周期分析を用いて、ＣｐＧ−ＯＤＮにより活性化されたＢ細胞の割合を決定した。ＣｐＧ−ＯＤＮは、９５％を超えるＢ細胞の細胞周期進行を誘導した（表２）。フローサイトメトリーによりＣＤ２３−（周辺領域）およびＣＤ２３＋（小胞）下位集団にソートされた脾臓Ｂリンパ球は、ＯＤＮ誘導刺激に対して同等に応答性であった。なぜならこれらは共に休止状態であり、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配での分画により単離されたＢ細胞の活性化集団であったからである。これらの研究により、ＣｐＧ−ＯＤＮが本質的にすべてのＢ細胞を細胞周期に入るようにすることが示された。
【００６８】
【表２】
実施例１に記載のように、ヒト細胞に対するＣｐＧ ＯＤＮのマイトジェン性効果を、２人の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）について調べた。ＣｐＧジヌクレオチド配列を含まないコントロールＯＤＮは、ヒト細胞の基礎増殖に対して４４２ｃｐｍおよび８７４ｃｐｍと効果を示さなかった（増殖は３Ｈチミジン取り込みにより測定した）。しかし、ホスホロチオエート修飾ＣｐＧ ＯＤＮ ３Ｍｄ（配列番号２５）は、わずか１μＭの濃度で、２人の患者においてそれぞれ７２１０および８６７９５ｃｐｍと増殖の増加を誘導した。これらの細胞は凍結されていたので、これらは、インビボの新鮮な細胞よりもオリゴに対して応答性が低かったかもしれない。さらに、ＣＬＬ患者由来の細胞は代表的には非増殖性であり、このことが従来の化学療法が有効でない原因である。
【００６９】
ある種のＢ細胞株（例えば、ＷＥＨＩ−２３１）が誘導され、抗ＩｇＭによるそれらの抗原レセプターの架橋に応答して増殖阻止および／またはアポトーシスを受ける（Ｊａｋｗａｙ，Ｊ．Ｐ．ら、「抗免疫グロブリン、リポ多糖および他の細菌性産物によるＢリンパ腫細胞株ＷＥＨＩ−２３１の増殖の調節」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２２２５（１９８６）；Ｔｓｕｂａｔａ，Ｔ．，Ｊ．Ｗｕ，およびＴ．Ｈｏｎｊｏ，「抗原レセプター架橋により誘導されたＢ細胞アポトーシスが、ＣＤ４０を介したＴ細胞シグナルによりブロックされる」，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：６４５（１９９３））。ＷＥＨＩ−２３１細胞は、ある種の刺激（例えば、ＬＰＳ）により、およびＣＤ４０リガンドにより、この増殖阻止からレスキューされる。ＣｐＧモチーフ含有ＯＤＮはまた、抗ＩｇＭ誘導増殖阻止からＷＥＨＩ−２３１を保護しすることが見いだされた。このことは、この効果にはアクセサリー細胞集団は必要とされないことを示している。
【００７０】
非メチル化ＣｐＧ ＯＤＮの免疫効果をより十分に理解するために、インビトロおよびインビボでのサイトカインおよびプロスタグランジンのレベルを調べた。ＬＰＳとは異なり、ＣｐＧ ＯＤＮは、精製マクロファージにプロスタグランジンＰＧＥ２の産生を誘導しないことが見いだされた。実際、マクロファージにおいてもＴ細胞においても、ＣｐＧ ＯＤＮの明らかな直接的効果は認められなかった。インビボまたは全脾臓細胞において、以下のインターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４またはＩＬ−１０）の有意な増加は、最初の６時間以内には認められなかった。しかし、ＩＬ−６のレベルは、ＣｐＧ ＯＤＮを注射したマウスの血清において、２時間以内に顕著に増加した。脾臓細胞によるＩＬ−１２およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の発現の増大もまた、最初の２時間以内に認められた。
【００７１】
ＣｐＧ ＯＤＮがインビボでの免疫刺激を引き起こし得るかどうかを決定するために、ＰＢＳまたはホスホロチオエートＣｐＧまたは非ＣｐＧ ＯＤＮを、３３ｍｇ／ｋｇ（約５００μｇ／マウス）の用量でＤＢＡ／２マウスに１回腹腔内注射した。マウスにおける薬物動態学的研究により、この用量でのホスホロチオエートが２４時間より長期間にわたり脾臓組織において約１０μｇ／ｇのレベル（本明細書に記載のインビトロでの研究から決定される有効濃度範囲内）を与えることが示される（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７５９５）。３色フローサイトメトリーを用いてＢ細胞表面活性化マーカーＬｙ−６Ａ／Ｅ、Ｂｌａ−１およびクラスＩＩＭＨＣの発現について、ならびに３Ｈチミジンを用いてそれらの自然増殖について、ＯＤＮ注射の２４時間後にマウス由来の脾臓細胞を調べた。３種の活性化マーカーすべての発現が、ＣｐＧ ＯＤＮ注射マウス由来のＢ細胞において有意に増加したが、ＰＢＳまたは非ＣｐＧ ＯＤＮ注射マウス由来のＢ細胞においては増加しなかった。刺激性ＯＤＮを注射したマウス由来の脾臓細胞は、ＰＢＳまたは非ＣｐＧ ＯＤＮ注射マウスと比較して、自然３Ｈチミジン取り込みが２〜６倍増加した。４日後、インビボでのＣｐＧ ＯＤＮ注射マウスの血清ＩｇＭレベルは、コントロールと比較して約３倍増加した。これらの薬剤がＴ細胞を活性化する能力がないことと一致して、ＩＬ−２ＲまたはＣＤ−４４のＴ細胞発現における変化は最小限であった。
【００７２】
血清におけるホスホジエステルＯＤＮの分解は、３’−エクソヌクレアーゼにより優先的に媒介される。一方、細胞内ＯＤＮ分解はより複雑であり、５’および３’エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。５’および３’末端で変化する数のホスホロチオエート修飾結合を有する３Ｄ配列を有するＯＤＮパネルを用いて、２つの５’修飾結合および５つの３’修飾結合がこのＣｐＧ ＯＤＮによる最適刺激を提供するために必要であることが実験的に決定された。（非メチル化ＣｐＧ含有オリゴはＮＫ細胞刺激活性を有する）
実施例４でさらに詳細に記載するように、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＢ細胞に加えてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を刺激するかどうかを決定するために実験を行った。表３に示すように、ＣｐＧ ＯＤＮ １および３Ｄｄと共に培養された脾臓細胞においてＮＫ活性の顕著な誘導が観察された。これに対して、非ＣｐＧコントロールＯＤＮで処理されたエフェクターにおいては、誘導はほとんど存在しなかった。
【００７３】
【表３】
（メチル化ＣｐＧ含有オリゴの中和活性）
ＯＤＮ（ＣｐＧモチーフまたは他の部分でのシトシンが５−メチルシトシンで置換されたもの）のＢ細胞マイトジェン性を、実施例１に記載のようにして調べた。上記表１に示すように、メチル化ＣｐＧを含むＯＤＮは、非マイトジェン性であった（表１；ＯＤＮ １ｃ、２ｆ、３Ｄｅ、および３Ｍｃ）。しかし、ＣｐＧジヌクレオチド以外のシトシンのメチル化では、刺激特性は維持された（表１；ＯＤＮ １ｄ、２ｄ、３Ｄｆ、および３Ｍｄ）。
（両末端およびその近傍にＧＣＧトリヌクレオチド配列を含むオリゴの免疫阻害活性）
いくつかの場合においては、上記の刺激モチーフ内部ではないＣｐＧジヌクレオチドを含むＯＤＮは、他のマイトジェン性ＣｐＧ ＯＤＮの刺激効果をブロックすることが見いだされた。具体的には、ＣｐＧ ＯＤＮの５’および／または３’末端およびその近傍にＧＣＧからなる非定型のＣｐＧモチーフを加えることにより、他のＣｐＧモチーフによる増殖の刺激が実際に阻害された。ＧＣＧモチーフにおけるシトシンのメチル化または置換は、この効果を逆転する。好ましいＣｐＧモチーフに見られるよりもずっと低いが、ＯＤＮ中のＧＣＧモチーフはそれ自体が低いマイトジェン性効果を有する。
（免疫刺激、中和および免疫阻害オリゴヌクレオチドの作用の提唱されるメカニズム）
その表面Ｉｇレセプターを介してＢ細胞をトリガーする抗原とは異なり、ＣｐＧ−ＯＤＮは、検出可能なＣａ２＋流出、タンパク質チロシンリン酸化における変化またはＩＰ ３生成のいずれも誘導しなかった。ＣｐＧモチーフ存在下または非存在下でのＦＩＴＣ−結合ＯＤＮを用いるフローサイトメトリーを、Ｚｈａｏ，Ｑら（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：５３−６６（１９９３））に記載のようにして行った。これにより、等価な膜結合、細胞取り込み、流出および細胞内局在化が示された。このことは、ＣｐＧ ＯＤＮに対して特異的な細胞膜タンパク質は存在しないかもしれないことを示唆している。細胞膜を介して作用するよりもむしろ、これらのデータは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが活性のために細胞取り込みを必要とすることを示唆している：固体Ｔｅｆｌｏｎ支持体に共有結合したＯＤＮは非刺激性であり、アビジンビーズまたはアビジンコートされたペトリ皿上に固定化されたビオチン化ＯＤＮも同様であった。ＦＩＴＣまたはビオチンのいずれかと結合されたＣｐＧ ＯＤＮは、完全なマイトジェン性特性を維持し、このことは立体障害を有さないことを示した。
【００７４】
最適なＣｐＧモチーフ（ＴＧＡＣＧＴＴ／Ｃ）は、ＣＲＥ（サイクリックＡＭＰ応答エレメント）と同一である。ＣｐＧ ＯＤＮのマイトジェン性効果と同様に、中央のＣｐＧがメチル化された場合には、ＣＲＥＢのＣＲＥへの結合はなくされる。電気泳動移動度シフトアッセイを用いて、ＣｐＧ ＯＤＮ（１本鎖）がＢ細胞ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質のそれらの通常の結合部位（２本鎖ＣＲＥ）への結合と競合し得るかどうかを決定した。競合アッセイにより、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ＯＤＮはＣＲＥＢのその結合部位への結合と競合し得るが、ＣｐＧモチーフを含まないＯＤＮは競合し得ないことが示された。これらのデータは、ＣｐＧ ＯＤＮがある種の様式で１つ以上のＢ細胞ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質と相互作用することによりそれらのマイトジェン性効果を発揮するという結論を支持する。逆に、ＯＤＮの３’および／または５’端部近傍のＧＣＧ配列または他の非定型ＣｐＧモチーフの存在により、活性化を引き起こさず、阻止さえし得る様式でＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質と相互作用するようである。
刺激ＣｐＧモチーフは、微生物ゲノムＤＮＡに共通であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはきわめてまれである。さらに、細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン（Ｉｇ）産生を誘導することが報告されているが、哺乳動物ＤＮＡは誘導しない（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９（１９９１））。さらに実施例３に記載の実験（この実験で、ＣｐＧメチラーゼを用いる細菌ＤＮＡのメチル化により、マイトジェン性がなくされることが見いだされた）により、ＣｐＧの状態の違いが細菌ＤＮＡによるＢ細胞刺激の原因であることが示された。このデータは以下の結論を支持する：細菌ＤＮＡ内に存在する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが、細菌ＤＮＡの刺激効果の原因となる。
目的論的には、ＣｐＧモチーフによる白血球活性化によって免疫防御メカニズムが代表され、これにより、宿主ＤＮＡと細菌ＤＮＡとが区別され得るようである。宿主ＤＮＡは、そのＣｐＧ抑制およびメチル化に起因してリンパ球活性化をほとんど誘導しないか全く誘導しない。細菌ＤＮＡは、感染組織において選択的なリンパ球活性化を引き起こす。ＣｐＧ経路は抗原レセプターを介するＢ細胞活性化と共働するので、細菌抗原に特異的な抗原レセプターを有するＢ細胞は、細胞膜Ｉｇを介する１つの活性化シグナルと細菌ＤＮＡからの第２のシグナルとを受信し、従って、優先的に活性化される傾向を有する。Ｂ細胞活性化におけるこの経路と他の経路との相互関係が、ポリクローナル抗原を用いて抗原特異性応答を誘導する生理学的メカニズムを提供する。
（免疫刺激オリゴの作製方法）
本発明において使用するために、オリゴヌクレオチドが、当該分野で周知の多くの方法のうちの任意の方法を用いて新たに合成され得る。例えば、β−シアノエチルホスホルアミダイト法（Ｓ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら，（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら，（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７；Ｇａｒｅｇｇら，（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８；Ｇａｆｆｎｅｙら，（１９８８）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２）。これらの化学反応は、種々の市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機により行われ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、公知の技術（例えば、制限酵素、エクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用する技術）を用いて、既存の核酸配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から調製され得る。
【００７５】
インビボでの使用のためには、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる）分解に対して比較的耐性である。オリゴヌクレオチドの安定化は、ホスフェート骨格での修飾により達成され得る。好ましい安定化されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾骨格を有する。ホスホロチオエートＯＤＮの薬物動態学は、それらが齧歯動物において４８時間の全身半減期を有することを示し、そしてそれらがインビボでの適用に有用であり得ることを示唆する（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７５９５）。ホスホロチオエートは、ホスホルアミデートまたはＨ ホスホネート化学のいずれかを使用する自動化技術を用いて合成され得る。アリールおよびアルキルホスホネートが（例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載のようにして）作製され得る；そして、アルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載のようにしてアルキル化される）が、市販の試薬を用いる自動化固相合成により調製され得る。他のＤＮＡ骨格修飾および置換の作製方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５）。
【００７６】
インビボで投与するために、オリゴヌクレオチドは、標的細胞（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面への高親和性結合が得られる分子、および／または標的細胞による細胞の取り込みを増大させる分子に結合されて、「オリゴヌクレオチド送達複合体」を形成し得る。オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の技術を用いて適切な分子にイオン的にまたは共有結合的に結合し得る。種々のカップリング剤または架橋剤（例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））が使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、周知技術を用いてリポソームまたはビロソーム中にカプセル化され得る。
【００７７】
本発明は、以下の実施例（これはさらなる限定として解釈されるべきではない）によりさらに説明される。本出願全体に引用されるすべての参考文献（学術文献、発行された特許、刊行された特許出願および同時係属特許出願を含む）の全体の内容は、本明細書に参考として援用される。
（免疫刺激オリゴの治療的使用）
その免疫刺激特性に基づいて、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、インビボで被験体に投与され、「免疫系不全」を処置し得る。あるいは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、免疫系不全を有する被験体から得られるリンパ球（例えば、Ｂ細胞またはＮＫ細胞）とエクスビボで接触され得、次いで、活性化リンパ球が被験体に再度移植され得る。
【００７８】
免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、アジュバントとしてワクチンと共に被験体に投与され得、被験体の免疫系を増強して、ワクチンからより優れた応答をもたらし得る。好ましくは、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、ワクチン投与の少し前またはワクチン投与と同時に投与される。
【００７９】
免疫刺激オリゴヌクレオチドを用いる先行する化学療法は、引き続く化学療法に対する悪性腫瘍細胞の応答性を増加させるに有用であることが判明するはずである。ＣｐＧ ＯＤＮはまた、ヒトおよびマウス細胞の両方においてナチュラルキラー細胞活性を増加させた。ＮＫ活性の誘導は、ガンの免疫療法において同様に有益であり得る。
（中性オリゴヌクレオチドの治療的使用）
特定の標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドが合成され得、そしてインビボで非検体に投与され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的なｍＲＮＡにハイブリダイズし、これにより特異的な標的遺伝子の発現を防止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列特異的な効果により、それらはタンパク質機能の研究に有用な調査手段となった。全身アンチセンス療法の第Ｉ／ＩＩ相のヒトへの試験が、急性骨髄性白血病およびＨＩＶについて現在行われている。
【００８０】
さらに、オリゴヌクレオチドプローブ（すなわち、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチド）が被験体に投与され得、結合標識の検出に基づいて相補的配列の存在を検出し得る。オリゴヌクレオチドプローブのインビボでの投与および検出は、特定のＤＮＡ配列により引き起こされるかまたは悪化される特定の疾病（例えば、全身性紅斑性狼瘡、敗血症および自己免疫疾患）の診断に有用であり得る。
【００８１】
任意のまたはすべてのＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブは、被験体へのインビボでの投与時に免疫反応を生じさせず、従って、対応する非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドよりも安全である。
【００８２】
治療における使用のために、有効量の適切なオリゴヌクレオチドが、単独で、またはオリゴヌクレオチド送達複合体として処方されて、オリゴヌクレオチドが適切な標的細胞（例えば、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）に取り込まれることを可能にする任意の方法で被験体に投与され得る。好ましい投与経路は、経口および経皮（例えば、パッチによる）を包含する。他の投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、腸管外、腹腔内、包膜内など）が挙げられる。注射は、ボーラスでの注射または連続的な注入であり得る。
【００８３】
オリゴヌクレオチドは、単独で、またはオリゴヌクレオチド送達複合体として、薬学的に受容可能なキャリアと共に投与され得る。本明細書において使用されるように、「薬学的に受容可能なキャリア」という表現は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体と同時投与され得、かつ、オリゴヌクレオチドがその意図された機能を実施することを可能にする物質を包含することが意図される。このようなキャリアの例としては、溶液、溶媒、分散媒体、遅延剤、エマルジョンなどが挙げられる。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体の使用は、当該分野で周知である。オリゴヌクレオチドとの使用に適切なあらゆる他の従来のキャリアは、本発明の範囲内にある。
【００８４】
用語「有効量の」オリゴヌクレオチドとは、所望の生物学的効果を実現するに必要または十分な量を意味する。例えば、免疫系不全を処置するための少なくとも１つのメチル化ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドの有効量は、腫瘍、ガン、あるいは細菌性、ウィルス性または真菌性感染症を除去するに必要な量であり得る。ワクチンアジュバントとしての使用のための有効量は、ワクチンに対する被験体の免疫応答を増強するに有用な量であり得る。免疫系活性化に関連する疾病の処置に使用するための非メチル化ＣｐＧを含まないオリゴヌクレオチドの「有効量」は、非メチル化ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列に競合して優るに必要な量であり得る。任意の特定用途についての有効量は、処置されるべき疾病または症状、投与される特定のオリゴヌクレオチド、被験体の大きさ、あるいは疾病または症状の重さなどの要因に応じて変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定のオリゴヌクレオチドの有効量を経験的に決定し得る。
上記で報告された研究によれば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）について直接的にマイトジェン性であることが示される。細菌ＤＮＡにおけるこれらの配列の存在とあわせて、これらの結果は、動物ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドが脱表現されないこと（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）、および、このようなジヌクレオチド中に存在するシトシンの広範囲のメチル化が、宿主ＤＮＡと細菌ＤＮＡとを区別し得る免疫防御メカニズムの存在により説明され得ることを示唆する。宿主ＤＮＡは、通常、多くの解剖学的領域およびアポトーシス（細胞死）による炎症領域に存在するが、一般に、リンパ球活性化をほとんど誘導しないか全く誘導しない。しかし、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡの存在は、それが有益である感染した解剖学的領域において、正確にリンパ球活性化を引き起こし得る。この新規な活性化経路は、Ｔ細胞依存抗原特異的Ｂ細胞活性化の迅速な代替物を提供する。しかし、Ｂ細胞活性化は、全体的には非特異的ではないようである。細菌産物に特異的な抗原レセプターを有するＢ細胞は、細胞膜Ｉｇを介する１つの活性化シグナルおよび細菌ＤＮＡからの第２のシグナルとを受信し得、これにより、抗原特異的免疫応答をさらに激しくトリガーし得る。
【００８５】
他の免疫防御メカニズムについては、細菌ＤＮＡに対する応答は、ある種の場合においては望ましくない結果を有し得る。例えば、自己抗原に対する自己免疫応答もまた、細菌感染により優先的にトリガーされる傾向にある。なぜなら自己抗原が、細菌ＤＮＡによりトリガーされる自己反応性Ｂ細胞に第２の活性化シグナルを提供し得るからである。実際、細菌感染による自己免疫の誘導は、一般的な臨床的観察である。例えば、自己免疫疾患である全身性紅斑性狼瘡は、（ｉ）抗ＤＮＡ抗体の産生により特徴づけられ；（ｉｉ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを阻害する薬物により誘導され（Ｃｏｒｎａｃｃｈｉａ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８（１９９３））；そして、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の減少をともなう（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ ３５：６４７（１９９２））。この疾病は、少なくとも部分的には、ＣｐＧモチーフにより提供される刺激シグナルによるＤＮＡ特異的Ｂ細胞の活性化によって、ならびに抗原レセプターの細菌ＤＮＡの結合によってトリガーされるようである。
【００８６】
さらに、敗血症（免疫系の多量でかつ非特異的な活性化に起因する高い罹患率および死亡率により特徴づけられる）は、多くのリンパ球を直接活性化するに十分な濃度に到達する死滅細菌から放出される細菌ＤＮＡおよび他の産物により発症され得る。
【００８７】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、またはＣｐＧモチーフがメチル化されているオリゴヌクレオチド）を被験体に投与し、非メチル化ＣｐＧ含有核酸配列の結合をブロックすることにより、狼瘡、敗血症および他の「免疫系活性化に関連する疾病」が処置され得、防止され得または改善され得る。非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチドは、単独で、または他のマイトジェン性細菌産物（例えば、ＬＰＳ）に対する免疫細胞応答をブロックする組成物と共に投与され得る。
【００８８】
以下、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドがどのようにして疾病狼瘡を処置し、防止しまたは改善し得るかについて、機構的に説明する。狼瘡は、一般に、細菌性またはウィルス性感染によりトリガーされると考えられている。このような感染は、１本鎖ＤＮＡに対する非病原性抗体の産生を刺激すると報告されている。これらの抗体は、主に非メチル化ＣｐＧを含む細菌配列を認識するようである。狼瘡において疾病が発達するにつれて、抗ＤＮＡ抗体は、２本鎖ＤＮＡに特異的な病原性抗体にシフトする。これらの抗体はメチル化ＣｐＧ配列への結合を増大させ、そしてこれらの産生は狼瘡における寛容の衰弱（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）から生じる。あるいは、患者のＤＮＡが過少メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）し、従って、非メチル化ＣｐＧに特異的な抗ＤＮＡ抗体が自己ＤＮＡに結合させ、そして、「エピトープスプレッディング（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）」と称されるプロセスを介してより広範な自己免疫をトリガーさせた場合に、狼瘡が生じ得る。
【００８９】
いずれの場合にも、抗原性オリゴヌクレオチドをタンパク質キャリア（例えば、γ−グロブリン（ＩｇＧ））にカップリングさせることにより、狼瘡患者の寛容を回復させることが可能であり得る。γ−グロブリンと複合体化した仔ウシ胸腺ＤＮＡは、抗ＤＮＡ抗体形成を減少させることが報告されている。
（両端またはその近傍にＧＣＧトリヌクレオチド配列を含むオリゴの治療的使用）
オリゴヌクレオチドと標的化されるウィルス配列との間の相補性に起因する任意のアンチセンス効果に関係なく、ＣＲＥＢ／ＡＴＦとのその相互作用に基づいて、両端またはその近傍にＧＣＧトリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドは、抗ウィルス活性を有する。この活性に基づいて、阻害オリゴヌクレオチドの有効量が、被験体に投与されてウィルス感染を処置または防止し得る。
【００９０】
【実施例】
（実施例１：Ｂ細胞全ＲＮＡ合成および細胞周期に対するＯＤＮの効果）
抗−Ｔｈｙ−１．２および補体を用いてＴ細胞を放血し、ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）で遠心分離した、６〜１２週齢で特定の病原体を有さないＤＢＡ／２またはＢＸＳＢマウス（アイオワ大学動物管理施設で飼育された；実質的な系統の違いは示されなかった）から得られた脾臓からＢ細胞を精製した（「Ｂ細胞」）。Ｂ細胞は、１％未満のＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を含んでいた。１０％ＦＢＳ（６５℃で３０分間熱失活させた）、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタメートを含む１００μｌ ＲＰＭＩ中の８×１０４のＢ細胞を、９６ウェルのマイクロタイタープレートに３連で分配した。２０μＭのＯＤＮを、３７℃で２０時間の培養開始時に加え、１μＣｉの３Ｈウリジンで細胞をパルスし、そして４時間後に細胞を回収し、そしてカウントした。２０μＭのＯＤＮとともに脾臓細胞全体を４８時間培養した後、ＥＬＩＳＡスポットアッセイを用いてＩｇ分泌Ｂ細胞を数えた。データ（表１に報告する）は、ＯＤＮなしで培養した細胞と比較した刺激指数を表す。本実験においては、ＯＤＮなしで培養した細胞は６８７ｃｐｍを与えたが、一方、２０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（最適濃度であることを滴定により決定した）と共に培養した細胞は９９，６９９ｃｐｍを与えた。３Ｈチミジン取り込みアッセイは、同様の結果を示したが、分解したＯＤＮから放出されたチミジンによる非特異的阻害をいくらか示した（Ｍａｔｓｏｎ，ＳおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ（１９９２），「コントロールオリゴヌクレオチドによる３Ｈ−チミジン取り込みの非特異的抑制」，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２：３２５）。
【００９１】
細胞周期分析のために、２×１０６のＢ細胞を、２ｍｌの組織培養培地単独で、または３０μｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、または１μＭの示されたホスホロチオエート修飾ＯＤＮと共に、４８時間培養した。Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２８８１（１９８１）に記載のようにして、細胞周期分析を行った。
【００９２】
ヒト細胞に対するＣｐＧ ＯＤＮのマイトジェン性効果を調べるために、２人の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（循環細胞が悪性腫瘍Ｂ細胞である疾病）患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。上記のようにして、細胞を４８時間培養し、トリチウム化チミジンで４時間パルスした。
（実施例２：Ｂ細胞由来のＩｇＭ産生に対するＯＤＮの効果）
新たに殺したマウスの脾臓由来の単一細胞懸濁液を、Ｌｅｉｂｓｏｎらの方法（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１６８１（１９８１））により抗−Ｔｈｙｌ、抗−ＣＤ４、および抗−ＣＤ８ならびに補体で処理した。休止Ｂ細胞（＜，０２％のＴ細胞混入）を、ＤｅＦｒａｎｃｏらの手順（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５：１５２３（１９８２））により非連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配の６３〜７０％バンドから単離した。上記のようにして、これらを３０μＭ ＯＤＮまたは２０μｇ／ｍｌ ＬＰＳ中で４８時間培養した。ＥＬＩスポットアッセイ（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：５０６（１９９０））により決定したところ、活発にＩｇＭを分泌するＢ細胞の数はこの時点で最大であった。このアッセイにおいては、Ｂ細胞を抗Ｉｇでコートされたマイクロタイタープレート上で６時間インキュベートした。それらが産生したＩｇ（＞９９％ ＩｇＭ）を、ホスファターゼ標識抗Ｉｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を用いて検出した。個々のＢ細胞により産生された抗体を、ホスファターゼの存在下で不溶性青色沈殿を形成するＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えることにより視覚化した。２０〜４０のスポット／ウェルを生じる細胞の希釈を用いて、抗体分泌Ｂ細胞／試料の総数を決定した。すべてのアッセイを３連で行った。いくつかの実験において、培地の上清をＥＬＩＳＡによりＩｇＭについてアッセイしたところ、ＣｐＧ−ＯＤＮに対する応答の同様な増加を示した。
（実施例３：細菌ＤＮＡによるＢ細胞刺激）
ＤＢＡ／２ Ｂ細胞を、ＤＮＡなしで、あるいは、５０μｇ／ｍｌの（ａ）Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ；（ｂ）ＮＺＢ／Ｎマウス脾臓；およびＮＦＳ／Ｎマウス脾臓ゲノムＤＮＡと共に４８時間培養し、次いで、３Ｈチミジンで４時間パルスし、そして、その後細胞を回収した。２連のＤＮＡ試料を、３７℃で３０分間ＤＮＡｓｅＩで消化し、次いで、細胞培養物に加えた。ＥＬＩＳＡスポットアッセイを用いると、Ｅ ｃｏｌｉ ＤＮＡもまた、４８時間までＩｇＭ分泌Ｂ細胞の数の８．８倍の増加を誘導した。
【００９３】
ＤＢＡ／２ Ｂ細胞を、添加物なしに、あるいは、５０μｇ／ｍｌのＬＰＳまたは２０μＭのＯＤＮ １；１ａ；４；または４ａとともに培養した。細胞を培養し、そして４、８、２４および４８時間後に回収した。実施例１と同様にして、ＢＸＳＢ細胞を、５、１０、２０、４０または８０μＭのＯＤＮ １；１ａ；４；または４ａあるいはＬＰＳと共に培養した。この実験において、ＯＤＮを含まないウェルは３８３３ｃｐｍを有していた。各実験を少なくとも３回行い、同様の結果を得た。３連のウェルの標準偏差は＜５％であった。
（実施例４：ナチュラルキラー（ＮＫ）活性に対するＯＤＮの効果）
１０×１０６のＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を、２ｍｌのＲＰＭＩ（実施例１に記載のように補充した）中で、４０μＭのＣｐＧまたは非ＣｐＧ ＯＤＮの存在下または非存在下で４８時間培養した。細胞を洗浄し、次いで、２つのＮＫ感受性標的細胞株（ＹＡＣ−１および２Ｃ１１）を用いる短期５１Ｃｒ放出アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた（Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１７）。０．２ｍｌ中Ｖ底マイクロタイタープレート中の１０４の５１Ｃｒ標識標的細胞に、種々の濃度でエフェクター細胞を加え、そして５％ＣＯ２中、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離し、上清のアリコートを放射能についてカウントした。エフェクター細胞の存在下で放出された５１Ｃｒから標的細胞単独で培養された場合に放出された５１Ｃｒ放出を引いた値の、２％酢酸中での細胞溶解後に放出された総カウントから細胞単独で培養された場合に放出された５１Ｃｒ ｃｐｍを引いた値に対する比率を計算することにより、特異的溶解パーセントを決定した。
（実施例５：ＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮについてのインビボでの研究）
マウスを計量し、０．２５ｍｌの滅菌ＰＢＳまたはＰＢＳに溶解した示されたホスホロチオエートＯＤＮをＩＰで注射した。２４時間後、脾臓細胞を回収し、洗浄し、そして、Ｂ細胞のゲートのためのファイコエリトリン結合６Ｂ２を、ビオチン結合抗Ｌｙ−６Ａ／Ｅまたは抗Ｉａｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または抗Ｂｌａ−１（Ｈａｒｄｙ，Ｒ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１１６９（１９８４））と組み合わせて用いて、フローサイトメトリーのために染色した。それぞれの条件について２匹のマウスを調べ、個々に分析した。
（実施例６：Ｂ細胞刺激についてのホスホロチオエートＯＤＮの滴定）
コントロールＯＤＮ １ａ、またはＣｐＧ ＯＤＮ １ｄおよび３Ｄｄの配列を有するホスホロチオエートＯＤＮと共にＢ細胞を培養し、次いで、２０時間後に３Ｈウリジン、または４４時間後に３Ｈチミジンのいずれかでパルスし、次いで、細胞を回収し、そしてｃｐｍを決定した。
（実施例７：アポトーシスからのＢ細胞のレスキュー）
ＷＥＨＩ−２３１細胞（５×１０４／ウェル）を、ＬＰＳあるいはコントロールＯＤＮ １ａまたはＣｐＧ ＯＤＮ １ｄおよび３Ｄｄの存在下または非存在下、３７℃で１時間培養し、次いで、抗ＩｇＭ（１μ／ｍｌ）を加えた。細胞をさらに２０時間培養し、次いで２μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンで４時間パルスした。この実験において、ＯＤＮも抗ＩｇＭも加えない細胞は、抗ＩｇＭの添加により９０．４×１０３を与えた。表１に示すホスホジエステルＯＤＮは、ＯＤＮ分解に起因する非特異的抑制をいくらか示すものの、同様の保護を与えた。各実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
（実施例８： ＩＬ−６のインビボでの誘導）
ＤＢＡ／２雌性マウス（２ヶ月齢）に、５００μｇのＣｐＧまたはコントロールホスホロチオエートＯＤＮをＩＰで注射した。注射後、種々の時点で、マウスを採血した。２匹のマウスを各時点について調べた。ＩＬ−６をＥｌｉｓａにより測定し、そしてＩＬ−６濃度を組換えＩＬ−６を用いて得られる標準曲線と比較することにより計算した。アッセイの感度は、１０ｐｇ／ｍｌであった。レベルは８時間後に検出不能であった。
（実施例９：Ｂ細胞ＣＲＥＢ／ＡＴＦの放射性標識２本鎖ＣＲＥプローブ（ＣＲＥＢ）への結合）
ＣＲＥプローブ（遊離プローブは、像の底部から離れている）を用いるＥＭＳＡにより分析すると、ＣＨ１２．ＬＸ Ｂ細胞由来の全細胞抽出物は、２つの遅延バンドを示した。ＣＲＥへのＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質の結合は、示された量のコールドＣＲＥおよび１本鎖ＣｐＧ ＯＤＮにより競合されたが、非ＣｐＧ
ＯＤＮによっては競合されなかった。
（等価物）
当業者は、日常的な実験程度を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様の多くの等価物を認識し、または確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【００９４】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、およびこのオリゴヌクレオチドの被験体における免疫応答を刺激する能力に基づく治療的有用性が開示される。また、被験体における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドにより開始される免疫系の活性化に関連する疾病を処置するための治療法が開示される。この治療法は、非メチル化ＣｐＧ配列（すなわち、メチル化ＣｐＧ配列またはＣｐＧ配列なし）を含まないオリゴヌクレオチドを被験体に投与し、非メチル化ＣｐＧ核酸を結合について競合して優る工程を包含する。さらに、アンチセンス療法において使用するための、またはインビボでのハイブリダイゼーションプローブとして使用するためのメチル化ＣｐＧ含有ジヌクレオチド、ならびに抗ウィルス治療剤として使用するための免疫阻害オリゴヌクレオチドが開示される。
【００９５】
【発明の効果】
本発明によって、新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物、このオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性に基づく有用な方法、中性オリゴヌクレオチド、中性オリゴヌクレオチドを用いる有用な方法、および免疫阻害オリゴヌクレオチド、免疫阻害オリゴヌクレオチドの種々の使用が提供される。
【００９６】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、およびこのオリゴヌクレオチドの被験体における免疫応答を刺激する能力に基づく治療的有用性に関する。本発明はまた、被験体における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドにより開始される免疫系の活性化に関連する疾病を処置するための治療法に関する。この治療法は、非メチル化ＣｐＧ配列（すなわち、メチル化ＣｐＧ配列またはＣｐＧ配列なし）を含まないオリゴヌクレオチドを被験体に投与し、非メチル化ＣｐＧ核酸を結合について競合して優る工程を包含する。さらに、本発明は、アンチセンス療法において使用するための、またはインビボでのハイブリダイゼーションプローブとして使用するためのメチル化ＣｐＧ含有ジヌクレオチド、ならびに抗ウィルス治療剤として使用するための免疫阻害オリゴヌクレオチドに関する。
（政府の援助）
本発明において得られる研究は、一部、米国衛生研究所認可番号 Ｒ２９−ＡＲ４２５５６−０１号により援助された。従って、本発明のある種の権利が米国政府に与えられ得る。
【０００２】
【従来の技術】
（ＤＮＡは細胞膜に結合しインターナライズされる）
１９７０年代には、幾人かの研究者が、高分子量ＤＮＡの細胞膜への結合を報告した（Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｗ．Ｍｅｉｎｋｅ，およびＤ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９７１，「二倍体ヒトリンパ球の細胞質における膜結合ＤＮＡ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６８：１２１２；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．Ｋ．，Ｒ．Ｗ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｐ．Ｋ．ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，およびＢ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９７５，「白金−ピリミジン錯体を用いて電子顕微鏡により視覚化された腫瘍発生細胞における細胞表面結合核酸」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２：９２８）。１９８５年には、Ｂｅｎｎｅｔｔらが、ＤＮＡのリンパ球への結合がリガンド−レセプター相互作用に類似することを初めて示した：すなわち、結合は飽和可能であり、競合的であり、そしてＤＮＡのエンドサイトーシスおよび分解を引き起こす（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｇ．Ｔ．Ｇａｂｏｒ，およびＭ．Ｍ．Ｍｅｒｒｉｔｔ．１９８５，「ＤＮＡのヒト白血球への結合。ＤＮＡのレセプター媒介結合、インターナリゼーションおよび分解の証拠」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１８２）。ＤＮＡと同様に、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）は、飽和可能であり、配列独立性であり、そして温度およびエネルギー依存性の様式で細胞に入り得る（Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｗ．，およびＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，１９９１，「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの細胞取り込み」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：２３５；Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．，Ｙ．Ｓｈｏｊｉ，およびＲ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，１９９２，「アンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的安定性および膜輸送特性の薬学的局面」；Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ： Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ，Ｒ．Ｐ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，およびＪ．Ｇ．Ｉｚａｎｔ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１３３；ならびに、Ｚｈａｏ，Ｑ．，Ｔ．Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｈｅｒｒｅｒａ，およびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，１９９４，「マウス骨髄Ｂ細胞前駆体における時期特異的オリゴヌクレオチド取り込み」，Ｂｌｏｏｄ ８４：３６６０）。ＤＮＡまたはＯＤＮ取り込みのレセプターはクローン化されておらず、そしてＯＤＮ結合および細胞取り込みが高分子量ＤＮＡと同一のメカニズムを介して起こるのか異なるメカニズムを介して起こるのかはいまだ明らかではない。
【０００３】
リンパ球のＯＤＮ取り込みは細胞の活性化により調節されることが示されている。Ｂ細胞マイトジェンＬＰＳにより刺激された脾臓細胞は、Ｂ細胞集団におけるＯＤＮ取り込みを飛躍的に増大させたが、一方、Ｔ細胞マイトジェンＣｏｎ Ａで処理された脾臓細胞は、Ｂ細胞ではなくＴ細胞によるＯＤＮ取り込みの増大を示した（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｆ．Ｇｍｅｌｉｇ−Ｍｅｙｌｉｎｇ，Ｍ．Ｆ．Ｇｏｕｒｌｅｙ，Ｗ．Ｊ．Ｋｉｓｃｈ，Ｌ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｅｙ，およびＡ．Ｄ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，１９９１，「リンパ様細胞によるオリゴデオキシヌクレオチドの取り込みは不均質かつ誘導性である」，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１６１）。
（核酸の免疫効果）
いくつかのポリヌクレオチドが、生体応答調節因子として広範に評価されている。その最良の例は、おそらくポリ（Ｉ，Ｃ）であろう。これは、ＩＦＮ産生の強力なインデューサーであり、そしてマクロファージのアクチベーターおよびＮＫ活性のインデューサーである（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｊ．Ａｄａｍｓ，Ｈ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｌｅｎｚ，Ｍ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅ．Ｓｃｈｌｉｃｋ，Ｒ．Ｒｕｆｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｈ．Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，およびＭ．Ａ．Ｃｈｉｒｉｇｏｓ，１９８５，「ポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースと複合体化されたポリイノシン−ポリシチジル酸のマウスにおける免疫調節効果」，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：１０５８；Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．，Ｒ．Ｒ．Ｓａｌｕｐ，Ｔ．Ａ．Ｔｗｉｌｌｅｙ，およびＪ．Ｅ．Ｔａｌｍａｄｇｅ，１９８５，「ポリリボヌクレオチドによるナチュラルキラー活性の免疫調節」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．４：５１２；Ｋｒｏｗｎ，Ｓ．Ｅ．１９８６，「ガン処置におけるインターフェロンおよびインターフェロンインデューサー」，Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．１３：２０７；ならびに、Ｅｗｅｌ，Ｃ．Ｈ．，Ｓ．Ｊ．Ｕｒｂａ，Ｗ．Ｃ．Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ ＩＩ，Ｒ．Ｇ．Ｓｔｅｉｓ，Ｊ．Ｌ．Ｒｏｓｓｉｏ，Ｄ．Ｌ．Ｌｏｎｇｏ，Ｍ．Ｊ．Ｊｏｎｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ａｌｖｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．Ｐｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ，Ｋ．Ｌ．ＭｃＮｉｔｔ，および Ｓ．Ｐ．Ｃｒｅｅｋｍｏｒｅ，１９９２，「ガン患者におけるポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースで複合体化されたポリイノシン−ポリシチジル酸とインターロイキン２の組み合わせ：臨床的および免疫学的効果」，Ｃａｎｓ．Ｒｅｓ．５２：３００５）。このマウスＮＫの活性化は、ＩＦＮ β分泌の誘導のみに起因し得るようである（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒ．，および Ｃ．Ａ．Ｂｉｒｏｎ，１９９３，「ＩＦＮ誘導およびそれに関連する脾臓白血球分布における変化」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３７１３）。デオキシリボースは有効ではなかったので、この活性化はリボース糖に特異的であった。インビトロにおけるその強力な抗腫瘍活性により、（ＲＮＡｓｅによる分解を減少させるために）ポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースで複合体化されたポリ（Ｉ，Ｃ）を用いるいくつかの臨床的試験がなされている（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．ら，１９８５，前述；Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．ら，１９８５，前述；Ｋｒｏｗｎ，Ｓ．Ｅ．ら，１９８６，前述；および、Ｅｗｅｌ，Ｃ．Ｈ．ら，１９９２，前述）。不運なことに、毒性の副作用により、ポリ（Ｉ，Ｃ）は有用な治療薬剤になるにはほど遠かった。
【０００４】
Ｃ８位が臭素またはチオール基で置換されたグアニンリボヌクレオチドはＢ細胞マイトジェンであり、「Ｂ細胞分化因子」を置換し得る（Ｆｅｌｄｂｕｓｈ，Ｔ．Ｌ．，およびＺ．Ｋ．Ｂａｌｌａｓ，１９８５，「８−メルカプトグアノシンのリンホカイン様活性：ＴおよびＢ細胞分化の誘導」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：３２０４；ならびに、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｇ．，１９８６，「体液性免疫におけるＴ細胞シグナルとＣ８置換グアニンヌクレオシドとの間の共働作用のメカニズム：Ｂリンパ球性（Ｂ ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）サイトカインは、８−メルカプトグアノシンに対する応答性を誘導する」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３３３５）。８−メルカプトグアノシンおよび８−ブロモグアノシンはまた、ＭＨＣ拘束性ＣＴＬの生成に必要とされるサイトカインの代替物となり得（Ｆｅｌｄｂｕｓｈ，Ｔ．Ｌ．，１９８５，前述）、マウスＮＫ活性を増大させ得（Ｋｏｏ，Ｇ．Ｃ．，Ｍ．Ｅ．Ｊｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ｌ．Ｍａｎｙａｋ，Ｎ．Ｈ．Ｓｉｇａｌ，およびＬ．Ｓ．Ｗｉｃｋｅｒ，１９８８，「８−ブロモグアノシンによるマウスナチュラルキラー細胞およびマクロファージの活性化」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３２４９）、そして、マウスＬＡＫ生成の誘導においてＩＬ−２と共働作用し得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，およびＺ．Ｋ．Ｂａｌｌａｓ，１９９０，リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞。Ｖ。ＬＡＫ生成におけるＩＬ−２節約剤としての８−メルカプトグアノシン」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３５２４）。これらのＣ８置換グアノシンのＮＫおよびＬＡＫ増大活性は、それらのＩＦＮの誘導に起因するようである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら，１９９０，前述）。最近、マイコバクテリウムにより産生された５’三リン酸化チミジンが、ヒトγδＴ細胞のサブセットに対してマイトジェン性であることが見いだされた（Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｐ．，Ｆ．Ｄａｖｏｄｅａｕ，Ｍ．−Ａ．Ｐｅｙｒａｔ，Ｙ．Ｐｏｑｕｅｔ，Ｇ．Ｐｕｚｏ，Ｍ．Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ，およびＪ．−Ｊ．Ｆｏｕｒｎｉｅ，１９９４，「非ペプチド性マイコバクテリウムリガンドによるヒトγδＴ細胞の刺激」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：２６７）。この報告は、免疫系が微生物の核酸に優先的に応答する経路を展開し得ることを示した。
【０００５】
いくつかの観察により、ある種のＤＮＡ構造もまたリンパ球を活性化する潜在性を有し得ることが示唆されている。例えば、Ｂｅｌｌらは、脾臓細胞上清中のヌクレオソームタンパク質−ＤＮＡ複合体（裸のＤＮＡではない）がＢ細胞増殖および免疫グロブリン分泌を引き起こしたことを報告した（Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，Ｂ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，およびＰ．ＶａｎｄｅｎＢｙｇａａｒｔ，１９９０，「免疫原性ＤＮＡ関連因子」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１４８７）。他の場合においては、裸のＤＮＡが免疫効果を有することが報告されている。例えば、最近、Ｍｅｓｓｉｎａらは、ポリ（ｄＧ）・（ｄＣ）およびポリ（ｄＧ・ｄＣ）の２６０〜８００ｂｐのフラグメントが、Ｂ細胞に対してマイトジェン性であることを報告した（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｇ．Ｓ．Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，およびＤ．Ｓ．Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，１９９３，「天然および合成ポリヌクレオチド抗原によるマウスリンパ球のインビトロでの刺激に対するＤＮＡ構造の影響」，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１４８）。Ｔｏｋｕｎａｇａらは、ｄＧ・ｄＣがγ−ＩＦＮおよびＮＫ活性を誘導することを報告した（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，およびＫ．Ｎａｍｂａ，１９８８，「合成一本鎖ＤＮＡ、ポリ（ｄＧ・ｄＣ）はインターフェロン−α／βおよび−γを誘導し、ナチュラルキラー活性を増大させ、そして腫瘍成長を抑制する」，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：６８２）。このような人工的なホモポリマー配列に加えて、Ｐｉｓｅｔｓｋｙらは、純粋な哺乳動物ＤＮＡは検出可能な免疫効果を有さないが、ある種の細菌由来のＤＮＡがＢ細胞活性化および免疫グロブリン分泌を誘導することを報告した（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｇ．Ｓ．Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，およびＤ．Ｓ．Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，１９９１，「細菌ＤＮＡによるマウスリンパ球のインビトロでの増殖の刺激」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９）。これらのデータがある種の通常でない混入物によるものでないとすれば、これらの研究は、細菌ＤＮＡの特定の構造または他の特性が、細菌ＤＮＡを、Ｂ細胞活性化をトリガーし得るようにしていることを示唆している。マイコバクテリウムＤＮＡ配列の研究により、ある種のパリンドローム配列を含むＯＤＮがＮＫ細胞を活性化し得ることが示された（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｅ．Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｏ．Ｙａｎｏ，およびＴ．Ｔｏｋｕｎａｇａ，１９９２，「合成オリゴヌクレオチドにおける独特のパリンドローム配列が、ＩＮＦを誘導するために、およびＩＮＦ媒介ナチュラルキラー活性を増大させるために必要とされる」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２；Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｅ．，Ｏ．Ｙａｎｏ，Ｙ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｂａｂａ，Ｔ．Ｍａｋｉｎｏ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋａｔａｏｋａ，およびＴ．Ｔｏｋｕｎａｇａ，１９９２，「ナチュラルキラー細胞の活性化に必要とされるオリゴヌクレオチド配列」，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８３：１１２８、および欧州特許出願、公開番号０ ４６８ ５２０号）。
【０００６】
いくつかのホスホロチオエート修飾ＯＤＮが、インビトロまたはインビボでのＢ細胞刺激を誘導することが報告されている（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｃ．Ｃ．Ｃｈｕ，およびＷ．Ｅ．Ｐａｕｌ，１９９２，「Ｉγ２ｂ中の配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、γ２ｂ生殖系列転写物を増加させ、Ｂ細胞ＤＮＡ合成を刺激し、そして免疫グロブリン分泌を阻害する」， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：５９７；Ｂｒａｎｄａ，Ｒ．Ｆ．，Ａ．Ｌ．Ｍｏｏｒｅ，Ｌ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｊ．ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，およびＧ．Ｚｏｎ，１９９３，「ＨＩＶ−１のｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴマーによる免疫刺激」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：２０３７；ＭｃＩｎｔｙｒｅ，Ｋ．Ｗ．，Ｋ．Ｌｏｍｂａｒｄ−Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｊ．Ｒ．Ｐｅｒｅｚ，Ｃ．Ｋｕｎｓｃｈ，Ｕ．Ｍ．Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｊ．Ｄ．Ｌａｒｉｇａｎ，Ｋ．Ｔ．Ｌａｎｄｒｅｔｈ，およびＲ．Ｎａｒａｙａｎａｎ，１９９３，「転写因子ＮＦ−κβＴ６５の開始コドンに対するセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、配列特異的な免疫刺激を引き起こす」，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：３０９；ならびに、Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．，およびＣ．Ｆ．Ｒｅｉｃｈ，１９９３，「単純ヘルペスウィルスに対するアンチセンス活性を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスリンパ球増殖の刺激」，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５４：１０１）。これらの報告は、これらのＯＤＮの効果を説明し得るこれらのＯＤＮにおける共通の構造的モチーフも共通の配列エレメントも示唆しない。
（転写因子のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーおよび複製におけるそれらの役割）
ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）および活性化転写因子（ＡＴＦ）、すなわち転写因子のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーは、偏在して発現する転写因子のクラスであり、そのうちの１１のメンバーが今までのところクローン化されている（ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｒ．Ｐ．，およびＰ．Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，「遺伝子発現のホルモンによる制御：環状アデノシン３’，５’−モノホスフェート−応答性核レギュレーターの多様性および多変性」，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．７：１４５，１９９３；Ｌｅｅ．Ｋ．Ａ．Ｗ．，およびＮ．Ｍａｓｓｏｎ，「ＣＲＥＢおよびその関連物質による転写調節」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７４：２２１，１９９３）。これらはすべて、塩基性領域／ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）クラスのタンパク質に属する。すべての細胞は１つ以上のＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質を発現するようであるが、発現されるメンバーおよびｍＲＮＡスプライシングの調節は組織特異的であるようである。活性化ドメインのディファレンシャルなスプライシングが、特定のＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質が転写インヒビターであるかアクチベーターであるかを決定し得る。多くのＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質がウィルス性転写を活性化し得るが、活性ドメインを有さないいくつかのスプライシング変異体は阻害性である。ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を介してホモダイマーまたはヘテロダイマーとしてＤＮＡを結合し得る。ＣＲＥのコンセンサス形態は、非メチル化配列ＴＧＡＣＧＴＣである（ＣｐＧがメチル化されている場合には、結合がなくされる）（Ｉｇｕｃｈｉ−Ａｒｉｇａ，Ｓ．Ｍ．Ｍ．，およびＷ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，「ｃＡＭＰ応答性エンハンサー／プロモーター配列ＴＧＡＣＧＴＣＡのＣｐＧのメチル化が、特定の因子の結合および転写活性化をなくさせる」，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：６１２，１９８９）。
【０００７】
ＣＲＥの転写活性は、Ｂ細胞活性化の間に増加する（Ｘｉｅ，Ｈ．Ｔ．Ｃ．Ｃｈｉｌｅｓ，およびＴ．Ｌ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，「Ｂ細胞の表面Ｉｇレセプターを介したＣＲＥＢ活性の誘導」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：８８０，１９９３）。ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、ＣＲＥを介して複数の遺伝子（免疫学的に重要な遺伝子を含む）の発現を調節するようである。このような遺伝子としては、例えば、以下が挙げられる：ｆｏｓ、ｊｕｎ Ｂ、Ｒｂ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１（Ｔｓｕｋａｄａ，Ｊ．，Ｋ．Ｓａｉｔｏ，Ｗ．Ｒ．Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．Ｗｅｂｂ，およびＰ．Ｅ．Ａｕｒｏｎ，「転写因子ＮＦ−ＩＬ６およびＣＲＥＢは、ヒトプロインターロイキン１β遺伝子における共通の必須部位を認識する」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７２８５，１９９４；Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｄ．，Ｏ．Ｍ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｄ．Ｈｅｂｅｌ，Ｍ．Ｒｏｏｔ，Ｊ．Ｍ．Ｐｏｗ−Ｓａｎｇ，およびＥ．Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，「ヌードマウスにおいてｃ−Ｈａ−ｒａｓオンコジーンにより誘導される腫瘍成長のアンチセンスＤＮＡ阻害」，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：５７７，１９９３）、ＩＦＮ−β（Ｄｕ，Ｗ．，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ「ＡＴＦ／ＣＲＥＢ結合部位タンパク質が、ヒトインターフェロンＢ遺伝子のウィルス誘導に必要とされる」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２１５０，１９９２）、ＴＧＦ−β１（Ａｓｉｅｄｕ，Ｃ．Ｋ．，Ｌ．Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｋ．Ａｓｓｏｉａｎ，およびＭ．Ｅｈｒｌｉｃｈ，「ヒトＴＧＦ−Ｂ１遺伝子下流の連続性部位へのＡＰ−１／ＣＲＥＢタンパク質およびＭＤＢＰの結合」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２１９：５５，１９９４）、ＴＧＦ−β２、クラスＩＩ ＭＨＣ（Ｃｏｘ，Ｐ．Ｍ．，およびＣ．Ｒ．Ｇｏｄｉｎｇ，「ＡＴＦ／ＣＲＥＢ結合モチーフが、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲａプロモーターの異常構成性発現およびＳＶ−４０ Ｔ−抗原による活性化に必要とされる」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：４８８１，１９９２），Ｅ−セレクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ−８α、生殖系列Ｉｇα定常領域遺伝子、ＴＣＲ Ｖβ遺伝子、および増殖細胞核抗原（Ｈｕａｎｇ，Ｄ．，Ｐ．Ｍ．Ｓｈｉｐｍａｎ−Ａｐｐａｓａｍｙ，Ｄ．Ｊ．Ｏｒｔｅｎ，Ｓ．Ｈ．Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，およびＭ．Ｂ．Ｐｒｙｓｔｏｗｓｋｙ，「増殖細胞核抗原遺伝子のプロモーター活性は、インターロイキン２−刺激Ｔリンパ球の誘導性ＣＲＥ−結合タンパク質に関連する」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４２３３，１９９４）。ｃＡＭＰ経路を介した活性化に加えて、ＣＲＥＢはまた、細胞内Ｃａ＋＋濃度の変化に対する転写応答を媒介し得る（Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ，およびＭ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，「膜の非極性化およびカルシウムが転写因子ＣＲＥＢのリン酸化を介するｃ−ｆｏｓ転写を誘導する」，Ｎｅｕｒｏｎ ４：５７１，１９９０）。
【０００８】
ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質による転写活性化におけるタンパク質−タンパク質相互作用の役割は、きわめて重要なようである。サイクリックＡＭＰ経路を介したＣＲＥＢの活性化は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）（これは、ＣＲＥＢ３４１をｓｅｒ１３３でリン酸化し、これを最近クローン化されたタンパク質ＣＢＰに結合させる）を必要とする（Ｋｗｏｋ，Ｒ．Ｐ．Ｓ．，Ｊ．Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｊ．Ｃ．Ｃｈｒｉｖｉａ，Ｊ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｈ．Ｐ．Ｂａｃｈｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．Ｇ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，およびＲ．Ｈ．Ｇｏｏｄｍａｎ，「核タンパク質ＣＢＰは、転写因子ＣＲＥＢのコアクチベーターである」，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：２２３，１９９４；Ａｒｉａｓ，Ｊ．，Ａ．Ｓ．Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｐ．Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｆ．Ｘ．Ｃｌａｒｅｔ，Ｔ．Ｓｍｅａ，Ｍ．Ｋａｒｉｎ，Ｊ．Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ，およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，「ｃＡＭＰおよびマイトジェン応答性遺伝子の活性化は、共通の核因子に依存する」，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：２２６，１９９４）。ＣＢＰは、次いで、基礎的な転写因子であるＴＦＩＩＢと相互作用して転写を増大させる。ＣＲＥＢはまた、ｄＴＡＦＩＩ １１０、ＴＡＴＡ結合タンパク質会合因子（この結合が転写を調節し得る）と相互作用することが報告されている（Ｆｅｒｒｅｒｉ，Ｋ．，Ｇ．Ｇｉｌｌ，およびＭ．Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，「ｃＡＭＰ調節転写因子ＣＲＥＢは、ＴＦＩＩＤ複合体の要素と相互作用する」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２１０，１９９４）。これらの相互作用に加えて、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質は、他の複数の核因子と特異的に結合し得る（Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｗ．Ｌｕｓｔｂａｄｅｒ，およびＣ．−Ｙ．Ｃｈｅｎ，「タンパク質−タンパク質相互作用により、環状アデノシン３’，５’−モノホスフェート応答エレメント結合タンパク質および活性化転写因子−２と相互作用する複数の核因子の同定」，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５：２５６，１９９１）。しかし、これらの相互作用の大部分についての生物学的意義は知られていない。ＣＲＥＢは、通常、ホモダイマーまたはいくつかの他のタンパク質とのヘテロダイマーのいずれかとしてＤＮＡと結合すると考えられている。驚くべきことに、ＣＲＥＢモノマーは、構成的に転写を活性化する（Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｗ．，およびＫ．Ａ．Ｗ．Ｌｅｅ，「細胞性転写因子ＣＲＥＢのモノマー誘導体は、構成性アクチベーターとして機能する」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７２０４，１９９４）。
【０００９】
細胞性転写の調節における重要な役割のほかに、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質がいくつかの感染性ウィルスおよびレトロウィルス（これらはウィルス性複製にＣＲＥＢ／ＡＴＰタンパク質を必要とする）によりくつがえされることが最近示されている。例えば、サイトメガロウィルス即時プロモーター（哺乳動物の最も強力な既知のプロモーターの１つ）は、プロモーター機能に必須である１１コピーのＣＲＥを含む（Ｃｈａｎｇ，Ｙ．−Ｎ．，Ｓ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓｔａｌｌ，Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｋ．−Ｔ．Ｊｅａｎｇ，およびＧ．Ｓ．Ｈａｙｗａｒｄ，「シミアンサイトメガロウィルス主要即時プロモーターにおけるパリンドロームシリーズＩ反復は、強力な基礎的エンハンサーおよびサイクリックＡＭＰ応答エレメントの両方として機能する」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２６４，１９９０）。アデノウィルスＥ１Ａタンパク質（これは多くのプロモーターを誘導する）の転写活性化効果のうちの少なくともいくつかは、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質、ＡＴＦ−２（これは、Ｅ１Ａ誘導性転写活性化を媒介する）のＤＮＡ結合ドメインへの結合に起因する（Ｌｉｕ，Ｆ．，およびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，「異なる細胞性ＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を介したアデノウィルスＥ１ａによるプロモーター標的化」，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：５２０，１９９４）。Ｅ１ＡがＣＲＥＢ結合タンパク質ＣＢＰに結合することも示唆されている（Ａｒａｎｙ，Ｚ．，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，およびＲ．Ｅｃｋｎｅｒ，「Ｅ１Ａ会合ｐ３００およびＣＲＥＢ会合ＣＢＰは、コアクチベーターの保存ファミリーに属する」，Ｃｅｌｌ ７７：７９９，１９９４）。ヒトＴ細胞白血病および熱帯痙性麻痺を引き起こすレトロウィルスであるヒトＴリンパ球性ウィルス−Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）もまた、複製にＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質を必要とする。この場合には、レトロウィルスはタンパク質Ｔａｘを産生する。Ｔａｘは、ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質に結合し、これらをその通常の細胞性結合部位からＨＴＬＶ転写エンハンサー内に存在する異なるＤＮＡ配列（Ｇ−およびＣ− リッチ配列に隣接する）へと再方向付けする（Ｐａｃａ−Ｕｃｃａｒａｌｅｒｔｋｕｎ，Ｓ．，Ｌ．−Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｎ．Ａｄｙａ，Ｊ．Ｖ．Ｃｒｏｓｓ，Ｂ．Ｒ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｂｏｒｏｓ，およびＣ．−Ｚ．Ｇｉａｍ，「ヒトＴ細胞リンパ球性ウィルスＩ型転写アクチベーターＴａｘに対して高度に応答性のＤＮＡエレメントのインビトロでの選択」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４５６，１９９４；Ａｄｙａ，Ｎ．，Ｌ．−Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｗ．Ｈｕａｎｇ，Ｉ．Ｂｏｒｏｓ，およびＣ．−Ｚ．Ｇｌａｍ，「ＴａｘによるＣＲＥＢのＤＮＡ認識特異性の拡大は、ＣＲＥＢの保存ＤＮＡ結合ドメイン近傍の２８２〜２８４位のＡｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇとの相互作用から生じる」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６４２，１９９４）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物、このオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性に基づく有用な方法、中性オリゴヌクレオチド、中性オリゴヌクレオチドを用いる有用な方法、および免疫阻害オリゴヌクレオチド、免疫阻害オリゴヌクレオチドの種々の使用を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式Ｉ：５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’に従う少なくとも１つの核酸配列を含む、免疫刺激オリゴヌクレオチドであり：
ここで、ＣＧは、オリゴヌクレオチドに免疫刺激能力を付与する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドであり；Ｘ１およびＸ２の少なくとも１つはプリンであり；そして、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つはピリミジンである。
【００１２】
好適な実施形態では、上記式Ｉがパリンドロームではない。
【００１３】
さらに好適な実施形態では、Ｘ１がプリンヌクレオチドである。
【００１４】
さらに好適な実施形態では、Ｘ４がピリミジンヌクレオチドである。
【００１５】
さらに好適な実施形態では、Ｘ１の５’側にさらにチミジンヌクレオチドを含む。
【００１６】
さらに好適な実施形態では、上記式Ｉのヌクレオチド配列が、５’ ＧＡＣＧＴＴ ３’、５’ ＡＧＣＧＴＴ ３’、５’ ＡＡＣＧＣＴ ３’、５’ ＣＴＣＧＡＣ ３’、５’ ＧＴＣＧＧＴ ３’、５’ ＧＡＣＧＴＴ ３’、５’ ＴＴＣＧＡＴ ３’、５’ ＡＡＣＧＡＴ ３’および５’ ＡＴＣＧＡＣ３’からなる群から選択される。
【００１７】
さらに好適な実施形態では、上記式Ｉの配列を含む上記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端のヌクレオチド配列がポリＧヌクレオチドである。
【００１８】
さらに好適な実施形態では、１つ以上のホスフェート骨格修飾を有する。
【００１９】
さらに好適な実施形態では、上記１つ以上のホスフェート骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である。
【００２０】
さらに好適な実施形態では、約６〜約１００のヌクレオチドを含む。
【００２１】
さらに好適な実施形態では、約６〜約４０のヌクレオチドを含む。
【００２２】
さらに好適な実施形態では、上記オリゴヌクレオチドと標的化手段とを有する。
【００２３】
さらに好適な実施形態では、上記標的化手段が、コレステロール、ビロソーム、リポソーム、脂質および標的細胞特異的結合因子からなる群から選択される。
【００２４】
本発明はまた、免疫系不全にかかっているかまたはかかりやすいヒトを含む動物の予防または処置のための薬品を製造するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２５】
好適な実施形態では、上記免疫系不全が、ウィルス、細菌、真菌または寄生体の感染によって引き起こされる。
【００２６】
本発明はまた、ガンにかかっているヒトを含む動物の処置のための薬品を製造するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２７】
本発明はまた、ワクチンに対する動物の免疫応答を増大させるためにワクチン投与前またはワクチン投与と同時にヒトを含む動物に投与するためのアジュバントを調製するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２８】
本発明はまた、免疫系の活性化に関連する疾病にかかりやすいヒトを含む動物の予防のための薬品を製造するための、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体の使用である。
【００２９】
好適な実施形態では、上記免疫系の活性化に関連する疾病が、自己免疫疾患である。
【００３０】
さらに好適な実施形態では、上記免疫系の活性化が、細菌、真菌または寄生体の感染によって引き起こされる。
【００３１】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的処方物である。
【００３２】
好適な実施形態では、別の治療剤をさらに含む。
【００３３】
本発明はまた、少なくとも１つのメチル化ＣＧジヌクレオチドを含む免疫中性オリゴヌクレオチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的処方物である。
【００３４】
本発明はまた、ヒトを含む動物の免疫系の活性化に関連する疾病の予防または処置のための薬品を調製するための、上記免疫中性オリゴヌクレオチドの使用である。
【００３５】
好適な実施形態では、上記疾病が全身性紅斑性狼瘡である。
【００３６】
好適な実施形態では、上記疾病が敗血症である。
【００３７】
好適な実施形態では、上記メチル化ＣＧジヌクレオチドが、５−メチルシトシンである。
【００３８】
【発明の実施の形態】
本発明は、非メチル化シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドを含むある種のオリゴヌクレオチドがインビトロおよびインビボデータにより示されるようにリンパ球を活性化するという知見に基づいている。この知見に基づいて、本発明は、１つの局面においては、新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物を特徴とする。
【００３９】
好ましい実施態様においては、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、合成物であり、２〜１００塩基対のサイズであり、そして以下の式で表されるコンセンサスマイトジェン性ＣｐＧモチーフを含む：
５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’
ここで、ＣおよびＧは、非メチル化であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はヌクレオチドであり；そしてＧＣＧトリヌクレオチド配列は、５’および３’末端にもその近傍にも存在しない。
【００４０】
細胞への取り込みを促進するためには、ＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。安定化されたオリゴヌクレオチド（特に、ホスホチオエート安定化オリゴヌクレオチド）を用いて、長期の免疫刺激が得られ得る。Ｘ１Ｘ２がジヌクレオチドＧｐＡおよび／またはＸ３Ｘ４がジヌクレオチド（最も好ましくはＴｐＣまたはＴｐＴ）である場合に、免疫刺激活性の増大が確認された。コンセンサスモチーフＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４が５’末端でＴにより先行される場合に、免疫刺激活性のさらなる増大が確認される。
【００４１】
第２の局面においては、本発明は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性に基づく有用な方法を特徴とする。例えば、リンパ球が被験体から得られ得、そして適切なオリゴヌクレオチドとの接触に際してエクスビボで刺激され得るか；または、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが被験体に投与され得、被験体のリンパ球のインビボでの活性化を促進し得る。本明細書に記載の方法で（例えば、エクスビボまたはインビボのいずれかで）刺激された、活性化されたリンパ球は、被験体の免疫応答を増強し得る。従って、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、免疫系不全（例えば、被験体の腫瘍またはガン、あるいは、ウィルス、真菌、細菌または寄生体による感染症）を処置し、防止し、または改善するために使用され得る。さらに、免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、ワクチンアジュバントとしても投与され得、被験体のワクチンに対する応答を刺激し得る。さらに、免疫刺激細胞が白血病性細胞を細胞周期に入るように誘導する能力を有するので、慢性白血病細胞の感受性を増大させた後、通常の除去化学療法（ａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）を施すことにより白血病を処置するための有用性が示唆される。
【００４２】
第３の局面においては、本発明は、中性オリゴヌクレオチド（すなわち、非メチル化ＣｐＧを含まないか、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）を特徴とする。好ましい実施態様においては、中和オリゴヌクレオチドは免疫刺激配列に相補的であるが、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の代わりにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、従って、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとの結合を完成し得る。好ましい実施態様においては、メチル化は、シトシンの６員環を含む４つの炭素および２つの窒素のうちの１つ以上で起こり、あるいは、グアニンの９員二重環を含む５つの炭素および４つの窒素のうちの１つ以上で起こる。好ましいメチル化ＣｐＧは、５’−メチルシトシンである。
【００４３】
第４の局面においては、本発明は、中性オリゴヌクレオチドを用いる有用な方法を特徴とする。例えば、中性オリゴヌクレオチドのインビボでの投与が、被験体における非メチル化ＣｐＧ２量体の存在により引き起こされるかまたは悪化させる疾病（例えば、全身性紅斑性狼瘡、敗血症および自己免疫疾患）の処置に有用であると判明するはずである。さらに、メチル化ＣｐＧ含有アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブは、インビボでの被験体への投与時に免疫反応を開始させない。従って、これらは、対応する非メチル化オリゴヌクレオチドよりも安全である。
【００４４】
第５の局面においては、本発明は、免疫阻害オリゴヌクレオチド（これは、ウィルス性または細胞性転写因子の活性を妨害し得る）を特徴とする。好ましい実施態様においては、免疫阻害オリゴヌクレオチドは、２〜１００塩基対のサイズの間であり、そして以下の式で表されるコンセンサス免疫阻害ＣｐＧモチーフを含む：
５’ ＧＣＧＸｎＧＣＧ ３’
ここで、Ｘはヌクレオチドであり；ｎは０〜５０の範囲である。好ましい実施態様においては、Ｘはピリミジンである。
【００４５】
細胞への取り込みを促進するためには、免疫阻害オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。安定化されたオリゴヌクレオチド（特に、ホスホチオエート安定化オリゴヌクレオチド）を用いて、長期の生物学的効果が得られ得る。
【００４６】
第６かつ最後の局面においては、本発明は、免疫阻害オリゴヌクレオチドの種々の使用を特徴とする。免疫阻害オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的とされるウィルス性配列との間の相補性に起因するいかなるアンチセンス効果とも無関係に、抗ウィルス活性を有する。
【００４７】
本発明の他の利点および特徴は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより明らかになるであろう。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書において用いられるように、以下の用語および表現は下記の意味を有する：
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、複数のヌクレオチド（すなわち、ホスフェート基および置換可能な有機塩基（置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））あるいは置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである）に結合した糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書において用いられるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）およびオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の両方を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオシド（すなわち、ホスフェートを含まないオリゴヌクレオチド）および任意の他の有機塩基含有ポリマーを包含する。オリゴヌクレオチドは、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得られ得るが、好ましくは合成である（例えば、オリゴヌクレオチド合成により産生される）。
【００４８】
「安定化されたオリゴヌクレオチド」は、インビボでの分解（例えば、エクソまたはエンドヌクレアーゼによる分解）に比較的耐性であるオリゴヌクレオチドを意味する。本発明の好ましい安定化されたオリゴヌクレオチドは、修飾ホスフェート骨格を有する。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾ホスフェート骨格（すなわち、ホスフェート酸素の少なくとも１つがイオウで置換された構造）を有する。他の安定化されたオリゴヌクレオチドは、非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキル−およびアリール−ホスホネート（荷電ホスホネート酸素が、アルキルまたはアリール基で置換される）、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分がアルキル化される））を包含する。いずれか一方または両方の末端にジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴヌクレオチドもまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている。
【００４９】
「免疫刺激オリゴヌクレオチド」、「免疫刺激ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」または「ＣｐＧ ＯＤＮ」は、シトシン、グアニンジヌクレオチド配列を含み、そして脊椎動物リンパ球を刺激する（例えば、マイトジェン効果を有する）オリゴヌクレオチドを意味する。好ましい免疫刺激オリゴヌクレオチドは、２〜１００塩基対のサイズであり、そして以下の式で表されるコンセンサスマイトジェン性ＣｐＧモチーフを含む：
５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’
ここで、ＣおよびＧは、非メチル化であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はヌクレオチドであり；そしてＧＣＧトリヌクレオチド配列は、５’および３’末端にもその近傍にも存在しない。
好ましくは免疫刺激オリゴヌクレオチドは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。さらに、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、好ましくは安定化されたオリゴヌクレオチドであり、特に好ましくはホスホロチオエートで安定化されたオリゴヌクレオチドである。好ましい１つの実施態様においては、Ｘ１Ｘ２はジヌクレオチドＧｐＡである。好ましい別の実施態様においては、Ｘ３Ｘ４は、好ましくはジヌクレオチドＴｐＣまたはＴｐＴである。特に好ましい実施態様においては、コンセンサスモチーフＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４は５’末端においてＴにより先行される。特に好ましいコンセンサス配列は、ＴＧＡＣＧＴＴまたはＴＧＡＣＧＴＣである。
【００５０】
「中性オリゴヌクレオチド」は、非メチル化ＣｐＧを含まないオリゴヌクレオチド、またはメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。好ましい実施態様においては、中和オリゴヌクレオチドは免疫刺激配列に相補的であるが、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の代わりにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、従って、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとの結合を完成し得る。好ましい実施態様においては、メチル化は、シトシンの６員環を含む４つの炭素および２つの窒素のうちの１つ以上で起こり、あるいは、グアニンの９員二重環を含む５つの炭素および４つの窒素のうちの１つ以上で起こる。好ましいメチル化ＣｐＧは、５’−メチルシトシンである。
【００５１】
「免疫阻害オリゴヌクレオチド」または「免疫阻害ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」は、ウィルス性または細胞性転写因子の活性を妨害し得るオリゴヌクレオチドである（明細書１０頁（英文明細書８頁）の発明の要旨に支持されている）。好ましい免疫阻害オリゴヌクレオチドは、２〜１００塩基対のサイズの間であり、そして以下の式で表され得る：
５’ ＧＣＧＸｎＧＣＧ ３’
ここで、Ｘはヌクレオチドであり；ｎは０〜５０の範囲である。好ましい実施態様においては、Ｘはピリミジンである。
【００５２】
細胞への取り込みを促進するためには、免疫阻害オリゴヌクレオチドは、好ましくは８〜４０塩基対のサイズの範囲である。安定化されたオリゴヌクレオチド（特に、ホスホロチオエート安定化オリゴヌクレオチド）を用いて、長期の免疫刺激が得られ得る。
【００５３】
「パリンドローム配列」は、逆方向反復（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’のような配列、ここでＡおよびＡ’は、通常のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成し得る塩基である）を意味する。インビボにおいては、このような配列は、二本鎖構造を形成し得る。
【００５４】
「オリゴヌクレオチド送達複合体」は、標的手段に結合した（例えば、標的手段にイオン的にまたは共有結合的に結合した；あるいは標的手段内にカプセル化された）オリゴヌクレオチドを意味する。標的手段は、例えば、標的細胞（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面との高親和性結合を生じる、および／または標的細胞による細胞性取り込みを増加させる分子である。オリゴヌクレオチド送達複合体の例としては、以下のものに結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる：ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、標的細胞特異性レセプターにより認識されるリガンド）。好ましい複合体は、標的細胞によるインターナリゼーション前の有意な非結合を防止するようにインビボで十分に安定でなければならない。しかし、複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的形態で放出されるよう、適切な条件下では細胞内で開裂可能でなければならない。
【００５５】
「免疫系不全」は、被験体の免疫系が通常の能力で機能しない疾病または障害を意味する。あるいは、被験体の免疫応答を増強し、例えば、被験体における腫瘍またはガン（例えば、脳、肺（例えば、小細胞および非小細胞）、卵巣、乳房、前立腺、結腸の腫瘍、ならびに他のガン腫および肉腫）、あるいは、ウィルス（例えば、ＨＩＶ、ヘルペス）、真菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）、細菌または寄生体（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）による感染症を取り除くことが有用である疾病または障害を意味する。
【００５６】
「免疫系の活性化に関連する疾病」は、被験体の免疫系の活性化により引き起こされるかまたは悪化される疾病または症状を意味する。例としては、全身性紅斑性狼瘡、敗血症および自己免疫疾患（例えば、リューマチ性関節炎、多発性硬化症）が挙げられる。
【００５７】
「被験体」は、ヒトまたは脊椎動物（イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラット、マウスなどを包含する）を意味する。
（ある種の非メチル化ＣｐＧ含有オリゴは、インビトロおよびインビボで示されるようにＢ細胞刺激活性を有する）
後述の実施例１および２に記載のプロトコールを用いて内在性レトロウィルス配列に特異的な２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのリンパ球刺激効果を調べると、驚くべきことに、２４の「コントロール」（「アンチセンス」ＯＤＮのパネルについての種々のスクランブル、センスおよびミスマッチコントロールを含む）のうちの２つもまたＢ細胞活性化およびＩｇＭ分泌を媒介するが、他の「コントロール」は効果を有さないことが見いだされた。
【００５８】
２つの観察から、この「コントロール」ＯＤＮによるＢ細胞の活性化は、アンチセンス効果を有し得ないことが示唆された：（１）ＧｅｎＢａｎｋにリストされる脊椎動物ＤＮＡ配列で比較すると、非刺激ＯＤＮで見られるものより大きな相同性を示さなかったこと、および、（２）２つのコントロールは、１０μｇの脾臓ポリＡ＋ＲＮＡを用いるノーザンブロットへのハイブリダイゼーションを示さなかったこと。異なる合成機によるこれらのＯＤＮの再合成またはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーによる十分な精製により、同一の刺激が得られた。このことは不純物の可能性を排除した。同様の刺激が、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＢ細胞を用いて得られた。このことはリポ多糖（ＬＰＳ）による汚染が原因となり得る可能性を排除した。
【００５９】
２つの「コントロール」ＯＤＮが２つの「アンチセンス」ＯＤＮと同様のＢ細胞活性化を引き起こしたという事実は、他のすべての非刺激コントロールＯＤＮには存在しない配列モチーフを含むある種の非アンチセンスメカニズムによってこれら４つのＯＤＮのすべてがＢ細胞を刺激するという可能性を提起した。これらの配列を比較すると、４つの刺激ＯＤＮはすべて、非刺激コントロールとは配列の異なるＯＤＮジヌクレオチドを含んでいた。
【００６０】
刺激ＯＤＮに存在するＣｐＧ要素が観察された刺激の原因となるかどうかを調べるために、５〜４２塩基の長さの範囲の３００を超えるＯＤＮ（これらは、種々の配列のメチル化、非メチル化、または非ＣｐＧジヌクレオチドを含む）を合成した。２つのもとの「コントロール」（ＯＤＮ１および２）および「アンチセンス」として独自に合成した２つ（ＯＤＮ ３Ｄおよび３Ｍ；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２４４８（１９８９））を含むこれらのＯＤＮを、脾臓細胞に対するインビトロでの効果を調べた（表１に代表的な配列を列挙する）。ＣｐＧジヌクレオチドを含むいくつかのＯＤＮが、Ｂ細胞活性化およびＩｇＭ分泌を誘導した；代表的には、刺激の程度は、ＣｐＧジヌクレオチドをより多く添加することにより増大し得た（表１；ＯＤＮ２を２ａに、または３Ｄを３Ｄａおよび３Ｄｂに比較のこと）。刺激は、アンチセンスメカニズムによるものでも不純物によるものでもないようである。ＯＤＮは、γδまたはその他のＴ細胞集団について検出可能な活性化を引き起こさなかった。
【００６１】
ＣｐＧジヌクレオチドが変異された場合（表１；ＯＤＮ１を１ａに；３Ｄを３Ｄｃに；３Ｍを３Ｍａに；および４を４ａに比較のこと）、または、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが５−メチルシトシンで置換された場合（表１；ＯＤＮ １ｂ、２ｂ、２ｃ、３Ｄｄ、および３Ｍｂ）には、マイトジェン性ＯＤＮ配列は一様に非刺激性となった。これに対して、他のシトシンがメチル化された場合には、ＯＤＮ活性は減少しなかった（ＯＤＮ １ｃ、２ｄ、３Ｄｅ、および３Ｍｃ）。これらのデータにより、ＣｐＧモチーフが、 Ｂ細胞を活性化する、ＯＤＮに存在する必須エレメントであることが確認された。
【００６２】
これらの研究において、ＣｐＧジヌクレオチドに隣接する塩基が、ＯＤＮに誘導されるＢ細胞活性化を決定する際に重要な役割を果たすことが明らかになった。最適刺激モチーフは、２つの５’プリン（好ましくは、ＧｐＡジヌクレオチド）および２つの３’ピリミジン（好ましくは、ＴｐＴまたはＴｐＣジヌクレオチド）に隣接するＣｐＧからなると決定された。この理想により近いＣｐＧモチーフをもたらすＯＤＮの変異により、刺激が改善された（例えば、ＯＤＮ ２を２ｅに；３Ｍを３Ｍｄに比較のこと）が、このモチーフを妨げる変異により刺激が減少した（例えば、ＯＤＮ ３Ｄを３Ｄｆに；４を４ｂ、４ｃおよび４ｄに比較のこと）。一方、ＣｐＧモチーフ外の変異によっては、刺激は減少しなかった（例えば、ＯＤＮ １を１ｄに；３Ｄを３Ｄｇに；３Ｍを３Ｍｅに比較のこと）。
【００６３】
試験されたもののうち、８塩基よりも短いＯＤＮは非刺激性であった（例えば、ＯＤＮ ４ｅ）。試験された４８の８塩基ＯＤＮのうち、同定された最も刺激性の配列はＴＣＡＡＣＧＴＴ（ＯＤＮ ４）であった。この配列は、自己相補性の「パリンドローム」ＡＡＣＧＴＴを含む。このモチーフをさらに最適化すると、（特に、末端のヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾により、ＯＤＮがヌクレアーゼ耐性とされる場合には、）両端部にＧを含むＯＤＮが増大した刺激を示すことが見いだされた。最初の２つおよび最後の５つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されているＯＤＮ １５８５（５’ ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＧ ３’（配列番号：１））は、両端の１０のＧが１０のＡで置換されていること以外はＯＤＮ １５８５と同じ配列を有するＯＤＮ １６３８により誘導されたマウス脾臓細胞増殖における平均３．２倍の増加に比較して、マウス脾臓細胞増殖における平均２５．４倍の増加を引き起こした。Ｇリッチ末端の効果はシスである；ポリＧ末端を有するがＣｐＧモチーフを有さないＯＤＮを１６３８と共に添加しても、増殖の増加は得られなかった。
【００６４】
最適モチーフに近似する場合には（例えば、ＯＤＮ ４ｂ、４ｃ）、５’末端にＴｐＣジヌクレオチドを有する６塩基のパリンドロームを含む他の８量体ＯＤＮもまた活性であった。５’末端の他のジヌクレオチドは、刺激を減少させた（例えば、ＯＤＮ ４ｆ；１６の可能なジヌクレオチドすべてについて試験した）。３’ジヌクレオチドの存在は、５’ジヌクレオチドの欠乏を補填するには不十分であった（例えば、ＯＤＮ ４ｇ）。パリンドロームの破壊により８量体ＯＤＮにおける刺激が取り除かれた（例えば、ＯＤＮ ４ｈ）が、より長いＯＤＮにはパリンドロームは必要とされなかった。
【００６５】
【表１】
【００６６】
マウス脾臓細胞を用いて白血球活性化の反応速度を調べた。ＯＤＮ添加と同時に細胞をパルスし、４時間後に細胞を集めると、３Ｈウリジン取り込みはすでに２倍に増加していた。刺激は１２〜４８時間後にピークとなり、その後減少した。２４時間後には、インタクトなＯＤＮは検出されず、おそらくこのことはその後の刺激の低下の原因となっている。（マイトジェン性以下の投与量での）抗ＩｇＭの存在下または非存在下で精製Ｂ細胞をＣｐＧ ＯＤＮとともに培養した場合に、２つのマイトジェンの組み合わせにより４８時間後には増殖が約１０倍と顕著に増加することが見いだされた。刺激の程度は濃度依存性であり、両方について最適条件の下では一致してＬＰＳの刺激の程度を上回っていた。ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドの約２００倍強力であった。
【００６７】
細胞周期分析を用いて、ＣｐＧ−ＯＤＮにより活性化されたＢ細胞の割合を決定した。ＣｐＧ−ＯＤＮは、９５％を超えるＢ細胞の細胞周期進行を誘導した（表２）。フローサイトメトリーによりＣＤ２３−（周辺領域）およびＣＤ２３＋（小胞）下位集団にソートされた脾臓Ｂリンパ球は、ＯＤＮ誘導刺激に対して同等に応答性であった。なぜならこれらは共に休止状態であり、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配での分画により単離されたＢ細胞の活性化集団であったからである。これらの研究により、ＣｐＧ−ＯＤＮが本質的にすべてのＢ細胞を細胞周期に入るようにすることが示された。
【００６８】
【表２】
【００６９】
ある種のＢ細胞株（例えば、ＷＥＨＩ−２３１）が誘導され、抗ＩｇＭによるそれらの抗原レセプターの架橋に応答して増殖阻止および／またはアポトーシスを受ける（Ｊａｋｗａｙ，Ｊ．Ｐ．ら、「抗免疫グロブリン、リポ多糖および他の細菌性産物によるＢリンパ腫細胞株ＷＥＨＩ−２３１の増殖の調節」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２２２５（１９８６）；Ｔｓｕｂａｔａ，Ｔ．，Ｊ．Ｗｕ，およびＴ．Ｈｏｎｊｏ，「抗原レセプター架橋により誘導されたＢ細胞アポトーシスが、ＣＤ４０を介したＴ細胞シグナルによりブロックされる」，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：６４５（１９９３））。ＷＥＨＩ−２３１細胞は、ある種の刺激（例えば、ＬＰＳ）により、およびＣＤ４０リガンドにより、この増殖阻止からレスキューされる。ＣｐＧモチーフ含有ＯＤＮはまた、抗ＩｇＭ誘導増殖阻止からＷＥＨＩ−２３１を保護しすることが見いだされた。このことは、この効果にはアクセサリー細胞集団は必要とされないことを示している。
【００７０】
非メチル化ＣｐＧ ＯＤＮの免疫効果をより十分に理解するために、インビトロおよびインビボでのサイトカインおよびプロスタグランジンのレベルを調べた。ＬＰＳとは異なり、ＣｐＧ ＯＤＮは、精製マクロファージにプロスタグランジンＰＧＥ２の産生を誘導しないことが見いだされた。実際、マクロファージにおいてもＴ細胞においても、ＣｐＧ ＯＤＮの明らかな直接的効果は認められなかった。インビボまたは全脾臓細胞において、以下のインターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４またはＩＬ−１０）の有意な増加は、最初の６時間以内には認められなかった。しかし、ＩＬ−６のレベルは、ＣｐＧ ＯＤＮを注射したマウスの血清において、２時間以内に顕著に増加した。脾臓細胞によるＩＬ−１２およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の発現の増大もまた、最初の２時間以内に認められた。
【００７１】
ＣｐＧ ＯＤＮがインビボでの免疫刺激を引き起こし得るかどうかを決定するために、ＰＢＳまたはホスホロチオエートＣｐＧまたは非ＣｐＧ ＯＤＮを、３３ｍｇ／ｋｇ（約５００μｇ／マウス）の用量でＤＢＡ／２マウスに１回腹腔内注射した。マウスにおける薬物動態学的研究により、この用量でのホスホロチオエートが２４時間より長期間にわたり脾臓組織において約１０μｇ／ｇのレベル（本明細書に記載のインビトロでの研究から決定される有効濃度範囲内）を与えることが示される（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７５９５）。３色フローサイトメトリーを用いてＢ細胞表面活性化マーカーＬｙ−６Ａ／Ｅ、Ｂｌａ−１およびクラスＩＩＭＨＣの発現について、ならびに３Ｈチミジンを用いてそれらの自然増殖について、ＯＤＮ注射の２４時間後にマウス由来の脾臓細胞を調べた。３種の活性化マーカーすべての発現が、ＣｐＧ ＯＤＮ注射マウス由来のＢ細胞において有意に増加したが、ＰＢＳまたは非ＣｐＧ ＯＤＮ注射マウス由来のＢ細胞においては増加しなかった。刺激性ＯＤＮを注射したマウス由来の脾臓細胞は、ＰＢＳまたは非ＣｐＧ ＯＤＮ注射マウスと比較して、自然３Ｈチミジン取り込みが２〜６倍増加した。４日後、インビボでのＣｐＧ ＯＤＮ注射マウスの血清ＩｇＭレベルは、コントロールと比較して約３倍増加した。これらの薬剤がＴ細胞を活性化する能力がないことと一致して、ＩＬ−２ＲまたはＣＤ−４４のＴ細胞発現における変化は最小限であった。
【００７２】
血清におけるホスホジエステルＯＤＮの分解は、３’−エクソヌクレアーゼにより優先的に媒介される。一方、細胞内ＯＤＮ分解はより複雑であり、５’および３’エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。５’および３’末端で変化する数のホスホロチオエート修飾結合を有する３Ｄ配列を有するＯＤＮパネルを用いて、２つの５’修飾結合および５つの３’修飾結合がこのＣｐＧ ＯＤＮによる最適刺激を提供するために必要であることが実験的に決定された。（非メチル化ＣｐＧ含有オリゴはＮＫ細胞刺激活性を有する）
実施例４でさらに詳細に記載するように、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＢ細胞に加えてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を刺激するかどうかを決定するために実験を行った。表３に示すように、ＣｐＧ ＯＤＮ １および３Ｄｄと共に培養された脾臓細胞においてＮＫ活性の顕著な誘導が観察された。これに対して、非ＣｐＧコントロールＯＤＮで処理されたエフェクターにおいては、誘導はほとんど存在しなかった。
【００７３】
【表３】
ＯＤＮ（ＣｐＧモチーフまたは他の部分でのシトシンが５−メチルシトシンで置換されたもの）のＢ細胞マイトジェン性を、実施例１に記載のようにして調べた。上記表１に示すように、メチル化ＣｐＧを含むＯＤＮは、非マイトジェン性であった（表１；ＯＤＮ １ｃ、２ｆ、３Ｄｅ、および３Ｍｃ）。しかし、ＣｐＧジヌクレオチド以外のシトシンのメチル化では、刺激特性は維持された（表１；ＯＤＮ １ｄ、２ｄ、３Ｄｆ、および３Ｍｄ）。
（両末端およびその近傍にＧＣＧトリヌクレオチド配列を含むオリゴの免疫阻害活性）
いくつかの場合においては、上記の刺激モチーフ内部ではないＣｐＧジヌクレオチドを含むＯＤＮは、他のマイトジェン性ＣｐＧ ＯＤＮの刺激効果をブロックすることが見いだされた。具体的には、ＣｐＧ ＯＤＮの５’および／または３’末端およびその近傍にＧＣＧからなる非定型のＣｐＧモチーフを加えることにより、他のＣｐＧモチーフによる増殖の刺激が実際に阻害された。ＧＣＧモチーフにおけるシトシンのメチル化または置換は、この効果を逆転する。好ましいＣｐＧモチーフに見られるよりもずっと低いが、ＯＤＮ中のＧＣＧモチーフはそれ自体が低いマイトジェン性効果を有する。
（免疫刺激、中和および免疫阻害オリゴヌクレオチドの作用の提唱されるメカニズム）
その表面Ｉｇレセプターを介してＢ細胞をトリガーする抗原とは異なり、ＣｐＧ−ＯＤＮは、検出可能なＣａ２＋流出、タンパク質チロシンリン酸化における変化またはＩＰ ３生成のいずれも誘導しなかった。ＣｐＧモチーフ存在下または非存在下でのＦＩＴＣ−結合ＯＤＮを用いるフローサイトメトリーを、Ｚｈａｏ，Ｑら（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：５３−６６（１９９３））に記載のようにして行った。これにより、等価な膜結合、細胞取り込み、流出および細胞内局在化が示された。このことは、ＣｐＧ ＯＤＮに対して特異的な細胞膜タンパク質は存在しないかもしれないことを示唆している。細胞膜を介して作用するよりもむしろ、これらのデータは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが活性のために細胞取り込みを必要とすることを示唆している：固体Ｔｅｆｌｏｎ支持体に共有結合したＯＤＮは非刺激性であり、アビジンビーズまたはアビジンコートされたペトリ皿上に固定化されたビオチン化ＯＤＮも同様であった。ＦＩＴＣまたはビオチンのいずれかと結合されたＣｐＧ ＯＤＮは、完全なマイトジェン性特性を維持し、このことは立体障害を有さないことを示した。
【００７４】
最適なＣｐＧモチーフ（ＴＧＡＣＧＴＴ／Ｃ）は、ＣＲＥ（サイクリックＡＭＰ応答エレメント）と同一である。ＣｐＧ ＯＤＮのマイトジェン性効果と同様に、中央のＣｐＧがメチル化された場合には、ＣＲＥＢのＣＲＥへの結合はなくされる。電気泳動移動度シフトアッセイを用いて、ＣｐＧ ＯＤＮ（１本鎖）がＢ細胞ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質のそれらの通常の結合部位（２本鎖ＣＲＥ）への結合と競合し得るかどうかを決定した。競合アッセイにより、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ＯＤＮはＣＲＥＢのその結合部位への結合と競合し得るが、ＣｐＧモチーフを含まないＯＤＮは競合し得ないことが示された。これらのデータは、ＣｐＧ ＯＤＮがある種の様式で１つ以上のＢ細胞ＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質と相互作用することによりそれらのマイトジェン性効果を発揮するという結論を支持する。逆に、ＯＤＮの３’および／または５’端部近傍のＧＣＧ配列または他の非定型ＣｐＧモチーフの存在により、活性化を引き起こさず、阻止さえし得る様式でＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質と相互作用するようである。
刺激ＣｐＧモチーフは、微生物ゲノムＤＮＡに共通であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはきわめてまれである。さらに、細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン（Ｉｇ）産生を誘導することが報告されているが、哺乳動物ＤＮＡは誘導しない（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９（１９９１））。さらに実施例３に記載の実験（この実験で、ＣｐＧメチラーゼを用いる細菌ＤＮＡのメチル化により、マイトジェン性がなくされることが見いだされた）により、ＣｐＧの状態の違いが細菌ＤＮＡによるＢ細胞刺激の原因であることが示された。このデータは以下の結論を支持する：細菌ＤＮＡ内に存在する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが、細菌ＤＮＡの刺激効果の原因となる。
目的論的には、ＣｐＧモチーフによる白血球活性化によって免疫防御メカニズムが代表され、これにより、宿主ＤＮＡと細菌ＤＮＡとが区別され得るようである。宿主ＤＮＡは、そのＣｐＧ抑制およびメチル化に起因してリンパ球活性化をほとんど誘導しないか全く誘導しない。細菌ＤＮＡは、感染組織において選択的なリンパ球活性化を引き起こす。ＣｐＧ経路は抗原レセプターを介するＢ細胞活性化と共働するので、細菌抗原に特異的な抗原レセプターを有するＢ細胞は、細胞膜Ｉｇを介する１つの活性化シグナルと細菌ＤＮＡからの第２のシグナルとを受信し、従って、優先的に活性化される傾向を有する。Ｂ細胞活性化におけるこの経路と他の経路との相互関係が、ポリクローナル抗原を用いて抗原特異性応答を誘導する生理学的メカニズムを提供する。
（免疫刺激オリゴの作製方法）
本発明において使用するために、オリゴヌクレオチドが、当該分野で周知の多くの方法のうちの任意の方法を用いて新たに合成され得る。例えば、β−シアノエチルホスホルアミダイト法（Ｓ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら，（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら，（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７；Ｇａｒｅｇｇら，（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８；Ｇａｆｆｎｅｙら，（１９８８）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２）。これらの化学反応は、種々の市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機により行われ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、公知の技術（例えば、制限酵素、エクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用する技術）を用いて、既存の核酸配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から調製され得る。
【００７５】
インビボでの使用のためには、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる）分解に対して比較的耐性である。オリゴヌクレオチドの安定化は、ホスフェート骨格での修飾により達成され得る。好ましい安定化されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾骨格を有する。ホスホロチオエートＯＤＮの薬物動態学は、それらが齧歯動物において４８時間の全身半減期を有することを示し、そしてそれらがインビボでの適用に有用であり得ることを示唆する（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７５９５）。ホスホロチオエートは、ホスホルアミデートまたはＨ ホスホネート化学のいずれかを使用する自動化技術を用いて合成され得る。アリールおよびアルキルホスホネートが（例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載のようにして）作製され得る；そして、アルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載のようにしてアルキル化される）が、市販の試薬を用いる自動化固相合成により調製され得る。他のＤＮＡ骨格修飾および置換の作製方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５）。
【００７６】
インビボで投与するために、オリゴヌクレオチドは、標的細胞（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面への高親和性結合が得られる分子、および／または標的細胞による細胞の取り込みを増大させる分子に結合されて、「オリゴヌクレオチド送達複合体」を形成し得る。オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の技術を用いて適切な分子にイオン的にまたは共有結合的に結合し得る。種々のカップリング剤または架橋剤（例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））が使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、周知技術を用いてリポソームまたはビロソーム中にカプセル化され得る。
【００７７】
本発明は、以下の実施例（これはさらなる限定として解釈されるべきではない）によりさらに説明される。本出願全体に引用されるすべての参考文献（学術文献、発行された特許、刊行された特許出願および同時係属特許出願を含む）の全体の内容は、本明細書に参考として援用される。
（免疫刺激オリゴの治療的使用）
その免疫刺激特性に基づいて、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、インビボで被験体に投与され、「免疫系不全」を処置し得る。あるいは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、免疫系不全を有する被験体から得られるリンパ球（例えば、Ｂ細胞またはＮＫ細胞）とエクスビボで接触され得、次いで、活性化リンパ球が被験体に再度移植され得る。
【００７８】
免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、アジュバントとしてワクチンと共に被験体に投与され得、被験体の免疫系を増強して、ワクチンからより優れた応答をもたらし得る。好ましくは、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、ワクチン投与の少し前またはワクチン投与と同時に投与される。
【００７９】
免疫刺激オリゴヌクレオチドを用いる先行する化学療法は、引き続く化学療法に対する悪性腫瘍細胞の応答性を増加させるに有用であることが判明するはずである。ＣｐＧ ＯＤＮはまた、ヒトおよびマウス細胞の両方においてナチュラルキラー細胞活性を増加させた。ＮＫ活性の誘導は、ガンの免疫療法において同様に有益であり得る。
（中性オリゴヌクレオチドの治療的使用）
特定の標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドが合成され得、そしてインビボで非検体に投与され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的なｍＲＮＡにハイブリダイズし、これにより特異的な標的遺伝子の発現を防止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列特異的な効果により、それらはタンパク質機能の研究に有用な調査手段となった。全身アンチセンス療法の第Ｉ／ＩＩ相のヒトへの試験が、急性骨髄性白血病およびＨＩＶについて現在行われている。
【００８０】
さらに、オリゴヌクレオチドプローブ（すなわち、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチド）が被験体に投与され得、結合標識の検出に基づいて相補的配列の存在を検出し得る。オリゴヌクレオチドプローブのインビボでの投与および検出は、特定のＤＮＡ配列により引き起こされるかまたは悪化される特定の疾病（例えば、全身性紅斑性狼瘡、敗血症および自己免疫疾患）の診断に有用であり得る。
【００８１】
任意のまたはすべてのＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブは、被験体へのインビボでの投与時に免疫反応を生じさせず、従って、対応する非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドよりも安全である。
【００８２】
治療における使用のために、有効量の適切なオリゴヌクレオチドが、単独で、またはオリゴヌクレオチド送達複合体として処方されて、オリゴヌクレオチドが適切な標的細胞（例えば、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）に取り込まれることを可能にする任意の方法で被験体に投与され得る。好ましい投与経路は、経口および経皮（例えば、パッチによる）を包含する。他の投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、腸管外、腹腔内、包膜内など）が挙げられる。注射は、ボーラスでの注射または連続的な注入であり得る。
【００８３】
オリゴヌクレオチドは、単独で、またはオリゴヌクレオチド送達複合体として、薬学的に受容可能なキャリアと共に投与され得る。本明細書において使用されるように、「薬学的に受容可能なキャリア」という表現は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド送達複合体と同時投与され得、かつ、オリゴヌクレオチドがその意図された機能を実施することを可能にする物質を包含することが意図される。このようなキャリアの例としては、溶液、溶媒、分散媒体、遅延剤、エマルジョンなどが挙げられる。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体の使用は、当該分野で周知である。オリゴヌクレオチドとの使用に適切なあらゆる他の従来のキャリアは、本発明の範囲内にある。
【００８４】
用語「有効量の」オリゴヌクレオチドとは、所望の生物学的効果を実現するに必要または十分な量を意味する。例えば、免疫系不全を処置するための少なくとも１つのメチル化ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドの有効量は、腫瘍、ガン、あるいは細菌性、ウィルス性または真菌性感染症を除去するに必要な量であり得る。ワクチンアジュバントとしての使用のための有効量は、ワクチンに対する被験体の免疫応答を増強するに有用な量であり得る。免疫系活性化に関連する疾病の処置に使用するための非メチル化ＣｐＧを含まないオリゴヌクレオチドの「有効量」は、非メチル化ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列に競合して優るに必要な量であり得る。任意の特定用途についての有効量は、処置されるべき疾病または症状、投与される特定のオリゴヌクレオチド、被験体の大きさ、あるいは疾病または症状の重さなどの要因に応じて変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定のオリゴヌクレオチドの有効量を経験的に決定し得る。
上記で報告された研究によれば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）について直接的にマイトジェン性であることが示される。細菌ＤＮＡにおけるこれらの配列の存在とあわせて、これらの結果は、動物ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドが脱表現されないこと（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）、および、このようなジヌクレオチド中に存在するシトシンの広範囲のメチル化が、宿主ＤＮＡと細菌ＤＮＡとを区別し得る免疫防御メカニズムの存在により説明され得ることを示唆する。宿主ＤＮＡは、通常、多くの解剖学的領域およびアポトーシス（細胞死）による炎症領域に存在するが、一般に、リンパ球活性化をほとんど誘導しないか全く誘導しない。しかし、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡの存在は、それが有益である感染した解剖学的領域において、正確にリンパ球活性化を引き起こし得る。この新規な活性化経路は、Ｔ細胞依存抗原特異的Ｂ細胞活性化の迅速な代替物を提供する。しかし、Ｂ細胞活性化は、全体的には非特異的ではないようである。細菌産物に特異的な抗原レセプターを有するＢ細胞は、細胞膜Ｉｇを介する１つの活性化シグナルおよび細菌ＤＮＡからの第２のシグナルとを受信し得、これにより、抗原特異的免疫応答をさらに激しくトリガーし得る。
【００８５】
他の免疫防御メカニズムについては、細菌ＤＮＡに対する応答は、ある種の場合においては望ましくない結果を有し得る。例えば、自己抗原に対する自己免疫応答もまた、細菌感染により優先的にトリガーされる傾向にある。なぜなら自己抗原が、細菌ＤＮＡによりトリガーされる自己反応性Ｂ細胞に第２の活性化シグナルを提供し得るからである。実際、細菌感染による自己免疫の誘導は、一般的な臨床的観察である。例えば、自己免疫疾患である全身性紅斑性狼瘡は、（ｉ）抗ＤＮＡ抗体の産生により特徴づけられ；（ｉｉ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを阻害する薬物により誘導され（Ｃｏｒｎａｃｃｈｉａ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８（１９９３））；そして、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の減少をともなう（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ ３５：６４７（１９９２））。この疾病は、少なくとも部分的には、ＣｐＧモチーフにより提供される刺激シグナルによるＤＮＡ特異的Ｂ細胞の活性化によって、ならびに抗原レセプターの細菌ＤＮＡの結合によってトリガーされるようである。
【００８６】
さらに、敗血症（免疫系の多量でかつ非特異的な活性化に起因する高い罹患率および死亡率により特徴づけられる）は、多くのリンパ球を直接活性化するに十分な濃度に到達する死滅細菌から放出される細菌ＤＮＡおよび他の産物により発症され得る。
【００８７】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、またはＣｐＧモチーフがメチル化されているオリゴヌクレオチド）を被験体に投与し、非メチル化ＣｐＧ含有核酸配列の結合をブロックすることにより、狼瘡、敗血症および他の「免疫系活性化に関連する疾病」が処置され得、防止され得または改善され得る。非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチドは、単独で、または他のマイトジェン性細菌産物（例えば、ＬＰＳ）に対する免疫細胞応答をブロックする組成物と共に投与され得る。
【００８８】
以下、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドがどのようにして疾病狼瘡を処置し、防止しまたは改善し得るかについて、機構的に説明する。狼瘡は、一般に、細菌性またはウィルス性感染によりトリガーされると考えられている。このような感染は、１本鎖ＤＮＡに対する非病原性抗体の産生を刺激すると報告されている。これらの抗体は、主に非メチル化ＣｐＧを含む細菌配列を認識するようである。狼瘡において疾病が発達するにつれて、抗ＤＮＡ抗体は、２本鎖ＤＮＡに特異的な病原性抗体にシフトする。これらの抗体はメチル化ＣｐＧ配列への結合を増大させ、そしてこれらの産生は狼瘡における寛容の衰弱（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）から生じる。あるいは、患者のＤＮＡが過少メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）し、従って、非メチル化ＣｐＧに特異的な抗ＤＮＡ抗体が自己ＤＮＡに結合させ、そして、「エピトープスプレッディング（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）」と称されるプロセスを介してより広範な自己免疫をトリガーさせた場合に、狼瘡が生じ得る。
【００８９】
いずれの場合にも、抗原性オリゴヌクレオチドをタンパク質キャリア（例えば、γ−グロブリン（ＩｇＧ））にカップリングさせることにより、狼瘡患者の寛容を回復させることが可能であり得る。γ−グロブリンと複合体化した仔ウシ胸腺ＤＮＡは、抗ＤＮＡ抗体形成を減少させることが報告されている。
（両端またはその近傍にＧＣＧトリヌクレオチド配列を含むオリゴの治療的使用）
オリゴヌクレオチドと標的化されるウィルス配列との間の相補性に起因する任意のアンチセンス効果に関係なく、ＣＲＥＢ／ＡＴＦとのその相互作用に基づいて、両端またはその近傍にＧＣＧトリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドは、抗ウィルス活性を有する。この活性に基づいて、阻害オリゴヌクレオチドの有効量が、被験体に投与されてウィルス感染を処置または防止し得る。
【００９０】
【実施例】
（実施例１：Ｂ細胞全ＲＮＡ合成および細胞周期に対するＯＤＮの効果）
抗−Ｔｈｙ−１．２および補体を用いてＴ細胞を放血し、ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）で遠心分離した、６〜１２週齢で特定の病原体を有さないＤＢＡ／２またはＢＸＳＢマウス（アイオワ大学動物管理施設で飼育された；実質的な系統の違いは示されなかった）から得られた脾臓からＢ細胞を精製した（「Ｂ細胞」）。Ｂ細胞は、１％未満のＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を含んでいた。１０％ＦＢＳ（６５℃で３０分間熱失活させた）、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタメートを含む１００μｌ ＲＰＭＩ中の８×１０４のＢ細胞を、９６ウェルのマイクロタイタープレートに３連で分配した。２０μＭのＯＤＮを、３７℃で２０時間の培養開始時に加え、１μＣｉの３Ｈウリジンで細胞をパルスし、そして４時間後に細胞を回収し、そしてカウントした。２０μＭのＯＤＮとともに脾臓細胞全体を４８時間培養した後、ＥＬＩＳＡスポットアッセイを用いてＩｇ分泌Ｂ細胞を数えた。データ（表１に報告する）は、ＯＤＮなしで培養した細胞と比較した刺激指数を表す。本実験においては、ＯＤＮなしで培養した細胞は６８７ｃｐｍを与えたが、一方、２０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（最適濃度であることを滴定により決定した）と共に培養した細胞は９９，６９９ｃｐｍを与えた。３Ｈチミジン取り込みアッセイは、同様の結果を示したが、分解したＯＤＮから放出されたチミジンによる非特異的阻害をいくらか示した（Ｍａｔｓｏｎ，ＳおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ（１９９２），「コントロールオリゴヌクレオチドによる３Ｈ−チミジン取り込みの非特異的抑制」，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２：３２５）。
【００９１】
細胞周期分析のために、２×１０６のＢ細胞を、２ｍｌの組織培養培地単独で、または３０μｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、または１μＭの示されたホスホロチオエート修飾ＯＤＮと共に、４８時間培養した。Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２８８１（１９８１）に記載のようにして、細胞周期分析を行った。
【００９２】
ヒト細胞に対するＣｐＧ ＯＤＮのマイトジェン性効果を調べるために、２人の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（循環細胞が悪性腫瘍Ｂ細胞である疾病）患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。上記のようにして、細胞を４８時間培養し、トリチウム化チミジンで４時間パルスした。
（実施例２：Ｂ細胞由来のＩｇＭ産生に対するＯＤＮの効果）
新たに殺したマウスの脾臓由来の単一細胞懸濁液を、Ｌｅｉｂｓｏｎらの方法（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１６８１（１９８１））により抗−Ｔｈｙｌ、抗−ＣＤ４、および抗−ＣＤ８ならびに補体で処理した。休止Ｂ細胞（＜，０２％のＴ細胞混入）を、ＤｅＦｒａｎｃｏらの手順（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５：１５２３（１９８２））により非連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配の６３〜７０％バンドから単離した。上記のようにして、これらを３０μＭ ＯＤＮまたは２０μｇ／ｍｌ ＬＰＳ中で４８時間培養した。ＥＬＩスポットアッセイ（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：５０６（１９９０））により決定したところ、活発にＩｇＭを分泌するＢ細胞の数はこの時点で最大であった。このアッセイにおいては、Ｂ細胞を抗Ｉｇでコートされたマイクロタイタープレート上で６時間インキュベートした。それらが産生したＩｇ（＞９９％ ＩｇＭ）を、ホスファターゼ標識抗Ｉｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を用いて検出した。個々のＢ細胞により産生された抗体を、ホスファターゼの存在下で不溶性青色沈殿を形成するＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えることにより視覚化した。２０〜４０のスポット／ウェルを生じる細胞の希釈を用いて、抗体分泌Ｂ細胞／試料の総数を決定した。すべてのアッセイを３連で行った。いくつかの実験において、培地の上清をＥＬＩＳＡによりＩｇＭについてアッセイしたところ、ＣｐＧ−ＯＤＮに対する応答の同様な増加を示した。
（実施例３：細菌ＤＮＡによるＢ細胞刺激）
ＤＢＡ／２ Ｂ細胞を、ＤＮＡなしで、あるいは、５０μｇ／ｍｌの（ａ）Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ；（ｂ）ＮＺＢ／Ｎマウス脾臓；およびＮＦＳ／Ｎマウス脾臓ゲノムＤＮＡと共に４８時間培養し、次いで、３Ｈチミジンで４時間パルスし、そして、その後細胞を回収した。２連のＤＮＡ試料を、３７℃で３０分間ＤＮＡｓｅＩで消化し、次いで、細胞培養物に加えた。ＥＬＩＳＡスポットアッセイを用いると、Ｅ ｃｏｌｉ ＤＮＡもまた、４８時間までＩｇＭ分泌Ｂ細胞の数の８．８倍の増加を誘導した。
【００９３】
ＤＢＡ／２ Ｂ細胞を、添加物なしに、あるいは、５０μｇ／ｍｌのＬＰＳまたは２０μＭのＯＤＮ １；１ａ；４；または４ａとともに培養した。細胞を培養し、そして４、８、２４および４８時間後に回収した。実施例１と同様にして、ＢＸＳＢ細胞を、５、１０、２０、４０または８０μＭのＯＤＮ １；１ａ；４；または４ａあるいはＬＰＳと共に培養した。この実験において、ＯＤＮを含まないウェルは３８３３ｃｐｍを有していた。各実験を少なくとも３回行い、同様の結果を得た。３連のウェルの標準偏差は＜５％であった。
（実施例４：ナチュラルキラー（ＮＫ）活性に対するＯＤＮの効果）
１０×１０６のＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を、２ｍｌのＲＰＭＩ（実施例１に記載のように補充した）中で、４０μＭのＣｐＧまたは非ＣｐＧ ＯＤＮの存在下または非存在下で４８時間培養した。細胞を洗浄し、次いで、２つのＮＫ感受性標的細胞株（ＹＡＣ−１および２Ｃ１１）を用いる短期５１Ｃｒ放出アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた（Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１７）。０．２ｍｌ中Ｖ底マイクロタイタープレート中の１０４の５１Ｃｒ標識標的細胞に、種々の濃度でエフェクター細胞を加え、そして５％ＣＯ２中、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離し、上清のアリコートを放射能についてカウントした。エフェクター細胞の存在下で放出された５１Ｃｒから標的細胞単独で培養された場合に放出された５１Ｃｒ放出を引いた値の、２％酢酸中での細胞溶解後に放出された総カウントから細胞単独で培養された場合に放出された５１Ｃｒ ｃｐｍを引いた値に対する比率を計算することにより、特異的溶解パーセントを決定した。
（実施例５：ＣｐＧホスホロチオエートＯＤＮについてのインビボでの研究）
マウスを計量し、０．２５ｍｌの滅菌ＰＢＳまたはＰＢＳに溶解した示されたホスホロチオエートＯＤＮをＩＰで注射した。２４時間後、脾臓細胞を回収し、洗浄し、そして、Ｂ細胞のゲートのためのファイコエリトリン結合６Ｂ２を、ビオチン結合抗Ｌｙ−６Ａ／Ｅまたは抗Ｉａｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または抗Ｂｌａ−１（Ｈａｒｄｙ，Ｒ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１１６９（１９８４））と組み合わせて用いて、フローサイトメトリーのために染色した。それぞれの条件について２匹のマウスを調べ、個々に分析した。
（実施例６：Ｂ細胞刺激についてのホスホロチオエートＯＤＮの滴定）
コントロールＯＤＮ １ａ、またはＣｐＧ ＯＤＮ １ｄおよび３Ｄｄの配列を有するホスホロチオエートＯＤＮと共にＢ細胞を培養し、次いで、２０時間後に３Ｈウリジン、または４４時間後に３Ｈチミジンのいずれかでパルスし、次いで、細胞を回収し、そしてｃｐｍを決定した。
（実施例７：アポトーシスからのＢ細胞のレスキュー）
ＷＥＨＩ−２３１細胞（５×１０４／ウェル）を、ＬＰＳあるいはコントロールＯＤＮ １ａまたはＣｐＧ ＯＤＮ １ｄおよび３Ｄｄの存在下または非存在下、３７℃で１時間培養し、次いで、抗ＩｇＭ（１μ／ｍｌ）を加えた。細胞をさらに２０時間培養し、次いで２μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンで４時間パルスした。この実験において、ＯＤＮも抗ＩｇＭも加えない細胞は、抗ＩｇＭの添加により９０．４×１０３を与えた。表１に示すホスホジエステルＯＤＮは、ＯＤＮ分解に起因する非特異的抑制をいくらか示すものの、同様の保護を与えた。各実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。
（実施例８： ＩＬ−６のインビボでの誘導）
ＤＢＡ／２雌性マウス（２ヶ月齢）に、５００μｇのＣｐＧまたはコントロールホスホロチオエートＯＤＮをＩＰで注射した。注射後、種々の時点で、マウスを採血した。２匹のマウスを各時点について調べた。ＩＬ−６をＥｌｉｓａにより測定し、そしてＩＬ−６濃度を組換えＩＬ−６を用いて得られる標準曲線と比較することにより計算した。アッセイの感度は、１０ｐｇ／ｍｌであった。レベルは８時間後に検出不能であった。
（実施例９：Ｂ細胞ＣＲＥＢ／ＡＴＦの放射性標識２本鎖ＣＲＥプローブ（ＣＲＥＢ）への結合）
ＣＲＥプローブ（遊離プローブは、像の底部から離れている）を用いるＥＭＳＡにより分析すると、ＣＨ１２．ＬＸ Ｂ細胞由来の全細胞抽出物は、２つの遅延バンドを示した。ＣＲＥへのＣＲＥＢ／ＡＴＦタンパク質の結合は、示された量のコールドＣＲＥおよび１本鎖ＣｐＧ ＯＤＮにより競合されたが、非ＣｐＧ
ＯＤＮによっては競合されなかった。
（等価物）
当業者は、日常的な実験程度を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様の多くの等価物を認識し、または確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【００９４】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、およびこのオリゴヌクレオチドの被験体における免疫応答を刺激する能力に基づく治療的有用性が開示される。また、被験体における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドにより開始される免疫系の活性化に関連する疾病を処置するための治療法が開示される。この治療法は、非メチル化ＣｐＧ配列（すなわち、メチル化ＣｐＧ配列またはＣｐＧ配列なし）を含まないオリゴヌクレオチドを被験体に投与し、非メチル化ＣｐＧ核酸を結合について競合して優る工程を包含する。さらに、アンチセンス療法において使用するための、またはインビボでのハイブリダイゼーションプローブとして使用するためのメチル化ＣｐＧ含有ジヌクレオチド、ならびに抗ウィルス治療剤として使用するための免疫阻害オリゴヌクレオチドが開示される。
【００９５】
【発明の効果】
本発明によって、新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物、このオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性に基づく有用な方法、中性オリゴヌクレオチド、中性オリゴヌクレオチドを用いる有用な方法、および免疫阻害オリゴヌクレオチド、免疫阻害オリゴヌクレオチドの種々の使用が提供される。
【００９６】
【配列表】
Claims (9)
- 少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、該非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、以下の式
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
で表され、該Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４がヌクレオチドであり、
ここで該オリゴヌクレオチドは、８〜１００個のヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、５’Ｘ １ Ｘ ２ ＣＧＸ ３ Ｘ ４ ３’のパリンドロームを含まない、ワクチンアジュバントとしての使用のための組成物。 - 請求項１に記載の組成物およびワクチンを含む、医薬としての使用のための組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが合成である、請求項１または２に記載の組成物。
- 以下：
（ａ）ヒト被験体；または
（ｂ）非ヒト脊椎動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラットまたはマウス、
を処置するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格修飾を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記Ｘ１Ｘ２は、ＴｐＣジヌクレオチドまたはＴｐＴジヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド送達複合体の形態で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ステロールまたはカチオン性脂質と会合している、請求項７に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、８ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
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