KR100906970B1

KR100906970B1 - 피부 면역질환에 대한 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드의치료학적 용도

Info

Publication number: KR100906970B1
Application number: KR1020070054604A
Authority: KR
Inventors: 김태윤; 권형주; 김두식
Original assignee: 주식회사 바이오씨에스; 신동헌
Priority date: 2006-06-03
Filing date: 2007-06-04
Publication date: 2009-07-10
Also published as: KR20070115808A

Abstract

본 발명은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고 면역조절능력이 증가된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드에 관한 것으로, 바람직하게는 서열번호 1 내지 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역반응 증강제 또는 면역반응 치료용 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 이를 포함하는 피부면역질환의 치료 또는 예방용 조성물 및 상기 올리고데옥시뉴클레오티드를 이용하여 피부면역질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 피부면역질환

Description

피부 면역질환에 대한 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드의 치료학적 용도 {Therapeutic use of CpG oligodeoxynucleotide for skin immune disease}

도 1은 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합 형태로 합성한 면역반응 조절용 올리고뉴크레오타이드 BD-ODN 4 종류를 농도 의존적으로 처리한 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 IL-8 프로모터 활성화를 보여 주는 그림이다.

도 2는 면역반응 조절용 올리고뉴클레오타이드 BD-ODN 4종류의 골격(backbone)을 포스포디에스테르(phosphodiester) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 형태로 합성하여 IL-8 프로모터 활성화에 미치는 영향을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 비교한 그림이다.

도 3은 포스포로티오에이트 골격(phosphorothioate backbone) 형태를 RAW 264.7 세포주에 자극하였을 때 NF-κB 를 활성화 시키는 것을 보여주는 그림이다. RAW 264.7 세포를 BD-ODN (10 ㎍/㎖)으로 30 분간 처리 후 세포를 고정한 다음 NF-κB p65-specific antisera로 간접면역형광법을 수행하여 NF-κB 의 위치를 확인한 그림이다.

도 4는 후보 4 종류의 BD-ODN을 포스포디에스테르(phosphodiester) 골격 형태로 합성하여 HEL(hen egg lysozyme) 에 의해 복강면역화된 Balb/c mice의 체액반 응을 보여주는 그림이다.

도 5는 IL-12 p40의 및 IFN-γ 생산을 본 발명에 따른 BD-ODN 의 골격 변형에 따른 효과를 비교 조사한 결과이다. 그림 a)는 BD-ODN을 Balb/c mice 에 복강면역화한 후 혈청에서 IL-12 p40의 생산을 확인한 그림이다. 그림 b)는 BD-ODN을 Balb/c mice에 복강면역화한 후 혈청에서 IFN-γ의 생산을 확인한 그림이다.

도 6은 마우스에서 자외선 조사로 인한 지연형 면역 반응(contact hypersensitivity)이 억제되는 것에 대하여 본 발명의 CpG ODN을 처리시 지연형 면역반응이 회복되는 것을 보여주는 실험 일정을 나타낸 것이다.

도 7은 마우스에서 자외선 조사로 유도된 특이 항원 (TNCB, Trinitrochlorobenzene)에 대한 지연형 면역 반응 (contact hypersensitivity)이 억제되는 것에 대한 본 발명의 CpG ODN을 처리시 지연형 면역반응의 회복 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 자외선 조사로 유도된 특이 항원 (TNCB)에 대한 지연형 면역 반응 (contact hypersensitivity)이 억제된 마우스에서 비장으로부터 분리한 TNP (trinitrophenyl) 특이 항원 T 세포 증식 반응 (T cell proliferation responses)에 대한 본 발명의 CpG ODN의 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 자외선 조사로 유도된 특이 항원 (TNCB)에 대한 지연형 면역 반응 (contact hypersensitivity)이 억제된 마우스에서 분리한 혈청 내 IgE 수준을 조사한 결과이다.

도 10은 자외선 조사로 유도된 특이 항원(TNCB)에 대한 지연형 면역 반응 (contact hypersensitivity)이 억제된 마우스 귀조직의 조직병리학적 변화에 대한 본 발명의 CpG ODN의 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 TMA (trimetillic anhydroxide)을 이용하여 type 2 면역반응이 활성화되는 것에 대하여 본 발명의 CpG ODN을 처리시 type 1 면역반응이 회복되는 것을 보여주는 실험 일정을 나타낸 것이다.

도 12는 마우스에서 TMA로 유도된 type 2 특이 항원에 대한 지연형 면역 반응 (contact hypersensitivity)이 억제되는 것에 대한 본 발명의 CpG ODN을 처리시 귀부종 변화를 TMA 유발 날짜에 따른 변화 (A)와 마지막 유발시의 귀부종 변화 (B)를 나타낸 것이다.

도 13은 TMA로 유도된 type 2 면역 특이 항원에 대한 지연형 면역 반응(contact hypersensitivity)이 억제된 마우스에서 혈장에서 분리한 IgE 수준을 조사한 결과이다.

본 발명은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고 면역조절능력이 증가된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 이를 포함하는 피부면역질환 치료 또는 예방용 조성물, 및 이를 이용하여 피부면역질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

피부질환은 사람을 포함하는 동물의 피부에서 나타나는 모든 이상소견을 말한다. 그 중에서도 아토피 피부염은 만성/염증성 피부질환으로서 심한 소양증, 건조한 피부 및 습진성 피부병변이 특징적인 주 증상이다(Rudikoff, D. et al., Lancet. 351:1715-1721, 1998). 아토피 피부염은 일반적으로 유전적 경향이 있으며 개개인에 따라 알레르기 천식, 알레르기 비염, 알레르기 결막염 및 담마진(urticaria)을 동반하기도 한다. 아토피 피부염 환자에서 보고된 일련의 면역학적 이상 소견으로는 IgE 생성의 증가, IFN-γ를 분비하는 Th1(T-cell Helper type 1) 림프구의 수적 감소 등이 있다. 또한 아토피 피부염은 조직학적으로 CD4⁺ 표현형을 갖는 T 림프구, 단핵구/대식 세포의 침윤, 비만 세포 및 호산구가 피부 병변에 증가되어 있으며, 수지상 세포(dendritic cells; DCs)와 표피의 랑게르한스 세포도 아토피 피부염의 피부 병변에서 증가되어 있다(Imokawa, G., et al., J. Invest. Dermatol., 96:523-526, 1991). 이와 같은 현상은 병변 부위가 아닌 정상 부위에서도 나타나는 것으로 조사되었다(Leung DY, Bhan AK, Schneeberger EE, Geha RS. J Allergy Clin Immunol., 71(1 Pt 1), 47-56, 1983). 최근에 CCR4-발현 메모리(expressing memory) CD4⁺ T 림프구의 수가 아토피 피부염의 병변 부위에서 증가한다고 보고되었다(Imai, T. et al., Int. Immunol., 11:81-88, 1999). 또한 Van der Heijden FL 등은 병변 내 침윤된 CD4⁺ 표현형을 갖는 T 림프구들이 주로 IL-4를 유리한다는 것을 보고했으며(Van der Heijden FL et al., J Invest Dermatol., 97:389-394, 1991), 이들 IL-4의 작용에 의해 항원 전달세포에서 면역글로불린 E에 대한 낮은 결합력 Fc 수용체(low-affinity Fc receptor)가 항진된다고 했다.

또한 T 림프구 및 이로부터 유리되는 여러 사이토카인들이 아토피 피부염의 면역 병리학적 발생기전과 밀접한 관계가 있다는 실험적 근거들이 최근에 보고되었다. 아토피 피부염 환자에서 IL-4, IL-5와 IL-10을 생성하는 알러젠-특이적 T 헬퍼 타입 2(allergen-specific T helper type2) 림프구들이 염증이 일어난 병변 부위에서 증가되며, 이것이 알러지 반응과 IgE의 증가 모두에서 중요한 영향을 미친다고 보고되어 있다(hussain, I. et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy., 2:199-120, 2003). 또 다른 연구자들은 아토피 피부염과 관련된 케모카인과 그들의 수용체들이 피부장벽에서 중요한 역할을 하는 것을 조사하였다. 그 결과, 아토피 피부염 환자의 각질형성 세포로부터 많은 양의 TSLP(thymic stromal lymphopoietin)과 MDC(macrophage-derived chemokine)가 생성되며, IFN-γ의 자극시 많은 양의 RANTES, TARC, MDC을 생성한다는 것을 보고하였다(Giustizieri, ML. et al.,J. Allergy Clin Immunol., 107:871-877, 2001).

한편, 일반적으로 척추동물이 진화하는 과정에서 면역체계는 몇 종류의 특징적인 미생물의 분자들을 인식하여 미생물의 침입에 대하여 면역 활성이 빠르게 일어나도록 발달하였다. 여러 연구자들의 보고에 의하면 박테리아 DNA는 척추동물의 DNA에는 존재하지 않는 여러 가지 구조 결정인자가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이 인자들이 면역세포를 활성화시킨다고 알려졌다(Gillkeson, GS. et al., J. Clin. Invest., 95:1398-1402, 1995). 척추동물과 박테리아 DNA의 특징적인 차이점 은 척추동물의 유전체는 CpG가 억제되어 있고, 또한 CpG 모티프 디뉴클레오티드 (dinucleotide)에서 시토신 (cytosine)의 70%가 메틸화 (methylation) 되어있다는 것이다 (Krieg, AM. et al., Nature 374:546-549, 1995). 비메틸화된 CpG 모티프들 (unmethylated CpG motifs)은 박테리아에서 매우 흔하나, 포유동물에서는 그렇지 않다. CpG 모티프를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드(oligodeoxynucleotide, ODN)는 선천적 (innate) 면역 반응에서 획득된 면역 반응 (acquired immune responses)에 이르는 숙주의 방어 기작을 활성화시킨다 (Akdis, CA. Curr Opin Immunol., 12:641-646, 2000). 일반적으로 CpG ODN은 B 세포와 NK 세포를 모두 활성화시킬 수 있다. 또한 CpG 서열은 NK 세포로부터 IFN-γ 생성의 잠재적인 유도체인 IL-12를 분비하기 위해 대식세포 (macrophages)를 자극한다 (Krieg, AM. Annual Review Immunol., 20:709-760, 2002). 동시에, 이러한 세포는 IL-1, IL-6, IL-18 및 TNF-α과 같은 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)과 IFN-γ 및 IL-12와 같은 Th1-biased 면역 환경을 만드는 사이토카인 또는 케모카인을 분비한다. 더욱이, CpG ODN은 IgG2a 아이소타입 (isotypes)(Th1 type indicator)쪽으로 유도하는 체액성 반응 (humoral responses)을 증진시키며, 증가된 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) 활성화를 유도한다 (Warren, TL. et al., J. Immunol., 165:6244-6251, 2000). 동물 모델에서 알러지 현상과 암 치료를 위한 CpG ODN의 사용은 직접적이거나 간접적인 면역 반응 증진에 매우 효과적인 방법이다. 이러한 CpG ODN은 동일한 CpG 모티프를 가지고 있다고 하더라도 그 염기서열에 따라 다른 생리적 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

최근에는 CpG ODN의 유용성을 높이기 위하여 골격 (backbone)을 변형시킨 CpG ODN이 개발되었다. DNA의 기본 골격인 포스포디에스터(phosphodiester) 골격의 CpG ODN은 뉴클레아제에 대해 민감한 편이어서 체내에서 빠르게 분해된다. 따라서 생체 내에서 독성을 유발할 위험이 적다. 그러나, 다른 골격의 CpG ODN에 비해 그 활성이 낮은 것으로 알려져 있다 (Kwon, HJ. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 311:129-138, 2003 Lee, KW. et al., Mol. Immunol. 41:955-964, 2004). 이에 반해, 포스포로티오에이트 골격(phosphorothioate backbone)의 CpG ODN은 체내에서 뉴클레아제에 의해 분해되지 않도록 구조를 변경하여 인위적으로 만들어진 것이다. 포스포로티오에이트 골격의 CpG ODN은 포스포디에스터 골격의 CpG ODN에 비해 체내에서 안정하고 B 세포를 유도하는 능력이 더욱 뛰어나다. 따라서 현재 포스포로티오에이트 골격으로 변형시킨 CpG ODN이 가장 널리 사용되고 있다. 그러나, 이러한 포스포로티오에이트 골격의 CpG ODN은 수많은 단백질에 비특이적인 ODN의 결합을 증가시키며, 체내에서 쉽게 분해되지 않기 때문에 독성을 유발한다. 또한 포스포로티오에이트 골격의 CpG ODN가 관절염 (arthritis)의 유발 및 증상을 악화시키고 (Deng GM et al., Arthritis & Rheumatisum, 43(2):356-364, 2000; Masayuki Miayta et al., Arthritis & Rheumatisum, 43(11):2578-2582, 2000), SLE (systemic lupus erythematosis)와 같은 자가면역 질환을 일으킬 수 있다고 보고된 바 있다(Tanaka, T. et al., J Exp. Med. 175:597-607, 1992; Hans-Joachim Anders et al., The FASEB Journal express article 10. 1096/fj. 03-0646fje. published online January 20, 2004). 이외에도 포스포로티오에이트 골격을 가지는 CpG ODN의 부작용에 대하여 여러 연구자들이 보고하였다 (Tsunoda I. et al., Brain Pathol., 9(3):481-493, 1999; Bachmaier K. et al., Science, 283(5406):1335-1339, 1999).

이와 같이 이러한 CpG ODN은 현재 면역 활성제로서의 용도에 대해서만 광범위하게 연구되어 있을 뿐, 피부질환의 치료 및 예방 효과에 대해서는 연구된 바 없으며, 특히 포스포디에스터 골격을 가지는 CpG ODN의 피부질환의 치료 및 예방 효과에 대하여 전혀 연구된 바 없다.

본 발명의 하나의 목적은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고 면역조절능력이 증가된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 특히 서열번호 1 내지 8의 핵산서열을 가지는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 피부면역질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 피부면역질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드에 관한 것이다.

SYYSSACGTTGSCGAWMYTC

AXSSWXTCGXWXCGTTCGSC

여기에서, S는 G 또는 C이고, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이고, M은 A 또는 C이고, X는 A 또는 G이다.

특히, 본 발명은 서열번호 1 내지 8, 바람직하게는 서열번호 5 내지 8의 핵산 서열을 가지는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, 'CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (oligodeoxynucleotide, 이하 'CpG ODN'이라 함)'는 CpG 모티프를 적어도 2개 이상 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드를 말한다. 상기 'CpG 모티프 (motif)'라 함은 포스페이트 결합(phosphate bond)으로 연결된 비메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(unmethylated cytosine-guanine dinucleotide)(또는 'unmethylated cytosine-phosphate-guanine dinucleotide'라고도 함)를 함유하며 면역반응을 활성화시키는 염기서열을 말한다. 본 발명의 CpG ODN은 구체적 양태로서 서열번호 1 내지 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이며, 바람직하게는 서열번호 5 내지 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 5 또는 서열번호 7인 CpG ODN이다.

본 발명의 CpG ODN은 천연 공급원(예: 대장균의 염색체 DNA)으로부터 유래될 수도 있으며, 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 CpG ODN은 당업계에 공지된 다양한 핵산 합성 기술 및 기계를 이용하여 합성될 수 있다 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Chs 2. and 4., Wiley Interscience, 1989; Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Lab., New York, 1982); 미국 특허 제4,458,066호 및 미국 특허 제4,650,675호). 또한 제한효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 이용하여 이미 존재하는 핵산 서열로부터 제조될 수도 있다.

본 발명의 CpG ODN은 포스포디에스터 골격을 갖는 것이 바람직하다. DNA의 기본 골격인 포스포디에스터 골격은 생체 내 뉴클레아제에 의해 쉽게 분해되기 때문에 독성을 유발할 위험이 적다. 본 발명의 CpG ODN은 포스포디에스터 골격이라 할지라도 종래 다른 CpG ODN과는 달리 시험관 내뿐 아니라 생체 내에서 뛰어난 면역 활성을 나타낸다는 특징이 있다. 또한 본 발명의 CpG ODN은 변형된 골격 (modified backbone)을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 골격의 변형은 생체 내에 투여될 때 CpG ODN의 활성 및/또는 안정성을 강화시킬 수 있음이 알려져 왔다. 본 발명의 CpG ODN에 있어서 바람직한 골격의 변형으로는 분해에 내성을 갖게 하는 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 포스포로티오에이트 변형은 말단에서 일어날 수 있으며, 예컨대 마지막 2개 또는 3개의 5' 또는 3' 뉴클레오티드가 포스포로티 오에이트 결합에 의해 연결될 수 있다. 또한 본 발명의 CpG ODN은 분해에 내성을 갖도록 하는 2차 구조 (예: 스템 루프 구조)를 포함하도록 변형될 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 부분적 포스포로티오에이트 변형된 골격을 가지도록 변형될 수 있다. 포스포로티오에이트는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 이용하여 자동화된 기술에 의해 합성될 수 있다 (S. E. Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22:1859, 1981; Connolly et al., Biochemistry, 23:3443, 1984; Agrawal et al., Proc. Antl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7079-7083, 1988; Garegg et al., Tetrahedron Lett., 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acidv . Res., 14:5399-5407, Garegg et al., Tetrahedron Lett., 29:2619-2622, 1988). 또 다른 변형인 아릴- 및 알킬- 포스포네이트는 예컨대 미국 특허 제4,469,863호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 알킬포스포트리에스테르 (하전된 산소 잔기가 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 기술된 바와 같이 알킬화됨)가 시판 시약을 이용하여 자동화된 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다. 또 분해에 덜 민감하도록 하는 또 다른 변형은 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 티오- 및 이와 유사한 변형뿐만 아니라 이노신 및 퀘신과 같은 비전형 염기를 포함하는 것이다. 테트라에틸글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜과 같은 디올을 말단으로 포함하는 CpG ODN도 분해에 보다 내성적이다. 이외에도 포스포디에스터와 포스포로티오에이트의 조합, 포스포트리에스터, 포스포라미네이트, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오네이트, 포스포로디티로에이트 및 이들의 조합이 포함된다 (Khorana et al ., J. Molec . Biol., 72:209, 1972; Reese, Tetrahedron Lett., 33:3143-3179, 1978; Jaget et al., Biochemistry., 27:7237, 1988; Agㅇrawal et al., Proc. Antl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7079-7083, 1988; Uhlmann, E. et al., Chem. Rev., 90:544, 1990; Goodchild, J. Bioconjugate Chem., 4:165, 1990). 이와 같이 골격이 변형된 CpG ODN은 강화된 뉴클레아제 저항성 (enhanced nuclease resistance), 증가된 세포 흡수 (increased cellular uptake), 증가된 단백질 결합 (increased protein uptake) 및/또는 변경된 세포내 위치화 (altered intracellular localization) 등을 통해 더 강력한 면역효과를 보일 수 있다.

본 발명의 CpG ODN의 바람직한 골격은 포스포디에스터 (이하, 'O형'이라 함) 또는 포스포로티오에이트 (이하, 'S형'이라 함) 골격이며, 가장 바람직한 골격은 생체 내에서 쉽게 분해되어 부작용을 유발하지 않는 O형 골격이다.

본 발명자는 국제출원 PCT/KR2005/003717에서 CpG ODN이 Th1/Th2 면역반응의 평형을 조절한다는 것을 밝혀냈으며, 또한 이의 연구를 계속한 결과 상기 화학식 1 또는 2, 바람직하게는 서열번호 1 내지 8의 핵산서열을 가지는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드도 Th1/Th2 면역반응의 평형을 조절함에 효과적임을 밝혀내었다.

즉, 본 발명의 CpG ODN은 Th2 사이토카인 (예: IL-4, IL-10)을 억제하거나 또는/및 Th1 사이토카인 (예: IL-12, IFN-γ)을 유도함으로써 Th1/Th2 면역반응의 평형 (balance)을 조절하는 생리적 활성을 가진다. 구체적으로, 본 발명의 CpG ODN 은 대식세포, 백혈구 세포 및 수지상 세포를 활성화하여 IL-12 및/또는 INF-γ의 발현을 유도한다. 또한 본 발명의 CpG ODN은 자외선을 이용하여 면역반응이 억제된 실험동물에서 면역 세포를 활성화시키고, T 림프구와 말초 혈액 단핵구 세포의 증식을 유도하며 혈청 내 IgE 수준을 증가시켜 면역반응을 회복시킨다. 나아가 종래 알려진 CpG ODN과는 달리 본 발명의 CpG ODN은 골격의 형태에 관계없이 거의 동일한 활성을 나타낸다는 점에 특징이 있다.

따라서, 본 발명은 상기 CpG ODN를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, Th2 사이토카인을 억제하거나 및/또는 Th1 사이토카인을 유도하는 방법 및 면역반응을 자극하는 방법을 제공한다.

이에 본 발명은 하나의 양태로서, 상기 CpG ODN을 포함하는 피부면역질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 및 이를 개체에 투여하여 피부면역질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 CpG ODN에 의해 억제되는 Th2 사이토카인은 Th2 세포에서 분비되는 사이토카인을 모두 포함한다. 예컨대, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 등이 있다. 또한 본 발명의 CpG ODN에 의해 유도되는 Th1 사이토카인은 Th1 세포에서 분비되는 사이토카인을 모두 포함하며, IL-12, IFN-γ 등이 있다. 본 발명에서 '면역 반응을 자극한다'는 것은 수지상 세포의 활성화, 면역세포 (예: T 림프구, 말초혈액 단핵 구 세포)의 증식 유도, 염증관련 사이토카인 (예: TNF-α, MIP-2, IL-1, IL-12)의 유도 및/또는 자외선 조사에 의한 면역 억제 반응의 회복을 유도하는 것을 말한다.

또한 본 발명에 따른 CpG ODN은 상기와 같은 활성을 통해 피부질환의 치료 또는 증상 개선의 효과를 나타낸다. 그러므로 본 발명의 CpG ODN은 피부질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 CpG ODN을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 피부질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명에 방법이 적용될 수 있는 피부질환은 Th1/Th2 면역반응의 평형에 이상이 생겨 유발되는 질환, 즉 Th2-림프구에 의해 매개되는 사이토카인의 과발현; Th1-림프구에 의해 매개되는 사이토카인의 저발현; 혈청 내 IgE 수치의 증가; CD8⁺ 표현형 T 림프구 및/또는 CD4⁺ 표현형 T 림프구의 수적 이상 및 기능적 이상 및 수지상 세포 및/또는 대식세포의 활성 저하로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로 인해 유발되는 피부질환일 수 있다. 특히, 본 발명의 CpG ODN에 의해 치료/예방될 수 있는 피부질환은 Th1 사이토카인인 IL-12의 발현 저하로 인하여 유발되거나 IL-12의 발현 또는 생성을 증가시킴으로써 치료될 수 있는 피부질환일 수 있다.

IL-12는 초기 감염에 대하여 생성되는 선천 면역 (innate immunity)을 증폭시키는 기능을 할 뿐 아니라, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 APCs (antigen presenting cells)와 T 세포와의 상호작용에 관여함으로써 보다 효과적인 획득 면역반응 (adaptive immune response)을 유도하는데 매우 중요한 역할을 하고 있다. 수지상 세포나 대식세포와 같은 APCs로부터의 IL-12의 생성은 크게 T 세포 비의존적 기작과 T 세포 의존적 기작으로 나뉜다. T 세포 비의존적 기작은 바이러스나 박테리아를 포함하는 감염성 제제(infectious agents) 또는 그 생성물인 LPS나 박테리아 DNA에 의해서 유도되는데 (D' Andrea A et al., J. Exp. Med., 176:1387, 1992; Sato T et al., Science273:352-354, 1996), 이 기작은 선천 면역과 획득 면역을 연결시켜주는 매개체로서의 IL-12의 면역학적 중요성을 제시해준다. 또한 T 세포 의존적인 IL-12 생성 기작은 주로 CD40 리간드와 같은 분자를 통한 동시-자극적 신호(co-stimulatory signal)를 제공하는 활성화된 T 세포와의 상호작용을 통해 유도되는데 (Shu U et al., Eur. J. Immunol., 25:1125-1128, 1995; Cella M et al., J. Exp. Med., 184:747-752, 1996), 이는 획득 면역 형성에 있어서 세포독성 T 세포 증식 및 세포독성의 증가나 Th1 면역반응의 지속적인 유지와 같은 T 세포 면역 반응을 유도하는데 IL-12가 중요한 역할을 함을 나타낸다. IL-12는 주로 APCs로부터 생성되는데, 수지상 세포나 대식세포에 직접 작용하여 IFN-γ의 생성을 유도한다. 또한 IL-12는 활성화된 T 세포에도 작용할 수 있는데, T 세포로부터 IFN-γ의 생성을 유도하며 IFN-γ에 의해 유도되는 면역반응을 조절할 수 있다(Chan SH et al., J. Exp. Med., 173:869-879, 1991).

이러한 IL-12가 다양한 질환과 관계있음이 알려져 있다. 그 예로는 아토피 피부염 및 알러지 피부질환 (Neumann C., et al., J Mol Med., 74: 401-406, 1996; Aiba S., et al., Exp Dermatol., 12: 86-95, 2003; Nilsson C., et al., Clin Exp Allergy., 34: 373-380, 2004), HIV, 헤르페스 바이러스 감염(Herpes simplex virus), 전염성 연속증, 사마귀 (Verruca/Wart) 등을 포함하는 바이러스성 피부질 환 (Katakura, T., et al., Clin. Immunol. 105:363-370, 2002 Hengge U. R., et al., Br. J. Dermatol., 149:15-19, 2003; Arany I., et al., Antiviral Res., 43: 55-63, 1999), 피부암 (Rook AH., et al Ann. N. Y. Acad. Sci., 795:310-318, 1996;Gollob, JA., et al., J. Clin. Oncol., 21:2564-2573, 2003; Trinchieri G., et al., Annu Rev Immunol., 13: 251-276, 1995; Krepler C., et al., J invest Dermatol., 122: 387-391, 2004) 등이 있다.

따라서, 본 발명에 적용될 수 있는 피부질환은 바람직하게는 아토피 피부염, IgE에 의해 매개되는 알러지 피부질환, 바이러스성 피부질환 및 피부암 치료에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는 아토피 피부염 또는 Th1 면역반응이 감소된 피부질환에 폭넓게 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, '개체'는 동물, 바람직하게는 포유동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다.

본 발명에 따른 CpG ODN은 개체에 직접 투여될 수 있다. 또한 표적 세포 (예: 수지상 세포의 표면)에 대한 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡슐화되어 핵산 전달 복합체 (nucleic acid delivery complex)의 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 CpG ODN은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 이온결합 또는 공유결합을 통해 스테롤 (예: 콜레스테롤), 지질 (예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제 (예: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예 컨대 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 수용할 수 있다.

본 발명에 따른 CpG ODN은 당업계에 공지된 방법 (Donnelly et al., J. Imm. Methods., 176:145, 1994; Vitrello et al., J. Clin. Invest., 95:341, 1995)에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉, 경구 또는 비경구, 예컨대 구강, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 골수내, 경막내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 CpG ODN을 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 CpG ODN은 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여용의 경우, 본 발명에 따른 CpG ODN은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한 비경구 투여용으로는 등장성 수용액 또는 현탁액과 같은 주사용 제형 또는 피부 도포용 제형으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 도포용 제형으로는 본 발명의 약학적 조성물과 약학적으로 허용되는 담체를 배합하여 파우더, 리미멘트 (liniment), 젤 (gel), 로션 (lotion), 크림 (cream), 연고제 (ointments), 파스타제 (pasta), 파프제, 에어로솔제 (aerosol), 좌제 (suppository) 등의 형태로 제형화할 수 있다. 그 중에서도 연고제가 보다 바람직하다. 상기 담체로는, 각 제형에 따라, 바세린, 유동 파라핀, 겔화 탄화수소 등의 탄화수소류 중쇄지방산트리글리세라이드, 돈지, 하드 팻트, 카카오지 등의 동식물성 오일 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아린산, 팔미틴산이소프로필 등의 고급지방산 알코올류 지방산 및 이의 에스테르류 폴리에틸렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤, 젤라틴, 백당, 당알코올 등의 수용성 기재 글리세린 지방산 에스테르, 스테아린산폴리옥실, 폴리옥시에틸렌경화피마자유 등의 유화제 아크릴산에스테르, 알긴산나트륨 등의 점착제 및 액화석유가스, 이산화탄소 등의 분사제 및 파라옥시벤조산에스테르류 등의 방부제 등이 사용될 수 있다. 이외에도 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라 이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 CpG ODN의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 '유효량(effective amount)'이라 함은 개체에서 Th2 사이토카인의 억제, Th1 사이토카인의 유도, 면역 세포의 활성화, 면역반응의 자극 또는 피부질환의 치료 또는 예방의 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명의 CpG ODN를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 전신적으로 투여되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 약 0.01 μM 내지 100 mM의 혈중 올리고뉴클레오티드 농도를 수득하기에 충분한 용량으로 일일 투여되는 것이 바람직하다. 국소적 투여의 경우에는 다른 경로에 의한 투여에 비해 보다 적은 양을 투여할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 CpG ODN의 바람직한 전체 용량은 1 일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 100 ㎎일 수 있다. 그러나, 상기 CpG ODN의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 CpG ODN의 피부질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 당업계에 공지된 다른 치료 방법, 예컨대, 화학요법 치료, 방사선 치료, 수술, 타 경구 치료제 및 치료용 연고제[예: 엘리델(Elidel, pimecrolimus)]와 투여될 수 있다. 또한 당분야에 공지된 다른 면역 보조제와 공동 투여될 수 있다. 상기 면역 보조제로는 INF-γ, IL-12, 시클로스포린 (Cyclosporine), FK506 (Tacrolimus), TP-5 (Thymopoietin pentapeptide, thymopentin) 등을 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 CpG OND을 함유하는 약학적 조성물은 필요에 따라 테트라사이클린 (tetracycline), 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline), 겐타마이신 (gentamicin), 황산 네오마이신 (neomycin sulfate), 바시트라신 (bacitracin) 및 황산 폴리믹신 B (polymyxin B sulfate), 뮤피로신(mupirocin) 등의 항생제 (antibiotics); 디펜히드라민 (diphenhydramine), 프로메타딘, 트리페레나민, 페노티아진, 클로로페니라민, 안타졸린 및 판톨릴 등의 항히스티민제 (anti-histamines); 항염제 (anti-inflammatory drugs); 항바이러스제 (anti-viral drugs) 및 항진균제 (anti-fungal agents)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

<1> BD-ODN들의 합성

하기 표 1에 개시된 서열은 (주)제노텍에 의뢰하여 3 '방향에서 5'방향으로 단일염기가 하나씩 차례로 붙으면서 염기사슬 (올리고뉴클레오타이드)을 신장시키는 자동화된 합성기를 사용하여 제조하였고, 골격(Backbone)을 포스포디에스테르(O 형) 및 포스포로티오에이트(S 형) 형태로 합성하여 후보물질 검색에 이용하였다. 합성된 표 1의 서열은 E. coli의 염색체 DNA 염기서열을 분석하여 면역반응 조절 효능을 가지는 후보물질이다.

ODNs	염기서열	형태	서열번호
BD-ODN 3611	GCTCGACGTTGGCGATACTC	O형	1
BD-ODN 3611	GCTCGACGTTGGCGATACTC	S형	2
BD-ODN 4546	CTCGCACGTTGCCGAACTTC	O형	3
BD-ODN 4546	CTCGCACGTTGCCGAACTTC	S형	4
BD-ODN 5419	AAGGTATCGGTACGTTCGCC	O형	5
BD-ODN 5419	AAGGTATCGGTACGTTCGCC	S형	6
BD-ODN 5441	AGCCAGTCGAAGCGTTCGGC	O형	7
BD-ODN 5441	AGCCAGTCGAAGCGTTCGGC	S형	8

<2> 합성 BD - ODN 들의 면역반응조사

상기 표1 에서 제조된 합성 BD-ODN 들이 농도의존적으로 또는 backbone의 형태에 따라 대식세포의 IL-8 의 프로모터를 활성화시키는지 조사하였다.

a) 마우스 대식세포의 배양

Raw 264.7 세포(ATCC, Manassas, VA)는 10% FBS(Gibco BRL)를 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포 배양은 37 ^oC, 5% CO₂ 배양기(Forma)에서 수행하였다.

b) IL-8 프로모터- Luc 리포터 플라스미드의 제작

IL-8 프로모터 영역 (-135 bp에서 +46 bp 까지)을 증폭하기 위하여, 인간 게놈 DNA를 주형으로 하고 다음과 같은 프라이머 셋트를 이용하여 PCR을 수행하였다.

5' primer (서열정보 9)	5'- GTGAGATCTGAAGTGTGATGACTCAGG-3'
3' primer (서열정보 10)	5'- GTGAAGCTTGAAGCTTGTGTGCTCTGC-3'

상기 증폭된 IL-8 프로모터 영역 단편을 BglⅡ 및 HindⅢ로 절단된 pGL3-Basic 플라스미드 (Promega, USA)에 삽입하였다. 이렇게 하여 IL-8 프로모터-Luc 리포터 플라스미드를 제조하였다 (Wu G. D. et al ., J. Biol . Chem., 272:2396-2403, 1997).

c) 프로모터 활성화 분석: 루시퍼라제 활성 어세이

RAW 264.7 세포(ATCC, Rockviller, MID)를 1X10⁵ cells/well의 농도로 12-웰 플레이트에 분주하여 37 ^oC, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 상기 b)에서 제조한 IL-8 프로모터-Luc 리포터 플라스미드와 pRL-null 플라스미드 (Promega, USA)로 공동-형질감염(co-transfection)시켰다. 이후, 37 ^oC, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 표 1에 기재된 BD-ODNs을 각 웰에 1, 2, 5, 10 ㎍/well의 농도로 처리하고, 37 ^oC, 5% CO₂ 배양기에서 8시간 동안 배양하였다. 이 때 대조군에는 PBS를 처리하였다. 이후, 듀얼-루시퍼라제 리포터 어세이 시스템 (Dual-luciferase reporter assay system, Promega, USA)의 PLB(passive lysis buffer)을 100 ㎕/well의 농도로 각 웰에 첨가하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 원심분리하고 얻은 상층액 (15 ㎕)을 이용하여 루시퍼라제 어세이를 수행하였다. 루시퍼라제 활성은 TD-20/20 루미노미터 (luminometer, Turner designs, USA)를 사용하여 측정하였다. BD-ODN의 처리에 따른 각 프로모터의 활성은 대조군에 대한 상대적인 활성으로 나타내었다. 즉, 대조군의 활성을 '1'로 하여 이에 대한 활성화 배수 (fold activation)로 나타내었다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441이 농도 의존적으로 IL-8 프로모터를 활성화시키는 것으로 확인되었다.

<3> BD - ODNs 의 골격 변형에 따른 RAW 264.7 세포의 활성화

RAW 264.7 세포에 상기 실시예 <2>의 b)에서 제작한 IL-8-Luc 프로모터 리포터 벡터와 pRL-null 플라스미드 (Promega, USA)로 공동-형질감염 시켰다. 상기 형질감염된 세포에 O형 (포스포디에스터 골격) 및 S형 (포스포로티오에이트 골격) BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441 (10 ㎍/㎖)을 각각 처리하고 8 시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 <2>와 동일한 방법에 따라 수행하여 IL-8 프로모터 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441 은 골격의 형태에 관계없이 (O형 및 S형 모두) 높은 활성을 나타내었다.

<4> BD-ODNs 의 NF-κB 활성화

24 웰 프레이트에 cover glass를 넣고 RAM 264.7 세포를 5x10⁵ 세포/㎖씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441을 각각 5 ㎍/웰 씩 처리하였다. 30 분 경과 후 3.7% formaldehyde로 세포를 고정시킨 후 0.2% Triton-X 100을 포함한 PBS로 permeabilize 하였다. 0.2% Tween-20을 포함한 PBS (PBST)에 1% donkey serum을 넣은 용액으로 30 분간 blocking한 후, PBST에 mouse anti-p65 (titer 1: 500) 항체를 0.5 ㎕/웰의 농도로 넣어 2 시간 동안 상온에 방치하였다. PBST로 세척 후, Donkey-anti-mouse-IgG-FITC (titer 1:250) 항체로 2 시간동안 처리하였다. Confocal microscopy를 이용하여 NF-kB의 핵으로 이동을 관찰하였다 (Lee, Y., et.al., (2002) Blood 99, 4307-4317).

도 3은 NF-κB를 면역 염색법으로 염색하여 confocal microscopy를 사용하여 NF-κB가 핵으로 이동하는 현상을 관찰한 그림이다. 아무것도 처리하지 않은 대조군이나 CpG 모티프가 없는 대조군 (non-CpG-ODN 2041)에서는 NF-κB가 세포질에 위치하였다. 대식세포에 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441를 처리한 경우에 NF-κB가 핵으로 이동하였다.

<5> BD-ODNs 의 혈액성 면역반응 유도

<5-1> Immunization

4 주령의 Balb/c 마우스에 hen egg lysozyme (HEL,50 ㎍/마리)과 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441 (50 ㎍/마리) 각각의 혼합물을 복강내 투여하였다. 1 주일 경과 후 동량의 HEL과 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441 혼합물을 두 번째 투여하였다. 1 주일 경과 후, heart punching방법으로 혈액을 채취하고 원심분리하여 혈구를 침전시키고 혈청을 획득하였다. 획득한 혈청으로부터 anti-HEL 항체 (total IgG, IgG1, IgG2a)의 역가를 확인하기 위해 ELISA를 수행하였다.

<5-2> ELISA

획득한 혈청에 PBS/0.2% sodium azide를 사용하여 1:10으로 dilution하여 -20 ℃에 보관하였다. 96 웰 Immunoplate (Nunc)에 HEL (10 ㎍/㎖ sodium bicarbonate 버퍼 pH 9.6)을 넣어 4 ℃에서 16 시간 동안 방치하여 프레이트 바닥에 HEL을 붙였다. PBST (PBS/0.05% Tween 20)를 사용하여 프레이트를 씻고, blocking하기 위해 1% bovine serum albumin (BSA)을 넣고 실온에서 1 시간 방치하였다. 혈청을 PBS를 사용하여 1:3으로 연속 희석하여 프레이트에 순서대로 넣고 4 ℃에서 16 시간 동안 방치한 후 PBST로 씻었다. Alkaline phosphatase-conjugated detecting 항체를 PBST에 섞어 프레이트에 넣고 실온에서 2 시간 방치하였다. Total IgG 검출을 위해 1:2,000 goat anti-mouse Ig(H+L) (Southern Biotechnology Associates) 항체를 사용하였다. 발색을 위해 1-StepTM ABTS (PIERCE, USA)를 넣고, ELISA 리더 (Labsystems, USA)를 사용하여 405 nm에서 흡광을 측정하였다 (Chu, R. S., et.al., (1997) J. Exp. Med. 186, 1623-1631).

BD-ODNs을 마우스 복강 내에 hen egg lysozyme (HEL)과 함께 주사하여 혈액성 면역반응을 조사하였다. HEL 만을 단독으로 주사하는 것에 비하여 BD-ODNs과 함께 주사한 HEL에 대한 항체의 양이 증가하므로 BD-ODNs이 혈액성 면역에서 면역 보조제 효과가 있음을 확인하였다 (도 4). Mycobacteria의 추출물을 파라핀 oil과 혼합한 약제인 Freund's adjuvant는 60년 전부터 현재까지 사용되고 있는 대표적인 면역보조제 중 하나이다. 그러나 이 면역보조제의 문제점은 세포성 면역증강이 이루어 지지 않고 인간에게 사용할 수 없다는 점이다. 본 발명의 BD-ODNs는 혈액성 면역을 증가시키는 면역보조제로의 역할 뿐 아니라 면역세포를 자극하여 세포성 면역을 유도하기 때문에 새로운 면역보조제로의 활용이 가능하다는 결과를 얻었다. 또한 BD-ODNs은 Th1 면역반응 특이적인 IgG2a의 항체 생산에 효과적임을 보여주고 있다.

<6> BD-ODNs 의 싸이토카인 생산 유도

<6-1> 사람 말초혈액 혈구 세포에서의 사이토카인 발현 분석

a) 사람 말초혈액 혈구 세포의 분리 및 BD-ODNs 처리

혈액원으로부터 구입한 혈액을 PBS와 동량으로 섞은 후 Ficoll-paque 용액을 이용하여 혈구 세포를 분리하였다. 상기 세포를 6-웰 플레이트(Nunc corp., USA)에 2 X 10⁶ cells/well의 농도로 분주하였다. 말초혈액의 혈구 세포에 GM-CSF (Biosource, USA)를 10 ng/㎖의 농도로 첨가한 10% FBS 함유 RPMI 배지를 각 웰에 가하였다 (Ghosh, M., J Immunol. 170: 5625-5629, 2003). 세포를 37 ^oC에서 5% CO₂를 함유한 배양기에서 1 일간 배양한 후, 본 발명에 따른 O형 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441을 10 ㎍/㎖ 처리하였다.

b) ELISA

먼저 상기 실시예 <5>에서와 같이 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441를 각각 처리한 세포배양액에 분비된 싸이토카인 IL-12 p40 및 IFN-γ의 역가를 확인하기 위해 상용화된 IL-12 p40 및 IFN-γ 항체 (R&D systems, Minneapolis, Minn.)를 이용하여 샌드위치 ELISA 분석을 각각 수행하였다. 그 결과, 도 5 에서 보는 바와 같이, 본 발명의 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441은 IL-12p40 및 IFN-γ의 생산을 유도하였다. 본 발명은 BD-ODN 3611, BD-ODN 4546, BD-ODN 5419, BD-ODN 5441이 IL-12p40 및 IFN-γ의 생산을 증가시켜 Th1 면역반응성을 증가 시키는 효과가 있음을 보여주고 있다.

< 실시예 2>

자외선 조사로 인한 마우스의 지연 면역억제 반응에 대한 CpG-ODN의 회복효과

20g 내외의 8 주령된 암컷 Balb/c 마우스(한국 SLC, 대한민국)를 각 그룹당 5마리씩 다음의 5그룹으로 나누었다.

(1) 음성대조군 : 자외선 조사 및 감작을 유도하지 않음

(2) 양성대조군 : 자외선을 조사하지 않고 감작만 유도함

(3) 자외선 단독 처리군 : 자외선을 조사하고 조사 3일 후 감작을 유도하였음

(4) CpG-ODN 1826 실험군 : 자외선을 조사한 후, 24시간 후 본 발명의 S형 CpG-ODN 1826을 복강주사하고 자외선 조사 3일 후 감작을 유도함

(5) BD-ODN 3611 실험군 : 자외선을 조사한 후, 24시간 후 본 발명의 O형 BD-ODN 3611을 복강주사하고 자외선 조사 3일 후 감작을 유도함.

(6) BD-ODN 5419 실험군 : 자외선을 조사한 후, 24시간 후 본 발명의 O형 BD-ODN 5419를 복강주사하고 자외선 조사 3일 후 감작을 유도함.

(7) BD-ODN 5441 실험군 : 자외선을 조사한 후, 24시간 후 본 발명의 O형 BD-ODN 5441를 복강주사하고 자외선 조사 3일 후 감작을 유도함.

자외선 조사를 위하여 쥐의 등 부위의 털을 제모하였고, 감작반응을 유도하기 위하여 쥐의 배부위의 털을 제모하여 실험을 행하였다. 각 단계의 실험일정은 도 6에 도시하였다

각 그룹의 마우스를 자외선B 램프 (4FSX24T12/UVB-HO, UBL, USA)가 구비된 자외선 상자에 넣고, 자외선을 0.6 mW/cm²의 광량으로 28 분간 조사하였다. 이때 조사된 자외선 B의 에너지 총량은 10 KJ/m²이다. 이와 같이 자외선을 조사함으로써 실험동물에서 자외선에 의한 접촉지연 과민반응의 면역억제효과를 유도하였다. 자외선 조사 24 시간 후, 1 ㎎/㎖의 농도로 PBS에 용해되어 있는 본 발명의 BD-ONDs을 각각 마리당 20 ㎍씩 복강 주사하였다. 대조군의 경우는 동량의 PBS 용액을 주사하였다.

약물 주사 2 일 경과 후, 털이 제거된 Balb/c 암컷 마우스의 배부위에 3% TNCB 용액(2,4,6-trinitrochlorobenzene; Tokyo Kasei Co., Tokyo, Japan) 100 ㎕을 도포하여 감작을 유도하였다. 감작 후 5 일째에, 쥐의 귀의 두께를 측정한 후 유발시험을 위해 다시 1% TNCB 용액을 마우스의 귀 양쪽면에 도포하였다. 24 시간 후, 마이크로미터 (Mitutyo, Tokyo, Japan)를 이용하여 귀의 부종정도를 측정하였다.

그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 털이 제거된 배부에 3% TNCB 100 ㎕를 도포함으로써 마우스의 접촉 피부염이 유발되었고 (양성 대조군: 21.7±1.18× 10^-2 mm), 자외선을 조사한 경우 귀의 부종 정도가 감소되었다 (7.0±1.17 × 10^-2mm). 본 발명의 BD-ODN을 복강내에 주입한 결과, 자외선에 의해 억제된 접촉지연면역반응이 모두 유의하게 회복되는 것으로 나타났다. 이로부터 본 발명의 BD-ODNs이 자외선으로 인한 억제된 면역 반응을 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

자외선 조사로 유도된 특이 항원 (TNCB)에 대한 지연형 면역 반응 (contact hypersensitivity)이 억제된 마우스의 비장으로부터 분리한 TNP (trinitrophenyl) 특이 항원 T 세포 증식 반응 (T cell proliferation responses)에 대한 본 발명의 BD-ODN의 증식 유도 효과

상기 실시예 8주령의 Balb/c 마우스를 각 그룹당 5마리씩 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 7개의 그룹 (음성대조군, 양성대조군, 자외선 단독 처리군, CpG-ODN 1826 실험군, BD-ODN 3611 실험군, BD-ODN 5419 실험군, BD-ODN 5441 실험군)으로 나누어 자외선 조사, 본 발명의 CpG ODN 처리, 감작 유도를 실시예 2와 같이 실시하였다. 항원 특이적 반응을 유도하기 위해 자외선 조사 및 감작 유도를 하지 않은 음성 대조군 마우스에서 분리한 비장세포를 10 mM TNBSO₃(Trinitrochlolrobenzensulfonic acid;Tokyo Kasei Co., Tokyo, Japan)와 결합 (conjugation)시켜 자극세포 (stimulator cell)로 사용하였다. 이외 양성대조군, 자외선 단독 처리군, 자외선 조사 후 CpG-ODN 1826 또는 BD-ODN 3611, 5419, 5441 처리 실험군의 마우스에서 분리한 비장세포를 반응세포 (responder cell)로 하여, 둥근 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰 당 1×10⁵ 세포를 넣어 주었다. 이후, 상기 자극세포를 각 웰에 혼합하여 5 일간 배양하였다. 이 때 자극세포와 반응세포는 1:1 비율로 혼합하였다. 세포를 수집하기 18 시간 전에 [³H]thymidine을 well당 0.5 μCi씩 첨가하여 18 시간 동안 반응시켰다. 세포 채취 (harvest) 기계를 이용하여 각 웰의 세포를 여과 종이에 모아서 상온에서 건조시켰다. 이후, 수용성 섬광 계수기 (aqueous scintillation counter, Amersham Biosciences, USA)를 바이얼 (vial)에 2 ㎖씩 분주한 후, 여기에 각각의 여과종이를 넣고 녹였다. β-계수기 (β-scintillation counter; Amersham Biosciences, USA)를 이용하여 cpm (counter per minute) 값을 측정을 통하여 비장에서 분리한 면역세포 (T 세포)의 증식능을 측정하였다.

그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 자외선 조사로 유도된 특이 항원 (TNCB)에 대한 지연형 면역 반응 (contact hypersensitivity)이 억제된 마우스의 비장으로부터 분리한 TNP (trinitrophenyl) 특이 항원 T 세포 증식 반응 (T cell proliferation responses)은 본 발명의 BD-ODN 처리에 의해 증식 반응이 유의하게 증가되는 것으로 나타났다. 이로부터 접촉성피부염 모델에서 자외선으로 인한 면역억제효과가 본 발명의 BD-ODN에 의해 긍정적으로 회복됨을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

<3-1> 혈청 내 IgE 수준 분석

각 군의 마우스를 에테르로 마취한 후, 즉시 안와정맥으로부터 혈액을 채취하여 헤파린이 처리된 튜브에 넣었다. 이후, 1000 g에서 10 분간 원심 분리하여 혈장을 수득하고, 사용하기 전까지 -20 ℃에서 보관하였다. 총 IgE 수준은 마우스 IgE BD OptEIA Kit(BD phamingen, USA)를 사용하여 측정하였다. 실험 방법은 BD OptEIA Kit의 매뉴얼 과정에 따라 실시하였다. 먼저, 96웰 플레이트의 각 웰에 IgE 캡춰 항체(capture antibody)를 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 12 시간 이상 반응시켰다. 웰 안의 용액을 제거하고, 세척 버퍼 (PBS, 0.05% Tween-20)로 3회 세척하였다. 이후, 블록킹 버퍼(PBS, 10% FBS) 200 ㎕를 각 웰에 넣고 상온에서 1 시간 반응시켰다. 블록킹 버퍼를 제거하고 상기 세척 버퍼로 3 회 세척하였다. 각 마우스로부터 얻은 혈장 샘플을 각각 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하고, 상온에서 2 시간 반응시켰다. 이후, 웰 안의 용액을 제거하고 상기 세척 버퍼로 5 회 세척하였다. 아비딘-HRP(avidin-horseradish peroxidase)가 결합되고 바이오틴으로 표지된 마우스 IgE 항체(BD pharmingen, USA) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 7 회 세척하였다. TMB 기질 용액 (BD pharmingen, USA) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 상온의 어두운 곳에서 30 분간 반응시켰다. 정지 용액 1M phosphoric acid (BD pharmingen, USA) 50 ㎕을 각 웰에 첨가하였다. 정지 용액을 첨가한 후 30 분 내에 ELISA 리더로 파장 450 nm에서 상기 용액의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 O형 BD-ODN를 자외선 조사로 면역반응이 억제된 마우스에 투여하였을 때, 혈청 내 IgE 수준이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

<3-2> TNP 특이항원에 대한 면역 유발 반응 병변의 관찰

본 발명의 BD-ODN를 복강 투여한 마우스의 TNP 특이항원에 대한 면역 유발 반응 1 일 후에 유발부위인 귀 부위를 적출하여 H&E 염색법에 의해 본 발명의 BD-ODN의 면역회복 효과를 조사하였다. 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 본 발병의 O 형 BD-ODN을 도포한 마우스의 귀 진피부위에서 림프구의 침윤 및 염증세포의 침윤이 현저히 증가하여 자외선으로 면역반응이 억제된 마우스에서 면역회복 반응이 성공적으로 진행됨을 확인하였다 (X 200배 관찰).

상기 결과들로부터 본 발명의 O형 BD-ODN이 특이항원 (TNCB)에 대한 지연형 면역반응이 억제된 마우스에서 Th1-림프구에 의해 매개되는 사이토카인의 발현은 감소시켜 혈청 내 IgE 수준을 증가시킴을 통해 면역회복에 매우 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

<4-1> TMA (trimellitic anhydride) 연속 투여로 인한 마우스의 지연 면역억제 반응에 대한 CpG-ODN의 회복효과

20g 내외의 8 주령된 암컷 Balb/c 마우스(한국 SLC, 대한민국)를 각 그룹당 5 마리씩 다음의 6 그룹으로 나누었다.

(1) 음성대조군 : TMA을 이용한 감작 및 유발을 유도하지 않음

(2) 양성대조군 : TMA을 이용한 감작 및 유발을 유도함

(3) CpG-ODN 1826 실험군 : TMA을 이용하여 감작을 유도한 직후, S형 CpG-ODN 1826을 복강주사하고 다시 5 일 후에 TMA을 이용하여 2 차 감작을 유도한 직후, 다시 S형 CpG-ODN 1826을 복강주사하고 5 일 후에 TMA로 유발반응을 유도함.

(4) BD-ODN 3611 실험군 : TMA을 이용하여 감작을 유도한 직후, 본 발명의 O형 BD-ODN 3611을 복강주사하고 다시 5 일 후에 TMA을 이용하여 2차 감작을 유도한 직후, 다시 본 발명의 O형 BD-ODN 3611을 복강주사하고 5 일 후에 TMA로 유발반응을 유도함.

(5) BD-ODN 5419 실험군 : TMA을 이용하여 감작을 유도한 직후, 본 발명의 O형 BD-ODN 5419을 복강주사하고 다시 5 일 후에 TMA을 이용하여 2차 감작을 유도한 직후, 다시 본 발명의 O형 BD-ODN 5419을 복강주사하고 5 일 후에 TMA로 유발반응을 유도함.

(6) BD-ODN 5441 실험군 : TMA을 이용하여 감작을 유도한 직후, 본 발명의 O형 BD-ODN 5411을 복강주사하고 다시 5 일 후에 TMA을 이용하여 2차 감작을 유도한 직후, 다시 본 발명의 O형 BD-ODN 5441을 복강주사하고 5 일 후에 TMA로 유발반응을 유도함.

TMA를 이용한 마우스의 감작반응을 유도하기 위하여 쥐의 배부위의 털을 제모하여 실험을 행하였다. 각 단계의 실험일정은 도 11에 도시하였다

털이 제거된 Balb/c 암컷 마우스의 배부위에 아세톤과 올리브 오일을 4:1의 혼합용액에 녹여있는 10% TMA 용액(Trimellitic anhydride; Sigma-Aldrich, USA) 100 ㎕을 도포하여 감작을 유도하였다. 감작 유도 직후, 1 ㎎/㎖의 농도로 PBS에 용해되어 있는 본 발명의 BD-ODNs을 각각 마리당 20 ㎍씩 복강 주사하였다. 음성 대조군의 경우는 TMA가 녹여져 있지 않은 아세톤-올리브 오일 혼합액을 이용하고, 동량의 PBS 용액을 주사하였다.감작 후 5일째에, 다시 털이 제거된 Balb/c 암컷 마우스의 배부위에 아세톤과 올리브 오일을 4:1의 혼합용액에 녹여있는 10% TMA 용액(Trimellitic anhydride; Sigma-Aldrich, USA) 100 ㎕을 도포하여 2 차 감작을 유도하였다. 감작 유도 직후, 1 ㎎/㎖의 농도로 PBS에 용해되어 있는 본 발명의 BD-ODNs을 각각 마리당 20 ㎍씩 복강 주사하였다. 음성 대조군의 경우는 TMA가 녹여져 있지 않은 아세톤-올리브 오일 혼합액을 이용하고, 동량의 PBS 용액을 주사하였다. 2 차 감작 유도 후 5 일째부터 3 일간 연속으로 쥐의 귀의 두께를 측정한 후 유발시험을 위해 다시 10% TMA 용액을 12.5 ㎕씩마우스의 귀 양쪽면에 도포하였다. 각각의 유발 24 시간 후, 마이크로미터(Mitutyo, Tokyo, Japan)를 이용하여 귀의 부종정도를 측정하였다.

그 결과, 털이 제거된 배부에 10% TMA 100 ㎕를 2 차에 걸쳐 도포함으로써 마우스의 접촉 피부염이 유발되었다 (음성 대조군: 31.0±1.6 ×10^-2 mm, 양성 대조군: 68.8±0.7 ×10^-2 mm). 본 발명의 BD-ODN을 복강내에 주입한 결과, TMA 접촉에 의해 증가된 Th2 면역반응이 모두 유의하게 회복되는 것으로 나타났다(도 12).

<4-2> 혈청 내 IgE 수준 분석

그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, 본 발명의 O형 BD-ODN를 투여시 TMA 접촉에 의해 증가된 혈청 내 IgE 수준을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다.

<적용예 1>

바이러스에 의해 유발되는 피부질환

바이러스성 피부질환은 면역상태가 저하된 사람 또는 만성질환자에서 잘 발생한다. 이들에서는 타입 1 T세포 면역 반응 (type 1 T cell responses)이 저하된 반면, 타입 2 T세포 면역 반응은 증가되어 있다(Hengge U.R., et al., Br J Dermatol., 149:15-19, 2003; Katakura T., et al., Clinical Immunol. 105: 363-370, 2002). 이들 바이러스성 질환에는 전염성 연속증, 사마귀, 헤르페스 바이러스 감염 등이 있으며, IL-12를 직접 주입하거나, IL-12를 증진시키는 치료를 함으로써 이들 감염 질환의 성공적인 치료를 할 수 있다 (Arany I., et al., Antiviral Res., 43: 55-63, 1999 Matsuo, R., et al., 59:623-630, 1996; Katakura, T., et al., Clin. Immunol. 105:363-370, 2002). 따라서 본 발명의 BD-ODNs의 IL-12 증진 효과는 바이러스성 피부 질환의 치료에 대단히 효과적이다.

<적용예 2>

피부암

피부암 발생은 면역억제 또는 저하된 사람에게서 잘 발생하며 이들에서 특히 세포성 매개 면역에 관여하는 Th1 면역 반응이 떨어져 있고, Th2 면역 반응이 증대한 것으로 보고되어 있다 (Rook AH., et al., Ann N Y Acad Sci., 795: 310-318, 1996). IL-12는 전염성 감염과 종양에 대한 면역 반응을 유발하여 이들 질환을 치료할 수 있는 사이토카인으로 알려져 있으며 이의 효과는 생체내 IFN-γ를 생성함으로써 나타나는 것으로 알려져 있다 (Trinchieri G., et al., Annu Rev Immunol. 13: 251-276, 1995). IL-12가 피부암 치료에 이용될 수 있다는 보고와 함께 BD-ODN이 마우스에서 악성 흑색종 치료에 효과적이라는 보고가 있다 (Gollob JA., et al., J Clin Oncology., 21: 2564-2573, 2003; Krepler C., et al., J invest Dermatol., 122: 387-391, 2004). 따라서 본 발명의 BD-ODN에 의한 IL-12의 증진 효과는 피부암의 치료에 대단히 효과적일 것이다.

<적용예 3>

아토피 피부염 및 알레르기 피부질환

아토피 피부염의 병인기전은 아직까지 확실치 않으나 IL-4와 IL-5를 포함한 Th2 사이토카인을 생산하는 알러겐 특이적 T 세포에 의해 질환이 유발된다고 생각되고 있으며, 아토피 피부염 환자의 병변에서 이들 세포의 침윤이 증명되었다 (Neumann C., et al., J Mol Med., 74: 401-406, 1996). 아토피 피부염 환자로부터 단핵구 또는 단핵구로부터 유래된 수지상 세포를 LPS (lipopolysaccaride)로 자극시 정상인에 비해 IL-12 p40의 생산이 현저히 감소한다고 보고된 바 있다 (Aiba S., et al., Exp Dermatol., 12: 86-95, 2003). 이와 함께 영아의 제대혈로부터 IL-12를 생산하는 단핵구의 수가 감소된 것이 IgE 생산의 증가와 관련이 있으며 이들에서 아토피 피부염 발생 가능성이 높은 것으로 보고되었다 (Nilsson C., et al., Clin Exp Allergy., 34: 373-380, 2004). Th1/Th2 면역 반응을 결정하는 중요한 인자 중의 하나가 IL-12라는 것을 감안할 때 본 발명의 BD-ODN이 수지상 세포에서 IL-12 생산을 증가시키는 것은 아토피 피부염 및 IgE 증가성 알레르기 피부질환에서 충분한 치료 효과를 갖는다는 것을 제시해 준다.

본 발명에 따른 BD-ODNs은 그 골격의 형태에 관계없이 피부질환의 치료 또는 예방에 효과적인 면역 반응을 유도한다. 따라서 본 발명에 따른 BD-ODNs, 특히 O형의 BD-ODNs은 피부질환의 치료 또는 예방제로서 유용하게 사용될 수 있다.

<110> BIO CLUE & SOLUTION CO., LTD SHIN, DONG HEON <120> Therapeutic use of CpG oligodeoxynucleotide for skin immune disease <130> PA9705-0359 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 3611 O form <400> 1 gctcgacgtt ggcgatactc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 3611 S form <400> 2 gctcgacgtt ggcgatactc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 4546 O form <400> 3 ctcgcacgtt gccgaacttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 4546 S form <400> 4 ctcgcacgtt gccgaacttc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 5419 O form <400> 5 aaggtatcgg tacgttcgcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 5419 S form <400> 6 aaggtatcgg tacgttcgcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 5441 O form <400> 7 agccagtcga agcgttcggc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BD-ODN 5441 S form <400> 8 agccagtcga agcgttcggc 20 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-8 promoter <400> 9 gtgagatctg aagtgtgatg actcagg 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-8 promoter <400> 10 gtgaagcttg aagcttgtgt gctctgc 27

Claims

하기의 화학식 2로 표시되는 면역반응 증강제(adjuvant) 또는 면역질환 치료용 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드:

화학식 2

AXSSWXTCGXWXCGTTCGSC

상기에서, S는 G 또는 C이고, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이고, M은 A 또는 C이고, X는 A 또는 G이다.
삭제
제1항에 있어서, 서열번호 5, 6, 7 및 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드.
제3항의 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 피부면역질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
제4항의 조성물이 INF-γ, IL-12, 시클로스포린(Cyclosporine), FK506(Tacrolimus) 및 TP-5(Thymopoietin pentapeptide, thymopentin)로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역 보조제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 피부면역질환이 Th1/Th2 면역반응의 평형에 이상이 생겨 유발되는 질환인 조성물.
제6항에 있어서, 질환이 아토피 피부염, 알러지, 바이러스성 피부질환 또는 피부암인 조성물.
삭제